UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 – 2015

Essentiële stappen in het proces van invriezen hengsten sperma

Door

Suzanne MOOREN

Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader

Kim Roels van de Masterproef

© 2015 Suzanne Mooren

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de

juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze

masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de

masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de

masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 – 2015

Essentiële stappen in het proces van invriezen hengsten sperma

Door

Suzanne MOOREN

Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader

Kim Roels van de Masterproef

© 2015 Suzanne Mooren

VOORWOORD

Als eerste wil ik graag Prof. Dr. Peter Daels en Kim Roels bedanken voor het begeleiden, nakijken en

tot een goed resultaat brengen van dit werk.

Dierenarts Rijk-Jan Pleijter wil ik graag bedanken voor de dag stage bij een hengstenhouderij. Dit

heeft het voor mij mogelijk gemaakt om het onderwerp van deze masterproef beter voor te kunnen

stellen in praktijk.

Mijn ouders, Karin van Dort & Hans Mertens, wil ik bedanken voor het nalezen van dit werk en hun al

hun steun door de jaren heen.

Als laatste wil ik dit werk opdragen aan een mogelijk toekomstig fries veulen. Het toeval heeft besloten

om mij bij een hengstenshow de gelukkige winnaar te maken van een gratis dekking. Weliswaar met

gekoeld sperma, maar dat mag de pret niet drukken.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING…………………………………………………………………………….…………… 1

INLEIDING……………………………………………………………………….………………………… 2

1. Algemeen……………………………………………………………………………………………….. 2

1.1. Basisprincipes invriezen/ontdooien cellen………………………………………………….…. 2

1.1.1. Celmembraan…………………………………………………….………………………… 2

1.1.2. Celmetabolisme…………………………………………………………………...……….. 3

1.1.3. Osmotische stress en dehydratatie.…………………………………………….………... 3

1.1.4. Ijskristalvorming…………………………………………………………………...………... 3

1.1.5. Cryoprotectantia…………………………………………………………………...……….. 3

1.2. Invloed op de spermacel van de hengst……………………………………………………….. 4

1.2.1. Complexiteit van de spermatozoa……………………………………………………….. 4

1.2.2. Afkoelen van sperma………………………………………………………………………. 4

1.2.3. Fysico-chemische omgeving van de spermatozoa tijdens invriezen en ontdooien…. 5

1.2.4. Oxidatieve stress…………………………………………………………………………… 5

1.2.5. Premature capacitatie en acrosoom reactie…………………………………………….. 5

1.2.6. Weinig ijskristalvorming intracellulaire bij snel invriezen…………………………….… 6

1.3. Kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma bij paarden…..………………………..… 7

1.3.1. Geschiedenis van kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma…..…………..… 7

1.3.2. Voordelen van ingevroren sperma…..…………………..…………………..………..… 7

1.3.3. Nadelen van ingevroren sperma………….…………………..……………………….… 8

2. Collectie van het ejaculaat…………………………….………………………………….……….…. 8

2.1. Voorbereiding…………………………...……….………………………………….……….… 8

2.1.1. Dekruimte………………………………….………………………………….……….…. 8

2.1.2. Seksuele stimulatie en libido…………………………….………………….……….…. 8

2.1.3. Collectie interval van de sperma-afname…………………………….……………….. 8

2.1.4. Aandachtspunten voor en tijdens de sperma-afname…………….…………….…… 8

2.2. Sperma-afname…………………………...……….………………………………….………… 9

2.2.1. Kunstmatige vagina…………………………...……….………………………………… 9

2.2.2. Verloop van de dekking…………………………...……….………………………….… 10

2.2.3. Uitgestelde invriezing van sperma…………………………...…………………….…... 10

2.3. Beoordeling ejaculaat en spermakwaliteit…………………………...…………………….…. 10

2.3.1. Macroscopische evaluatie ejaculaat…………………………...……….……………… 10

2.3.2. Microscopische evaluatie ejaculaat…………………………...……….……….……… 11

3. Invriezingsprocedures…………………………...……….………………………………………….… 11

3.1. Testen voorafgaand aan het invriesseizoen…………………………...……….……………... 11

3.1.1. Meting van de testis…………………………...……….……………………………….….. 11

3.1.2. Testen op een geschikt invriesprotocol……………………………………………….….. 12

3.2. Verwerken ejaculaat………………………………..………………………………………….… 13

3.2.1. Verdunnen vers ejaculaat………………………………..……………..…………………. 13

3.2.2. Concentreren van het sperma………………………………..……..…………………….. 14

3.2.3. Toevoegen van cryoprotectant………………………………..………..…………………. 14

3.2.4. Verpakken………………………………..……………..…………………………………… 15

3.2.5. Koelen………………………………..……………..……………………………………….. 15

3.3. Invriezen van het sperma………………………………..……………..……………………….. 15

3.4. Ontdooien van ingevroren sperma……………………………..……………..………………... 16

3.4.1. Protocol opwarmen………………………………..……………..………………………… 16

3.4.2. Evaluatie ontdooide sperma………………………………..……………..………………. 17

4. Bewaring en transport van ingevroren sperma………………………………..……………………. 17

5. Factoren die een invloed hebben op de spermakwaliteit………………………………..………… 19

5.1. Intrinsieke factoren die de spermakwaliteit beïnvloeden…………………..………………… 19

5.1.1. Leeftijd……………………………..……………..…………………………………………. 19

5.1.2. Genetica: individuele gevoeligheid van de hengst voor het invriezingsproces……… 19

5.1.3. Seizoen……………………………..……………..…………………………..................... 19

5.2. Hygiëne……………………………..……………..……………………………………………… 20

5.2.1. Contaminatie met micro-organismen……………………………..……………………… 20

5.2.2. Hygiëne van het personeel, materiaal en laboratorium………………………………… 20

5.2.3. Hygiëne van de hengst……………………………..……………..……………… ………. 20

5.2.4. Overdraagbare ziektes met ingevroren sperma……………………………..………….. 21

5.2.5. Desinfectie van het ejaculaat……………………………..……………..………………… 21

5.3. Management……………………………..……………..………………………………………… 22

5.3.1. Stalling……………………………..……………..…………………………………………. 22

5.3.2. Bioveiligheid……………………………..……………..…………………………………… 22

5.3.3. Seksuele rust……………………………..……………..…………………………………...22

5.3.4. Intratesticulare temperatuur……………………………..……………..…………………. 22

5.3.5. Stress en effect van inspanning…………………..……………..……………………….. 23

BESPREKING……………………………..……………..………………………………………………... 24

REFERENTIELIJST……………………………..……………..…………………………………………. 25

1

SAMENVATTING

Het doel van deze masterproef is om de essentiële stappen in het proces van invriezen van

hengstensperma weer te geven. Dit betreft niet enkel het invriesproces op zich, maar ook de invloed

eromheen die belangrijk is om een goed eindresultaat te bereiken.

Het invriezen veroorzaakt schade aan de spermatozoa door de vorming van ijskristallen, verstoring

van het metabolisme, osmotische- en oxidatieve stress. Deze schade tast de vruchtbaarheid aan of

kan de cel afdoden. Tijdens het afkoelen kan er al schade optreden. Vooral tussen 19 en 8°C is de

kans groot op koude-shock en om dit te voorkomen moet er langzaam gekoeld worden. Sperma wordt

om de 48 uur afgenomen en voor een optimale kwaliteit gebeurd deze afname tijdens de eerste

dekking. Direct het ejaculaat evalueren is nodig om te berekenen hoeveel rietjes er geproduceerd

kunnen worden. Het wordt afgeraden om sperma in te vriezen als het verse sperma < 35% progressief

motiele en/of <40% morfologisch normale spermatozoa bevat. Zodra de temperatuur onder de -130°C

komt, ligt het metabolisme stil en bij bewaring aan -196°C is het sperma onbeperkt houdbaar.

Invriesprotocollen zullen de negatieve effecten tijdens invriezen zo laag mogelijk proberen te houden.

Verdunners beschermen tegen de schadelijke effecten van seminaal plasma, stabiliseren de

plasmamembraan, bevatten nutriënten en antibiotica. Centrifugatie gebeurt om de spermatozoa

concentratie te verhogen en het aandeel seminaal plasma te verlagen tot 5 à 20%. Cryoprotectantia

zorgen ervoor dat de spermatozoa het invriesproces beter overleven. Juiste verpakking, omgang,

transport en ontdooiing met het ingevroren sperma is nodig om de kwaliteit stabiel te houden.

Afhankelijk van individuele factoren van de hengst en het invriesprotocol zal maximaal 60% van de

spermatozoa het invriezen overleven. Ten slotte zijn er nog een aantal factoren die invloed hebben op

de spermakwaliteit waar men veel (management, hygiëne) of weinig (leeftijd, seizoen, genetica)

invloed op heeft.

Key words: Cryoinjury - Freezing protocol - Frozen semen - Semen quality - Stallion

2

INLEIDING

Het percentage merries die geïnsemineerd worden met bevroren sperma, verschilt tussen de

Europese landen, doch is het gebruik van ingevroren sperma in alle Europese landen proportioneel

lager dan dat van gekoeld sperma1. De individuele variatie van invriesbaarheid van hengstensperma

en de lange cyclus van de merrie belemmeren een wijdverspreid gebruik van diepvriessperma2,3.

Desalniettemin heeft ingevroren sperma in belang van de reproductie een belangrijke plaats

verworven4,5. Bevroren sperma van de hengst kan namelijk voor onbepaald lange tijd opgeslagen

worden4,5,6. Tijdens het invriezen zullen spermatozoa te maken krijgen met dehydratatie die ontstaat

door ijskristalvorming en alle daaraan gekoppelde negatieve effecten7. Veel spermatozoa zullen

beschadigd worden en zullen na ontdooiing een kortere overlevingsduur hebben3,8. Om acceptabele

drachtpercentages te bereiken is het belangrijk dat de vruchtbaarheid van het sperma optimaal is 3,8,9.

Dit kan bereikt worden met een goede kwaliteit sperma die, door op de juiste manier met het sperma

om te gaan, na het invriezen nog steeds een goede bevruchtingscapaciteit bevat. De mensen die het

sperma verwerken en dierenartsen in het bijzonder, zijn best op de hoogte van de stappen waar

spermatozoa aan onderworpen worden tijdens invriezen en de factoren die de spermakwaliteit

beïnvloeden.

Deze masterproef zal eerst de basisprincipes van invriezen van cellen, de invloed op de spermacel en

de rol van kunstmatige inseminatie bespreken. Hierna wordt ingegaan op de collectie van het

ejaculaat waar het belang van een goede voorbereiding, de stappen van sperma-afname en de

evaluatie nadien van het ejaculaat worden uitgelegd. Aan het begin van het fokseizoen of bij een

nieuwe hengst zal het sperma getest worden op verschillende parameters en kan ook getest worden

welke invriesprocedure het beste is. Bij het ontdooien, bewaren en transporteren, moet er ook strikt

aan de voorgeschreven stappen voldaan worden, anders gaat de bevruchtingscapaciteit van het

sperma sterk achteruit. Ten slotte zullen de factoren die een invloed hebben op de spermakwaliteit

besproken worden.

LITERATUURSTUDIE

1. ALGEMEEN

1.1. BASISPRINCIPES INVRIEZEN/ONTDOOIEN CELLEN

Door cellen in te vriezen worden ze blootgesteld aan aanzienlijke temperatuurverschillen die schade

kunnen veroorzaken op morfologisch en functioneel vlak10,11.

1.1.1. Celmembraan

De celmembraan ondergaat fysieke verandering tijdens het afkoelen9. Denaturatie van proteïnen komt

door een reversibele of irreversibele verstoring van de secundaire structuur bij afkoeling tussen 20 tot

0°C12. Zodra een bepaalde temperatuur (faseovergangstemperatuur) overschreden wordt, zal de

membraan van een vloeibare structuur veranderen naar een gelstructuur9,12. Deze

faseovergangstemperatuur voor cellen is afhankelijk van de hoeveelheid water die de cel bevat en van

de membraansamenstelling (verzadigde/onverzadigde fosfolipiden)12. Tijdens de afkoeling of

opwarming zullen lipiden en proteïnen zich herschikken9. Hierdoor kunnen er defecten ontstaan

tussen membraanproteïnen en de lipidenlaag die een verhoogde membraanpermeabiliteit voor ionen

creëeren12. Dit proces verzwakt de celmembraan en verlaagt het vermogen van integrale eiwitten om

de intracellulaire elektrolyten te reguleren12. Hierdoor kan er schade optreden aan de membraan en/of

3

de metabole functies waardoor na opwarmen de spermatozoa geen motiliteit meer vertonen13. Dit

fenomeen wordt “koude-shock” (“cold shock”) genoemd9,12,13.

