FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Identificatie van prognostische en predictieve factoren

in gastrointestinale kankers

met behulp van microarray

Wendy MATTHYS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

licentiaat in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Marc Peeters

Begeleider: Dr. Tom Boterberg

Vakgroep : Inwendige Ziekten

Academiejaar 2004-2005

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Identificatie van prognostische en predictieve factoren

in gastrointestinale kankers

met behulp van microarray

Wendy MATTHYS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

licentiaat in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Marc Peeters

Begeleider: Dr. Tom Boterberg

Vakgroep : Inwendige Ziekten

Academiejaar 2004-2005

BIJLAGE

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

23 mei 2005

Wendy Matthys Prof. Dr. Marc Peeters

VOORWOORD

Bij het voltooien van deze scriptie wil ik graag

dank betuigen aan alle mensen die bijgedragen

hebben in de verwezenlijking van dit werk.

In de eerste plaats dank ik mijn promotor Prof. Dr. Marc Peeters

voor de mogelijkheid dit werk tot stand te brengen.

Een speciaal woord van dank richt ik aan Nancy Van Damme

voor de vriendelijkheid waarmee ik steeds werd ontvangen,

voor haar bereidwilligheid in het bijstaan met raad en suggesties.

Ook wil ik mijn appreciatie betuigen aan Dhr. Philippe Fonteyne

voor de bijstand bij het uitvoeren van de experimenten in het laboratorium

en het N. Goormaghtich Instituut voor Pathologische Anatomie van het UZ Gent

die zijn infrastructuur ter beschikking stelde.

Ik dank ook Prof. Dr. Van Hummelen en zijn team van

de dienst VIB Microarray Facility te Leuven en Prof. Dr. Speleman

en zijn team van de dienst Medische Genetica te Gent voor hun medewerking .

Verder wil ik mijn ouders en broer bedanken voor de steun

gedurende mijn opleiding en hun bijdrage in het nazicht van deze scriptie.

INHOUDSTAFEL VOORWOORD INHOUDSTAFEL I VERKLARENDE LIJST VAN DE GEHANTEERDE AFKORTINGEN III 1. SAMENVATTING…………………………………………………………………… 1

2. INLEIDING…………………………………………………………………………… 2 2.1 Prognostische en predictieve factoren 2 2.2 Anatomie 2 2.3 Epidemiologie 3 2.4 Risicofactoren en preventie 3 2.5 Symptomen 4 2.6 Types 5 2.6.1 Familiale adenomoteuse polyposis (FAP) 5 2.6.2 Andere polyposis syndromen 6 2.6.3 Hereditaire non-polyposis colorectale kanker (HNPCC) 6 2.6.4 Sporadische colorectale carcinomen 6 2.7 Stadium van het colorectale carcinoom 6 2.8 Colorectaal carcinoom diagnosticeren 7 2.8.1 Feces occult blood test (FOBT) 7 2.8.2 Endoscopie 8 2.8.3 Endoscopische ultrasonografie (EUS) 9 2.8.4 Carcino- embryonaal antigeen (CEA) 9 2.8.5 Radiologie 9 2.8.5.1 Barium enema 9 2.8.5.2 Computed tomography (CT) en magnetic resonance imaging (MRI): Virtuele coloscopie

10

2.9 Behandeling 10 2.9.1 Chirurgie 10 2.9.2 Chemotherapie 10 2.9.2.1 5-Fluorouracil (5-FU) 11 2.9.2.2 Irinotecan 11 2.9.2.3 Oxaliplatin 12 2.9.3 Radiotherapie 12 2.10 Betrokken genen 12 2.11 Microarray 13 2.12 Doelstelling 14 3. MATERIALEN & METHODEN…………………………………………………… 16

3.1 Staalname 16 3.2 RNA Isolatie 18 3.2.1 RNeasy® Mini kit 18 3.2.2 TRIZOL® 21 3.3 Hoeveelheid RNAbepalen 21 3.3.1 Spectrofotometer 21 3.3.2 NanoDrop® 22 3.4 Kwaliteit en zuiverheid van het RNA 23 4. RESULTATEN……………………………………………………………………… 26 4.1 Spectrofotometer 26 4.2 NanoDrop® 28 4.3 RNA 6000 Nano Assay kit® & Agilent 2100 Bioanalyzer® 32 5. BESPREKING………………………………………………………………………… 36

6. REFERENTIELIJST…………………………………………………………………. 39

7. ADDENDUM………………………………………………………………………… IV

7.1 Ethisch comité IV

7.2 Agilent 2100 Bioanalyzer® Outputs V

VERKLARENDE LIJST VAN DE GEHANTEERDE AFKORTINGEN 5-FU 5-Fluorouracil

β-ME Beta-Mercaptoethanol

APC Adenomatous polyposis coli

CEA Carcino- embryonaal antigeen

CH2-THF 5, 10 methyleen tetrahydrofolaat

COX-2 Cyclooxygenase-2

CRC Colorectale carcinomen

CT Computed tomography

dUMP Deoxyuridine-5’- monofosfaat

dTMP Deoxythymidine-5’- monofosfaat

EUS Endoscopische ultrasonografie

FAP Familiale adenomateuse polyposis

FdUMP 5-fluoro- deoxyuridine- monofosfaat

FOBT Feces occult blood test

HNPCC Hereditaire non-polyposis colorectal cancer

K-ras Kirsten-ras

LV Leucovorine

MRI Magnetic resonance imaging

NSAID Niet-steroïdale anti-inflammatoire drugs

P53 Proteïne 53

Rpm Routes per minute

TNM Tumor, Nodus, Metastase

TS Thymidylaat synthase

UZ Universitair ziekenhuis

VIB Vlaams interuniversitair instituut voor biotechnologie

1. SAMENVATTING

DOELSTELLING: Indien we willen weten welke genen een gewijzigde expressie vertonen

bij het ontwikkelen van een colorectaal carcinoom, kunnen we een beroep doen op een

techniek die momenteel nog in zijn kinderschoenen staat maar alvast veel belovend is, “de

microarraytechnologie”. Vooraleer deze techniek kan toegepast worden, is er nood aan

voldoende maar vooral kwaliteitsvol RNA. De manier waarop het RNA geïsoleerd wordt, is

dan ook een cruciale stap in het volledige proces. Het doel van deze scriptie is de RNA

isolatie te optimaliseren.

MATERIALEN & METHODEN: Om RNA te isoleren uit colorectaal weefsel kan een beroep

gedaan worden op de RNeasy® Mini kit van Qiagen. Een andere methode die eveneens toelaat

RNA te isoleren is de TRIZOL® methode. Na de isolatie kan gekozen worden voor

verschillende technieken om de kwantiteit van het RNA te bepalen. Hier werd gekozen voor

een klassieke spectrofotometer en de meer geavanceerde NanoDrop®. Om na te gaan welke de

kwaliteit van het RNA is, wordt de Agilent 2100 Bioanalyzer® aangewend.

RESULTATEN: Na meting met de spectrofotometer wordt de absorbantie en de 260/280 ratio

bekomen. Op basis hiervan kan de opbrengst berekend worden. De NanoDrop® verschaft

naast de absorbantie en de 260/280 ratio ook informatie over de 260/230 ratio en de

opbrengst. Stalen met voldoende kwaliteit worden op een RNA Nano Labchip® gebracht. Op

basis van het verloop van de grafiek kan een uitspraak gedaan worden over de graad van

degradatie.

BESPREKING: Het isoleren van RNA uit colorectaal weefsel is zeker geen eenvoudige

opdracht. Er bestaat geen techniek die bij 100 % van de stalen bruikbaar RNA oplevert. Na

proberen en herproberen kunnen we vaststellen dat voor resectiestukken inbedden in

RNALater® stabilisatie reagens en isoleren met de TRIZOL® methode de meest geschikte

techniek is. Voor biopten wordt best gekozen voor het RNeasy® Mini kit protocol. Ook het

inbedden van biopten in RNALater® stabilisatie reagens heeft een gunstig effect op

hoeveelheid, kwaliteit en zuiverheid van het RNA.

2. INLEIDING

Sinds de ontdekking van de DNA dubbele helix, 50 jaar geleden, heeft de mens veel

inspanning geleverd om de moleculaire wereld te doorgronden en op basis daarvan de

biotechnologie te ontwikkelen. Dit droeg bij tot het ophelderen van een groot aantal

biologische processen. Ondanks de vele medische informatie die er tot op heden voor handen

is, blijven vele vragen toch nog onbeantwoord (1). Zo blijft het op het gebied van kanker vaak

nog tasten in het duister.

In deze scriptie wordt nader ingegaan op colorectale carcinoma (CRC), meer bepaald op de

RNA isolatie hieruit. Aan de hand hiervan kunnen prognostische en predictieve factoren

worden geïdentificeerd met behulp van microarrays.

2.1 Prognostische en predictieve factoren

Het is belangrijk een onderscheid te maken tussen een prognostische en een predictieve

factor.

Een prognostische merker geeft informatie over de afloop van de ziekte. Prognostische

merkers bepalen dan ook vaak de therapeutische route die zal gevolgd worden.

Predictieve factoren daarentegen geven informatie over hoe een tumor reageert op een

bepaald therapeutisch agens (2).

2.2 Anatomie

Het colon begint rechtsonder in de buikholte

en verloopt in craniale richting tot onder de

lever (colon ascendens). Daar buigt het colon

naar links en doorkruist de buikholte tot onder

de milt (dit gedeelte is het colon transversum).

Van hieruit daalt het colon naar caudaal (colon

descendens) en links onderaan in de buikholte

gaat het over in een S-vormig gebogen

gedeelte (colon sigmoïdeum), waarop het

rectum aansluit (Figuur 1). Het aldus gevormde verloop van het colon wordt het colonkader

Figuur 1: Anatomie van het colon en rectum (3)

genoemd. Distaal aan het colon ascendens bevindt zich een zakvormige verbreding, het

caecum of de blinde darm, waarin het ileum uitmondt. Aan de dorsale zijde van het caecum

mondt de appendix vermiformis uit.

De bloedvoorziening van het colon gebeurt via takken van de arteria mesenterica superior

(voor colon ascendens en colon transversum) en via takken van de arteria mesenterica inferior

(voor colon descendens en colon sigmoideum) (3).

