Post on 30-Jun-2019
Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van ratten.
De Beleyr Elke
Promotor: Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans
Vakgroep: Inwendige Geneeskunde
Dienst: Gastroenterologie en Hepatologie
Academiejaar 2008-2009
Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van ratten.
De Beleyr Elke
Promotor: Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans
Vakgroep: Inwendige Geneeskunde
Dienst: Gastroenterologie en Hepatologie
Academiejaar 2008-2009
Datum 25 mei 2009
De Beleyr Elke Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans
VOORWOORD Deze thesis heeft me meer inzicht gegeven in hoe de onderzoekswereld in elkaar zit, hoe alles
gestructureerd is en hoe zo efficiënt mogelijk wordt onderzocht. Gedurende deze periode heb
ik kunnen vaststellen hoe belangrijk teamwork is in deze sector om tot de nodige resultaten te
kunnen komen. Ook ik kon beroep doen op een team van gemotiveerde mensen die steeds
voor mij klaar stonden en bereid waren hun kennis met mij te delen.
Mijn woord van dank voor:
- Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans, mijn promoter, die in zijn drukke agenda tijd maakte voor het geven van tips en feedback.
- Van Steenkiste Christophe, Heindryckx Femke en Blomme Bram, mijn
begeleiders, die me hielpen bij het uitvoeren van de praktische zaken en waarop ik altijd kon terugvallen bij eventuele problemen.
- Kim Olivier en alle andere mensen in het labo, voor hun hulp bij het uitvoeren
van mijn praktisch werk.
- Louis Libbrecht, patholoog, voor het bekijken van de coupes onder de microscoop.
- Nathalie Michels, medestudente, voor de vele dagen die we samengewerkt
hebben en de kennis die we met elkaar gedeeld hebben.
Het uitwerken van een eindwerk is natuurlijk ook een periode die gepaard gaat met veel werk,
en dit brengt op zijn beurt de nodige stress met zich mee. Daarom wil ik graag Julien
bedanken vermits hij altijd het zonnetje in het labo deed schijnen!
Tot slot bedank ik mijn ouders die me de kans hebben gegeven deze opleiding te volgen en
mij zijn blijven steunen en motiveren om mijn studies tot een goed einde te brengen.
INHOUDSTAFEL
Samenvatting p.1
Inleiding p.2
1. De lever………………………………………………………………………………….p.2
1.1 Pathofysiologie
1.2 Complicaties
2. Diermodel van portale hypertensie………………………………………….…………p.7
3. Malnutritie en leverlijden……………………………………………………………….p.8
4. Malnutritie diagnoseren………………………...……………………….……………...p.9 4.1 Mens 4.2 Dier 4.3 Vetmeting in het mesenterium
5. Biochemische merkers…………………………………………………………………p.10 5.1 Hormonen
5.1.1 Leptine 5.1.2 Ghreline 5.1.3 Adiponectine
5.2 Merkers voor leverschade 5.2.1 Aminotransferasen 5.2.2 Albumine 5.2.3 Bilirubine
5.3 Merkers van het koolhydraat metabolisme 5.3.1 Glucose 5.3.2 Insuline
5.4 Inflammatie merkers 5.5 Sporenelementen 5.5.1Vitamine A, D en E
5.5.2 Zink en koper 6. Doelstelling……………………………………..……………………………………….p.15
Materialen en methoden p.16
1. Proefdieren…………………………...………………………………………...……….p.16
1.1 Ratmodellen 1.1.1Partial portal vein ligation (PPVL) model 1.1.2 Controle ratten 1.2 Voeding 1.3 Hemodynamische studies
1.4 Vetmeting 2. Anatomie en histologie……………...…………………………………………………..p.18
2.1 Weefsel afnemen 2.2 Paraffinecoupes 2.3 Kleuringen 2.3.1 Haematoxyline-eosine kleuring
2.3.2 Sirius red kleuring
2.4 Dehydratatie en monteren
2.5 Microscopische evaluatie
2.5.1 Evaluatie van de Haematoxyline-eosine kleuringen
2.5.2 Evaluatie van de Sirius red kleuringen
3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ………………………………...….………..p.26
3.1 Principe
3.2 Lysaten maken
3.3 Proteïnebepaling
3.4 Protocol van een kwantitatieve sandwich ELISA
3.5 Protocol van een competitieve ELISA
4. Statistiek……………………………………….………………………………………..p.26
Resultaten p.27
1. Ratmodellen……………………………………………………………………………..p.27 1.1 Hemodynamische metingen 1.2 Haematoxyline-eosine kleuring 1.3 Sirius red kleuring 1.4 Macroscopische observaties 2. Malnutritie…………………………………………………………………… …………p.30 2.1 Gewicht 2.2 Voeding en drank 2.3 Vetmeting 3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay………………………………………...……p.34 3.1 Leptine 3.2 Adiponectine 3.3 Ghreline 3.4 Albumine 3.5 Insuline 3.6 Inflammatie merkers 4. Resultaten uit het routinelabo…………………………………………………………p.37 4.1 Aminotransferasen
4.2 Glucose 4.3 Metalen 4.4 Bilirubine 4.5 Vitamines 5. Insulineresistentie.………………...……………………………………………...…….p.40 6. Samenvattende tabel……………………………………………………………………p.40
Discussie p.42
1. Bespreking………………………………………………………………………………p.42 2. Biochemische merkers…………………………………..……………………………...p.44 3. Eindconclusie…………………………………………………….………….......………p.47 4. De invloed van een cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten…………...p.47
Referentie p.50
Bijlage
1
SAMENVATTING
Achtergrond: Portale hypertensie (PHT) is een klinisch syndroom dat geassocieerd is met
chronische leverziekten. De primaire oorzaak van PHT is een verhoogde vasculaire weerstand
van de portale bloedflow (P= Q x R waarbij P de druk, Q de flow en R de weerstand is). De
hyperdynamische situatie die ontstaat is medeverantwoordelijk voor het ontstaan van PHT.
Malnutritie is een veel voorkomende complicatie van patiënten met leverlijden.
Doelstelling: Deze studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op de
voedingstoestand van ratten. Aan de hand van verschillende merkers werd de relatie tussen
malnutritie en PHT bij ratten nagegaan.
Materialen en methoden: Bij deze thesis werd 1 ratmodel voor PHT en 1 groep controle
ratten gebruikt. Het PPVL-model voor geïsoleerde PHT zonder onderliggende
leverproblematiek werd geïnduceerd door partiële ligatie van de vena porta. Sham
geopereerde ratten vormden de controlegroep. Histologisch onderzoek gebeurde door
haematoxiline-eosine (HE) en sirius red kleuringen, ook hemodynamische metingen werden
uitgevoerd. De opgenomen hoeveelheid voeding en drank en de grootte van de vetcellen
werden gemeten bij beide groepen. Tenslotte werden er interleukines, sporenelementen,
hormonen, merkers voor leverschade en van het koolhydraat mechanisme onderzocht.
Resultaten: PPVL leidt tot een bruikbaar model van PHT waarbij de ratten 14 dagen na de
ligatie PHT ontwikkelen. Aan de hand van de portale druk werd er vastgesteld dat de PPVL-
ratten PHT hadden ontwikkeld. Op de HE kleuring werd er geen leverschade opgemerkt en bij
het visceraal peritoneum werd geen significant verschil tussen beide groepen opgemerkt in
grootte van de vetcellen. Met behulp van de sirius red kleuring werd er milde portale fibrose
opgemerkt bij de PPVL-ratten. De PPVL-ratten dronken en aten significant minder dan de
sham-ratten waardoor hun gewicht ook significant gedaald was. De merkers leptine, ghreline,
adiponectine, glucose, insuline, vitamine A en D, koper, zink en bilirubine zijn niet significant
veranderd bij de PPVL-ratten in vergelijking met de sham-ratten. Daarentegen is albumine
significant gedaald en IL-6 significant en TNF-α borderline significant gestegen bij de PPVL-
ratten.
Conclusie: De daling in voedingsopname bij de PPVL-ratten wijst erop dat PHT en eventueel
de milde portale fibrose invloed hadden op de eetlust van deze ratten. De hypermetabole
status, inflammatie en mogelijks intestinaal eiwitverlies zouden aan de basis kunnen liggen
voor de verminderde vrijwillige voedselopname bij PHT.
2
INLEIDING
1. De lever
De lever is een multifunctioneel orgaan dat belangrijke metabole en endocriene functies
vervult. Het is het grootste inwendige orgaan (1,5 – 2 kg) in het lichaam en bevindt zich in het
rechter boven kwadrant van het abdomen, net onder het middenrif. Het wordt gekenmerkt
door een wigvormige bouw, bestaande uit een vlakke achterzijde (facies visceralis) en een
convexe voorzijde (facies diaphragmatica). De lever wordt verdeeld in verschillende lobben,
waartussen zich de galblaas bevindt [1,2].
Figuur 1: De viscerale oppervlakte van de lever [1].
De lever bestaat uit talrijke hexagonale leverlobuli die de functionele eenheden van de lever
vormen. De lobuli zijn opgebouwd uit platen van hepatocyten (leverparenchymcellen) die
radiair geschikt zijn rond een centrale ader. In het bindweefsel tussen deze zogenaamde
celplaten liggen takken van de poortader (vena porta), leverslagader (arteria hepatica) en
galgangen. Het bloed afkomstig van de vena cava en arteria hepatica vloeit via de sinusoïden
naar de centrale ader [1,2]. Om een maximaal contact van het bloed met de hepatocyten te
verzekeren, bevindt er zich slechts 1 cellaag
leversinusoïden zijn afgelijnd door gevensterd endotheel, deze poriën bevorderen de
uitwisseling tussen de sinusoïde
De hepatocyten scheiden gal af
komen samen in grotere kanalen, die zich op hun beurt verbinden met de rechter en linker
ductus hepaticus (leverbuis). Het hoofdgalkanaal wordt gevormd uit deze twee leverbuizen.
Dit hoofdgalkanaal draineert
hoeveelheid gal die nodig is voor een goede spijsvertering [1,2]
Figuur 2: De driedimensionele synopsis van het normale leverparenchym [2]
De lever wordt van bloed voorzien d
(70%). De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min
brengt zuurstofrijk bloed naar de lever
uit de darmen, de maag, de milt en de alvleesklier
lever komt via de leverader (vena hepatica) in de vena cava
De lever is een veelzijdig orgaan dat een groot aantal functies uitoefent
� Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum
� Eiwit metabolisme: ureum cyclus en oxidatieve deaminatie
3
verzekeren, bevindt er zich slechts 1 cellaag hepatocyten tussen de sinusoïden. De
leversinusoïden zijn afgelijnd door gevensterd endotheel, deze poriën bevorderen de
tussen de sinusoïden en de parenchymcellen [2].
De hepatocyten scheiden gal af dat terecht komt in interlobulaire galbuisjes. Deze
komen samen in grotere kanalen, die zich op hun beurt verbinden met de rechter en linker
ductus hepaticus (leverbuis). Het hoofdgalkanaal wordt gevormd uit deze twee leverbuizen.
Dit hoofdgalkanaal draineert de gal vanuit de lever en voorziet de galblaas van een rijke
hoeveelheid gal die nodig is voor een goede spijsvertering [1,2].
De driedimensionele synopsis van het normale leverparenchym [2]
De lever wordt van bloed voorzien door middel van de leverslagader (30%) en de poortader
. De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min
brengt zuurstofrijk bloed naar de lever, terwijl de poortader zuurstofarm bloed met
uit de darmen, de maag, de milt en de alvleesklier naar de lever transportee
lever komt via de leverader (vena hepatica) in de vena cava terecht [1,2].
De lever is een veelzijdig orgaan dat een groot aantal functies uitoefent [3]:
Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum
metabolisme: ureum cyclus en oxidatieve deaminatie
tussen de sinusoïden. De
leversinusoïden zijn afgelijnd door gevensterd endotheel, deze poriën bevorderen de
dat terecht komt in interlobulaire galbuisjes. Deze galbuisjes
komen samen in grotere kanalen, die zich op hun beurt verbinden met de rechter en linker
ductus hepaticus (leverbuis). Het hoofdgalkanaal wordt gevormd uit deze twee leverbuizen.
galblaas van een rijke
de leverslagader (30%) en de poortader
. De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min. De leverslagader
, terwijl de poortader zuurstofarm bloed met nutriënten
naar de lever transporteert. Bloed uit de
:
Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum
4
� Vetmetabolisme: synthese van cholesterol en lipoproteïne, opstapeling, synthese en
export van triglyceriden
� Synthese en secretie van eiwitten: albumine, stollingsfactoren, bindingseiwitten,
hormonen
� Solubilizering, transport en opstapelingsfunctie: enterohepatische cyclus, drug
metabolisme en excretie, biotransformatie, apolipoproteïne bij transport van vetten,
productie van bindingseiwitten
� Bescherming en klaring: fagocyt- en endocyt-functie van Kupffer cellen, endocyt-
functie van hepatocyten, ammonium metabolisme
� Vitamine A opstapeling
� Afbraak rode bloedcellen (bilirubine metabolisme)
De lever is een onmisbaar en uniek orgaan dat talrijke essentiële functies in het lichaam
vervult [1,2].
1.1 Pathofysiologie
Portale hypertensie (PHT) is een klinisch syndroom dat geassocieerd is met chronische
leverziekten en geassocieerd wordt met levercirrose [4-9]. De primaire factor van PHT is een
verhoogde vasculaire weerstand van de portale bloedflow [4,10]. De normale druk in de vena
porta is laag, rond de 5 mm kwikdruk, omdat de vasculaire weerstand in de hepatische
sinusoïden laag is [11]. Complicaties van PHT ontwikkelen zich meestal wanneer de
bloeddruk in de poortader groter is dan 12 mm kwikdruk [5,7]. Dilatatie van het portaal
systeem proximaal van de occlusie en verhoging van de capillaire druk in de organen die
gedraineerd worden door desbetreffende portale venen zijn het resultaat van deze verhoogde
portale veneuze druk [5,7,12].