1.1.2. Celmetabolisme

Het metabolisme van een cel is onder andere afhankelijk van de temperatuur. Een algemene regel is

dat elke temperatuurdaling van 10°C, het metabolisme van een cel voor de helft reduceert9. Voor

gekoeld sperma bij 5°C betekent dit een metabolisme van 10% van het origineel9. Het actieve

ionentransport van de membraan zal bij verlaging van de temperatuur minder efficiënt plaatsvinden12.

Zodra de temperatuur van een cel onder de -130°C komt, zijn er geen chemische reacties meer

mogelijk en ligt het metabolisme volledig stil13.

1.1.3. Osmotische stress en dehydratatie

Tijdens het invriezen, ontdooien, toevoegen en verwijderen van cryoprotectantia ondergaan cellen

grote verschillen in osmotische gradiënten, “osmotische stress” genoemd14. De extracellulaire

ijskristallen die aangroeien bij lagere temperatuur zullen een netwerk vormen waarin cellen gevangen

worden in de kanalen van hoog geconcentreerde oplossing9,11,12,15. Cellen zullen krimpen in deze

hyperosmotische omgeving omdat ze water verliezen via poriën en diffusie door de celmembraan

heen9,11,12. De periode en impact van dehydratatie wordt bepaald door de snelheid van invriezen9.

Langzaam invriezen geeft een langere blootstelling aan de steeds hoger wordende osmolariteit van

extracellulaire vloeistof. De cellen zullen een lange periode dehydrateren met cellulaire verstoring tot

gevolg. Deze vriesschade bij gevoelige cellen ten gevolg van blootstelling aan extracellulaire

hypertone vloeistof wordt oplossingseffect (“solution effect”) genoemd11. Snel invriezen leidt tot grote

drukverschillen in osmotische gradiënten aan de intra- en extracellulaire kant van de

plasmamembraan11. Dit kan schade geven aan de membraan en uiteindelijk leiden tot intracellulaire

ijsvorming11. De invriessnelheid moet dusdanig afgestemd zijn dat de cel voldoende tijd krijgt om te

krimpen, maar zonder lange blootstelling aan lethale hypertone concentraties11.

1.1.4. Ijskristalvorming

Tijdens verdere daling van de temperatuur zal er steeds meer water uit de oplossing zich omvormen

tot ijs15. Het overblijvende deel van de oplossing zal hierdoor steeds meer geconcentreerd raken15. Bij

het snel invriezen van cellen kan het intracellulaire water de cel niet op tijd verlaten12. Als het water

onder de faseovergangstemperatuur komt, zal er nucleatie (vorming van microscopisch kleine

ijskristallen onder 0°C in een oplossing119) ontstaan aan de celmembraan of celorganellen met de

vorming van uitgroeiende intracellulaire ijskristallen9,11,12. De vorming van grote ijskristallen kan direct

dodelijk zijn voor door membraanverbreking en uiteenvallen van het cytoskelet11,12. Vorming van

kleinere ijskristallen zijn niet direct dodelijk als deze de celorganellen intact laten. Bij ontdooien

kunnen ze echter gaan herkristalliseren met vorming van schadelijke grote ijskristallen11,12. Het

voorkomen van intracellulaire ijskristalisatie, door de cel langer aan dehydratatie bloot te stellen, kan

als keerzijde osmotische shock geven12. Osmotische shock is het fenomeen waarbij het eiwit

denatureert, lyse van de membraan plaats vindt en er schade optreedt aan kern en mitochondriën12.

1.1.5. Cryoprotectantia

Een cryoprotectant wordt toegevoegd met als doel de cellen te beschermen tegen vriesschade9. Een

cryoprotectant zal de dehydratatie van de celmembraan in de beginfase verlagen, betere dehydratatie

van de cel geven, de wateractiviteit verminderen en de optimale snelheid voor invriezen wijzigen12,14.

Reeds bij kamertemperatuur zullen de cryoprotectantia de conformatie van integrale eiwitten in de

plasmamembraan wijzigen12. Intracellulaire ijskristallen ontstaan al bij -10°C, maar in aanwezigheid

van cryoprotectantia zal deze temperatuur verder onder de -10°C komen te liggen15. Zodra een

4

cryoprotectant toegevoegd of verwijderd wordt, kan door de volumeveranderingen schade aan de

cellen optreden9. Wat deze stoffen allen gemeen hebben, is dat ze een laag moleculair gewicht

hebben12.

Er zijn 2 groepen cryoprotectantia:

1. penetrerend: dringen door tot in het cytoplasma van de cel7. Deze cryoprotectantia verlagen de

elektrolytenconcentratie en voorkomen dat het volume intracellulair hypertoon wordt12. Tot deze

groep behoren glycerol, methanol, ethyleen glycol, 1,2-propaandiol, butaandiol, acetamide en

dimethyl sulfoxide7.

2. niet-penetrerend: blijven extracellulair aanwezig7. Deze stimuleren de dehydratatie van de cel,

verhogen het percentage extracellulaire oplossing en beschermen tegen koude-shock7,12. Tot

deze groep behoren de suikers (raffinose, lactose), polymeren (polyvinyl pyrollidone), eigeel en

magere melk7.

1.2. INVLOED OP DE SPERMACEL VAN DE HENGST

Het vermogen van cellen om het invriesproces te weerstaan en hierbij cellulaire hoofdfuncties te

behouden, zal de kwaliteit van het ingevroren sperma bepalen10.

1.2.1. Complexiteit van de spermatozoa

Theoretische modellen voorspellen hoe spermatozoa zich gedragen tijdens het vries/ontdooiproces10.

De schattingen komen niet helemaal overeen met de werkelijkheid, omdat ze gebaseerd zijn op

volgende veronderstellingen10:

1. Een spermatozoön is een symmetrische bol tot cilinder vorm, gevuld met fysiologische

zoutoplossing.

2. De celmembraan is semipermeabel.

3. De vloeistoffen intra- en extracellulair zijn gebaseerd op ideale oplossingen.

In werkelijkheid is een spermatozoön een haploïde cel met weinig cytoplasma en organellen: enkel de

kern, acrosoom en meerdere mitochondriën, nodig voor energieproductie voor de motiliteit, zijn

duidelijk aanwezig13. Doordat de chromosomen in de kern zeer sterk gecondenseerd zijn, is er geen

transcriptie van eiwitten mogelijk. Hierdoor is de spermacel sterk afhankelijk van de omgeving om in

zijn nutriëntenvoorziening te voldoen13. Het oppervlakte van een spermacel is zeer groot in vergelijking

met zijn inhoud en de smalle cellen hebben een hoge waterpermeabiliteit van de membraan15.

De plasmamembraan is een complexe dynamische structuur van lipiden en fosfolipiden die door een

actief metabolisme in een dubbele laag gerangschikt liggen10. Zowel de interne als externe omgeving

van de spermacel staan met elkaar in contact door proteïnen die in de membraan ingebed liggen10.

Het endoplasmatisch reticulum en het golgi apparaat zijn weinig aanwezig en kunnen maar een kleine

bijdrage leveren voor membraan behoud13. Deze complexe plasmamembraan van de spermacel wordt

beïnvloed door temperatuur10. In de spermacel bevinden zich organellen en proteïnen die met elkaar

in contact staan en ook gevoelig kunnen zijn voor invriezen en ontdooien10. Middels onderzoek is

aangetoond dat een aantal van de intracellulaire signaaltransducties aangetast werden tijdens koelen

en invriezen10.

1.2.2. Afkoelen van sperma

De spermatozoa zijn gevoelig voor temperatuurwijzigingen die plaats vinden tijdens het afkoelen van

lichaamstemperatuur tot het vriespunt13. Verlagen van de temperatuur geeft een ander

distributiepatroon van vloeistoffen door de poriën en kanalen heen10. De lipiden in de

plasmamembraan zullen zich door het verlagen van de temperatuur ook anders herschikken,

waardoor de diffusie door de plasmamembraan verandert10. Van 37 tot 20°C kunnen de spermatozoa

5

snel gekoeld worden16. Tussen 19 en 8°C zijn de spermatozoa zeer gevoelig voor schade door koude-

shock, vooral als er te snel gekoeld wordt. Tussen 8 en 5°C kan er weer snel gekoeld worden16.

1.2.3. Fysico-chemische omgeving van de spermatozoa tijdens invriezen en ontdooien

Tijdens het invriezen zal door de vorming van extracellulair ijs de resterende ijsvrije oplossing steeds

meer in concentratie stijgen14. Hierdoor worden de spermatozoa blootgesteld aan hypertonische

condities14. Om het evenwicht intra- en extracellulair gelijk te houden, zal er water uit de cel

diffunderen met dehydratatie van de spermacel tot gevolg14. Tijdens het ontdooien zal dit proces

omgekeerde plaatsvinden en worden de cellen blootgesteld aan hypotone condities14. Deze hypotone

stress zal opzwelling van de spermatozoa veroorzaken. Dit fenomeen is schadelijker dan het krimpen

van de cel door dehydratatie14.

Spermatozoa zijn zeer klein en bevinden zich in een hoog visceuze oplossing tijdens het invriezen15.

Onderling zullen spermatozoa nauwelijks met elkaar in contact komen, tenzij bij zeer hoge

concentratie spermatozoa en/of lage concentratie glycerol15. De spermatozoa komen vrijwel niet direct

in contact met de vormende ijsmassa, in tegenstelling tot grotere cellen zoals oöcyten en embryo’s.

Hieruit blijkt dat de overleving zal afhangen van de reactie op de hyper- en hypotone omgeving15.

1.2.4. Oxidatieve stress

Zuurstofradicalen worden gevormd als een normaal bijproduct van een oxidatief metabolisme of

worden door cellen zoals leukocyten geproduceerd als reactie op omgevingsstimuli17. De

zuurstofradicalen spelen een belangrijke rol in het normaal functioneren van spermatozoa. Een tekort

of overmaat aan zuurstofradicalen zal echter schade veroorzaken17. In het seminaal plasma zitten

antioxidanten zoals catalase, superoxide dismutase en glutathion peroxidase die beschermen tegen

de negatieve effecten van zuurstofradicalen. Teveel verwijdering van seminaal plasma is daarom zeer

schadelijk voor de spermatozoa. De activiteit van deze antioxidanten verschilt tussen individuele

hengsten17.

Door invriezen verhoogt de concentratie zuurstofradicalen in het ejaculaat door vooral lekkage van

elektronen uit de mitochondriën van de spermatozoa17. De concentratie zuurstofradicalen zal

verhogen als het aantal beschadigde spermatozoa stijgt14,17. Een sensitieve indicator voor oxidatieve

stress is de afname van motiliteit van de spermatozoa zonder aantasting van andere parameters van

het ejaculaat17. Het middenstuk van de spermatozoa wordt namelijk door het invriezen zeer gevoelig

voor oxidatieve schade17.

1.2.5. Premature capacitatie en acrosoom reactie

Invriezen en ontdooien veroorzaken premature capacitatie en acrosoom reactie van spermatozoa en

dit zal leiden tot verlaagde vruchtbaarheid of zelfs het afsterven van de cel18.

Capacitatie van de spermatozoa is een fenomeen waarbij er tijdelijke biochemische veranderingen

optreden die in vivo de interactie met het vrouwelijk voortplantingskanaal mogelijk maakt13.

Veranderingen die optreden tijdens capacitatie zijn13:

- inactiveren decapacitatie-factoren op het oppervlakte van de spermatozoa

- veranderen van integrale proteïnen structuur

- bepaalde proteïnen uit het vrouwelijk voortplantingsstelsel opnemen in de spermatozoa

- veranderingen in lipiden opbouw van de plasmamembraan (cholesterol/fosfolipiden verhouding

verandert)

- andere ionen samenstelling (calcium, natrium en pH verhoging intracellulair)

- productie van zuurstofradicalen, verhoging van het cyclisch adenosinemonofosfaat (CAMP) en

fosforylatie van tyrosine.

6

Bij het invriezen van spermatozoa verandert de samenstelling van de plasmamembraan door verlies

van lipiden tijdens invriezen en ontdooien. Dit gebeurd ook door verlies van decapacitatie-factoren die

in het seminaal plasma zitten en verwijderd worden tijdens centrifugatie19. Deze veranderingen in de

plasmamembraan lijken op een soort gedeeltelijke capacitatie van de spermatozoa en zal ertoe leiden

dat spermatozoa minder lang overleven17,20.

