BEPALING VAN FENTANYL EN ANALOGEN IN BIOLOGISCHE...

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep bioanalyse

Laboratorium voor Toxicologie

Academiejaar 2008 – 2009

BEPALING VAN FENTANYL EN ANALOGEN IN BIOLOGISCHE MATRICES VIA GC – MS

Joke VAN DAMME

Eerste master in de Farmaceutische Zorg

PROMOTOR

Prof. Dr. Apr. W. Lambert

COMMISSARISSEN

Dr. Apr. C. Stove

Dr. Apr. C. Van Poucke

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

masterproef.”

21 mei 2009

Promotor Auteur

Prof. Dr. Apr. W. Lambert Joke Van Damme

DANKWOORD

Hierbij wil ik iedereen bedanken die mij bij het schrijven van deze masterproef geholpen heeft.

Allereerst dank ik mijn promotor, Prof. Dr. Apr. W. Lambert,

voor de algemene leiding van de masterproef.

Daarnaast wil ik mijn begeleider Dr. Apr. Christophe Stove bedanken voor de hulp en begeleiding bij de proeven. Je was altijd bereid om mijn vele vragen te beantwoorden en de

verschillende masterproefdelen te lezen en te becommentariëren. Dank je wel hiervoor.

In het bijzonder wil ik Ann Houvenaeghel bedanken voor de nuttige tips, het oplossen van

de vele problemen met de gaschromatograaf en de leuke babbel tussendoor.

Ook wil ik iedereen bedanken in het laboratorium voor de aangename sfeer

en de ontspannende koffiepauzes.

Tenslotte wil ik mijn ouders bedanken voor de mogelijkheid die ze mij gaven om deze studie te volgen. Ook wens ik hen en mijn vriend Brecht te bedanken voor de ondersteuning tijdens het

schrijven van mijn masterproef.

Aan allen nogmaals mijn oprechte dank!

Inhoudsopgave

Dankwoord

Inhoudsopgave

Lijst met gebruikte afkortingen

1. INLEIDING ...................................................................................................1

1.1 GESCHIEDENIS VAN FENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL ..................................................... 1

1.2. WAT ZIJN FENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL? ................................................................... 2

1.3. WERKINGSMECHANISME EN THERAPEUTISCHE EFFECTEN ......................................................... 4

1.4. METABOLISME EN INTERACTIES................................................................................................... 4

1.5. THERAPEUTISCH GEBRUIK ............................................................................................................ 6

1.6. MISBRUIK EN TOXICITEIT .............................................................................................................. 7

1.7. AFGELEIDEN VAN FENTANYL ........................................................................................................ 8

1.7.1. Remifentanil .......................................................................................................................... 8

1.7.2. Carfentanil ............................................................................................................................. 8

1.7.3. Illegale fentanyl analogen ..................................................................................................... 9

1.8. STAALVOORBEREIDING .............................................................................................................. 10

1.8.1. Vaste fase extractie ............................................................................................................. 10

1.8.2. Andere methodes ................................................................................................................ 11

1.9. DETECTIETECHNIEK..................................................................................................................... 11

1.9.1. Gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) ............................................................. 11

1.9.1.1. inleiding ........................................................................................................................ 11

1.9.1.2. Principe massaspectrometrie ....................................................................................... 12

1.9.2. Andere methodes ................................................................................................................ 14

2. OBJECTIEVEN ............................................................................................. 15

3. MATERIALEN EN METHODEN .................................................................... 16

3.1. REAGENTIA EN SOLVENTEN ....................................................................................................... 16

3.2. BEREIDING VAN DE STANDAARDEN ........................................................................................... 16

3.3. PLASMASTALEN .......................................................................................................................... 17

3.4. APPARATUUR ............................................................................................................................. 17

3.4.1. centrifuge, vacuümtoestel, indampingstoestel, vortexer, verwarmingsblokje en

sonicatiebad .................................................................................................................................. 17

3.4.2 gaschromatografie – massaspectrometrie (GC – MS) ......................................................... 17

3.5. STAALBEHANDELING VOOR HET UITVOEREN VAN VASTE FASE EXTRACTIE .............................. 19

3.6. UITVOEREN VAN DE VASTE FASE EXTRACTIE ............................................................................. 19

3.6.1. keuze geschikte stationaire fase ......................................................................................... 19

3.6.2. keuze van de condities voor het conditioneren, laden, wassen en elueren ....................... 19

3.7. UITVOEREN VAN DE DERIVATISATIE........................................................................................... 20

3.7.1. heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) versus heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA) ....... 20

3.8. CONDITIES VOOR OPTIMALE MASSASPECTROMETRIE .............................................................. 20

3.9. GASCHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS ................................................................................ 21

3.9.1. staalintroductie ................................................................................................................... 21

3.9.2. keuze van interne standaarden ........................................................................................... 22

3.9.3. optimalisatie van de splitless injectie .................................................................................. 22

3.9.3.1. injectiesolvent .............................................................................................................. 22

3.9.3.2. injectietemperatuur ..................................................................................................... 22

3.9.3.3. splitless versus pulsed splitless injectie ........................................................................ 23

3.9.3.4. injectievolume .............................................................................................................. 23

3.9.4. optimalisatie van de chromatografische scheiding ............................................................. 23

3.9.4.1. optimalisatie van het temperatuursprogramma.......................................................... 23

3.10. BEPALEN VAN HET EXTRACTIERENDEMENT ............................................................................. 25

3.11. LINEARITEIT .............................................................................................................................. 25

3.12. STABILITEIT ............................................................................................................................... 25

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ........................................................................ 26

4.1. STAALBEHANDELING VOOR HET UITVOEREN VAN VASTE FASE EXTRACTIE .............................. 26

4.2. UITVOEREN VAN DE VASTE FASE EXTRACTIE ............................................................................. 26

4.2.1. keuze geschikte stationaire fase ......................................................................................... 27

4.3. UITVOEREN VAN DE DERIVATISATIE........................................................................................... 28

4.3.1. Heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) versus heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA) ...... 29

4.4. CONDITIES VOOR OPTIMALE MASSASPECTROMETRIE .............................................................. 30

4.4.1. Inleiding: SIM – SCAN modus .............................................................................................. 30

4.4.2. Massaspectra van fentanyl, norfentanyl, sufentanil, alfentanil, norfentanyl – D5 en

fentanyl – D5 ................................................................................................................................. 30

4.4.3. Ontwikkeling van een SIM – methode ................................................................................ 32

4.5. GASCHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS ................................................................................ 35

4.5.1. optimalisatie van de splitlessinjectie ................................................................................... 35

4.5.1.1. injectietemperatuur ..................................................................................................... 35

4.5.1.2. splitless versus pulsed splitless injectie ........................................................................ 36

4.5.1.3. injectievolume .............................................................................................................. 36

4.5.2. optimalisatie van de chromatografische scheiding ............................................................. 38

4.5.2.1. optimalisatie van het temperatuursprogramma.......................................................... 38

4.6. BEPALEN VAN HET EXTRACTIERENDEMENT ............................................................................... 39

4.7. LINEARITEIT ................................................................................................................................ 40

4.8. STABILITEIT ................................................................................................................................. 42

5. ALGEMEEN BESLUIT ................................................................................... 43

6. LITERATUURLIJST ....................................................................................... 46

Lijst met gebruikte afkortingen

AMX N – phenylpropionamide

AM5 N – (4 – hydroxylphenyl) propionamide

AM3 N – (4 – hydroxyphenyl) acetamide

CI Chemische ionisatie

CYP 3A4 Cytochroom P 450 3A4

EI Electron impact ionisatie

ELISA Enzyme- linked immunosorbent assay

GC Gaschromatografie

GC- MS Gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie

HFBA Heptafluoroboterzuur anhydride

HFBI 1-(heptafluorobutyryl) imidazool

HPLC High performance liquid chromatography

IS Interne standaard

LC- MS/MS Vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie

LLE Liquid- liquid extraction / vloeistof- vloeistof extractie

m/z Massa – over – lading verhouding

PFPA Pentafluoropropionzuur anhydride

RIA Radio- immuno assay

SCX Strong cation exchanger

SIM Selected ion monitoring

SPE Solid- phase extraction / vaste fase extractie

SPME Solid phase microextraction

TIC Total ion chromatogram

TTS Transdermaal therapeutisch systeem

1

1. INLEIDING

1.1 GESCHIEDENIS VAN FENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL

Fentanyl, één van de meest populaire opioïde analgetica in de moderne anesthesie

werd in België in de late jaren ’50 van de vorige eeuw ontwikkeld. Paul Janssen (Janssen

Pharmaceutica) begon zich toen te interesseren voor sterke analgetica om een hele reeks

pijnsyndromen aan te pakken, die op dat moment inadequaat behandeld werden. De

structuur van meperidine diende als basis voor het ontwikkelen van die sterke analgetica.

Meperidine is een opioïd dat ongeschikt is om te gebruiken als anestheticum door zijn lage

potentie doch vrij eenvoudig qua structuur om mee te experimenteren.

Janssen vermoedde dat door het veranderen van die structuur de vetoplosbaarheid

zou verhogen en eventueel ook de potentie en specificiteit. Gedurende drie tot vier jaar

werkte Janssen aan de ontwikkeling van een reeks opioïden met analgetische activiteit. Deze

moleculen werden getest op dierlijke modellen en de beste van de reeks was een

geneesmiddel dat later fentanyl werd genoemd ( Stanley, 2005).

Fentanyl werd voor het eerst in de klinische praktijk gebruikt begin jaren ‘60. In de

jaren ’90 werd fentanyl verkrijgbaar als een transdermaal therapeutisch systeem (TTS)

(Durogesic®) (fig 1.1.a). Deze toedieningsvorm van fentanyl heeft ondertussen een

belangrijke plaats ingenomen in de behandeling van chronische en kankergerelateerde pijn.

In de jaren die daarop volgden werd er onderzoek gedaan naar alternatieve

toedieningsvormen, zoals de orale en nasale toediening van fentanyl (Dale et al., 2002;

Zhang et al., 2002). Één van die alternatieve toedieningsvormen is Actiq (fig 1.1.b), beter

gekend als de fentanyl lolli die wordt gebruikt bij patiënten met doorbraakpijn.

Midden jaren zeventig bracht de farmaceutische industrie sufentanil en alfentanil op

de markt. Zij worden gebruikt als analgeticum en in hoge doses als anestheticum. Tot op

heden is fentanyl het meest geliefde geneesmiddel voor gebruik in de operatiekamer, als

premedicatie voor een chirurgische ingreep en als postoperatief analgeticum (Stanley, 2005).

2

( a ) ( b )

FIG 1.1. a) DUROGESIC ® TTS b) ACTIQ ® LOLLI

1.2. WAT ZIJN FENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL?

Fentanyl, sufentanil en alfentanil zijn opioïden die behoren tot de 4-propananilido-

piperidine klasse van narcotische analgetica. Ze zijn potenter dan morfine, hebben een

kortere werkingsduur en veroorzaken minder neveneffecten. Als gevolg hiervan worden

deze geneesmiddelen het meest gebruikt als anestheticum in de operatiekamer. Fentanyl,

sufentanil en alfentanil verschillen qua structuur in de substitutie van N1 en N4, wat zich uit

in verandering van potentie en werkingsduur (Valaer et al., 1997).

Sufentanil, (N-[4-(methoxymethyl)-1-[2-(2-thienyl)ethyl]-4-piperidinyl]-N–

phenylpropanamide) is de meest krachtige van de drie en is ongeveer 2000 keer potenter

dan morfine en 5 tot 10 maal potenter dan fentanyl. Dit kan verklaard worden door de

hogere intrinsieke activiteit en affiniteit van sufentanil voor de opioïdreceptor. Sufentanil

wordt overwegend parenteraal maar ook epiduraal gebruikt. Door zijn hoge lipofiliciteit kan

het makkelijk de bloed-hersenbarrière passeren ( Zöllner & Schäfer, 2008).

Fentanyl, N-(1-phenethyl-4-piperidyl) propionanilide, de tweede meest potente,

heeft een potentie die ongeveer 50 tot 100 maal hoger ligt dan morfine. Naast die hoge

potentie heeft fentanyl ook een snelle onset (2 tot 3 minuten), een korte werkingsduur (30

tot 60 minuten) en veroorzaakt het geen cardiovasculaire depressie (Kuhlman et al., 2003).

3

In tegenstelling tot morfine leidt fentanyl niet tot een relevante histaminevrijstelling,

waardoor roodheid, jeuk en oedeem niet optreden (Zöllner & Schäfer, 2008).

Alfentanil, (N-[1-[2-(4-ethyl-4,5-dihydro-5-oxo-1H-tetrazol-1-yl)ethyl]-4-

(methoxymethyl)4–piperidinyl]-N-propanamide), is de minst sterke van de drie, met een

potentie die ongeveer 30 keer hoger ligt dan morfine. Alfentanil begint in vergelijking met

fentanyl en sufentanil sneller te werken en kent een snellere afbraak. Het verdelingsvolume

bedraagt slechts 0.06L/ kg lichaamsgewicht. Een mogelijke oorzaak hiervoor is de lagere

vetoplosbaarheid, waardoor de opname in cellen gelimiteerd wordt (Zöllner & Schäfer, 2008;

Stanski & Hug, 1982). Hierdoor heeft alfentanil een relatief korte werkingsduur van 15

minuten na intraveneuze toediening (Poklis, 1995).

