Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen

Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen

Academiejaar 2011-2012

Beïnvloeding van beta-alanine

retentie na chronische beta-alanine

suppletie

Masterproef voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de

Lichamelijke Opvoeding en de Bewegingswetenschappen

Door: Coussens Brendan en D’Hondt Anthony

Promotor: Prof. Dr. Derave Wim

Begeleider: Master Everaert Inge

-1-

-2-

VOORWOORD

Beste lezer

In de opleiding Master Lichamelijke Opvoeding komen heel wat interessante

onderzoeksdomeinen aan bod. We gaven beide onze voorkeur aan het onderzoeksdomein

“fysiologie van het menselijk lichaam”. Doordat carnosine in enkele lessen werd aangehaald,

steeg onze interesse voor dit metaboliet. De mogelijke prestatiebevorderende effecten en

andere positieve invloeden op het menselijk lichaam zijn zeer fascinerend. Door middel van

dit onderzoek hopen we ons steentje bij te dragen aan het werk van het onderzoeksteam van

het Hoger Instituut voor Lichamelijke Opvoeding onder leiding van prof. Derave.

Hierbij willen wij graag enkele personen danken voor de kans die we kregen om deze

masterproef te schrijven. In de eerste plaats danken wij onze promotor prof. Dr. Wim Derave

voor het selecteren en het begeleiden. Daarnaast danken wij ook onze begeleidster Inge

Everaert die ons perfect heeft bijgestaan met haar deskundige en motiverende feedback. Ook

willen we het onderzoeksteam en de proefpersonen bedanken voor hun bijdrage aan de

testafname. Tenslotte willen we onze ouders danken voor de kans die zij ons gaven om te

studeren aan de UGent.

In de eerste plaats hopen we dat deze masterproef een nuttige bron van informatie kan zijn bij

verder onderzoek. Daarnaast wensen we met deze masterproef de neutrale lezer op een

wetenschappelijke, maar begrijpelijke manier te boeien.

Wij nodigen u uit dit werkstuk met een kritische blik te lezen, zodat u ook geprikkeld wordt

om onderzoek te verrichten.

-3-

Inhoud

VOORWOORD

INHOUDSTAFEL

ABSTRACT

SITUERING ............................................................................................................................... 1

LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................. 2

A) Supplementatie van β-alanine en andere metabolieten .................................................. 2

1. Carnosine ..................................................................................................................... 2

1.1 Werking en functie ................................................................................................... 2

1.2 β-alanine ................................................................................................................... 4

1.3 Conclusie .................................................................................................................. 7

2. Creatine ........................................................................................................................ 8

2.1 Situering ................................................................................................................... 8

2.2 Supplementatie van creatine en de prestatiebevorderende effecten ........................ 8

2.3 Methode van supplementatie .................................................................................... 9

2.4 Invloed van koolhydraten ....................................................................................... 10

2.5 Insuline als determinant voor transport .................................................................. 11

2.6 Koolhydraten en eiwitten ....................................................................................... 11

2.7 Retentie van creatine .............................................................................................. 12

2.8 Optimaliseren van de creatineretentie .................................................................... 13

3. Carnitine .................................................................................................................... 14

3.1 Functiebeschrijving van carnitine .......................................................................... 14

3.2 Supplementatie van carnitine ................................................................................. 15

3.3 Carnitinetransporter OCTN2 .................................................................................. 15

3.4 Hyperinsulinemie via infuus .................................................................................. 16

3.5 Hyperinsulinemie door koolhydraatinname ........................................................... 16

3.6 Retentie van carnitine ............................................................................................. 17

4. Conclusie ................................................................................................................... 18

B) β-alanine metabolisme: de verscheidene pathways ...................................................... 19

1. β-alanine - carnosine reactieweg ............................................................................... 21

1.1 Carnosine synthase ................................................................................................. 21

-4-

1.2 -alaninetransport: van bloed naar spier ................................................................ 22

2. β-alanine - uracil reactieweg ...................................................................................... 24

3. β-alanine - malonaat semialdehyde - acetylCoA reactieweg ..................................... 26

3.1 β-alanine katabolisme ............................................................................................. 26

3.2 4-aminobutyraat aminotransferase (ABAT) & β-alanine-pyruvaat aminotransferase

...................................................................................................................................... 26

3.3 Metabolisme van malonaat semialdehyde .............................................................. 27

C) Onderzoeksvraag .......................................................................................................... 28

METHODE .............................................................................................................................. 29

A) Populatie ....................................................................................................................... 29

1. Rekrutering ................................................................................................................ 29

2. Aantal proefpersonen ................................................................................................. 29

B) Procedure ...................................................................................................................... 29

1. Dataverzameling ........................................................................................................ 29

2. Meetmomenten .......................................................................................................... 31

C) Meetinstrumenten ......................................................................................................... 32

1. Meting met de HPLC-methode .................................................................................. 32

2. Voorbereiding van de meting .................................................................................... 33

D) Data-analyse ................................................................................................................. 34

1. Berekenen van de β-alanineretentie ........................................................................... 34

2. Analyse van de β-alanineretentie ............................................................................... 34

RESULTATEN ........................................................................................................................ 35

1. Retentie van β-alanine na chronische supplementatie van β-alanine ........................ 35

2. Optimaliseren van β-alanineretentie door toevoeging van koolhydraten en eiwitten 36

3. Analyse van individuele waarden .............................................................................. 37

DISCUSSIE .............................................................................................................................. 39

1. Analyse van de resultaten .......................................................................................... 39

1.1 Retentie van β-alanine daalt niet na chronische supplementatie ............................ 39

-5-

1.2 Koolhydraten tonen geen effect op β-alanineretentie na chronische supplementatie

...................................................................................................................................... 39

2. Mogelijke verklaringen voor de hoge retentie van β-alanine ................................... 39

2.1 Reabsorptie van β-alanine in de nieren .................................................................. 39

2.2 Reactieweg naar energielevering ........................................................................... 40

2.3 Opname van β-alanine in de spier ter vorming van carnosine ............................... 41

2.4 Supplementatie van β-alanine kan concentratie carnosine in de hersenen doen

stijgen ........................................................................................................................... 41

2.5 Opname van β-alanine in organen .......................................................................... 41

2.6 Conclusie ............................................................................................................... 42

3. Vergelijking van de β-alanineretentie met de carnitine- en creatineretentie ............. 42

3.1 Een plafondeffect treedt op na supplementatie van creatine en carnitine .............. 42

3.2 Er treedt geen plafondeffect op na chronische supplementatie van β-alanine ....... 42

3.3 Vergelijking tussen de retentie van creatine, carnitine en β-alanine ...................... 43

4. Invloed van koolhydraten op de opname van β-alanine ............................................ 44

4.1 Activatie van β-alaninetransporter (TauT) door koolhydraatinname ..................... 44

4.2 Invloed van lage energievoorraad op de concentratie van aminozuren ................. 44

4.3 Link met de resultaten van het onderzoek .............................................................. 45

5. Verhogen van de (homo)carnosineconcentratie in het lichaam ................................. 45

5.1 Blokkeren van 4-aminobuyraat aminotransferase (ABAT) ................................... 45

6. Toekomstig onderzoek .............................................................................................. 45

6.1 Langer supplementeren .......................................................................................... 46

6.2 Voedingstoestand vergelijken ................................................................................ 46

6.3 Opname van β-alanine in de spieren ...................................................................... 46

6.4 Inhibitoren .............................................................................................................. 46

6.5 Invloed van fysieke activiteit op de opname van β-alanine in de spieren .............. 47

7. Eindconclusie ............................................................................................................. 47

REFERENTIES ........................................................................................................................ 48

-6-

ABSTRACT

De interesse in het metaboliet carnosine is tegenwoordig zeer groot. Vanuit de

sportwereld is men vooral geïnteresseerd in de prestatiebevorderende effecten van carnosine,

omdat het zou optreden als protonenbuffer. Onderzoek heeft aangetoond dat de

carnosineconcentratie in menselijke skeletspieren kan toenemen door supplementatie van β-

alanine. Bij acute supplementatie van β-alanine merkt men dat de retentie in de urine zeer

hoog is (96% bij gewone β-alanine; 98,9% bij slow-release β-alanine). Omdat bij andere

metabolieten zoals creatine en carnitine een daling van de retentie werd vastgesteld na

chronische supplementatie, werd in dit onderzoek gekeken of dit voor β-alanine ook het geval

is. Mannelijke proefpersonen (n = 7) werden gedurende zes weken (week 0 – week 5)

gesupplementeerd met PowerBar slow-release β-alanine (4.8 g/dag). Een repeated measures

test, afgenomen met het statistisch programma SPSS, toonde geen significante daling in β-

alanineretentie na zes weken β-alanine supplementatie (F = 1,148 ; p = 0,379). Daarnaast

werd in de literatuur beschreven dat de retentie van zowel creatine als carnitine steeg door de

supplementatie van beide metabolieten te combineren met koolhydraatinname. Ook deze

stelling werd nagegaan voor β-alanineretentie. De proefpersonen namen vanaf week twee

1x/week slow-release β-alanine in gecombineerd met twee energierijke snacks (PowerBar

Energize C2 Max (55g) & Powerbar Protein plus (55g)). Elke week werd gezocht naar een

significant verschil (p ≤ 0.05) tussen koolhydraten en placebo. Door middel van vier paired

sample T-testen werden beide condities aan elkaar getoetst. Zowel voor week 2 (F = 0.656 ; p

= 0.541), week 3 (F = -1.741 ; p = 0.142), week 4 (F = 0.096 ; p = 0.928) als week 5 (F =

1.320 ; p = 0.244) werden geen significante verschillen gevonden tussen de

koolhydraatconditie en de placeboconditie.

Uit dit onderzoek blijkt dat de retentie van β-alanine niet daalt na chronische

supplementatie van β-alanine. Ook heeft het aangetoond dat koolhydraten geen invloed

uitoefenen op de retentie van β-alanine. Toch leverden de resultaten interessante bevindingen

en theorieën op. Zo bleek dat het lichaam β-alanine niet graag wil afstaan aan de urine,

wellicht omdat β-alanine tal van nuttige reactiewegen kan doorlopen. Sommige van die

reactiewegen zijn reeds gekend maar verder onderzoek is nodig. Daarnaast werd gesteld dat

supplementatie van β-alanine gecombineerd met een toestand van insulinemia, kan zorgen

voor een grotere stijging van de carnosineconcentratie in de spier.

-1-

SITUERING

De olympische slogan "citius, altius, fortius" toont aan dat de competitie in topsport

steeds hogere pieken haalt. Atleten streven naar optimale prestaties, die hen legendarisch

maken. Om optimaal te presteren zoeken atleten vaak hulp in het gebruik van

voedingssupplementen. In topsport is voeding een onmiskenbare schakel geworden.

Welke voedingssupplementen precies een effect teweeg brengen en hoe groot deze

effecten kunnen zijn wordt al meer dan 50 jaar door fysiologen bestudeerd. Het metaboliet

carnosine krijgt tegenwoordig veel aandacht omdat men vermoedt dat het een positieve

invloed kan hebben op het prestatievermogen. Om een beter zicht te krijgen op de werking

van dit metaboliet wordt de fysiologische rol van carnosine grondig bestudeerd.

-2-

LITERATUURSTUDIE

A) Supplementatie van β-alanine en andere metabolieten

1. Carnosine

1.1 Werking en functie

Een aantal voedingssupplementen, waaronder carnosine, worden ingenomen om een

positief effect te bekomen op het energiemetabolisme. Het is belangrijk om eerst te kijken

naar de algemene kenmerken van carnosine vooraleer de prestatiebevorderende effecten

besproken worden.

Bij mensen kan men carnosine vooral aantreffen in de skeletspieren (99%). Carnosine

is een dipeptide dat bestaat uit L-histidine en β-alanine. Het enzym carnosine synthetase (of

synthase) (figuur 1) katalyseert de vorming van deze dipeptide in spier- en zenuwweefsel bij

ratten (Ng RH et al., 1978) en kippen (Winnick & Winnick, 1959) maar ook in skeletspieren

en zenuwcellen van het centrale zenuwstelsel bij mensen (Bakardjiev en Bauer, 1994).

Daarnaast kunnen mensen ook carnosine opnemen uit natuurlijke voedingsbronnen zoals

vlees en vis (Abe H et al., 2000).

Een aantal onderzoeken toonden aan dat carnosine een effect heeft op een aantal

aspecten van het uithoudings- en prestatievermogen van de spier. Allereerst zou het een

protonbuffer zijn (Bate-Smith EC, 1938) die ervoor zorgt dat de zuurtegraad minder snel

toeneemt bij intensieve inspanning (Baguet A et al., 2010). Daarnaast werd er gevonden dat

carnosine kan fungeren als regulator bij spiercontracties (Batrukova MA et al., 1997), als een

Figuur 1: De vorming van carnosine uit L-

histidine en β-alanine onder invloed van

carnosine synthetase in de skeletspier. β-alanine

-3-

antioxidant (Boldyrev AA., 1993), en als een bron van histidine voor synthese van histamine

(Flancbaum L et al., 1990).

Doordat carnosine heel wat positieve effecten heeft, zowel op vlak van gezondheid als

op sportief vlak, tracht men de concentratie ervan in het lichaam te verhogen (Stellingwerff T

et al., 2012). Het onderzoek van Dunnett en Harris (1999) waarbij men een significante

stijging van de carnosineconcentratie vond na supplementatie van β-alanine bij paarden, was

de aanleiding voor het onderzoek van Harris et al. (2006).

Harris et al. (2006) onderzochten bij menselijke subjecten het verschil tussen

supplementatie van vrije β-alanine en supplementatie van gebonden β-alanine met histidine,

gekend onder de naam carnosine.

De proefpersonen werden in vier groepen verdeeld en werden dagelijks gedurende vier

weken gesupplementeerd (figuur 2). Groep 1 (A-E) kreeg dagelijks 3.2g β-alanine, wat neer

komt op een totale toediening van 89.6g β-alanine in vier weken tijd. Groep 2 (F-J) kreeg

iedere week een hogere dosis β-alanine gesupplementeerd, goed voor 4g/dag in de eerste

week, oplopend tot 6.4g/dag in de vierde week. Groep 2 kreeg gedurende de vier weken in

totaal 145.6g β-alanine toegediend. De derde groep (K-O) kreeg L-carnosine toegediend

volgens hetzelfde stramien als groep 2. De absolute hoeveelheid werd aangepast zodat de

relatieve hoeveelheid carnosine isomolair gelijk zou zijn aan de dosis β-alanine. Groep 4 (P-

U) was de controlegroep en kreeg dagelijks een placebo (maltodextrine) toegediend.

Alle drie de

supplementatiemethoden zorgden voor

een even grote stijging van de

carnosineconcentratie in de skeletspieren

ten opzichte van het placebo (figuur 2).

Door het lage aantal proefpersonen vond

men geen significant verschil tussen

groep 1, groep 2 en groep 3. β-alanine is

dus een belangrijke precursor voor de

carnosine-synthese in de spieren.

Omdat de supplementatie van β-alanine even efficiënt is als supplementatie van

carnosine verkiest men het gebruik van β-alanine, wat goedkoper is. Tevens wordt carnosine

Figuur 2: Invloed van β-alanine en carnosine supplementatie

op de carnosineconcentratie in de spier (Harris RC et al.,

2006). (Zwart= pretest, wit = posttest; A -> J kreeg β-alanine,

K -> O kreeg carnosine, P -> U kreeg een placebo).

-4-

wanneer het in de bloedbaan terechtkomt, afgebroken door het enzym carnosinase (figuur 3)

(Asatoor AM et al., 1970; Sadikali F et al., 1975; Teufel M et al., 2003).