De acrosoom reactie houdt een structurele en biochemische verandering in die toelaat dat de

versmelting met de oöcyt doorgaat ter hoogte van het acrosoom13. Het verlies van cholesterol uit de

membraan tijdens capacitatie is nodig om de acrosoom reactie in gang te zetten13. Door het invriezen

en ontdooien zal de acrosoom reactie vroegtijdig plaatsvinden en dit leid tot een verminderd

bevruchtingsvermogen10,13.

1.2.6. Weinig ijskristalvorming intracellulaire bij snel invriezen

Uit onderzoek is gebleken dat bij snel invriezen enkel in de staart en het middelstuk van de

spermatozoa kleine hoeveelheden intracellulaire ijskristal gevormd worden15. In het hoofd van de

spermacel zijn deze niet gevonden15. Het is niet duidelijk waarom er geen ijskristallen worden

gevormd in het hoofd van de spermatozoa van de hengst. Het kan mogelijk verklaard worden doordat

spermacellen niet in direct contact komen met het ijs. Hierdoor worden de theorieën over ijskristallen

die door poriën binnen komen of door de hoger permeabele membraan, weinig waarschijnlijk. Ook is

het mogelijk dat spermatozoa de zones missen waaraan nucleatie kan ontstaan15. De hoofdreden

voor het afsterven van ingevroren spermatozoa is de uitgebreide beschadiging van de

plasmamembraan door osmotische shock tijdens invriezen en ontdooien, en externe herkristalisatie

tijdens het opwarmen15.

Fig. 1: dwarsdoorsnedes ingevroren rietjes met spermatozoa en glycerol met bijbehorende detailopname (uit

Morris et al. 2012)15.

Foto 1a en 1b: rietje met trage invriessnelheid. Foto 1c en 1d: rietje met hoge invriessnelheid.

7

Door de vriessnelheid te verhogen wordt de tijd verlaagt dat spermatozoa aan de hypertonische conditie

blootstaan. Echter het water in de geconcentreerde oplossing is onvoldoende gemigreerd naar het extracellulaire

ijs in deze korte tijd. In foto 1d zie je hierdoor het ijs gevangen in de oplossing.

Het invriezen van sperma kan ook gebeuren aan zeer

hoge invriessnelheden (zie figuur 2). Dit proces wordt

vitrificatie genoemd15. Door de hoge intracellulaire

eiwit concentratie, uitgesproken dehydratatie en

extracellulaire ijsvorming zal de hoog

geconcentreerde oplossing een glasachtige massa

(“vitrifies”) vormen15. Deze methode wordt enkel in de

humane geneeskunde gebruikt.

Fig. 2: Hoeveelheid ijsvorming (g ijs/g totaal water) in een verdunner die gekoeld is aan verschillende

snelheden (uit Morris et al. 2007)21.

1.3. KUNSTMATIGE INSEMINATIE MET INGEVROREN SPERMA BIJ PAARDEN

1.3.1. Geschiedenis van kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma

In 1957 is voor het eerst melding gemaakt van een levendgeboren veulen na inseminatie met

diepgevroren sperma4. Sindsdien werd hengstensperma op kleine schaal ingevroren, maar hiermee

werd slechts wisselend succes bereikt22. In de rundersector werd er veel vooruitgang geboekt met het

gebruik van ingevroren sperma, wat het onderzoek bij paarden bevorderde5,22. De originele verdunner

was een mengsel op basis van eigeel en citraat, waarin glycerol als cryoprotectant was toegevoegd5.

Aanvankelijk gebeurde de opslag van bevroren sperma in druppel-vorm op vaste koolstofdioxide van -

79°C. Na de jaren 60 werd dit vervangen door rietjes die in vloeibare stikstof van -196°C worden

bewaard5. De industriële ontwikkelingen van ingevroren sperma zijn, ondanks acceptatie door de

meeste stamboeken en de internationale opmars van de paardenfokkerij, maar langzaam op gang

gekomen1,8.

1.3.2. Voordelen van ingevroren sperma

Bevroren sperma van de hengst kan voor onbepaalde tijd opgeslagen worden in vloeibare stikstof4,5,6

Geschat wordt dat de samenstelling van spermatozoa voor 50.000 jaar gelijk blijven23. Het sperma is

steeds voorhanden, zelfs als de hengst niet beschikbaar is om te dekken of overleden is4,8,24. Via

aangepaste transportboxen kan het sperma wekenlang ingevroren blijven waardoor het wereldwijd

getransporteerd kan worden1,3,4. Men moet zich houden aan duidelijke regelgeving, maar het

genetisch aanbod aan hengsten is daardoor groter4,6,8,22. Dit is van belang bij fokprogramma’s voor

beschermde of bedreigde paardenrassen25. Bevroren sperma kan opgeslagen worden op de

verblijfplaats van de merrie, alwaar deze geïnsemineerd dient te worden3,4,6,8. Ingevroren sperma biedt

de mogelijkheid om het sperma te onderzoeken op pathogene organismen. De resultaat van de test

kan afgewacht worden omdat het sperma lang bewaren kan worden. Hierdoor vermindert de kans op

overdracht van bepaalde besmettelijke ziektes4,22.

8

1.3.3. Nadelen van ingevroren sperma

Eenmaal ontdooid heeft het sperma slechts een korte overlevingsduur, waardoor het aanbevolen is

om minder dan 12 uur vóór tot maximaal 6 uur na ovulatie te insemineren3,8. Dit vereist een frequente

opvolging van de merrie3,4,8,9,26. De drachtpercentages na inseminatie met diepvriessperma liggen

beduidend lager dan na inseminaties met gekoeld sperma4,8,9,26. De kwaliteit van het sperma na

ontdooiing is sterk variabel, doordat er tijdens hengstenkeuring niet geselecteerd wordt op

vruchtbaarheid van de hengsten in het algemeen of op invriesbaarheid van het sperma in het

bijzonder9. Door de individuele verschillen aan gevoeligheid voor invriezen, zijn er aangepaste

protocollen die per hengst de beste kwaliteit van spermatozoa na ontdooiing geven9. Inflammatoire

reactie van de geïnsemineerde merrie met ontdooide sperma is sterker dan bij inseminatie met

gekoeld sperma of natuurlijke dekking4,27.

2. COLLECTIE VAN HET EJACULAAT

Collectie van sperma met een hoge kwaliteit is zeer belangrijk voor kunstmatige inseminatie als

uitgangspunt. Soms kan het proces van sperma-afname op zichzelf al een oorzaak zijn van

verminderde vruchtbaarheid of van een lage kwaliteit sperma.

2.1. VOORBEREIDING

2.1.1. Dekruimte

De dekruimte moet functioneel genoeg ruimte hebben, hygiënisch werk toelaten, stofvrij zijn en voor

de hengst een goed libido toelaten28,29. Een goed libido toelaten wil zeggen dat er een plek om een

merrie in oestrus te plaatsen, vrij van storende geluiden, dieren of mensen28, 29. Door een gepaste

schone bedding te voorzien, feces te verwijderen, grondig te desinfecteren na elke dag van sperma-

afname en stof weg te halen, wordt de bacteriële contaminatie van het ejaculaat sterk verlaagd28,30.

Het gebruik van een bok, in plaats van een merrie, is voor routinematige collectie aan te bevelen31.

Een bok kan grondig schoongemaakt en gedesinfecteerd worden, waardoor het risico verminderd op

verspreiding van ziektes31.

2.1.2. Seksuele stimulatie en libido

Meer seksuele stimulatie van een hengst dan nodig is voor ejaculatie zal een verhoging van het

volume met zich meebrengen en een verlaging van concentratie levensvatbare spermatozoa, maar

geen verhoging van het totaal aantal spermatozoa32,33. Daarom, voor het invriezen van sperma, is het

niet aangewezen om een hengst extra seksuele stimulatie te geven32. Een slecht libido heeft zijn

weerslag op de spermakwaliteit omdat het langer duurt voordat de hengst tot erectie komt. Ook zal de

hengst meerdere dekpogingen vertonen zonder ejaculatie en zal hierdoor meer gestimuleerd moet

worden om tot ejaculatie te komen33. Dit sperma is van mindere kwaliteit na ontdooiing dan sperma

dat bij een eerste dekking binnen de 5 minuten is afgenomen33.

2.1.3. Collectie interval van de sperma afname

Het interval tussenin de collecties moet gelijk blijven zodat binnen het individu de verschillende

ejaculaties zo gelijk mogelijk blijven10,33. Het ideale interval voor een gemiddelde hengst bedraagt

ongeveer 48 uur, maar dit moet echter aangepast worden per individuele hengst10,33.

2.1.4. Aandachtspunten voor en tijdens de sperma-afname

Voor de sperma-afname is het aangeraden om de penis met warm water te wassen en erna te

drogen16. De bok moet voorafgaand aan de dekking goed schoon gemaakt en/of ingewikkeld zijn met

9

plastiek folie30. De binnenwand in de kunstmatige vagina moet schoon, droog en vrij van detergent

zijn. Het gebruik van een wegwerpbare plastic binnenvoering in een kunstmatige vagina is aan te

raden om kruiscontaminatie tussen hengsten te voorkomen, sneller werk toe te laten en vermijden van

toxiteit16,29,31. Om koude-shock te vermijden moet het opvangrecipiënt tot 37°C zijn opgewarmd34.

Omheen het recipiënt kan best ook een isolerend en lichtwerend omhulsel geplaatst worden om

schade van de spermatozoa door koude en licht te voorkomen31. Kunstmatige vagina’s bevatten een

waterreservoir waarmee de gewenste temperatuur (44°C tot 48°C), druk en diameter geregeld kunnen

worden29. Als de inwendige temperatuur hoger is dan 45°C, moet worden voorkomen dat het sperma

in contact komt met het warme oppervlakte31. Vanaf 37°C kunnen spermatozoa namelijk irreversibel

beschadigd worden en dit fenomeen wordt hitte-shock (“heat shock”) genoemd3,34.

De kunstmatige vagina moet tijdens collectie parallel met de buikwand lopen en dicht tegen de basis

van de penis worden gehouden29. Veel voorkomende problemen bij het collecteren van het ejaculaat

zijn een slechte positionering van de kunstmatige vagina tijdens de dekking, te lage bok, te lage

watertemperatuur of te hoge druk in de kunstmatige vagina voor de hengst29.

2.2. SPERMA-AFNAME

2.2.1. Kunstmatige vagina

Een kunstmatige vagina is de meest gebruikte methode voor collectie van sperma en tevens de beste

keus voor routinematige collectie. Deze collectiemethode, mits juist uitgevoerd, verhoogt de efficiëntie

van spermacollectie en laat een optimale kwaliteit van het sperma toe31.

Er zijn veel verschillende modellen op de markt, hier volgt een selectie van veel gebruikte modellen:

1. Missouri31 (Fig. 3a): Bevat een leren houder, dubbele laag binnenwand

als waterreservoir, luchtventiel, aankoppelbare rubberen laag voor

opvangen ejaculaat en glans penis steekt buiten de kunstmatige vagina.

a. Voordelen: relatief goedkoop, lichtgewicht zodra lucht erbij zit in

waterreservoir, gemakkelijk te reinigen en demonteren, weinig

kans op waterlekkage.

b. Nadeel: ejaculaat in contact met rubberen laag.

2. Colorado29.31 (Fig. 3b): Hard-plastic houder, leren handvat, 2

onafhankelijke rubberlagen voering, volledige penis van de hengst in

kunstmatige vagina.

a. Voordelen: langdurige warmte afgifte.

b. Nadeel: sperma langer in contact met warme binnenkant

kunstmatige vagina, minder makkelijk te hanteren (zwaar).

c. Aangepaste versies zijn CSU en Lane: zijn lichter en hebben een

rigide plastic handvat.

3. Nishikawa31 (Japanse model) en HarVet (Fig. 3c): aluminium houder

(Nishikawa) of hard-plastic (HarVet), enkele laag rubbervoering, directe

opvangrecipiënt aan te koppelen aan kunstmatige vagina.

a. Voordelen: lichtgewicht, gemakkelijk te demonteren en reinigen,

minimaal contact met rubberen voering.

b. Nadeel: groter risico op water lekkage (minder druk en

contaminatie ejaculaat).