FIG 1.2.: STRUCTUREN VAN FENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL

4

1.3. WERKINGSMECHANISME EN THERAPEUTISCHE EFFECTEN

Fentanyl, sufentanil en alfentanil binden met hoge affiniteit op de opioïdreceptoren.

De opioïdreceptoren kunnen worden ingedeeld in de mu (µ), kappa (κ) en delta (δ )-

receptoren en bevinden zich voornamelijk in de cortex, de thalamus, de hypothalamus, het

limbische systeem en de hersenstam. Deze receptoren behoren tot de familie van de G-

proteïne gekoppelde receptoren en hebben allen in hun structuur een extracellulaire N-

terminus, een intracellulaire C-terminus en zeven hydrofobe, transmembranaire domeinen

(Zöllner & Schäfer, 2008). Men vermoedt dat de µ en κ-receptoren een rol spelen bij

pijnmodulatie door te interfereren met calcium -of kaliumkanalen. De rol van de δ- receptor

bij de inhibitie van pijn is niet goed gekend. Wanneer de µ-receptor wordt gestimuleerd

veroorzaakt dit respiratoire depressie, bradycardie, hypothermie, constipatie, miosis en

euforie, terwijl κ-receptorstimulatie verantwoordelijk is voor sedatie. Wanneer fentanyl,

sufentanil of alfentanil worden toegediend zullen deze binden op de drie receptoren maar

de meeste analgetische effecten worden veroorzaakt door binding met de µ -receptor

(Willens & Myslinski, 1993).

1.4. METABOLISME EN INTERACTIES

Na opname in het bloed verspreiden fentanyl en analogen zich snel naar de perifere

weefsels. Ze verschijnen het eerst in de goed doorbloede organen zoals het hart, de longen,

de hersenen en daarna in de spieren en het vetweefsel (Willens & Myslinski, 1993). De

eliminatie uit het lichaam gebeurt door biotransformatie via cytochroom P (CYP)-450 3A4

enzymen die aanwezig zijn in de lever. Fentanyl en analogen worden snel en bijna volledig

gemetaboliseerd. Ongeveer 80 % van een intraveneuze dosis wordt geëlimineerd binnen de

72 uur na toediening en minder dan 6%, bij alfentanil zelfs minder dan 1%, wordt

onveranderd afgedreven door het lichaam (Stanski & Hug, 1982). De voornaamste

metabolisatiepathway is oxidatieve N-dealkylatie tot de normetabolieten: norfentanyl,

norsufentanil en noralfentanil ( Valaer et al., 1997).

5

Fentanyl wordt ook in mindere mate omgezet in despropionylfentanyl door hydrolyse

van de amidegroep en in hydroxyfentanyl door hydroxylatie van de alkylgroep (fig. 1.2.)

(Labroo et al., 1997). Naast omzetting in norsufentanil wordt sufentanil ook afgebroken tot

het O-desmethyl derivaat (Valaer et al. 1997). Alfentanil wordt in mindere mate via N-

dealkylatie omgezet in N-phenylpropionamide (AMX). Het is niet gekend of die vorming

rechtstreeks gebeurt vanuit alfentanil of via noralfentanil. AMX wordt verder snel

gemetaboliseerd tot de secundaire metabolieten N-( 4-hydroxyphenyl) proponamide (AM5)

en N-(4-hydroxyphenyl) acetamide (AM3) (Labroo et al. 1994).

Wanneer fentanyl en analogen worden ingenomen samen met geneesmiddelen die

CYP 3A4 inhiberen, zoals ketoconazole, itraconazole en erythromycine, is het mogelijk dat

fentanyl, sufentanil en alfentanil minder snel worden afgebroken, waardoor schadelijke

concentraties in het lichaam kunnen ontstaan. Pompelmoessap heeft eveneens de

eigenschap om CYP 3A4 te inhiberen.

De CYP3A4-enzymen kunnen ook geïnduceerd worden, bijvoorbeeld door

barbituraten, carbamazepine, rifampicine en glucocorticoïden. Hierdoor worden fentanyl en

analogen sneller afgebroken, met een verminderde efficaciteit tot gevolg. In dergelijke

gevallen is het van belang dat de dosis wordt aangepast. (Labroo et al., 1994; Labroo et al.,

1997)

norfentanyl despropionylfentanyl hydroxyfentanyl

norsufentanil O-desmethylderivaat

a

b

6

noralfentanil AMX AM5 AM3

FIG. 1.3. METABOLIETEN VAN a) FENTANYL b) SUFENTANIL EN c) ALFENTANIL

1.5. THERAPEUTISCH GEBRUIK

Fentanyl wordt wereldwijd gebruikt als anestheticum in de operatiekamer. Naast zijn

gebruik als pre-anestheticum, primair intraveneus anestheticum en post-operatief

analgeticum, wordt fentanyl ook voorgeschreven voor de behandeling van chronische pijn.

Hiervoor worden fentanyl transdermale pleisters (Durogesic®) gebruikt. Door zijn laag

moleculair gewicht (336.471 g/mol), hoge potentie en vetoplosbaarheid is fentanyl

uitermate geschikt om geformuleerd te worden in transdermale pleisters (Kuhlman et al,

2003). Na aanbrengen van deze pleisters op de huid ontstaat er een depot in het onderhuids

vetweefsel waaruit fentanyl met een constante snelheid wordt vrijgesteld in het bloed

gedurende maximum 72 uur. Hierdoor is de patiënt een lange tijd pijnvrij. Fentanylpleisters

worden geproduceerd in vijf groottes: 12, 25, 50, 75 en 100 µg/u.

De dosering is gebaseerd op de grootte van de pleister. De absorptiesnelheid is

afhankelijk van een aantal factoren zoals lichaamstemperatuur, huidtype en de plaats waar

de pleister wordt aangebracht ( Grobosch et al., 2007).

Sufentanil wordt door zijn analgetische eigenschappen en zijn groot therapeutisch

bereik zowel voor intraveneuze anesthesie als voor gebalanceerde anesthesie gebruikt.

Maar omwille van zijn eigenschap om negatief inotroop te zijn, is sufentanil uitermate

geschikt voor de cardiochirurgie (Zöllner & Schäfer, 2008).

Alfentanil heeft een snelle onset en korte werkingsduur, waardoor het zeer geschikt

is voor kleine ingrepen (Willens & Myslinski, 1993). Alfentanil wordt ook postoperatief

toegediend voor de behandeling van pijn. Zo is intraveneus gebruik van alfentanil na

c

7

abdominale operaties ongeveer tien keer effectiever dan morfine. In combinatie met

midazolam wordt alfentanil ook toegediend aan patiënten op intensive care. Alfentanil leidt

sneller tot tolerantie dan de andere opioiden waardoor het niet wordt gebruikt voor de

behandeling van pijn bij kankerpatiënten (Chrubasik et al., 1994).

TABEL 1.1.: THERAPEUTISCHE EN LETALE CONCENTRATIES VAN FENTANYL, SUFENTANIL EN

ALFENTANIL IN BLOED

Therapeutische conc.

(ng/ml)

Letale conc.

(ng / ml)

Fentanyl Analgesie: 1 – 2

Anesthesie: 10 – 20

2 – 20

Sufentanil 0.5 – 5 1 – 7

Alfentanil 30 – 600 ?

1.6. MISBRUIK EN TOXICITEIT

Fentanyl en analogen worden al sinds midden jaren zeventig misbruikt door

anesthesisten, apothekers en verplegers. Ze veroorzaken een roes die begint binnen één à

twee minuten en die vergelijkbaar is met heroïne (Poklis, 1995; Schwartz et al., 1994).

Volgens Kintz et al. (2005) zijn fentanyl en sufentanil de meest misbruikte geneesmiddelen

door anesthesisten.

Fentanyl en analogen worden niet alleen misbruikt door mensen uit de medische

sector, maar ook door druggebruikers en individuen met zelfmoordneigingen. De

fentanylpleisters zijn hiervoor heel populair. Ze worden gebruikt als thee (Barrueto et al.,

2004), geïnhaleerd (Marquardt & Tharratt, 1994), opgegeten (Thomas et al., 2008),

intraveneus geïnjecteerd (Sutlovic & Definis-Gojanovic , 2007), en overmatig aangebracht op

de huid (Edinboro et al., 1997).

In 2002 werd een derivaat van fentanyl gebruikt als chemisch wapen. Toen werden

ongeveer 800 mensen in het Moscow Theatre gegijzeld door Tsjetsjeense rebellen. Deze

rebellen dreigden ermee om het theater op te blazen wanneer er geen gehoor werd

8

gegeven aan hun politieke eisen. Als antwoord hierop bestormden Russische militairen het

gebouw na eerst een onbekend gas door het ventilatiesysteem te sturen. Dit gas bleek later

een fentanylderivaat te bevatten (Wax et al., 2003.)

Wanneer fentanyl en analogen worden toegediend, heeft de anesthesist steeds een

antidoot bij de hand, dit wil zeggen dat recreatief gebruik van deze geneesmiddelen heel

gevaarlijk is. Een fentanyl overdosis wordt gekenmerkt door respiratoire depressie,

bradycardie, hypotensie, misselijkheid, convulsies en braken. Deze klinische symptomen

kunnen beperkt of verminderd worden door lage dosissen van naloxone toe te dienen, door

beademing en cardiopulmonaire reanimatie (Poklis, 1995).

1.7. AFGELEIDEN VAN FENTANYL

Naast sufentanil en alfentanil bestaan er nog andere afgeleiden van fentanyl zoals

remifentanil en carfentanil. Allen behoren ze tot de anilidopiperidine familie (Servin &

Billard, 2008). Bovendien zijn er in de loop van de jaren een groot aantal illegale fentanyl

analogen ontwikkeld.

1.7.1. Remifentanil

Remifentanil is een potente µ-agonist met dezelfde farmacodynamische

eigenschappen als fentanyl, sufentanil en alfentanil maar met een uniek farmacokinetisch

profiel (Servin & Billard, 2008). Het wordt vlug gehydroliseerd door niet-specifieke plasma -

en weefselesterasen. Hierdoor heeft remifentanil een korte werkingsduur en geeft het een

snel herstel na stopzetten van de behandeling (Patel & Spencer, 1996). Remifentanil wordt

intraveneus toegediend voor het bekomen van sedatie en analgesie bij patiënten die pijnlijke

operaties moeten ondergaan (Beers et al., 2004).

1.7.2. Carfentanil

Carfentanil is het meest potente opioïd dat therapeutisch gebruikt wordt. Het is

ongeveer 10 000 keer potenter dan morfine. Hierdoor kan het niet gebruikt worden voor

behandeling van mensen. Onder de naam Wildnil wordt het wel toegediend als

verdovingsmiddel aan grote dieren zoals olifanten, neushoorns, zeehonden en ijsberen (Wax

et al., 2003).

9

1.7.3. Illegale fentanyl analogen

Begin 1979 werd door clandestiene laboratoria α-methylfentanyl gesynthetiseerd dat

verdeeld werd als een heroïnevervanger onder de naam “China White” of synthetische

heroïne. Hierna werden nog verschillende andere analogen ontwikkeld. Zo zouden er

vandaag de dag meer dan 12 verschillende illegale fentanylanalogen bestaan. Ze zouden

verantwoordelijk zijn voor verschillende doden door overdosis. Ze worden in de USA

geclassificeerd als “Schedule I drugs” wat betekent dat ze niet geaccepteerd worden voor

medisch gebruik. Het meest dodelijke van alle illegale fentanylderivaten zou 3-

methylfentanyl zijn, dat ongeveer 6000 keer potenter is dan morfine (Poklis, 1995).

α - methylfentanyl 3 – methylfentanyl

FIG. 1.4.: STRUCTUREN VAN CARFENTANIL, REMIFENTANIL, α-METHYLFENTANYL EN 3-

METHYLFENTANYL

10

1.8. STAALVOORBEREIDING

1.8.1. Vaste fase extractie

Één van de technieken om fentanyl en analogen te isoleren uit biologische matrices is

solid phase extraction (SPE). SPE is een extractieprocedure die gebruik maakt van een vaste

fase, aanwezig in een kolom, en een vloeibare fase. De vaste fase heeft een grotere affiniteit

voor het isolaat dan de vloeibare fase waarin het isolaat is opgelost. Wanneer het staal het

sorbentbed doorloopt, interageert het met functionele groepen die aanwezig zijn in het

sorbentbed, terwijl de andere componenten uit het staal het sorbentbed verlaten.

Algemeen kan men SPE opdelen in vier stappen. Een eerste stap is het conditioneren

van het sorbentbed, daarna wordt het staal over de kolom gebracht, vervolgens worden

ongewenste componenten weggewassen en in de laatste stap worden de gewenste

componenten geëlueerd (Varian, handbook of sorbent extraction technology, 1998)

FIG 1.5.: DE VERSCHILLENDE STAPPEN IN EEN SPE-PROCEDURE ( www.

