Moleculaire diagnose en karakterisatie van...
76
Moleculaire diagnose en karakterisatie van urineweginfecties Naomi VAN DEN EEDE Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte Begeleider: Piet Cools Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie Academiejaar 2011 – 2012
Transcript of Moleculaire diagnose en karakterisatie van...
Moleculaire diagnose en karakterisatie van
urineweginfecties
Naomi VAN DEN EEDE
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte
Begeleider: Piet Cools
Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie
Academiejaar 2011 – 2012
Moleculaire diagnose en karakterisatie van
urineweginfecties
Naomi VAN DEN EEDE
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte
Begeleider: Piet Cools
Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie
Academiejaar 2011 – 2012
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder
met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het
aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Naomi Van den Eede Prof. Dr. Mario Vaneechoutte
Voorwoord
Graag wil ik enkele mensen bedanken die, elk op hun eigen wijze, bijgedragen hebben tot het
schrijven van deze masterproef.
Prof. Dr. Mario Vaneechoutte, mijn promotor, voor de begeleiding bij het uitdenken van de
experimenten, de interpretatie van de resultaten en het nalezen van mijn thesis.
M. Sc. Piet Cools, mijn begeleider, voor al de tijd die hij heeft vrijgemaakt om mij te helpen.
Zowel voor het praktische werk als voor het zoeken van nieuwe denkpistes, het verklaren van
resultaten en het nalezen van mijn thesis.
Leen Van Simaey, Bart Saerens, Dr. Pieter Deschaght, Drs. Guido Lopes dos Santos
Santiago, Ing. Ellen Decat en Maya Merabishvili voor hun hulp bij het praktisch werk en
het beantwoorden van al mijn vragen. En zeker voor de toffe sfeer die zij creëerden in
het labo.
Prof. Geert Claeys en alle mensen van het labo bacteriologie P8. Voor het bezorgen van
de urinestalen en de deskundige uitleg bij de MALDI-TOF.
Leen en Bart, voor de leuke gesprekken, de aanmoedigingen en het plezier dat we
hadden tijdens de stage.
Tine, Tineke en Vickà, voor de gezellige koffiepauzes en de vriendschap die zeker zal
blijven duren.
En in het bijzonder mijn ouders, voor hun onvoorwaardelijke steun tijdens mijn studie
Biomedische Wetenschappen.
Bedankt!
Afkortingen
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CFU Colony Forming Units
CLED Cysteïne Lactose Elektroliet-Deficiënt
Cq Cycles of quantification
DAEC Diffuus adherente E. coli
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EAEC Enteroaggregatieve E. coli
EHEC Enterohaemorrhagische E. coli
EIEC Enteroinvasieve E. coli
EPEC Enteropathogene E. coli
ESBL Extended Spectrum Beta-Lactamasen
ETEC Enterotoxigene E. coli
FIMH Fimbriaal adhesine H
IBC Intracellular bacterial communities
LBR Laboratory Bacteriology Research
MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass
Spectrometer
Max ID Maximum Identity
MRS DeMan, Rogosa en Sharpe
NMEC Neonatale meningitis E. coli
PMN Polymorfonucleaire cellen
QIR Quiescent Intracellular Reservoirs
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction
ROS Reactive Oxygen Species
rRNA Ribosomaal Ribonucleïnezuur
SDS Natrium (sodium) dodecyl (lauryl) sulfaat
Ta Annealingstemperatuur
tDNA Transfer deoxyribonucleïnezuur
Tm Smelttemperatuur
UPEC Uropathogene E. coli
VMF Vaginale microflora
PGUA p-nitrophenyl, B-D glucopyranosiduronic acid
Inhoudstafel
1. SAMENVATTING...................................................................................................................................... 1
2. INLEIDING ................................................................................................................................................ 2
2.1 PATHOGENESE VAN URINEWEGINFECTIES ................................................................................................. 2 2.1.1 Uropathogene Escherichia coli........................................................................................................ 3
2.2 RISICOFACTOREN .................................................................................................................................... 5 2.3 DIAGNOSE ............................................................................................................................................... 6
2.3.1 Klinische presentatie ....................................................................................................................... 7 2.3.2 Urine dipsticks ................................................................................................................................ 7 2.3.3 De gouden standaard: Kweek .......................................................................................................... 8
2.4 THERAPIE................................................................................................................................................ 9 2.4.1 Profylactie ...................................................................................................................................... 9 2.4.2 Richtlijnen voor behandeling in België ............................................................................................ 9 2.4.3 Richtlijnen voor behandeling in Kenia ............................................................................................. 9
