UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

GESTRUCTUREERDE AANPAK VAN UIERGEZONDHEIDSPROBLEMEN OP EEN

MELKVEEBEDRIJF – FOCUS OP STAPHYLOCOCCUS AUREUS

door

Mathias VANDEN BOSCH

Promotor: Dr. S. Piepers Onderzoek in het

Medepromotor: D’arts D. Valckenier kader van de masterproef

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of

volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk

uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor

enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

GESTRUCTUREERDE AANPAK VAN UIERGEZONDHEIDSPROBLEMEN OP EEN

MELKVEEBEDRIJF – FOCUS OP STAPHYLOCOCCUS AUREUS

door

Mathias VANDEN BOSCH

Promotor: Dr. S. Piepers Onderzoek in het

Medepromotor: D’arts D. Valckenier kader van de masterproef

VOORWOORD

Eerst en vooral wil ik de veehouder bedanken voor de gastvrijheid en om mij zijn gegevens van het

bedrijf ter beschikking te stellen. Steeds hebben ze ook de tijd vrijgemaakt om mij de stalen te kunnen

laten nemen.

Verder wil ik mijn promotor en medepromotor bedanken voor het vele werk dat ze in dit onderzoek

gestoken hebben. Ze stonden steeds klaar met raad en daad om dit onderzoek tot een goed eind te

brengen.

Tot slot wil ik mijn vriendin en ouders bedanken voor het nalezen van deze masterproef en de nodige

steun hierbij.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING…………………………………………………………………………………………. p. 1

INLEIDING…………………………………………………………………………………………………. p. 2

LITERATUURSTUDIE……………………………………………………………………………………. p. 3

1. ANATOMIE VAN DE UIER……………………………………………………………………... p. 3

2. FYSISCHE EN IMMUNOLOGISCHE BARRIERES VAN DE UIER……………………….. p. 4

3. MASTITIS p. 8

3.1. Etiologie……………………………………………………………………………. p. 8

3.2. Epidemiologie……………………………………………………………………… p. 10

3.3. Diagnose…………………………………………………………………………... p. 12

3.4. Behandeling……………………………………………………………………….. p. 17

3.5. Controle en management………………………………………………………… p. 21

3.6. Economische impact……………………………………………………………… p. 24

MATERIAAL EN METHODEN p. 25

RESULTATEN p. 28

BESPREKING p. 39

REFERENTIELIJST p. 41

SAMENVATTING

Mastitis is voor een melkveebedrijf naast één van de meest voorkomende ziekten ook een

aandoening van groot economisch belang. Het algemeen aanwezig zijn van bacteriën die mastitis

kunnen veroorzaken in de omgeving zorgt ervoor dat mastitis niet te eradiceren valt. Het controleren

tot onder een aanvaardbaar niveau zou dan ook het doel moeten zijn van iedere melkveehouder.

Toch blijken niet alle maatregelen voor productieverliezen op te wegen tegen de kosten. In dit

onderzoek wordt een bedrijf uit West-Vlaanderen met een gemiddelde van 119 koeien geanalyseerd.

Gegevens werden uit de melkproductieregistratie gehaald over een periode van een jaar (maart 2013

– maart 2014). Op dit bedrijf was er een vermoeden van de aanwezigheid van Staphylococcus aureus

door het cyclisch karakter van het bedrijfscelgetal. In totaal werden er 132 stalen genomen voor

bacteriologisch onderzoek over een periode van 4 maanden. Zes stalen hiervan testten positief voor

S. aureus. Na het aanleggen van een antibiogram werd er geen resistentie vastgesteld. Ondanks het

feit dat er weinig maatregelen genomen worden op het bedrijf voor het onder controle houden van

mastitis blijft het bedrijfscelgetal toch binnen de perken. Een korte tussenkalftijd met als gevolg het

sneller droogzetten van chronisch geïnfecteerde dieren blijkt hier een belangrijke rol in te spelen.

Sleutelwoorden: controle, mastitis, resistentie, st aalnamen, Staphylococcus aureus

2

INLEIDING

Ondanks dat er al meer dan 50 jaar controleprogramma’s toegepast worden, blijft uierontsteking of

mastitis tot op vandaag één van de meest voorkomende aandoeningen bij melkvee. De totale

incidentie van mastitis is wel al sterk gedaald. In plaats van 121 gevallen per 100 koeien per jaar in

1968, werden er in 1995 nog maar 50 gevallen per 100 koeien per jaar vastgesteld (Blowey en

Edmondson, 2010). Deze daling is vooral toe te schrijven aan de toepassing van maatregelen zoals

tepeldipping, droogstandstherapie en het opruimen van chronisch geïnfecteerde dieren. Daarnaast

wordt ook een verschuiving van hoofdzakelijk infecties met koegebonden kiemen (60,6% in 1968 vs.

26,2% in 1995) naar voornamelijk omgevingsgerelateerde infecties (23,1% in 1968 vs. 58% in 1995)

vastgesteld (tabel 1). Aangezien mastitis belangrijke economische verliezen met zich mee brengt

(voor klinische mastitis werden deze verliezen bv. recentelijk geschat op €61 - €91 per gemiddelde

koe op een bedrijf per jaar), dringt de ontwikkeling van nieuwe controleprogramma’s en

preventiemethoden zich op (Aeberhardt et al., 1997; Stark et al., 1997; Huijps et al., 2009). Daarbij

moet steeds rekening gehouden worden met de multifactoriële aard van deze aandoening (Harmon,

1994).

Tabel 1: Vergelijking van het aantal gevallen van mastitis in 1968 en 1995 (naar Blowey en Edmondson, 2010).

Type 1968 (%) 1995 (%)

Koegebonden kiemen

• Staphylococcus aureus

• Streptococcus agalactiae

• Streptococcus dysgalactiae

60.6

37.5

3

20.1

26.2

15.4

/

10.8

Omgevingsgebonden kiemen

• Streptococcus uberis

• Coliformen

23.1

17,7

5.4

58

32

26

Andere 16.3 15.8

Aantal casussen/100 koeien/jaar 121 50

3

Fig. 1: Anatomie van de uier en tepel. 1.

Melkklieralveole; 2. Ductus lactiferus; 3. Uiercysterne; 4.

Slijmvliesplooi; 5. Venenring van Fürstenberg; 6.

Tepelwand met mucosa; 7. Spierlaag; 8. Tepelhuid; 9.

Tepelcysterne; 10. Rozet van Fürstenberg; 11.

Tepelsfincter; 12. Tepelkanaal; 13. Tepelkanaalopening

(uit Steenhaut en Vlaminck, 1995).

LITERATUURSTUDIE

1. ANATOMIE VAN DE UIER

Melkklieren zijn gemodificeerde zweetklieren die melk produceren. Bij runderen bestaat de uier uit vier

afzonderlijke melkklieren, ook wel aangeduid als kwartieren. De mediale intermammaire groeve en de

transversale groeve, dewelke de uier respectievelijk verdelen in een linker- en een rechterhelft en in

voor- en achterkwartieren, maken het onderscheid tussen de vier kwartieren uitwendig zichtbaar. Elk

kwartier heeft een tepel. In sommige gevallen kunnen ter hoogte van één kwartier echter meerdere

tepels aanwezig zijn. Deze accessoire tepels komen vooral voor aan de achterkwartieren en zijn

ongewenst omdat ze het melkproces bemoeilijken (Singh et al., 2006).

Iedere melkklier bestaat uit parenchym (het secretorisch weefsel en de melkgangen) dat omgeven

wordt door bindweefsel en vet (stroma). De verhouding tussen parenchym en stroma wordt hormonaal

gestuurd. Zo is er gedurende de lactatie een groot aandeel aan secretorisch weefsel, na de lactatie

regresseert het parenchym zodat het relatieve aandeel van bindweefsel toeneemt (Frandson et al.,

2009).

De functionele eenheid van het parenchym is een

alveolus. Deze bestaat uit een eenlagig cilindrisch

tot kubisch epitheel en een aantal myoepitheliale

cellen, dewelke onder invloed van het hormoon

oxytocine contraheren en zo de melk laten “schieten”

(Singh et al., 2006). De melk stroomt via steeds

breder wordende melkgangen (ducti lactiferi) naar de

melkcysterne (sinus lactiferus). De sinus lactiferus

bestaat uit een uiercysterne en een tepelcysterne.

Deze zijn van elkaar gescheiden door een

mucosaplooi waarin de veneuze plexus of venenring

van Fürstenberg ingebed is. Tussen de

tepelcysterne en het tepelkanaal bevindt zich een

andere mucosaplooi, namelijk de rozet van

Fürstenberg, welke lymfocyten en plasmacellen

bevat en zodus instaat voor de afweer. De grootte

van de opening van het tepelkanaal wordt bepaald

door de tepelsfincter of musculus sfincter papillae

(Fig. 1) (Steenhaut en Vlaminck, 1995).

4

2. FYSISCHE EN IMMUNOLOGISCHE BARRIERES VAN DE UIER

Om een intramammaire infectie te veroorzaken, moeten pathogenen in staat zijn om twee

hoofdbarrières in de afweer te doorbreken. Het tepelkanaal zorgt samen met zijn omgevende weefsels

voor een eerste fysische barrière. Bacteriën die deze eerste defensie toch weten te doorbreken,

komen in contact met de lokale afweer, waarvan neutrofielen die de bacteriën fagocyteren het

belangrijkste deel uitmaken. Ondanks dat de uier veelvuldig in contact komt met allerhande

pathogenen, blijft de incidentie van intramammaire infecties relatief laag. Het afweermechanisme moet

zodoende optimaal zijn om deze infecties te voorkomen en/of te overwinnen (Myllys et al., 1993).

Ter hoogte van de tepels bestaat het epitheliale deel van de huid uit een dikke laag gestratificeerd

squameus epitheel. Wanneer dit epitheel niet aangetast is, zorgen de dode cellen met keratine aan

het oppervlak voor een ongunstige omgeving voor pathogenen. De continuïteit van de huid kan echter

door diverse factoren onderbroken worden. Streptococcus dysgalactiae en Staphylococcus aureus in

het bijzonder maken van deze opportuniteit gebruik om zich aan het oppervlak van de huid te

vermenigvuldigen en zo een reservoir voor mastitisinfecties te vormen (Blowey en Edmondson, 2010).

Staphylococcus spp. zijn in staat om zich te binden aan weefselproteïnen zoals fibronectine,

fibrinogeen, fibrine, vitronectine en collageen. Deze eiwitten worden aan het oppervlak geëxposeerd

na beschadiging van het epitheel. Tepelverwondingen en subklinische mastitis zijn significant met

elkaar gecorreleerd. Wanneer een tepelverwonding zich voordoet, neemt het risico voor de

ontwikkeling van mastitis tijdens de volgende 10 maanden met 50% toe. Subklinische mastitis komt

1.75 keer meer voor bij beschadigde kwartieren dan bij ongeschonden kwartieren. De meest frequente

oorzaken van zulke laesies zijn een gebrekkige afstelling van melkmachines, een verkeerde

melktechniek, een foute huisvesting en extern trauma waaronder speenbetrapping (Myllys et al.,

1993). Het gebruik van een goede tepeldip na het melken draagt bij tot een gezonde tepelhuid

(Blowey en Edmondson, 2010).

Het tepelkanaal vormt een ingang voor pathogenen. Het kanaal bevat een kringspier dewelke zich

tussen twee melkbeurten sluit om het binnenkomen van pathogenen te verhinderen. Na het melken

duurt het minstens nog 20 à 30 minuten alvorens het tepelkanaal weer volledig gesloten is. Omwille

van deze reden wordt veehouders geadviseerd om hun koeien na het melken gedurende deze tijd te

laten vaststaan aan het voederhekken, zodat ze niet kunnen gaan liggen en zodoende intens contact

met pathogenen wordt vermeden. Binnengedrongen pathogenen worden gedetecteerd door de rozet

van Fürstenberg. Deze in een ring gelegen lymfocyten activeren de immuunrespons. Daarnaast bevat

het tepelkanaal nog andere afweermechanismen. Bacteriën worden geabsorbeerd in de keratinelaag,

welke vrije vetzuren bevat met een bacteriostatische werking. Kationische proteïnen binden

elektrostatisch aan pathogenen waardoor hun celwand verandert. Hierdoor worden ze gevoelig voor

osmotische druk. Het niet meer kunnen regelen van de osmolariteit zorgt uiteindelijk voor lyse van de

pathogenen (Myllys et al., 1993).