Sigmaaldrich.com/Graphics/objects/4600/4538.pdf )

11

1.8.2. Andere methodes

Een andere vaak toegepaste techniek om fentanyl en analogen te extraheren is

liquid-liquid extraction (LLE). Hierbij worden de gewenste componenten van de ene

vloeibare fase overgebracht naar een andere niet-mengbare vloeibare fase. LLE wordt nog

vaak gebruikt ter staalvoorbereiding bij toxicologische analyses, zeker wanneer er een groot

aantal, eventueel onbekende componenten moeten geanalyseerd worden (Wille, 2008).

SPE en LLE zijn de meest gekozen methodes als staalvoorbereiding voor de bepaling

van fentanyl en analogen. Maar deze methodes hebben verschillende nadelen, ze zijn

tijdrovend en arbeidsintensief. Bagheri et al. (2007) en Gupta et al. (2007) beschreven een

andere staalvoorbereidingstechniek. Zij maakten gebruik van solid phase microextraction

(SPME). SPME kent op de dag van vandaag een enorme toename in gebruik. Deze

staalvoorbereidingstechniek is sneller, eenvoudiger, goedkoop en gevoelig.

1.9. DETECTIETECHNIEK

1.9.1. Gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)

1.9.1.1. inleiding

Gaschromatografie is een scheidingstechniek waarbij de componenten worden

gescheiden tussen een stationaire fase en een mobiele fase. Een gaschromatografisch proces

kan als volgt omschreven worden: een staal wordt verdampt en vermengd met de mobiele

fase (het dragergas), vervolgens wordt het geïnjecteerd op een chromatografische kolom en

daarna wordt het gescheiden in zijn verschillende componenten. Deze scheiding gebeurt

volgens de dampspanning of hun affiniteit voor de stationaire fase. Gaschromatografie is

voorbehouden voor componenten die vluchtig zijn, thermostabiel zijn en een lage polariteit

hebben.

12

GC en GC-MS zijn twee technieken die vaak worden gebruikt door toxicologen. Een

groot aantal GC en GC-MS-methodes zijn ontwikkeld voor de detectie en kwantificatie van

fentanyl, zijn analogen en hun metabolieten. Oorspronkelijk werd een gepakte kolom met

OV-17 als stationaire fase gebruikt voor het scheiden van deze componenten (Gillespie et al.,

1981; Phipps et al., 1983; Van Rooy et al., 1981). Tegenwoordig hebben capillaire kolommen

de voorkeur gekregen. Door te injecteren met een splitlessinjector neemt de gevoeligheid en

reproduceerbaarheid van de bepalingen van fentanyl bij lage concentraties toe. Fentanyl,

sufentanil en alfentanil kunnen goed gescheiden worden via gaschromatografie, maar hun

gedealkyleerde en gedeacyleerde metabolieten vereisen derivatisatie. Frequent gebruikte

derivatisatiereagentia zijn azijnzuur anhydride, heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA) , en

pentafluoropropionic anhydride (PFPA) (Poklis, 1995).

GC-methodes kunnen gebruik maken van verschillende technieken voor de detectie

van fentanyl. Moore et al., (1986) beschrijven een methode gebruik makend van een

“electron capture detector”. Andere detectoren die worden gebruikt zijn een stikstof/fosfor-

detector (Watts & Caplan, 1988; Björkman & Stanski, 1988) en massaspectrometrie (Van

Nimmen & Veulemans, 2006; Moore et al., 2007; Paradis et al., 2002; Fryirsa et al., 1997).

Massaspectrometrie wordt beschouwd als de voorkeursmethode voor de detectie en

kwantificatie van fentanyl, zijn analogen en hun metabolieten (Poklis; 1995). In de loop van

de jaren zijn er methodes ontwikkeld voor de bepaling van deze componenten in

verschillende soorten matrices zoals urine (Valaer et al., 1997; Poklis & Backer, 2004; Van

Nimmen et al., 2004) plasma (Lin et al., 1981; Fryirsa et al., 1997), haar (Moore et al., 2007,

Kintz et al., 2005) en serum (Szeitz et al., 1996).

1.9.1.2. Principe massaspectrometrie

Voor de detectie van componenten in een staal kan gebruik gemaakt worden van

massaspectrometrie. Deze detectie is gebaseerd op de vorming van ionen (zowel positieve

als negatieve) en scheiding volgens hun massa-over-lading verhouding (m/z).

De massaspectrometer is opgebouwd uit een inlaat, ionenbron, massafilter en een

detector. Op de GC capillaire kolom worden de componenten uit het staal van elkaar

gescheiden, daarna verlaten ze de kolom en komen ze samen met het dragergas terecht in

13

de massaspectrometer. De massaspectrometer zal het staal ioniseren, de ionen filteren en

uiteindelijk de ionen detecteren.

De componenten uit het staal zullen eerst in de ionenbron terechtkomen, daar

worden ze geïoniseerd en gefragmenteerd. Componenten uit een staal kunnen geïoniseerd

en gefragmenteerd worden door toepassing van elektron impact ionisatie (EI) en chemische

ionisatie (CI). Een ionenbron die EI toepast zal de componenten ioniseren en fragmenteren

door gebruik te maken van hoogenergetische elektronen (70 eV). Deze hoogenergetische

elektronen worden geproduceerd door een filament. Bij chemische ionisatie gebruikt men

een extra reagensgas, zoals methaan, dat naast het staal en het carriergas in de ionenbron

wordt gebracht. Dit reagensgas botst met de elektronen met vorming van de primaire ionen

CH4+ en CH3

+. Deze primaire ionen reageren met elkaar en vormen zo secundaire ionen. Deze

secundaire ionen zullen dan reageren met de componenten afkomstig van het staal. Na de

ionisatiestap via EI of CI zal de spanning op de “repeller” ervoor zorgen dat de ionen

doorheen verschillende lenzen gestuurd worden. Dit zal de ionen in een nauwe bundel naar

de massafilter (de quadrupool) leiden. Electron impact ionisatie wordt het meest gebruikt in

toxicologische analyses.

De massafilter is een quadrupool die de ionen filtert en scheidt volgens hun massa

over lading verhouding (m/z). De quadrupool bestaat uit 4 metalen staven. Tegenover elkaar

liggende staven zijn elektrisch met elkaar verbonden. Het ene paar is negatief geladen, het

andere positief. Hierdoor ontstaat een complex elektrisch veld dat nodig is voor de selectie

van de ionen die doorgelaten worden. De massafilter kan werken in SCAN-modus waarbij

gekeken wordt naar een hele reeks m/z waarden, of in de SIM-modus (selected ion

monitoring-modus) waarbij enkel een aantal geselecteerde m/z worden gemeten.

Na de passage doorheen de quadrupool bereikt de ionenbundel de detector. Deze

detector is een “electron multiplier” die de ionenbundel omzet in een elektronenbundel.

Deze elektronenbundel wordt geamplificeerd en omgezet in een elektrisch signaal dat

evenredig is met het aantal ionen ( Rood, 1999; Wille, 2008).

14

1.9.2. Andere methodes

Niet alleen GC-MS wordt gebruikt voor de scheiding en detectie van fentanyl, zijn

analogen en hun metabolieten.

Radioimmunoassay (RIA) was vroeger de meest gebruikte methode voor

farmacokinetische studies en detectie van fentanyl die als doping ingenomen werd door

sportlui. Schüttler & White (1984) en Woestenborghs et al. (1987) analyseerden fentanyl

met RIA wanneer het gebruikt wordt als anestheticum (Fryirsa et al., 1997). RIA methodes

zijn gevoelig, maar de resultaten kunnen sterk variëren en liggen vaak hoger dan deze

bekomen via chromatografische scheidingstechnieken (Szeitz et al., 1996). Deze techniek

wordt vandaag de dag niet meer gebruikt omwille van de radioactiviteit.

ELISA wordt heden als screeningsmethode toegepast voor de detectie van fentanyl.

Tobin et al., 1988 ontwikkelden een éénstaps ELISA-test voor de bepaling van fentanyl en

zijn metabolieten in bloed en urine van paarden. Ruangyuttikarn et al. beschreef in 1990 een

ELISA-test voor de detectie van fentanyl en analogen in menselijke urine.

Kumar et al. (1996), Lambropoulos et al. (2000) en Tsuchiya et al. (1991) beschreven

methodes die high performance liquid chromatography (HPLC) toepassen. De methodes zijn

echter beperkt in gevoeligheid voor de bepaling van lage tot zeer lage fentanylconcentraties.

Verschillende methodes werden ontwikkeld gebruik makend van LC-MS/MS, dit is

vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie. Shou et al. (2001),

Palleschi et al. (2003), Huynh et al. (2005) beschreven methodes voor de bepaling van

fentanyl in plasma. Coopman et al. (2007) ontwikkelde een techniek voor de bepaling in

Duragesic®-pleisters. LC MS/MS is een gevoelige en selectieve methode voor de bepaling van

fentanyl.

15

2. OBJECTIEVEN

Fentanyl, sufentanil en alfentanil zijn zeer potente stoffen waardoor de letale

concentraties in bloed heel laag liggen, namelijk 2 – 20 ng/ml voor fentanyl en 1 – 7 ng/ml

voor sufentanil. Voor alfentanil zijn de letale concentraties niet gekend. Voornamelijk

fentanyl kent een opmars in de drugswereld aangezien het een roes veroorzaakt die

gelijkaardig is aan die van heroïne. Gezien de lage letale concentratie, is bij druggebruikers

die vaak geen weet hebben van de exacte concentratie en/of identiteit van hetgeen ze

nemen, een overdosis nooit ver weg. Ook voor zelfmoord bij onder andere kankerpatiënten

wordt fentanyl gebruikt. Hierdoor komen er zo nu en dan gerechtelijke stalen binnen in het

toxicologisch laboratorium die positief zijn op fentanyl.

Het doel van deze masterproef is om via gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-

MS) een methode te ontwikkelen die fentanyl, zijn metaboliet norfentanyl en de analogen

sufentanil en alfentanil met voldoende gevoeligheid en selectiviteit kan bepalen in

biologische matrices.

Eerst wordt er een SIM-methode ontwikkeld. Hiervoor wordt er aan de hand van de

massaspectra per component 1 “quantifier” en 1 of 2 “qualifiers” gekozen.

Vervolgens wordt de staalvoorbehandeling geoptimaliseerd door het selecteren van

de geschikte SPE-kolommen en het kiezen van de condities voor het conditioneren, laden,

wassen en elueren. Norfentanyl dient gederivatiseerd te worden aangezien het te polair is

om op zichzelf bepaald te worden via GC-MS. Hiervoor wordt het optimale

derivatisatiereagens bepaald.

Ook worden gaschromatografische parameters op vlak van staalintroductie en

chromatografische scheiding gevarieerd zoals de injectietemperatuur, het injectievolume,

het temperatuursprogramma, enzovoort. Het doel hiervan is om zo een ideale scheiding en

respons van de verschillende componenten te krijgen.

Hierna wordt de bekomen methode gevalideerd op extractierendement, lineariteit

en stabiliteit.

16

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1. REAGENTIA EN SOLVENTEN

Alfentanil HCl (1 mg / ml in methanol), fentanyl ( 1 mg / ml in methanol), fentanyl –

D5 ( 0.1 mg / ml in methanol), norfentanyl oxalaat ( 1 mg / ml in methanol), norfentanyl – D5

oxalaat ( 100 µg / ml in methanol) en sufentanil citraat ( 0.1 mg / ml in methanol) werden

geleverd door LGC standards (Molsheim Cedex, Frankrijk).

De volgende reagentia werden gebruikt voor de vaste fase extractie en besteld bij

Merck (Darmstadt, Duitsland): methanol (LiChrosolv), ammoniakoplossing 25% (pro analysi)

en water (LiChrosolv.). De fosfaatbuffer (25 mM, pH 2.5) werd gemaakt door 6.662 g

NaH2PO4.H2O (Merck, Darmstadt, Duitsland) toe te voegen aan 2.7 L HPLC-water. Vervolgens

werd de pH aangepast door toevoegen van ortho-fosforzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland,

pro analysi), gebruik makend van een Consort C 532 pH-meter (Cole – Palmer, Il, USA). De

1.25% ammoniakoplossing in methanol werd bij elk experiment opnieuw bereid. De reden

hiervoor is dat ammoniak verdampt waardoor de concentratie aan ammoniak in de

oplossing na verloop van tijd niet meer juist is.

1-(heptafluorobutyryl)imidazool (HFBI) (Thermoscientific, Rockford, USA),

heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA) (Machery – Nagel, Düren, Duitsland) en tolueen

(Suprasolv quality, Merck, Darmstadt, Duitsland) werden gebruikt in het derivatisatieproces.