2.3 Epidemiologie

Colorectale kanker is een belangrijk

probleem in onze huidige samenleving. Elk

jaar worden er wereldwijd ongeveer één

miljoen nieuwe gevallen geregistreerd en

bezwijken er ongeveer een half miljoen

mensen aan deze ziekte (4).

Het Vlaamse Kankerregistratienetwerk heeft

cijfers gerapporteerd voor het jaar 2000. In

dit jaar werden 2144 mannen (waarvan 1324

colon- en 820 rectumcarcinomen) en 1799

vrouwen (waarvan 1246 colon- en 553 rectumcarcinomen) gediagnosticeerd.

Colorectale kanker is daarmee de derde meest voorkomende kanker bij mannen, na prostaat-

en longkanker. Bij vrouwen komt colorectale kanker op de tweede plaats na borstkanker

(Figuur 2) (5).

2.4 Risicofactoren en preventie

Zowel genetische als omgevingsfactoren spelen een rol bij het ontstaan van CRC. De

genetische factoren worden verder uitgewerkt in 2.5 waar de verschillende types van

colorectale carcinomen worden toegelicht. Een overzicht van de andere risicofactoren wordt

gegeven in Tabel 1.

Een verlaagde incidentie van het CRC wordt waargenomen bij inname van aspirine en niet-

steroïdale anti-inflammatoire farmaca (NSAID). Zo wordt bij langdurige inname van

cyclooxygenase- 2 (COX- 2) selectieve inhibitoren een daling in de incidentie gezien. Verder

onderzoek is echter nodig om dit te verduidelijken.

Figuur 2: Meest voorkomende kankers in

Vlaanderen (5)

Tabel 1: Risicofactoren voor de ontwikkeling van CRC (6)

Beschermend Ongunstig

Fysieke activiteit Dieet: Vezels Groenten en fruit (folaat, methionine) Calcium Antioxidantia Vetzuren in visolie

Koffie en groene thee bij frequente inname Exogene oestrogenen bij hormonale substitutietherapie

Familiale predispositie Leeftijd: toenemend risico vanaf de 5de

levensdecade Etniciteit: Afrikanen > Blanken > Aziërs Dieet: Vetinname

Alcohol Tabak Voorgeschiedenis van inflammatoir darmlijden

Zeker is dat een evenwichtig en vetarm dieet, rijk aan vezels en vitaminen, samen met

voldoende lichaamsbeweging reeds een behoorlijke voorzorgsmaatregel vormt tegen het

CRC. Tenslotte kan ook screening veel onheil voorkomen (6).

2.5 Symptomen

Symptomen zijn gelijkaardig in de late fase van de colorectale kankers wanneer de prognose

ongunstig is maar ze zijn veel minder gemeenschappelijk en duidelijk bij het begin van de

aandoening.

Symptomen die bij zo wat elke colonkanker opduiken zijn abdominale pijn, rectale

bloedingen, veranderende stoelganggewoontes en gewichtsverlies. Colonkanker kan zowel

gepaard gaan met diarree als met constipatie. Symptomen die interindividuele verschillen

vertonen zijn: nausea, braken, malaise en anorexie.

De symptomen hangen af van de tumorlocalisatie, tumorgrootte en het al dan niet aanwezig

zijn van metastasen. Colonkankers gesitueerd aan de linkerzijde zullen meer de neiging

vertonen om een gedeeltelijke of een volledige intestinale obstructie te veroorzaken. Dit kan

verklaard worden doordat het lumen van het linkse gedeelte van het colon nauwer is en de

stoelgang al een vastere consistentie heeft doordat reabsorptie van water in het proximaal

gedeelte van de darm gebeurt.

Distale kankers veroorzaken vaak ernstige rectale bloedingen. Proximale tumoren zullen

zelden dit symptoom veroorzaken omdat het bloed gemengd wordt met de feces en chemisch

gedegradeerd wordt gedurende de transit. De bloedingen op hun beurt veroorzaken een

ijzertekort wat aanleiding kan geven tot zwakte, vermoeidheid, dyspnea en hartkloppingen

(7).

2.6 Types

2.6.1 Familiale adenomoteuse polyposis (FAP)

Familiale adenomateuse polyposis is een dominant overerfbare aandoening. De klinische

diagnose is gebaseerd op de detectie van honderden tot duizenden adenomateuse poliepen in

het colon en rectum.

Wanneer deze poliepen niet worden behandeld, kunnen ze leiden tot een CRC. De kans dat ze

aanleiding geven tot een colorectaal carcinoom is rechtevenredig met het aantal poliepen.

Ongeveer 0.5 % van alle colorectale carcinomen ontstaat tengevolge van FAP.

Geattenueerde FAP is een fenotypische variant van FAP en wordt gekenmerkt doordat minder

dan honderd poliepen aanwezig zijn. De fenotypische kenmerken van FAP vertonen DE De

De fenotypische kenmerken van FAP vertonen opmerkelijke verschillen. Dit zou je kunnen

verklaren doordat FAP wordt veroorzaakt door verschillende mutaties. Maar de fenotypische

variabiliteit wordt ook gedetecteerd bij familieleden met een identieke mutatie. Een

fenotypisch kenmerk eigen aan FAP is de hypertrofie van het pigmentepitheel van de retina.

FAP kan ook leiden tot gastrointestinale, desmoid of thyroid carcinomen, medullablastomen en

Figuur 3: Deze figuur werd overgenomen uit Screening for colorectal cancer van Patrick Lau en

Joseph Sung en toont de transformatie van een normaal colonweefsel tot een

coloncarcinoom met als intermediair het adenoom (8)

hepatoblastomen. Genetisch wordt FAP verklaard door een chromosomale deletie ter hoogte

van 5q21. Dit is de regio waar het APC gen gelegen is (Figuur 3) (9).

2.6.2 Andere polyposis syndromen

Peutz Jegher’s syndroom is een autosomaal dominante aandoening waarbij kleine poliepen

een maligne transformatie kunnen ondergaan. De genen die hierbij zijn gemuteerd, zijn

STK11 en LKB1 beiden gelegen op chromosoom 19. Familiale juveniele polyposis is een

andere autosomale dominante ziekte. Hier worden mutaties gevonden in PTEN, SMAD4 en

BMPR1A genen op chromosoom 10, 18 en 10, respectievelijk (9).

2.6.3 Hereditaire non-polyposis colorectale kanker (HNPCC)

Hereditaire non-polyposis colorectale kanker (HNPCC) wordt veroorzaakt door een mutatie

in één van de mismatch repair genen (hMLH1, hMSH2, hMSH6). HNPCC is een dominant,

overerfbare aandoening en aanwezigheid van deze aandoening geeft 80 % kans op een CRC.

Genetisch testen voor HNPCC is zeer gecompliceerd door de betrokkenheid van een groot

aantal genen, toch worden 70 à 75 % van de mutaties gevonden. Mutaties die gevonden

worden zijn meestal missense en nonsense mutaties (9).

2.6.4 Sporadische colorectale carcinomen

Adenomateuse poliepen kunnen ook sporadisch ontstaan. Deze poliepen worden

onderverdeeld in tubulaire, villi-vormige en tubulovilleuse poliepen. Het zijn vooral de villi-

vormige, grote adenoma’s die de neiging vertonen om te transformeren tot een maligne poliep

(10).

2.7 Stadium van het colorectale carcinoom

Stadiëring van het colorectale carcinoom is gerelateerd aan de invasiediepte en de

verspreiding naar lymfeklieren en organen op afstand. Zowel de Tumor-Nodus-Metastase

(TNM) classificatie als het Dukes’ classificatiesysteem zijn gebaseerd op deze variabelen

(Tabel 2). Het klinische stadium wordt bepaald op basis van anamnese, klinisch onderzoek,

sigmoïdoscopie en/of coloscopie met biopsie (7).

Tabel 2: TNM-classificatie voor colorectale kanker volgens Union International Contre le Cancer (UICC) zesde

editie (11)

Tumorstadium T N M Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium I T1,T2 N0 M0 Stadium IIA T3 N0 M0 Stadium IIB T4 N0 M0 Stadium IIIA T1,T2 N1 M0 Stadium IIIB T3,T4 N1 M0 Stadium IIIC Elke T N2 M0 Stadium IV Elke T N0,N1,N2 M1

Tumor (T)

TX Primaire tumor kan niet geëvalueerd worden T0 Geen evidentie van primaire tumor Tis Carcinoma in situ : intraepitheliaal of invasie van de lamina propria T1 Tumor invadeert submucosa T2 Tumor invadeert muscularis propria T3 Tumor invadeert doorheen muscularis propria in subserosa of in niet-peritoneaal

pericolisch of perirectaal weefsel T4 Tumor invadeert in andere organen of structuren en/of perforeert visceraal

peritoneum

Lymfeklieren (N)

NX Regionale lymfeklieren kunnen niet geëvalueerd worden N0 Geen regionale lymfeklier metastases N1 Metastases in 1 tot 3 regionale lymfeklieren N2 Metastases in 4 of meer regionale lymfeklieren

Metastases op afstand (M)

MX Metastases op afstand kunnen niet bepaald worden M0 Geen metastases op afstand M1 Metastases op afstand

__________________________________________________________________________________________

2.8 Colorectaal carcinoom diagnosticeren

2.8.1 Feces occult blood test (FOBT)

Normaal verliezen individuen tot 1,5 ml bloed per dag via het maagdarmkanaal. Er zijn

verschillende testen in gebruik voor de opsporing van occult (onzichtbaar) bloed, welke alle

hun eigen sensitiviteit en specificiteit hebben. De testen tonen de peroxidaseactiviteit, humaan

bloedeiwit of heemderivaten aan.

De testuitslag wordt onder andere beïnvloed door omvang, consistentie, wijze van bewaren

van de feces en het aantal monsters dat wordt genomen.

Om de specificiteit van de peroxidasetest te verhogen, dient twee à drie dagen vóór en tijdens

het verzamelen van de feces een dieet vrij van vlees en groenten te worden gevolgd.

De FOBT heeft als voordelen dat het niet duur, eenvoudig, niet-invasief en veilig is. Een

nadeel is de lage specificiteit van de test (8).