De afweer van de uier kan onderverdeeld worden in een niet-specifieke afweer, welke in staat is om

weerstand te bieden tegen verschillende pathogenen, en een specifieke immuniteit welke nadat de

5

niet-specifieke immuniteit het liet afweten in staat is om een specifiek afweermechanisme voor ieder

pathogeen te ontwikkelen. De niet-specifieke afweer bestaat uit lactoferrine, lactoperoxidase en het

complementsysteem. Het lactoferrine bindt het voor de bacteriële groei noodzakelijke ijzer aan zich.

Hierdoor wordt de bacteriële vermeerdering geminimaliseerd. Deze vorm van afweer werkt enkel

voldoende bij droogstaande koeien, doordat er in deze periode geen verdunning optreedt van de

lactoferrineconcentratie door het wegvallen van de melkproductie en omdat hoge citraatgehalten in de

melk in competitie kunnen gaan met lactoferrine voor het ijzer. Het gevormde ijzercitraat kan wel nog

gebruikt worden door bacteriën. Samen met thiocyanaat (SCN) en waterstofperoxide (H2O2) kan

lactoperoxidase de groei van sommige Gram-positieve bacteriën inhiberen en heeft het een

bactericiede werking op sommige Gram-negatieven. De concentratie van SCN in de melk kan sterk

variëren naargelang het dieet en is bijzonder hoog wanneer het voeder brassicaceae en peulvruchten

bevat. Complementactivatie, met een cascadereactie tot gevolg, resulteert in het afdoden van

sommige Gram-negatieve stammen zoals E. coli (Myllys et al., 1993).

Tot de specifieke immuniteit behoren de macrofagen, polymorfonucleairen, lymfocyten en antistoffen.

Het meest effectieve systeem tegen invaderende pathogenen is de fagocyterende werking van de

neutrofielen. Macrofagen en polymorfonucleairen, welke al in lage aantallen in de melk aanwezig zijn,

herkennen de fragmenten van dode bacteriën en hun toxines en nemen deze vervolgens op volgens

een proces dat fagocytose genoemd wordt (Fig. 2). Specifieke mediatoren die vrijkomen door dit

proces, zoals interleukine-8 (IL-8) en tumor necrosis factor alfa (TNF-α), zullen samen met de

bacteriële toxines de inflammatoire respons triggeren. Hierdoor is er een instroom van

polymorfonucleairen uit de capillairen in de tepelwand en uier naar de cysternen en de melkgangen.

Deze instroom is zo groot dat op enkele uren tijd het aantal cellen in de melk van een basisgehalte

van 100.000 cellen/ml toeneemt tot 100.000.000 cellen/ml en meer (Fig. 3). Eens aangekomen in de

melk begint hun taak van fagocytose (Blowey en Edmondson, 2010). Opmerkelijk is dat sommige S.

aureus stammen in staat zijn om te weerstaan aan de afdodende werking van de neutrofielen eens ze

gefagocyteerd zijn. Op dat moment zijn ze niet alleen onbereikbaar voor het immuunstelsel maar op

die manier kunnen ze ook de uier herinfecteren wanneer ze terug vrijkomen eens de neutrofielen

afsterven (Biggs, 2009).

Gedurende de droogstand wordt de melkklier beschouwd als zeer immuun tegen infecties. Het

tepelkanaal is afgesloten door een keratineplug. De concentratie van leukocyten is hoog en de

omgeving is gunstiger voor hun werking dan in de lacterende uier (Burvenich et al., 2007). Vanaf 2

weken voor tot 2 à 3 weken na de kalving is de meest kritische periode voor de gezondheid van

melkklier. De aangeboren immuniteit van de koeien rond het tijdstip van kalven is onderdrukt.

Gedurende de colostrogenese is de gevoeligheid van de melkklier voor infecties toegenomen vanaf

wanneer het tepelkanaal zich opent en kliersecreet lekt. Op dat moment verdwijnt ook het positief

effect van het eventueel gebruikte droogzetpreparaat (Pyörälä, 2008).

Fig. 2: Het proces van fagocytose (naar Blowey en Edmondson, 2010).

Fig. 3: Een goede polymorfonucleaire respons kan leiden tot een snelle eliminatie van pathogenen (a). Bij een onvoldoende respons nemen de bacteriën de overhand (b) (naar Hill,

1981).

8

3. MASTITIS

Mastitis is een ontsteking van de melkklier en wordt meestal veroorzaakt door bacteriën die via het

tepelkanaal de uier binnendringen. Hier vermenigvuldigen ze zich en veroorzaken ze een

ontstekingsreactie (Brightling et al., 1998). Deze ontstekingsreactie kan zich ofwel subklinisch

manifesteren, waarbij geen visuele symptomen zichtbaar zijn, dan wel klinisch waarbij lokale of

systemische symptomen zichtbaar zijn (De Vliegher et al., 2012). Subklinische mastitis is de meest

voorkomende vorm. Er is geen macroscopisch zichtbare afwijking aan de melk en de uier vertoont

geen zichtbare ontstekingsreactie. Enkel door een daling in melkproductie en een afwijkend celgetal

kan er een vermoeden ontstaan. Klinische mastitis kan zich zowel peracuut voordoen, waarbij er een

zeer snelle ontstekingsreactie van de uier ontstaat, resulterend in één of meerdere warme, opgezette,

pijnlijke en/of harde kwartieren met geen of abnormaal secreet. Septicemie of toxinemie zorgen voor

een versnelling van de hartslag, koorts, depressie, een daling van de pensmotiliteit, een verlies van

eetlust en diarree. De koe is duidelijk ziek en wanneer deze symptomen aanhouden, kan dit leiden tot

dehydratatie en zelfs de dood van het dier. Wanneer een koe over een lange termijn mastitis heeft of

herhaaldelijk hervalt, spreekt men van chronische mastitis. Chronische mastitis kan zich gedurende

maanden tot jaren subklinisch gedragen met af en toe tekenen van klinische mastitis. Een permanente

uierbeschadiging is vaak het gevolg. Tussen deze twee uitersten bestaan de mildere vormen nl.: de

acute en subacute klinische mastitis (Biggs, 2009).

3.1. ETIOLOGIE

Tot nog toe zijn er in de literatuur meer dan 200 verschillende oorzaken gerapporteerd van mastitis bij

runderen (Blowey en Edmondson, 2010). Een gedetailleerde opsomming van al deze organismen ligt

buiten het bereik van dit onderzoek. Hun indeling kan gebeuren op basis van hun virulentie in major

en minor pathogenen. Major pathogenen, waaronder Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. en

coliformen, hebben het potentieel om klinische mastitis te veroorzaken of het celgetal sterk te laten

toenemen bij subklinische mastitis. Minor pathogenen zullen het celgetal meestal maar licht laten

toenemen en eerder occasioneel een mild geval van klinische mastitis teweegbrengen. Tot deze

groep behoren de coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) en Corynebacterium bovis. In

onderstaande tabel worden de meest voorkomende pathogenen weergegeven en onderverdeeld in

koegebonden en omgevingsgerelateerde kiemen (Tabel 2). Omgevingsgebonden kiemen zijn deels

geadapteerd om te overleven in de omgeving van de koe en moeten beschouwd worden als

opportunistische indringers van de uier. Koegebonden kiemen hebben zich daarentegen aangepast

om te overleven in of op de koe en spreiden zich typisch van koe naar koe tijdens het melkproces,

daar waar de verspreiding van omgevingsgebonden kiemen typisch gebeurt in de periode tussen 2

melkbeurten. Als mogelijke oorzaak hiervan kan het niet dagelijks proper maken van de ligbedden zijn.

Het onderscheid dat we maken is zeker niet steeds eenduidig. Zo kan, afhankelijk van de stam,

eenzelfde species of genus zich anders gaan gedragen (Zadoks en Schukken, 2006).

9

Tabel 2: Samenvatting van de verschillen tussen koe- en omgevingsgebonden mastitisverwekkers (naar Blowey en

Edmondson, 2010 en Brightling et al., 1998).

Koegebonden kiemen Omgevingsgebonden kiemen

Leefomgeving Intramammair of op de tepelhuid Leefomgeving van de koe

Verspreiding Via gecontamineerde melk Via een gecontamineerde omgeving

Tijdstip van besmetting Voornamelijk tijdens het melken Tussen melkbeurten, tijdens de

droogstand en rond de kalving

Voornaamst e kiemen - Staphylococcus aureus

- Streptococcus agalactiae

- Coagulase-negatieve sta-

phylococci

- Streptococcus dysgalac-

tiae

- Corynebacterium bovis

- Mycoplasma

- Streptococcus uberis

- Coagulase-negatieve

staphylococci

- Coliformen

o E. coli

o Citrobacter

o Enterobacter

o Klebsiella

o Pseudomonas aeru-

ginosa

- Bacillus cereus

- Bacillus licheniformis

- Pasteurella

- Streptococcus faecalis

- Schimmels/Gisten

Subklinisch of klinisch Vooral subklinisch Hoger aantal klinisch, Streptococcus

uberis kan subkli-nisch zijn

Controle - Tepeldip na het melken

- Droogstandstherapie

- Melkhygiëne

- Afvoermanagement

- Omgevingshygiëne

- Predipping

- Inwendige speenafsluiter

(preparaat om keratineplug na

te bootsen)

Opmerkingen S. aureus is moeilijk te

behandelen, vooral tijdens de

lactatie. Preventie is dus

noodzakelijk.

- Coliformen berokkenen hun

schade vooral door vrijstelling

van toxines nadat ze gestorven

zijn. Antibiotica zouden niet

nodig zijn.

- Pseudomonas is zeer moeilijk

te behandelen en koeien die

overleven moeten afgevoerd

worden.

10

3.2. EPIDEMIOLOGIE

De verdeling van de geïsoleerde pathogenen verschilt naargelang de leeftijd. Zo hebben vaarzen een

hogere incidentie van Streptococcus uberis en CNS en een lagere incidentie van Staphylococcus

aureus infecties in vergelijking met oudere soortgenoten (De Vliegher et al., 2012) (Fig. 4). Vaarzen

riskeren reeds voordat ze geslachtsrijp zijn om mastitis te ontwikkelen. Studies hebben mastitis in

vaarzen met een leeftijd van 9 maand gedocumenteerd en onderzoek toonde aan dat de incidentie

kan oplopen tot 97% (Nickerson et al., 1995). Subklinische vaarzenmastitis wordt overwegend

veroorzaakt door Staphylococcus spp. Het merendeel hiervan zijn CNS, maar S. aureus kan hier een

aanzienlijk deel van vertegenwoordigen. In lacterende koeien is S. aureus moeilijk te genezen. Om

deze reden is de aanwezigheid ervan in vaarzen iets waarover men zich zorgen moet maken. De

grootste ontwikkeling van het melkproducerend weefsel in de uier gebeurt gedurende de eerste

dracht, daarom is het belangrijk om het secretorisch weefsel van de uier te beschermen tegen

pathogenen om een maximale melkproductie mogelijk te maken gedurende de eerste en

daaropvolgende lactaties. In de VS vonden onderzoekers dat wanneer vaarzen die geïnfecteerd zijn

met S. aureus niet behandeld worden, ze 10% minder melk produceren in vroege lactatie dan diegene

die wel behandeld worden (Owens et al., 1991). S. aureus mastitis in vaarzen kan persisteren van de

periode voor de partus tot in de 1ste lactatie. De resulterende schade in de ontwikkeling van het

uierweefsel kan de melkproductie reduceren en zorgt ervoor dat de vaars nooit haar potentiële

maximale melkproductie zal bereiken (Owens et al., 2001). Daarenboven zijn potentieel hoog

producerende vaarzen gevoeliger voor de ontwikkeling van een intramammaire infectie.

Fig. 4: Distributie van verschillende pathogenen geïsoleerd bij koeien van verschillende leeftijden (uit De Vliegher et al.,

2012).

11

Een opvallend gegeven is dat de met CNS geïnfecteerde vaarzen meer produceren dan hun niet-

geïnfecteerde leeftijdsgenoten van hetzelfde bedrijf. Dit zou toegeschreven kunnen worden aan het

feit dat vaarzen met CNS geïnfecteerde kwartieren in vroege lactatie minder kans hebben om

klinische mastitis te ontwikkelen en bijgevolg beschermd zijn tegen toekomstige melkverliezen in

vergelijking met niet-geïnfecteerde vaarzen (Piepers et al., 2010).