4. Polish31 (Fig. 3d): kort model met open einde, aangepast Missouri- Fig. 3: Verschillende

model (afkoppelen rubberen laag) of CSU (korter gesneden). Kunstmatige vagina’s

a. Voordelen: enkel de sperma-rijke fractie opvangen. (uit Brinsko et al. 2011)31

a

b

c

d

10

In sommige kunstmatige vagina’s kan een filter geplaatst worden om het vuil en de gel uit het

ejaculaat te filteren, maar meestal zal het filteren kort na afname gedaan worden29. Het filteren van het

ejaculaat houdt een verlies van spermatozoa in omdat deze achterblijven in de gelfractie of de gelfilter

zelf. Vooral polyester filters zorgen voor een significant verlies van spermatozoa omdat deze vloeistof

opzuigen, terwijl nylon filters minder verlies geven omdat deze geen vloedstof aanzuigen29. Tijdens de

collectie van sperma gaat ongeveer 7% van het totaal aantal spermatozoa in een ejaculaat verloren35.

Het ejaculaat wordt gevormd door 6 tot 9 opeenvolgende fracties tijdens ejaculatie36. In de eerste 3

fracties bevinden zich 60 tot 80% van het totaal aantal spermatozoa31,36. Door met een open einde

kunstmatige vagina enkel deze sperma-rijke fractie op te vangen, verhoogt de concentratie

spermatozoa, vermindert de hoeveelheid seminaal plasma met de helft en verlaagt de contaminatie

met bacteriën, urine of bloed31. Contaminatie met urine of bloed treedt vaak pas op na ejaculatie van

de sperma-rijke fractie29. Deze contaminatie veroorzaakt veranderingen in pH en osmolariteit die een

negatief effect hebben op de motiliteit van het sperma37.

2.2.2. Verloop van de dekking

Gemiddeld zal een hengst ejaculeren na 6 tot 8 georganiseerde stoten vanuit de pelvis38,39. Ejaculatie

is zichtbaar aan drie tot vijf kortere stoten, knikken van de staart en voelbare pulsen van de urethra

aan de basis van de penis38. Sperma dat bij de eerste dekking afgenomen wordt binnen de 5 minuten

heeft de beste kwaliteit na ontdooiing33. Meer dan 3 dekpogingen om een ejaculaat te verkrijgen zijn af

te raden voor sperma dat ingevroren moet worden omdat het percentage levensvatbare spermatozoa

met intacte membranen veel daalt33.

2.2.3. Uitgestelde invriezing van sperma

Voor hengsten die zich niet in de buurt van een laboratorium bevinden kan als alternatief het ejaculaat

vervoerd worden naar een laboratorium met als doel het daar in te vriezen40. Het seminaal plasma

moet zo snel mogelijk verwijderd worden door centrifugatie en het sperma moet gekoeld (5°C)

opgestuurd worden41. Als het sperma volgens deze voorwaarden binnen de 18 uur verwerkt wordt,

resulteert dat in gelijke vruchtbaarheidscijfers als sperma dat na centrifugatie direct ingevroren

wordt42. Als het sperma binnen de 6 uur verwerkt wordt, is er zelfs vlak voor invriezen geen afname

van de motiliteit van de spermatozoa41.

2.3. BEOORDELING EJACULAAT EN SPERMAKWALITEIT

2.3.1. Macroscopische evaluatie ejaculaat

Evaluatie van het ejaculaat is nodig voor de verwerking van het sperma in rietjes. De inseminatiedosis

wordt gemaakt met een minimaal aantal bevruchtingscapabele spermatozoa, maar toch met een hoge

kans op bevruchting (zie figuur 4)43. Het wordt afgeraden om sperma van slechte kwaliteit in te vriezen

omdat de vruchtbaarheid na ontdooien slecht zal zijn9. De normaal kleur van sperma is grijs tot

crèmekleurig wit, afhankelijk van de spermatozoa concentratie34. Sperma

dat een afwijkende kleur vertoont moet niet gebruikt worden om in te

vriezen, bijvoorbeeld geel (urospermia) of rozerood (haemospermia)34.

De normale pH van het ejaculaat ligt tussen 7,2 tot 7,7 en een afwijking

hiervan heeft een negatief effect op de kwaliteit van het sperma34,37. Het

totaal volume van de gel-vrije fractie laat toe om het totaal aantal rietjes

te berekenen uit een ejaculaat34. Een gemiddelde warmbloed hengst

produceert 20 tot 80 ml gel-vrij ejaculaat34.

Fig.4: Theoretische relatie tussen vruchtbaarheid en inseminatiedosis (uit Watson, 2000)43

11

2.3.2. Microscopische evaluatie ejaculaat

De concentratie kan bepaald worden met een hemocytometer telkamer, “densimeter”, “nucleocounter”

of een automatische spermateller en varieert van 100 tot 500 x106 spermatozoa per ml31,34. In een

ejaculaat zitten gemiddeld 4 tot 14 x109 totaal aantal spermatozoa34.

Het percentage progressief motiele spermatozoa voor invriezen is best 60% minimaal 34. Afwijkend is

als de spermatozoa voorwaarts of achterwaarts in een cirkelende beweging draaien. Dit fenomeen is

gelinkt aan koude-shock of hitte-shock3,34. Daarom is het essentieel dat al het materiaal voorverwarmd

is op 37°C.

Omdat vers sperma snel gaat samenklonteren wordt van het verdunde ejaculaat een staal genomen

voor het percentage levensvatbare spermatozoa en de morfologie te bepalen34. Het percentage

levensvatbare spermatozoa wordt bepaald met een eosine-negrosine kleuring in een verhouding van

60:40 (ejaculaat/kleuring). Een druppel kleuring van 5 tot 6 mm aanbrengen op het draagglaasje,

gevolgd door een 3 tot 4 mm druppel verdund ejaculaat, samen mixen en uitstrijken. Na droging

worden 100 spermatozoa beoordeeld om het percentage leefbare spermatozoa te bepalen. Een

normale hengst zal minimaal 70% leefbare spermatozoa in zijn vers ejaculaat hebben34. De morfologie

van de spermacellen worden ingedeeld naar categorie (zie figuur 5)34. Om het percentage van elke

categorie te bepalen zal men minimaal 200 spermatozoa te beoordelen, zowel levend als dood34. Een

teruggeslagen abaxiaal middenstuk wordt als normaal beschouwd34.

Voor het voorspellen van de vruchtbaarheid heeft het evalueren van het ejaculaat minder belang44.

Eenmalige evaluatie (motiliteit, progressief motiele, normale morfologie spermatozoa) zal namelijk

enkel 20% van de vruchtbaarheid verklaren34. Om de vruchtbaarheid van een hengst in te schatten is

een combinatie van testen nodig om ontdooid sperma te evalueren of genoeg gegevens over

nakomelingen18.

Fig. 5: Eosine-negrosine kleuring spermatozoa

(uit Crabtree, 2010)34

fase contrast microscoop x1000.

(a) normale spermatozoa.

(b) knobbel acrosoom.

(c) onderontwikkeld hoofd.

(d) vacuoles in kern.

(e) proximale cytoplasmatische druppel.

(f) distale cytoplasmatische druppel.

(g) teruggeslagen distaal middenstuk.

(h) opgerolde staart.

3. INVRIESPROCEDURES

3.1. TESTEN VOORAFGAAND AAN HET INVRIESSEIZOEN

3.1.1. Meting van de testis

Het gewicht van het testisparenchym is goed gecorreleerd met de dagelijkse spermaproductie38. Het

gewicht van het testisparenchym kan bij levende paarden niet exact bepaald worden, maar het

testisvolume kan geschat worden met behulp van een caliper of door middel van echografie38.

Echografie geeft een nauwkeurigere schatting van het testisvolume38. De grootte van de testikels

12

variëren naar gelang het seizoen, leeftijd, ras en reproductiestatus van de hengst38. Gemiddeld zijn de

testikels 50 tot 80 mm breed, 80 tot 140 mm lang, 60 tot 70 mm hoog en weegt 150 tot 300 g bij een

volwassen warmbloedhengst38.

Met volgende formules kan het testis volume en dagelijkse sperma productie ingeschat worden38:

Testis volume = 4/3π (lengte / 2)(breedte / 2)(hoogte / 2)

= 0,5233 x hoogte x lengte x breedte

Schatting dagelijkse sperma productie = (0,024 x volume beide testikels) – 0,76

Bij een gemiddelde hengst is de totale breedte van beide testikels idealiter meer dan 9 centimeter39.

Een te klein volume of breedte van de testis betekent een lagere spermaproductie per dag, dus het

sperma van deze hengsten is minder geschikt om in te vriezen, omdat de vaste kosten van afnemen

en verwerken relatief gezien te hoog zijn ten gevolg van minder opbrengst van rietjes per ejaculaat.

Als de schatting van de dagelijkse sperma productie niet overeen komt met de werkelijke waarde

kunnen er andere problemen aan de hand zijn wat verder onderzocht vraagt38.

3.1.2. Testen op een geschikt invriesprotocol

Vriesprotocollen zijn ontwikkeld om de negatieve effecten van invriezen zo minimaal mogelijk te

houden3. Door de grote individuele variatie tussen hengsten is het aangeraden om het ejaculaat te

testen op geschiktheid voor het invriesprotocol9. Binnen een protocol kan men de verschillende

stappen experimenteel veranderen, zodat gezocht kan worden naar de methode die de hoogste

kwaliteit sperma na ontdooien geeft10. Ondanks een goed invriesprotocol zal 40 tot 50% van de

spermatozoa het invriesproces niet overleven43. Het wordt afgeraden om de hengst commercieel te

gebruiken om sperma in te vriezen als het verse sperma minder dan 35% progressief motiele en/of

<40% morfologisch normale spermatozoa bevat9. Na afname, verdunnen en centrifugeren wordt het

ejaculaat gesplitst in verschillende dosissen om in te vriezen volgens verschillende protocollen. Na

een opslagperiode van minstens 24 uur wordt het sperma ontdooid en wordt geëvalueerd welk

protocol het beste resultaat geeft9.

Fig.5: Verschillende vriesprotocollen voor invriezen van hengsten sperma (uit Sieme et al., 2008)10

13

3.2. VERWERKEN EJACULAAT

3.2.1. Verdunnen vers ejaculaat

Het ejaculaat wordt door een gelfilter gegoten om het grof vuil en de gel-fractie eruit te halen34.

Langdurig contact met het seminaal plasma moet vermeden worden, omdat het zeer nadelig is voor

de overleving van de spermatozoa. Daarom wordt binnen de 2 tot 5 minuten na afname de verwarmde

verdunner toegevoegd aan het gefilterde ejaculaat16,19,31. De verhouding van het ejaculaat ten

opzichte van de verdunner is 1:1 of het ejaculaat wordt verdund tot een gewenste aantal spermatozoa

per ml10. Verdunners op basis van eigeel of melk bevatten lipoproteïnen die de spermamembraan

stabiliseren en zo beschermen tegen koude-shock24. Metaboliseerbare substraten zoals glucose

zorgen voor nutriënten24. Verdunners dienen als chemische buffer tegen verzuring door afvalstoffen

en zorgen voor het behouden van een juiste osmolariteit. Toevoeging van een breedspectrum

antibioticum gaat de groei van micro-organismen tegen45. Veel gebruikte antibiotica in verdunners zijn

amakacine, gentamicine, streptomycine, penicilline, ticarcilline, lincomycine en polymixin30. Het minst

nadelige effect op motiliteit en de beste antimicrobiële activiteit werd gezien voor amikacine (1000

mg/ml) en penicilline (1000 IU/ml)45. Mycoplasma equigenitalium kan effectief bestreden worden met

lincomycine en gentamicine45. Taylorella equigenitalis veroorzaakt de ziekte “Contagieuze Equine

Metritis” en is zeer resistent tegen invriezen46. Echter als de verdunner antibiotica bevat is het

aangetoond dat het de kans verminderd op transmissie van T. equigenitalis via kunstmatige

inseminatie met ingevroren sperma47. Verdunners zijn van dierlijke oorsprong, dus potentiële

contaminatie kan ook van deze bron afkomstig zijn45. Tegenwoordig zijn er ook verdunners

beschikbaar die niet gebaseerd zijn op producten van dierlijke oorsprong45. Commercieel zijn er

verschillende soorten verdunners beschikbaar, zie tabel 1, of laboratoria stellen de verdunner zelf

samen48.

Tabel 1. Verschillende verdunners en hun reagentia48.

