Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van...

Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van ratten.

De Beleyr Elke

Promotor: Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans

Vakgroep: Inwendige Geneeskunde

Dienst: Gastroenterologie en Hepatologie

Academiejaar 2008-2009

Datum 25 mei 2009

De Beleyr Elke Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans

VOORWOORD Deze thesis heeft me meer inzicht gegeven in hoe de onderzoekswereld in elkaar zit, hoe alles

gestructureerd is en hoe zo efficiënt mogelijk wordt onderzocht. Gedurende deze periode heb

ik kunnen vaststellen hoe belangrijk teamwork is in deze sector om tot de nodige resultaten te

kunnen komen. Ook ik kon beroep doen op een team van gemotiveerde mensen die steeds

voor mij klaar stonden en bereid waren hun kennis met mij te delen.

Mijn woord van dank voor:

- Prof. Dr. Van Vlierberghe Hans, mijn promoter, die in zijn drukke agenda tijd maakte voor het geven van tips en feedback.

- Van Steenkiste Christophe, Heindryckx Femke en Blomme Bram, mijn

begeleiders, die me hielpen bij het uitvoeren van de praktische zaken en waarop ik altijd kon terugvallen bij eventuele problemen.

- Kim Olivier en alle andere mensen in het labo, voor hun hulp bij het uitvoeren

van mijn praktisch werk.

- Louis Libbrecht, patholoog, voor het bekijken van de coupes onder de microscoop.

- Nathalie Michels, medestudente, voor de vele dagen die we samengewerkt

hebben en de kennis die we met elkaar gedeeld hebben.

Het uitwerken van een eindwerk is natuurlijk ook een periode die gepaard gaat met veel werk,

en dit brengt op zijn beurt de nodige stress met zich mee. Daarom wil ik graag Julien

bedanken vermits hij altijd het zonnetje in het labo deed schijnen!

Tot slot bedank ik mijn ouders die me de kans hebben gegeven deze opleiding te volgen en

mij zijn blijven steunen en motiveren om mijn studies tot een goed einde te brengen.

INHOUDSTAFEL

Samenvatting p.1

Inleiding p.2

1. De lever………………………………………………………………………………….p.2

1.1 Pathofysiologie

1.2 Complicaties

2. Diermodel van portale hypertensie………………………………………….…………p.7

3. Malnutritie en leverlijden……………………………………………………………….p.8

4. Malnutritie diagnoseren………………………...……………………….……………...p.9 4.1 Mens 4.2 Dier 4.3 Vetmeting in het mesenterium

5. Biochemische merkers…………………………………………………………………p.10 5.1 Hormonen

5.1.1 Leptine 5.1.2 Ghreline 5.1.3 Adiponectine

5.2 Merkers voor leverschade 5.2.1 Aminotransferasen 5.2.2 Albumine 5.2.3 Bilirubine

5.3 Merkers van het koolhydraat metabolisme 5.3.1 Glucose 5.3.2 Insuline

5.4 Inflammatie merkers 5.5 Sporenelementen 5.5.1Vitamine A, D en E

5.5.2 Zink en koper 6. Doelstelling……………………………………..……………………………………….p.15

Materialen en methoden p.16

1. Proefdieren…………………………...………………………………………...……….p.16

1.1 Ratmodellen 1.1.1Partial portal vein ligation (PPVL) model 1.1.2 Controle ratten 1.2 Voeding 1.3 Hemodynamische studies

1.4 Vetmeting 2. Anatomie en histologie……………...…………………………………………………..p.18

2.1 Weefsel afnemen 2.2 Paraffinecoupes 2.3 Kleuringen 2.3.1 Haematoxyline-eosine kleuring

2.3.2 Sirius red kleuring

2.4 Dehydratatie en monteren

2.5 Microscopische evaluatie

2.5.1 Evaluatie van de Haematoxyline-eosine kleuringen

2.5.2 Evaluatie van de Sirius red kleuringen

3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ………………………………...….………..p.26

3.1 Principe

3.2 Lysaten maken

3.3 Proteïnebepaling

3.4 Protocol van een kwantitatieve sandwich ELISA

3.5 Protocol van een competitieve ELISA

4. Statistiek……………………………………….………………………………………..p.26

Resultaten p.27

1. Ratmodellen……………………………………………………………………………..p.27 1.1 Hemodynamische metingen 1.2 Haematoxyline-eosine kleuring 1.3 Sirius red kleuring 1.4 Macroscopische observaties 2. Malnutritie…………………………………………………………………… …………p.30 2.1 Gewicht 2.2 Voeding en drank 2.3 Vetmeting 3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay………………………………………...……p.34 3.1 Leptine 3.2 Adiponectine 3.3 Ghreline 3.4 Albumine 3.5 Insuline 3.6 Inflammatie merkers 4. Resultaten uit het routinelabo…………………………………………………………p.37 4.1 Aminotransferasen

4.2 Glucose 4.3 Metalen 4.4 Bilirubine 4.5 Vitamines 5. Insulineresistentie.………………...……………………………………………...…….p.40 6. Samenvattende tabel……………………………………………………………………p.40

Discussie p.42

1. Bespreking………………………………………………………………………………p.42 2. Biochemische merkers…………………………………..……………………………...p.44 3. Eindconclusie…………………………………………………….………….......………p.47 4. De invloed van een cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten…………...p.47

Referentie p.50

Bijlage

1

SAMENVATTING

Achtergrond: Portale hypertensie (PHT) is een klinisch syndroom dat geassocieerd is met

chronische leverziekten. De primaire oorzaak van PHT is een verhoogde vasculaire weerstand

van de portale bloedflow (P= Q x R waarbij P de druk, Q de flow en R de weerstand is). De

hyperdynamische situatie die ontstaat is medeverantwoordelijk voor het ontstaan van PHT.

Malnutritie is een veel voorkomende complicatie van patiënten met leverlijden.

Doelstelling: Deze studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op de

voedingstoestand van ratten. Aan de hand van verschillende merkers werd de relatie tussen

malnutritie en PHT bij ratten nagegaan.

Materialen en methoden: Bij deze thesis werd 1 ratmodel voor PHT en 1 groep controle

ratten gebruikt. Het PPVL-model voor geïsoleerde PHT zonder onderliggende

leverproblematiek werd geïnduceerd door partiële ligatie van de vena porta. Sham

geopereerde ratten vormden de controlegroep. Histologisch onderzoek gebeurde door

haematoxiline-eosine (HE) en sirius red kleuringen, ook hemodynamische metingen werden

uitgevoerd. De opgenomen hoeveelheid voeding en drank en de grootte van de vetcellen

werden gemeten bij beide groepen. Tenslotte werden er interleukines, sporenelementen,

hormonen, merkers voor leverschade en van het koolhydraat mechanisme onderzocht.

Resultaten: PPVL leidt tot een bruikbaar model van PHT waarbij de ratten 14 dagen na de

ligatie PHT ontwikkelen. Aan de hand van de portale druk werd er vastgesteld dat de PPVL-

ratten PHT hadden ontwikkeld. Op de HE kleuring werd er geen leverschade opgemerkt en bij

het visceraal peritoneum werd geen significant verschil tussen beide groepen opgemerkt in

grootte van de vetcellen. Met behulp van de sirius red kleuring werd er milde portale fibrose

opgemerkt bij de PPVL-ratten. De PPVL-ratten dronken en aten significant minder dan de

sham-ratten waardoor hun gewicht ook significant gedaald was. De merkers leptine, ghreline,

adiponectine, glucose, insuline, vitamine A en D, koper, zink en bilirubine zijn niet significant

veranderd bij de PPVL-ratten in vergelijking met de sham-ratten. Daarentegen is albumine

significant gedaald en IL-6 significant en TNF-α borderline significant gestegen bij de PPVL-

ratten.

Conclusie: De daling in voedingsopname bij de PPVL-ratten wijst erop dat PHT en eventueel

de milde portale fibrose invloed hadden op de eetlust van deze ratten. De hypermetabole

status, inflammatie en mogelijks intestinaal eiwitverlies zouden aan de basis kunnen liggen

voor de verminderde vrijwillige voedselopname bij PHT.

2

INLEIDING

1. De lever

De lever is een multifunctioneel orgaan dat belangrijke metabole en endocriene functies

vervult. Het is het grootste inwendige orgaan (1,5 – 2 kg) in het lichaam en bevindt zich in het

rechter boven kwadrant van het abdomen, net onder het middenrif. Het wordt gekenmerkt

door een wigvormige bouw, bestaande uit een vlakke achterzijde (facies visceralis) en een

convexe voorzijde (facies diaphragmatica). De lever wordt verdeeld in verschillende lobben,

waartussen zich de galblaas bevindt [1,2].

Figuur 1: De viscerale oppervlakte van de lever [1].

De lever bestaat uit talrijke hexagonale leverlobuli die de functionele eenheden van de lever

vormen. De lobuli zijn opgebouwd uit platen van hepatocyten (leverparenchymcellen) die

radiair geschikt zijn rond een centrale ader. In het bindweefsel tussen deze zogenaamde

celplaten liggen takken van de poortader (vena porta), leverslagader (arteria hepatica) en

galgangen. Het bloed afkomstig van de vena cava en arteria hepatica vloeit via de sinusoïden

naar de centrale ader [1,2]. Om een maximaal contact van het bloed met de hepatocyten te

verzekeren, bevindt er zich slechts 1 cellaag

leversinusoïden zijn afgelijnd door gevensterd endotheel, deze poriën bevorderen de

uitwisseling tussen de sinusoïde

De hepatocyten scheiden gal af

komen samen in grotere kanalen, die zich op hun beurt verbinden met de rechter en linker

ductus hepaticus (leverbuis). Het hoofdgalkanaal wordt gevormd uit deze twee leverbuizen.

Dit hoofdgalkanaal draineert

hoeveelheid gal die nodig is voor een goede spijsvertering [1,2]

Figuur 2: De driedimensionele synopsis van het normale leverparenchym [2]

De lever wordt van bloed voorzien d

(70%). De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min

brengt zuurstofrijk bloed naar de lever

uit de darmen, de maag, de milt en de alvleesklier

lever komt via de leverader (vena hepatica) in de vena cava

De lever is een veelzijdig orgaan dat een groot aantal functies uitoefent

� Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum

� Eiwit metabolisme: ureum cyclus en oxidatieve deaminatie

3

verzekeren, bevindt er zich slechts 1 cellaag hepatocyten tussen de sinusoïden. De


tussen de sinusoïden en de parenchymcellen [2].

De hepatocyten scheiden gal af dat terecht komt in interlobulaire galbuisjes. Deze



Dit hoofdgalkanaal draineert de gal vanuit de lever en voorziet de galblaas van een rijke

hoeveelheid gal die nodig is voor een goede spijsvertering [1,2].

De driedimensionele synopsis van het normale leverparenchym [2]

De lever wordt van bloed voorzien door middel van de leverslagader (30%) en de poortader

. De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min

brengt zuurstofrijk bloed naar de lever, terwijl de poortader zuurstofarm bloed met

uit de darmen, de maag, de milt en de alvleesklier naar de lever transportee

lever komt via de leverader (vena hepatica) in de vena cava terecht [1,2].

De lever is een veelzijdig orgaan dat een groot aantal functies uitoefent [3]:

Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum

metabolisme: ureum cyclus en oxidatieve deaminatie

tussen de sinusoïden. De


dat terecht komt in interlobulaire galbuisjes. Deze galbuisjes



galblaas van een rijke

de leverslagader (30%) en de poortader

. De normale hepatische bloedflow bedraagt ongeveer 1500mL/min. De leverslagader

, terwijl de poortader zuurstofarm bloed met nutriënten

naar de lever transporteert. Bloed uit de

:

Koolhydraat metabolisme: homeostase van stabiele glucosespiegels in het serum

4

� Vetmetabolisme: synthese van cholesterol en lipoproteïne, opstapeling, synthese en

export van triglyceriden

� Synthese en secretie van eiwitten: albumine, stollingsfactoren, bindingseiwitten,

hormonen

� Solubilizering, transport en opstapelingsfunctie: enterohepatische cyclus, drug

metabolisme en excretie, biotransformatie, apolipoproteïne bij transport van vetten,

productie van bindingseiwitten

� Bescherming en klaring: fagocyt- en endocyt-functie van Kupffer cellen, endocyt-

functie van hepatocyten, ammonium metabolisme

� Vitamine A opstapeling

� Afbraak rode bloedcellen (bilirubine metabolisme)

De lever is een onmisbaar en uniek orgaan dat talrijke essentiële functies in het lichaam

vervult [1,2].

1.1 Pathofysiologie

Portale hypertensie (PHT) is een klinisch syndroom dat geassocieerd is met chronische

leverziekten en geassocieerd wordt met levercirrose [4-9]. De primaire factor van PHT is een

verhoogde vasculaire weerstand van de portale bloedflow [4,10]. De normale druk in de vena

porta is laag, rond de 5 mm kwikdruk, omdat de vasculaire weerstand in de hepatische

sinusoïden laag is [11]. Complicaties van PHT ontwikkelen zich meestal wanneer de

bloeddruk in de poortader groter is dan 12 mm kwikdruk [5,7]. Dilatatie van het portaal

systeem proximaal van de occlusie en verhoging van de capillaire druk in de organen die

gedraineerd worden door desbetreffende portale venen zijn het resultaat van deze verhoogde

portale veneuze druk [5,7,12].