2.8.2 Endoscopie

Endoscopie is een zeer gevoelige onderzoeksmethode. Met behulp van een flexibele buis

waarop een camera is bevestigd, bekijkt de arts de binnenzijde van de dikke darm.

Tijdens het onderzoek worden stukjes weefsel weggenomen voor verder onderzoek (het

biopt). Ook poliepen kunnen op die manier verwijderd worden. Het onderzoek, beperkt

tot het einde van de dikke darm en de endeldarm, noemt men recto-sigmoïdoscopie. Dit

onderzoek laat toe om 40 tot 60 % van de poliepen op te sporen.

In de andere gevallen kan het gaan om een volledig onderzoek, totale coloscopie genoemd.

Een totale coloscopie is noodzakelijk wanneer de rectosigmoïdoscopie een gezwel en/of

poliepen heeft aangetoond. Het is bovendien invasief en dus oncomfortabel. Complicaties

zoals bloedingen of perforaties kunnen optreden na een endoscopie (8).

Figuur 4: Endoscopie (12)

2.8.3 Endoscopische ultrasonografie (EUS)

De echo-endoscopie is momenteel de beste techniek voor de visualisatie van de tumor en de

onmiddellijke omgeving. Het combineert de voordelen van de echoscopie en de endoscopie.

De frequenties uitgezonden door de roterende transducer variëren van 5 tot 30 mHz. Het beeld

wordt gevormd wanneer de transducer de echo’s van de uitgezonden stralen terug opvangt.

Het echopatroon is afhankelijk van de samenstelling van het weefsel waarop de stralen

invallen (13).

2.8.4 Carcino- embryonaal antigeen (CEA)

CEA is een antigen terug te vinden in het foetale colon en in CRC, maar is afwezig in het

colon van gezonde volwassenen. Hoge waarden worden ook vastgesteld bij zwangere

vrouwen en patiënten met niet-gastrointestinale kanker. Ook rokers vertonen een sterk

verhoogde CEA concentratie. Tot factoren die een positieve invloed hebben op de

serumconcentratie van CEA bij patiënten met een CRC behoren: een hoger tumoraal stadium,

goede differentiatiegraad van de tumor, aneuploïdie van de tumor, aanwezigheid van

levermetastasen, linkzijdige ligging in het colon en aanwezigheid van darmobstructie (14).

2.8.5 Radiologie

2.8.5.1 Barium enema

Barium wordt, gevolgd door lucht, onder zachte druk in de darmen gebracht. Terwijl de

patiënt verschillende houdingen aanneemt, worden radiologische opnames gemaakt.

De procedure neemt ongeveer 30 à 60 minuten in beslag. Deze techniek is bovendien ook

veilig. Perforaties en andere complicaties komen zelden voor. Een beperking van de barium

enema test is dat kleine en platte poliepen niet worden gedetecteerd. Ook kan geen biopsie

worden genomen of poliepectomie worden uitgevoerd. Deze onderzoeksmethode wordt dan

ook enkel gebruikt bij patiënten die niet in staat zijn een coloscopie te ondergaan (15).

2.8.5.2 Computed tomography (CT) en magnetic resonance imaging (MRI): Virtuele

coloscopie

Virtuele coloscopie is een techniek dat gebruik maakt van data gegenereerd door CT of MRI

om een twee- of driedimensionaal beeld van de darm te verkrijgen. Het duurt een 5 tal

minuten om met deze techniek een opname te maken. Virtuele coloscopie geeft naast het

beeld van het colon ook beelden van andere intra-abdominale organen en kan simultaan met

de detectie van de colonkanker een voorspelling doen over het stadium van de tumor (15).

2.9 Behandeling

2.9.1 Chirurgie

Chirurgie is de belangrijkste en eerste behandeling van kanker van de dikke darm. Bij deze

operatie worden het kankergezwel en een gedeelte normaal weefsel aan weerszijden van de

tumor plus de nabijgelegen lymfeklieren verwijderd. De twee uiteinden van de dikke darm

worden weer aan elkaar gehecht. Deze operatie is routine en veroorzaakt geen ernstige

gevolgen voor de darmfunctie. Soms zal een tijdelijk stoma (uitgang via de buikwand) nodig

zijn (5).

2.9.2 Chemotherapie

Chemotherapie is de behandeling van kanker met geneesmiddelen. Deze geneesmiddelen

worden ook cytostatica genoemd en hebben als doel de groei van de kankercellen te remmen

of de cellen te vernietigen.

Chemotherapie kan een curatieve, adjuvante, neoadjuvante of palliatieve bedoeling hebben.

• een curatieve behandeling is bedoeld om de patiënt te genezen.

• een adjuvante behandeling wordt gegeven als aanvulling op een curatieve behandeling. Zo

wordt chemotherapie vaak gegeven als aanvulling na chirurgie met de bedoeling dat de

kanker niet terugkomt.

• een neoadjuvante of preoperatieve behandeling wordt voor de operatie gegeven met de

bedoeling de tumor te verkleinen zodat hij makkelijker chirurgisch te verwijderen is.

• een palliatieve behandeling verlicht symptomen zoals pijn, maar geneest de ziekte niet. Ze

kan wel de levensduur verlengen (16).

2.9.2.1 5-Fluorouracil (5-FU)

5-FU is een voorbeeld van een antimetaboliet. Antimetabolieten zijn stoffen die de

biosynthese of de functie van nucleïnezuren verstoren en interfereren met de opbouw van

nucleotidebasen. 5-FU (Fluracedyl®, Efudix®) is een prodrug, die na omzetting in zijn actieve

component, thymidylaat synthase (TS) inhibeert en dus ook de vorming van thymidine, DNA

en RNA.

In Figuur 5 wordt het 5-FU metabolisme

verduidelijkt. TS katalyseert de methylatie

van deoxyuridine-5’- monofosfaat (dUMP)

in deoxythymidine-5’- monofosfaat (dTMP)

met 5, 10 methyleen tetrahydrofolaat

(CH2-THF) als co-factor. Dit is de

beperkende stap in de DNA synthese. Zodra

5-FU is omgezet in zijn actieve component

5-fluoro-deoxyuridine monofosfaat

(FdUMP) inhibeert het TS. De anti-tumorale

effecten van 5-FU worden ook toegeschreven aan de incorporatie in het DNA en RNA (17).

De patiënten waarvan stalen werden genomen voor dit onderzoek kregen standaard

neoadjuvante chemotherapie van 5-FU. Patiënten met een stadium III CRC krijgen standaard

adjuvant chemotherapie op basis van 5-FU in combinatie met de biochemische modulator

leucovorine (LV). Voor een stadium IV CRC kan een adjuvante chemotherapie de overleving

verlengen met een periode van gemiddeld 6 tot 12 maanden en de levenskwaliteit verbeteren.

2.9.2.2 Irinotecan

Irinotecan (Campto®) is een topoisomerase I inhibitor. Topoisomerase I en II zijn enzymen

die de ruimtelijke vorm van het DNA bepalen tijdens de verschillende fasen van de celcyclus.

Zij doen dit door tijdelijk breuken te maken in één (topo I) of twee (topo II) strengen van het

DNA. Deze breuken maken het mogelijk dat het opgerolde DNA zich ontwindt. Cholinerge

Figuur 5: 5-fluorouracil metabolisme (17)

symptomen, bradycardie, hypotensie, diarree en abdominale krampen kunnen optreden bij

gebruik van dit geneesmiddel (18).

2.9.2.3 Oxaliplatin

Eloxatin® is de merknaam voor oxaliplatin. Oxaliplatin is een derde-generatie platina analoog

dat DNA crosslinkt en op die manier apoptose induceert (19).

2.9.3 Radiotherapie

Radiotherapie is een behandeling met radioactieve stralen om kankercellen te vernietigen. Bij

radiotherapie wordt radioactieve energie in de vorm van een stralenbundel (te vergelijken met

een lichtbundel) precies gericht op de plaats van het gezwel of de plaats waar het gezwel zich

bevond. Bestralen gebeurt soms voor de operatie, soms erna. Het kan kankercellen vernietigen

die na de operatie mogelijk nog achtergebleven zijn. Bij grote of moeilijk te bereiken dikke

darm tumoren, of bij een gezwel dat met andere organen vergroeid is (blaas, prostaat...) kan

radiotherapie voor de operatie de tumor verkleinen, zodat de tumor chirurgisch operabel

wordt. Bestraling kan ook gebruikt worden als palliatieve behandeling. De patiënten die in dit

huidig onderzoek werden opgenomen werden 25 keer bestraald gedurende 5 opeenvolgende

weken met 1.8 gray. De totale dosis waaraan de patiënten werden blootgesteld komt zo op 45

gray. De bestraling op zich is pijnloos. Bestraling van de dikke darm heeft ook invloed op de

gezonde cellen in het bestraalde gebied (5).

2.10 Betrokken genen

Normale celgroei hangt af van een gebalanceerde expressie tussen groei-promoting en groei-

suppressor genen. Als de groei-promoting genen in een staat van hyperfunctie zijn, worden ze

oncogenen genoemd. Deze hebben een positief effect op de celgroei. Een voorbeeld van een

dergelijk gen die kenmerkend is voor een CRC, is het Kirsten-ras (K-ras) gen. Groei-

suppressor genen worden gedefinieerd als tumor-suppressors. De best gekende tumor-

suppressor is proteïne 53 (p53) (20).

2.11 Microarray

Microarrays zijn in staat om het genexpressie patroon van tienduizenden genen in één enkel

experiment aan het licht te brengen. De DNA array is meestal een substraat (nylon membraan,

glas of plastic) waarop men enkelstrengig DNA met verschillende sequenties afzet. Dit

enkelstrengig DNA wordt de probe genoemd. Op de array wordt vervolgens enkelstrengig

DNA, gegenereerd uit het biologische staal dat wordt bestudeerd, gebracht. Dit wordt het

target genoemd. Probe en target die complementair zijn hybridiseren. Het target wordt

gelabeld met een fluorescente stof, een radioactief element of een antilichaam (Figuur 6), zo

kan de hybridisatiespot gemakkelijk worden gedetecteerd. Het principe van microarrays wordt

geïllustreerd in Figuur 7.

