UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2011 – 2012

BEENMERGTRANSPLANTATIE EN STAMCELTHERAPIE BIJ DE HOND.

door

Kaat VAN GILS

Promotor: Dierenarts Jan Spaas Literatuurstudie in het kader

Medepromotor: Prof. Dr. Gerlinde Van de Walle van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar

te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht,

in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen

van gegevens uit deze studie.

Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het

auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft

benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de

individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De

auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen

die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD

Beenmergtransplantatie en stamceltherapie zijn innoverende behandelingen van talrijke

aandoeningen en ziekten die bijzonder veelbelovend lijken. Er is echter nog heel wat onderzoek

nodig, en gedeeltelijk reeds lopende, om in de toekomst het volle potentieel van deze technieken te

kunnen benutten. Het feit dat er wellicht nog vele baanbrekende toepassingen zullen uitgewerkt

worden met deze therapieën, spreekt mij bijzonder aan. Vandaar ook mijn keuze voor deze thematiek

als onderwerp voor de masterproef.

Toen ik aan deze literatuurstudie begon, werd het me al snel duidelijk dat ik niet het meest

eenvoudige onderwerp had gekozen. Maar na goed zoeken en heel wat artikels te lezen kon ik me

dan toch een beeld vormen van wat stamceltherapie allemaal inhield. Ik wist al dat deze therapie

toegepast wordt bij verschillende vormen van kanker, maar ik had er niet bij stil gestaan dat de

toepassingsmogelijkheden zo uitgebreid waren. Dit heeft me dan ook aangenaam verrast.

Mijn thesis is tot stand gekomen met de hulp van een aantal personen. Ten eerste wil ik mijn promotor

Jan Spaas en copromotor Prof. Dr. Gerlinde Van de Walle bedanken voor hun deskundige

begeleiding. Zij waren het venster langs waar ik een kijk kreeg op de onderzoekswereld rond

beenmergtransplantatie en stamceltherapie. Daarnaast mijn medestudenten diergeneeskunde, mijn

kotgenoten en mijn vriend Nick voor de emotionele steun, waarvoor ik ook mijn ouders en familie niet

wil vergeten. Van mijn broer Bert kreeg ik tips voor een vlotte schrijfwijze en formulering van de

teksten.

Tot slot wens ik de lezers van deze thesis veel plezier en hoop ik dat zij er een meerwaarde in vinden.

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING p. 1

INLEIDING p. 2

LITERATUURSTUDIE p. 3

1 Definitie p. 3

1.1 Embryonaal versus adult p. 3

1.2 Hematopoëtische stamcellen p. 3

1.3 Mesenchymale stamcellen p. 4

1.4 Stamcelhiërarchie p. 4

2 Stamcelisolatie p. 5

2.1 Bronnen p. 5

2.1.1 Hematopoëtische stamcellen p. 5

2.1.2 Mesenchymale stamcellen p. 5

2.1.3 Embryonale stamcellen p. 6

2.1.4 Invloed van de oorsprong p. 7

2.1.5 Effect van de donorleeftijd p. 8

2.2 Isolatie van HSC p. 8

2.3 Isolatie van MSC p. 9

2.4 Stamcel expansie in cultuur p. 9

2.4.1 Stamcelniche – optimale condities van de cultuur p. 10

2.4.2 Stamceldifferentiatie – optimale condities voor differentiatie p. 11

2.5 Bewaring p. 11

2.5.1 Cryopreservatie p. 11

2.5.2 Lange termijn cultuur p. 12

2.5.3 Stamcelbank p. 12

3 Stamceltherapie p. 13

3.1 Algemeen p. 13

3.1.1 Donor versus acceptor p. 13

3.1.2 Immunotolerantie p. 13

3.2 Hematopoëtische stamcellen p. 13

3.3 Mesenchymale stamcellen p. 14

3.3.1 Regeneratieve geneeskunde p. 14

3.3.2 Tissue engineering p. 15

3.3.3 Gebruik p. 15

3.4 Transplantatiemethode p. 18

3.5 Beenmergtransplantatie p. 18

4 Complicaties p. 19

4.1 Graft versus host reactie p. 19

4.2 Graft afstoting p. 19

4.3 Infectie p. 19

4.4 Tumorvorming p. 19

5 Toepassingen p. 20

5.1 Gebruik van MSC voor beenderregeneratie p. 20

5.2 Gebruik van HSC ter behandeling van leukemie p. 21

5.3 Individuele therapie p. 23

BESPREKING/DISCUSSIE p. 24

REFERENTIELIJST p. 25

SAMENVATTING

Afhankelijk van de leeftijd van de donor, worden stamcellen onderverdeeld in embryonale versus

adulte stamcellen. Deze laatste worden verder onderverdeeld in mesenchymale (MSC) en

hematopoëtische (HSC) stamcellen naargelang hun oorsprong en mogelijkheden tot differentiatie.

De isolatie van HSC kan enkel gebeuren uit bloed of beenmerg, terwijl MSC zich in quasi alle

weefsels van het lichaam bevinden. Na isolatie worden de stamcellen bewaard. Hierbij is het

belangrijk om de micro-omgeving van de stamcellen te optimaliseren zodat ze zo goed mogelijk

kunnen overleven. Bewaring kan eventueel diepgevroren maar meestal plaatst men ze in cultuur,

opdat ze nog zouden prolifereren. Deze vermeerdering is nodig omdat de hoeveelheid stamcellen in

een isolaat meestal onvoldoende is om te gebruiken voor therapie. Er gebeurt ook onderzoek naar

omgevingsfactoren die de stamcellen doen differentiëren in de juiste cellijn met oog op plaatselijke

toepassing.

Door de veelzijdige toepassingsmogelijkheden van stamcellen en de bijkomende eigenschap van

immunotolerantie bestaat er een brede waaier van stamceltherapieën. In dit werk worden er enkele

mogelijkheden besproken, om het praktisch gebruik van stamcellen wat toe te lichten. HSC worden

gebruikt bij de behandeling van kanker, bloedziektes en immunodeficiënties. MSC worden gebruikt bij

regeneratieve behandelingen en tissue engineering in talrijke weefsels. Beenmergtransplantatie is het

toedienen van beenmerg via een infuus. Hierbij worden er naast stamcellen, ook groeifactoren en

andere cellen toegediend die van nature aanwezig zijn in het beenmerg.

Stamceltherapie is niet zonder risico. Eerst en vooral kan het transplantaat in zijn geheel afgestoten

worden door het immuunsysteem van de patiënt. Daarom worden er bij stamceltransplantaties ook

steeds immunosuppressieve geneesmiddelen en ontstekingsremmers toegediend. De graft versus

host reactie kan leiden tot ernstige ziekte en zelfs sterfte bij de patiënt. Hierbij worden weefsels van de

patiënt aangevallen door immuuncellen uit het transplantaat. Er kunnen ook infecties optreden. En tot

slot kan het gebruik van stamcellen leiden tot kanker, direct of via stimulatie van reeds bestaande

tumoren. Daarom is er extra voorzichtigheid geboden bij onderzoek en experimentele behandelingen

met stamcellen.

Als laatste worden enkele toepassingsmogelijkheden uitvoerig besproken.

MSC zorgen voor osteogenese, -inductie, -conductie én –promotie waardoor ze aan alle voorwaarden

voor botregeneratie voldoen. Bijgevolg zijn ze een handig hulpmiddel in de behandeling van fracturen

die gestopt zijn met hun spontane regeneratie.

HSC worden al enkele decennia toegediend na de voorbehandeling van verschillende vormen van

kanker, zoals leukemie. Men heeft echter ontdekt dat ze ook eigenhandig voor bestrijding van de

ziekte kunnen zorgen door het graft versus leukemie effect. Hierbij vallen immuuncellen van het

transplantaat de kwaadaardige tumorcellen aan met behulp van cytokines.

2

INLEIDING

Stamceltherapie is een veelbelovende toepassing in het opkomende gebied van veterinaire

regeneratieve geneeskunde en chirurgie. Stamcellen kunnen differentiëren naar verschillende

celtypes, massaal vermenigvuldigen, spontaan migreren naar beschadigde weefsels, belangrijke

factoren secreteren voor weefselherstel en zijn immunotolerant. Kortom, de theoretische

mogelijkheden zijn bijna onbeperkt. Het feit dat stamcellen relatief eenvoudig te isoleren zijn en goed

vermenigvuldigen in cultuur, maakt dat ze toegankelijk zijn voor verder onderzoek.

Onderzoek naar stamcellen is niet alleen nuttig in de diergeneeskunde, maar geeft ook meer

informatie over het ziekteverloop en de behandeling bij de mens. Diermodel studies zijn vaak zeer

interessant om te extrapoleren naar de mens toe. Muizen worden vaak als proefdieren gebruikt, maar

voor extrapolatie naar de mens zijn studies bij grotere huisdieren van nog groter belang, waarvoor de

hond een veelbelovende kandidaat is. Onder andere omdat er vele gelijkaardige immunodeficiënties

zijn die zowel bij de mens als de hond voorkomen en ook omdat stamceleigenschappen van hond en

mens goed overeenkomen (Schneider et al., 2009). Bijgevolg is het experimenteel zoeken naar

pathogenese en behandeling bij honden zeer nuttig voor eventuele toepassing bij de mens. Hoewel

het vinden van een mogelijke behandeling meestal het uiteindelijke doel is, zal ook het onderzoek

naar isolatie, karakterisatie, expansie, bewaring, toediening, etc. van de caniene stamcellen een

duidelijker inzicht geven voor eventuele stamceltherapieën bij mensen.

Het onderzoek naar stamceltherapie staat echter nog in zijn kinderschoenen. Er is nog veel

onwetendheid over de precieze werkingsmechanismen en het gebruik is niet zonder risico voor de

patiënt. Aangezien het onderzoek volop gaande is, is het slechts een kwestie van tijd vooraleer grote

doorbraken zullen volgen. De toekomst ziet er veelbelovend uit maar hoe dan ook is er nog een lange

weg te gaan voor stamcellen routinematig in therapie kunnen worden toegepast.

3

LITERATUURSTUDIE

1. DEFINITIE

Stamcellen zijn ongedifferentieerde cellen die kunnen differentiëren tot cellen van verschillende

cellijnen en zichzelf kunnen vernieuwen door symmetrische deling (Spencer et al., 2011). Ze zitten

zowat overal in het lichaam en zorgen hier voor een continue fysiologische turnover of regeneratie van

het weefsel. Ook wanneer pathologische letsels optreden, worden ze geactiveerd om de schade te

herstellen.

Stamcellen kunnen een symmetrische deling ondergaan, waarbij twee dochtercellen ontstaan die

identiek zijn aan elkaar en aan de ouder-stamcel. Doorgaans zijn beide cellen ongedifferentieerd.

Echter bij een assymetrische deling ontstaat een dochtercel die meer gedifferentieerd is, deze laatste

verliest dus aan potentie en differentiatiemogelijkheden. Bij verdere deling kan ze zich enkel

omvormen tot een cel binnen een bepaalde cellijn. Vanaf er enige differentiatie plaatsvindt, verliest de

cel ook aan levensvatbaarheid en zal ze verouderen en na enige tijd afsterven.