Wanneer er sprake is van een portale systemische levershunt is er iets mis met de normale

bloedvoorziening van de lever. Het bloed uit de poortader gaat direct naar de systemische

circulatie zonder eerst de lever te passeren. Doordat het bloed de obstructie omzeilt wordt de

bloedstroom tussen de portale en systemische circulatie vergroot. Hierdoor bereikt het bloed

de systemische circulatie op een directe manier zonder langs de hepatische sinusoïden te

stromen [2,7].

5

De portale druk wordt gedefinieerd door de wet van Ohm in de vergelijking: ∆P=Q x R

waarbij ∆P de portale druk gradiënt is, Q de bloedflow in het totale portale veneuze systeem

en R de vasculaire weerstand van het volledige portale veneuze systeem. Hieruit volgt dat de

portale druk kan stijgen door een verhoogde portale bloedflow of een verhoogde vasculaire

weerstand of een combinatie van beide [4,9,10].

De plaats van de verhoogde weerstand is afhankelijk van het ziekteproces. De oorzaken van

PHT worden meestal ingedeeld als prehepatisch, posthepatisch of intrahepatisch. In pre- en

posthepatische PHT is de verhoogde weerstand secundair, respectievelijk aan de obstructie

(bijvoorbeeld door een verhoogde weerstand of doordat het bloed niet meer voldoende wordt

rondgepompt als gevolg van hartfalen) van de portale veneuze inflow of de hepatische

veneuze outflow. In tegenstelling tot pre- en posthepatische PHT, zijn de intrahepatische

syndromen complexer en kunnen zelden volgens één enkele plaats van weerstand worden

geclassificeerd in de lever [2,4].

Tabel 1: Oorzaken van portale hypertensie.

OORZAKEN VAN PORTALE HYPERTENSIE PREHEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE EXTRAHEPATISCHE OORZAKEN Portale vene trombose Caverneuze transformatie van de vena porta Extrinsieke compressie van de vena porta Arterioportale fistula Massieve splenomegalie INTRAHEPATISCHE OORZAKEN Schistosomiasis Sarcoidosis Primaire biliaire cirrose Ideopatische portale hypertensie (niet cirrotische portale hypertensie) HEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE Cirrose Alcoholische hepatitisch Vitamine A toxiciteit POSTHEPATISCHE PORTALE HYPERTENSIE Veno-occlusieve ziekte Budd-Chiari syndroom Hepatisch veneus of inferior vena cava web Restrictieve hart ziekten Constructieve pericarditis Ernstige congestieve hartfalen

6

Recente studies hebben aangetoond dat wijzigingen in de vasoreactiviteit (vasodilatie en –

constrictie) een centrale rol spelen in de pathogenese van PHT [9]. Een normale vasculaire

tonus is afhankelijk van een goede balans tussen vasoconstrictors (bv. endotheline) en

vasodilators (bv. stikstofmonoxide). Beide vaso-actieve stoffen worden gesynthetiseerd door

de sinusoïdale endotheelcellen en zijn betrokken bij het bepalen van de vasculaire weerstand.

De verhoogde vasculaire tonus in cirrotische levers wordt veroorzaakt door vorming van

collageen, een te kort aan vasodilators, een verhoging van vasoconstrictors of een combinatie

van beide [4,8,10]. Als gevolg van de verminderde productie van vasodilators (NO en

glucagon) ontstaat er splanische vasodilatie. Dit resulteert enerzijds in een verhoogde portale

inflow en anderzijds in een centrale (systemische) ondervulling. Deze systemische

ondervulling leidt tot activatie van het renine-angiotensine-aldosteronsysteem (RAAS), een

enzymsysteem dat instaat voor een stabiele bloeddruk door verschillende terugkoppelingen en

door invloeden van buitenaf. De activatie van RAAS leidt tot renale vasoconstrictie wat

resulteert in natrium en water retentie [10]. De hyperdynamische circulatie, zowel

systemische als splanchnisch, die ontstaat bij PHT is dus verantwoordelijk voor de

complicaties van PHT [4,9].

Figuur 3: Schematische representatie van de pathofysiologie van portale hypertensie. [Laleman W, Van Landeghem L, Wilmer A, Fevery J, Nevens F (2005). Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver international 25:1079-1090]

hepatische weerstand ↑

portale inflow ↑ shunts ↑ PHT

splanchnishce vasodilatie

het circulerend volume ↓

herverdeling van het totale bloedvolume

7

1.2 Complicaties

De hyperdynamische circulatie leidt tot een verhoging van de portale bloedflow en het

ontwikkelen van porto-systemische collateralen [4,5,10]. De verhoogde portale bloedflow

draagt bij tot het onderhouden maar ook het verergeren van PHT door de ontwikkeling van

porto-systemische collateralen of ook wel porto-systemische shunts genoemd. Deze

collateralen hebben als doel de druk van het portaal systeem te verlagen door het portale bloed

terug te brengen naar de systemische circulatie [12].

Het ontstaan van varices in collaterale bloedvaten is één van de belangrijkste complicaties van

PHT, de meest voorkomende zijn slokdarm- en maag-varices. Umbilicale venen, vene van de

abdominale wand, kunnen uitgezet zijn, wat de ontwikkeling van zichtbare collateralen geeft.

Een ruptuur in de varices, bijvoorbeeld als gevolg van een overmatige hydrostatische druk,

kan aanleiding geven tot hemorragie (bloedingen) met ernstige tot mogelijks letale gevolgen.

Dus, de porto-systemische circulatie speelt een rol in de mechanismen van vaak dodelijke

complicaties van PHT [5,6,10]. Hemorragie door geruptureerde gastro-oesophagaele varices

is de voornaamste complicatie bij PHT. Ongeveer 10% van de patiënten die varices hebben

zullen variceale bloedingen ontwikkelen per jaar en de mortaliteitskans bij deze personen is

30-50%. Aan de hand van endoscopie kunnen varices opgespoord worden [2,5].

Een andere complicatie van PHT is splenomegalie of vergrote milt. Door stijging van de

portale druk ontstaat er stuwing in de milt bloedvaten wat resulteert in een vergrote milt. Er is

een correlatie tussen de portale veneuze druk en de grootte van de milt [2].

2. Diermodel van portale hypertensie

Zoals voor alle pathologische condities is het gebruik van proefdieren enorm belangrijk voor

het begrijpen van het onderliggend mechanisme [6,10]. De drie meest gebruikte modellen

zijn: Partial Portal Vein Ligation model (PPVL) waarbij er ter hoogte van de vena porta een

stenose (vernauwing) wordt aangebracht, het Common Bile Duct Ligation model (CBDL)

waarbij de hoofdgalweg wordt geligeerd en het Carbon TetraChloride model (CCl4) waarbij

koolstof tetrachloride chronisch wordt toegediend. Het grote verschil tussen deze drie

diermodellen is dat we bij het eerste model te maken hebben een prehepatische PHT zonder

8

hepatische dysfunctie, terwijl bij de andere twee modellen PHT het resultaat is van cirrose en

er wel hepatische dysfunctie optreedt [10,11].

De keuze van het model is grotendeels afhankelijk van welke pathofysiologie van PHT men

wenst te onderzoeken. Het PPVL-diermodel wordt gebruikt om wijzigingen in de splanische

circulatie en de pathofysiologie van de hyperdynamische circulatie in PHT te onderzoeken

zonder de invloed van cirrose. De cirrose geïnduceerde modellen worden gebruikt bij het

bestuderen van wijzigingen in de intrahepatische microcirculatie [10,11]. Deze modellen

worden vooral toegepast op ratten, maar wegens de grote vooruitgang in de moleculaire

biologie en het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren (bv. transgene en knock-out

muizen) is er nood aan goed beschreven muismodellen om specifieke pathogene processen bij

PHT te beschrijven [11].

3. Malnutritie en leverlijden

Malnutritie is een multifactoriële en veel voorkomende complicatie van patiënten met

leverlijden [13,14]. Het wordt steeds meer herkend als een belangrijke prognostische factor

dat het klinisch resultaat van patiënten kan beïnvloeden die lijden aan eind stadium

leverlijden. Malnutritie leidt tot een verhoogde morbiditeit en mortaliteit in deze setting [13].

Malnutritie wordt veroorzaakt door een verminderde vrijwillige voedselinname, malabsorptie,

verhoogd intestinaal eiwitverlies, inflammatie, leverschade, verminderde leversynthese

functie en een hypermetabole status [14]. De hypermetabole status leidt tot systemische

vasodilatie waardoor het intraveneuze bloedvolume vergroot. Een direct effect hiervan is een

verhoogd hart-bloedvolume en een groter gebruik van macro- en micronutriënten en hoger

energie uitgave wat resulteert in een nutritionele depletie [14].

Malnutritie vermindert de klinische functies, wat resulteert in complicaties en een slechte

prognose. Malnutritiemeting is dan ook aangewezen om risicovolle patiënten op te sporen en

eventueel over te gaan op nutritionele ondersteuning [13,14].

Vermijden van alcohol en overmaat vetgebruik, het innemen van 4-6 maaltijden per dag zijn

de meest voorkomende aanbevelingen. Bij erge malnutritie, is het starten van enterale voeding

vaak aanbevolen [13,14]. Enterale voeding verbetert de nutritionele status en de leverfunctie.

9

Het verlengt de levensduur, verbetert de levenskwaliteit, vermindert de complicaties en zorgt

voor een beter herstel voor patiënten met een levertransplantatie [13].

4. Malnutritie diagnoseren

4.1 Mens

Het identificiëren van patiënten met malnutritie aan de hand van eenvoudige en gemakkelijk

toegepaste methoden is noodzakelijk zodat voedingsondersteuning kan voorzien worden [13].

Volgens de Europese vereniging voor klinische nutritie en metabolisme (ESPEN) zijn

eenvoudige methoden zoals subjective global assessment (SGA) en antropometrische

parameters betrouwbaar bij de beoordeling van de voedingsstatus van cirrotische patiënten

[13,14]. SGA is een techniek dat meerdere elementen van nutritionele beoordeling combineert

om de graad van de malnutritie te classificeren. Antropometrie is de studie van de menselijke

afmetingen, wat onder andere de omtrek van de middenarm spieren en de triceps huiddikte

meten inhoudt [13].

De beoordeling van malnutritie in een klinische praktijk met cirrosepatiënten wordt

bemoeilijkt door de objectiviteit van de gebruikte methoden en de tendens tot vochtretentie bij

cirrose (ascites) wat de resultaten beïnvloedt [13,14]. Daarom worden verschillende

parameters, die hieronder besproken worden in het hoofdstuk over biochemische merkers,

gebruikt om de nutritionele status te evalueren [13].

4.2 Dier

Vermits antropometrische parameters en SGA enkel mogelijk zijn bij patiënten, worden

biochemische merkers, gewicht en voeding- en drank inname bij proefdieren gebruikt om de

voedingstoestand te achterhalen [13-15].

4.3 Vetmeting in het mesenterium

Het mesenterium is een deel van het peritoneum (buikvlies) waarmee de meeste organen in de

buikholte vastzitten aan de achterwand van de buik. Het peritoneum is het membraan dat de

buikholte en de daarin liggende organen bekleedt. Het kan onderverdeeld worden in twee

10

lagen, namelijk, het viscerale (bekleedt buitenkant van de inwendige organen) en het pariëtale

(bekleedt binnenkant van de buik) peritoneum [1].

5. Biochemische merkers

5.1 Hormonen

5.1.1 Leptine

Leptine is een cytokine eiwithormoon dat voornamelijk geproduceerd wordt door de

adipocyten, maar ook in mindere mate door ovaria, placenta, skeletspieren, de lever en de

maag [17,18]. De grootte van de productie is proportioneel met de hoeveelheid vetmassa

[14,19]. Het stimuleert de hypothalamus tot een anorectische reactie, waardoor een verhoogd

leptine gehalte resulteert in een snellere verzadiging en dus gedaalde voedselinname, maar

ook een toename in energieverbruik. Leptine neemt toe o.i.v. insuline en TNF-α, het

onderhoudt zelf de insulineresistentie en stimuleert de vrijzetting van pro-inflammatoire

(TNF-α, IL-6, IL-12) en pro-fibrotische (TGF-ß) cytokines. Leptine receptoren behoren tot de

cytokine klasse I receptor familie en worden overal in het lichaam gevonden. Het pleïotrope

karakter van leptine is nog niet volledig begrepen [14,17,19].

5.1.2 Ghreline

Ghreline is een peptide hormoon dat hoofdzakelijk geproduceerd wordt door de funduscellen

van de maag. Kleine hoeveelheden worden geproduceerd in de placenta, nier, hypofyse en

hypothalamus [18]. De cellen van de hypofyse hebben een receptor die, wanneer ze

geactiveerd zijn, de secretie van groeihormoon sterk stimuleren. Deze receptor wordt de

groeihormoon secretagogue receptor (GHS-R) genoemd en wordt geactiveerd door ghreline

wat leidt tot een verhoogde groeihormoonproductie [18]. Het groeihormoon stimuleert via de

hypothalamus het hongergevoel, hierdoor zullen veranderingen van ghreline concentratie in

het bloed positief gecorreleerd zijn aan veranderingen in de eetlust. Ghreline zorgt tevens

voor een toename in vetweefsel door een daling van de β-oxidatie en stimuleert ook de maag

motiliteit [18,19].