Figuur 6: Codelink microarray (21) Figuur 7: Techniek van microarray (22)

De micorarray slide kan op verschillende manieren geconstrueerd worden. De eerste manier is

de fotolithografische vervaardiging van microarrays. Hierbij worden synthetische linkers

gemodificeerd met fotochemische verwijderbare beschermende groepen op een glasplaatje

vastgehecht. Deze techniek laat toe om hoge densiteit arrays te maken maar de lengte van de

geconstrueerde probe is beperkt. Affimetrix® arrays maken gebruik van deze techniek.

De tweede benadering is de inkjet technologie en maakt gebruik van de technologie van de

kleurenprinter. Vier verschillende inktpatronen zijn geladen met de vier nucleotiden (adenine,

guanine, cytosine en thymine). De nucleotiden worden afgezet daar waar ze nodig zijn (23).

Het aantal wetenschappelijke artikels die gebruik maken van microarrays om colorectale

carcinomen te onderzoeken is beperkt. Wanneer deze artikels van naderbij worden bekeken

kan opgemerkt worden dat de patiëntenpopulatie waarop het onderzoek gebaseerd is telkens

gering is. In het artikel van Sugiyama et al (24) werd gewerkt met 11 stalen. Birkenkamp-

Demtroder en collega’s (20) doen het wat beter en baseerden hun onderzoek op 27 stalen.

Ghadimi et al baseerden hun onderzoek op 30 stalen afkomstig van 23 patiënten (25). Bij

verdere analyse van deze drie artikels valt ook het verschil in staalmanipulatie na resectie op.

Sugiyama en zijn medewerkers opteerden er voor om de samples onmiddellijk met vloeibare

stikstof in te vriezen en ze vervolgens te bewaren bij -80°C (24). Birkenkamp-Demtroder en

zijn groep behandelden de stalen eerst met sodium dodecyl sulfaat en guanidinium

isothiocyanaat vooraleer ze in te vriezen met vloeibare stikstof en te bewaren bij -80°C (20).

Ghadimi en zijn collega’s kozen ervoor de stalen eerst in te bedden in RNALater® alvorens ze

te vervriezen (25). Uit het artikel van Huang et al (26) bleek eveneens dat de tijd die verloopt

tussen de afname en het invriezen van het staal bepalend is voor de kwaliteit van het RNA.

Ook het al dan niet degraderen van het RNA wordt bepaald door de snelheid en de manier

waarop de staalname gebeurt.

Uit de artikels blijkt ook dat er nog geen eensgezindheid bestaat over de techniek voor de

RNA extractie. Sugiyama et al maakten gebruik van de RNeasy® Kit van Qiagen voor de

extractie (24) waar Birkenkamp-Demtroder en zijn collega’s kozen voor een extractie op basis

van de polytron homogenizer of fastprep gevolgd door een behandeling met RNAzol (20). Bij

Ghadimi et al was de extractie gebaseerd op TRIZOL® (25). Ook voor de array kozen de

verschillende groepen elk voor een andere firma. Sugiyama et al maakten gebruik van Human

Cancer Pathway Finder Gene Arrays (24). Birkenkamp-Demtroder en zijn collega’s gaven de

voorkeur aan de arrays van Affimetrix® (20). Ghadimi et al maakten gebruik van zelf

gemaakte cDNA en oligonucleotide arrays (25).

Voor de arrays zullen de beschreven artikels niet worden gevolgd en zal in de toekomst

geopteerd worden voor de arrays van Amersham Biosciences, Codelink®. Dit komt in deze

scriptie echter niet meer aan bod.

2.12 Doelstelling

Veel patiënten krijgen een behandeling die niet van toepassing is op hun ziekte. Ze zitten

ofwel in een te vroeg ofwel in een al te ver gevorderd stadium van de kanker voor de therapie

die ze krijgen. Om dit in de toekomst te vermijden, wordt er naar gestreefd de patiënt in de

toekomst een therapie op maat aan te bieden. Hiervoor dienen heel wat moleculaire factoren,

die aan de basis liggen van kankerpathways, te worden onderzocht. Op die manier kan tot het

hart van het kankerproces gekomen worden.

Het doel van dit onderzoek is na te gaan welke genen een veranderende expressie vertonen bij

CRC. Hierbij is het in eerste instantie nodig dat voldoende en zuiver RNA kan verkregen

worden uit de stalen. Het doel van deze scriptie is dan ook de isolatie van RNA uit colorectaal

humaan weefsel (afkomstig van resectiestukken en biopten, zowel tumoraal als normaal

weefsel, bewaard bij -80°C zowel met als zonder enige manipulaties) te optimaliseren.

Gebruikmakend van de nieuwe high-throughput technologie, microarray, willen we er in de

toekomst toekomen nieuwe predictieve en prognostische factoren te identificeren. Dit alles

heeft tot doel het kankerproces verder te ontrafelen en zo de overlevingskansen van de patiënt

te verbeteren.

3. MATERIALEN & METHODEN

3.1 Staalname

Na de operatie wordt het resectiestuk zo spoedig mogelijk van de operatiekamer naar de

dienst pathologie (N. Goormaghtigh instituut voor pathologische anatomie, Gent) gebracht.

Daar wordt zowel een stukje tumor als een stukje normaal weefsel van de patiënt genomen.

Dit wordt vervolgens bij -80°C bewaard. Sommige stalen gaan zonder enige manipulaties

naar de -80°C (Jouan VWR, Leuven, België). Andere werden eerst ingebed in RNALater®

stabilisatie reagens (Ambion® The RNA Company, Cambridgeshire, Verenigd Koninkrijk) of

Cryoblock® (Reichert-Jung, Oreland, Pennsylvania). RNALater® stabilisatie reagens

beschermt het RNA in het weefsel tegen degradatie.

Indien mogelijk wordt van elke patiënt ook het biopt (tijdens coloscopie) verzameld (zowel

tumoraal als normaal weefsel).

Om dit onderzoek te mogen uitvoeren werd toelating gevraagd aan het ethische comité. Deze

toelating werd verkregen op de vergadering van het ethisch comité op 20 november 2003 waar een positief advies werd gevraagd over het protocol “Opbouwen van databanken van

serum, DNA en weefsel van digestieve oncologische patiënten” (zie addendum). Ook de

patiënten dienen hun goedkeuring te geven. Dit gebeurt via een informed consent.

In totaal werden 73 stalen (afkomstig van 16 patiënten met de patiëntennummers van A tot en

met P) onderzocht, waarvan 32 tumorale en 41 normale stalen. De weefsels werden allen

verzameld in de periode 2004-2005. Het betreft allemaal colorectaal weefsel met uitzondering

van de stalen van 2 patiënten (patiëntennummers D en G) waar het om slokdarmweefsel gaat

(Tabel 3).

Tabel 3: Gegevens over het weefseltype (Tumoraal / Normaal), de manipulaties ( Vers / RNALater) , de isolatiemethode (Qiagen / TRIZOL) van de 73 stalen afkomstig van 16 patiënten. Ook of het een resectiestuk dan wel een biopt is wordt aangegeven in de tabel

Nummer T/N Vers/RNALater Isolatie-methode R/B Patiëntennummers van A tot en met P

1 T Vers Qiagen bij 4°C R A 2 T Vers Qiagen bij 4°C R B 3 T Vers Qiagen bij 4°C R B 4 T Vers Qiagen bij 4°C R C 5 N Vers Qiagen bij 4°C R C 6 N Vers Qiagen bij 4°C R A 7 T Vers Qiagen bij 4°C R D

8 N Vers Qiagen bij 4°C R D 9 N Vers Qiagen bij 4°C R E 10 T Vers Qiagen bij 4°C R E 11 T Vers Qiagen bij 4°C R F 12 N Vers Qiagen bij 4°C R G 13 N Vers Qiagen bij 4°C R F 14 T Vers Qiagen bij 4°C R B 15 N Vers Qiagen bij 4°C R B 16 T Vers Qiagen bij 4°C R A 17 N Vers Qiagen bij 4°C R A 18 T Vers Qiagen bij 4°C R C 19 N Vers Qiagen bij 4°C R C 20 T Vers Qiagen bij 4°C R E 21 N Vers Qiagen bij 4°C R E 22 T Vers Qiagen bij 4°C R F 23 N Vers Qiagen bij 4°C R F 24 T Vers Qiagen bij 4°C R G 25 N Vers Qiagen bij 4°C R G 26 T Vers Qiagen bij 4°C R D 27 N Vers Qiagen bij 4°C R D 28 N Vers Qiagen bij 4°C R H 29 N RNALater Qiagen bij 4°C R H 30 T Vers Qiagen bij 4°C R H 31 T Vers Qiagen bij 4°C R I 32 N Vers Qiagen bij 4°C R I 33 N Vers Qiagen bij 4°C R J 34 T Vers Qiagen bij 4°C R J 35 T Vers Qiagen bij 4°C B J 36 N Vers Qiagen bij 4°C B J 37 T Vers Qiagen bij 4°C B K 38 N Vers Qiagen bij 4°C B K 39 T Vers Qiagen bij 4°C R K 40 N Vers Qiagen bij 4°C R K 41 T Vers Qiagen bij 4°C B L 42 N Vers Qiagen bij 4°C B L 43 N Vers Qiagen bij 20°C R B 44 T Vers Qiagen bij 20°C R A 45 N Vers Qiagen bij 20°C R A 46 N Vers TRIZOL R B 47 T Vers TRIZOL R F 48 N Vers TRIZOL R F 49 T Vers TRIZOL R G 50 N Vers TRIZOL R G 51 N Vers TRIZOL R A 52 N Vers TRIZOL R C 53 N Vers TRIZOL R E 54 N RNALater TRIZOL R H 55 N RNALater TRIZOL R H 56 N Vers TRIZOL R H 57 T RNALater TRIZOL R M 58 N RNALater TRIZOL R M 59 T Vers TRIZOL R M

60 N Vers TRIZOL R M 61 T Vers TRIZOL R N 62 N Vers TRIZOL R N 63 T RNALater TRIZOL R N 64 N RNALater TRIZOL R N 65 T Vers TRIZOL B O 66 N Vers TRIZOL B O 67 T RNALater TRIZOL R O 68 N RNALater TRIZOL R O 69 T Vers TRIZOL R O 70 N Vers TRIZOL R O 71 N RNALater TRIZOL R H 72 T RNALater Qiagen bij 20°C B P 73 N RNALater Qiagen bij 20°C B P

T: Tumor, N: Normaal, R: Resectie, B: Biopt

3.2 RNA Isolatie

3.2.1 RNeasy® Mini Kit

Voor de RNA extractie wordt gebruik gemaakt van de RNeasy® Mini kit (Qiagen Benelux

B.V., Venlo, Nederland).

