DNA-herstelkinetiek en therapierespons bij gecombineerde...

DNA-herstelkinetiek en therapierespons bij

gecombineerde radio-cetuximab therapie

Cedric BRACKENIER

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Hubert Thierens

Begeleider: Dr. Ir. Kim De Ruyck

Vakgroep medische basiswetenschappen

Academiejaar 2011-2012

i

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder

de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

21 mei 2012

Cedric Brackenier Prof. Dr. Hubert Thierens

ii

Voorwoord

Deze masterproef was niet tot stand kunnen komen zonder de hulp van een aantal mensen. Ik

wens hen dan ook oprecht te bedanken.

In de eerste plaats gaat mijn dank uit naar mijn promotor, prof. dr. Hubert Thierens, en mijn

begeleidster, dr. ir. Kim De Ruyck. Bedankt voor de begeleiding bij mijn eerste stappen in de

wereld van het wetenschappelijk onderzoek. Dit nieuwe onderzoek vereiste arbeidsintensieve

optimalisatieprocedures alvorens er kon worden overgegaan tot de eigenlijke experimenten.

Het nieuwe karakter van deze studie liet me echter toe om bijzonder veel bij te leren tijdens

dit academiejaar. Bedankt!

Mijn dank gaat ook uit naar het voltallige personeel van de diensten medische fysica en

fysische controle voor de aangename sfeer op de werkvloer. Bedankt!

Verder gaat mijn dank uit naar prof. dr. Jan Philippé voor het ter beschikking stellen van de

apparatuur voor flow cytometrie, en naar prof. dr. Stéphanie Laurent voor het verkrijgen van

cetuximab. Ik wens ook dr. Nancy Van Damme te bedanken voor het verkrijgen van de HT-

29 cellijn, en Koen Mertens en Julie Depuydt voor het overleg in verband met

celcultuursystemen. Bedankt!

Ook bedank ik mijn vrienden, bij wie ik steeds mijn hart kon luchten over ‘de kanker’

wanneer de experimenten iets moeizamer verliepen. Bedankt!

Wie ongetwijfeld ook een fundamentele bijdrage geleverd hebben tot het succes van deze

masterproef, zijn mijn medestudenten van ‘de straling’. Dankzij hen werd er, tussen het

werken door, heel wat afgelachen. Wat mij betreft heb ik vier extra vrienden overgehouden

aan deze thesis. Ik hoop hen in de toekomst nog regelmatig te zullen zien. Bedankt Lore,

Pieter, Mattias en Eline!

Mijn grootste dank gaat uit naar mijn ouders. Zonder hen had ik deze studies nooit kunnen

aanvatten en succesvol afronden. Bedankt!

iii

Inhoud

Voorwoord ................................................................................................................................. ii

Inhoud ........................................................................................................................................ iii

Overzicht afkortingen ................................................................................................................ vi

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

1. Inleiding ................................................................................................................................. 2

1.1. Kanker ............................................................................................................................. 2

1.2. Colorectale kanker ........................................................................................................... 2

1.2.1. Epidemiologie ........................................................................................................... 2

1.2.2. Oorzaken en risicofactoren ....................................................................................... 3

1.2.3. Screening en preventie .............................................................................................. 3

1.2.4. Pathogenese ............................................................................................................... 4

1.2.5. Diagnose ................................................................................................................... 5

1.2.6. Behandeling .............................................................................................................. 5

1.3. Moleculair gerichte therapieën ........................................................................................ 6

1.3.1. De epidermale groeifactor receptor........................................................................... 6

1.3.2. Anti-EGFR therapie .................................................................................................. 8

1.3.3. Predictieve merkers voor anti-EGFR therapie ........................................................ 10

1.3.4. Rationale voor gecombineerde radio-cetuximab therapie ...................................... 11

1.4. Radiotherapie ................................................................................................................. 12

1.5. Detectie en herstel van stralingsgeïnduceerde DNA-schade ......................................... 13

1.5.1. DNA-schade checkpoints ........................................................................................ 14

1.5.2. Herstel van DNA-dubbelstrengbreuken .................................................................. 15

1.5.3. De γ-H2AX foci assay ............................................................................................ 16

1.6. Doel van de studie ......................................................................................................... 16

2. Materialen en methoden ....................................................................................................... 18

iv

2.1. Celcultuur ...................................................................................................................... 18

2.1.1. Oorsprong van de HT-29 cellijn ............................................................................. 18

2.1.2. Kweekomstandigheden van de HT-29 cellijn ......................................................... 18

2.1.3. Onderhoud van de HT-29 cellijn ............................................................................ 18

2.1.4. Periodieke controle op mycoplasmacontaminatie................................................... 18

2.1.5. Invriezen van de HT-29 cellijn ............................................................................... 20

2.1.6. Ontdooien en opstarten van de HT-29 cellijn ......................................................... 20

2.1.7. Kwantificatie van de HT-29 cellen ......................................................................... 20

2.2. Constructie van een groeicurve ..................................................................................... 21

2.3. Synchronisatie in G0/G1 fase van de celcyclus ............................................................. 21

2.3.1. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure ....................................................... 21

2.3.2. Controle van de synchronisatietoestand .................................................................. 21

2.3.3. Synchronisatieprocedure voorafgaand aan de experimenten .................................. 22

2.4. Dosisrespons experimenten ........................................................................................... 22

2.4.1. De γH2AX foci assay voor dosisrespons experimenten ......................................... 22

2.5. DNA-herstelkinetiek experimenten ............................................................................... 23

2.5.1. De γH2AX foci assay na bestraling ........................................................................ 23

2.5.2. De γH2AX foci assay na gecombineerde radio-cetuximab therapie ...................... 24

2.6. Analyse van de γH2AX foci .......................................................................................... 25

2.6.1. Automatische analyse ............................................................................................. 25

2.6.2. Manuele analyse ...................................................................................................... 25

2.7. Statistische analysen ...................................................................................................... 26

3. Resultaten ............................................................................................................................. 27

3.1. Constructie van een groeicurve ..................................................................................... 27

3.2. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure .............................................................. 29



v

4. Discussie ............................................................................................................................... 38

4.1. De constructie van een groeicurve ................................................................................. 38

4.2. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure .............................................................. 38



4.5. Besluit ............................................................................................................................ 44

5. Referenties ............................................................................................................................ 45

vi

Overzicht afkortingen

60Co cobalt-60

ADP adenosine diphosphate

Akt RAC-alpha serine/threonine-protein kinase

AMP adenosine monophosphate

APC adenomatous polyposis coli

ATM ataxia telangiectasia mutated

ATP adenosine triphosphate

ATR ataxia telangiectasia and Rad3 related

ATRIP ATR interacting protein

BER base excision repair

BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

BSA bovine serum albumin

Cav-1 caveoline 1

CIMP CpG island methylator phenotype

CIN chromosomale instabiliteit

CO2 koolstofdioxide

CRC colorectal cancer

CT computed tomography

CU colitis ulcerosa

D-PBS Dulbecco’s phosphate-buffered saline

DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole

DMSO dimethylsulfoxide

DNA deoxyribonucleic acid

DNA-PK DNA-dependent protein kinase

DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase catalytic subunit

vii

DSB double strand breaks

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

EGFR epidermal growth factor receptor

erbB erythroblastic leukemia viral oncogene homolog

EU Europese Unie

FAP familial adenomatous polyposis

FBS fetal bovine serum

Fcγ Immunoglobulin gamma Fc

FOLFIRI chemotherapeutisch regime bestaande uit combinatie van 5-

fluorouracil, leucovorine en irinotecan

FOLFOX chemotherapeutisch regime bestaande uit combinatie van 5-

fluorouracil, leucovorine en oxaliplatine

HER tyrosine kinase-type cell surface receptor HER

HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer

HR homologe recombinatie

HRAS v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog

HUS1 Hus1 checkpoint protein

IR ionizing radiation

JAK janus kinase

KRAS v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

Ku70 x-ray repair cross-complementing protein 6

Ku80 x-ray repair cross-complementing protein 5

MAB monoclonal antibody

MAPK mitogen-activated protein kinase

mCRC metastatic colorectal cancer

MDC1 mediator of DNA damage checkpoint protein 1

Mg2+

tweewaardig magnesium ion

MMR mismatch repair

viii

MRI magnetic resonance imaging

MRN Mre11, Rad50 en NBS1

MSI microsatelliet instabiliteit

nEGFR nuclear epidermal growth factor receptor

NHEJ non-homologous end joining

NRAS neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog

O2 zuurstofgas

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PE phyco-erythrin

PET positron emission tomography

PFA paraformaldehyde

PI3K phosphoinositide-3-kinase

PI3KCA phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide

PIKK phosphatidylinositol-3-kinase-related kinases

PKC protein kinase C

PLC-n1 phospholipase C

PNK polynucleotide kinase

PPi pyrophosphate

PTEN phosphatase and tensin homolog

RAD GTP binding protein RAD

Raf Raf proto-oncogene serine/threonine protein kinase

RAM-TRITC tetramethyl rhodamine isothiocyanate conjugated rabbit anti-mouse

antibody

RPA replication protein A

RPA2 replication protein A2, 32 kDa

RT radiation therapy

SMAD mothers against decapentaplegic

ix

SQEY serine, glutamine, glutamaat, tyrosine

Src proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src

SSA sessile serrated adenoma

SSM serum starvation medium

STAT signal transducer and activator of transcription

TdT terminal deoxynucleotidyltransferase

TGFBR1 transforming growth factor beta receptor 1

TGFBR2 transforming growth factor beta receptor 2

TGF-β transforming growth factor beta

TK tyrosine kinase

TKI tyrosine kinase inhibitor

TSA traditional serrated adenoma

VEGF vascular endothelial growth factor

WRN Werner syndrome, RecQ helicase-like

XLF synoniem voor NHEJ1, non-homologous end-joining factor 1

XRCC4 x-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4

1

Samenvatting

Ondanks grote vooruitgang in de behandeling van geavanceerde kankers zijn conventionele

behandelingsstrategieën niet steeds genezend. Moleculair gerichte therapieën verhogen, door

hun specifieke focus op ontregelde signaalpathways in tumoren, de therapeutische index.

Bovendien zijn ze combineerbaar met conventionele cytotoxische therapieën. De epidermale

groeifactor receptor (EGFR) is een plasmamembranair glycoproteïne dat een kritische rol

speelt bij regulatie van cellulaire proliferatie, overleving, groei, migratie, tumorcel invasie en

inhibitie van apoptose. Overexpressie van EGFR wordt frequent gezien in humane tumoren en

is geassocieerd met een slechte prognose. Naast ligandbinding kan ook blootstelling aan

ioniserende straling EGFR activeren. Dit leidt tot translocatie van EGFR naar de nucleus.

Nucleaire EGFR draagt bij tot DNA-herstel, waardoor de cellulaire radiosensitiviteit en dus

ook het effect van radiotherapie afneemt. Dit maakt de EGFR een zinvol therapeutisch target.

Er bestaan 2 klassen van anti-EGFR therapeutica: tyrosine kinase inhibitoren en monoclonale

antilichamen (MAB). Cetuximab is een MAB dat specifiek bindt aan het extracellulair

domein van EGFR en receptorinternalisatie veroorzaakt. Het wordt toegepast bij de

behandeling van patiënten met KRAS wildtype metastatische colorectale kanker. Er is echter

nood aan predictieve merkers voor identificatie van patiënten die met grote waarschijnlijkheid

baat zullen hebben bij gecombineerde radio-cetuximab therapie. Het doel van deze studie was

de bepaling van de DNA-herstelkinetiek van de HT29 colonadenocarcinoma cellijn na

gecombineerde radio-cetuximab therapie. Hiervoor werden het celcultuursysteem en de

synchronisatieprocedure geoptimaliseerd. Dosisrespons experimenten werden uitgevoerd om

de optimale dosis 60

Co γ-straling te bepalen voor de DNA-herstelkinetiek experimenten.

DNA-herstelkinetiek experimenten werden uitgevoerd na gecombineerde radio-cetuximab

behandeling van de cellen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de γH2AX foci assay. De

γH2AX foci werden manueel gescoord met behulp van fluorescentiemicroscopie.

HT29 cellen die blootgesteld werden aan zowel cetuximab als aan ioniserende straling bleken

stralingsgeïnduceerde DNA dubbelstrengbreuken trager te herstellen in vergelijking met

HT29 cellen die enkel aan ioniserende straling werden blootgesteld. In vervolgonderzoek

kunnen de gegevens bekomen in deze pilootstudie gecorreleerd worden met therapierespons,

om zo na te gaan of DNA-herstelkinetiek al dan niet bruikbaar is als predictieve merker voor

radio-cetuximab therapie bij patiënten met colorectale kanker.

2

1. Inleiding

1.1. Kanker

Kanker is een ziekte die geassocieerd is met dynamische veranderingen in het genoom [1]. Bij

de progressieve evolutie van normale cellen naar een neoplastische toestand verwerven de

cellen geleidelijk wijzigingen in hun cellulaire fysiologie. Hierdoor verkrijgen ze nieuwe

functionele eigenschappen zoals het zelfvoorzienend zijn in groeisignalen, ongevoeligheid

aan groei-inhiberende signalen, ontwijking van apoptose, onbeperkte replicatiecapaciteit,

ondersteuning van angiogenese, weefselinvasie, metastasering, herprogrammering van het

cellulaire energiemetabolisme en actieve ontwijking van de immunologische respons. Het

ontstaan van deze nieuwe eigenschappen wordt bevorderd door de ontwikkeling van

genoominstabiliteit en inflammatie. Samen laten deze verworven kenmerken de kankercellen

toe te overleven, te prolifereren en zich te verspreiden [2].

Het wereldwijde aantal nieuwe kankergevallen en de kankergerelateerde mortaliteit worden in

2008 geschat op respectievelijk 12.7 en 7.6 miljoen [3]. Momenteel krijgen 1 op 3 Belgische

mannen en 1 op 4 Belgische vrouwen kanker voor het bereiken van de 75-jarige leeftijd [4].

De ziekte heeft dan ook een grote financiële impact op de gezondheidszorg [5].