De incidentie van klinische mastitis bij vaarzen is tijdens de eerste dagen postpartum hoger dan bij

koeien (Fig. 5). Zomerwrang wordt typisch gezien bij eerste kalfsvaarzen maar ook bij droogstaande

koeien en wordt veroorzaakt door een combinatie van aërobe en anaërobe kiemen waaronder

Trueperella pyogenes, Peptococcus indolicus en Streptococcus dysgalactiae. Deze pathogenen

worden overgedragen door de vlieg Hydrotaea irritans (De Vliegher et al., 2012).

Fig. 5: De dagelijkse incidentie van mastitis bij vaarzen (bolletjes) en koeien (driehoeken) (naar De Vliegher et al., 2012).

In een Canadese studie was de prevalentie van mastitis bij pas afgekalfde koeien 34% en de meeste

van deze nieuwe infecties werden veroorzaakt door omgevingsgebonden Streptococcus spp. en

coliformen (Dingwell et al., 2004). Mastitis veroorzaakt door Streptococcus uberis wordt het frequentst

waargenomen tijdens de droogstand en in vroege lactatie en in sommige landen is deze de meest

voorkomende kiem vlak na het afkalven (McDougall et al., 2007). Anderzijds neemt de incidentie

veroorzaakt door de koegebonden kiem S. aureus toe naar het einde van de lactatie (Sol et al., 2000).

12

3.3. DIAGNOSE

Mastitis beïnvloedt naast de melkkwaliteit ook de melkproductie en de bacteriën kunnen gemakkelijk

spreiden doorheen de veestapel. Het is daarom belangrijk om naast de klinische gevallen, welke

duidelijk zichtbaar zijn onder andere aan de hand van vlokken in de melk, ook de subklinische

gevallen te diagnosticeren.

Er is het een en ander wettelijk bepaalt. De richtlijn 89/362/EEG van de Commissie van 26 mei 1989

houdende algemene voorschriften inzake de hygiëne op melkveebedrijven, stelt dat voordat de koe

gemolken wordt, de melker de uiterlijke eigenschappen van de melk moet controleren. Indien enige

fysische afwijking wordt geconstateerd, mag de melk van de betrokken koe niet worden geleverd.

Koeien met klinische uierziekten moeten het laatst met een aparte melkmachine of met de hand

worden gemolken en de melk mag niet worden geleverd (Pyörälä, 2003). Na het melken moet de melk

onmiddellijk worden opgeslagen in een proper lokaal dat is ontworpen en uitgerust om verontreiniging

te voorkomen. Wanneer de melk dagelijks wordt opgehaald moet de melk onmiddellijk tot ten hoogste

8°C worden gekoeld en tot ten hoogste 6°C wanneer d it niet het geval is. Een representatief aantal

steekproefsgewijs genomen monsters van de opgehaalde rauwe melk moet worden gecontroleerd om

na te gaan of de melk voldoet aan bepaalde criteria. Zo mag volgens richtlijn 92/46/EEG van de raad

van 16 juni 1992 tot vaststelling van gezondheidsvoorschriften voor de productie en het in de handel

brengen van rauwe melk, warmtebehandelde melk en producten op basis van melk met een celgetal

van boven de 400.000 cellen/ml niet gebruikt worden voor menselijke consumptie. Het kiemgetal moet

bij 30°C lager liggen dan 100.000 kiemen/ml. Onverm inderd het bepaalde in richtlijn 96/23/EG, mag

rauwe melk niet in de handel worden gebracht wanneer zij de toegestane gehalten van één van de in

de bijlagen I en III van Verordening nr. 2377/90 genoemde stoffen overschrijdt of het gecombineerde

totaal van antibioticaresiduen hoger is dan enige toegestane maximumwaarde (Schukken et al.,

2003).

Er zijn drie niveaus waar het opsporen van mastitis en het bepalen van de melkkwaliteit noodzakelijk

is. De diagnose moet gesteld kunnen worden op koeniveau, op tankniveau en in de zuivelindustrie.

Bacteriologisch onderzoek is niet altijd realiseerbaar als routinematig onderzoek. Daarenboven doet

het intermitterend uitscheiden van S. aureus kiemen in de melk en zijn vermogen om te overleven in

neutrofielen de sensitiviteit van een bacteriologisch onderzoek dalen (Biggs, 2009). Screeningstesten

voor het bepalen van de mate van ontsteking zijn daarom belangrijk om kwartieren te identificeren met

een intramammaire infectie en voor het selecteren van koeien om een melkstaal van te nemen voor

verder bacteriologisch onderzoek. De mate waarin mastitis de melkkwaliteit beïnvloedt hangt af van de

pathogeniciteit van de bacteriën en de hoeveelheid aangetast klierweefsel. De hoofdveranderingen in

de uier bestaan uit het lekken van ionen, proteïnen en enzymen uit het bloed naar de melk omwille

van een toegenomen permeabiliteit, de massale influx van fagocyterende cellen in de melk en een

afname van de secreterende capaciteit van de klier. Dit veroorzaakt een verlaging van de concentratie

van de melkcomponenten. Daarenboven kunnen er in het geïnfecteerde kwartier ook elementen

afkomstig van de immuunrespons, zoals acute fase proteïnen, teruggevonden worden. Deze

veranderingen kunnen potentieel bruikbaar zijn voor het detecteren van mastitis. De gouden

13

standaard voor de mate van ontsteking is het celgetal (Pyörälä, 2003). De cellen aanwezig in de melk

van een gezonde koe zijn voornamelijk macrofagen (66-88%). Daarnaast zijn er ook nog neutrofielen,

epitheliale (0-7%) en mononucleaire cellen aanwezig. De proportie van het aantal neutrofielen neemt

toe van 1-11% in een gezond kwartier naar 90% bij een intramammaire infectie (Sandholm, 1995).

Celgetalgrenzen worden vaak gebruikt voor het vaststellen van intramammaire infecties op zowel

kwartier- als uierniveau. Het gebruik van een mengstaal voor het bepalen van het celgetal brengt met

zich mee dat er een verdunningseffect optreedt van de melk van geïnfecteerde kwartieren met deze

van de niet-geïnfecteerde. Zo zal het geïnfecteerde kwartier een celgetal moeten halen van minstens

700.000 cellen/ml om een grenswaarde van 250.000 cellen/ml te bereiken wanneer de gezonde

kwartieren een celgetal hebben van 100.000 cellen/ml (Ruegg en Reinemann, 2002) (Fig. 6).

Fig. 6: Het celgetal van het melkstaal wanneer er maar 1 kwartier geïnfecteerd is en de 3 gezonde kwartieren een

celgetal van 100.000 cellen/ml hebben (naar Ruegg, 2002).

In het verleden zijn verschillende studies gedaan over de sensitiviteit en de specificiteit van

verschillende grenswaarden van het celgetal. Een grenswaarde van 100.000 cellen/ml voor

kwartierstalen heeft de grootste sensitiviteit en specificiteit voor het detecteren van een intramammaire

infectie 5 dagen na afkalven (Tabel 3).

Tabel 3: Verklaring sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde.

sensitiviteit mate waarin een test een geïnfecteerde koe als geïnfecteerd aangeeft

specificiteit mate waarin een test een niet-geïnfecteerde koe als niet-geïnfecteerd aangeeft

positief voorspellende

waarde

is de kans dat een positief testresultaat ook daadwerkelijk een geïnfecteerde

koe aanwijst

negatief voorspellende

waarde

is de kans dat een negatief testresultaat ook daadwerkelijk een niet-

geïnfecteerde koe aanwijst

De probabiliteit dat een koe boven deze grenswaarde ook daadwerkelijk een intramammaire infectie

heeft (de positief voorspellende waarde) of de probabiliteit dat een koe onder deze grenswaarde ook

werkelijk negatief is (de negatief voorspellende waarde) zijn bruikbare tools in het interpreteren van de

bekomen resultaten. Deze waarden hangen echter af van de prevalentie van mastitis op het bedrijf

14

(Tabel 4). Zo zal het laten toenemen van de grenswaarde tot 250.000 cellen/ml in een kudde met een

lage prevalentie (5%) van subklinische mastitis, de positief voorspellende waarde doen stijgen. 57%

(100%-43%) van de koeien boven deze waarde zullen ook effectief geïnfecteerd zijn, daar waar de

negatief voorspellende waarde amper beïnvloed zal worden (3% van de koeien met infectie wordt

onterecht als negatief bestempeld) (Ruegg en Reinemann, 2002).

Tabel 4: Effect van het veranderen van de grenswaarde op de positief voorspellende waarde (PVW) en de negatief

voorspellende waarde (NVW) bij een hoge en een lage prevalentie (naar Doohoo en Leslie, 1991).

Prevalentie 40% Prevalentie 5%

Grenswaarde Sensitiviteit Specificiteit PVW NVW PVW NVW

200000 0,726 0,855 77 82 21 98

225000 0,63 0,932 86 79 33 98

250000 0,547 0,692 91 79 43 97

Het celgetal wordt evenwel beïnvloed door het lactatiestadium. Meteen na de partus is het celgetal

hoog, waarna het snel weer daalt naar een normaal niveau binnen de 4-5 dagen. Daalt het echter niet,

dan kan het kwartiercelgetal gebruikt worden om een vroege postpartum infectie aan te tonen. Naar

het einde van de lactatie toe zal het celgetal weer lichtjes stijgen (Pyörälä, 2003). Naarmate de koeien

ouder worden, stijgt hun celgetal. Hun celgetal neemt toe met gemiddeld 100.000 cellen/ml per

lactatie. Ook de melkfrequentie beïnvloedt het celgetal. Een verandering van twee keer melken naar

drie keer melken op een dag, heeft een daling van de proportie koeien met een hoog celgetal tot

gevolg. Langs de andere kant doet een kort interval van minder dan 4 uur het celgetal weer

toenemen. Tot slot is het belangrijk om steeds op hetzelfde moment van de dag stalen te nemen. Het

celgetal is het hoogst 1-3 uur na het melken en neemt vervolgens af tot de volgende melking. Het is

gerapporteerd dat staalnamen in de namiddag dubbel zo hoog zijn als staalnamen in de voormiddag

(Reneau, 1985). In een studie werd vastgesteld dat het gemiddeld celgetal van bacteriologisch

negatieve kwartieren 68.000 cellen/ml is, voor kwartieren geïnfecteerd met minor pathogenen ligt dit

tussen de 110.000 cellen/ml en de 150.000 cellen/ml en voor kwartieren geïnfecteerd met major

pathogenen stijgt dit boven de 350.000 cellen/ml. Het hoogst gemiddelde celgetal wordt gevonden bij

coliformen en Streptococcus uberis (meer dan 1 miljoen cellen/ml) en het laagste celgetal wordt

aangetroffen bij corynebacteriën (105.000 cellen/ml) (Pyörälä, 2003). Het kwartier- en koecelgetal zijn

afhankelijk van de inflammatoire status van de melkklier, daar waar het tankmelkcelgetal ook in zekere

mate gerelateerd is met het inflammatoire proces van de individuele koeien, maar nog meer een maat

is voor de gezondheid van de uiers en de rauwe melkkwaliteit van de volledige veestapel (= op

bedrijfsniveau) (Schukken et al., 2003). Het feit dat S. aureus niet steeds in contact komt met het

immuunsysteem door zich te verbergen in de neutrofielen kan resulteren in een cyclisch verloop van

het celgetal (Biggs, 2009).

Een andere test, de California Mastitis Test (CMT), blijft een goede screeningstest voor het snel,

eenvoudig en goedkoop vaststellen van subklinische mastitis en kan eenvoudig “onside” gebruikt

worden (Fig. 7). Verse, ongekoelde melk kan tot 12 uur en gekoelde tot 36 uur na de staalname

15

gebruikt worden (Ruegg en Reinemann, 2002). De test is

gebaseerd op het principe dat door toevoegen van een detergent

(Bromocresol) aan een melkstaal met een hoog celgetal het

detergent de cellen zal lyseren waardoor nucleïnezuren en

andere constituenten vrijkomen wat zal leiden tot de vorming van

een gelachtige consistentie van het staal (Viguier et al., 2009).

De CMT reactie moet binnen de 15 seconden afgelezen worden

aangezien een zwakke reactie zal verdwijnen na die tijd. Een

nadeel van deze test is dat de reactie pas duidelijk wordt

wanneer het celgetal zich boven de 400.000 cellen/ml bevindt

(Blowey en Edmondson, 2010).

