UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE … · 2011. 2. 19. · UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT...
65
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Farmaceutische Technologie Academiejaar 2009-2010 ZOEKTOCHT NAAR STABILIZERS EN OPTIMALE PRODUCTIEPARAMETERS IN DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG POEDERVACCIN VOOR PLUIMVEE TEGEN DE NEWCASTLE DISEASE Kaat STRYBOL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. dr. apr. C. Vervaet Commissarissen Prof. dr. apr. H. Nelis Dr. apr. K. Raemdonck
Transcript of UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE … · 2011. 2. 19. · UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT...
-
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer
Laboratorium voor Farmaceutische Technologie
Academiejaar 2009-2010
ZOEKTOCHT NAAR STABILIZERS EN OPTIMALE PRODUCTIEPARAMETERS IN DE
ONTWIKKELING VAN EEN DROOG POEDERVACCIN VOOR PLUIMVEE TEGEN DE NEWCASTLE
DISEASE
Kaat STRYBOL
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. dr. apr. C. Vervaet
Commissarissen
Prof. dr. apr. H. Nelis
Dr. apr. K. Raemdonck
-
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik
valt onder de beperking van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze
masterproef.”
31 mei 2010
Promotor
Prof. dr. apr. C. Vervaet
Auteur
Kaat Strybol
-
DANKWOORD
In de eerste plaats wil ik Prof. dr. apr. C. Vervaet bedanken om mij de
kans te geven mijn onderzoeksstage op het labo te mogen uitvoeren en
voor de algemene begeleiding.
Eveneens gaat mijn dank uit naar apr. K. Huyge. Bedankt Katrien om mij
wegwijs te maken in deze materie en voor de dagelijkse ondersteuning en
begeleiding.
De gezellige babbels tussendoor en je enthousiasme tijdens het
onderzoek van “onze poedertjes” maakten het voor mij veel aangenamer.
Ook bedankt voor de adviezen bij het schrijven en voor het corrigeren van
mijn tekst.
Voorts wens ik ook de assistenten en het labopersoneel te bedanken voor
het oplossen van allerlei praktische problemen in het labo en voor de
leuke sfeer.
Tenslotte bedank ik ook mijn ouders voor hun steun en het nalezen van
mijn thesis.
-
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING ..................................................................................................................... 1
1.1. NEWCASTLE DISEASE ....................................................................................................... 1
1.1.1. Pathogenese en classificatie .................................................................................... 1
1.1.2. Diagnose ................................................................................................................... 3
1.1.2.1. Klinische symptomen ........................................................................................ 3
1.1.2.2. Serologische diagnose ....................................................................................... 3
1.1.3. Controle en preventie .............................................................................................. 5
1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE .............................................................................................. 5
1.2.1. Types vaccins ............................................................................................................ 5
1.2.1.1. Levend geattenueerde vaccins .......................................................................... 5
1.2.1.2. Geïnactiveerde vaccins ...................................................................................... 6
1.2.2. Huidige vaccinatietechnieken .................................................................................. 6
1.2.2.1. Individuele vaccinatie ........................................................................................ 6
1.2.2.2. Massavaccinatie ................................................................................................ 7
1.3. DROGE POEDERAEROSOLEN VOOR MASSAVACCINATIE VIA RESPIRATOIRE ROUTE.... 10
2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 12
3. MATERIALEN ............................................................................................................... 14
3.1. MANNITOL ..................................................................................................................... 14
3.2. TREHALOSE .................................................................................................................... 14
3.3. MYO-INOSITOL .............................................................................................................. 16
3.5. GLYCINE ......................................................................................................................... 16
3.6. BETAÏNE ......................................................................................................................... 17
4. METHODEN ................................................................................................................. 18
4.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN B-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 18
4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen ..................................................... 18
4.1.1.1. Principe ............................................................................................................ 18
4.1.1.2. Methode .......................................................................................................... 19
4.1.2. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß-galactosidasetest .................................... 20
4.1.3. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ................................................... 21
4.1.3.1. Scanning Elektronenmicroscoop (SEM): bepaling morfologie ........................ 21
-
4.1.3.2. Laserdiffractie: bepaling partikelgrootte ........................................................ 22
4.1.3.3. Karl Fischer titratie: bepaling vochtgehalte .................................................... 24
4.1.3.4. Dynamic Vapour Sorption: bepaling hygroscopiciteit .................................... 25
4.1.3.5. Differential Scanning Calorimetrie: bepaling smelt en
glastransitietemperatuur ......................................................................................... 26
4.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS ................................................................. 27
4.3. DESIGN OF EXPERIMENTS: INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE
ENZYMSTABILITEIT ........................................................................................................... 28
4.3.1. Inleidende begrippen ............................................................................................. 28
4.3.2. Design opzet ........................................................................................................... 39
4.3.3. Evaluatie van de poederstalen ............................................................................... 31
4.3.4. Analyse van het experimenteel design .................................................................. 31
4.3.4.1. Evaluatie van de ruwe data ............................................................................. 31
4.3.4.2. Lineaire regressie analyse ............................................................................... 32
4.3.4.3. Gebruik van het model .................................................................................... 33
4.4. VIRUSTITRATIE ............................................................................................................... 33
4.4.1. Principe ................................................................................................................... 33
4.4.2. Methode ................................................................................................................. 34
5. RESULTATEN EN DISCUSSIE.......................................................................................... 36
5.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN B-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 36
5.1.1. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: β-galactosidasetest .................................... 36
5.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ................................................... 38
5.1.2.2. Morfologie ....................................................................................................... 38
5.1.2.3. Partikelsgroottedistributie .............................................................................. 39
5.1.2.4. Vochtgehalte ................................................................................................... 41
5.1.2.5. Smelt- en glastransitietemperatuur ................................................................ 42
5.1.2.6. Hygroscopiciteit ............................................................................................... 43
5.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS ................................................................. 44
5.2.1. Morfologie .............................................................................................................. 44
5.2.2. Partikelgroottedistributie ....................................................................................... 45
5.3. EXPERIMENTAL DESIGN/ INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE
ENZYMSTABILITEIT ........................................................................................................... 46
-
5.3.1. Evaluatie van de poederstalen ............................................................................... 46
5.3.2. Analyse van het experimenteel design .................................................................. 47
5.3.2.1. Evaluatie van de ruwe data ............................................................................. 47
5.3.2.2. Lineaire regressie analyse ............................................................................... 47
5.3.2.3. Gebruik van het model .................................................................................... 48
5.4. Virustitratie .................................................................................................................... 49
6. CONCLUSIE .................................................................................................................. 51
7. LITERATUURSLIJST ....................................................................................................... 53
-
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
Bet
BSA
DVS
DSC
EID50
Betaïne
Bovine Serum albumine
Dynamic Vapour Sorption
Differential scanning calorimetry
Egg infectious dose 50% endpoint
ELISA
Glyc
H
HA-test
Enzyme-inked immunosorbent assay
Glycine
Hemagglutinine
Hemagglutinatie-test
Ino
Mann
N
NCD
PBS
PVP
RBC
RH
SEM
Treh
Myo-inositol
Mannitol
Neuraminidase
Newcastle Disease
Phosphate Buffered Saline
Polyvinylpyrrolidone
Rode bloedcellen
Relatieve vochtigheid
Scanning elektronenmicroscoop
Trehalose
-
1
1. INLEIDING
De pluimvee-industrie speelt de dag van vandaag een belangrijke rol in de economie.
In pluimveebedrijven kunnen duizenden kippen samen zitten in één ruimte. Hierdoor is het
risico op verspreiding van ziektes tussen de dieren zeer groot. Maatregelen zoals vaccinatie
en hygiënische maatregelen moeten genomen worden om het uitbreken en verspreiden van
deze ziektes te voorkomen (Cargill, 1999; Alexander et al, 2004).
Pluimveehouders moeten zich tegenwoordig aan een strikt vaccinatieschema houden
om zo de uitbraak van ziektes te vermijden. Onder andere de Newcastle Disease (NCD), een
respiratoire aandoening die ook de pseudovogelpest genoemd wordt (Rauw et al, 2009), is
opgenomen in dit vaccinatieschema (tabel 1.1.).
TABEL 1.1.: KLASSIEK VACCINATIESCHEMA VOOR PLUIMVEE
(http://www.cbip-vet.be)
Leeftijd Toedieningswijze Reproductiedieren Legkippen Mestkippen Label mestkippen
1 dag I. M. Marek Marek Marek
Spray Newcastle
Bronchitis
Newcastle
Bronchitis
Newcastle Bronchitis
Newcastle Bronchitis
2 à 4 weken
drinkwater of spray Newcastle
Gumboro
Newcastle
Gumboro
Newcastle
Gumboro
Newcastle
Gumboro
7 à 12 weken
drinkwater of spray Newcastle
Bronchitis
Newcastle
Bronchitis
14 à 18 weken
drinkwater of spray Encefalomyelitis
Newcastle
Encefalomyelitis
Newcastle
I.M. Newcastle Newcastle
1.1. NEWCASTLE DISEASE
1.1.1. Pathogenese en classificatie
De Newcastle Disease werd voor het eerst gesignaleerd bij pluimvee in Java,
Indonesië en Newcastle-upon-Tyne in 1926. De dag van vandaag is de ziekte wereldwijd
verspreid. Het virus heeft een zeer brede range aan gastheren, 27 van de 50 ordes van
-
2
vogels werden reeds gerapporteerd besmet te zijn met het Newcastle Disease Virus (NCV)
(Seal et al, 1999).
De verspreiding van het virus kan gebeuren via direct contact met besmette vogels,
via contact met besmet materiaal (bijvoorbeeld voeder of drinkwater, verontreinigd door
uitwerpselen) of via de lucht. Kuikens kunnen besmet worden door viruspartikels die zich op
de eierschaal bevinden (http://www.afsca.be/sp/sa-newcastle/newcastle_nl.asp).
Het Newcastle Disease virus maakt deel uit van de familie Paramyxoviridae, meer
bepaald van de sub-familie Paramyxoviriniae. Het is een omhuld RNA virus met een negatief
enkel-strengig genoom. De belangrijkste antigenen op het oppervlak van het virus die
verantwoordelijk zijn voor de protectieve immuunrespons zijn de fusie-glycoproteïnen (F-
glycoproteïnen) en de haemaglutinine (H) en neuraminidase (N) oppervlakte glycoproteïnen
(Alexander et al, 2004; Seal et al, 1999; Reddy et al, 1996).
