Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van herpesvirus en Mycoplasma sp. infecties.

door

Stephan GÖBEL

Promotoren: Prof. Dr. An Martel Onderzoek in het kader

Prof. Dr. Frank Pasmans van de masterproef

© 2014 Stephan Göbel

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking

tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de

inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt of aanleiding kan geven tot inbreuken op

de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud

van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie

vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van herpesvirus en Mycoplasma sp. infecties.

door

Stephan GÖBEL

Promotoren: Prof. Dr. An Martel Onderzoek in het kader

Prof. Dr. Frank Pasmans van de masterproef

© 2014 Stephan Göbel

VOORWOORD

Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. A. Martel willen bedanken voor de begeleiding tijdens

het schrijven van deze masterproef. Ondanks haar lange afwezigheid van afgelopen winter

verliep de communicatie via e-mail prima. Ook zou ik graag Connie Adriaensen hartelijk

willen bedanken voor al het werk dat zij in de analyse van de stalen heeft gestoken. Zoveel

stalen analyseren is een hele klus! Verder wil ik Drs. J. van der Sluis en zijn assistent Rob

van der Bijl bedanken voor het nemen van een groot aantal stalen. Ook gaat mijn dank uit

naar co-promotor Prof. Dr. F. Pasmans voor het nalezen van deze masterproef. Dan als

laatste wil ik Sandra Göbel bedanken voor de laatste keer nalezen van mijn masterproef.

Zonder al deze mensen was het uitvoeren van een dergelijk onderzoek in het afstudeerjaar

van de opleiding diergeneeskunde niet mogelijk. Verder wens ik U veel leesplezier in deze

masterproef toe.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING………………………………………………………………………….……….. p. 1

INLEIDING………………………………………………………………………………...………... p. 2

LITERATUURSTUDIE……………………………………………………………………………... p. 2

1. Herpesvirose bij duiven…………………………………………………………………. p. 2

1.1. Etiologie………………………………………………………………………………… p. 2

1.1.1. Oorzakelijk agens…………………………………………………………............... p. 2

1.1.2. Eigenschappen van het PHV-1……………..………………………………………. p. 3

1.1.3. Gastheerspecificiteit………………………………………………………..………... p. 4

1.2. Epidemiologie…………………………………………………………………………… p. 5

1.3. Pathogenese…………………………………………………………………..………... p. 6

1.4. Symptomen…………………………………………………………………....………... p. 8

1.5. Letsels………………………………………………………………………….………... p. 10

1.6. Diagnose………………………………………………………………………………… p. 11

1.7. Differentiaaldiagnose…………………………………………………………………… p. 13

1.8. Therapie…………………………………………………………………………………. p. 13

1.9. Prognose………………………………………………………………………………… p. 15

1.10. Preventie……………………………………………………………………..………... p. 15

2. Mycoplasmose bij duiven………………………………………………………………… p. 16

2.1. Etiologie………………………………………………………………………..………... p. 16

2.1.1. Oorzakelijk agens…………………………………………………………..………... p. 16

2.1.2. Eigenschappen van Mycoplasma sp……………………………………..………... p. 16

2.1.3. Gastheerspecificiteit………………………………………………………..………... p. 17

2.2. Epidemiologie…………………………………………………………………………… p. 18

2.3. Pathogenese…………………………………………………………………..………... p. 19

2.4. Symptomen……………………………………………………………………………… p. 20

2.5. Letsels………………………………………………………………………….………... p. 21

2.6. Diagnose………………………………………………………………………....……… p. 21

2.7. Differentiaaldiagnose………………………………………………………................ p. 23

2.8. Therapie…………………………………………………………………………………. p. 23

2.9. Preventie en controle…………………………………………………………………... p. 24

ONDERZOEK……………………………………………………………………………..………... p. 25

1. Materialen en methoden………………………………………………………………… p. 25

1.1. Staalname………………………..……………………………………………………….. p. 25

1.2. DNA-bereiding……………………………………………………………………………. p. 25

1.3. PCR-techniek…………………………………………………………………………….. p. 27

1.4. Gelelektroforese…………………………………………………………………………. p. 29

1.5. Sequenering……………………………………………………………………………… p. 31

2. Resultaten………………………………………………………………………………… p. 32

3. Discussie…………………………………………………………………………………. p. 38

4. Conclusie…………………………………………………………………………………. p. 41

REFERENTIELIJST………………………………………………………………………………... p. 43

BIJLAGE I: Tabellering van de stalen……………………………………………………………. p. 46

1

SAMENVATTING

In deze masterproef wordt verslag gedaan van een onderzoek naar de prevalentie van

herpes en mycoplasma’s in drie provincies van Nederland. Het doel van dit onderzoek is om

een beter inzicht te krijgen in het voorkomen van het duivenherpesvirus en de verschillende

soorten mycoplasma’s in Nederland. Een ander doel van dit onderzoek is om na te gaan of

het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s een rol speelt bij het ontstaan van

ademhalingsproblemen bij duiven. Na een literatuurstudie over beide organismen worden in

deze masterproef de onderzoeksresultaten gepubliceerd. Uit het onderzoek blijkt dat de

prevalentie van zowel herpes als mycoplasma’s bij duiven in de drie deelnemende provincies

van het onderzoek veel lager zijn dan de prevalenties die voor beide organismen in de

literatuur beschreven zijn. Ook is er een vermoeden van een seizoensgebonden uitscheiding

van zowel het PHV-1 als van Mycoplasma sp. en blijkt uit het onderzoek dat de verhoudingen

in voorkomen van de verschillende soorten mycoplasma’s in de drie deelnemende provincies

sterk afwijken van de percentages die in de literatuur beschreven worden. Verder kan er uit

de gegevens, die voorvloeien uit dit onderzoek, niet opgemaakt worden dat het gezamenlijk

voorkomen van PHV-1 en mycoplasma’s invloed heeft op het ontstaan van

ademhalingsstoornissen bij duiven en bijgevolg schadelijk kan voor de gezondheid van de

duif.

Keywords: duiven-herpes-mycoplasma’s-prevalentie-ademhalingsstoornissen

2

INLEIDING

Het herpesvirus en mycoplasma’s zijn twee veel voorkomende agentia bij duiven. De laatste

jaren zijn uitbraken van herpesvirose bij postduiven een vaak gezien verschijnsel in België en

Nederland. Vooral jonge duiven zijn het slachtoffer van deze ziekte. Dit kan zijn doordat zij

sterven als gevolg van een klinische herpesvirose, maar ook door een verminderde

gezondheid van de jongen die ze een achterstand geeft in hun ontwikkeling en oriëntatie in

de omgeving van het hok. Het gevolg hiervan is dat er veel meer duiven wegblijven bij het

opleren en op de eerste wedvluchten, omdat zij simpelweg ervaring te kort komen. Ook

sluimerende infecties van herpesvirose zijn de laatste jaren meer en meer de oorzaak

geworden van minder goede prestaties op bepaalde hokken.

In het verleden is nog maar weinig onderzoek gedaan naar de rol van mycoplasma’s in de

duivensport. Het is bekend dat klinische mycoplasmose bij duiven zelden of nooit voorkomt.

Maar over de vraag of mycoplasma’s een rol van betekenis kunnen spelen in bijvoorbeeld het

voorkomen van klinische herpesvirose is weinig tot niets bekend.

Dit onderzoek heeft als doel meer te weten te komen over de prevalentie van zowel het

herpesvirus als mycoplasma’s in de provincies Zuid-Holland, Noord-Holland en Utrecht van

Nederland. Daarnaast is het doel om een relatie te vinden tussen het herpesvirus en

Mycoplasma sp., door na te gaan welke duiven met ademhalingsstoornissen drager zijn van

het herpesvirus, welke duiven met ademhalingsstoornissen drager zijn van mycoplasma’s en

welke duiven drager zijn van beide agentia.

LITERATUURSTUDIE

1. HERPESVIROSE BIJ DUIVEN

Vroeger kende deze ziekte een groot aantal synoniemen. Zo werd herpesvirose bij duiven

kort na de ontdekking door Smadel et. al. in 1945 ook wel de ziekte van ‘Smadel’ genoemd.

Maar ook benamingen als ‘Infectieuze Coryza’, ‘Intranucleair Inclusion Disease’ en ‘Inclusion

Body Disease’ werden in het verleden aan herpesvirusinfecties bij duiven toegekend3.

1.1. ETIOLOGIE

1.1.1. Oorzakelijk agens

Het oorzakelijk agens van de ziekte ‘herpesvirose’ bij duiven is een virus dat behoort tot de

familie van de Herpesviridae. Het virus wordt tegenwoordig in de literatuur vaak beschreven

als ‘pigeon herpesvirus 1’, oftewel PHV-11,2

. Het PHV-1 is verwant aan de herpesvirussen

3

van valken, uilen, oehoe’s en papegaaien en het behoort samen met het herpesvirus van de

aalscholver tot groep A van de aviare herpesvirussen1,3

.

1.1.2. Eigenschappen van PHV-1

PHV-1 is morfologisch gelijkwaardig aan alle andere herpesvirussen. Ook de voornaamste

physico-chemische eigenschappen van het PHV-1 zijn in overeenstemming met de physico-

chemische eigenschappen van andere herpesvirussen1. De diameter van het virus en zijn

envelop varieert van 120-200 nanometer. Het virion heeft een icosahedraal nucleokapsied

dat bestaat uit 162 holle langwerpige kapsomeren. De diameter van dit icosahedrale

nucleokapsied varieert van 90 tot 100 nanometer2,3,4

. De envelop die om het virion heen zit is

een lipoproteïne-omhulsel en bevat antigeen materiaal van het virus maar ook van de cel die

Figuur 2: Verdere fylogenetische onderverdeling van de α-herpesvirinae tot aan de aviare herpesvirussen (uit Mc Geoch et al., 2006)

Figuur 1: Vereenvoudige fylogenetische stamboom met onderverdeling van de herpesvirussen die bij gewervelde dieren voorkomen. De stippenlijn geeft een hogere onzekerheid in de evolutie aan (uit Davison A.J., 2002)

4

het virus geïnfecteerd heeft2,3

. Saik et al. (1985) stelde bij het bestuderen van het duiven

herpesvirus in zijn gastheer vast dat, net als bij sommige humane herpesvirussen, er bij een

infectie met PHV-1 af en toe virions zonder envelop terug te vinden zijn2.

Serologisch gezien verschilt PHV-1 van herpesvirussen van papegaaiachtigen en van andere

diersoorten. Als men de antigenische eigenschappen van de verschillende isolaten, die men

in de loop der tijd bij duiven heeft gevonden met elkaar vergelijkt, komt men tot de conclusie

dat alle isolaten tot hetzelfde antigenische type van het herpesvirus behoren, namelijk het

PHV-15,6

. Volgens sommige auteurs is het PHV-1 niet in staat tot het agglutineren van rode

bloedcellen2,3

.

Er zijn een aantal omstandigheden waarbij het PHV-1 niet stabiel blijft. Zo blijkt PHV-1

gevoelig te zijn aan ether en chloroform3,4

. Ook is het PHV-1 labiel bij een pH van 4 of lager

en wordt de replicatie van het virus geinhibeerd door de aanwezigheid van gehalogeneerde

deoxyuridines. De infectiviteit van het PHV-1 wordt totaal vernietigd als het virus gedurende

30 minuten aan een temperatuur van 56ºC blootgesteld wordt. Bij lagere temperaturen blijkt

het virus stabieler te zijn dan de andere virussen van groep A van de aviaire herpesvirussen.

Zo zou de halfwaardetijd van PHV-1 in een celcultuur bij 37ºC ongeveer 15 uur bedragen2,4

.

Over de stabiliteit van PHV-1 in de buitenwereld is tot op heden nog weinig bekend3.

Het in vitro kweken van PHV-1 kan men het beste doen in geëmbryoneerde eieren. PHV-1

groeit het best in de fibroblasten van een kippenembryo, maar ook in niercellen van het

kippenembryo en in niercellen van een volwassen duif kan het PHV-1 opgekweekt

worden2,4,6

. Het virus groeit het best op de chorio-allantoïdale membraan waar dan ook de

fijnste haarden van virusreplicatie terug te vinden zijn3,4

.

1.1.3. Gastheerspecificiteit

PHV-1-infecties worden veruit het meest bij duiven vastgesteld. Duiven zijn dan ook de

natuurlijke gastheer voor dit virus1, maar duiven zijn zeker niet de enige gastheer waarvoor

PHV-1 pathogeen is. Zo stelde Vindevogel et al. in 1977 al vast. Zij bedachten een proef

waarbij de pathogeniciteit van het PHV-1 op celculturen van verschillende soorten vogels en

van een aantal zoogdieren werd getest. Met deze werd proef dus enkel de gevoeligheid van

bepaalde celculturen voor PHV-1 nagegaan en niet de gevoeligheid van de desbetreffende

diersoort voor het PHV-17.

Uit de proef bleek dat PHV-1 cytopathogeen is voor de meeste celculturen die afkomstig zijn

van vogels. Verder bleek ook dat de meeste celculturen afkomstig van zoogdieren niet

gevoelig zijn aan PHV-1. Dit is met uitzondering van de BHK (‘baby hamster kidney’) cellijn.

De gevoeligheid van deze cellijn werd aangetoond door de morfologische veranderingen van

de celcultuur en ook het verschijnen van PHV-1-specifiek antigeen materiaal in de celcultuur.

Ook werden er bij deze cellijn verhoogde virustiters vastgesteld7.

5

Eerder in 1970 voerde Cornwell et al. ook al een experiment uit waarbij de infectiviteit van

PHV-1 voor duiven en voor kuikens werd getest. Uit dit experiment bleek dat gebruikte

stammen van het PHV-1 pathogeen waren voor voornamelijk jonge duiven en niet voor

kuikens8.

Voor wat betreft de gastheerspecificiteit van het PHV-1 neemt de grasparkiet (Nymphicus

hollandicus) een bijzondere status in. Zo bleek uit onderzoek dat, ondanks dat de grasparkiet

niet de natuurlijke gastheer van PHV-1 is, hij door nauw kontakt met geïnfecteerde duiven

toch herpesvirose kan ontwikkelen1,3

. Daarnaast zijn grasparkieten ook gevoelig voor het

papegaaien-herpesvirus. Grasparkieten op hun beurt kunnen het papegaaien-herpesvirus

niet op duiven overbrengen3.

Evenals de grasparkiet zijn ook roofvogels gevoelig aan het ontwikkelen van klinische

herpesvirose door nauw kontakt met duiven. Dit nauw kontakt komt vooral tot stand door de

predatie van roofvogels ten opzichte van duiven. Uit verschillende onderzoeken in het

verleden is gebleken, dat het herpesvirus wat roofvogels vaak bij zich dragen gelijkwaardig is

aan het PHV-1. Bij deze vergelijkende onderzoeken werd gebruik gemaakt van een restrictie

endonuclease analyse, die het vergelijken van verschillende isolaten van het herpesvirus

afkomstig van duiven, uilen en valken mogelijk maakte9,10

.

1.2. EPIDEMIOLOGIE

Het duiven herpesvirus werd ruim 65 jaar geleden, in 1945, voor het eerst gerapporteerd door

Smadel et al. In New York trof hij bij een kolonie duiven die toebehoorde aan het

Amerikaanse leger, de zogenaamde ‘army pigeons’, duiven aan waarbij hij na autopsie

multipele necrosehaardjes in de lever, de pancreas en de milt te zien waren. Hij noemde de

ziekte destijds ‘Inclusion Body Disease’, omdat de cellen in de necrosehaardjes intranucleaire

inclusies bevatten2,3,4

. Later werd het duiven herpesvirus over de gehele wereld in een relatief

korte tijd ontdekt2,3,4,11

.

Tegenwoordig draagt het duiven herpesvirus over de hele wereld de naam ‘PHV-1’ en het

virus komt anno 2014 nog steeds wereldwijd voor. Er wordt algemeen aangenomen dat

minstens 50 tot zelfs 80% van alle duiven latent besmet is met PHV-11,2,3,5,6,11,12

.

Voor wat betreft het voorkomen van PHV-1 wordt er vaak een link gelegd tussen acute

coryza en PHV-1. Zo kon men in België bij 82% van de duiven met acute coryza uit de farynx

het PHV-1 isoleren. Ook kon men in 60% van de duivenbestanden, waarin permanent acute

coryza heerste tegelijkertijd, PHV-1 aantonen1,3,4

. Een significant onderscheid voor wat betreft

de gevoeligheid voor PHV-1 tussen postduiven en sierduiven kon niet gemaakt worden. Bij

een onderzoek testte 58% van de postduiven en 56% van de sierduiven positief op PHV-1.

6

Leeftijd daarentegen is daarentegen wel een significante factor gebleken in het voorkomen

van PHV-1 bij duiven3,4

. Zo bleek uit een onderzoek waarbij in totaal 524 duiven (383 jongen

en 141 oude duiven) werden getest op PHV-1 dat 47,4% van de jongen en maarliefst 71,6%

van de oude duiven antistoffen tegen PHV-1 bezaten3.

De klinische vorm van herpesvirose bij duiven is echter eerder zeldzaam te noemen. Zo bleek

uit een onderzoek van de Universiteit Gent dat herpesvirussen slechts in 0,2% van de duiven

die ter autopsie aangeboden worden verantwoordelijk is voor de klinische ziekte5,6

. De

klinische ziekte kan in elk seizoen voorkomen, maar in de zomer lijkt de prevalentie hoger te

liggen. Verder blijken geslacht en het ras waartoe de duiven behoren geen invloed te hebben

op het ontwikkelen van klinische ziekte na infectie met PHV-12.