11

5.1.3 Adiponectine

Adiponectine is een hormoon dat geproduceerd wordt door de pre-adipocyten. [17]. Er is een

negatieve correlatie tussen visceraal vet en adiponectine niveaus in plasma. De invloed van

visceraal vet is veel groter dan dat van subcutaan vet in het lichaam. Het is een beschermend

eiwit met anti-atherogenische, anti-diabetische en anti- inflammatoire effecten [18,20,21]. De

adiponectine secretie wordt geregeld via nutritionele status, namelijk bij visceraal vet

accumulatie krijgen we disregulatie van de adiponectine activiteit en oversecretie van TNF-α,

wat een inhibitor is van adiponectine [21]. Adiponectine verhoogt de gevoeligheid voor

insuline en vermindert zo insulineresistentie, daardoor wordt de glucose-opname en de

vetzuuroxidatie gestimuleerd, en dalen de triglyceriden spiegels. Adiponectine vermindert ook

de vetsynthese en glucoseproductie in de lever en veroorzaakt hierdoor een daling van glucose

en vrije vetzuren in het bloed [17].

5.2 Merkers voor leverschade

5.2.1 Aminotransferasen

AST en ALT zijn uitstekende merkers voor hepatocellulaire schade. Ze nemen deel aan de

gluconeogenese door de transfer van de aminogroep te katalyseren van aspartaatzuur of

alanine naar ketoglutaarzuur voor de productie van respectievelijk oxaloaatzuur en

pyruvaatzuur. Hepatocellulaire schade (necrose) is de trigger voor de vrijlating van deze

aminotransferasen [15].

AST is aanwezig in cytosolische en mitochondriale enzymen. Dit enzym komt voor in de

lever, hartspier, skeletspieren, de nieren en de rode bloedcellen. Beschadiging van deze

weefsels en cellen kan tot verhoogde waarden van AST leiden [15,17].

Alanine aminotransferase (ALT) is een cytosolisch enzym dat gevonden wordt in de lever en

in veel mindere mate in hart, nier en spieren. Doordat het hoofdzakelijk in de lever wordt

teruggevonden is ALT meer leverspecifiek dan AST. Bij beschadiging van de hepatocyten

komt ALT vrij, waardoor het een goede merker is voor leverschade [15,17].

5.2.2 Albumine

Albumine wordt uitsluitend geproduceerd door de lever. Het is de belangrijkste

determinerende factor voor het onderhouden van de osmotische plasmadruk. Bij progressieve

leverziekten is er een gedaalde serum albumine concentratie, dit is een gevolg van de

gedaalde albuminesynthese door de lever [15]. Bij hypo-albuminemie kan water uit de

12

bloedbaan naar de interstitiële weefsels migreren en vochtophoping (oedeem, ascites)

veroorzaken. Hypo-albuminemie heeft een brede waaier van oorzaken, namelijk: malnutritie,

hepatisch lijden, verhoogd katabolisme, malabsorptie, eiwitverlies, terwijl hyperalbuminemie

geassocieerd wordt met dehydratatie. Dit moet in rekening gebracht worden bij de

interpretatie van lage albumine niveaus [15].

5.2.3 Bilirubine

Bilirubine wordt gevormd door lyse van rode bloedcellen binnen het reticulo-endotheliaal

systeem. Ongeconjugeerd bilirubine gebonden aan albumine wordt getransporteerd in het

bloed naar de lever. Het ongeconjugeerde bilirubine is water onoplosbaar waardoor het niet

geëxcreteerd kan worden in de urine [15]. In de lever gebeurt er een omzetting van

ongeconjugeerd bilirubine naar geconjugeerd bilirubine door binding met glucuronzuur.

Geconjugeerd bilirubine is water oplosbaar en kan nu door de lever in de gal uitgescheiden

worden, waardoor het in de urine verschijnt. Stijging van bilirubine (geconjugeerd) wijst op

slechte functionering van de lever of op een obstructie van de galweg [2,15].

5.3 Merkers van het koolhydraat metabolisme

5.3.1 Glucose

Glucose is een monosaccharide, de brandstof die het lichaam voorziet van energie. Glucose

kan wegens zijn grote oplosbaarheid via het bloed naar alle lichaamscellen vervoerd worden.

Het wordt verbruikt door de lichaamscellen of wordt opgeslagen in de lever en spier onder de

vorm van glycogeen, een onoplosbare vorm. De omzetting van glucose in glycogeen

geschiedt onder invloed van het hormoon insuline. De regeling van het bloedglucose vindt

plaats in de hersenen, van waaruit signalen worden doorgegeven aan de lever en de spieren

om glycogeen weer om te zetten in glucose voor verbranding. De omzetting van glycogeen

naar glucose gebeurt onder andere door adrenaline. De absolute glucoseconcentratie heeft

geen rechtstreekse relatie met de eetlust. Een tijdelijke en dynamische daling in bloed glucose

concentratie binnen een korte tijd (5 minuten) is sterk gerelateerd aan de initiatie van een

maaltijd. Het meten van deze daling van bloed glucose binnen een korte tijd is zeer moeilijk

en eerder invasief, vermits het continu gemeten moet worden [19].

13

5.3.2 Insuline

Insuline wordt gemaakt door de β cellen van de pancreas in de eilandjes van Langerhans. Het

wordt gesecreteerd in het bloed wanneer er een kleine verhoging van de glucoseconcentratie

in het bloed optreedt. In gezonde personen, wordt de hoeveelheid glucose in het bloed

gestabiliseerd door enerzijds stimulatie van de glucoseopname door perifere weefsels en

anderzijds het onderdrukken van de hepatische glucose productie. Overproductie van insuline

kan genormaliseerd worden door glucagon. Insuline speelt een centrale rol in het energie-

metabolisme maar is geen specifieke merker voor verzadiging. Insulineresistentie kan

optreden bij leverfalen, een verhoogde hoeveelheid insuline wordt dan waargenomen. De

HOMA index is een klassieke manier om insuline resistentie na te gaan [17,19].

5.4 Inflammatie merkers

De cytokines interleukine-6 (IL-6) en Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) zijn inflammatie

merkers. Cytokines zijn zeer kleine eiwitten die een belangrijke rol spelen in de communicatie

tussen cellen. Ze zijn actief in zeer lage concentraties (nano of pico) en hebben een endocrien

of paracrien effect. De cytokines worden niet in specifieke organen of cellen gestockeerd

zoals de hormonen, maar worden aangemaakt na stimulatie van een cel. Deze aanmaak is snel

en de producerende cel kan de cytokines secreteren in de systemische circulatie of het

intercellulair compartiment. Binding op hun specifieke receptor leidt tot de activatie van een

signalisatiecascade die gentranscriptie kan beïnvloeden en zo de groei, overleving en

differentiatie van verschillende cellen kan bepalen. Deze stoffen kunnen dus functies van

organen moduleren om zo een effect te hebben op een multitude van fysiologische

eigenschappen [22].

TNF-α is een pro-inflammatoir eiwit dat wordt geproduceerd in geactiveerde

adipocyten en door macrofagen die aanwezig zijn in vetweefsel. Door zowel de glucose

transporter GLUT4 als PPARα (peroxisome proliferator- activated receptor alfa) te

onderdrukken en de adiponectine activiteit te inhiberen doet TNF-α de insulineresistentie

stijgen [21]. TNF-α stimuleert niet alleen lipolysis en apoptose, maar zorgt ook voor een

toename in expressie en vrijstelling van inflammatoire adipokines zoals IL-6 en van TNF-α

zelf. Hierdoor onderhoudt het een feedbackmechanisme. Bij een groot aantal ziekten,

waaronder leverziekten, vindt men een overmatige productie van TNF-α [17,18,23].

IL-6 wordt door de meeste genucleëerde cellen aangemaakt nadat deze geprikkeld

worden. De prikkels die leiden tot IL-6 productie zijn celspecifiek. In stress-situaties zullen de

meeste cellen overgaan tot productie van IL

betrokken in de regulatie van de acute fase inflammatoire respons. IL

de activatie van de synthese van de acute fase eiwitten [

De inflammatie merkers worden gekwantificeerd zodat de mate van inflammatie kan

achterhaald worden in de behandelde ratten.

5.5 Sporenelementen

5.5.1 Vitamine A en D en E

Deze vitamines behoren allen tot de vetoplosbare vitamines. Door het bepalen van

vetoplosbare vitamines kan vetmalabsorptie nagegaan worden.

gevorderde leverziekten, in het bijzonder cholestatische leverziekten, ontwikkelen een

deficiëntie aan vetoplosbare vitamines [

Vitamine A (retinol) is een antioxidant.

de vorming van capillairen. D

pigmentlaag van het oog)

mobilisatie van de lever. Een gebrek aan vitamine A veroorzaakt

Figuur 4: De structuur van vitamine A

Vitamine D deficiëntie is het gevolg van malabsorptie, verminderde blootstelling aan

UV licht en onvoldoende inname. 25

evaluatie van de vitamine D reserve in een indivi

van cholecalciferol (op koolstof 25

Figuur 5: De structuur van vitamine D.

14

meeste cellen overgaan tot productie van IL-6. Het is een krachtig pro-inflammatoir cytokine

betrokken in de regulatie van de acute fase inflammatoire respons. IL-6 is vooral gekend voor

these van de acute fase eiwitten [17,22].


achterhaald worden in de behandelde ratten.

Vitamine A en D en E


vitamines kan vetmalabsorptie nagegaan worden. De meeste patiënten met


vitamines [14].

Vitamine A (retinol) is een antioxidant. De werking van vitamine A is essentieel voor

. Deficiëntie treedt op na depletie van de weefselvoorraden

t.g.v. ondervoeding, vetmalabsorptie of een verminderde

mobilisatie van de lever. Een gebrek aan vitamine A veroorzaakt nachtblindheid [

: De structuur van vitamine A


UV licht en onvoldoende inname. 25-hydroxyvitamine D is de beste parameter voor de

evaluatie van de vitamine D reserve in een individu. Het wordt gevormd door hydroxylatie

op koolstof 25) in de lever [13,14,24].

: De structuur van vitamine D.

inflammatoir cytokine,

6 is vooral gekend voor



De meeste patiënten met


De werking van vitamine A is essentieel voor

eficiëntie treedt op na depletie van de weefselvoorraden (huid,

alabsorptie of een verminderde

nachtblindheid [13,24].


hydroxyvitamine D is de beste parameter voor de

du. Het wordt gevormd door hydroxylatie

Vitamine E is een antioxidant. Het is noodzakelijk voor de vorming van rode

bloedcellen en opbouw en herstel van spier en ander weefsel. Een te kort aan vitamine E kan

voorkomen worden wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen

treden op [24].

Figuur 6: De structuur van vitamine

5.5.2 Zink en koper

Zink (Zn) is een essentieel sporenelement met verschillende biologische effecten zoals

anti-oxyderende, anti-inflammatoire en anti

lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden

albumine [25]. Naast een katalytische en struc

rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaa

eetlust [13]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl

Zn ook noodzakelijk is voor een goede leverfunctie. Een daling van de Zn niveaus wordt

gezien bij leverziekten [14,25].

Koper is ook een sporenelement da

wordt via de gal uitgescheiden. Een opstapeling van koper wordt waargenomen wanneer de

galgang vernauwd wordt (cholestase)

6. Doelstelling

In de laatste 10 jaar zijn er verschillende relevante artikels over

en pathogenese in cirrose gepubliceerd

diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn

onopgelost [14]. Deze studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op

de voedingstoestand van ratten. We trachten aan de hand van verschillende merkers de relatie

tussen malnutritie en PHT bij ratten na

15



wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen

e structuur van vitamine E.


inflammatoire en anti-apoptotische. Het wordt gevonden in de meeste

lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden

]. Naast een katalytische en structurele rol bij vele enzymen

rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaa

]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl


].

Koper is ook een sporenelement dat essentieel is voor de menselijke gezondheid. Het


(cholestase).

In de laatste 10 jaar zijn er verschillende relevante artikels over de diagnose van malnutritie

en pathogenese in cirrose gepubliceerd. Maar verschillende elementen van pathogenese,

diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn

studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op


tussen malnutritie en PHT bij ratten na te gaan.



wanneer er vet malabsorptie is, maar geen uitgesproken symptomen


apoptotische. Het wordt gevonden in de meeste

lichaamsweefsels en in bloed. Het komt voornamelijk eiwitgebonden voor, vooral aan

turele rol bij vele enzymen speelt het ook een

rol bij de wondheling, immuunreacties, ontgiften van ammoniak en veranderde smaak- en

]. Bij de regulatie van de Zn homeostase speelt de lever een belangrijke rol terwijl


t essentieel is voor de menselijke gezondheid. Het


de diagnose van malnutritie

. Maar verschillende elementen van pathogenese,

diagnose, preventie en therapie met betrekking tot deze malnutritie zijn actueel nog altijd

studie heeft als doel inzicht te verwerven over de invloed van PHT op


16

MATERIALEN EN METHODEN

1. Proefdieren

De experimenten werden uitgevoerd met mannelijke Wistar ratten (Iffa-Credo, Brussel,

België) van ± 200 gram. De ratten werden in afzonderlijke kooien gehouden onder constante

temperatuur (17-20°C) en vochtigheid (36-44%) in een 12 uren gecontroleerde licht/donker

cyclus om mogelijke invloed van omgevingsfactoren op de voedselinname te vermijden. Het

ethisch comité voor proefdieren van de faculteit Geneeskunde en

Gezondheidswetenschappen, Universiteit Gent, België, keurde het protocol goed. (ECD-

08/19)

1.1 Ratmodellen

1.1.1 Partial portal vein ligation (PPVL) model

Het ratmodel voor een prehepatische portale hypertensie zonder cirrose is PPVL [7]. Deze

chirurgische procedure werd uitgevoerd onder steriele condities. De ratten werden

geanestheseerd door middel van isofluraaninhalatie (Forene®, Abbott NV, Brussel, België).