3.2. BEREIDING VAN DE STANDAARDEN

Fentanyl, alfentanil en norfentanyl standaardoplossingen werden aangemaakt in

methanol met concentraties 100 -10 -2,5-1-0,5 en 0,1 ng/µL. Sufentanil, standaardoplossing

werd aangemaakt met concentraties 10-2,5-1-0,5-0,1 ng/µL. Drie mengsels van norfentanyl,

fentanyl, sufentanil en alfentanil werden aangemaakt met concentraties 0,1 , 1 en 10 ng/µL.

Na aanmaak werden ze bewaard buiten de invloed van licht bij – 20 °C.

17

3.3. PLASMASTALEN

Bloed werd afgenomen en bewaard in dikalium EDTA Venosafe bloedcollectie buizen

(Terumo, Europe N.V., Leuven, België). Om blanco plasma te bekomen werden de buizen

gecentrifugeerd aan 1100 g gedurende 10 minuten. Hierna werd het plasma verwijderd en

bewaard bij – 20 °C.

3.4. APPARATUUR

3.4.1. centrifuge, vacuümtoestel, indampingstoestel, vortexer, verwarmingsblokje en

sonicatiebad

De centrifuge was een eppendorf centrifuge 5804 R (Hamburg, Duitsland). Voor de

vaste fase extractie werd gebruik gemaakt van een vacuümtoestel Visiprep TM (Supelco,

Bornem, België) met debietregelende wegwerpliners (Supelco, Bellefonte, USA). De Strata

XC en Strata SCX extractiekolommen werden aangekocht bij Phenomenex (Benelux). Het

droogdampen van de stalen onder stikstof gebeurde met een Turbovap LV evaporator van

Zymark (Teralfene, België). Voor het vortexen van de stalen werd gebruik gemaakt van een

super-mixer cat n° 1291 van Lab-line (Leuven, België).

Via een verwarmingsblokje, ‘Multi-Blok Heater’ (Lab-Line, Leuven, België) werd de juiste

temperatuur verkregen voor derivatisatie. Het sonicatiebad was een ‘Brandson 1510’

(Brandson UL Transonics corporation, Danbury, CT, USA).

Autosampler vials (1.5 ml), clear glass micro-inserts (100 µl, 31 x 6 mm, 15 mm top)

en aluminium “caps” werden aangekocht bij VWR international (Amsterdam, Nederland).

3.4.2 gaschromatografie – massaspectrometrie (GC – MS)

Een HP 6890 GC system werd gebruikt, gekoppeld aan een HP 5973 massaselectieve

detector, met een HP 7683 split/splitless auto injector en een G1701 DA chem station, versie

D.02.00 data processing eenheid (Agilent Technologies, Avondale, PA, USA).

De injector bevatte een splitless gedeactiveerde inlet liner met glaswol. De

chromatografische scheiding gebeurde op een Agilent J&W HP-5ms kolom (5% fenyl methyl

siloxaan) (Agilent Technologies, Avondale, PA, USA). Deze kolom heeft een lengte van 30 m,

een interne diameter van 0.25 mm en een filmdikte van 0.25 µm.

18

De initiële kolomtemperatuur was 90 °C gedurende 1 minuut. Met een snelheid van

50°C/min steeg de temperatuur tot 290 °C, dit werd aangehouden gedurende 3 minuten om

tenslotte de temperatuur te laten stijgen met 10°C / min tot 300°C. Deze 300°C werd 3

minuten aangehouden.

De pulsed splitless injectietemperatuur was 290°C, de ‘purge time’ 1 minuut en de

‘pulse time’ 1,5 minuut. De injectie pulse druk was 25,5 psi en 2 µL van het staal, opgelost in

50 µL tolueen, werd geïnjecteerd. Ultrapure helium met een constante flow van 1.3 ml/min

werd gebruikt als carriergas.

In de EI mode waren de temperatuurcondities als volgt: 230 °C voor de EI-bron, 150 °C voor

de quadrupool en 300 °C voor de transferline. Een electronspanning van 70 eV werd

gebruikt.

FIGUUR 3.1. EEN HP 6890 GASCHROMATOGRAAF MET EEN HP 5973 MASSA – SELECTIEVE

DETECTOR EN EEN HP 7683 SPLIT/SPLITLESS INJECTOR (www.toxicologie.ugent.be)

19

3.5. STAALBEHANDELING VOOR HET UITVOEREN VAN VASTE FASE EXTRACTIE

Één ml plasma werd gecentrifugeerd bij 4500 g gedurende 10 minuten en het

supernatans werd belast met fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil (concentratie

afhankelijk van experiment). Dit gebeurde met behulp van een pipettor. Het plasma werd

verdund met 4 ml fosfaatbuffer (25 mM, pH 2.5). Na vortexen werd gedurende 10 minuten

gecentrifugeerd bij 1100 g. Vervolgens werd het supernatans overgebracht.

3.6. UITVOEREN VAN DE VASTE FASE EXTRACTIE

3.6.1. keuze geschikte stationaire fase

Voor dit experiment werden 3 verschillende kolommen uitgetest: Strata X, Strata XC

en Strata SCX. Zij werden gekozen voor hun potentiële interactie met fentanyl, sufentanil en

alfentanil. Strata XC en Strata SCX zijn sterke kationuitwisselaars. Het verschil tussen beiden

is dat Strata XC een “mixed mode” is, dit wil zeggen dat hij de eigenschappen van de

kationuitwisselaars combineert met een styreen-divinylbenzeenpolymeer, die ook

hydrofobe en aromatische interacties vertoont. Strata X is een reversed phase SPE kolom.

Deze kolom weerhoudt componenten op basis van apolaire interacties. De stationaire fase is

hierbij selectief voor apolaire componenten.

3.6.2. keuze van de condities voor het conditioneren, laden, wassen en elueren

De SPE-kolommen werden eerst geconditioneerd met 2 ml methanol en 3 ml

fosfaatbuffer. Vervolgens werden de voorbereide stalen op de kolommen gebracht. Het

wassen van de kolommen gebeurde met 4 keer 1 ml methanol (20 % voor Strata X en 100%

voor Strata XC en Strata SCX). Hierna werden de SPE-kolommen gedurende 2 minuten

gedroogd. Voor het elueren van de gewenste componenten werd gebruik gemaakt van 2

keer 1 ml 1.25% ammoniak in methanol.

20

3.7. UITVOEREN VAN DE DERIVATISATIE

3.7.1. heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) versus heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA)

Voor de derivatisatie met heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA) werd gebruik

gemaakt van een mengsel dat 50 ng van elke component bevat. Dit mengsel werd

drooggedampt onder stikstofgas bij 40 °C. Vervolgens werd 50 µL ethylacetaat en 50 µL

HFBA toegevoegd. Na afsluiten van de proefbuis werd gemengd door vortexen, waarna

gesoniceerd werd gedurende 5 minuten. Hierna werd verwarmd gedurende 30 min bij 65 °C.

Nadien werd er drooggedampt onder stikstofgas bij 40 °C. Het residu werd heropgelost in 50

µL tolueen.

Bij de derivatisatie met heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) werd opnieuw gebruik

gemaakt van een mengsel dat 50 ng van elke component bevat. Dit mengsel werd

drooggedampt onder stikstofgas bij 40 °C. Vijftig µL HFBI werd toegevoegd aan de

drooggedampte stalen. Hierna werden ze verwarmd bij 85°C gedurende 30 minuten.

Vervolgens werd 0.5 ml HPLC-water en 2 ml tolueen toegevoegd. Na vortexen gedurende 30

seconden werden de stalen gecentrifugeerd bij 1600 g gedurende 10 minuten. De stalen

werden hierna in de diepvriezer (-20 °C) geplaatst gedurende ca. 45 minuten. Op deze

manier kon de tolueenlaag makkelijk overgebracht worden omdat de waterlaag bevriest

maar de tolueenlaag niet. Deze tolueenlaag werd drooggedampt onder stikstofgas bij 40 °C.

Het residu werd heropgelost in 50 µL tolueen.

Het optimale derivatisatiereagens werd bepaald door de derivatisaties van mengsels

die 50 ng van elke component bevatten te vergelijken. Deze mengsels werden

drooggedampt onder stikstofgas bij 40 °C, gederivatiseerd met HFBA of HFBI en heropgelost

in 50 µL tolueen.

3.8. CONDITIES VOOR OPTIMALE MASSASPECTROMETRIE

Voor het bepalen van de optimale massaspectrometrische condities werd 10 ng van

fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil op de kolom gebracht en na scheiding

gedetecteerd in de SCAN-modus. Norfentanyl diende eerst gederivatiseerd te worden. Dit

gebeurde door 50 µL 10 ng/µL in een puntbuis te brengen en droog te dampen onder

stikstofgas bij 35 °C. Vervolgens werd 50 µL ethylacetaat en 50 µL HFBA toegevoegd. De

21

puntbuis werd hierna 5 seconden gevortext en 5 minuten gesoniceerd. Er werd daarna

verwarmd bij 60 °C gedurende 30 minuten. Nadien werd er drooggedampt onder stikstofgas

bij 40 °C. Het residu werd heropgelost in 50 µL tolueen.

3.9. GASCHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS

3.9.1. staalintroductie

Er bestaan verschillende injectietechnieken om een staal op een capillaire kolom te

brengen, namelijk “split injection”, “splitless injection” en “cold on column injection”. Voor

de bepaling van fentanyl en analogen in biologische matrices werd gebruik gemaakt van de

splitless injectie. Een splitless injector (fig. 3.2. a) is gelijk aan een splitinjector maar met een

gesloten naaldventiel. Hierdoor komt het grootste deel van het staal op de kolom terecht.

Een splitless injector wordt hoofdzakelijk gebruikt voor de injectie en analyse van sterk

verdunde oplossingen. Een splitless injector kan op 2 manieren voorkomen, namelijk in de

purge off-modus en in de purge on-modus (fig. 3.2. b). Tijdens injectie en een tijdje erna

bevindt de injector zich in de purge off-modus. Hierbij zal het naaldventiel de split line

sluiten waardoor er geen gas doorheen de split line zal bewegen. Na injectie van het staal,

zal het staal verdampen en zich mengen met het dragergas. Aangezien de split line op dat

moment gesloten is kan het staal enkel op de kolom terechtkomen. Na een tijd zal de split

line geopend worden door het naaldventiel. Dit wordt de purge-on modus genoemd.

Hierdoor stromen het overgebleven dragergas en achtergebleven residuen van het staal weg

langs de split line (Rood, 1998).

FIG 3.2. a) SPLIT/SPLITLESS INJECTORS b) SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN EEN SPLITLESS INJECTIE (www.chromacademy.com)

22

3.9.2. keuze van interne standaarden

Het kiezen van de geschikte interne standaard (IS) is belangrijk bij het ontwikkelen

van een bruikbare methode. Het is belangrijk dat de IS een retentietijd heeft die in de buurt

ligt van de te kwantificeren substantie. Ook moet hij vergelijkbare fysische eigenschappen bij

GC hebben, zoals onder andere oplosbaarheid en vluchtigheid. Een interne standaard wordt

in dezelfde hoeveelheid toegevoegd in stalen en in blanco en compenseert voor eventueel

staalverlies tijdens de staalvoorbehandeling of tijdens de chromatografische bepaling. Vaak

wordt een gedeutereerd analoog als interne standaard gebruikt. Voor norfentanyl werd

norfentanyl-D5 gebruikt, voor fentanyl fentanyl-D5. Aangezien er geen gedeutereerd

analoog van sufentanil en alfentanil in het laboratorium beschikbaar was, werd fentanyl-D5

gebruikt als interne standaard voor sufentanil en alfentanil.

3.9.3. optimalisatie van de splitless injectie

3.9.3.1. injectiesolvent

In voorgaand onderzoek door S. Van Haecke werd de keuze van injectiesolvent

geoptimaliseerd. Toen werd besloten dat tolueen beter was als injectiesolvent dan

methanol. Als reden hiervoor werd onder andere gegeven dat het dampvolume van tolueen

(260 µL) veel lager ligt dan dit van methanol (750 µl). Bijgevolg kan men tot 3 keer meer

injecteren wanneer gebruik wordt gemaakt van tolueen. Hierdoor kan er gevoeliger gewerkt

worden. Bovendien bevat methanol meer water dan tolueen waardoor er meer energie

nodig is om methanol te verdampen (Van Haecke, 2008).

3.9.3.2. injectietemperatuur

De invloed van de injectietemperatuur werd onderzocht door een mix te maken van

de componenten met een concentratie van 50 ng/µl (n = 3). Deze mix werd toegevoegd aan

1 ml plasma en onderworpen aan vaste fase extractie en derivatisatie zoals hierboven

beschreven. Het residu werd opgelost in 50 µL tolueen. Het temperatuursprogramma was

als volgt: De initiële kolomtemperatuur was 90 °C gedurende 1 minuut. Met een snelheid

van 50°C/min steeg de temperatuur tot 290 °C, dit werd aangehouden gedurende 3 minuten

om tenslotte de temperatuur te laten stijgen met 10°C / min tot 300°C. Deze 300°C werd 3

23

minuten aangehouden. De injectietemperaturen die werden uitgetest waren 200, 250, 260,

270, 280, 290 en 300 °C.