Voor wat betreft de morbiditeit en mortaliteit van klinische herpesvirose bij duiven is deze

anders dan de latente vorm. In enzoötisch aangetaste hokken varieert de morbiditeit van 5 tot

50%. Op deze hokken sterft 10-15% van de dieren aan klinische herpesvirose3. In de

kweekperiode kunnen deze waarden nog hoger liggen, omdat er dan veel jongen aanwezig

zijn op de hokken die meer gevoelig zijn aan het ontstaan van de klinische vorm van de

ziekte2,3

. De morbiditeit en mortaliteit liggen het hoogst bij duivenbestanden die voor het eerst

in aanraking komen met het virus en wanneer het duivenbestand te maken heeft met

ongunstige milieufactoren. Ongunstige milieufactoren zijn bijvoorbeeld slechte verzorging,

slechte voeding, zware belasting door deelname aan wedvluchten of algemene verzwakking

door een primaire aantasting van een ander pathogeen agens, bijvoorbeeld een

worminfestatie3. Afhankelijk van de stam van PHV-1 waarmee een duivenbestand

geïnfecteerd wordt kan de mortaliteit oplopen tot wel 90%2.

1.3. PATHOGENESE

Het PHV-1 kan uitgescheiden worden door klinisch zieke of subklinisch geïnfecteerde

duiven3. Evenwel is de belangrijkste factor in de verspreiding en pathogenese van PHV-1 in

een duivenpopulatie de latent geïnfecteerde fractie van de desbetreffende duivenpopulatie.

Deze zogenaamde dragers kunnen het virus intermitterend uitscheiden onder invloed van

bepaalde factoren1,2,3,5,6,11,12,13,14,15

.

Een eerste factor die een verhoogde uitscheiding van het virus tot gevolg heeft is stress. Dit

is natuurlijk een heel breed begrip en kan verschillende oorzaken hebben. Zo is stress door

het transport van duiven bij een verhoogde temperatuur een zeer belangrijke triggerende

factor voor een verhoogde virusuitscheiding. Ook de kweekperiode kan een extra

hoeveelheid stress geven, evenals een te dichte bezettingsgraad of luchtvochtigheid in het

hok5,6

.

7

De tweede factor die een verhoogde virusexcretie tot gevolg kan hebben is

immunosuppressie. Duiven die een minder goed werkend immuunsysteem bezitten hebben

een grotere kans op verhoogde virusexcretie en het ontwikkelen van klinische

ziekte2,5,6,11,12,15,16

. Zo zijn er in het verleden experimenten uitgevoerd waarbij duiven werden

behandeld met het chemotherapeuticum cyclophosphamide. Men stelde tijdens deze

experimenten vast dat wanneer een duif met dit chemotherapeuticum behandeld werd, zijn

bursa van Fabricius en thymus atrofiëerden en zelfs tekenen van degeneratie vertoonden.

Om precies te zijn ontstaat er na behandeling met cyclophosphamide een deficiëntie aan B-

en T-cellen. Na het stopzetten van deze therapie regeneren beide lymfoïede organen weer.

Het valt hierbij op dat in deze lymfoïede organen het T-cel producerend weefsel sneller

regenereert dan het B-cel producerend weefsel11,15,16,17

. Overigens is het mechanisme

waarmee het cyclophosphamide de immunosuppressie veroorzaakt tot op heden nog niet

gekend16

.

De besmetting van een duif met PHV-1 gebeurt uitsluitend horizontaal. Zo wordt het virus

onder andere uitgescheiden via de mest en kunnen duiven door kontakt met besmet

materiaal of aerosolen in het hok zelf geïnfecteerd worden2,3

. Een veel belangrijkere

besmettingsroute is de overdracht van het virus van de ouders op hun jongen. De besmetting

van de jongen gebeurt tijdens het azen en vaak al in de eerste paar dagen na het

uitkomen1,2,3,5,11,14,18

.

Verticale transmissie lijkt in de overdracht van een PHV-1 infectie geen enkele rol te spelen.

De overdracht van het virus vanuit de ouderdieren via het ei naar de jongen heeft men tot op

heden nog niet aan kunnen tonen1,2,11,14,15

. Ook is men er nog niet in geslaagd om het duiven

herpesvirus uit de genitale tractus van een duif te isoleren. Dit is dus een ondersteunend

argument om aan te nemen dat verticale transmissie van PHV-1 niet bestaat15

.

Wanneer het virus is opgenomen door de duif gaat het zich vestigen in de kern van de

geïnfecteerde cel. Hier vindt de replicatie van het virus plaats. Vervolgens worden de

viruspartikels geassembleerd in de kern en het cytoplasma van de geïnfecteerde cel2. De

verspreiding doorheen het lichaam van de duif gebeurt door middel van cel-cel kontakt dat

begint op de plaats waar het virus terecht komt als het wordt opgenomen. Meestal is dit de

pharynx. Hiervandaan gaat het virus zich verspreiden naar de mucosae van het

ademhalingsstelsel of het spijsverteringsstelsel2,3,15

.

Wanneer het virus zich in het lichaam van de duif verspreidt via cel-cel kontakt, is het niet

gevoelig aan eventuele hoge antistoftiters buiten de cel. Dit is zowel in vitro als in vivo

aangetoond. Dit geeft tegelijkertijd een verklaring voor het feit dat hoge titers van antistoffen

tegenover PHV-1 niet kunnen voorkomen dat een latent geïnfecteerde duif milde episodes

van re-excretie van het virus vertoont en dat de frequentie van voorkomen van deze episodes

8

van re-excretie gelijk is aan de frequentie van diezelfde episodes van re-excretie bij duiven

die geen antistoffen bezitten tegen PHV-1. Hieruit kan men concluderen dat de humorale

immuniteit geen hoofdrol speelt in de controle van een PHV-1 infectie bij de duif1,15

. Als het

virus gelokaliseerd is in het spijsverteringsstelsel is er een grote kans dat zich van hieruit een

algemene viremie gaat ontwikkelen. Dit verklaart ook vaak de aantasting van de lever, de milt

en soms ook de hersenen15

.

Bij met PHV-1 geïnfecteerde duiven kan 24 uur na infectie de virusuitscheiding al beginnen.

Deze virusuitscheiding kan 7 tot 10 dagen aanhouden. De incubatietijd van klinische

herpesvirose varieert van 3 tot 7 dagen1,2,3,16

.

Jonge duiven van 2 tot 10 weken zijn het gevoeligst voor het ontwikkelen van systemische en

daardoor vaak ook klinische herpesvirose. Bij oudere duiven beperkt een infectie met PHV-1

zich vaak tot het ademhalingsstelsel, tenzij zij onder erge stress lijden of immunodeficient zijn

2,3,5,6,11,12. Met name de jongen van ouderdieren die zelf geen latente drager zijn van PHV-1

hebben een grote kans op het ontwikkelen van klinische herpesvirose2,5,6,11

. Volgens

sommige bronnen zou de gevoeligheid voor het ontwikkelen van klinische herpesvirose ook

gedeeltelijk erfelijk bepaald zijn3. Jonge duiven van ouderdieren die latent besmet zijn met

PHV-1 krijgen volgens verschillende bronnen antistoffen binnen via de ouderdieren. Dit

gebeurt niet zoals aanvankelijk gedacht werd via de kropmelk, maar via de eidooier. De

aanwezigheid van de antistoffen ten tijde van het uitkippen behoedt de jongen voor het

ontwikkelen van klinische herpesvirose. Deze antistoffen beschermen de jongen de eerste 2

weken na het uitkomen en verdwijnen dan uit de duif. Dit wordt ook wel passieve immuniteit

genoemd. De antistoffen voorkomen echter niet dat de jongen evenals hun ouders latente

dragers worden1,2,11

.

1.4. SYMPTOMEN

De acute vorm van herpesvirose bij duiven wordt gekenmerkt door een aantal symptomen.

Een eerste symptoom is dat de oorspronkelijk krijtwitte neusdoppen van de duif verkleuren

naar een grijze tot soms zelfs grijsbruine kleur1,3

. Op deze neusdoppen kan zich in een verder

stadium van de ziekte 1 tot 2 mm dik beleg vormen dat de neusdoppen geheel of gedeeltelijk

bedekt3. Ook overmatig veel niezen kan duiden op een PHV-1 infectie

1.

Vaak is er bij een klinische manifestatie van herpesvirose ook een conjunctivitis aan 1 of

beide ogen van de duif waar te nemen1,2,3,4,11

. Dit kan gepaard gaan met het verstoppen van

de neusgaten met mucus of er kan eventueel een sereuze uitvloei vanuit de neusgaten te

zien zijn1,2,3

.

9

Wanneer er een secundaire bacteriële infectie in combinatie met een primaire infestatie van

het herpesvirus plaatsvindt, kan de gehele respiratoire tractus bij het ziektebeeld betrokken

raken. De oorspronkelijke PHV-1 infectie wordt dan voornamelijk gekenmerkt door typische

ademhalingssymptomen1,2,4,16,19

.

Zoals eerder in deze studie beschreven zijn jongen van ouderdieren die niet latent besmet

zijn met PHV-1 het meest gevoelig aan het ontwikkelen van klinische herpesvirose. Vooral bij

een leeftijd van 2-10 weken. Bij deze jongen die geen maternale antistoffen bezitten zal de

infectie in zeer korte tijd ontwikkelen tot veralgemeende infectie met ernstige hepatitis met

vaak acute sterfte binnen enkele dagen1,2,5,6

.

De veralgemeende symptomen van klinische herpesvirose bestaat onder andere uit apathie,

depressie, anorexie, dehydratatie en vaak is er door de algemene verzwakking een

onmogelijkheid tot vliegen bij de aangetaste duiven2,3

. Veelal is er bij een veralgemeende

herpesvirose ook uitscheiding van vieze donkergroene en slijmerige mest waar te nemen3,12

.

Afhankelijk van de stam van het PHV-1 waarmee de duiven geïnfecteerd worden kan het

virus zich gaan lokaliseren in de hersenen van een duif, welke op zijn beurt neurologische

symptomen kan gaan veroorzaken zoals torticollis of instabliteit12,15,19

.

Bij oudere duiven met een normale immuniteitsstatus gaat een herpesvirusinfectie vaak

gepaard met coryza of ornithose. Dit is een veelvuldig voorkomend en typisch

verschijnsel4,5,6

.

Figuur 3: Grijs-geel verkleuring van de neusdoppen bij een jonge duif met klinische herpesvirose (uit Marlier D. & Vindevogel H., 2006)

10

1.5. LETSELS

Klinische herpesvirose bij duiven kent een groot aantal letsels, waarvan sommige zeer

specifiek zijn voor een infectie met PHV-1. Soms zijn er slechts milde letsels waar te nemen

zoals enkel laryngeale congestie1. Ook is er soms algemene stuwing van het gehele

orgaanpakket met uitzetting van de galblaas2.

In acute gevallen zijn er vaak focale necrose en kleine ulceraties te zien ter hoogte van de

bek, de pharynx en de larynx. Soms zijn deze ook te zien op de mucosa van de kliermaag en

in de trachea1,2,3

. Over deze letsels kan eventueel een geelachtig difteroïd beleg heen

liggen4,5,6,11,19

. In sommige gevallen ontwikkelt de duif ook sinusitis, pericarditis of

aerosacculitis1,2

.

Typische letsels bij een uitbraak van klinische herpesvirose bij duiven zijn de focale

necrosehaardjes in de lever, de milt, de pancreas en de nieren2,3,4,5,6,8,12,19

. Deze focale

necrosehaardjes kunnen volgens sommige bronnen ook voorkomen ter hoogte van de

luchtzakken, de speekselklieren en de longen3,6,8

. In de focale necrosehaardjes in de lever,

de nieren, de pharynx en de larynx zijn intracellulaire en intranucleaire eosinofiele

inclusielichaampjes te zien2,3,4,5,8,12,19

. De inclusielichaampjes die te zien zijn bij klinische

herpesvirose zijn kleiner dan de inclusielichaampjes die men ziet bij een adenovirusinfectie6.

Verder is er aan de randen van de focale necrosehaardjes vaak een vergrote leucocytische

activiteit waar te nemen2,3

.

Figuur 4: Difteroïde faryngitis met necrose bij een duif met klinische herpesvirose (uit Marlier D. & Vindevogel H., 2006)

11

Ook kunnen er hersenletsels ontstaan wanneer men te maken heeft met bepaalde stammen

van PHV-1. Er is een mononucleaire infiltratie en perivasculaire cuffing, maar ook een verlies

van Purkinje-cellen en een stapeling van mononucleaire cellen in het cerebellum komen

voor2,3,15,19

. De letsels kunnen zelfs uitbreiden tot een erge meningo-encephalitis19

.

1.6. DIAGNOSE

Herpesvirose bij duiven kan op verschillende manieren gediagnosticeerd worden. Een eerste

methode om herpesvirose te diagnosticeren is, na autopsie, aan de hand van de

verschillende letsels die door het herpesvirus veroorzaakt worden1,2,3,4,6,20

. Ook typische

histologische letsels zoals intranucleaire inclusielichaampjes in de cellen, behorende tot de

letsels die herpesvirose veroorzaakt, kunnen meehelpen de diagnose van herpesvirose te

bevestigen1,2,5,6

. Voor wat betreft het stellen van de diagnose ‘herpesvirose’ aan de hand van

alleen de symptomen is dat niet betrouwbaar, omdat de meeste symptomen die

waarneembaar zijn tijdens klinisch herpesvirose niet pathognomisch zijn. Wel kunnen de

symptomen in combinatie met een andere diagnostische methode gebruikt worden om de

diagnose te stellen1,2

.

Een van de meest gebruikte methodes voor het stellen van de diagnose ‘herpesvirose’ bij

duiven is de inoculatie weefselsuspensies of swabs van mogelijk geïnfecteerde duiven in

geëmbryoneerde SPF kippeneieren. Deze inoculatie gebeurt meer specifiek op de chorio-

allantoïdale membraan van het embryo1,3,4,5,21

. Wanneer deze test positief is ontstaan er al na

een paar dagen plaques op de chorio-allantoïdale membraan van het geïnoculeerde ei5,21

.

Figuur 5: Intranucleaire inclusielichaampjes in de lever van een duif met herpesvirose (uit Cornwell H.J.C. & Wright N.G.,1970).

12

Tegenwoordig wordt voor het aantonen van PHV-1 in swabs of andere stalen ook PCR

gebruikt. Dit kan echter alleen in gespecialiseerde laboratoria gebeuren. Daarbij komt dat

deze techniek totaal geen onderscheid kan maken tussen klinische en subklinische

herpesvirose1.

Volgens sommige bronnen kan serologisch onderzoek naar de aanwezigheid van antistoffen

in het bloed van de duiven tegen het PHV-1 ook een diagnostische methode zijn3. Andere

bronnen spreken dit echter tegen met de beargumentering dat de aanwezigheid van

antistoffen tegenover PHV-1 in het bloed van een duif niet bevestigt dat deze duif lijdt aan

klinische herpesvirose. Daarbij komt ook nog dat uit onderzoek is gebleken dat ruim 50% van

alle duiven serologisch positief test op de aanwezigheid van antistoffen tegenover PHV-15.

Bij het vaststellen van de uiteindelijke diagnose van herpesvirose bij duiven zou men de

duiven best ook parasitologisch op Trichomonas columbae testen, maar ook een

bacteriologisch onderzoek naar de aanwezigheid van Staphylococcus intermedius,

Pasteurella multocida en Escherichia coli is aangewezen bij het stellen van de diagnose.

Deze bijkomende onderzoeken voert men uit, omdat duivenbestanden die primair lijden aan

klinische herpesvirose vaak ook secundair aangetast zijn met bovengenoemde agentia. Het

is dan van belang om het duivenbestand niet alleen te behandelen tegen de klinische

herpesvirose maar ook zeker een behandeling in te stellen tegen de secundair pathogene

agentia indien deze uit de duiven geïsoleerd kunnen worden1.

Figuur 6: Intranuclaire inclusielichaampjes op de chorio-allantoïdale membraan van een kippenembryo na inoculatie van PHV-1 in een SPF-kippenei (uit Cornwell H.J.C. & Wright N.G., 1970).

13

1.7. DIFFERENTIAALDIAGNOSE

Om een goed overzicht van de verschillende differentiaaldiagnoses te bekomen zullen in dit

hoofdstuk de differentiaaldiagnoses per hoofdstuk besproken worden:

Tijdens de kweekperiode kan een uitbraak van herpesvirose in een duivenbestand acute

sterfte van nestjongen met zich meebrengen. Dit moet differentiaaldiagnostisch

onderscheiden worden van een uitbraak van paramyxovirose, salmonellose, S. gallolyticus,

E. coli, trichomoniasis en hexamitiasis5,6

.

De difteroïde letsels in de bek moeten differentiaaldiagnostisch onderscheiden worden van

een infectie met het poxvirus1,3,5,6

. Ook trichomoniasis en een infestatie met Candida albicans

behoren tot de differentiaaldiagnose van de difteroïde letsels5,6

. De difteroïde letsels die men

bij een klinische PHV-1 ziet, zijn eerder pseudomembraneus en minder invasief dan de

difteroïde letsels die het poxvirus doorgaans in de bek van de duif veroorzaakt1. Ook mag

men de difteroïde letsels die te zien zijn bij klinische herpesvirose niet verwarren met

sialolieten die te zien zijn als kleine witte stipjes achter in de bek van de duif. Hun etiologie is

tot op heden ongekend. Zij worden vaak geassocieerd met verminderde vliegprestaties van

duiven6.