FIGUUR 1.1.: PARAMYXOVIRUS MET F EN HN GLYCOPROTEÏNEN
(http://pathmicro.med.sc.edu)
Er zijn verschillende Newcastle Disease virusstrengen die in 5 pathotypes
onderverdeeld kunnen worden. Viscerotrope en neurotrope velogenische strengen zijn de
meest virulente stammen voor kippen en kunnen acute letale infecties met aantasting van
de ingewanden veroorzaken. Neurologische en respiratoire symptomen met lage mortaliteit
kunnen voorkomen bij infecties met mesogene strengen, terwijl de lentogene strengen
mildere infecties ter hoogte van het respiratoire systeem veroorzaken. Ten slotte zijn er ook
-
3
asymptomatische enterische strengen die enkel verantwoordelijk zijn voor subklinische
enterische infecties (Alexander et al, 2004;
http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/111/newcastle-disease-paramyxovirus-1).
1.1.2. Diagnose
1.1.2.1. Klinische symptomen
De Newcastle Disease tast zowel het respiratoir, nerveus als spijsverteringsstelsel
aan. De incubatieperiode van het virus bedraagt 2 tot 15 dagen. Symptomen zijn onder
andere plotse dood, zwelling van de weefsels rond de ogen en nek, hoesten,
kortademigheid, diarree, verlamming, depressie, draainek, vermindering tot volledig
stoppen van de productie van eieren en productie van eieren met een dunnere schaal (Gallili
& Ben-Nathan, 1998; http://www.aphis.usda.gov/lpa/pubs/pub_ahend.html).
FIGUUR 1.2.: BROOSHEID VAN DE EIERSCHAAL ALS GEVOLG VAN DE NEWCASTLE DISEASE
(http://partnersah.vet.cornell.edu)
1.1.2.2. Serologische diagnose
De aanwezigheid van antilichamen tegen een virus tonen aan dat het dier besmet is
met dat virus, maar dat wil niet noodzakelijk zeggen dat het besmette dier aan de ziekte
lijdt. Een hoge antilichaam titer wijst wel op een recente infectie. Er zijn twee methoden om
de antilichaam titer te meten: de hemagglutinatie test en de enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Voor beide methoden zijn bloedstalen van de kippen nodig (Alexander et al,
2004).
-
4
Hemagglutinatietest
De hemagglutinatietest is gebaseerd op het principe dat sommige virussen, die in hun
kapsied of envelop de virale hemagglutine glycoproteïnen bevatten, in staat zijn zich aan
erytrocyten vast te hechten. Door een brug te vormen tussen 2 of meer bloedcellen kunnen
ze een netwerk doen ontstaan.
Influenzavirussen en paramyxovirussen bevatten ook het enzym neuraminidase in
hun envelop. Dit enzym zal er voor zorgen dat er elutie ontstaat door gedurende de
hemagglutinatie de glycoproteïne receptoren op de wand van de rode bloedcellen af te
breken. Elutie is het fenomeen waarbij de virussen terug loskomen van de rode bloedcellen.
Zo zal de hemagglutinatie verdwijnen na ongeveer 1 uur bij 37°C.
Of een virus hemagglutinerend is kan visueel makkelijk aangetoond worden. Er
worden rode bloedcellen toegevoegd aan een proefbuisje of recipiënt waarin het virus
aanwezig is. Als er hemagglutinatie optreedt, zullen de rode bloedcellen niet bezinken naar
het diepste punt van het buisje of recipiënt maar bedekken ze de volledige bodem. Indien er
geen hemagglutinatie optreedt, zullen de rode bloedcellen wel bezinken en een knop
vormen. Dit fenomeen wordt geïllustreerd in onderstaande figuur (cursus Virologie, faculteit
diergeneeskunde).
FIGUUR 1.3.: HEMAGGLUTINATIETEST
(http://pages.usherbrooke.ca)
-
5
1.1.3. Controle en preventie
Om de uitbraak van de Newcastle Disease te vermijden moet er veel aandacht
besteed worden aan bioveiligheid en hygiëne. Boerderijen en pluimveebedrijven moeten
gescheiden worden en verschillende vogelsoorten moeten op verschillende plaatsten
gekweekt worden (Alexander et al, 2004). Ook moet er een vlotte toevoer zijn van vers
water en moeten geïnfecteerde vogels verwijderd worden (Gallili & Ben-Nathan, 1998; Rauw
et al, 2009). Naast het optimaliseren van de levensomstandigheden speelt ook vaccinatie
een belangrijke rol in de preventie van NCD (Alexander et al, 2004).
1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE
1.2.1. Types vaccins
1.2.1.1. Levend geattenueerde vaccins
Bij vaccinatie van dieren met een levend geattenueerd vaccin wordt het dier
geïnfecteerd met een natuurlijk voorkomend virus dat niet virulent genoeg is om een ziekte
te veroorzaken of een virus dat afgezwakt is en dus zijn virulentie verloren heeft, maar niet
zijn immunogeniciteit.
Levende vaccins kunnen repliceren in hun gastheer. Hierin verschillen ze van
geïnactiveerde vaccins. Het nadeel hiervan is dat vaccinatie met levende vaccins kan
resulteren in ziekte met klinische symptomen als gevolg aangezien het virusvaccin de
gastheer infecteert en op deze manier een immuunreactie uitlokt. Anderzijds is het bij
vaccinatie met levende virusvaccins niet noodzakelijk om ieder dier individueel te
vaccineren. Het vaccin kan zich namelijk zelf verspreiden van vogel tot vogel.
Dit type vaccin wordt het meest gebruikt omwille van het grote aantal te behandelen
dieren en wordt vaak toegediend via massavaccinatietechnieken zoals drinkwater- en
sprayvaccinatie. Sommige van deze vaccins vereisen wel individuele applicatie via
oogdruppels of injectie (Alexander et al., 2004 ; Cargill, 1999).
-
6
Voorbeelden van levend geattenueerde Newcastle Disease vaccins zijn de mild
virulente B1 en La Sota strengen van het NDV. Deze zijn de meest effectieve levende
virusvaccins en worden wereldwijd meest gebruikt (Seal et al, 1999).
1.2.1.2. Geïnactiveerde vaccins
Geïnactiveerde vaccins worden gemaakt door een virus op te kweken in eieren.
Daarna wordt de infectieve allantoïsche vloeistof behandeld met een inactiverende stof en
met hulpstoffen, zoals minerale olie, om het geïnactiveerde virus immunogener te maken
(Gallili & Ben-Nathan, 1998; Alexander et al, 2004).
Een nadeel van dit type vaccins ten opzichte van levende vaccins is dat de virussen
dood zijn en zich dus niet langer kunnen repliceren in hun gastheer. Als gevolg hiervan
moeten alle vogels individueel gevaccineerd worden wat kan gebeuren via intramusculaire
of subcutane injectie.
Geïnactiveerde vaccins zorgen voor een goede protectie tegen het virulent virus
doordat ze hoge antilichaam spiegels tegen het virus induceren. In de pluimvee-industrie
worden geïnactiveerde vaccins meestal aangewend na een primaire vaccinatie met een
levend virus (Alexander et al, 2004).
1.2.2. Huidige vaccinatietechnieken
1.2.2.1. Individuele vaccinatie
FIGUUR 1.4.: VACCINATIE VIA OOGDRUPPELAPPLICATIE
(http://www.cdfa.ca.gov)
-
7
De meest effectieve manier om levende vaccins toe te dienen aan vogels is via
oogdruppelapplicatie (zie figuur 1.4). Elke vogel wordt hierbij individueel behandeld en krijgt
zo dus een volle dosis vaccin (Cargill, 1999).
De meest gebruikte techniek voor het vaccineren met vaccins met olie en
aluminiumhydroxide en voor sommige levende vaccins is vaccinatie via intramusculaire
injectie. Het vaccin wordt geïnjecteerd ter hoogte van de borst, poot of lagere nek. Het
plaatsen van de naald is zeer belangrijk omdat fouten hierbij kunnen leiden tot
granulomavorming, verlamming, zwelling en leverpunctie (Cargill, 1999).
In-ovo vaccinatie (zie figuur 1.5.) is een proces waarbij het vaccin toegediend wordt
aan bevruchte eieren na 17,5 tot 19 dagen incubatie. Deze techniek behoort tot een snel
groeiend terrein van de vaccinatietechnologie (Cargill, 1999; Reddy et al., 1996).
Aangezien de pluimvee-industrie vaak gerelateerd is aan grote aantallen kippen is
individuele vaccinatie zeer tijdrovend en hierdoor duur aangezien hiervoor gespecialiseerd
personeel nodig is. Daarom is massavaccinatie zowel economisch als praktisch gezien een
betere oplossing.
FIGUUR 1.5.: IN-OVO VACCINATIE
(http://www.reussir-aviculture.com)
1.2.2.2. Massavaccinatie
Drinkwatervaccinatie (zie figuur 1.6.) is een goede vaccinatiemethode voor levend
geattenueerde vaccins, voornamelijk wanneer het gastro-intestinaal stelsel het doelorgaan
-
8
is, zoals bij de infectieuze bursale ziekte. Het vaccin wordt bij deze methode van
massavaccinatie namelijk opgenomen ter hoogte van de gastro-intestinale mucosa. Door de
aanwezigheid van de achterste neusopeningen, die de neusholte met de larynx verbinden,
kan drinkwatervaccinatie ook gebruikt worden voor de meeste respiratoire virusvaccins.
Deze openingen zorgen er immers voor dat het vaccin de neus kan bereiken bij opname via
de mond (Cargill, 1999).
FIGUUR 1.6.: MASSAVACCINATIE VIA DRINKWATER
(http://www.vactora.com)
Alhoewel drinkwatervaccinatie een veel gebruikte methode is, zijn er toch enkele
nadelen aan verbonden. Zo blijft het vaccin slechts kort stabiel na oplossing in water. Alle
kippen zouden binnen de 2 uur na reconstitutie een voldoende dosis vaccin ingenomen
moeten hebben. Ook de kwaliteit van het water moet gegarandeerd zijn. Het mag
bijvoorbeeld geen chloor bevatten en desinfectantia die achtergebleven zijn in de
drinkbakken moeten vermeden worden (Cargill, 1999).
Een andere zeer effectieve massavaccinatiemethode die gebruikt wordt bij
respiratoire virus vaccinatie is toediening via spray en aerosol. Hierbij wordt het
gelyofiliseerde vaccin opgelost in niet-gechloreerd water om het daarna met behulp van een
sprayapparaat over de kippen te vernevelen
(http://www.ema.europa.eu/pdfs/vet/referral/avinew/112901nl4.pdf). Deze vernevelde
druppels worden door de kippen geïnhaleerd. De druppelgroottedistributie speelt hier een
zeer belangrijke rol. Vele sprayapparaten genereren namelijk druppels met een grote
druppelgroottedistributie en dus een grote hoeveelheid druppels die niet inhaleerbaar zijn
-
9
(Corbanie et al, 2006). Deze kunnen oraal of via het oog opgenomen worden of vallen op de
grond (Cargill, 1999). Ook de leeftijd van de kip bepaalt de ideale druppelgrootte.