Er zijn een hele reeks parameters die een indicatie kunnen geven over het al dan niet voorkomen van

mastitis en die gedurende het melken bepaald kunnen worden. Veranderingen in melktemperatuur,

dieractiviteit, dagelijkse melkhoeveelheid en de elektrische conductiviteit (EC) van de melk kunnen

gemeten worden, gebruikmakende van verschillende melksystemen. De EC is een maatstaf voor de

weerstand van de melk door een elektrische stroom. De eenheid voor conductiviteit is millisiemens per

centimeter (mS/cm). De EC in melk wordt bepaald door de concentratie van kationen en anionen en

dan voornamelijk door natrium (Na), kalium (K) en chloor (Cl). De melk van een niet-geïnfecteerde koe

varieert tussen 4.0 en 5.5 mS/cm bij 25°C (Norberg et al., 2004) (Fig. 8). Door de toegenomen

permeabiliteit van de bloedcapillairen en de beschadiging van ‘tight junctions’ en de actieve

ionenpomp zal de concentratie van lactose en K dalen en de concentratie van Na en Cl stijgen in de

melk gedurende een ontsteking waardoor de geleidbaarheid stijgt. De temperatuur van de melk, het

lactatiestadium, het vetpercentage, het melkinterval en het ras kunnen ook een invloed hebben op de

geleidbaarheid waardoor de diagnostische waarde achteruit gaat. Voor zowel de detectie van

klinische als subklinische mastitis is de EC meting geen goede screeningstest. Van de 100 positieve

testen zullen er maar 58 werkelijk mastitis hebben (lage PVW) en 15-30% van de negatieve testen

zullen wel mastitis hebben (lage NVW) (Ruegg en Reinemann, 2002). Wanneer men deze test

evenwel gebruikt om kwartieren binnen eenzelfde koe te vergelijken, neemt de sensitiviteit toe van

57% naar 68% en de specificiteit van 91% naar 96%. De gedachtegang hierachter is dat de niet door

mastitis veroorzaakte variatie in de EC voor alle kwartieren dezelfde is (Ruegg en Reinemann, 2002).

In hoofdzaak zijn er 2 systemen op de markt. Het eerste systeem meet de EC van de volledige melk

van 1 koe waarbij de sensor zich in de elektronische melkmeter bevindt. Bij het tweede systeem

waarbij de sensors zich in de melkklauw bevinden bij traditionele melksystemen of in de lange

melkslang bij automatisch melksystemen wordt de EC per kwartier gemeten (Hogeveen et al., 2010).

Er bestaan ook verschillende apparaten op de markt die je gemakkelijk in de hand kan houden om de

EC per kwartier te meten (Ruegg en Reinemann, 2002). De ontwikkeling van nieuwe analytische

methoden waaronder enzymatische assays, immunoassays, biosensors en nucleïnezuurtesten zullen

in de toekomst meer en meer de conventionele methoden gaan vervangen. Met de vooruitgang in

proteomics en genomics zullen er nog meer biomerkers gevonden worden waardoor men in staat zal

zijn om mastitis in een vroeger stadium vast te stellen (Viguier et al., 2009).

Fig. 7: Een positive California

Mastitis Test

(uit Blowey en Edmondson,

2010).

Fig. 8: Elektrische conductiviteit (EC) profielen (in milisiemens) voor alle 4 kwartieren van een gezonde koe (a) en voor de 4 kwartieren van een koe met klinische mastitis (b). De dikke

lijn vertegenwoordigt het EC profiel van het geïnfecteerde kwartier (naar Norberg et al., 2004).

17

3.4. BEHANDELING

De behandeling van mastitis kan op twee verschillende tijdstippen in de lactatiecyclus van de koe

gebeuren. Ofwel gebeurt de behandeling tijdens de lactatie ofwel tijdens de droogstand. Ook de wijze

van behandelen kan verschillen. Dit kan zowel intramammair als parenteraal. Intramammaire

preparaten worden als enkelvoudige therapie of als gecombineerde therapie samen met een

parenterale behandeling gebruikt voor de behandeling van klinische mastitis tijdens de lactatie of voor

het behandelen van subklinische infecties op het einde van de lactatie en voor het voorkomen van het

ontstaan van nieuwe infecties tijdens de droogstand. Het intramammair inbrengen van antibiotica moet

zorgvuldig gebeuren. Alvorens de top van de uiertube doorheen het slotgat ingebracht wordt, moet de

top van de speen ontsmet worden met ontsmettende vloeistof (bvb alcohol). Zo worden er geen

pathogenen (vb bacteriën, schimmels, gisten,…) van de gecontamineerde tepel door middel van de

tube in het tepelkanaal ingebracht. Na het inbrengen van de tube worden de antibiotica naar de

uiercysterne gemasseerd door met de ene hand de tepel onderaan af te klemmen en met de andere

hand over de tepel naar boven te duwen. Na het inbrengen wordt aangeraden om de tepels te dippen

aangezien het tepelkanaal door de manipulatie wat open staat en er zodoende makkelijker

pathogenen kunnen binnen treden. Afhankelijk van het product moet de behandeling 1, 2 of 3 dagen

met een interval van 12 of 24 uur herhaald worden (Blowey en Edmondson, 2010). Tubes voor de

droogstand bezitten formulaties met het oog op een zo lang mogelijk werkzame

antibioticaconcentratie. Dit wordt verkregen door het gebruik van ofwel hogere concentraties ofwel van

het benzathine zout van de actieve stof in een olieoplossing.

Het doel van het droogzetten van de koeien met een langwerkend intramammair antibioticum is

enerzijds het genezen van bestaande subklinische infecties en anderzijds het voorkomen van nieuwe

infecties die opgelopen kunnen worden in de vroege droogstandsperiode (Arruda et al., 2013).

Preparaten gebruikt bij lacterende koeien moeten snel geëlimineerd worden uit de uier aangezien hier

de wachttijd een belangrijke rol speelt. Antibiotica die systemisch toegediend worden moeten aan een

aantal eisen voldoen. Zo moet de minimum inhibitorische concentratie (MIC) voor de meest

voorkomende mastitis-veroorzakende pathogenen laag zijn, moeten ze vetoplosbaar zijn, een lange

halfwaardetijd hebben om een concentratie boven de MIC gedurende het toedieningsinterval te

kunnen verzekeren en een korte wachttijd hebben. Enkele producten die hieraan voldoen zijn

procaïne benzylpenicilline, trimethoprim-sulfadiazine en enrofloxacine (O’ Rourke en Baggot, 2004). In

een studie waarbij verschillende antibiotica getest werden voor de behandeling van S. aureus bleken

de genezingspercentages gelijkaardig (Fig. 9). Er werd echter vastgesteld dat er geen nieuwe infecties

met S. aureus optraden na een behandeling in het derde trimester van de dracht. Zodoende verlaagt

wachten met behandelen tot het derde trimester de kans dat nieuwe infecties zullen voorkomen nadat

de behandeling met antibiotica voltooid is. Een behandeling 60 tot 45 dagen voor de partus geeft

voldoende tijd om residuen te voorkomen na het kalven en verzekert dat een maximum aantal

infecties behandeld is. Het behandelen van vaarzen waarvan geweten is dat ze een risico lopen om S.

aureus te ontwikkelen is aangewezen, omdat het verwachte genezingspercentage veel hoger ligt dan

wanneer men de infecties zou behandelen tijdens de lactatie. Genezingspercentages van S. aureus

18

infecties in vaarzen overschrijden de 90% wanneer de behandeling uitgevoerd wordt voor de kalving,

terwijl genezingspercentages tijdens de lactatie rond de 50% liggen (Owens et al., 1993). Tevens is er

geen verlies van melk, is er een minimaal risico van antibioticaresiduen in de melk en is de

toekomstige melkproductie toegenomen in koeien die genezen zijn van S. aureus (Owens et al.,

1991).

Gerapporteerde genezingspercentages van S. aureus mastitis bij koeien variëren van 4 tot 92%. Dit is

toe te schrijven aan allerhande factoren. Om te beginnen spelen gastheerfactoren mee. De kans op

genezing daalt naarmate de pariteit hoger wordt, het celgetal toeneemt, er infectie van de

achterkwartieren is, het aantal positieve stalen voor de start van de behandeling en het aantal

kwartieren dat geïnfecteerd is. Met behulp van regressiemodellen kan men een voorspelling maken

van de waarschijnlijkheid van genezing. Deze informatie kan meespelen in de beslissing tot het al dan

niet overgaan tot een behandeling van de geïnfecteerde dieren. We vergelijken de twee uitersten. De

kans op genezing bij een koe met meerdere lactaties, die 150 dagen in lactatie is, geïnfecteerd is in

de achterste kwartieren en een celgetal van 2.000.000 cellen/ml heeft, bedraagt ongeveer 1%. Er

moet dan niet geadviseerd worden om deze koe nog te behandelen, maar er moet eerder geopteerd

worden om de koe op te ruimen of om het geïnfecteerde kwartier droog te zetten (Middleton en Fox,

2001). Daarentegen heeft een vaars die 220 dagen in lactatie is met een infectie in een voorkwartier

en een celgetal van 500.000 cellen/ml nog 61% kans op genezing. Hierbij is behandeling dus een

goede optie wanneer men ook in gedachte houdt dat de kosten voor het opfokken van deze vaars al

gemaakt zijn, maar de vaars nog niks opgebracht heeft.

Fig. 9: Genezingspercentage van S. aureus na behandeling voor ieder trimester van de dracht bij vaarzen (uit Owens et

al., 2001).

19

Een andere factor waar rekening mee moet gehouden worden is antibioticaresistentie. De keuze van

behandeling zou gebaseerd moeten zijn op basis van een gevoeligheidsbepaling. Gerapporteerde

resistentieniveaus lopen sterk uiteen tussen verschillende landen. In Denemarken en Finland varieert

dit tussen de 20-30% (De Oliveira et al., 2000), daar waar het in Ierland en Brazilië boven de 85%

komt (Costa et al., 2000). Klassen van antibiotica die gangbaar gebruikt worden voor de behandeling

van S. aureus zijn macroliden (erythromycin, spiramycin, tilmicosin) en lincosamiden (pirlimycin). In

een onderzoek naar de resistentie van de kiem werd er van de 116 onderzochte isolaten resistentie

gevonden bij 12 (10.3%) isolaten tegen tetracycline, 8 (7%) tegen penicilline, 6 (5.2%) tegen

ampicilline, 6 (5.2%) tegen erythromycine, 5 (4.3%) tegen pirlimycine, 3 (2.6%) tegen enrofloxacin, 2

(1.7%) tegen cephalothin, 2 (1.7%) tegen penicilline-novobiocine en 1 (0.9%) tegen sulfadimethoxine

(Fig. 10). Bij de stalen genomen van de klinische gevallen werd er geen resistentie vastgesteld voor

ceftiofur, cephalothine, oxacilline, penicilline-novobiocine of sulfadimethoxine. Bij de stalen genomen

van de subklinische gevallen werd er geen resistentie waargenomen bij ceftiofur, erythromycine of

oxaciline (Oliveira et al., 2012).

Fig. 10: Antibioticaresistentie tegen verschillende antibiotica (naar Oliveira et al., 2012).

Tussen verschillende formulaties met dezelfde actieve component kan de efficaciteit ook sterk

verschillen. Als voorbeeld kan penethamaat hydriodide, een zwakke basische estervorm van

penicilline G, aangehaald worden, welke in een hogere kans op genezing resulteerde dan penicilline

G zelf na een 4-dagen durende behandeling bij subklinische mastitis (68.8 vs. 56.5% genezing,

respectievelijk) (Barkema et al., 2006). Genezingspercentages van 6%, 56% en 86% worden

20

bekomen wanneer men de behandelingsduur laat variëren van geen behandeling tot 2 dagen of 8

dagen behandelen (Deluyker et al., 2005).

De voordelen van een langer gebruik van antibiotica zoals een hoger genezingspercentage, een

daling van het celgetal en een verminderd risico op verspreiding van de kiemen naar andere dieren

moeten opwegen tegen de kostprijs van de antibiotica, het verlies van melk, het toegenomen risico

van residuen en de mogelijkheid van het infecteren van de koe door het herhaaldelijk inbrengen van

uiertubes (Swinkels et al., 2005). De meeste antimicrobiële behandelingen worden door de veehouder

zelf intramammair toegediend. Toch kan het voor S. aureus aangeraden zijn om parenteraal te

behandelen. Een klinische trial bij 78 subklinisch geïnfecteerde koeien welke een intramammaire

behandeling met amoxicilline vergeleek met een combinatiebehandeling van amoxicilline

intramammair en penicilline G systemisch, toonde aan dat de combinatiebehandeling een 51%

genezingspercentage had, welke bijna twee keer zo hoog was als bij de enkelvoudige behandeling.