2.5 MICROBIOLOGIE ...................................................................................................................................... 9 2.6 PROBLEEMSTELLING EN DOELSTELLINGEN ............................................................................................. 10
3. MATERIAAL EN METHODEN .............................................................................................................. 12
3.1 BACTERIËLE STAMMEN .......................................................................................................................... 12 3.2 KWEEK- EN INVRIESMEDIA..................................................................................................................... 12 3.3 INVRIEZEN EN TERUG IN CULTUUR BRENGEN VAN BACTERIËLE STAMMEN ................................................ 12 3.4 DNA-EXTRACTIES ................................................................................................................................. 12
3.4.1 Roche DNA-extractie ..................................................................................................................... 12 3.4.2 Alkalische DNA-extractie .............................................................................................................. 12 3.4.3 NucliSens EasyMAG extractie ....................................................................................................... 13 3.4.4 Koken-vriezen methode ................................................................................................................. 13
3.5 METEN VAN CONCENTRATIE EN ZUIVERHEID DNA ................................................................................. 13 3.6 BEREKENEN VAN HET AANTAL CHROMOSOMEN PER µL DNA-EXTRACT ................................................... 13 3.7 AANMAKEN VAN EEN TIENVOUDIGE VERDUNNINGSREEKS VAN EEN DNA-EXTRACT ................................. 14 3.8 STAALNAME VAN DE URINE ................................................................................................................... 14 3.9 KWEEK VAN URINE ................................................................................................................................ 14 3.10 NAGAAN VAN RESISTENTIE MET BEHULP VAN HET ANTIBIOGRAM .......................................................... 14 3.11 DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN STAMMEN ......................................................................................... 15
3.11.1 Fenotypische detectie en identificatie van stammen ...................................................................... 15 3.11.1.1 p-nitrophenyl, B-D glucopyranosiduronic acid (PGUA) test ................................................................... 15
3.11.2 Moleculaire detectie en identificatie van stammen ........................................................................ 16 3.11.2.1 Kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) (realtime PCR) ........................................................... 16 3.11.2.2 Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer (MALDI-TOF) ................... 18 3.11.2.3 Transfer DNA-PCR (tDNA-PCR) ......................................................................................................... 18 3.11.2.4 16S rRNA sequencing gebaseerde identificatie ...................................................................................... 19
3.11.2.4.1 16S rRNA PCR ............................................................................................................................ 19 3.11.2.4.2 Sequencing ................................................................................................................................... 19
3.11.2.4.2.1 Zuiveren van PCR-producten voor sequentiebepaling ............................................................ 19 3.11.2.4.2.2 Cycle sequencing-reactie....................................................................................................... 20 3.11.2.4.2.3 Ethanolprecipitatie ................................................................................................................ 20
3.11.2.5 Capillaire elektroforese ......................................................................................................................... 20 3.11.2.5.1 Capillaire elektroforese voor fragmentanalyse ............................................................................... 21 3.11.2.5.2 Capillaire elektroforese voor sequentieanalyse ............................................................................... 21
3.12 PRIMERPAREN ..................................................................................................................................... 22 3.13 BESTELLEN EN UITVERDELEN VAN DE PRIMERS ..................................................................................... 22
4. RESULTATEN ......................................................................................................................................... 23