Eendagskuikens worden gevaccineerd via sprayvaccinatie (Gallili & Ben-Nathan,
1998). De druppels zijn vaak te groot om geïnhaleerd te kunnen worden aangezien de
kuikens en hun respiratoir systeem vrij klein zijn. De opname van het vaccin gebeurt dus
voornamelijk oraal of via het oog aangezien de druppels op de kippen of op de grond vallen
en zo opgepikt worden. De druppelgrootte bekomen via de spray is 100-800 µm. Het is
belangrijk dat de druppels niet kleiner zijn dan 20 µm want dan kunnen ze via inhalatie de
diepere luchtwegen bereiken en zo ernstige post-vaccinale reacties teweeg brengen (Cargill,
1999; Corbanie et al, 2006).
Voor de secundaire vaccinatie van kippen die 2 weken en 4 weken oud zijn wordt
aerosolvaccinatie gebruikt (Gallili & Ben-Nathan, 1998). Bij deze kippen zijn in tegenstelling
tot de eendagskuikens de diepere luchtwegen de target. Kleinere druppels worden
gegenereerd in een range van 10-1000 µm. De ideale druppelgrootte voor 2 weken oude
kippen is kleiner dan 5 µm en voor 4 weken oude kippen kleiner dan 10µm (Cargill, 1999;
Corbanie et al, 2006).
Ook bij de spray- en aerosolvaccinatie zijn enkele problemen gekend. Zo genereren
de meeste vernevelaars een te brede druppelgroottedistributie met als gevolg veel druppels
die te groot zijn om geïnhaleerd te kunnen worden tijdens aerosolvaccinatie. Ook kan de
efficiëntie van het vaccin verminderen door het gebruik van kraantjeswater, door shear
krachten die werkzaam zijn op het vaccin bij de aerosolvorming en door het indrogen van
vaccindruppels in de tijdspanne tussen de aerosolgeneratie en opname (Corbanie et al,
2006).
Deze nadelen, zowel van de drinkwater- als van de spray- en aerosolmethoden,
dragen bij tot een verminderde efficiëntie van vaccinatie. Daarom moet gezocht worden
naar een betere methode die een oplossing kan bieden voor deze problemen.
-
10
1.3. DROGE POEDERAEROSOLEN VOOR MASSAVACCINATIE VIA
RESPIRATOIRE ROUTE
Als oplossing voor de hierboven vermelde problemen die huidige
massavaccinatiemethoden met zich meebrengen, kan een droog poederaerosol gebruikt
worden als geneesmiddelformulatie. De productie van deze droge poeders kan gebeuren via
sproeidrogen. Tijdens het economisch voordelige sproeidroogproces wordt in één stap een
poeder verkregen vertrekkende vanuit een vloeistof.
Droge poederaerosolen hebben twee voordelen. Enerzijds is de reconstitutie van het
vaccin in water onnodig, waardoor de ongecontroleerde indroging van vloeistofdruppels
vermeden wordt. Anderzijds worden via sproeidrogen poeders bekomen met relatief kleine
partikelgroottedistributies.
Sproeidrogen is een methode die de laatste jaren veel aandacht gekregen heeft in
het onderzoek naar de productie van respiratoire geneesmiddelpartikels. Het is een
methode die veel potentieel biedt in de micronisatie van peptiden en proteïnen, zodat deze
partikels via de pulmonaire route kunnen afgegeven worden aan de systemische circulatie.
Peptiden en proteïnen zijn namelijk te labiel voor mechanische micronisatie door hun
complexe tertiaire en quaternaire structuur (Malcolmson et al, 1998).
Om thermolabiele bioactieven zoals proteïnen, bacteriën en virussen tijdens
droogprocessen te beschermen moeten thermoprotectoren toegevoegd worden aan de te
drogen vloeistof. Veel van deze thermoprotectoren zijn suikers. Zo zijn mannitol, myo-
inositol en trehalose reeds beschreven als stabilisatoren van vaccins (Amorij et al, 2008; Maa
et al, 2004; Burger et al., 2008) en proteïnen (Bakaltcheva et al, 2006) tijdens verscheidene
droogprocessen. Ook aminozuren en afgeleiden zoals glycine en betaïne staan beschreven
als thermoprotectoren van proteïnen (Caldas et al, 1999).
Het werkingsmechanisme van thermostabiliserende stoffen blijft voorlopig
onduidelijk. In verband met de stabilisatie van proteïnen door suikers zijn er twee
hypothesen. De eerste hypothese omvat het zogenaamde vitrificatiemodel, waarin beweerd
-
11
wordt dat de thermoprotectoren de moleculaire bewegingen van het proteïne verminderen
door de vorming van een glasachtige matrix rond de proteïne. Anderzijds zegt het
watervervangingsmodel dat de suikers bekwaam zijn om te interageren met de proteïne via
H-bruggen en hierdoor de waterverwijdering tijdens het droogproces op te vangen. Vaak
wordt aangenomen dat er in werkelijkheid een wisselwerking van beide mechanismen
plaatsvindt. Algemeen wordt ook gesteld dat om de bioactiviteit te behouden het belangrijk
is om de native structuur van de bioactieven zo intact mogelijk te houden (Hill et al, 2005).
Volgens het vitrificatiemodel zouden de beste thermoprotectoren dus amorfe stoffen
zijn. Doordat sproeidrogen een snel droogproces is, kunnen amorfe stoffen gevormd worden
tijdens het proces. De moleculen krijgen namelijk onvoldoende tijd om zich in een
kristalrooster te plaatsen en vormen uiteindelijk een glas. Een nadeel van amorfe stoffen is
dat deze vaak onstabiel zijn en zich na verloop van tijd neigen om te zetten naar
kristalstructuren met een lagere energie-inhoud. Door deze omzetting kan de native
structure van de bioactieve stof verstoord raken, waardoor de bio-activiteit achteruit gaat
tijdens de bewaring. Vandaar dat de gesproeidroogde amorfe poeders bewaard moeten
worden bij een temperatuur lager dan de glastransitietemperatuur van de amorfe stof
(Chang et al, 1996).
Mannitol blijft doorgaans kristallijn, ook na sproeidrogen, waardoor verwacht kan
worden dat er tijdens bewaring weinig verlies aan bio-activiteit zal optreden. Trehalose dat
beschreven staat als een suiker met een hoge glastransitietemperatuur, kan een molecule
zijn die vaccins goed gaat beschermen tijdens droogprocessen én tijdens de bewaring zolang
de bewaartemperatuur voldoende onder het glastransitiepunt ligt (Malcolmson et al, 1998).
In voorafvermelde publicaties worden de vernoemde stabilisatoren vaak als enige
stabilisator aangewend. In dit werk zullen stabilisatoren vaak in combinatie worden
toegepast.
Het gebruik van droge poeders voor inhalatie als geneesmiddelvehikel wordt ook
onderzocht in de humane geneeskunde (Huang et al, 2007; Amorij et al, 2008).
-
12
2. OBJECTIEVEN
De Newcastle disease is een besmettelijke respiratoire aandoening bij vogels
veroorzaakt door het Newcastle disease virus. Voornamelijk kippen zijn zeer vatbaar voor de
ziekte. Aangezien pluimvee een belangrijke schakel is in de huidige economie en een
dergelijke uitbraak van de ziekte een groot verlies voor de landbouwer zou betekenen is het
uiterst belangrijk dat kippen gevaccineerd worden tegen dit virus. Daar pluimveebedrijven
meestal kippen in grote getalen houden, is massavaccinatie, zoals spray- en
aerosolvaccinatie, praktisch en economisch de meest geschikte vaccinatiemethode. Aan
deze spray- en aerosolvaccinatietechniek zijn echter wel enkele nadelen verbonden zoals de
preparatieve reconstitutie van het vaccin in water en de ongecontroleerde indroging van de
vaccindruppels. Een mogelijke manier om deze problemen te voorkomen is het gebruik van
droge poederaerosolen. Dit onderzoek spitst zich specifiek toe op deze droge
poederaerosolen geproduceerd via sproeidrogen.
Een doel van het onderzoek is het vinden van nieuwe stabilisatoren met het oog op
de productie van een stabiel vaccin. Een stabilisator moet het vaccin beschermen tijdens het
sproeidroogproces en ook tijdens de bewaring. Bij een geschikt gestabiliseerd vaccin in
poedervorm is niet enkel de stabilisatie ervan belangrijk, maar zijn ook de fysicochemische
karakteristieken ervan, zoals vochtgehalte, hygroscopiciteit, morfologie en
partikelgroottedistributie van groot belang. Een smalle partikelgroottedistributie en partikels
groter dan 20 µm zijn gewenst voor een optimale werking van het vaccin. Ook vochtgehalte
en hygroscopiciteit van het poeder dienen laag te zijn om de werking van het vaccin te
garanderen.
Gedurende het volledige onderzoek wordt gebruik gemaakt van het enzym ß-
galactosidase als modelmolecule voor het vaccin.
In het onderzoek worden poeders geproduceerd met verschillende combinaties aan
stabilisatoren. Vervolgens worden ze onderzocht op hun stabiliserend vermogen direct na
het sproeidroogproces alsook na 1 week en 1 maand bewaring bij 6°C en 25°C. Verder
worden ook de poederkarakteristieken bepaald, namelijk de morfologie, deeltjesgrootte,
-
13
vochtgehalte, smelt- en glastransitietemperatuur, hygroscopiciteit en pH. Dit gebeurt met
respectievelijk scanning elektronenmicroscopie, laserdiffractie, Karl Fischer titraties,
differential scanning calorimetrie, dynamic vapour sorption en de pH-meter.
Om uit te zoeken of poeders met specifieke partikelgroottes kunnen gesproeidroogd
worden, worden waterige oplossingen van stabilisatoren gesproeidroogd met een ultrasone
sproeidroger. Deze poeders worden ook onderzocht op hun morfologie en deeltjesgrootte.
Om tot een beter begrip te komen in de effecten van de sproeidroogparameters op
het stabiliserend effect van de bekomen poeders wordt een full factorial experimental
design opgesteld. De onderzochte procesparameters zijn het vaste stofgehalte van de
sproeidroogoplossing (feed), de feedsnelheid door het sproeidroogsysteem, de luchtstroom
of airflow verantwoordelijk voor de vorming van de spray en de inlaattemperatuur waarbij
de feed verneveld en gedroogd wordt.
-
14
3. MATERIALEN
3.1. MANNITOL
Mannitol is een polyol of suiker-alcohol, met structuurformule C6H14O6. Het is een
wit, geurloos en kristallijn poeder gekarakteriseerd door een zoete smaak. Mannitol, dat
geëxtraheerd kan worden uit het gedroogde sap van de manna-es, vertoont polymorfisme.
Commercieel wordt het suiker geproduceerd door katalytische of elektrolytische reductie
van monosacchariden zoals mannose en glucose. Mannitol is stabiel in droge vorm en in
waterige oplossingen. Het is een isomeer van sorbitol, met het belangrijkste verschil tussen
de twee dat sorbitol hygroscoop is en mannitol niet (Rowe et al, 2002).