1.1 EMBRYONAAL VERSUS ADULT

Er bestaan embryonale stamcellen en adulte stamcellen. Het gebruik van de embryonale stamcellen

wordt echter sterk ter discussie gesteld. Vanuit een ethisch standpunt gaat het immers om een jong

levend wezen dat geproduceerd en daarna gedood wordt om mee te experimenteren. Ook bestaat er

een groot gevaar op het ontstaan van teratoma’s na transplantatie bij het gebruik van deze

pluripotente cellen (Bieback en Brinkmann, 2010). Ze kunnen echter permanent in hun pluripotente,

ongedifferentieerde staat gehouden worden (Schneider et al., 2009). En bovendien kunnen ze

differentiëren in cellen van alle drie de kiemlagen, waardoor de mogelijkheden voor hun gebruik

praktisch oneindig zijn. Door deze capaciteiten bestaat er echter een risico op het ontstaan van

teratoma’s en andere tumoren bij therapeutisch gebruik.

Wegens het ethische aspect wordt er volop onderzoek gedaan naar het gebruik van adulte

stamcellen. Deze komen in alle volwassen individuen voor en kunnen geïsoleerd worden zonder dat

dit al te veel nadelige gevolgen voor de donor heeft. Sommige onderzoekers twijfelen echter of adulte

stamcellen evenveel potentieel hebben als de embryonale. Binnen de adulte stamcellen wordt een

onderscheid gemaakt tussen mesenchymale stamcellen en hematopoëtische stamcellen. Dit

onderscheid is belangrijk voor het vervolg van deze literatuurstudie en wordt daarom uitvoerig

besproken in de volgende tekstdelen.

1.2 HEMATOPOËTISCHE STAMCELLEN

Hematopoëtische stamcellen (HSC) kunnen alle hematopoëtische progenitorcellen vormen welke de

bron zijn van alle cellulaire elementen in het bloed. In de literatuur bestaat er, voor zover ik heb

gevonden, geen eenduidige definitie van HSC. Volgens Kedong et al. (2010) bevatten ze de merkers

CD34 en CD45 maar geen CD105. Maar dit zijn geen uitsluitende merkers. Bij de mens wordt CD34

als merker gebruikt voor HSC. Ook bij de hond blijkt dit een goede merker te zijn, echter ook

endotheelcellen en alle hematopoëtische progenitorcellen zijn CD34+ (Kaori et al., 2008).

4

1.3 MESENCHYMALE STAMCELLEN

Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn afkomstig van de mesenchymale weefsels. Volgens ‘The

International Society for Cellular Therapy’ zijn er verschillende criteria waaraan deze cellen moeten

voldoen: “Ten eerste moeten ze plastiek adherent zijn wanneer ze in standaard cultuur

omstandigheden worden bewaard. Ten tweede moeten ze ‘cluster of differentiation (CD)’ merkers

CD105, CD73 en CD90 tot expressie brengen maar geen CD45 (merker voor panleukocyten), CD34

(merker voor HSC en endotheelcellen), CD11b en CD14 (merkers voor monocyten en macrofagen),

CD79alfa of CD19 (merker voor B-cellen) en HLA-DR (humaan leukocyte antigen-DR) oppervlakte

molecules. Ten derde moeten ze kunnen differentiëren tot osteoblasten, adipocyten en

chondroblasten in vitro.” (Dominici et al., 2006).

Cellen worden beschouwd als MSC als ze aan zo veel mogelijk van deze criteria voldoen.

1.4 STAMCELHIËRARCHIE

Tijdens de bevruchting komen een zaadcel en een eicel bijeen, om samen de zygote of bevruchte

eicel te vormen. Deze zygote is totipotent. Dit wil zeggen dat ze de mogelijkheid heeft om te evolueren

tot alle weefsels: het volledige embryo en de extra embryonale weefsels (dit zijn de vruchtvliezen en

placenta). Deze totipotente cellen gaan zich delen door klieving, waarbij uiteindelijk een morula

ontstaat. Deze morula bestaat uit een blastocyst en een trofoblast. De blastocyst is het groepje cellen

binnen in de morula dat uiteindelijk het embryo zal vormen, deze bevat de embryonale stamcellen. De

trofoblastlaag omvat de cellen aan de buitenzijde van de morula waaruit later de extra embryonale

weefsels zullen ontstaan. De cellen van de blastocyst zijn pluripotent. Ze kunnen een volledig embryo

vormen. Hierna ontstaat de blastula, deze verschilt van de morula omdat er zich een holte, de

blastocoel, in het embryo heeft gevormd.

Dan zijn er ook nog geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cellen, gevormd uit adulte cellen (Spencer

et al., 2011). In het labo worden deze gevormd door pluripotente genen tot expressie te brengen.

Tijdens de gastrulatie ontstaan multipotente cellen. Deze kunnen nog steeds cellen uit één of

meerdere kiemlagen vormen, maar geen volledig embryo meer, wat bestaat uit drie kiemlagen: het

endoderm, het mesoderm en het ectoderm.

Vervolgens zijn er in dit stadium unipotente cellen die enkel nog hun eigen celtype kunnen vormen.

(zie figuur 1)

Naast embryonale stamcellen zijn er ook stamcellen aanwezig in het volwassen individu. Deze adulte

stamcellen zijn echter minder potent, waardoor hun gebruik iets moeilijker en beperkter is. De adulte

stamcellen zijn multipotent en kunnen differentiëren tot cellen van die kiemlaag van waaruit de

stamcel ontstaan is..

Figuur 1: Stamcellen hebben verschillende

graden van differentiatiemogelijkheden die hier

voorgesteld wordt als een hiërarchie. (Uit

Spencer et al., 2011)

5

2. STAMCELISOLATIE

2.1 BRONNEN

Stamcellen kunnen uit verschillende weefsels geïsoleerd worden. De HSC zijn enkel terug te vinden in

het bloed (perifeer of navelstrengbloed) of het rode beenmerg. De MSC kunnen uit bijna alle weefsels

worden geïsoleerd, bij de hond beschrijft men de isolatie uit volgende weefsels: vet (Vieira et al.,

2010), beenmerg (Minguell et al., 2010), foetale adnexa zoals amnionvocht, amnionmembraan en

navelstreng (matrix of bloed) (Uranio et al., 2011), haarfollikels (Kobayashi et al., 2009), olfactorisch

epitheel (Alves et al., 2010). Daarnaast werden MSC bij de mens ook reeds geïsoleerd uit perifeer

bloed, placenta, retina, periost, hersenen, lever, en skeletspieren (Rastegar et al. 2010). Hieronder

worden enkele voorbeelden bij de hond besproken.

2.1.1 Hematopoëtische stamcellen

HSC kunnen bij de hond geïsoleerd worden uit beenmerg zoals beschreven door Wijewardana et al.

(2007). Voor het bekomen van het beenmerg worden het ilium en/of de femur gepuncteerd. Beenmerg

wordt vervolgens gecollecteerd door aspiratie en bewaard in een heparine oplossing.

Daarnaast kan beenmerg ook bekomen worden door het spoelen van de beenmergholten van lange

beenderen. Dit kan echter alleen post mortem gebeuren, want de beenderen moeten hiervoor

geopend worden. Het grootste nadeel van deze werkwijze is dat het bekomen van beenmerg een

invasieve en dus ook pijnlijke procedure is.

Daarnaast kunnen HSC bekomen worden uit bloed. Dit kan navelstrengbloed zijn of perifeer bloed.

Perifeer bloed wordt bij honden meestal uit de vena jugularis genomen.

2.1.2 Mesenchymale stamcellen

Het bekomen van beenmerg voor isolatie van MSC (zie figuur 2) zal op dezelfde manier gebeuren als

bij HSC. Zo beschrijft Minguell et al. (2010) het bekomen van beenmerg voor isolatie van MSC door

aspiratie uit de ileumvleugel en Kaori et al. (2008) de aspiratie van beenmerg uit humerus en femur bij

beagles.

Figuur 2: Beenmerg wordt bij een hond geoogst uit het bekken van de patiënt. In het labo worden

MSC geïsoleerd en geëxpandeerd dmv cultuur. Vervolgens gebruikt men de MSC om een implant te

vormen dat kan dienen ter transplantatie (Uit Kraus en Kirker-Head, 2006).

6

Het bekomen van vetweefsel voor isolatie van MSC kan gebeuren via liposuctie, beschreven door

Vieira et al. (2010) bij de hond. Hierbij wordt een incisie gemaakt in de huid, parallel aan de

wervelkolom. Vervolgens verwijdert men het vetweefsel uit de subcutane ruimte boven de

oppervlakkige fascie van de gluteusspieren. Tijdens de liposuctie zijn de honden gesedeerd met

meperidine en acetylpromazine, en worden huid en subcutaan weefsel verdoofd door lokale infiltratie

met lidocaine.

Daarnaast kan vetweefsel ook bekomen worden door een bioptname. Dit gebeurt onder lokale

anesthesie, waarna het subcutaan vetweefsel gepreleveerd wordt en de incisie gehecht wordt.

Stukjes foetale weefsels, zoals amnionmembraam, amnionvocht en navelstrengmatrix, worden

bekomen na ovariohysterectomie bij honden. (Uranio et al., 2011). De stukjes amnionmembraan en

navelstrengmatrix worden in cultuur gebracht onder standaardcondities (zie 2.4 stamcel expansie in

cultuur). Het gecollecteerde amnionvocht wordt bewaard in speciale tubes en gecentrifugeerd om de

cellen van de vloeibare fractie te scheiden. De bekomen cellen worden opnieuw in een cultuurmedium

geplaatst, zoals beschreven voor amnionmembraan en navelstrengmatrix.

Vervolgens kunnen MSC ook bekomen worden uit olfactorisch epitheel. Alves (et al., 2010) doet dit bij

honden door weefsel te nemen van de ethomoïdale laminae van foetussen post mortem. Deze

stamcellen kunnen differentiëren tot cellen met neuronale merkers en dus gebruikt worden voor de

behandeling van traumatische en degeneratieve letsels van neuronaal weefsel.

Daarnaast kunnen bij de mens ook HSC en MSC gezamenlijk geoogst worden uit navelstrengbloed,

dit wordt beschreven door Kedong et al. (2010). Het is ook gebleken dat MSC het expansiepotentieel

van HSC kunnen ondersteunen en zelfs verbeteren. Onderzoek heeft uitgewezen dat MSC

groeifactoren produceren die de groei van HSC bevorderen en bij gezamenlijke transplantatie van

MSC en HSC kunnen MSC op die manier het aanslaan van HSC bevorderen en versnellen (Bieback

en Brinkmann, 2010). Bij therapeutische toepassing van HSC zal de hematopoëse dus sneller

gebeuren in aanwezigheid van MSC. MSC worden ook gebruikt als voedende cellen in celtherapie en

functionele carrier cellen in gentherapie. Het lijkt dus veelbelovend om MSC en HSC gezamenlijk te

oogsten én toe te dienen bij therapie.

MSC kunnen van HSC onderscheiden worden door middel van flow cytometrie.

2.1.3 Embryonale stamcellen

De methode voor isolatie van embryonale stamcellen bij de hond is nog maar vrij recent ontwikkeld

(Schneider et al., 2009). In 2006 slaagde men erin om cellijnen van caniene blastocysten te isoleren

die karakteristieken vertoonden van ESC, qua morfologie en expressie van pluripotente merkers.