Een abdominale incisie werd gemaakt ter hoogte van de middenlijn en de vena porta werd

afgezonderd van het omliggende weefsel. Een ligatuur (silk cut 7-0) werd gebonden rond de

portale vene met daarop liggend een 27-gauge poly-ethyleen katheter. Na het verwijderen van

de katheter werd er een gekalibreerde stenose van de vena porta bekomen. Nadien werd de

buikwand gesloten door het dichthechten van de abdominale spier en de huid (silk cut 7-0).

Exsanguinatie van de ratten door bloedafname gebeurde 14 dagen na PPVL-inductie (n=12).

Om het comfort van de ratten te verhogen, werd er postoperatief pijnstilling toegediend:

Temgesic (0.1 ml/kg) intramusculair om de 12 uur gedurende 48 uur. Tevens werd bij het

sluiten van de wonde een lokale infiltratie van Xylocaine gegeven.

In de PPVL-groep is er een mortaliteit van 20% die te wijten is aan een inwendige bloeding,

inherent aan de techniek en meestal optredend de eerste dag na PPVL-inductie. Nadien is er

meestal geen verdere uitval en hebben de dieren een goede algemene toestand.

1.1.2 Controle ratten

Sham geopereerde ratten werden als controlegroep gebruikt. De abdominale holte werd

geopend en de portale vene werd geïsoleerd, maar er werd geen ligatuur aangebracht. De

17

sham-groepen werden op dezelfde manier als de PPVL-groep gedood 4 weken na operatie

(n=10).

1.2 Voeding

Ad libitum standaardvoeding onder de vorm van pellets en standaard vocht (water) werd aan

de ratten gegeven. De ratten werden dagelijks gecontroleerd en twee maal in de week

gewogen. De opgenomen hoeveelheid voedsel/drank werd nagegaan door het voedsel dat

gegeven werd eerst te wegen/meten en bij de volgende weging het overblijvende voedsel

ervan af te trekken.

Figuur 7: Protocol van de standaard voeding.

1.3 Hemodynamische studies

Na 14 dagen is de PHT volledig en moesten de ratten overnacht vasten. De volgende ochtend

werden ze gesacrifieerd. Eerst werden alle ratten gewogen en daarna werden ze

geanestheseerd met isofluraan (Forene®, Abbott NV, Brussel, België). Er werd een

tracheacanule geplaatst voor een open luchtweg.

18

De portale druk, bloeddruk (arteria carotis), hartslag (beat-to-beat variation in de arteria

carotis) werden gemeten in elke rat. Via cannulatie van de ileocolische vene met een 24-gauge

catheter (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, België), die aangesloten werd aan een hoog

sensitieve druktransducer werd de portale druk gemeten. Het externe nul referentie punt werd

aan mid-abdominaal geplaatst. Een tweede catheter werd geplaatst in de arterie carotis voor

bloeddruk en hartslagmeting. De metingen werden geregistreerd op een multikanaal

computer-geconnecteerde recorder (Powerlab, ADInstruments, Spechbach, Duitsland) en

geanalyseerd met Chart5 (ADInstruments).

1.4 Vetmeting

Om een verschil in de grote van de vetcellen te achterhalen werd de perimeter van enkele

vetcellen in het mesenterium, meer bepaald het visceraal peritoneum gemeten bij zowel de

PPVL- als de sham-ratten [16].

2. Anatomie en histologie

2.1 Weefsel afnemen

De lever en milt werden gewogen en weergegeven in g/10g lichaamsgewicht. Fragmenten

(ongeveer 1cm diameter) van de linkse, rechtse en midden leverlob werden na inbedden (cf.

infra) met behulp van een microtoom (Leica Microsystems, Nussloch, Duitsland) gesneden.

Verder werden er ook nog fragmenten van de huid, zowel van de nek als de buik, afgenomen

op een gestandaardiseerde plaats.

2.2 Paraffinecoupes

De leversecties en het mesenterium (visceraal peritoneum) werden gefixeerd in 4% fosfaat

gebufferde formaldehyde oplossing (PFA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) zodat de metabole

activiteiten in het weefsel werden stilgelegd en om weefselschade te voorkomen. Na 24u

werden de stalen gespoeld met gebufferde fysiologische oplossing (PBS) en werden ze

gedehydrateerd in stijgende ethanolbaden (Klinipath NV, Geel, België):

� 1 uur 30 % alcohol


19



� 2 x 1 uur 99 % alcohol

Vervolgens werden de stalen 2 keer 1 uur gespoeld met ultraclear (Klinipath NV, Geel,

België) en werden ze ingebed in paraffine. Dehydratatie van de stalen is noodzakelijk zodat

paraffine (hydrofoob inbedmiddel) voldoende kan inwerken op de stalen.

De paraffineblokjes werden met een microtoom (Leica RM2145, Leica Microsystems AG,

Wetzlar, Duitsland) gesneden zodat weefselcoupes met een dikte van 5 µm ontstaan. Deze

werden overnacht geïncubeerd bij 37°C om vasthechting van de coupe aan het draagglaasje te

versterken.

Hierna werden de coupes 2 keer 5 minuten in ultraclear gebracht om ze te deparaffineren en

nadien in dalende ethanolbaden om de coupes te rehydrateren:

� 2 x 5min 100 % alcohol

� 2 x 5 min 96 % alcohol

� 5 min 70 % alcohol

� 5 min 50 % alcohol

Nadat de coupes 5 minuten in gedestilleerd water hebben gezeten zijn ze klaar om een

kleuring te ondergaan.

2.3 Kleuringen

2.3.1 Haematoxyline-eosine kleuring

Visceraal peritoneum en levercoupes werden ondergedompeld in Mayer haematoxyline

(Klinipath NV, Geel, België). Na 30 seconden in het haematoxyline werden de weefselcoupes

5 minuten gespoeld met stromend leidingwater en daarna nogmaals 5 minuten met

gedestilleerd water totdat het water niet meer verkleurde. Nadien werden de weefselcoupes 5

minuten ondergedompeld in eosine 0,5% (Klinipath NV, Geel, België) en weer 5 minuten

gespoeld moet stromend leidingwater. Vervolgens nogmaals 5 minuten gedestilleerd water

laten overlopen.

20

Figuur 8: Structuurformule van haematoxyline (links) [The Merck Index]en eosine structuur (rechts)

[www.univ-tln.fr].

2.3.2 Sirius red kleuring

De sirius red oplossing bestaat uit 0,1% sirius red (Sirius Red F3B 80115, Klinipath NV,

Geel, België) opgelost in verzadigd picrinezuur (Sigma, St-Louis, Mo, VS). Deze kleuring

werd gebruikt om de graad van fibrose/cirrose te evalueren in het leverweefsel van de

verschillende ratmodellen met behulp van de Metavir-score. Bij deze kleuring kleurt het

cytoplasma geel en het collageen rood.

Na deparaffinering en rehydratatie van de weefselcoupes werden ze gedurende 30 minuten

ondergedompeld in de sirius red oplossing. Daarna werden de coupes gedurende 10 minuten

gespoeld met stromend leidingwater. Vervolgens werd er 2 maal 5 minuten gespoeld met

gedestilleerd water totdat het water niet meer kleurde.

2.4 Dehydratatie en monteren

Na de kleuring werden de preparaten gedehydrateerd in stijgende ethanolbaden:

� 5 min 50% alcohol




� 2 x 5 min 100% alcohol

Vervolgens werden ze 2 keer 5 minuten in ultraclear gebracht en tenslotte 5 minuten in

Mounting clear (Klinipath NV, Geel, België).

21

Om het weefsel te fixeren tussen het draagglas en het dekglaasje werden er enkele druppels

Neutral Mounting Medium (D.P.X., Klinipath, Geel, België) aangebracht op het draagglas.

Vervolgens kon het dekglaasje erop gemonteerd worden en werden luchtbellen zoveel

mogelijk vermeden. Nadien werden de preparaten overnacht gedroogd bij kamertemperatuur.

2.5 Microscopische evaluatie

2.5.1 Evaluatie van de haematoxiline-eosine kleuringen

De haematoxyline-eosine kleuring is een kleuring die standaard toegepast wordt in

histologisch onderzoek, vermits het een beeld geeft van de algemene morfologie van de

stalen. Haematoxyline is een basische kleurstof die bij een lage pH aan de zure of negatief

geladen bestanddelen in het chromatine bindt. Deze kleurstof is een indicator voor de pH en

dit zorgt voor de kleuromslag. Na het kleuren met haematoxyline is spoelen met

kraantjeswater noodzakelijk vermits hierdoor de pH verhoogt tot 7, waardoor de kernen paars-

blauw kleuren. Eosine is een rode kleurstof die bindweefsel en cytoplasma kleurt. Het is een

zure kleurstof die negatieve ladingsgroepen bevat. Eosine kleurt de basische of positieve

geladen bestanddelen in het cytoplasma helder rood. De coupes werden na kleuren onder een

lichtmicroscoop (Olympus BX41, Aartselaar, België) bekeken en met behulp van het

programma D-cell konden foto’s gemaakt worden.

De perimeter van de vetcellen werd bepaald op de coupes van het visceraal peritoneum. In

elke coupe (40x vergroot) werden at random 3 regio’s geselecteerd en in elke regio werd de

afmeting van 10 vetcellen gemeten. Het bepalen van de perimeter gebeurde digitaal met de

lichtmicroscoop (Olympus BX41, Aartselaar, België).

Op de haematoxyline-eosine kleuring van de weefselcoupes werd er gekeken of er

hepatocellulaire schade aanwezig was. Vermits dit enige ervaring vraagt, werd dit door een

patholoog bekeken.

2.5.2 Evaluatie van de sirius red kleuringen

De coupes werden op een blinde manier geëvalueerd met behulp van een lichtmicroscoop

(Olympus BX41, Aartselaar, België) met een 10 tot 100x vergroting. De leversecties werden

vervolgens gescoord met behulp van de Metavir-score (zie figuur 9):

22

� F0 = afwezigheid van fibrose

� F1 = de fibrotische veranderingen blijven meetal beperkt tot de portale velden (portale

fibrose)

� F2 = portale fibrose is aanwezig met vorming van enkele septa

� F3 = portale fibrose met vele septa zonder cirrose (septale fibrose)

� F4 = cirrose

Figuur 9: De evolutie van fibrose van periportale fibrose tot cirrose volgens de Metavir score. [Bedossa P., Hépatites chroniques virales. In : La biopsie hépatique en pathologie non tumorale du foie. Groupe Metavir. Paris France : Elsevier, 2000, p31]

3. Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

3.1 Principe

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) is een methode om de concentratie van

macromoleculaire stoffen (zoals eiwitten) te bepalen in een oplossing (zoals bloed). De

ELISA testen worden uitgevoerd om de concentraties van de biochemische merkers te

bepalen zoals: leptine, ghreline, adiponectine, insuline, albumine en IL-6 in serum of lysaten.

23

3.2 Lysaten maken

Weefselstalen van het abdominaal vet en van de lever werden onmiddellijk ingevroren in

vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. De weefselstalen werden gehomogeniseerd in RIPA

(= radio immunoprecipitation assay) buffer, een lyse-buffer. De RIPA-buffer bestaat uit:

� 25 mM Tris; pH8,2; 0,1515g (VWR International, Leuven, België)

� 50 mM NaCl 0,1461g (VWR International, Leuven, België)

� 0,5% NP40 250 µl (FlukaChemieGmbH, Buchs, Zwitserland)

� 0,5% deoxycholaat 250µl (Sigma, St-Louis, MO, VS)

� 0,1% SDS 250 µl (Bio-rad Laboratories S.A.-N.V., Nazareth Eke, België)

� mini EDTA-free protease tablet 20µl/ml (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg,

Duitsland)

� β-glycerofosfaat 0,055g/ml (Sigma, St-Louis, MO,VS)

� DTT 1µl/ml (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Duitsland)

� standard fosfatase inhibitor cocktail 20µl/ml (Sigma, St-Louis, MO, VS)

3.3 Proteïnebepaling

De proteïnebepaling wordt uitgevoerd om de hoeveelheid eiwit in het lysaat te bepalen. Dit

werd na het uitvoeren van een ELISA in rekening gebracht, zodat de concentratie van het te

bepalen eiwit kan bepaald worden ten opzichte van de totale hoeveelheid eiwit in het lysaat.

De eiwitconcentratie werd gemeten via een colorimetrische analyse (Bio-Rad DC Proteïn

Assay, Bio-Rad, Nazareth Eke, België). De proteïnebepaling werd als volgt uitgevoerd:

� standaardreeks: BSA opgelost in RIPA buffer.

� 5µl eiwitstaal pipetteren in microtiterplaat (NuclonTM Surface, Nunc A/S, Roskilde,

Denemarken)

� 25µl reagens A’ toevoegen

Dit reagens A’ bestaat uit 20µl reagens S (Bio-Rad DC Protein Assay Reagens A, Bio-

Rad Laboratories, Nazareth Eke, België) per ml reagens A (Bio-Rad DC Protein assay

24

Reagens A, Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, België). Reagens S is nodig om

detergent te neutraliseren en reagens A is een alkaline koper tartraat oplossing. Het eiwit

in het lysaat vormt samen met reagens A’ een koperreactie.

� 200µl reagens B toevoegen (Bio-Rad DC Protein Assay Reagens B, Bio-Rad

Laboratories, Nazareth Eke, België)

Reagens B is een verdund foline reagens, dit reagens zal reduceren door het koper-eiwit

complex wat leidt tot een blauwe kleurontwikkeling met een maximale absorbantie bij

750nm.