De neurologische verschijnselen en dan met name de meningo-encephalitis die soms te zien

is bij duiven, die lijden aan klinische herpesvirose, moeten differentiaaldiagnostisch

onderscheiden worden van de neurologische verschijnselen die zich voor kunnen doen bij

een besmetting met het paramyxovirus of Salmonella spp2.

Het gehele klinische beeld dat soms te zien is wanneer een duif lijdt aan klinische

herpesvirose wordt soms verward met ornithose3.

1.8. THERAPIE

Er bestaat nog geen doeltreffende therapie om duiven die geïnfecteerd zijn met PHV-1 van

dit virus te ontdoen2,5,6,22

. In het verleden zijn er een aantal hoopgevende experimenten met

onder andere trisodium phosphonoformate uitgevoerd. Deze stof zou een belangrijk antiviraal

effect bezitten, omdat trisodium phosphonoformate het door PHV-1 geïnduceerde DNA-

polymerase zou inhiberen en zo de replicatie van PHV-1 stil zou leggen22

.

Er werd onder andere een experiment uitgevoerd waarbij vijf verschillende stammen van het

PHV-1 in vitro werden onderworpen aan een behandeling met trisodium phosphonoformate in

verschillende dosissen. De gevoeligheid van iedere stam van PHV-1, aan een behandeling

met trisodium phosphonoformate, werd gemeten door de grootte van de plaques die het

PHV-1 in vitro vormde in de aanwezigheid van trisodium phosphonoformate. Uit de resultaten

bleek duidelijk dat alle vijf de stammen van PHV-1 die gebruikt werden in dit experiment

14

gevoelig waren aan een behandeling met trisodium phosphonoformate. De gevoeligheid voor

deze stof verschilde wel significant per stam van PHV-1, maar natuurlijke resistentie van het

virus tegenover trisodium phosphonoformate werd niet vastgesteld. Het minst gevoelig aan

een behandeling met trisodium phosphonoformate bleken de stammen van PHV-1 afkomstig

van verschillende psitacciformes23

.

Toen men het gebruik van trisodium phosphonoformate verder ging testen op levende dieren

werd al snel duidelijk dat deze stof niet aangewezen is voor de bestrijding van PHV-1 bij

duiven1,22

. Zo bleek uit een experiment van Vindevogel et al. (1982) dat, wanneer trisodium

phosphonoformate intramusculair werd ingespoten bij klinisch gezonde duiven, men het

ontstaan van een klassieke klinische herpesvirose niet kon voorkomen. Ook kon men met

deze behandeling de excretie van het virus niet verminderen of het ontstaan van dragers

voorkomen. Men veronderstelde na dit experiment dat de geringe distributie van het product

doorheen het lichaam van de duif aan de basis lag van de verminderde werkzaamheid van

trisodium phosphonoformate in vivo ten opzichte van de werkzaamheid van dezelfde stof in

vitro22

.

Een ander middel wat in het verleden getest werd op zijn activiteit tegenover PHV-1 is

acyclovir. In vitro werden onder andere plaques van PHV-1 blootgesteld aan verschillende

concentraties van acyclovir. Uit de resultaten van deze tests bleek dat acyclovir een duidelijke

vermindering van de grootte van de plaques tot gevolg had wanneer deze werden

blootgesteld aan acyclovir. De resultaten van de tests in vivo waren minder bevredigend.

Voor de in vivo tests gebruikte men duiven en grasparkieten die men experimenteel

infecteerde met PHV-1. Intramusculaire injecties met acyclovir aan een dosis van 100

mg/kg/dag konden bij beide soorten het optreden van klinische ziekte niet voorkomen. Ook

de virusexcretie van de geïnfecteerde vogels werd niet verminderd door de behandeling met

acyclovir24

.

Ondanks dat er geen werkzame stof tegen PHV-1 op de markt is, kan men wel een aantal

maatregelen treffen om de kans op een veralgemeende uitbraak van klinische herpesvirose

in een duivenbestand tegen te gaan. Ten eerste isoleert men de zieke duiven best, zodat zij

als zeer voorname kiemuitscheiders minder snel de andere duiven zullen belasten met een

hogere infectiedruk. Indien de reeds aangetaste duiven niet van grote waarde zijn of een zeer

slechte prognose van overleven hebben ruimt men deze duiven beter op. Men kan daarnaast

ook proberen de natuurlijke weerstand van de duiven te verhogen. Dit kan men doen door

middel van het verstrekken van een uitgebalanceerd voeder en het toedienen van

multivitaminepreparaten. Ook is het belangrijk om de natuurlijke weerstand van de duiven niet

te onderdrukken. Dit gebeurt vaak wanneer er bepaalde stressoren zoals vervoer,

tentoonstellingen of wedvluchten plaatsvinden. Het is dan ook beter wanneer er een uitbraak

15

van klinische herpesvirose in een duivenbestand heeft plaatsgevonden dit bestand tijdelijk

niet deel te laten nemen aan tentoonstellingen en wedvluchten3.

1.9. PROGNOSE

De prognose van een klinische herpesvirusinfectie is afhankelijk van de stam van PHV-1

waarmee de duif geïnfecteerd is. De mortaliteit na infectie met bepaalde stammen van PHV-1

kan oplopen tot wel 90%, voornamelijk bij stammen die de hersenen aantasten kan de

mortaliteit erg hoog oplopen. Duiven, die een klinische herpesvirose overleven, herstellen

vaak langzaam en kunnen levenslang nadelen ondervinden van hun ziekte. Zo is er vaak een

permanent verminderde vruchtbaarheid en zullen ook de vluchtprestaties veelal van minder

niveau zijn na het doormaken van een klinische herpesvirose3.

1.10. PREVENTIE

Het is voorwat betreft herpesvirose zo dat er op dit moment geen commercieel vaccin op de

markt beschikbaar is welke de duif kan behoeden voor een infectie met PHV-11,13

. In het

verleden zijn er verschillende vaccins tegen herpesvirose ontwikkeld. Zo is er een experiment

uitgevoerd waarin zowel een geattenueerd als een geïnactiveerd vaccin werden uitgetest.

Beide vaccins waren in staat om de primaire virusexcretie na ‘challenge’ te onderdrukken.

Ook waren de klinische symptomen bij de gevaccineerde duiven minder uitgesproken dan bij

een controlegroep na dezelfde ‘challenge’1,13

.

Nadeel van het geattenueerde vaccin was dat het mild pathogeen bleek te zijn voor duiven.

PHV-1 vrije duiven die na vaccinatie met het geattenueerd vaccin een immunosuppressieve

behandeling met cyclofosphosphamide ondergingen vertoonden na enige tijd uitscheiding

van het virus. Een ander nadeel van deze twee geteste vaccins was dat zij beiden niet

konden voorkomen dat gevaccineerde duiven na infectie met PHV-1 toch nog drager van het

virus werden1,13

.

Ondanks dat het vaccineren tegen het PHV-1 geen bescherming geeft tegen de infectie met

PHV-1 en het ontstaan van dragers van PHV-1 is het geïnactiveerde vaccin wel goed te

gebruiken bij de preventie van het ontstaan van klinische herpesvirose. Zo kan men best de

duiven waarmee gefokt gaat worden voor aanvang van de kweek hyperimmuniseren door ze

te vaccineren met het geïnactiveerd vaccin. Men gebruikt een geïnactiveerd vaccin omdat

deze geen excretie van het virus geeft en omdat een duif na vaccinatie met het dit vaccin een

betere seroconversie vertoont in vergelijking met een geattenueerd vaccin. Door deze

hyperimmunisatie zullen de jongen op het moment dat zijn geïnfecteerd worden met het PHV-

1, meestal enkele dagen na het uitkippen, optimaal beschermd zijn tegen dit virus. Op deze

manier verkleint men de kans op een uitbraak van klinische herpesvirose13

.

16

Een andere maatregel die men kan nemen is het uitselecteren van duiven of koppels die een

verhoogde gevoeligheid vertonen voor PHV-1. Het is beter niet met deze duiven te fokken om

een zo hoog mogelijke natuurlijke weerstand van het duivenbestand tegen klinische

herpesvirose op te bouwen. Ook is het van groot belang om de duiven in een hygiënische

omgeving te houden en een volwaardig voeder te verstrekken. Ook het beperken van

stresserende factoren die de natuurlijke weerstand kunnen onderdrukken behoort tot de

preventie van klinische herpesvirose3.

2. MYCOPLASMA BIJ DUIVEN

2.1. ETIOLOGIE

2.1.1. Oorzakelijk agens

Mycoplasmose wordt veroorzaakt door kleine pleomorfe bacteriën, ook wel mycoplasma’s

genoemd25,26

. Ze groeien evenals andere bacteriën ook goed op een artificiële

voedingsbodem25

. Het grote verschil tussen een Mycoplasma en andere bacteriën is dat

bacteriën een celwand hebben en hierdoor als het ware altijd een zelfde uiterlijke vorm

hebben, maar mycoplasma’s hebben daarentegen geen celwand. Door het ontbreken van de

celwand bij mycoplasma’s kan dit organisme een wisselende vorm aannemen. Het is dus een

pleomorf organisme25,26

.

Mycoplasma’s behoren tot de klasse van de Schizomyceten, de orde van de Eubacteriales,

de familie van de Mycoplasmataceae, welke op hun beurt onderverdeeld zijn in de genera

Mycoplasma, Acheloplasma en Ureoplasma25,26

. Er zijn in de loop der tijd wereldwijd meer

dan zeventig verschillende soorten mycoplasma’s ontdekt, waarvan er ongeveer twintig bij

vogels kunnen voorkomen26

.

2.1.2. Eigenschappen van een Mycoplasma

Zoals eerder vermeld hebben mycoplasma’s geen vaste celwand. Ze hebben enkel een

lipoproteinemembraan drie voor een pleomorf uitzicht zorgt25,26

. Zo kunnen mycoplasma’s

waargenomen worden als kok-achtige vormen, maar ook als nesten van staafjes of met

flagellen24

. Het zijn de kleinste vrijlevende organismen op aarde. Uit onderzoek is gebleken

dat mycoplasma’s zelfs filters met een diameter van 150 micrometer kunnen passeren25

. De

grootte van deze organismen is zeer moeilijk te meten door hun grote vervormbaarheid, maar

wordt geschat op 0,3 – 1,0 micrometer25,26

.

Mycoplasma’s groeien op speciaal daarvoor samengestelde vaste media. Zij vormen hierop

kleine translucente kolonies die niet zelden alleen met een vergrootglas waargenomen

kunnen worden. De kolonies van Mycoplasma columbinum hebben microscopisch een zeer

kenmerkend ‘spiegelei-uitzicht’ waarbij er centraal een verdikte zone waar te nemen is door

17

de hogere intensiteit van vermenigvuldiging op deze plaats. Wanneer men mycoplasma’s

kweekt op een voedingsbodem die 20% paardenserum bevat vormen de kolonies het

typische beeld van ‘film and spots’25

.

Ook op het vlak van de reproductie verschillen mycoplasma’s van andere bacteriën die wel

een celwand hebben. Het lijkt erop dat bepaalde delen van een moedercel, die DNA-

componenten bevatten, afgesnoerd worden en in staat zijn te overleven en tot een nieuwe

Mycoplasma uit te groeien25

.

2.1.3. Gastheerspecificiteit

Zoals eerder beschreven zijn er bij vogels reeds meer dan 20, volgens sommige auteurs zelfs

meer dan 40, verschillende soorten mycoplasma’s beschreven. Er zijn in de literatuur 3

soorten mycoplasma’s beschreven die tot op heden ook alleen bij duiven waargenomen zijn,

namelijk Mycoplasma columbinum, M. columborale en M. columbinasale. M. columbinasale

werd vroeger ook wel aangeduid als het ‘L-serotype’. Deze drie species zijn zeer

gastheerspecifiek. Ze komen dan ook niet bij een andere diersoort dan de duif

voor25,26,27,28,29,30,31,32

.

Verder zouden duiven, volgens sommige bronnen, symptoomloze dragers kunnen zijn van

Mycoplasma meleagridis die vooral bij kalkoenen voor problemen kan zorgen26

. Andere

bronnen beweren dat M.meleagridis enkel bij de kalkoen voorkomt30

. Hoewel een duif bij

besmetting met deze species van Mycoplasma geen symptomen zou ontwikkelen wordt

mycoplasmose bij kalkoenen, veroorzaakt door M.meleagridis, gekenmerkt door

conjunctivitis, rhinitis, tracheïtis en fibrineuze aerosacculitis26

.

Figuur 7: Het typische 'spielgelei-uitzicht' dat men verkrijgt wanneer men Mycoplasma columborale opkweekt in een medium verrijkt met 20% paardenserum (uit Shimizu et al., 1978)

18

2.2. EPIDEMIOLOGIE

Mycoplasma’s bij duiven werden voor het eerst aangetoond in Amerika in 1953 door

Winterfield. Hij toonde de mycoplasma’s aan door inoculatie van een suspensie van

geïnfecteerd materiaal op kippenembryo’s. In Europa waren het Schrag et al. die in 1974 in

West-Duitsland voor het eerst duifspecifieke mycoplasma’s rapporteerden25

. Heden ten dage

zijn mycoplasma’s over de gehele wereld vastgesteld door tal van

onderzoekers25,26,27,28,29,30,31,32

.

De prevalentie van mycoplasma’s bij duiven is hoog. Zelfs zo hoog dat bijna elk

duivenbestand ter wereld wel eens geïnfecteerd is geweest met mycoplasma’s. Shimuzu

stelde, in een onderzoek waarbij 262 duiven onderzocht werden op de aanwezigheid van

mycoplasma’s, vast dat bij 68,7% van de onderzochte duiven mycoplasma’s aanwezig

waren24. In een ander onderzoek dat Shimizu uitvoerde, waarbij hij in totaal meer dan 850

vogels onderzocht op de aanwezigheid van mycoplasma’s, vond hij meer dan 40

verschillende soorten mycoplasma’s. Voor wat betreft de 3 soorten die bij duiven voorkomen

stelde hij vast dat 43% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species

M.columbinum, 55% tot M. columborale en 2% behoorde tot een toen nog onbekende

species van Mycoplasma25,26

. Later werd dit onbekende species, vroeger aangeduid als het

‘L-serotype’, M. columbinasale genoemd28,31

. De hiervoor genoemde Mycoplasma sp. komen

alleen bij duiven voor. Een enkele keer werden 2 verschillende soorten mycoplasma’s in één

duif geïsoleerd. Het betrof in deze gevallen een infectie met M. columbinum en M.

columborale25

.

Mycoplasma’s komen op een aantal specifieke plaatsen in de duif voor. Zo zijn er bij duiven

reeds mycoplasma’s geïsoleerd uit de oropharynx, de turbinale sinussen en het tracheaal

exsudaat25,26,27,30

. Maar ook uit de longen, hersenen en de luchtzakken zijn in het verleden al

mycoplasma’s geïsoleerd. Men heeft in het verleden ook dikwijls geprobeerd mycoplasma’s

uit cloacale swabs te isoleren, maar men heeft hierin nog nooit mycoplasma’s weten aan te

tonen. Ook uit de genitale tractus heeft men getracht mycoplasma’s te isoleren maar ook

hieruit is dit nog nooit gelukt25,30

.

Een infectie met mycoplasma’s is niet seizoensgebonden. Evenals het jaargetijde hebben de

leeftijd en het geslacht van de duif geen enkele invloed op de gevoeligheid van de duif voor

een infectie met mycoplasma’s. Ook het ras heeft geen invloed op de gevoeligheid van de

duif voor Mycoplasma-infecties25

.

De incubatieperiode voor een infectie met mycoplasma’s is moeilijk vast te stellen. Dit komt

door het feit dat er zelden klinische ziekte optreedt na een infectie met Mycoplasma sp.25

.

19

Volgens sommige bronnen zouden mycoplasma’s zelfs volledig apathogeen zijn voor duiven.

Mycoplasma-infecties bij duiven zijn dan ook vaak latent aanwezig in een duivenbestand25,26

.

Uit de huidige documentatie is niet op te maken of duiven klinische mycoplasmose kunnen

ontwikkelen wanneer zij enkel geïnfecteerd worden met Mycoplasma columbinum, M.

columborale of M. columbinasale25

. Wel is bekend dat mycoplasma’s vaak als secundaire

pathogenen aanwezig zijn bij infecties met PHV-1 en infecties met Chlamydophila

psitacci25,26

.

Klinische ziekte wordt volgens sommige auteurs ook in de hand gewerkt door de invloed die

bepaalde stressoren op de duif hebben. In de literatuur worden stressoren zoals Eschericha

coli-infecties, infecties met Haemoproteus spp., overbevolking, slechte hygiene, hoge

concentraties aan ammonia, koud of nat weer en uitputting door lange races genoemd.

Ondanks deze grote hoeveelheid mogelijke stressoren wordt klinische ziekte niet vaak

gezien25

.