Enkele belangrijke punten die in acht moeten genomen worden voor het starten van de

isolatie:

• Reinig het werkblad met RNaseZap® (Ambion® The RNA Company, Cambridgeshire,

Verenigd Koninkrijk).

• Het is essentieel om te starten met de correcte hoeveelheid weefsel. De RNeasy®

kolommen kunnen een maximum hoeveelheid van 30 mg weefsel aan.

• Overlaad de kolommen niet. Overladen vermindert de opbrengst en de kwaliteit van

het RNA.

• Vers, vervroren of RNALater® gestabiliseerd weefsel kan gebruikt worden.

• De beste resultaten worden verkregen wanneer het weefsel wordt gestabiliseerd in

RNALater® stabilisatie reagens.

• β-Mercaptoethanol (β-ME) (Merck, Darmstadt, Duitsland) moet aan de RLT buffer

worden toegevoegd. Per 1 ml RLT buffer wordt 10 µl β-ME toegevoegd. De RLT

buffer denatureert het weefsel. β-ME zorgt voor de inactivatie van de RNases.

• De RPE buffer is geconcentreerd. Voor gebruik moet er 44 ml ethanol (96-100 %)

toegevoegd worden.

• Alle stappen van het RNeasy protocol moeten uitgevoerd worden bij

kamertemperatuur. Gedurende de procedure moet snel worden gewerkt.

• Alle centrifugatie stappen moeten uitgevoerd worden bij 4°C in een standaard

gekoelde centrifuge.

Het protocol (Figuur 8)

Figuur 8: Protocol voor RNA isolatie met de RNeasy® Mini kit van Qiagen (27)

1. Bepaal de hoeveelheid weefsel. Gebruik niet meer dan 30 mg.

2. Het weefsel wordt in een steriel mortier gebracht die gekoeld is met vloeibare stikstof.

Na het versnijden van het weefsel wordt 600 µl RLT buffer β-ME toegevoegd.

Hierdoor bevriest het weefsel.

3. Het lysaat wordt op een QIAshredder® spin kolom gebracht die op een 2 ml

verzamelbuis geplaatst is.

4. Centrifugeer 2 min op maximale snelheid (14000 rpm).

5. Centrifugeer het weefsel lysaat gedurende 3 min op maximale snelheid (14000 rpm).

6. Breng het supernatans over in een epje.

7. Voeg 600 µl ethanol (70 % in RNase vrij water (Promega Benelux B.V., Leiden,

Nederland)) toe en mix door op en neer te pipetteren. Centrifugeer niet.

8. Breng 700 µl van het mengsel op een RNeasy® Mini kolom die op een 2 ml verzamel

buis is geplaatst.

9. Centrifugeer gedurende 15 s bij maximale snelheid (14000 rpm).

10. Verwijder lysaat.

11. Voeg 700 µl RW1 toe aan de RNeasy® Mini kolom.

12. Centrifugeer gedurende 15 s bij maximale snelheid (14000 rpm) om de kolom te

wassen.

13. Verwijder opnieuw lysaat.

14. Breng de RNeasy® kolom over op een nieuwe 2 ml verzamelbuis.

15. Voeg 500 µl RPE buffer toe.

16. Centrifugeer gedurende 15 s bij maximale snelheid (14000 rpm) om de kolom te

wassen.

17. Verwijder lysaat.

18. Voeg nogmaals 500 µl RPE buffer toe.

19. Centrifugeer nu gedurende 2 min om de RNeasy® silica-gel membraan te drogen.

20. Breng de RNeasy® kolom op een epje en voeg er 50 µl nuclease vrij water aan toe.

21. Centrifugeer gedurende 1 min bij maximale snelheid (14000 rpm) om het RNA te

elueren (27).

3.2.2 TRIZOL®

Het protocol

1. Breng ongeveer 100 mg weefsel in een RNase vrij mortier.

2. Homogeniseer het weefsel in 1 ml TRI Reagent® (Sigma-Aldrich, Bornem, België).

Zorg ervoor dat geen grote stukken meer zichtbaar zijn. Bewaar gedurende de hele tijd

op droog ijs. Deze homogenisatie kan zowel in een nuclease vrij Kontes epje (VWR,

Amsterdam, Nederland) als in een steriel mortier. Wanneer voor het laatst vernoemde

wordt gekozen moet het weefsel na deze stap worden overgebracht in een Kontes epje.

3. Laat het staal gedurende 5 min staan bij kamertemperatuur zodat het nucleoproteïne

complex kan dissociëren.

4. Voeg 200 µl chloroform (Sigma-Aldrich, Bornem, België) toe.

5. Schudt het epje gedurende 15 s met de hand.

6. Laat voor 2 à 3 min staan bij kamertemperatuur. Een melkachtige vloeistof wordt

gevormd.

7. Centrifugeer gedurende 15 min aan 12000 g (10600 rpm) bij 4°C. Het mengsel wordt

door de centrifugatie gescheiden in 3 lagen. De rode onderste laag bevat eiwitten, in

de middelste witte laag zit het DNA en de kleurloze bovenste fase bevat het RNA.

8. Terwijl het staal op ijs wordt bewaard, wordt de bovenste kleurloze fase overgebracht

in een RNase vrij epje.

9. Vervolg nu met stap 7 tot en met 21 (uit 3.2.1) van het RNeasy® Mini Kit protocol.

3.3 Hoeveelheid RNA bepalen

3.3.1 Spectrofotometer

Voor de bepaling van de RNA concentratie wordt gebruik gemaakt van een spectrofotometer

(GeneQuant Biochrom, Cambridge, Verenigd Koninkrijk) (Figuur 9).

• Om de spectrofotometer te kalibreren wordt gebruik gemaakt van 100 µl nuclease vrij

water als referentie. Er wordt gemeten bij een golflengte (λ) van 260 nm. Dit is de

golflengte waarbij RNA licht absorbeert.

• Vervolgens wordt een verdunning van 1 op 100 van het staal in de cuvet gebracht. Op

die manier wordt de absorbantie gemeten. Door deze absorbantie te vermenigvuldigen

met 40 (1 absorbantie = 40 µg/ml), 100 (verdunning van 1 op 100) en tenslotte met

0.05 (0.05 ml is de hoeveelheid nuclease vrij water die wordt gebruikt) wordt de

hoeveelheid RNA bepaald. De RNA concentratie is dus 40 x A260 x verdunningsfactor.

• De spectrofotometer geeft ook de ratio van de absorbanties bij 260 en 280 (dit is de λ

waarbij proteïnen licht absorberen). Deze ratio is een schatting van de zuiverheid van

het RNA.

3.3.2 Nanodrop®

Ook met de NanoDrop® (Isogen Life Science, Maarssen,

Nederland) wordt de hoeveelheid RNA bepaald (Figuur 10). Het

wordt uitgedrukt in ng/µl. De NanoDrop® berekent ook de ratio

260/280 en 260/230. De 260/280 ratio is de verhouding van de

absorbanties bekomen na meting bij een golflengte van 260 nm

en 280 nm. Dit zijn respectievelijk de golflengtes waarbij RNA

en proteïnen licht absorberen. De 260/230 ratio is de verhouding

van absorbanties bekomen na meting bij 260 nm en 230 nm. Bij

een golflengte van 260 nm absorbeert RNA licht, suikers en fenolen doen dit bij een

golflengte van 230 nm. Deze meting werd uitgevoerd op de dienst VIB (Vlaams

Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie) MicroArray Facility van Prof. Dr. Van

Hummelen te Gasthuisberg, Leuven. Nadat duidelijk werd dat dit toestel ook beschikbaar was

in het Universitair Ziekenhuis (UZ) te Gent werd eveneens een beroep gedaan op de dienst

Figuur 10: NanoDrop® (29)

Figuur 9: De spectrofotometer van GeneQuant (28)

Medische Genetica van Prof. Dr. Speleman. De NanoDrop® is een toestel die het mogelijk

maakt kleine staal volumes (1 µl) te analyseren zonder dat er nood is aan cuvetten.

Van zodra het staal op het apparaat is gebracht, wordt het apparaat gesloten. Op die manier

wordt de druppel samengedrukt. Het staal vormt als het ware een kolom die door

oppervlaktespanning op zijn plaats wordt gehouden (Figuur 11).

De spectrale meting kan nu uitgevoerd worden bij een weglengte van 1 mm. De analyse

gebeurt door het NanoDrop® 1000 software pakket (29).

3.4 Kwaliteit en zuiverheid van het RNA

Ook voor deze procedure werd een beroep gedaan op Prof. Dr. Van Hummelen en zijn team

van de dienst VIB MicroArray Facility uit Gasthuisberg, Leuven en Prof. Dr. Speleman en

zijn team van de dienst Medische Genetica van het UZ Gent.

Er werd gebruik gemaakt van de RNA 6000 Nano Assay kit® (Agilent Technologies

Deutschland GmbH, Waldbronn, Duitsland). Met deze kit kan zowel de kwaliteit als de

kwantiteit van het RNA bepaald worden.

Denatureren van stalen en ladder

1. Breng van elk staal 1.5 µl in een epje (ABgene, Epsom, Verenigd Koninkrijk).

2. Centrifugeer 10 s om het staal te mengen.

3. Denatureer gedurende 2 min bij 70°C in een PCR toestel (Biorad ICycler, Hercules,

Canada).

Figuur 11: De kolomvorming op de NanoDrop® (29)

Decontamineren van de electroden

1. Vul langzaam een van de wells van de elektrode cleaner met 350 µl RNaseZap®.

2. Open de klep van de Agilent 2100 Bioanalyzer® (Agilent Technologies Deutschland

GmbH, Waldbronn, Duitsland) en plaats de elektrode cleaner op de daarvoor bestemde

plaats.