1.2. Colorectale kanker

1.2.1. Epidemiologie

Zowel wereldwijd als in België vormt kanker van het colon en rectum (colorectale kanker,

CRC) bij mannen en vrouwen respectievelijk de derde en tweede meest voorkomende vorm

van kanker [3,4]. Zo wordt het wereldwijde aantal nieuwe CRC gevallen in 2008 geschat op

1.2 miljoen. Er zijn grote regionale verschillen in incidentie. De hoogste incidenties worden

gezien in de Oost-Europese landen, Japan, Nieuw-Zeeland, Australië, Duitsland en bij Afro-

Amerikanen. De laagste incidenties worden waargenomen in Centraal- en Zuid-Amerika,

Afrika en Centraal- en Zuid-Azië. Wegens de overname van Westerse levensgewoonten en

diëten neemt de incidentie sterk toe in gebieden waar vroeger een laag risico bestond op de

ontwikkeling van CRC. Anderzijds daalt de incidentie in sommige ontwikkelde landen door

de detectie en verwijdering van laesies in een voorstadium van CRC. De CRC-gerelateerde

mortaliteit daalt in regio’s met een goede gezondheidsinfrastructuur, maar blijft stijgen in

gebieden die daar niet over beschikken [3]. Momenteel is CRC bij Belgische mannen en

3

vrouwen respectievelijk de tweede en derde meest frequente oorzaak van kankergerelateerde

sterfte [4].

1.2.2. Oorzaken en risicofactoren

Circa 90% van alle CRC-gevallen zijn sporadisch van oorsprong. Gekende risicofactoren zijn

hoge leeftijd, mannelijk geslacht, cholecystectomie, ureterocolische anastomosen, vroege

menopauze, hoge leeftijd bij eerste zwangerschap, nullipariteit, vlees- en vetrijk dieet, dieet

arm aan vezels, foliumzuur en calcium, sedentaire levensstijl, obesitas, diabetes mellitus,

roken, blootstelling aan ioniserende straling, occupationele blootstellingen, hoge

alcoholinname en een persoonlijke historiek van sporadische tumoren [6]. Regelmatig

gebruik van aspirine of niet-steroïdale anti-inflammatoire middelen zou, net als gebruik van

oestrogenen bij vrouwen, dan weer beschermend werken [7]. Circa 20% van de sporadische

patiënten hebben bovendien een familiale risicocomponent, maar voldoen niet aan de

gedefinieerde criteria voor erfelijke CRC. Slechts 5 tot 10% van alle colorectale kankers

ontwikkelen in de context van erfelijke kankersyndromen zoals FAP1 en HNPCC

2. Tot slot

liggen bij 1 tot 2 procent der CRC-gevallen inflammatoire darmziekten zoals CU3 of de ziekte

van Crohn aan de basis [6].

1.2.3. Screening en preventie

De mogelijkheid tot verwijdering van letsels in een voorstadium van CRC maakt dat

screening kan bijdragen tot verlaging van incidentie en CRC-gerelateerde mortaliteit [7].

Diverse methoden, waaronder sigmoïdoscopie, colonoscopie, dubbelcontrast barium klysma

en de feces occult bloed test, zijn beschikbaar [6]. Gezien 94% van de patiënten ouder zijn

dan 50 jaar, kan screening beperkt worden tot deze leeftijdsgroep [7].

De belangrijkste en tevens de goedkoopste preventiemanier is aanpassing van de levensstijl.

Door te zorgen voor voldoende fysische activiteit, tabakgebruik te vermijden, eetgewoonten

aan te passen en het lichaamsgewicht onder controle te houden kan het risico op CRC

verlaagd worden. Daarnaast kunnen ook geneesmiddelen en chirurgie bijdragen tot

risicoverlaging, zij het dan in het geval van FAP, CU en eventueel HNPCC [6].

1 FAP: Familial adenomatous polyposis

2 HNPCC: Hereditary nonpolyposis colorectal cancer

3 CU: Colitis ulcerosa

4

1.2.4. Pathogenese

CRC is een heterogene ziekte die zich ontwikkelt via een toenemende graad van dysplasie van

de normale colonmucosa. Diverse moleculaire pathways dragen bij tot maligne transformatie

in deze adenoma-carcinoma sequentie [8].

Een eerste pathway, chromosomale instabiliteit (CIN), vormt de meest frequente genetische

aberratie in CRC en is geassocieerd met mutatie van het APC4 tumorsuppressorgen. Deze

mutaties treden zeer vroeg op in de ontwikkeling van adenoma’s en zorgen voor cellulaire

accumulatie van β-catenine. Daarnaast leidt inactivatie van APC tot abnormale chromosomale

segregatie, wat bijdraagt tot chromosomale instabiliteit. Ook het KRAS5 proto-oncogen, dat

een rol speelt bij cellulaire proliferatie, kan betrokken zijn bij chromosomale instabiliteit.

Constitutieve activatie van KRAS draagt bij tot de ontwikkeling en progressie van poliepen

[8].

De CpG island methylator phenotype (CIMP) pathway vormt een tweede pathway. Hij wordt

gekenmerkt door epigenetische instabiliteit, ontstaan door hypermethylatie-geïnduceerde

silencing van tumorsuppressorgenen en door globale DNA-hypomethylatie [8].

Een derde pathway, microsatelliet instabiliteit (MSI), ontstaat bij het optreden van mutaties in

nucleotide herhalingssequenties in het DNA. Deze pathway is geassocieerd met het mismatch

repair (MMR) systeem, dat instaat voor herstel van polymerase-geïnduceerde fouten bij

DNA-replicatie. Daar waar deficiëntie van het MMR systeem bij HNPCC berust op germline

mutaties in de MMR genen, is deze bij sporadische MSI tumoren te wijten aan silencing van

de genen via promotor hypermethylatie [8].

Een vierde grote pathway is de serrated pathway. Sessile serrated adenomas (SSA) en

traditional serrated adenomas (TSA) kunnen op een verschillende manier aanleiding geven tot

maligne progressie. Hoewel MSI en CIMP daarbij een overlappende rol spelen, zijn er toch

specifieke mutaties geïdentificeerd voor elke pathway. Daar waar KRAS mutaties vooral

worden aangetroffen bij TSA, zijn mutaties in BRAF6, een gen waarvan het eiwitproduct een

rol speelt in cellulaire proliferatie en inhibitie van apoptose, karakteristiek voor SSA [8].

Naast deze vier grote pathways kan ook chronische inflammatie bijdragen tot maligne

transformatie. Dit is te wijten aan een foutieve respons van het immuunsysteem tegenover de

4 APC: Adenomatous polyposis coli

5 KRAS: v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

6 BRAF: v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

5

intraluminale bacteriën, gecombineerd met bepaalde voorbeschikkende genetische

wijzigingen [8].

Tot slot zijn er nog diverse biochemische pathways die, wanneer getroffen door mutaties,

kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van maligne weefsel. Dit is van toepassing voor de

TGF-β7 pathway, wanneer getroffen door mutaties in TGFBR1

8, TGFBR2

9 en de SMAD

10

genen, alsook bij verlies van de lange arm van chromosoom 18. De tumorsuppressor p53

speelt een rol in diverse pathways en kan dan ook op verschillende manieren geïnactiveerd

worden. Mutaties in p53 worden gezien in de helft van alle CRC-gevallen. Ook verhoogde

expressie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR), een transmembranaire receptor die

een rol speelt bij cellulaire proliferatie, angiogenese en apoptose, is geassocieerd met

geavanceerde ziekte [8].

1.2.5. Diagnose

De gouden standaard voor de diagnose van CRC is colonoscopie [6]. Diverse alternatieven,

zoals sigmoïdoscopie, flexibele sigmoïdoscopie, virtuele colonoscopie, dubbelcontrast

bariumklysma en pneumocolon computer tomografie (CT), zijn beschikbaar [7]. Naast fysisch

onderzoek worden ook abdominale echografie en thoraxradiografie routinematig uitgevoerd.

Goede beeldvorming van rectale kanker, noodzakelijk voor de behandelingsplanning, gebeurt

bij voorkeur door middel van magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Positron emissie

tomografie (PET) wordt dan weer gebruikt voor detectie van CRC recidieven. Voor de

detectie van levermetastasen vormen CT en MRI de diagnostische standaard [6].

1.2.6. Behandeling

Chirurgie vormt de basisbehandeling voor CRC. Voor patiënten met stadium I of II

colonkanker volstaat chirurgische behandeling. Voor patiënten met stadium III of een

specifieke risicovolle stadium II colonkanker wordt chirurgie gecombineerd met adjuvante

fluorouracil gebaseerde therapie [6]. Adjuvante therapie is een systemische behandeling die

wordt toegediend na resectie van de primaire tumor [9].

Ook bij vroege stadia van rectale kanker volstaat chirurgische behandeling. In meer lokaal

geavanceerde kankers wordt preoperatieve radiotherapie toegepast. Bij de meest lokaal

7 TGF-β: Transforming growth factor beta

8 TGFBR1:Transforming growth factor beta receptor 1

9 TGFBR2: Transforming growth factor beta receptor 2

10 SMAD: Mothers against decapentaplegic

6

geavanceerde kankers wordt, voorafgaand aan radicale chirurgie, preoperatieve

radiochemotherapie toegediend gebaseerd op fluorouracil [10].

Bijna 50% van de CRC-patiënten ontwikkelen metastasen. Eerstelijns palliatieve

chemotherapie voor metastatische CRC (mCRC) is gebaseerd op fluoropyrimidines.

Combinaties van 5-fluorouracil, leucovorine en oxaliplatine (FOLFOX) of 5-fluorouracil,

leucovorine en irinotecan (FOLFIRI) leiden tot hogere overleving. Ook monoclonale

antilichamen gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en tegen de

epidermale groeifactor receptor (EGFR) kunnen, eventueel in combinatie met chemotherapie,

overwogen worden. In sommige gevallen kan chemotherapie leiden tot downstaging,

waardoor initieel onresecteerbare metastasen toch resecteerbaar worden [11].

1.3. Moleculair gerichte therapieën

Ondanks grote vooruitgang in de behandeling van geavanceerde kankers zijn conventionele

behandelingsstrategieën niet steeds genezend [12]. Dit is te wijten aan de ontwikkeling van

primaire en verworven resistentie aan conventionele chemo- en radiotherapie. Moleculair

gerichte therapieën verhogen, door hun specifieke focus op ontregelde signaalpathways in

tumoren, de therapeutische index. Bovendien maken de verschillende biologische effecten en

het andere toxiciteitsprofiel combinatie met conventionele cytotoxische therapieën mogelijk

[13].

1.3.1. De epidermale groeifactor receptor

Groeifactoren en hun receptoren spelen een fundamentele rol in de communicatie tussen

cellen en hun omgeving [14]. Cellulaire ontwikkeling is dan ook afhankelijk van de activiteit

van plasmamembraan receptoren die intracellulaire signaalbanen controleren die, op hun

beurt, instaan voor de regulatie van cellulaire responsen. De epidermale groeifactor receptor

(EGFR, erbB1, HER1) is een dergelijk transmembranair glycoproteïne dat bestaat uit een

extracellulair ligandbindend domein, een hydrofobe transmembranaire regio en een

intracellulair domein met tyrosine kinase activiteit. Hij vormt samen met erbB2 (HER2),

erbB3 (HER3) en erbB4 (HER4) de erbB familie van transmembranaire proteïnekinase

receptoren [12].

1.3.1.1. EGFR signalering na ligandbinding

Binding van specifieke liganden ter hoogte van het extracellulair domein van EGFR

veroorzaakt receptor homo- of heterodimerisatie, gevolgd door activatie van intrinsieke

7

proteïnekinase activiteit en tyrosine autofosforylatie. Dit leidt tot activatie van de Ras-Raf-

MAPK11

, PI3K12

-Akt13

, PKC14

, JAK15

/STAT16

, STAT3 en PLC-n117

signaalpathways [12].

Hierdoor speelt EGFR-gemedieerde intracellulaire signalering een kritische rol bij cellulaire

proliferatie, overleving, groei, migratie, tumorcel invasie en inhibitie van apoptose [15].

Figuur 1 geeft een overzicht van de cytoplasmatische signaalpathways van EGFR.

Figuur 1. Overzicht van de cytoplasmatische signaalpathways geïnduceerd door EGFR-activatie. Figuur

overgenomen uit Rodemann et al. [16].

Omdat signaleringsniveaus strikt gereguleerd dienen te zijn [17], is receptorinactivatie

noodzakelijk. Hiervoor is receptorinternalisatie essentieel [18]. Internalisatie van EGFR na

ligandbinding gebeurt via clathrine-gemedieerde endocytose [12]. Na fusie van de

endocytotische vesikels met vroege endosomen wordt EGFR afgebroken in lysosomen of

gerecycleerd naar de plasmamembraan [17].

De geïnternaliseerde EGFR molecule kan echter ook naar de nucleus getransporteerd worden.

Na endocytose is het onduidelijk welke pathway EGFR naar de nucleus brengt [17]. De

nucleaire EGFR (nEGFR) is betrokken bij transcriptionele activatie van diverse genen [18].

11

MAPK: mitogen activated protein kinase 12

PI3K: phosphoinositide 3-kinase 13

Akt: RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 14

PKC: Protein kinase C 15

JAK: Janus kinase 16

STAT: Signal transducer and activator of transcription 17

PLC-n1: phospholipase C

8

Bovendien fosforyleert nEGFR chromatingebonden PCNA18

, wat leidt tot verhoogde

stabiliteit van actief PCNA en dus stimulatie van DNA-replicatie en DNA-herstel [17]. Ook

kan nEGFR rechtsreeks bijdragen tot DNA-herstel en cellulaire overleving door te interageren

met DNA-PK19

[18], een essentieel onderdeel van de NHEJ (non homologous end joining)

DNA-herstel pathway [19]. Aldus speelt nEGFR een belangrijke rol in verschillende

biologische functies zoals tumorprogressie, DNA-herstel, DNA-replicatie en weerstand aan

bepaalde kankertherapieën [17].

1.3.1.2. EGFR signalering na blootstelling aan ioniserende straling

Naast binding van specifieke liganden kan ook blootstelling aan ioniserende straling (IR) en

oxidatieve stress leiden tot activatie van EGFR. Deze manier van EGFR-activatie is niet

geassocieerd met een proliferatieve celrespons, maar met regulatie van de cellulaire

overleving en herstel van DNA-schade. Blootstelling aan IR resulteert in de snelle stabilisatie

en activatie van Src kinase20

, dat vervolgens caveoline-1 (Cav-1) en EGFR fosforyleert. Dit

induceert internalisatie van EGFR via caveolae, en is geassocieerd met perinucleaire

accumulatie van EGFR en persisterende kinase activiteit. Caveolae bestaan uit associaties van

caveolines met sfingolipiden en cholesterol ter hoogte van de plasmamembraan. Ze vormen

samen met geassocieerde eiwitten het caveosoom, dat kan fuseren met vroege endosomen.

Compartimentatie van EGFR in caveolae voorkomt degradatie en laat intracellulaire EGFR

kinase-gelinkte signalering toe. De stralingsgeïnduceerde Cav-1 en EGFR fosforylaties zijn

bovendien geassocieerd met transport van EGFR naar de nucleus [18]. In bestraalde cellen

wordt nEGFR dan ook in complex gevonden met DNA-PK [19].