Beide groepen werden gedurende 6 melkbeurten in elk geïnfecteerd kwartier behandeld met een

commercieel product dat 62.5 mg amoxicilline bevatte. Daarnaast werd 1 van de 2 groepen nog

bijkomend voor 3 opeenvolgende dagen 1 keer per dag intramusculair behandeld met 9.000.000

eenheden procaïne penicilline G (Owens et al., 1988).

Verschillende experimentele S. aureus vaccins, alsook 1 commercieel vaccin, kunnen de

antilichaamtiters tegen de kiem doen toenemen en zo het aantal nieuwe infecties bij vaarzen doen

dalen. Op 4 en 2 weken voor het kalven werden vaarzen subcutaan geïnjecteerd in de

supramammaire lymfeknoop en na het kalven werden ze in contact gebracht met S. aureus. Nieuwe

infecties werden bij gevaccineerde dieren voor 52% gereduceerd. Daarnaast kreeg 64% van de

controledieren chronische mastitis vergeleken met maar 12% bij de gevaccineerde koeien (Nickerson,

2012). Verder onderzoek is echter nog aangewezen.

21

3.5. CONTROLE EN MANAGEMENT

In de jaren 60 van de vorige eeuw werd een 5-punten plan ontwikkeld om de prevalentie van

intramammaire infecties te reduceren. Later werd dit plan uitgebreid tot een 10-punten plan (Barkema

et al., 2006) (Tabel 5).

Tabel 5: Tien puntenplan (naar National mastitis council).

Punt Doel

1 Een goede melktechniek Nieuwe infecties voorkomen

2 Een goed werkende melkmachine Nieuwe infecties voorkomen

3 Optimalisatie van het management van de droge koeien

Nieuwe infecties voorkomen en bestaande

infecties genezen

4 Zorgvuldige behandeling van klinische en subklinische

mastitis

Nieuwe infecties voorkomen en bestaande

infecties genezen

5 Opruimen van chronisch geïnfecteerde dieren

Nieuwe infecties voorkomen en bestaande

infecties genezen

6 Optimalisatie van comfort, hygiëne en stalbouw Nieuwe infecties voorkomen

7 Het maandelijks opvolgen van de uiergezondheid

Nieuwe infecties voorkomen en bestaande

infecties genezen

8 Stel een goede doelstelling op voor uiergezondheid

Nieuwe infecties voorkomen en bestaande

infecties genezen

9 Fok- en aanschaffingsbeleid Nieuwe infecties voorkomen

10 Voldoende aandacht aan de huisvesting en hygiëne van de

vaarzen Nieuwe infecties voorkomen

De kans op infectie lijkt hoofdzakelijk beïnvloed te worden door managementfactoren. Punten 1 en 2

zijn kritische controlepunten voor het verlagen van de incidentie van S. aureus. De melkmachine is

een belangrijke component in de preventie van mastitis. Het is van groot belang dat deze optimaal

werkt. Een jaarlijkse controle door de leverancier is dan ook meer dan nodig. Hoewel algemene

richtlijnen gegeven kunnen worden, is het voor iedere veehouder aan te raden om deze te

personaliseren en zijn manier van werken te standaardiseren en te formuleren in een protocol.

Uit onderzoek bleek dat gestresseerde dieren vatbaarder zijn voor ziekten en dat stress meer

gevonden wordt op melkveebedrijven met een hoge incidentie van mastitis dan op vergelijkbare

melkveebedrijven met een lage incidentie aan mastitis (Holtenius et al., 2004). Een belangrijke factor

voor stress kan de mens-dier relatie zijn (De Passille en Rushen, 1999). Deze verhouding wordt ook

geassocieerd met de melkhoeveelheid, het niet of onvoldoende leegmelken en de algemene

gezondheid van de koeien (Waiblinger et al., 2002). Rushen et al. (2001) vonden meer onrust, een

hogere frequentie van de hartslag en het slecht leegmelken van koeien in de aanwezigheid van

mensen die hen in het verleden slecht behandeld hadden. Het cortisolgehalte was lager in de melk

22

van vaarzen na een positieve behandeling, wat erop wees dat ze minder stress hadden ervaren

(Hemsworth et al., 1989). Het positief behandelen van koeien kan de stress reduceren tijdens het

melken en zo de negatieve effecten van stress op het immuunsysteem vermijden. Daarnaast kan

stress beperkt worden door de psychologische effecten van positieve tactiele stimulatie, welke

daarmee direct de immuunfuncties en zelfgenezing ondersteunen (Waiblinger et al., 2002) (Tabel 6).

Zodoende wordt er een lager celgetal en een lagere prevalentie van mastitis bereikt (Uvnas-Moberg et

al., 2001; Caroprese et al., 2006).

Tabel 6: Bestudeerde handelingen van melkers onderverdeeld in positieve, neutrale en negatieve interacties (naar

Waiblinger et al., 2002).

Interactie Handelingen

Positief Rustig praten, aanraken, liefkozen

Neutraal Dominant praten, zachte handelingen

Negatief Ongeduldig praten, roepen, harde handelingen

Voorstralen is aan te bevelen om op die manier de eerste melkstralen, die het meest beladen zijn met

bacteriën en ook een hoger celgetal hebben, te verwijderen. Het aanraken van de tepels zorgt er ook

voor dat de koeien vlotter zullen melken door een oxytocinefeedback. Tussen het aanraken van de

tepels en het aanhangen van het melkstel gaan bij voorkeur minstens 60 seconden voorbij om

blindmelken te voorkomen, met een kleinere kans tot beschadiging van het slotgat tot gevolg. Het

predippen van de tepels met een desinfectans zorgt voor de laagste bacteriële contaminatie van de

melk in vergelijking met andere genomen maatregels. Hoewel predippen vooral

omgevingsgerelateerde infecties reduceert, toonde een Canadese studie aan dat het ook

geassocieerd wordt met een lagere prevalentie en incidentie van S. aureus (Dufour et al., 2012). De

predip moet voor minstens 30 seconden in contact geweest zijn met de uier om effectief te zijn. Na het

predippen worden de tepels afgedroogd met wegwerpbare doekjes om het organisch vuil en het

desinfectans te verwijderen. Per koe wordt 1 doekje gebruikt waarbij er per tepel een proper deel van

het doekje gebruikt wordt.

Gedurende het melken zouden handschoenen gedragen moeten worden. Onderzoek in Nederland

toonde aan dat, wanneer de melker handschoenen draagt, de bacteriële contaminatie op zijn handen

voor 75% vermindert. Wanneer hij regelmatig zijn handschoenen zou desinfecteren, stijgt dit tot 98%

(Olde Riekerink et al., 2008). De odds voor het elimineren van de infectie ligt 2.2 keer hoger in

melkveebedrijven waar de melker handschoenen draagt (Dufour et al., 2012).

De aanbevolen volgorde van de voorbereiding is voorstralen-predippen-drogen-aanhangen van het

melkstel. Na de afname van de melkklauw, al dan niet automatisch, is het aanbevolen om de tepels

opnieuw te dippen. Het dippen van de tepels krijgt de voorkeur t.o.v. sprayen omdat eerstgenoemde

een betere dekking toelaat en er minder dipmiddel verbruikt wordt en dus minder duur is. Het is

belangrijk om volledig rondom rond en minstens tweederde van de tepel die in contact komt met de

melkcluster te dippen teneinde de melkfilm af te breken, de besmetting van de tepelhuid te reduceren

23

Tabel 7: Risicofactoren en hun controle specifiek voor S. aureus (naar Biggs, 2009).

Risicofactoren Controle

Aankoop geïnfecteerde dieren Gesloten bedrijf

Verkeerd gebruik van tepeldip na het melken

(onvolledig dippen, verkeerde verdunning,

slechte kwaliteit dipmiddel)

Optimaliseer het dippen na het melken

Geen gebruik van handschoenen, meerdere

koeien voorbehandelen met hetzelfde doekje

Goede hygiëne en voorbehandeling

Slechte diagnose van klinische mastitis

Verhoog de diagnose door staalnames

Slechte behandelingsprocedure en registratie

van klinische mastitis

Verhoog het succes van behandeling door

gebruik van een aangepaste therapie

Slecht afgestelde melkmachine

Controle door firma

Slecht onderhoud van melkmachine

Vervang rubbers tijdig, optimaliseer

schoonmaakproces

Verkeerd toegepaste droogstandstherapie

Behandel elk dier.

Kies voor een tube met een werkingsduur die Inadequaat opruimen van geïnfecteerde

koeien of oude koeien met een hoog celgetal

Ruim koeien met een hoog celgetal op basis

van betrouwbare bronnen tijdig op

Transmissie van koe naar koe via de melkklauw

Gebruik aparte melkklauw voor

mastitiskoeien

Melk mastitis koeien als laatste

Diagnosticeer infecties vroegtijdig

Manuele of automatische

melkklauwdesinfectie

en de gezondheid van de tepelhuid te optimaliseren. Dit is zeker belangrijk voor pathogenen zoals S.

aureus die de tepelhuid koloniseren (Blowey en Edmondson, 2010).

Risicofactoren en hun controle specifiek voor S. aureus worden voorgesteld in volgende tabel (Tabel

7).

24

3.6. ECONOMISCHE IMPACT

De kosten van mastitis zijn toe te schrijven aan het verlies in melkproductie, het vroegtijdig opruimen,

het toegenomen werk, het management en de dierenartskosten, het gebruik van antibiotica en het

risico op residuen en de productie van niet verkoopbare melk (Huijps et al., 2009). Recentelijke

schattingen van de economische verliezen door klinische mastitis variëren van €61 tot €97 per

gemiddelde koe op een bedrijf per jaar. Bijkomende verliezen in melkproductie door subklinische

mastitis werden geschat op €13 per gemiddelde koe op het bedrijf per jaar. Deze verliezen liggen in

het verlengde van de geschatte verliezen door kreupelheid (€75/jaar/koe) (Bruijnis et al., 2010) en

vruchtbaarheidsproblemen (€88/koe/jaar) (Inchaisri et al. 2010). Een schatting van de verliezen aan

inkomsten die vermeden zouden kunnen worden, is belangrijk voor het plannen van bijkomende

preventieve maatregelen.

Niet alle mogelijke maatregels die productieverliezen ten gevolge van mastitis verminderen, wegen op

tegen de kosten. Vooral diegene die veel arbeid en een grote investering met zich meebrengen,

overtreffen vaak de verminderde verliezen niet. Maatregelen die een netto voordeel opbrengen zijn in

dalende volgorde, een goede droogstandstherapie, het laten rechtstaan van koeien na het melken, het

reinigen van de melkclusters na het melken van koeien met mastitis, een goed behandelingsprotocol,

het wassen van vuile uiers en het dragen van handschoenen tijdens het melken (Hogeveen et al.,

2011).

25

I. MATERIAAL EN METHODEN

Voor dit onderzoek werd een West-Vlaams melkveebedrijf gedurende een jaar opgevolgd welke deel

uitmaakt van de bedrijfsbegeleiding van de Faculteit Diergeneeskunde van de Universiteit Gent. Het

bedrijf telde over dit jaar een gemiddelde van 119 lacterende Holstein koeien. De gegevens voor de

analyse werden uit de melkproductieregistratie gehaald welke om de 5 weken 11 keer per jaar werd

toegepast. Gedurende de periode oktober-januari werden uit de melkattentielijsten van de MPR

koeien geselecteerd op basis van hun celgetal die in aanmerking kwamen voor melkstaalnamen.

1. STAALNAME

Gedurende de periode oktober-januari werden er tijdens de 5 wekelijkse bedrijfsbegeleiding stalen

verzameld volgens onderstaand protocol. Tijdens deze periode werden er bij 21 verschillende koeien

stalen genomen. Enkelen hiervan werden meerdere opeenvolgende maanden bemonsterd. Zo

werden er 132 stalen verzameld.

� STAALNAME PROTOCOL:

- De spenen werden met afzonderlijke droge doekjes gereinigd om het grootste deel van het

vuil te verwijderen.

- Vervolgens werden de eerste stralen weggemolken.