3.9.3.3. splitless versus pulsed splitless injectie

Er werd een mix gemaakt van de componenten met een concentratie van 50 ng/µl (n

= 1). Deze mix werd toegevoegd aan 1 ml plasma. Vervolgens werd er vaste fase extractie en

derivatisatie uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Het residu werd opgelost in 50 µl

tolueen. Om te kijken of de pulsed splitless-injectie beter is dan de gewone splitless wordt

de druk verhoogd tot 25,5 psi in plaats van 10.05 psi bij een splitless injectie. Daarna daalt de

druk tot 13.50 psi.

3.9.3.4. injectievolume

Om de pulsed splitless injectie te optimaliseren werd het injectievolume gevarieerd.

Één µl injectievolume werd vergeleken met 2 µl injectievolume.

3.9.4. optimalisatie van de chromatografische scheiding

3.9.4.1. optimalisatie van het temperatuursprogramma

Voor het bepalen van het geschikte temperatuursprogramma werd 1 ml plasma

belast met de standaarden van fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil (50 ng/ml

plasma) en verdund met 4 ml fosfaatbuffer pH 2.5 . Vervolgens werd gedurende 10 minuten

gecentrifugeerd bij 4500 g en werd het supernatans overgebracht. Hierna werd vaste fase

extractie uitgevoerd volgens de procedure zoals hierboven beschreven. Het extract werd

ingedampt onder stikstof bij 40 °C. Na indampen werd er gederivatiseerd met HFBI.

Vervolgens werd er verwarmd bij 85 °C gedurende 30 minuten. Er werd 5 minuten afgekoeld

en 500 µL water en 2 ml tolueen werd toegevoegd. De proefbuizen werden gevortext en

gedurende 10 minuten gecentrigufeerd bij 1600 g. Vervolgens werden ze in de diepvries

geplaatst totdat de tolueenfase kon afgescheiden worden van de waterfase. Deze

tolueenfase werd ingedampt onder stikstofgas bij 40 °C en het residu werd opgelost in 50 µL

24

tolueen. Er werd 1 µL staal op de kolom gebracht. De stalen werden in de scanmodus

gedetecteerd.

Volgende temperatuursprogramma’s werden uitgetest: Eerste temperatuursprogramma: vierde temperatuursprogramma:

50°C/min 50°C/min

90°C (1’) 240 °C 90°C (1’) 280 °C (3’) 10°C/min 10°C/min

240°C 285 °C 280 °C 300 °C (3’) 5°C/min

285 °C 300°C (3’)

→ duur van de run: 14.50 minuten → duur van de run: 12.80 minuten

Tweede temperatuursprogramma: vijfde temperatuursprogramma:

50°C/min 50°C/min

90°C (1’) 250°C (1’) 90°C (1’) 300°C (3’) 50°C/min

250°C 290 °C 5°C/min

290 °C 300°C (3’)

→ duur van de run: 12 minuten → duur van de run: 8.20 minuten

Derde temperatuursprogramma:

50°C/min

90°C (1’) 290°C (3’) 10°C/min

290°C 300 °C (3’) → duur van de run: 12 minuten

25

3.10 BEPALEN VAN HET EXTRACTIERENDEMENT

Het extractierendement van elke component werd bepaald bij 2 concentraties,

namelijk 5 ng/ml en 50 ng/ml. Er werden 3 extractiestalen bekomen door blanco

plasmastalen te belasten met standaardwerkoplossingen vóór de vaste fase extractie. Voor

de 3 controlestalen werden blancostalen geëxtraheerd en werd de standaardwerkoplossing

toegevoegd na de SPE-extractie. De interne standaarden werden toegevoegd na de vaste

fase extractie en vóór derivatisatie.

3.11. LINEARITEIT

De lineariteit werd onderzocht door calibratiecurves te maken van fentanyl,

norfentanyl, sufentanil en alfentanil. Volgende concentraties werden gebruikt voor het

maken van de calibratiecurves: 5, 10, 20, 30, 40 en 50 ng/ml. Hiervoor werd aan 1 ml

blancoplasma bovenstaande concentraties toegevoegd. De stalen werden verdund met 4 ml

fosfaatbuffer pH 2.5 en onderworpen aan vaste fase extractie en derivatisatie zoals

hierboven beschreven (zie 3.6.2 en 3.7.1). Tevens werd er een blancostaal meegenomen.

3.12. STABILITEIT

Voor het bepalen van de stabiliteit werd 1 ml plasma belast met de standaarden van

fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil (50 ng/ml) en verdund met 4 ml fosfaatbuffer

pH 2,5. Vervolgens werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 4500 g en het

supernatans werd overgebracht. Hierna werden de stalen onderworpen aan vaste fase

extractie en derivatisatie zoals hierboven beschreven (zie 3.6.2 en 3.7.1). De stabiliteit werd

bepaald door de stalen ongeveer 15 uur te laten staan in de autosampler en om de 2 uur te

injecteren.

26

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1. STAALBEHANDELING VOOR HET UITVOEREN VAN VASTE FASE EXTRACTIE

Vooraleer vaste fase extractie werd uitgevoerd, werd 4 ml fosfaatbuffer pH 2.5 aan

het staal toegevoegd. In plasma is 84.4% van fentanyl, 92.5% van sufentanil en 92.1% van

alfentanil gebonden aan proteïnen (Meuldermans et al., 1982). Wanneer de fosfaatbuffer

wordt toegevoegd zal de proteïnebinding breken en zullen de proteïnen neerslaan.

Bovendien worden de componenten door toevoegen van de buffer positief geladen, wat

noodzakelijk is voor de vaste fase extractie (zie 4.2).

4.2. UITVOEREN VAN DE VASTE FASE EXTRACTIE

Vaste fase extractie (SPE) wordt gebruikt om fentanyl, zijn metaboliet norfentanyl,

sufentanil en alfentanil uit een biologische matrix te extraheren. SPE zal interfererende

componenten zoals onder andere eiwitten en zouten verwijderen uit het staal, vervolgens

de gewenste componenten aanconcentreren en ze daarna overbrengen in een solvent dat

kan gebruikt worden voor chromatografische analyses.

Vaste fase extractie werd ontwikkeld als alternatief voor vloeistof-vloeistofextractie

(LLE). SPE heeft in vergelijking met LLE verschillende voordelen zoals de mogelijkheid om

meer zuivere extracten te verkrijgen. Verder is het gemakkelijk automatiseerbaar en zorgt

het voor een hoge selectiviteit en goede reproduceerbaarheid (Thurman & Mills, 1998). SPE

heeft echter ook nadelen zoals de kostprijs van de SPE-kolommen en de soms tijdrovende

optimalisatie van de SPE-procedure (Wille, 2008).

De SPE-procedure kan opgedeeld worden in 4 stappen. Een eerste stap is het

conditioneren van de kolom. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van methanol. Door het

conditioneren wordt het sorbent bevochtigd, wat noodzakelijk is voor de interactie tussen

de componenten en de functionele groepen aanwezig in het sorbent. Een fosfaatbuffer pH

2.5 wordt toegevoegd ter equilibratie. Na conditioneren wordt het staal op de kolom

gebracht. Fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil zijn positief geladen door de

verdunning met de fosfaatbuffer en interageren bijgevolg met de functionele groepen.

Vervolgens wordt een wasstap uitgevoerd. Hierdoor worden componenten die niet

gereageerd hebben met de functionele groepen verwijderd en zullen ze bijgevolg niet

27

interfereren bij verdere metingen. Als laatste stap wordt een 1.25% ammoniakoplossing in

methanol op de kolom gebracht. Dit verbreekt de bindingen tussen de component en de

functionele groepen, waardoor de gewenste componenten worden geëlueerd.

4.2.1. keuze geschikte stationaire fase

Drie verschillende kolommen werden uitgetest, Strata X, Strata XC en Strata SCX.

Strata X werd uitgesloten omdat de extracten afkomstig van deze SPE-kolom troebel waren.

Aangezien fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil een aminefunctie bevatten kunnen

de kationuitwisselaars Strata XC en Strata SCX gebruikt worden. Strata XC en Strata SCX

gaven vergelijkbare resultaten maar de piekoppervlakten waren bij Strata SCX lichtjes hoger

dan bij Strata XC. Een doorslaggevende factor was de reproduceerbaarheid. Na herhaalde

proeven bleek SPE gebruik makend van Strata XC als kolom weinig reproduceerbaar.

Bijgevolg werd er gekozen voor Strata SCX als SPE-kolom bij verdere experimenten.

TABEL 4.1. VERSCHIL IN PIEKOPPERVLAKTEN VAN DE VERSCHILLENDE COMPONENTEN NA

SPE MET STRATA XC EN STRATA SCX (n=1)

Component piekoppervlakte

Strata SCX Strata XC

Norfentanyl 17236 16586

Fentanyl 21929 21355

Sufentanil 71042 69328

Alfentanil 28591 28369

4.3. UITVOEREN VAN DE DERIVATISATIE

Om gescheiden te kunnen worden door een gaschromatograaf moeten

componenten aan een aantal voorwaarden voldoen. Ze moeten thermostabiel en vluchtig

zijn en een beperkte polariteit bezitten. Fentanyl, sufentanil en alfentanil voldoen aan dez

voorwaarden. Norfentanyl, een secundair

en moet bijgevolg gederivatiseerd worden. Als derivatisatiereagens werden HFBA en HFBI

uitgetest. Derivatisatie met HFBA en HFBI is een acylatiereactie, waarbij een labiel

waterstofatoom op het stikstofatoom vervangen wordt door een minder polaire, stabie

groep. De secundaire aminefunctie van norfentanyl zal reageren met

heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) of heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA), wat

resulteert in de vorming van heptafluorogebutyleerd

bijproducten imidazool en heptafluoroboterzuur

FIG 4.1.: REACTIESCHEMA VAN DERIVATISATIE MET HFBI EN HFBA

DERIVATISATIE



zijn en een beperkte polariteit bezitten. Fentanyl, sufentanil en alfentanil voldoen aan dez

en. Norfentanyl, een secundair amine, voldoet echter niet aan deze voorwaarde



waterstofatoom op het stikstofatoom vervangen wordt door een minder polaire, stabie



esulteert in de vorming van heptafluorogebutyleerd norfentanyl en de

en heptafluoroboterzuur.


28



zijn en een beperkte polariteit bezitten. Fentanyl, sufentanil en alfentanil voldoen aan deze

amine, voldoet echter niet aan deze voorwaarden



waterstofatoom op het stikstofatoom vervangen wordt door een minder polaire, stabiele



norfentanyl en de respectievelijke


4.3.1. Heptafluorobutyrylimidazool (HFBI) versus heptafluoroboterzuur anhydride (HFBA)

De piekoppervlakten van de componenten werden

HFBA en HFBI. Hieruit bleek dat de piekoppervlakten na derivatisatie met HFBI hoger lagen

dan de piekoppervlakten bekomen door derivatisatie met HFBA. Voornamelijk voor de niet

gederivatiseerde tertiaire amines (fentanyl, su

derivatisatiecondities met HFBI tot hogere piekoppervlakten.

FIG 4.2.: VERGELIJKING VAN DERIVATISATIE MET HFBA EN HFBI ( n = 3)

Een ander voordeel van het gebruik van HFBI is dat door de bijkom

er zuiverder extracten worden verkregen.

HFBA werd er gekozen voor HFBI als derivatisatiereagens. HFBI zorgt immers voor hogere

piekoppervlakten van de tertiaire amines.

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

HFB-norfentanyl

pie

ko

pp

erv

lak

ten


De piekoppervlakten van de componenten werden vergeleken na derivatisatie met



gederivatiseerde tertiaire amines (fentanyl, sufentanil en alfentantil) leidde

met HFBI tot hogere piekoppervlakten.

FIG 4.2.: VERGELIJKING VAN DERIVATISATIE MET HFBA EN HFBI ( n = 3)

Een ander voordeel van het gebruik van HFBI is dat door de bijkom

extracten worden verkregen. Ondanks de kortere derivatisatieprocedure van


piekoppervlakten van de tertiaire amines.

norfentanyl fentanyl sufentanil alfentanil

HFBI versus HFBA

29


vergeleken na derivatisatie met



fentanil en alfentantil) leidde

Een ander voordeel van het gebruik van HFBI is dat door de bijkomende extractiestap

Ondanks de kortere derivatisatieprocedure van


alfentanil

HFBA

HFBI

30

4.4. CONDITIES VOOR OPTIMALE MASSASPECTROMETRIE

4.4.1. Inleiding: SIM – SCAN modus

De detectiemodus van de massaspectrometer kan gebruikt worden in de scan of SIM

(selected ion monitoring) modus. Een scanmodus wordt gebruikt voor de identificatie van

staalcomponenten. Hierbij scant de massaspectrometer continu ionen van lage naar hoge

m/z-waarden. Dit geeft een Total Ion Chromatogram (TIC). Wanneer de meest abundante of

unieke fragmentionen van een component gekend zijn, kan de SIM-modus gebruikt worden.