4.1 ONTWIKKELING VAN EEN QPCR SPECIFIEK VOOR E. COLI ........................................................................ 23 4.1.1 Primers ......................................................................................................................................... 23 4.1.2 Standaard verdunningsreeks .......................................................................................................... 24 4.1.3 Bepalen assay set-up ..................................................................................................................... 25 4.1.4 Validatie van de E. coli qPCR met behulp van gekende bacteriële stammen.................................... 26 4.1.5 Validatie van de E. coli qPCR met behulp van klinische stalen ....................................................... 27
4.1.5.1 DNA-extractie uit urine .......................................................................................................................... 27
4.1.5.2 Diagnose van E. coli urineweginfecties: E. coli qPCR vs. routinelaboratorium ......................................... 28 4.1.5.3 Kweek: vergelijking van kweekmethoden ............................................................................................... 29
4.1.5.3.1 Aeroob vs. anaeroob: CLED-agar ................................................................................................... 30 4.1.5.3.2 Aeroob vs. anaeroob: MacConckey ................................................................................................. 31 4.1.5.3.3 CLED- vs. MacConckey agar ......................................................................................................... 32
4.2 URINEWEGINFECTIES IN MOMBASA, KENIA ............................................................................................ 33 4.2.1 Moleculaire karakterisatie met behulp van MALDI-TOF ................................................................ 33 4.2.2 Nagaan van resistentie .................................................................................................................. 34
5. DISCUSSIE ............................................................................................................................................... 35
5.1 ONTWIKKELING VAN EEN E. COLI QPCR ................................................................................................. 35 5.2 VERGELIJKING AEROBE EN ANAEROBE KWEEK OP CLED- EN MACCONKEY AGAR .................................... 39 5.3 URINEWEGINFECTIES IN MOMBASA, KENIA ............................................................................................ 44
6. REFERENTIES ........................................................................................................................................ 48
7. ADDENDUM
1
1. Samenvatting
Urineweginfecties behoren tot de meest frequent voorkomende infecties. De gouden standaard
voor diagnose van urineweginfecties is een aerobe kweek op CLED-agar, geïnterpreteerd
volgens Kass criteria en in combinatie met klinische symptomen. Recente studies suggereren
echter dat deze methode infecties met moeilijk en traag groeiende bacteriën mist. Bovendien
is voor sommige patiëntenpopulaties snel resultaat nodig, terwijl een kweek gemiddeld 12 u
in beslag neemt. Om al deze redenen werd in een eerste luik van deze studie een goed
gevalideerde E. coli specifieke qPCR voor urine ontwikkeld. Met deze moleculair
diagnostische methode is het resultaat sneller beschikbaar en meer precies kwantitatief.
Bovendien suggereren onze resultaten dat de ontwikkelde E. coli qPCR E. coli serotypes
oppikt die niet of moeilijk kweekbaar zijn. Deze E. coli qPCR zal verder gebruikt kunnen
worden voor volgende studies.
In een tweede luik van deze studie werd dieper ingegaan op de gouden standaard. Om de
invloed van de zuurstofgraad van de omgeving na te gaan werden alle urinestalen zowel
aeroob als anaeroob gekweekt. Op basis van een verschil in aantal CFU en gegroeide species
suggereren onze resultaten dat een anaerobe kweek een toegevoegde waarde heeft bij de
diagnose van urineweginfecties. Verdere studies met grotere studiepopulaties zijn hier
aangewezen. Om te verifiëren dat CLED-agar de meest geschikte voedingsbodem is voor de
diagnose van UWIs werden de urinestalen op zowel CLED- als MacConckey agar gekweekt.
Op basis van onze resultaten en voorgaande studies konden we concluderen dat CLED-agar
beter geschikt is voor kweek van urine dan MacConkey agar.
In een derde en laatste luik van deze studie werden UWIs in Kenia gekarakteriseerd met
MALDI-TOF en werd de antibioticumgevoeligheid van de voornaamste uropathogenen
bepaald met behulp van een antibiogram. Het verzamelen van deze regionale data is
belangrijk voor de Keniaanse gezondheidszorg om tot een gefundeerd blind behandelingsplan
voor urineweginfecties te komen. Opvallend bij de karakterisatie was de hoge prevalentie van
Klebsiella pneumoniae. Bij de bepaling van de antibioticumgevoeligheid was de hoge
gevoeligheid voor nitrofurantoïne en de hoge prevalentie van ESBL-positieve stammen
opvallend. Voortgaande op onze beperkte studiepopulatie zijn er in Kenia momenteel nog
veel antibiotica mogelijk voor behandeling van UWIs. Bevestiging door middel van een
grotere populatie is nodig.
2
2. Inleiding
Urineweginfecties (UWIs) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties [1].
Nosocomiaal is het zelfs de meest frequente infectie. Vooral vrouwen zijn vatbaar (Zie 2.2
Risicofactoren). Zo zal 40 tot 50 % van alle vrouwen minstens één UWI doormaken [2]. Bij
mannen is een UWI eerder uitzonderlijk, tenzij in aanwezigheid van anatomische of
functionele abnormaliteiten [3]. Gemiddeld 25 % van de patiënten ondervindt recurrente
infecties, met drie of meer symptomatische episoden over een periode van 12 maanden [2].