Echter, hun zelfvernieuwend potentieel was gelimiteerd en de cellijnen waren verloren na acht

passages. Na een tijdje ontdekte men dat caniene ESC kunnen differentiëren tot HSC, maar het bleef

moeilijk om de cellen in een pluripotente, proliferatieve conditie te houden.

7

Er zijn 2 technieken beschreven om ESC te isoleren: immunodissectie van de innerlijke celmassa of

het vermenigvuldigen van volledige blastocysten. Deze laatste techniek wordt beschreven in figuur 3.

Figuur 3: Het bekomen van embryonale stamcellen (ESC) en hun toepassingsmogelijkheden.

Blastocysten worden genomen van een donorhond, hieruit verkrijgt men ESC die men oneindig kan

vermenigvuldigen. Hierna doet men deze differentiëren tot het weefsel naar keuze en kunnen ze

gebruikt worden voor weefselvervanging in de patiënt of voor in vitro onderzoek naar toxicologische

screening. (Uit Schneider et al., 2009).

2.1.4 Invloed van de oorsprong

Stamcellen uit verschillende bronnen hebben allen hun eigen voor- en nadelen. Zo zijn er volgens

Malgieri et al. (2010) belangrijke voordelen bij het gebruik van HSC uit navelstrengbloed (NSB) in

vergelijking met HSC uit beenmerg (BM). Ten eerste is het verzamelen van NSB eenvoudiger, niet

invasief en al helemaal niet pijnlijk voor de donor waardoor het aantal potentiële donors hoger is dan

voor BM. Echter, na isolatie van MSC uit NSB is er eerst een expansie op cultuur nodig vooraleer men

ze kan invriezen om te bewaren. Het aantal stamcellen uit een NSB-staal is namelijk te laag voor

therapeutisch gebruik. En elke handeling in het laboratorium geeft een groterrisico op contaminatie.

Bovendien zijn MSC uit NSB meer primitief. Er hoeft bijgevolg geen perfect genetische match te zijn

tussen donor en patiënt bij een allogene transplantatie van cellen uit het navelstrengbloed omdat deze

stamcellen minder snel een immunologische reactie veroorzaken dan die uit het BM. De immaturiteit

van de stamcellen uit het NSB zorgt voor minder immunogeniteit waardoor ze minder snel een GVHR

zullen veroorzaken.

8

Er is verder onderzoek nodig om alle voor- en nadelen van de verschillende stamcelbronnen te

identificeren en om eventuele oplossingen voor de obstakels te zoeken zodat stamceltherapie in de

toekomst zo veilig en goedkoop mogelijk kan worden uitgevoerd.

2.1.5 Effect van donorleeftijd

Volgens Suter et al. (2004) is de leeftijd van de donor bij de isolatie van hematopoëtische stamcellen

(HSC) niet onbelangrijk. Niet enkel vertonen HSC bekomen van oudere donoren duidelijke

verouderingskenmerken, ook het aantal stamcellen in het lichaam van een dier vermindert met de

leeftijd. Daarom gebeurt weefselregeneratie bij oudere dieren vaak minder efficiënt of onvolledig.

Foetale HSC zouden grotere kolonies vormen en hebben ook een hogere proliferatierespons na

toediening van cytokines. Implantatie van HSC uit navelstrengbloed blijkt dan ook efficiënter dan HSC

uit volwassen beenmerg: en succesvolle transplantatie van HSC uit navelstrengbloed kan bekomen

worden met één tiende van de dosis nodig van HSC uit volwassen beenmerg. Bij oudere dieren is er

immers een vermindering van proliferatie en differentiatie capaciteit van de stamcellen. Het ziet er dus

naar uit dat HSC geïsoleerd op jonge leeftijd een betere proliferatie en expansie kennen dan HSC

afkomstig van oudere dieren. Bovendien zouden ook mesenchymale stamcellen (MSC) afkomstig uit

navelstrengbloed meer potentieel hebben dan MSC uit bloed van volwassen mensen (Malgieri et al.,

2010).

Lund et al. (2010) weerlegde deze stelling door MSC te isoleren uit mensen van twee

leeftijdscategorieën. De eerste categorie bestond uit kinderen tussen 8 maanden en 6 jaar, de tweede

categorie waren ouderen tussen 38 en 58 jaar. De MSC van de twee categorieën werden vergeleken

op verschillende verouderingskenmerken zoals oppervlakte merkers, vesikels en pigment zoals

lipofuscine, de snelheid van vermenigvuldigen, telomeerlengte, mogelijkheid tot migratie, vermogen tot

omgaan met oxidatieve stress, etc. Enkel de snelheid van vermenigvuldigen bleek trager bij de oudere

categorie, maar het verschil was niet statistisch significant. Dit kan verklaard worden door het feit dat

er minder MSC zaten in de oorspronkelijke isolaties van de oudere donoren, gezien deze aantallen

niet exact te bepalen zijn. Het is alleszins duidelijk dat de cellen wel verouderen tijdens herhaalde

passages van de ex vivo expansie. Maar, volgens Lund et al. (2010) had de leeftijd van de donor

hierop geen significant effect.

2.2 ISOLATIE VAN HEMATOPOËTISCHE STAMCELLEN

Na het bekomen van de verschillende stamcel bevattende weefsels uit de hond, moeten de

stamcellen nog geïsoleerd worden uit deze weefsels.

Hematopoëtische stamcellen in bloed worden van de andere bloedcellen gescheiden volgens hun

dichtheidsgradiënt met behulp van centrifugatie. Hiervoor worden isotonische Percoll oplossingen van

verschillende gradiënten gemaakt (Wijewardana et al., 2007). Na centrifuge worden de cellen in de

interfase tussen de verschillende Percoll oplossingen verzameld, zo krijg je 5 fracties. De cellen uit de

verschillende fracties worden geanalyseerd op oppervlaktemerkers door flow cytometrie.

9

Daarnaast worden HSC ook vaak geïsoleerd door middel van magnetisch geactiveerde celsortering

(MAC) (Kaori et al., 2008). Hierbij worden eerst de beenmerg mononucleaire cellen gescheiden door

centrifuge volgens dichtheidsgradiënt in een Ficoll oplossing. Daarna worden de CD34+ cellen

gescheiden van de Beenmerg mononucleaire cellen door de MAC techniek. Dit werkt als volgt: eerst

worden muisantigenen tegen CD34 gebonden aan geladen metalen. Wanneer deze antigenen dan

binden met CD34 op de stamcel, worden de metalen op de CD34+ cellen aangetrokken door een

magneet. Op deze manier kunnen verschillende types van stamcellen relatief snel en eenvoudig

gesorteerd worden volgens aan- of afwezigheid van oppervlaktemoleculen zoals CD34. De zuiverheid

van de CD34+ celfractie wordt gecontroleerd met behulp van flowcytometrie.

2.3 ISOLATIE VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN

Isolatie van MSC kan gebeuren door centrifuge volgens dichtheidsgradiënt (al dan niet voorafgegaan

door enzymatische vertering), flow cytometrie isolatie of screening volgens aanhechting.

Bij centrifuge met voorafgaande enzymatische vertering worden de weefsels geïncubeerd, gewassen

met fosfaat gebufferde saline (PBS) en gedissocieerd door middel van enzymen zoals collagenase of

trypsine bevattende ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Hierdoor worden de bindweefsels

verteerd tot er enkel cellen overblijven. Vervolgens worden de stamcellen gescheiden van andere

onbruikbare cellen en celdebris door centrifuge van de overblijvende suspensie, waarbij de scheiding

gebeurt volgens dichtheid van de cellen. Eventueel kunnen de stamcellen ook gescheiden worden van

andere onbruikbare cellen door middel van een filter. Kobayashi et al. (2004) gebruikte een 100

micrometer filter om interfolliculaire epidermale of haarfollikel keratinocyten van honden te sorteren.

Na deze eerste centrifugatie ontstaan er drie laagjes: bovenaan het serum, dan de buffycoatlaag met

witte bloedcellen en onderaan de rode bloedcellen. Enkel de buffycoat wordt verder gebruikt. Deze

celsuspensie wordt verder gescheiden door middel van een een Percoll of Ficoll oplossing.

Er volgt een tweede centrifugatie waarbij de stamcellen uit de witte bloedcel fractie worden gehaald.

De buffycoat wordt wederom verzameld en hieruit worden de stamcellen in een cultuurmedium

geplaatst voor verdere expansie. Tijdens de expansie wordt het cultuurmedium regelmatig vervangen

en worden telkens de niet-adherente cellen verwijderd. Op deze manier gebeurt er een verdere

concentratie van de adherente stamcel populatie, dit zijn de MSC.

Bij collectie van stamcellen uit bloed wordt het bekomen bloed rechtstreeks gecentrifugeerd en is er

geen voorafgaande vertering nodig.

2.4 STAMCELEXPANSIE

Afhankelijk van de techniek worden kleine tot iets grotere aantallen stamcellen geoogst, maar voor

therapeutisch gebruik zijn meestal grotere hoeveelheden nodig. Dit kan men oplossen door een

combinatie te nemen van verschillende stalen of door ex vivo expansie van de geoogste stamcellen.

Voor ex vivo expansie van MSC legt men de stamcellen in weefselcultuurplaten. Hierbij wordt de

natuurlijke stamcelniche (=micro-omgeving) zo sterk mogelijk nagebootst.

10

De culturen worden behouden aan standaardcondities (= 37°C met 5% CO2 en 20% O2) op

groeimedia. Deze media bevatten serum, groeifactoren, en eventueel antibiotica voor het optimale

behoud en proliferatie van de stamcellen. Daarnaast worden ook stromale cellen gebruikt om de

stamcellen te ondersteunen. De cultuurmedia worden om de drie tot vier dagen vervangen. De

bedoeling is dat er een homogene populatie van stamcellen ontstaat.

Madkaikar et al. (2007) onderzocht de ideale omstandigheden voor het vermenigvuldigen van HSC

bekomen uit navelstrengbloed van de mens. Een tekort aan stamcellen in het transplantaat is immers

een belangrijke oorzaak van graft afstoting en uitgesteld aanslaan van de graft. In het onderzoek

werden twee verschillende mengsels van groeifactoren vergeleken, en de bijdrage van stromale (=

steungevende) cellen. Het eerste mengsel van groeifactoren (GF1) bevatte enkel de vroeg

optredende groeifactoren: stamcelfactor, interleukine-3 en interleukine-6. Het tweede mengsel

groeifactoren (GF2) bevatte zowel vroeg als laat optredende groeifactoren: stamcelfactor, ilterleukine-

3, interleukine-6, granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor en erythropoëtine. GF2 bleek de

beste expansie van HSC te geven. De culturen met steun van stromale cellen, groeiden beter dan

deze zonder.

2.4.1 Stamcelniche

De stamcelniche is de natuurlijke micro-omgeving van de stamcel in het lichaam van het individu.