Figuur 3: Gesupplementeerde

carnosine wordt in de bloedbaan

afgebroken door het enzym

serumcarnosinase (groen)

1.2 β-alanine

β-alanine is dus de bepalende factor voor de carnosineconcentratie in het menselijk

lichaam. Dit metaboliet wordt in het menselijk lichaam gevormd in de lever als eindproduct

van de afbraak van uracil en thymine (Matthews en Traut, 1987). Maar, de concentratie β-

alanine in het lichaam is vrij laag ten opzichte van de concentratie L-histidine (Horinishi H et

al., 1978). De meeste carnivoren nemen β-alanine op via hun dieet, door de hydrolyse van

dipeptides.

Omdat het opnemen van β-alanine via natuurlijke bronnen beperkt is, opteert men om

β-alanine te supplementeren wanneer men de carnosineconcentratie in de spieren wil doen

stijgen. Zoals eerder beschreven toonde de studie van Harris et al. (2006) aan dat de

supplementatie van zowel β-alanine als

carnosine leidt tot een toename van de

carnosineconcentratie in de vastus

lateralis bij mensen.

Ook de studie van Stellingwerff

(2011), waarin men poogde om het

supplementatieprotocol verder te

optimaliseren toonde aan dat het

supplementeren van β-alanine leidt tot

een stijging van de

Figuur 4: Twee verschillende supplementatiemethoden voor β-

alanine. De controlegroep kreeg een placebo toegediend

(Stellingwerff T et al., 2011).

-5-

carnosineconcentratie in menselijke spieren (Baguet A et al., 2009; Harris RC et al., 2006;

Hill CA et al., 2007; Kendrick IP et al., 2008). Stellingwerff et al. (2011) kozen voor een

placebogecontroleerd, dubbel blind onderzoek waarin men twee supplementatiemethoden

ging vergelijken gedurende acht weken, gevolgd door een wash-out periode van nog eens acht

weken. Groep 1 (high-low groep) kreeg de eerste vier weken dagelijks 3.2g β-alanine

toegediend, gevolgd door 1.6g/dag in de laatste vier weken. De tweede groep (low-low groep)

kreeg gedurende acht weken dagelijks 1.6g β-alanine gesupplementeerd. Groep 3 was een

controlegroep, zij kregen dagelijks een placebo toegediend (figuur 4). Via een H-MRS werd

de carnosineconcentratie gemeten in de m. tibialis anterior en de m. gastrocnemius. De

metingen vonden plaats in week 0, 2, 4, 8, 12 en 16.

De resultaten van die metingen tonen aan dat beide supplementatiemethoden leiden tot

een toename in spiercarnosine. Er is wel duidelijk een verschil in grootte van toename van de

carnosineconcentratie. Hierdoor kon men concluderen dat de hoeveelheid β-alanine dat wordt

gesupplementeerd bepalend is voor de toename in carnosineconcentratie. Hoe groter de dosis

β-alanine, hoe meer carnosine er wordt gevormd in de spier. Men vond geen invloed van de

carnosineconcentratie in het begin van het onderzoek. Ook de invloed van het spiervezeltype

werd vergeleken tussen m. gastrocnemius (trage vezels) en m. tibialis anterior (snelle vezels)

(figuur 5), maar men vond geen invloed op de toename van carnosineconcentratie. Daarnaast

kon men aantonen dat de washout (afbraak van gevormde carnosine) vrij traag verliep (slechts

2%/week).

Figuur 5: Toename van de carnosineconcentratie in de m.gastrocnemius (A) en de m. tibialis anterior

(B). Men vond geen verschil in toename van carnosineconcentratie tussen beide spieren ondanks het

verschil in spiervezeltype. De m. gastrocnemius bestaat uit meer snelle spiervezels dan de m. tibialis

anterior. De beginconcentratie aan carnosine van de m. gastrocnemius was 3 mmol/kg ww groter dan

bij de m. tibialis anterior (p < 0.001) (Stellingwerff T et al., 2011)

-6-

Het is belangrijk om te weten welke supplementatiemethode wordt gehanteerd om de

opname van β-alanine te optimaliseren. De manier van supplementatie kan variëren in

dagelijkse dosis, frequentie, duur van supplementatie, verschil tussen high-responders en low-

responders,… Deze factoren moeten bijgevolg zodanig gemanipuleerd worden dat β-alanine

optimaal wordt opgenomen in het lichaam. De studie van Stellingwerff et al. (2011) toonde

aan dat er een verband is tussen de grootte van de dosis die men inneemt en de grootte van de

stijging in carnosineconcentratie. Helaas is het onmogelijk om grote dosissen te

supplementeren daar Harris et al. (2006) aantoonden dat één enkele dosis van meer dan 800

mg kan leiden tot klachten bij de subjecten. De klachten varieerden tussen vasodilatatie ter

hoogte van de huid, prikkelend gevoel en blozen.

Tegenwoordig maakt men ook gebruik van β-alaninetabletten die traag worden

vrijgegeven ter hoogte van de darmen (slow-release

tablets). Doordat de piek in het bloed veel lager is kan men

tot 1,6g in één enkele dosis supplementeren zonder dat er

symptomen van paresthesie optreden (Harris RC et al.,

2008; Décombaz J et al., 2011).

Men heeft kunnen aantonen dat de excretie van β-

alanine na supplementatie van slow-release β-alanine tot

70% lager was in vergelijking met gewone β-alanine

(figuur 6) gedurende de eerste twee uur (Décombaz J et al.,

2011). Men vond dat de retentie van slow-release β-alanine groter was dan de retentie van

gewone β-alanine (98.9 ± 0.9% vs 96.3 ± 2.1% met p < 0.0001). De retentie is zeer hoog,

maar blijft dit zo na een lange supplementatieperiode?

Via urine-analyses, toonde men in studies van relevante metabolieten aan dat

koolhydraten een verhoogde retentie teweeg kunnen brengen (Steenge GR et al., 2000;

Stephens et al., 2007). Dit kan een belangrijke bevinding zijn om toe te passen in het

onderzoek rond β-alanine, aangezien ook β-alanine via urine wordt uitgescheiden, weliswaar

in mindere mate dan de bestudeerde metabolieten (figuur 7) (Harris RC et al., 2006).

Figuur 6: Verschil in β-alanine verlies

via urine tussen gewone tabletten (REF)

en slow-release tabletten (TAB)

(Décombaz et al., 2011).

-7-

Na supplementatie van 10, 20 en

40 mg.kg-1

β-alanine vond men

respectievelijk retentiewaarden van 99.4

± 0.09%, 98.5 ± 0.40% en 96.4 ± 0.47%.

De retentie in de urine daalt dus bij

hogere supplementatie van β-alanine. De

verklaring voor deze bevinding ligt

waarschijnlijk bij de nieren, waar de

transporters in de proximale tubulus die

verantwoordelijk zijn voor de reabsorptie

van β-alanine, mogelijks overladen

worden wanneer meer dan 20 mg.kg-1

β-

alanine wordt toegediend bij eenmalige

supplementatie (Jessen et al., 1989). Bijgevolg komt er meer β-alanine in de urine terecht

waardoor men een daling van de retentie krijgt.

1.3 Conclusie

Carnosine- en β-alaninesupplementatie zorgen beiden voor een stijging van carnosine

in de spieren. Bij éénmalige supplementatie van slow-release β-alanine vindt men een

verhoogde retentie ten opzichte van de gewone β-alanine. De vraag rijst of de retentie gelijk

blijft bij langdurige supplementatie. Een grondige studie van creatine- en carnitineretentie is

vereist vooraleer onderzoek te doen naar de retentie van β-alanine.

Verschillende studies onderzochten de biologische precursoren van creatine en

carnitine. Tevens onderzocht men de rol en de functie van creatine en carnitine in de

skeletspieren (Bloch K et al., 1941; Walker JB, 1979; Alkonyi I et al., 1975; Fritz IB en

McEwen B, 1959). Men ontdekte dat deze metabolieten een rol spelen bij de energielevering

in de skeletspieren. Zoals later beschreven zal worden, heeft insuline een bevorderend effect

op de opname van deze metabolieten in de skeletspier (Hultman E et al., 1996; Stephens FB et

al., 2007). Om deze redenen worden beide metabolieten in de volgende hoofdstukken

nauwkeuriger bestudeerd.

Figuur 7: β-alanineconcentratie gevonden in urine na

supplementatie van 0, 10, 20 & 40 mg β-alanine per kg LG en

40 mg per kg kippenborst (carnosine). Bij 0 mg vond men

geen sporen van β-alanine terug in de urine. Bij 10 mg.kg-1

was de retentie 99.4 ± 0.09%, bij 20 mg.kg-1 was de retentie

98.5 ± 0.40% en bij 40 mg.kg-1 96.4 ± 0.47% (Harris RC et

al., 2006)

-8-

2. Creatine

2.1 Situering

Creatine is een metaboliet dat een functie heeft in het anaeroob

energieleveringssysteem. Creatine gebonden aan een fosfaatgroep (fosfocreatine) zorgt voor

een omzetting van het laag energetische ADP naar het hoog energetische ATP, waardoor

energie opnieuw voorradig is in de spier (figuur 8). Dit metaboliet zorgt dus enerzijds voor

een lage concentratie ADP en anderzijds voor een continue aanwezigheid van ATP in

anaerobe omstandigheden (Walker JB, 1979; Walliman T et al., 1992).

Figuur 8: Omzetting van fosfocreatine naar creatine onder invloed van het enzym creatine kinase. Bij deze reactie

wordt 1 ATP gevormd.

2.2 Supplementatie van creatine en de prestatiebevorderende effecten

Creatinesupplementatie zorgt voor een snellere resynthese van ATP in type II

spiervezels, waardoor de energievoorraad sneller aangevuld wordt. Op die manier zou

uitputting uitgesteld worden, wat leidt tot een verbeterde prestatie op inspanningen van

maximale intensiteit (Casey A et al., 1996; Birch R et al., 1994).

Casey en Greenhaff (2000) onderzochten verder de invloed van chronische

creatinesupplementatie op het metabolisme van de skeletspieren en het gevolg op de prestatie.

Zij vonden dat bij inspanningen van maximale intensiteit de ATP resynthese sneller verliep

door een verhoging van de beschikbaarheid aan fosfocreatine. Dit effect vonden ze ook terug

wanneer meerdere opeenvolgende inspanningen aan maximale intensiteit werden gedaan.

Creatine heeft geen bevorderende effecten bij inspanningen van lange duur en submaximale

intensiteit (Casey A en Greenhaff PL, 2000).

De fysiologische invloed van creatine beperkt zich dus duidelijk tot de eerste seconden

van een maximale inspanning (Casey A en Greenhaff PL., 2000). Zowel Casey en Greenhaff

(2000) als Birch et al. (1994) vonden dat de tijd vanaf de supplementatie tot het moment

waarop het effect van het metaboliet is uitgewerkt een belangrijke factor was voor het effect

van creatine-supplementatie op de prestatie van maximale intensiteit.

Omdat creatine positieve effecten teweeg brengt op het anaeroob prestatievermogen

heeft men dit metaboliet als supplementatiemiddel onderzocht. Er is gemiddeld 124 mmol/kg

-9-

creatine voorradig, wat overeenkomt met ongeveer 120g creatine voor een persoon van

ongeveer 70kg (Harris RC et al., 1974; Casey A en Greenhaff PL, 2000). Aangezien creatine

een belangrijke rol speelt in de stabiliteit van de energiehomeostase vindt men de grootste

concentratie terug in de skeletspieren (Hunter A, 1922; Walker JB, 1979). Creatine kan onder

twee vormen voorkomen, namelijk vrije creatine en fosfocreatine (65%) (Casey A et al.,

1996). De mens kan creatine opnemen uit natuurlijke voedingsbronnen zoals vlees en vis

(Walker JB, 1979).

Een belangrijke bevinding naar de supplementatie van creatine is de inter-individuele

verschillen vóór supplementatie. Blijkbaar varieert de totale hoeveelheid spiercreatine tussen

de 100 en de 150 mmol/kg droge massa (Harris RC et al., 1992). De belangrijkste determinant

voor de variabiliteit in creatineconcentratie in de spier is de spiervezeltypesamenstelling.

Type II spiervezels bezitten een grotere concentratie (fosfo-)creatine dan type I spiervezels,

met als gevolg dat type II spiervezels een hogere ATP-resynthese kunnen verwezenlijken

(Casey A et al., 1996).

2.3 Methode van supplementatie

Algemeen worden drie verschillende manieren van supplementatie gehanteerd om de

creatineconcentratie in de spier te verhogen. De snelle methode hanteert 20g/dag gedurende

vijf dagen (Harris RC et al., 1992). De trage methode hanteert 2g/dag gedurende 28 dagen

(Hultman E et al., 1996). Beide methoden zorgen voor een gemiddelde stijging van 20%,

alleen de tijdsperiode waarin deze stijging in creatineconcentratie gebeurt varieert dus.

Volgens de studie van Hultman et al.

(1996) zou de combinatie van beide

methoden ook vaak gebruikt worden. Na vijf

dagen supplementatie aan 20g/dag daalde

gedurende de daaropvolgende dagen de

totale creatineconcentratie bij de groep

waarbij de supplementatie werd stopgezet (=

controle groep). Wanneer de volgende dagen

slechts 2g/dag creatine wordt ingenomen (=

experimentele groep) merkt men een

stabilisatie van de totale creatineconcentratie

(Hultman E et al., 1996). Opnieuw dient er te

Figuur 9: De invloed van initiële creatineconcentratie in de

spier op de stijging van creatine in de spier na supplementatie

van creatine (Greenhaff PL et al., 1994).

-10-

worden vermeld dat er een inter-individuele variabiliteit in creatine-oplading bestaat. De

grootte van deze inter-individuele variabiliteit varieert tussen 2 en 40 mmol/kg droge massa.

Figuur 9 toont duidelijk de sterke en zwakke responders aan (Green AL et al., 1996;

Greenhaff PL et al., 1994; Harris RC et al., 1992), waarbij men vaststelt dat een lage initiële

creatineconcentratie vaak leidt tot een hoge respons (op de figuur de nummers 1, 2, 3 en 4).

Proefpersonen met een initieel hoge creatineconcentratie (op de figuur de nummers 5, 6, 7 en

8) vertonen dus een minder grote stijging in creatineconcentratie in de spieren (Greenhaff PL

et al., 1994).

2.4 Invloed van koolhydraten

Na deze bevindingen zijn onderzoekers gaan kijken hoe deze stijging nog verhoogd

kan worden bij responders of hoe er bij non-responders toch een significante stijging kan

bekomen worden. Zowel contracties (submaximale inspanningen) (Harris RC et al., 1992) als

aanwezigheid van insuline (Haughland RB en Chang DT, 1975) zouden de opname van

creatine stimuleren. Insuline wordt vrijgegeven in de bloedbaan wanneer de

bloedsuikerspiegel stijgt, bijvoorbeeld door inname van koolhydraatrijke snacks.

De eerste studie die onderzoek verrichtte naar het gebruik van koolhydraten was de

studie van Green et al. (1996). Men vond dat supplementatie van creatine in combinatie met

93g opgeloste koolhydraten een hogere toename van creatine in de spier veroorzaakte dan

wanneer deze koolhydraten afwezig

bleven (in de spier steeg de concentratie

creatine met 60% meer bij de

koolhydratengroep) (figuur 10). Verder

stelde men in deze studie een daling vast

in inter-variabiliteit bij de

koolhydratengroep. Men vond een

stijging van meer dan 20mmol/kg droge

massa van de totale spiercreatine. Er

wordt algemeen aanvaard dat een stijging

van 20 mmol/kg nodig is om te kunnen

spreken van een significant verschil in creatineconcentratie in de spier (Casey A et al., 1996;

Greenhaff PL et al., 1994). In deze studie vond men trouwens ook dat de combinatiemethode

Figuur 10: Invloed van creatinesupplementatie met (zwarte

balk) en zonder (witte balk) koolhydraatinname op de totale

stijging van creatine in de spier (Green AL, 1996).