Elk eiwitstaat werd in duplo uitgevoerd. Na het volgen van het bovenstaande protocol werd de

microtiterplaat in een microplaatlezer geplaatst die de absorbantie leest bij 750nm. Aan de

hand van deze resultaten werd er met behulp van de standaardreeks formule berekend hoeveel

mg eiwit aanwezig is per ml lysaat.

3.4 Protocol van een kwantitatieve sandwich ELISA

Voor de bepaling van leptine (Mouse leptin immunoassay, Quantikine), adiponectine

(adiponectin (rat, Mouse) ELISA Kit Protocol, Phoenix Pharmaceuticals, Inc), albumine (rat

albumine ELISA kit, BioVendor), insuline (rat insulin ELISA kit, crystal chem inc.), TNF- α

(rat TNF-α/TNFSF1A immunoassay, Quantikine) en IL-6 (rat Il-6, Quantikine) werd een

kwantitatieve sandwich enzym immunoassay gebruikt. Het principe van deze ELISA testen

zijn overal hetzelfde.

De microtiterplaat, geleverd bij de ELISA kit, is gecoat met een monoclonaal of polyclonaal

antilichaam aanwezig tegen een specifiek eiwit. Hierop werden de standaarden en de al dan

niet verdunde stalen aangebracht. De aangebrachte antigenen zullen binden met de aanwezige

antilichamen in de wellen van de microtiterplaat. Vervolgens werd de microtiterplaat

gewassen om de ongebonden antigenen te verwijderen. Nadien werd er een enzym-gelinkt-

antilichaam toegevoegd, ook nu werd er na een bepaalde wachttijd gewassen om het

ongebonden antilichaam te verwijderen. Vervolgens werd er een substraat oplossing

toegevoegd die een blauwe kleur gaf aan de wellen afhankelijk van de hoeveelheid

antilichaam-antigeen-antilichaam complex. Daarna werd er een stopoplossing toegevoegd,

waardoor de reactie in stopt en de blauwe kleur omsloeg in een gele kleur. Binnen de 30

minuten moet de optische densiteit van elke well gemeten worden. Het aflezen gebeurde door

de microtiterplaat in de microtiterplaatlezer te plaatsen die ingesteld was op de aangegeven

25

absorbantie zoals vermeld in het protocol van de ELISA. Vermits de kleurintensiteit

evenredig is met de hoeveelheid eiwit, kan bepaald worden wat de concentratie van het staal

is. Met behulp van de standaardoplossing, die gekende concentraties bevat van het

desbetreffende eiwit, konden de ongekende concentraties van het eiwit nagegaan worden door

extrapolatie van de gevonden waarden in de standaardcurve.

Figuur 10: Het principe van een kwantitatieve ELISA

3.5 Protocol van een competitieve ELISA

Voor de bepaling van ghreline werd een competitieve enzym immunoassay gebruikt (enzyme

immunoassay kit, Phoenix Pharmaceuticals,Inc.) vermits er geen kwantitatieve sandwich

ELISA voor bestaat. De microtiterplaat bevat een secundair antilichaam en de niet specifieke

bindingssites zijn geblokkeerd. Het secundaire antilichaam kan binden met de Fc fragmenten

van het primaire antilichaam (peptide antilichaam). Vervolgens werd zowel een gekende

hoeveelheid antigenen toegevoegd via het gebiotinileerde peptide als een onbekende (nog te

bepalen) hoeveelheid antigenen via de standaard/staal. De gebiotinileerde antigenen en

antigenen uit de standaard/staal concurreren om te binden aan het antilichaam. Na instellen

van het evenwicht werden de niet gebonden antigenen weggewassen. Nadien werd het

streptavadine horse-radish peroxidase (SA-HRP) toegevoegd. De gebiotinileerde peptiden

interageren met SA-HRP wat het substraat katalyseert, een kleur omslag van blauw naar geel

was waar te nemen in de wellen. Vervolgens werd er een stopoplossing toegevoegd, waardoor

de reactie in de wellen werd beëindigd. De intensiteit van de bekomen gele kleur was

proportioneel met de hoeveelheid gebiotinileerd peptide-SA-HRP complex maar omgekeerd

evenredig met de hoeveelheid peptide in de standaard en de stalen. Hoe minder kleuring, hoe

26

minder conjugaat er gevonden werd en dus hoe meer antilichaam aanwezig was in de stalen

en de standaard.

Figuur 11: Het principe van een competitieve ELISA

Net zoals bij de sandwich ELISA wordt ook hier een standaardcurve van de gekende

concentraties gemaakt, het verschil met de sandwich ELISA is wel dat bij een competitieve

ELISA de curve een omgekeerd sigmoïdale vorm heeft in plaats van een rechte. De

ongekende concentraties van de stalen konden achterhaald worden door extrapolatie van de

resultaten naar de standaardcurve.

4. Statistiek De gegevens werden statistisch verwerkt in SPSS. Om het verschil tussen de sham- en de

PPVL-groep weer te geven werd gebruik gemaakt van een Mann-Whitney-U-test. Deze test

wordt gebruikt bij niet normaal verdeelde waarden. Een p-waarde kleiner dan 0,05 wordt als

statistisch significant beschouwd. Een p- waarde tussen de 0,05 en 0,1 wordt beschouwd als

een trend.

Secundair antibody

(microtiterplaat) +

primair antibody

27

RESULTATEN

1. Ratmodellen

Een PPVL-model voor geïsoleerde PHT werd twee weken na operatie onderzocht. Sham

geopereerde ratten, als controleratten voor het PPVL-model, werden vier weken na operatie

onderzocht. Dit gebeurde aan de hand van hemodynamische studies, haematoxyline-eosine

kleuring en sirius red kleuring van de lever, macroscopische observaties en gewichten van de

lever en de milt en de dieren.

1.1 Hemodynamische metingen

De hemodynamische metingen werden uitgevoerd op de PPVL-ratten, 14 dagen na operatie.

Slecht 9 van de 12 PPVL-ratten hebben deze periode overleefd. Kort na de operatie stierven 3

ratten omwille van darmnecrose ten gevolge van de ligatie. Bij 2 ratten zijn de

hemodynamische metingen mislukt omwille van bloedingen, hierdoor hebben we slechts

resultaten van 7 PPVL-ratten. De sham-ratten, die 4 weken na operatie gedood werden, zijn

niet gemeten. We gaan ervan uit dat deze de normale waarden benaderen [2]. Bij de

hemodynamische metingen werd de arteriële bloeddruk (ABD), de portale veneuze druk

(PVP) en de hartslag gemeten.

Tabel 2: Hemodynamische metingen in de PPVL-ratten.

PPVL PVP (mmHg) ABD (mmHg) hartslag

(slagen/min)

Rat 1 6,36 57,86 540

Rat 2 18,40 100,90 700

Rat 3 12,25 92,43 740

Rat 4 11,95 82,07 620

Rat 5 11,60 70,70 650

Rat 6 9,02 79,43 580

Rat 7 11,63 106,80 640

gemiddelde 11,9 ± 3,78 84,31 ± 17,13 639 ± 67,93

28

Door het meten van de PVP konden we nagaan of de ratten wel degelijk PHT hadden. Er is

sprake van PHT wanneer de PVP de normale druk van 5 mmHg overschrijdt [11]. Uit de

resultaten van de metingen van de PVP zien we dat alle ratten een PVP boven de 5 mmHg

hebben.

De ABD bij sham geopereerde ratten ligt normaal rond de 100 mmHg [26]. Doordat bij de

ratten met PHT een hyperdynamische situatie aanwezig is, daalt de ABD. De gemiddelde

ABD in de PPVL-groep is 84,31 ± 17,13mmHg wat dus lager ligt dan de normale verwachte

ABD.

De hartslag van kleine zoogdieren is normaal tussen de 300-500 slagen per minuut. Vermits

de rat een klein zoogdier is zou de sham-groep een hartslag moeten hebben dat tussen 300-

500 slagen per minuut ligt [26]. Wanneer de ratten PHT hebben blijkt de hartslag te stijgen.

De gemiddelde hartslag van de ratten met PHT is 639 ± 67,93 slagen per minuut.

1.2 Haematoxiline-eosine kleuring

De haematoxiline-eosine kleuringen van de leversecties werden door een patholoog (L.L.)

bekeken. Op de levercoupes is er sporadisch infiltratie van inflammatoire cellen te zien rond

de galwegen. Op de levercoupes werd er geen hepatocellulaire schade opgemerkt .

1.3 Sirius red kleuring

(Semi-) kwantitatieve analyse van de hoeveelheid fibrose gebeurt door middel van picro sirius

red kleuring [11]. Bij de PPVL-levercoupes merken we rond de portale velden enkele septa

(F1 Metavir-score), (figuur 12). Bij de sham-groep was er geen fibrose aanwezig (F0 Metavir-

score), (figuur 13).

29

Figuur 12: Sirius red kleuring op leverweefsel van een PPVL-rat ( vergroting 10x). De pijltjes wijzen op fibrotische veranderingen rond de portale velden (F1 Metavir-score).

Figuur 13: Sirius red kleuring op leverweefsel van een sham-rat (vergroting 40x). De pijltjes duiden aan dat er geen fibrose aanwezig is (F0 Metavir-score).

30

1.4 Macroscopische observaties

Zowel het gewicht van de lever als van de milt werd uitgezet ten opzichte van het eindgewicht

van de rat [11]. De resultaten hiervan worden weergegeven aan de hand van de grafieken in

figuur 14.

Figuur 14: Resultaten lever en milt gewicht.

Uit bovenstaande grafiek is er geen toename in levervolume te merken bij de PPVL-ratten ten

opzichte van de sham-ratten. De PPVL-ratten hadden wel een grotere milt in vergelijking met

de sham-ratten (p<0,05).

2. Malnutritie

2.1 Gewicht

Twee maal in de week werd het gewicht van de PPVL- en sham-ratten gewogen. In figuur 15

ziet u het gewichtsverloop van de PPVL- en sham-ratten over het verloop van twee weken

heen. Het gewicht van de PPVL-ratten blijft de eerste week constant, de tweede week is er

een lichte toename van het gewicht. Het gewicht van de sham-ratten neemt al toe de eerste

week en kent een grotere gewichtstoename de tweede week. We merken dus een verschil in

gewicht tussen de PPVL- en sham-groep. Zowel na 1 als na 2 weken is er een significant

daling in gewicht tussen de sham- en PPVL-groep (p = 0,001). Wanneer het verschil in begin

gewicht in rekening wordt gebracht, blijft er een significante daling (p = 0,001) in gewicht

tussen de sham- en PPVL-groep.

2,61 2,56

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

% to

egen

omen

tov

eind

gew

.

lever gewicht

Sham PPVL

p = 0,923

0,18

0,33

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

% to

egen

omen

tov

eind

gew

.

milt gewicht

Sham PPVL

p = 0,001

31

In figuur 16 wordt een significante daling (p = 0,009) in gewicht tussen de PPVL- en sham-

groep opgemerkt wanneer geen rekening gehouden wordt met het gewicht van de lever en

milt. Wanneer het gewicht van de lever en milt wel in rekening wordt gebracht (eindgewicht -

lever - milt) – (begingewicht - gemiddelde leversham - gemiddelde miltsham) zien we geen

significante daling maar wel een trend (0,1 > p > 0,05 ). Het gewicht van de PPVL-groep

zonder rekening te houden met lever en milt is lager dan bij de sham-groep.

Figuur 15: Het gewichtverloop van de PPVL- en sham-ratten gedurende twee weken vanaf dag 0. (W = week, D = dag)

Figuur 16: Het toegenomen gewicht bij de PPVL- en sham-groep na 2 twee weken. Links: Het toegenomen gewicht in % ten opzichte van het begingewicht zowel van de PPVL- als de sham-ratten. Rechts: Het gewicht van de PPVL- en sham-ratten zonder het gewicht van de lever en milt mee te wegen, uitgedrukt in gram.

200,67 200,22 201,67211,67

221,11

221,00225,25

244,88262,13

278,25

0

50

100

150

200

250

300

W1D1 W1D4 W2D1 W2D4 W3D1

gew

icht

(gr

am)

tijdsverloop gewicht (2 weken)

PPVL

shamp = 0,001p = 0,001 p = 0,001p = 0,001 p = 0,002

26,00 10,35

-10

0

10

20

30

40

toeg

enom

en g

ewic

ht (

%)

% toegenomen gewicht na 2 weken tov dag 0

Sham PPVL

p = 0,009

41,13

22,74

-505

101520253035404550

gew

icht

(gr

am)

gewicht zonder lever en milt

Sham PPVL

p = 0.083

32

2.2 Voeding en drank

De hoeveelheid opgenomen voeding en drank werd elke week twee maal gecontroleerd,

zowel voor de PPVL- als de sham-ratten. Onderstaande grafieken geven de resultaten van de

gemiddelde hoeveelheid opgenomen voeding en drank weer bij de PPVL- en de sham-ratten

(figuur 17). Zowel voor de voeding als de drank zien we een significante daling (p = 0,001) in

de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep.

Figuur 17: De totale hoeveelheid voeding en water opgenomen door de PPVL- en sham-ratten in twee weken tijd.