Deze micro-omgeving draagt bij tot het bekomen van de specifieke eigenschappen van de stamcellen,

zoals hun regeneratie en proliferatie capaciteit. De expansie en differentiatie van stamcellen ex vivo

daarentegen is beperkt. Volgens Vacanti et al. (2005) vertonen MSC die reeds enkele passages

hebben ondergaan, tekenen van celveroudering en hebben ze een verminderde

differentiatiecapaciteit. Het is dus aangewezen om de stamcelniche in vivo te onderzoeken om ze ex

vivo zo goed mogelijk te kunnen nabootsen. Op deze manier kunnen alle nuttige eigenschappen van

stamcellen - zoals ze die hebben in hun natuurlijke niche - zo goed mogelijk behouden worden.

De stamcelniche bestaat uit de stamcellen zelf maar ook de extracellulaire matrix, oplosbare

moleculen en aangrenzende, steungevende cellen (Spencer et al., 2011). De stamcelniche bepaalt

proliferatie, differentiatie en apoptose van de omliggende cellen door middel van cytokines en andere

factoren. Ook intercellulaire communicatie in de niche en interactie tussen cellen en de extracellulaire

matrix spelen een bepalende rol (Spencer et al., 2011). De extracellulaire matrix kan factoren

secreteren die proliferatie of differentiatie van omliggende cellen stimuleren en kan inflammatie en

immuunrespons verminderen.

In de natuurlijke stamcelniche heerst een toestand van hypoxie. Het zuurstofgehalte in de weefsels

varieert sterk van plaats tot plaats maar is in het lichaam altijd lager dan de atmosferische gehalten.

Stamcellen zouden bij een contact met bloedvaten, waar een hoger zuurstofgehalte heerst, aangezet

worden tot differentiatie. Daarnaast zal ook de lengte van de telomeren in belangrijke mate de

differentiatie en proliferatie capaciteit bepalen. Een verminderde activiteit van telomerase zou de

differentiatie van MSC voorkomen (Rastegar et al., 2010).

11

Er bestaat een ruime keuze uit verschillende soorten groeimedia, supplementen, sera en

groeifactoren om de bewaring en groei van stamcellen in cultuur te optimaliseren aan de hand van

gekende nichefactoren.

2.4.2 Stamceldifferentiatie

Voor therapeutisch gebruik is het vaak gewenst om stamcellen tijdens de ex vivo expansie te laten

differentiëren tot een bepaald celtype. Hiervoor worden culturen gebruikt met specifieke groeifactoren,

maar ook andere eiwitten en/of chemische producten die de differentiatie naar een bepaalde richting

kunnen sturen.

Zo hebben Volk et al. (2005) bone morphogenetic protein (BMP)-2, ascorbaat, dexamethasone en een

combinatie van deze stoffen toegediend aan culturen van MSC uit het beenmerg van de hond, om

inductie van osteogenese te bekomen. Ter beoordeling werd de alkaline fosfatase activiteit van de

culturen gemeten en RNA geïsoleerd om met de polymerase chain reaction (PCR) analyse osteoblast

merkers te detecteren. Uit het onderzoek bleek dat BMP-2 vroege merkers van osteogenese in de

culturen teweeg bracht. Dexamethasone echter niet. Ascorbaat stimuleerde de vorming van

extracellulaire matrix wat belangrijk is voor de maximale BMP-2 respons van de MSC. Ook de leeftijd

van de honden maakte een verschil. Bij jonge, immature honden was er een grotere stijging van

merkers en fosfatase activiteit in combinatie met ascorbaat en BMP-2.

Ook combinatie van dexamethasone, ascorbaat en beta-glycerofosfaat zou osteogenetische

differentiatie stimuleren (Spencer et al., 2011).

2.5 BEWARING

2.5.1 Cryopreservatie

Na de isolatie en voor of na expansie, is het nuttig dat stamcellen voor langere tijd bewaard kunnen

blijven. Cryopreservatie is het bewaren van cellen in diepgevroren toestand, die kan variëren tussen

temperaturen -40°C en -196°C. Bij invriezen van cellen stopt de proliferatie en differentiatie. Typisch

wordt daarbij dimethylsulfoxide (DMSO) gebruikt, een intracellulair cryoprotectant dat kan bewegen

langs de celmembraam door het water in de cel te verplaatsen. Zo voorkomt het dat er in de cel

ijskristallen worden gevormd die de celmembraan kunnen doen scheuren. Invriezen met DMSO als

cryoprotectant wordt beschouwd als de “gouden standaard”.

Kaori et al. (2008) deed een onderzoek naar de ideale omstandigheden voor het bewaren van CD34+

cellen uit beenmerg van de hond. Hij vergeleek twee oplossingen waarbij oplossing A, bestaande uit

fysiologische zoutoplossing met 5% DMSO, 6% hydroxyethyl zetmeel en 4% bovien serum albumine,

vergeleken werd met oplossing B, bestaande uit foetaal bovien serum met 10% DMSO. Daarnaast

vergeleek hij ook twee methoden van invriezen. De eerste is een geprogrammeerde gradiënt-

gestuurde vriezer, waarbij de temperatuur met een vaste snelheid daalt (bv. 1°C per minuut). De

tweede is een gewone vriescontainer. Op verschillende tijdstippen werden volgende parameters

gemeten: kolonievormende eenheid, celherstel en celleefbaarheid.

12

Uit het onderzoek bleek dat oplossing A en de geprogrammeerde gradiënt-gestuurde vriezer een

betere bewaring garanderen. Alle diepgevroren tubes werden uiteindelijk bewaard in vloeibare stikstof

bij een temperatuur van min 196°C.

In plaats van in een ander dierlijk serum kan cryopreservatie ook gebeuren in autoloog plasma, zodat

de cellen niet aan vreemde antigenen en antilichamen blootgesteld worden.

2.5.2 Lange termijn cultuur

Naast het invriezen kunnen culturen van stamcellen ook op lange termijn bewaard worden. De cellen

blijven dan wel prolifereren maar het is de bedoeling dat ze niet differentiëren.

Neuner et al. (1998) onderzocht de ideale omstandigheden om culturen, bekomen van de hond, op

lange termijn te behouden. Groeifactoren zoals granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-

KSF) en recombinant canine stamcelfactor (rcan-SCF) zorgden voor grotere en meer

kolonievormende eenheden (KVE) in kortetermijn culturen. Echter, na drie weken cultuur zagen ze

een daling van het aantal KVE. Daarnaast werden ook verschillende commercieel verkrijgbare

celcultuur media vergeleken in datzelfde onderzoek. De toediening van hydrocortisone als supplement

aan de cultuur verbeterde de groei van de cellen. Vervolgens werd het gebruik van serum van

verschillende diersoorten onderzocht. Humaan serum bleek zeer efficiënt voor het behoud van lange

termijn culturen terwijl foetaal kalf serum minder goed werkte. Tot slot bleek ook de

incubatietemperatuur een niet onbelangrijke factor. Er werden meer kolonievormende eenheden

gevormd bij 37°C dan bij 33°C. Een belangrijke conclusie was dat er voor caniene beenmergcellen na

lange termijn cultuur andere behoeften zijn voor de groei dan voor verse beenmergcellen.

2.5.3 Stamcelbank

Eenmaal de bewaring van stamcellen op punt staat, zal een (internationale) stamcelbank erg nuttig

zijn. Op deze manier kan er heel wat tijd uitgespaard worden met het zoeken naar een geschikte

donor voor HSC, waarna de stamcellen nog geïsoleerd en geëxpandeerd moeten worden. Indien

aangetoond kan worden dat het veilig is, zou men het in overweging kunnen nemen om MSC van

andere dieren van dezelfde soort (allogeen) te bewaren en deze toe te passen wanneer een letsel

zich voordoet. Voor humane stamcellen wordt dit reeds toegepast in ziekenhuizen of non-profit

organisaties (Malgieri et al., 2010).

13

3. STAMCELTHERAPIE

3.1 ALGEMEEN

Het doel van stamceltherapie is dat een patiënt stamcellen toegediend krijgt om zieke of beschadigde

cellen te vervangen en hun functie over te nemen. Dit noemt men ook regeneratieve geneeskunde,

wat neerkomt op het herstellen, vervangen of de nieuwvorming van cellen, weefsels en organen.

De HSC kunnen enkel afweer- en bloedcellen vervangen en zullen bijgevolg ingezet worden bij allerlei

bloedziektes of immunodeficiënties. Zoals eerder besproken, hebben de MSC meerdere

differentiatiemogelijkheden over verschillende cellijnen en hebben zij bijgevolg ook meer

toepassingsmogelijkheden.

3.1.1 Donor versus acceptor

De donor van de stamcellen kan de patiënt zelf zijn, dan spreekt men van een autologe transplantatie.

Hierbij treedt geen afstoting op en is er minder kans op infectie, waardoor meestal een sneller herstel

plaatsvindt. Bij een allogene transplantatie zijn donor en patiënt verschillende individuen van

eenzelfde diersoort. De weefsels van de donor kunnen dan herkend worden als lichaamsvreemd en er

bestaat risico op afstoting. Wanneer acceptor en donor voldoende genotypische gelijkenissen

vertonen, is de kans op afstoting kleiner. Een laatste mogelijkheid is het toedienen van stamcellen aan

een patiënt met een donor van een verschillende diersoort. Dit noemt men een xenologe

transplantatie wat echter zelden wordt toegepast.

3.1.2 Immuuntolerantie

Adulte stamcellen zijn ideaal voor gebruik bij transplantatie omdat ze immunotolerant zijn. Dit wil

zeggen dat ze geen immuunrespons induceren in een vreemd lichaam. Soms zijn stamcellen zelfs

immunosuppressief, wat wil zeggen dat ze actief de immuunrespons kunnen onderdrukken en zo

ontsteking beperken. Ongedifferentieerde MSC kunnen de immuunrespons moduleren, door

onderdrukking van T-cel proliferatie, via cel/cel interactie tussen de stamcellen en hun doelcellen en

door secretie van oplosbare factoren (Mezey et al., 2011).

MSC hebben enkel MHC klasse I en geen MHC klasse II oppervlaktemoleculen en bovendien geen

co-stimulerende moleculen. Dit betekent dat deze MSC geen antigeenpresenterende cellen zijn,

waardoor ze ongezien blijven voor het immuunsysteem van de acceptor (Krampera et al., 2003).

Bijgevolg kan het toedienen van allogene MSC na transplantatie het voorkomen van graft versus host

reactie verminderen. (Le Blanc, 2006).

3.2 HEMATOPOËTISCHE STAMCELLEN

Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) kan een brede waaier aan hematologische

aandoeningen behandelen. Hieronder worden een aantal voorbeelden bij de mens uitgewerkt omdat

er tot nu toe weinig informatie beschikbaar is omtrent gebruik van HSC bij de hond.

14

Kanker

Initieel werden HSC gebruikt ter ondersteuning van het beenmerg na radio- of chemotherapie. Deze

therapieën zijn cytotoxisch en doden naast de neoplastische cellen ook lichaamseigen, gezonde

cellen. Hierdoor worden stamcellen vernietigd, die onder andere instaan voor de bloedvorming en

immuniteit in het beenmerg.

Vanaf de jaren 70 ontdekte men dat HSCT ook gebruikt kon worden ter bestrijding van allerlei soorten

kanker zonder voorafgaande chemo- of radiotherapie. De HSC hadden een curatief effect door hun

immune werking (Odom et al., 1978). HSC van de donor kunnen namelijk het acceptorweefsel

aanvallen. Wanneer gezond weefsel wordt vernietigd, spreekt men van de graft versus host reactie

(GVHR). Wanneer de donorcellen echter kwaadaardige cellen aanvallen, ontstaat het graft versus

tumor (GVT) effect. Dit is een nuttig effect dat kan gebruikt worden voor de behandeling van tumorale

processen. Op deze manier kunnen bijvoorbeeld leukemie maar ook myeloma’s, lymfoma’s of solide

tumoren bestreden worden (Ringdén et al., 2009).