Reagens

(g/100 ml)

Kenny’s Dmitropoulos-

II

Magere

melk

sucrose

Glucose

EDTA

Citraat

EDTA

INRA-82 11%

Lactose

Magere melk 2,4 2,4

Glucose 4,9 2 3 6 0,15 5

Sucrose 5

BSA 1,5

Raffinose 0,3

Fructose 2

Na-Citraat 2 0,38 2,59 0,06

K-Citraat 0,08

Hepes 0,71

EDTA 0,37 0,37

Na-Bicarbonaat 0,12 0,12

Glycine 0,94

Sulfanilamide 0,35

Lactose 0,3 11

Eigeel 40

14

3.2.2. Concentreren van het sperma

Het centrifugeren van het verdunde ejaculaat heeft als doel de spermatozoa concentratie te verhogen

en het aandeel seminaal plasma te verlagen. Hierdoor kan de gewenste inseminatiedosis in een klein

volume verpakt worden24. Het ejaculaat wordt gecentrifugeerd met een kracht van 350 tot 700 x g aan

een periode van 10 tot 15 minuten10. Voor de spermatozoa is het essentieel dat er 5 tot 20% van het

seminaal plasma overblijft na centrifugatie of opnieuw moet toegevoegd worden19. Factoren in het

seminaal plasma zullen namelijk de gecapaciteerde spermatozoa omzetten in niet gecapaciteerde

spermatozoa2. Het vermijden van premature capacitatie zal ervoor zorgen dat spermatozoa lang

overleven17,20.

Tegenwoordig is het commercieel mogelijk om het ejaculaat aan zeer hoge snelheid te centrifugeren

(1000xg, 20min) door gedempte centrifugatie (“cushioned centrifugation”) toe te passen10. Het

voordeel van deze techniek is een grotere opbrengst van de spermatozoa en het heeft geen nadelige

effecten op de vruchtbaarheid10.

Een andere manier om seminaal plasma uit het ejaculaat te verwijderen is met behulp van een

synthetische hydrofiele membraan (“Sperm Filter, BotuPharma, Botucatu, Sao Paulo, Brazil”). In

vergelijking met centrifugatie is de “Sperm Filter” even efficiënt in het verwijderen van seminaal

plasma en geeft minder verlies van spermatozoa41.

3.2.3. Toevoegen van cryoprotectant

Een tweede verdunning vindt plaats door een verdunner met cryoprotectant toe te voegen aan het

gecentrifugeerde ejaculaat10. Commerciële verdunners zijn beschikbaar, zie tabel 2, of worden door

het laboratorium zelf samengesteld48.

Cryoprotectantia hebben verschillende voordelen waardoor spermatozoa het invriesproces kunnen

overleven12,14:

- Verminderen van de blootstelling aan osmotische stress.

- Stabiliseren van biomoleculen en celstructuren.

- Verminderen het schadelijke effecten van oxiderende stoffen.

- Vertraging van de initiële dehydratatie en verhoging van de totale dehydratatie.

- Verlagen van de temperatuur waarbij intracellulaire ijskristalvorming optreedt.

Het nadeel van cryoprotectantia is dat deze vooral in hoge concentratie, toxisch zijn voor de

spermatozoa en ze zullen de spermatozoa aan osmotische stress blootstellen12,49.

Na blootstelling aan osmotische stress zal de spermatozoa zijn volume weer terug brengen tot een

isotoon volume. Dit vermogen is mogelijk tot 900 mOsm kg-1, echter een osmolariteit van meer dan

450 mOsm kg-1 kan mogelijk de spermatozoa reeds irreversibel aantasten49. De meest gebruikte

cryoprotectantia voor bewaring van ingevroren hengstensperma zijn magere melk, eigeel en

glycerol14,49. Al meer dan 50 jaar is glycerol de meest gebruikte cryoprotectant voor ingevroren

hengstensperma10,49.

Cryoprotectantia worden opgedeeld in 2 verschillende groepen:

1. Membraanpermeabele cryoprotectantia stabiliseren de membraan en regelen de snelheid van

celdehydratatie14. Onder het vriespunt vindt normaal nauwelijks watertransport plaats bij

cellen, maar dankzij een cryoprotectant kan watertransport wel doorgaan en zorgen voor meer

dehydratatie. Zowel bij invriezen als ontdooien zal dit mechanisme voor een verhoogde

overleving van spermatozoa zorgen omdat minder intracellulaire ijskristallen zich vormen14.

2. Membraanimpermeabele cryoprotectantia zorgen dat de overgangstemperatuur van de sterk

geconcentreerde oplossing verhoogt wordt. Hierdoor zal de ingevroren spermatozoa langer

zijn stabiele structuur behouden en pas gaan smelten bij hogere temperaturen. Hierdoor zal

15

de blootstelling aan de geconcentreerde oplossing pas aanvangen bij hogere temperaturen14.

Het voordeel hiervan is dat er minder snel schade optreedt aan de spermatozoa bij

fluctuerende temperaturen tijdens transport of verplaatsing van de rietjes14.

Tabel 2. Verschillende verdunners en hun reagentia48.

Bestanddeel (ml /100) Martin French Magere melk / eigeel

Magere melk sucrose 45 92

INRA-82 45

Glucose-EDTA 25

11% Lactose 50

Eigeel 20 5 8

Equex 0,6

3.2.4. Verpakken

Om het gekoelde sperma te verpakken wordt meestal gebruik gemaakt van 0,5 ml rietjes met een

dosis van 50 tot 100 miljoen spermatozoa10,24,26. Om fluctuaties in temperatuur te vermijden is het

essentieel dat de rietjes dezelfde temperatuur hebben als het sperma10. Een rietje van 5,0 ml inhoud

wordt ook gebruikt en deze bevat ongeveer 600 tot 800 miljoen spermatozoa24. Een 0,5 ml rietje geeft

echter een uniformere invriezingssnelheid24. Een kleiner rietje van 0,25 ml wordt meestal gebruikt voor

gesext sperma. Spermatozoa in rietjes van 0,5 ml en 0,25 ml tonen na ontdooien dezelfde membraan

integriteit, echter de spermatozoa van de 0,5 ml tonen verhoogde kinetische waarden na ontdooien50.

Voor een inseminatie worden meestal 600 tot 800 miljoen spermatozoa in totaal geïnsemineerd, dus

voor 0,5 ml rietjes betekent dit 6 tot 8 rietjes per inseminatie of 1 rietje van 5,0 ml24. Andere manieren

om sperma te verpakken is in aluminiumbuizen, glazen ampullen, glascilinders en polyethylene

zakjes10. De rietjes vullen met sperma kan handmatig of met semi-automatische apparatuur gebeuren.

Om te voorkomen dat rietjes gaan barsten tijdens het invriesproces door het expanderende ijs, moet

er een luchtbel in het centrum van het rietje zitten24. Hierna worden ze hermetisch afgesloten24.

3.2.5. Koelen

Koude-shock kan voorkomen worden door de koelingsstappen gecontroleerd te laten verlopen13. Van

37 tot 20°C kunnen de spermatozoa snel gekoeld worden aan een snelheid van -2,0°C/min16,24.

Tussen 19 en 8°C zijn de spermatozoa zeer gevoelig voor schade door koude-shock16. De snelheid

van deze koelingsstap moet onder de -0,3°C/min liggen om de spermacel de tijd te geven zich aan te

passen aan de veranderende temperatuur24. Tussen 8 en 0°C kan er weer snel gekoeld worden16,24.

3.3. INVRIEZEN VAN HET SPERMA

Het koelen van rietjes kan gebeuren door deze te plaatsen in een rekje boven stikstofdampen of door

een programmeerbare stikstof vriezer24. Een programmeerbare vriezer geeft een uniformere

vriescurve en een betere levensvatbaarheid van spermatozoa na ontdooien24. De optimale

invriessnelheid zal liggen tussen de -20 en -100°C per minuut, afhankelijk van de verwerkingsmethode

en verpakking10,21. Bij een grafiek die de overlevende cellen uitzet tegen de snelheid van invriezen,

krijg je een typisch omgekeerde U-curve. De piek van de curve toont de optimale invriessnelheid

(“optimal cooling rate”) voor overleven van de cel na ontdooien (zie figuur 6)11,12,21. Een invriessnelheid

tussen -4 en -50°C/min blijkt het meest optimaal voor de motiliteit21. Bij lagere of hogere

invriessnelheden gaat de levensvatbaarheid van spermatozoa sterk achteruit21.

16

Tussen -30 en -55°C zal de sterk geconcentreerde oplossing naar een overgang van glasachtige

structuur veranderen14. Vanaf -110°C en lager bevindt al het water zich in een glasachtige structuur21.

Fig. 6: Het herstel van de motiliteit (●) en levensvatbaarheid (○) van hengsten spermatozoa na het snel ontdooien

volgens verschillende invriessnelheden (uit Morris et al., 2007)21.

3.4. ONTDOOIEN VAN INGEVROREN SPERMA

3.4.1. Protocol opwarmen

Het ontdooien van rietjes gebeurt meestal in een warmwaterbad3. Belangrijk hierbij is dat de

watertemperatuur goed in de gaten gehouden moet worden. Bij een temperatuur van 35 tot 36°C

kunnen de spermatozoa goed overleven, terwijl boven een temperatuur van 39°C de spermatozoa

snel afsterven. Voor 0,5 ml rietjes wordt meestal water van 37°C gebruikt waarin de rietjes minimaal

20 seconden verblijven3. Een manier om meerdere rietjes voor één inseminatiedosis tegelijk te

ontdooien is om alle rietjes één voor één in het 37°C warme waterbad te plaatsen. Men wacht af met

het uithalen van de rietjes totdat het laatste rietje er voor 30 seconden in heeft gelegen3. Na het

ontdooien moeten de rietjes goed afgedroogd worden omdat water zeer toxisch is voor spermatozoa3.

Hoge opwarmsnelheden zijn beter voor de overleving van spermatozoa (zie figuur 7)21. Bijvoorbeeld

het ontdooien van 0,5 ml rietjes in een warm waterbad van 75°C voor 7 seconden geeft een beter

herstel van motiliteit. Echter elke seconde langer in het water brengt irreversibele schade aan de

spermatozoa toe en is dus moeilijker veilig uit te voeren in de praktijk. De rietjes met een groter

volume van 4,0 ml of 5,0 ml worden meestal ontdooid in een waterbad van 50°C voor maximaal 45

seconden3. Rietjes met een klein volume van 0,25 ml kunnen worden ontdooid in een waterbad van

46°C voor maximaal 12 seconden50.

17

Fig.7: Het herstel van de motiliteit (●) en levensvatbaarheid (○) van hengsten spermatozoa volgens verschillende

opwarmsnelheden (uit Morris et al., 2007)21. Alle rietjes zijn ingevroren aan 10°C/min.

3.4.2. Evaluatie ontdooid sperma

De evaluatie van het sperma na ontdooiing gebeurd op dezelfde manier als de evaluatie van het verse

sperma. Alhoewel er geen standaard afspraak gemaakt is over de inseminatie dosis, wordt er meestal

een minimum criterium gehanteerd van 600 miljoen spermatozoa waarvan minimaal 30% progressief

motiel26. Hierdoor is het belangrijk dat de progressieve motiliteit na het ontdooien bepaald wordt omdat

dan de minimum dosis per rietje berekend kan worden18. Na ontdooien is het belangrijk dat de

spermatozoa vruchtbaar zijn en belangrijk hierbij zijn: een progressieve motiliteit, normaal

metabolisme, intacte celmembranen, aanwezigheid van acrosomale enzymen, intacte oppervlakte-

eiwitten en nucleoproteïnen24. Afwijkingen zoals teruggeslagen middenstukken en voorwaarts of

achterwaarts cirkelen, wijzen op koude-shock of “heat shock”. Een teruggeslagen staart wijst op

osmotische stress en een teruggeslagen abaxiaal middenstuk wordt als normaal beschouwd34.

4. BEWARING EN TRANSPORT VAN INGEVROREN SPERMA

Het bewaren van de rietjes gebeurt in opslagtanks (“cryotank”) met vloeibare stikstof van –196°C24.