Mannitol werd reeds beschreven als stabilisator van proteïnen bij sproeidrogen
(Andya et al, 1999; Costantino et al, 1998).
FIGUUR 3.1.: STRUCTUURFORMULE VAN MANNITOL
(http://upload.wikimedia.org)
3.2. TREHALOSE
Trehalose is commercieel beschikbaar als trehalose dihydraat. Trehalose is een
natuurlijk voorkomend disaccharide. Het bestaat uit twee glucose moleculen, α,α-1,1
gebonden. Het zijn geurloze, witte kristallen met een zoete smaak. Het disaccharide is
chemisch stabiel en een niet-reducerend suiker. Trehalose komt wijd verspreid voor in de
natuur, onder andere in dieren, planten en micro-organismen (Rowe et al, 2002).
Trehalose beschermt organismen tegen bevriezing, droogte, hitte, koude en
dehydratatie. Trehalose heeft zo een stabiliserende functie. Het is een van de meest stabiele
sacchariden. Dit onder meer dankzij zijn zeer hoge glastransitietemperatuur (90°C) en zijn
-
15
stabiliteit onder lage pH condities waardoor trehalose stabiel blijft onder extreme
temperatuursomstandigheden en niet hydrolyseert bij lage pH. Aangezien trehalose een
lage hygroscopiciteit heeft is het stabiel bij hoge vochtigheidsgraden
(http://www.rspharmchem.com/trehalose.htm).
De combinatie van de hoge glastransitietemperatuur, de hoge stabiliteit onder lage
pH en de lage hygroscopiciteit maakt van trehalose een ideale proteïne beschermer bij het
sproeidrogen (http://www.hayashibara-intl.com/food/trehalose.html). Na sproeidrogen is
trehalose vaak amorf, vandaar dat het wordt gebruikt in combinatie met het kristallijne
mannitol teneinde een amorf-kristallijn product te bekomen dat het vaccin kan stabiliseren
tijdens zowel het sproeidrogen als de bewaring achteraf.
FIGUUR 3.2.: STRUCTUURFORMULE VAN TREHALOSE
(http://en.wikipedia.org)
3.3. MYO-INOSITOL
De best gekende vorm van inositol is myo-inositol, een cyclisch polyol met
structuurformule C6H12O6. Myo-inositol is terug te vinden in spierweefsel vandaar de naam.
Een lage hygroscopiciteit en een laag vochtgehalte zijn voordelen van het myo-
inositol. (http://www.farma.ku.dk/index.php/Kristina-Mosen-F/5045/0/).
In een studie van Burger et al. (2008) worden formulaties gebruikt op basis van myo-
inositol voor het stabiliseren van virusvaccins tijdens het droogproces en de bewaring
http://www.rspharmchem.com/trehalose.htmhttp://www.hayashibara-intl.com/food/trehalose.htmlhttp://www.farma.ku.dk/index.php/Kristina-Mosen-F/5045/0/
-
16
achteraf. Aangezien het product moeilijk te sproeidrogen is, worden combinaties met
mannitol aangewend.
FIGUUR 3.3.: STRUCTUURFORMULE VAN MYO-INOSITOL
(http://upload.wikimedia.org)
3.4. BOVINE SERUM ALBUMINE (BSA)
BSA is serum albumine die verkregen wordt uit runderbloed. BSA, een bruin, amorf
en goed wateroplosbaar poeder, wordt vaak gebruikt als stabilisator voor formulaties die
proteïnen en enzymen bevatten (Rowe et al, 2002).
3.5. GLYCINE
Glycine is een natuurlijk voorkomend aminozuur met structuurformule C2H5NO2.
Het is een niet-essentieel aminozuur en tevens het kleinste. Het wordt gesynthetiseerd uit
threonine en serine (http://www.britannica.com/EBchecked/topic/236059/glycine).
Glycine is beschreven als thermoprotectans bij recombinante vaccins (Singh, 2004).
FIGUUR 3.4.: STRUCTUURFORMULE VAN GLYCINE
(http://upload.wikimedia.org)
-
17
3.6. BETAÏNE
Betaïne of trimethylglycine is een derivaat van glycine waarop de waterstofmoleculen
gesubstitueerd zijn door drie methylgroepen. Het is dus een methylamine, een alkylamine
met drie methyleengroepen
(http://www.vannature.nl/monografie/Betaine_TMG_Trimethylglycine.html). Betaïne werd
reeds onderzocht als stabilisator van biomoleculen (Knapp et al, 1999).
FIGUUR 3.5.: STRUCTUURFORMULE VAN BETAÏNE
(http://upload.wikimedia.org)
http://www.vannature.nl/monografie/Betaine_TMG_Trimethylglycine.html
-
18
4. METHODEN
4.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN ß-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS
4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen
4.1.1.1. Principe
Sproeidrogen is een proces waarbij een vloeistof (feed) omgezet wordt naar een
droge poedervorm in één stap. Deze omzetting gebeurt doordat de feed in een heet
droogmedium gesprayd wordt, wat meestal lucht is. Het proces kan opgesplitst worden in
drie stadia. Het eerste daarvan is de atomisatie van de oplossing, emulsie, suspensie of
pasta. Onder atomisatie wordt de vorming van miljoenen kleine druppels uit de feed
oplossing door toevoeging van kinetische energie verstaan. Zo wordt er een spray gevormd.
De tweede stap is het droogproces. De vele kleine druppels komen in contact met een
drooggas. De temperatuur van dit gas is doorgaans zeer hoog en kan ingesteld worden als de
inlaattemperatuur. Door deze hoge temperatuur zal het solvent van de vloeistofdruppels
verdampen en wordt een poeder bekomen. Deze verdamping zal tevens het
sproeidroogsysteem afkoelen. De temperatuur die zo wordt bereikt kan gemeten worden en
wordt de uitlaattemperatuur genoemd. Als laatste stadium van het proces wordt het poeder
gecollecteerd en opgevangen in een reservoir. Het poeder wordt door de circulerende
luchtstroom meegetrokken vanuit de droogkamer naar de cycloon. Daar zullen de partikels
met hoge snelheid tegen de cycloonwand botsen, waardoor ze hun snelheid verliezen en in
het collecterende reservoir onderaan de cycloon vallen (Cal & Sollohub, 2009; Seville et al.,
2007).
FIGUUR 4.1.: SYSTEMISCHE VOORSTELLING VAN EEN SPROEIDROOGSYSTEEM
(www.buchi.com)
-
19
4.1.1.2. Methode
Voor het stabiliteitsonderzoek werden waterige oplossingen gesproeidroogd. De
waterige oplossingen bevatten allen 5% vaste stof: Mannitol (C*Mannidex 16700, Cerestar,
Mechelen, België), glycine (Sigma-aldrich), betaïne (Sigma-aldrich), trehalose (C*Ascend
16400, Cerestar, Mechelen, België) en myo-inositol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)
werden in variërende hoeveelheden opgelost zoals weergegeven in Tabel 4.1. Per 100 ml
oplossing werden ongeveer 100 activiteitsunits van het enzym ß-galactosidase toegevoegd.
Deze feedoplossingen werden vervolgens gesproeidroogd met een Büchi Mini Spray Dryer B-
290 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Zwitserland). De inlaattemperatuur van de sproeidroger
werd ingesteld op 150°C, de pomp op 5 mL/min en de airflow op 414 L/h. De
uitlaattemperatuur resulteerde in 77°C. De bekomen poeders werden bewaard bij 6°C en bij
25°C in aluminium zakjes die werden toegelast.
TABEL 4.1.: VERSCHILLENDE SPROEIDROOGFORMULATIES MET
PERCENTAGES VASTE STOF
Formulatie Mannitol Glycine Betaïne Trehalose Myo-inositol
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5,00%
4,50%
4,50%
4,50%
4,50%
4,00%
4,00%
4,00%
4,00%
-
0,50%
-
-
-
1,00%
-
0,50%
0,50%
-
-
0,50%
-
-
-
1,00%
-
-
-
-
-
0,50%
-
-
-
0,50%
-
-
-
-
-
0,50%
-
-
-
0,50%
-
20
4.1.2. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß – galactosidasetest
Als modelmolecule voor het Newcastle Disease Vaccin werd het enzym ß-
galactosidase gebruikt. Dit enzym werd met een activiteit van ongeveer 0,09 units/mL aan
de oplossing toegevoegd vooraleer deze gesproeidroogd werd. De mate waarin het enzym
het sproeidroogproces overleefde, werd bepaald met een enzymatische test.
FIGUUR 4.2.: PRINCIPE ß-GALACTOSIDASETEST
Het principe van de test verloopt volgens bovenstaande reactie (figuur 4.2.). Het
ongekleurde substraat ONP ß-D-Galactopyranoside wordt in aanwezigheid van water door
het enzym ß-galactosidase omgezet tot het suiker ß-D-Galactose en het geelgekleurd
product o-nitrophenol. Door de absorbantie van de gele oplossingen spectrofotometrisch te
bepalen, kan de activiteit van het enzyme in de oorspronkelijke oplossing afgeleid worden.
Om de enzymactiviteit van een onbekende te bepalen moest de onbekende oplossing
verdund worden in gedemineraliseerd water tot een geschatte activiteit binnen een range
van 0,2-0,4 units/ml. Gesproeidroogde poeders dienden alvorens de enzymatische test uit te
voeren gereconstitueerd te worden in gedemineraliseerd water.
De enzymatische reactie verliep in een reactiemedium met pH 4,5 waarvoor een 20
mM fosfaat-citraat bufferoplossing werd gebruikt. Aan het reactiemedium werd eerst de
onbekende met een bepaalde enzymactiviteit toegevoegd. Vervolgens werd het substraat
toegevoegd onder de vorm van een 10 mM o-Nitrophenyl ß-D-Galactoside oplossing. Na
exact 10 minuten werd de reactie stopgezet door het toevoegen van een hoeveelheid 200
mM boraatbuffer met een pH 9,8. Nadien werden de absorbanties van de stalen in UV
cuvetten (weglengte = 1cm) gemeten door een spectrofotometer (Shimadzu Scientific
Systems, Japan) bij een golflengte van 410 nm. Telkens werd ook een ijkcurve gemaakt door
gekende hoeveelheden enzym (0-0,03 units) toe te voegen aan het reactiemedium,
waardoor de activiteit van de onbekenden via lineaire regressie kon worden afgeleid.
Elke onbekende werd in drievoud geanalyseerd.
-
21
TABEL 4.2.: AANGEWENDE VOLUMINA IN ß-GALACTOSIDASE
ACTIVITEITSBEPALING
REAGENTIA VOLUME (ml)
Fosfaat-citraat buffer 0,40
(Verdunde) onbekende 0,10
ONP-Gal oplossing 0,50
Boraatbuffer (na exact 10 min.) 3,00
4.1.3. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders
4.1.3.1. Scanning Elektronenmicroscoop (SEM): bepaling morfologie
4.1.3.1.1. Principe
De morfologie van de gesproeidroogde poeders werd bekeken onder de scanning
elektronenmicroscoop (SEM).