-11-

voor een daling van de creatineconcentratie in het plasma zorgde, in vergelijking met de

methode waarin creatine alleen werd gesupplementeerd (Green AL et al., 1996).

2.5 Insuline als determinant voor transport

Dierenstudies wezen uit dat het stimulerend effect van koolhydraten te wijten is aan

insuline-gerelateerde opname van spiercreatine. Wanneer men koolhydraten inneemt stijgt de

concentratie van glucose in het bloed. Bij gezonde mensen leidt dit onmiddellijk tot het

vrijzetten van insuline in de bloedbaan ter hoogte van de alvleesklier.

Creatine kan via twee mechanismen in de spier terecht komen. Enerzijds zal de

depletie van fosfocreatine in de spier of een overaanbod van creatine in het bloed voor een

concentratiegradiënt zorgen waardoor creatine het membraan zal passeren (Fitch CD en

Shields RP, 1966; Fitch CD et al., 1968). Wanneer door biosynthese of door supplementatie

de creatineconcentratie in het bloedplasma stijgt, zal meer creatine in de spiercellen trekken

waarbij een specifieke creatinetransporter is betrokken (Wyss M en Kaddurah-Daouk R,

2000). Deze creatinetransporter (CreaT) is zeer specifiek voor creatine en laat geen andere

substanties via deze weg in de spiervezels (Williams MH et al., 1999). Anderzijds zal creatine

carrier-gemedieerd de natriumgevoelige spiercel binnenkomen (Daly MM en Seifter F, 1980).

Daar de natrium-kaliumpomp sterk wordt geactiveerd door insuline, zal meer natrium uit de

cel komen waardoor de opname van creatine vanuit het bloed naar de spiercellen zal stijgen.

Een insulinedrempel van 100mU/l is noodzakelijk om een waarneembaar effect te bekomen

op de toename van spiercreatine. (Hultman E et al., 1996; Odoom JE et al., 1996).

2.6 Koolhydraten en eiwitten

Glucose is de belangrijkste

regulator wat betreft het vrijmaken van

insuline via de alvleesklier, maar ook

eiwitten zouden grote effecten hebben op

het vrijmaken van insuline in de bloedbaan.

De vertering van koolhydraten gebeurt

moeilijker dan die van eiwitten. Om die

reden onderzochten Steenge et al. (2000) het

effect van creatinesupplementatie op

spiercreatine via vier verschillende condities.

Figuur 11: De insulineconcentraties in het serum

voor en na supplementatie van creatine met (witte

cirkel en zwart vierkant) en zonder (zwarte cirkel

en wit vierkant) koolhydraten(Steenge GR et al.,

2000).

-12-

Zowel de combinatie van eiwitten en koolhydraten (47g koolhydraten en 50g eiwitten)

en de hoge koolhydraatmethode (94g koolhydraten) zorgden voor een grotere stijging (25%)

van creatine in de spieren in vergelijking met de controlegroep. Beide methoden geven een

even hoge insulinevrijzetting weer door een gelijke oppervlakte onder de insuline-tijdcurve

(zie figuur 11), wat erop wijst dat het niet nodig is om grote hoeveelheden koolhydraten in te

nemen om hetzelfde effect te bekomen (Steenge GR et al., 2000). Dit houdt in dat de

insulineconcentraties zowel bij de hoge koolhydraatmethode als de eiwit-koolhydraatmethode

even hoog zijn en op hetzelfde tijdstip na de supplementatie vallen.

In hetzelfde onderzoek van Steenge et al. (2000) onderzocht men ook de hypothese dat

koolhydraten een verhoogde retentie teweeg brengen. Op figuur 12 is te zien dat zowel de

eiwit-koolhydraatmethode en de hoge koolhydraatmethode een significant hogere retentie

opleveren.

Ten eerste kan men op basis van deze

resultaten besluiten dat de creatine-excretie een

belangrijke indicator is voor de concentratie

creatine in de spier. Daarnaast heeft men ook

kunnen aantonen dat de totale creatine-excretie

in de urine verlaagd wordt wanneer de

supplementatie van creatine gecombineerd

wordt met 94g koolhydraten of door 47g

koolhydraten en 50g eiwitten (Steenge GR et al.,

2000).

2.7 Retentie van creatine

Harris et al. (1992), Preen et al. (2001) en Greenwood et al. (2003) toonden aan dat de

retentie van creatine in de urine daalde na chronische supplementatie van creatine. In de

studie van Harris et al. (1992) daalde de retentie overheen de drie dagen van 60% naar 32%

bij supplementatie van creatine. Preen et al. (2001) supplementeerden hun doelgroep dagelijks

20g/dag gedurende vijf dagen. Men toonde aan dat de creatineretentie daalde van 63% op dag

1 tot 46% op dag 5. Ook Greenwood et al. (2003) supplementeerden dagelijks 20g creatine

monohydraat gedurende drie dagen. Eveneens vond men een daling van de creatineretentie in

de urine. Op dag 1 was de retentie 72.3%, op dag 2 57.1% en op dag 3 53.6%. Elk van deze

onderzoeken tonen aan dat de retentie van creatine in de urine daalt bij chronische

Figuur 12: De totale creatineretentie bij de hoge

koolhydraatgroep en de combinatiegroep liggen

significant hoger dan de placebo en de lage

koolhydraatgroep (Steenge GR et al., 2000).

-13-

supplementatie van creatine. Hierdoor ging men op zoek naar manieren om de retentie, en dus

de opname in de spieren, van creatine te verhogen.

2.8 Optimaliseren van de creatineretentie

Een mengsel bestaande uit koolhydraten, eiwitten en aminozuren zorgde voor een

identieke verhoging in creatineretentie (figuur 13) en een even hoge insuline-excretie (figuur

14) als de eiwit-koolhydraatmethode en de hoge koolhydraatmethode (Pittas et al., 2010). Dit

mengsel is tevens calorie-armer en zorgt voor minder gastro-intestinale problemen (Van Loon

et al., 2000).

Figuur 14: De totale hoeveelheid creatine-excretie via de urine

bij enkel creatine-inname (zwart), bij creatine gevolgd door

95g koolhydraten (wit) en bij creatine gevolgd door 57g

koolhydraten, 14g eiwitten en 14g aminozuren (gestreept)

(Pittas G et al., 2010)

Figuur 13: Serum insuline concentraties na supplementatie

van creatine (ruiten), creatine met 95g koolhydraten

(vierkanten), creatine met 57g koolhydraten, 14g eiwitten,

14g aminozuren (driehoeken) (Pittas G et al., 2010)

-14-

3. Carnitine

3.1 Functiebeschrijving van carnitine

In de jaren 50 zijn verschillende onderzoeken verricht naar de fysiologische functie

van carnitine in de skeletspieren. Friedman en Fraenkel (1955) hadden in hun onderzoek

ontdekt dat carnitine kon worden geacetyleerd door acetyl-CoA en omgekeerd (Friedman S en

Fraenkel G, 1955). Daar acetyl-CoA een belangrijke intermediair is in de Krebscyclus, kan

men veronderstellen dat carnitine een rol kan spelen in het energiemetabolisme van de spier.

Overvloedig acetyl-CoA zorgt voor verbranding van glucose terwijl acetyl-carnitine

(ALCAR) zorgt voor vrijzetting van vrije vetzuren (Fritz IB, 1955). Latere studies hebben een

meer concrete functie beschreven: carnitine speelt een rol als substraat in de translocatie

(figuur 15) van vrije vetzuren in de mitochondriën (Fritz IB en McEwen B, 1959; Fritz IB en

Yue KTN, 1963).

Figuur 15: Schema van de metabole functies van carnitine. De rode pijlen tonen de functie van carnitine in de

translocatie van lange ketens vrije vetzuren: carnitine levert de acyl-groep. De blauwe pijlen tonen de tweede functie

van carnitine: carnitine treedt op als buffer voor het behoud van vrij CoA (Stephens FB et al., 2007).

Een tweede belangrijke rol is het vormen van acetylcarnitine om steeds vrije CoA

beschikbaar te hebben (Childress et al., 1966; Harris RC et al., 1987). In de studie van

Cederblad et al. (1974) werden concentraties carnitine gevonden, afhankelijk van de

-15-

spiergroep, variërend tussen 13.7 mmol/kg droge massa en 17.9 mmol/kg droge massa

(Cederblad G et al., 1974).

3.2 Supplementatie van carnitine

Het supplementeren van carnitine leidt bij mensen vaak tot een stijging van de

carnitineconcentratie in het bloedplasma, maar men vond weinig tot geen stijging van

carnitine in de spieren (Barnett C et al., 1994; Vukovich MD et al., 1994; Wächter S et al.,

2002). Vukovich et al. (1994) toonden aan dat de carnitineconcentratie in de spieren niet steeg

na supplementatie van 6g carnitine per dag gedurende 7 of 14 dagen. Later dat jaar toonde

ook de studie van Barnett et al. (1994) aan dat de carnitineconcentratie in de spieren niet steeg

na supplementatie van carnitine. De proefpersonen namen gedurende 14 dagen 4g/dag

carnitine in. Men vond duidelijk een stijging van de concentratie carnitine in het bloedplasma,

maar in de spieren vond men geen significante stijging. Een studie op lange termijn (2x2g

carnitine/dag gedurende 3 maanden) toonde ook geen significante stijging van de

carnitineconcentratie in de skeletspieren (Wächter S et al., 2002). Meer inzicht over het

transport van carnitine naar de skeletspieren is dus nodig om de carnitineconcentratie in de

spieren te verhogen.

3.3 Carnitinetransporter OCTN2

Carnitine in het bloedplasma is zodanig laag in vergelijking met de omliggende

weefsels dat actief transport noodzakelijk is om carnitine in andere weefsels te doen stijgen

(Cederblad G et al., 1974; Yue KTN en Fritz IB, 1962;

Brooks DE en McIntosh JE, 1975; Rebouche CJ, 1977).

Actief transport van carnitine werd ontdekt via de

activatie van het eiwit OCTN2 (Tamai I et al., 1998). Dit

is een carnitinetransporter die insulinegevoelig is (figuur

16). Stephens et al. (2007) vonden een stijging van 2.3

keer de OCTN2-expressie wanneer het lichaam in een

staat van hyperinsulinemie verkeert (Stephens FB et al.,

2007). Op basis van deze bevinding kan men concluderen

dat hyperinsulinemie voordelig is voor de opname van

carnitine in de spieren. Net zoals in de studies rond

creatine is een minimale hoeveelheid van 50 mU/l noodzakelijk om een zichtbare toename te

creëren van de carnitineconcentratie in de spieren. (Stephens FB et al., 2007). In de volgende

Figuur 16: De rol van insuline en de

natrium/kalium-pomp) op de

carnitinetransporter OCTN2 (Stephens

FB et al., 2007).

-16-

paragrafen worden studies besproken die de rol van hyperinsulinemie hebben onderzocht op

de totale carnitineconcentratie.

3.4 Hyperinsulinemie via infuus

Na de bevindingen over carnitinetransport

werden onderzoeken opgesteld om de

carnitineconcentratie in de spieren toch te doen

stijgen. In de studie van Stephens et al. (2007)

vond men reeds een significante stijging van

13% in de totale concentratie van

spiercarnitine wanneer hyperinsulinemie

veroorzaakt werd via een infuus, gevolgd door

een intraveneuze toediening van carnitine

(figuur 17).

3.5 Hyperinsulinemie door koolhydraatinname

Zoals eerder werd aangetoond, kan men ook hyperinsulinemie bekomen via het innemen

van koolhydraten. Een tweede onderzoek van Stephens et al. (2007) onderzocht de invloed

van koolhydraatinname op de carnitineopname en –retentie bij mensen. Het onderzoek

leverde twee belangrijke bevindingen op. Koolhydraten zorgen voor een lagere totale

carnitineconcentratie in de bloedbaan, wat duidt op een verhoogde opname in de spier in

vergelijking met controles (= zonder koolhydraten). In de urine vond men een lagere excretie

van totale carnitine, wat duidt op een verhoogde retentie van totale carnitine in vergelijking

met controles (= zonder koolhydraten).

Men kan concluderen dat een stijging in insuline, veroorzaakt door koolhydraatinname,

zorgt voor een hogere retentie van carnitine, wat resulteert in een hogere totale

carnitineconcentratie in het lichaam (Stephens FB et al., 2007).

Figuur 17: Totale spiercarnitineconcentratie bij

verschillende toestanden van hyperinsulinemie

(Stephens FB et al., 2007).

-17-

Uit het recente onderzoek van

Wall et al. (2011) is gebleken dat de

totale carnitineconcentratie in de

skeletspier met 21% kan stijgen door

middel van supplementatie na een

periode van 24 weken (figuur 18).

Als gevolg nam het vetmetabolisme

toe en werd glycogeendepletie in de

spier tegen gegaan tijdens inspanning

(30 minuten aan 50% VO2max, 30

minuten aan 80% VO2max en 30

minuten inspanningstest) (Wall BT et al., 2011). Wanneer proefpersonen 2x per dag 80g

koolhydraten innamen samen met 2g carnitine, steeg de totale carnitineconcentratie in de spier

significant in vergelijking met de groep die enkel 80g koolhydraten innam. Men vond ook een

halvering in spierglycogeenverbruik tijdens inspanningen van lage intensiteit. Het aandeel in

energielevering van vrije vetzuren verhoogde dankzij de verhoogde spiercarnitine (Wall BT et

al., 2011).

3.6 Retentie van carnitine

In de studie van Stephens et al. (2007) onderzocht men de carnitineretentie na chronische

carnitinesupplementatie (3g/dag) (figuur 19). Na drie dagen steeg de excretie van carnitine

wat natuurlijk neerkomt op een daling

van de retentie, bij zowel de

controlegroep 97.8% (dag 1) naar

90.6% (dag 3) als bij de

koolhydratengroep 98.2% (dag 1) naar

94.4% (dag 3). Hierdoor konden

Stephens et al. aantonen dat

koolhydraten een kleinere daling van

de carnitineretentie veroorzaken bij

chronische supplementatie (p < 0.01).

Figuur 18: 80g koolhydraten en 2g carnitine verhogen de totale

concentratie van carnitine in de spier in vergelijking met wanneer

gesupplementeerd wordt zonder koolhydraten (Wall BT et al.,

2011).

Figuur 19: Dagelijkse hoeveelheid carnitine die wordt

afgescheiden in de urine met (zwarte cirkels) en zonder (witte

cirkels) koolhydraten. Met koolhydraten werd significant (p <

0.01) minder carnitine uitgescheiden in de urine (Stephens FB

et al., 2007).

-18-

4. Conclusie

De studie rond de supplementatie en retentie van creatine en carnitine leverde enkele

interessante bevindingen op die men in acht moet nemen in het onderzoek naar de retentie van

β-alanine. De creatineconcentratie in de spieren kan stijgen door supplementatie van creatine,

daarentegen merkt men bij carnitine enkel een stijging van de carnitineconcentratie in het

bloedplasma en niet in de spieren. Er werd bij beide metabolieten aangetoond dat de retentie

daalde na chronische supplementatie.

Beide metabolieten worden bij het supplementeren beïnvloed door de insulineconcentratie

in het bloed. Insuline activeert de Na+/K

+-pomp en tevens ook de transporters die zorgen dat

het metaboliet wordt opgenomen in de spier. Om de insulineconcentratie te doen stijgen kiest

men in vele studies voor het toedienen van koolhydraten.