GVT is een vorm van graft versus host reactie (GVHR). Dit is een complicatie die zich vaak voordoet

bij transplantaties. Deze reactie kan leiden tot recidieven of transplantatie gerelateerde mortaliteit

(TRM). Het mechanisme van GVT is bijgevolg gelijkaardig aan dat van GVHR.

Het gaat om T-cellen die lichaamsvreemde antigenen aanvallen. Bij voorkeur zijn dit specifieke T-

cellen zodat ze selectief de ‘zieke’ cellen aanvallen en niet de gezonde, lichaamseigen weefsels. Ze

kunnen gebruikt worden ter bestrijding van leukemie, bijvoorbeeld door een specifieke T-cel receptor

te implanteren in de toe te dienen T-cel populatie. Maar ook opportunistische infecties zoals

cytomegalovirus, adenovirus en epstein barr virus bevatten specifieke antigenen waartegen T-cellen

kunnen worden ingezet (Falkenburg et al., 1999). Ten derde kunnen de T-cellen ook orgaanspecifieke

antigenen aanvallen. Deze antigenen komen echter tot expressie in kwaadaardige en niet-

kwaadaardige cellen, dus het volledige orgaan wordt aangevallen. Deze therapie is bijgevolg enkel

bruikbaar in niet-vitale organen zoals de prostaat of borstklieren (Bishop et al., 2004). Ten slotte

bestaan er ook nog tumor-geassocieerde antigenen die selectief tot expressie komen in kwaadaardige

cellen zoals Wilms tumour antigen 1, mucin-1 en proteinase-3 bij de mens (Rezvani en Barrett, 2008).

Aangeboren of verworven bloedziektes

Bloedziektes kunnen aangeboren zijn, zoals aplastische anemie, sikkelcelziekte (rbc in sikkelvorm

waardoor kleinste bloedvaten kunnen verstoppen) en thalassemie (foutief hemoglobine dat door eigen

lichaam wordt afgebroken) of verworven, zoals onder andere anemie. Beenmerg of navelstrengbloed

transplantaties worden gebruikt in de therapie tegen ernstige hemoglobinopathiën (Eridani en Mosca,

2008).

3.3 MESENCHYMALE STAMCELLEN

3.3.1 Regeneratieve geneeskunde

MSC kunnen differentiëren tot een brede waaier van cellen, zelfs tot cellen die niet van mesodermale

oorsprong zijn, zoals hepatocyten, neurale cellen en epitheliale cellen. Bijgevolg kennen ze een breed

toepassingsgebied in tal van therapieën zoals bij hartinfarcten, acuut nierfalen of leverziekten.

15

MSC kunnen op verschillende manieren bijdragen aan het herstel van weefsels door (Mezey, 2011):

a) Rechtstreeks aan te slaan op het weefsel, te differentiëren naar weefselspecifieke stamcellen,

vervolgens prolifereren en zo het defect opvullen.

b) Het teweegbrengen van een paracrien effect door productie van factoren die groei,

differentiatie en regeneratie van de aanwezige stamcellen induceren.

c) Het voorkomen van apoptose van beschadigde cellen door productie van anti-apoptotische

factoren. Het ‘redden’ van deze cellen draagt bij tot een snellere heling. Stamcellen uit het beenmerg

kunnen bijvoorbeeld IL-6 produceren dat apoptose van neutrofielen tegengaat.

d) Het moduleren van het immuunsysteem door inhibitie of inductie van migratie en door

cytokineproductie.

3.3.2 Tissue engineering

Bij ‘tissue engineering’ worden nieuwe weefsels gevormd die geïmplanteerd worden in de patiënt om

een defect op te vullen. Hiervoor worden stamcellen, biomoleculen en scaffolds of sheets als dragers

gebruikt waarop de stamcellen worden geïmplanteerd.

Op deze manier kunnen verschillende weefsels gereproduceerd worden. Zo beschreef Jafarian et al.

(2008) de vorming van beenweefsel ter herstel van kaakbeen ter hoogte van de mandibula van een

hond. Maar ook vetweefsel, kraakbeen en zelfs een bronchus kunnen op deze manier gevormd

worden (Spencer et al., 2011). Bij regeneratieve geneeskunde worden stamcellen gebruikt als steun

of hulp in het zelfherstel van schade aan de weefsels. Terwijl bij tissue engineering er effectief nieuwe

organen of weefsels worden gevormd.

3.3.3 Gebruik:

Orthopedie (zie figuur 4A)

MSC kunnen toegepast worden voor de behandeling van verschillende orthopedische problemen

zoals non-union fracturen, ligament- en peesletsels, genetische beenderaandoeningen zoals

osteogenesis imperfecta en hypofosfatase, groeidefecten, degeneratieve aandoeningen en

osteoarthritis (Rastegar et al., 2010).

Dit kan door het toedienen van opgezuiverde stamcellen of een beenmergtransplantatie, waarbij het

volledige beenmerg wordt toegediend. MSC zorgen voor een verhoogde sterkte van het bot door het

bevorderen van de beendergroei, met als gevolg een verminderde kans op fractuur (Horwitz et al.,

2002). Bone morphogenetic proteïne-9 is een groeifactor die de MSC aanzet tot differentiatie naar

beendercellen en kan dus een belangrijke hulp zijn bij deze vorm van therapie.

Ook (gewrichts)kraakbeen kan hersteld worden met MSC. Het is aangetoond door Yan en Yu (2007)

bij het konijn dat ze een beter herstel geven dan de toediening van chondrocyten, fibroblasten of HSC

uit navelstrengbloed. MSC geven namelijk een betere subchondrale beenremodellering, cel ordening

en integratie met omliggend kraakbeen. Op deze manier kan ook osteoartritis behandeld worden.

16

Figuur 4: Therapeutisch potentieel van perinatale MSC. (Uit Bieback en Brinkmann, 2010)

Hartaandoeningen (zie figuur 4B)

Hatzistergos et al. (2011) deden onderzoek bij meer dan 500 grote dieren zoals varkens, honden en

schapen. Ze besloten dat MSC transplantatie een veilige en duurzame methode was ter behandeling

van hartaandoeningen, en eventueel zelfs effectiever dan beenmergtransplantatie. De MSC konden

differentiëren in cardiomyocyten en hartvezels maar stimuleerden ook de eigen stamcellen van het

hart tot nieuwvorming van hartspier.

Ruggenmerg-, hersen- en zenuwletsels (zie figuur 4C)

Transplantatie van humane MSC uit navelstrengbloed in een ruggenmergletsel kan gebruikt worden

voor compensatie van de demyelinisatie, promotie van axonale regeneratie, het sturen van de axonen

in de juiste richting en vervanging van verloren cellen. MSC kunnen op die manier gebruikt worden ter

behandeling van allerlei beschadigingen in de hersenen, zoals de ziekte van Parkinson bij de mens

(Weiss et al., 2006).

Longaandoeningen (zie figuur 4D)

Bij acuut respiratoir distress syndroom treedt er een progressief verlies op van longweefsel door

inflammatie en fibrose. Naast beenmergtransplantatie kunnen hier ook MSC gebruikt worden als

therapie (Ortiz et al., 2003). De MSC kunnen namelijk differentiëren tot longspecifieke celtypes. Ook

letsels ten gevolge van hypoxie, zoals bronchopulmonaire neonatale dysplasie, kunnen verbeteren

met MSC therapie.

17

Nierletsels

MSC kunnen ook toegepast worden bij acuut nierfalen en acute nierletsels. Onderzoek wees uit dat

toediening van MSC bij muizen met acute nierletsels de nierfunctie verbeterde en bovendien de

levensduur van de muizen kon verlengen. Dit als gevolge van een vermindering van apoptose en het

bevorderen van de celproliferatie door productie van groeifactoren (Morigi et al., 2010).

Auto-immune aandoeningen

Multiple sclerose, reumatoïde artritis, ziekte van Crohn en systemische lupus erythematosus zijn auto-

immune aandoeningen bij de mens die effect kunnen hebben op specifieke organen of soms zelfs het

volledige lichaam van het zieke individu. MSC zijn immunotolerant en kunnen het immuunsysteem

moduleren tot zelfs volledig onderdrukken. Bijgevolg kunnen ze erg nuttig zijn in de bestrijding van

auto-immune aandoeningen.

Multiple sclerose is een auto-immune aandoening waarbij het immuunsysteem het centraal

zenuwstelsel aanvalt. Dit leidt tot demyelinisatie van axonen met talrijke neurologische symptomen tot

gevolg. Men probeert de ziekte onder controle te houden met behulp van steroïden, immuun

modulatoren en immuun modulerende antilichamen. MSC therapie zou echter efficiënter zijn,

aangezien het effectief de immune aanval tegen het zenuwstelsel kan remmen. Dit gebeurt door

stimulatie van de regulatorische T-cellen, door het cytokineprofiel te doen afwijken en door apoptose

van geactiveerde T-cellen te veroorzaken. Daarnaast stimuleren MSC ook de regeneratie van het

beschadigde weefsel (Riordan et al., 2009).

Tumoren

MSC hebben verschillende eigenschappen waardoor ze ingezet kunnen worden bij de bestrijding van

tumoren. Eerst en vooral hebben ze de neiging om te migreren naar ischemische weefsels zoals het

hart na een hartinfarct maar ook naar de tumorale omgeving. Ook lokale hoge concentraties aan

paracriene groeifactoren doet de MSC migreren naar plaatsen van tumorgroei. Daar zorgen ze voor

een vertraging van tumorproliferatie door apoptose te promoten. En tot slot kunnen MSC tumorgroei

afremmen door directe cel-cel contacten (Khakoo et al., 2006).

Bovenstaande voorbeelden zijn slechts een kleine greep uit het aantal mogelijke behandelingen met

MSC. Aangezien MSC kunnen differentiëren in zowat alle cellen, is hun gebruik enorm veelzijdig.

18

3.4 TRANSPLANTATIEMETHODE

De transplantatie moet ervoor zorgen dat de toegediende stamcellen ter plaatse geraken. Meestal

gebeurt dit door inspuiting in de bloedstroom of lokaal op de plaats van het defect. Stamcellen hebben

een variëteit aan chemokinereceptoren die het migreren naar de doelplaats mogelijk moeten maken.

Wanneer de cellen ter plaatse zijn, kunnen ze differentiëren naar orgaanspecifieke cellen zodat

regeneratie kan plaatsvinden of eventueel reeds begonnen regeneratie versnelt.