Wanneer er sprake is van een portale systemische levershunt is er iets mis met de normale
bloedvoorziening van de lever. Het bloed uit de poortader gaat direct naar de systemische
circulatie zonder eerst de lever te passeren. Doordat het bloed de obstructie omzeilt wordt de
bloedstroom tussen de portale en systemische circulatie vergroot. Hierdoor bereikt het bloed
de systemische circulatie op een directe manier zonder langs de hepatische sinusoïden te
stromen [2,7].
5
De portale druk wordt gedefinieerd door de wet van Ohm in de vergelijking: ∆P=Q x R
waarbij ∆P de portale druk gradiënt is, Q de bloedflow in het totale portale veneuze systeem
en R de vasculaire weerstand van het volledige portale veneuze systeem. Hieruit volgt dat de
portale druk kan stijgen door een verhoogde portale bloedflow of een verhoogde vasculaire
weerstand of een combinatie van beide [4,9,10].
De plaats van de verhoogde weerstand is afhankelijk van het ziekteproces. De oorzaken van
PHT worden meestal ingedeeld als prehepatisch, posthepatisch of intrahepatisch. In pre- en
posthepatische PHT is de verhoogde weerstand secundair, respectievelijk aan de obstructie
(bijvoorbeeld door een verhoogde weerstand of doordat het bloed niet meer voldoende wordt
rondgepompt als gevolg van hartfalen) van de portale veneuze inflow of de hepatische
veneuze outflow. In tegenstelling tot pre- en posthepatische PHT, zijn de intrahepatische
syndromen complexer en kunnen zelden volgens één enkele plaats van weerstand worden
geclassificeerd in de lever [2,4].
Tabel 1: Oorzaken van portale hypertensie.
OORZAKEN VAN PORTALE HYPERTENSIE PREHEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE EXTRAHEPATISCHE OORZAKEN Portale vene trombose Caverneuze transformatie van de vena porta Extrinsieke compressie van de vena porta Arterioportale fistula Massieve splenomegalie INTRAHEPATISCHE OORZAKEN Schistosomiasis Sarcoidosis Primaire biliaire cirrose Ideopatische portale hypertensie (niet cirrotische portale hypertensie) HEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE Cirrose Alcoholische hepatitisch Vitamine A toxiciteit POSTHEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE Veno-occlusieve ziekte Budd-Chiari syndroom Hepatisch veneus of inferior vena cava web Restrictieve hart ziekten Constructieve pericarditis Ernstige congestieve hartfalen
6
Recente studies hebben aangetoond dat wijzigingen in de vasoreactiviteit (vasodilatie en –
constrictie) een centrale rol spelen in de pathogenese van PHT [9]. Een normale vasculaire
tonus is afhankelijk van een goede balans tussen vasoconstrictors (bv. endotheline) en
vasodilators (bv. stikstofmonoxide). Beide vaso-actieve stoffen worden gesynthetiseerd door
de sinusoïdale endotheelcellen en zijn betrokken bij het bepalen van de vasculaire weerstand.
De verhoogde vasculaire tonus in cirrotische levers wordt veroorzaakt door vorming van
collageen, een te kort aan vasodilators, een verhoging van vasoconstrictors of een combinatie
van beide [4,8,10]. Als gevolg van de verminderde productie van vasodilators (NO en
glucagon) ontstaat er splanische vasodilatie. Dit resulteert enerzijds in een verhoogde portale
inflow en anderzijds in een centrale (systemische) ondervulling. Deze systemische
ondervulling leidt tot activatie van het renine-angiotensine-aldosteronsysteem (RAAS), een
enzymsysteem dat instaat voor een stabiele bloeddruk door verschillende terugkoppelingen en
door invloeden van buitenaf. De activatie van RAAS leidt tot renale vasoconstrictie wat
resulteert in natrium en water retentie [10]. De hyperdynamische circulatie, zowel
systemische als splanchnisch, die ontstaat bij PHT is dus verantwoordelijk voor de
complicaties van PHT [4,9].
Figuur 3: Schematische representatie van de pathofysiologie van portale hypertensie. [Laleman W, Van Landeghem L, Wilmer A, Fevery J, Nevens F (2005). Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver international 25:1079-1090]
hepatische weerstand ↑
portale inflow ↑ shunts ↑ PHT
splanchnishce vasodilatie
het circulerend volume ↓
herverdeling van het totale bloedvolume
7
1.2 Complicaties
De hyperdynamische circulatie leidt tot een verhoging van de portale bloedflow en het
ontwikkelen van porto-systemische collateralen [4,5,10]. De verhoogde portale bloedflow
draagt bij tot het onderhouden maar ook het verergeren van PHT door de ontwikkeling van
porto-systemische collateralen of ook wel porto-systemische shunts genoemd. Deze
collateralen hebben als doel de druk van het portaal systeem te verlagen door het portale bloed
terug te brengen naar de systemische circulatie [12].
Het ontstaan van varices in collaterale bloedvaten is één van de belangrijkste complicaties van
PHT, de meest voorkomende zijn slokdarm- en maag-varices. Umbilicale venen, vene van de
abdominale wand, kunnen uitgezet zijn, wat de ontwikkeling van zichtbare collateralen geeft.
Een ruptuur in de varices, bijvoorbeeld als gevolg van een overmatige hydrostatische druk,
kan aanleiding geven tot hemorragie (bloedingen) met ernstige tot mogelijks letale gevolgen.
Dus, de porto-systemische circulatie speelt een rol in de mechanismen van vaak dodelijke
complicaties van PHT [5,6,10]. Hemorragie door geruptureerde gastro-oesophagaele varices
is de voornaamste complicatie bij PHT. Ongeveer 10% van de patiënten die varices hebben
zullen variceale bloedingen ontwikkelen per jaar en de mortaliteitskans bij deze personen is
30-50%. Aan de hand van endoscopie kunnen varices opgespoord worden [2,5].
Een andere complicatie van PHT is splenomegalie of vergrote milt. Door stijging van de
portale druk ontstaat er stuwing in de milt bloedvaten wat resulteert in een vergrote milt. Er is
een correlatie tussen de portale veneuze druk en de grootte van de milt [2].
2. Diermodel van portale hypertensie
Zoals voor alle pathologische condities is het gebruik van proefdieren enorm belangrijk voor
het begrijpen van het onderliggend mechanisme [6,10]. De drie meest gebruikte modellen
zijn: Partial Portal Vein Ligation model (PPVL) waarbij er ter hoogte van de vena porta een
stenose (vernauwing) wordt aangebracht, het Common Bile Duct Ligation model (CBDL)
waarbij de hoofdgalweg wordt geligeerd en het Carbon TetraChloride model (CCl4) waarbij
koolstof tetrachloride chronisch wordt toegediend. Het grote verschil tussen deze drie
diermodellen is dat we bij het eerste model te maken hebben een prehepatische PHT zonder
8
hepatische dysfunctie, terwijl bij de andere twee modellen PHT het resultaat is van cirrose en
er wel hepatische dysfunctie optreedt [10,11].
De keuze van het model is grotendeels afhankelijk van welke pathofysiologie van PHT men
wenst te onderzoeken. Het PPVL-diermodel wordt gebruikt om wijzigingen in de splanische
circulatie en de pathofysiologie van de hyperdynamische circulatie in PHT te onderzoeken
zonder de invloed van cirrose. De cirrose geïnduceerde modellen worden gebruikt bij het
bestuderen van wijzigingen in de intrahepatische microcirculatie [10,11]. Deze modellen
worden vooral toegepast op ratten, maar wegens de grote vooruitgang in de moleculaire
biologie en het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren (bv. transgene en knock-out
muizen) is er nood aan goed beschreven muismodellen om specifieke pathogene processen bij
PHT te beschrijven [11].
3. Malnutritie en leverlijden
Malnutritie is een multifactoriële en veel voorkomende complicatie van patiënten met
leverlijden [13,14]. Het wordt steeds meer herkend als een belangrijke prognostische factor
dat het klinisch resultaat van patiënten kan beïnvloeden die lijden aan eind stadium
leverlijden. Malnutritie leidt tot een verhoogde morbiditeit en mortaliteit in deze setting [13].
Malnutritie wordt veroorzaakt door een verminderde vrijwillige voedselinname, malabsorptie,
verhoogd intestinaal eiwitverlies, inflammatie, leverschade, verminderde leversynthese
functie en een hypermetabole status [14]. De hypermetabole status leidt tot systemische
vasodilatie waardoor het intraveneuze bloedvolume vergroot. Een direct effect hiervan is een
verhoogd hart-bloedvolume en een groter gebruik van macro- en micronutriënten en hoger
energie uitgave wat resulteert in een nutritionele depletie [14].
Malnutritie vermindert de klinische functies, wat resulteert in complicaties en een slechte
prognose. Malnutritiemeting is dan ook aangewezen om risicovolle patiënten op te sporen en
eventueel over te gaan op nutritionele ondersteuning [13,14].
Vermijden van alcohol en overmaat vetgebruik, het innemen van 4-6 maaltijden per dag zijn
de meest voorkomende aanbevelingen. Bij erge malnutritie, is het starten van enterale voeding
vaak aanbevolen [13,14]. Enterale voeding verbetert de nutritionele status en de leverfunctie.
9
Het verlengt de levensduur, verbetert de levenskwaliteit, vermindert de complicaties en zorgt
voor een beter herstel voor patiënten met een levertransplantatie [13].
4. Malnutritie diagnoseren
4.1 Mens
Het identificiëren van patiënten met malnutritie aan de hand van eenvoudige en gemakkelijk
toegepaste methoden is noodzakelijk zodat voedingsondersteuning kan voorzien worden [13].
Volgens de Europese vereniging voor klinische nutritie en metabolisme (ESPEN) zijn
eenvoudige methoden zoals subjective global assessment (SGA) en antropometrische
parameters betrouwbaar bij de beoordeling van de voedingsstatus van cirrotische patiënten
[13,14]. SGA is een techniek dat meerdere elementen van nutritionele beoordeling combineert
om de graad van de malnutritie te classificeren. Antropometrie is de studie van de menselijke
afmetingen, wat onder andere de omtrek van de middenarm spieren en de triceps huiddikte
meten inhoudt [13].
De beoordeling van malnutritie in een klinische praktijk met cirrosepatiënten wordt
bemoeilijkt door de objectiviteit van de gebruikte methoden en de tendens tot vochtretentie bij
cirrose (ascites) wat de resultaten beïnvloedt [13,14]. Daarom worden verschillende
parameters, die hieronder besproken worden in het hoofdstuk over biochemische merkers,
gebruikt om de nutritionele status te evalueren [13].
4.2 Dier
Vermits antropometrische parameters en SGA enkel mogelijk zijn bij patiënten, worden
biochemische merkers, gewicht en voeding- en drank inname bij proefdieren gebruikt om de
voedingstoestand te achterhalen [13-15].
4.3 Vetmeting in het mesenterium
Het mesenterium is een deel van het peritoneum (buikvlies) waarmee de meeste organen in de
buikholte vastzitten aan de achterwand van de buik. Het peritoneum is het membraan dat de
buikholte en de daarin liggende organen bekleedt. Het kan onderverdeeld worden in twee
10
lagen, namelijk, het viscerale (bekleedt buitenkant van de inwendige organen) en het pariëtale
(bekleedt binnenkant van de buik) peritoneum [1].
5. Biochemische merkers
5.1 Hormonen
5.1.1 Leptine
Leptine is een cytokine eiwithormoon dat voornamelijk geproduceerd wordt door de
adipocyten, maar ook in mindere mate door ovaria, placenta, skeletspieren, de lever en de
maag [17,18]. De grootte van de productie is proportioneel met de hoeveelheid vetmassa
[14,19]. Het stimuleert de hypothalamus tot een anorectische reactie, waardoor een verhoogd
leptine gehalte resulteert in een snellere verzadiging en dus gedaalde voedselinname, maar
ook een toename in energieverbruik. Leptine neemt toe o.i.v. insuline en TNF-α, het
onderhoudt zelf de insulineresistentie en stimuleert de vrijzetting van pro-inflammatoire
(TNF-α, IL-6, IL-12) en pro-fibrotische (TGF-ß) cytokines. Leptine receptoren behoren tot de
cytokine klasse I receptor familie en worden overal in het lichaam gevonden. Het pleïotrope
karakter van leptine is nog niet volledig begrepen [14,17,19].
5.1.2 Ghreline
Ghreline is een peptide hormoon dat hoofdzakelijk geproduceerd wordt door de funduscellen
van de maag. Kleine hoeveelheden worden geproduceerd in de placenta, nier, hypofyse en
hypothalamus [18]. De cellen van de hypofyse hebben een receptor die, wanneer ze
geactiveerd zijn, de secretie van groeihormoon sterk stimuleren. Deze receptor wordt de
groeihormoon secretagogue receptor (GHS-R) genoemd en wordt geactiveerd door ghreline
wat leidt tot een verhoogde groeihormoonproductie [18]. Het groeihormoon stimuleert via de
hypothalamus het hongergevoel, hierdoor zullen veranderingen van ghreline concentratie in
het bloed positief gecorreleerd zijn aan veranderingen in de eetlust. Ghreline zorgt tevens
voor een toename in vetweefsel door een daling van de β-oxidatie en stimuleert ook de maag
motiliteit [18,19].