Voor wat betreft de morbiditeit van mycoplasma-infecties variëren de percentages volgens de

verschillende bronnen in de literatuur van 10% to 100%. Tevens is de mortaliteit net als de

morbiditeit van een infectie met Mycoplasma sp. moeilijk na te gaan. Het is namelijk moeilijk

vast te stellen of dode duiven die mycoplasma’s bij zich dragen daadwerkelijk gestorven zijn

aan mycoplasmose daar er altijd nog andere infectieuze agentia aanwezig zijn25,26

.

Voor wat betreft de opbouw van immuniteit bij een Mycoplasma-infectie is vrij weinig bekend.

De verschillende auteurs zijn het op dit vlak niet geheel met elkaar eens. Keymer et al. (1984)

beweerden dat er seroconversie optreedt na infectie25,27. Maar Gerlach (1978) stelde vast dat

seroconversie na een infectie met Mycoplasma’s lang niet altijd plaatsvindt en dus helemaal

niet zo vanzelfsprekend is25

. In hun onderzoeken observeerden zij duiven die 5 maanden na

een experimentele infectie met mycoplasma’s nog steeds geen seroconversie vertoonden26

.

2.3. PATHOGENESE

De pathogenese van een Mycoplasma-infectie bij duiven start met het opnemen van het

infectieus agens door de duif. Mycoplasma’s kunnen het lichaam van de duif binnentreden via

de bek, de neusopeningen en de ogen25

. Opname door inademing van mycoplasma’s is

mogelijk, omdat ze zich kunnen bevinden op de kleinste stofdeeltjes en op deze manier met

de lucht mee naar binnen gezogen worden. Hierdoor is er tevens een aerogene spreiding van

mycoplasma’s mogelijk26

. Ook ander indirect kontakt zoals gecontamineerde hokken en

materiaal kunnen de transmissie van een Mycoplasma-infectie tot stand brengen25

.

20

Een andere manier van overdracht is via direct kontakt tussen twee duiven. Direct kontakt

tussen twee duiven kan ten eerste plaatsvinden wanneer de duiven elkaar liefkozen. Een

ander voorbeeld van direct kontakt tussen twee duiven is de ouder die zijn of haar jong

voedert. Mycoplasma’s kunnen via de kropmelk van de ouderduiven, bij het azen,

overgedragen worden op de jongen26

.

Tevens is verticale transmissie van mycoplasma’s via het ei mogelijk. Verschillende auteurs

hebben dit door middel van onderzoek bevestigd25,26

. De incubatietijd van een Mycoplasma-

infectie is, ondanks dat deze moeilijk te bepalen is, volgens sommige auteurs zeer lang26

.

2.4. SYMPTOMEN

Een klinische vorm van mycoplasmose zoals die bij kippen en kalkoenen voorkomt, waarbij

mycoplasma’s als primaire pathogenen worden bestempeld, komt volgens sommige bronnen

niet voor bij duiven26,29

. De situatie bij duiven is vaak complexer. Zo zijn er vaak primaire

pathogenen die de duiven aantasten, waarbij mycoplasma’s in dit geval vaak secundaire

pathogenen zijn. Zo zouden mycoplasma’s vaak synergistisch zijn met primaire

ziekteverwekkers zoals Chlamydia psitacci en het duivenherpesvirus (PHV-1). Het is in deze

gevallen moeilijk te bepalen of de aanwezige symptomen veroorzaakt worden door de

mycoplasma’s of door de primaire pathogenen26

.

Zo werden tijdens een uitbraak van ziekte bij nestjongen in een duivenbestand in Hongarije

zowel circovirus, Salmonella Typhimurium en Mycoplasma columbinasale teruggevonden.

Deze jongen vertoonden een vertraagde groei, diarree en zenuwsymptomen. De morbiditeit

Figuur 8: Foto van een duif met erge conjunctivitis waarbij uit de letsels ook Mycoplasma columborale werd geïsoleerd (uit Loria G.R. et al., 2005)

21

bij deze uitbraak bedroeg 60% van de jongen waarvan uiteindelijk 80% stierf. Ook het

percentage onbevruchte eieren, dat normaal rond de 5% ligt, was verhoogd tot 20%31

.

Volgens Gerlach (1977,1978) kunnen door Mycoplasma beschadigde weefsels makkelijker

gekoloniseerd worden door andere pathogenen, welke deze weefsel nog verder aan zullen

tasten26

.

Volgens sommige auteurs kunnen duiven wel lijden aan klinische ‘mycoplasmose’. De

symptomen van een klinische ‘mycoplasmose’ bij duiven zouden ademhalingsproblemen,

conjunctivitis, rhinitis en donker verkleurde neusdoppen zijn25,26,27,28,29,33

. Dit kan weer andere

symptomen zoals rochelen, hoesten en niezen veroorzaken25,33

. Ook een gestuwde en meer

rode mucosa van de trachea en de choanespleet zouden veroorzaakt kunnen worden door

een infectie met mycoplasma’s. Tevens zou een meer dan normale hoeveelheid seromuceus

slijm ter hoogte van de choanespleet ook kunnen duiden op de aanwezigheid van

mycoplasma’s in de duif26

.

Wanneer een duif wel met mycoplasma’s geïnfecteerd is, maar verder geen symptomen

vertoont, wordt hij een asymptomatische drager genoemd. Duiven kunnen levenslang drager

blijven van mycoplasma’s maar vertonen verder geen klinische ziekte25,26

.

2.5. LETSELS

Bij autopsie kan men bij duiven, die geïnfecteerd zijn geweest met mycoplasma’s, onder

andere variërende hoeveelheden slijm in de respiratoire tractus terug vinden25

. Vaak zijn er

kleinschalige weefselreacties met infiltratie van mononucleaire cellen en oedeem van het

subepitheliaal weefsel te zien27

. Ook kan er een enkele keer vertroebeling van de luchtzakken

waargenomen worden met eventueel een geelachtig beleg. Tevens kunnen de drainerende

lymfeknopen van het ademhalingsstelsel ook sterk vergroot zijn26

. Verder zijn er bij

seropositieve dieren vrijwel nooit andere letsels terug te vinden25

.

2.6. DIAGNOSE

Aangezien mycoplasma’s niet altijd duidelijke letsels veroorzaken bij duiven is het bij het

stellen van de diagnose van belang dat men het organisme aan kan tonen. Het aantonen van

de aanwezigheid van mycoplasma’s kan door middel van het nemen van een swab uit de

choanespleet, de trachea, de longen of de luchtzakken25,27,31

. Het materiaal van de swab

brengt men vervolgens over op een speciaal Mycoplasma-groeimedium. Dit zijn speciaal voor

de groei van Mycoplasma aangerijkte media om mycoplasma’s te kunnen cultiveren25,31

.

Deze aanrijking gebeurt vaak met gistcomponenten en serum, bijvoorbeeld 20%

22

paardenserum. Swab-culturen worden vaak van een bouillon naar een agar-medium

overgeënt na een incubatieperiode van 1-3 dagen bij 37ºC25

.

Ook het remmen van andere organismen tijdens het cultiveren is nodig om overgroei van het

medium tegen te gaan. Om bacteriële overgroei tijdens het incuberen tegen te gaan, worden

vaak penicilline en thalliumacetaat gebruikt25

.

Wanneer een cultuur positief test op Mycoplasma zijn er kleine translucente kolonies

gevormd die enkel met een vergrootglas waar te nemen zijn. M. columborale-kolonies

hebben een karakteristiek ‘spiegelei-uitzicht’ waarbij centraal een verdikte zone van

vermeerdering te zien is. Wanneer men 20%-paardenserum gebruikt vormen kolonies van M.

columbinum het karakteristieke uitzicht van ‘film and spots’25

.

Een tweede methode om mycoplasma’s te cultiveren is door middel van inoculatie van

embryo’s of vogels. Bij deze methode wordt tracheaal exsudaat in bouillon behandeld met

penicilline (10.000 units/ml), omdat men dan de mogelijke bacteriële overgroei onder controle

kan houden. Dit is nodig omdat het exsudaat bij kamertemperatuur bewaard dient te worden

vooraleer het geïnoculeerd wordt in de dooierzak van 7 dagen geïncubeerde SPF-eieren. Na

een verdere incubatie van 5 of 6 dagen kan men de mycoplasma’s uit de respiratoire tractus

van het embryo isoleren. Bij deze methode kan men ook kuikens of in het geval van

duifspecifieke mycoplasma’s ook jonge duiven inoculeren25

.

Figuur 9: Typisch beeld van 'film and spots' dat men verkrijgt na het opkweken van Mycoplasma columbinum op een medium dat verrijkt is met 20% paardenserum (uit Shimizu et al., 1978)

23

Tegenwoordig wordt ook vaak de PCR-techniek gebruikt om het DNA van mycoplasma’s in

swabs te detecteren. Door middel van het aantonen van het DNA van de duifspecifieke

mycoplasma’s kan men bepalen of het organisme wel of niet aanwezig is in de duif31

.

Serologisch onderzoek kan bij het stellen van de diagnose van mycoplasmose niet gebruikt

worden omdat vele geïnfecteerde duiven geen seroconversie tegenover de antigenen van

mycoplasma’s vertonen. Tevens kan men de antigenen die gebruikt worden voor het

aantonen van mycoplasma’s bij kippen en kalkoenen niet gebruiken voor de diagnose van

mycoplasmose bij duiven omwille van het verschil in diersoortspecificiteit tussen de

verschillende mycoplasma’s26

.

2.7. DIFFERENTIAALDIAGNOSE

Tot de differentiaaldiagnose van ‘mycoplasmose’ bij duiven kan men alle ziekten rekenen die

met luchtwegklachten verbonden zijn. Zo worden de klinische verschijnselen die optreden bij

een infectie met herpesvirose vaak geassocieerd met mycoplasmose26,27

. Verder behoren

ook infecties met C. psitacci tot deze differentiaaldiagnose25,26,27

. Evenals Bordetella spp. en

Haemophilus spp.. Als laatste kan men ook nog de mucosale vorm van duivenpokken en

eventueel ook aspergillose tot deze differentiaaldiagnose rekenen26,27

.

Volgens andere auteurs behoren ook vitamine A. deficiëntie, E-coli infecties en

paramyxovirus-infecties tot de differentiaaldiagnose van een infectie met mycoplasma’s26,27

.

2.8. THERAPIE

Er is tot op heden nog geen middel gevonden dat effectief mycoplasma’s uit het lichaam van

de duif kan eradiceren. In de loop der jaren zijn er veel middelen uitgetest met als doel

mycoplasma’s geheel uit de duiven te doen verdwijnen. Ondanks dat dit doel heden ten dage

nog niet bereikt is, heeft men inmiddels wel een aantal middelen gevonden om mycoplasma’s

te onderdrukken en de uitscheiding ervan enigszins te verminderen25

.

Een eerste product die men gebruikt om mycoplasma’s te onderdrukken is lincomycine25,27

.

Deze stof werd door Keymer et al. (1984) gebruikt op een hok waar Mycoplasma-achtige

verschijnselen voor kwamen. De duiven reageerden op de behandeling en de

ademhalingsproblemen bleven voor langere tijd onder controle27

.

Een tweede product die in het verleden al ingezet werd voor de bestrijding van

mycoplasma’s is tiamuline-OH-fumaraat25,27

. Overigens wordt de werkzaamheid van dit

product door sommige bronnen in twijfel getrokken27

.

24

Een ander product dat vaak wordt aangewend voor de behandeling van ‘mycoplasmose’ bij

duiven is spiramycine25,27

. Spiramycine werd door Keymer et al. (1984) op twee verschillende

hokken ingezet om Mycoplasma-infecties te onderdrukken. In een eerste hok waar in eerste

instantie tiamuline-OH-fumaraat niet werkzaam was, bleek de behandeling met spiramycine

wel effectief want na deze tweede behandeling was men gedurende de navolgende anderhalf

jaar niet meer in staat om mycoplasma’s te isoleren uit swabs genomen bij de in eerste

instantie met Mycoplasma geïnfecteerde duiven. In een tweede hok dat meteen na het

vaststellen van de aanwezigheid van mycoplasma’s behandeld werd met spiramycine werd

wel een lichte verbetering van de aanwezige ademhalingssymptomen gezien, maar kon men

ook na de behandeling met spiramycine nog steeds mycoplasma’s aantonen27

.

Tevens wordt tegenwoordig ook spectinomycine gebruikt ter bestrijding van Mycoplasma-

infecties van duiven25

.

In het verleden zijn ook duiven bij wijze van experiment behandeld met tetracyclines. Zo

behandelden Loria et. al duiven, die ademhalingsstoornissen en ontstoken ogen hadden

waaruit mycoplasma’s geisoleerd werden, met oxy-tetracyclines. De resultaten waren

allerminst bevredigend en men kwam tot de conclusie dat oxy-tetracycline niet aangewend

dient te worden ter bestrijding van mycoplasma’s bij duiven.

2.9. PREVENTIE EN CONTROLE

Ter preventie van Mycoplasma-infestaties van een duivenbestand moet men met een aantal

zaken rekening houden. Zo is het van belang om voor voldoende frisse lucht in de behuizing

van de duiven te zorgen. Wanneer er teveel ammoniagassen in het hok aanwezig zijn kan dit

een triggerende werking uitoefenen op het ontstaan van ‘mycoplasmose’ bij duiven25

.

Wanneer men Mycoplasma-vrije dieren wil kweken uit duiven die geïnfecteerd zijn met

mycoplasma’s is het volgens onderzoek uit de USA effectief om de eieren van de

geïnfecteerde duiven te inoculeren met of te dippen in lincomycine en/of spectinomycine25

.

Serologisch onderzoek en het medicineren van Mycoplasma-positieve duivenbestanden kan

nuttig zijn in het kader van de reductie van infectiedruk en de remissie van de uitscheiding

van mycoplasma’s door de geïnfecteerde duiven25

.

25

ONDERZOEK

1. MATERIALEN EN METHODEN

1.1. STAALNAME

Om uit dit onderzoek een helder beeld te vormen over het voorkomen van herpes- en

Mycoplasma-infecties bij duiven in de drie Nederlandse provincies Zuid-Holland, Noord-

Holland en Utrecht is er voor gekozen om 440 stalen te verzamelen van in totaal 225

postduivenhouders woonachtig in deze drie provincies. Aangezien in deze drie provincies

naar schatting een kleine 2000 postduivenhouders wonen is er een bemonstering

gerealiseerd van ongeveer 11% van alle aanwezige liefhebbers in deze streek (voor de

tabellering van de stalen zie bijlage I). Het verzamelen van de stalen gebeurde op 2

manieren. Ten eerste werden er in de praktijk waar ik mijn stage gevolgd heb van elke

postduivenhouder die op consultatie kwam en woonachtig is in één van de drie aangegeven

provincies, na zijn goedkeuring, 2 duiven bemonsterd. Ook werd er door elke meewerkende

liefhebber een standaard formulier ingevuld waarop naar de provincie, de woonplaats en het

voorkomen van ademhalingsstoornissen bij zijn of haar duiven gevraagd werd. Om aan het

grote aantal stalen te geraken is er ook op een aantal tentoonstellingen, die in het

winterseizoen plaatshebben, afname van stalen gebeurd. De stalen werden telkens bij het

inzetten van de duiven voor de tentoonstelling genomen zodat kruisbesmetting van duiven

van de verschillende postduivenhouders op dat moment niet mogelijk was.

Elke staalname vond plaats door met een swab de keel en de choanespleet van de duif te

bemonsteren. Na de staalname werden de stalen steriel verpakt en ingevroren bij -20°C. Na

het verzamelen van de stalen werden deze ontdooid en naar het PCR-labo van de kliniek

‘Vogels en Bijzondere dieren’ in Gent overgebracht waar ze uiteindelijk verder verwerkt

werden.

1.2. DNA-BEREIDING

Om PCR op de stalen uit te kunnen voeren dient er eerst een speciale DNA-bereiding plaats

te vinden. Deze DNA-bereiding gaat als volgt:

Eerst werden de stalen per serie gesorteerd. Van bijna elke postduivenhouder werden een a-

en een b-staal van twee verschillende duiven genomen en genummerd als

‘serienummer.staalnummer+a of b’, bijvoorbeeld ‘6.24a’. De swabs werden uit hun steriele

verpakking genomen en één voor één in een epje geplaatst. Door middel van een microliter

pipet werd er aan elk epje 100 µL lyserende buffer toegevoegd. Deze buffer is commercieel

verkrijgbaar en heet ‘PrepMan Ultra’. Deze buffer werd direct door de swab opgenomen. Voor

26

het toevoegen van de buffer werd voor elk epje een nieuwe tip gebuikt om contaminatie van

de stalen te voorkomen. Vervolgens werd elke swab in zijn eigen tip uitgedrukt. Hierna

werden de swabs afgeknipt, zodat alleen het uiteinde van de swab in de tip bleef. De tip

bevond zich nog steeds in het epje. Vervolgens werden de epjes met daarin de tips en de

uiteinden van de swabs gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan de maximale snelheid van

13.000 RPM. Na het centrifugeren werden de tips met daarin de swab verwijderd en bleven

enkel de epjes met daarin het gecentrifugeerde materiaal over. De volgende stap in de DNA-

bereiding was het verhitten van de epjes en hun inhoud tot 100ºC voor een tijdsduur van 10

minuten. Door verhitting van het materiaal gaan de cellen lyseren en komt de inhoud van de

cellen met daarin ook het DNA vrij. Na 10 minuten tot 100ºC verhit te zijn geweest werden de

stalen afgekoeld tot kamertemperatuur. Vervolgens werden de stalen 1 op 10 verdund

overgebracht naar een speciale PCR-plaat waarna de PCR procedure kan starten. Bewaring

van dergelijke platen gebeurt het best in de vriezer bij een temperatuur van -20ºC.