Omdat een grote hoeveelheid koolhydraten een negatieve invloed hebben op het gastro-

intestinaal stelsel heeft men gezocht naar alternatieven. Zo vond men dat een combinatie van

koolhydraten en eiwitten even efficiënt werkte als een hoge concentratie koolhydraten. Zelfs

de toevoeging van enkele aminozuren optimaliseerde de aanmaak van insuline en het

transport van creatine. Creatine en carnitine worden beter opgenomen in het lichaam wanneer

men deze samen met koolhydraten en eiwitten inneemt. Hierdoor kan men de hypothese

stellen dat dit ook het geval zou kunnen zijn voor β-alanine, omdat transporters van β-alanine

ook Na+-gevoelig zijn.

-19-

B) β-alanine metabolisme: de verscheidene pathways

De studie van Stellingwerff et al. (2011) toonde aan dat na éénmalige supplementatie

van -alanine slechts een paar procent in de urine terechtkomt. Dit wil zeggen dat een groot

deel van de gesupplementeerde -alanine wordt opgenomen in het lichaam. Men weet dat -

alanine onder andere wordt omgezet naar (spier)carnosine. Hoeveel -alanine er wordt

omgezet naar carnosine kan berekend worden doordat 100g -alanine zorgt voor een stijging

van 2 mmol/kg (Stellingwerff T et al., 2011). Bij een mens die 30 kg spieren bezit komt dit

neer op 5.34% dat wordt omgezet naar spiercarnosine. Op basis van dit getal kan men de

vraag stellen waar de andere 95% naar toe gaat.

Zoals afgebeeld op figuur 20 kan -alanine heel wat reactiewegen doorlopen waardoor er

meerdere metabolieten kunnen gevormd worden. In deze studie worden vier metabolieten en

hun bijhorende reactiewegen bestudeerd. De metabolieten die worden besproken zijn:

Carnosine (dit is het doelmetaboliet van dit onderzoek)

Uracil (mogelijke link naar eiwitsynthese)

Malonaat semialdehyde – acetylCoA (mogelijk link naar energievoorziening)

-20-

Figuur 20: Schema van het β-alaninemetabolisme: Het metaboliet β-alanine (rood) kan in het lichaam

ondermeer worden omgezet naar carnosine, uracil en malonaat semi-aldehyde (groen) (bron:

http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00410.html); geraadpleegd op 23 april 2012)

-21-

1. -alanine - carnosine reactieweg

1.1 Carnosine synthase

Het onderzoek van Kalyankar & Meister (1959) was één van de eerste onderzoeken

naar de vorming van carnosine uit -alanine. De onderzoekers vonden een enzym in de

borstspier van kippen. Wanneer dit enzym werd ingebed in een systeem dat L-histidine, -

alanine, magnesiumchloride en ATP bevatte, verkreeg men carnosine. Bijgevolg

concludeerde men dat dit enzym de reactie katalyseerde.

In het onderzoek van Stenesh & Winnick (1960) dacht men een reactievergelijking

voor de omzetting van -alanine naar carnosine te hebben gevonden. Zij veronderstelden dat

de reactie in twee stappen verliep:

1e stap:

-alanine + ATP + Enzym Enzym--alanine-AMP + PPi

(Mg2+ is vereist voor deze reactie)

2e stap:

Enzym--alanine-AMP + L-histidine L-carnosine + Enzym + AMP

Een recent onderzoek van Drozak et al. (2010) toonde echter aan dat het

veronderstelde reactiemechanisme niet juist is. In hun onderzoek vonden ze dat er geen AMP

maar ADP wordt gevormd bij de vorming van carnosine uit -alanine en L-histidine.

Drozak et al. (2010) verkregen bijgevolg deze reactie:

Correcte reactie:

-alanine + L-histidine + ATP carnosine + ADP + Pi

Omdat de reactieweg leidt tot ADP-vorming in plaats van AMP, stelde men de hypothese

dat het enzym carnosine synthase behoort tot de ATP-grasp familie. Hierdoor kon men

carnosine synthase moleculair identificeren als ATPGD1. De vorming van ADP in plaats van

AMP is energetisch gunstiger want 2 ADP ATP + AMP, terwijl AMP verder degradeert

naar IMP.

-22-

De reactie van L-histidine met -alanine tot carnosine gebeurt niet in de bloedbaan. Om

de concentratie carnosine in de spier te verhogen moet -alanine getransporteerd worden

vanuit de bloedbaan naar de spier. Dit transport kan gebeuren via verschillende transporters.

1.2 -alaninetransport: van bloed naar spier

Figuur 21: Transport van β-alanine uit de bloedbaan naar de spier via TauT of PEPT2 (Stellingwerff T et al., 2012).

Een studie bij embryonale spiercelculturen van kippen door Bakardjiev and Bauer (1994)

toonde aan dat het transport van -alanine naar de spiercellen verloopt via een β-

aminozuurtransporter die sterk afhankelijk is van Na+ en Cl

-. Deze transporter heeft een Km-

waarde van ~40 µM. Men heeft aangetoond dat zowel peptide transporter 2 (dit is een

transporter van dipeptides waaronder carnosine) (Lu H en Klaassen C, 2006) alsook de

taurine transporter (TauT) (Tomi M et al., 2008) zorgen voor het transport van -alanine in

verschillende celcultuur preparaties. In hun review hebben Stellingwerff et al. (2012) een

duidelijke figuur gemaakt van beide transporters (figuur 21). Harris et al. vonden in hun

onderzoek (Harris RC et al., 2006; Harris RC et al., 2010) dat taurine en -alanine elkaar

inhiberen voor deze gemeenschappelijke transporter. Hun eerste bevindingen (Harris RC et

al., 2006) toonden een stijging van de taurineconcentratie in het plasma na stijgende -

alanineconcentratie in het plasma. In verder onderzoek (Harris RC et al., 2010) vond men dat

de stijging in spiercarnosine als gevolg van -alanine supplementatie leidde tot een

-23-

omgekeerd effect van de taurineconcentratie in de spier. Dit toont aan dat -alanine het

taurinetransport kan inhiberen na supplementatie. Men vermoedt dus dat het transport van -

alanine uit het bloed naar de spier voornamelijk afhankelijk is van TauT.

Harris et al. (2006) toonde aan dat de supplementatie van 10 mg . kg-1

LG -alanine leidde

tot een toename in het bloedplasma van 50 à 100 µM binnen 30 minuten. Een minimum van

40 µM -alanine is nodig om het enzym/transporter-complex te laten werken aan 50% van de

maximale snelheid (Bakardjiev A en Bauer K, 1994).

In de studie van Xiang et al. (2006) bij muizen, heeft men aangetoond dat PEPT2 de

belangrijkste transporter is voor de opname van carnosine in astrocyten. Hierbij gaat het dus

om gebonden -alanine die wordt opgenomen in het centrale zenuwstelsel, vooral in de

hersenen. De onderzoekers stelden dat PEPT2 de dominantste, en misschien wel enige,

transporter is van carnosine in culturen van astrocyten.

Naast PEPT2 en TauT zijn er nog twee -alaninetransporters bekend, namelijk PAT1

dat niet Na+ en Cl

- afhankelijk is maar wel pH-afhankelijk daar het bindt met H

+ en ATB

0,+

dat net zoals TauT Na+ en Cl

- afhankelijk is (Anderson CM et al., 2009).

PAT1 en ATB0,+

bevinden zich in het darmepitheel van de mens. Ze zouden

verantwoordelijk kunnen zijn voor het transport van -alanine vanuit de darmwand naar het

bloed. Omtrent deze transporters is nog maar weinig onderzoek gedaan in de spier.

-24-

2. β-alanine - uracil reactieweg

Zoals eerder al aangehaald wordt β-alanine in het lichaam gevormd als afbraakproduct

van het uracil katabolisme. Uracil is een belangrijk metaboliet in het pyrimidine-metabolisme

en wordt gevormd in de lever (Fink RM et al., 1956; Canellakis ES, 1956; Grisolia S en

Cardoso SS, 1957; Fritzson P en Pihl A, 1957; Matthews MM en Traut TW, 1987). Men heeft

kunnen aantonen dat vegetariërs, die geen β-alanine opnemen uit natuurlijke

voedingsbronnen, toch nog carnosine in de spier aanwezig hebben (20-30%), hoewel dit lager

is in vergelijking met omnivoren (Everaert I et al., 2010). Mogelijks kan dit verklaard worden

door de endogene productie van β-alanine uit het uracil katabolisme. Deze reactieweg is

reversibel en verloopt in 3 stappen. Studies bij ratten hebben aangetoond dat de eerste stap

(Stap 1 op figuur 22) de snelheidsbepalende reactie is (Canellakis ES, 1956; Fritzson P en

Pihl A, 1957). Op het moment dat uracil omgezet is tot 5.6-dihydrouracil gebeurt de vorming

van β-alanine zeer snel (Stap 2 en 3 op figuur 22). Vegetariërs kunnen dus carnosine

aanmaken door β-alanine te halen uit uracilafbraak. Omgekeerd is het ook mogelijk dat

gesupplementeerde β-alanine wordt omgezet naar uracil.

Figuur 22: Reactieweg van uracil naar β-alanine (bron: http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00410.png;

geraadpleegd op 23 april 2012)

De reactie van uracil tot 5,6-Dihydroxyuracil is dus de belangrijkste reactie wat betreft

de omzettingsratio van uracil tot β-alanine (figuur 23) (Campbell LL, 1957; Canellakis ES,

1956; Fritzson P en Pihl A, 1957). De omzetting van uracil tot 5,6-Dihydroxyuracil gebeurt

door het enzym dihydrouracil dehydrogenase (DHU dehydrogenase). Deze reactie is verder

afhankelijk van de cofactor TPNH (TPNH = Reduced Triphosphopyridine Nucleotide)

(Canellakis ES, 1956).

Figuur 23: Stap 1: omzetting van uracil

naar dihydrouracil (bron: Campbell LL,

1957)

-25-

Canellakis’ onderzoek bij ratten bewees later dat er een link bestond tussen de

aanwezigheid van het enzym DHU dehydrogenase en het gebruik van uracil in de RNA-

synthese. Een blokkering van het enzym zou een verhoogd gebruik van uracil in de RNA-

synthese veroorzaken (Canellakis ES, 1957) en omgekeerd. Ook een beperkte hoeveelheid

TPNH in de lever kan ervoor zorgen dat uracil niet wordt gekataboliseerd.

-26-

3. -alanine - malonaat semialdehyde - acetylCoA reactieweg

3.1 β-alanine katabolisme

Pihl & Fritzson (1955) toonden met hun onderzoek bij ratten aan dat -alanine snel en

uitgebreid wordt geoxideerd. Hierbij wordt de koolstofketen omgezet naar azijnzuur, dat op

zijn beurt nodig is voor de vorming van acetylCoA. De overblijvende koolstofgroep wordt

omgezet naar CO2 dat wordt uitgeademd. De snelle oxidatie van -alanine is mogelijks één

van de redenen waarom er slechts een kleine concentratie -alanine wordt gevonden in urine.

Pihl & Fritzson suggereerden dat het losmaken van een aminogroep de eerste stap in de

oxidatie van -alanine inhield. Men verwees hierbij naar het onderzoek van Roberts &

Bregoff (1953), die aantoonden dat een enzym verantwoordelijk is voor de

transaminasereactie van -alanine met -ketoglutaraat in lever- en hersenweefsel.

3.2 4-aminobutyraat aminotransferase (ABAT) & β-alanine-pyruvaat aminotransferase

Twee enzymen zijn verantwoordelijk voor de omzetting van -alanine naar malonaat

semialdehyde. De eerste enzymatische onderzoeken werden gedaan bij bacteriën van de soort

Pseudomonas Fluorescens. Hierbij vond men het enzym -alanine--alanine transaminase,

beter bekend onder het synoniem -alanine-pyruvaat aminotransferase (Hayaishi O et

al.,1961). Zij vonden dat dit enzyme de reactie van -alanine naar malonaat semialdehyde

katalyseert. Het is een transaminase reactie wat wijst op het overdragen van een aminogroep,

zoals Pihl & Fritzson (1955) al suggereerden. Voor de vorming van malonaat semialdehyde

uit -alanine is pyruvaat vereist.

Hayaishi et al. (1961) vonden deze reactievergelijking:

-alanine + pyruvaat malonaat semialdehyde + L--alanine

Bij de mens zorgt vooral het enzym 4-aminobutyraat aminotransferase (-

alanine/GABA transaminase) voor de omzetting naar malonaat semialdehyde. Dit enzym

katalyseert de afbraak van zowel -alanine als GABA (Schor DS et al., 2001). Bij enkele

patiënten heeft men ontdekt dat een defect van het -alanine/GABA transaminase enzym

mogelijks de oorzaak is van hyper--alaninemia (Scriver CR et al., 1966). Als gevolg van

deze bevinding zou men kunnen proberen de concentratie carnosine in de hersenen te doen

stijgen door het gebruik van inhibitoren. Over inhibitie van het -alanine/GABA transaminase

is nog weinig onderzoek uitgevoerd. Het 4-amino-hex-5-enoic zuur is een anti-epilepticum

-27-

dat het enzym -alanine/GABA transaminase zou inhiberen (Lippert B et al., 1977). Naast

supplementatie van -alanine zou dit misschien een andere manier zijn om de

homocarnosineconcentratie te laten toenemen in de hersenen, maar verder onderzoek is

vereist.

3.3 Metabolisme van malonaat semialdehyde

Volgens Phil & Fritzson (1955) reageert malonaat semialdehyde in weefsels van

zoogdieren tot acetylCoA.

Deze reactieweg werd beschreven door Yamada & Jakoby (1960). Zij bestudeerden de

volgende reactievergelijking:

HOOCCH2CHO + DPN+ + CoASH CH2OSCoA + CO2 + DPNH + H

+

Bij bovenstaande decarboxylasereactie wordt acetylCoA rechtsreeks gevormd uit

malonaat semialdehyde. Yamada & Jakoby (1960) suggereerden dat de omzetting van

malonaatsemialdehyde naar acetylCoA wordt gekatalyseerd door slechts één enzym. Een

gelijktijdig onderzoek van Hayaishi et al. (1961) leverde een resultaat dat overeenstemde met

wat Yamada & Jakoby (1960) dachten. Hayaishi et al. (1961) gaven het verkregen enzym de

naam “malonaat semialdehyde oxidatieve decarboxylase”.

Men vindt dus de volgende reactieweg van -alanine naar acetylCoA:

-alanine malonaat semialdehyde acetylCoA

De vorming van acetylCoA is heel interessant omdat dit co-enzym onontbeerlijk is bij de

omzetting van oxaalacetaat naar citraat in de Krebscyclus. Men zou dus de hypothese kunnen

stellen dat -alanine onrechtstreeks bijdraagt aan energielevering via de Krebscyclus. Daar de

mens geen malonylCoA vormt uit malonaatsemialdehyde is de kans klein dat -alanine

bijdraagt aan de vrije vetzuursynthese, te weten dat malonylCoA nodig is voor de opstart van

deze reactieweg. Het is wel mogelijk dat acetylCoA wordt omgezet naar malonylCoA door

het enzym acetylCoA carboxylase (biotine-afhankelijk), maar dit zal waarschijnlijk enkel

mogelijk zijn wanneer er veel energie voorradig is (Luo DX et al., 2012).