- De speentoppen werden daarna met alcoholdoekjes gedesinfecteerd. Hierbij moet opgepast

worden dat men niet opnieuw in aanraking komt met de net ontsmette speentoppen en

zodoende de speentoppen weer herbesmet. Daarom past men best de volgorde linksachter-

linksvoor-rechtsachter-rechtsvoor toe wanneer men zich aan de rechterzijde van de koe stelt.

Men past deze volgorde omgekeerd toe wanneer men zich aan de linkerzijde stelt.

- Men klemt de dop tussen handpalm en pink van de hand waarmee men niet zal melken. Na

het openen van het recipiënt wordt deze onmiddellijk omgedraaid zodat er geen contaminatie

vanuit de omgeving mogelijk is. Slechts wanneer er een straal melk gemolken wordt, keert

men het melkbuisje om. In tegenstelling tot bij het ontsmetten van de spenen neemt men nu

om dezelfde reden eerst de stalen van de dichtstbijzijnde tepels. Men houdt het buisje wat

schuin zodat de kans kleiner is dat er vuil kan invallen.

- Elk buisje wordt vervolgens op de juiste plaats gestoken in de doos. Identificatie van de stalen

is vanzelfsprekend belangrijk.

- Na de staalnamen werden de tepels gedipt om infectie van de openstaande slotgaten te

voorkomen.

26

2. ONDERZOEK VAN DE STALEN

De stalen werden dezelfde dag nog verwerkt in het laboratorium op de Faculteit Diergeneeskunde in

Merelbeke. Met behulp van een entoog werd 10 µl van elk melkstaal geënt op een MacConkey en op

een Aesculine bloed-agar plaat. Vervolgens werden ze gedurende 24 uur onder aerobe

omstandigheden bij een temperatuur van 37°C in een broedstoof geïncubeerd. Op basis van

eventuele groei op één van de platen kon men al een eerste onderscheid maken tussen Gram-

positieve of Gram-negatieve kiemen (Fig. 11). Omdat dit onderzoek zich vooral focust op S. aureus

wordt er verder enkel op Gram-positieve ingegaan. Wanneer er meer dan 3 fenotypisch verschillende

kolonies aanwezig waren werd het staal al polybacterieel beschouwd. Door middel van de katalase

test kan een onderscheid gemaakt worden tussen streptokokken (katalase negatief) en stafylokokken

(katalase positief). Bij deze test voegt men een 3% waterstofperoxide oplossing toe aan een kolonie

op een apart draagglaasje. Katalase-positieve kolonies vormen zuurstof waardoor er gasbelletjes

ontstaan. Voor de ‘Coagulase tube test’ worden er enkele kolonies toegevoegd aan 0.5ml

konijnenplasma waarna er geïncubeerd wordt aan 37°C . Deze test kan al afgelezen worden na 2-4uur

maar kan ook tot 24uur duren. Wanneer er stolling is van het plasma is de test positief. Bij de DNase

test wordt er een entstreep van de kolonie getrokken op een agarplaat die DNA bevat. Na een

incubatie van 24uur bij 37°C zal er bij DNAse posit ieve bacteriën een heldere zone ontstaan zijn rond

de entstreep. Deze moet minsten 4x de breedte van de entstreep hebben om positief te zijn. Wanneer

men hemolyse kon zien rond de entstrepen op een bloedagar en polymyxineresistentie werd

vastgesteld kon men tot slot een onderscheid maken tussen S. intermedius en S. aureus waarbij

laatstgenoemde twee keer positief uit de test kwam. Vervolgens werd er nog een antibiogram

aangelegd voor de afzonderlijke kiemen.

Figuur 11: Diagram interpretatie bacteriologisch onderzoek Gram-positieve bacteriën.

28

Figuur 12: De stal met de hoogproductieve koeien.

II. RESULTATEN

1. ALGEMENE BEDRIJFSGEGEVENS

In de periode van 1 september 2012 tot en met 31 augustus 2013 telde het bedrijf gemiddeld 119

zwartbonte Holstein Friesian koeien. Hiermee is de bedrijfsomvang groter dan het provinciaal

gemiddelde van 52 koeien op melkveebedrijven in West-Vlaanderen. Met een 365-dagen productie

van 9385 liter melk produceren ze een kleine 1000 liter meer dan de gemiddelde West-Vlaamse

melkveehouders. Het percentage dieren met een verhoogd celgetal valt met 18% tussen de

grenswaarde en de streefwaarde (streefwaarde: <15%; grenswaarde: >20%). Het percentage nieuwe

dieren met een verhoogd celgetal per maand ligt juist op de grens van 10%. De verwachte

tussenkalftijd gedurende het voorbije jaar bedraagt 404 dagen, terwijl het landelijk gemiddelde op 427

dagen uitkomt. Het melkveebedrijf bestaat uit een oud en een nieuwer gedeelte. De hoogproductieve

dieren worden gehouden in de nieuwe stal waar er veel licht is en de ventilatie optimaal is (Fig.12). De

laagproductieve dieren en de koeien met mastitis worden gehouden in de oude stal waar het donker is

en het dak veel lager is. Daarnaast staat het jongvee ook afgescheiden gehuisvest in de oude stal. In

beide stallen zijn ligbedden met matrassen aanwezig. Een kleine overbezetting is momenteel aan de

orde, maar met uitbreidingsplannen in het vooruitzicht wordt dit in de nabije toekomst verholpen. In het

nieuwe gedeelte, waar er meer ruimte is, zijn de ligboxen groter dan in het oude gedeelte. Door te

korte ligboxen in de oude stal komen er daar meer dieren met dikke hakken voor. De droge koeien

worden in een strobox gehuisvest. De kalveren worden individueel gehuisvest in een aparte stal. Melk

van behandelde dieren wordt aan de kalveren gevoederd.

29

Figuur 14: Spenen net na het dippen.

Figuur 13: De Laval 2x14 met rapid-exit.

2. MELKMANAGEMENT

De melkmachine van het type De Laval bestaat uit

een 2x10 zij-aan-zij melkstanden met rapid-exit welke

met het oog op uitbreiding van het bedrijf al is

voorzien om uitgebouwd te worden tot 2x14

melkstanden (Fig. 13). De koeien stromen vlot door

vanaf de wachtruimte naar hun plaats in de

melkstand. Één keer per jaar wordt er een statische

meting gedaan door het melkcontrolecentrum

Vlaanderen (MCC Vlaanderen). Op jaarbasis worden

de rubberen tepelvoeringen eenmalig vervangen. De

verdeling van de melkkoeien bestaat uit 2 groepen.

Nadat men de hoogproductieve koeien gemolken

heeft, komen de laagproductieve en de mastitiskoeien

aan de beurt. Met behulp van droge wegwerpdoekjes worden de tepels gereinigd. Gemiddeld worden

hierbij 4 doekjes gebruikt per 10 koeien. Als opmerking hierbij moet gezegd worden dat de uiers er

zeer proper uitzien. Na het reinigen straalt men enkele keren voor. Dit gebeurt niet in een

voorstraalbeker maar rechtstreeks op de grond. Tussen het voorbehandelen en het aanhangen van

het melkstel werd na verschillende metingen een gemiddelde van 71 seconden vastgesteld.

Gedurende deze handelingen maakt men geen gebruik van wegwerpbare handschoenen. De uiers

worden gecontroleerd of ze volledig zijn leeggemolken alvorens de automatische afname van de

melkklauwen wordt ingesteld. Als dipmiddel na het melken maakt men gebruik van Risorsa® Barrier

(Fig. 14). Koeien met klinische/subklinische mastitis of koeien die behandeld zijn met antibiotica

worden gemolken in een aparte melkkan. Na afname wordt het melkstel ondergedompeld in een

emmer met warm water welke van voor het melkproces is klaar gezet. Door de rapid-exit gaan de

koeien vlot uit de melkstand. De koeien worden niet verplicht om recht te staan na het melken. Toch

gaat er enige tijd over alvorens de koeien de stal bereikt hebben en kunnen gaan liggen. Het melken

van de 105 koeien duurt anderhalf uur.

Koeien worden gedurende 6-8 weken drooggezet. Wanneer

het celgetal gedurende de lactatie niet boven de 150.000

cellen/ml geweest is, worden de koeien zonder antibiotica

drooggezet maar wordt wel een inwendige speenafsluiter

(Orbeseal®) toegepast. Overschrijdt het celgetal eenmalig

deze grens, dan injecteert men eerst een tube Ubrostar®

(penicilline+neomycine) alvorens de Orbeseal® toe te

passen. Voor de behandeling van klinische mastitis maakt

men gebruik van Cefocet LC® (Cefalosporines).

30

Figuur 15: Celgetal op bedrijfsniveau ( : Officiële grens; : aanvaardbaar; : streefwaarde)

3. ANALYSE MPR

Hierna volgt de bespreking van het verloop van de uiergezondheid vanaf maart 2013 tot maart 2014.

Dit jaar werd onderverdeeld in 10 fasen (Fig. 15). Koeien werden als verhoogd in celgetal beschouwd

vanaf 250.000 cellen/ml. Bij vaarzen vanaf 150.000 cellen/ml.

Fase 1: In vergelijking met de maand februari is het celgetal in maart verdubbeld. Deze stijging is

vooral te wijten aan een toename van het celgetal bij de oudere koeien (Fig. 16). Bij deze groep stijgt

het celgetal van 194.000 cellen/ml naar 461.000 cellen/ml. Van de 8 koeien die op dat moment onder

de 50 dagen in lactatie zijn hebben er 4 een laag en de overige 4 een hoog celgetal. De groep met

een verhoogd celgetal bestaat uit 3 nieuw verhoogde en 1 chronisch verhoogde. Wanneer we deze in

celgetal nieuw verhoogde dieren de volgende maanden blijven opvolgen wordt er bij één van hen,

voor de aanvang van de staalnames voor dit onderzoek, S. aureus vastgesteld in de maand augustus.

Echter werd er geen S. aureus meer vastgesteld nadat er van dit dier in de maanden november en

december stalen werden genomen. Momenteel is dit dier nog steeds verhoogd. Een tweede koe bleef

de volgende maanden hoog in celgetal en werd opgeruimd in augustus. De laatste koe bleef in de

maand april nog hoog, maar hield de maanden daarna een laag celgetal aan.

Fase 2: In de maand april blijft het bedrijfscelgetal uit de MPR-uitslag stabiel. Van de 3 koeien die

onder de 50 dagen in lactatie zijn, is er 1 koe die een nieuwe infectie opgelopen heeft kort na het

kalven. In januari 2014 wordt uit het rechter achterkwartier bij deze koe S. aureus geïsoleerd.

Fase 3: Het bedrijfscelgetal stijgt voor de eerste keer boven de boetegrens tijdens juni. Echter moet

het geometrisch gemiddelde van het tankcelgetal de laatste 3 maanden boven deze grens zijn

alvorens men werkelijk een boete moet betalen. Men heeft 20 nieuwe dieren die een verhoogd

celgetal hebben. Dit is evenveel als de voorgaande maanden samen (Fig. 22). Van de 4 vaarzen die

�

�

�

�

�

�

�

�

31

nog niet lang geleden afgekalfd zijn, hebben er 2 een verhoogd celgetal. Geen enkele koe heeft een

nieuwe infectie opgelopen kort na het afkalven (Fig. 23). De 8 koeien met chronische mastitis in de

maand april vallen terug naar 5 in de maand juni. Van deze dieren blijken er 3 opgeruimd te zijn.

Fase 4: Tijdens de maand augustus daalt het bedrijfscelgetal naar een gelijkaardig niveau als de

maanden maart en april. Er zijn 20 dieren met een verhoogd celgetal (Fig. 21). Hiervan zijn er 4 met

een verhoogd celgetal kort na het afkalven waarvan er 2 vaarzen en 2 koeien zijn (Fig. 23 en 24). Het

aantal nieuwe gevallen bedraagt nog de helft van vorige maand. Deze daling is vooral in de groep van

de koeien. In deze maand wordt er ook een chronisch geïnfecteerde koe opgeruimd en wordt een

andere drooggezet. Toch stijgt het aantal chronische gevallen door een toename van het aantal

vaarzen die langdurig verhoogd zijn. Samengevat kan gesteld worden dat de daling in bedrijfscelgetal

deze maand waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een daling van het aantal nieuwe gevallen en een

stijging van het aantal genezen dieren (9%=>33%) (Fig. 17).