Bij een SEM onderzoek wordt een straal van elektronen, ook wel primaire elektronen
genoemd, gefocusseerd op een bepaalde plaats in het staal. Dit resulteert in een transfer
van energie naar deze plaats. Door de energie van deze primaire elektronen worden
secundaire elektronen, afkomstig van het staal, uitgestoten. De secundaire elektronen
worden aangetrokken en gecollecteerd door een detector en vervolgens vertaald tot een
signaal. Om een SEM foto te maken gaat de elektronenbundel over de volledig te bepalen
oppervlakte. Zo worden vele van deze signalen geproduceerd die dan allemaal samenkomen
en het 3D-beeld vormen (http://science.howstuffworks.com/scanning-electron-
microscope.htm, http://www.siliconfareast.com/SEMTEM.htm).
4.1.3.1.2. Methode
Voor het onderzoek werd gebruik gemaakt van de Quanta 200F (FEI Company,
Eindhoven, Nederland) scanning electron microscoop. De poeders werden aangebracht op
zelfklevende staalhouders. Om het staal geleidbaar te maken voor elektronen werden de
poeders op de staalhouders gecoat met ongeveer 40 nm goud.
-
22
FIGUUR 4.3.: DE SCANNING ELEKTRONENMICROSCOOP
(http://www.britannica.com)
4.1.3.2. Laserdiffractie: bepaling partikelgrootte
4.1.3.2.1. Principe
De bepaling van de partikelgroottedistributie van de poeders gebeurde met behulp
van de laserdiffractor. Het principe van de laserdiffractie is gebaseerd op het feit dat
poederpartikels die een laserstraal passeren het licht verstrooien onder een hoek die
gerelateerd is aan hun partikelgrootte. Deze hoek zal logaritmisch toenemen als de
partikelgrootte afneemt. Ook de intensiteit van het verstrooide licht is afhankelijk van de
grootte van de partikels. Zo zullen grotere partikels resulteren in een veel intenser licht dan
kleinere partikels. Beide principes werden geïllustreerd in figuur 4.4.
FIGUUR 4.4.: DIFFRACTIEPATROON
(www.sympatec.com)
-
23
De rode lichtbron van een laserdiffractor is een Helium-Neonlaser. Deze laser is een
bron van coherent, intens licht met een vaste golflengte (voor Helium-Neonlaser: 632,8 nm).
Vooraleer de lichtbundel invalt op het staal gaat hij door verschillende optische lenzen zodat
we evenwijdige stralen krijgen. Een staalpresenteersysteem moet ervoor zorgen dat de
laserstraal door een homogene stroom van partikels gaat. Verschillende diode array
detectoren meten tenslotte de hoeken waaronder de partikels de straal van de laserbron
verstrooien (www.malvern.com).
FIGUUR 4.5.: DE LASERDIFFRACTOR
(www.malvern.com)
De diameters D[v, 0.1], D[v, 0.5] en D[v, 0.9] kunnen bepaald worden uit de
partikelgroottedistributiecurve. Deze gemeten diameters zijn de volumediameters die
aantonen dat respectievelijk 10%, 50% en 90% van de gemeten partikels een kleinere
volumediameter hebben dan de aangegeven waarde.
4.1.3.2.2. Methode
De Malvern Mastersizer-S long bench 2000 (Malvern instruments, Worcestershire,
Verenigd Koninkrijk) werd gebruikt tijdens het onderzoek. Deze laserdiffractor kan
partikelgroottes van 0,5 tot 3500µm meten in geval van staalmetingen in droge toestand en
partikels van 0,05 tot 900µm in geval van metingen via de natte dispersiemethode.
De partikelgroottes van de gesproeidroogde poeders werden bepaald via de natte
dispersiemethode. Hiervoor werd een aliquot poeder gesuspendeerd in een
dispersiemedium van Miglyol 812 (Sasol, Witten, Duitsland) met 0,2% Tween 80
(Polysorbatum 80, SA Fagron, Waregem, België). Deze suspensie werd gevortexed vooraleer
-
24
toe te voegen aan het natte dispersiepresenteersysteem van de laserdiffractor . Na een
eerste bepaling werden de stalen kort in een ultrasoon bad gestoken om de eventuele
agglomeraten open te breken. Hierna werden de stalen opnieuw gevortexed en gemeten.
Voor de bepalingen via de natte dispersiemethode werd de 300RF lens gebruikt. De stalen
werden doorheen de meetcel gestuurd met behulp van een rotordrijfkracht die ingesteld
was op 1500 rpm. Tussen de metingen vond telkens een wasstap plaats met zuiver
dispersiemedium.
4.1.3.3. Karl Fisher titratie: bepaling vochtgehalte
4.1.3.3.1. Principe
De meting van het watergehalte van de poeders gebeurde via de Karl Fischer titratie,
een bepaling die gebaseerd is op de oxidatie van zwaveldioxide door jood in de
aanwezigheid van water zoals voorgesteld in vergelijking 4.1.
I2 + SO2 + 2H2O 2HI + H2SO4 (4.1)
Een oplossing van I2 en SO2 wordt in methanol gebracht, een niet-waterig, watervrij
solvent. De gevormde zuren, H2SO4 en HI worden met pyridine geneutraliseerd. De
eindpuntbepaling van de titratie is gebaseerd op de detectie van de overmaat I2. Een
overmaat I2 ontstaat wanneer in de titratiecel geen water meer aanwezig is en wordt
bivoltametrisch vastgesteld. Tussen 2 identische indicatorelectroden, dubbele platina
elektrode, wordt namelijk een constante stroom aangelegd om vervolgens het
potentiaalverschil tussen de beide elektroden te kunnen meten. Tijdens de titratie, wanneer
er een reactie plaatsvindt tussen het water en I2, is er geen vrije I2 aanwezig en kan dus geen
reductie van I2 en stroomdoorgang optreden. Als al het H2O weg getitreerd is zal er wel vrije
I2 aanwezig zijn. Hierdoor zal het potentiaalverschil zeer sterk dalen en wordt de
stroomdoorgang mogelijk. Deze sterke daling in potentiaal en de bijhorende stijging van de
stroom wordt gebruikt als indicatie van het titratie eindpunt (practicumnota’s intrumentele
analytische chemie, Prof. L. Thienpont, 3e bachelor farmaceutische wetenschappen).
-
25
4.1.3.3.2. Methode
De metingen werden uitgevoerd met een Mettler Karl Fischer titrator DL35 (N.V.
Mettler-Tolede SA, Zaventem, België). Watervrij methanol (Biosolve BV, Valkenswaard,
Nederland) en het Karl Fischer reagens Hydranal®-Composite 2 (Sigma-Aldrich, Seelze,
Duitsland) werden gebruikt bij de titratie van de poeders. Bij elke meting werd 0,1-0,2 gram
poeder afgewogen en in de titratiecel gebracht. Voor elke titratie werd het staal gedurende
5 minuten vermengd met het medium met behulp van een magnetische roerder. Elk staal
werd drie keer getitreerd.
4.1.3.4. Dynamic Vapour Sorption: bepaling hygroscopiciteit
4.1.3.4.1. Principe
De hygroscopiciteit of de watersorptie van de gesproeidroogde poeders werd
bepaald door gebruik te maken van een dynamic vapour sorption toestel (DVS) met
microbalans. Tijdens het proces wordt het staal blootgesteld aan een variabele relatieve
vochtigheid (RH). Het toestel maakt gebruik van een droog carriergas (bv. stikstofgas) dat
vermengd wordt met een verzadigd carrier gas. De ratio van beiden wordt geregeld door
elektrische massadebietcontrollers en deze ratio bepaalt de RH. Een daling of stijging van RH
kan een verschil in gewicht van het staal teweeg brengen doordat water adsorbeert aan het
staal of geabsorbeerd wordt door het staal. Deze veranderingen worden gemeten door een
microbalans en vergeleken met een referentiemassa. De mate waarin het gewicht zal stijgen
of dalen is dus afhankelijk van de hygroscopiciteit van het staal
(www.thesorptionsolution.com).
4.1.3.4.2. Methode
De DVS Advantage 1 (Surface Measurement Systems, Londen, VK) werd gebruikt bij
het onderzoek. Per meting werd er van het staal tussen de 10 en 20 mg poeder afgewogen.
Als eerste stap werd dit poeder gedroogd tot constant gewicht. Nadien werd het
blootgesteld aan een stijgende RH van 0% tot 90% in stappen van 10% tot evenwicht (i.e.
massaverschil kleiner dan 0,002% per minuut gedurende minstens 15 minuten). De bepaling
werd uitgevoerd bij een temperatuur van 25°C.
-
26
FIGUUR 4.6. : DYNAMIC VAPOUR SORPTION
(www.thesorptionsolution.com)
4.1.3.5. Differential Scanning Calorimetrie: bepaling smelt- en
glastransitietemperatuur
4.1.3.5.1. Principe
Differential Scanning Calorimetrie (DSC) is een techniek waarbij de energie gemeten
wordt die nodig is om een zo miniem mogelijk temperatuursverschil te verkrijgen tussen een
monster en een referentie staal die onderworpen worden aan een identieke
temperatuursprogrammatie. Er bestaan twee types DSC systemen: ‘power compensation
DSC‘ en ‘heat flux DSC’. Dit laatste meetprincipe wordt hier besproken.
Het meetsysteem van dit type bestaat uit een metalen schijf waarop het monster en
een referentiestaal worden geplaatst. Het monster wordt in een DSC pannetje gebracht. Het
referentiestaal is meestal een leeg DSC pannetje. Dit geheel wordt vervolgens in een oven
gebracht die aan een welbepaalde constante snelheid verwarmd wordt. Het
temperatuursverschil tussen referentie en monster wordt gemeten en hierdoor kan de
warmtestroom in het monster bepaald worden. Wanneer een smelt- of
glastransitietemperatuur bereikt wordt stijgt het temperatuursverschil en wordt als gevolg
een energiepiek waargenomen die dit verschil moet compenseren
(http://www.msm.cam.ac.uk/phasetrans/2002/Thermal2.pdf; cursus fysicochemie van het
geneesmiddel, Prof. S. De Smedt, 2e bachelor farmaceutische wetenschappen).
-
27
FIGUUR 4.7.: HEAT FLUX DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY
(http://materials.npl.co.uk/matsol/thermal.html)
4.1.3.5.2. Methode
De DSC (Q-2000,TA Instruments) werd gebruikt. Voor de analyses werd 5 tot 10 mg
poederstaal in een hermetisch aluminium DSC pannetje gebracht en vervolgens geplaatst in
de autosampler van het DSC toestel.