Figuur 10: A) Staal in steriele verpakking; B) Swabs worden uitgedrukt in de tips waarmee de buffer aan de epjes werd toegevoegd; C) De lyserende buffer: PrepMan

TMUltra; D) De stalen worden gedurende 1

minuut aan een snelheid van 13000 RPM gecentrifugeerd; E) Vervolgens wordt de gecentrifugeerde fractie 10 minuten verhit tot 100°C; F) De stalen worden 1:10 verdund ,aangebracht op een microtiterplaat en vervolgens ingevroren

27

1.3. PCR-TECHNIEK

Zoals eerder vermeld hebben we voor de analyse van de stalen gebruik gemaakt van de

PCR-techniek. De PCR-techniek berust zowel voor de controle op de aanwezigheid van

Mycoplasma als voor de controle op de aanwezigheid van herpes op hetzelfde principe, maar

er zijn wel een aantal verschillen in de methodiek voor de analyse van de genomen stalen op

herpes en op Mycoplasma. Daarom worden naast het algemeen principe van de PCR-

techniek ook de beide protocols, voor zowel de PCR op Mycoplasma, als voor de PCR op

herpes nog eens apart en meer in detail besproken.

De PCR-techniek zelf bestaat uit een combinatie van een drietal fasen. In de eerste fase

worden de stalen, die daarvoor gemengd zijn met een speciale mix waarover later meer,

verhit tot een temperatuur van ongeveer 95°C. Door deze verhitting worden de

dubbelstrengige DNA-moleculen ontdubbeld en ontstaan er enkelvoudige DNA-moleculen.

Vervolgens begint de fase van het eigenlijke kopiëren van het DNA dat aanwezig is in het

staal. Hierbij wordt, afhankelijk van het soort organisme waarvan men het DNA kopieert, een

speciaal programma van verhitting en afkoeling gevolgd, waarover hierna meer verteld zal

worden. Na het afwerken van het programma worden de stalen nog enkele minuten op een

temperatuur van 72°C gehouden om de vorming van de nieuwe DNA-strengen te

completeren. Vervolgens worden de stalen afgekoeld tot een temperatuur van ongeveer 15°C

om het verkregen DNA-materiaal voor langere tijd te kunnen bewaren.

Het protocol van zowel het PCR onderzoek naar herpes als dat van het PCR onderzoek naar

de aanwezigheid van mycoplasma’s begint met het samenbrengen van 1 µL van elk staal met

24 µL van een zogenaamde ‘biomix’. De 1 µL van het staal bevat voldoende DNA-materiaal

om de PCR mee uit te voeren. De biomix is afkomstig van de firma ‘Bioline’ en bevat

verschillende bestanddelen die nodig zijn bij het uitvoeren van het PCR onderzoek. Zo bevat

de ‘biomix’ het enzym DNA-polymerase dat tijdens de PCR de enkelvoudige DNA-strengen

aanvult met nucleotiden totdat zich dubbelstrengige DNA-moleculen hebben gevormd. De

‘biomix’ bevat ook de nucleotiden welke ook wel dNTP’s (deoxyribonucleotide triphosphate)

genoemd worden. Een ander onmisbaar bestanddeel dat nodig is om het DNA-polymerase

zijn werk te laten doen is het magnesiumchloride (MgCl2). De ‘biomix’ is commercieel

verkrijgbaar in een geconcentreerde vorm. Voor gebruik dient men eerst de ‘biomix’ 1:1 te

verdunnen, vooraleer ze gebruikt kan worden voor de PCR.

Tot op dit moment in het proces verlopen de protocollen voor de PCR op herpes en de PCR

op Mycoplasma identiek. De volgende stap in het proces is het toevoegen van de primers die

nodig zijn om het DNA van de organismen waar onze interesse naar uit gaat te kunnen

repliceren.

28

Voor de PCR op herpes worden 2 soorten primers gebruikt. Het eerste soort primers dient

voor de eigenlijke PCR. Bij dit onderzoek werden de primers DFA (sequentie:

GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC), ILK (sequentie: TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNA)

en KG-1 (sequentie: GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT) gebruikt. Tevens wordt er een

zogenaamde ‘nested-PCR’ uitgevoerd met de primers TGV (sequentie:

TGTAACTGCGTGTAYGGNTTYACNGGNGT) en IYG (sequentie:

CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT). Een nested-PCR is een modificatie van de

conventionele PCR met het doel om niet-specifieke bindingen, die ontstaan door de

amplificatie van niet gewenste regio’s in het DNA waarmee de primers complementair zijn,

tegen te gaan.

Voor de PCR op Mycoplasma werden bij mijn onderzoek 2 primers gebruikt, namelijk GPO-1

(sequentie: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT) en MGSO (sequentie:

TGCACCATCTGTCACTCTGTT).

Na het toevoegen van de primers wordt het geheel van het DNA uit het staal, de ‘biomix’ en

de primers gecentrifugeerd met als doel een goede vermenging van de verschillende

componenten te bekomen.

Om achteraf te kunnen controleren of de PCR op de juiste manier uitgevoerd is werden er

naast de te testen stalen van het onderzoek ook positieve stalen aan de PCR toegevoegd. Dit

noemt men de ‘positieve controle’. Voor de PCR op Mycoplasma was dit Mycoplasma

columbinum en voor herpes waren dit de stam AG 770 en de stam 1473.

Na de voorgaande stappen werden de te onderzoeken stalen in de PCR-machine geplaatst

en werd het PCR-programma gestart. Voor de PCR op herpes ziet het programma van de

PCR-machine er als volgt uit:

3 minuten verhitten tot 95°C

40x herhalen: 30 seconden verhitten tot 94°C waarna 60 seconden afkoelen tot 43°C

waarna 60 seconden verhitten tot 72°C


Koelen tot 15°C

Het programma van de PCR voor de detectie van Mycoplasma sp. ziet er als volgt uit:


35x herhalen: 1 minuut verhitten tot 94°C waarna 30 seconden afkoelen tot 58°C

waarna 1,5 minuten verhitten tot 72°C


Koelen tot 15°C

29

De PCR-techniek werkt als het ware als een enorme kopieermachine. Omdat de drie fasen

van het programma een groot aantal keren herhaald werden zijn er miljoenen kopieën van de

oorspronkelijke DNA-molecule uit het staal gevormd.

1.4. GELELEKTROFORESE

Nadat het DNA-materiaal van Mycoplasma of herpes, wat mogelijks aanwezig was in de

stalen, gekopieerd was tot een meetbare hoeveelheid DNA-fragmenten werd er een

gelelektroforese uitgevoerd in het speciale Gelred-labo van de ‘Kliniek Bijzondere Huisdieren’

van de ‘Faculteit Diergeneeskunde’ in Merelbeke. De gelelektroforese start met het

aanmaken van de gelplaat waardoorheen de uiteindelijke gelelektroforese plaats zal vinden.

Om de gel aan te maken lost men agarose op in een speciale buffer, genaamd TBE. Voor dit

onderzoek werd 3 gram agarose vermengd met 200 ml buffer, zodat men een mengsel

verkreeg met daarin 1,5% agarose. Vervolgens werd het mengsel gedurende 3 minuten

gekookt in de microgolfoven op volle sterkte. Na het koken werd de agarose-gel uit de

microgolfoven genomen en werd er GelRed aan het nog vloeibare mengsel toegevoegd aan

de verhouding 1:20, dus 400 µL voor 200 ml agarose-gel. GelRed is een intercalerende

nucleïnezuurkleuring, die in de moleculaire biologie vaak gebruikt wordt voor onder andere

agarose gelelektroforese. De voornaamste eigenschap van deze stof is dat het fluorescerend

is. Bij blootstelling aan UV-licht, zal de stof oplichten met een oranje kleur. Het fluorescerend

vermogen van de stof neemt sterk toe na binding met DNA. Op deze manier kan DNA in de

gel met UV-belichting zichtbaar gemaakt worden. Na het toevoegen van de GelRed werd het

mengsel uitgegoten over 4 platen en werden de platen 15 tot 20 minuten met rust gelaten om

te stollen waarbij het van belang is dat er geen luchtbellen in de gel ontstaan.

Figuur 11: Electroforese van nested herpes PCR: L1: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp (Plus DNA Ladder ready-to-use), L2-13 stalen: 4.8b, 4.9a, 4.9b, 4.10a, 4.10b, 4.11a, 4.11b, 4.12a, 4.12b, 4;13a, 4.13b,4.14a, L14-15: positieve controles (+/- 200 bp), L16: negatieve controle.

30

Om de stalen voor te bereiden om ze deel te laten nemen aan de gelelektroforese, neemt

men een plaat met 96 welletjes, waarin men in elk welletje 3 µL van een gele ladingsbuffer

aanbrengt. Daarna voegt men 5 µL van het staal per welletje toe aan de ladingsbuffer.

Als laatste voorbereiding voordat de werkelijke gelelektroforese kon starten werd een

zogenaamde DNA-ladder toegevoegd (Gene Ruler). Een DNA-ladder is een oplossing van

DNA-moleculen, waarbij de lengte van deze DNA-moleculen bekend is. De lengte van DNA-

moleculen wordt uitgedrukt in baseparen (bp). De DNA-ladder wordt toegevoegd aan de

agarose-gel als een referentie waar de onbekende DNA-moleculen uit de stalen die in de

gelelektroforese getest worden mee vergeleken kunnen worden. Op deze manier kan men

een schatting maken van de lengte van het onbekende DNA. De lengte van de DNA-ladder

die voor de gelelektroforese van mijn onderzoek gebruikt werd bedraagt 100 bp.

Na de bereiding van de stalen werden deze op de platen geplaatst voor de eigenlijke

gelelektroforese. Bij een gelelektroforese als deze wordt er een stroom van 175 Volt gebruikt

om het DNA-materiaal doorheen de gelplaat te laten voortbewegen. De totale duur van de

gelelektroforese bedroeg telkens 75 minuten.

Om de resultaten van de gelelektroforese te bekijken werden de gelplaten na afloop op een

speciale UV-lichtbak geplaatst, waarbij het aan DNA-gebonden GelRed oplicht en zo de

bandjes van het aanwezige DNA in de gelplaat laat oplichten. Op deze manier kan men aan

de hand van de bandjes van de positieve controle bepalen of het DNA-materiaal in een

bepaald staal afkomstig is van het organisme waarop getest wordt (zie figuren 11 en 12).

Figuur 12: Electroforese van Mycoplasma genus PCR: L1: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp (Plus DNA-ladder ready-to-use), L2-13 stalen: 4.8b, 4.9a, 4.11a, 4.10a,4.9b, 4.11b, 4.12a, 4.14a, 4.13a, 4.13b, 4.12b, L14: positieve controle (+/- 717 bp), L15: negatieve controle

31

Soms komt het voor dat er zeer brede bandjes gevormd worden of bandjes op een andere

plek in de agarose-gel gevormd worden. Dit wijst op contaminatie van het DNA-materiaal.

Indien men hierdoor geen duidelijke conclusie kan trekken uit het patroon van de

fluorescerende bandjes kan men de PCR het best herhalen.

1.5. SEQUENERING

Nadat de PCR voor de detectie van Mycoplasma werd afgerond was het onderzoek nog niet

ten einde. Omdat er bij dit onderzoek naar het voorkomen van Mycoplasma bij duiven ook

voor gekozen is om, indien een staal positief is voor de aanwezigheid van Mycoplasma, ook

de specifieke soort Mycoplasma vast te stellen, werd er op de stalen die positief testten op

Mycoplasma een sequenering uitgevoerd, de zogenaamde ‘Sanger sequencing’. De ‘Sanger

sequencing’ is een methode voor DNA-sequenering welke gebaseerd is op de selectieve

opname van ketenbeëindigende dideoxynucleotiden door DNA-polymerase tijdens in vitro

DNA-replicatie. ‘Sanger sequencing’ wordt tegenwoordig alleen nog gebruikt voor

kleinschalige projecten en voor het bepalen van zeer lange DNA-sequenties van meer dan

500 nucleotiden lang. De DNA-sequenties in dit onderzoek zijn 700 nucleotiden lang en dus

is de ‘Sanger sequencing’ een geschikte methode om toe te passen voor dit onderzoek. De

sequenering gebeurde in een extern laboratorium in Duitsland waar de stalen per post

naartoe werden gestuurd. Alleen de DNA-strengen die gevormd werden aan de MGSO-

primers, welke een lengte van ongeveer 700 bp hebben, werden opgestuurd. Wat men na

enkele dagen terug gestuurd kreeg was per opgestuurd staal een digitaal bestand met daarin

de sequentie van het DNA-materiaal dat in dat specifieke staal aanwezig was. Met speciaal

hiervoor ontwikkelde software zoals ‘Chromas’ of ‘Nucleotide BLAST’ (Basic Local Alignment

Search Tool) kan men de computer de DNA-sequentie die men verkregen heeft met de

‘Sanger sequencing’ laten vergelijken met de specifieke DNA-sequenties in een database die

uniek zijn voor een bepaald soort organisme. In dit geval werden de sequenties dus

vergeleken met de sequentie van de verschillende soorten mycoplasma’s. Nadat de

computer klaar is met het vergelijken van de DNA-sequenties krijgt men een overzicht te zien

met de gerelateerde Mycoplasma-species en de graad van zekerheid dat die bepaalde

sequentie ook daadwerkelijk overeenkomt met een bepaalde soort Mycoplasma. Indien de

zekerheid voor verschillende Mycoplasma-species gelijk is kan op het niveau van de

nucleotiden nagegaan worden waar en hoeveel verschillen precies tussen de sequenties

aanwezig zijn. Zo kan men ook bij een gelijke zekerheid voor 2 verschillende Mycoplasma-

species nagaan welke soort Mycoplasma in de duif aanwezig was op het moment van de

staalname.

32

2. RESULTATEN

Het doel van dit onderzoek is om een inzicht te krijgen in het voorkomen van herpes (PHV-1)

en Mycoplasma sp. bij reisduiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in

Nederland. Het onderzoek is niet zozeer gebaseerd op het voorkomen van de klinische

symptomen van herpesvirose en/of mycoplasmose maar meer op het voorkomen van deze

organismen en een eventueel verband tussen het voorkomen van de twee organismen en de

eventuele gevolgen voor de gezondheid van de duif.

Voor het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 bij reisduiven werden in totaal 438 stalen

genomen bij 221 verschillende duivenliefhebbers. Van de meeste liefhebbers werden 2

duiven bemonsterd. Van 4 liefhebbers werd slechts 1 duif bemonsterd omdat zij op het

moment van de staalname maar slechts 1 duif bij zich hadden. Uit de resultaten van het

PCR-onderzoek bleek dat in totaal 134 stalen positief testten op de aanwezigheid van DNA

van PHV-1 (zie tabel 1). Als we de drie provincies waar de stalen genomen zijn met elkaar

vergelijken valt het op dat vooral de provincie Utrecht eruit springt met 42,5% van de stalen

die positief testen op de aanwezigheid van PHV-1. De provincies Zuid-Holland en Noord-

Holland bleven steken op percentages van respectievelijk 29,0% en 26,2%.

Een tweede vraag bij aanvang van dit onderzoek was de relatie tussen herpes en klinische

respiratoire problemen. Bij de staalname is de liefhebber, bij wijze van een in te vullen

formulier, gevraagd of zijn duiven op het moment van staalname of minder dan 6 maanden

voor de staalname last hebben gehad van ademhalingsstoornissen. Met

ademhalingsstoornissen werden dan vooral ornithose, kortademigheid, een ontstoken keel,

ronkende ademhalingsgeluiden of ontstoken ogen met eventueel ‘het vliesje’ erop bedoeld.

Van ‘het vliesje’ wordt heden ten dage vaak gesproken wanneer de duif een lichte ontsteking

van de bovenste luchtwegen heeft waarbij ook het oog betrokken is, maar dan in een

dusdanig milde vorm dat enkel het derde ooglid iets achterblijft wanneer de duif met zijn oog

knippert.

Provincie: Aantal

stalen

Herpes-

positief

Herpes-

Negatief

% Herpes-

positief

Utrecht 80 34 46 42,5%

Zuid-Holland 217 63 154 29,0%

Noord-Holland 141 37 104 26,2%

Totaal 438 134 304 30,6%

Tabel 1: Het voorkomen van PHV-1 bij duiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland

33

Uit het PCR-onderzoek bleek dat de percentages voor wat betreft het voorkomen van zowel

PHV-1 als respiratoire problemen bij de duif niet echt een duidelijke trend volgt (zie tabel 2).

Bij de liefhebbers, die op het moment van het nemen van de stalen, geen respiratoire

problemen voor een periode van meer dan 6 maanden bij hun duiven hadden waargenomen

testten procentueel gezien ongeveer evenveel duiven positief als bij de liefhebbers die zeiden

op het moment van staalname duiven op het hok te hebben met duidelijke

ademhalingsstoornissen (28,9% tegenover 29,7%). Bij de categorie van liefhebbers die

aangaven dat zij in de periode van minder dan 6 maanden voor het moment van de

staalname nog ademhalingsstoornissen bij hun duiven te hebben gehad, bleek 34,1% van de

stalen positief op de aanwezigheid van DNA-materiaal van PHV-1 te testen.