11
5.1.3 Adiponectine
Adiponectine is een hormoon dat geproduceerd wordt door de pre-adipocyten. [17]. Er is een
negatieve correlatie tussen visceraal vet en adiponectine niveaus in plasma. De invloed van
visceraal vet is veel groter dan dat van subcutaan vet in het lichaam. Het is een beschermend
eiwit met anti-atherogenische, anti-diabetische en anti- inflammatoire effecten [18,20,21]. De
adiponectine secretie wordt geregeld via nutritionele status, namelijk bij visceraal vet
accumulatie krijgen we disregulatie van de adiponectine activiteit en oversecretie van TNF-α,
wat een inhibitor is van adiponectine [21]. Adiponectine verhoogt de gevoeligheid voor
insuline en vermindert zo insulineresistentie, daardoor wordt de glucose-opname en de
vetzuuroxidatie gestimuleerd, en dalen de triglyceriden spiegels. Adiponectine vermindert ook
de vetsynthese en glucoseproductie in de lever en veroorzaakt hierdoor een daling van glucose
en vrije vetzuren in het bloed [17].
5.2 Merkers voor leverschade
5.2.1 Aminotransferasen
AST en ALT zijn uitstekende merkers voor hepatocellulaire schade. Ze nemen deel aan de
gluconeogenese door de transfer van de aminogroep te katalyseren van aspartaatzuur of
alanine naar ketoglutaarzuur voor de productie van respectievelijk oxaloaatzuur en
pyruvaatzuur. Hepatocellulaire schade (necrose) is de trigger voor de vrijlating van deze
aminotransferasen [15].
AST is aanwezig in cytosolische en mitochondriale enzymen. Dit enzym komt voor in de
lever, hartspier, skeletspieren, de nieren en de rode bloedcellen. Beschadiging van deze
weefsels en cellen kan tot verhoogde waarden van AST leiden [15,17].
Alanine aminotransferase (ALT) is een cytosolisch enzym dat gevonden wordt in de lever en
in veel mindere mate in hart, nier en spieren. Doordat het hoofdzakelijk in de lever wordt
teruggevonden is ALT meer leverspecifiek dan AST. Bij beschadiging van de hepatocyten
komt ALT vrij, waardoor het een goede merker is voor leverschade [15,17].
5.2.2 Albumine
Albumine wordt uitsluitend geproduceerd door de lever. Het is de belangrijkste
determinerende factor voor het onderhouden van de osmotische plasmadruk. Bij progressieve
leverziekten is er een gedaalde serum albumine concentratie, dit is een gevolg van de
gedaalde albuminesynthese door de lever [15]. Bij hypo-albuminemie kan water uit de
12
bloedbaan naar de interstitiële weefsels migreren en vochtophoping (oedeem, ascites)
veroorzaken. Hypo-albuminemie heeft een brede waaier van oorzaken, namelijk: malnutritie,
hepatisch lijden, verhoogd katabolisme, malabsorptie, eiwitverlies, terwijl hyperalbuminemie
geassocieerd wordt met dehydratatie. Dit moet in rekening gebracht worden bij de
interpretatie van lage albumine niveaus [15].
5.2.3 Bilirubine
Bilirubine wordt gevormd door lyse van rode bloedcellen binnen het reticulo-endotheliaal
systeem. Ongeconjugeerd bilirubine gebonden aan albumine wordt getransporteerd in het
bloed naar de lever. Het ongeconjugeerde bilirubine is water onoplosbaar waardoor het niet
geëxcreteerd kan worden in de urine [15]. In de lever gebeurt er een omzetting van
ongeconjugeerd bilirubine naar geconjugeerd bilirubine door binding met glucuronzuur.
Geconjugeerd bilirubine is water oplosbaar en kan nu door de lever in de gal uitgescheiden
worden, waardoor het in de urine verschijnt. Stijging van bilirubine (geconjugeerd) wijst op
slechte functionering van de lever of op een obstructie van de galweg [2,15].
5.3 Merkers van het koolhydraat metabolisme
5.3.1 Glucose
Glucose is een monosaccharide, de brandstof die het lichaam voorziet van energie. Glucose
kan wegens zijn grote oplosbaarheid via het bloed naar alle lichaamscellen vervoerd worden.
Het wordt verbruikt door de lichaamscellen of wordt opgeslagen in de lever en spier onder de
vorm van glycogeen, een onoplosbare vorm. De omzetting van glucose in glycogeen
geschiedt onder invloed van het hormoon insuline. De regeling van het bloedglucose vindt
plaats in de hersenen, van waaruit signalen worden doorgegeven aan de lever en de spieren
om glycogeen weer om te zetten in glucose voor verbranding. De omzetting van glycogeen
naar glucose gebeurt onder andere door adrenaline. De absolute glucoseconcentratie heeft
geen rechtstreekse relatie met de eetlust. Een tijdelijke en dynamische daling in bloed glucose
concentratie binnen een korte tijd (5 minuten) is sterk gerelateerd aan de initiatie van een
maaltijd. Het meten van deze daling van bloed glucose binnen een korte tijd is zeer moeilijk
en eerder invasief, vermits het continu gemeten moet worden [19].
13
5.3.2 Insuline
Insuline wordt gemaakt door de β cellen van de pancreas in de eilandjes van Langerhans. Het
wordt gesecreteerd in het bloed wanneer er een kleine verhoging van de glucoseconcentratie
in het bloed optreedt. In gezonde personen, wordt de hoeveelheid glucose in het bloed
gestabiliseerd door enerzijds stimulatie van de glucoseopname door perifere weefsels en
anderzijds het onderdrukken van de hepatische glucose productie. Overproductie van insuline
kan genormaliseerd worden door glucagon. Insuline speelt een centrale rol in het energie-
metabolisme maar is geen specifieke merker voor verzadiging. Insulineresistentie kan
optreden bij leverfalen, een verhoogde hoeveelheid insuline wordt dan waargenomen. De
HOMA index is een klassieke manier om insuline resistentie na te gaan [17,19].
5.4 Inflammatie merkers
De cytokines interleukine-6 (IL-6) en Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) zijn inflammatie
merkers. Cytokines zijn zeer kleine eiwitten die een belangrijke rol spelen in de communicatie
tussen cellen. Ze zijn actief in zeer lage concentraties (nano of pico) en hebben een endocrien
of paracrien effect. De cytokines worden niet in specifieke organen of cellen gestockeerd
zoals de hormonen, maar worden aangemaakt na stimulatie van een cel. Deze aanmaak is snel
en de producerende cel kan de cytokines secreteren in de systemische circulatie of het
intercellulair compartiment. Binding op hun specifieke receptor leidt tot de activatie van een
signalisatiecascade die gentranscriptie kan beïnvloeden en zo de groei, overleving en
differentiatie van verschillende cellen kan bepalen. Deze stoffen kunnen dus functies van
organen moduleren om zo een effect te hebben op een multitude van fysiologische
eigenschappen [22].
TNF-α is een pro-inflammatoir eiwit dat wordt geproduceerd in geactiveerde
adipocyten en door macrofagen die aanwezig zijn in vetweefsel. Door zowel de glucose
transporter GLUT4 als PPARα (peroxisome proliferator- activated receptor alfa) te
onderdrukken en de adiponectine activiteit te inhiberen doet TNF-α de insulineresistentie
stijgen [21]. TNF-α stimuleert niet alleen lipolysis en apoptose, maar zorgt ook voor een
toename in expressie en vrijstelling van inflammatoire adipokines zoals IL-6 en van TNF-α
zelf. Hierdoor onderhoudt het een feedbackmechanisme. Bij een groot aantal ziekten,
waaronder leverziekten, vindt men een overmatige productie van TNF-α [17,18,23].
IL-6 wordt door de meeste genucleëerde cellen aangemaakt nadat deze geprikkeld
worden. De prikkels die leiden tot IL-6 productie zijn celspecifiek. In stress-situaties zullen de
meeste cellen overgaan tot productie van IL
betrokken in de regulatie van de acute fase inflammatoire respons. IL
de activatie van de synthese van de acute fase eiwitten [
De inflammatie merkers worden gekwantificeerd zodat de mate van inflammatie kan
achterhaald worden in de behandelde ratten.
5.5 Sporenelementen
5.5.1 Vitamine A en D en E
Deze vitamines behoren allen tot de vetoplosbare vitamines. Door het bepalen van
vetoplosbare vitamines kan vetmalabsorptie nagegaan worden.
gevorderde leverziekten, in het bijzonder cholestatische leverziekten, ontwikkelen een
deficiëntie aan vetoplosbare vitamines [
Vitamine A (retinol) is een antioxidant.
de vorming van capillairen. D
pigmentlaag van het oog)
mobilisatie van de lever. Een gebrek aan vitamine A veroorzaakt
Figuur 4: De structuur van vitamine A
Vitamine D deficiëntie is het gevolg van malabsorptie, verminderde blootstelling aan
UV licht en onvoldoende inname. 25
evaluatie van de vitamine D reserve in een indivi
van cholecalciferol (op koolstof 25
Figuur 5: De structuur van vitamine D.
14
meeste cellen overgaan tot productie van IL-6. Het is een krachtig pro-inflammatoir cytokine
betrokken in de regulatie van de acute fase inflammatoire respons. IL-6 is vooral gekend voor
these van de acute fase eiwitten [17,22].
De inflammatie merkers worden gekwantificeerd zodat de mate van inflammatie kan
achterhaald worden in de behandelde ratten.
Vitamine A en D en E
Deze vitamines behoren allen tot de vetoplosbare vitamines. Door het bepalen van
vitamines kan vetmalabsorptie nagegaan worden. De meeste patiënten met
gevorderde leverziekten, in het bijzonder cholestatische leverziekten, ontwikkelen een
vitamines [14].
Vitamine A (retinol) is een antioxidant. De werking van vitamine A is essentieel voor
. Deficiëntie treedt op na depletie van de weefselvoorraden
t.g.v. ondervoeding, vetmalabsorptie of een verminderde
mobilisatie van de lever. Een gebrek aan vitamine A veroorzaakt nachtblindheid [
: De structuur van vitamine A
Vitamine D deficiëntie is het gevolg van malabsorptie, verminderde blootstelling aan
UV licht en onvoldoende inname. 25-hydroxyvitamine D is de beste parameter voor de
evaluatie van de vitamine D reserve in een individu. Het wordt gevormd door hydroxylatie
op koolstof 25) in de lever [13,14,24].
: De structuur van vitamine D.
inflammatoir cytokine,
6 is vooral gekend voor
De inflammatie merkers worden gekwantificeerd zodat de mate van inflammatie kan
Deze vitamines behoren allen tot de vetoplosbare vitamines. Door het bepalen van
De meeste patiënten met
gevorderde leverziekten, in het bijzonder cholestatische leverziekten, ontwikkelen een
De werking van vitamine A is essentieel voor
eficiëntie treedt op na depletie van de weefselvoorraden (huid,
alabsorptie of een verminderde
nachtblindheid [13,24].
Vitamine D deficiëntie is het gevolg van malabsorptie, verminderde blootstelling aan
hydroxyvitamine D is de beste parameter voor de
du. Het wordt gevormd door hydroxylatie
Vitamine E is een antioxidant. Het is noodzakelijk voor de vorming van rode
bloedcellen en opbouw en herstel van spier en ander weefsel. Een te kort aan vitamine E kan
voorkomen worden wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen
treden op [24].
Figuur 6: De structuur van vitamine
5.5.2 Zink en koper
Zink (Zn) is een essentieel sporenelement met verschillende biologische effecten zoals
anti-oxyderende, anti-inflammatoire en anti
lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden
albumine [25]. Naast een katalytische en struc
rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaa
eetlust [13]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl
Zn ook noodzakelijk is voor een goede leverfunctie. Een daling van de Zn niveaus wordt
gezien bij leverziekten [14,25].
Koper is ook een sporenelement da
wordt via de gal uitgescheiden. Een opstapeling van koper wordt waargenomen wanneer de
galgang vernauwd wordt (cholestase)
6. Doelstelling
In de laatste 10 jaar zijn er verschillende relevante artikels over
en pathogenese in cirrose gepubliceerd
diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn
onopgelost [14]. Deze studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op
de voedingstoestand van ratten. We trachten aan de hand van verschillende merkers de relatie
tussen malnutritie en PHT bij ratten na
15
Vitamine E is een antioxidant. Het is noodzakelijk voor de vorming van rode
bloedcellen en opbouw en herstel van spier en ander weefsel. Een te kort aan vitamine E kan
wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen
e structuur van vitamine E.
Zink (Zn) is een essentieel sporenelement met verschillende biologische effecten zoals
inflammatoire en anti-apoptotische. Het wordt gevonden in de meeste
lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden
]. Naast een katalytische en structurele rol bij vele enzymen
rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaa
]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl
Zn ook noodzakelijk is voor een goede leverfunctie. Een daling van de Zn niveaus wordt
].
Koper is ook een sporenelement dat essentieel is voor de menselijke gezondheid. Het
wordt via de gal uitgescheiden. Een opstapeling van koper wordt waargenomen wanneer de
(cholestase).
In de laatste 10 jaar zijn er verschillende relevante artikels over de diagnose van malnutritie
en pathogenese in cirrose gepubliceerd. Maar verschillende elementen van pathogenese,
diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn
studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op
de voedingstoestand van ratten. We trachten aan de hand van verschillende merkers de relatie
tussen malnutritie en PHT bij ratten na te gaan.