4.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS
Er werden 4 waterige oplossingen gesproeidroogd: Mann 15,00%, Mann 9,00% - Ino
6,00%, Mann 9,00% - BSA 6,00% en Mann 9,00% - Ino 3,00% - BSA 3,00%. Elk van deze
formulaties werd meerdere malen gesproeidroogd met behulp van een lab-scale
sproeidroger (ProCept), telkens bij andere sproeidroogparameters zoals weergegeven in
tabel 4.3. De gebruikte ultrasone nozzle werd ingesteld op een frequentie van 25 kHz.
TABEL 4.3.: DE 4 SETTINGS MET BIJHORENDE PARAMETERS WAARMEE DE
FORMULATIES WERDEN GESPROEIDROOGD
SETTING Inlaattemp (°C) Feedsnelheid
(ml/min)
Airflow (m³/min) Druk
(mbar)
1 180 2 0,3 20
2 160 2 0,3 20
3 180 4 0,3 20
4 180 4 0,4 20
-
28
4.4. DESIGN OF EXPERIMENTS: INVLOED VAN DE SPROEIDROOG-
PARAMETERS OP DE ENZYMSTABILITEIT
4.4.1. Inleidende begrippen
Om informatie te verkrijgen over welke sproeidroogparameters de enzymstabiliteit
beïnvloeden, moeten experimenten uitgevoerd worden.
In een experimenteel design worden vooraf de relevante factoren gekozen die een
invloed zouden kunnen hebben op de respons. In dit onderzoek zijn de factoren de
sproeidroogprocesparameters en de respons de stabiliteit van de gesproeidroogde poeders.
Het basis experimenteel design is het two level full factorial design. Het aantal experimenten
die worden uitgevoerd, is afhankelijk van het aantal factoren die onderzocht worden. Zo zal
een two level (2x) experimenteel design met drie factoren 23 of 8 experimenten omvatten.
Hierbij wordt elke factor op twee niveaus getest, een laag en een hoog niveau,
respectievelijk weergegeven als een ‘-‘ en ‘+’ symbool. Om een optimaal design te verkrijgen
worden ook centerpoints toegevoegd, weergegeven met het symbool ‘0’. Voor de
centerpoint experimenten wordt voor elke factor de middelste waarde toegepast tussen het
laag en hoog niveau. Het driemaal uitvoeren van deze centerpoints laat toe de replicaatfout
te berekenen.
In onderstaande figuur en tabel wordt een 23 full factoral design weergegeven,
waarbij x1, x2 en x3 de factoren zijn.
FIGUUR 4.8.: GEOMETRISCHE VOORSTELLING VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN
(http://www.itl.nist.gov)
-
29
TABEL 4.4.: SCHEMATISCH OVERZICHT VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN
X1 X2 X3
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
9 0 0 0
10 0 0 0
11 0 0 0
Het randomiseren van de run order is voornamelijk van belang om te voorkomen dat
systemische veranderingen in ongecontroleerde variabelen de experimenten zouden kunnen
beïnvloeden. Moesten alle experimenten van hoge inlaattemperatuur eerst worden
uitgevoerd, dan zou de temperatuur in het lokaal ook toenemen en hoger liggen dan
wanneer de experimenten met lage inlaattemperatuur zouden worden uitgevoerd. Dit is van
belang wanneer de omgevingstemperatuur een invloed op het resulterende poeder heeft.
De invloed hiervan op de stabiliteit van het enzym is vermoedelijk verwaarloosbaar. Voor de
zekerheid werden de experimenten toch gerandomiseerd.
4.4.2. Design opzet
De formulatie mannitol 4,50% – trehalose 0,50% beladen met ongeveer 100 units ß-
galactosidase werd over de gehele experimental design gebruikt. Deze formulatie werd
gekozen op basis van resultaten uit de stabiliteitsstudie.
-
30
TABEL 4.5.: OPZET VAN HET EXPERIMENTEEL DESIGN
Exp No Exp Name Run Order inlettº
(°C) solids
(%) airflow
(L/h) pump
(ml/min)
1 N1 16 130 5 355 3,5
2 N2 11 180 5 355 3,5
3 N3 14 130 15 355 3,5
4 N4 6 180 15 355 3,5
5 N5 18 130 5 473 3,5
6 N6 1 180 5 473 3,5
7 N7 3 130 15 473 3,5
8 N8 4 180 15 473 3,5
9 N9 15 130 5 355 7
10 N10 17 180 5 355 7
11 N11 12 130 15 355 7
12 N12 5 180 15 355 7
13 N13 13 130 5 473 7
14 N14 19 180 5 473 7
15 N15 8 130 15 473 7
16 N16 9 180 15 473 7
17 N17 7 155 10 414 5
18 N18 2 155 10 414 5
19 N19 10 155 10 414 5
De gekozen factoren waren de inlaattemperatuur, feedsnelhied, airflow en vaste
stofgehalte (solids) van de feedoplossing. Aangezien er vier factoren zijn, betekent dit dat
het een 24 full factorial design is, wat geometrisch voorgesteld kan worden als een
hyperkubus. Er werden dus 19 gerandomiseerde experimenten (24 + 3 centerpoints)
uitgevoerd.
Voor de inlaattemperatuur werd 130°C als laag niveau gekozen en 180°C als hoog
niveau. Het is belangrijk dat de inlaattemperatuur niet te laag gekozen wordt, zodat het
gesproeidroogde product voldoende gedroogd wordt tijdens het proces. Anderzijds mag de
inlaattemperatuur niet te hoog zijn om het enzym tegen thermale degradatie te
beschermen, wanneer dit in de formulatie zou geïntroduceerd worden.
De feedsnelheid bepaalt mee wat de resulterende uitlaattemperatuur zal zijn. Is deze
hoger dan zal er meer water door het sproeidroogsysteem gestuurd worden, wat resulteert
in een grotere afkoeling van het systeem en een lagere uitlaattemperatuur. Een lage
uitlaattemperatuur is eveneens belangrijk voor de enzymstabiliteit wanneer het enzym in de
formulatie geïntroduceerd wordt. Een te lage uitlaattemperatuur zou onvoldoende droging
-
31
van het product betekenen. De minimumfeedsnelheid werd ingesteld op 3,5 mL/min, de
maximale op 7,0 mL/min.
De luchtstroom (airflow) door de sproeikop werd gevarieerd van 355 tot 473 L/h, wat
de meest gebruikte waarden zijn voor de Büchi B-290 sproeidroger.
Het solidsgehalte bedroeg minimum 5% en maximum 15%. De bovengrens werd
bepaald door de maximale wateroplosbaarheid van mannitol, wat 15% bedraagt bij
kamertemperatuur.
4.4.3. Evaluatie van de poederstalen
De respons die gemeten werd, was de stabiliteit van het enzym ß-galactosidase in de
gesproeidroogde poeders.
De stabiliteit van het enzym werd bepaald via de ß-galactosidasetest (zie 4.1.2.).
4.4.4. Analyse van het experimenteel design
Het uitvoeren van de data-verwerking van het experimenteel design werd uitgevoerd
met behulp van het software programma MODDE 9 (MKS Umetrics AB, Umeå, Zweden).
4.4.4.1. Evaluatie van de ruwe data
Voor de respons werd een replicatieplot opgesteld. Hierbij wordt voor elk experiment
de gemeten waarde uitgezet in een grafiek. De 3 centerpoint experimenten zijn 3 identieke
experimenten die voor elke factor uitgevoerd werden bij waarden tussen het laagste en
hoogste niveau. Daarom horen de responsen van deze experimenten een gelijke waarde te
hebben, die ongeveer tussen de hoogste en de laagste responswaarde ligt.
-
32
4.4.4.2. Lineaire regressie analyse
Via lineaire regressie konden de hoofd- en interactie-effecten berekend worden. Het
24 full factorial design kon via de volgende vergelijking, i.e. model, beschreven worden.
Y = ß0 + gemiddelde respons
ß1x1 + ß2x2 + ß3x3 + ß4x4 + hoofdeffecten
ß12x1x2 + ß13x1x3 + ß14x1x4 + ß23x2x3 + ß24x2x3 + ß34x3x4 + 2-factorinteracties
ß123x1x2x3 + ß124x1x2x4 + ß234x2x3x4 + ß134x1x3x4 + 3-factorinteracties
ß1234x1x2x3x4 4-factorinteracties
(4.2)
waarin Y: respons
x1,x2,…: factoren
ß0: gemiddelde respons
ß1,ß2,…: coëfficiënten van de hoofdeffecten
ß12,... ß123,... ß1234: coëfficiënten van de interacties
Een hoofdeffect van een factor wordt beschreven als het gemiddelde verschil in
respons tussen het lage en hoge factorniveau.
Aangezien de software MODDE de data met behulp van de gecodeerde factorniveaus
(-1, 0, +1) hanteert in plaats van de werkelijke waarden (vb. voor temperatuur: 130°C, 150°C,
170°C) wordt niet meer over hoofd- en interactie-effecten gesproken, maar wel over hoofd-
en interactiecoëfficiënten. De coëfficiënten zijn een maat voor de effecten. Deze
coëfficiënten werden uitgezet in een plot. Niet-significante coëfficiënten van hoofd- en
interactie-effecten werden geëxcludeerd uit de modelopzet.
Vervolgens werden de R2, Q2 en reproduceerbaarheid van het experimenteel model
berekend door de software via lineaire regressie. Deze waarden werden uitgezet in een
‘summary of fit’ plot.
-
33
R2 drukt uit in hoeverre het berekende model de gegeven data kan herberekenen
volgens het model. Deze waarde ligt tussen ‘0’ en ‘1’, waarbij een waarde van ‘1’ een perfect
model weergeeft.
Q2 geeft weer hoe goed het model in staat is nieuwe experimenten te voorspellen.
Aanvaardbare waarden van Q2 zijn vanaf ‘0,5’. Vanaf ‘0,9’ worden excellente waarden
verkregen voor de Q2-waarde. Het is belangrijk in acht te nemen dat R2 de Q2 waarden met
niet meer dan 0,2-0,3 mag overschrijden.
De reproduceerbaarheid laat zien hoe groot de pure fout op de experimenten is. Is
deze waarde kleiner dan ‘0,5’, dan is er een grote pure fout en zijn de uitgevoerde
experimenten onvoldoende gecontroleerd.
4.4.4.3. Gebruik van het model
Voor elke respons werd een contour plot opgemaakt met de belangrijkste
coëfficiënten. Uit deze contour plot kunnen voorspellingen gedaan worden in verband met
bij welke omstandigheden de experimenten moeten worden uitgevoerd om een bepaalde
respons te bekomen.