Zodra er zich fluctuaties in opslagtemperatuur voordoen boven de -100°C bestaat de kans dat het

sperma beschadigd wordt en zijn vruchtbaarheid verliest3. Deze kans bestaat vooral bij het uithalen

van de rietjes voor inspectie, verplaatsing naar een transportcontainer of verplaatsen naar een

waterbad3. Daarom dient er snel gewerkt te worden en dienen de tangen, waarmee de rietjes uit de

cryotank worden gehaald, voorgekoeld te zijn23,51. Bij het overplaatsen van een rietje moet de afstand

tussen beide tanks zo klein mogelijk zijn. De bekers waarin de rietjes naar boven gehaald worden,

moeten goed gevuld zijn met vloeibare stikstof3,23. Rietjes met een klein volume van 0,25 ml zijn door

hun grotere oppervlakte ten opzichte van de inhoud zeer kwetsbaar voor hogere temperaturen en

mogen zich maximaal 3 seconden buiten de vloeibare stikstof bevinden51. In de nek van de vriestank

stijgt de temperatuur snel (zie figuur 8)51. In de regio boven de vrieslijn moet het verblijf van rietjes

zoveel mogelijk vermeden worden51. Containers worden het best opgeslagen in een schone, droge en

stofvrije omgeving zonder direct contact met een betonnen vloer, omdat de zuren uit de vloer het

aluminium zullen corroderen3,51. Regelmatig controleren van de vloeistoflijn en zorgen dat de

18

afsluitdop goed vast zit en intact is, zijn belangrijk voor het garanderen dat de spermatozoa hun

leefbaarheid behouden3,23. Zodra een container aan de buitenkant ijs begint te vormen, is dit een

teken dat er geen vacuüm meer is. De inhoud moet dan snel overgeplaatst worden naar een andere

container3. Cryotanks zijn een mogelijke bron van kruiscontaminatie als de rietjes niet goed afgesloten

zijn en in contact komen met vloeibare stikstof die micro-organismen bevat30,52. Stenotrophomonas

maltophila beïnvloedt de motiliteit van spermatozoa en kan geïsoleerd worden uit vloeibare stikstof52.

Het is daarom aangeraden om de vloeibare stikstof regelmatig te vervangen en de tanks te

desinfecteren52. Een desinfectans 15 tot 30 minuten laten inwerken en dan goed uitspoelen met steriel

water is voldoende om micro-organismen te elimineren. Desinfectans die gebruikt kunnen worden

hiervoor zijn een 10% oplossing natriumhypochloriet, 3% tot 6% oplossing waterstofperoxide of 37%

gedenatureerde alcohol52.

Fig. 8: Dwarsdoorsnede door de bovenste helft van een cryotank (uit Miller et al., 2011)51. Temperaturen (in

Fahrenheit) staan aangegeven op afstand (in inche) vanaf de top van de tank.

Als sperma in een goedgekeurd KI centrum in Europa is gecollecteerd dan mag het vrij

getransporteerd worden binnen Europa1. In België moet ingevroren sperma bestemd voor

internationaal transport, gescreend worden op “equine infectious anemia virus, equine arteritis virus en

contagieuze equine metritis”. Om ingevroren sperma te verzenden tussen landen moet de

inseminatiedosis minstens 250 miljoen progressief motiele spermatozoa bevatten waarvan minstens

35% na het ontdooien progressief motiel is gebleven4. Transport van ingevroren sperma gebeurt

meestal in een container die stikstofdampen bevat3,23. Stikstofdampcontainers absorberen de

vloeibare stikstof in een dikke laag absorberend materiaal dat rond het compartiment ligt waarin de

rietjes worden geplaatst3. In de container blijft een constante temperatuur van –190°C behouden voor

ongeveer 21 dagen3,23. Bij een langere periode van transport wordt soms een cryotank met vloeibare

stikstof gebruikt. Hier bestaat het gevaar dat door het kantelen van de container tijdens transport de

vloeibare stikstof eruit lekt3. Mocht op de plaats van aankomst een langere periode voor opslag nodig

zijn dan voorzien dan kan de container of tank bijgevuld worden met vloeibare stikstof3.

19

5. FACTOREN DIE EEN INVLOED HEBBEN OP DE SPERMAKWALITEIT

5.1. INTRINSIEKE FACTOREN DIE DE SPERMAKWALITEIT BEÏNVLOEDEN

Factoren zoals leeftijd, genetica en seizoen hebben een invloed op de spermakwaliteit, maar kunnen

niet of nauwelijks beïnvloed worden.

5.1.1. Leeftijd

De leeftijd van een hengst heeft een grote impact op de eigenschappen van zijn sperma. De

kwaliteitsparameters van het ejaculaat zijn: gelvrij volume, concentratie spermatozoa, totaal aantal

spermatozoa en afwijkende spermatozoa53. Hengsten tussen 3 en 11 jaar hebben de beste

kwaliteitsparameters53. Na 20 á 25 jaar neemt de vruchtbaarheid af als gevolg van

testikeldegeneratie33,54. Hengsten jonger dan 3 jaar hebben ten gevolge van immature

spermatogenese volgende parameters: kleiner volume ejaculaat, laagste concentratie spermacellen,

laagst totaal aantal spermatozoa, hoogste percentage aan dode en niet motiele spermatozoa en ook

het hoogste percentage spermatozoa met abnormale koppen, proximale protoplasma druppels en

afwijkende staarten53. De hoogste spermaconcentratie wordt bereikt op twaalf- en dertienjarige

leeftijd53. Het percentage abnormale koppen en abnormale staarten daalt van drie- tot negenjarige

leeftijd, waarna de abnormale koppen relatief constant blijven en de abnormale staarten geleidelijk

stijgen53.

5.1.2. Genetica: individuele gevoeligheid van hengsten voor het invriezingsproces

Het ejaculaat van hengsten vertoont een grote individuele variatie in het weerstaan van het invries- of

ontdooiingsproces10. Hengsten kunnen ingedeeld worden in “goede vriezers” (“good freezers”) en

“slechte vriezers” (“bad freezers”)26,9,55. Ongeveer 20% van de hengsten vriezen goed in, 20% van de

hengsten vriest slecht in en de overige 60% geeft acceptabele resultaten55. Inteelt kan ervoor zorgen

dat de kwaliteit van het sperma vermindert56.

5.1.3. Seizoen

In het noordelijk halfrond valt het natuurlijk dekseizoen bij het paard van april tot september57,58. Het

invriezen van hengstensperma gebeurt echter meestal van november tot februari, met andere

woorden buiten het natuurlijk dekseizoen59,60. In vergelijking met de winter wordt in de zomer en lente

een verhoogd libido, hoger volume ejaculaat en gelfractie, en gedaalde concentratie spermatozoa

teruggevonden, maar de dagelijkse spermaproductie is wel hoger60,61. Verschillende pogingen zijn

reeds ondernomen om de seizoensinvloed op de spermakwaliteit van diepvriessperma en de meest

gunstige periode om sperma in te vriezen na te gaan57,59,60,61,62,63,64,65. Deze studies leiden echter tot

verschillende aanbevelingen, doordat er verschillende parameters onderzocht werden. Zo zijn van

september tot november morfologische defecten aan de spermatozoa het laagst en de motiliteit en

levensvatbaarheid het hoogst59,63. Wanneer enkel naar de motiliteit na ontdooien van het sperma werd

gekeken, dan bleek de winter het meest optimale seizoen om sperma in te vriezen61. In maart en juni

daarentegen werden de minste verschillen tussen vers sperma en ingevroren sperma gevonden wat

betreft totale en progressieve motiliteit62. Tot slot vonden Blottner et al. (2001) geen noemenswaardig

verschil tussen ejaculaten ingevroren in mei en ejaculaten ingevroren in december60.

De seizoensinvloed zou te verklaren kunnen zijn doordat onder invloed van het circadiaans ritme de

samenstelling en hormonale samenstelling van het seminaal plasma verandert. Dit heeft op zijn beurt

een repercussie op de structuur en functionele samenstelling van het acrosoom en de

plasmamembraan van de spermacel66,67.

20

De invloed van het seizoen op spermakwaliteit na invriezen is echter beperkt. Het invriesproces zelf

en de genetica van de hengst hebben een meer doorslaggevende invloed op de invriesbaarheid van

het sperma60.

5.2. HYGIËNE

5.2.1. Contaminatie met micro-organismen

Bij contaminatie van het ejaculaat met bacteriën treedt er een zaaddodend effect op30.

Mogelijke oorzaken van infectie met micro-organismen:

- Hengst-gebonden: feces, preputium, huid, haar, respiratoire uitscheidingen, systemische of

lokale infectie van het geslachtsstelsel28,30,45.

- Omgevings-gebonden: contaminatie vindt plaats tijdens collectie, verwerken en opslagperiode.

Bronnen zijn het personeel, water, plantaardig materiaal, wasbak, riolering, lucht, ventilatie

systeem of voorwerpen28,30,45.

Een infectie is vaak intermitterend waardoor het ejaculaat ook verschillende concentraties aan micro-

organismen kan bevatten. Met het intermitterend karakter moet je rekening houden als je sperma

onderzoekt op mogelijke pathogenen28. Het is belangrijk om de risico’s op contaminatie zo laag

mogelijk te houden, anders zal de vruchtbaarheid achteruitgaan, kwaliteit van het sperma verminderen

en leefbaarheid van de spermatozoa afnemen30.

5.2.2. Hygiëne van het personeel, materiaal en het laboratorium

Door bij elke stap in het verwerkingsproces van het sperma sanitaire hygiëne na te streven, krijg je

een algehele vermindering van contaminatie30.

Voorkomen van contaminatie van het ejaculaat tijdens opslag en distributie28,30:

- Hygiënische werkwijze nastreven door het personeel.

- Zoveel mogelijk wegwerpmateriaal gebruiken

- Enkel werken met gedesinfecteerd of gesteriliseerd gebruiksmateriaal.

- Grootverpakkingen meteen verbruiken of verdelen in kleinere volumes.

- Het aangebroken pak rietjes moet op dusdanige manier bewaard worden dat er zo min mogelijk

contaminatie mogelijk is.

- De ruimte waar het ejaculaat verwerkt wordt scheiden van de dekruimte.

- Toevoeging van doelgerichte antibiotica, steriele verdunners en cryoprotectantia aan het

ejaculaat.

5.2.3. Hygiëne van de hengst

Bij de hengst is het aangeraden om de buik en de ruimte rondom het preputium schoon en droog te

houden en indien nodig bij te trimmen. Dit gezien het feit dat de hoeveelheid contaminatie van het

ejaculaat sterk gelinkt is met de verontreiniging van de hengst16,28,30. Vlak voor of tijdens de dekking

kan je het best het voorvocht niet opvangen, omdat het vaak veel bacteriën bevat30. Commensale

bacteriën op de penis, preputium en distale urethra behoren tot de normale flora. Deze flora is

onschadelijk voor de hengst en speelt een belangrijke rol in afweer tegen pathogene bacteriën39,46. Ze

verminderen onder andere de groei van de seksueel overdraagbare bacteriën Pseudomonas

aeruginosa en Klebsiella pneumoniae (type 1, 2 en 5)39. Wassen van de penis wordt daarom enkel

met warm water aanbevolen. Volgende handelingen vermijden dat infecties overgedragen worden

tussen hengsten: kunstmatige vagina reinigen na elke dekking of de plastiekfolie in de kunstmatige

vagina vervangen, de bok reinigen of beschermen met wegwerpfolie, de penis voor een dekking met

een droge doek afnemen of wassen16,29,30.

21

5.2.4. Overdraagbare ziektes met ingevroren sperma

Zelfs na het proces van invriezen en ontdooien kunnen er micro-organismen overleven in het

ejaculaat, met mogelijke overdracht van pathogene bacteriën naar de merrie28,46. De species die

meest frequent uit ontdooid sperma worden geïsoleerd zijn: Enterobacter spp., Enterococcus spp.,

Stenotrophomonas maltophila, Propionibacterium granulosum en Corynebacterium spp.. Andere

bacteriën die ook vaak uit het ontdooide ejaculaat worden geïsoleerd zijn Micrococcus spp.,

schimmels (Aspergillus spp.), gisten (Candida en Cryptococcus), Pseudomonas aeruginosa en

anaërobe bacteriën (Propionibacterium granulosum en Clostridum spp.)46. De meeste species zijn niet

pathogeen, uitgezonderd Clostridum spp en Pseudomonas aeruginosa46. Bij gevoelige merries

kunnen opportunistische bacteriën in het ejaculaat, zoals Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae, Streptococcus zooepidemicus en Taylorella equigenitalis, een ontstekingsrespons

veroorzaken die tot onvruchtbaarheid kan leiden46. Wat betreft de invloed van de micro-organismen op

de spermatozoa en vruchtbaarheid is weinig bekend. Het aantal kolonie vormende eenheden per

milliliter sperma verschilt veel per individuele hengst. Het toevoegen van antibiotica aan de verdunner

is onvoldoende om contaminatie met micro-organismen tegen te gaan46.