Recurrente infecties kunnen het gevolg zijn van een gefaalde therapie, waarbij niet alle
bacteriën gedood werden, maar in 80 % van de gevallen is het het gevolg van reïnfectie met
een ander organisme [2] [3] [4].
De symptomen van een UWI variëren van asymptomatisch tot een milde irritatie bij het
plassen, sepsis of zelfs de dood [4]. De belangrijkste symptomen zijn dysurie (pijn bij het
plassen), pollakisurie (toename van het aantal urinelozingen, zonder toename in dagelijks
geproduceerde urine), nycturie (overmatige productie van urine tijdens de nacht), hematurie
(bloed in de urine), suprapubische pijn en een geurende, troebele urine [5] [6]. Hoewel de
mortaliteit geassocieerd met urineweginfecties laag is, is de globale last van deze ziekte zeker
niet te onderschatten. De combinatie van een aanzienlijke morbiditeit en hoge prevalentie
betekent een aanzienlijke kost voor de gezondheidszorg [7].
UWIs worden verder opgedeeld volgens de locatie van de infectie in het urinaire stelsel. Zo
wordt onderscheid gemaakt tussen cystitis of blaasontsteking (infectie van de onderste
urinewegen) en pyelonephritis of nierontsteking (infectie van de bovenste urinewegen) [8].
Verder wordt ook onderscheid gemaakt tussen gecompliceerde en ongecompliceerde UWIs.
Men spreekt van gecompliceerde UWIs wanneer de infectie geassocieerd is met anatomische,
functionele of metabole afwijkingen die de natuurlijke immuunrespons in het urinair stelstel
beïnvloeden. Voorbeelden hiervan zijn glomerulosclerosis, catheterisatie, zwangerschap en
immuunsupressie. In afwezigheid van dergelijke afwijkingen wordt de UWI gedefinieerd als
ongecompliceerd [3].
2.1 Pathogenese van urineweginfecties
De voornaamste oorzaak van urineweginfecties is een bacteriële infectie die opstijgt vanuit de
urinebuis. In een eerste cruciale fase wordt de vaginale introïtus gekoloniseerd door
3
uropathogenen. De meerderheid van deze bacteriën heeft een rectale oorsprong [9].
Uropathogenen bereiken de blaas en eventueel de nieren respectievelijk via opklimmende
urethrale en ureterale kolonisaties [7] [9]. Occasioneel ontwikkelen urineweginfecties zich
door een hematogene of lymfatische spreiding van bacteriën [1]. Dit is voornamelijk het geval
bij een persistente infectie van het bloed of een obstructie van de urinewegen [9].
E. coli wordt geïsoleerd bij 80-90 % van alle urineweginfecties en is hierdoor de belangrijkste
veroorzaker van urineweginfecties [1]. Om deze reden wordt dieper ingegaan op de
pathogenese van deze Gram-negatieve bacterie.
2.1.1 Uropathogene Escherichia coli
Escherichia coli behoort tot de microflora van de gezonde humane darm. Verschillende
serotypes bestaan, gebaseerd op de O (lipopolysacchariden), H (flagellaire) en K (capsulaire)
oppervlakte antigenen [10]. E. coli kan echter ook ziekte veroorzaken, zowel bij mens als
dier. Verschillende pathogene varianten van de bacterie werden geïdentificeerd, elk met een
specifiek virulentiemechanisme. De belangrijkste en tot op heden best gedefinieerde
pathogene varianten zijn de enteropathogene E. coli (EPEC), de enterohaemorrhagische E.
coli (EHEC), de enterotoxigene E. coli (ETEC), de enteroinvasieve E. coli (EIEC), de
enteroaggregatieve E. coli (EAEC), de diffuus adherente E. coli (DAEC), de neonatale
meningitis E. coli (NMEC) en de uropathogene E. coli (UPEC). Het zijn UPEC die
urineweginfecties veroorzaken. Serotypes O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21,
O22, O25, O75 en O83 worden het vaakst geïsoleerd bij UWIs [2] [11].
Net als tal van andere uropathogenen hebben UPEC hun oorsprong in de intestinale tractus.