1.3.2. Anti-EGFR therapie

Gezien de complexiteit van erbB-gerelateerde signaaltransductie en haar belang voor de

cellulaire groei en overleving, is het niet verwonderlijk dat wijzigingen hierin kunnen

bijdragen tot carcinogenese [14]. EGFR overexpressie wordt dan ook frequent gezien in

humane tumoren [17] en is geassocieerd met een slechte prognose [14]. De epidermale

groeifactor receptor kan daarom beschouwd worden als een zinvol moleculair therapeutisch

doelwit.

18

PCNA: Proliferating cell nuclear antigen 19

DNA-PK: DNA-dependent protein kinase 20

Src-kinase: Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src

9

1.3.2.1. Monoclonale antilichamen versus tyrosine kinase inhibitoren

Binnen de anti-EGFR therapeutica kan men 2 grote klassen onderscheiden. Tyrosine kinase

inhibitoren (TKI) blokkeren de binding van adenosine trifosfaat aan het tyrosine kinase (TK)

domein van EGFR, waardoor ze TK activiteit en intracellulaire signalering blokkeren.

Monoclonale antilichamen (MAB) daarentegen binden ter hoogte van het extracellulair

domein en verhinderen zo ligandgeïnduceerde receptoractivatie [14]. Hoewel beide

benaderingen interfereren met EGFR-gemedieerde signalering, vertonen ze toch een aantal

functionele verschillen. MAB leiden, door inductie van receptorinternalisatie en -degradatie,

tot langdurige neerregulatie van EGFR op de plasmamembraan. TKI binden reversibel ter

hoogte van de kinase actieve site en vertonen deze werking niet. Ook kunnen MAB, in

tegenstelling tot TKI, immuniteitsreacties induceren tegen de tumorcel. Doordat MAB

intraveneus worden toegediend, treden hierbij minder geneesmiddeleninteracties op dan bij

peroraal toegediende TKI. Bovendien gebeuren sommige EGFR functies onafhankelijk van de

TK activiteit. Al deze verschillen in acht genomen, lijken MAB meer geschikt voor

toediening in combinatie met cytotoxische therapieën [13].

1.3.2.2. Anti-EGFR monoclonale antilichamen gebruikt bij therapie voor CRC

Voor de behandeling van geavanceerde chemorefractaire CRC zijn twee anti-EGFR

monoclonale antilichamen goedgekeurd: cetuximab en panitumumab [20].

1.3.2.2.1. Cetuximab

Cetuximab is een recombinant, humaan-muis chimeer immunoglobuline G1 MAB dat

specifiek bindt aan het extracellulair domein van humaan EGFR. Het heeft een hogere

affiniteit voor de receptor dan de endogene liganden en veroorzaakt receptorinternalisatie

zonder stimulatie van receptorfosforylatie. De antitumorale efficaciteit van cetuximab berust

aldus op inhibitie van celcyclusprogressie, promotie van apoptose, antiangiogenese en

verhoging van de immunologische activiteit [12]. In een fase III klinische studie werd

aangetoond dat cetuximab, bij patiënten met geavanceerde EGFR-expresserende CRC die

geen baat bleken te hebben bij eerdere behandelingen met irinotecan, oxaliplatin of

fluoropyrimidines, zowel de totale als de progressievrije overleving kan verhogen. Ook kon

het de achteruitgang van de levenskwaliteit bij deze patiënten beperken [21]. Gezien

moleculair gerichte therapieën een ander toxiciteitsprofiel vertonen dan conventionele

cytotoxische therapieën, kunnen beide gecombineerd worden [13]. Een fase III klinische

studie toonde aan dat additie van cetuximab aan irinotecan leidt tot langere progressievrije

10

overleving, een hogere graad van respons en een betere levenskwaliteit dan irinotecan

monotherapie bij patiënten met EGFR-expresserende metastatische CRC (mCRC) die eerder

onsuccesvol behandeld werden met fluoropyrimidine en oxaliplatin [22]. Additie van

cetuximab aan FOLFIRI voor eerstelijnsbehandeling van mCRC blijkt het risico op

ziekteprogressie te verminderen. Dit voordeel wordt echter enkel gezien bij patiënten met

wildtype KRAS tumoren. Het KRAS-gen codeert voor een G-eiwit dat ligandafhankelijke

receptoractivatie linkt met intracellulaire pathways van de EGFR signaalcascade. Mutaties in

codons 12 en 13 veroorzaken constitutieve activatie van KRAS-geassocieerde signaalpathways

[23], wat de klinische respons op EGFR-inhibitie beperkt. In een fase II klinische studie is

cetuximab ook in combinatie met FOLFOX veilig en actief gebleken voor eerstelijnstherapie

van mCRC. Door verbetering van de resectiegraad kan het de overleving verhogen bij

geavanceerde ziekte [24]. Het gebruik van cetuximab is binnen de Europese Unie (EU)

goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met EGFR-expresserende KRAS-wildtype

mCRC in combinatie met irinotecan-gebaseerde chemotherapie of FOLFOX4, of als

monotherapie voor patiënten waarbij eerdere oxaliplatin en irinotecan gebaseerde therapieën

faalden en die intolerant zijn voor irinotecan [25].

1.3.2.2.2. Panitumumab

Panitumumab is een volledig humaan immunoglobuline G2 MAB. Het bindt ter hoogte van

het extracellulaire domein van EGFR en inhibeert zo ligandgeïnduceerde receptoractivatie en

tyrosine kinase fosforylatie. Het vertoont minder immunogeniciteit en veroorzaakt minder

infusiereacties dan cetuximab [14]. Ook voor respons op panitumumab therapie is KRAS-

status van belang [12]. Panitumumab is in de EU goedgekeurd voor eerstelijnsbehandeling

van patiënten met KRAS-wildtype mCRC in combinatie met FOLFOX en voor

tweedelijnsbehandeling in combinatie met FOLFIRI in patiënten die reeds eerstelijns

fluoropyrimidine-gebaseerde chemotherapie kregen (exclusief irinotecan) of als monotherapie

na falen van fluoropyrimidine, oxaliplatin en irinotecan bevattende chemotherapieregimes

[25].

1.3.3. Predictieve merkers voor anti-EGFR therapie

Wegens biologische heterogeniteit zijn veel van de moleculair gerichte therapieën slechts

effectief bij een minderheid der patiënten [20]. Bovendien ontwikkelen initieel responsieve

patiënten na verloop van tijd resistentie. Mogelijke mechanismen voor deze resistentie zijn

activatie van alternatieve receptor tyrosine kinasen die de EGFR pathway omzeilen,

11

constitutieve activatie van signaalpathways downstream van EGFR, EGFR genamplificatie en

receptormutaties [14]. Predictieve merkers bieden de mogelijkheid om op voorhand patiënten

te identificeren die met hoge waarschijnlijkheid baat zullen hebben bij een specifieke

behandeling en zijn bijgevolg van grote klinische waarde. Hun beschikbaarheid leidt tot een

verhoogde therapeutische doeltreffendheid en daling van de toxiciteit, hetgeen zowel de

levenskwaliteit van de patiënten als de kosten voor de gezondheidszorg ten goede komt [20].

De hoge kostprijs en de potentiële toxiciteit van cetuximab maken predictieve merkers van

groot belang voor dit type therapie.

KRAS, een intracellulaire mediator van de signaaltransductie stroomafwaarts van EGFR, is

een predictieve merker voor cetuximab en panitumumab therapie bij CRC. Mutaties in codons

12, 13 of 61, die leiden tot constitutieve activatie van KRAS, maken KRAS signalering

onafhankelijk van EGFR functie [13]. Gezien in diverse studies werd aangetoond dat

patiënten met mutaties in codons 12 of 13 van KRAS geen baat hebben bij cetuximab of

panitumumab therapie, dient de KRAS mutatiestatus in deze codons bepaald te worden bij alle

mCRC patiënten die kandidaat zijn voor deze therapievorm. Indien deze mutaties worden

aangetroffen zal er niet gestart worden met anti-EGFR therapie. Toch zijn deze mutaties in

codons 12 en 13 slechts verantwoordelijk voor hoogstens 40 % van de onresponsieve gevallen

[20]. Er is dus nood aan bijkomende predictieve merkers. Mogelijke merkers voor lage

therapierespons zijn mutaties in codon 61 van KRAS, mutaties in HRAS21

of NRAS22

, mutaties

in genen die coderen voor eiwitten stroomafwaarts van KRAS zoals de BRAF, PI3KCA23

en

PTEN24

genen en verlies van PTEN expressie [20]. Ook het aantal kopijen van EGFR [14],

het tumorale expressieniveau van EGFR liganden en Fcγ25

receptorpolymorfismen van patiënt

immuuncellen zijn mogelijke predictieve merkers [13].

1.3.4. Rationale voor gecombineerde radio-cetuximab therapie

De epidermale groeifactor receptor kan op diverse manieren bijdragen tot de ontwikkeling

van radioresistentie. Drie temporele fasen kunnen worden onderscheiden [15]. Deze worden

geïllustreerd in figuur 2.

21

HRAS: v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog 22

NRAS: Neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog 23

PI3KCA: Phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide 24

PTEN: Phosphatase and tensin homolog 25

Fcγ receptor: Immunoglobulin gamma Fc receptor

12

Figuur 2. De EGFR-gemedieerde radioprotectie bestaat uit 3 temporele fasen. In een eerste fase interageert

nEGFR met DNA-PK (A). In een tweede fase leidt snelle activatie van de PI3K-Akt signaalbaan tot

onderdrukking van apoptose (B). Tot slot dragen de Ras/Raf/Mek/Erk en STAT pathways bij tot tumor

repopulatie door stimulatie van cellulaire proliferatie (C). Overgenomen uit Chen et al. [15].

In een eerste vroege fase leidt interactie van de nucleaire EGFR met DNA-PKcs26

tot herstel

van DNA dubbelstrengbreuken. In een tweede fase zorgt stralingsgeïnduceerde activatie van

EGFR voor activering van de PI3K-Akt pathway, die leidt tot blokkering van apoptotische

signaalpathways. Tot slot biedt activatie van de Ras-MAPK en STAT signaalpathway de

tumorcellen een kritisch overlevingsvoordeel door ondersteuning van tumorrepopulatie en -

progressie [15]. Dit maakt dat combinatie van cetuximab, dat EGFR-signalering en transport

van EGFR naar de nucleus blokkeert, met radiotherapie een zinvolle benadering is.

1.4. Radiotherapie

Radiotherapie (RT) maakt gebruik van ioniserende straling (IR) en wordt frequent toegepast

als eerstelijnsbehandeling met curatieve intentie voor primaire kankers en als palliatieve

therapie voor patiënten met geavanceerde metastatische ziekte [15]. Ioniserende straling is

deeltjes- of elektromagnetische straling die voldoende energie bezit om 1 of meerdere orbitale

elektronen te verwijderen van de atomen of moleculen waarmee ze interageert. Via diverse

absorptiemechanismen wordt het merendeel van de energie van de fotonen omgezet in

kinetische energie van secundaire elektronen. IR kan op een directe manier interageren met

kritische cellulaire doelwitstructuren en deze ioniseren of exciteren. Gezien het hoge

26

DNA-PKcs: DNA-dependent protein kinase catalytic subunit

13

watergehalte van cellen zal het grootste deel van de neergezette energie echter geabsorbeerd

worden in water. Deze indirecte werking van IR leidt tot vorming van vrije radicalen, die

wegens de aanwezigheid van een ongepaard elektron zeer reactief zijn en op hun beurt de

kritische doelwitten kunnen beschadigen [26]. Figuur 3 geeft een overzicht van de directe en

indirecte werking van ioniserende straling.

Figuur 3. De directe en indirecte werking van ioniserende straling. Bij de directe werking interageert het

secundaire elektron rechtstreeks met de doelwitten. Bij de indirecte werking interageren de vrije radicalen

geproduceerd door radiolyse van water met de doelwitten. Figuur overgenomen uit [26].

Het hoofddoel van RT is de destructie van het reproductiepotentieel van tumorcellen, wat kan

gebeuren door inductie van celdood. Dit kan optreden door apoptotische mechanismen, maar

zal bij solide tumoren vooral geschieden door mitotische celdood, een vorm van celdood die

optreedt tijdens of als resultaat van foutieve mitose [27].

1.5. Detectie en herstel van stralingsgeïnduceerde DNA-schade

Gezien DNA haar meest kritische doelwit is [7], geeft ioniserende straling aanleiding tot

diverse vormen van DNA-schade [26]. DNA dubbelstrengbreuken (DSB) vormen zich als het

resultaat van 2 enkelstrengbreuken in tegenoverliggende DNA strengen in elkaars nabijheid,

gewoonlijk binnen de 10 tot 20 basenparen [28]. Hoewel ze weinig frequent voorkomen in

vergelijking met andere vormen van DNA-schade, vormen DSB een bedreiging voor de

genomische integriteit en de cellulaire overleving. Dit is te wijten aan hun moeilijke herstel

door gebrek aan een intacte templatestreng en aan de verstoring van de continuïteit van de

DNA-molecule [29]. Aldus vormen DSB de meest cytotoxische vorm van DNA-schade.

Cellen beschikken dan ook over diverse herstelmechanismen voor deze vorm van schade [30].

14

1.5.1. DNA-schade checkpoints

Zoogdiercellen beschikken over DNA-schade checkpoints die werkzaam zijn bij de overgang

van de G1- naar de S-fase, tijdens de S-fase en bij de overgang van de G2- naar de M-fase

[31]. Deze checkpoints zorgen, na detectie van onherstelde DSB, voor een vertraging van de

celcyclusprogressie, waardoor DNA-herstel mogelijk wordt [32]. Ze bestaan uit complexe

fosforylatiecascades [32] en de deelnemende eiwitten kunnen onderverdeeld worden als

schadesensoren, signaalmediatoren, signaaltransducers en effectoren [31].

Belangrijke sensoren zijn het MRN27

complex en het Ku7028

/Ku8029

heterodimeer [31]. Na

detectie van DSB recruteert het MRN complex het ATM30

transducerkinase, dat

checkpointactivatie triggert. Ook stimuleert ATM DSB-processing door nucleasen, die de

vorming van enkelstrengig DNA katalyseren. Vervolgens wordt dit enkelstrengig DNA

gebonden door RPA31

, waarna RPA via de cofactor ATRIP32

herkend wordt door het

transducerkinase ATR33

. Volledige activatie van ATR vereist ook RPA-gemedieerde

rekrutering van het RAD9-RAD1-HUS134

complex [32]. ATM en ATR vormen samen met

DNA-PKcs de PIKK35

kinasefamilie. Rekrutering van DNA-PKcs naar de DSB gebeurt door

zijn interactie met de sensor Ku70/Ku80 [31]. Uiteindelijk worden door de transducerkinasen

effectorkinasen geactiveerd die transcriptiefactoren, celcyclusregulerende eiwitten en DSB-

herstelfactoren als doelwitten hebben [32].