2.3 Vetmeting

Vetmeting werd uitgevoerd op HE gekleurde coupes van het visceraal peritoneum. Door de

perimeter van vetcellen te meten in het visceraal peritoneum van zowel PPVL- als sham-

ratten, konden we nagaan of er verschil was in de vetlaag tussen de 2 groepen[16]. Figuur 18

toont hoe het visceraal peritoneum is opgebouwd en hoe de perimeter van de vetcellen werd

bepaald. Figuur 19 geeft de resultaten van de perimeter van de PPVL- en sham-ratten. Er is

geen significant verschil (p > 0,05) te merken tussen de perimeter van de vetcellen van de

PPVL- en sham-groep.

342,75

213,350

100

200

300

400

500

gem

opg

enom

en

hoev

eelh

eid

voed

ing

(gra

m) totale hoeveelheid

opgenomen voeding na 2 weken

Sham PPVL

p = 0,001

450,00

338,89

0

100

200

300

400

500

600

opge

nom

en h

oeve

elhe

id

dran

k (m

L)

totale hoeveelheid opgenomen water na 2

weken

Sham PPVL

p = 0,001

33

.

Figuur 18: Visceraal peritoneum. Links boven: 10x vergroot, rechts boven: 20x vergroot, links onder: De vetlaag in het visceraal peritoneum. De manier waarop de perimeter van de vetcellen gemeten werd.

Figuur 19: De resultaten van de vetcel perimeter bij de PPVL- en sham-ratten.

150,72 122,48

0

50

100

150

200

perim

eter

(µ

m)

perimeter

Sham PPVL

p = 0,248

submucosa mucosa musculari

mucosa (epitheel)

34

3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

3.1 Leptine

De resultaten van de leptine ELISA test staan hieronder weergegeven in de grafieken van

figuur 20. De hoeveelheid leptine werd zowel op serum als op vetlysaat getest.

Zowel in het serum als in het vetlysaat is er een daling van de hoeveelheid leptine in de

PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep, maar deze daling is bij beide groepen niet

significant verschillend (p > 0,05).

Figuur 20: Leptine ELISA in serum (links) en vetlysaat (rechts) van PPVL- en sham-ratten.

3.2 Adiponectine

Net zoals bij leptine wordt ook bij adiponectine de concentratie in zowel serum als vetlysaat

nagegaan. De grafieken met de resultaten van de adiponectine ELISA test worden

weergegeven in figuur 21.

De hoeveelheid adiponectine in zowel het serum als het vetlysaat van de PPVL-ratten blijft

ongeveer hetzelfde als de hoeveelheid adiponectine in het serum en vetlysaat van de sham-

ratten. Er is geen significant verschil tussen de PPVL- en de sham-groep (p > 0,05).

338,24242,55

0

100

200

300

400

500

gem

idde

lde

lept

ine

(ng/

mL)

leptine serum

sham PPVL

p = 0,201

182,20 98,020

50

100

150

200

250

300

350

gem

idde

lde

lept

ine

(ng/

mg)

leptine/totaal eiwit in vetlysaat

sham PPVL

p = 0,234

35

Figuur 21: Adiponectine ELISA in serum en vetlysaat bij PPVL- en sham-ratten.

3.3 Ghreline

De resultaten van serum ghreline worden weergegeven in figuur 22. Er is geen significant

verschil (p > 0,05) op te merken tussen de ghreline waarden van de sham-groep en de PPVL-

groep.

Figuur 22: Ghreline ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.

3.4 Albumine

De grafiek met de resultaten van de albumineconcentratie in serum wordt in figuur 23

weergegeven. Er is een significante daling (p = 0,02) van de hoeveelheid albumine in serum

bij de PPVL ten opzichte van de hoeveelheid albumine in het serum bij de sham-groep.

2.917,37

3.761,29

0

1000

2000

3000

4000

5000

geem

idde

lde

adip

onec

tine

(ng/

mL)

serum adiponectine

sham PPVL

p = 0,251

134,77 92,83

0

50

100

150

200

250

gem

idde

lde

adip

onec

tine

(ng/

mg)

adiponectine/totaal eiwit in vetlysaat

Sham PPVL

p = 0,251

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

gem

idde

lde

ghre

line

(ng/

mL)

serum ghreline

Sham PPVL

p = 0,293

36

Figuur 23: Albumine ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.

3.5 Insuline

De concentratie van insuline in serum wordt weergegeven in figuur 24. De serumconcentratie

van insuline in de PPVL-groep is gelijk als in de sham-groep. Er is dus geen significant

verschil tussen beide groepen (p > 0,05).

Figuur 24: Insuline ELISA test in serum bij PPVL- en sham-ratten.

3.6 Inflammatie merkers

De resultaten van de hoeveelheid inflammatie bij de PPVL- en sham-ratten worden

weergegeven in figuur 25. Zowel TNF-α als IL-6 zijn verhoogd in de PPVL-groep in

vergelijking met de sham-groep. Bij IL-6 zien we een significante stijging (p < 0,001) in de

PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. De stijging van TNF-α bij de PPVL-groep is

38,58 33,01

0

10

20

30

40

50ge

mid

deld

e al

bum

ine

(g/L

)albumine

sham PPVL

p = 0,02

569,00 565,00

0

200

400

600

800

1000

1200

gem

idde

lde

insu

line

(ng/

mL)

insuline

Sham PPVL

p = 1,00

37

niet significant verschillend van de sham-groep (p > 0,05), maar is wel een trend te zien ( 0,05

< p < 0,1) wat wijst op een relevante stijging van de TNF-α bij PPVL-ratten.

Figuur 25: TNF-α en IL- 6 ELISA test in serum van PPVL- en sham-ratten.

4. Resultaten uit het routinelabo

4.1 Aminotransferasen

De grafieken met de resultaten van AST en ALT in serum worden weergegeven in figuur 26.

Zowel AST als AST zijn significant gestegen in vergelijking met de sham-groep

(respectievelijk p = 0,001 en p = 0,006).

-

Figuur 26: Resultaten van AST en ALT in serum bij PPVL- en sham-ratten.

0,27

4,84

-10

-5

0

5

10

15

20

gem

idde

lde

TN

F-α

(pg/

mL)

serum TNF-α

Sham PPVL

p =0,097

3,77

43,26

-20

-10

0

10

20

30

40

50

gem

idde

lde

IL-6

(pg

/mL)

serum IL-6

Sham PPVL

p = 0,000

44,80119,38

0

50

100

150

200

gem

idde

lde

AS

T (

U/L

) AST

sham ppvl

p =0,001

28,09 72,80

0

20

40

60

80

100

120

140

gem

idde

lde

ALT

(U

/L)

ALT

sham ppvl

p = 0,006

38

4.2 Glucose

De concentratie van glucose in serum wordt weergegeven in figuur 27. De serumconcentratie

van glucose in de PPVL-groep is ongeveer gelijk als in de sham-groep. Er is dus geen

significant verschil tussen beide groepen (p > 0,05).

Figuur 27: Insuline ELISA test in serum bij PPVL- en sham-ratten.

4.3 Metalen

De grafieken met de resultaten van de serumconcentraties worden weergegeven in figuur 28.

Als we de concentratie van de metalen van de PPVL-groep vergelijken met de sham-groep

zijn er geen significante verschillen (p > 0,05). De concentraties van de metalen zijn dus niet

significant veranderd bij de PPVL-groep.

Figuur 28: Resultaten van serum zink en koper bij PPVL- en sham-ratten

1,55 1,49

0

0,5

1

1,5

2

2,5

gem

idde

lde

gluc

ose

(g/L

)

glucose

sham ppvl

p = 1,00

111,45 118,75

020406080

100120140

gem

idde

lde

zink

(µ

g/dL

)

zink

sham ppvl

p = 0,439

111,66 111,15

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

gem

idde

lde

kope

r(µ

g/dL

)

koper

sham ppvl

p = 0,796

39

4.4 Bilirubine

De hoeveelheid totaal bilirubine in het serum wordt weergegeven in figuur 29. Wanneer de

PPVL-groep wordt vergeleken met de sham-groep zien we een stijging van de hoeveelheid

bilirubine in de PPVL-groep, maar deze is echter niet significant (p > 0,05) [12].

Figuur 29: Resultaten van serum bilirubine bij PPVL- en sham-ratten.

4.5 Vitamines

Enkele vetoplosbare vitamines werden gemeten om vetmalabsorptie na te gaan. De resultaten

van deze testen worden hieronder in figuur 30 weergegeven. Zowel vitamine A als D vertonen

geen significant verschil in de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. Vitamine E

daarentegen kent wel een significante stijging (p = 0,008) in de PPVL-groep in vergelijking

met de sham-groep.

0,05 0,100

0,05

0,1

0,15

0,2

gem

idde

lde

bilir

ubin

e (m

g/dL

)

bilirubine

sham ppvl

p = 0,109

36,72 29,52

0

10

20

30

40

50

gem

idde

lde

vit A

(µ

g/dL

)

vitamine A

sham ppvl

p = 0,306

23,47 27,91

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

gem

idde

lde

vit D

(ng/

dL)

vitamine D

sham ppvl

p = 0,175

40

Figuur 30: De resultaten van vitamine A, D en E in serum van PPVL- en sham-ratten.

5. Insulineresistentie

Aan de hand van de HOMA index kan nagegaan worden of er insulineresistent aanwezig is.

Wanneer de waarde van de HOMA index boven de 1 ligt is er sprake van insulineresistentie.

De formule van de HOMA index is: HOMA = ��

�� waarbij de

normalisatiefactor glucose x insuline voorstelt van een niet insulineresistente populatie. De

sham-ratten vertegenwoordigen de niet insulineresistente populatie. Hierdoor kan er geen

HOMA index van de sham-ratten berekend worden [17]. De HOMA index van de PPVL-

ratten is 0,94 ± 0,72. Hieruit kan besloten worden dat de PPVL-ratten niet insulineresistent

zijn.

6. Samenvattende tabel

Tabel 3: Een samenvatting van alle resultaten met de p-waarde en significantie.

sham PPVL p-waarde significant

PVP (mmHg) 5 11,9 ± 3,78 ↑

ABD (mmHg) 100 84,31 ± 17,13 ↓

hartslag (slagen/min) 260-600 639 ± 67,93 ↑

ALT (U/L) 28,09 ± 8,43 72,80 ± 49,93 0,006 ↑

AST (U/L) 44,80 ± 6,67 119,38 ± 63,73 0,001 ↑

Bilirubine (mg/dL) 0,05 ± 0,03 0,10 ± 0,05 0,109 niet

Albumine (g/L) 38,58 ± 0,56 33,01 ± 2,08 0,020 ↓

Vitamine A (µg/dL) 36,72 ± 4,97 29,52 ± 10,60 0,306 niet

0,51

0,78

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

gem

idde

lde

vit E

(µ

g/dL

)vit E

sham ppvl

p = 0,008

41

Vitamine D (ng/dL) 23,47 ± 4,24 27,91 ± 6,03 0,175 niet

Vitamine E (µg/dL) 0,51 ± 0,130 0,78 ± 0,19 0,008 ↑

Zink (µg/dL) 111,45 ± 8,54 118,75 ± 14,10 0,439 niet

Koper (µg/dL) 111,66 ± 13,9 111,20 ± 25,60 0,796 niet

Glucose (g/L) 1,55 ± 0,4 1,49 ± 0,24 1,000 niet

Insuline (ng/mL) 569,00 ± 406,35 565,00 ± 395,24 1,000 niet

IL6 (pg/mL) 3,77 ± 5,46 43,26 ± 17,05 0,000 ↑

TNFα (pg/mL) 0,27 ± 0,42 4,84 ± 9,90 0,097 ↑

Leptine serum (ng/mL) 338,24 ± 109,30 242,55 ± 93,15 0,201 niet

Leptine vet (ng/mg) 182,20 ± 146,44 98,02 ± 20,45 0,234 niet

Adiponectine serum (ng/mL) 2917,37 ± 1570,38 3761,29 ± 753,46 0,251 niet

Adiponectine vet (ng/mg) 134,77 ± 73,13 92,83 ± 44,33 0,251 niet

Ghreline serum (ng/mL) 2,34 ± 0,97 2,86 ± 1,28 0,293 niet

Toegenomen gewicht eind-begin (%) 26,00 ± 4,58 10,35 ± 12,21 0,001 ↓

Voeding eind-begin (gram) 342,75 ± 21,69 213,35 ± 47,26 0,001 ↓

Drank eind-begin (mL) 450,00 ±35,56 338,89 ± 71,32 0,001 ↓

Gewicht zonder lever en milt (gram) 41,13 ± 6,02 22,74 ± 22,71 0,083 niet

Vetcelomtrek (µm) 150,72 ± 25,13 122,48 ± 27,06 0,248 niet

Milt (%) 0,18 ± 0,028 0,33 ± 0,08 0,001 ↑

Lever (%) 2,61 ± 0,118 2,56 ± 0,37 0,923 niet Metavir score F0 F1

HOMA-index 0,94 ± 0,72

42

DISCUSSIE

1. Bespreking Het gewicht, de opgenomen hoeveelheid voeding en drank, de perimeter van de vetcellen,

interleukines, sporenelementen, hormonen, merkers voor leverschade en van het koolhydraat

mechanisme werden onderzocht om na te gaan of PHT een invloed heeft op de voeding van

ratten. Op deze manier trachten we te achterhalen of er een relatie is tussen PHT en de

voedingtoestand van de ratten. Twee groepen ratten werden getest, namelijk ratten met PHT

en sham geopereerde ratten als controlegroep.