Vitamine E is een antioxidant. Het is noodzakelijk voor de vorming van rode
bloedcellen en opbouw en herstel van spier en ander weefsel. Een te kort aan vitamine E kan
wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen
Zink (Zn) is een essentieel sporenelement met verschillende biologische effecten zoals
apoptotische. Het wordt gevonden in de meeste
lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden voor, vooral aan
turele rol bij vele enzymen speelt het ook een
rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaak- en
]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl
Zn ook noodzakelijk is voor een goede leverfunctie. Een daling van de Zn niveaus wordt
t essentieel is voor de menselijke gezondheid. Het
wordt via de gal uitgescheiden. Een opstapeling van koper wordt waargenomen wanneer de
de diagnose van malnutritie
. Maar verschillende elementen van pathogenese,
diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn actueel nog altijd
studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op
de voedingstoestand van ratten. We trachten aan de hand van verschillende merkers de relatie
16
MATERIALEN EN METHODEN
1. Proefdieren
De experimenten werden uitgevoerd met mannelijke Wistar ratten (Iffa-Credo, Brussel,
België) van ± 200 gram. De ratten werden in afzonderlijke kooien gehouden onder constante
temperatuur (17-20°C) en vochtigheid (36-44%) in een 12 uren gecontroleerde licht/donker
cyclus om mogelijke invloed van omgevingsfactoren op de voedselinname te vermijden. Het
ethisch comité voor proefdieren van de faculteit Geneeskunde en
Gezondheidswetenschappen, Universiteit Gent, België, keurde het protocol goed. (ECD-
08/19)
1.1 Ratmodellen
1.1.1 Partial portal vein ligation (PPVL) model
Het ratmodel voor een prehepatische portale hypertensie zonder cirrose is PPVL [7]. Deze
chirurgische procedure werd uitgevoerd onder steriele condities. De ratten werden
geanestheseerd door middel van isofluraaninhalatie (Forene®, Abbott NV, Brussel, België).
Een abdominale incisie werd gemaakt ter hoogte van de middenlijn en de vena porta werd
afgezonderd van het omliggende weefsel. Een ligatuur (silk cut 7-0) werd gebonden rond de
portale vene met daarop liggend een 27-gauge poly-ethyleen katheter. Na het verwijderen van
de katheter werd er een gekalibreerde stenose van de vena porta bekomen. Nadien werd de
buikwand gesloten door het dichthechten van de abdominale spier en de huid (silk cut 7-0).
Exsanguinatie van de ratten door bloedafname gebeurde 14 dagen na PPVL-inductie (n=12).
Om het comfort van de ratten te verhogen, werd er postoperatief pijnstilling toegediend:
Temgesic (0.1 ml/kg) intramusculair om de 12 uur gedurende 48 uur. Tevens werd bij het
sluiten van de wonde een lokale infiltratie van Xylocaine gegeven.
In de PPVL-groep is er een mortaliteit van 20% die te wijten is aan een inwendige bloeding,
inherent aan de techniek en meestal optredend de eerste dag na PPVL-inductie. Nadien is er
meestal geen verdere uitval en hebben de dieren een goede algemene toestand.
1.1.2 Controle ratten
Sham geopereerde ratten werden als controlegroep gebruikt. De abdominale holte werd
geopend en de portale vene werd geïsoleerd, maar er werd geen ligatuur aangebracht. De
17
sham-groepen werden op dezelfde manier als de PPVL-groep gedood 4 weken na operatie
(n=10).
1.2 Voeding
Ad libitum standaardvoeding onder de vorm van pellets en standaard vocht (water) werd aan
de ratten gegeven. De ratten werden dagelijks gecontroleerd en twee maal in de week
gewogen. De opgenomen hoeveelheid voedsel/drank werd nagegaan door het voedsel dat
gegeven werd eerst te wegen/meten en bij de volgende weging het overblijvende voedsel
ervan af te trekken.
Figuur 7: Protocol van de standaard voeding.
1.3 Hemodynamische studies
Na 14 dagen is de PHT volledig en moesten de ratten overnacht vasten. De volgende ochtend
werden ze gesacrifieerd. Eerst werden alle ratten gewogen en daarna werden ze
geanestheseerd met isofluraan (Forene®, Abbott NV, Brussel, België). Er werd een
tracheacanule geplaatst voor een open luchtweg.
18
De portale druk, bloeddruk (arteria carotis), hartslag (beat-to-beat variation in de arteria
carotis) werden gemeten in elke rat. Via cannulatie van de ileocolische vene met een 24-gauge
catheter (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, België), die aangesloten werd aan een hoog
sensitieve druktransducer werd de portale druk gemeten. Het externe nul referentie punt werd
aan mid-abdominaal geplaatst. Een tweede catheter werd geplaatst in de arterie carotis voor
bloeddruk en hartslagmeting. De metingen werden geregistreerd op een multikanaal
computer-geconnecteerde recorder (Powerlab, ADInstruments, Spechbach, Duitsland) en
geanalyseerd met Chart5 (ADInstruments).
1.4 Vetmeting
Om een verschil in de grote van de vetcellen te achterhalen werd de perimeter van enkele
vetcellen in het mesenterium, meer bepaald het visceraal peritoneum gemeten bij zowel de
PPVL- als de sham-ratten [16].
2. Anatomie en histologie
2.1 Weefsel afnemen
De lever en milt werden gewogen en weergegeven in g/10g lichaamsgewicht. Fragmenten
(ongeveer 1cm diameter) van de linkse, rechtse en midden leverlob werden na inbedden (cf.
infra) met behulp van een microtoom (Leica Microsystems, Nussloch, Duitsland) gesneden.
Verder werden er ook nog fragmenten van de huid, zowel van de nek als de buik, afgenomen
op een gestandaardiseerde plaats.
2.2 Paraffinecoupes
De leversecties en het mesenterium (visceraal peritoneum) werden gefixeerd in 4% fosfaat
gebufferde formaldehyde oplossing (PFA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) zodat de metabole
activiteiten in het weefsel werden stilgelegd en om weefselschade te voorkomen. Na 24u
werden de stalen gespoeld met gebufferde fysiologische oplossing (PBS) en werden ze
gedehydrateerd in stijgende ethanolbaden (Klinipath NV, Geel, België):
� 1 uur 30 % alcohol
� 1 uur 50 % alcohol
19
� 1 uur 70 % alcohol
� 1 uur 96 % alcohol
� 2 x 1 uur 99 % alcohol
Vervolgens werden de stalen 2 keer 1 uur gespoeld met ultraclear (Klinipath NV, Geel,
België) en werden ze ingebed in paraffine. Dehydratatie van de stalen is noodzakelijk zodat
paraffine (hydrofoob inbedmiddel) voldoende kan inwerken op de stalen.
De paraffineblokjes werden met een microtoom (Leica RM2145, Leica Microsystems AG,
Wetzlar, Duitsland) gesneden zodat weefselcoupes met een dikte van 5 µm ontstaan. Deze
werden overnacht geïncubeerd bij 37°C om vasthechting van de coupe aan het draagglaasje te
versterken.
Hierna werden de coupes 2 keer 5 minuten in ultraclear gebracht om ze te deparaffineren en
nadien in dalende ethanolbaden om de coupes te rehydrateren:
� 2 x 5min 100 % alcohol
� 2 x 5 min 96 % alcohol
� 5 min 70 % alcohol
� 5 min 50 % alcohol
Nadat de coupes 5 minuten in gedestilleerd water hebben gezeten zijn ze klaar om een
kleuring te ondergaan.
2.3 Kleuringen
2.3.1 Haematoxyline-eosine kleuring
Visceraal peritoneum en levercoupes werden ondergedompeld in Mayer haematoxyline
(Klinipath NV, Geel, België). Na 30 seconden in het haematoxyline werden de weefselcoupes
5 minuten gespoeld met stromend leidingwater en daarna nogmaals 5 minuten met
gedestilleerd water totdat het water niet meer verkleurde. Nadien werden de weefselcoupes 5
minuten ondergedompeld in eosine 0,5% (Klinipath NV, Geel, België) en weer 5 minuten
gespoeld moet stromend leidingwater. Vervolgens nogmaals 5 minuten gedestilleerd water
laten overlopen.
20
Figuur 8: Structuurformule van haematoxyline (links) [The Merck Index]en eosine structuur (rechts)
[www.univ-tln.fr].
2.3.2 Sirius red kleuring
De sirius red oplossing bestaat uit 0,1% sirius red (Sirius Red F3B 80115, Klinipath NV,
Geel, België) opgelost in verzadigd picrinezuur (Sigma, St-Louis, Mo, VS). Deze kleuring
werd gebruikt om de graad van fibrose/cirrose te evalueren in het leverweefsel van de
verschillende ratmodellen met behulp van de Metavir-score. Bij deze kleuring kleurt het
cytoplasma geel en het collageen rood.
Na deparaffinering en rehydratatie van de weefselcoupes werden ze gedurende 30 minuten
ondergedompeld in de sirius red oplossing. Daarna werden de coupes gedurende 10 minuten
gespoeld met stromend leidingwater. Vervolgens werd er 2 maal 5 minuten gespoeld met
gedestilleerd water totdat het water niet meer kleurde.
2.4 Dehydratatie en monteren
Na de kleuring werden de preparaten gedehydrateerd in stijgende ethanolbaden:
� 5 min 50% alcohol
� 5 min 70% alcohol
� 5 min 96% alcohol
� 5 min 96% alcohol
� 2 x 5 min 100% alcohol
Vervolgens werden ze 2 keer 5 minuten in ultraclear gebracht en tenslotte 5 minuten in
Mounting clear (Klinipath NV, Geel, België).
21
Om het weefsel te fixeren tussen het draagglas en het dekglaasje werden er enkele druppels
Neutral Mounting Medium (D.P.X., Klinipath, Geel, België) aangebracht op het draagglas.
Vervolgens kon het dekglaasje erop gemonteerd worden en werden luchtbellen zoveel
mogelijk vermeden. Nadien werden de preparaten overnacht gedroogd bij kamertemperatuur.
2.5 Microscopische evaluatie
2.5.1 Evaluatie van de haematoxiline-eosine kleuringen
De haematoxyline-eosine kleuring is een kleuring die standaard toegepast wordt in
histologisch onderzoek, vermits het een beeld geeft van de algemene morfologie van de
stalen. Haematoxyline is een basische kleurstof die bij een lage pH aan de zure of negatief
geladen bestanddelen in het chromatine bindt. Deze kleurstof is een indicator voor de pH en
dit zorgt voor de kleuromslag. Na het kleuren met haematoxyline is spoelen met
kraantjeswater noodzakelijk vermits hierdoor de pH verhoogt tot 7, waardoor de kernen paars-
blauw kleuren. Eosine is een rode kleurstof die bindweefsel en cytoplasma kleurt. Het is een
zure kleurstof die negatieve ladingsgroepen bevat. Eosine kleurt de basische of positieve
geladen bestanddelen in het cytoplasma helder rood. De coupes werden na kleuren onder een
lichtmicroscoop (Olympus BX41, Aartselaar, België) bekeken en met behulp van het
programma D-cell konden foto’s gemaakt worden.
De perimeter van de vetcellen werd bepaald op de coupes van het visceraal peritoneum. In
elke coupe (40x vergroot) werden at random 3 regio’s geselecteerd en in elke regio werd de
afmeting van 10 vetcellen gemeten. Het bepalen van de perimeter gebeurde digitaal met de
lichtmicroscoop (Olympus BX41, Aartselaar, België).
Op de haematoxyline-eosine kleuring van de weefselcoupes werd er gekeken of er
hepatocellulaire schade aanwezig was. Vermits dit enige ervaring vraagt, werd dit door een
patholoog bekeken.
2.5.2 Evaluatie van de sirius red kleuringen
De coupes werden op een blinde manier geëvalueerd met behulp van een lichtmicroscoop
(Olympus BX41, Aartselaar, België) met een 10 tot 100x vergroting. De leversecties werden
vervolgens gescoord met behulp van de Metavir-score (zie figuur 9):
22
� F0 = afwezigheid van fibrose
� F1 = de fibrotische veranderingen blijven meetal beperkt tot de portale velden (portale
fibrose)
� F2 = portale fibrose is aanwezig met vorming van enkele septa
� F3 = portale fibrose met vele septa zonder cirrose (septale fibrose)
� F4 = cirrose
Figuur 9: De evolutie van fibrose van periportale fibrose tot cirrose volgens de Metavir score. [Bedossa P., Hépatites chroniques virales. In : La biopsie hépatique en pathologie non tumorale du foie. Groupe Metavir. Paris France : Elsevier, 2000, p31]
3. Enzym Linked Immuno Sorbent Assay
3.1 Principe
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) is een methode om de concentratie van
macromoleculaire stoffen (zoals eiwitten) te bepalen in een oplossing (zoals bloed). De
ELISA testen worden uitgevoerd om de concentraties van de biochemische merkers te
bepalen zoals: leptine, ghreline, adiponectine, insuline, albumine en IL-6 in serum of lysaten.
23
3.2 Lysaten maken
Weefselstalen van het abdominaal vet en van de lever werden onmiddellijk ingevroren in
vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. De weefselstalen werden gehomogeniseerd in RIPA
(= radio immunoprecipitation assay) buffer, een lyse-buffer. De RIPA-buffer bestaat uit:
� 25 mM Tris; pH8,2; 0,1515g (VWR International, Leuven, België)
� 50 mM NaCl 0,1461g (VWR International, Leuven, België)
� 0,5% NP40 250 µl (FlukaChemieGmbH, Buchs, Zwitserland)
� 0,5% deoxycholaat 250µl (Sigma, St-Louis, MO, VS)
� 0,1% SDS 250 µl (Bio-rad Laboratories S.A.-N.V., Nazareth Eke, België)
� mini EDTA-free protease tablet 20µl/ml (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg,
Duitsland)
� β-glycerofosfaat 0,055g/ml (Sigma, St-Louis, MO,VS)
� DTT 1µl/ml (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Duitsland)
� standard fosfatase inhibitor cocktail 20µl/ml (Sigma, St-Louis, MO, VS)
3.3 Proteïnebepaling
De proteïnebepaling wordt uitgevoerd om de hoeveelheid eiwit in het lysaat te bepalen. Dit
werd na het uitvoeren van een ELISA in rekening gebracht, zodat de concentratie van het te
bepalen eiwit kan bepaald worden ten opzichte van de totale hoeveelheid eiwit in het lysaat.