Ademhalings-

stoornissen:

Aantal

stalen

Herpes-

positief

Herpes-

Negatief

% Herpes-

positief

Nee 266 77 189 28,9%

Ja, < 6 maanden geleden 135 46 89 34,1%

Ja, op moment van

staalname aanwezig

37 11 26 29,7%

Totaal 438 134 304 30,6%

Tabel 2: Het voorkomen van PHV-1 bij duiven in Nederland gerelateerd aan de zichtbaarheid van respiratoire problemen voor de liefhebber

Voor het onderzoek is ook het voorkomen van PHV-1 bij duiven tijdens twee verschillende

seizoenen gevolgd. In het onderzoek zijn alleen de herfst en de winter opgenomen. Dit komt

omdat het onderzoek van eind juli 2013 tot half maart 2014 liep. Bijgevolg werden er dus

geen duiven bemonsterd in het voorjaar en zeer weinig in de zomer. Omdat het aantal

verkregen stalen in de zomer niet relevant was voor het totaal aantal stalen is de zomer ook

niet meegenomen in de beschouwing van de seizoensverschillen in het voorkomen van PHV-

1 bij duiven. Van alle stalen die genomen werden tijdens de herfst, die loopt van 21

september tot 20 december testten slechts 50 duiven positief op de aanwezigheid van PHV-1

(zie tabel 3). Dit komt neer op 23,8% positieve stalen. Van de stalen die in de winter werden

genomen testte maarliefst 35,2% van de stalen positief op de aanwezigheid van PHV-1. Het

totaal aantal stalen die voor de parameter ‘jaargetijde’ in beschouwing zijn genomen licht

lager dan het totaal aantal verzamelde stalen omdat er een klein aantal in de zomer van 2013

genomen is.

34

Jaargetijde Aantal

stalen

Herpes-

positief

Herpes-

Negatief

% Herpes-

positief

Herfst

(21-9-2013 t/m 20-12-2013)

210 50 160 23,8%

Winter

(21-12-2013 t/m 20-3-2014)

193 68 125 35,2%

Totaal 403 118 285 29,3%

Tabel 3: Het voorkomen van PHV-1 in 3 provincies in Nederland tijdens de herfst en de winter

Voor het onderzoek naar de prevalentie van Mycoplasma sp. bij reisduiven werden dezelfde

438 stalen gebruikt die ook voor het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 gebruikt

werden. Uit de PCR-analyse van deze 438 stalen bleek dat 174 stalen positief testten op de

aanwezigheid van DNA-materiaal afkomstig van een bepaalde soort Mycoplasma. Als we het

algemeen voorkomen van Mycoplasma sp. in de drie provincies met elkaar gaan vergelijken

dan valt op dat de provincies Utrecht en Zuid-Holland, met respectievelijk 41,3% en 44,7%

positief geteste stalen, een hogere prevalentie van Mycoplasma sp. kennen dan de provincie

Noord-Holland, waar slechts 31,2% van de genomen stalen positief testte op de

aanwezigheid van DNA-materiaal afkomstig van Mycoplasma sp. (zie tabel 4).

Als men dan het voorkomen van Mycoplasma sp. in relatie met het voorkomen van

ademhalingstoornissen bij duiven in beschouwing neemt, ziet men dat het voorkomen van

Mycoplasma sp. niet direct in verband gebracht kan worden met ademhalingsstoornissen. Zo

kan men uit de onderstaande tabel (zie tabel 5) opmaken dat het percentage positief testende

stalen in de groep duiven afkomstig van hokken waar nooit ademhalingsproblemen gezien

Provincie: Aantal

stalen

M.-

positief

M.-

negatief

% M.-

positief

Utrecht 80 33 47 41,3%

Zuid-Holland 217 97 114 44,7%

Noord-Holland 141 44 97 31,2%

Totaal 438 174 264 39,7%

Tabel 4: Het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland

35

worden gelijk is aan het percentage positief testende stalen in de groep duiven afkomstig van

hokken waar in de 6 maanden voor de staalname nog ademhalingsstoornissen

waargenomen zijn, namelijk 40,2% tegenover 40,7%. In de groep stalen afkomstig van

duiven, die gehuisvest zijn op een hok waar op het moment van staalname

ademhalingsstoornissen bij de duiven voorkwamen, testte zelfs maar 32,4% van de stalen

positief op Mycoplasma sp..

Bij de analyse van het voorkomen van Mycoplasma sp. in de herfst en de winter valt meteen

op dat Mycoplasma sp. in de winter meer voorkomt bij duiven dan in de herfst. Zo bleek uit de

PCR-analyse dat slechts 27,1% van de stalen die in de herfst genomen werden positief

testten op Mycoplasma sp., terwijl van de stalen die in de winter genomen werden meer dan

het dubbele percentage positief testten, namelijk 56%.

Jaargetijde

Aantal

stalen

M.-

positief

M.-

negatief

% M.-

positief

Herfst

(21-9-2013 t/m 20-12-2013)

210 57 153 27,1%

Winter

(21-12-2013 t/m 20-3-2014)

193 108 85 56,0%

Totaal 403 165 238 40,9%

Tabel 6: Het voorkomen van Mycoplasma sp. in 3 provincies in Nederland tijdens de herfst en de winter

Een volgende stap in de analyse van het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven was het

bepalen van welke soorten van Mycoplasma waar voorkomen en in welke mate zij

voorkomen in de drie provincies waar het onderzoek gehouden is. Uit onderstaande tabel (zie

Ademhalings-

stoornissen:

Aantal

stalen

M.-

positief

M.-

Negatief

% M.-

positief

Nee 266 107 159 40,2%

Ja, < 6 maanden geleden 135 55 80 40,7%

Ja, op moment van

staalname aanwezig

37 12 25 32,4%

Totaal 438 174 264 39,7%

Tabel 5: Het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven in Nederland gerelateerd aan de zichtbaarheid van respiratoire problemen voor de liefhebber

36

tabel 7) valt op te maken dat in elke provincie die deelneemt aan het onderzoek M.

columbinum het meest voorkomt. M. columbinasale kent ook een hoge prevalentie en M.

columborale komt in alle drie de provincies het minst voor. Categorie 4 in de tabel omvat de

stalen die wel positief testten op de aanwezigheid van DNA-materiaal van Mycoplasma sp.,

maar waarvan na sequenering niet duidelijk was tot welke soort van Mycoplasma ze

behoorden

Het probleem van de tabel met daarin de absolute aantallen positieve stalen is dat men uit

deze tabel moeilijk of niet kan opmaken hoe de verhouding tussen de verschillende soorten

mycoplasma’s in de drie verschillende provincies is. Daarom is er een staafdiagram

opgesteld welke de variatie in voorkomen van de verschillende soorten mycoplasma’s

Figuur 12: Staafdiagram over de prevalentie van de verschillende species van Mycoplasma’s in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland (1= M. columbinum, 2= M. columbinasale, 3= M. columborale, 4= ondefinieerbaar type)

Tabel 7: De prevalentie van de verschillende species van Mycoplasma’s in absolute aantallen in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland (1= M. columbinum, 2= M. columbinasale, 3= M. columborale, 4= ondefinieerbaar type)

Provincie: Aantal

stalen

Positief 1 2 3 4

Utrecht 80 33 23 6 3 1

Zuid-Holland 217 97 43 35 10 9

Noord-Holland 141 44 25 8 6 4

Totaal 438 174 91 49 19 14

37

weergeeft (zie figuur 13). Uit het staafdiagram valt duidelijk op te maken dat in de provincie

Utrecht het verschil in prevalentie tussen Mycoplasma columbinum (69,7%) en Mycoplasma

columbinasale (13,1%) veel groter is dan het verschil tussen dezelfde soorten mycoplasma’s

in de provincie Zuid-Holland (respectievelijk 44,3% en 36,1%). Verder valt uit de staafdiagram

ook op te maken dat de prevalenties van Mycoplasma columborale in de drie provincies die

aan het onderzoek deelnemen laag zijn en elkaar niet veel ontlopen.

De laatste en misschien wel belangrijkste parameter die voor het onderzoek belicht werd is

het al dan niet gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en Mycoplasma sp. bij duiven. En dan

meer specifiek hoe groot de prevalenties van de verschillende combinaties van deze twee

organismen gerelateerd aan een bepaalde categorie van ademhalingsstoornissen zijn (zie

tabel 8). De analyse van de stalen kende voor deze parameter van het onderzoek vier

verschillende uitkomsten, namelijk herpes-positief / Mycoplasma sp.-negatief, herpes-negatief

/ Mycoplasma sp.-positief, herpes-positief / Mycoplasma sp.-positief en herpes-negatief /

Mycoplasma sp.-negatief.

Bij beschouwing van de drie verschillende categorieën ziet men dat in de categorie ‘Nee’,

welke 266 stalen bevat afkomstig van de duiven van liefhebbers die nooit

ademhalingstoornissen bij hun duiven opmerken, slechts 46,6% van de stalen negatief

testten op de aanwezigheid van herpes én mycoplasma’s. Opvallend in deze categorie is dat

toch 15,8% positief test op zowel herpes als mycoplasma’s terwijl er bij deze duiven nooit

ademhalingsstoornissen zijn opgemerkt. Verder testte 13,2% van de stalen enkel positief

voor de aanwezigheid van herpes en testte 24,4% alleen positief voor de aanwezigheid van

mycoplasma’s.

De stalen afkomstig van de tweede categorie zijn afkomstig van liefhebbers die recent nog (<

6 maanden geleden) ademhalingsstoornissen bij hun duiven hebben opgemerkt. Van de

Tabel 8: Het gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en Mycoplasma sp. en de invloed hiervan op het optreden van ademhalingsstoornissen bij duiven

Ademhalings-

stoornissen:

Aantal

stalen

H+/M-

(%)

H-/M+

(%)

H+/M+

(%)

H-/M-

(%)

Nee 266 13,2% 24,4% 15,8% 46,6%

Ja, <6 maand geleden 135 17,7% 24,4% 16,3% 41,5%

Ja, op moment van

staalname aanwezig

37 16,2% 18,9% 13,5% 51,4%

Totaal 438 14,8% 24,0% 15,8% 45,4%

38

stalen in deze categorie testte ook nog 41,5% van de stalen negatief op zowel de

aanwezigheid van herpes als de aanwezigheid van mycoplasma’s. 16,3% van alle stalen in

deze categorie testte positief op de aanwezigheid van beide organismen. Bij 17,75% van de

stalen werd enkel de aanwezigheid van herpes vastgesteld en bij 24,4% van de stalen in

deze tweede categorie werd enkel positief getest op de aanwezigheid van mycoplasma’s.

De laatste categorie van het onderzoek, die de hokken omvat waarop zich op het moment

van de staalname duiven bevonden met ademhalingsstoornissen, bevatte 37 stalen. Van

deze 37 stalen testten er slechts 5 positief op zowel herpes als mycoplasma’s. Dit komt neer

op een percentage van 13,5%. Bij 19% van de stalen was er geen enkel spoor van de

aanwezigheid van herpes en mycoplasma’s terug te vinden. 18,9% van de stalen testte enkel

positief op de aanwezigheid van Mycoplasma sp. en 16,2% van de stalen bevatte alleen

DNA-materiaal van herpes.

3. DISCUSSIE

Uit de verschillende bronnen, die voor de literatuurstudie over herpesvirose bij duiven zijn

geraadpleegd, komt naar voren dat heden ten dage 50% tot zelfs 80% latent besmet zou zijn

met PHV-11,2,3,5,6,11,12

. Uit dit onderzoek daarentegen bleek dat slechts 30,6% van alle stalen

die genomen werden positief testten op PHV-1. Wat zou hier nu precies een verklaring voor

kunnen zijn?

Een verklaring voor het feit dat PHV-1 in de drie provincies van het onderzoek minder

voorkomt dan in de literatuur wordt beweerd is dat de prevalentie van PHV-1 per land of

gebied sterk kan verschillen. Zo zal de prevalentie van PHV-1 in een gebied met veel

duivenliefhebbers die aan een groot aantal wedvluchten per jaar deelnemen hoger zijn dan

de prevalentie van PHV-1 in een gebied met weinig duivenliefhebbers die aan slechts enkele

of helemaal geen wedvluchten deelnemen. Ook het klimaat van de gebieden die in alle

verschillende onderzoeken genoemd worden zou een rol kunnen spelen. Een andere

verklaring voor de verschillen in prevalentie kan zijn dat voor andere onderzoeken andere

methoden werden gebruikt om het virus aan te tonen. Zo zijn er ook een aantal onderzoekers

die naar antistoffen tegenover het PHV-1 in het serum van de duiven zochten2,3,5,6

. Voor deze

methode is, in tegenstelling tot de PCR-techniek die in dit onderzoek gebruikt is, geen actieve

virusuitscheiding nodig om de aanwezigheid van het virus in de duif aan te tonen. Verder is

voor dit onderzoek ook maar één tijdsopname gebruikt om de aanwezigheid van het virus aan

te tonen, terwijl voor andere onderzoeken misschien een aantal stalen per duif, met een

bepaald tijdsbestek ertussen, zijn genomen.

39

Een volgend punt van discussie is de uitkomst van het onderzoek naar het voorkomen van

PHV-1 in combinatie met ademhalingsstoornissen. Uit de resultaten van het onderzoek bleek

dat de prevalentie van PHV-1 bij de verschillende categorieën nagenoeg gelijkwaardig aan

elkaar zijn. Een verklaring hiervoor zou kunnen liggen bij de liefhebber zelf. In de duivensport

heerst een zogenaamde ‘machocultuur’ wat betekent dat duivenmelkers onderling elkaar niet

graag vertellen over wat hun duiven allemaal mankeren of gemankeerd hebben. Het is dan

ook maar de vraag of de liefhebbers het vragenformulier, dat bij de staalname is ingevuld,

naar waarheid is beantwoord. Een tweede mogelijke verklaring voor het feit dat de resultaten

in de verschillende categorieën nagenoeg gelijk aan elkaar zijn is dat de duivenliefhebber het

vaak simpelweg niet ziet of zijn duiven iets mankeren, waarbij het ook vaak voorkomt dat

duiven subklinisch geïnfecteerd zijn met PHV-1 en zij geen klinische symptomen van

herpesvirose vertonen. Een derde en laatste verklaring kan natuurlijk zijn dat het grootste

gedeelte van de ademhalingsstoornissen bij duiven niet enkel en alleen gerelateerd is aan

het voorkomen van PHV-1, maar dat het optreden van klinische herpesvirose en

multifactoriele oorzaak kent. Zo kan het zijn dat een infectie met PHV-1 alleen tot klinische

herpesvirose leidt indien er tegelijkertijd ook management- of huisvestingsproblemen

aanwezig zijn.

Wat ook uit het onderzoek naar voren kwam was dat de uitscheiding en daarmee de

prevalentie van PHV-1 bij duiven in de herfst veel lager is dan in de winter. Met respectievelijk

percentages van 23,8% en 35,2% is er een aannemelijk verschil tussen deze twee seizoenen

aanwezig. Een mogelijke verklaring is de toestand van de duiven in de herfst in vergelijking

met de toestand van de duiven in de winter. De herfst is in de duivensport het zogenaamde

rustseizoen. De duiven zijn dan in de rui en komen op de meeste hokken niet meer los. De

wedstrijden liggen stil en de geslachten worden vaak gescheiden. In de winter daarentegen

begint men in de duivensport vaak al vroeg met de kweek voor het nieuwe seizoen, wat

eigenlijk onfysiologisch is. Ook zijn er veel tentoonstellingen en worden de duiven

blootgesteld aan vaccinaties. Al deze handelingen en gebeurtenissen zorgen ervoor dat er

meer stress heerst onder de duiven en stress zou wel eens de aanleiding kunnen zijn voor de

verhoogde uitscheiding van PHV-1 in de winter. Eigenlijk zou het onderzoek een langere

looptijd moeten hebben waarbij ook het voorjaar en de zomer in de resultaten verwerkt

kunnen worden om zo de verschillende factoren voor een verhoogde aanwezigheid van PHV-

1 bij duiven vast te kunnen stellen.

Het tweede deel van dit onderzoek gaat over de prevalentie van Mycoplasma sp. bij duiven in

de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland. Volgens de literatuur is de prevalentie

van mycoplasma’s bij duiven hoog. Zelfs zo hoog dat bijna elk duivenbestand ter wereld wel

eens geïnfecteerd is geweest met mycoplasma’s. Shimuzu stelde, in een onderzoek waarbij

262 duiven onderzocht werden op de aanwezigheid van mycoplasma’s, vast dat bij 68,7%

van de onderzochte duiven mycoplasma’s aanwezig waren24.

40

Uit het onderzoek dat nu plaats heeft gevonden bleek dat slechts 39,7% van alle stalen

positief testte op de aanwezigheid van mycoplasma’s. Een verklaring hiervoor zou het

verschil in geografische ligging van de bemonsterde gebieden kunnen zijn. Het onderzoek

van Shimizu werd niet in dezelfde streek en zelfde periode uitgevoerd als dit onderzoek.

Klimaat, geografische ligging en tijd kunnen een belangrijke rol spelen in de uitkomsten van

een prevalentieonderzoek.

Voor wat betreft de 3 soorten mycoplasma’s die bij duiven voorkomen stelde Shimizu vast dat

43% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species Mycoplasma columbinum,

55% tot M. columborale en 2% tot de species M. columbinasale behoorde28,31

. De hiervoor

genoemde mycoplasma’s komen alleen bij duiven voor25

.