Virussen, onder andere influenza virus, equine viraal arteritis virus, equine herpesvirus type 1 en

equine infectieuze anemie virus, kunnen persisteren in de voortplantingsorganen van de hengst

zonder een significante ontsteking te geven68. Een virus waarvan gekend is dat het de

invriesprocedure overleeft en zich verspreidt via ontdooid sperma, is het equine viraal arteritis virus69.

Fig. 9: Microbieel gewicht van de geïsoleerde bacteriën (uit Corona en Cherchi, 2009)46

5.2.5. Aanzuren van het ejaculaat

Een mogelijke methode om virussen uit het ejaculaat te elimineren is door aanzuren van het sperma45.

De meeste virussen worden namelijk geïnactiveerd bij een pH tussen 5 en 6. Voorafgaand aan het

invriezen kan men HCL toevoegen aan het verdunde ejaculaat45. Dit gebeurt in de verhouding 1:1 bij

een temperatuur van 35°C tot een pH van 5 bereikt wordt. Deze verlaagde pH wordt aanhouden voor

2 tot 5 minuten. Erna kan met NaOH de pH genormaliseerd worden. Virussen die geïnactiveerd

worden binnen 1 minuut bij een pH lager dan 6 zijn onder andere het “eastern” en “western equine

22

encephalomyelitis” en “Semliki Forest virus”45. In vitro proeven hebben uitgewezen dat een kortdurend

zuur milieu geen morfologische afwijkingen veroorzaakt45. Kortstondig aanzuren van sperma is dus

handig om zuurlabiele pathogenen uit het ejaculaat te elimineren.

5.2. MANAGEMENT

5.2.1. Stalling

Het groeperen van meerdere hengsten zonder contact met merries kan een bachelor band, zoals die

in de natuur voorkomt, nabootsen69. Een bachelor hengst heeft minder androgeenconcentratie in het

bloed, vertoont minder seksueel en agressief gedrag, vertoont afgenomen testikelgrootte en heeft een

verminderde spermakwaliteit69. Een hengst die verlaagde vruchtbaarheid en libido vertoont, zou

mogelijk baat kunnen hebben bij permanent contact met merries69.

5.2.2. Bioveiligheid

Per maand is het aanbevolen om 1% van het totaal aantal verzamelde ejaculaten te testen op

contaminatie met organismen30. Om infecties te voorkomen is het belangrijk dat hengsten

gecontroleerd worden voordat ze de faciliteit binnenkomen. Regelmatig onderzocht en test van

hengsten op mogelijke ziektes kan ook gedaan worden28. Nieuwe hengsten of zieke paarden dienen

in quarantaine geplaatst te worden28.

5.2.3. Seksuele rust

In de cauda epididymis bevindt zich 62% van de extra-gonadale spermareserve. De vas deferens

inclusief ampulla bevat 7% van de extra-gonadale spermareserve70. Bij een seksueel uitgeruste

hengst moeten de eerste twee tot vier ejaculaties niet gebruiken worden om in te vriezen26. Zelfs al

zou het sperma er onder de microscoop als goede kwaliteit uit zien26. Te lange seksuele rust kan

zorgen voor een opstapeling aan spermatozoa in de epididymis. Hier blijft het sperma zitten en zal

mettertijd afsterven als de hengst zijn reserves niet ledigt via urineren. Dagelijkse afname gedurende

een week zal zorgen voor een depletie van de extra-gonadale reserve en zodoende zal de werkelijke

spermakwaliteit zich stabiliseren32,33.

5.2.4. Intratesticulaire temperatuur

De thermoregulatie van de testis is afhankelijk van warmte uitwisseling via het counter current

mechanisme van de plexus pampiniformus, contractie en relaxatie van de musculus cremaster en

tunica dartos, warmte straling op het scrotale oppervlak en de zweetklier activiteit71,72. Normale

temperatuur intra testiculair is 35°C71. Een verhoogde testiculaire temperatuur is schadelijk voor de

spermatogenese en geeft degeneratie van de testis door hypoxie73,74. Een verhoogde intratesticulaire

temperatuur kan verschillende oorzaken hebben, waaronder koorts, abdominale of inguinale testis,

trauma, ontsteking van de testis, scrotum of epididymis, oedeem, bloeding, dermatitis, torsie van de

testis en hoge omgevingstemperatuur71,72,73,74. Primaire en secundaire spermatocyten zijn gevoeliger

voor de schadelijke effecten van verhoogde temperatuur dan de spermatogonia in de testis en de

spermatozoa in de epididymis73. Het duurt ongeveer 60 dagen voordat de waarden in het ejaculaat

weer normaal zijn geworden na een temperatuursverhoging van één tot twee dagen73. Slechts 25 tot

40 dagen na de temperatuursverhoging worden de nadelige effecten waargenomen namelijk

verminderde motiliteit, afwijkende morfologie, laagste concentratie spermatozoa en totaal aantal

spermatozoa (zie figuur 10)73. Mocht een hengst een vermoedelijke periode van verhoogde

intratesticulaire temperatuur hebben meegemaakt en hij wordt gekeurd in de 25 tot 60 dagen na deze

periode, dan is de evaluatie niet een weerspiegeling van de werkelijke kwaliteit van het sperma. Het is

aan te raden om de hengst dan te herkeurd na een of twee maanden.

23

Fig. 10: Regressie analyse van spermatozoa van: a) progressief motiel, b) percentage morfologisch normaal, c)

concentratie, d) totaal aantal (uit Freidman et al., 1991)73.

De x-as geeft het aantal dagen weer ná de periode van verhoogde intra-testiculaire temperatuur.

De rechte lijn in het midden van de grafiek geeft het normale niveau aan vóór de verhoogde intra-testiculaire

temperatuur.

De gestippelde lijn geeft het gemiddelde van de groep hengsten weer die 24 uur lang op dag 0 een verhoogde

intra-testiculaire temperatuur hebben ondergaan.

De vaste lijn geeft het gemiddelde van de groep hengsten weer die 48 uur lang op dag 0 een verhoogde intra-

testiculaire temperatuur hebben ondergaan.

5.2.5. Stress en effect van inspanning

Drie weken na de start van een stressvolle periode neemt de spermakwaliteit af van zowel vers als

diepvriessperma en drie weken na het beëindigen van de stress verbetert deze weer75. Dit negatief

effect zou het gevolg kunnen zijn van verhoogde corticosteroïdenspiegels of van een verhoogde

lichaamstemperatuur75. Tijdens het voortplantingsseizoen worden veel fokhengsten getraind76. Een

dagelijkse matige inspanning heeft geen effect op de spermakwaliteit76. Intensieve inspanning

daarentegen, vooral wanneer uitgevoerd in een warme omgeving, kan mogelijk de testiculaire

temperatuur inwendig verhogen en zo de spermatogenese aantasten72. Hengsten die tijdens het

fokseizoen deelnamen aan de racen, vertoonden nochtans geen gedaalde fertiliteit77. In deze studie

zijn helaas geen gegevens van ingevroren sperma meegenomen. Uit een andere studie is gebleken

dat Duitse warmbloed hengsten, die uitgebracht worden in de dressuur- of springsport, veranderingen

in de hormoonspiegels vertonen77. Deze veranderingen in hormoonconcentraties hadden geen effect

op de spermakwaliteit.

a

b

c

d

24

BESPREKING

Het proces van invriezen is in het begin een serendipiteit geweest: bij toeval is ontdekt dat glycerol

zorgt voor een betere overleving van spermatozoa. Het onderzoek hierna is meer door “trial-error”

gevorderd. Tegenwoordig zijn de onderzoeken gericht op cel- en molecuulniveau om een betere

voorspelling te maken hoe een vriesproces de spermacel beïnvloedt. Hierdoor kunnen meer gerichte

protocollen ontworpen worden. Desondanks komt de theorie niet altijd overeen met de werkelijkheid.

Tussen laboratoria onderling en tussen verschillende landen is er geen uniformiteit van het proces van

invriezen48. Dit maakt het moeilijk om onderzoeken te vergelijken met elkaar en ook om de

betrouwbaarheid van de resultaten in te schatten. Het is dus belangrijk dat laboratoria internationaal

streven naar gestandaardiseerde protocollen. Het zorgvuldig noteren van resultaten en

vruchtbaarheidscijfers is nodig om genoeg data te verzamelen waarop onderzoek kan gebeuren.

Onderzoek wordt ook belemmerd door het laag aantal gedekte merries per hengst waardoor er geen

betrouwbare resultaten worden verkregen. Ook zijn er weinig financiële middelen beschikbaar om

onderzoeken te stimuleren.

Rasverschillen, klimatologische omstandigheden en management spelen een grote rol in de kwaliteit

van het sperma. Deze verschil tussen landen maakt het zeer moeilijk om onderzoeken te extrapoleren

naar een ander land omdat de factoren verschillen. Daarnaast bestaat er individueel ook een groot

verschil in gevoeligheid van het sperma voor het invriesproces. Om toch een breed aanbod van

hengsten te kunnen aanbieden zijn er meerdere protocollen nodig. Hierdoor is het zeer moeilijk om

een uniform standaardprotocol te maken. Meerdere gestandaardiseerde protocollen vast leggen zal

ervoor zorgen dat internationale onderzoeken beter met elkaar vergeleken kunnen worden, terwijl de

hengsten voor hun intrinsieke factoren tegemoet worden gekomen.

Eenmaal een gekozen protocol wordt toegepast houd men zich hieraan. Met andere woorden, zodra

men aan het gefilterde ejaculaat een verdunner toevoegt tot en met het rietje in de vloeibare

stikstofcontainer, zit je aan die specifieke stappen van het protocol vast en gaat men ervanuit dat de

kwaliteit iedere keer constant zal zijn. Echter het tegendeel is waar, een moment van onoplettendheid

kan zeer nefaste gevolgen hebben voor de kwaliteit van de spermatozoa. Men moet er constant van

bewust zijn dat de minste afwijking negatieve gevolgen heeft voor de vruchtbaarheid.

Ook heerst er bij de dierenartsen en eigenaren de opvatting dat ingevroren sperma van minder

kwaliteit is. Als men echter zorgvuldig omgaat met het sperma en de merrie juist begeleid, worden er

acceptabele vruchtbaarheidscijfers bereikt met ingevroren sperma. Mocht het eenmaal zover komen

dat gekoeld sperma en ingevroren sperma op één lijn staan, dan zal ingevroren sperma zeker de

voorkeur hebben vanwege zijn onbepaalde houdbaarheid.

Vanaf de voorbereiding voor sperma-afname tot en met het ontdooien van de rietjes zijn een aantal

essentiële stappen die op de spermatozoa een grote impact hebben. Bij elke stap gaan er

spermatozoa verloren en het is de taak om dit verlies zo minimaal mogelijk te houden.

25

REFERENTIELIJST

1. Aurich J., Aurich C. (2006). Developments in European horse breeding and consequences for

veterinarians in equine reproduction. Reproduction of Domestic Animals 41, 275–279.

2. Aurich J.E., Kühne A., Hoppe H., Aurich C. (1996). Seminal plasma affects membrane integrity

and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology 46, 791-7.

3. Paul R., Loomis P.R., Squires E.L. (2005). Frozen semen management in equine breeding

programs. Theriogenology 64, 480–491.

4. Miller C.D. (2008). Optimizing the use of frozen–thawed equine semen. Theriogenology 70, 463–

468.

5. Foote R.H. (2002). The history of artificial insemination: selected notes and notables. Journal of

animal science 80, 1-10.

6. Squires E.L. (2009). Changes in equine reproduction: have they been good or bad for the horse

industry. Journal of Equine Veterinary Science 29, 268-273.

7. Holt W.V. (2000). Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science 62, 3–

22.

8. Loomis P.R. (2001). The equine frozen semen industry. Animal Reproduction Science 68, 191-

200.

9. Loomis P.R., Graham J.K. (2008). Commercial semen freezing: Individual male variation in

cryosurvival and the response of stallion sperm to customized freezing protocols. Animal

Reproduction Science 105, 119–128.

10. Sieme H., Harrison R.A., Petrunkina A.M. (2008). Cryobiological determinants of frozen semen

quality, with special reference to stallion. Animal Reproduction Science 107, 276-292.

11. Petrunkina A.M. (2007). Fundamental aspects of gametes cryobiology. Journal of Reproductive

Medicine and Endocrinology 4, 78–92.

12. Zhmakin A.I. (2008). Physical aspects of cryobiology. Uspekhi Fizicheskikh Nauk 51, 231-252.

13. Medeiro C.M.O., Forell F., Oliveira A.T.D., Rodrigues J.L. (2002). Current status of sperm

cryopreservation: why isn’t it better?. Theriogenology 57, 327-344.