Deze wordt gebruikt voor de kwantificatie van componenten. De SIM-modus scant niet alle

massa’s, maar enkel de vooraf gekozen ionen. Hierdoor wordt een maximale gevoeligheid

bekomen. In het algemeen worden 2 tot 3 ionen met de hoogste abundantie gekozen

omwille van hun grotere reproduceerbaarheid en lagere detectielimiet. Alleen de

componenten die één of meerdere van de geselecteerde fragmentionen bezitten, worden

weergegeven door een piek in een chromatogram (Rood, 1998).

4.4.2. Massaspectra van fentanyl, norfentanyl, sufentanil, alfentanil, norfentanyl – D5 en

fentanyl – D5

Eerst werden de massaspectra van fentanyl, zijn metaboliet norfentanyl, sufentanil,

alfentanil en de interne standaarden fentanyl-D5 en norfentanyl-D5 bepaald. Hiertoe werd

10 ng van elke standaard op de kolom gebracht en gedetecteerd in de scan-modus. Via GC-

software kon uit de bekomen chromatogrammen het massaspectrum van elke piek

gereconstrueerd worden. Deze massaspectra werden vergeleken met referentiespectra van

fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil aanwezig in de GC-bibliotheek. Norfentanyl en

norfentanyl-D5 zijn op zichzelf niet via GC-MS analyseerbaar en moeten bijgevolg

gederivatiseerd worden. Dit gebeurde door middel van HFBA. In figuur 4.3. en figuur 4.4. zijn

de massaspectra van fentanyl, norfentanyl, sufentanil, alfentanyl, norfentanyl-D5 en

fentanyl-D5 weergegeven.

31

FIG 4.3. MASSASPECTRA VAN a) FENTANYL b) SUFENTANIL c) ALFENTANIL

a

b

c

32

FIG 4.4. MASSASPECTRA VAN a) HFB-NORFENTANYL b) HFB-NORFENTANYL – D5 c) FENTANYL – D5

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 0

10000 20000 30000 40000 50000

m/z-->

Abundance

155.1

279.0 109.0

207.0 180.1

377.1 341.0 239.9 415.2 433

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 4600

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

Abundance

150.1

279.0

104.1 372.1

337.1 428.2 226.0

176.1

252.0 399.1 305.1 457.1

a

b

c

33

4.4.3. Ontwikkeling van een SIM – methode

Het ontwikkelen van een SIM-methode is noodzakelijk zodat fentanyl, norfentanyl,

sufentanil en alfentanil in lage concentraties kunnen gedetecteerd worden. Een SIM-

methode zorgt immers voor een winst in gevoeligheid vergeleken met de scan-modus. Bij de

ontwikkeling van een SIM-methode is het kiezen van de geschikte m/z waarden heel

belangrijk. Hiervoor worden de oorspronkelijke massaspectra gebruikt. De gekozen m/z-

waarden moeten aan een aantal criteria voldoen. Zo moeten ze een voldoende hoge

intensiteit hebben om een maximale gevoeligheid te bekomen en een zo hoog mogelijke

m/z-waarde bezitten voor het verkrijgen van een maximale selectiviteit. De kans op een vals

positieve kwantificatie door co-eluerende componenten of achtergrondionen die dezelfde

m/z-waarde bezitten daalt door het gebruik van ionen met een hoge m/z-waarde.

Uit de massaspectra die bekomen werden in de scan-modus, werden 1 “quantifier”

en 1 of 2 “qualifiers” gekozen. Het quantifier-ion is het ion dat in de massaspectra met de

hoogste intensiteit aanwezig is. De qualifier-ionen zijn niet met de hoogste intensiteit

aanwezig en zijn met absolute zekerheid afkomstig van de onderzochte molecule.

De ionen die per component werden gekozen zijn weergegeven in tabel 4.2. samen

met de retentietijden. Deze retentietijden kunnen verkorten wanneer er bij vervuiling van de

kolom een stuk moet afgeknipt worden. Hierdoor zullen de componenten vroeger elueren.

In figuur 4.5. is een chromatogram weergegeven van een mix van de componenten

opgenomen in de SIM-modus.

34

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

Time-->

Abundance

alfentanil

fentanyl

HFB-norfentanyl

sufentanil

TABEL 4.2. SAMENVATTENDE TABEL VAN DE GEKOZEN IONEN EN RETENTIETIJDEN VAN ELKE

COMPONENT

FIG. 4.5. CHROMATOGRAM VAN FENTANYL, HFB-NORFENTANYL, SUFENTANIL EN

ALFENTANIL (50 NG/ML PLASMA) OPGENOMEN IN SIM - MODUS

component

Retentietijd M – ion M – ion HFB quantifier qualifiers

HFB-norfentanyl 5,3 min 232 428 372 428 /

Fentanyl 7,4 min 336 336 245 146 /

sufentanil 7,7 min 387 387 289 140 290

alfentanil 8,8 min 417 417 289 140 222

HFB- norfentanyl-D5 5,3 min 237 433 377 433 /

fentanyl-D5 7,4 min 341 341 250 151 194

4.5. GASCHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS

4.5.1. optimalisatie van de splitlessinjectie

4.5.1.1. injectietemperatuur

Het kiezen van de juiste injectietem

injectietemperatuur hoog genoeg

Bovendien geeft een te lage injectietemperatuur aanleiding tot een te trage of onvolledig

verdamping van het staal,

injectietemperatuur van 250°C word

ontwikkeling van een methode voor de analyse van nieuwe componenten

(www.chromacademy.com).

uitgeprobeerd. Vervolgens werden

component) volgende injectietemperaturen uitgetest: 200, 260, 270, 280, 290

Zoals te zien in figuur 4.6. werd alfentanil bij 200°C bijna niet gedetecteerd en lagen de

piekoppervlakten van fentanyl en sufentanil

gegeven worden dat deze temperatuur te laag is voor de volledige verdamping van fentanyl,

sufentanil en alfentanil. Een inj

resulteerde in de hoogste piekoppervlakten.

FIG 4.6. VERGELIJKING VAN DE PIEKOPP

VERSCHILLENDE INJECTIETEMPERATUREN (n = 3)

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

200 °C 250 °C

pie

ko

pp

erv

lak

teGASCHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS

4.5.1. optimalisatie van de splitlessinjectie

Het kiezen van de juiste injectietemperatuur is van belang omdat de

hoog genoeg moet zijn zodat het gehele staal onmiddellijk ve

Bovendien geeft een te lage injectietemperatuur aanleiding tot een te trage of onvolledig

wat zorgt voor “tailing” van de pieken

injectietemperatuur van 250°C wordt vaak als initiële injectietemperatuur


Bijgevolg werd deze injectietemperatuur het eerst

uitgeprobeerd. Vervolgens werden voor de injectie van de stalen (50 ng/µl van elke

ietemperaturen uitgetest: 200, 260, 270, 280, 290

werd alfentanil bij 200°C bijna niet gedetecteerd en lagen de

piekoppervlakten van fentanyl en sufentanil ook beduidend lager. Als reden


. Een injectietemperatuur van 290°C werd gekozen

resulteerde in de hoogste piekoppervlakten.

VERGELIJKING VAN DE PIEKOPPERVLAKTEN VAN DE COMPONENTEN

VERSCHILLENDE INJECTIETEMPERATUREN (n = 3)

C 260 °C 270 °C 280 °C 290 °C 300 °C

injectietemperatuur

injectietemperatuur

35

peratuur is van belang omdat de

onmiddellijk verdampt.

Bovendien geeft een te lage injectietemperatuur aanleiding tot een te trage of onvolledige

(Rood, 1998). Een

e injectietemperatuur gebruikt bij de


Bijgevolg werd deze injectietemperatuur het eerst

voor de injectie van de stalen (50 ng/µl van elke

ietemperaturen uitgetest: 200, 260, 270, 280, 290 en 300 °C.

werd alfentanil bij 200°C bijna niet gedetecteerd en lagen de

Als reden hiervoor kan


peratuur van 290°C werd gekozen omdat deze

PONENTEN BIJ DE

HFB-norfentanyl

fentanyl

sufentanil

alfentanil


Tijdens een pulsed splitless injectie wordt de druk van het dragergas enorm verhoogd

tijdens injectie waarna de druk vermind

scheiding van de componenten.

liner verkort, wat leidt tot een verminderde adsorptie a

en minder tijd voor degradatie van de componenten

analogen de neiging hebben om te blijven kleven

de voorkeur boven splitless injectie. Bovendien bleken de piekoppervlaktes

gederivatiseerde componenten

splitlessinjectie. Bijgevolg werd er in verdere proeven gewerkt met pulsed splitless.

FIG. 4.7. VERGELIJKING PULSED SPLITLESS VERSUS SPLITLESS

4.5.1.3. injectievolume

De keuze van het juiste injectievolume is van belang aangezien het volume van het

staal dat wordt geïnjecteerd een grote invloed zal hebben op de accuraatheid en

reproduceerbaarheid van kwantitatieve analyses. Om

moet het totaal volume van het gas passen in de “inlet liner”. Wanneer dit niet het geval is

dan zal het overtollige gas overlopen in de “septum purge lines” en de “inlet gas supply”

figuur 3.2.a.) Hier ligt de temperatuur veel lager

componenten afgezet zullen worden op de wand

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

HFB-norfentanyl

pie

ko

pp

erv

lak

te



tijdens injectie waarna de druk verminderd wordt tot een ideale gas flow gedurende de

scheiding van de componenten. Een voordeel van pulsed splitless is dat de verblijftijd in de

wat leidt tot een verminderde adsorptie aan de actieve plaatsen in de inj

degradatie van de componenten (Wille, 2008). Aangezien fentanyl en

ing hebben om te blijven kleven in de liner, geniet pulsed splitless injectie

de voorkeur boven splitless injectie. Bovendien bleken de piekoppervlaktes

iseerde componenten na pulsed splitless injectie beduidend hoger te liggen dan na


VERGELIJKING PULSED SPLITLESS VERSUS SPLITLESS INJECTIE ( n = 1)



kwantitatieve analyses. Om kwantitatieve problemen te


dan zal het overtollige gas overlopen in de “septum purge lines” en de “inlet gas supply”

Hier ligt de temperatuur veel lager, waardoor het staal zal recondenseren en de

worden op de wand.

fentanyl sufentanil alfentanil

componenten

pulsed splitless vs splitless

36


erd wordt tot een ideale gas flow gedurende de

Een voordeel van pulsed splitless is dat de verblijftijd in de

an de actieve plaatsen in de injector

. Aangezien fentanyl en

geniet pulsed splitless injectie

de voorkeur boven splitless injectie. Bovendien bleken de piekoppervlaktes van de niet

hoger te liggen dan na


( n = 1)



kwantitatieve problemen te vermijden


dan zal het overtollige gas overlopen in de “septum purge lines” en de “inlet gas supply” (zie

or het staal zal recondenseren en de

pulsed splitless

Splitless

Bij een volgend injectievolume dat te hoog is, zal

terechtkomen. Bijgevolg zullen de componenten die achtergelaten werden tijdens de vorige

injectie terug in de inlet belanden en uiteindelijk terechtkomen op de kolom. Hierdoor zal de

accuraatheid en reproduceerbaarheid verminderen. Wanneer er gebruik gemaakt wordt van

pulsed splitless kan men grotere volumes injecteren aangez

in de inlet liner beperkt blijft (www.chromacademy.com)

Ook het solvent waarin het analyt is opgelost speelt een rol. Tolueen werd gebruikt

als solvent. Tolueen heeft een

innemen in de inlet liner. Hierdoor kunnen er grotere volumes geïnjecteerd worden.

Het injecteren van 1 µL staal werd vergeleken met de injectie van 2 µL staal in pulsed

splitless. De injectie van 2 µL staal gaf ongeveer een verdubbeling van piekoppervlakten,

bijgevolg werd 2 µL als injectievolume gekozen.

FIG. 4.8. VERGELIJKING INJECTIE 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

HFB-norfentanyl

pie

ko

pp

erv

lak

te

volgend injectievolume dat te hoog is, zal het staal opnieuw daar

komen. Bijgevolg zullen de componenten die achtergelaten werden tijdens de vorige

terug in de inlet belanden en uiteindelijk terechtkomen op de kolom. Hierdoor zal de


pulsed splitless kan men grotere volumes injecteren aangezien de expansie van het so

(www.chromacademy.com).


als solvent. Tolueen heeft een vrij klein dampvolume. Bijgevolg zal het gas

Hierdoor kunnen er grotere volumes geïnjecteerd worden.



2 µL als injectievolume gekozen.

VERGELIJKING INJECTIE 1 VERSUS 2 µL ( n = 1)

fentanyl sufentanil alfentanil

injectievolume

37

het staal opnieuw daar

komen. Bijgevolg zullen de componenten die achtergelaten werden tijdens de vorige

terug in de inlet belanden en uiteindelijk terechtkomen op de kolom. Hierdoor zal de


ien de expansie van het solvent


Bijgevolg zal het gas minder plaats

Hierdoor kunnen er grotere volumes geïnjecteerd worden.



alfentanil

1 µL

2 µL

38

4.5.2. optimalisatie van de chromatografische scheiding

De scheiding van een mengsel van fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil

gebeurt op een capillaire kolom. De verdampte stalen bewegen initieel doorheen de kolom

met dezelfde snelheid als het dragergas. Doordat de capillaire kolom bedekt is met een dun

laagje polymeer zullen de componenten op een verschillende manier reageren met de film,

waardoor ze met een verschillende snelheid over de kolom zullen bewegen. De retentie van

de componenten op de kolom zal afhankelijk zijn van hun chemische structuur en fysische

eigenschappen. Het resultaat hiervan is dat iedere component de kolom op een ander

tijdstip zal verlaten en afzonderlijk gedetecteerd zal worden door de massaspectrometer

(Wille, 2008).