Wanneer UPEC de urethra binnenkomen (Zie 2.2 Risicofactoren), hechten ze zich
onmiddellijk vast aan het urotheel door middel van fimbriaal adhesine H (FimH). Dit bindt
geglycolyseerd uroplakin Ia op de oppervlakkige epitheelcellen van de blaas. Ook binding van
uroplakin IIIa en van α3 en β1 integrines en destabilisatie van microtubuli spelen een
belangrijke rol bij de invasie. Het totaal van interacties stimuleert intracellulaire herschikking
van het actine en internalisatie van de bacteriën in de oppervlakkige urotheelcellen.
In de cel repliceren UPEC zich bijzonder snel waarbij intracellular bacterial communities
(IBCs) gevormd worden (Figuur 1), een structuur die sterk lijkt op een biofilm. Hier
ontwikkelt zich ook een filamenteuze vorm van UPEC. Door verdere groei van de IBCs gaat
4
de urotheelcel in apoptose en komen UPEC vrij in het lumen van de blaas. De bacteriën
kunnen dan via de ureters opstijgen naar de nieren of met de urine het lichaam verlaten. De
filamenteuze UPEC daarentegen invaderen onmiddellijk naburige urotheelcellen. Deze cyclus
ondersteunt en versterkt de infectie [12].
Figuur 1. Invasie en replicatie van UPEC in het urotheel [13]
Legende. Binding. Bij contact met het urotheel binden UPEC onmiddellijk de oppervlakkige epitheelcellen.
Invasie. De binding aan het epitheel lokt tal van interacties uit waardoor UPEC geïnternaliseerd worden. Vroeg
stadium. UPEC repliceren snel en filamenteuze UPEC ontwikkelen zich. Het lichaam herkent de
lichaamsvreemde bacteriën en reageert met een immuunrespons (polymorfonucleaire leukocyten). Midden
stadium. Intracellular bacterial communities worden gevormd. Laat stadium. Verdere replicatie van UPEC en
filamenteuze UPEC. Ontsnapping. De oppervlakkige urotheelcellen barsten en de inhoud komt vrij in het lumen
van de blaas. Filamenteuze UPEC invaderen naburige epitheelcellen.
Het lichaam reageert op de infectie met een influx van polymorfonucleaire cellen (PMNs)
maar de immuunrespons is niet altijd in staat de infectie te klaren. De oorzaak hiervan is een
zuur polysaccharide kapsel dat UPEC omringt. Dit beschermt de bacteriën tegen fagocytose
door PMNs en verhindert activatie van het complement. De grote influx van PMNs gaat
echter gepaard met weefselschade. In combinatie met de pathogenese van UPEC resulteert dit
in stelselmatig verdwijnen van de oppervlakkige urotheelcellaag. Op deze manier wordt de
onderliggende transitionele cellaag blootgesteld aan de infectie.
Bacteriën invaderen deze cellaag maar fixatie van de geëndocyteerde bacteriën door actine
verhindert verdere replicatie. Deze inactieve fase, afgeschermd van de immuunrespons en
eventuele antibiotica, kan functioneren als bacterieel reservoir. Verdere differentiatie van
transitionele naar oppervlakkige urotheelcel laat afbraak van actine en bijgevolg replicatie van
UPEC toe (Figuur 2) [12]. Onderzoek toont aan dat UPEC zelf deze urotheeldifferentiatie
5
kunnen beïnvloeden. De infectieuze cyclus wordt hierdoor verder versterkt [14]. Mogelijks
speelt dit mechanisme ook een rol bij recurrente infecties [12].
Figuur 2. Invasie van de transitionele urotheellaag [12]
Legende. Door het invasiemechanisme van UPEC en interventie van PMNs breekt de oppervlakkige cellaag van
het urotheel stelselmatig af. Transitionele urotheelcellen komen hierbij vrij voor verdere infectie. Maar zolang
deze cellen niet verder gedifferentieerd zijn, wordt replicatie van de bacteriën verhinderd door actine en zijn deze
aanwezig als quiescent intracellular reservoirs (QIRs).
2.2 Risicofactoren
Gemiddeld 80 % van alle urineweginfecties wordt vastgesteld bij vrouwen. De hogere
prevalentie bij vrouwen heeft verscheidene oorzaken. Zo is er het anatomisch verschil tussen
man en vrouw. Bij vrouwen is de afstand tussen de urethrale opening en het rectum, een
belangrijke bron van uropathogenen, kleiner. Bovendien heeft de vrouw een kortere urethra
zodat bacteriën de blaas sneller bereiken [3] (Figuur 3).