-28-

C) Onderzoeksvraag

De retentie van creatine en carnitine bij acute supplementatie van humane subjecten is

respectievelijk ± 65% en ± 98%. In de literatuur beschreef men voor -alanine

retentiewaarden hoger dan 95% wanneer men acuut supplementeerde. Bij chronische

supplementatie van creatine en carnitine merkt men een significante daling in de retentie van

deze stoffen (van ± 65% naar ± 53% voor creatine en van ± 98% naar 91% voor carnitine).

Daarom kan men de vraag stellen wat het effect is van chronische supplementatie van -

alanine op de retentiewaarden van -alanine. Over een supplementatieperiode van zes weken

verwacht men een significante daling in de -alanineretentie bij humane subjecten, zoals die

ook werd gevonden bij creatine en carnitine.

Een tweede belangrijke bevinding is de invloed van de koolhydraatgerelateerde

insulinerespons in het bloed op de totale retentie van creatine en carnitine. Creatine- en

carnitinetransport zijn Na+/Cl

- afhankelijk, waardoor een verhoogde insulineconcentratie in

het bloed zorgt voor een verhoogde activiteit van deze transportsystemen in het membraan

van de spiercel omdat insuline zorgt voor Na+ vrijzetting door de Na

+/K

+-pomp. In

verschillende studies probeerde men de significante daling van de retentie na chronische

supplementatie, tegen te gaan door koolhydraten (en eiwitten) samen in te nemen met creatine

of carnitine. Men veronderstelde dat de verhoogde insulineconcentratie in het bloed ervoor

zou zorgen dat meer creatine of carnitine in de spier terecht zou komen en aldus de retentie

van deze metabolieten zou verhogen in humane subjecten. Wanneer men dus chronisch -

alanine supplementeert zou men met koolhydraten de retentie kunnen verhogen, indien er

effectief een daling in retentiewaarden van -alanine wordt gevonden.

In dit onderzoek wordt nagegaan of de retentie van -alanine bij humane subjecten daalt

na chronische supplementatie van β-alanine over een periode van zes weken. Indien er een

daling wordt gevonden bij deze humane subjecten wordt er gekeken of koolhydraten en

eiwitten de retentie van -alanine kunnen verhogen.

-29-

METHODE

A) Populatie

1. Rekrutering

De proefpersonen werden gecontacteerd door een bericht ad valvas en via Minerva

(elektronisch leerplatform van de Universiteit van Gent). Er werd gevraagd om vrijwillig

contact op te nemen met het onderzoeksteam. De respons was vrij laag, daarom werden leden

van het onderzoeksteam ingeschakeld om aan voldoende proefpersonen te komen.

Inclusiecriteria waren de volgende:

Mannelijk

Leeftijd tussen 18 en 28 jaar

Nemen geen medicatie in

Gedurende 6 weken beschikbaar op de faculteit

Gezond

2. Aantal proefpersonen

Er namen zeven proefpersonen deel aan het onderzoek. Hun gemiddelde leeftijd bedroeg

22,1 ± 1,3 jaar. De gemiddelde lengte bedroeg 179,9 ± 7,9 cm en het gemiddelde gewicht was

80,7 ± 11,8 kg.

B) Procedure

1. Dataverzameling

Zeven proefpersonen werden onderzocht gedurende zes weken. Tijdens die zes weken

werd er dagelijks 4,8g β-alanine gesupplementeerd aan de hand van zes pillen. Elke pil

bevatte 0,8g β-alanine, men nam er telkens twee op drie verschillende momenten. Er was

minstens een periode van twee uur tussen elk moment van supplementatie.

De eerste twee weken van het onderzoek werd één keer per week een retentietest

afgenomen. Deze proefpersonen dienden nuchter (noch eten noch drinken) te zijn vanaf 12u

-30-

’s nachts. Eerst werd de ochtendurine verzameld, daarna werd op een nuchtere maag 1,6g β-

alanine ingenomen. Gedurende de volgende zes uren mocht men niets innemen (behalve

water) terwijl men de urine collecteerde. Belangrijk om weten is dat de urine in één bidon

werd verzameld.

Na deze zes uren werd een laatste maal de urine verzameld. Vanaf week drie van het

onderzoek werd deze retentietest twee keer per week (opeenvolgende dagen) afgelegd. Hier

werd echter de rol van koolhydraatinname bestudeerd. Op één van de twee testdagen moest de

proefpersoon na de inname van twee pillen β-alanine, koolhydraten en eiwitten innemen

onder de vorm van energierijke snacks, terwijl de andere testdag op dezelfde wijze verliep

zoals de eerste twee weken. Er werden twee energierijke snacks van PowerBar gebruikt in het

onderzoek. De eerste snack, Energize C2 Max (55g), is een koolhydraatrijke snack. De

tweede energiereep, de Protein plus (55g), is vooral een eiwitrijke snack (figuur 24). Om een

constant verhoogde insulinespiegel te bekomen dienden de proefpersonen de eerste reep (C2

max) te eten tussen minuut 10 en minuut 15, na inname van de β-alanine pillen. De tweede

reep (protein plus) diende tussen minuut 55 en 60 gegeten te worden. De energetische

waarden van beide energierepen worden beschreven in tabel 1.

Tabel 1: Energetische waarden van de energierepen die werden gebruikt in het onderzoek (PowerBar Europe

GmbH). Daarnaast werd de som gemaakt voor iedere energiebron, zodat de totale inname bekend is.

Energize C2Max (per

55g) Protein plus (per 55g) Som (110g)

Energie kJ (kcal) 844 (199) 924 (220) 1768 (419)

Eiwitten 5,8g 16,6g 32,4g

Koolhydraten 39,1g 22,2g 61.3g

Waarvan suikers 23,7g 19,5g 43.2g

Vetten 2,0g 6,5g 8.5g

Waarvan verzadigd 0,4g 3,9g 4.3g

Voedingsvezels 0,8g < 1,0g < 1.8g

Natrium 0,19g 0,04g 0.23g

Figuur 24: PowerBar Energize C2 Max (55g) & Protein plus (55g) (PowerBar Europe GmbH).

-31-

2. Meetmomenten

Gedurende zes weken werd er twee maal per week urine gecollecteerd (de eerste twee

weken slechts één maal per week) voor een voorbeeld van een testperiode zie tabel 2.

Tabel 2: Schematische voorstelling van een testperiode.

WEEK 1 WEEK 2 WEEK 3 WEEK 4 WEEK 5 WEEK 6

Testdag 1 PLA PLA PLA CHO PLA CHO

Testdag 2 Geen test Geen test CHO PLA CHO PLA

PLA = urinetesten zonder koolhydraten

CHO = urinetesten met koolhydraten

Ieder testmoment werd volgens hetzelfde protocol afgenomen. Een voorbeeld van een testmoment

wordt weergegeven in tabel 3.

Tabel 3: Schematische voorstelling van een testdag waarbij het individu start om 07u00.

TIJDSTIP Beschrijving PLA Beschrijving CHO

00:00 Nuchter blijven vanaf dit moment Nuchter blijven vanaf dit moment

07:00 Ochtendurine verzamelen + 1,6g β-

alanine innemen

Ochtendurine verzamelen + 1,6g β-

alanine innemen

07:10 – 07:15 Nuchter blijven (enkel water) Inname 1e koolhydraatrijke snack

(C2max Berry Blast)

Enkel water drinken

07:55 – 08:00 Nuchter blijven (enkel water) Inname 2e koolhydraatrijke snack

(Protein Plus)

Enkel water drinken

07:00 – 13:00 Nuchter blijven (enkel water)

Urine verzamelen in bidon

Enkel water drinken

Urine verzamelen in bidon

13:00 Laatste maal urine verzamelen Laatste maal urine verzamelen

13:00 – 20:00 Nog twee maal 1,6g β-alanine innemen Nog twee maal 1,6g β-alanine innemen

-32-

C) Meetinstrumenten

1. Meting met de HPLC-methode

In dit onderzoek werden de urinestalen gemeten met de HPLC-methode. HPLC staat voor

High-Performance Liquid Chromatography en is in staat de deeltjes die aanwezig zijn in een

vloeibare oplossing te scheiden, te identificeren en te kwantificeren. Een pomp stuwt een

vloeistof vanuit het reservoir naar de kolom. Deze fase wordt de mobiele fase genoemd en is

gekenmerkt door hoofdzakelijk een polaire buffer. De verschillende deeltjes bewegen met

verschillende snelheden door de kolom. Afhankelijk van de polariteit van de opgeloste

deeltjes zullen ze sneller (meer polaire deeltjes) of trager (meer apolaire deeltjes) door de

kolom bewegen. Bijgevolg verlaten de deeltjes de kolom op een verschillend tijdstip.

Een UV-detector vertaalt deze intervallen naar een chromatogram op de computer. Het

chromatogram toont een tijd-as waarop verschillende pieken te zien zijn die overeenkomen

met een respons van de UV-detector. Iedere piek kan gelinkt worden aan een specifieke

metaboliet. De opstelling van alle apparatuur wordt weergegeven in figuur 25.

Figuur 25: Voorstelling van de HPLC-methode zoals deze werd toegepast in het onderzoek: Hoge druk gradiënt

systeem (bron: http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10048919 geraadpleegd op 30 april 2012).

Om te weten welke piek moet gelinkt worden met β-alanine heeft men de resultaten

gespiked. Hierbij worden twee urinestalen door de HPLC gestuwd. De ene urinestaal heeft

normale concentraties van alle metabolieten en aan de andere urinestaal werd een hoeveelheid

β-alanine toegevoegd. Op het chromatogram worden beide grafieken op elkaar gelegd en

-33-

merkt men één moment waarop de pieken duidelijk verschillen. Deze piek komt dan overeen

met β-alanine. De resultaten van deze methode tonen ons dat deze piek steeds rond minuut

11,3 valt (bron: http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10048919 geraadpleegd op 30

april 2012)

2. Voorbereiding van de meting

Vooraf werd 11.1 µL SSA toegevoegd aan 100 µL urine. Na centrifugatie (5 min) werd

100 µL vacuüm gedroogd gedurende 45 min bij een temperatuur van 40°C. Na het drogen

werd het residu opgelost in 40 µL van een gekoppelde reagens nl.

methanol/triethylamine/H2O/phenylisothiocyanate (verhouding 7/1/1/1). Deze reagens (PITC)

fungeert als een vlag die wordt aangebracht op de deeltjes en is een herkenningspunt in een

later stadium. De totale reactietijd van de deeltjes en het reagens bedroeg 20 minuten op

kamertemperatuur. Hierna werd het sample opnieuw gedroogd en opgelost in een buffer van

100 µL natrium acetaat (10mM, pH 6.4). Als laatste stap werd het gederivatiseerde sample

(20 µL) geïnjecteerd in een Waters HPLC systeem met volgende parameters:

Spherisorb kolom ODS-2 5 µM (4.6 mm x 150 mm, 5 µm), UV detector (golflengte 254

nm), 3 buffers (A = [10 mM natrium acetaat aangepast aan pH 6.4 met 6% azijnzuur], B =

[60% acetonitrile – 40% buffer A], C = [100% acetonitrile]), debiet = 0.8 mL/min, 25°C. Het

tijdsinterval van de buffers wordt weergegeven in tabel 4.

De limiet voor detectie en kwantificatie waren respectievelijk 3 µM en 10 µM.

Tabel 4: Toevoeging van de buffers in functie van de tijd. Bij de start wordt enkel buffer A (polair) toegevoegd. Na 10

minuten wordt buffer B (apolair) geleidelijk aan toegevoegd tot 100% op minuut 34. Vanaf minuut 35 wordt buffer C

(ACN) toegevoegd om de kolom te spoelen en klaar te maken voor een volgende meting.

Tijd (min) % buffer A

(H2O acet)

% buffer B

(40% buffer A – 60% ACN)

% buffer C

(100% ACN)

0 100 0 0

10 87 13 0

30 72 28 0

34 0 100 0

35 0 0 100

50 100 0 0

70 100 0 0

-34-

D) Data-analyse

1. Berekenen van de β-alanineretentie

Bij iedere meting kan men de β-alaninepiek vinden rond minuut 11,3. Hierdoor kan

worden afgeleid hoeveel deeltjes er aanwezig zijn in het sample door middel van de

oppervlakte onder de curve. Eens de oppervlakte onder de curve gekend is, kan er berekend

worden hoeveel milligram β-alanine er terechtkomt in de urine. De concentratie β-alanine (x)

kan berekend worden aan de hand van volgende formule: y = ax+b (= standaardcurve met y =

oppervlakte onder de curve, a = richtingscoëfficiënt, b = intercept). Door deze waarde

percentueel te vergelijken met de hoeveelheid β-alanine die gesupplementeerd werd bekomt

men de β-alanineretentie.

Zo verkrijgt men voor elke proefpersoon 20 retentiewaarden (10 testafnames: pre en post).

In dit onderzoek zijn vooral de postwaarden van belang. Er wordt gezocht naar een significant

tijdsverschil binnen de placeboconditie, maar ook tussen placebo en koolhydraten. Hiervoor

worden de berekende retentiewaarden ingegeven in het statistisch programma SPSS.

2. Analyse van de β-alanineretentie

Om de eerste stelling te toetsen werd er gebruik gemaakt van de repeated measures test.

Hierbij werden alle post-waarden van de placebogroep gecontroleerd op een significant

verschil. Zo kon er eventueel een daling in de retentie worden waargenomen na chronische

supplementatie van β-alanine. Er wordt pas een significant verschil aangenomen wanneer het

hoofdeffect van het meetmoment een p-waarde oplevert die kleiner is of gelijk aan 0,05 (p ≤

0.05).

De tweede stelling werd getoetst door middel van vier paired sample T-testen. Iedere

week werd de placebotest vergeleken met de koolhydraattest. Indien er een significant

resultaat (p ≤ 0.05) werd gevonden zou dit betekenen dat de retentiewaarde op de

koolhydraattest significant verschilt van de retentiewaarde op de placebotest. Door de

gemiddelden te vergelijken kan er besloten worden welke conditie de hoogste retentiewaarde

oplevert.

-35-

RESULTATEN

1. Retentie van β-alanine na chronische supplementatie van β-alanine

De gemiddelde retentiewaarden van ieder meetmoment (placebo) zijn weergegeven in

tabel 5. De repeated measures test leverde geen significant resultaat voor het hoofdeffect van

het meetmoment: F = 1,148 ; p = 0,379. Hieruit kan er besloten worden dat de

retentiewaarden van β-alanine noch stijgen, noch dalen na chronische supplementatie van β-

alanine.

Figuur 26 is een staafdiagram van alle uitgevoerde meetmomenten voor de

placeboconditie. De staven tonen aan dat de retentiewaarden van ieder meetmoment

nauwelijks verschillen van alle andere meetmomenten. Er wordt geen daling in de retentie van

β-alanine waargenomen na chronische supplementatie.

Tabel 5: Gemiddelde retentiewaarden van de placebotesten (week 0 t.e.m. 5)

Gemiddelde retentiewaarde (%) Standaard afwijking (%)

Week 0 98,40 ± 1,41

Week 1 97,98 ± 1,45

Week 2 98,45 ± 1,20

Week 3 98,05 ± 0,85

Week 4 98,40 ± 0,47

Week 5 98,71 ± 0,50

Figuur 26: Staafdiagram van de β-

alanineretentie overheen de weken 0

tot 5 van de

placeboconditie (= zonder

koolhydraten) toont aan dat de

retentie niet daalt na een

supplementatieperiode van 6 weken.

-36-

2. Optimaliseren van β-alanineretentie door toevoeging van koolhydraten en

eiwitten

Er werd geen daling in β-alanineretentie gevonden waardoor de retentiewaarde na zes

weken supplementeren nog steeds zeer hoog is. Toch werd er gekeken of de invloed van

koolhydraten de retentie alsnog deed stijgen. In tabel 6 worden de gemiddelde

retentiewaarden weergegeven voor ieder meetmoment met koolhydraten.