Daarnaast staan de drie transducerkinasen van de PIKK familie in voor fosforylatie van histon

H2AX ter hoogte van serine 139, wat dan wordt aangeduid als γH2AX [31,32]. γH2AX wordt

vervolgens gebonden door signaalmediatoren. MDC136

is een dergelijke mediator die door

constitutieve interactie met het MRN complex ATM activeert [31]. Dit veroorzaakt

amplificatie van het γH2AX signaal [33], wat leidt tot stabiele accumulatie van diverse

eiwitten betrokken bij DSB-herstel [32].

27

MRN: Complex bestaande uit de Mre11, Rad50 en NBS1 eiwitten 28

Ku70: X-ray repair cross-complementing protein 6 29

Ku80: X-ray repair cross-complementing protein 5 30

ATM: Ataxia telangiectasia mutated 31

RPA: Replication protein A 32

ATRIP: ATR interacting protein 33

ATR: Ataxia telangiectasia and Rad3 related 34

RAD9-RAD1-HUS1: Complex gevormd door de RAD1, RAD9 en HUS1eiwitten 35

PIKK: Phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases 36

MDC1: Mediator of DNA damage checkpoint protein 1

15

1.5.2. Herstel van DNA-dubbelstrengbreuken

Hogere eukaryoten beschikken over twee belangrijke systemen om cellen te beschermen

tegen stralingsgeïnduceerde DNA-schade: ‘homologe recombinatie’ (HR) en ‘non-

homologous end joining’ (NHEJ) [15]. HR vereist de aanwezigheid van homologe sequenties

[33] en is beperkt tot de S/G2 fasen van de celcyclus [30,32]. NHEJ daarentegen werkt

onafhankelijk van homologie voor de hereniging van DSB-uiteinden [33] en is mogelijk

gedurende de volledige celcyclus [30,32]. Hoewel beide pathways samenwerken, vormt

NHEJ de dominante pathway voor herstel van stralingsgeïnduceerde DSB in eukaryoten [15].

Bijgevolg wordt hier enkel ingegaan op deze pathway. Het principe van NHEJ wordt

weergegeven in figuur 4.

Figuur 4. Principe van NHEJ. Associatie van Ku eiwitten faciliteert de recrutering van DNA-PKcs, wat

processing door Artemis en daaropvolgende hereniging van de DSB uiteinden door het DNA ligase IV-XRCC4-

XLF complex promoot. Dit leidt finaal tot herstel van de genomische integriteit zonder verzekering van

sequentiebehoud. Overgenomen uit Mladenov et al [29].

DSB-inductie veroorzaakt binding van de Ku70 en Ku80 eiwitten ter hoogte van de DSB

[29,30,34], welke alignering van beide uiteinden promoten [33]. Het MRN-complex speelt

hierin mogelijks ook een rol, maar lijkt niet essentieel bij hogere eukaryoten [32]. Ku

transloceert 1 helicale draai inwaarts, recruteert vervolgens DNA-PKcs, stabiliseert zijn

binding op DNA en activeert zijn kinase functie [15,33]. DNA-PKcs bindt en activeert het

16

endonuclease Artemis. Verder fosforyleert DNA-PKcs de XLF37

, DNA ligase IV, XRCC438

,

WRN39

en RPA240

eiwitten. Bovendien treedt er DNA-PKcs autofosforylatie op, wat leidt tot

een conformationele verandering waardoor processing van de DSB-uiteinden (door TdT41

en

PNK42

), polymerisatie (door Polymerasen µ en λ) en ligatie (door een complex gevormd door

XLF, XRCC4 en DNA ligase IV) mogelijk worden. Vermits IR-geïnduceerde DSB vaak

geassocieerd zijn met zowel schade aan de pentosefosfaatruggengraat als met basenschade ter

hoogte van de terminale nucleotiden, is processing meestal vereist alvorens ligatie kan

gebeuren. Modificaties van DNA uiteinden die op deze manier ontstaan, kunnen leiden tot

inserties en deleties ter hoogte van de gevormde junctie, wat de mogelijke inductie van

sequentiewijzigingen door NHEJ verklaart [29]. Hoewel de NHEJ-componenten

onafhankelijk van elkaar kunnen werken, werken ze synergistisch in elkaars nabijheid [34].

Dit maakt NHEJ tot een zeer dynamische reactie [32].

1.5.3. De γ-H2AX foci assay

Ioniserende straling geïnduceerde DSB leiden tot lokale fosforylatie ter hoogte van het sterk

geconserveerde SQEY-motief43

van H2AX, een substraat voor de PIKK eiwitfamilie.

Significante signaalamplificatie treedt op, waardoor het γH2AX signaal zich verspreidt naar

naburige chromatineregio’s [28]. De ontwikkeling van een antilichaam tegen γH2AX maakte

het mogelijk om H2AX fosforylatie te detecteren. Dit laat in situ detectie toe van DNA-

schade en –herstel in individuele cellen [35]. Bij klinisch relevante dosissen is DSB detectie

via de γH2AX foci assay minstens een factor 100 gevoeliger dan alternatieve methoden.

Doordat γH2AX de novo gevormd word, is het bovendien een meer betrouwbare merker van

DSB dan hersteleiwitten die ook aanwezig zijn in afwezigheid van beschadigd DNA [28].

1.6. Doel van de studie

Het doel van deze studie was om de DNA-herstelkinetiek van HT-29 colonadenocarcinoma

cellen na gecombineerde radio-cetuximab therapie te bepalen. In vervolgonderzoek kunnen de

gegevens bekomen in deze pilootstudie gecorreleerd worden met therapierespons, om zo na te

37

XLF: Synoniem voor NHEJ1, non-homologous end-joining factor 1 38

XRCC4: X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 39

WRN: Werner syndrome, RecQ helicase-like 40

RPA2: Replication protein A2, 32kDa 41

TdT: Terminal deoxynucleotidyltransferase 42

PNK: Polynucleotide kinase 43

SQEY-motief: Aminozuursequentiemotief bestaande uit serine, glutamine, glutamaat en tyrosine

17

gaan of DNA-herstelkinetiek al dan niet bruikbaar is als predictieve merker voor radio-

cetuximab therapie bij patiënten met colorectale kanker.

18

2. Materialen en methoden

2.1. Celcultuur

2.1.1. Oorsprong van de HT-29 cellijn

De HT-29 cellijn werd verkregen van de dienst gastro-enterologie van het Universitair

Ziekenhuis Gent. Deze dienst kocht de cellijn aan bij de Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). De HT-29 cellijn is een adherente cellijn

afkomstig van een 44-jarige caucasische vrouw met colon adenocarcinoma.

2.1.2. Kweekomstandigheden van de HT-29 cellijn

De HT-29 cellijn werd gekweekt in polystyreen filtercap cultuurflessen met oppervlakten van

25 of 75 cm² (Thermo Scientific). De kweekomstandigheden waren 37°C, 5% CO2 en 100%

luchtvochtigheid. Het groeimedium bestond uit Mc Coy’s 5A medium, aangerijkt met 10%

FBS44

en 1% antibiotica-antimycotica 100X (allen Invitrogen).

2.1.3. Onderhoud van de HT-29 cellijn

Om de twee dagen werd het groeimedium ververst. Subculturen werden aangelegd bij het

bereiken van circa 95% confluentie. Hiervoor werden, na verwijdering van het groeimedium,

de cellen tweemaal gespoeld met D-PBS45

(Sigma Aldrich), waarna gedurende 10 seconden

trypsine-EDTA46

(Invitrogen) aan de cellen werd toegevoegd. Vervolgens werd de falcon

gedurende 5 minuten te rusten gelegd. Om dissociatie van de cellen te bevorderen werd een

aantal keer met de falcon op het tafelblad geklopt. Indien de cellen moeilijk loskwamen werd

gebruik gemaakt van een cell scraper (BD). Tot slot werd vers groeimedium aan de cellen

toegevoegd, waarna de celsuspensie in de gewenste verhouding werd overgebracht naar een

nieuwe falcon. Groeimedium, D-PBS en trypsine-EDTA werden telkens op 37°C gebracht

vóór toevoeging aan de culturen. De cellen werden nooit langer dan 30 passages in cultuur

gehouden.

2.1.4. Periodieke controle op mycoplasmacontaminatie

Mycoplasma is de veelgebruikte triviale naam voor micro-organismen van de klasse

Mollicutes. Het zijn de kleinste vrijlevende bacteriële vormen die wijdverspreid zijn in de

natuur. Gedurende de evolutie hebben mycoplasma’s zowel hun bacteriële celwand als enkele

metabolische pathways verloren. Door deze structurele en metabolische deficiënties is

44

FBS: Foetal bovine serum 45

D-PBS: Dulbecco’s phosphate buffered saline 46

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

19

replicatie van mycoplasma grotendeels afhankelijk van de aanwezigheid van voedingsstoffen

in de omgeving. Wegens hun brede verspreiding zijn mycoplasma’s een frequente oorzaak

van celcultuurcontaminatie [36]. Hun aanwezigheid uit zich niet steeds door macroscopische

veranderingen in de cellen of media. Ook met routinemicroscopie is detectie niet

vanzelfsprekend. Veel mycoplasmacontaminanten groeien traag zonder de gastheercel te

vernietigen [37]. Ze veroorzaken echter wel wijzigingen in de biologische eigenschappen van

de gecontamineerde cellen [36]. Vermits dit de betrouwbaarheid van experimentele resultaten

kan ondermijnen, werd maandelijks getest op de aanwezigheid van mycoplasmacontaminatie.

2.1.4.1. Principe van de test

Voor detectie van mycoplasma contaminatie werd gebruik gemaakt van de MycoAlert

detectiekit (Lonza). Mycoplasmatische enzymen reageren met MycoAlert substraat, wat leidt

tot katalysering van de omzetting van ADP47

tot ATP48

. Bepaling van de ATP-niveau’s

gebeurt door middel van een bioluminiscente reactie, weergegeven in figuur 5.

Luciferase, Mg2+

ATP + Luciferine + O2 Oxyluciferine + AMP + PPi + CO2 + Licht

Figuur 5. Bioluminiscente reactie gebruikt voor de bepaling van de ATP niveaus. De hoeveelheid uitgezonden

licht is lineair gerelateerd aan de ATP-concentratie. AMP en PPi staan respectievelijk voor adenosine

monophosphate en pyrophosphate. O2, Mg2+

en CO2 staan respectievelijk voor zuurstofgas, een tweewaardig

positief magnesium atoom en koolstofdioxide. Figuur overgenomen uit [38].

Bepaling van de ATP-niveaus voor en na toevoeging van het substraat geeft een ratio die

indicatief is voor de aan- of afwezigheid van mycoplasma in het staal [38].

2.1.4.2. Uitvoering van de test

Groeimedium dat minstens 3 dagen op de te testen cultuur had gestaan werd gedurende 5

minuten gecentrifugeerd aan 330 g. Van elk staal werd 100 µl supernatans overgebracht naar

een well in een witte FluoroNunc module met Maxisorp oppervlakte (Thermo Scientific). Er

werden ook 2 wells gevuld met een positief en negatief controlestaal van de MycoAlert Assay

Control Set (Lonza). Aan elk staal werd 100 µl MycoAlert Reagens (Lonza) toegevoegd. Na

resuspendering en incubatie gedurende 5 minuten werd de eerste meting uitgevoerd. De

meting gebeurde met de Microlumat LB96P luminometer (EG&G Berthold) en WinGlow

software (EG&G Berthold). Vervolgens werd aan elk staal 100 µl MycoAlert Substraat

47

ADP: Adenosine diphosphate 48

ATP: Adenosine triphosphate

20

(Lonza) toegevoegd. Na resuspendering en incubatie gedurende 10 minuten werd de meting

herhaald. De verhouding van de luminiscentie van de tweede meting tot die van de eerste

meting werd bepaald. Bij een verhouding groter dan 1 werd het staal positief beschouwd voor

mycoplasma.

2.1.5. Invriezen van de HT-29 cellijn

Voor het invriezen van de HT-29 cellen werd de procedure van de aanleg van subculturen

gevolgd tot het punt waarop er vers groeimedium in de falcon gebracht wordt (zie sectie 2.1.3,

‘Onderhoud van de HT-29 cellijn’). De bekomen celsuspensie werd vervolgens overgebracht

naar een tube en gecentrifugeerd aan 330 g gedurende 5 minuten. Na weggieten van het

supernatans werd de pellet opgelost in vriesmedium bestaande uit Mc Coy’s 5A medium

aangerijkt met 20% FBS en 10% DMSO49

(Sigma-Aldrich). De oplossing werd daarna

verdeeld over cryotubes (Thermo Scientific), welke dan gedurende minstens 4 uur in een

CoolCell (BioCision) bij -80°C geplaatst werden. Vervolgens werden de cryovials

overgebracht naar een vat met vloeibare stikstof voor lange termijn stockering.

2.1.6. Ontdooien en opstarten van de HT-29 cellijn

De bevroren HT-29 cellen werden ontdooid door druppelsgewijze toevoeging van tot 37°C

opgewarmd groeimedium. Vervolgens werd de celsuspensie gecentrifugeerd gedurende 5

minuten aan 330 g. Na afgieten van het supernatans werd de pellet opgelost in groeimedium

en verdeeld over twee 25 cm² cultuurfalcons in de verhoudingen 1:5 en 4:5.

2.1.7. Kwantificatie van de HT-29 cellen

Voor kwantificatie van de cellen werd 100µl celsuspensie in een epje gebracht. Hieraan werd

100 µl trypaanblauw 0.4% (Sigma-Aldrich) toegevoegd. Na resuspendering werd deze

oplossing in de Bürker telkamer (Marienfeld) gebracht. Per 50 vakjes werden alle levende

cellen geteld, gelegen volledig binnen het vakje of rakend aan de rechtse of onderste lijn van

het vakje. Deze telling werd in totaal viermaal herhaald en de gemiddelde waarde, n, werd

berekend. De gebruikte formule om deze waarde te herleiden tot het aantal cellen in de

celsuspensie wordt weergegeven in figuur 6.

49

DMSO: Dimethylsulfoxide

21

s

Figuur 6. Formule gebruikt ter omzetting van het gemiddelde getelde celaantal per 50 vakjes van de Bürker

telkamer, n, naar het aantal cellen in het totale volume celsuspensie (Vs). TB staat voor trypaanblauw.