Uit het onderzoek dat nu heeft plaatsgevonden bleek dat de cijfers van nu toch wel enorm

verschillen met de cijfers die Shimizu in zijn onderzoeksverslag toonde. Zo bleek uit het

onderzoek van nu dat 52,3% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species

Mycoplasma columbinum, 28,2% behoorde tot de species Mycoplasma columbinasale en

slechts 10,9% behoorde tot de species Mycoplasma columborale. Nu is er in het onderzoek

van nu ook nog een bescheiden groep van stalen (8%) die wel positief testte op

mycoplasma’s maar waarvan na sequenering de species waartoe zij behoorden niet

vastgesteld kon worden. Desalniettemin kan men uit deze gegevens wel concluderen dat net

als vroeger Mycoplasma columbinum nog steeds veelvuldig voorkomt, maar dat Mycoplasma

columborale veelal minder voorkomt dan vroeger.

Voor wat betreft de onderlinge verschillen tussen de drie provincies die deelnamen aan het

onderzoek valt het op dat de verdeling van de verschillende soorten van mycoplasma’s in alle

drie de provincies anders is. Een verklaring hiervoor kan zijn dat er door het

wedvluchtensysteem, waarbij Nederland opgedeeld is in twaalf verschillende afdelingen,

duiven uit de ene provincie niet meer in contact komen met duiven uit de andere provincie.

Omdat in Nederland vóór het in werking treden van dit wedvluchtensysteem geen onderzoek

is gedaan naar de prevalentie van mycoplasma’s bij duiven kan men niet met zekerheid

zeggen dat dit ook daadwerkelijk van invloed is geweest op het ontstaan van dergelijke

verschillen in prevalentie.

Een ander punt van discussie is de uitkomst van het onderzoek naar het voorkomen van

mycoplasma’s in combinatie met ademhalingsstoornissen. Uit de resultaten van het

onderzoek bleek dat de prevalentie van mycoplasma’s in de verschillende categorieën

nagenoeg gelijkwaardig aan elkaar zijn. Een verklaring hiervoor zou, net als bij het onderzoek

naar de prevalentie van herpes bij duiven, kunnen liggen bij de liefhebber zelf. De liefhebber

kan het formulier niet naar waarheid ingevuld hebben, hij kan eventuele

41

ademhalingsstoornissen bij zijn duiven simpelweg niet gezien hebben omdat het bijvoorbeeld

subklinisch heerst bij zijn duiven of het kan zo zijn dat het optreden van

ademhalingsstoornissen niet gerelateerd is aan de aanwezigheid van mycoplasma’s bij

duiven.

Wat net als bij het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 bij duiven naar voren kwam,

was het grote verschil in uitscheiding en dus ook in prevalentie van Mycoplasma sp. tussen

de 2 verschillende seizoenen waarin het onderzoek uitgevoerd is, namelijk de herfst en de

winter. Van de stalen die in de herfst werden genomen testte slechts 27,1% positief voor de

aanwezigheid van mycoplasma’s, terwijl van de stalen die in de winter genomen werden 56%

positief testte op de aanwezigheid van mycoplasma’s. De verklaring die voor dit verschil kan

worden gegeven werd eerder in de tekst ook al aangehaald en zou kunnen berusten op

verhoogde stress die de duiven in de winter ondergaan omwille van het begin van het

kweekseizoen en de vele tentoonstellingen en vaccinaties. Net als bij het onderzoek naar de

prevalentie van PHV-1 zou het onderzoek eigenlijk een langere looptijd moeten hebben

waarbij ook het voorjaar en de zomer in de resultaten verwerkt kunnen worden om zo de

verschillende factoren voor een verhoogde aanwezigheid van mycoplasma’s bij duiven vast

te kunnen stellen.

Het derde deel van het onderzoek ging over het gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en

mycoplasma’s bij duiven en een eventuele invloed die er zou zijn op het optreden van

ademhalingsstoornissen bij de duif. In de literatuur was er geen informatie te vinden over het

gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s bij duiven. Uit de gegevens die bij het

onderzoek van nu verkregen werden kan opgemaakt worden dat het gezamenlijk voorkomen

van herpes en mycoplasma’s (herpes-positief / Mycoplasma sp.-positief) in de drie

verschillende categorieën van ademhalingsstoornissen (nee / ja,<6 maanden geleden / ja, op

moment van staalname aanwezig) schommelt rond het gemiddelde percentage van 15,8%.

Ook voor de andere combinaties van het voorkomen van de twee organismen (herpes-

positief / Mycoplasma sp.-negatief, herpes-negatief / Mycoplasma sp.-positief, en herpes-

negatief / Mycoplasma sp.-negatief) schommelen alle percentage van de verschillende

categorieën steeds rond het gemiddelde percentage (zie tabel 8). Met andere woorden

volgens dit onderzoek heeft het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s geen

invloed op het optreden van ademhalingsstoornissen bij duiven. Het is in ieder geval niet zo

dat enkel de aanwezigheid van mycoplasma’s en PHV-1 klinische ademhalingsstoornissen bij

duiven veroorzaken.

4. CONCLUSIE

Uit dit onderzoek zijn vooralsnog een aantal interessante gegevens naar voren gekomen.

Een eerste interessant gegeven, dat zowel geldt voor de prevalentie van PHV-1 als voor de

42

prevalentie van Mycoplasma sp. bij duiven in de drie deelnemende provincies, is dat de

prevalentie van zowel PHV-1 als van Mycoplasma sp. in het huidige onderzoek lager is dan in

de literatuur beschreven wordt.

Verder kan uit dit onderzoek geconcludeerd worden dat zowel herpes als mycoplasma’s

seizoensgebonden in meer of mindere mate uit de duiven te isoleren zijn. Dit vraagt echter

wel om verder en meer uitgebreid onderzoek om een zekere bevestiging te krijgen.

Voor wat betreft het belang van herpes en Mycoplasma sp.-infecties bij het optreden van

ademhalingsstoornissen bij duiven kan er uit de gegevens die in dit onderzoek verzameld zijn

een duidelijke conclusie getrokken worden. Het gezamenlijk voorkomen van herpes en

Mycoplasma sp. heeft geen invloed op het voorkomen van ademhalingsstoornissen bij

duiven. Het percentage van gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s verschilde

niet tussen de verschillende categorieën van duiven, die ingedeeld waren naar het

voorkomen van ademhalingsstoornissen op het hok vanwaar deze duiven afkomstig waren.

43

REFERENTIELIJST

1. Marlier D., Vindevogel H. (2006). Viral infections in pigeons. The Veterinary Journal

172, p. 40-51.

2. Tudor D.C. (1991). Pigeon Health and Disease. Iowa State University Press, Ames,

Iowa 50010, p. 34-38.

3. Vogel K. (1983). Taubenkrankheiten. Schober Verlags GmbH, Hengersberg, p. 74-

81.

4. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. I. Pathology

and virus isolation. Journal of Comparative Pathology 80, p. 221-227.

5. Martel A., Pasmans F., De Herdt P. (2007). Duivenziekten. Diergeneeskundig

memorandum 2, p. 35.

6. De Herdt P., Devriese L.(2000). Pigeons. In: Tully TN, Lawton M.P.C., Dorrestein

G.M. et al., editors. Avian Medicine. Oxford: Butterworth Heinemann, p. 312-338.

7. Vindevogel H., Duchatel J.P., Gouffeaux M., Pastoret P.P.(1977). Pigeon

herpesvirus: Susceptibility of avian and mammalian cell cultures to infection with

pigeon herpesvirus. Journal of Comparative Pathology 87, p. 605-610.

8. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. II.

Experimental Infection of Pigeons and Chicks. Journal of Comparative Pathology 80,

p. 229-232.

9. Gailbreath K.L., Oaks J.L. (2008). Herpesviral Inclusion Body Disease in Owls and

Falcons is caused by the Pigeon Herpesvirus (Columbid Herpesvirus 1). Journal of

wildlife diseases 44.2, p. 427-433.

10. Aini, I., et al. (1993). Comparison of herpesvirus isolates from falcons, pigeons and

psittacines by restriction endonuclease analysis. Journal of wildlife diseases 29.2, p.

196-202.

11. Vindevogel H., Debruyne H. (1985). Observation of Pigeon Herpesvirus 1: Re-

excretion during the Reproduction period in conventionally reared Homing Pigeons.

Journal of Comparative Pathology 95, p. 105-112.

12. Harlin R., Wade L. (2009). Bacterial and parasitic diseases of columbiformes.

Veterinary Clinics of North America Exotic Animal Practice 12, 453-473.

13. Vindevogel H., Pastoret P.P., Leroy P. (1982). Vaccination Trials against Pigeon

Herpesvirus Infection (Pigeon Herpesvirus 1). Journal of Comparative Pathology 92,

p. 483-494.

14. Vindevogel H., Pastoret P.P. (1980). Pigeon Herpes Infection: Natural Transmission

of the Disease. Journal of Comparative Pathology 90, p. 409-413.

15. Vindevogel H., Pastoret P.P. (1981). Pathogenesis of Pigeon Herpesvirus Infection.

Journal of Comparative Pathology 91, p. 415-426.

44

16. Vindevogel H., Pastoret P.P., Burtonboy G. (1980). Pigeon Herpes Infection:

Excretion and Re-excretion of Virus after experimental Infection. Journal of

Comparative Pathology 90, p. 401-408.

17. Coignoul F., Vindevogel H. (1980). Cellulair changes in the Bursa of Fabricius and

thymus of cyclophosphamide-treated pigeons. Journal of Comparative Pathology 90,

p. 395-400.

18. Messana M., Kösters J., Grund C. (1997). Studies on reactivation and transmission of

pigeon herpes virus (PHV) for raising PHV-free pigeons (Columba livia dom.), Avian

Pathology 26:4, p. 859-864.

19. Mohammed M.A., Sokker S.M., Tantawi H.H. (1978). Contagious paralysis of

pigeons. Avian Pathology 7, p. 637-643.

20. Gough R.E. et al. (1988). Routine virus isolation or detection in the diagnosis of

diseases in birds, Avian Pathology 17:4, p. 893-907.

21. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. III. Use of

Embryonated Eggs for the Growth and Characterization of the Virus. Journal of

Comparative Pathology 80, p. 509-515.

22. Vindevogel H., Pastoret P.P., Aguilar-Setien A. (1982). Assessment of

phosphonoformate-treatment of pigeon herpesvirus infections in pigeons and

budgerigars and Aujeszky disease in rabbits. Journal of Comparative Pathology 92,

p. 177-180.

23. Schwers A., Vindevogel H., Leroy P. & Pastoret P.P. (1981). Susceptability of

different strains of pigeon herpesvirus to trisodium phosphonoformate, Avian

Pathology 10:1, p. 23-29.

24. Thiry E. et al. (1983) In vivo and in vitro effect of acyclovir on pseudorabies virus,

infectious bovine rhinotracheïtis virus and pigeon herpesvirus, Annales de recherches

vétérinaires. Annals of veterinary research 14.3 : 239

25. Tudor D.C. (1991). Pigeon Health and Disease. Iowa State University Press, Ames,

Iowa 50010, p. 94-98.

26. Vogel K. (1983). Taubenkrankheiten. Schober Verlags GmbH, Hengersberg, p. 131-

137.

27. Keymer I.F. et al. (1984). Isolation of Mycoplasma spp. from racing pigeons

(Columbia Livia). Avian pathology 13:1, p. 65-74.

28. Nagatomo H., Kato H., Shimizu T. & Katayama B. (1997). Isolation of mycoplasmas

from fantail pigeons. Journal of Veterinay Medical Science 59, p. 461-462.

29. Loria G.R. et al.(2005). Isolation of mycoplasmas from pigeons suffering eye lesions

and respiratory disease. Veterinary Record 2005 157, p. 664-665.

30. Beneina D., Dorrer D. & Tadina T. (1987). Mycoplasma species isolated from six

avian species. Avian Pathology 16:4, p. 653-663.

31. Turcsányi I. et al. (2005). Isolation of Mycoplasma columbinasale from pigeons in

Hungary. Veterinary Record 2005 157, p. 235-236.

45

32. Shimizu T. et al. (1978). Isolation and characterisation of Mycoplasma columbinum

and Mycoplasma columborale, two new species from pigeons. International Journal

of Systematic Bacteriology 28, p. 538-546.

33. Guo Z. et al. (2013). Genome sequence of Mycoplasma columbinum Strain SF7.

Genome Announc. 1(2):e00157-13.

34. Davison A.J. (2002) Evolution of the herpesviruses. Veterinary microbiology 86.1: p.

69-88

35. Mc Geoch, Duncan J., Rixon F.J & Davison A.J. (2006). Topics in herpesvirus

genomics and evolution. Virus research 117.1: p. 90-104.

46

BIJLAGE

SERIE 1

Staalnr Datum Provincie Plaats AH-

probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.

1.1a 26-7-2013 Noord-Holland Marken 1 + 1

1.1b 26-7-2013 Noord-Holland Marken 1 - -

1.2a 26-7-2013 Utrecht Bilthoven 1 + -

1.2b 26-7-2013 Utrecht Bilthoven 1 - -

1.3 30-7-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 3 - 1

1.4a 30-7-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 1 - 1

1.4b 30-7-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 1 - -

1.5a 30-7-2013 Utrecht De Bilt 1 - -

1.5b 30-7-2013 Utrecht De Bilt 1 + -

1.6 16-8-2013 Utrecht Vreeland 1 + -

1.7 16-8-2013 Utrecht Hilversum 2 + 1

1.8a 27-8-2013 Noord-Holland Zaandam 3 + -

1.8b 27-8-2013 Noord-Holland Zaandam 3 - 1

1.9a 2-9-2013 Utrecht De Bilt 3 + -

1.9b 2-9-2013 Utrecht De Bilt 3 + -

1.10a 2-9-2013 Utrecht Driebergen 3 + -

1.10b 2-9-2013 Utrecht Driebergen 3 + 1

1.11a 2-9-2013 Utrecht De Bilt 2 - -

1.11b 2-9-2013 Utrecht De Bilt 2 - 1

1.12a 9-9-2013 Noord-Holland Uitgeest 2 - -

1.12b 9-9-2013 Noord-Holland Uitgeest 2 + -

1.13a 9-9-2013 Noord-Holland Heemskerk 3 + -

1.13b 9-9-2013 Noord-Holland Heemskerk 3 + -

1.14a 10-9-2013 Utrecht Kamerik 3 - -

1.14b 10-9-2013 Utrecht Kamerik 3 + 2

1.15a 10-9-2013 Utrecht Utrecht 1 - 2

1.15b 10-9-2013 Utrecht Utrecht 1 + -

1.16a 13-9-2013 Noord-Holland Den Helder 2 + -

1.16b 13-9-2013 Noord-Holland Den Helder 2 - -

1.17a 13-9-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 2 - -


47

1.18a 4-10-2013 Zuid-Holland Gouderak 2 - -

1.18b 4-10-2013 Zuid-Holland Gouderak 2 + -

1.19a 4-10-2013 Noord-Holland Uithoorn 3 + -

1.19b 4-10-2013 Noord-Holland Uithoorn 3 - -

1.20a 5-10-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 2 - -

1.20b 5-10-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 2 - -

1.21a 1-9-2013 Zuid-Holland Boskoop 2 - -

1.21b 1-9-2013 Zuid-Holland Boskoop 2 - -


1.22b 31-8-2013 Zuid Holland Alphen a/d Rijn 2 - -

SERIE 2


probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.