Een belangrijke opmerking die moet gemaakt worden is dat de sham-ratten pas na 4 weken

gesacrificeerd werden terwijl dit bij de PPVL-groep al na twee weken gebeurde. We zijn ons

ervan bewust dat deze condities niet optimaal zijn. Het is vooral uit ethische reden dat de

sham-ratten 2 weken langer geleefd hebben dan de PPVL-ratten. De sham-groep heeft als

controle gediend voor zowel mijn thesis als voor de thesis van een medestudente, Nathalie

Michels. De thesis van Nathalie ging over hetzelfde onderwerp als mijn thesis, maar in plaats

van PPVL-ratten gebruikte Nathalie CBDL-ratten die 4 weken moesten overleven om

levercirrose te bekomen. Doordat de parameters van sham-ratten normaal gezien constant

blijven over de tijd, werd aangenomen dat de sham-groep ook als controle voor de PPVL-

ratten kon gebruikt worden [26].

De PPVL-techniek wordt veel gebruikt om een diermodel met geïsoleerde PHT zonder cirrose

te ontwikkelen. Het PPVL-model ontstaat door stenose van de vena porta, waardoor

prehepatische PHT ontstaat. Hemodynamische metingen werden uitgevoerd in de PPVL-rat

14 dagen na inductie, een periode met splanchnische vasodilatie, hyperdynamische circulatie

en portale systemische collateralen.

De normale PVP bedraagt ongeveer 5 mmHg. PHT treedt op vanaf 10 mmHg, complicaties

bij 12 mmHg of meer [11]. De PVP is significant hoger in de PPVL-groep ten opzichte van de

controlegroep. In een recent artikel werd aangetoond dat na de PPVL-operatie er een

progressieve toename van de PVP optreedt gedurende de eerste week en dat nadien een

plateau wordt bereikt [11,12]. De plateaufase die bereikt werd is het gevolg van de portale-

systemische collaterale vaten die ontstaan [12]. Doordat de weerstand in de portale vene is

toegenomen, ontstaat er een grotere bloedpool in het splanchnisch systeem, waardoor hier een

veel hogere druk ontstaat. Als gevolg hiervan zal het circulerend systemische bloed dalen wat

43

resulteert in een gedaalde bloeddruk. De baroreceptoren van de carotis nemen deze lagere

bloeddruk waar waardoor de hartslag en bijgevolg het hartdebiet zal stijgen. Dit resulteert in

een hyperdynamische circulatie. Ondanks deze stijging in het hartdebiet blijft de gemiddelde

arteriële bloeddruk lager dan normaal. Samengevat: gemiddelde arteriële bloeddruk ↓ = totale

perifere weerstand ↓↓ x hartdebiet ↑

Zowel de lever als het mesenterium (visceraal peritoneum) werden gekleurd met

haematoxyline-eosine (HE) kleuring.

Deze kleuring werd bij de lever gedaan om na te gaan of er geen hepatocellulaire

schade aanwezig was waardoor de parameters beïnvloed konden worden. Na histologische

analyse door een patholoog was er geen schade te zien op de leversecties.

Aan de hand van een sirius red kleuring van de lever konden we zien dat sham-ratten

(F0 Metavir-score) geen fibrose ontwikkelen. De PPVL-ratten (F1 Metavir-score)

ontwikkelden discrete portale fibrose. PPVL-ratten zouden normaal geen fibrose mogen

ontwikkelen omdat PPVL een model is voor geïsoleerde PHT zonder leverdysfunctie.

Pathologisch onderzoek toonde een beperkte infiltratie van inflammatoire cellen rond de

galwegen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat tijdens de inductie de arteria hepatica licht

werd geraakt (niet afgebonden) waardoor dit finaal een biliaire reactie zou kunnen teweeg

brengen. Door de aanwezigheid van milde portale fibrose in de PPVL-ratten is het mogelijk

dat deze fibrose een bijdrage levert aan bepaalde biochemische testen zoals koper, AST en

ALT en vitamines; in de PPVL-ratten.

In het visceraal peritoneum werd de perimeter van de vetcellen bepaald bij zowel de

PPVL- als de sham-ratten. Er bleek geen significant verschil te zijn in de perimeter van de

vetcellen bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Dit zegt enkel dat de grootte

van de vetcellen ongeveer gelijk zijn en zegt niets over de totale hoeveelheid vetcellen die

aanwezig zijn. Om de hoeveelheid vet in de ratten te bepalen zijn verschillende methodes

uitgetest zoals het meten van de huidplooidikte, de dikte van de panniculus adiposus, maar

geen van beide bleken geschikt om in de praktijk toe te passen. De betrouwbaarheid van de

perimeter metingen zijn echter ook niet 100 procent. De keuze van de vetcellen waarvan de

perimeter bepaald werd gebeurde at random maar het was soms zeer moeilijk om de vetcellen

van elkaar te onderscheiden.

Om na te gaan of PHT een invloed heeft op de voedingstoestand van de ratten werd de

hoeveelheid eten en drinken gemeten die de PPVL- en sham-ratten hadden opgenomen.

Vermits de PPVL-ratten significant minder gegeten en gedronken hadden is ook hun gewicht

44

significant afgenomen in vergelijking met de sham-ratten. De eetlust van de PPVL-ratten was

dus kleiner dan van de sham-ratten.

Er was geen significant verschil tussen de PPVL- en sham-groep wat betreft het levergewicht.

Bij de PPVL-ratten zou de lever geen cirrose mogen ontwikkelen en dus geen stijging in

levergewicht mogen veroorzaken.

Het gewicht van de milt is wel significant toegenomen in de PPVL-groep in vergelijking met

de sham-groep. In het artikel van Fernandez et al is bewezen dat bij PHT de grootte van de

milt parallel loopt met een verhoogde portale druk [12]. De verklaring hiervoor is dat door

stijging van de portale druk er stuwing in de milt bloedvaten ontstaat waardoor het gewicht

van de milt zal toenemen.

2. Biochemische merkers Leptine, ghreline en adiponectine zijn 3 hormonen die betrokken zijn bij de regeling van het

energiemetabolisme en dus aan de oorzaak kunnen liggen van malnutritie.

Zowel in het serum als het vetlysaat is er een daling van de hoeveelheid leptine bij de

PPVL-groep. Deze daling is echter niet significant verschillend van de sham-groep. Dit kan

veroorzaakt worden door enerzijds een daling van het totale vetgehalte in PPVL- versus

sham-ratten of anderzijds een daling van de metabole activiteit van elke vetcel. De eerste

mogelijkheid werd niet onderzocht en dit zou in de toekomst belangrijk zijn om te bestuderen.

Wanneer de hoeveelheid leptine, geproduceerd door de vetcellen, in relatie gebracht wordt

met de grootte van de vetcellen kan de metabolische activiteit van elke vetcel achterhaald

worden. Vermits de perimeter van de PPVL-vetcellen kleiner is dan deze van de sham-

vetcellen, kan gesteld worden dat er bij een bepaalde concentratie meer (maar kleinere)

vetcellen aanwezig zijn bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Doordat er

meer vetcellen zijn maar een kleiner productie van leptine bekomen wordt, zal de metabole

activiteit per vetcel lager zijn bij de PPVL-groep in vergelijking met de sham-groep. Deze

gedaalde activiteit zou normaliter moeten resulteren in een verhoogde voedingsopname, maar

dit komt niet overeen met onze resultaten over de opgenomen voeding. Mogelijks zijn er

andere factoren die een sterkere invloed hebben op de eetlust. Er kan niet worden gesproken

van leptineresistentie (ongevoeligheid van de leptinereceptor voor leptine) vermits de

leptinehoeveelheid dan zou moeten stijgen in de PPVL-groep.

45

In normale omstandigheden is adiponectine detecteerbaar in het plasma [17]. Bij vet-

accumulatie, voornamelijk visceraal vet, ontstaat er een disregulatie van de adiponectine-

functie en oversecretie van TNF-α wat een sterke inhibitor is van adiponectine [21]. Uit onze

resultaten van zowel het serum als het vetlysaat kunnen we opmerken dat de adiponectine

niveaus niet veranderd zijn vermits er geen significant verschil is tussen de PPVL- en de

sham-groep. Hieruit blijkt dat er weinig of geen disregulatie is opgetreden door TNF-α.

Adiponectine is nog altijd in grote hoeveelheid aanwezig en kan zijn beschermende rol blijven

uitoefenen [21]. Er is geen verhoogde kans op insulineresistentie, wat inderdaad op basis van

de HOMA index en de hoeveelheid adiponectine kan worden vermoed. Net zoals bij leptine

kan de metabole activiteit van elke vetcel nagegaan worden. Bij de PPVL-groep hebben we

meer (maar kleinere) vetcellen voor een bepaalde concentratie vet wat resulteert in een grotere

adiponectine productie per vetcel. Vermits de adiponectine-concentratie omgekeerd evenredig

is met de vetaccumulatie kan deze grotere productie van adiponectine mogelijks gelinkt

worden aan een gedaalde hoeveelheid vet en dus een lager gewicht bij de PPVL-ratten in

vergelijking met de sham-ratten.

Ghreline is een hormoon dat voedselinname stimuleert en dus de eetlust opwekt. Uit

onze resultaten blijkt dat ghreline waarden van de sham- en PPVL-groep ongeveer gelijk zijn.

Dit wil zeggen dat de gedaalde eetlust bij de PPVL-ratten in vergelijking met de sham-ratten

niet verklaard kan worden op basis van verschillen in ghreline. De resultaten van ghreline zijn

mogelijks niet 100% betrouwbaar vermits de serumstalen meerdere malen werden ontdooid

voordat de ELISA werd uitgevoerd waardoor er mogelijks eiwitafbraak aanwezig is. Een

andere oorzaak voor de gelijke waarden kan liggen aan de vasttijd voor de exsanguinatie.

Zowel de sham- als PPVL-ratten moesten overnacht vasten voor de exsanguinatie plaats vond,

waardoor de ghreline waarden manueel gestimuleerd zijn.

De verhoging van de aminotransferasen bij de PPVL-ratten wijst mogelijks op schade aan de

hepatocyten. Normaal gezien mogen PPVL-ratten geen hepatocellulaire schade hebben

vermits er enkel pre-hepatisch een vernauwing is aangebracht en dit geen leverschade

veroorzaakt. De verhoging van AST en ALT zou kunnen gelinkt worden aan de milde portale

fibrose aanwezig in de PPVL-ratten. Vermits er volgens pathologisch onderzoek geen schade

is aan de levercellen zou de verhoging van de aminotransferasen ook verklaard kunnen

worden door het hemolytisch karakter van het serum.

46

Er is een significante daling van de hoeveelheid albumine in de PPVL-groep in vergelijking

met de sham-groep. Door stijging van de druk in de viscerale vaten ontstaat er stuwing in de

dunne darm wat kan resulteren in albumineverlies.

De hoeveelheid IL-6 en TNF-α werden gemeten om de hoeveelheid inflammatie na te gaan.

De significant verhoogde hoeveelheid IL-6 en de trend bij TNF-α wijzen erop dat er

inflammatie aanwezig is bij de PPVL-ratten. IL-6 heeft naast zijn inflammatoire functie ook

andere functies zoals het inhiberen van de adiponectine activiteit [21]. De niet prominente

stijging van TNF-α verklaart mogelijks ook de normale concentratie van adiponectine gezien

TNF-α een remmende werking heeft op adiponectine vrijstelling. De upregulatie van TNF-α

is dus minder extreem dan deze van IL-6. Uit de studie van Lopez-Talavera JC et al. weten we

ook dat TNF-α een rol speelt bij de hemodynamische abnormaliteiten van PHT [23]. De

borderline verhoging van TNF-α bij de PPVL-ratten zou dus mee aan de basis kunnen liggen

van de hyperdynamische situatie.

Uit de resultaten van de vetoplosbare vitamine A, E en D blijkt dat enkel vitamine E

significant gestegen is in de PPVL-groep ten opzichte van de sham-groep. De oorzaak van dit

resultaat is onbekend. Vermits er bij geen van de drie vitamines een significante daling in de

PPVL-groep is opgetreden gaan we ervan uit dat er geen vetmalabsorptie is bij de PPVL-

groep.

Om na te gaan of de PPVL-ratten insulineresistent zijn werd de hoeveelheid glucose en

insuline nagegaan. Beide merkers waren niet significant verschillend in de PPVL-groep ten

opzichte van de sham-groep. Vermits de waarde van de HOMA index onder 1 ligt kan ervan

uitgegaan worden dat de PPVL-ratten niet insulineresistent zijn. Dit resultaat kan bevestigd

worden aan de hand van het hoge adiponectineniveau, dat een beschermer is voor

insulineresistentie.

PHT heeft geen invloed op koper en zink. Deze metalen kunnen op een efficiënte manier

gemetaboliseerd worden door de lever waardoor het de normale waarden benaderd.

Net zoals bij koper wordt bilirubine ook uitgescheiden via de gal. Aangezien er bij de PPVL-

ratten geen problemen zijn met de gal, is het bilirubine metabolisme niet verstoord bij de

PPVL-groep.

47

3. Eindconclusie De resultaten van onze studie wijzen erop dat PHT ( inclusief de milde portale fibrose) een

invloed heeft op de voedingstoestand van de ratten. De eetlust van de PPVL-ratten is gedaald

wat resulteert in een daling van het gewicht. We kunnen besluiten dat de merkers leptine,

adiponectine, ghreline, glucose, insuline, vitamine A en D, koper, zink en bilirubine geen

significante verandering ondergaan hebben. Deze merkers zijn dus niet gerelateerd aan de

verminderde voedselopname bij PPVL-ratten. Daarentegen is albumine significant gedaald en

IL-6 significant en TNF-α borderline significant gestegen bij de PPVL-groep. Aan de hand

van TNF-α en IL-6 zien we dat bij de PPVL-ratten er wel degelijk inflammatie optreedt. De

daling van albumine wijst erop dat er eiwitverlies optreedt als gevolg van de stuwing in de

viscerale vaten. De hypermetabole status, inflammatie en het mogelijks intestinaal

eiwitverlies zouden aan de basis kunnen liggen voor de verminderde vrijwillige

voedselopname bij PHT.