2.2. Constructie van een groeicurve

Voor de constructie van een groeicurve werden de HT-29 cellen op diverse tijdstippen na

subcultuur geteld (zie secties 2.1.3, ‘onderhoud van de HT-29 cellijn’ en 2.1.7, ‘Kwantificatie

van de HT-29 cellen’). Met behulp van Excel 2010 (Microsoft) werden de bekomen

celaantallen op semilogaritmische schaal uitgezet in functie van het aantal uren na subcultuur.

Aan de hand van de punten gelegen binnen het exponentiële deel van de groeicurve werden de

vergelijking en de determinatiecoëfficiënt van de best passende exponentiële trendlijn

bepaald. In de bekomen vergelijking werden 2 celaantallen ingevuld die bereikt werden in het

exponentiële deel van de groeicurve, en waarvan de ene waarde het dubbele is van de andere.

Uit het verschil tussen beide bekomen tijdstippen werd de verdubbelingstijd verkregen. De

duur van de lagfase werd bekomen door invulling van de hoeveelheid cellen op tijdstip 0 in de

vergelijking van de trendlijn.

2.3. Synchronisatie in G0/G1 fase van de celcyclus

2.3.1. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure

Synchronisatie van de cellen in de G0/G1 fase van de celcyclus werd bekomen via

serumdeprivatie. Diverse condities werden uitgetest om de optimale methode te ontdekken.

Voor de optimalisatie-experimenten werd de periode waarin de cellen in normaal

groeimedium groeiden gevarieerd tussen 24 of 48 uur. De serumconcentratie in het

vervangende medium werd gevarieerd tussen 0 (SSM 0%), 0.1 (SSM 0.1%) of 10 procent (N

medium) en de periode waarin de cellen geïncubeerd werden in dit vervangende medium

werd gevarieerd tussen 24 en 48 uur. Telkens werd de synchronisatietoestand bepaald.

2.3.2. Controle van de synchronisatietoestand

Voor de bepaling van de synchronisatietoestand werd gebruik gemaakt van de Coulter DNA

Prep Reagents Kit (Beckman Coulter). Aan 100 µl celsuspensie werd eenzelfde volume

lysebuffer toegevoegd. Na mengen werd hieraan 1 ml DNA-stain oplossing toegevoegd,

waarna de oplossing opnieuw werd gemengd. Vervolgens werd de oplossing in het donker en

op kamertemperatuur bewaard gedurende 15 minuten tot maximaal 3 uren. Na deze incubatie

22

werd de DNA-index bepaald met behulp van de FACSCanto II flow cytometer (BD) en

FACSDiva v.6.1.3 software (BD). De flowrate werd op laag ingesteld. Als controlestaal werd

een humaan bloedstaal gebruikt dat een identieke behandeling onderging met lysebuffer en

DNA-stain oplossing. Bij analyse van dit controlestaal werd de PE50

waarde aangepast tot de

singlet piek zich ter hoogte van de waarde 50 bevond. Vervolgens werd de analyse van de

HT-29 cellen uitgevoerd met dezelfde PE-waarde als het controlestaal. De flow cytometer en

de Coulter DNA Prep Reagents Kit werden ter beschikking gesteld door prof. dr. Jan Philippé

van het laboratorium voor klinische biologie.

2.3.3. Synchronisatieprocedure voorafgaand aan de experimenten

Voorafgaand aan elk experiment werden de cellen gesynchroniseerd. Hiervoor werden 5 tot

7.5 miljoen cellen uitgezaaid per 75 cm² falcon in normaal groeimedium (N medium)

bestaande uit Mc Coy’s 5A medium met 10% FBS en 1% antibiotica-antimycotica 100X. Na

24 uur werd het medium verwijderd en werden de cellen tweemaal gespoeld met D-PBS.

Hierna werd medium toegevoegd dat enkel bestaat uit Mc Coy’s 5A medium met 1 %

antibiotica-antimycotica 100X (SSM 0%). Bij de DNA-herstelkinetiek experimenten werd

voor de hersteltijden langer dan 1 uur SSM 2% (bestaande uit Mc Coy’s 5A medium met 2%

FBS en 1% antibiotica-antimycotica 100X) gebruikt omdat dit in het aangepaste

cultuursysteem aanleiding gaf tot betere cellulaire morfologie. Na 24 uur incubatie in het

verarmde medium werden de cellen getrypsiniseerd en heropgelost in SSM 0% medium (of in

SSM 2% voor de lange herstelpunten). Ten slotte werd de celcyclusdistributie geanalyseerd.

2.4. Dosisrespons experimenten

2.4.1. De γH2AX foci assay voor dosisrespons experimenten

De gesynchroniseerde HT-29 cellen werden geoogst door trypsinisatie en heropgelost in SSM

0% aan een concentratie van 1.2 x 106 cellen per 2 ml. De 2 ml culturen werden bestraald met

60Co γ-straling (Gammatron R, Siemens) aan een dosis van 0.2, 0.5, 1, 1.5 of 2 Gy in een

warmwaterbad op 37°C. Er werd ook een onbestraald controlestaal geïncorporeerd in het

experiment. Per conditie werden 3 preparaten gemaakt. Na de bestraling werden de culturen

gedurende 15 minuten op 37°C geplaatst om DNA-herstel toe te laten. Dit DNA-herstel werd

gestopt door de culturen gedurende 10 minuten op ijs te plaatsen. Vervolgens werd 0.5 ml van

de celsuspensie gecentrifugeerd op poly-l-lysine gecoate slides (VWR International) door

middel van cytospin centrifugatie (Sigma). Nadien werden de slides gedurende minstens 20

50

PE: Phyco-erythrin

23

minuten gefixeerd in 3% PFA51

(Sigma-Aldrich). Bewaring overnacht gebeurde in 0.5% PFA

op 4°C. De volgende dag werden de gefixeerde cellen gewassen met D-PBS gedurende 5

minuten, waarna ze gedurende 10 minuten geïncubeerd werden met ijskoude Triton X-100

(Fluka Analytical). Vervolgens werden de cellen driemaal gedurende 10 minuten gewassen

met D-PBS met 1% BSA52

(Roche). Na de cellen te hebben bedekt met 100 µl van een 1:500

verdunning van het anti-γ-H2AX antilichaam (Biolegend) in D-PBS met 1% BSA, werden de

slides gedurende 1 uur in een vochtige kamer bewaard. De vochtige kamer bestaat uit een

grote petri-plaat waarin enkele vochtige tissues gelegd worden. Na opnieuw drie wasstappen

van 10 minuten met D-PBS met 1% BSA, werden de cellen bedekt met 100 µl van een 1:1000

verdunning van RAM-TRITC53

antilichaam (dakoCytomation) in D-PBS met 1% BSA. Na 1

uur incubatie in een verduisterde vochtige kamer volgden drie wasstappen van 10 minuten

met D-PBS. Tot slot werd 35 µl van een 200 ng DAPI54

(Sigma-Aldrich) per ml fluoromount

(Sigma-Aldrich) oplossing op de slides gebracht, en werden de slides bedekt met een proper

dekglaasje (Knittel Glass). De slides werden bewaard in het donker bij 4°C. Om uitdroging te

voorkomen werden de randen van de dekglaasjes bedekt met nagellak.

2.5. DNA-herstelkinetiek experimenten

Alvorens de eigenlijke DNA-herstelkinetiek experimenten te starten werden 20 cm x 20 cm

dekglaasjes (Menzel-Gläser) gecoat met poly-l-lysine. Een oplossing van 50 µl poly-l-lysine

(Sigma-Aldrich) per ml steriel water werd gesteriliseerd door ze doorheen een 0.22µm filter

(Millipore) te spuiten. De door droge autoclavering gesteriliseerde dekglaasjes werden in de

gesteriliseerde poly-l-lysine oplossing gespoeld en in een 6-well plaat (BD) geplaatst.

Vervolgens werd per well 2 ml steriele poly-l-lysine oplossing toegevoegd. Na een incubatie

van 1 uur bij 37°C werd de poly-l-lysine oplossing uit de wells verwijderd en werden de wells

vijfmaal gespoeld met steriel water. De platen werden overnacht te drogen gelegd in een

droge incubator. Ten slotte werden de 6-well platen omwikkeld met parafilm en bewaard bij

4°C.

2.5.1. De γH2AX foci assay na bestraling

De gesynchroniseerde HT-29 cellen werden geoogst door trypsinisatie en heropgelost in SSM

2% aan een concentratie van 1.2 x 106 cellen per 2 ml. De 2 ml culturen werden bestraald met

51

PFA: Paraformaldehyde 52

BSA: Bovine serum albumin 53

RAM-TRITC: Tetramethyl rhodamine isothiocyanate conjugated rabbit anti-mouse antibody 54

DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole

24

60Co γ-straling aan een dosis van 0.5 Gy in een warmwaterbad op 37°C. Er werden ook

onbestraalde controlestalen geïncorporeerd in het experiment. Per conditie werden 3

preparaten gemaakt. Na de bestraling werden de culturen gedurende diverse perioden (15

minuten, 2 uur, 4 uur) op 37°C geplaatst om DNA-herstel toe te laten.

Voor de hersteltijden van 2 uur en 4 uur werden de 2 ml culturen op de vooraf met poly-l-

lysine gecoate dekglaasjes in een 6-well plaat gebracht.

DNA-herstel werd gestopt door de culturen gedurende 10 minuten op ijs te plaatsen.

Vervolgens werd voor het herstelpunt van 15 minuten 0.5 ml van de celsuspensie

gecentrifugeerd op poly-l-lysine gecoate slides door middel van cytospin centrifugatie. Bij de

lange herstelpunten werd het medium uit de wells verwijderd en werden de dekglaasjes

tweemaal gespoeld met D-PBS.

De cellen werden vervolgens gedurende 20 minuten gefixeerd in 3% PFA. Bewaring

overnacht gebeurde in 0.5% PFA bij 4°C. De volgende dag werden de gefixeerde cellen

gewassen met D-PBS gedurende 5 minuten, waarna ze gedurende 10 minuten geïncubeerd

werden met ijskoude Triton X-100. Vervolgens werden de cellen driemaal gedurende 10

minuten gewassen met D-PBS met 1% BSA (Roche). Na de cellen te hebben bedekt met 100

µl van een 1:500 verdunning van het anti-γ-H2AX antilichaam (Biolegend) in D-PBS met 1%

BSA, werden de slides gedurende 1 uur in een vochtige kamer bewaard. Na opnieuw drie

wasstappen van 10 minuten met D-PBS met 1% BSA, werden de cellen bedekt met 100 µl

van een 1:1000 verdunning van RAM-TRITC antilichaam (dakoCytomation) in D-PBS met

1% BSA. Na 1 uur incubatie in een verduisterde vochtige kamer volgden drie wasstappen van

10 minuten met D-PBS.

De slides van het 15 minuten herstelpunt werden bedekt met 35 µl van een 200 ng DAPI per

ml fluoromount oplossing, waarna ze bedekt werden met een proper dekglaasje. De

dekglaasjes van de lange herstelpunten werden na de laatste van de drie wasstappen met D-

PBS uit de 6-well plaat verwijderd. Er werd 35 µl van een 200 ng DAPI per ml fluoromount

oplossing op poly-l-lysine gecoate slides gebracht, waarna de dekglaasjes hier omgekeerd

werden opgelegd.

Bewaring van de slides gebeurde in het donker bij 4°C. Om uitdroging te voorkomen werden

de randen van de dekglaasjes bedekt met nagellak.

2.5.2. De γH2AX foci assay na gecombineerde radio-cetuximab therapie

Een eerste experiment gebeurde analoog aan het DNA-herstelkinetiek experiment waar enkel

bestraling werd toegepast. Nu werd 4 uur voor trypsinisatie van de cellen 1µM cetuximab

25

(Merck) toegevoegd per 1 x 106 cellen. Het aantal γH2AX foci werd enkel bepaald na 15

minuten en na 4 uur DNA-herstel. Cetuximab werd ter beschikking gesteld door prof. dr.

Stéphanie Laurent van de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent.

Voor een volgend DNA-herstelkinetiek experiment werden de cellen uitgezaaid op vooraf met

poly-l-lysine gecoate dekglaasjes in 6-well platen in plaats van in 75 cm² cultuurfalcons. De

cellen werden in deze platen gesynchroniseerd door 24 uur incubatie in N medium, gevolgd

door 24 uur incubatie in SSM 2%. Om het celaantal te bepalen dat na de

synchronisatieprocedure aanleiding zou geven tot een geschikt aantal cellen voor het γH2AX

foci experiment, werd een deelexperiment opgezet. Hierbij werden diverse celaantallen

uitgezaaid op vooraf met poly-l-lysine gecoate dekglaasjes in een 6 well plaat. Na doorlopen

van de synchronisatieprocedure werden de culturen visueel geïnspecteerd. Er dienden

voldoende cellen aanwezig te zijn op de dekglaasjes zonder elkaar te overlappen. Op basis

van dit deelexperiment werd gekozen om 400 000 cellen uit te zaaien per well. Vier uur voor

bestraling met 0.5 Gy 60

Co γ-straling werd 1µM cetuximab toegevoegd per 1 x 106 cellen. In

het experiment werden ook controlestalen geïncorporeerd die niet werden blootgesteld aan

cetuximab of 60

Co γ-straling.

2.6. Analyse van de γH2AX foci

2.6.1. Automatische analyse

Automatische analyse werd uitgevoerd met de Metacyte module van het Metafer 4

scanningssysteem (Metasystems) in combinatie met een Zeiss Axio Imager Z.2 microscoop

(Carl Zeiss MicroImaging) met Plan-Neofluar 40x/0.75 M27 objectief (Carl Zeiss

International). Gezien dit systeem nog niet eerder gebruikt werd voor de kwantificatie van

γH2AX foci in HT-29 cellen, drong een optimalisatieprocedure specifiek voor dit celtype zich

op. Er werd hiermee gestart, maar volledige optimalisatie bleek te tijdrovend voor het

tijdsbestek van deze masterproef. Automatische analyse werd bijgevolg enkel uitgevoerd voor

het dosisrespons experiment. Andere experimenten werden manueel geanalyseerd.