2.1a 19-10-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - -

2.1b 19-10-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - -

2.2a 26-10-2013 Zuid-Holland Bodegraven 2 - -

2.2b 26-10-2013 Zuid-Holland Bodegraven 2 + 3


2.3b 26-10-2013 Zuid-Holland Bodegraven 2 - 1

2.4a 27-10-2013 Zuid-Holland Nieuwerkerk 2 - 2

2.4b 27-10-2013 Zuid-Holland Nieuwerkerk 2 - 2

2.5a 8-11-2013 Zuid-Holland Dordrecht 2 + 3

2.5b 8-11-2013 Zuid-Holland Dordrecht 2 - 3

2.6a 8-11-2013 Zuid-Holland Dordrecht 3 - 3

2.6b 8-11-2013 Zuid-Holland Dordrecht 3 - -


2.7b 9-11-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 2 + -

2.8a 9-11-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 2 + -


2.9a 11-11-2013 Zuid-Holland Gouderak 3 - -

2.9b 11-11-2013 Zuid-Holland Gouderak 3 - -

2.10a 11-11-2013 Zuid-Holland Rotterdam 2 - -

2.10b 11-11-2013 Zuid-Holland Rotterdam 2 - -

2.11a 11-11-2013 Noord-Holland Landsmeer 3 - -

2.11b 11-11-2013 Noord-Holland Landsmeer 3 + -

48

2.12a 11-11-2013 Noord-Holland Groot-Ammers 2 - -

2.12b 11-11-2013 Noord-Holland Groot-Ammers 2 - -

2.13a 11-11-2013 Utrecht De Meern 1 - 2

2.13b 11-11-2013 Utrecht De Meern 1 - -

2.14a 11-11-2013 Noord-Holland Haarlem 3 + -

2.14b 11-11-2013 Noord-Holland Haarlem 3 - -

2.15a 12-11-2013 Noord-Holland Oostzaan 3 - 4

2.15b 12-11-2013 Noord-Holland Oostzaan 3 - -

2.16a 12-11-2013 Zuid-Holland Berkel en R. 2 - -

2.16b 12-11-2013 Zuid-Holland Berkel en R. 2 - -

2.17a 13-11-2013 Noord-Holland Nieuw Vennep 3 - -

2.17b 13-11-2013 Noord-Holland Nieuw Vennep 3 + -

2.18a 13-11-2013 Utrecht Nieuwegein 2 - -

2.18b 13-11-2013 Utrecht Nieuwegein 2 - -

2.19a 13-11-2013 Zuid-Holland Krimpen a/d Ij. 3 - -

2.19b 13-11-2013 Zuid-Holland Krimpen a/d Ij. 3 - -

2.20a 13-11-2013 Zuid-Holland Vlaardingen 3 - -

2.20b 13-11-2013 Zuid-Holland Vlaardingen 3 + 2

2.21a 13-11-2013 Zuid-Holland Vlaardingen 3 - -

2.21b 13-11-2013 Zuid-Holland Vlaardingen 3 - -

2.22a 13-11-2013 Zuid-Holland Leidschendam 1 - -

2.22b 13-11-2013 Zuid-Holland Leidschendam 1 - -

2.23a 15-11-2013 Noord-Holland Amsterdam 1 - -

2.23b 15-11-2013 Noord-Holland Amsterdam 1 - -



2.25a 13-11-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 2 - 1

2.25b 13-11-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 2 + -

2.26a 15-11-2013 Utrecht Kockengen 2 - -

2.26b 15-11-2013 Utrecht Kockengen 2 - -

2.27a 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 - -






2.30a 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 + -



49





2.33b 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 + -

2.34a 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 + 1










2.39a 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 - 1



2.40b 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 - 1





2.43b 17-11-2013 Noord-Holland Marken 3 - 1

2.44a 17-11-2013 Noord-Holland Driehuis 3 - -

2.44b 17-11-2013 Noord-Holland Driehuis 3 - -

2.45a 17-11-2013 Noord-Holland Bloemendaal 3 - -

2.45b 17-11-2013 Noord-Holland Bloemendaal 3 - -

2.46a 17-11-2013 Noord-Holland Haarlem 2 - 1

2.46b 17-11-2013 Noord-Holland Haarlem 2 - -

2.47a 17-11-2013 Noord-Holland Ijmuiden 3 - -

2.47b 17-11-2013 Noord-Holland Ijmuiden 3 - -

2.48a 18-11-2013 Utrecht Amerongen 1 - -

2.48b 18-11-2013 Utrecht Amerongen 1 - -

2.49a 24-11-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - 3

2.49b 24-11-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - 1

2.50a 24-11-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - 4

2.51a 16-12-2013 Noord-Holland Aalsmeer 3 - -

2.51b 16-12-2013 Noord-Holland Aalsmeer 3 - -

50

2.52a 16-12-2013 Noord-Holland Loosdrecht 3 - -

2.52b 16-12-2013 Noord-Holland Loosdrecht 3 - 1

SERIE 3


probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.

3.1a 13-12-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 3 + 1





3.3b 13-12-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 3 + 3


3.4b 13-12-2013 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 3 - 1







3.8a 13-12-2013 Zuid-Holland Koudekerk 2 - 3

3.8b 13-12-2013 Zuid-Holland Koudekerk 2 + -

3.9a 13-12-2013 Zuid-Holland Koudekerk 2 + -

3.9b 13-12-2013 Zuid-Holland Koudekerk 2 - -



3.11a 13-12-2013 Zuid-Holland Aarlanderveen 2 - 3

3.11b 13-12-2013 Zuid-Holland Aarlanderveen 2 + 1








3.15b 14-12-2013 Zuid-Holland Bodegraven 3 - -

51



3.17a 14-12-2013 Zuid-Holland De Meije 3 - -

3.17b 14-12-2013 Zuid-Holland De Meije 3 + -







3.21a 14-12-2013 Utrecht Hekendorp 2 - 1

3.21b 14-12-2013 Utrecht Hekendorp 2 - 1









3.26a 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 - 1

3.26b 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 + 3

3.27a 13-12-2013 Zuid-Holland Vrouwenakker 3 - -

3.27b 13-12-2013 Zuid-Holland Vrouwenakker 3 - -

3.28a 13-12-2013 Zuid-Holland Nieuwveen 3 - -

3.28b 13-12-2013 Zuid-Holland Nieuwveen 3 - -



3.30a 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 - -

3.30b 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 - 3

3.31a 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 - -

3.31b 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 - -

3.32a 13-12-2013 Zuid-Holland Ter Aar 3 + -


3.33a 13-12-2013 Zuid-Holland Nieuwveen 2 - 1

3.33b 13-12-2013 Zuid-Holland Nieuwveen 2 + 1

3.34a 13-12-2013 Noord-Holland De Kwakel 3 - 2

3.34b 13-12-2013 Noord-Holland De Kwakel 3 - 4

3.35a 13-12-2013 Zuid-Holland Zevenhoven 3 + -

52

3.35b 13-12-2013 Zuid-Holland Zevenhoven 3 + 1

3.36a 13-12-2013 Zuid-Holland Aarlanderveen 3 + 4

3.36b 13-12-2013 Zuid-Holland Aarlanderveen 3 - -

3.37a 13-12-2013 Zuid-Holland Zevenhoven 3 + 4

3.37b 13-12-2013 Zuid-Holland Zevenhoven 3 - 4



3.39a 13-12-2013 Zuid-Holland Nieuwveen 3 + 1


3.40a 20-12-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 3 + -

3.40b 20-12-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 3 - 1

3.41a 20-12-2013 Utrecht Woerden 3 - -

3.41b 20-12-2013 Utrecht Woerden 3 - 1

3.42a 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 + -

3.42b 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 - 1

3.43a 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 + -

3.43b 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 + -

3.44a 20-12-2013 Utrecht Hekendorp 2 + -

3.44b 20-12-2013 Utrecht Hekendorp 2 + -



3.46a 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 - 1





3.48b 20-12-2013 Utrecht Woerden 2 - -





SERIE 4


probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.

4.1a 16-12-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 3 + 4

53

4.1b 16-12-2013 Zuid-Holland Reeuwijk 3 - 2

4.2 30-12-2013 Zuid-Holland Leerdam 3 - -

4.3a 30-12-2013 Utrecht Benschop 3 - 1

4.3b 30-12-2013 Utrecht Benschop 3 + -

4.4a 30-12-2013 Utrecht Benschop 3 - 1

4.4b 30-12-2013 Utrecht Benschop 3 - 2

4.5a 5-1-2014 Noord-Holland Santpoort 3 - -

4.5b 5-1-2014 Noord-Holland Santpoort 3 - -

4.6a 6-1-2014 Utrecht Maarssen 3 - -

4.6b 6-1-2014 Utrecht Maarssen 3 + 2

4.7a 6-1-2014 Utrecht Utrecht 3 - -

4.7b 6-1-2014 Utrecht Utrecht 3 - -

4.8a 6-1-2014 Utrecht Driebergen 2 - 1

4.8b 6-1-2014 Utrecht Driebergen 2 - 1

4.9a 6-1-2014 Utrecht Driebergen 3 + -

4.9b 6-1-2014 Utrecht Driebergen 3 + -

4.10a 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 - 4

4.10b 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 - 1

4.11a 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 + 3

4.11b 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 + 1

4.12a 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 + 1

4.12b 7-1-2014 Utrecht Utrecht 3 + 1

4.13a 7-1-2014 Zuid-Holland Ameide 3 - 1

4.13b 7-1-2014 Zuid-Holland Ameide 3 + -

4.14a 7-1-2014 Zuid-Holland Leidschendam 1 + -

4.14b 7-1-2014 Zuid-Holland Leidschendam 1 + 2

4.15a 8-1-2014 Utrecht Veenendaal 3 + 1

4.15b 8-1-2014 Utrecht Veenendaal 3 + 1

4.16a 13-1-2014 Zuid-Holland Leerdam 1 + 2

4.16b 13-1-2014 Zuid-Holland Leerdam 1 + -

4.17a 13-1-2014 Noord-Holland Amsterdam 2 + -


4.18a 20-1-2014 Noord-Holland Badhoevedorp 3 - -

4.18b 20-1-2014 Noord-Holland Badhoevedorp 3 - 3

4.19a 20-1-2014 Noord-Holland Uithoorn 2 + 1

4.19b 20-1-2014 Noord-Holland Uithoorn 2 + 4

4.20a 20-1-2014 Noord-Holland Loosdrecht 3 - 1

4.20b 20-1-2014 Noord-Holland Loosdrecht 3 + -

4.21a 20-1-2014 Noord-Holland Hilversum 3 + 2

54

4.21b 20-1-2014 Noord-Holland Hilversum 3 + 1

4.22a 21-1-2014 Noord-Holland Huizen 2 + 2

4.22b 21-1-2014 Noord-Holland Huizen 2 - -

4.23a 21-1-2014 Noord-Holland Huizen 1 - 3

4.23b 21-1-2014 Noord-Holland Huizen 1 - 1

4.24a 21-1-2014 Noord-Holland Nrd-Beemster 2 - 3

4.24b 21-1-2014 Noord-Holland Nrd-Beemster 2 + -

4.25a 27-1-2014 Noord-Holland Uitgeest 3 - 3

4.25b 27-1-2014 Noord-Holland Uitgeest 3 - -

4.26a 27-1-2014 Zuid-Holland Gouda 1 - -

4.26b 27-1-2014 Zuid-Holland Gouda 1 - -

4.27a 28-1-2014 Noord-Holland Nieuw-Vennep 3 - 4

4.27b 28-1-2014 Noord-Holland Nieuw-Vennep 3 - 1

4.28a 29-1-2014 Noord-Holland Mijdrecht 1 + 1

4.28b 29-1-2014 Noord-Holland Mijdrecht 1 - 1

4.29a 3-2-2014 Utrecht Veenendaal 2 - 3

4.29b 3-2-2014 Utrecht Veenendaal 2 + -

4.30a 6-2-2014 Noord-Holland Zaandam 3 - 1

4.30b 6-2-2014 Noord-Holland Zaandam 3 + 1

4.31a 7-2-2014 Utrecht Vinkeveen 3 + 1

4.31b 7-2-2014 Utrecht Vinkeveen 3 + 1

4.32a 7-2-2014 Noord-Holland Zaandam 3 - -


4.33a 9-2-2014 Zuid-Holland Sassenheim 2 - -

4.33b 9-2-2014 Zuid-Holland Sassenheim 2 - -

4.34a 10-2-2014 Zuid-Holland Sassenheim 3 - 1

4.34b 10-2-2014 Zuid-Holland Sassenheim 3 + 1

4.35a 10-2-2014 Noord-Holland Driehuis 3 + -

4.35b 10-2-2014 Noord-Holland Driehuis 3 - 2


4.36b 11-2-2014 Utrecht Utrecht 3 + -


4.37b 17-2-2014 Utrecht Utrecht 1 - -

4.38a 18-2-2014 Noord-Holland Amsterdam 3 + 4

4.38b 18-2-2014 Noord-Holland Amsterdam 3 - 1

4.39a 18-2-2014 Zuid-Holland Krimpen a/d Ij. 3 - -

4.39b 18-2-2014 Zuid-Holland Krimpen a/d Ij. 3 + 1

4.40a 18-2-2014 Noord-Holland Amstelveen 2 + 2

4.40b 18-2-2014 Noord-Holland Amstelveen 2 + 1

55

4.41a 20-2-2014 Utrecht De Hoef 3 + -

4.41b 20-2-2014 Utrecht De Hoef 3 - 1

4.42a 25-2-2014 Noord-Holland Zaandam 2 + 3

4.42b 25-2-2014 Noord-Holland Zaandam 2 + 3


4.43b 25-2-2014 Noord-Holland Amsterdam 3 + 1

4.44a 25-2-2014 Utrecht Maarssen 2 + 1

4.44b 25-2-2014 Utrecht Maarssen 2 - 3

4.45a 25-2-2014 Noord-Holland Kortenhoef 3 - -

4.45b 25-2-2014 Noord-Holland Kortenhoef 3 + 1

4.46a 3-3-2014 Zuid-Holland Gouda 3 - -

4.46b 3-3-2014 Zuid-Holland Gouda 3 - -

4.47a 4-3-2014 Noord-Holland Zaandam 1 + 2


4.48a 5-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 + 2

4.48b 5-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 + -

4.49a 7-3-2014 Noord-Holland Krommenie 3 - -

4.49b 7-3-2014 Noord-Holland Krommenie 3 + 1

4.50a 7-3-2014 Noord-Holland Krommenie 3 - -

4.50b 7-3-2014 Noord-Holland Krommenie 3 - -

4.51a 7-3-2014 Utrecht Amersfoort 3 - -

4.51b 7-3-2014 Utrecht Amersfoort 3 + -

4.52a 10-3-2014 Noord-Holland Heemskerk 2 + -

4.52b 10-3-2014 Noord-Holland Heemskerk 2 + -

4.53a 10-3-2014 Noord-Holland Uitgeest 3 + -

4.53b 10-3-2014 Noord-Holland Uitgeest 3 + -

SERIE 5


probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.

5.1a 27-12-2013 Noord-Holland Zaandam 3 - 1



5.2b 27-12-2013 Noord-Holland Zaandam 3 - -



56







5.7a 27-12-2013 Noord-Holland Koog a/d Zaan 3 - -

5.7b 27-12-2013 Noord-Holland Koog a/d Zaan 3 - -

5.8a 27-12-2013 Noord-Holland Zaandijk 2 - -

5.8b 27-12-2013 Noord-Holland Zaandijk 2 - -

5.9a 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 - -

5.9b 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 + -






5.12b 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 - -

5.13a 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 - 1

5.13b 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 - 2

5.14a 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 + 1

5.14b 29-12-2013 Zuid-Holland Wassenaar 3 - 1





5.17a 29-12-2013 Zuid-Holland Leiden 3 - 2

5.17b 29-12-2013 Zuid-Holland Leiden 3 - 2

SERIE 6


probleem

(1=Ja)

(2=Ja,<6

mnd.)

(3=Nee)

Herpes Mycoplasma

1= -inum

2=-inasale

3=-orale

4= ondef.



6.2a 6-2-2014 Zuid-Holland Bodegraven 3 - 2


57


6.3b 6-2-2014 Zuid-Holland Alphen a/d Rijn 2 - 4

6.4a 8-2-2014 Zuid-Holland Rijswijk 2 - 1

6.4b 8-2-2014 Zuid-Holland Rijswijk 2 - 1

6.5a 8-2-2014 Zuid-Holland Voorburg 3 + -

6.5b 8-2-2014 Zuid-Holland Voorburg 3 - -

6.6a 8-2-2014 Zuid-Holland Nootdorp 3 + 2

6.6b 8-2-2014 Zuid-Holland Nootdorp 3 + 1

6.7a 8-2-2014 Zuid-Holland Delft 3 - 2

6.7b 8-2-2014 Zuid-Holland Delft 3 + 2

6.8a 8-2-2014 Zuid-Holland Nootdorp 3 - 2

6.8b 8-2-2014 Zuid-Holland Nootdorp 3 - 4

6.9a 14-2-2014 Zuid-Holland Dordrecht 2 - -

6.9b 14-2-2014 Zuid-Holland Dordrecht 2 - 1

6.10a 15-2-2014 Zuid-Holland Noorden 3 - 2

6.10b 15-2-2014 Zuid-Holland Noorden 3 - 2

6.11a 16-2-2014 Utrecht Breukelen 3 - 2

6.11b 16-2-2014 Utrecht Breukelen 3 - 1

6.12a 22-2-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 3 + 1

6.12b 22-2-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 3 - 2

6.13a 22-2-2014 Zuid-Holland Gouda 3 + 1

6.13b 22-2-2014 Zuid-Holland Gouda 3 - 2

6.14a 22-2-2014 Zuid-Holland Gouda 3 - 2

6.14b 22-2-2014 Zuid-Holland Gouda 3 - 2

6.15a 22-2-2014 Zuid-Holland Stolwijk 2 + -

6.15b 22-2-2014 Zuid-Holland Stolwijk 2 - 2

6.16a 2-3-2014 Zuid-Holland Ammerstol 2 - 1

6.16b 2-3-2014 Zuid-Holland Ammerstol 2 + 1

6.17a 3-3-2014 Zuid-Holland Nieuwkoop 2 - -

6.17b 3-3-2014 Zuid-Holland Nieuwkoop 2 - 4

6.18a 15-3-2014 Zuid-Holland Waddinxveen 2 + 2

6.18b 15-3-2014 Zuid-Holland Waddinxveen 2 + 1

6.19a 15-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 - 2

6.19b 15-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 - 2

6.20a 15-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 - -

6.20b 15-3-2014 Zuid-Holland Moerkapelle 3 + -

6.21a 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 2 - -

6.21b 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 2 - 1

6.22a 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 2 - -

58

6.22b 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 2 + -

6.23a 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 3 - 1

6.23b 15-3-2014 Zuid-Holland Zevenhuizen 3 + 1

6.24a 16-3-2014 Zuid-Holland Ter Aar 3 + -

6.24b 16-3-2014 Zuid-Holland Ter Aar 3 - 2


6.25b 16-3-2014 Zuid-Holland Ter Aar 3 - -





6.28a 16-3-2014 Zuid-Holland Zwammerdam 2 - 1

6.28b 16-3-2014 Zuid-Holland Zwammerdam 2 - 1

Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van...

Documents

Transcript of Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van...