Fase 5: Het bedrijfscelgetal kent opnieuw een stijging in de maand september. Overigens neemt het

aantal dieren met een verhoogd celgetal verder toe tot 27. Het percentage nieuwe infecties over de

droogstand en het aandeel koeien met een verhoogd celgetal na afkalven piekt deze maand (Fig. 25).

Opnieuw zijn er 3 koeien en 2 vaarzen die kort na het afkalven een verhoogd celgetal hebben. Deze 3

koeien zijn chronisch geïnfecteerde dieren die reeds in de vorige lactatie meermaals een verhoogd

celgetal hadden en welke niet genezen zijn doorheen de droogstand. Het percentage genezen dieren

over de droogstand daalt vervolgens ook van 100% in augustus naar 25% in september (Fig. 26).

Fase 6: Vanaf oktober daalt het celgetal opmerkelijk waarna het laag blijft. Het aantal dieren met een

verhoogd celgetal daalt van 27 in september naar 14 in oktober. Deze daling is vooral te merken bij de

vaarzen. Het aantal nieuwe gevallen daalt van 16 in september naar 3 in oktober. Het percentage

genezen dieren tijdens lactatie stijgt van 25% in september (n=27) naar 44% (n=14) in oktober. Ook

het percentage genezen dieren tijdens de droogstand stijgt weer van 25% naar 100%. Het procent

koeien en vaarzen met een verhoogd celgetal na afkalven valt terug op 0% die maand. 3 dieren

komen in de droogstand (2 vaarzen en 1 koe). Een van de vaarzen was al 7 keer verhoogd en had

een celgetal van 2.382.000 cellen/ml. De koe had een celgetal van 1.043.000 cellen/ml en was

eveneens 7 keer verhoogd. Daarnaast werden er ook nog 3 koeien opgeruimd waarvan 2 dieren met

een chronisch verhoogd celgetal. De stijging in celgetal was echter beperkt waardoor ook hun bijdrage

tot het bedrijfscelgetal beperkt bleef.

Fase 7: Gedurende de maand november wordt het laagste bedrijfscelgetal bereikt. Deze verdere

daling is toe te schrijven aan een halvering van het celgetal bij de koeien en de 2de kalfskoeien. Vier

dieren uit de verhoogde groep van de maand oktober werden drooggezet en 5 dieren zijn genezen.

Deze groep dieren had vorige maand een gemiddeld celgetal van 1.715.000 cellen/ml. Het percentage

genezen dieren tijdens lactatie en genezen dieren over de droogstand blijft deze maand hoog. Men

heeft 1 vaars die geïnfecteerd geraakt kort na het afkalven.

32

Fase 8: In de maand december stijgt het bedrijfscelgetal weer maar deze blijft net onder de grens van

de streefwaarde. Deze stijging vindt vooral plaats in de groep van de koeien. Net zoals het

bedrijfscelgetal stijgt het aantal dieren met een verhoogd celgetal en het aantal nieuwe dieren met een

verhoogd celgetal. Van de dieren die verhoogd waren in celgetal vorige maand wordt er 1 koe

opgeruimd en 1 koe wordt drooggezet. Het genezingspercentage tijdens lactatie daalt licht. Het aantal

dieren met chronisch verhoogd celgetal blijft stabiel (n=5).

Fase 9: In de maand januari overschrijdt het bedrijfscelgetal de streefwaarde van 200.000 cellen/ml.

Deze stijging is voornamelijk te wijten aan een stijging van het celgetal bij de vaarzen. Het celgetal bij

de koeien is gedaald. Het percentage vaarzen met een verhoogd celgetal na afkalven neemt toe van

0% (n=5) naar 25% (n=7). Ook het percentage genezen dieren daalt verder. Een koe die al 4x

verhoogd was en een celgetal had van 8.136.000 cellen/ml werd opgeruimd. Geen enkel dier met een

verhoogd celgetal werd drooggezet.

Fase 10: Tijdens de maand maart is er een kleine daling van het bedrijfscelgetal. Deze daling ontstaat

door een verminderd celgetal bij de vaarzen. Deze daling is te verklaren doordat 3 van de in totaal 4

genezen dieren vaarzen zijn. De andere groepen blijven zo goed als stabiel. Eén chronisch in celgetal

verhoogde koe wordt opgeruimd en 1 nieuw in celgetal verhoogde koe komt in de droogstand. Het

percentage nieuwe infecties over de droogstand en het percentage koeien met een verhoogd celgetal

na afkalven neemt na vijf maand weer toe.

Figuur 16: Weergave celgetal volgens pariteit.

33

Figuur 17: Weergave maandelijks percentage genezen dieren tijdens lactatie.

Figuur 18: Weergave maandelijks percentage dieren met een verhoogd celgetal na afkalven.

34

Figuur 19: Weergave maandelijks percentage van alle dieren met een verhoogd celgetal ( : grenswaarde; : streefwaarde).

Figuur 20: Weergave maandelijks percentage van alle dieren met een nieuw verhoogd celgetal ( : grenswaarde).

Figuur 21: Maandelijkse weergave van het aantal dieren met een verhoogd celgetal.

Figuur 22: Maandelijkse weergave van het aantal dieren met een nieuw verhoogd celgetal.

Figuur 23: % koeien met een verhoogd celgetal na afkalven. Het getal boven de balk staat voor het aantal dieren dat zijn afgekalfd die maand.

Figuur 24: % vaarzen met een verhoogd celgetal na afkalven. Het getal boven de balk staat voor het aantal dieren dat zijn afgekalfd die maand.

Figuur 25: % nieuwe infecties over de droogstand.

Figuur 26: % genezen dieren over de droogstand.

37

4. ANALYSE VAN DE LABORESULTATEN

Uit de 132 stalen werd er 6 keer S. aureus geïsoleerd. In oktober testte er één staal positief. Deze koe

testte ook in de maanden november en december positief. Voordat de staalname van de

melkproductieregistratie (MPR) plaats vond in januari werd deze koe opgeruimd. In november testte er

nog een 2de koe eenmalig positief op S. aureus. Deze koe had de volgende maand wel nog een

verhoogd celgetal. In de maand december waren er 3 stalen positief. Naast de koe die opgeruimd

werd testten de andere 2 koeien in de maand januari negatief voor S. aureus waardoor er in januari

geen S. aureus meer werd vastgesteld. Beide waren in de maand januari nog verhoogd in celgetal.

Het is niet omdat de kiem niet geïsoleerd wordt dat de dieren genezen zijn. Omwille van het

intermitterend uitscheidend karakter van de kiem kan het zijn dat de dieren de maand erop wel nog

besmet waren maar de stalen vals negatief waren. Opvolging van deze dieren is dus aangewezen

Figuur 26: Weergave van de resultaten van het bacteriologisch onderzoek per maand.

38

Tabel 8: Weergave antibioticaresistentie van de genomen stalen.

Amp Oxa Peni Cef Tetra Tylo

S. aureus NVT Gevoelig Gevoelig Gevoelig NVT Gevoelig

Trueperella pyogenes NVT Gevoelig Gevoelig Intermediair NVT Gevoelig Streptococcus dysglactiae NVT Gevoelig Gevoelig Gevoelig NVT NVT

Esc. Pos. Kokken NVT Resistent Gevoelig Gevoelig NVT Gevoelig

Streptococcus uberis NVT Resistent Gevoelig Gevoelig NVT Resistent

E. Coli Gevoelig NVT NVT Gevoelig Gevoelig NVT

TMS Cef/Kan Ceph Naf/Pen/Strep Lin Neo

S. aureus NVT Gevoelig Gevoelig Gevoelig Gevoelig NVT

Trueperella pyogenes NVT Gevoelig NVT Gevoelig Gevoelig NVT Streptococcus dysglactiae NVT Gevoelig NVT Gevoelig Gevoelig NVT

Esc. Pos. Kokken NVT Gevoelig Gevoelig Gevoelig Resistent NVT

Streptococcus uberis NVT NVT Gevoelig Gevoelig Resistent NVT

E. Coli Gevoelig Gevoelig NVT Intermediair NVT Gevoelig

Resistentie bij de gevonden S. aureus stammen op het bedrijf werd er niet vastgesteld (Tabel 8). De

behandeling van klinische mastitis met Cefovet LC ®, zoals op het bedrijf gebruikt wordt, zou dus in

staat moeten zijn om de kiem af te doden. Echter, zoals hierboven al beschreven, hangt de kans op

genezing af van allerhande factoren. Voor elk dier moet individueel uitgemaakt worden of behandeling

wel nog (economisch) verantwoord is op basis van verschillende parameters, zoals de pariteit van het

dier, aantal geïnfecteerde kwartieren, aantal maanden met een verhoogd celgetal… Enkel voor

Trueperella pyogenes werd er een mindere gevoeligheid voor het gebruikte antibioticum

geconstateerd.

39

III. BESPREKING

Voor de aanvang van de analyse van de resultaten van de MPR en de staalnames was er een

vermoeden van de aanwezigheid van S. aureus op het bedrijf door het cyclisch verloop van het

bedrijfscelgetal. Ter illustratie kan het verloop van het bedrijfscelgetal tussen de maanden juni en

september aangehaald worden (Fig.15). Hierbij is het celgetal in de maand juni hoog, daalt het in

de maand augustus, waarna het weer naar hetzelfde niveau als in juni stijgt in de maand

september. De veronderstelling van de aanwezigheid van S. aureus werd bevestigd in de maand

oktober. Aangezien er geen gegevens voorhanden zijn over staalnames van de maanden

voordien kan het cyclisch patroon te wijten aan S. aureus moeilijk bekrachtigd worden. Wat wel

vaststaat, is dat de korte tussenkalftijd (TKT) ook een positieve invloed heeft op de

uiergezondheid (TKT=404dagen). Dit is te verklaren doordat dieren met een chronisch verhoogd

celgetal toch vrij snel opnieuw drachtig geraken en dus terug snel kunnen drooggezet worden. Dit

in combinatie met de goede genezingsresultaten van de behandelingen tijdens het droogzetten

zorgt ervoor dat het aantal dieren met een chronisch verhoogd celgetal min of meer onder

controle kan gehouden worden.

Hoewel de laatste maanden het bedrijfscelgetal niet meer boven de 250.000 cellen/ml is gekomen

zijn er toch enkele punten waar meer aandacht aan besteed kan worden om dit ook zo te houden.

De melkmachine, welke dagelijks twee keer in contact komt met de uiers, speelt een belangrijke

rol in de overdracht van koegebonden pathogenen zoals S. aureus. Regelmatige controle van een

goede werking van de melkmachine door het MCC-Vlaanderen is dan ook aan te raden. Dit kan

zowel door een statische meting of door een dynamische meting. Aangezien er op dit bedrijf S.

aureus voorkomt, wordt men aanbevolen om een dynamische meting te doen welke plaatsvindt

terwijl de koeien gemolken worden. Zo krijgt men een beter inzicht over de koeien waarmee men

te maken heeft en kan men de instellingen van de melkmachine op maat aanpassen aan hen.

Tepelvoeringen moeten bij maximaal 2500 melkbeurten vervangen worden. Voor dit bedrijf

zouden de tepelvoeringen best om de 3 maanden vervangen worden. Macroscopisch zien de

voeringen er dan nog zeer bruikbaar uit. Echter dienen kleine scheuren in de tepelvoeringen als

ideale ‘schuilplaats’ voor pathogenen, aangezien deze op die manier verscholen zitten en dus niet

afgedood en verwijderd worden door de reiniging. Overdracht van deze kiemen van een besmette

koe via het melkstel naar een andere koe kan op deze manier plaatsvinden tijdens het melken.

Het melkstel waarmee koeien met een verhoogd celgetal of klinische mastitis gemolken zijn

geweest moet gereinigd worden met warm water van boven de 75°C. Het enkele malen hervullen

van een emmer met warm water die voor meerdere dieren wordt gebruikt volstaat niet om

eventuele bacteriën af te doden na onderdompelen van het melkstel. Gebruik maken van tape in

verschillende kleuren geeft een duidelijk overzicht van de subklinische en de klinische gevallen

waardoor vergissingen vermeden worden. Wegwerpbare handschoenen dragen tijdens het

melken is een goedkope maatregel met een grote impact. Handen bezitten een ruw oppervlak dat

moeilijk te reinigen is en zodoende spelen ze een rol in de overdracht tussen verschillende koeien.