2.6.2. Manuele analyse

Manuele analyse werd uitgevoerd met het ChromoScan systeem (Applied Imaging),

bestaande uit een Olympus BX60 fluoroscentiemicroscoop met UPIan FL 100x/1.30 oil

objectief (Olympus) en Cytovision v2.8 software (Applied Imaging). Per beeld werd het

TRITC-signaal opgenomen op 10 optische secties van 1.03 µm volgens de z-as. Het finale

26

beeld werd bekomen door alle secties te projecteren op 1 vlak en dit te combineren met de

DAPI kleuring, waarvoor geen focusvlakken werden gebruikt. Per preparaat werden 100

cellen geteld. Voor elk van deze 100 cellen werd het aantal γH2AX foci geteld. Met behulp

van Excel 2010 (Microsoft) werd, per preparaat, het gemiddeld aantal foci per cel bepaald en

uitgezet in functie van de dosis (voor dosisresponsrespons experimenten) of in functie van de

periode van DNA-herstel (voor DNA-herstelkinetiek experimenten).

2.7. Statistische analysen

De resultaten werden verwerkt met behulp van Office Excel 2010 (Microsoft). Voor elk

preparaat werd het gemiddeld aantal γH2AX foci per cel bepaald. Vervolgens werden de

gemiddelde waarde en de standaarddeviatie voor de verschillende preparaten van dezelfde

conditie bepaald. Dit gemiddelde werd voor elke conditie gecorrigeerd met de gemiddelde

waarde voor de controlestalen. De standaardfout werd bekomen door middel van

onderstaande formule.

27

3. Resultaten

3.1. Constructie van een groeicurve

Voor een eerste groeicurve (groeicurve A) werd er gestart van 900 000 cellen en werden de

cellen gekwantificeerd op 10, 22, 34, 46, 58 en 70 uur na subcultuur. Gezien bij dit

experiment een duidelijke outlier bekomen werd (tijdspunt 58 uur na subcultuur), werd het

experiment nog tweemaal herhaald. Voor groeicurven B en C werd er respectievelijk gestart

van 950 000 en 1 300 000 cellen. De cellen werden nu gekwantificeerd op 24, 48, 60, 72 en

96 uur na subcultuur. De resultaten van de celtellingen worden weergegeven in tabel 1. De

celaantallen werden op semilogaritmische schaal uitgezet in functie van het aantal uren na

subcultuur in figuur 7.

Groeicurve Aantal uren na subcultuur Celaantal Gebruikt voor trendlijn

A 0 900 000

10 875 000

22 1 300 000 X

34 1 850 000 X

46 3 750 000 X

58 3 195 000

70 5 175 000 X

B 0 950 000

24 1 225 000 X

48 2 400 000 X

60 3 633 000 X

72 4 600 000 X

96 8 080 000

C 0 1 300 000

24 2 167 000 X

48 4 900 000 X

60 5 933 000 X

72 8 600 000 X

96 10 383 000

Tabel 1. Overzicht van de celaantallen in functie van het aantal uren na subcultuur.

28

Figuur 7. Resultaten van de 3 groeicurve experimenten. De vergelijking van de trendlijn en de R²-waarde worden

telkens weergegeven. De pijl in groeicurve A wijst op een outlier.

Voor de drie groeicurven worden de vergelijking van hun trendlijnen met bijhorende R²-

waarden, de verdubbelingstijd en de duur van de lagfase samengevat in tabel 2. De

y = 731806e0,0296x

R² = 0,92

100000

1000000

10000000

0 20 40 60 80

Cel

aanta

l

Uren na subcultuur

Niet gebruikt voor

trendlijn

Gebruikt voor

trendlijn

y = 627900e0,0282x

R² = 0,99

100000

1000000

10000000

0 20 40 60 80 100 120

Cel

aanta

l

Uren na subcultuur

B

y = 1E+06e0,0282x

R² = 0,99

1000000

10000000

100000000

0 20 40 60 80 100 120

Cel

aanta

l

Uren na subcultuur

C

A

29

gemiddelde verdubbelingstijd en de gemiddelde duur van de lagfase bedroegen respectievelijk

24.2 ± 0.69 en 10.3 ± 4.0 uur.

Groeicurve Vergelijking trendlijn R²-waarde Verdubbelingstijd

(u)

Duur lagfase (u)

A y=731806e0.0296x

0.92 23.4 7.0

B y=627900e0.0282x

0.99 24.6 14.7

C y=1E+06e0.0282x

0.99 24.6 9.3

Gemiddelde

SD

24.2

0.69

10.3

4.0

Tabel 2. Samenvatting van de vergelijkingen en R²-waarden van de trendlijn, de verdubbelingstijd en duur van

de lagfase bekomen bij de drie experimenten.

3.2. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure

Voor een eerste experiment werden de cellen gedurende 24 uur geïncubeerd in normaal

groeimedium dat vervolgens werd vervangen door vers normaal groeimedium of serum

starvation medium (SSM) met 0.0 % of 0.1 % FBS. De resultaten van dit experiment worden

weergegeven in tabel 3.

Medium 1 Periode op medium

1 (u)


2 (u)

Cellen in G0/G1

(%)

N 24 SSM 0.0% 24 74

N 24 SSM 0.1% 24 63

N 24 N 24 39

N 24 SSM 0.0% 48 76

N 24 SSM 0.1% 48 77

N 24 N 48 78

Tabel 3. Resultaten van het eerste synchronisatie-experiment. N staat voor normaal groeimedium, SSM 0.0% en

SSM 0.1% staan respectievelijk voor serum starvation medium met 0.0% en 0.1% FBS.

Voor een tweede experiment werden de cellen gedurende 20 uur geïncubeerd in normaal

groeimedium, waarna dit medium vervangen werd door SSM 0.0%. De resultaten van dit

experiment worden weergegeven in tabel 4.


1 (u)


2 (u)

Cellen in G0/G1

(%)

N 20 SSM 0.0% 24 78

N 20 SSM 0.0% 48 73

Tabel 4. Resultaten van het tweede synchronisatie-experiment. N staat voor normaal groeimedium, SSM 0.0%

staat voor serum starvation medium met 0.0% FBS.

Bij een derde synchronisatie-experiment werden de cellen geteld en uitgezaaid aan 5 miljoen

per 75 cm² falcon. Bij experimenten 1 en 2 werd het aantal uitgezaaide cellen niet

30

gekwantificeerd. Dit aantal lag wel met zekerheid lager dan bij experiment 3. De resultaten

van experiment 3 worden weergegeven in tabel 5.


1 (u)


2 (u)

Cellen in G0/G1

(%)

N 24 SSM 0.0% 24 86

N 24 N 24 63

Tabel 5. Resultaten van het derde synchronisatie-experiment. N staat voor normaal groeimedium, SSM 0.0%

voor serum starvation medium met 0.0 % FBS.

De grootste graad van synchronisatie werd bekomen door 5 miljoen cellen uit te zaaien in een

75 cm² falcon en deze cellen te incuberen gedurende 24 uur in normaal groeimedium en 24

uur in SSM 0.0%.


Voor de dosisrespons experimenten werden gesynchroniseerde cellen blootgesteld aan

verschillende stralingsdosissen. Telkens werd 15 minuten DNA-herstel toegelaten. Deze

experimenten werden uitgevoerd om de ideale stralingsdosis te bepalen voor toepassing in de

DNA-herstelkinetiek experimenten. De resultaten van zowel de manuele als de automatische

analyse van het dosisrespons experiment worden weergegeven in tabel 6. Het gecorrigeerde

gemiddelde aantal foci per cel werd verkregen door het gemiddelde aantal foci per cel bij een

bepaalde dosis te verminderen met het gemiddelde aantal foci per cel bij 0.0 Gy. Figuur 8

geeft het gecorrigeerde gemiddelde aantal foci per cel weer in functie van de dosis.

Manuele analyse Automatische analyse

Dosis (Gy) Gemiddeld # foci /

cel (±SD)

Gecorrigeerd

gemiddeld # foci / cel

(±SD)

Gemiddeld # foci / cel

(±SD)

Gecorrigeerd

gemiddeld # foci

/ cel (±SD)

0.0 8.0±1.1 0.0±1.6 1.0±0.1 0.0±0.2

0.2 12.9±1.1 4.9±1.6 3.8±0.5 2.8±0.5

0.5 22.3±2.1 14.3±2.4 7.1±0.8 6.1±0.8

1.0 31.0±1.5 23.0±1.9 13.9±5.0 12.9±5.0

1.5 40.0±2.8 32.0±3.0 15.4±5.7 14.4±5.7

2.0 49.3±0.3 41.3±1.1 20.8±2.3 19.8±2.3

Tabel 6. Resultaten van de manuele en automatische analyse van het dosisresponsexperiment. De berekende

gemiddeldes en standaarddeviaties zijn intra-experimenteel.

31

Figuur 8. Gecorrigeerde dosisrespons curve na manuele en automatische analyse. De vergelijking van de lineaire

trendlijnen en de R²-waarden worden weergegeven. De foutbalken tonen de intra-experimentele standaardfout.

Er lijkt een lineair verband te zijn tussen de gebruikte stralingsdosis en de inductie van

γH2AX foci. De manuele telmethode leidt tot een merkelijk hoger gemiddeld aantal foci per

cel dan de automatische telling. Om het verband na te gaan tussen de resultaten van de

manuele en de automatische analyse werd een regressiecurve opgesteld. Deze wordt

weergegeven in figuur 9.

Figuur 9. Regressielijn. De vergelijking en de R²-waarde van de trendlijn worden weergegeven.

Op basis van dit dosisrespons experiment werd besloten een stralingsdosis van 0.5 Gy te

gebruiken voor de DNA-herstelkinetiek experimenten. Bij hogere dosissen is er immers

y = 20,3x + 1,6

R² = 0,99

y = 9,7x + 1,0

R² = 0,97

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Gec

orr

igee

rd g

emid

del

d #

fo

ci /

cel

Dosis (Gy)

Manuele analyse

Automatische analyse

y = 0,47x + 0,22

R² = 0,98 0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50

Gec

orr

igee

rd g

emid

del

d #

fo

ci /

cel

,

auto

mat

isch

e an

alyse

Gecorrigeerd gemiddeld # foci / cel, manuele analyse

32

inductie van een zeer groot aantal γH2AX foci, wat hun kwantificatie compliceert. Dit wordt

geïllustreerd in figuur 10.

TRITC DAPI TRITC + DAPI

0.0

Gy

0.5

Gy

2.0

Gy

Figuur 10. Illustratie van de γH2AX foci assay voor bepaling van de dosisrespons. Het TRITC signaal toont de

γH2AX foci. De kern werd gekleurd met DAPI.


In een eerste reeks experimenten werd de DNA-herstelkinetiek bepaald na blootstelling aan

0.5 Gy 60

Co γ-straling. De resultaten worden weergegeven in tabel 7 en figuur 11.

0 Gy 0.5 Gy Gecorrigeerd

Experiment Hersteltijd

(min)


(± SD)


(± SD)


(± SD)

A 15 5.3±0.3 19.0±2.1 13.7±2.1

120 5.5±0.8 12.0±1.3 6.5±1.5

240 5.8±0.2 8.2±0.4 2.4±0.5

B 15 7.0±0.6 18.6±1.0 11.6±1.2

120 5.5±0.2 13.7±0.4 8.1±0.4

240 6.0±1.1 7.4±0.1 1.3±1.1

A+B 15 12.7±1.5

120 7.3±1.2

240 1.9±0.7

Tabel 7. DNA-herstelkinetiek na blootstelling aan 0.5 Gy 60

Co γ-straling. In experiment A+B werden de

resultaten van experimenten A en B gegroepeerd. Gemiddelden en standaarddeviaties werden intra-

experimenteel berekend voor experimenten A en B afzonderlijk, en inter-experimenteel voor experiment A+B.

33

Figuur 11. DNA-herstelkinetiek na blootstelling aan 0.5 Gy 60

Co γ-straling. Het bekomen gemiddelde aantal foci

per cel werd gecorrigeerd met de bekomen waarde bij de onbestraalde stalen. Het experiment werd tweemaal

uitgevoerd (panel A en B). Panel C toont de combinatie van beide experimenten met inter-experimentele

standaardfouten.

In een volgend experiment werd de DNA-herstelkinetiek bepaald na blootstelling aan zowel

0.5 Gy 60

Co γ-straling als aan cetuximab. Vier uur voor trypsinisatie van de cellen werd 1µM

cetuximab toegevoegd per 1 x 106 cellen. De resultaten van dit experiment worden

weergegeven in tabellen 8 en 9, en in figuren 12 en 13.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

15 120 240

# f

oci

/ c

el,

gec

orr

igee

rd

Hersteltijd (minuten)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

15 120 240

# f

oci

/ c

el,

gec

orr

igee

rd


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

15 120 240

# f

oci

/ c

el,

gec

orr

igee

rd


A

B

C

34

Stralingsdosis

(Gy)

Dosis cetuximab

(µM / miljoen

cellen)

Hersteltijd

(min)

Gemiddeld # foci /

cel (± SD)

Gecorrigeerd

gemiddeld # foci / cel (±

SD)

0.0 0 15 3.1 ± 0.8 0.0 ± 1.1

0.0 0 240 3.5 ± 0.2 0.0 ± 0.3

0.0 1 15 6.3 ± 0.1 3.2 ± 0.8

0.0 1 240 5.5 ± 1.1 2.0 ± 1.1

0.5 0 15 19.0 ± 0.1 15.9 ± 0.8

0.5 0 240 9.0 ± 0.5 5.5 ± 0.5

0.5 1 15 23.2 ± 0.1 20.1 ± 0.8

0.5 1 240 12.1 ± 0.7 8.6 ± 0.7

Tabel 8. DNA-herstelkinetiek. Het gemiddeld aantal foci per cel na 15 en 240 minuten DNA-herstel werd

gecorrigeerd met de overeenkomstige waarden van de controle (onbestraald, geen cetuximab toegevoegd). De

vermelde gemiddelden en standaarddeviaties zijn intra-experimenteel.

Figuur 12. DNA-herstelkinetiek na gecombineerde radio-cetuximab therapie. De foutbalken geven de intra-

experimentele standaarddeviaties weer.

0

5

10

15

20

25

15 240

Gem

idd

eld

# f

oci

/ c

el

Hersteltijd (min)

0 Gy

0 Gy + cetuximab

0.5 Gy

0.5 Gy + cetuximab

35

Figuur 13. DNA herstelkinetiek na gecombineerde radio-cetuximab therapie. Het gemiddeld aantal foci per cel

na 15 en 240 minuten DNA-herstel werd gecorrigeerd met de overeenkomstige waarden van de controle (

onbestraald, geen cetuximab toegevoegd).

Tabel 9 toont het percentage van het aantal γH2AX foci na 15 minuten DNA-herstel dat

resteert na 4 uur DNA-herstel.

Conditie Percentage γH2AX foci resterend 4 uur na bestraling

0.5 Gy 35

0.5 Gy + Cetuximab 43

Tabel 9. Percentage γH2AX foci resterend 4 uur na blootstelling aan 0.5 Gy γ-straling al dan niet gecombineerd

met cetuximab. Het aantal resterende foci na 4 uur werd uitgedrukt ten opzichte van het aantal foci 15 minuten

na bestraling.