Tabel 6: Gemiddelde retentiewaarden voor de koolhydraatconditie overheen de 4 weken waarin koolhydraten werden

gebruikt.

Gemiddelde retentiewaarde (%) Standaard afwijking (%)

Week 2 98,37 ± 0,92

Week 3 98,71 ± 0,83

Week 4 98,54 ± 0,98

Week 5 97,81 ± 1,76

Bij ieder meetmoment worden beide condities met elkaar vergeleken door middel van de

paired sample T-test. De resultaten van deze vergelijkingen worden weergegeven in tabel 7.

Op geen enkel meetmoment werd er een significant verschil gevonden tussen de

placeboconditie en de koolhydraatconditie.

Tabel 7: Resultaten van de paired sample T-test: placeboconditie vergeleken met koolhydraatconditie. Een significant

verschil word aangenomen bij p ≤ 0.05.

T-waarde p-waarde

Week 2 (PLA - CHO) 0.656 0.541 (n.s.)

Week 3 (PLA - CHO) -1.741 0.142 (n.s.)

Week 4 (PLA - CHO) 0.096 0.928 (n.s.)

Week 5 (PLA - CHO) 1.320 0.244 (n.s.)

-37-

In onderstaande grafiek (figuur 27) worden de resultaten grafisch weergegeven. Er is

duidelijk geen zichtbaar verschil tussen beide condities waar te nemen. Hierdoor kan besloten

worden dat koolhydraten geen effect uitoefenen op de retentie van β-alanine na chronische

supplementatie waardoor ook de tweede hypothese verworpen kan worden.

3. Analyse van individuele waarden

Wanneer men figuur 28 bekijkt merkt men dat er geen merkbare tendensen zijn. Alle

waarden lopen door elkaar zonder enig verband aan te tonen. Dit wijst er op dat de personen

Figuur 27: De retentiewaarden van β-alanine voor beide condities (wit = koolhydraatconditie;

zwart is placeboconditie) tonen aan dat er geen significant verschil te vinden was tussen de

twee condities.

Figuur 28: Retentiewaarden voor elke proefpersoon afzonderlijk. Alle proefpersonen toonden na week 5 een even

hoge retentie.

-38-

onderling niet verschillen in de placeboconditie. Men kan ook niet spreken van high- en low-

responders, aangezien de ene proefpersoon initieel en na vijf weken hoog scoort maar

daartussen laag (proefpersoon 1) en de andere proefpersoon juist laag scoort initieel en na vijf

weken maar daartussen hoog (proefpersoon 4).

In figuur 29 zijn de individuele testscores tussen placebo en koolhydraatgroep

tegenover elkaar uitgezet. Opnieuw zien we zeven verschillende grafieken zonder enige

significantie. Alle waarden variëren immers tussen 95% en 99.5%.

Uit deze grafieken is dus duidelijk te concluderen dat de retentiewaarden voor zowel

de placebogroep als voor de koolhydraatgroep zeer hoog zijn en blijven gedurende zes weken

van supplementatie.

Figuur 29: Individuele testscores

tussen placebo (blauw) en

koolhydraten (rood). Bij geen

enkele proefpersoon werd een

significant verschil gevonden.

-39-

DISCUSSIE

1. Analyse van de resultaten

1.1 Retentie van β-alanine daalt niet na chronische supplementatie

De eerste hypothese die stelde dat de retentie van β-alanine na chronische

supplementatie zou dalen, kan op basis van de resultaten van dit onderzoek verworpen

worden. Wanneer de gemiddelde retentiewaarde van week 0 (98.4 ± 1.41 %) vergeleken

wordt met die van week 5 (98.71 ± 0.50 %), merkt men duidelijk geen daling. Optimaliseren

van de retentie van β-alanine is bijgevolg niet nuttig, aangezien na zes weken nog steeds hoge

concentraties β-alanine door het lichaam worden opgenomen. Mogelijke redenen voor de

hoge retentie van β-alanine en mogelijke verschillen tussen enerzijds β-alanine en anderzijds

creatine en carnitine, worden besproken in volgende hoofdstukken.

1.2 Koolhydraten tonen geen effect op β-alanineretentie na chronische supplementatie

Daarnaast werd er in de literatuur beschreven dat de retentie van creatine en carnitine

kan stijgen door inname van koolhydraten en eiwitten (Steenge GR et al. 2000; Greenwood M

et al., 2003; Stephens FB et al., 2007), maar in deze studie blijkt dat dit niet het geval is voor

β-alanine. Wel dient te worden vermeld dat de retentie van β-alanine reeds zeer hoog is

(gemiddelde van alle metingen samen: 98.40 ± 0.79 %). Op basis van deze resultaten blijkt

dus dat koolhydraten (en eiwitten) geen effect hebben op de retentie van β-alanine na een

supplementatieperiode van zes weken. Hierdoor kan men stellen dat ook de tweede hypothese

dient verworpen te worden.

2. Mogelijke verklaringen voor de hoge retentie van β-alanine

2.1 Reabsorptie van β-alanine in de nieren

Wanneer β-alanine wordt gesupplementeerd wordt het via de brush border in de

dunne darm opgenomen in het bloed. De transporters hiervoor verantwoordelijk zijn PAT1 en

TauT (Anderson CM et al., 2009). ATB0,+

werd in dit onderzoek ook onderzocht, maar men

vond dat deze transporter niet deelnam aan het transport van β-alanine vanuit de dunne darmn

naar het bloed. Vanuit het bloed kan β-alanine worden getransporteerd naar de skeletspieren

en naar het centrale zenuwstelsel. Indien β-alanine nergens in het lichaam wordt opgenomen,

zal het uiteindelijk naar de nieren worden gebracht. De nieren filteren het bloed en

reabsorberen bruikbare stoffen, waaronder β-alanine, uit de urine. De gereabsorbeerde stoffen

komen zo terug in de bloedcirculatie terecht. De transporters zouden volgens Jessen H (1994)

-40-

Na+

en Cl- afhankelijk zijn, waardoor de kans groot is dat de hiervoor vernoemde transporters

ook in de nieren actief zijn. Wanneer men β-alanine supplementeert stijgt de concentratie β-

alanine in het bloed waardoor de transporters in de nieren wellicht overladen worden. Dit zou

verklaren waarom er toch een klein deel van de gesupplementeerde β-alanine in de urine

terechtkomt. Niettegenstaande is het aminozuur β-alanine een aantrekkelijk metaboliet voor

het lichaam, waardoor het zo lang en zo veel mogelijk wordt opgehouden. De verschillende

mogelijke bestemmingen voor β-alanine worden hieronder opgesomd.

2.2 Reactieweg naar energielevering

Een mogelijke verklaring voor de hoge retentie van β-alanine is

misschien te vinden in de reactiewegen die β-alanine kan doorlopen.

Rekening houdend met het feit dat de proefpersonen op het moment

van de testen normaal functioneerden en dus een bepaalde behoefte

aan energie nodig hadden, kan het misschien zijn dat in het geval van

de placebotesten, waarbij men nuchter moest blijven, de ingenomen

β-alanine onmiddellijk werd ingeschakeld in de energielevering.

Wanneer de energievoorraad laag is, zal het lichaam onder andere

energie halen uit een aantal aminozuren. Zoals aangetoond kan β-

alanine worden omgezet naar acetylCoA, dat een intermediair is van

de Krebscyclus (Yamada & Jakoby, 1960; Hayaishi O et al., 1961).

In het onderzoek van Van Waarde et al. (1987) werd een

duidelijke link gevonden tussen uracil en acetyl Coenzyme A

waarbij β-alanine als intermediair fungeert (figuur 30) (Van Waarde

et al., 1987). Uit de literatuur blijkt dat β-alanine zowel in uracil als

in malonaat-semialdehyde kan worden omgezet (Canellakis ES,

1956; Hayaishi O et al., 1961)). Hierdoor kan men veronderstellen

dat het lichaam, afhankelijk van de behoeften van de cellen, één van de twee reactiewegen

doorloopt. Indien het lichaam energie nodig heeft, wordt β-alanine omgezet tot malonaat-

semialdehyde dat verder wordt omgezet naar acetyl coenzyme A. In een staat waarbij de

cellen meer eiwitten moeten aanmaken, zal β-alanine worden omgezet naar uracil dat

noodzakelijk is bij RNA-synthese.

Figuur 30: Reactieweg van

uracil tot acetyl coenzyme A

met β-alanine als

intermediair (Van Waarde,

1987).

-41-

2.3 Opname van β-alanine in de spier ter vorming van carnosine

In de literatuur werd aangetoond dat een deel van de gesupplementeerde β-alanine wordt

opgenomen in de skeletspieren, waar het kan worden gesynthetiseerd tot carnosine (Harris et

al., 2006) Stellingwerff et al. (2011) toonden aan dat ± 5% van de gesupplementeerde β-

alanine wordt omgezet naar spiercarnosine, wat niet wil zeggen dat er slechts 5% wordt

opgenomen in de spieren. Verder onderzoek hierover zal meer duidelijkheid moeten brengen.

Het is wel duidelijk dat de omzetting naar spiercarnosine een deel van de β-alanineretentie

kan verklaren.

2.4 Supplementatie van β-alanine kan concentratie carnosine in de hersenen doen stijgen

Het onderzoek van Murakami et al. (2010) toonde aan dat de concentratie van carnosine in

zowel de cerebrale cortex (stijging van 33%: 16.5 µmol/kg ± 0.8 naar 22.0 µmol/kg ± 1.2 (P <

0.05)) als in de hypothalamus (stijging van 49%: 45.3 µmol/kg ± 0.9 naar 67.6 µmol/kg ± 4.6

(P < 0.05)) steeg na supplementatie van -alanine (Murakami T, 2010). Een korte berekening

toont aan dat slechts 0.025% van de gesupplementeerde -alanine wordt opgenomen in de

cerebrale cortex en 0.1% wordt opgenomen in de hypothalamus. Deze waarden zijn heel laag

maar mogelijks wordt -alanine ook op andere manieren opgenomen in de hersenen. Zo zag

men in dit onderzoek ook een stijging van BDNF (brain-derived neurotrophic factor) na

supplementatie van -alanine. Tiedje et al. (2010) schreven een review over de verschillende

functies en werkingen van β-alanine. Hierin beschreef men dat β-alanine wordt opgenomen in

de hersenen via de blood-hersenbarrière, waarbij een transportsysteem met hoge affiniteit

voor β-alanine aanwezig is. In de hersenen zou β-alanine diverse functies uitoefenen (vb.:

neurotransmitter) (Tiedje KE, 2010). Deze bevindingen zijn belangrijk voor dit onderzoek

daar er de mogelijkheid bestaat dat een kleine hoeveelheid van de gesupplementeerde -

alanine wordt opgenomen in de hersenen.

2.5 Opname van β-alanine in organen

Men heeft sterke vermoedens dat β-alanine in de skeletspieren kan opgenomen worden via

specifieke transporters (TauT, Pept2). Daarnaast vermoedt men ook dat β-alanine kan worden

opgenomen in de nieren en de lever. Shuttleworth et al. (1984) vonden dat β-alanine in de

levercellen kan getransporteerd worden. Dit transport wordt volgens Shuttleworth gezien als

de snelheidsbepalende stap voor de oxidatie van aminozuren. Liu et al. (1999) vonden bij

ratten dat dit transport gemedieerd werd via een GABA-transporter GAT-2. Deze transporter

is net als TauT Na+/Cl

--afhankelijk. GAT-2 is volgens Liu et al. (1999) ook aanwezig in het

-42-

centraal zenuwstelsel, nieren en retina. Mogelijks fungeert deze transporter dan ook in andere

organen om β-alanine op te nemen.

2.6 Conclusie

Deze theorieën zouden verklaren waarom de retentie van β-alanine zo hoog is.

Waarschijnlijk zijn de vele metabole reactiewegen die β-alanine kan doorlopen

verantwoordelijk voor de hoge retentie van β-alanine na chronische supplementatie. Daarom

zorgt het lichaam ervoor dat de nieren β-alanine zeer sterk zullen reabsorberen. De meest

interessante metabole reactieweg voor deze studie is de omzetting van β-alanine naar

spiercarnosine, daarnaast kan β-alanine ook worden opgenomen in het centrale zenuwstelsel

of kan β-alanine worden omgezet naar andere metabolieten via verscheidene reactiewegen.

De opname van β-alanine ter omzetting naar spiercarnosine kan vergeleken worden met de

opname van creatine en carnitine in de skeletspieren.

3. Vergelijking van de β-alanineretentie met de carnitine- en creatineretentie

3.1 Een plafondeffect treedt op na supplementatie van creatine en carnitine

De gesupplementeerde creatine en carnitine hebben slechts één bestemming, namelijk de

skeletspieren. Bij chronische supplementatie merkt men een down-regulatie van de

creatinetransporter (Guerrero-Ontiveros and Wallimann, 1998). Deze down-regulatie is te

wijten aan het plafondeffect dat optreedt wanneer de concentraties in de spieren te hoog

worden. In het onderzoek van Greenhaff et al. (1995) spreekt men over een bovengrens van

de creatineconcentratie in de spier (150-160 mmol/kg droge spier). Hierdoor daalt de opname

van beide metabolieten bij chronische supplementatie. Omdat ook de retentie van carnitine

daalt, kan men vermoeden dat de skeletspieren ook een maximale capaciteit hebben voor

carnitine. Als gevolg van de daling in opname komt er meer creatine of carnitine in de urine

terecht, waardoor de retentie daalt.

3.2 Er treedt geen plafondeffect op na chronische supplementatie van β-alanine

De studie van Stellingwerff et al. (2011) toonde aan dat slechts ± 5% van de

gesupplementeerde β-alanine wordt gesynthetiseerd tot carnosine in de skeletspieren. Dit is

veel lager in vergelijking met creatine en carnitine. Hierdoor kan verondersteld worden dat

een plafondeffect pas veel later (mogelijks zelfs niet) optreedt omwille van het feit dat β-

alanine misschien eerder wordt geoxideerd ter vorming van azijnzuur in plaats van

uitgescheiden in de urine (Pihl A en Fritzson P, 1955). Het zou ook kunnen dat de periode van

supplementatie (in deze studie = 6 weken) te kort is. De studie van Baguet et al. (2009)

-43-

vergeleek de supplementatie van creatine met die van β-alanine en toonde aan dat

spiercarnosine veel meer kan toenemen door supplementatie van β-alanine dan dat

spiercreatine toeneemt na supplementatie van creatine, maar omdat de stijging van de

spiercarnosine veel trager gebeurt is de supplementatieperiode veel langer. Bij creatine zou na

enkele dagen het plafondeffect al worden bereikt, waardoor de retentie al na enkele dagen

begint te dalen (Steenge et al., 2000; Preen et al, 2001).

3.3 Vergelijking tussen de retentie van creatine, carnitine en β-alanine

Wanneer men alle retentiewaarden van verschillende studies uitzet in een grafiek (zie

figuur 31) dan merkt men zowel voor creatine als voor carnitine een dalend patroon.

Daarentegen blijft β-alanine gedurende een supplementatieperiode van zes weken (36 dagen)

op retentiewaarden hoger dan 95%. Hierdoor kan men duidelijk stellen dat β-alanine een

metaboliet is dat door het lichaam meer gebruikt kan worden dan creatine of carnitine.

Gemiddeld daalde de retentie van creatine van 65% naar 53% en van carnitine van 98 % naar

91%. De retentiewaarde voor creatine (placebo) verschillen bij de studie van Harris et al.