De eiwitconcentratie werd gemeten via een colorimetrische analyse (Bio-Rad DC Proteïn
Assay, Bio-Rad, Nazareth Eke, België). De proteïnebepaling werd als volgt uitgevoerd:
� standaardreeks: BSA opgelost in RIPA buffer.
� 5µl eiwitstaal pipetteren in microtiterplaat (NuclonTM Surface, Nunc A/S, Roskilde,
Denemarken)
� 25µl reagens A’ toevoegen
Dit reagens A’ bestaat uit 20µl reagens S (Bio-Rad DC Protein Assay Reagens A, Bio-
Rad Laboratories, Nazareth Eke, België) per ml reagens A (Bio-Rad DC Protein assay
24
Reagens A, Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, België). Reagens S is nodig om
detergent te neutraliseren en reagens A is een alkaline koper tartraat oplossing. Het eiwit
in het lysaat vormt samen met reagens A’ een koperreactie.
� 200µl reagens B toevoegen (Bio-Rad DC Protein Assay Reagens B, Bio-Rad
Laboratories, Nazareth Eke, België)
Reagens B is een verdund foline reagens, dit reagens zal reduceren door het koper-eiwit
complex wat leidt tot een blauwe kleurontwikkeling met een maximale absorbantie bij
750nm.
Elk eiwitstaat werd in duplo uitgevoerd. Na het volgen van het bovenstaande protocol werd de
microtiterplaat in een microplaatlezer geplaatst die de absorbantie leest bij 750nm. Aan de
hand van deze resultaten werd er met behulp van de standaardreeks formule berekend hoeveel
mg eiwit aanwezig is per ml lysaat.
3.4 Protocol van een kwantitatieve sandwich ELISA
Voor de bepaling van leptine (Mouse leptin immunoassay, Quantikine), adiponectine
(adiponectin (rat, Mouse) ELISA Kit Protocol, Phoenix Pharmaceuticals, Inc), albumine (rat
albumine ELISA kit, BioVendor), insuline (rat insulin ELISA kit, crystal chem inc.), TNF- α
(rat TNF-α/TNFSF1A immunoassay, Quantikine) en IL-6 (rat Il-6, Quantikine) werd een
kwantitatieve sandwich enzym immunoassay gebruikt. Het principe van deze ELISA testen
zijn overal hetzelfde.
De microtiterplaat, geleverd bij de ELISA kit, is gecoat met een monoclonaal of polyclonaal
antilichaam aanwezig tegen een specifiek eiwit. Hierop werden de standaarden en de al dan
niet verdunde stalen aangebracht. De aangebrachte antigenen zullen binden met de aanwezige
antilichamen in de wellen van de microtiterplaat. Vervolgens werd de microtiterplaat
gewassen om de ongebonden antigenen te verwijderen. Nadien werd er een enzym-gelinkt-
antilichaam toegevoegd, ook nu werd er na een bepaalde wachttijd gewassen om het
ongebonden antilichaam te verwijderen. Vervolgens werd er een substraat oplossing
toegevoegd die een blauwe kleur gaf aan de wellen afhankelijk van de hoeveelheid
antilichaam-antigeen-antilichaam complex. Daarna werd er een stopoplossing toegevoegd,
waardoor de reactie in stopt en de blauwe kleur omsloeg in een gele kleur. Binnen de 30
minuten moet de optische densiteit van elke well gemeten worden. Het aflezen gebeurde door
de microtiterplaat in de microtiterplaatlezer te plaatsen die ingesteld was op de aangegeven
25
absorbantie zoals vermeld in het protocol van de ELISA. Vermits de kleurintensiteit
evenredig is met de hoeveelheid eiwit, kan bepaald worden wat de concentratie van het staal
is. Met behulp van de standaardoplossing, die gekende concentraties bevat van het
desbetreffende eiwit, konden de ongekende concentraties van het eiwit nagegaan worden door
extrapolatie van de gevonden waarden in de standaardcurve.
Figuur 10: Het principe van een kwantitatieve ELISA
3.5 Protocol van een competitieve ELISA
Voor de bepaling van ghreline werd een competitieve enzym immunoassay gebruikt (enzyme
immunoassay kit, Phoenix Pharmaceuticals,Inc.) vermits er geen kwantitatieve sandwich
ELISA voor bestaat. De microtiterplaat bevat een secundair antilichaam en de niet specifieke
bindingssites zijn geblokkeerd. Het secundaire antilichaam kan binden met de Fc fragmenten
van het primaire antilichaam (peptide antilichaam). Vervolgens werd zowel een gekende
hoeveelheid antigenen toegevoegd via het gebiotinileerde peptide als een onbekende (nog te
bepalen) hoeveelheid antigenen via de standaard/staal. De gebiotinileerde antigenen en
antigenen uit de standaard/staal concurreren om te binden aan het antilichaam. Na instellen
van het evenwicht werden de niet gebonden antigenen weggewassen. Nadien werd het
streptavadine horse-radish peroxidase (SA-HRP) toegevoegd. De gebiotinileerde peptiden
interageren met SA-HRP wat het substraat katalyseert, een kleur omslag van blauw naar geel
was waar te nemen in de wellen. Vervolgens werd er een stopoplossing toegevoegd, waardoor
de reactie in de wellen werd beëindigd. De intensiteit van de bekomen gele kleur was
proportioneel met de hoeveelheid gebiotinileerd peptide-SA-HRP complex maar omgekeerd
evenredig met de hoeveelheid peptide in de standaard en de stalen. Hoe minder kleuring, hoe
26
minder conjugaat er gevonden werd en dus hoe meer antilichaam aanwezig was in de stalen
en de standaard.
Figuur 11: Het principe van een competitieve ELISA
Net zoals bij de sandwich ELISA wordt ook hier een standaardcurve van de gekende
concentraties gemaakt, het verschil met de sandwich ELISA is wel dat bij een competitieve
ELISA de curve een omgekeerd sigmoïdale vorm heeft in plaats van een rechte. De
ongekende concentraties van de stalen konden achterhaald worden door extrapolatie van de
resultaten naar de standaardcurve.
4. Statistiek De gegevens werden statistisch verwerkt in SPSS. Om het verschil tussen de sham- en de
PPVL-groep weer te geven werd gebruik gemaakt van een Mann-Whitney-U-test. Deze test
wordt gebruikt bij niet normaal verdeelde waarden. Een p-waarde kleiner dan 0,05 wordt als
statistisch significant beschouwd. Een p- waarde tussen de 0,05 en 0,1 wordt beschouwd als
een trend.
Secundair antibody
(microtiterplaat) +
primair antibody
27
RESULTATEN
1. Ratmodellen
Een PPVL-model voor geïsoleerde PHT werd twee weken na operatie onderzocht. Sham
geopereerde ratten, als controleratten voor het PPVL-model, werden vier weken na operatie
onderzocht. Dit gebeurde aan de hand van hemodynamische studies, haematoxyline-eosine
kleuring en sirius red kleuring van de lever, macroscopische observaties en gewichten van de
lever en de milt en de dieren.
1.1 Hemodynamische metingen
De hemodynamische metingen werden uitgevoerd op de PPVL-ratten, 14 dagen na operatie.
Slecht 9 van de 12 PPVL-ratten hebben deze periode overleefd. Kort na de operatie stierven 3
ratten omwille van darmnecrose ten gevolge van de ligatie. Bij 2 ratten zijn de
hemodynamische metingen mislukt omwille van bloedingen, hierdoor hebben we slechts
resultaten van 7 PPVL-ratten. De sham-ratten, die 4 weken na operatie gedood werden, zijn
niet gemeten. We gaan ervan uit dat deze de normale waarden benaderen [2]. Bij de
hemodynamische metingen werd de arteriële bloeddruk (ABD), de portale veneuze druk
(PVP) en de hartslag gemeten.
Tabel 2: Hemodynamische metingen in de PPVL-ratten.
PPVL PVP (mmHg) ABD (mmHg) hartslag
(slagen/min)
Rat 1 6,36 57,86 540
Rat 2 18,40 100,90 700
Rat 3 12,25 92,43 740
Rat 4 11,95 82,07 620
Rat 5 11,60 70,70 650
Rat 6 9,02 79,43 580
Rat 7 11,63 106,80 640
gemiddelde 11,9 ± 3,78 84,31 ± 17,13 639 ± 67,93
28
Door het meten van de PVP konden we nagaan of de ratten wel degelijk PHT hadden. Er is
sprake van PHT wanneer de PVP de normale druk van 5 mmHg overschrijdt [11]. Uit de
resultaten van de metingen van de PVP zien we dat alle ratten een PVP boven de 5 mmHg
hebben.
De ABD bij sham geopereerde ratten ligt normaal rond de 100 mmHg [26]. Doordat bij de
ratten met PHT een hyperdynamische situatie aanwezig is, daalt de ABD. De gemiddelde
ABD in de PPVL-groep is 84,31 ± 17,13mmHg wat dus lager ligt dan de normale verwachte
ABD.
De hartslag van kleine zoogdieren is normaal tussen de 300-500 slagen per minuut. Vermits
de rat een klein zoogdier is zou de sham-groep een hartslag moeten hebben dat tussen 300-
500 slagen per minuut ligt [26]. Wanneer de ratten PHT hebben blijkt de hartslag te stijgen.
De gemiddelde hartslag van de ratten met PHT is 639 ± 67,93 slagen per minuut.
1.2 Haematoxiline-eosine kleuring
De haematoxiline-eosine kleuringen van de leversecties werden door een patholoog (L.L.)
bekeken. Op de levercoupes is er sporadisch infiltratie van inflammatoire cellen te zien rond
de galwegen. Op de levercoupes werd er geen hepatocellulaire schade opgemerkt .
1.3 Sirius red kleuring
(Semi-) kwantitatieve analyse van de hoeveelheid fibrose gebeurt door middel van picro sirius
red kleuring [11]. Bij de PPVL-levercoupes merken we rond de portale velden enkele septa
(F1 Metavir-score), (figuur 12). Bij de sham-groep was er geen fibrose aanwezig (F0 Metavir-
score), (figuur 13).
29
Figuur 12: Sirius red kleuring op leverweefsel van een PPVL-rat ( vergroting 10x). De pijltjes wijzen op fibrotische veranderingen rond de portale velden (F1 Metavir-score).
Figuur 13: Sirius red kleuring op leverweefsel van een sham-rat (vergroting 40x). De pijltjes duiden aan dat er geen fibrose aanwezig is (F0 Metavir-score).
30
1.4 Macroscopische observaties
Zowel het gewicht van de lever als van de milt werd uitgezet ten opzichte van het eindgewicht
van de rat [11]. De resultaten hiervan worden weergegeven aan de hand van de grafieken in
figuur 14.
Figuur 14: Resultaten lever en milt gewicht.
Uit bovenstaande grafiek is er geen toename in levervolume te merken bij de PPVL-ratten ten
opzichte van de sham-ratten. De PPVL-ratten hadden wel een grotere milt in vergelijking met
de sham-ratten (p<0,05).
2. Malnutritie
2.1 Gewicht
Twee maal in de week werd het gewicht van de PPVL- en sham-ratten gewogen. In figuur 15
ziet u het gewichtsverloop van de PPVL- en sham-ratten over het verloop van twee weken
heen. Het gewicht van de PPVL-ratten blijft de eerste week constant, de tweede week is er
een lichte toename van het gewicht. Het gewicht van de sham-ratten neemt al toe de eerste
week en kent een grotere gewichtstoename de tweede week. We merken dus een verschil in
gewicht tussen de PPVL- en sham-groep. Zowel na 1 als na 2 weken is er een significant
daling in gewicht tussen de sham- en PPVL-groep (p = 0,001). Wanneer het verschil in begin
gewicht in rekening wordt gebracht, blijft er een significante daling (p = 0,001) in gewicht
tussen de sham- en PPVL-groep.
2,61 2,56
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
% to
egen
omen
tov
eind
gew
.
lever gewicht
Sham PPVL
p = 0,923
0,18
0,33
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
% to
egen
omen
tov
eind
gew
.
milt gewicht
Sham PPVL
p = 0,001
31
In figuur 16 wordt een significante daling (p = 0,009) in gewicht tussen de PPVL- en sham-
groep opgemerkt wanneer geen rekening gehouden wordt met het gewicht van de lever en
milt. Wanneer het gewicht van de lever en milt wel in rekening wordt gebracht (eindgewicht -
lever - milt) – (begingewicht - gemiddelde leversham - gemiddelde miltsham) zien we geen
significante daling maar wel een trend (0,1 > p > 0,05 ). Het gewicht van de PPVL-groep
zonder rekening te houden met lever en milt is lager dan bij de sham-groep.
Figuur 15: Het gewichtverloop van de PPVL- en sham-ratten gedurende twee weken vanaf dag 0. (W = week, D = dag)
Figuur 16: Het toegenomen gewicht bij de PPVL- en sham-groep na 2 twee weken. Links: Het toegenomen gewicht in % ten opzichte van het begingewicht zowel van de PPVL- als de sham-ratten. Rechts: Het gewicht van de PPVL- en sham-ratten zonder het gewicht van de lever en milt mee te wegen, uitgedrukt in gram.