4.5.2.1. optimalisatie van het temperatuursprogramma

Het opstellen van een geschikt temperatuursprogramma is een belangrijk onderdeel

bij het ontwikkelen van een methode. Er bestaan twee soorten scheidingen bij de

gaschromatograaf, namelijk isotherme scheiding en temperatuursgeprogrammeerde

scheiding. Een isotherme scheiding wordt gebruikt voor een beperkt aantal componenten.

Wanneer een groot aantal substanties met uiteenlopende kookpunten moet gescheiden

worden, wordt er gebruik gemaakt van temperatuursgeprogrammeerde scheiding. Hierbij

laat men de kolomtemperatuur tijdens de run oplopen. Bijgevolg zullen de componenten

binnen een aanvaardbare tijd elueren. Als starttemperatuur wordt er een temperatuur

gekozen die ongeveer 20°C onder het kookpunt van het solvent ligt. Het kookpunt van

tolueen is 110°C, vandaar dat er als starttemperatuur werd gekozen voor 90 °C.

Vijf verschillende temperatuursprogramma werden uitgetest (zie 3.9.4.1.). Bij het

eerste temperatuursprogramma waren fentanyl en sufentanil niet basislijn gescheiden,

bijgevolg werd er een tweede temperatuursprogramma ontwikkeld.

Bij het tweede temperatuursprogramma waren fentanyl en sufentanil wel basislijn

gescheiden maar wanneer het chromatogram gedetailleerd bekeken werd, viel het op dat de

piek van norfentanyl niet symmetrisch is en een knik vertoont.

39

Bijgevolg werd er een derde en vierde temperatuursprogramma ontwikkeld. Beide

zorgden voor een lichte verbetering van de pieksymmetrie van norfentanyl maar de knik

blijft aanwezig.

De duur van een run speelt ook een rol. Hoe korter de run hoe meer analyses per uur

gedaan kunnen worden. Vandaar dat een vijfde temperatuursprogramma werd opgesteld

met een run die slechts 8.20 minuten duurt. Dit temperatuursprogramma gaf de slechtste

resultaten. De piekoppervlakten lagen veel lager en alfentanil werd niet gedetecteerd.

Het derde temperatuursprogramma werd uiteindelijk gekozen, aangezien hij een kortere run

had dan het vierde temperatuursprogramma. Hierbij is de initiële kolomtemperatuur 90 °C

gedurende 1 minuut. Met een snelheid van 50°C/min stijgt de temperatuur tot 290 °C, dit

wordt aangehouden gedurende 3 minuten om tenslotte de temperatuur te laten stijgen met

10°C / min tot 300°C. Deze 300°C wordt 3 minuten aangehouden.

4.6 BEPALEN VAN HET EXTRACTIERENDEMENT

Het extractierendement kan berekend worden als het percentage van de

analytrespons na vaste fase extractie (SPE) vergeleken met die van stalen die na de extractie

belast werden met de standaarden van fentanyl, norfentanyl, sufentanil en alfentanil. Het

extractierendement wordt bepaald bij een hoge en een lage concentratie (Peters & Maurer,

2002). De extractierendementen die bekomen werden zijn samen met de standaarddeviatie

weergegeven in tabel 4.2. De extractierendementen zijn gelegen rond de 90%. De waarden

tonen aan dat deze extractiemethode geschikt is voor de isolatie van fentanyl en analogen

uit plasma.

TABEL 4.3. EXTRACTIERENDEMENT VAN NORFENTANYL, FENTANYL, SUFENTANIL EN

ALFENTANIL IN PLASMA GEBRUIK MAKEND VAN STRATA SCX ALS SPE-KOLOM (n = 3)

Component extractierendement (%) (SD)

5 ng 50 ng

Norfentanyl 98 (6.4) 85 (14.9)

Fentanyl 92 (8.6) 96 (9.6)

Sufentanil 87 (9.5) 89 (8.2)

Alfentanil 90 (13.5) 94 (17.8)

40

4.7. LINEARITEIT

De keuze van een geschikt calibratiemodel is noodzakelijk voor een betrouwbare

kwantificatie. Hiervoor moet de relatie tussen de concentratie van het analyt in het staal en

de corresponderende detectorrespons onderzocht worden (Peters & Maurer, 2002). Dit kan

gedaan worden door stalen te belasten en de resulterende ratio’s uit te zetten in functie van

de verschillende concentraties.

y = 0,0281x - 0,0127R² = 0,9982

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 10 20 30 40 50 60

rati

o f

en

tan

yl/

fe

nta

ny

l -D

5

concentratie (ng/mL)

calibratiecurve fentanyl

Reeks1

Lineair (Reeks1)

y = 0,035x + 0,0469R² = 0,9926

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 10 20 30 40 50 60rati

o n

orf

en

tan

yl/

no

rfe

nta

ny

l -

D5


calibratiecurve norfentanyl

Reeks1

Lineair (Reeks1)

41

FIG. 4.9. CALIBRATIECURVES VAN FENTANYL, NORFENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL

Uit figuur 4.9. kan afgeleid worden dat er voor fentanyl, norfentanyl, sufentanil en

alfentanil een lineair verband bestaat tussen de concentratie en de piekoppervlakte. De

correlatiecoëfficiënten bedragen respectievelijk 0.9982, 0.9926, 0.9942 en 0.9951. Bijgevolg

kunnen deze curves gebruikt worden voor kwantitatieve concentratiebepalingen van een

onbekend staal. Ook kan er een besluit genomen worden over de laagst detecteerbare

concentraties. Voor alle vier de componenten is dit 5 ng/ml.

y = 0,0598x - 0,0807R² = 0,9942

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60

rati

o s

ufe

nta

nil

/fe

nta

ny

l-D

5


calibratiecurve sufentanil

Reeks1

Lineair (Reeks1)

y = 0,0312x - 0,0334R² = 0,9951

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 10 20 30 40 50 60

rati

o a

lfe

nta

nil

/fe

nta

ny

l -D

5


calibratiecurve alfentanil

Reeks1

Lineair (Reeks1)

42

4.8. STABILITEIT

Het is belangrijk om de stabiliteit te testen voor een betrouwbare kwantificatie. De

stabiliteit van de componenten (50 ng/ml) in bereide stalen werd getest wanneer ze bij

kamertemperatuur in de autosampler stonden. De stabiliteit kan getest worden door de

piekoppervlakten te vergelijken voor en nadat de bereide stalen gedurende een zekere tijd

in de autosampler stonden. Door de ratio te nemen van stabiliteitsstaal op controlestaal

(tijdstip 0) bleek dat de componenten in de bereide stalen zeker 15 uur stabiel zijn (figuur

4.10.)

FIG 4.10. STABILITEIT VAN FENTANYL, HFB-NORFENTANYL, SUFENTANIL EN ALFENTANIL IN

BEREIDE STALEN

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

sta

bil

ite

it (

pro

cen

t)

uur

stabiliteit

HFB-norfentanyl

fentanyl

sufentanil

alfentanil

43

5. ALGEMEEN BESLUIT

Fentanyl, sufentanil en alfentanil zijn opioïden die behoren tot de 4-

propanilidopiperidine klasse van narcotische analgetica. Ze zijn potenter dan morfine,

hebben een kortere werkingsduur en veroorzaken minder neveneffecten. Als gevolg hiervan

worden deze geneesmiddelen het meest gebruikt als anestheticum in de operatiekamer. De

letale concentraties zijn zeer laag. Fentanyl en analogen worden al sinds midden jaren

zeventig van de vorige eeuw misbruikt. Ze veroorzaken een roes die begint binnen 1 à 2

minuten en die vergelijkbaar is met die door heroïne. Een GC-MS methode werd ontwikkeld

om lage concentraties van fentanyl, zijn metaboliet norfentanyl, sufentanil en alfentanil te

kunnen bepalen.

Plasma bevat interferende componenten zoals eiwitten en zouten waardoor het van

belang is dat de componenten eerst uit het staal worden geïsoleerd. Hiervoor werd gebruik

gemaakt van vaste fase extractie. Voor het bekomen van een optimale extractie werd een

geschikt SPE-kolom geselecteerd. Strata X, Strata XC en Strata SCX werden uitgetest. Strata

XC en Strata SCX zijn sterke kationuitwisselaars. Het verschil tussen beiden is dat strata XC

een “mixed mode” is, dit wil zeggen dat hij de eigenschappen van de kationuitwisselaars

combineert met een styreen-divinylbenzeenpolymeer, die ook hydrofobe en aromatische

interacties vertoont. Strata X is een reversed phase SPE kolom. Deze kolom weerhoudt

componenten op basis van apolaire interacties. De stationaire fase is hierbij selectief voor

apolaire componenten. Strata X gaf aanleiding tot troebele extracten en werd buiten

beschouwing gelaten. De piekoppervlakten van de verschillende componenten bekomen na

extractie met Strata XC en Strata SCX, werden vergeleken. Strata XC en Strata SCX gaven

vergelijkbare resultaten maar de piekoppervlakten waren bij Strata SCX lichtjes hoger. Na

herhaalde proeven bleek SPE gebruik makend van Strata XC als kolom weinig

reproduceerbaar. Bijgevolg werd er gekozen voor Strata SCX als SPE-kolom. De

extractierendementen van zowel de hoge concentratie (50 ng/ml) als de lage concentratie

(5 ng/ml) lagen rond de 90 %. Hieruit kan besloten worden dat de extractiemethode en dus

ook de SPE-kolom geschikt is voor de isolatie van fentanyl en analogen uit plasma.

44

Door de beperkte vluchtigheid en de polariteit van norfentanyl kan deze component

op zichzelf niet bepaald worden via GC-MS. Dit kan opgelost worden door norfentanyl te

derivatiseren. Het optimale reagens voor deze derivatisatie werd bepaald. Er werd gekozen

voor HFBI aangezien deze zorgde voor hogere piekoppervlaktes van fentanyl, sufentanil en

alfentanil.

Voor de kwantificatie van fentanyl en analogen moest er een SIM-methode

ontwikkeld worden. Hiervoor werden eerst de massaspectra bepaald door te detecteren in

de scan-modus. Hieruit werden de “quantifiers” en “qualifiers” gekozen. Voor fentanyl werd

als “quantifier” het fragmention met een m/z-waarde van 245 gekozen. Als “qualifier” werd

het fragmention met een m/z-waarde van 146 gekozen. De “qualifiers” van norfentanyl,

sufentanil en alfentanil waren de fragmentionen met een m/z-waarde van 372, 289 en 289

respectievelijk. De “qualifier(s)” van norfentanyl was het ion met een m/z – waarde van 428,

die van sufentanil 140 en 290 en die van alfentanil 140 en 222.

Als injectietechniek om het staal op de capillaire kolom te brengen werd gebruik

gemaakt van een splitlessinjectie. Deze splitlessinjectie werd geoptimaliseerd op vlak van

injectietemperatuur, injectiedruk en injectievolume. De optimale injectietemperatuur was

290°C, er werd gebruik gemaakt van pulsed splitless injectie en een injectievolume van 2 µL

bleek het meest geschikt.

Ook de chromatografische scheiding werd geoptimaliseerd door verschillende

temperatuursprogramma’s op te stellen en deze met elkaar te vergelijken. Bij het gekozen

temperatuursprogramma was de initiële kolomtemperatuur 90 °C gedurende 1 minuut, die

steeg met een snelheid van 50°C/min tot 290 °C. De temperatuur van 290 °C werd

aangehouden gedurende 3 minuten om deze tenslotte te laten stijgen met 10°C / min tot

300°C. De temparatuur van 300°C werd 3 minuten aangehouden.

45

De finale methode werd gevalideerd op lineariteit en stabiliteit. Voor alle vier de

componenten bestond er een lineair verband tussen de concentratie en de piekoppervlakte.

De laagst detecteerbare concentratie bedroeg voor alle vier de componenten 5ng/ml staal.

De stalen blijven gedurende 15 uur stabiel in de autosampler.

Er is een volledige methode ontwikkeld van staalvoorbereiding tot

gaschromatografische analyse. Aangezien er al een aantal parameters van de

methodevalidatie uitgevoerd zijn met een gunstig resultaat kan men vermoeden dat de

methode bruikbaar is. Om dit zeker te zijn moeten nog een aantal parameters geëvalueerd

worden zoals selectiviteit en accuraatheid. De laagst detecteerbare concentratie van de

componenten is 5 ng/ml. De letale concentraties van fentanyl en sufentanil liggen echter

mogelijk lager. Als oplossing hiervoor zou men eventueel gebruik kunnen maken van

chemische ionisatie in plaats van electron impact ionisatie.