Figuur 3. Positie van de urethrale opening ten opzichte van de anus en lengte van de urethra
bij man en vrouw [15]
Een bijkomende predisponerende conditie betreft de aanwezigheid van een verstoorde
vaginale microflora (VMF). De normale VMF, die voornamelijk bestaat uit lactobacillen,
omgeeft de urethrale opening en verhindert kolonisatie door uropathogenen. Verstoring van
deze microflora verhoogt het risico op UWIs. Dit kan verschillende oorzaken hebben zoals
sexuele gemeenschap, een voorgaande antibioticumkuur of contraceptie met een vaginaal
diafragma of spermicide [2].
6
Het oestrogeenniveau van de vrouw bepaalt tevens de vatbaarheid voor UWIs. Voldoende
oestrogeen zou nodig zijn om de gezonde VMF in stand te houden, maar tegelijkertijd lijkt
een teveel aan oestrogenen de adherentie van uropathogenen te bevorderen. Een belangrijke
oorzaak van een tekort aan oestrogeen bij vrouwen is de menopauze. Belangrijke oorzaken
van een verhoogd oestrogeengehalte zijn het gebruik van anticonceptie, gebaseerd op
oestrogenen, en een zwangerschap [2].
Een genetische aanleg voor het ontwikkelen van urineweginfecties wordt tevens
gesuggereerd. Een voorbeeld hiervan zijn mutaties in het secretor-gen. Dit gen codeert voor
een glycosyltransferase dat mee de carbohydraatsamenstelling van glycoproteïnen en
glycosfingolipiden op het celoppervlak bepaalt. Deze structuren zijn tevens bindingplaatsen
voor UPEC. Mutaties in het secretor-gen leiden tot verhoogde binding van UPEC en
bijgevolg verhoogde vatbaarheid voor UWIs [2] [7].
Andere geslachtsonafhankelijke risicofactoren voor UWIs zijn congenitale anatomische
afwijkingen, infrequente blaaslediging, lage vochtinname, neurologische stoornissen,
catheterisatie, voorafgaande UWIs, hogere leeftijd [1] en diabetes mellitus [16]. Patiënten met
diabetes mellitus hebben dubbel zoveel kans op een UWI. Meerdere mechanismen dragen
hiertoe bij: de hoge glucoseconcentratie in de urine die de groei van bacteriën bevordert, de
verzwakte immuunrespons die er niet in slaagt de infectie te klaren en de neurologische
schade die de functionaliteit van de blaas vermindert [16].
2.3 Diagnose
De stijgende prevalentie van antibioticumresistentie maakt de diagnostische accuraatheid bij
urineweginfecties essentieel. Urineweginfecties zijn met hun hoge prevalentie immers
verantwoordelijk voor een aanzienlijke hoeveelheid antibioticumvoorschriften [5].
De diagnose van urineweginfecties is niet altijd eenvoudig. Niet zelden zijn UWIs
asymptomatisch of presenteren ze zich met atypische symptomen. Bovendien dienen artsen
UWIs te onderscheiden van aandoeningen met gelijkaardige presentatie zoals blaaskanker.
Het is dan ook niet verwonderlijk dat naast de klinische presentatie van de patiënt ook het
onderzoek van de urine van groot belang is. Dit laatste gebeurt door middel van urine
dipsticks of kweek [17].
7
2.3.1 Klinische presentatie
In de kliniek is de diagnose van een UWI voornamelijk gebaseerd op de symptomen en de
medische voorgeschiedenis van de patiënt [5]. Wanneer een vrouw zich presenteert met
dysurie, frequente en urgente mictie en suprapubische pijn of druk, dan is de kans dat deze
vrouw een UWI heeft 50 %. Dit stijgt tot 84-92 % wanneer de vrouw een geschiedenis heeft
van recurrente UWIs [1].
Bij patiënten met verhoogd risico op UWIs (Zie 2.2 Risicofactoren) volstaat soms de
aanwezigheid van symptomen om behandeling te starten. Deze methode heeft een maximale
sensitiviteit: alle patiënten met UWIs worden behandeld. Maar het aantal onterecht
behandelende patiënten is aanzienlijk. Met de stijgende antibioticumresistentie in het
achterhoofd, dient deze aanpak in vraag te worden gesteld [5].