200,67 200,22 201,67211,67
221,11
221,00225,25
244,88262,13
278,25
0
50
100
150
200
250
300
W1D1 W1D4 W2D1 W2D4 W3D1
gew
icht
(gr
am)
tijdsverloop gewicht (2 weken)
PPVL
shamp = 0,001p = 0,001 p = 0,001p = 0,001 p = 0,002
26,00 10,35
-10
0
10
20
30
40
toeg
enom
en g
ewic
ht (
%)
% toegenomen gewicht na 2 weken tov dag 0
Sham PPVL
p = 0,009
41,13
22,74
-505
101520253035404550
gew
icht
(gr
am)
gewicht zonder lever en milt
Sham PPVL
p = 0.083
32
2.2 Voeding en drank
De hoeveelheid opgenomen voeding en drank werd elke week twee maal gecontroleerd,
zowel voor de PPVL- als de sham-ratten. Onderstaande grafieken geven de resultaten van de
gemiddelde hoeveelheid opgenomen voeding en drank weer bij de PPVL- en de sham-ratten
(figuur 17). Zowel voor de voeding als de drank zien we een significante daling (p = 0,001) in
de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep.
Figuur 17: De totale hoeveelheid voeding en water opgenomen door de PPVL- en sham-ratten in twee weken tijd.
2.3 Vetmeting
Vetmeting werd uitgevoerd op HE gekleurde coupes van het visceraal peritoneum. Door de
perimeter van vetcellen te meten in het visceraal peritoneum van zowel PPVL- als sham-
ratten, konden we nagaan of er verschil was in de vetlaag tussen de 2 groepen[16]. Figuur 18
toont hoe het visceraal peritoneum is opgebouwd en hoe de perimeter van de vetcellen werd
bepaald. Figuur 19 geeft de resultaten van de perimeter van de PPVL- en sham-ratten. Er is
geen significant verschil (p > 0,05) te merken tussen de perimeter van de vetcellen van de
PPVL- en sham-groep.
342,75
213,350
100
200
300
400
500
gem
opg
enom
en
hoev
eelh
eid
voed
ing
(gra
m) totale hoeveelheid
opgenomen voeding na 2 weken
Sham PPVL
p = 0,001
450,00
338,89
0
100
200
300
400
500
600
opge
nom
en h
oeve
elhe
id
dran
k (m
L)
totale hoeveelheid opgenomen water na 2
weken
Sham PPVL
p = 0,001
33
.
Figuur 18: Visceraal peritoneum. Links boven: 10x vergroot, rechts boven: 20x vergroot, links onder: De vetlaag in het visceraal peritoneum. De manier waarop de perimeter van de vetcellen gemeten werd.
Figuur 19: De resultaten van de vetcel perimeter bij de PPVL- en sham-ratten.
150,72 122,48
0
50
100
150
200
perim
eter
(µ
m)
perimeter
Sham PPVL
p = 0,248
submucosa mucosa musculari
mucosa (epitheel)
34
3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
3.1 Leptine
De resultaten van de leptine ELISA test staan hieronder weergegeven in de grafieken van
figuur 20. De hoeveelheid leptine werd zowel op serum als op vetlysaat getest.
Zowel in het serum als in het vetlysaat is er een daling van de hoeveelheid leptine in de
PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep, maar deze daling is bij beide groepen niet
significant verschillend (p > 0,05).
Figuur 20: Leptine ELISA in serum (links) en vetlysaat (rechts) van PPVL- en sham-ratten.
3.2 Adiponectine
Net zoals bij leptine wordt ook bij adiponectine de concentratie in zowel serum als vetlysaat
nagegaan. De grafieken met de resultaten van de adiponectine ELISA test worden
weergegeven in figuur 21.
De hoeveelheid adiponectine in zowel het serum als het vetlysaat van de PPVL-ratten blijft
ongeveer hetzelfde als de hoeveelheid adiponectine in het serum en vetlysaat van de sham-
ratten. Er is geen significant verschil tussen de PPVL- en de sham-groep (p > 0,05).
338,24242,55
0
100
200
300
400
500
gem
idde
lde
lept
ine
(ng/
mL)
leptine serum
sham PPVL
p = 0,201
182,20 98,020
50
100
150
200
250
300
350
gem
idde
lde
lept
ine
(ng/
mg)
leptine/totaal eiwit in vetlysaat
sham PPVL
p = 0,234
35
Figuur 21: Adiponectine ELISA in serum en vetlysaat bij PPVL- en sham-ratten.
3.3 Ghreline
De resultaten van serum ghreline worden weergegeven in figuur 22. Er is geen significant
verschil (p > 0,05) op te merken tussen de ghreline waarden van de sham-groep en de PPVL-
groep.
Figuur 22: Ghreline ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.
3.4 Albumine
De grafiek met de resultaten van de albumineconcentratie in serum wordt in figuur 23
weergegeven. Er is een significante daling (p = 0,02) van de hoeveelheid albumine in serum
bij de PPVL ten opzichte van de hoeveelheid albumine in het serum bij de sham-groep.
2.917,37
3.761,29
0
1000
2000
3000
4000
5000
geem
idde
lde
adip
onec
tine
(ng/
mL)
serum adiponectine
sham PPVL
p = 0,251
134,77 92,83
0
50
100
150
200
250
gem
idde
lde
adip
onec
tine
(ng/
mg)
adiponectine/totaal eiwit in vetlysaat
Sham PPVL
p = 0,251
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
gem
idde
lde
ghre
line
(ng/
mL)
serum ghreline
Sham PPVL
p = 0,293
36
Figuur 23: Albumine ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.
3.5 Insuline
De concentratie van insuline in serum wordt weergegeven in figuur 24. De serumconcentratie
van insuline in de PPVL-groep is gelijk als in de sham-groep. Er is dus geen significant
verschil tussen beide groepen (p > 0,05).
Figuur 24: Insuline ELISA test in serum bij PPVL- en sham-ratten.
3.6 Inflammatie merkers
De resultaten van de hoeveelheid inflammatie bij de PPVL- en sham-ratten worden
weergegeven in figuur 25. Zowel TNF-α als IL-6 zijn verhoogd in de PPVL-groep in
vergelijking met de sham-groep. Bij IL-6 zien we een significante stijging (p < 0,001) in de
PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. De stijging van TNF-α bij de PPVL-groep is
38,58 33,01
0
10
20
30
40
50ge
mid
deld
e al
bum
ine
(g/L
)albumine
sham PPVL
p = 0,02
569,00 565,00
0
200
400
600
800
1000
1200
gem
idde
lde
insu
line
(ng/
mL)
insuline
Sham PPVL
p = 1,00
37
niet significant verschillend van de sham-groep (p > 0,05), maar is wel een trend te zien ( 0,05
< p < 0,1) wat wijst op een relevante stijging van de TNF-α bij PPVL-ratten.
Figuur 25: TNF-α en IL- 6 ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.
4. Resultaten uit het routinelabo
4.1 Aminotransferasen
De grafieken met de resultaten van AST en ALT in serum worden weergegeven in figuur 26.
Zowel AST als AST zijn significant gestegen in vergelijking met de sham-groep
(respectievelijk p = 0,001 en p = 0,006).
-
Figuur 26: Resultaten van AST en ALT in serum bij PPVL- en sham-ratten.
0,27
4,84
-10
-5
0
5
10
15
20
gem
idde
lde
TN
F-α
(pg/
mL)
serum TNF-α
Sham PPVL
p =0,097
3,77
43,26
-20
-10
0
10
20
30
40
50
gem
idde
lde
IL-6
(pg
/mL)
serum IL-6
Sham PPVL
p = 0,000
44,80119,38
0
50
100
150
200
gem
idde
lde
AS
T (
U/L
) AST
sham ppvl
p =0,001
28,09 72,80
0
20
40
60
80
100
120
140
gem
idde
lde
ALT
(U
/L)
ALT
sham ppvl
p = 0,006
38
4.2 Glucose
De concentratie van glucose in serum wordt weergegeven in figuur 27. De serumconcentratie
van glucose in de PPVL-groep is ongeveer gelijk als in de sham-groep. Er is dus geen
significant verschil tussen beide groepen (p > 0,05).
Figuur 27: Insuline ELISA test in serum bij PPVL- en sham-ratten.
4.3 Metalen
De grafieken met de resultaten van de serumconcentraties worden weergegeven in figuur 28.
Als we de concentratie van de metalen van de PPVL-groep vergelijken met de sham-groep
zijn er geen significante verschillen (p > 0,05). De concentraties van de metalen zijn dus niet
significant veranderd bij de PPVL-groep.
Figuur 28: Resultaten van serum zink en koper bij PPVL- en sham-ratten
1,55 1,49
0
0,5
1
1,5
2
2,5
gem
idde
lde
gluc
ose
(g/L
)
glucose
sham ppvl
p = 1,00
111,45 118,75
020406080
100120140
gem
idde
lde
zink
(µ
g/dL
)
zink
sham ppvl
p = 0,439
111,66 111,15
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
gem
idde
lde
kope
r(µ
g/dL
)
koper
sham ppvl
p = 0,796
39
4.4 Bilirubine
De hoeveelheid totaal bilirubine in het serum wordt weergegeven in figuur 29. Wanneer de
PPVL-groep wordt vergeleken met de sham-groep zien we een stijging van de hoeveelheid
bilirubine in de PPVL-groep, maar deze is echter niet significant (p > 0,05) [12].
Figuur 29: Resultaten van serum bilirubine bij PPVL- en sham-ratten.
4.5 Vitamines
Enkele vetoplosbare vitamines werden gemeten om vetmalabsorptie na te gaan. De resultaten
van deze testen worden hieronder in figuur 30 weergegeven. Zowel vitamine A als D vertonen
geen significant verschil in de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. Vitamine E
daarentegen kent wel een significante stijging (p = 0,008) in de PPVL-groep in vergelijking
met de sham-groep.
0,05 0,100
0,05
0,1
0,15
0,2
gem
idde
lde
bilir
ubin
e (m
g/dL
)
bilirubine
sham ppvl
p = 0,109
36,72 29,52
0
10
20
30
40
50
gem
idde
lde
vit A
(µ
g/dL
)
vitamine A
sham ppvl
p = 0,306
23,47 27,91
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
gem
idde
lde
vit D
(ng/
dL)
vitamine D
sham ppvl
p = 0,175
40
Figuur 30: De resultaten van vitamine A, D en E in serum van PPVL- en sham-ratten.
5. Insulineresistentie
Aan de hand van de HOMA index kan nagegaan worden of er insulineresistent aanwezig is.
Wanneer de waarde van de HOMA index boven de 1 ligt is er sprake van insulineresistentie.
De formule van de HOMA index is: HOMA = �������� ������ ������� ��������
���������������� waarbij de
normalisatiefactor glucose x insuline voorstelt van een niet insulineresistente populatie. De
sham-ratten vertegenwoordigen de niet insulineresistente populatie. Hierdoor kan er geen
HOMA index van de sham-ratten berekend worden [17]. De HOMA index van de PPVL-
ratten is 0,94 ± 0,72. Hieruit kan besloten worden dat de PPVL-ratten niet insulineresistent
zijn.
6. Samenvattende tabel
Tabel 3: Een samenvatting van alle resultaten met de p-waarde en significantie.
sham PPVL p-waarde significant
PVP (mmHg) 5 11,9 ± 3,78 ↑
ABD (mmHg) 100 84,31 ± 17,13 ↓
hartslag (slagen/min) 260-600 639 ± 67,93 ↑
ALT (U/L) 28,09 ± 8,43 72,80 ± 49,93 0,006 ↑
AST (U/L) 44,80 ± 6,67 119,38 ± 63,73 0,001 ↑
Bilirubine (mg/dL) 0,05 ± 0,03 0,10 ± 0,05 0,109 niet
Albumine (g/L) 38,58 ± 0,56 33,01 ± 2,08 0,020 ↓
Vitamine A (µg/dL) 36,72 ± 4,97 29,52 ± 10,60 0,306 niet
0,51
0,78
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
gem
idde
lde
vit E
(µ
g/dL
)vit E
sham ppvl
p = 0,008
41
Vitamine D (ng/dL) 23,47 ± 4,24 27,91 ± 6,03 0,175 niet
Vitamine E (µg/dL) 0,51 ± 0,130 0,78 ± 0,19 0,008 ↑
Zink (µg/dL) 111,45 ± 8,54 118,75 ± 14,10 0,439 niet
Koper (µg/dL) 111,66 ± 13,9 111,20 ± 25,60 0,796 niet
Glucose (g/L) 1,55 ± 0,4 1,49 ± 0,24 1,000 niet
Insuline (ng/mL) 569,00 ± 406,35 565,00 ± 395,24 1,000 niet
IL6 (pg/mL) 3,77 ± 5,46 43,26 ± 17,05 0,000 ↑
TNFα (pg/mL) 0,27 ± 0,42 4,84 ± 9,90 0,097 ↑
Leptine serum (ng/mL) 338,24 ± 109,30 242,55 ± 93,15 0,201 niet
Leptine vet (ng/mg) 182,20 ± 146,44 98,02 ± 20,45 0,234 niet
Adiponectine serum (ng/mL) 2917,37 ± 1570,38 3761,29 ± 753,46 0,251 niet
Adiponectine vet (ng/mg) 134,77 ± 73,13 92,83 ± 44,33 0,251 niet
Ghreline serum (ng/mL) 2,34 ± 0,97 2,86 ± 1,28 0,293 niet
Toegenomen gewicht eind-begin (%) 26,00 ± 4,58 10,35 ± 12,21 0,001 ↓
Voeding eind-begin (gram) 342,75 ± 21,69 213,35 ± 47,26 0,001 ↓
Drank eind-begin (mL) 450,00 ±35,56 338,89 ± 71,32 0,001 ↓
Gewicht zonder lever en milt (gram) 41,13 ± 6,02 22,74 ± 22,71 0,083 niet
Vetcelomtrek (µm) 150,72 ± 25,13 122,48 ± 27,06 0,248 niet
Milt (%) 0,18 ± 0,028 0,33 ± 0,08 0,001 ↑
Lever (%) 2,61 ± 0,118 2,56 ± 0,37 0,923 niet Metavir score F0 F1
HOMA-index 0,94 ± 0,72
42
DISCUSSIE
1. Bespreking Het gewicht, de opgenomen hoeveelheid voeding en drank, de perimeter van de vetcellen,
interleukines, sporenelementen, hormonen, merkers voor leverschade en van het koolhydraat
mechanisme werden onderzocht om na te gaan of PHT een invloed heeft op de voeding van
ratten. Op deze manier trachten we te achterhalen of er een relatie is tussen PHT en de
voedingtoestand van de ratten. Twee groepen ratten werden getest, namelijk ratten met PHT
en sham geopereerde ratten als controlegroep.