(1992) in vergelijking met de studies van Preen et al. (2001) en Greenwood et al. (2003)

omdat in de eerstgenoemde studie 30g creatine per dag werd gesupplementeerd, terwijl de

andere twee studies telkens 20g creatine supplementeerden. Hierdoor is de retentiewaarde in

de studie van Harris et al. (1992) lager in vergelijking met de twee andere studies.

Figuur 31: Vergelijking van de retentie tussen chronische supplementatie van β-alanine (donkerblauw (PLA) en

lichtblauw (CHO)) van het huidig onderzoek met carnitine (roze (CHO) en rood (PLA) volgens Stephens FB et al.

2007) en creatine (lichtgroen (CHO) en donkergroen (PLA) volgens Greenwood M et al. 2003; Preen D et al. 2001 en

Harris RC et al. 1992). De waarden van creatineretentie verschillen omdat in de studie van Harris et al. (1992)

dagelijks 30g creatine werd gesupplementeerd terwijl bij Preen et al. (2001) en Greenwood et al. (2003) 20g creatine

per dag werd gesupplementeerd. Hoe meer er werd gesupplementeerd, hoe lager de retentie.

-44-

4. Invloed van koolhydraten op de opname van β-alanine

In dit onderzoek werd onder meer onderzocht of koolhydraten en eiwitten de retentie van

β-alanine kunnen verhogen. Ondertussen is aangetoond dat dit niet het geval is. Toch kan het

zijn dat koolhydraten een belangrijke rol spelen in het optimaliseren van de

carnosineconcentratie in de skeletspieren.

4.1 Activatie van β-alaninetransporter (TauT) door koolhydraatinname

In de studie van Stellingwerff et al. (2012) bespreekt men de gekende β-

alaninetransporters. Hieruit bleek dat TauT waarschijnlijk de belangrijkste transporter is van

β-alanine voor de opname in de skeletspieren. Het is mogelijk dat, net zoals bij carnitine en

creatine, de transporter sterker geactiveerd wordt na inname van koolhydraten. De

koolhydraten worden in het spijsverteringsstelsel afgebroken en komen in het bloed terecht

onder de vorm van glucose. Wanneer de glucoseconcentratie stijgt tot boven het normale

homeostatische niveau, geven de bèta-cellen in de eilandjes van Langerhans (alvleesklier)

insuline af. Bijgevolg stijgt de insulineconcentratie in het bloed waardoor de Na+/K

+-pomp

actiever wordt en meer Na+ in het plasma wordt gepompt. De β-alaninetransporter (TauT) is

gevoelig voor Na+, waardoor de transporter actiever wordt. Door deze activatie zou het

mogelijk zijn dat er meer β-alanine worden opgenomen in de skeletspieren waar het wordt

omgezet naar carnosine. Als vervolg op de experimenten beschreven in deze masterproef, is

het onderzoeksteam onder leiding van prof. Derave gestart met het toetsen van deze stelling.

Op het moment dat deze masterproef wordt ingediend zullen de resultaten van dit onderzoek

bekend zijn.

4.2 Invloed van lage energievoorraad op de concentratie van aminozuren

In het beschreven onderzoek werden de proefpersonen gevraagd om gedurende zes uur na

inname van de pillen nuchter te blijven (enkel water mocht genuttigd worden). Dit kan men

zien als een vorm van vasten. De lage energievoorraad heeft zijn invloed op de concentratie

aminozuren in het lichaam. Wood et al. (2010) vonden in hun onderzoek bij haaien iets

merkwaardigs over de invloed van vasten op de concentratie aminozuren, meer bepaald over

β-alanine. In het plasma daalden de concentraties aminozuren bijna allemaal significant

naarmate langer een toestand van vasten werd voorzien. Enkel drie aminozuren, waaronder β-

alanine, bleven stabiel (Wood CM, 2010). Hieruit zou men kunnen besluiten dat β-alanine in

het lichaam aanwezig blijft om als energiereserve te kunnen dienen mocht dit nodig zijn, maar

het zou evengoed kunnen betekenen dat β-alanine niet wordt ingeschakeld in de

energielevering tijdens vasten. Interpretatie van deze studie is moeilijk omdat het onderzoek

-45-

werd uitgevoerd bij haaien. Tevens werd de β-alanineconcentratie in het plasma gemeten,

terwijl in dit onderzoek vooral de β-alanineconcentratie in de urine van belang is. Verder

onderzoek naar de functie van β-alanine in de energielevering is vereist.

4.3 Link met de resultaten van het onderzoek

Indien β-alanine in geval van vasten zou worden ingeschakeld in de energielevering, kan

men veronderstellen dat er in dat geval meer β-alanine wordt opgenomen in het lichaam dan

wanneer er minder nood is aan energie. Indien deze stelling correct zou zijn, dan zou er bij het

innemen van koolhydraten (een sterke energiebron) minder β-alanine worden opgenomen.

Tenzij de theorie omtrent de activatie van de β-alaninetransporter (TauT) correct zou zijn.

Wanneer de β-alaninetransporter (TauT) sterker geactiveerd wordt door de hoge

insulineconcentratie die de koolhydraten veroorzaken, zou men kunnen veronderstellen dat de

transporter ervoor zorgt dat er meer β-alanine wordt opgenomen in de spieren en eventueel in

andere weefsels, waar het kan worden omgezet naar carnosine. Men kan dus vermoeden dat

koolhydraten weinig tot geen effect hebben op de retentie van β-alanine, maar wel op de

totale opname van β-alanine in de spieren. In beide gevallen wordt β-alanine meer opgenomen

door het lichaam, waardoor men kan vermoeden dat er weinig verschil is in de opname van β-

alanine tussen beide condities.

5. Verhogen van de (homo)carnosineconcentratie in het lichaam

5.1 Blokkeren van 4-aminobuyraat aminotransferase (ABAT)

Het zou mogelijk kunnen zijn dat koolhydraten zorgen voor een hogere

carnosineconcentratie in de skeletspieren, wat een heel belangrijke bevinding zou zijn naar

supplementatiestrategie. Daarnaast heeft de studie van Petroff (1998) aangetoond dat de

homocarnosineconcentratie in de hersenen verdubbeld kan worden door het inhiberen van het

enzym 4-aminobutyraat aminotransferase (ABAT) dat verantwoordelijk is voor de omzetting

van GABA naar succinaat semi-aldehyde. Wellicht kan dit ook leiden tot een verhoging van

carnosine in de spieren. Indien koolhydraten de opname van β-alanine in de skeletspieren

verhogen kan een combinatie van beide methoden leiden tot een grotere stijging van de

spiercarnosineconcentratie.

6. Toekomstig onderzoek

Uit deze discussie kan men een aantal interessante hypotheses stellen voor volgende

onderzoeken.

-46-

6.1 Langer supplementeren

Men zou kunnen vermoeden dat een supplementatieperiode van zes weken te kort is.

Zoals hierboven werd beschreven is het plafondeffect bij β-alanine zeer moeilijk te bereiken.

Men zou dus kunnen onderzoeken welke effecten chronische supplementatie heeft op de β-

alanineretentie over een supplementatieperiode van 12 of zelfs 18 weken.

6.2 Voedingstoestand vergelijken

Verder zou men kunnen onderzoeken in welke mate de voedingstoestand van de

proefpersonen effect heeft op de -alanine-opname in de spier. Zoals reeds gezegd, bestaat de

kans dat de -alanine-opname in skeletspieren stijgt wanneer voldoende energie

(koolhydraten, eiwitten en vetten) voorradig is in het lichaam. Omgekeerd kan men stellen dat

wanneer men nuchter is, het tekort aan energie wordt vermeden door verbranding van

aminozuren (β-alanine). Bij elke voedingstoestand kan men nogmaals de retentie gaan

analyseren. Een daling van de retentie bij een voldoende voorraad aan energie lijkt een voor

de hand liggende hypothese, maar de kans dat dit een positief resultaat oplevert is heel klein.

Ook in dit onderzoek werd aangetoond dat koolhydraten de retentie niet veranderden. Er zijn

nog heel wat andere reactiewegen die β-alanine kan doorlopen die voor een even hoge retentie

zouden kunnen zorgen. Toch zouden eventuele verschillen in β-alanine-opname in de spier

een belangrijke aanzet kunnen zijn om verdere voedingspatronen te vergelijken (nuchter,

koolhydraatrijk, eiwitrijk, vetrijk).

6.3 Opname van β-alanine in de spieren

Men weet nu dat chronische supplementatie van -alanine een zeer hoge retentie teweeg

brengt. Wat men niet weet uit dit onderzoek is de hoeveelheid β-alanine dat in de spier wordt

opgenomen. Wel kan men berekenen hoeveel carnosine wordt gesynthetiseerd in de spieren

(Stellingwerff et al., 2011). Het zou heel interessant zijn om te weten hoeveel procent van de

gesupplementeerde β-alanine effectief in de skeletspieren terechtkomt en hoeveel daarvan

wordt omgezet naar spiercarnosine. Op basis van deze resultaten zou men dus een goede

uitspraak kunnen doen over het effect van koolhydraten op de β-alanine-opname in de

skeletspieren.

6.4 Inhibitoren

Zoals reeds in de literatuur werd beschreven zou het interessant zijn mochten

enzymatische werkingen kunnen geblokkeerd worden om zo de omzetting van β-alanine naar

andere metabolieten dan carnosine te verlagen. Wanneer deze inhibitoren de pathways

-47-

blokkeren, kan men dus vermoeden dat de carnosineconcentratie in de skeletspieren zal

stijgen. Onderzoek naar het effect van deze inhibitoren zou interessante informatie kunnen

geven over de β-alanineretentie en β-alanine-opname in de spieren. Een daling in β-

alanineretentie zou het logische gevolg zijn van inhibitie van andere pathways, aangezien β-

alanine minder mogelijkheden heeft om in het lichaam te blijven. In die zin kan men ook

veronderstellen dat de opname van β-alanine in de spieren verhoogt, waardoor meer carnosine

in de spieren kan worden gevormd.

6.5 Invloed van fysieke activiteit op de opname van β-alanine in de spieren

In de literatuur werden twee manieren besproken om creatine op te nemen in de spieren.

Harris RC et al. (1992) vonden dat zowel spiercontracties als insuline zorgden dat creatine

meer werd opgenomen in de spieren. Men kan aldus veronderstellen dat ook β-alanine meer

zal worden opgenomen in de spieren, hoewel dit in tegenstelling is met de veronderstelling

over energie en acetyl coenzyme A. Het is dus geen zekerheid dat spiercontracties dezelfde

invloed uitoefenen op β-alanine zoals op creatine. Verder onderzoek is dus vereist om

hierover uitsluitsel te geven.

7. Eindconclusie

Als algemene conclusie kan men stellen dat de supplementatie van creatine en carnitine

enerzijds en β-alanine anderzijds zeer sterk verschilt. Uit dit onderzoek werd duidelijk dat de

retentiewaarden van β-alanine ten opzichte van de andere metabolieten hoger liggen. Het

lichaam hecht dus veel belang aan β-alanine en wil het niet zomaar uitscheiden via de urine,

ook niet na een chronische supplementatie van zes weken. De nieren zorgen dan ook voor een

quasi perfecte reabsorptie. Om β-alanine in de spier te gaan verhogen is het dus niet zozeer

belangrijk om te kijken naar de urinaire retentie. Onderzoek over de transporters van β-

alanine van de bloedbaan naar de spier kan nuttigere informatie opleveren. Hierbij is het van

belang om de optimalisering van deze opname te bestuderen, waarbij men vermoedt dat de

insuline in het bloed een rol zou kunnen spelen. Het grote aanbod aan metabole pathways

zorgt ervoor dat β-alanine op zeer veel manieren kan gekataboliseerd worden. Afgaande op de

literatuur is dit wellicht de belangrijkste reden waarom de retentie van β-alanine zo hoog is.

-48-

REFERENTIES

1. Abe H (2000). Role of histidine-related compounds as intracellular proton buffering

constituents in vertebrate muscle. Biochemistry (Mosc), 65:757-765.

2. Alkonyi I, Kerner J, Sandor A (1975). Possible role of carnitine and carnitine acetyl-

transferase in contracting skeletal-musle. FEBS Lett, 52: 265-268.

3. Anderson CM, Howard A, Walters JR et al (2009). Taurine uptake across the human

intestinal brush-border membrane is via two transporters: H+-coupled PAT1 (SLC36A1)

and Na+- and Cl

—dependent TauT (SLC6A6). J Physiol, 587: 731-744.

4. Asatoor AM, Bandoh JK, Lant AF, Milne MD, Navab F (1970). Intestinal absorption of

carnosine and its constituent amino acids in man. Gut, 11: 250-254.

5. Awad R, Muhammad A, Durst T (2009). Bioassay-guided fractionation of lemon balm

(Melissa officinalis L.) using an in vitro measure of GABA transaminase activity.

Phytother Res, 23: 1075-1081.

6. Baguet A, Bourgois J, Vanhee L et al (2010). Important role of muscle carnosine in

rowing performance. J Appl Physiol,109: 1096–1101.

7. Baguet A, Reyngoudt H, Pottier A et al (2009). Carnosine loading and washout in human

skeletal muscles. J Appl Physiol, 106: 837–842.

8. Bakardjiev A, Bauer K (1994). Transport of β-alanine and biosynthesis of carnosine by

skeletal muscle cells in primary culture. Eur J Biochem, 225: 617-623.

9. Barnett C, Kostill DL, Vukuvich MD et al (1994). Effect of L-carnitine supplementation

on muscle and blood carnitine content and lactate accumulation during high-intensity

sprint cycling. Int J Sport Nutr, 4: 280-288.

10. Bate-Smith EC (1938). The buffering of muscle in rigor: protein, phosphate and

carnosine. J Physiol, 92: 336-343.

11. Batrukova MA, Rubtsov AM (1997). Histidine-containing dipeptides as endogenous

regulators of the activity of sarcoplasmic reticulum Ca-release channels. Biochim

Biophys Acta, 1324: 142-150.

12. Birch R, Noble D, Greenhaff PL (1994). The influence of dietary creatine

supplementation on performance during repeated bouts of maximal isokinetic cycling in

man. Eur J Appl Physiol, 69: 268-270.

13. Bloch K, Schoenheimer R, Rittenberg D (1941). Rate of formation and disappearance of

body creatine in normal animals. J Biol Chem, 138: 155-166.

-49-

14. Boldyrev AA (1993). Does carnosine possess direct antioxidant activity? Int J Biochem,

25: 1101-1107.

15. Brooks DE, McIntosh JE (1975). Turnover of carnitine by rat tissues. Biochem J, 148:

439-445.

16. Campbell LL (1957). Reductive degradation of pyrimidines. II. Mechanism of uracil

degradation by Clostridium uracilicum. J Bacteriol, 73: 225-229.

17. Canellakis ES (1956). Pyrimidine metabolism. I. Enzymatic pathways of uracil and

thymine degradation. J Biol Chem, 221:315-322.

18. Canellakis ES (1957). Pyrimidine metabolism. III. The interaction of the catabolic and

anabolic pathways of uracil metabolism. J Biol Chem, 227: 701-709.

19. Casey A, Constantin-Teodosiu D, Howell S et al (1996). Metabolic response of type I

and II muscle fibers during repeated bouts of maximal exercise in humans. Am J Physiol,

271: E38-E42.

20. Casey A, Greenhaff PL (2000). Does dietary creatine supplementation play a role in

skeletal muscle metabolism and performance? Am J Clin Nutr, 72: 607S-617S.

21. Cederblad G, Lindstedt S, Lundholm K (1974). Concentration of carnitine in human

muscle tissue. Clin Chim Acta, 53: 311-321.

22. Childress CC, Sacktor B, Traynor DR (1966). Function of carnitine in fatty acid oxidase-

deficient insect flight muscle. J Biol Chem, 242: 754-760.