4.5. VIRUSTITRATIE
4.5.1. principe
De virologie is vaak geïnteresseerd in het aantal infectieuze virussen die aanwezig zijn
in een orgaansuspensie of een cultuurvloeistof. Dit kan bepaald worden door een
virustitratie uit te voeren. Voor de titratie wordt een serie van 10-voudige verdunningen
(log10) gemaakt uit een virussuspensie. Vervolgens worden bebroede eieren geïnoculeerd
met deze verdunningen. Indien er virusvermeerdering plaatsvindt door de aanwezigheid van
infectieuze virussen kunnen veranderingen van het embryo in het ei waargenomen worden
zoals embryonale sterfte, embryonale afwijkingen, membraanletsels etc. De virusdosis die in
50% van de geïnoculeerde eieren een dergelijk respons geeft kan bepaald worden. Dit
noemen we de egg infectious doses 50% endpoint (EID50). Het eindpunt zal zelden op het
-
34
zicht bepaald kunnen worden. Daarom wordt gebruik gemaakt van de formule van Reed en
Muench, zie vergelijking (4.3).
(4.3)
De uiteindelijke titer van de virusoplossing kan berekend worden met de bekomen index (x):
(4.4)
Waarin 10y: minst verdunde oplossing waartussen het 50% endpoint ligt
x: index
Via de hemagglutinatietest (zie inleiding) kunnen de eieren die geïnfecteerd zijn
gezien worden.
4.5.2. Methode
Voor de titratie op eieren werd ongeveer 100 mg van het gesproeidroogde poeder
met levend geattenueerd virus opgelost en 10 keer verdund in commerciële PBS (Phosphate
Buffered Saline). Een aliquot van de feedoplossing werd als zodanig aangewend voor de
verdunningen.
Zowel van de feed- als de poederoplossingen werd een verdunningsreeks gemaakt
van 10-1 tot en met 10-8. Deze verdunningen werden vervolgens geïnoculeerd in bebroede
eieren van ongeveer 15 dagen oud. Per verdunning werden 4 eieren geïnoculeerd in de
allantoïsvloeistof met 100 µl virusverdunningen. Deze geïnoculeerde eieren werden
gedurende 3 dagen in een broedstoof geplaatst bij 37°C bij een vochtigheidsgraad van 60-
65%. Als volgende stap werden de eieren één uur bij –20°C geplaatst zodat de embryo’s
afstierven. Hierna konden de eieren geopend worden om een hemagluttinatietest (HA-test)
op uit te voeren.
Voor de HA-test werd gebruik gemaakt van microtiterplaten. De welletjes werden
allen gevuld met 50 µl PBS. Uit elk ei werd 50 µl allantoïsvloeistof gepipetteerd en in een
xyTiter ,10
-
35
welletje gebracht. Vanuit deze well werden dan 8 opeenvolgende 1/2 verdunningen
gemaakt. Zo werden 1/2, 1/4, 1/8,… tot 1/256 verdunningen gemaakt per ei. Tenslotte werd
aan elk welletje 50 µl van een 0,5% rodebloedcellensuspensie van kippen toegevoegd en
geschud. Na de microtiterplaten één uur te incuberen bij kamertemperatuur kon het
resultaat afgelezen worden. Indien er virus aanwezig was in de allantoïsvloeistof was er
hemagluttinatie zichtbaar. Geen hemagluttinatie wees aldus op de afwezigheid van het
virus.
Vervolgens werd de virustiter (EID50) berekend aan de hand van de formule van
Reed en Muench zoals hierboven beschreven.
-
36
5. RESULTATEN EN DISCUSSIE
5.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN ß-GALACTOSIDASE IN
GESPROEIDROOGDE POEDERS
5.1.1. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß-galactosidasetest
1. Mann 5,00%
2. Mann 4,50% - Bet 0,50%
3. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
4. Mann 4,50% - Treh 0,50%
5. Mann 4,50% - Ino 0,50%
6. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
7. Mann 4,00% - Treh 0,50% -
Glyc 0,50%
8. Mann 4,00% - Ino 0,50% -
Glyc 0,50%
FIGUUR 5.1.: ENZYMACTIVITEIT (%) NA PRODUCTIE
Uit figuur 5.1. kan afgeleid worden dat de toevoeging van trehalose en inositol aan
mannitol meer bescherming biedt aan het enzym tijdens het sproeidroogproces dan zuiver
gesproeidroogde mannitol (respectievelijk 104,2% en 88% vs. 38% aan resterende
enzymactiviteit). De toevoeging van glycine aan de mannitol-trehalose en mannitol-inositol
formulatie resulteerde in een lagere enzymactiviteit (EA= 74,0%; EA=73,3% respectievelijk)
dan wanneer glycine niet toegevoegd werd (EA=104,2%; EA= 88,0% respectievelijk), maar
een hogere dan bij de mannitol-glycine (0,5%) formulatie (EA= 54,0%). Werd het percentage
aan glycine in de mannitoloplossing opgedreven tot 1%, werd een nog lagere enzymactiviteit
vastgesteld (EA= 22,1%). Betaïne in een hoeveelheid van 0,50% bleek met een
enzymactiviteit van slechts 5,8% geen positieve invloed te hebben op de enzymstabiliteit
tijdens het sproeidroogproces en werd als gevolg hiervan verder niet meer onderzocht. Er
werd ook een formulatie met 1% betaïne gesproeidroogd. De resultaten hiervan zijn echter
niet terug te vinden in de figuur aangezien de yield 0% was.
38,01
5,77
104,21
22,14
54,01
74,02 73,2988,00
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8
En
zym
acti
vit
eit
(%
)
-
37
1. Mann 5,00%
2. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
3. Mann 4,50% - Treh 0,50%
4. Mann 4,50
% - Ino 0,50%
5. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
6. Mann 4,00% - Treh 0,50% -
Glyc 0,50%
7. Mann 4,00% - Ino 0,50% -
Glyc 0,50%
1. Mann 5,00%
2. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
3. Mann 4,50% - Treh 0,50%
4. Mann 4,50% - Ino 0,50%
5. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
6. Mann 4,00% - Treh 0,50% -
Glyc 0,50%
7. Mann 4,00% - Ino 0,50%-
Glyc 0,50%
*geen data voor verlies na 1 week
FIGUUR 5.2.: VERLIES AAN ENZYMACTIVITEIT BIJ BEWARING TOV POEDER NA PRODUCTIE
A. BEWARING BIJ 6°C; B.BEWARING BIJ 25°C
Van een goede stabilisator wordt verwacht dat hij het enzym ook kan blijven
stabiliseren na bewaring. Stabiliteitstesten werden gedaan 1 week en 1 maand na het
sproeidroogproces. De resultaten staan weergegeven in figuur 5.2. A en B.
De enzymactiviteit van bijna alle formulaties werd vrij goed behouden na 1 week
bewaring met een maximum verlies van ongeveer 16% met weinig verschil tussen de twee
bewaartemperaturen. De formulaties mannitol-inositol en mannitol-glycine 1% toonden bij
de bewaring bij 6ºC geen verlies aan enzymactiviteit. Uit figuur 5.2. blijkt dat na 1 maand
15,467,49 10,31
00
0,42
5,72
54,66 58,93
6,39 16,18 19,41
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7
En
zym
acti
vit
eit
(%
)
1 week 6°C 1 maand 6°C
9,710
13,9816,17 12,26
18,27
17,65
72,09
83,6
7,9117,73
34,19
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7
En
zym
acti
vit
eit
(%
)
1 week 25°C 1 maand 25°C
-
38
bewaring bij 6ºC het enzymactiviteitsverlies kon oplopen tot 59% zoals bij de mannitol-
inositol formulatie het geval was. De mannitol-trehalose formulatie bleek bij deze
bewaaromstandigheden 55% aan enzymactiviteit verloren te hebben, waarmee een totaal
van 65% aan enzymactiviteit verloren gegaan is tijdens de bewaring. Werden de stalen bij
25ºC bewaard dan was het enzymactiviteitsverlies na 1 maand iets hoger met een totaal
maximum van 83% enzymactiviteitsverlies voor de formulatie mannitol-inositol. De
formulatie enkel bestaande uit mannitol vertoonde vrijwel geen verlies aan enzymactiviteit
na 1 maand bij 25ºC.
Er kan dus besloten worden dat de formulaties mannitol-trehalose en mannitol-
inositol het enzym beter beschermen tijdens het sproeidroogproces, maar minder tijdens de
bewaring dan de andere formulaties.
5.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders
5.1.2.2. Morfologie
Onderstaande SEM foto’s in figuur 5.3. tonen de morfologie van de gesproeidroogde
poeders.
Uit de beelden blijkt dat bij de formulaties met betaïne en 1% glycine geen sferische
partikels gevormd werden, maar grillige clusterspartikels. Deze vaststelling kan ook gelinkt
worden aan de stabiliteitstesten. Daaruit bleek namelijk dat de overleving van het enzym bij
deze twee formulaties laag lag (5,77% en 22,14% respectievelijk).
Bij de overige formulaties werden sferische partikels gevormd van uiteenlopende
groottes.
-
39
FIGUUR 5.3.: MORFOLOGIE VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS.
5.1.2.3. Partikelgroottedistributie
De individuele partikelgroottes konden vastgesteld worden uit de
partikelgroottedistributies gemeten via laserdiffractie volgens de natte dispersiemethode.
Uit onderstaande figuur (figuur 5.4.) blijkt dat de formulaties met betaïne en 1% glycine,
zowel voor als na sonicatie van de suspensie, grotere partikels hebben dan de overige
poeders. Dit resultaat is in overeenstemming met de grillige clusterpartikels te zien op de
SEM-foto’s.
Figuur 5.4. A. toont bimodale partikelgroottedistributies, wat verklaart kan worden
door de losse partikelaggregaten zichtbaar na dispersie van de poederstalen in miglyol.
Sonicatie van de stalen resulteerde in het verdwijnen van deze bimodale
partikelgrootteverdeling (figuur 5.4. B.), waardoor kon besloten worden dat het inderdaad
om losse aggregaatstructuren ging. Dit kan voorts ook beaamd worden door de SEM foto’s
-
40
die, behalve bij het betaïne- en glycine 1%-poeder, losse sferische partikels toonden. Het kan
dus gesteld worden dat de primaire partikelgrootte het best kan worden gemeten na
sonicatie van de in miglyol gedispergeerde poederstalen.
FIGUUR 5.4.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIECURVES VAN DE GESPROEIDROOGDE
POEDERS BEPAALD VIA LASERDIFFRACTIE
A. POEDERS GEDISPERGEERD IN MIGLYOL; B. NA SONICATIE
Exacte waarden van de gemeten volumediameters staan weergegeven in
onderstaande tabel 5.1.
De meeste formulaties, behalve de mannitol-betaine en mannitol-glycine 1%
formulatie, vertoonden gelijkaardige partikelgroottedistributies met een gemiddelde
D(v,0.5) van 9,37 µm voor sonicatie en een gemiddelde van 8,14 µm na sonicatie .
Na sonicatie liggen de D(v,0.5) waarden alsook de spans van de formulaties lager
(Tabel 5.1.B.) dan bleek uit de metingen ervoor (Tabel 5.1.A.) wat opnieuw te wijten is aan
het opbreken van de losse aggregaten. Aangezien liefst zo weinig mogelijk variatie in
partikelgrootte gewenst is, ligt de span bij voorkeur laag. De spans van de gesproeidroogde
poeders zijn gelijkaardig en liggen tussen 1,4 – 2,1, wat acceptable waarden zijn.