3. Sluit de klep en laat ze gedurende 1 min dicht.

4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner.

5. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met 350 µl RNase-vrij water.

6. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer®.

7. Sluit de klep en laat het gedurende 10 s dicht.

8. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner.

Gelbereiding

1. Laat alle reagentia gedurende 30 min op kamertemperatuur equilibreren.

2. Breng 550 µl de RNA 6000 Nano gel matrix (●) in een spinfilter.

3. Centrifugeer gedurende 10 min aan 1500 g (dit correspondeert met 4000 rpm in de

Eppendorf microcentrifuge).

4. Breng 65 µl van het gefilterde gel in een 0,5 ml RNase-vrij microfuge buis.

Bereiden van de Gel-Vloeistof Mix

1. Laat het RNA 6000 Nano vloeistof concentraat (●) gedurende 30 min op

kamertemperatuur komen.

2. Vortex het RNA 6000 Nano vloeistof concentraat gedurende 10 s.

3. Breng 1 µl van de vloeistof bij 65 µl van het gefilterde gel.

4. Bescherm het epje met aluminiumfolie tegen licht.

5. Vortex de oplossing.

6. Centrifugeer gedurende 10 min aan 13000 g (komt overeen met 14000 rpm in de

Eppendorf microcentrifuge) bij kamertemperatuur.

Laden van de Gel-Vloeistof Mix

1. Breng een nieuwe RNA Nano Labchip® (Figuur 12) op

het Chip Priming Station.

2. Pipetteer 9 µl van de gel-vloeistof mix in de well Figuur 12: RNA Nano Labchip®

van Agilent Technologies (30)

gemarkeerd met G

3. Sluit het Chip Priming Station. Zorg ervoor dat de duiker van de spuit op 1 ml staat.

4. Druk de hendel aan totdat de clip van de spuit vastzit.

5. Wacht gedurende 30 s en laat de clip dan los.

6. Wacht nog 5 s en zet de duiker van de spuit op 1 ml.

7. Pipetteer 9 µl van de gel-vloeistof mix in de wells die aangeduid zijn met een G.

Laden van de RNA 6000 Nano Merker

1. Pipetteer 5 µl van de RNA 6000 Nano Merker (●) in de well gemarkeerd met een

ladder en in de overige 12 wells.

2. Voeg 6 µl RNA 6000 Nano Merker toe wanneer een well niet wordt gebruikt.

Laden van de ladder en de stalen

1. Pipetteer 1 µl van de RNA 6000 ladder in de well gemarkeerd met een ladder.

2. Pipetteer 1 µl van een sample in één van de 12 wells.

3. Pipetteer 1 µl van de RNA 6000 Nano Merker (●) in elke ongebruikte well.

4. Vortex de chip gedurende 1 min aan 2400 rpm.

5. Loop de chip in de Agilent 2100 Bioanalyzer® (Figuur 13).

Reinigen van de Agilent 2100 Bioanalyzer®

1. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met 350 µl RNase-vrij water.

2. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer®.

3. Sluit de klep en laat het gedurende 10 s dicht.

4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner (30).

Figuur 13: De 2100 Bioanalyzer® van Agilent (30)

4. RESULTATEN 4.1 Spectrofotometer

Vooraleer het experiment werd uitgevoerd op colorectaal weefsel werd het protocol

beschreven in 3.2.1 toegepast op verschillende weefseltypes zoals slokdarm en maag ingebed

in Cryoblock® . De spectrofotometing werd uitgevoerd op de dienst pathologie van het UZ

Gent.

Om geen verwarring te scheppen met de nummering van het colorectale weefsel uit het

uiteindelijke onderzoek, wordt hier genummerd van I tot en met IX (Tabel 4). Tabel 4: RNA opbrengst uit de teststalen bekomen na meting op de spectrofotometer

Nummer

T/N

Jaartal

Absorbantie

Ratio 260/280

Opbrengst (µg)

R/B

I T 2004 0,074 1,720 7,4 R II T 2004 0,072 1,577 7,2 R III T 2003 0,206 1,677 20,6 R IV T 2002 0,046 1,514 4,6 R V T 2004 0,244 1,472 24,4 R VI T 2001 0,099 1,428 9,9 R VII T 2003 0,179 1,492 17,9 R VIII T 2001 0,055 1,482 5,5 R IX T 2003 0,050 1,672 5 R

T: Tumor, N: Normaal, R: Resectie, B: Biopt

Uit de gegevens, zoals beschreven in Tabel 4, kan besloten worden dat het

opbrengstminimum van 5 µg niet steeds wordt gehaald. Bovendien brengt het werken met

Cryoblock® heel wat praktische ongemakken met zich mee.

Na de teststalen werd overgegaan op colorectaal weefsel. Deze metingen werden eveneens

uitgevoerd op de dienst pathologie van het UZ Gent.

Uit de stalen 1 tot en met 42 werd het RNA geïsoleerd met de RNeasy® Mini Kit zoals

beschreven in 3.2.1 (Tabel 5).

Voor de stalen 43, 44, 45, 72 en 73 werd een kleine wijziging aangebracht aan het protocol

zoals beschreven in 3.2.1. Er werd namelijk geopteerd om de centrifugatie bij 20°C i.p.v. bij

4°C te laten verlopen. Voor de stalen 46 tot en met 71 werd het TRIZOL® protocol gevolgd

zoals uiteengezet in 3.2.2. Alle stalen zijn van colorectale oorsprong met uitzondering van de

stalen 11, 12, 13, 14, 49 en 50 die slokdarmweefsel zijn (Tabel 5).

Tabel 5: RNA opbrengst uit colorectaal weefsel, met uitzondering van de stalen 11, 12, 13, 14, 49, 50 waar het om slokdarmweefsel gaat, bekomen na meting met de spectrofotometer

Nummer T/N Jaartal Absorbantie Ratio

260/280 Opbrengst

(µg) R/B 1 T 2005 0,026 1,492 5,2 R 2 T 2005 0,037 1,85 7,4 R 3 T 2005 0,015 1,483 3 R 4 T 2005 0,084 1,433 16,8 R 5 N 2005 0,063 1,459 12,6 R 6 N 2005 0,048 1,466 9,6 R 7 T 2004 0,042 1,555 8,4 R 8 N 2004 0,072 1,45 14,4 R 9 N 2004 0,03 1,443 6 R 10 T 2004 0,067 1,58 13,4 R 11 T 2004 0,052 1,51 10,4 R 12 N 2004 0,005 1,742 1 R 13 N 2004 0,025 1,565 5 R 14 T 2005 0,141 1,54 28,2 R 15 N 2005 0,015 1,598 3 R 16 T 2005 0,053 1,497 10,6 R 17 N 2005 0,03 1,494 6 R 18 T 2005 0,094 1,54 18,8 R 19 N 2005 0,025 1,476 5 R 20 T 2004 0,056 1,499 11,2 R 21 N 2004 0,043 1,523 8,6 R 22 T 2004 0,041 1,491 8,2 R 23 N 2004 0,035 1,502 7 R 24 T 2004 0,021 1,496 4,2 R 25 N 2004 0,005 1,497 1 R 26 T 2004 0,016 1,584 3,2 R 27 N 2004 0,039 1,52 7,8 R 28 N 2005 0,019 1,669 3,8 R 29 N 2005 0,027 1,64 5,4 R RNALater 30 T 2005 0,046 1,528 9,2 R 31 T 2005 0,149 1,607 29,8 R 32 N 2005 0,075 1,561 15 R 33 N 2005 0,021 1,504 4,2 R 34 T 2005 0,019 1,675 3,8 R 35 T 2005 0,044 1,691 8,8 B 36 N 2005 0,02 1,817 4 B 37 T 2005 0,027 1,675 5,4 B 38 N 2005 0,031 1,652 6,2 B 39 T 2005 0,026 1,649 5,2 R 40 N 2005 0,028 1,627 5,6 R 41 T 2005 0,028 1,701 5,6 B 42 N 2005 0,023 1,571 4,6 B 43 N 2005 0.048 1.684 9.6 R 44 T 2005 0.050 1.603 10 R 45 N 2005 0.018 1.620 3.6 R 46 N 2005 0.340 1.486 68 R 47 T 2004 0,029 1,586 5,8 R

48 N 2004 0,09 1,625 18 R 49 T 2004 0,054 1,612 10,8 R 50 N 2004 0,027 1,677 5,4 R 51 N 2005 0,09 1,665 18 R 52 N 2005 0,057 1,692 11,4 R 53 N 2004 0,115 1,727 23 R 54 N 2005 0,003 1,639 0,6 R RNALater 55 N 2005 0,044 1,631 8,8 R RNALater 56 N 2005 0,093 1,612 18,6 R 57 T 2005 0,256 1,499 51,2 R RNALater 58 N 2005 0,16 1,647 32 R RNALater 59 T 2005 0,32 1,499 64 R 60 N 2005 0,176 1,551 35,2 R 61 T 2005 0,134 1,605 26,8 R 62 N 2005 0,208 1,54 41,6 R 63 T 2005 0,252 1,493 50,4 R RNALater 64 N 2005 0,135 1,639 27 R RNALater 65 T 2005 0,108 1,645 21,6 B 66 N 2005 0,045 1,706 9 B 67 T 2005 0,026 1,635 5,2 R RNALater 68 N 2005 0,071 1,674 14,2 R RNALater 69 T 2005 0,277 1,543 55,4 R 70 N 2005 0,111 1,646 22,2 R 71 N 2005 0,031 1,761 6,2 R RNALater 72 T 2005 0,006 1,128 1,2 B RNALater 73 N 2005 0,009 1,504 1,8 B RNALater

T: Tumor, N: Normaal, R: Resectie, B: Biopt

4.2 Nanodrop®

De stalen I tot en met IX en stalen 1 tot en met 73 werden na de spectrofotometer ook op de

NanoDrop® gemeten. Hier wordt naast de opbrengst en de 260/280 ratio eveneens de 260/230

ratio verkregen (Tabel 6 en 7). De teststalen werden allen gemeten door VIB MicroArray

Facility te Gasthuisberg, Leuven.