23. Daly MM, Seifter F (1980). Uptake of creatine by cultured-cells. Arch Biochem Biophys,

203: 317-324.

24. Decombaz J, Beaumont B, Vuichoud J et al (2011). Effect of slow-release β-alanine

tablets on absorption kinetics and paresthesia. Amino Acids, doi:10.1007/s00726-011-

1169-7.

25. Drozak J, Veiga-da-Cunha M, Vertommen D et al (2010). Molecular identification of

carnosine synthase as ATP-grasp domain-containing protein 1 (ATPGD1). J Biol Chem,

285: 9346–9356.

26. Dunnett M, Harris RC (1995). Carnosine and taurine contents of type I, IIA and IIB

fibres in the middle gluteal muscle. Equine Vet J, 18: 214-217.

27. Dunnett M, Harris RC (1999). Influence of oral beta-alanine and L-histidine

supplementation on the carnosine content of the gluteus medius. Equine Vet J Suppl, 30:

499–504.

28. Everaert I, Mooyaart A, Baguet A et al (2010). Vegetarianism, female gender and

-50-

increasing age, but not CNDP1 genotype, are associated with reduced carnosine levels in

humans. Amino Acids, 40: 1221-1229.

29. Fink RM, McGaughey C, Cline RE et al (1956). Metabolism of intermediated

pyrimidine reduction products in vitro. J Biol Chem, 218: 1-7.

30. Fitch CD, Shields RP (1966). Creatine metabolism in skeletal muscle. I. Creatine

movement across muscle membranes. J Biol Chem, 241: 3611-3614.

31. Fitch CD, Shields RP, Payne WF, et al (1968). Creatine metabolism in skeletal muscle.

III. Specificity of the creatine entry process. J Biol Chem, 243: 2024-2027.

32. Flancbaum L, Fitzpatrick JC, Brotman DN et al (1990). The presence and significance of

carnosine in histamine-containing tissues of several mammalian species. Agents Actions,

31: 190–196.

33. Friedman S, Fraenkel G (1955). Reversible enzymatic acetylation of carnitine. Arch

Biochem Biophys, 59: 491-501.

34. Fritz IB (1955). The effect of muscle extracts on the oxidation of palmitic acid by liver

slices and homogenates. Acta Physiol Scand, 34: 367-385.

35. Fritz IB, McEwen B (1959). Effects of carnitine on fatty-acid oxidation by muscle.

Science, 129: 334-335.

36. Fritz IB, Yue KTN (1963). Long-chain carnitine acyltransferase and the rol of

acylcarnitine derivatives in the catalytic increase of fatty acid oxidation induced by

carnitine. J Lipid Res, 4: 279-288.

37. Fritzson P, Pihl A (1957). The catabolisme of C14-labeled uracil, dihydrouracil, and

beta-ureidopropionic acid in the intact rat. J Biol Chem, 226: 229-235.

38. Green AL, Hultman E, MacDonald IA (1996). Carbohydrate ingestion augments skeletal

muscle creatine accumulation during creatine supplementation in humans. Am J Physiol,

271: E821-E826.

39. Green AL, Simpson EJ, Littlewood JJ et al (1996). Carbohydrate ingestion augments

creatine retention during creatine feeding in man. Acta Physiol Scand, 158: 195-202.

40. Greenhaff PL (1995). Kreatin: Seine Rolle im Bezug auf die körperliche

Leistungsfähigkeit sowie Ermüdung; seine Anwendung als ein Sporternäahrungs-

Supplement. Insider, News Sport Nutr, Isostar Sport Nutr Found, 3: 1-4.

41. Greenhaff PL, Bodin K, Soderlund K et al (1994). Effect of oral creatine

supplementation on skeletal muscle phosphocreatine resynthesis. Am J Physiol, 266:

E725-E730.

-51-

42. Greenwood M, Kreider R, Earnest C et al (2003). Differences in creatine retention

among three nutritional formulations of oral creatine supplements. J Am Soc Exerc

Fysiol, 6: 37-43.

43. Grisolia S, Cardoso SS (1957). Purification and properties of hydropyrimidine

dehydrogenase. Biochim Biophys Acta, 25: 430-431.

44. Guerrero-Ontiveros ML, Walliman T (1998). Creatine supplementation in health and

disease. Effects of chronic creatine ingestion in vivo: down-regulation of the expression

of creatine transporter isoforms in skeletal muscle. Mol Cell Biochem, 184: 427-437.

45. Harris RC (2010). Simultaneous changes in muscle carnosine and taurine during and

following supplementation with β-alanine. Am Coll Sports Med, 5:107.

46. Harris RC, Foster CVL, Hultman E (1987). Acetylcarnitine formation during intense

muscular-contraction in humans. J Appl Physiol, 63: 440-442.

47. Harris RC, Hultman E, Nordesjo LO (1974). Glycogen, glycolytis intermediates and

high-energy phosphates determined in biopsy samples of musculus quadriceps femoris

of man at rest. Methods and variance of values. Scand J Clin Lab Invest, 33: 109-120.

48. Harris RC, Jones G, Wise JA (2008). The plasma concentration-time profile of β-alanine

using a controlled-release formulation (Carnosyn TM). FASEB J, 22:701.9.

49. Harris RC, Soderlund K, Hultman E (1992). Elevation of creatine in resting and

exercised muscle of normal subjects by creatine supplementation. Clin Science, 83: 367-

374.

50. Harris RC, Tallon MJ, Dunnett M et al (2006). The absorption of orally supplied beta-

alanine and its effect on muscle carnosine synthesis in human vastus lateralis. Amino

Acids, 30: 279-289.

51. Haugland RB, Chang DT (1975). Insulin effect on creatine transport in skeletal-muscle.

Proc Soc exp Biol Med, 148: 1-4.

52. Hayaishi O, Nishizuka Y, Tatibana M et al (1961). Enzymatic studies on the metabolism

of beta-alanine. J Biol Chem, 236: 781-790.

53. Hill CA, Harris RC, Kim HJ et al (2007). Influence of beta-alanine supplementation on

skeletal muscle carnosine concentrations and high intensity cycling capacity. Amino

Acids, 32: 225–233.

54. Horinishi H, Grillo M, Margolis FL (1978). Purification and characterization of

carnosine synthetase from mouse olfactory bulbs. J Neurochem, 31: 909-919.

55. Hultman E, Soderlund K, Timmons JA et al (1996). Muscle creatine loading in men. J

-52-

Appl Physiol, 81: 232-237.

56. Hunter A (1922). The physiology of creatine and creatinine. Physiol Rev, 2: 586-626.

57. Jessen H, Jorgensen KE, Roigaard-Petersen H, et al. (1989). Demonstration of H+- and

Na+-coupled co-transport of beta-alanine by luminal membrane vesicles of rabbit

proximal tubule. J Physiol, 411: 517-528

58. Kalyankar GD, Meister A (1959). Enzymatic synthesis of carnosine and related beta-

alanyl and gamma-aminobutyryl peptides. J Biol Chem, 234: 3210-3218.

59. Kendrick IP, Harris RC, Kim HJ et al (2008). The effects of 10 weeks of resistance

training combined with beta-alanine supplementation on whole body strength, force

production, muscular endurance and body composition. Amino Acids, 34: 547–554.

60. Lippert B, Metcalf BW, Jung MJ et al (1977). 4-amino-hex-5-enoic acid, a selective

catalytic inhibitor of 4-aminobutyric-acid aminotransferase in mammalian brain. Eur J

Biochem, 74: 441-445.

61. Liu M, Russell RL, Beigelman L (1999). Β-alanine and α-fluoro-β-alanine concentrative

transport in rat hepatocytes is mediated by GABA transporter GAT-2. Am J Physiol

Gastrointest Liver Physiol, 276: 206-210.

62. Lu H, Klaassen C (2006). Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1

and Pept2 mRNA in rodents. Peptides, 27: 850–857.

63. Luo DX, Tong DJ, Rajput S, et al. 2012. Targeting Acetyl-CoA Carboxylases: Small

Molecular Inhibitors and their Therapautic Potential. Recent Pat Anticancer Drug

Discov, 7: 168-184.

64. Matthews MM, Traut TW (1987). Regulation of N-carbamoyl-beta-alanine

amidohydrolase, the terminal enzyme in pyrimidine catabolism, by ligand-induced

change in polymerization. J Biol Chem, 262: 7232-7237.

65. Murakami T, Furuse M (2010). The impact of taurine- and beta-alanine-supplemented

diets on behavioral and neurochemical parameters in mice: antidepressant versus

anxiolytic-like effects. Amino Acids, 39: 427-434.

66. Ng RH, Marshall FD (1978). Regional and subcellular distribution of homocarnosine-

carnosine synthetase in the central nervous system of rats. J Neurochem, 30: 187-190.

67. Odoom JE, Kemp GJ, Radda GK (1996). The regulation of total creatine content in a

myoblast cell line. Mol Cell Biochem, 158: 179-188.

68. Petroff OA, Mattson RH, Behar KL et al (1998). Vigabatrin increases human brain

homocarnosine and improves seizure control. Ann Neurol, 44: 948-952.

-53-

69. Pihl A, Fritzson P (1955). The catabolism of C14-labeled beta-alanine in the intact rat. J

Biol Chem, 215: 345-351.

70. Pittas G, Hazell MD, Simpson EJ et al (2010). Optimization of insulin-mediated creatine

retention during creatine feeding in humans. J Sports Sci, 27: 67-74.

71. Rebouche CJ (1977). Carnitine movement across muscle cell membranes. Studies in

isolated rat muscle. Biochim Biophys Acta, 471: 145-155.

72. Roberts E, Bregoff HM (1953). Transamination of gamma-aminobutyric acid and beta-

alanine in brain and liver. J Biol Chem, 201: 393-398.

73. Preen D, Dawson B, Goodman C et al (2001). Effect of creatine loading on long-term

sprint exercise performance and metabolism. Med Sci Sports Exerc, 33: 814-821.

74. Sadikali F, Darwish R, Watson WC (1975). Carnosinase activity of human

gastrointestinal mucosa. Gut, 16: 585-589.

75. Schor DS, Struys EA, Hogema BM et al (2001). Development of a stable-isotope

dilution assay for gamma-aminobutyric acid (GABA) transaminase in isolated

leukocytes and evidence that GABA and beta-alanine transaminases are identical. Cil

Chem, 47: 525-531.

76. Scriver SR, Pueschel S, Davies E (1966). Hyper-beta-alaninemia associated with beta-

aminoaciduria and gamma-aminobutyric aciduaia, somnolence and seizures. N Engl J

Med, 274: 635-643.

77. Shuttleworth TJ, Goldstein L (2005). Beta-alanine transport in the isolated hepatocytes

of the elasmobranch Raja erinacea. J Exp Zool, 231: 39-44.

78. Steenge GR, Simpson EJ, Greenhaff PL (2000). Protein- and carbohydrate-induced

augmentation of whole body creatine retention in humans. J Appl Physiol, 89: 1165-

1171.

79. Stellingwerff T, Anwander H, Egger A et al (2011). Effect of two β-alanine dosing

protocols on muscle carnosine synthesis and washout. Amino Acids, doi:10.1007/s00726-

011-1054-4.

80. Stellingwerff T, Décombaz J, Harris RC et al (2012). Optimizing human in vivo dosing

and delivery of β-alanine supplements for muscle carnosine synthesis. Amino Acids, DOI

10.1007/s00726-012-1245-7.

81. Stenesh JJ, Winnick T (1960). Carnosine-anserine synthetase of muscle. IV. Partial

purification of the enzyme and further studies of beta-alanyl peptide synthesis. Biochem

J, 77: 575-581.

-54-

82. Stephens FB, Constantin-Teodosiu D, Greenhaff PL (2007). New insights concerning the

role of carnitine in the regulation of fuel metabolism in skeletal muscle. J Physiol, 581:

431-444.

83. Stephens FB, Constantin-Teodosiu D, Laithwaite D et al (2007). A threshold exists for

the stimulatory effect of insulin on plasma L-carnitine clearance in humans. Am J

Physiol Endocrinol Metab, 292: 637-641.

84. Stephens FB, Evans CE, Constantin-Teodosiu D et al (2007). Carbohydrate ingestion

augments L-carnitine retention in humans. J Appl Physiol, 102: 1065-1070.

85. Tamai I, Ohashi R, Nezu J et al (1998). Molecular and functional identification of

sodium ion-dependent, high affinity human carnitine transporter OCTN2. J Biol Chem,

273: 20378-20382.

86. Teufel M, Saudek V, Ledig JP et al (2003). Sequence identification and characterization

of human carnosinase and a closely related non-specific dipeptidase. J Biol Chem, 278:

6521-6531.

87. Tiedje KE, Stevens K, Barnes S et al (2010). β-alanine as a small molecule

neurotransmitter. Neurochem Int, 57: 177-188.

88. Tomi M, Tajima A, Tachikawa M, Hosoya K (2008). Function of taurine transporter

(Slc6a6/TauT) as a GABA transporting protein and its relevance to GABA transport in

rat retinal capillary endothelial cells. Biochim Biophys Acta, 1778: 2138–2142.

89. Van Loon LJC, Saris WHM, Verhagen H et al (2000). Plasma insulin responses after

ingestion or different amino acids or protein mixtures with carbohydrate. Am J Clin Nutr,

72: 96-105.

90. Van Waarde A (1987). Biochemistry of non-protein nitrogenous compounds in fish

including the use of amino acids for anaerobic energy production. Comp Biochem

Physiol, 91: 207-228.

91. Vukuvich MD, Kostill DL, Fink WJ (1994). Carnitine supplementation: effect on muscle

carnitine and glycogen-content during exercise. Med Sci Sports Exerc, 26: 1022-1029.

92. Wächter S, Vogt M, Kreis R et al (2002). Long-term administration of L-carnitine to

humans: effect on skeletal muscle carnitine content and physical performance. Clin Chim

Acta, 318: 51-61.

93. Walker JB (1979). Creatine: biosynthesis, regulation and function. Adv Enzymol, 50:

177-242.

94. Wall BT, Stephens FB, Constantin-Teodosiu et al (2011). Chronic oral ingestion of L-

-55-

carnitine and carbohydrate increases muscle carnitine content and alters muscle fuel

metabolism during exercise in humans. J Physiol, 589: 963-973.

95. Walliman T, Wyss M, Brdiczka D et al (1992). Significanceof intracellular

compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes for cellular

energy homeostasis: ‘the phospho-creatine circuit’. Biochem J, 281: 21-40.

96. Williams MH, Kreider RB, Branch JD (1999). Creatine: the power supplement, Human

Kinetics, Champaign, Illinois.

97. Winnick RE, Winnick T (1959). Carnosine-anserine synthetase of muscle. Biochim

biophys Acta, 31: 47-55.

98. Wood CM, Walsh PJ, Kajimura M et al (2010). The influence of feeding and fasting on

plasma metabolites in the dogfish shark (Squalus acanthias). Comp Biochem Physiol,

155: 435-444.

99. Wyss M, Kaddurah-Daouk R (2000). Creatine and creatinine metabolism. Physiol Rev,

80: 1107-1213.

100. Xiang J, Hu Y, Smith DE et al (2006). Pept2-mediated transport of 5-aminolevulinic

acid and carnosine in astrocytes. Brain Res, 1122: 18-23.

101. Yamada EW, Jakoby WB (1960). Aldehyde oxidation. V. Direct conversion of malonic

semialdehyde to acetyl-coenzyme A. J Biol Chem, 235: 589-594.

102. Yue KTN, Fritz IB (1962). Fate of tritium-labeled carnitine administered to dogs and

rats. Am J Physiol, 202: 122-128.