2.3.2 Urine dipsticks
Meestal wordt de diagnose gesteld door de klinische presentatie van de patiënt te combineren
met urine-onderzoek door middel van dipsticks. Deze teststrookjes bestaan uit stevige plastic
waarop verschillende afzonderlijke reagentiazones werden vastgehecht. De dipsticks worden
in de urine gedompeld waarna de verkleuring van de reagentiazones vergeleken wordt met de
bijgevoegde kleurenpatronen. Op deze manier kan een kwantitatief resultaat snel en
eenvoudig worden afgelezen. Multisticks die onder andere nitriet, leukocyt esterase, proteïnen
en bloed detecteren, worden het frequentst aangewend [5].
De biochemische reactie die wordt gedetecteerd door de nitriettest is de omzetting van nitraat
tot nitriet door de Enterobacteriaceae, die verantwoordelijk zijn voor het merendeel van de
UWIs. Dit houdt echter in dat andere uropathogenen zoals enkele Pseudomonas stammen en
de enterococcen niet gedetecteerd worden met deze test.
De leukocyt esterasetest detecteert enzymes met esterolytische activiteit, geproduceerd door
neutrofielen. Esterase-activiteit kan wijzen op inflammatie. De uitkomst van deze test is
echter sterk onderhevig aan omgevingsfactoren zoals contaminatie van de urine met vaginale
microflora of een hoge concentratie glucose in de urine.
8
De urine dipsticks hebben een lage sensitiviteit, een hoge specificiteit, een lage positief
predictieve waarde en een hoge negatief predictieve waarde. Hun toepassing ligt daarom
vooral in het uitsluiten van bacteriurie op basis van een negatief resultaat [17].
2.3.3 De gouden standaard: Kweek
Een kwantitatieve cultuur van de urine is de enige manier om met absolute zekerheid de
diagnose te stellen [1]. Tegelijkertijd wordt meer informatie verschaft over de prevalentie en
antibioticumresistentie van de uropathogenen [17].
Enkel de urine van patiënten bij wie de therapie niet aanslaat, patiënten met recurrente of
compliceerde UWIs en ziekenhuispatiënten wordt gekweekt. Voor alle andere patiënten
volstaat de combinatie van klinische symptomen en een urine dipstick om een voldoende
betrouwbare diagnose te stellen [17], dit om zowel tijd, arbeid als geld te sparen [5].
Standaard wordt een midstream urinestaal aeroob op CLED (Cysteïne Lactose Elektroliet-
Deficiënte)-agar gekweekt [18]. Na overnachte incubatie kan het aantal colony forming units
(CFU) geteld worden. Volgens de Kass criteria wijst een groei van 105
of meer CFU per
milliliter urine op een urineweginfectie [19] maar steeds meer laboratoria passen deze grens
aan naargelang de methode van staalname en de status van de patiënt (Figuur 4). Meestal
wordt geopteerd voor een drempelwaarde van 104 CFU/ml urine, wat de sensitiviteit verhoogt
[17].
Figuur 4. Interpretatie van de cultuur van een urinestaal [17]
9
Legende. Kolom 1: De urinestalen worden opgedeeld naargelang de kans op contaminatie (hoge of lage kans),
afhankelijk van de methode van staalname en de status van de patiënt. De cijfers in deze kolom geven weer
hoeveel fenotypisch verschillende micro-organismen gegroeid zijn. Kolom 2: per fenotypisch verschillend
micro-organisme wordt het aantal CFU per ml urine geteld. Kolom 3: Naargelang het resultaat in kolom 1 en 2
verschilt de interpretatie van de cultuur van het urinestaal.
2.4 Therapie
2.4.1 Profylactie
Patiënten met recurrente infecties kunnen door kleine wijzigingen in hun levensstijl vaak al
een groot deel van de infecties voorkomen. Enkele voorbeelden hiervan zijn een dubbele
mictie, het vermijden van spermiciden en antibiotica en de inname van probiotica om de
genitale microflora te ondersteunen [3].