14. Oldenhof H., Gojowsky M., Wang S., Henke S., Yu C., Rohn K., Wolkers W.F., Sieme H. (2013).

Osmotic stress and membrane phase changes during freezing of stallion sperm: mode of action of

cryoprotective agents. Biology of Reproduction 88, 1–11.

15. Morris G.J., Acton E., Murray B.J., Fonseca F. (2012). Freezing injury: the special case of the

sperm cell. Cryobiology 64, 71–80.

16. Katila T. (1997). Procedures for handling fresh stallion semen. Theriogenology 46,1217-1227.

17. Ball B.A. (2008).Oxidative stress, osmotic stress and apoptosis: Impacts on sperm function and

preservation in the horse. Animal Reproduction Science 107, 257–267.

18. Katila T. (2001). In vitro evaluation of frozen–thawed stallion semen: a review. Acta Veterinaria

Scandinavica 42, 199–217.

19. Moore A.I., Squires E.L., Graham J.K. (2005). Effect of seminal plasma on the cryopreservation of

equine spermatozoa. Theriogenology 63, 2372–2381.

20. Vidament M. (2005). French field results (1985–2005) on factors affecting fertility of frozen stallion

semen. Animal Reproduction Science 89, 115–136.

21. Morris G.J., Faszer K., Green J.E., Draper D., Grout B.W.W., Fonseca F. (2007). Rapidly cooled

horse spermatozoa: loss of viability is due to osmotic imbalance during thawing, not intracellular

ice formation. Theriogenology 68, 804–812.

22. Aurich J.A. (2012). Artificial insemination in horses - More than a century of practice and research.

Journal of Equine Veterinary Science 32, 458-463.

26

23. Squires E.L. (2013). Semen cryopreservation - challenges and perspectives. Revista Brasileira de

Reprodução Animal 37, 136-139.

24. Steven P., Brinsko S., Terry L., Blanchard T., Dickson D., Varner D., Schumacher J., Charles C.,

Love C., Hinrichs K., Hartman D.L. (2011). Semen Preservation. Manual of Equine Reproduction,

3rd Edition. Mosby Elsevier, Missouri. 207-227.

25. Smits K., Hoogewijs M., Woelders H., Daels P., Van Soom A. (2012). Breeding or assisted

reproduction? Relevance of the horse model applied to the conservation of endangered equids.

Reproduction of domestic animals 47, 239–248.

26. Sanchez R., Gomez I., Samper J.C. (2009). Artificial insemination with frozen semen. Equine

Breeding Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia. 175–183.

27. Troedsson M.H.T., Liu I.K.M., Crabo B.G. (1998). Sperm transport and survival in the mare.

Theriogenology 50, 807-818.

28. Thibier M., Guerin B. (2000). Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial

insemination. Animal Reproduction Science 62, 233–251.

29. Hurtgen J.P. (2009). Semen collection in stallions. Artificial insemination. Equine Breeding

Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia. 33-39.

30. Althouse G.C. (2008). Sanitary procedures for the production of extended semen. Reproduction of

domestic animals 43, 374–378.

31. Brinsko S.P., Blanchard T.L., Varner D.D., Schumacher J., Love C.C., Hinrichs K., Hartman D.L.

(2011). Semen Collection and Artificial Insemination with Fresh Semen. Manual of Equine

Reproduction, 3rd Edition. Mosby Elsevier, Missouri. 160-175.

32. Ionata L.M., Anderson T.M., Pickett B.W., Heird J.C., Squires E.L. (1991). Effect of supplementary

sexual preparation on semen characteristics of stallions. Theriogenology 36, 923-937.

33. Sieme H., Katila T., Klug E. (2004). Effect of semen collection practices on sperm characteristics

before and after storage and on fertility of stallions. Theriogenology 61, 769–784.

34. Crabtree J. (2010). Prebreeding examination of the stallion 2. Semen collection and evaluation. In

Practice 32, 58–63.

35. Côté M.A., Blum K.M., Burd M.A. (2011). Sources of spermatozoa loss during collection and

artificial insemination of horses. Animal Reproduction Science 126, 207– 210.

36. Kareskoski M., Katila T. (2008). Components of stallion seminal plasma and the effects of seminal

plasma on sperm longevity. Animal Reproduction Science 107, 249–256.

37. Griggers S., Paccamonti D.L., Thompson R.A., Eilts B.E. (2001). The effects of pH, osmolarity and

urine contamination on equine spermatozoal motility. Theriogenology 56, 613-622.

38. Chenier T.S. (2009). Anatomy and physical examination of the stallion. Equine Breeding

Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia.1-16.

39. Crabtree J. (2010). Prebreeding examination of the stallion 1. Physical examination. In Practice

32, 22–28.

40. Crockett E.C., Graham J.K., Bruemmer J.E., Squires E.L. (2001). Effect of cooling of equine

spermatozoa before freezing on post-thaw motility: preliminary results. Theriogenology 55, 793-

803.

41. Neto C.R., Monteiro G.A., Soares R.F., Pedrazzi C., Dell’aqua J.A., Papa F.O., Castro-Chaves

M.M., Alvarenga M.A. (2013). New seminal plasma removal method for freezing stallion semen.

Theriogenology 79, 1120–1123.

42. Backman T., Bruemmer J.E., Graham J.K., Squires E.L. (2004). Pregnancy rates of mares

inseminated with semen cooled for 18 hours and then frozen Journal of Animal Science 82, 690-

694.

27

43. Watson P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal

Reproduction Science 60, 481–492.

44. Kuisma P., Andersson M., Koskinen E., Katila T. (2006). Fertility of frozen–thawed stallion semen

cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Veterinaria Scandinavica 48,

1-8.

45. Bielanski A. (2007). Disinfection procedures for controlling microorganisms in the semen and

embryos of humans and farm animals. Theriogenology 68, 1–22.

46. Corona A., Cherchi R. (2009). Microbial quality of equine frozen semen. Animal Reproduction

Science 115, 103–109.

47. Klein C., Donahue J.M., Sells S.F., Squires E.L., Timoney P.J., Troedsson M.H.T. (2010).

Antibiotic-containing semen extender reduces the risk of transmission of CEM. Animal

Reproduction Science 121, 222–223.

48. Samper J.C., Morris C.A. (1998). Current methods for stallion semen cryopreservation: a survey.

Theriogenology 49, 895–903.

49. Hoffmann N., Oldenhof H., Morandini C., Rohn K., Sieme H. (2011). Optimal concentrations of

cryoprotective agents for semen from stallions that are classified ‘good’ or ‘poor’ for freezing.

Animal Reproduction Science 125, 112– 118.

50. Maziero R.R.D.M., Guasti P.N., Monteiro G.A., Avanzi B.R., Hartwig F.P., Lisboa F.P., Martin I.,

Papa F.A. (2013). Evaluation of sperm kinetics and plasma membrane integrity of frozen equine

semen in different storage volumes and freezing conditions. Journal of equine veterinary science

33, 165 -168.

51. Miller H., Lock S., Busch D., Brace B. (2011). Semen storage and handling. Proceedings, Applied

Reproductive Strategies in Beef Cattle 9, 227-229.

52. Bielanski A. (2012). A review of the risk of contamination of semen and embryos during

cryopreservation and measures to limit cross-contamination during banking to prevent disease

transmission in ET practices. Theriogenology 77, 467–482.

53. Dowsett K.F., Knott L.M. (1996). The influence of age and breed on stallion semen.

Theriogenology 46, 397-412.

54. Katila T., Nivola K., Reilas T., Sairanen J., Peltonen T., Virtala A.M. (2010). Factors affecting

reproductive performance of horses. Pferdeheilkunde 26, 6-9.

55. Vidament M., Dupree A.M., Julienne P., Evian A., Noue P., Palmer E. (1997). Equine frozen

semen: freezability and fertility field results. Theriogenology 48, 907–917.

56. Eldik P., Waaij E.H., Ducro B., Kooper A.W., Stout T.A.E., Colenbrander B. (2006). Possible

negative effects of inbreeding on semen quality in Shetland pony stallions. Theriogenology 65,

1159-1170.

57. Gamboa S., Rodrigues A.S., Henriques L., Batista C., Ramalho-Santos J. (2010). Seasonal

functional relevance of sperm characteristics in equine spermatozoa. Theriogenology 73, 950–

958.

58. Nagy P., Guillaume D., Daels P. (2000). Seasonality in mares. Animal Reproduction Science 60,

245–262.

59. Janett F., Thun R., Bettschen S., Burger D., Hässig M. (2003). Seasonal changes of semen

quality and freezability in Franches-Montagnes stallions. Animal Reproduction Science 77, 213–

221.

60. Blottner S., Warnke C., Tuchscherer A., Heinen V., Torner H. (2001). Morphological and functional

changes of stallion spermatozoa after cryopreservation during breeding and non-breeding season.

Animal Reproduction Science 65, 75–88.

28

61. Magistrini M., Chanteloube P., Palmer E. (1987). Influence of season and frequency of ejaculation

on production of stallion semen for freezing. Journal of Reproduction and Fertility 35, 127–133.

62. Wrencha N., Pintob C.R.F., Klinefelter G.R., Dixc D.J., Flowersa W.L., Farin C.E. (2010). Effect of

season on fresh and cryopreserved stallion semen. Animal Reproduction Science 119, 219–227.

63. Janett F., Thun R., Niederer K., Burger D., Hässig M. (2003). Seasonal changes of semen quality

and freezability in the warmblood stallion. Theriogenology 60, 453–461.

64. Mantovani R., Bailoni L. (2011). Energy and protein allowances and requirements in stallions

during the breeding season, comparing different nutritional systems. Journal of Animal Science

89, 2113-2122.

65. Schmid-Lausigk Y., Aurich C. (2014). Influences of a diet supplemented with linseed oil and

antioxidants on quality of equine semen after cooling and cryopreservation during winter.

Theriogenology 81, 966–973.

66. Johnson L., Thompson D.L. (1987). Effect of seasonal changes in Leydig cell number on the

volume of smooth endoplasmic reticulum in Leydig cells and intratesticular testosterone content in

stallion. Journal of Reproduction and Fertility 81, 227-232.

67. Hoffmann B., Landeck A. (1999). Testicular endocrine function, seasonality and semen quality of

the stallion. Animal Reproduction Science 57, 89–98.

68. Edwards J.F. (2008). Pathologic conditions of the stallion reproductive tract. Animal Reproduction

Science 107, 197–207.

69. Burger D., Wedekind C., Wespi B., Imboden I., Meinecke-Tillmann S., Sieme H. (2012). The

Potential Effects of Social Interactions on Reproductive Efficiency of Stallions. Journal of Equine

Veterinary Science 32, 455-457.

70. Amann R.P., Thompson D.L., Squires E.L., Pickett B.W. (1979). Effects of age and frequency of

ejaculation on sperm production and extragonadal sperm reserves in stallions. Journal of

Reproduction and Fertility 27, 1-6.

71. Neto C.R., Monteiro G.A., Delfiol D.J.Z., Farras M.C., Dell'aqua J.A., Papa F.O., Alvarenga M.A.

(2013). The relationships between scrotal surface temperature, age and sperm quality in stallions.

Livestock Science 157, 358–363.

72. Staempfli S., Janett F., Burger D., Kündig H., Imboden I., Hässig M., Thun R. (2006). Effect of

exercise and suspensory on scrotal surface temperature in the stallion. Theriogenology 66, 2120–

2126.

73. Freidman R., Scott M., Heath S.E., Hughes J.P., Daels P.F., Tran T.Q. (1991). The effects of

increase testicular temperature on spermatogenesis in the stallion. Journal of Reproduction and

Fertility 44, 127-134.

74. Ball B.A. (2008). Diagnostic methods for evaluation of stallion subfertility: a review. Journal of

Equine Veterinary Science 28, 650-665.

75. Janett F., Burkhardt C., Burger D., Imboden I., Hässig M., Thun R. (2006). Influence of repeated

treadmill exercise on quality and freezability of stallion semen. Theriogenology 65, 1737–1749.

76. Mawyer J.D., Cavinder C.A., Vogelsang M.M., Sigler D.H., Love C.C., Brinsko S.P., Blanchard

T.L., Varner D.D., Arnold C.E., Teague S., Gordon R.K. (2012). Thermoregulation of the testicle in

response to exercise and subsequent effects on semen characteristics of stallions. Journal of

animal science 90, 2532–2539.

77. Sairanena J., Katila T., Virtala A.M., Ojala M. (2011). Effects of racing on equine fertility. Animal

Reproduction Science 124, 73–84.