4. De invloed van een cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten.

Het CBDL-model is een model voor acute cholestase waarbij 4 weken na inductie cirrose

ontstaat. Het CBDL-ratmodel wordt geïnduceerd door een dubbele ligatie van de

hoofdgalweg. Vervolgens wordt de hoofdgalweg tussen de 2 afsnoeringen doorgesneden [12].

Naast een cirrotische lever ontwikkelen de dieren ook PHT. Om de additieve invloed van deze

cirrotische lever op de voedingstoestand van ratten na te gaan, wordt het CBDL-model

vergeleken met het PPVL-model. Doordat Nathalie en ik bij het praktische gedeelte van onze

thesis nauw hebben samengewerkt, kunnen we onze resultaten met elkaar vergelijken. Een

overzicht hiervan vindt u in bijlage.

De ratten ontwikkelen cholestase wat resulteert in significant verhoogde bilirubine en koper

waarden. Deze merkers zijn verhoogd doordat ze niet meer efficiënt uitgescheiden kunnen

worden via de gal. Zowel de cholestase als een verminderde darmbarrièrefunctie zijn de

oorzaken van de verhoogde inflammatie merkers. Als gevolg van de cholestase hebben

CBDL-ratten ook een gestoorde vetabsorptie, hierdoor ontstaan significant verlaagde waarden

voor de vet oplosbare vitamines. Uit de resultaten blijkt de perimeter van de vetcellen kleiner

te zijn bij de CBDL-ratten, mogelijks de oorzaak van de vetmalabsorptie.

48

De verhoging van de aminotransferasen kunnen verklaard worden door de aanwezigheid van

de histopathologische veranderingen in de lever. Deze significant verhoogde waarden wijzen

op leverschade bij de CBDL-ratten. Als gevolg van de levercirrose is het gewicht van de lever

ook significant gestegen, deze stijging is niet waarneembaar bij de PPVL-ratten.

Vermits de lever verantwoordelijk is voor de albuminesynthese, ontstaat er een daling van de

albuminehoeveelheid bij de CBDL-ratten. Deze daling is nog meer uitgesproken door

eventuele stuwing in de viscerale vaten als gevolg van de portale hypertensie.

Splenomegalie, als gevolg van de groter bloedpool, is een indicator voor PHT. Het wordt

zowel bij de PPVL- als CBDL-ratten teruggevonden. Bij de CBDL-ratten werden geen

hemodynamische metingen uitgevoerd waardoor de aanwezigheid van PHT enkel via het

verhoogde milt gewicht kan bewezen worden. Normalerwijze hebben CBDL-ratten net zoals

de PPVL-ratten een hyperdynamische circulatie, splanchnische vasodilatie en de ontwikkeling

van portale systemische collateralen [12].

Wat betreft malnutritie bij de CBDL-ratten, merken we dat het gewicht, de opgenomen

hoeveelheid eten en drank niet significant veranderd zijn in vergelijking met de sham-ratten.

Wanneer we het gewicht van de lever en milt in rekening brengen, is er wel een trend tot

daling in het gewicht van de CBDL-ratten. Deze trend wijst erop dat de CBDL-ratten wel

degelijk iets minder eten dan de sham-groep, maar deze daling is niet significant verschillend

zoals bij de PPVL-ratten.

De CBDL-waarden van zowel serum ghreline, vetlysaat leptine, serum en vetlysaat

adiponectine lopen gelijk met de PPVL-ratten. Vermits de voedselopname van de PPVL-

ratten significant lager was dan de CBDL-ratten, kan geconludeerd worden dat deze merkers

geen invloed hebben op de voedingsinname van de dieren. Enkel het serumleptine kent een

significante daling bij de CBDL-ratten wat mogelijks de oorzaak is van een daling van de

hoeveelheid vet bij CBDL-ratten en misschien de reden waarom ze meer voeding opnamen.

Malnutritie bij CBDL-ratten wordt veroorzaakt door leverschade, malabsorptie, een

verminderde leversynthesefunctie, hypermetabole toestand, inflammatie en een verhoogd

intestinaal eiwitverlies. De laatste 3 oorzaken worden ook teruggevonden bij PHT. De

vrijwillige voedingsopname blijft ongeveer hetzelfde als bij de controledieren. De invloed van

een cirrotische lever op de malnutritie zal dus bepaald worden door de leverschade,

malabsorptie en de verminderde lever synthese functie.

49

In de toekomst zou het zeker interessant zijn om de relatie van de drie modellen, namelijk

CBDL, PPVL en CCl4 met de voedingstoestand te onderzoeken.

50

REFERENTIES 1. Marieb EN, Mallat J, Wilhelm PB (2005). Human anatomy 4th edition. San Francisco: Benjamin

Cummings, pp: 634-641. 2. Bacon BR, O’Grady JG, DI Bisceglie AM, Lake JR (2006). Comprehensive Clinical hepatology. Mosby

elsevier. 3. Leroux, Gillebert, Kaufman, Vanholder, Joos, Van Vlierberghe, Leroux-Roels, Vogelaers, De Keyser,

De Vos, Loeys, Ruige, Petrovic, Boon, Santens, Offner, Decruyenaere, Cuvelier, Peeters (2007).Cursus Pathogenese van ziekten (3e jaar bachelor Biomedische Wetenschappen).

4. Tarun K, Gupta TK, Chen L, Groszmann RJ (1997). Pathophysiology of portal hypertension. Baillieres clinical gastroenterology 11(2):203-19.

5. Escorsell A, Bosh J (1998). Pathogenesis of bleeding in portal hypertension. Pathogenesis of bleeding and hepatorenal syndrome 59(2):2-5.

6. Groszmann RJ, Abraldes JG (2005). Portal hypertension from bedside to bench. Journal clinical gastroenterology 39(2):125-130.

7. D’amico G, Pagliaro L, Bosch J (1995). The treatment of Portal Hypertension: a meta-analytic review Hepatology 332-354.

8. Bosch J, Abraldes JG, Groszmann (2003). Current management of portal hypertension. Journal of hepatology 38:S54-S68.

9. Shah V (2007). Molecular mechanisms of increased intrahepatic resistance in portal hypertension. Journal clinical gastroenterology 41:259-261.

10. Abraldes JG, Pasarin M, Garcia-Pagan J (2006). Animal models of portal hypertension. World journal gastroenterology 12:6577-6584.

11. Geerts AM, Vanheule E, Praet M, Van Vlierberghe H, De Vis M, Colle I (2008). Comparison of three research models of portal hypertension in mice: macroscopic, histological and portal pressure evaluation. Int. J. Exp. Pathology 89:251-263.

12. Fernandez M, Vizzutti F, Garca-Pagan JC, Rodes J, Bosch J (2004). Anti-VEGF receptor-2 monoclonal antibody prevents portal-systemic collateral vessel formation in portal hypertensive mice. Gastroenterology 126: 886-894.

13. Tsiausi ET, Hatzitolios AI, Trygonis SK, Savopoulos CG (2008). Malnutrition in end stage liver disease: Recommendations and nutritional support. Journal of gastroenterology and hepatology 23(4):527-532.

14. Cabré E, Gassull MA (2001). Nutritional aspects of liver disease and transplantation. Current opinion in clinical nutrition and metabolic care 4: 581-589.

15. Limdi JK, Hyde GM (2003). Evaluation of abnormal liver function tests. Postgrad. Medicine journal 79: 307-312.

16. Bing C, Russell S, Becket E, Pope M, Tisdale MJ, Trayhurn P, JenkinsJR (2006). Adipose atrophy in cancer cachxia: morphologic and molecular analysis of adipose tissue in tumor-bearing mice. British journal of cancer 95: 1028-1037.

17. Fevery J (2007). Vetlever en steatohepatitis: de sleutelrol van insulineresistentie. Zorg, onderzoek en ontwikkeling 4-11.

18. Meier U, Gressner AM (2004). Endocrine regulation of energy metabolism: review of pathobiochemical and clinical chemical aspects of leptin, ghrelin, adiponectin, and resistin. Clinical Chem 50(9): 1511-25.

19. De Graaf C, Blom W, Smeets P, Stafleu A, Hendriks H (2004). Biomarkers of satiation and satiety. Clinical Nutrition 79:946-961.

20. Tacke F, Wüstefeld T, Horn R, Luedde T, Rao AS, Manns MP, Trautwein C, Brabant G (2005). High adiponectin in chronis liver disease and cholestasis suggests biliary route of adiponectin excretion in vivo. Journal of hepatology 42: 666-673.

21. Matsuzawa Y (2006). The metabolic syndrome and adipocytokines. FEBS letters 580: 2917-2921 22. http://www.zol.be/printversie.asp?id=312 23. Lopez-Talavera JC, Merrill WW, Groszmann RJ (1995). TNF-α: Major contributor to the hyperdynamic

circulation in prehepatic portal-hypertensive rats. Gastroenterology 108: 761-767. 24. http://users.telenet.be/leeflang/algemeen/vitaminen/ 25. Stamoulis I, Kouraklis G, Theocharis S (2007). Zinc and the liver: an active interaction. Dig. dis. sci.

52 :1595-1612. 26. Fox JG, Anderson LC, Loew FM, Quimby FW (1984). Laboratory animal medicine 2nd edition.

American College of Laboratory.

Bijlage: Vergelijkende tabel tussen sham-, CBDL- en PPVL-ratten.

sham (4 weken) sham (2 weken) CBDL p-waarde tov sham PPVL

p-waarde tov sham

ALT (U/L) 28,09 ± 8,426 103,578 ± 30,67 0,000 72,8 ± 49,93 0,006 AST (U/L) 44,80 ± 6,670 328,93 ± 144,56 0,000 119,38 ± 63,73 0,001 Bilirubine (mg/dL) 0,05 ± 0,023 9,052 ± 1,41 0,000 0,10 ± 0,053 0,109 Albumine (g/L) 38,58 ± 0,562 29,111 ± 1,395 0,002 33,01 ± 2,08 0,020 Vitamine A (µg/dL) 36,72 ± 4,970 25,843 ± 9,42 0,001 29,52 ± 10,60 0,306 Vitamine D (ng/dL) 23,47 ± 4,24 4,64 ± 1,25 0,001 27,91 ± 6,03 0,175 Vitamine E (µg/dL) 0,51 ± 0,130 0,227 ± 0,041 0,001 0,78 ± 0,19 0,008 Zink (µg/dL) 111,45 ± 8,54 107,81 ± 15,04 0,596 118,75 ± 14,10 0,439 Koper (µg/dL) 111,66 ± 13,9 522,2 ± 94,2 0,001 111,20 ± 25,6 0,796 Glucose (g/L) 1,55 ± 0,397 1,341 ± 0,36 0,193 1,49 ± 0,24 1,000 Insuline (ng/mL) 569,00 ± 406,35 775,17 ± 466,60 0,361 565,00 ±

395,24 1,000 IL6 (pg/mL) 3,77 ± 5,46 20,74 ± 25,98 0,542 43,26 ± 17,05 0,000 TNFα (pg/mL) 0,27 ± 0,42 7,429 ± 3,12 0,002 4,84 ± 9,90 0,097 Leptine serum (ng/mL) 338,24 ± 109,30 195,280 ± 116,27 0,045 242,55 ± 93,15 0,201 Leptine vet (ng/mg) 182,20 ± 146,44 99,259 ± 46,71 0,105 98,02 ± 20,45 0,234 Adiponectine serum (ng/mL) 2917,37 ±

1570,38 2775,66 ±

1418,48 0,754 3761,29 ±

753,46 0,251 Adiponectine vet (ng/mg) 134,77 ± 73,13 234,92 ± 113,46 0,251 92,83 ± 44,33 0,251 Ghreline serum (ng/mL) 2,34 ± 0,97 2,97 ± 1,33 0,294 2,86 ± 1,28 0,293 Toegenomen gewicht eind-begin (%) 142,28 ± 8,47 26,00 ± 4,58 136,84 ± 15,03 0,441 10,35 ± 12,21 0,001 Voeding eind-begin (gram) 685,85 ± 44,01 342,75 ± 21,69 627,53 ± 104,54 0,149 213,35 ± 47,26 0,001

Drank eind-begin (mL) 875,63 ± 90,02 450 ± 35,56 968,89 ± 174,94 0,123 338,89 ± 71,32 0,001 Gewicht zonder lever en milt (gram) 144,04 ± 8,80 41,125 ± 6,02 132,69 ± 14,47 0,102 22,74 ± 21,70 0,083 Vetcelomtrek (µm) 198,52 ± 74,05 150,72 ± 25,13 140,37 ± 36,08 0,000 122,48 ± 27,06 0,248 Milt (%) 0,181 ± 0,03 0,460 ± 0,12 0,000 0,33 ± 0,08 0,001 Lever (%) 2,61 ± 0,12 6,50 ± 0,79 0,000 2,56 ± 0,37 0,923 Metavir score F0 F3 F1 HOMA-index 1,14 ± 0,82 0,94 ± 0,72

Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van...

Documents

Transcript of Invloed van portale hypertensie op de voedingstoestand van...