Tabel 6: De resultaten van de teststalen op de NanoDrop®

Nummer Opbrengst

(ng/µl) 260/280 260/230 I 202,7 1,98 1,98 II 161,4 2,02 1,35 III 595,4 2,02 1,9 IV 99,01 2,01 0,65 V 461,9 2,02 1,56 VI 189,5 2,03 1,18 VII 334,8 2 1,43 VIII 252,1 2,05 1,67

IX 102,7 2,01 1,19

De stalen 1 tot en met 42 evenals de stalen 69 tot en met 73 werden gemeten door de dienst

VIB MicroArray Facility te Gasthuisberg, Leuven. Stalen 43 tot en met 68 werden gemeten

op de dienst Medische Genetica te Gent.

Tabel 7: De resultaten van het colorectaal weefsel op de NanoDrop® . Merk op dat de stalen 11, 12, 13, 14, 49 en 50 ook hier weer slokdarmweefsel zijn

Nummer Opbrengst

(ng/µl) 260/280 260/230 1 101,88 1,86 0,87 2 199,02 1,95 0,6 3 126,73 1,84 1,27 4 331,88 1,97 1,81 5 122,51 1,89 1,09 6 185,45 1,96 1,67 7 67,06 1,78 0,69 8 273,19 1,99 1,37 9 95,47 1,84 0,73

10 109,87 1,86 1,02 11 223,57 1,94 1,43 12 300,25 1,98 2,02 13 138,98 1,93 1,49 14 127,77 1,99 2,21 15 66,75 2,1 1,09 16 217,06 2,04 2,14 17 150,19 2,07 1,5 18 392,06 2,07 1,76 19 120,61 2,04 1,41 20 275,95 2,07 1,87 21 104,37 2,08 0,58 22 200,75 2,08 1,94 23 158,58 2,06 1,47 24 81,34 2,03 0,79 25 12,19 2,18 0,37 26 69,17 1,87 1,67 27 168,47 2,06 1,56 28 62,36 2,06 0,41 29 109,68 2,07 1,13 30 129,32 2,07 1,93 31 403,13 2,06 1,71 32 239,62 1,66 0,58 33 0,75 1,14 0,02 34 43,63 1,96 0,89 35 162,34 2,07 1,16 36 82,89 2,09 0,23 37 132,69 2,05 1,11 38 110,33 2,07 1,04 39 67,06 2,05 0,47

40 127,38 2,05 1,17 41 72,2 2,05 0,79 42 72,99 2,04 0,96 43 147,99 2,07 1,23 44 196,47 2,08 1,34 45 46,62 1,97 0,83 46 794,52 2,05 2,08 47 105,53 2 1,18 48 306,2 2,04 1,5 49 213,95 1,98 1,69 50 78,44 1,96 1,18 51 370,4 2,01 2,18 52 309,77 2 1,47 53 561,41 2 1,94 54 11,8 1,53 0,34 55 167,23 2 2,06 56 419,97 2,02 2,15 57 1027,47 2,05 2,14 58 578,81 2,01 1,67 59 1094,37 2,06 2,17 60 932,14 2,06 2,17 61 502,85 2,03 2,02 62 585,02 2,02 1,82 63 620,58 2,03 2,05 64 397,88 2,03 1,72 65 485,23 2,02 1,67 66 194,73 2,02 1,55 67 97,65 1,97 0,48 68 240,85 1,97 0,84 69 1068,2 1,83 2,24 70 484,6 1,98 1,27 71 233,24 2,04 1,47 72 24,79 1,9 0,84 73 18,09 1,95 0,18

Na analyse van de stalen op de NanoDrop® wordt via het software pakket NanoDrop® 1000

een output verkregen zoals wordt weergegeven in Figuur 14 en 15. Figuur 14 komt overeen

met staal 30 van patiënt H en is een voorbeeld van een staal die zich perfect leent voor de

microarraytechnologie. Figuur 15 is een voorbeeld van een staal die niet geschikt is voor de

microarray. De output is afkomstig van een staal niet opgenomen in dit onderzoek. De outputs

geven informatie over de absorbantie, de ratio 260/280 en 260/230 en de concentratie.

Figuur 15: Dit is een NanoDrop® output van een staal die niet aan de nodige voorwaarden voldoet om verder geanalyseerd te worden. Het betreft hier een output van een staal die niet

in Tabel 3 is opgenomen

Na het vergelijken van de gegevens bekomen met de spectrofotometer en de NanoDrop®

moet worden vastgesteld dat deze gegevens niet altijd overeenstemmen. De grotere

Figuur 14: De NanoDrop® output van staal 30. Het staal bevat 129,3 ng/µl RNA, heeft een 260/280 ratio van 2,07 en een 260/230 ratio van 1,93. Dit staal voldoet dus aan alle

parameters om aan de 2100 Bioanalyzer® analyse te worden onderworpen

nauwkeurigheid van de NanoDrop® verklaart dit verschil. Enkel de stalen waarvan de

opbrengst op de NanoDrop® ≥ 100 ng/µl is en de 260/280 en 260/230 ratio een waarde

hebben ≥ 1,5 komen in aanmerking voor analyse met de 2100 Bioanalyzer®.

4.3 RNA 6000 Nano Assay kit® & Agilent 2100 Bioanalyzer® Wanneer een staal aan de nodige voorwaarden voldoet; dit wil zeggen dat het een RNA

opbrengst heeft van ≥ 100 ng/µl en zowel een 260/280 en 260/230 ratio van 1,5 wordt het op

een RNA Nano Labchip® gebracht. Er wordt hier echter met een zekere marge gewerkt.

Stalen die bijvoorbeeld net geen 1,5 hebben voor één van de twee ratio’s kunnen toch RNA

bevatten die van voldoende kwaliteit en zuiver is. Het loont dus zeker de moeite deze stalen

op te nemen in de verdere analyse.

De stalen van 1 tot en met 42 en 69 tot en met 73 die in aanmerking kwamen (≥ 100ng/µl;

ratio 1.5) voor de RNA Nano Labchip® werden op de chips gebracht door Prof. Dr. Van

Hummelen en zijn team te Gasthuisberg, Leuven. De stalen 43 tot en met 68 met de juiste

parameters, werden geanalyseerd op de dienst Medische Genetica te Gent (zie addendum 7.2).

Stalen 15, 25, 32, 33, 36, 43, 44, 45, 72, 73 werden niet op de RNA Nano Labchip® gebracht.

De RNA 6000 ladder die geladen werd op de RNA Nano Labchip® ter hoogte van het icoon

ladder, dient als referentie en geeft de hieronder weergegeven output (Figuur 16). Bij een

ladder dienen er 6 pieken worden gezien. Dit komt overeen met transcripten van

respectievelijk 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 en 6,0 kb. De X-as in de grafiek geeft het tijdsverloop

weer, de Y-as toont de mate van fluorescentie.

Figuur 16: De RNA 6000 Ladder is een set van 6 transcripten waarvan de pieken respectievelijk een lengte hebben van 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 en 6,0 kb.

Het RNA van 0,2 kb komt overeen met een concentratie van 20 ng/µl. De eerste piek in de output komt overeen met de merker

Uit de analyse met de Agilent 2100 Bioanalyzer® blijkt of een staal al dan niet in aanmerking

komt om op een microarray te worden gebracht. Hiervoor wordt gekeken naar de kwaliteit,

zuiverheid en degradatie van het RNA.

Hieronder worden de outputs van 3 stalen weergegeven. Het gaat om respectievelijk een staal

met RNA van goede kwaliteit (Figuur 17), een staal die een intermediaire kwaliteit heeft

(Figuur 18) en een staal waarvan het RNA gedegradeerd is (Figuur 19). Het betreft de stalen

37, 40 en 28 uit 3.1, respectievelijk. Wanneer een staal RNA bevat van goede kwaliteit

verschijnt er een grafiek met 3 duidelijk te onderscheiden pieken. De eerste piek geeft de

merker weer. De tweede piek toont de aanwezigheid van 18S rRNA en de derde piek

vertegenwoordigt het 28S rRNA. Een staal met een intermediaire kwaliteit vertoont meer

onregelmatigheden en een staal met slechte kwaliteit waarvan het RNA gedegradeerd is, heeft

een ongeordend patroon.

Figuur 17: De eerste piek in de grafiek geeft de merker weer. De tweede piek toont het 18 S rRNA en de laatste piek toont het 28 S rRNA van staal 37

Figuur 18: Deze grafiek toont duidelijk meer onregelmatigheden dan figuur 17 wat wijst op een zekere degradatie van het RNA in staal 40

Figuur 19: Deze grafiek is een weergave van staal 28 waarvan het RNA volledig gedegradeerd is

Van de 73 stalen die geanalyseerd werden zijn er 24 (33 %) van voldoende kwaliteit en zuiver

voor de microarraytechnologie, meer bepaald de stalen 2, 8, 11, 14, 16, 18, 20, 26, 27, 29, 35,

37, 38, 50, 55, 57, 58, 59, 63, 64, 67, 68, 69 en 71 (zie addendum 7.2).

De stalen 2, 8, 11, 14, 16, 18, 20, 26 en 27 waren materiaal afkomstig van resectiestukken;

stalen 35, 37 en 38 waren biopten; die werden bewaard bij -80°C. RNA werd geïsoleerd met

behulp van de RNeasy® Mini kit. Staal 29 werd opgevangen in RNALater® en het RNA werd

eveneens geïsoleerd met de RNeasy® Mini kit.

De stalen 50, 59 en 69 waren vers materiaal van resectieweefsel bewaard bij -80°C en het

RNA werd geïsoleerd met de TRIZOL® methode.

De stalen 55, 57, 58, 63, 64, 67, 68 en 71 waren resectiemateriaal opgevangen in RNALater®

en RNA werd geïsoleerd met behulp van de TRIZOL® methode.

5. BESPREKING

Colorectale kanker is een veel voorkomende vorm van kanker. In het jaar 2000 werden er

3943 nieuwe gevallen geregistreerd (5). Vele vragen zijn nog onbeantwoord en met dit

onderzoek willen we bijdragen tot het doorgronden van colorectale carcinomen. In deze

scriptie ligt de nadruk op het isoleren van RNA uit colorectaal weefsel. Dit RNA kan dan

gebruikt worden om een microarraychip te lopen. Wanneer het genexpressiepatroon, die een

colorectale tumor vertoont, gekend is, kan er naar gestreefd worden om de patiënt een

behandeling op maat aan te bieden. Wanneer de gewijzigde genexpressie, die aanleiding geeft

tot een colorectaal carcinoom, beter zal worden begrepen zal dit niet alleen tot een betere

therapie maar ook tot een betere en vroegere diagnose leiden. Dit alles zal zorgen voor een

daling van het sterftecijfer ten gevolge van deze ziekte.