Tot slot moet de methode uitgetest worden op een post – mortem bloedstaal.

Hierdoor kan geëvalueerd worden of de methode bruikbaar is voor de analyse van reële

stalen.

46

6. LITERATUURLIJST

Bagheri, H.; Es-haghi, A.; Khalilian, F.; Rouini, M.-R. (2007). Determination of fentanyl in human plasma by head-space solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 43, 1763 – 1768.

Barrueto, F. Jr; Howland, M.A.; Hoffman, R.S.; Nelson L.S. (2004). The fentanyl tea bag. Vet

Hum Toxicol., Vol. 46 (1), 30.

Beers, R.; Camporesi, E. (2004). Remifentanil update: clinical science and utility. CNS drugs, vol. 18 (15), 1085 – 1104.

Björkman, S.; Stanski, D. (1988). Simultaneous determination of fentanyl and alfentanil in rat tissues by capillary column gas chromatography. J Chromatogr., vol. 433, 95 – 104.

Chrubasik, S.; Chrubasik, J.; Friedrich G. (1994). Clinical use of alfentanil. Anaesthesiol

Reanim., Vol. 19 (3), 60 – 66.

Coopman, V.; Cordonnier, J.; Pien, K.; Van Varenbergh, D. (2007). LC-MS/MS analysis of fentanyl and norfentanyl in a fatality due to application of multiple Durogesic® transdermal therapeutic systems. J. Forensic Sci., vol. 169, 223 – 227.

Dale, O.; Hjortkjaer, R.; Kharasch, E. (2002). Nasal administration of opioids for pain management in adults. Acta Anaesthesiol. Scand., vol. 46 (7), 759 – 770.

Edinboro, L.E.; Poklis A.; Trautman D (1997). Fatal fentanyl intoxication following excessive transdermal application. J Forensic Sci., Vol. 42, 741 – 743.

Fryirsa, B.; Woodhouse, A.; Huang, J. L.; Dawson, M.; Mather, L. E. (1997). Determination of subnanogram concentrations of fentanyl in plasma by gas chromatography- mass spectrometry: comparison with standard radioimmunoassay. J. Chromatogr. B, vol. 688, 79 – 85.

Gillespie, T. J.; Gandolfi, A. J.; Maiorino, R. M.; Vaughan, R. W. (1981). Gas chromatographic determination of fentanyl and its analogues in human plasma. J. Anal. Tox., vol. 5, 133 – 137.

47

Grobosch, T.; Weniger, St.; Lampe, D. (2007). Fentanyl analytics in a case of fatal misuse of transdermal fentanyl. T + K, vol. 74 (1), 59 – 63. Gupta, P.K.; Manral, L.; Ganesan, K.; Dubey, K. D. (2007). Use of single-drop microextraction for determination of fentanyl in water samples. J. Anal. Bioanal. Chem., vol. 388, 579 – 583.

http://www.sigmaaldrich.com/graphics/object/4600/4538.pdf

http://www.chromacademy.com

http://www.toxicologie.ugent.be

Huynh, N.-H.; Tyrefors, N.; Ekman, L.; Johansson, M. (2005). Determination of fentanyl in human plasma and fentanyl and norfentanyl in human urine using LC-MS/MS. J. Pharm.

Biomed. Anal., vol. 37, 1095 – 1100.

Kintz, P.; Villain, M.; Dumestre, V.; Cirimele, V. (2005). Evidence of addiction by anesthesiologists as documented by hair analysis. J. Forensic Sci. Int., vol. 153, 81 – 84.

Kuhlman, J. J. Jr; McCaulley, R.;, Valouch, T. J.;, Behonick, G. S. (2003). Fentanyl use, misuse, and abuse: a summary of 23 postmortem cases. J Anal Toxicol., Vol. 27 (7), 499 – 504.

Kumar, K.; Ballantyne, J. A.; Baker A.B. (1996). A sensitive assay for the simultaneous measurement of alfentanil and fentanyl in plasma. J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 14, 667 – 673.

Labroo, RB.; Kharasch, E. D. (1994). Gas chromatographic-mass spectrometric analysis of alfentanil metabolites. Application to human liver microsomal alfentanil biotransformation.

Hitchcock annual. Vol. 660 (1), 85 – 94.

Labroo, R. B.; Paine, M. F.; Thummel, K. E.; Kharasch, E. D. (1997). Fentanyl metabolism by human hepatic and intestinal cytochrome P 450 3A4: implications for interindividual variability in disposition, efficacy, and drug interactions. Drug Metab. Dispos., 25 (9), 1072 – 1080.

48

Lambropoulos, J.; Spanos, G.A.; Lazaridis, N. V. (2000). Development and validation of an HPLC assay for fentanyl, alfentanil, and sufentanil in swab samples. J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 23, 421 – 428.

Lin S.-N.; Wang, T.-P. F.; Caprioli, R. M.; Mo, B. P. N. (1981). Determination of plasma fentanyl by GC- mass spectrometry and pharmacokinetic analysis. J. Pharm. Sci., vol. 70 (11),1276 – 1278.

Marquardt, K. A.; Tharratt R. S. (1994). Inhalation abuse of fentanyl patch. J Toxicol Clin

Toxicol., Vol. 32 (1), 75 – 80.

Meuldermans, W.; Hurkmans, R.; Heykants, J. (1982). Plasma protein binding and distribution of fentanyl, sufentanil, alfentanil and lolfentanil in blood. Arch Int Pharmacodyn

Ther., vol. 257 (1), 4 – 19.

Moore, J.M.; Allen, A.C.; Cooper, D.A. (1986). Determination of fentanyl and related compounds by capillary gas chromatography with electron capture detection. Anal Chem, Vol. 58, 165-166.

Moore, C.; Marinetti, L.; Coulter, C.; Crompton, K. (2007). Analysis of pain management drugs, specifically fentanyl, in hair: application to forensic specimens. J. Forensic Sci. Int., vol. 176(1), 47 – 50.

Palleschi, L.; Lucentini, L.; Ferretti, E.; Anastasi, F.; Amoroso, M.; Draisci, G. (2003). Quantitative determination of sufentanil in human plasma by liquid chromatographytandem mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 32, 329 – 336.

Paradis, C.; Dufresne, C.; Bolon, M.; Boulieu, R. (2002). Solid – phase microextraction of human plasma samples for determination of sufentanil by gas chromatography – mass spectrometry. Ther Drug Monit., Vol. 24, 768 – 774.

Patel, S.; Spencer, C. (1996). Remifentanil. Drugs, vol. 52 (3), 417 – 428.

Peters, F.; Maurer H. (2002). Bioanalytical method validation and its implications for forensic and clinical toxicology – A review. Accred Qual Assur.,vol. 7, 441 – 449.

49

Phipps, J.A.; Sabourin, M.A.; Buckingham, W.; Strunin, L. (1983). Detection of pictogram concentrations of fentanyl in plasma by gas-liquid chromatography. J Chromatogr., Vol. 272, 392 – 395.

Poklis, A. (1995). Fentanyl: a review for clinical and analytical toxicologists J Toxicol Clin

Toxicol., Vol 33 (5), 439 – 447.

Poklis, A.; Backer, R. (2004). Urine concentrations of fentanyl and norfentanyl during Application of Duragesic® transdermal patches. J. Anal. Tox., vol. 28, 422 – 425.

Rood, D. (1999). A practical guide to the care, maintenance and troubleshooting of capillary gaschromatographic systems. Wiley – VCH, Weinheim, Germany.

Ruangyuttikarn, W.; Law, M.; Rollins, D.; Moody, D. (1990). Detection of fentanyl and its analogs by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Anal Toxicol., vol. 14 (3), 160 – 4.

Schüttler, J.; White, P. (1984). Optimization of the radioimmunoassay for measuring fentanil and alfentanil in human serum. Anesthesiology, vol. 61 (3), 315 – 320. Schwartz, J. G.; Garriott, J. C.; Somerset, J. S.; Igler, E. J.; Rodriguez, R.; Orr M. D. (1994). Measurements of fentanyl and sufentanil in blood and urine after surgical application. Implication in detection of abuse. Am J Forensic Med Pathol., Vol. 15 (3), 236 – 241.

Servin, F.; Billard, V. (2008). Remifentanyl and other opioids. Handb Exp Pharmacol., vol. 182, 283 – 311.

Shou, W. Z.; Jiang, X.; Beato, B. D.; Naidong, W. (2001). A highly automated 96- well solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the determination of fentanyl in human plasma. Rapid commun. Mass Spectrom., 15, 466 – 476.

Stanley, T. ( 2005). Fentanyl. J Pain Symptom Manage., Vol. 29 (5 suppl), s67 – 71.

Stanski, D. R.; Hug, C. C. Jr. (1982). Alfentanil--a kinetically predictable narcotic analgesic.

Anesthesiology, Vol. 57 (6), 435 – 8.

50

Sutlovic, D. ; Definis – Gojanovic, M. (2007). Suicide by fentanyl. Arh Hig Rada Tokisol, Vol. 58, 317 – 321.

Szeitz, A.; Riggs, K. W.; Harvey- Clark, C. (1996). Sensitive and selective assay for fentanyl using gas chromatography with mass selective detection. J. Chromatogr. B, 675, 33 – 42.

Thomas, S.; Winecker, R.; Pestaner, J. P. (2008). Unusual fentanyl patch administration. The

Am J Forensic Med Pathol., Vol. 29 (2), 162 – 163.

Thurman, E. M. and Mills, M. S. (1998). Solid Phase Extraction, Principles and Practice / Volume 147 in Chemical Analysis: A series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications, Wiley-Interscience, New York, pg. 1 – 4.

Tobin, T.; Tai, H.; Tai, C.; Houtz, P.; Dai, M.; Woods, W.; Yang, J.; Weckman, T.; Chang, S.; Blake, J. et al. (1988). Immunoassay detection of drugs in racing horses. IV. Detection of fentanyl and its congeners in equine blood and urine by a one step ELISA assay. Res Commun

Cem Pathol Pharmacol., vol. 60 (1), 97 – 115. Valaer, A. K.; Huber, T.; Andurkar , SV.; Clark, CR; DeRuiter, J. (1997). Development of a gas chromatographic-mass spectrometric drug screening method for the N-dealkylated metabolites of fentanyl, sufentanil, and alfentanil. J Chromatogr Sci., Vol. 35 (10), 461 – 46.

Van Haecke, S. (2008). Masterproef Ugent: gaschromatografische bepaling van fentanyl in gerechtelijke post – mortem stalen.

Van Nimmen, N. F. J.; Veulemans, H. A. F. (2004). Development and validation of a highly sensitive gas chromatographic- mass spectrometric screening method for the simultaneous determination of nanogram levels of fentanyl, sufentanil and alfentanil in air and surface contamination wipes. J. Chromatogr. B, vol. 1035, 249 – 259.

Van Nimmen, N. F. J.; Veulemans, H. A. F. (2006). Validated GC- MS analysis for the determination of residual fentanyl in applied Durogesic® reservoir and Durogesic® D- Trans® matrix transdermal fentanyl patches. J. Chromatogr. B, vol. 846, 264 – 272.

51

Van Rooy, H. H.; Vermeulen, N. P. E.; Bovilli J. G. (1981). The assay of fentanyl and its metabolites in plasma of patients using gas chromatography with alkali flame ionisation detection and gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr., vol. 223, 85 – 93.

Varian, Handbook of sorbent extraction (1998).

Willens, J. S..; Myslinski, N. R. (1993). Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and clinical uses of fentanyl, sufentanil, and alfentanil. Heart Lung, Vol. 22 (3), 239 – 251.

Watts, V.W.; Caplan Y.H. (1988).Determination of fentanyl in whole blood at subnanogram concentrations by dual capillary column gas chromatography with nitrogen sensitive detectors and gas chromatography/ mass spectrometry. J Anal Toxicol, Vol. 12 (5), 246 – 254.

Wax, P. M.; Becker, C. E.; Curry, S. C. (2003). Unexpected “Gas” Casualties in Moscow: A Medical Toxicology Perspective. Ann Emerg Med., vol. 41, 700-705.

Wille, S. (2008). Doctoraatsthesis Ugent: Quantitative analysis of new generation antidepressants using gas chromatography – mass spectrometry. Applications in clinical and forensic toxicology.

Woestenborghs, R.; Stanski, D.; Scott, J.; Heykants, J. (1987). Assay methods for fentanyl in serum: gas – liquid chromatography versus radioimmunoassay. Anesthesiology, vol. 67 (1), 85 – 90. Zhang, H.; Zhang, J.; Streisand, J. ( 2002). Oral mucosal drug delivery: clinical pharmacokinetics and therapeutic applications. Clin. Pharmacokinet., vol. 41 (9), 661 – 680.

Zöllner, C.; Schäfer, M. (2008). Opioide in der Anästhesie. Anaesthesist, Vol. 57 (7), 729 – 740.

BEPALING VAN FENTANYL EN ANALOGEN IN BIOLOGISCHE...

Documents

Transcript of BEPALING VAN FENTANYL EN ANALOGEN IN BIOLOGISCHE...