Gezien cetuximab inwerkt op de EGFR, die zich in de plasmamembraan bevindt, werd er

verondersteld dat trypsinisatie kan interfereren met de werking van cetuximab. Daarom werd

bij een volgend experiment trypsinisatie vermeden door de cellen rechtstreeks uit te zaaien op

vooraf met poly-l-lysine gecoate dekglaasjes in 6-well platen. Vier uur voor bestraling met 0.5

Gy 60

Co γ-straling werd 1µM cetuximab toegevoegd per 1 x 106 cellen. De resultaten van dit

experiment worden weergegeven in tabellen 10 en 11 en in figuren 14 en 15.

0

5

10

15

20

25

0 Gy +

Cetuximab

0,5 Gy +

Cetuximab

0,5 Gy

Gec

orr

igee

rd g

emid

del

d #

fo

ci /

cel

15 min herstel

4u herstel

36

Stralingsdosis

(Gy)

Dosis cetuximab

(µM / miljoen

cellen)

Hersteltijd

(min)

Gemiddeld # foci /

cel (± SD)

Gecorrigeerd

gemiddeld # foci / cel( ±

SD)

0.0 0 15 5.0 ± 0.3 0.0 ± 0.4

0.0 0 240 5.1 ± 0.4 0.0 ± 0.5

0.0 1 15 5.4 ± 0.1 0.4 ± 0.3

0.0 1 240 5.4 ± 0.1 0.3 ± 0.4

0.5 0 15 18.8 ± 0.1 13.8 ± 0.3

0.5 0 240 7.0 ± 0.2 1.9 ± 0.4

0.5 1 15 20.2 ± 0.4 15.2 ± 0.5

0.5 1 240 10.6 ± 0.8 5.5 ± 0.9

Tabel 10. DNA-herstelkinetiek. Het gemiddeld aantal foci per cel na 15 en 240 minuten DNA-herstel werd

gecorrigeerd met de overeenkomstige waarden van de controle ( onbestraald, geen cetuximab toegevoegd). De

vermelde gemiddelden en standaarddeviaties zijn intra-experimenteel.

Figuur 14. DNA-herstelkinetiek na gecombineerde radio-cetuximab therapie. De foutbalken geven de intra-

experimentele standaarddeviatie weer.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

15 240

Gem

idd

eld

# f

oci

/ c

el

Hersteltijd (min)

0 Gy

0 Gy + Cetuximab

0.5 Gy

0.5 Gy + Cetuximab

37

Figuur 15. DNA-herstelkinetiek na gecombineerde radio-cetuximab therapie. Het gemiddeld aantal foci per cel

na 15 en 240 minuten DNA-herstel werd gecorrigeerd met de overeenkomstige waarden van de controle

(onbestraald, geen cetuximab toegevoegd). De foutbalken geven de intra-experimentele standaardfout weer.

Tabel 11 toont het percentage van het aantal γH2AX foci na 15 minuten DNA-herstel dat

resteert na 4 uur DNA-herstel.

Conditie Percentage γH2AX foci resterend 4 uur na bestraling

0.5 Gy 14

0.5 Gy + Cetuximab 36

Tabel 11. Percentage γH2AX foci resterend 4 uur na blootstelling aan 0.5 Gy γ-straling al dan niet gecombineerd

met cetuximab. Het aantal resterende foci na 4 uur werd uitgedrukt ten opzichte van het aantal foci 15 minuten

na bestraling.

Deze DNA-herstelkinetiek experimenten tonen aan dat additie van cetuximab aan 60

Co γ-

straling in HT29 cellen aanleiding geeft tot trager herstel van stralingsgeïnduceerde DNA-

dubbelstrengbreuken.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

0 Gy +

Cetuximab

0,5 Gy +

Cetuximab

0,5 Gy

Gec

orr

igee

rd g

emid

del

d #

fo

ci /

cel

15 min herstel

4u herstel

38

4. Discussie

4.1. De constructie van een groeicurve

De groeicurven werden opgesteld om een betere inschatting toe te laten van de cellulaire

proliferatie, en dus ook van de tijdstippen waarop subculturen moeten worden gemaakt.

De bekomen groeicurven (zie figuur 7) vertonen een sigmoïdaal verloop. De cellen nemen

niet toe in aantal tijdens de lagfase. Dit is een adaptatieperiode waarin de cellen aanhechten

aan het substraat en waarin ze componenten van de plasmamembraan en de extracellulaire

matrix vervangen die verloren gingen bij de trypsinisatie. Tijdens de daaropvolgende logfase

is er een exponentiële toename van het celaantal. Wanneer uiteindelijk de volledige

beschikbare oppervlakte door de cellen is ingenomen, vertoont de groeicurve een plateaufase

[37].

De drie groeicurven leverden vergelijkbare verdubbelingstijden op. De gemiddelde

verdubbelingstijd van 24.2 uur ligt tevens dicht bij deze beschreven in de literatuur

[39,40,41,42]. Tabel 12 toont de resultaten van een vergelijkende literatuurstudie.

Publicatie Gerapporteerde verdubbelingstijd HT-29 (u)

Forgue-Lafitte et al. [39]

Zhu et al. [40]

Potla et al. [41]

Yao et al. [42]

Eigen studie

24

22

26

25.9 ± 2.3

24.2 ± 0.7

Tabel 12. Vergelijkende literatuurstudie met betrekking tot de verdubbelingstijd van HT-29 cellen.

4.2. Optimalisatie van de synchronisatieprocedure

De cellen werden gesynchroniseerd om 2 redenen. De cellulaire radiosensitiviteit varieert

doorheen de celcyclus. Hij is het hoogst tijdens de M/G2 fasen, intermediair tijdens G1 en het

laagst tijdens de late S-fase [43]. Een eerste reden om te synchroniseren is het vermijden van

variatie in de resultaten omwille van een variabele celcyclusdistributie. DNA DSB worden

spontaan geïnduceerd wanneer de replicatievork tijdens de S-fase een beschadigde template

bereikt [33]. Een tweede reden om de cellen te synchroniseren is de beperking van de

hoeveelheid endogeen geïnduceerde DSB. Daarom werd geopteerd voor synchronisatie in de

G0/G1 fase. Hiertoe bestaan diverse methoden. Gezien farmacologische agentia cellulaire

bijwerkingen kunnen vertonen [44], werd in deze studie geopteerd voor synchronisatie door

serumdeprivatie. Hierbij resulteert het gebrek aan groeifactoren in het medium in arrest van

39

de celcyclus in de G1-fase of in overgang van de cellen naar de G0-fase [45]. Deze manier

van synchronisatie werd bovendien reeds eerder toegepast voor HT-29 cellen [46,47,48].

Het eerste synchronisatie-experiment (Tabel 3) toont dat 24 uur incubatie met normaal

groeimedium gevolgd door 24 uur incubatie met media met diverse hoeveelheden serum leidt

tot duidelijke verschillen in de celcyclusdistributie. Zoals verwacht steeg het procentuele

aantal cellen in G1/G0 bij daling van het serumgehalte van het medium. Bij 24 uur incubatie

met normaal groeimedium, gevolgd door 48 uur incubatie met media met diverse

hoeveelheden serum, zijn er geen duidelijke verschillen in synchronisatietoestand meer

merkbaar tussen de verschillende condities. Dit is mogelijk te wijten aan het optreden van

contactinhibitie, of aan de mogelijke uitputting van groeifactoren in de serumbevattende

media na 48 uur.

Uit een tweede experiment (tabel 4) kan worden afgeleid dat 48 uur incubatie op SSM 0%

medium geen meerwaarde biedt ten opzichte van 24 uur incubatie op dit medium.

Voor een derde experiment (tabel 5) werd er gestart van een welbepaald aantal cellen,

namelijk 5 miljoen per 75 cm² falcon. Deze werden 24 uur geïncubeerd in N medium,

gevolgd door 24 uur incubatie in SSM 0%. Op deze manier werden circa 85 % van de cellen

in G0/G1 aangetroffen. Dit werd als voldoende beschouwd en deze procedure werd dan ook

verkozen om de cellen te synchroniseren voorafgaand aan elk experiment. Telkens werd de

synchronisatietoestand gecontroleerd. Het procentueel celaantal in G0/G1 bedroeg steeds

minstens 85.


De dosisrespons experimenten werden uitgevoerd om de optimale stralingsdosis te bepalen

voor de DNA-herstelkinetiek experimenten. Te hoge dosissen zouden resulteren in niet meer

telbare hoeveelheden foci. Te lage dosissen zouden niet meer representatief zijn voor

radiotherapie-effecten. Op basis van de dosisrespons experimenten werd beslist de DNA-

herstelkinetiek experimenten uit te voeren met een stralingsdosis van 0.5 Gy.

In de literatuur werden geen studies gevonden die handelen over herstelkinetiek van

stralingsgeïnduceerde DNA-schade in de HT29 cellijn. Om toch een idee te krijgen over de

relatieve positie van de bekomen dosisrespons curve ten opzichte van reeds uitgevoerde

dosisrespons experimenten, wordt in figuur 16 de bekomen dosisrespons curve weergegeven

samen met een aantal dosisrespons curven die werden gevonden in de literatuur.

40

Figuur 16. Overzicht van de beschikbare dosisrespons data uit de literatuur.

Door variatie in het gebruikte celtype, in het gebruikte tijdspunt of in de manier van scoring,

is onderlinge vergelijking van de resultaten van deze dosisrespons experimenten zeer

moeilijk.

De verschillen in het aantal γH2AX foci na bestraling tussen verschillende celtypes zijn

mogelijk te verklaren door variatie van de hoeveelheid H2AX eiwit tussen verschillende

cellijnen [51]. Ook de achtergrond van γH2AX foci is variabel. In tabel 13 wordt de bekomen

achtergrondwaarde vergeleken tussen een aantal studies.

Celtype Gemiddeld # foci /

cel

Scoringsmethode Studie

Geïsoleerde T-lymfocyten 0.74 Manueel Beels et al. [49]

Bloedstaal 0.67 Manueel Beels et al. [49]

NHLF 0.35 Manueel Wu et al. [50]

LVTHM MCF10A 1.62 Metafer Vandersickel et al. [51]

HT29 5.1 Manueel Eigen experimenten

Tabel 13. Overzicht van de beschikbare data m.b.t. γH2AX foci achtergrond in de literatuur.

De eigen experimenten leverden een eerder hoge achtergrond op in vergelijking met de andere

studies vermeld in tabel 13. Door de diverse verschillen tussen de studies kunnen ook deze

41

waarden moeilijk met elkaar vergeleken worden. Volgens Mah et al. kan de achtergrond bij

kankercellijnen variëren tussen 5 en 20 foci per nucleus [52]. De bekomen achtergrondwaarde

is hiermee in overeenstemming.


In figuur 17 wordt de bekomen DNA-herstelkinetiek curve weergegeven in combinatie met

een aantal DNA-herstelkinetiek curven die werden gevonden in de literatuur. Door variatie in

het gebruikte celtype, in de gebruikte stralingsdosis, in het gebruik van cetuximab of in de

manier van scoring, is onderlinge vergelijking van de resultaten van deze DNA-

herstelkinetiek experimenten zeer moeilijk.

Figuur 17. Overzicht van de beschikbare DNA-herstelkinetiek data in de literatuur.

Bij de eigen experimenten bleek het herstel van stralingsgeïnduceerde DNA-schade trager te

verlopen na gecombineerde blootstelling van de HT-29 cellen aan cetuximab en 60

Co γ-

42

straling (Zie tabel 10 en grafiek 15). Vier uur na blootstelling van de HT-29 cellen aan 0.5 Gy

60Co γ-straling resteerde 14 % van het aantal aanwezige γH2AX foci 15 minuten na

bestraling. Indien echter 4 uur voor de bestraling 1µM cetuximab werd toegevoegd per 1 x

106 cellen, bleek nog 36 % van het oorspronkelijk aantal foci te resteren (Zie tabel 11).

González et al. [53] maakten ook gebruik van gecombineerde radio-cetuximab therapie. A431

cellen werden behandeld met verschillende concentraties cetuximab in combinatie met 4 Gy

137Cs straling. Cetuximab werd toegevoegd 1 uur voor de bestraling. Het aantal γH2AX foci

per nucleus werd bepaald 24 uur na bestraling. Een cetuximab concentratie van 50 µg/ml in

combinatie met een stralingsdosis van 4 Gy leverde na 24 uur DNA-herstel 13 foci op. Bij een

concentratie van 25 µg/ml resteerden 6.5 foci. 4 Gy 137

Cs straling in afwezigheid van

cetuximab leverde na 24 u DNA-herstel nog 3 γH2AX foci op [53]. Ook hier leidde additie

van cetuximab aan radiotherapie, net als bij de eigen experimenten, tot vertraagd herstel van

DNA dubbelstrengbreuken.

De functie van EGFR als regulator van DNA-herstel ligt mogelijk aan de basis van de

verklaring van het vertraagde herstel van stralingsgeïnduceerde DNA DSB na behandeling

met cetuximab.

Blootstelling aan ioniserende straling veroorzaakt translocatie van EGFR naar de nucleus,

waar EGFR associeert met DNA-PK. Dit leidt tot activatie van NHEJ DNA DSB herstel.

Blokkering van EGFR met cetuximab, een anti-EGFR monoclonaal antilichaam, verhindert

de stralingsgeïnduceerde translocatie van EGFR naar de nucleus [54]. Dit leidt tot

gereduceerde activiteit van DNA-PK, waardoor DNA-PK autofosforylatie op residu Thr2609,

wat essentieel is voor NHEJ, wordt gereduceerd [16]. Dittmann et al. konden in A549 cellen

inderdaad aantonen dat blokkering van nucleair EGFR transport door cetuximab DNA PK

activiteit deed afnemen. Dit had verhoogde residuele DNA schade en verminderde cellulaire

overleving tot gevolg [18].

Activatie van DNA-PKcs kan ook gebeuren door EGFR signalering via de PI3K-Akt

pathway. Hierbij interageert Akt rechtstreeks met DNA-PKcs. In cellen met gemuteerde Ras

eiwitten leidt constitutieve activatie van de MAPK pathway tot een autocriene lus van EGFR

ligandproductie en signalering, die vooral de PI3K-Akt pathway zal stimuleren [16]. Dit

mechanisme wordt geïllustreerd in figuur 18.