3.5 BEENMERGTRANSPLANTATIE

Het beenmerg is belangrijk voor de bloedvoorziening en het immuunsysteem. Wanneer het beenmerg

aangetast is, kan dit vervangen worden door gezond beenmerg. Het doel van de transplantatie is het

aanbrengen van voldoende nieuwe stamcellen om het immuunsysteem te versterken en een normale

bloedvoorziening te verzekeren. Volgens Mezey et al., (2011) bevat het beenmerg bovendien MSC

die kunnen differentiëren toteen waaier van weefsels. Deze MSC produceren ook groeifactoren,

factoren die immuuncellen aantrekken en anti-apoptotische agentia. Wanneer de MSC uit het

beenmerg in contact komen met immuuncellen, kunnen ze hun functie beïnvloeden en zo het lichaam

helpen met weefselherstel. Tot slot ondersteunen de MSC ook de hematopoëtische differentiatie van

de HSC in het beenmerg (Kedong et al.,2010).

Beenmergtransplantatie is dus een vorm van stamceltherapie hierbij wordt het volledige beenmerg

ingespoten bij de acceptor zonder specifieke voorafgaande isolatie van stamcellen. Op deze manier

worden dus zowel HSC als MSC met bijhorende adulte cellen, groeifactoren, cytokines in één keer

toegediend.

Voor een beenmergtransplantatie worden bij voorkeur stamcellen van een gezond persoon gebruikt.

Eventueel kan men beenmerg genomen worden van de patiënt zelf. Een typisch gebruik van

beenmerg is bij de behandeling van kanker. Het beenmerg wordt gecollecteerd voor de aanvang van

de cytotoxische therapie en bewaard om later, na de therapie, toe te dienen.

Transplantatie van beenmerg kan analoog aan een bloedtransfusie gebeuren, waarbij het beenmerg

in het bloed wordt gebracht. Beenmerg kan ook intra-osseus worden toegediend (Suter et al., 2004).

De toepassingen van beenmergtransplantatie zijn wederom zeer uitgebreid. Malgieri et al. (2010)

beschrijven het gebruik bij behandeling van hartaandoeningen, orthopedische problemen en

kraakbeenletsels, huiddefecten, nierstoornissen en neuronale ziekten.

19

4. COMPLICATIES

4.1 GRAFT AFSTOTING

Bij een beenmergtransplantatie worden, naast stamcellen, ook adulte cellen en andere componenten

ingespoten die van nature aanwezig zijn in het beenmerg. Deze stoffen worden wel herkend als

lichaamsvreemd. Er is dus geen sprake van immunotolerantie zoals deze wel optreedt bij zuivere

stamceltherapie. Hierdoor kunnen allogene transplantaten worden afgestoten door de gastheercellen.

Bepaalde componenten kunnen herkend worden als lichaamsvreemd door incompatibiliteit tussen

oppervlaktemoleculen van donor en acceptor. Graft afstoting kan voorkomen worden door een donor

te zoeken met voldoende genetische gelijkenissen of door het uitlokken van immunosuppressie.

4.2 GRAFT VERSUS HOST REACTIE

Wanneer het immuunsysteem van de gastheer onderdrukt is, in die mate dat er geen afstoting van het

transplantaat plaatsvindt, kunnen immunocompetente donorcellen het acceptorweefsel aanvallen. Dit

is de graft versus host reactie (GVHR). Deze reactie is alles behalve bevorderend voor het

genezingsproces en kan leiden tot transplantatiegerelateerde mortaliteit (TRM).

Het volledige mechanisme van de GVHR is nog niet gekend. Maar het gaat alleszins om alloreactieve

T-cellen van de donor die geactiveerd worden door en reageren op antigenen van de acceptor. Het

zijn CD4+, CD8+ en natural killer (NK) cellen in het transplantaat die met behulp van cytokines zoals

interleukine-2, interferon-gamma en tumor necrosis factor-alfa de GVHR teweeg brengen (Schmaltz et

al., 2003). Deze cytokines zullen effectorcellen aantrekken, zoals CD4+ T-cellen die op hun beurt

celsterfte veroorzaken door Fas-FasLigand geïnduceerde apoptose terwijl de CD8+ T-celreactie

voornamelijk gebaseerd is op perforine degranulatie (Hseih en Korngold, 2000).

4.3 INFECTIE

Infecties na transplantatie kunnen ontstaan door onvoldoende steriel te werken in het labo of bij de

inspuiting, of door een virusinfectie bij de donor. Vooral bij beenmergtransplantatie bestaat er een

relatief grote kans op infectie omdat er een verhoogde blootstelling aan virussen plaatsvindt.

4.4 TUMORVORMING

Zoals eerder vermeld hebben MSC de neiging om te migreren naar ischemische weefsels zoals de

tumorale omgeving (Khakoo et al., 2006), ook de lokale hoge concentraties aan paracriene

groeifactoren doet de MSC migreren naar plaatsen van tumorgroei. Bijkomend kunnen MSC tot

eender welke cellen differentiëren en zijn ze in staat om oneindig te prolifereren. Daarom moet er

voorzichtig worden omgegaan met stamcellen. Daarenboven kunnen MSC tumorgroei bevorderen en

eventueel metastasen veroorzaken door actief naar de plaats van tumorvorming te migreren en terwijl

angiogenese te induceren (Tang et al., 2005). Uit MSC kunnen bovendien zelf tumoren ontstaan. Ze

worden aangetrokken tot plaatsen met chronische ontsteking waar ze vervolgens metaplasie kunnen

ondergaan en omvormen tot kankercellen. Aangezien MSC kunnen differentiëren in talrijke

verschillende weefsels, bestaat het risico op het ontstaan van teratoma’s.

20

5. TOEPASSINGEN

5.1 GEBRUIK VAN MSC VOOR BEENDERREGENERATIE BIJ DE HOND

Herstel van beperkte schade in beenweefsel gebeurt door secundaire beenvorming door de in het

weefsel aanwezige MSC. Bij breuken of beenonderbrekingen ontstaan bloedingen die leiden tot

vrijstelling van chemo-attractieve stoffen die MSC aantrekken naar de plaats van schade. Biologische

en mechanische omgevingsfactoren zorgen voor proliferatie en differentiatie van MSC tot

chondroblasten, fibroblasten en osteoblasten met de vorming van een callus.

Soms is de schade echter te groot en is herstel door callusvorming niet mogelijk. Een ondersteunende

behandeling kan dan de natuurlijke helingmechanismen optimaliseren zodat grotere stukken been

kunnen regenereren.

Om beenregeneratie te bekomen zijn vier processen belangrijk (Kraus en Kirker-Head., 2006):

a) Osteogenese: Het juiste type cellen moet aanwezig zijn om beenweefsel te kunnen vormen.

b) Osteoinductie: De cellen moeten aangezet worden tot omvorming tot beenweefsel.

c) Osteoconductie: Er moet een drager zijn waarop de been vormende cellen kunnen binden.

d) Osteopromotie: Beenvorming moet gestimuleerd worden door biologische en/of mechanische

stimulatie van de omgeving.

MSC afkomstig van beenmerg zijn een goed middel als osteogenetische factor. Ze kunnen

differentiëren tot osteoblasten en bijgevolg ook beenweefsel vormen. Bone morphogenetic proteïnes

zijn groeifactoren die belangrijk zijn voor de osteoinductie. Voor de osteoconductie kunnen scaffolds of

sheets gebruikt worden. Scaffolds zorgen voor een omkadering waarop de stamcellen zich kunnen

vasthechten. Ze zijn poreus zodat stamcellen erop kunnen vermenigvuldigen en bloedvaten plaats

hebben om te groeien. Scaffolds moeten biocompatibel en absorbeerbaar zijn en de celgroei

bevorderen. Ze bevatten chemische fatoren die de celadhesie en celdifferentiatie stimuleren. Er

bestaan scaffolds op basis van tal van materialen waaronder hydroxyapatiet, tricalcium fosfaat,

collageen, hydrogel, calcium fosfaat, gecalcificieerde triglyceriden, bioactief glas, etc. De scaffolds

bepalen mee het osteogenetische potentieel van de stamcellen. Voor de osteopromotie wordt best

platelet-rich plasma gebruikt. Dit kan bekomen worden uit het bloed van de patiënt zelf en bevat

talrijke groeifactoren zoals transforming growth factor (TGF)-beta, platelet derived growth factor

(PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) en insulin-like growth factor (IGF). Ook

mechanische stimulatie zet de cellen aan tot beenvorming en remodelering (zie Figuur 5).

Figuur 5: Het effect van mechanische krachten

op beenheling bij de hond: In de callus wordt

chondrogenese bevorderd door compressieve

krachten tussen beide fractuuruiteinden,

terwijl aan de buitenzijde van de callus

trekkrachten de osteogenese van

toegevoegde stamcellen bevorderen.

(Uit Kraus en Kirker-Head, 2006).

21

Lee et al. (2009) beschrijft een case van een vier jaar oude, mannelijke hond met een non-union

fractuur van ulna en radius. Een non-union fractuur ontstaat wanneer beide uiteinden van een fractuur

niet terug aan elkaar groeien. De fractuur werd eerst behandeld door het implanteren van een

autograft, deze zorgt voor osteogenese, osteoconductie en osteoinductie. Maar hierbij bestaat het

risico op fractuur en infectie, waardoor er pijn zal ontstaan op de donorplaats. De behandeling met

deze implantatie was daardoor mislukt. Vervolgens werd de fractuur behandeld door middel van tissue

engineering (zie boven).

Hierbij werden cellen met osteogenese-potentieel geplaatst op een scaffold van hydroxyapatiet en

chitosan vezels (zie figuur 6). De MSC werden bekomen uit subcutaan vet van de patiënt. In principe

kunnen MSC ook geïsoleerd worden uit beenmerg, maar op die manier kan slechts een beperkte

hoeveelheid stamcellen bekomen worden en bij beenheling is de effectiviteit positief evenredig met

de hoeveelheid geïmplanteerde osteoprogenitorcellen. Vervolgens werd 800 microliter van het

cultuurmedium dat 3.2 * 10^7

cellen bevat, gepipetteerd op het oppervlak van de scaffold. De scaffold

met MSC werd vervolgens op de plaats van fractuur geïmplanteerd. Vijf dagen later werd de fractuur

chirurgisch gestabiliseerd.

Figuur 6: Elektronenmicroscopisch beeld van

de scaffold met stamcellen na 21 dagen cultuur

in een osteogenetisch medium. De stamcellen

adhereren aan de scaffold en zijn omringd door

extracellulaire matrix (A). (Uit Lee et al., 2009)

MSC produceren bioactieve factoren die apoptose onderdrukken, angiogenese bevorderen en mitose

en differentiatie van weefselspecifieke reparatieve cascades stimuleren. Zo wordt de beenheling

bevorderd en het risico op chirurgisch falen verkleind.

Drie maanden na de operatie was de fractuur geheeld zonder complicaties. Radiografie toonde een

goede aflijning en appositie van de fractuur fragmenten en een callus die de fractuurholte overbrugt.

5.2 GEBRUIK VAN HSC TER BEHANDELING VAN LEUKEMIE BIJ DE MENS

De therapie voor leukemie bestaat uit een myeloablatieve voorbehandeling gevolgd door een allogene

hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT). Deze voorbehandeling bestaat uit een zware

chemotherapie of een combinatie van chemo- en radiotherapie met totale lichaamsbestraling. Het doel

van deze voorbehandeling is om zoveel mogelijk tumorcellen te vernietigen, hierbij worden echter ook

talrijke gezonde stamcellen in het beenmerg gedood. Daarom volgt er een HSCT om het vernietigde

beenmerg te ondersteunen en vervangen. Deze therapie kan echter niet gebruikt worden bij oudere of

verzwakte patiënten, wegens de ernstige bijwerkingen (Giralt et al., 1997).