Een belangrijke opmerking die moet gemaakt worden is dat de sham-ratten pas na 4 weken
gesacrificeerd werden terwijl dit bij de PPVL-groep al na twee weken gebeurde. We zijn ons
ervan bewust dat deze condities niet optimaal zijn. Het is vooral uit ethische reden dat de
sham-ratten 2 weken langer geleefd hebben dan de PPVL-ratten. De sham-groep heeft als
controle gediend voor zowel mijn thesis als voor de thesis van een medestudente, Nathalie
Michels. De thesis van Nathalie ging over hetzelfde onderwerp als mijn thesis, maar in plaats
van PPVL-ratten gebruikte Nathalie CBDL-ratten die 4 weken moesten overleven om
levercirrose te bekomen. Doordat de parameters van sham-ratten normaal gezien constant
blijven over de tijd, werd aangenomen dat de sham-groep ook als controle voor de PPVL-
ratten kon gebruikt worden [26].
De PPVL-techniek wordt veel gebruikt om een diermodel met geïsoleerde PHT zonder cirrose
te ontwikkelen. Het PPVL-model ontstaat door stenose van de vena porta, waardoor
prehepatische PHT ontstaat. Hemodynamische metingen werden uitgevoerd in de PPVL-rat
14 dagen na inductie, een periode met splanchnische vasodilatie, hyperdynamische circulatie
en portale systemische collateralen.
De normale PVP bedraagt ongeveer 5 mmHg. PHT treedt op vanaf 10 mmHg, complicaties
bij 12 mmHg of meer [11]. De PVP is significant hoger in de PPVL-groep ten opzichte van de
controlegroep. In een recent artikel werd aangetoond dat na de PPVL-operatie er een
progressieve toename van de PVP optreedt gedurende de eerste week en dat nadien een
plateau wordt bereikt [11,12]. De plateaufase die bereikt werd is het gevolg van de portale-
systemische collaterale vaten die ontstaan [12]. Doordat de weerstand in de portale vene is
toegenomen, ontstaat er een grotere bloedpool in het splanchnisch systeem, waardoor hier een
veel hogere druk ontstaat. Als gevolg hiervan zal het circulerend systemische bloed dalen wat
43
resulteert in een gedaalde bloeddruk. De baroreceptoren van de carotis nemen deze lagere
bloeddruk waar waardoor de hartslag en bijgevolg het hartdebiet zal stijgen. Dit resulteert in
een hyperdynamische circulatie. Ondanks deze stijging in het hartdebiet blijft de gemiddelde
arteriële bloeddruk lager dan normaal. Samengevat: gemiddelde arteriële bloeddruk ↓ = totale
perifere weerstand ↓↓ x hartdebiet ↑
Zowel de lever als het mesenterium (visceraal peritoneum) werden gekleurd met
haematoxyline-eosine (HE) kleuring.
Deze kleuring werd bij de lever gedaan om na te gaan of er geen hepatocellulaire
schade aanwezig was waardoor de parameters beïnvloed konden worden. Na histologische
analyse door een patholoog was er geen schade te zien op de leversecties.
Aan de hand van een sirius red kleuring van de lever konden we zien dat sham-ratten
(F0 Metavir-score) geen fibrose ontwikkelen. De PPVL-ratten (F1 Metavir-score)
ontwikkelden discrete portale fibrose. PPVL-ratten zouden normaal geen fibrose mogen
ontwikkelen omdat PPVL een model is voor geïsoleerde PHT zonder leverdysfunctie.
Pathologisch onderzoek toonde een beperkte infiltratie van inflammatoire cellen rond de
galwegen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat tijdens de inductie de arteria hepatica licht
werd geraakt (niet afgebonden) waardoor dit finaal een biliaire reactie zou kunnen teweeg
brengen. Door de aanwezigheid van milde portale fibrose in de PPVL-ratten is het mogelijk
dat deze fibrose een bijdrage levert aan bepaalde biochemische testen zoals koper, AST en
ALT en vitamines; in de PPVL-ratten.
In het visceraal peritoneum werd de perimeter van de vetcellen bepaald bij zowel de
PPVL- als de sham-ratten. Er bleek geen significant verschil te zijn in de perimeter van de
vetcellen bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Dit zegt enkel dat de grootte
van de vetcellen ongeveer gelijk zijn en zegt niets over de totale hoeveelheid vetcellen die
aanwezig zijn. Om de hoeveelheid vet in de ratten te bepalen zijn verschillende methodes
uitgetest zoals het meten van de huidplooidikte, de dikte van de panniculus adiposus, maar
geen van beide bleken geschikt om in de praktijk toe te passen. De betrouwbaarheid van de
perimeter metingen zijn echter ook niet 100 procent. De keuze van de vetcellen waarvan de
perimeter bepaald werd gebeurde at random maar het was soms zeer moeilijk om de vetcellen
van elkaar te onderscheiden.
Om na te gaan of PHT een invloed heeft op de voedingstoestand van de ratten werd de
hoeveelheid eten en drinken gemeten die de PPVL- en sham-ratten hadden opgenomen.
Vermits de PPVL-ratten significant minder gegeten en gedronken hadden is ook hun gewicht
44
significant afgenomen in vergelijking met de sham-ratten. De eetlust van de PPVL-ratten was
dus kleiner dan van de sham-ratten.
Er was geen significant verschil tussen de PPVL- en sham-groep wat betreft het levergewicht.
Bij de PPVL-ratten zou de lever geen cirrose mogen ontwikkelen en dus geen stijging in
levergewicht mogen veroorzaken.
Het gewicht van de milt is wel significant toegenomen in de PPVL-groep in vergelijking met
de sham-groep. In het artikel van Fernandez et al is bewezen dat bij PHT de grootte van de
milt parallel loopt met een verhoogde portale druk [12]. De verklaring hiervoor is dat door
stijging van de portale druk er stuwing in de milt bloedvaten ontstaat waardoor het gewicht
van de milt zal toenemen.
2. Biochemische merkers Leptine, ghreline en adiponectine zijn 3 hormonen die betrokken zijn bij de regeling van het
energiemetabolisme en dus aan de oorzaak kunnen liggen van malnutritie.
Zowel in het serum als het vetlysaat is er een daling van de hoeveelheid leptine bij de
PPVL-groep. Deze daling is echter niet significant verschillend van de sham-groep. Dit kan
veroorzaakt worden door enerzijds een daling van het totale vetgehalte in PPVL- versus
sham-ratten of anderzijds een daling van de metabole activiteit van elke vetcel. De eerste
mogelijkheid werd niet onderzocht en dit zou in de toekomst belangrijk zijn om te bestuderen.
Wanneer de hoeveelheid leptine, geproduceerd door de vetcellen, in relatie gebracht wordt
met de grootte van de vetcellen kan de metabolische activiteit van elke vetcel achterhaald
worden. Vermits de perimeter van de PPVL-vetcellen kleiner is dan deze van de sham-
vetcellen, kan gesteld worden dat er bij een bepaalde concentratie meer (maar kleinere)
vetcellen aanwezig zijn bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Doordat er
meer vetcellen zijn maar een kleiner productie van leptine bekomen wordt, zal de metabole
activiteit per vetcel lager zijn bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Deze
gedaalde activiteit zou normaliter moeten resulteren in een verhoogde voedingsopname, maar
dit komt niet overeen met onze resultaten over de opgenomen voeding. Mogelijks zijn er
andere factoren die een sterkere invloed hebben op de eetlust. Er kan niet worden gesproken
van leptineresistentie (ongevoeligheid van de leptinereceptor voor leptine) vermits de
leptinehoeveelheid dan zou moeten stijgen in de PPVL-groep.
45
In normale omstandigheden is adiponectine detecteerbaar in het plasma [17]. Bij vet-
accumulatie, voornamelijk visceraal vet, ontstaat er een disregulatie van de adiponectine-
functie en oversecretie van TNF-α wat een sterke inhibitor is van adiponectine [21]. Uit onze
resultaten van zowel het serum als het vetlysaat kunnen we opmerken dat de adiponectine
niveaus niet veranderd zijn vermits er geen significant verschil is tussen de PPVL- en de
sham-groep. Hieruit blijkt dat er weinig of geen disregulatie is opgetreden door TNF-α.
Adiponectine is nog altijd in grote hoeveelheid aanwezig en kan zijn beschermende rol blijven
uitoefenen [21]. Er is geen verhoogde kans op insulineresistentie, wat inderdaad op basis van
de HOMA index en de hoeveelheid adiponectine kan worden vermoed. Net zoals bij leptine
kan de metabole activiteit van elke vetcel nagegaan worden. Bij de PPVL-groep hebben we
meer (maar kleinere) vetcellen voor een bepaalde concentratie vet wat resulteert in een grotere
adiponectine productie per vetcel. Vermits de adiponectine-concentratie omgekeerd evenredig
is met de vetaccumulatie kan deze grotere productie van adiponectine mogelijks gelinkt
worden aan een gedaalde hoeveelheid vet en dus een lager gewicht bij de PPVL-ratten in
vergelijking met de sham-ratten.
Ghreline is een hormoon dat voedselinname stimuleert en dus de eetlust opwekt. Uit
onze resultaten blijkt dat ghreline waarden van de sham- en PPVL-groep ongeveer gelijk zijn.
Dit wil zeggen dat de gedaalde eetlust bij de PPVL-ratten in vergelijking met de sham-ratten
niet verklaard kan worden op basis van verschillen in ghreline. De resultaten van ghreline zijn
mogelijks niet 100% betrouwbaar vermits de serumstalen meerdere malen werden ontdooid
voordat de ELISA werd uitgevoerd waardoor er mogelijks eiwitafbraak aanwezig is. Een
andere oorzaak voor de gelijke waarden kan liggen aan de vasttijd voor de exsanguinatie.
Zowel de sham- als PPVL-ratten moesten overnacht vasten voor de exsanguinatie plaats vond,
waardoor de ghreline waarden manueel gestimuleerd zijn.
De verhoging van de aminotransferasen bij de PPVL-ratten wijst mogelijks op schade aan de
hepatocyten. Normaal gezien mogen PPVL-ratten geen hepatocellulaire schade hebben
vermits er enkel pre-hepatisch een vernauwing is aangebracht en dit geen leverschade
veroorzaakt. De verhoging van AST en ALT zou kunnen gelinkt worden aan de milde portale
fibrose aanwezig in de PPVL-ratten. Vermits er volgens pathologisch onderzoek geen schade
is aan de levercellen zou de verhoging van de aminotransferasen ook verklaard kunnen
worden door het hemolytisch karakter van het serum.
46
Er is een significante daling van de hoeveelheid albumine in de PPVL-groep in vergelijking
met de sham-groep. Door stijging van de druk in de viscerale vaten ontstaat er stuwing in de
dunne darm wat kan resulteren in albumineverlies.
De hoeveelheid IL-6 en TNF-α werden gemeten om de hoeveelheid inflammatie na te gaan.
De significant verhoogde hoeveelheid IL-6 en de trend bij TNF-α wijzen erop dat er
inflammatie aanwezig is bij de PPVL-ratten. IL-6 heeft naast zijn inflammatoire functie ook
andere functies zoals het inhiberen van de adiponectine activiteit [21]. De niet prominente
stijging van TNF-α verklaart mogelijks ook de normale concentratie van adiponectine gezien
TNF-α een remmende werking heeft op adiponectine vrijstelling. De upregulatie van TNF-α
is dus minder extreem dan deze van IL-6. Uit de studie van Lopez-Talavera JC et al. weten we
ook dat TNF-α een rol speelt bij de hemodynamische abnormaliteiten van PHT [23]. De
borderline verhoging van TNF-α bij de PPVL-ratten zou dus mee aan de basis kunnen liggen
van de hyperdynamische situatie.
Uit de resultaten van de vetoplosbare vitamine A, E en D blijkt dat enkel vitamine E
significant gestegen is in de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. De oorzaak van dit
resultaat is onbekend. Vermits er bij geen van de drie vitamines een significante daling in de
PPVL-groep is opgetreden gaan we ervan uit dat er geen vetmalabsorptie is bij de PPVL-
groep.
Om na te gaan of de PPVL-ratten insulineresistent zijn werd de hoeveelheid glucose en
insuline nagegaan. Beide merkers waren niet significant verschillend in de PPVL-groep ten
opzichte van de sham-groep. Vermits de waarde van de HOMA index onder 1 ligt kan ervan
uitgegaan worden dat de PPVL-ratten niet insulineresistent zijn. Dit resultaat kan bevestigd
worden aan de hand van het hoge adiponectineniveau, dat een beschermer is voor
insulineresistentie.
PHT heeft geen invloed op koper en zink. Deze metalen kunnen op een efficiënte manier
gemetaboliseerd worden door de lever waardoor het de normale waarden benaderd.
Net zoals bij koper wordt bilirubine ook uitgescheiden via de gal. Aangezien er bij de PPVL-
ratten geen problemen zijn met de gal, is het bilirubine metabolisme niet verstoord bij de
PPVL-groep.