43

Figuur 18. De EGFR-PI3K-AKT pathway. Ioniserende straling kan rechtstreeks de EGFR activeren, die

vervolgens vooral aanleiding geeft tot activatie van de PI3K-AKT cascade. AKT signalering staat in voor anti-

apoptotische responsen en activeert herstel van DNA DSB door directe interactie met DNA-PKcs. In cellen met

een gemuteerd Ras eiwit, stimuleert de constitutief actieve MAPK pathway de productie en vrijstelling van

EGFR liganden. Deze stimuleren op hun beurt EGFR-afhankelijke PI3K-AKT signalering via een autocrien

mechanisme. Figuur overgenomen uit Rodemann et al. [16].

Anderzijds staat de nucleaire EGFR in voor fosforylatie van PCNA (proliferating cell nuclear

antigen) [18], een essentieel onderdeel van de ‘DNA sliding clamp’ [16]. Deze fosforylatie

verhoogt de stabiliteit van PCNA op chromatine [18], waardoor replicatie en herstel van DNA

gestimuleerd worden [16].

Daarnaast zorgt nEGFR voor opregulatie van de expressie van XRCC1, een eiwit uit de base

excision repair (BER) pathway dat instaat voor herstel van DNA enkelstrengbreuken.

Bijgevolg kan door inactivatie van EGFR de frequentie van geclusterde DNA-schade

toenemen, wat kan leiden tot een hoger aantal DNA DSB [16]. Dit verklaart het verhoogd

aantal γH2AX foci 15 minuten na bestraling bij radio-cetuximab combinatietherapie ten

opzichte van bestraling alleen (zie figuur 15).

Doordat cetuximab zowel nucleair transport [54], als de cytoplasmatische pathways [13] van

EGFR blokkeert, draagt het bij tot inhibitie van EGFR geïnduceerd DNA herstel. Dit verklaart

de geobserveerde radiosensitiserende werking van cetuximab.

Cetuximab monotherapie lijkt het aantal γH2AX foci licht te verhogen (Zie tabel 10 en figuur

15). In eerste instantie kan dit doen vermoeden dat cetuximab in beperkte mate DNA

dubbelstrengbreuken zou induceren. Er werd echter reeds aangetoond dat cetuximab geen

44

genotoxisch effect heeft [55]. De lichte verhoging van het aantal γH2AX foci kan mogelijk

verklaard worden door een hoger aantal cellen in apoptose na cetuximab behandeling, te

wijten aan inhibitie van de anti-apoptotische PI3K-AKT pathway. Om de statistische

significantie van deze lichte verhoging van het aantal γH2AX foci na te gaan, zijn er echter

meer herhalingen van het experiment vereist.

4.5. Besluit

Uit deze studie blijkt dat HT29 cellen die blootgesteld worden aan zowel cetuximab als aan

ioniserende straling, stralingsgeïnduceerde DNA dubbelstrengbreuken trager herstellen in

vergelijking met HT29 cellen die enkel aan ioniserende straling worden blootgesteld. Verder

onderzoek is nodig om deze resultaten te bevestigen. Door de resultaten te correleren met

therapierespons, kan worden nagegaan of de γH2AX foci assay bruikbaar is als predictieve

merker voor radio-cetuximab therapie bij patiënten met colorectale kanker. Op die manier

zouden patiënten die baat zullen hebben bij deze therapievorm op voorhand geïdentificeerd

kunnen worden, waardoor nodeloze bijwerkingen voor de patiënt alsook kosten voor de

gezondheidszorg vermeden kunnen worden. De resultaten van deze studie dienen nog

bevestigd te worden, zodat de statistische significantie ervan kan worden nagegaan. Eventueel

kan de procedure herhaald worden voor andere monoclonale antilichamen.

45

5. Referenties

1. Hanahan D, Weinberg RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell. 100(1):57-70

2. Hanahan D, Weinberg RA (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144(5):646-74

3. Jemal A, Center MM, DeSantis C, Ward EM (2010). Global patterns of cancer incidence and mortality

rates and trends. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19(8):1893-907

4. Cancer incidence in Belgium (2008). Belgian cancer registry. Online beschikbaar op

www.kankerregister.be

5. Meropol NJ, Schrag D, Smith TJ, Mulvey TM, Langdon RM Jr, Blum D, Ubel PA, Schnipper LE;

American Society of Clinical Oncology (2009). American Society of Clinical Oncology guidance

statement: the cost of cancer care. J Clin Oncol. 27(23):3868-74

6. Weitz J, Koch M, Debus J, Höhler T, Galle PR, Büchler MW (2005). Colorectal cancer. Lancet.

14;365(9454):153-65

7. Souhami R, Tobias J (2007). Cancer and its management. 5th

ed. Blackwell publishing.

8. Harrison S, Benziger H (2011). The molecular biology of colorectal carcinoma and its implications: a

review. Surgeon. 9(4):200-10

9. Labianca R, Nordlinger B, Beretta GD, Brouquet A, Cervantes A; ESMO Guidelines Working Group

(2010). Primary colon cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, adjuvant treatment and

follow-up. Ann Oncol. 21 Suppl 5:v70-7

10. Glimelius B, Påhlman L, Cervantes A; ESMO Guidelines Working Group (2010). Rectal cancer: ESMO

Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 Suppl 5:v82-6

11. Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes A; ESMO Guidelines Working Group (2010). Advanced

colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for treatment. Ann Oncol. 21 Suppl 5:v93-7

12. Capdevila J, Elez E, Macarulla T, Ramos FJ, Ruiz-Echarri M, Tabernero J (2009). Anti-epidermal growth

factor receptor monoclonal antibodies in cancer treatment. Cancer Treat Rev. 35(4):354-63

13. Gerber DE, Choy H (2010). Cetuximab in combination therapy: from bench to clinic. Cancer Metastasis

Rev. 29(1):171-80

14. Lurje G, Lenz HJ (2009). EGFR signaling and drug discovery. Oncology. 77(6):400-10

15. Chen DJ, Nirodi CS (2007). The epidermal growth factor receptor: a role in repair of radiation-induced

DNA damage. Clin Cancer Res. 13(22 Pt 1):6555-60

16. Rodemann HP, Dittmann K, Toulany M (2007). Radiation-induced EGFR-signaling and control of DNA-

damage repair. Int J Radiat Biol. 83(11-12):781-91

17. Wang YN, Yamaguchi H, Hsu JM, Hung MC (2010). Nuclear trafficking of the epidermal growth factor

receptor family membrane proteins. Oncogene. 29(28):3997-4006

18. Dittmann K, Mayer C, Rodemann HP (2010). Nuclear EGFR as novel therapeutic target: insights into

nuclear translocation and function. Strahlenther Onkol. 186(1):1-6

19. Dittmann K, Mayer C, Kehlbach R, Rodemann HP (2008). Radiation-induced caveolin-1 associated

EGFR internalization is linked with nuclear EGFR transport and activation of DNA-PK. Mol Cancer.

7:69

20. Duffy MJ, O'Donovan N, Crown J (2011). Use of molecular markers for predicting therapy response in

cancer patients. Cancer Treat Rev. 37(2):151-9

21. Jonker DJ, O'Callaghan CJ, Karapetis CS, Zalcberg JR, Tu D, Au HJ, Berry SR, Krahn M, Price T, Simes

RJ, Tebbutt NC, van Hazel G, Wierzbicki R, Langer C, Moore MJ (2007). N Engl J Med. 357(20):2040-8

22. Sobrero AF, Maurel J, Fehrenbacher L, Scheithauer W, Abubakr YA, Lutz MP, Vega-Villegas ME, Eng

C, Steinhauer EU, Prausova J, Lenz HJ, Borg C, Middleton G, Kröning H, Luppi G, Kisker O, Zubel A,

Langer C, Kopit J, Burris HA 3rd

(2008). EPIC: phase III trial of cetuximab plus irinotecan after

fluoropyrimidine and oxaliplatin failure in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol.

26(14):2311-9

23. Van Cutsem E, Köhne CH, Hitre E, Zaluski J, Chang Chien CR, Makhson A, D'Haens G, Pintér T, Lim

R, Bodoky G, Roh JK, Folprecht G, Ruff P, Stroh C, Tejpar S, Schlichting M, Nippgen J, Rougier P

(2009). Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med.

360(14):1408-17.

24. Tabernero J, Van Cutsem E, Díaz-Rubio E, Cervantes A, Humblet Y, André T, Van Laethem JL, Soulié

P, Casado E, Verslype C, Valera JS, Tortora G, Ciardiello F, Kisker O, de Gramont A (2007). Phase II

trial of cetuximab in combination with fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin in the first-line treatment

of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 25(33):5225-32

25. www.ema.europa.eu

26. Lehnert S (2008). Biomolecular action of ionizing radiation. Taylor and Francis.

http://www.kankerregister.be/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19581533





























46

27. Eriksson D, Stigbrand T (2010). Radiation-induced cell death mechanisms. Tumor Biol. 31(4):363-72

28. Mah LJ, El-Osta A, Karagiannis TC (2010). gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage

and repair. Leukemia. 24(4):679-86

29. Mladenov E, Iliakis G (2011). Induction and repair of DNA double strand breaks: the increasing spectrum

of non-homologous end joining pathways. Mutat Res. 711(1-2):61-72

30. Kass EM, Jasin M (2010). Collaboration and competition between DNA double-strand break repair

pathways. FEBS Lett. 584(17):3703-8

31. Langerak P, Russell P (2011). Regulatory networks integrating cell cycle control with DNA damage

checkpoints and double-strand break repair. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366(1584):3562-71

32. Pardo B, Gómez-González B, Aguilera A (2009). DNA repair in mammalian cells: DNA double-strand

break repair: how to fix a broken relationship. Cell Mol Life Sci. 66(6):1039-56

33. Hartlerode AJ, Scully R (2009). Mechanisms of double-strand break repair in somatic mammalian cells.

Biochem J. 423(2):157-68

34. Lieber MR (2010). The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-

joining pathway. Annu Rev Biochem. 79:181-211

35. Podhorecka M, Skladanowski A, Bozko P (2010). H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage

Response and Cancer Therapy. J Nucleic Acids. pii: 920161

36. Volokhov DV, Graham LJ, Brorson KA, Chizhikov VE (2011). Mycoplasma testing of cell substrates and

biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25(2-3):69-77

37. Freshney RI (2010). Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6th

rev. ed. Wiley-Blackwell.

38. Mycoplasma detection assay - Instructions for use. Online beschikbaar op www.lonza.com

39. Forgue-Lafitte ME, Coudray AM, Bréant B, Mester J (1989). Proliferation of the human colon carcinoma

cell line HT29: autocrine growth and deregulated expression of the c-myc oncogene. Cancer Res.

49(23):6566-71

40. Zhu B, Vemavarapu L, Thompson WJ, Strada SJ (2005). Suppression of cyclic GMP-specific

phosphodiesterase 5 promotes apoptosis and inhibits growth in HT29 cells. J Cell Biochem. 94(2):336-50

41. Potla L, Boghaert ER, Armellino D, Frost P, Damle NK (2002). Reduced expression of EphrinA1

(EFNA1) inhibits three-dimensional growth of HT29 colon carcinoma cells. Cancer Lett. 175(2):187-95

42. Yao K, Gietema JA, Shida S, Selvakumaran M, Fonrose X, Haas NB, Testa J, O'Dwyer PJ (2005). In

vitro hypoxia-conditioned colon cancer cell lines derived from HCT116 and HT29 exhibit altered

apoptosis susceptibility and a more angiogenic profile in vivo. Br J Cancer. 93(12):1356-63

43. Pawlik TM, Keyomarsi K (2004). Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy. Int J Radiat

Oncol Biol Phys. 59(4):928-42

44. Davis PK, Ho A, Dowdy SF (2001). Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian

cells. Biotechniques. 30(6):1322-6, 1328, 1330-1

45. Uzbekov RE (2003). Analysis of the cell cycle and a method employing synchronized cells for study of

protein expression at various stages of the cell cycle. Biochemistry (Mosc). 69(5):485-96

46. Parnaud G, Corpet DE, Gamet-Payrastre L (2001). Cytostatic effect of polyethylene glycol on human

colonic adenocarcinoma cells. Int J Cancer. 92(1):63-9

47. Abal M, Bras-Goncalves R, Judde JG, Fsihi H, De Cremoux P, Louvard D, Magdelenat H, Robine S,

Poupon MF (2004). Enhanced sensitivity to irinotecan by Cdk1 inhibition in the p53-deficient HT29

human colon cancer cell line. Oncogene. 23(9):1737-44

48. Liu BP, Chong EY, Cheung FW, Duan JA, Che CT, Liu WK (2005). Tangutorine induces p21 expression

and abnormal mitosis in human colon cancer HT-29 cells. Biochem Pharmacol. 70(2):287-99

49. Beels L, Werbrouck J, Thierens H (2010). Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci

induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. Int J

Radiat Biol. 86(9):760-8

50. Wu J, Fu Q, Quan Y, Wang W, Mei T, Li J, Yang G, Ren X, Xue J, Wang Y (2012). Repair rates of DNA

double-strand breaks under different doses of proton and γ-ray irradiation. Nucl Instrum Meth B. 276:1-6

51. Vandersickel V, Depuydt J, Van Bockstaele B, Perletti G, Philippe J, Thierens H, Vral A (2010). Early

increase of radiation-induced γH2AX foci in a human Ku70/80 knockdown cell line characterized by an

enhanced radiosensitivity. J Radiat Res. 51(6):633-41

52. Mah LJ, Orlowski C, Ververis K, Vasireddy RS, El-Osta A, Karagiannis TC (2011). Evaluation of the

efficacy of radiation-modifying compounds using γH2AX as a molecular marker of DNA double-strand

breaks. Genome Integr. 2(1):3

53. González JE, Barquinero JF, Lee M, García O, Casaco A (2012). Radiosensitization induced by the anti-

epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies cetuximab and nimotuzumab in A431 cells.

Cancer Biol Ther. 13(2):71-6














http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Forgue-Lafitte%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2684395

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Coudray%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2684395

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Br%C3%A9ant%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2684395

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mester%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2684395

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=1989%20doubling%20time%20ht29





























47

54. Dittmann K, Mayer C, Rodemann HP (2005). Inhibition of radiation-induced EGFR nuclear import by

C225 (Cetuximab) suppresses DNA-PK activity. Radiother Oncol. 76(2):157-61

55. Dittmann K, Mayer C, Fehrenbacher B, Schaller M, Raju U, Milas L, Chen DJ, Kehlbach R, Rodemann

HP (2005). Radiation-induced epidermal growth factor receptor nuclear import is linked to activation of

DNA-dependent protein kinase. J Biol Chem. 280(35):31182-9





DNA-herstelkinetiek en therapierespons bij gecombineerde...

Documents

Transcript of DNA-herstelkinetiek en therapierespons bij gecombineerde...