22

Odom et al. (1978) ontdekten dat immunocompetente T-cellen in het transplantaat een potentieel graft

versus leukemie (GVL) effect kunnen uitlokken. Dit gaf de mogelijkheid tot een minder intensieve

behandeling van kanker: een non-myeloablatieve voorbehandeling, gevolgd door HSCT. Hierbij

ondergaat de patiënt een minimale chemotherapie en eenmalig een lichte totale lichaamsbestraling.

Deze voorbehandeling is nauwelijks celdodend en zal bijgevolg ook minder bijwerkingen veroorzaken.

De werkzaamheid van deze transplantatie is vooral gebaseerd op het GVL effect van de HSCT. Deze

therapie kan bijgevolg ook gebruikt worden bij oudere of verzwakte patiënten, of patiënten die reeds

een autologe stamceltransplantatie hebben ondergaan.

Het mechanisme van het GVL effect is gelijkaardig aan dit van de GVHR (Ringdén et al., 2009). Het

zijn de CD4+, CD8+ en NK cellen die de reactie veroorzaken. De epitopen die door de T-cellen

herkend worden, kunnen gedeelde alloantigenen zijn, die ook de GVHR kunnen veroorzaken, of tumor

specifieke antigenen. De zoektocht naar deze tumor specifieke antigenen is lopende en blijkt niet zo

eenvoudig. Bijgevolg gaat het GVL effect vaak gepaard met een GVHR. Een beperkte of chronische

GVHR zorgt voor een sterker GVL effect, minder kans op hervallen en een grotere kans op remissie,

maar een ernstige of acute GVHR verhoogt de kans op TRM. Het is dus belangrijk om de GVHR in de

mate van het mogelijke te controleren en moduleren. Dit kan op verschillende manieren:

1. Immunosuppressie

T-cel depletie is het verwijderen van de T-cellen die verantwoordelijk zijn voor de GVHR uit het

transplantaat, hierdoor kan er geen GVHR plaatsvinden. Maar ook het GVL effect zal hierdoor

afnemen en er is een verhoogd risico op hervallen.

Na deze depletie kunnen donor T-cellen met een verminderde alloreactiviteit toch terug aan het

transplantaat toegevoegd worden. Hierdoor is er toch een GVL effect, maar dan zonder GVHR.

Eventueel kunnen aangepaste T-cellen ook na de transplantatie ingespoten worden. Deze zijn

antigeenspecifieke T-cellen die in vitro vermenigvuldigd worden. Ze veroorzaken een in vivo

immuunrespons tegen de leukemiecellen (Falkenburg et al., 1999). Het is echter nog een uitdaging

om specifieke tumor-antigenen te identificeren. Deze T-cellen kunnen ook genetisch gemanipuleerd

worden tot expressie van het thymidine kinase suicide gen. Wanneer dit wordt geactiveerd ondergaat

de cel apoptose .

Na T-cel depletie van het transplantaat, blijft enkel nog het GVL effect van de NK cellen over.

Anderson et al. (2000) demonstreerden dat NK-cellen in muizen de capaciteit hadden om de plaats

van tumorgroei te bereiken, er te infiltreren en lokaal selectief de kwaadaardige cellen te doden

zonder de gezonde cellen aan te tasten. Het effect van de NK-cellen vermindert de kans op hervallen,

induceert graft afstoting en resulteert in een verbeterde overleving van de patiënt in afwezigheid van

de GVHR.

Immunosuppressie kan ook bekomen worden door het gebruik van geneesmiddelen. Ter preventie

van GVHR wordt een mengsel van methotrexaat, calcineurine inhibitor en cyclosporine of tacrolimus

toegediend aan de patiënt (Nash et al., 1996).

23

Immunosuppressieve therapieën kunnen een levensbedreigende GVHR voorkomen maar zijn

geassocieerd met een verhoogd risico op hervallen en verminderen van het GVL effect waardoor de

gebruikte anti-tumor therapie minder effectief wordt.

2. Donorlymfocyten infusies (DLI)

DLI is een vorm van immunotherapie die het GVT effect verbetert door het ontstaan van de GVHR te

bevorderen. Deze lymfocyten kunnen in hoge doses echter een fatale GVHR doen ontstaan. De dosis

van DLI moet bijgevolg zorgvuldig aangepast worden aan het individu en de ernst van ziekte om het

risico op TGM te beperken (Dazzi et al., 2000).

3. Celdosis

De celdosis in het transplantaat is niet onbelangrijk. Barrett et al. (2000) onderzochten dit door

eenzelfde transplantaat met verschillende concentraties aan dosis toe te dienen patiënten met

leukemie. Patiënten die meer dan 3*10^8 cellen per kg toegediend kregen, hadden na genezing een

verminderd risico op hervallen en een verbeterde overleving in vergelijking met patiënten die een

lagere dosis kregen.

4. Graft bron

Ook de bron van de HSC kan een verschil maken. Zoals eerder besproken kunnen HSC geïsoleerd

worden uit beenmerg, perifeer bloed of navelstrengbloed. Vroeger werden de benodigde stamcellen

vooral uit het beenmerg gehaald en toegediend via beenmergtransplantatie. Tegenwoordig worden

stamcellen vrijwel altijd rechtstreeks uit het bloed gehaald, en gebeurt de behandeling via

stamceltransplantatie. Er bestaat echter nog discussie over welke HSC bron de beste zou zijn.

5.3 INDIVIDUELE THERAPIE

Om de optimale SC transplantatie uit te voeren, moet men rekening houden met de toestand van de

individuele patiënt, gebaseerd op het risico op graft versus host reactie (GVHR) en het risico op

hervallen. De GVHR moet geoptimaliseerd worden door het immuunsysteem van de donor te

manipuleren zodat de cellen in het transplantaat enkel effectief zijn tegen tumorspecifieke antigenen

zonder de gezonde weefsels te beschadigen. Tumorspecifieke antigenen zijn antigenen die enkel of

vooral tot expressie gebracht worden door tumorcellen. Het risico op hervallen wordt berekend aan de

hand van het stadium van ontwikkeling van de ziekte en de vordering van de tumor. In de toekomst

moet HSCT gecombineerd worden met andere therapieën, zoals immunosuppressieve

geneesmiddelen en kankerspecifieke cytotoxische T-cellen, om de therapie veiliger te maken en aan

te passen aan de noden van het individu.

24

DISCUSSIE

Stamceltherapie is een vrij recente ontwikkeling. Er is al heel wat onderzoek gebeurd, maar

toepassingen, in het algemeen en meer specifiek bij de hond, zijn tot nu toe voornamelijk

experimenteel. Een voortzetting van het onderzoek is zeer belangrijk, omdat de toepassingen met

stamcellen quasi oneindig zijn. Echter, met de huidige vooruitgang en technologieën zal het niet lang

duren of deze techniek behoort tot de standaard behandelingsmethodes.

De meeste kennis omtrent stamcellen is er tot nu toe bekomen door studies met muizen. Echter,

studies met grote dieren zouden meer representatief zijn voor het onderzoek naar humane ziekten,

omdat ze biologisch (anatomie, fysiologie en pathologie) beter overeenkomen met de mens. Ook

leven grotere dieren langer wat een efficiëntere en langdurige opvolging mogelijk maakt, waarbij ook

lange termijn risico’s kunnen worden beoordeeld (Horn et al., 2004). De hond is een zeer goed model

om meer informatie te bekomen over humane ziektes wegens de grote gelijkenissen in fysiologie,

ziektepresentatie en klinische reacties in vergelijking met verschillende andere traditionele

modeldiersoorten. Ook bevatten stamcellen van de hond gelijkaardige eigenschappen als stamcellen

van de mens, zoals kinetiek en reactie op cytokines. Bijgevolg kan de hond gebruikt worden voor de

ontwikkeling van beenmergtransplantatie en gentherapie protocols bij de mens (Schneider et al.,

2009).

Naast de hond zijn ook de niet humane primaten een goed voorbeeld voor studies in de humane

geneeskunde. Maar bij zo een diermodellen zijn meer ethische bezwaren. De primaten zijn genetisch

meer identiek aan de mens dan de hond, maar daarom zijn ze niet noodzakelijk meer voorspelbaar

qua stamceltechnieken.

Onderzoek naar caniene stamcellen is niet alleen nuttig voor het biomedisch onderzoek maar ook

voor de ontwikkeling van stamceltherapie bij honden zelf. Lymfoma’s vertegenwoordigen meer dan 80%

van alle hematologische ziekten bij honden. Men slaagt er maar niet in om met de huidige

behandeling, nl. chemotherapie, een hogere overlevingstijd dan een gemiddelde van 1 jaar te

bekomen. Gebaseerd op humaan onderzoek, lijkt transplantatie de meest belovende therapie in de

nabije toekomst tegen caniene lymfoma (Kaori et al., 2008).

25

REFERENTIELIJST

Alves F.R., Guerra R.R., Fioretto I.T., Delgado J.C., Machado Junior A.A.N., Ambrosio C.E., Kerkis I.,

Miglino M.A. (2010). Establishment of a protocol for obtention of neuronal stem cells lineages from the

dog olfactory epithelium. Pesq. Vet. Bras. 30 (4), 363-372.

Anderson L.D., Savary C.A.Jr. en Mullen C.A. (2000). Immunization of allogeneic bone marrow

transplant recipients with tumor cell vaccines enhances graft-versus-tumor activity without

exacerbating graft-versus-host disease. Blood 95, 2426-2433.

Barrett A.J., Ringden O., Zhang M.J., Bashey A., Cahn J.Y., Cairo M.S., Gale R.P., Gratwohl A.,

Locatelli F., Martino R., Schultz K.R., Tiberghien P. (2000). Effect of nucleated marrow cell dose on

relapse and survival in identical twin bone marrow transplants for leukemia. Blood 95, 3323-3327.

Bishop M.R., Fowler D.H., Marchigiani D., Castro K., Kasten-Sportes C., Steinberg S.M., Gea-

Banacloche J.C., Dean R., Chow C.K., Carter C., Read E.J., Leitman S., Gress R. (2004). Allogeneic

lymphocytes induce tumor regression of advanced metastatic breast cancer. Journal of clinical

oncology 22, 3886-3892.

Bieback K., Brinkmann I (2010). Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From

biology to cell therapy. World Journal of Stem Cells, 2 (4), 81-92.

Dazzi F., Szydlo R.M., Craddock C., Cross N.C., Kaeda J., Chase A., Olavarria E., van Rhee F.,

Kanfer E., Apperley J.F., Goldman J.M. (2000). Comparison of single-dose and escalating-dose

regimens of donor lymphocyte infusion for relapse after allografting for chronic myeloid leukemia.

Blood 95, 67-71.

Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Krause D.S., Deans R.J.,

Keating A., Prockop D.J., Horwitz E.M. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal

stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8 (4), 31-

317.

Eridani S. and Mosca A. (2011). Fetal hemoglobin reaction and cell engineering in the treatment of

sickle cell anemia. Journal of blood medicine 2, 23-30.