47
3. Eindconclusie De resultaten van onze studie wijzen erop dat PHT ( inclusief de milde portale fibrose) een
invloed heeft op de voedingstoestand van de ratten. De eetlust van de PPVL-ratten is gedaald
wat resulteert in een daling van het gewicht. We kunnen besluiten dat de merkers leptine,
adiponectine, ghreline, glucose, insuline, vitamine A en D, koper, zink en bilirubine geen
significante verandering ondergaan hebben. Deze merkers zijn dus niet gerelateerd aan de
verminderde voedselopname bij PPVL-ratten. Daarentegen is albumine significant gedaald en
IL-6 significant en TNF-α borderline significant gestegen bij de PPVL-groep. Aan de hand
van TNF-α en IL-6 zien we dat bij de PPVL-ratten er wel degelijk inflammatie optreedt. De
daling van albumine wijst erop dat er eiwitverlies optreedt als gevolg van de stuwing in de
viscerale vaten. De hypermetabole status, inflammatie en het mogelijks intestinaal
eiwitverlies zouden aan de basis kunnen liggen voor de verminderde vrijwillige
voedselopname bij PHT.
4. De invloed van een cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten.
Het CBDL-model is een model voor acute cholestase waarbij 4 weken na inductie cirrose
ontstaat. Het CBDL-ratmodel wordt geïnduceerd door een dubbele ligatie van de
hoofdgalweg. Vervolgens wordt de hoofdgalweg tussen de 2 afsnoeringen doorgesneden [12].
Naast een cirrotische lever ontwikkelen de dieren ook PHT. Om de additieve invloed van deze
cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten na te gaan, wordt het CBDL-model
vergeleken met het PPVL-model. Doordat Nathalie en ik bij het praktische gedeelte van onze
thesis nauw hebben samengewerkt, kunnen we onze resultaten met elkaar vergelijken. Een
overzicht hiervan vindt u in bijlage.
De ratten ontwikkelen cholestase wat resulteert in significant verhoogde bilirubine en koper
waarden. Deze merkers zijn verhoogd doordat ze niet meer efficiënt uitgescheiden kunnen
worden via de gal. Zowel de cholestase als een verminderde darmbarrièrefunctie zijn de
oorzaken van de verhoogde inflammatie merkers. Als gevolg van de cholestase hebben
CBDL-ratten ook een gestoorde vetabsorptie, hierdoor ontstaan significant verlaagde waarden
voor de vet oplosbare vitamines. Uit de resultaten blijkt de perimeter van de vetcellen kleiner
te zijn bij de CBDL-ratten, mogelijks de oorzaak van de vetmalabsorptie.
48
De verhoging van de aminotransferasen kunnen verklaard worden door de aanwezigheid van
de histopathologische veranderingen in de lever. Deze significant verhoogde waarden wijzen
op leverschade bij de CBDL-ratten. Als gevolg van de levercirrose is het gewicht van de lever
ook significant gestegen, deze stijging is niet waarneembaar bij de PPVL-ratten.
Vermits de lever verantwoordelijk is voor de albuminesynthese, ontstaat er een daling van de
albuminehoeveelheid bij de CBDL-ratten. Deze daling is nog meer uitgesproken door
eventuele stuwing in de viscerale vaten als gevolg van de portale hypertensie.
Splenomegalie, als gevolg van de groter bloedpool, is een indicator voor PHT. Het wordt
zowel bij de PPVL- als CBDL-ratten teruggevonden. Bij de CBDL-ratten werden geen
hemodynamische metingen uitgevoerd waardoor de aanwezigheid van PHT enkel via het
verhoogde milt gewicht kan bewezen worden. Normalerwijze hebben CBDL-ratten net zoals
de PPVL-ratten een hyperdynamische circulatie, splanchnische vasodilatie en de ontwikkeling
van portale systemische collateralen [12].
Wat betreft malnutritie bij de CBDL-ratten, merken we dat het gewicht, de opgenomen
hoeveelheid eten en drank niet significant veranderd zijn in vergelijking met de sham-ratten.
Wanneer we het gewicht van de lever en milt in rekening brengen, is er wel een trend tot
daling in het gewicht van de CBDL-ratten. Deze trend wijst erop dat de CBDL-ratten wel
degelijk iets minder eten dan de sham-groep, maar deze daling is niet significant verschillend
zoals bij de PPVL-ratten.
De CBDL-waarden van zowel serum ghreline, vetlysaat leptine, serum en vetlysaat
adiponectine lopen gelijk met de PPVL-ratten. Vermits de voedselopname van de PPVL-
ratten significant lager was dan de CBDL-ratten, kan geconludeerd worden dat deze merkers
geen invloed hebben op de voedingsinname van de dieren. Enkel het serumleptine kent een
significante daling bij de CBDL-ratten wat mogelijks de oorzaak is van een daling van de
hoeveelheid vet bij CBDL-ratten en misschien de reden waarom ze meer voeding opnamen.
Malnutritie bij CBDL-ratten wordt veroorzaakt door leverschade, malabsorptie, een
verminderde leversynthesefunctie, hypermetabole toestand, inflammatie en een verhoogd
intestinaal eiwitverlies. De laatste 3 oorzaken worden ook teruggevonden bij PHT. De
vrijwillige voedingsopname blijft ongeveer hetzelfde als bij de controledieren. De invloed van
een cirrotische lever op de malnutritie zal dus bepaald worden door de leverschade,
malabsorptie en de verminderde lever synthese functie.
49
In de toekomst zou het zeker interessant zijn om de relatie van de drie modellen, namelijk
CBDL, PPVL en CCl4 met de voedingstoestand te onderzoeken.
50
REFERENTIES 1. Marieb EN, Mallat J, Wilhelm PB (2005). Human anatomy 4th edition. San Francisco: Benjamin
Cummings, pp: 634-641. 2. Bacon BR, O’Grady JG, DI Bisceglie AM, Lake JR (2006). Comprehensive Clinical hepatology. Mosby
elsevier. 3. Leroux, Gillebert, Kaufman, Vanholder, Joos, Van Vlierberghe, Leroux-Roels, Vogelaers, De Keyser,
De Vos, Loeys, Ruige, Petrovic, Boon, Santens, Offner, Decruyenaere, Cuvelier, Peeters (2007).Cursus Pathogenese van ziekten (3e jaar bachelor Biomedische Wetenschappen).
4. Tarun K, Gupta TK, Chen L, Groszmann RJ (1997). Pathophysiology of portal hypertension. Baillieres clinical gastroenterology 11(2):203-19.
5. Escorsell A, Bosh J (1998). Pathogenesis of bleeding in portal hypertension. Pathogenesis of bleeding and hepatorenal syndrome 59(2):2-5.
6. Groszmann RJ, Abraldes JG (2005). Portal hypertension from bedside to bench. Journal clinical gastroenterology 39(2):125-130.
7. D’amico G, Pagliaro L, Bosch J (1995). The treatment of Portal Hypertension: a meta-analytic review Hepatology 332-354.
8. Bosch J, Abraldes JG, Groszmann (2003). Current management of portal hypertension. Journal of hepatology 38:S54-S68.
9. Shah V (2007). Molecular mechanisms of increased intrahepatic resistance in portal hypertension. Journal clinical gastroenterology 41:259-261.
10. Abraldes JG, Pasarin M, Garcia-Pagan J (2006). Animal models of portal hypertension. World journal gastroenterology 12:6577-6584.
11. Geerts AM, Vanheule E, Praet M, Van Vlierberghe H, De Vis M, Colle I (2008). Comparison of three research models of portal hypertension in mice: macroscopic, histological and portal pressure evaluation. Int. J. Exp. Pathology 89:251-263.
12. Fernandez M, Vizzutti F, Garca-Pagan JC, Rodes J, Bosch J (2004). Anti-VEGF receptor-2 monoclonal antibody prevents portal-systemic collateral vessel formation in portal hypertensive mice. Gastroenterology 126: 886-894.
13. Tsiausi ET, Hatzitolios AI, Trygonis SK, Savopoulos CG (2008). Malnutrition in end stage liver disease: Recommendations and nutritional support. Journal of gastroenterology and hepatology 23(4):527-532.
14. Cabré E, Gassull MA (2001). Nutritional aspects of liver disease and transplantation. Current opinion in clinical nutrition and metabolic care 4: 581-589.
15. Limdi JK, Hyde GM (2003). Evaluation of abnormal liver function tests. Postgrad. Medicine journal 79: 307-312.
16. Bing C, Russell S, Becket E, Pope M, Tisdale MJ, Trayhurn P, JenkinsJR (2006). Adipose atrophy in cancer cachxia: morphologic and molecular analysis of adipose tissue in tumor-bearing mice. British journal of cancer 95: 1028-1037.
17. Fevery J (2007). Vetlever en steatohepatitis: de sleutelrol van insulineresistentie. Zorg, onderzoek en ontwikkeling 4-11.
18. Meier U, Gressner AM (2004). Endocrine regulation of energy metabolism: review of pathobiochemical and clinical chemical aspects of leptin, ghrelin, adiponectin, and resistin. Clinical Chem 50(9): 1511-25.
19. De Graaf C, Blom W, Smeets P, Stafleu A, Hendriks H (2004). Biomarkers of satiation and satiety. Clinical Nutrition 79:946-961.
20. Tacke F, Wüstefeld T, Horn R, Luedde T, Rao AS, Manns MP, Trautwein C, Brabant G (2005). High adiponectin in chronis liver disease and cholestasis suggests biliary route of adiponectin excretion in vivo. Journal of hepatology 42: 666-673.
21. Matsuzawa Y (2006). The metabolic syndrome and adipocytokines. FEBS letters 580: 2917-2921 22. http://www.zol.be/printversie.asp?id=312 23. Lopez-Talavera JC, Merrill WW, Groszmann RJ (1995). TNF-α: Major contributor to the hyperdynamic
circulation in prehepatic portal-hypertensive rats. Gastroenterology 108: 761-767. 24. http://users.telenet.be/leeflang/algemeen/vitaminen/ 25. Stamoulis I, Kouraklis G, Theocharis S (2007). Zinc and the liver: an active interaction. Dig. dis. sci.
52 :1595-1612. 26. Fox JG, Anderson LC, Loew FM, Quimby FW (1984). Laboratory animal medicine 2nd edition.
American College of Laboratory.
Bijlage: Vergelijkende tabel tussen sham-, CBDL- en PPVL-ratten.
sham (4 weken) sham (2 weken) CBDL p-waarde tov sham PPVL
p-waarde tov sham
ALT (U/L) 28,09 ± 8,426 103,578 ± 30,67 0,000 72,8 ± 49,93 0,006 AST (U/L) 44,80 ± 6,670 328,93 ± 144,56 0,000 119,38 ± 63,73 0,001 Bilirubine (mg/dL) 0,05 ± 0,023 9,052 ± 1,41 0,000 0,10 ± 0,053 0,109 Albumine (g/L) 38,58 ± 0,562 29,111 ± 1,395 0,002 33,01 ± 2,08 0,020 Vitamine A (µg/dL) 36,72 ± 4,970 25,843 ± 9,42 0,001 29,52 ± 10,60 0,306 Vitamine D (ng/dL) 23,47 ± 4,24 4,64 ± 1,25 0,001 27,91 ± 6,03 0,175 Vitamine E (µg/dL) 0,51 ± 0,130 0,227 ± 0,041 0,001 0,78 ± 0,19 0,008 Zink (µg/dL) 111,45 ± 8,54 107,81 ± 15,04 0,596 118,75 ± 14,10 0,439 Koper (µg/dL) 111,66 ± 13,9 522,2 ± 94,2 0,001 111,20 ± 25,6 0,796 Glucose (g/L) 1,55 ± 0,397 1,341 ± 0,36 0,193 1,49 ± 0,24 1,000 Insuline (ng/mL) 569,00 ± 406,35 775,17 ± 466,60 0,361 565,00 ±
395,24 1,000 IL6 (pg/mL) 3,77 ± 5,46 20,74 ± 25,98 0,542 43,26 ± 17,05 0,000 TNFα (pg/mL) 0,27 ± 0,42 7,429 ± 3,12 0,002 4,84 ± 9,90 0,097 Leptine serum (ng/mL) 338,24 ± 109,30 195,280 ± 116,27 0,045 242,55 ± 93,15 0,201 Leptine vet (ng/mg) 182,20 ± 146,44 99,259 ± 46,71 0,105 98,02 ± 20,45 0,234 Adiponectine serum (ng/mL) 2917,37 ±
1570,38 2775,66 ±
1418,48 0,754 3761,29 ±
753,46 0,251 Adiponectine vet (ng/mg) 134,77 ± 73,13 234,92 ± 113,46 0,251 92,83 ± 44,33 0,251 Ghreline serum (ng/mL) 2,34 ± 0,97 2,97 ± 1,33 0,294 2,86 ± 1,28 0,293 Toegenomen gewicht eind-begin (%) 142,28 ± 8,47 26,00 ± 4,58 136,84 ± 15,03 0,441 10,35 ± 12,21 0,001 Voeding eind-begin (gram) 685,85 ± 44,01 342,75 ± 21,69 627,53 ± 104,54 0,149 213,35 ± 47,26 0,001
Drank eind-begin (mL) 875,63 ± 90,02 450 ± 35,56 968,89 ± 174,94 0,123 338,89 ± 71,32 0,001 Gewicht zonder lever en milt (gram) 144,04 ± 8,80 41,125 ± 6,02 132,69 ± 14,47 0,102 22,74 ± 21,70 0,083 Vetcelomtrek (µm) 198,52 ± 74,05 150,72 ± 25,13 140,37 ± 36,08 0,000 122,48 ± 27,06 0,248 Milt (%) 0,181 ± 0,03 0,460 ± 0,12 0,000 0,33 ± 0,08 0,001 Lever (%) 2,61 ± 0,12 6,50 ± 0,79 0,000 2,56 ± 0,37 0,923 Metavir score F0 F3 F1 HOMA-index 1,14 ± 0,82 0,94 ± 0,72