-
41
TABEL 5.1.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE GEKARAKTERISEERD DOOR DE
VERSCHILLENDE DIAMETERS.
A. OORSPRONKELIJKE POEDERS; B. NA ULTRASOON BAD
D(v, 0.1) (µm) D(v, 0.5) (µm) D(v, 0.9) (µm) Span
Mann
Mann-Bet
Mann-Glyc 0,5%
Mann-Treh
Mann-Ino
Mann-Glyc 1%
Mann-Treh-Glyc
Mann-Ino-Glyc
2,99
15,40
2,37
4,11
2,62
10,70
1,24
0,88
8,96
54,46
9,04
13,65
8,06
43,87
9,29
7,24
20,88
125,84
19,43
115,70
70,07
113,04
141,44
17,13
1,995
2,028
1,887
8,175
8,372
2,333
1,510
2,244
D(v, 0.1) (µm) D(v, 0.5) (µm) D(v, 0.9) (µm) Span
Mann
Mann-Bet
Mann-Glyc 0,5%
Mann-Treh
Mann-Ino
Mann-Glyc 1%
Mann-Treh-Glyc
Mann-Ino-Glyc
3,00
16,34
2,93
4,04
2,68
9,31
1,10
1,04
6,69
41,08
7,67
11,84
6,14
40,59
9,00
7,52
13,15
74,80
15,14
23,20
11,62
97,17
20,64
16,56
1,517
1,423
1,593
1,618
1,456
2,165
2,172
2,062
Een van de doelstellingen van het onderzoek was poeders verkrijgen met een
partikelgrootte groter dan 20 µm (zie inleiding). Uit de resultaten in bovenstaande tabellen
kan echter besloten worden dat al de gesproeidroogde poeders veel partikels bevatten
kleiner dan 20 µm.
5.1.2.4. Vochtgehalte
Uit de resultaten van de Karl Fisher titraties, te zien in figuur 5.5., kon afgeleid worden dat
de formulaties met trehalose het meeste vocht bevatten, namelijk 0,76% voor de formulatie
mann-treh en 0,59% voor mann-treh-glyc. Alle poeders hadden echter een uiterst laag
-
42
vochtgehalte, lager dan 1,00%. Dit kan gunstig zijn voor de stabiliteit van het virusvaccin
tijdens de bewaring en voor de luchtdispergeerbaarheid van het poeder.
FIGUUR 5.5.: VOCHTGEHALTE (%) VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS MET
STANDAARDDEVIATIE BEPAALD DOOR KARL FISHER TITRATIE
5.1.2.5. Smelt- en glastransitietemperatuur
FIGUUR 5.6.: GLASTRANSITIE – EN SMELTTEMPERATUURSBEPALING UITGEVOERD MET
DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRIE
Uit de resultaten van de experimenten met de DSC bleek dat enkel bij de
trehaloseformulatie na het sproeidroogproces een poeder bekomen werd met een
glastransitietemperatuur. Dit wijst op de aanwezigheid van een amorfe stof. Deze
temperatuur is, zoals te zien op figuur 5.6., bij de formulatie waar 0,5% trehalose
-
43
toegevoegd werd aan mannitol 86,54°C. De zuivere stoffen mannitol, trehalose en het
fysisch mengsel van beiden vertoonden enkel smeltpieken, wat wijst op de aanwezigheid
van kristallijne stoffen. Er kan dus worden gesteld dat het amorfe karakter van het
gesproeidroogde mannitol-trehalose poeder te wijten is aan het sproeidroogproces.
Ook het poeder met 0,5% trehalose en 0,5% glycine vertoonde na sproeidrogen een
glastransitietemperatuur bij 82,88°C.
Gesproeidroogd mannitol en betaïne vertoonden een smeltpiek bij respectievelijk
168,54 en 94,13°C. Glycine vertoonde geen duidelijke smeltpiek en degradeerde vanaf
250°C. Zuiver inositol vertoonde ook een smeltpiek bij 226,48ºC. Bij het analyseren van de
mannitol-inositol formulatie kon de smeltpiek van inositol echter niet duidelijk worden
waargenomen te wijten aan het oplossen van de inositol in de reeds vooraf gesmolten
mannitol bij 165,05ºC.
5.1.2.6. Hygroscopiciteit
FIGUUR 5.7.: WATERSORPTIECURVEN BEKOMEN DOOR DVS.
Figuur 5.6. geeft de resultaten van de hygroscopiciteitsbepalingen weer, uitgevoerd
met behulp van DVS. Algemeen kan besloten worden dat alle formulaties een relatief lage
hygroscopiciteit bezitten. De maximale wateropname bedroeg 10,39% bij een blootstelling
aan 90% RH bij de formulatie waar zowel 0,5% trehalose als 0,5% glycine toegevoegd
werden aan mannitol.
-
44
Opvallend is de stijging gevolgd door een daling in de curve van het poeder met
mannitol, trehalose en glycine bij 60% RH. Dit kan wellicht te verklaren zijn door de overgang
van een amorfe naar een kristallijne structuur in het poeder. Het is zo dat amorfe stoffen
hygroscopischer zijn dan kristallijne stoffen. Beneden de glastransitietemperatuur zal de
watersorptie zich beperken tot oppervlakteadsorptie. Wanneer de glastransitie plaatsvindt,
zal de moleculaire mobiliteit stijgen en zo bulkwaterabsorptie induceren wat resulteert in
een hogere wateropname. Amorfe materialen zullen iets boven hun
glastransitietemperatuur overgaan in een meer stabiele kristallijne vorm. Deze overgang
doet de hygroscopiciteit van de stof drastisch verlagen (Burnett & Thielmann). Dit fenomeen
verklaart de plotse daling in de curve.
5.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS
In het kader van dit onderzoek werden enkele formulaties gesproeidroogd met een
sproeidroger uitgerust met een ultrasone nozzle om te kijken of deze deeltjes groter dan 20
µm kan produceren dan de two fluid nozzle die voordien gebruikt werd.
5.2.1. Morfologie
FIGUUR 5.8.: MORFOLOGIE VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS
A. MANN 15,00%; B. MANN 9,00% - INO 6,00%; C. MANN 9,00% -
BSA 6,00%; D. MANN 9,00% - INO 3,00% - BSA 3,00%
-
45
Figuur 5.8. toont de SEM-foto’s van de 4 formulaties gesproeidroogd met de
ultrasone nozzle procept, bij een inlaattemperatuur van 160°C wat resulteerde in een
uitlaattemperatuur van ongeveer 60°C, een feed rate van 2 ml/min, een airflow van 0,3
m³/min en een druk van 20 mbar.
Mann 15,00% gaf aanleiding tot eenzijdig ingedeukte partikelsferen. Uit het SEM-
beeld van de Mann-Ino formulatie kan afgeleid worden dat er tijdens het sproeidroogproces
een onvolledige droging heeft plaatsgevonden aangezien sommige partikels zich tijdens het
droogproces aan elkaar vastgehecht hebben. Bij deze formulatie was de yield ook slechts
30% terwijl de yield van de overige formulaties rond de 65% lag. Het poeder bestaande uit
mannitol, BSA en inositol lijkt ellipsvormige partikels te bevatten, maar vertoonde op zich
slecht vloeiende eigenschappen. Toevoeging van enkel BSA aan mannitol resulteerde in
veelzijdig ingedeukte sferen en vertoonde bovendien goede vloeiende eigenschappen.
Opvallend is, vergeleken met de poeders van de two-fluid nozzle, dat alle partikels
van gelijkaardige grootte zijn en ook vrij groot zijn.
5.2.2. Partikelgroottedistributie
FIGUUR 5.9.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIECURVES VAN DE POEDER GESPROEIDROOGD
MET EEN ULTRASONE NOZZLE BEPAALD VIA LASERDIFFRACTIE
Uit figuur 5.9. blijkt dat de partikelgroottedistributies slechts weinig ten opzichte van
elkaar verschillen.
-
46
TABEL 5.3.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE GEKARAKTERISEERD DOOR DE
VERSCHILLENDE VOLUMEDIAMETERS. D(v, 0.1) (µm) D(v, 0.5) (µm) D(v, 0.9) (µm) Span
Mann
Mann - BSA
Mann - Ino
Mann - BSA - Ino
15,76
22,61
18,13
16,56
29,37
46,14
37,30
29,69
42,39
86,30
71,50
47,85
0,9068
1,380
1,431
1,054
Uit tabel 5.3 kan afgeleid worden dat de partikels van alle formulaties duidelijk groter
zijn dan die van de formulaties die met de two fluid nozzle gesproeidroogd werden
(gemiddelde D(v,0.5)= 8,14). Het poeder met mannitol en BSA heeft de grootste partikels
met slechts 10% van de partikels kleiner dan 22,61 µm. Dit resultaat leunt zeer dicht aan bij
de minimale diameter van 20 µm die vooropgesteld was. Deze formulatie toonde in de
voorgaande SEM-beelden ook minder kleine partikels dan de andere formulaties.
5.3. EXPERIMENTAL DESIGN: INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS
OP DE ENZYMSTABILITEIT
5.3.1. Evaluatie van de poederstalen
TABEL 5.4.: OPZET VAN HET EXPERIMENTEEL DESIGN MET FACTOREN EN RESPONSEN
Exp No Exp Name Run
Order inlettº (ºC)
Solids
(%) Airflow
(L/h) Pump
(mL/min) Stabiliteit
(%)
1 N1 16 130 5 355 3,5 114,13
2 N2 11 180 5 355 3,5 0,59
3 N3 14 130 15 355 3,5 93,32
4 N4 6 180 15 355 3,5 50,83
5 N5 18 130 5 473 3,5 109,56
6 N6 1 180 5 473 3,5 8,72
7 N7 3 130 15 473 3,5 68,40
8 N8 4 180 15 473 3,5 7,83
9 N9 15 130 5 355 7 119,56
10 N10 17 180 5 355 7 72,00
11 N11 12 130 15 355 7 113,01
12 N12 5 180 15 355 7 84,29
13 N13 13 130 5 473 7 107,76
14 N14 19 180 5 473 7 80,51
15 N15 8 130 15 473 7 82,44
16 N16 9 180 15 473 7 45,79
17 N17 7 155 10 414 5 101,14
18 N18 2 155 10 414 5 99,62
19 N19 10 155 10 414 5 75,05
-
47
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
inle
t
air
pum
inle
t*pu
m
%
Scaled & Centered Coefficients for s tabiliteit
N=19 R2=0,834 RSD=17,7
DF=14 Q2=0,697 Conf. lev.=0,95
5.3.2. Analyse van het experimenteel design
5.3.2.1. Evaluatie van