Ook al zijn de uiers proper, het is toch aangeraden om ten minste één droog of nat wegwerpbaar

40

doekje per dier te gebruiken waarbij er per speen steeds een proper deel van het doekje gebruikt

wordt. Het geven van mastitismelk aan kalveren wordt afgeraden. Wanneer S. aureus op het

bedrijf aanwezig is, wordt verspreiding op deze manier in de hand gewerkt. Kalveren kunnen op

deze manier drager worden van S. aureus in de mond. Wanneer ze vervolgens aan elkaars

spenen gaan zuigen kan er zo overdracht plaatsvinden. Bij het ontwikkelen van het

melkklierweefsel kan de jonge vaars dan mastitis krijgen. Dieren waarvan na staalname geweten

is dat ze S. aureus hebben worden best opgeruimd. Tot slot kan elke vorm van vliegenbestrijding

bijdragen tot een daling van de incidentie van mastitis ten gevolge van S. aureus.

41

REFERENTIELIJST

Aeberhardt K., Bruckmaier R., Blum J.W. (1997). Hochleistungskuhe in der Schweiz. Agrarforschung 4, 277–280.

Arruda A.G., Godden S., Rapnicki P., Gorden P., Timms L., Aly S.S., Lehenbauer T.W., Champagne J. (2013). Randomized noninferiority clinical trial evaluating 3 commercial dry cow preparations: cow health and performance in early lactation. Journal of Dairy Science 96, 6390-6399.

Barkema H.W., Schukken Y.H., Zadoks R.N. (2006). Invited review: The role of cow, pathogen, and treatment regimen in the therapeutig success of bovine Staphylococcus aureus mastitis. Journal of Dairy Science 89, 1877-1895.

Biggs A. (2009). Mastitis in cattle. The crowood press ltd. Ramsbury, p.12-48.

Blowey R., Edmondson P. (2010). Mastitis control in dairy herds. 2nd edition. CAB international, Oxforshire, p.266.

Brightling P., Mein G.A., Malmo J., Ryan D.P. (1998). Countdown downunder: farm guidelines for mastitis control. Dairy Research and Development Corporation, Melbourne, p.3.

Bruijnis M.R.N., Hogeveen H., Stassen E.N. (2010). Assessing economic consequences of foot disorders in dairy cattle using a dynamic stochastic simulation model. Journal of Dairy Science 93, 2419–32.

Burvenich C., Bannerman D.D., Lippolis J.D., Peelman L., Nonnecke B.J., Kehrli M.E. Jr., Paape M.J. (2007). Cumulative physiological events influence the inflammatory response of the bovine udder to Escherichia coli infections during the transition period. Journal of Dairy Science 90, 39–54.

Caroprese M., Napolitano F., Albenzio M., Annicchiarico G., Musto M., Sevi A. (2006). Influence of gentling on lamb immune response and human-lamb interactions. Applied Animal Behavior Science 99, 118–131.

Costa E.O., Benites N.R, Guerra J.L., Melvilla P.A. (2000). Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus spp. Isolated from mammary parenchymas of slaughtered dairy cows. Journal of Veterinary Medicine B 47, 99–103.

Deluyker H.A., Van Oye S.N., Boucher J.F. (2005). Factors affecting cure and somatic cell count after pirlimycin treatment of subclinical mastitis in lactating cows. Journal of Dairy Science 88, 604–614.

De Oliveira A.P., Watts J.L., Salmon S.L., Aarestrup F.M. (2000). Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Europe and the United States. Journal of Dairy Science 83, 855–862.

De Passille A.M., Rushen J. (1999). Are you a source of stress or comfort for your cows? Advanced Dairy science and Technology 11, 347–360.

De Vliegher S., Fox L.K., Piepers S., Mcdougall S., Barkema H.W. (2012) Invited revieuw: mastitis in dairy heifers: nature of the disease, potential impact, prevention, and control. Journal of Dairy Science 95, 1025-1040.

Dingwell R.T., Leslie K.E., Schukken Y.H., Sargeant J.M., Timms L.L., Duffield T.F., Keefe G.P., Kelton D.F., Lissemore K.D., Conklin J., (2004). Association of cow and quarter-level factors at drying-off with new intramammary infections during the dry period. Preventive Veterinary Medicine 63, 75–89.

42

Dufour S., Dohoo I.R., Barkema H.W. (2012). Manageable risk factors associated with the lactational incidence, elimination, and prevalence of Staphylococcus aureus intramammary infections in dairy cows. Journal of Dairy Science 95, 1283–1300.

Dohoo I.R., Leslie K.E.(1991). Evaluation of changes in somatic cell counts as indicators of new intramammary infections. Preventive Veterinary Medicine 10, 225. Frandson R.D., Wilke W.L., Fails A.D. (2009). Anatomy and physiology of farm animals. 7th edition. Wiley-blackwell, Iowa, p.449-455.

Harmon R.J. (1994). Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. Journal of Dairy Science 77, 2103–2112.

Hemsworth P.H., Barnett J.L., Tilbrook A.J., Hansen C. (1989). The effects of handling by humans at calving and during milking on the behaviour and milk cortisol concentrations of primiparous dairy cows. Applied Animal Behavior Science 22, 313–326.

Hill A.W. (1981). Factors influencing the outcome of Escherichia coli mastitis in the dairy cow. Research in Veterinary Science 31, 107–112. Hogeveen H., Huijps K., Lam T.J.G.M. (2011). Economic aspects of mastitis: New developments. New Zealand Veterinary Journal 59, 16-23.

Hogeveen H., Kamphuis C., Steeneveld W., Mollenhorst H. (2010). Sensors and Clinical Mastitis- The test for the perfect alert. Sensors 10, 7991-8009.

Holtenius K., Persson Waller K., Essen-Gustavsson B., Holtenius P., Hallen Sandgren C. (2004). Metabolic parameters and blood leukocyte profiles in cows from herds with high or low mastitis incidence. The Veterinary Journal 168, 65–73.

Huijps K., De Vliegher S., Lam T., Hogeveen H. (2009). Cost estimation of heifer mastitis in early lactation by stochastic modeling. Veterinary Microbiology 134, 121–127.

Inchaisri C., Jorritsma R., Vos P.L.A.M., Van Der Weijden G.C., Hogeveen H. (2010) Economic consequences of reproductive performance in dairy cattle. Theriogenology 74, 835–46.

McDougall S., Arthur D.G., Bryan M.A., Vermunt J.J., Weir A.M. (2007). Clinical and bacteriological response to treatment of clinical mastitis with one of three intramammary antibiotics. New Zealand Veterinary Journal 55, 161–170.

Middleton J.R., Fox L.K. (2001). Influence of Staphylococcus aureus strain on mammary quarter milk production. in Proc. 39th Annu. Mtg. Natl. Mastitis Counc., Atlanta, GA.Natl. Mastitis Council, Madison, WI. p.179–180.

Myllys V., Honkanen-Buzalski T., Virtanen H., Pyörälä S., Müller H.-P. (1993). Effect of abrasion of teat orifice epithelium on development of bovine staphylococcal mastitis. Journal of dairy science 77, 446-452.

Nickerson S.C. (2012). Managing mastitis in heifers: an initial step in improving dairy herd health. In Milk production- an up-to-date overvieuw of animal nutrition, management and health. Novi Sad: Intech Prepress, p. 333-355.

Nickerson S.C., Owens W.E., Boddie. R.L. (1995). Mastitis in dairy heifers: Initial studies on prevalence and control. Journal of Dairy Science 78, 1607–1618.

Norberg E., Hogeveen H., Korsgaard I.R., Friggens N.C., Sloth K.H.M.N., Lovendahl P. (2004); Electrical conductivity of milk: Ability to predict mastitis status. Journal of dairy science 87, 1099-1107.

43

Olde Riekerink R.G.M., Sampimon O.C., Eerland V.J. (2008). Comparing bacterial counts on bare hands with gloved hands during milking. In Mastitis control: from science to practice. Wageningen (Netherlands): Wageningen Academic Publishers, p.77–82.

Oliveira L., Langoni H., Hulland C., Ruegg P.L. (2012). Minimum inhibitory concentrations of Staphylococcus aureus recovered from clinical and subclinical cases of bovine mastitis. Journal of Dairy Science 95, 1913-1920.

O’ Rourke D.J., Baggot J.D. (2004) Antimicrobial therapy of mastitis, in: Andrews A.H., Bovine medicine diseases and husbandry of cattle, Blackwell science, Oxford, UK, p. 391-405.

Owens W.E., Nickerson S.C., Boddie R.L., Tomita G.M., Ray C.H. (2001). Prevalence of mastitis in dairy heifers and effectiveness of antibiotic therapy. Journal of dairy science 84, 814-817.

Owens W.E., Nickerson S.C., Washburn P.J., Ray C.H. (1991). Efficacy of a cephapirin dry cow product for treatment of experimentally induced Staphylococcus aureus mastitis in heifers. Journal of Dairy Science 74, 3376–3382.

Owens W.E., Nickerson S.C., Washburn P.J., Ray. C.H. (1993). Prepartum antibiotic therapy with a cephapirin dry cow product against naturally occurring intramammary infections in heifers. Veterinary Medicine B. 41, 90–100.

Owens W.E., Ray C.H., Boddie R.L., Nickerson S.C. (1988). Antibiotic treatment of mastitis: Comparison of intramammary and intramammary plus intramuscular therapies. Journal of Dairy Science 71, 3143–3147.

Piepers, S., Opsomer G., Barkema H.W., de Kruif A., De Vliegher S. (2010). Heifers infected with coagulase-negative staphylococci in early lactation have fewer cases of clinical mastitis and higher milk production in their first lactation than non-infected heifers. Journal of Dairy Science 93, 2014–2024.

Pyörälä S. (2003). Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis. Veterinary research 34, 567-578.

Pyörälä S. (2008). Mastitis in post-partum dairy cows. Reproduction in Domestic Animimals 43, 252-259.

Reneau J.K. (1985). Effective use of dairy herd improvement somatic cell counts in mastitis control. Dairy science 69, 1708-1720.

Rushen J., Munksgaard L., Marnet P.G., De Passille A.M. (2001). Human contact and the effects of acute stress on cows at milking. Applied Animimal Behaviour Science 73, 1–14.

Sandholm M. (1995) Detection of inflammatory changes in the milk, in: Sandholm M., Honkanen-Buzalski T., Kaartinen L., Pyörälä S. (Eds.), The bovine udder and mastitis, Gummerus, Jyväskylä, Finland, p. 89–104.

Schukken Y.H., Wilson D.J., Welcome F., Garrison-Tikofsky L., Gonzalez R.N. (2003). Monitoring udder health and milk quality using somatic cell counts. Veterinary research 34, 579-596.

Singh S., Jaiswal S., Singh D.D., Singh H. (2006). Bovine mastitis and udder affections. International book distributing co., Lucknow, p.1-5.

Sol J., Sampimon O.C., Barkema H.W., Schukken Y.H. (2000). Factors associated with cure after therapy of clinical mastitis caused by Staphylococcus aureus. Journal of Dairy Science 83, 278–284.

44

Stark K.D., Frei-Staheli C., Frei P.P., Pfeiffer D.U., Danuser J., Audige L., Nicolet J., Strasser M., Gottstein B., Kihm U. (1997). Haufigkeit und Kosten von Gesundheitsproblemen bei Schweizer Milchkuhen und deren Kalbern (1993–1994). Schweiz. Arch. Tierheilkd. 139, 343–353.

Steenhaut M., Vlaminck L. (1995). De heelkundige behandeling van tepel- en uieraandoeningen bij het rund. Vlaams diergeneeskundig tijdschrift 64, 78-89.

Swinkels J.M., Rooijendijk R.G., Hogeveen H., Zadoks R.N. (2005). Economic benefits of lactational treatment of subclinical Staphylococcus aureus mastitis. Journal of Dairy Science 88, 4273–4287.

Uvnas-Moberg K., Johansson B., Lupoli B., Svennersten-Sjaunja K. (2001). Oxytocin facilitates behavioural, metabolic and physiological adaptations during lactation. Applied Animal Behaviour Science 72, 225–234.

Viguier C., Arora S., Gilmartin N., Welbeck K., O’Kennedy R. (2009). Mastitis detection: current trends and future perspectives. Trends in biotechnology. Vol.27 No.8, 486-493.

Waiblinger S., Menke C., Coleman G. (2002). The relationship between attitudes, personal characteristics and behaviour of stockpeople and subsequent behaviour and production of dairy cows. Applied Animal Behaviour Science 79, 195–219.

Zadoks R. N., Schukken Y. H. (2006). Use of molecular epidemiology in veterinary practice. Veterinary Clinics of Food Animals. 22, 229-261.