Falkenburg J.H., Wafelman A.R., Joosten P., Smit W.M., van Bergen C.A., Bongaerts R., Lurvick E.,

van der Hoorn M., Kluck P., Landegent J.E., Kluin-Nelemans H.C., Fibbe W.E., Willemze R. (1999).

Complete remission of accelerated phase chronic myeloid leukemia by treatment with leukemia-

reactive cytotoxic T lymphocytes. Blood 94, 1201-1208.

26

Giralt S., Estey E., Albitar M., van Besien K, Rondon G., Anderlini P., O’Brien S., Khouri I., Gajewski

J., Mehra R., Claxton D., Andersson B., Beran M., Przepiorka D., Koller C., Kornblau S., Korbling M.,

Keating M., Kantarijan H., Champlin R. (1997). Engraftment of allogeneic hematopoietic progenitor

cells with purine analog-containing chemotherapy: harnessing graft-versus-leukemia without

myeloablative therapy. Blood 89, 4531-4536.

Hatzistergos K.E., Blum A., Ince T.A., Grichnik J.M., Hare J.M. (2011). What is the oncologic risk of

stem cell treatment for heart disease? Heart Research 108, 1300-1303.

Horn A.P., Morris J.C., Neff T., Kiem H.P. (2004). Stem Cell Gene Transfer – Efficacy and Safety in

Large Animal Studies. Molecular Therapy 10 (3), 417-431.

Horwitz E.M., Gordon P.L., Koo W.K., Marx J.C., Neel M.D., McNall R.Y., Muul L., Hofmann T. (2002)

Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells engraft and stimulate growth in

children with osteogenesis imperfect: implications for cell therapy of bone. Proc Natl Acad Sci USA 99,

8932-8937.

Hseih M.H. en Korngold R. (2000). Differential use of FasL- and perforin-mediated cytolytic

mechanisms by T-cell subsets involved in graft-versus-myeloid leukemia responses. Blood 96, 1047-

1055.

Jafarian M., Eslaminejad M.B., Khojasteh A. (2008). Marrow-derived mesenchymal stem cells-directed

bone regeneration in the dog mandible: a comparison between biphasic calcium phosphate and

natural bone mineral. Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 105, 14-24.

Kaori I.D.E., Matsuura S., Fujino Y., Ohno K., Tsujimoto H. (2008). Investigation of Various Methods

for the Cryopreservation of Canine Bone Marrow-derived CD34+ Cells. Journal of Veterinary

Medicine and Science 70 (11), 1211-1217.

Kedong S., Xiubo F., Tianqing L., Macedo H.M., LiLi J., Meiyun F., Fangxin S., Xuehu M., Zhanfeng C.

(2010). Simultaneous expansion and harvest of hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells

derived from umbilical cord blood. J Mater Sci: Mater Med 21, 3183-3193.

Khakoo A.Y., Pati S., Anderson S.A., Reid W., Elshal M.F., Rovira II., Nguyen A.T., Malide D., Combs

C.A., Hall G., Zhang J., Raffeld M., Roers T.B., Stetler-Stevenson W., Frank J.A., Reitz M., Finkel T.

(2006). Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi’s

sarcoma. J Exp Med 203, 1235-1247.

27

Kobayashi T., Shimizu A., Nishifuji K., Amagai M., Iwasaki T., Ohyama M. (2009). Canine hair-follicle

keratinocytes enriched with bulge cells have the highly proliferative characteristic of stem cells.

Veterinary Dermatology 20, 338-346.

Krampera M., Glennie S., Dyson J., Scott D., Laylor R., Simpson E., Dazzi F. (2003). Bone marrow

mesenchymal stem cells inhibit the respons of naïve and memory antigen-specific T cells to their

cognate peptide. Blood 101 (9), 3722-3729.

Kraus K.H., Kirker-head C. (2006). Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Veterinary sugery

35, 232-242.

Lee H.B., Chung Y.S., Heo S.Y., Kim N.S. (2009). Augmentation of bone healing of nonunion fracture

using stem cell based tissue engineering in a dog: a case report. Veterinarni Medicina 54 (4), 198-203.

Le Blanc K. (2006). Mesenchymal stromal cells: Tissue repair and immune modulation. Cytotherapy 8,

559-561.

Lund T.C., Kobs A., Blazar B.R., Tolar J. (2010). Mesenchymal stromal cells from donors varying in

age are equal cellular fitness after in vitro expansion under hypoxic conditions. Cytotherapy 12, 971-

981.

Madkaikar M., Ghosh K., Gupta M., Swaminathan S., Mohanty D. (2007). Ex vivo expansion of

umbilical cord blood stem cells using different combinations of cytokines and stromal cells. Acta

Haematologica 118, 153-159.

Malgieri A., Kantzari E., Patrizi M.P., Gambardella S. (2010). Bone marrow and umbilical cord blood

human mesenchymal stem cells: state of the art. Int J Clin Exp Med 3 (4), 248-269.

Mezey E. (2011). The therapeutic potential of bone marrow-derived stromal cells. Journal of Cellular

Biochemestry.

Minguell J.J., Florenzano F.M., Ramirez M.R., Martinez R.F., Lasala G.P. (2010). Intracoronary

infusion of a combination of bone marrow-derived stem cells in dogs. Experimental clinical Cardiology

15 (2), 17-20.

Morigi M., Rota C., Montemurro T., Montelatici E., Lo Cicero V., Imberti B., Abbate M., Zoja C., Cassis

P., Longaretti L., Rebulla P., Introna M., Capelli C., Benigni A., Remuzzi G., Lazzari L. (2010). Life-

sparing effect of human cord blood-mesenchymal stem cells in experimental acute kidney injury. Stem

Cells 28 (3), 513-522.

28

Nash R.A., Pineiro L.A., Storb R., Deeg H.J., Fitzsimmons W.E., Furlong T., Hansen J.A., Gooley T.,

Maher R.M., Martin P., McSweeny P.A., Sullivan K.M., Anasetti C., Fay J.W. (1996). FK506 in

combination with methotrexaat for the prevention of graft-versus-host disease after marrow

transplantation from matched unrelated donors. Blood 88, 3634-3641.

Neuner E., Schumm M., Schneider E-M., Guenther W., Kremmer E., Vogl C., Büttner M., Thierfelder

S., Kolb H-J. (1998). Studies on canine bone marrow long-term culture: effect of stem cell factor.

Veterinary Immunology and Immunopathology 61, 1-16.

Odom L.F., August C.S., Githens J.H., Humbert J.R., Morse H., Peakman D., Sharma B., Rusnak S.L.,

Johnson F.B. (1978). Remission of relapsed leukaemia during a graft-versus-host reaction. A “graft-

versus-leukaemia reaction” in man? Lancet 2, 537-540.

Ortiz L.A., Gambelli F., McBride C., Gaupp D., Baddoo M., Kaminski N., Phinney D.G. (2003).

Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enchanced in response to bleomycin exposure and

ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA 100, 8407-8411.

Rastegar F., Shenaq D., Huang J., Zhang W., Zhang B-Q., He B-C., Chen L., Zuo G-W., Luo Q., Shi

Q., Wagner E.R., Huang E., Gao Y., Gao J-L., Kim S.H., Zhou J-Z., Bi Y., Su Y., Zhu G., Luo J., Luo

X., Qin J., Reid R.R., Luu H.H., Haydon R.C., Deng Z-L., He T-C. (2010). Mesenchymal stem cells:

Molecular characteristics and clinical applications. World Journal of Stem Cells 2 (4), 67-80.

Rezvani K., Barrett A.J. (2008). Characterizing and optimizing immune responses to leukaemia

antigens after allogeneic stem cell transplantation. Best Practice and Research Clinical Haematology

21, 437-453.

Ringdén O., Karlsson H., Olsson R., Omazic B., Uhlin M. (2009). The allogenic graft-versus-cancer

effect. British Journal of Haematology 147, 614-633.

Riordan N.H., Ichim T.E., Min W-P., Wang H., Solano F., Lara F., Alfaro M., Rodriguez J.P., Harman

R.J., Patel A.N., Murphy M.P., Lee R.R., Minev B. (2009). Non-expanded adipose stromal vascular

fraction cell therapy for multiple sclerosis. Journal of Translational Medicine 7, 29.

Schmaltz C., Alpdogan O., Muriglan S.J., Kappel B.J., Rotolo J.A., Ricchetti E.T., Greenberg A.S.,

Willis L.M., Murphy G.F., Crawford J.M., van den Brink M.R. (2003). Donor T cell-derived TNF is

required for graft-versus-host disease and graft-versus-tumor activity after bone marrow

transplantation. Blood 101, 2440-2445.

Schneider M.R., Wolf E., Braun J., Kolb H-J., Adler H. (2010). Canine embryonic stem cells: State of

the art. Theriogenology 74, 492-497.

29

Spencer N.D., Gimble J.M., Lopez M.J. (2011). Mesenchymal Stromal Cells: Past, Present, and

Future. Veterinary Surgery 40, 129-139.

Suter S.E., Gouthro T.A., McSweeney P.A., Nash R.A., Haskins M.E., Felsburg P.J., Henthorn P.S.

(2004). Isolation and characterization of pediatric canine bone marrow CD34+ cells. Veterinary

Immunology and Immunopathology 101, 31-47.

Tang Y.L., Zhao Q., Qin X., Shen L., Cheng L., Ge J., Phillips M.I. (2005). Aracrine action enhances

the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model

of myocardial infarction. Ann Thorac Surg 80, 229-237.

Uranio M.F., Valentini L., Lange-Consiglio A., Caira M., Guaricci A.C., L’Abbate A., Catacchio C.R.,

Ventura M., Cremonesi F., Dell’Aquila M.E. (2011). Isolation, Proliferation, Cytogenetic, and Molecular

Characterization and In Vitro Differentiation Potency of Canine Stem Cells From Foetal Adnexa: A

comparative Study of Amniotic Fluid, Amnion, and Umbilical Cord Matrix. Molecular Reproduction and

Development 78, 361-373.

Vacanti V., Kong E., Suzuki G., Sato K., Canthy J.M., and Lee T. (2005). Phenotypic changes of adult

porcine mesenchymal stem cells induced by prolonged passaging in culture. Journal of cellular

physiology 205, 194-201.

Vieira N.M., Brandalise V., Zucconi E., Secco M., Strauss B.E., Zatz M. (2010). Isolation,

Characterization, and Differentiation Potential of Canine Adipose-Derived Stem Cells. Cell

Transplantation 19, 279-289.

Volk S.W., Diefenderfer D.L., Christopher S.A., Haskins M.E., Leboy P.S. (2005). Effects of

osteogenic inducers on cultures of canine mesenchymal stem cells. AJVR 66 (10), 1729-1737.

Weiss M.L., Medicetty S., Bledsose A.R., Rachakatla R.S., Choi M., Merchav S., Luo Y., Rao M.S.,

Velagaleti G., Troyer D. (2006). Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization

and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson’s disease. Stem cells 24, 781-792.

Wijewardana V., Sugiura K., Shigeyama N., Moriguchi M., Tsunoda S., Ikehara S., Inaba T. (2007).

Isolation and characterization of hematopoietic progenitor cells in canine bone marrow. Veterinary

Immunology and Immunopathology 115, 230-238.

Yan H., Yu C. (2007). Repair of full-thickness cartilage defects with cells of different origin in a rabbit

model. Arthroscopy 23, 178-187.

30