Vooraleer de RNA isolatie te starten op colorectaal weefsel werd de isolatietechniek van de

RNeasy® Mini kit toegepast op verschillende weefseltypes zoals maag en slokdarm, al

naargelang wat ter beschikking was. Op die manier kon de techniek onder de knie gekregen

worden alvorens het protocol toe te passen op de duurzame colorectale weefselbank. Al deze

stalen waren ingebed in Cryoblock® en werden bewaard bij -80°C. Al gauw bleek dat dit

inbedmedium heel wat negatieve invloed had op de kwaliteit en zuiverheid van het

geïsoleerde RNA.

De manier waarop de colorectale stalen zouden bewaard worden moest dus anders. Er werd

voor gekozen de colorectale stalen te bewaren bij -80°C zonder enige manipulaties. In de

literatuur wordt deze bewaarmethode eveneens beschreven door Sugiyama et al (24) en

Huang et al (26). Na toepassen van het RNeasy® Mini kit protocol, zoals beschreven door

Sygiyama et al (24) werd tot de constatatie gekomen dat dit niet leidde tot de nodige

hoeveelheid zuiver RNA voor de microarray.

Zelfs resectieweefsel dat ingebed werd in RNALater® stabilisatie reagens bracht niet het

gehoopte resultaat met deze extractiemethode. Het inbedden in RNALater® werd gedaan in

navolging van Ghadimi en zijn team (25). Voor wat biopten betreft kan wel gesteld worden

dat inbedden in RNALater® genoeg RNA oplevert dat bovendien de juiste zuiverheid heeft.

Een andere manier van inbedden vinden we bij Birkenkamp- Demtroder et al. Zij maakten

gebruik van sodium dodecyl sulfaat en guanidinium isothiocyanaat (20). Deze inbedmethode

werd echter niet toegepast in ons onderzoek.

Een kleine wijziging werd aan het protocol van de RNeasy® Mini kit aangebracht. De

centrifugatie zou voortaan uitgevoerd worden bij 20°C in plaats van bij 4°C.

Deze wijziging leverde echter geen spectaculaire verbeteringen op.

Overstappen naar de TRIZOL® isolatiemethode was onze laatste hoop. Deze extractietechniek

werd ook gebruikt door Ghadimi et al (25) en Huang et al (26). Een gelijkaardige

extractiemethode die in plaats van het TRIZOL® isolatiereagens RNAzol® gebruikt treffen we

aan bij Birkenkamp- Demtroder et al (20). In onze studie werd van dit isolatiereagens geen

gebruik gemaakt.

Er kon vastgesteld worden dat resectiestukken ingebed in RNALater® stabilisatie reagens

voldoende RNA opleverde, volgens de TRIZOL® methode, met de juiste zuiverheid om te

voldoen aan de parameters nodig om over te stappen naar een microarray. Voor biopten bleek

deze techniek minder geschikt omdat de nodige hoeveelheid weefsel die de TRIZOL®

methode vereist vaak niet voorhanden is.

Wij gebruikten in de studie beschreven in deze scriptie als uitgangsmateriaal zowel resectie-

stukken als biopten. Resectiestukken werden ook gebruikt in het onderzoek van Birkenkamp-

Demtroder et al (20), Sugiyama et al (24) en Huang et al (26). Ghadimi en zijn collega’s

daarentegen maakten gebruik van biopten (25). Er is dus duidelijk nog geen eensgezindheid

over het uitgangsmateriaal (resectie/biopt), de bewaarmethode (zonder manipulaties,

RNALater®, sodium dodecyl sulfaat en guanidinium isothiocyanaat) en de techniek (RNeasy®

Mini kit, TRIZOL® of RNAzol®) voor de isolatie van RNA uit colorectaal weefsel.

Van alle stalen waaruit RNA geïsoleerd werd, zijn er 24 van de 73 stalen die RNA opleveren

bruikbaar voor microarrays. Bij de isolatie uit colorectaal weefsel mogen we ons dus aan een

slaagpercentage van 33 % verwachten. Van 13 stalen werd het RNA verkregen met het

RNeasy® Mini kit protocol. Het RNA van de andere 11 stalen werd verkregen met het

TRIZOL® protocol.

We kunnen dus vaststellen dat voor resectiestukken inbedden in RNALater® stabilisatie

reagens en isoleren met de TRIZOL® methode de meest geschikte techniek is. Voor biopten

wordt best gekozen voor het RNeasy® Mini kit protocol. De TRIZOL® methode vereist

namelijk teveel weefsel en die is niet voor handen bij het gebruik van biopten. Ook het

inbedden van biopten in RNALater® stabilisatie reagens heeft een gunstig effect op

hoeveelheid, kwaliteit en zuiverheid van het RNA.

Aanvankelijk was het de bedoeling om in deze scriptie het geïsoleerde RNA te gebruiken om

een microarray te lopen en zo te kijken naar de genen die een veranderd expressiepatroon

vertoonden. De patiënten konden dan ingedeeld worden naargelang de behandeling die ze

hadden gekregen om op basis hiervan de voor- en nadelen die de verschillende behandelingen

met zich meebrengen af te wegen. In de toekomst zou dat kunnen leiden tot een behandeling

op maat naar gelang het genexpressiepatroon per patiënt.

Maar aangezien het isoleren van RNA geen sinecure is en moeizamer verlopen is dan

gepland, is het niet tot een microarray gekomen.

Nu de RNA isolatie op punt staat, kan in de toekomst alle aandacht gevestigd worden op de

microarrays en de statistische verwerking van de gegevens hiervan in de hoop dat colorectale

carcinomen in de toekomst beter zullen behandeld kunnen worden.

6. REFERENTIELIJST

1) Koizumi S. Application of DNA microarrays in occupational health research (2004). J Occup Health 46: 20-25.

2) Maughan NJ, Quirke P. Pathology- a molecular prognostic approach (2002). Br Med

Bull 64: 59-74. 3) Marieb EN, Mallat J (2003). Human Anatomy. 3rd rev. ed. San Francisco (CA).

Benjamin Cummings. 4) Boyle P, Leon ME (2002). Epidemiology of colorectal cancer. Br Med Bull 64: 1-25. 5) www.vlaamseligategenkanker.be 6) Hawk ET, Limburg PJ, Viner JL (2002). Epidemiology and prevention of colorectal

cancer. Surg Clin North Am 82: 905-941. 7) Cappell MS, MD, PhD, FACG (2005). The pathophysiology, clinical presentation, and

diagnosis of colon cancer and adenomatous polyps. Med Clin North Am 89: 1-42. 8) Lau P, Sung J (2004). Screening for colorectal cancer. Chin J of Dig Dis 5: 87-92. 9) Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF (2002). Genetics of colorectal cancer:

hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull 64: 27-43. 10) Nicum S, Midgley R, Kerr DJ (2003). Colorectal cancer. Acta Oncol 42 (4): 263-275. 11) Sobin LH, Wittekind C (2002). International Union Against Cancer (UICC), TNM

Classification of malignant tumours. 6th ed. Wiley-Liss. 12) www.sweetlove.be 13) Pfau PR, Chak A (2002). Endoscopic ultrasonography. Endoscopy 34 (1): 21-28. 14) Duffy MJ (2001). Carcinoembryonic antigen as a marker for colorectal cancer: is it

clinically usefull? Clin Chem 47 (4): 624-630. 15) Walsh JME, Terdiman JP (2003). Colorectal cancer screening. JAMA 289: 1288-

1296. 16) Vlaamse liga tegen kanker; chemotherapie: Infobrochure voor kankerpatiënten en hun

familie. 17) Formentini A, Henne-Bruns D, Kornmann M. Thymidylate synthase expression and

prognosis of patients with gastrointestinal cancers receiving adjuvant chemotherapy : a review (2004). Langenbecks Arch Surg 389: 405-413.

18) www.ikcnet.nl

19) Midgley R, Kerr D (1999). Colorectal cancer. Lancet North Am Ed 353: 391-399. 20) Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Olesen SH, Frederiksen CM, Laiho P,

Aaltonen LA, Laurberg S, Sørensen FB, Hagemann R, Ørntoft TF (2002). Gene expression in colorectal cancer. Cancer Res 62: 4352-4363.

21) www.microarrays.be 22) http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bcintro/list_of_figures.htm 23) Draghici S (2003). Data analysis tools for DNA microarrays. United States Of

America. Chapman & Hall. 24) Sygiyama Y, Farrow B, Murillo C, Li J, Watanabe H, Sygiyama K, Evers BM (2005).

Microarrays and other new technologies: Analysis of differential gene expression patterns in colon cancer and cancer stroma using microdissected tissues. Gastroenterology 128: 480-486.

25) Ghadimi BM, Grade M, Difilippantonio MJ, Varma S, Simon R, Montagna C, Füzesi

L, Langer C, Becker H, Liersch T, Ried T (2005). Effectiveness of gene expression profiling for response prediction of rectal adenocarcinomas to preoperative chemoradiotherapy. J Clin Oncol 23: 1826-1838.

26) Huang J, Qi R, Quackenbush J, Dauway E, Lazaridis E, Yeatman T (2001). Effects of

ischemia on gene expression. J Surg Res 99: 222-227. 27) RNeasy Mini Handbook van Qiagen, 3rd ed. june 2001. 28) www.biochrom.co.uk/genequant.htm 29) www.nanodrop.com 30) Agilent Technologies (2003). Reagent kit guide RNA 6000 Nano Assay. 11th ed.

Waldbronn.

7. ADDENDUM 7.1 Ethisch Comité

7.2 Agilent 2100 Bioanalyzer® Outputs De figuren zoals ze in de papieren versie van deze scriptie zitten, konden hier niet worden

ingevoerd aangezien het om pdf bestanden gaat.

De pdf bestanden vind je als afzonderlijke bestanden op deze CD-ROM.