2.4.2 Richtlijnen voor behandeling in België
De gekozen therapie hangt af van de locatie van infectie (cystitis vs. pyelonephritis), de
oorzaak van infectie (ongecompliceerd vs. gecompliceerd), de leeftijd van de patiënt, de ernst
van de infectie en de regionale antibioticumresistentie [8]. In België zijn nitrofuranen en
trimethoprim de eerste keuze in antibiotica bij ongecompliceerde infecties. Fosfomycine komt
in aanmerking als tweede keuze. Bij gecompliceerde urineweginfectie wordt amoxicilline,
met clavulaanzuur gecombineerd (amoxy/clav of augmentine), aangewend en in tweede lijn
co-trimoxazol of een fluoroquinolone [20]. Asymptomatische bacteriurie wordt enkel
behandeld bij kinderen, een zwangerschap of voor urologische chirurgie [3].
2.4.3 Richtlijnen voor behandeling in Kenia
Bij vermoeden van UWI wordt in Kenia amoxycilline, cotrimoxazole of nitrofurantoïne
toegediend. Bij diagnose van pyelonefritis wordt de behandeling beperkt tot cotrimoxazole en
nitrofurantoïne [21].
2.5 Microbiologie
Er werd steeds aangenomen dat de blaas van een gezond individu steriel is. Recent werd deze
stelling echter in twijfel getrokken door Siddiqui et al. die door middel van moleculaire
technieken aantoonden dat de natuurlijke urinaire microflora polymicrobieel is en aanzienlijk
varieert tussen individuen. Lactobacillus, Prevotella en Gardernella zouden de dominante
genera zijn in urine van gezonde individuen [22].
10
Bij infectie daarentegen zijn de Enterobacteriaceae de dominante species. Zo wordt
gemiddeld 80-90 % van alle UWIs veroorzaakt door E. coli [17]. Naast E. coli worden ook
andere Enterobacteriaceae zoals Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella
oxytoca, Klebsiella pneumoniae en Proteus mirabilis geïdentificeerd als oorzaak van een
urineweginfectie. En ook de enterococcen, Groep B streptococcen, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus en S. saprophyticus worden geïsoleerd bij UWIs. De frequentie van
deze bacteriën als veroorzaker van een UWI verschilt van populatie tot populatie (Figuur 5)
[23].
Figuur 5. Bacteriële soortensamenstelling van de urine van drie verschillende
patiëntenpopulaties: ambulante patiënten, ziekenhuispatiënten en rusthuisbewoners [23]
Legende. Er wordt weergegeven bij welk percentage van de patiënten de species, door middel van kweek,
werden teruggevonden in de urine.
2.6 Probleemstelling en doelstellingen
Jarenlang werd aangenomen dat de urine van gezonde individuen steriel is. Deze
veronderstelling was gebaseerd op de afwezigheid van bacteriën bij de kweek van een
midstream of katheter urinestaal van een gezond individu. Recent werd door middel van high-
throughput sequencing aangetoond dat urine niet steriel is maar zelfs een verrassend brede
microflora heeft met Lactobacillus, Prevotella en Gardnerella als dominante genera. Deze
bevindingen versterken het vermoeden dat de gouden standaard in de diagnose van
urineweginfecties, een cultuur in combinatie met de Kass criteria, mogelijk infecties met
moeilijk en traag groeiende bacteriën mist [22]. Bovendien moet men bij een kweek
gemiddeld 12 u wachten op het resultaat, wat voor bepaalde patiëntenpopulaties (bijvoorbeeld
intensieve zorgen) onaanvaardbaar is.
Een eerste doel van deze studie was daarom de ontwikkeling en validatie van een moleculair
diagnostische test voor E. coli UWIs. Met de moleculaire methode, een kwantitatieve PCR,
11
zou het resultaat sneller beschikbaar zijn en zouden eventueel E. coli serotypes opgepikt
worden die niet of moeilijk kweekbaar zijn. Naast deze mogelijk diagnostische toepassing,
zou onze qPCR ook toegepast kunnen worden in verder onderzoek, waar het een krachtige
assay vormt voor het kwantificeren van E. coli.
Naast het ontwikkelen van een nieuwe diagnostische methode, werd ook dieper ingegaan op
de huidige gouden standaard van de diagnose. Standaard wordt het urinestaal gekweekt op
CLED-agar en overnacht aeroob geïncubeerd [18]. Om na te gaan of hierdoor infecties gemist
worden, werden de urinestalen in deze studie zowel aeroob als anaeroob, en zowel op CLED-
als op MacConckey agar gekweekt om vervolgens de bacteriële groei te vergelijken.
Een derde luik van de studie betrof de karakterisatie van UWIs in Kenia door middel van
MALDI-TOF. Zoals werd aangetoond door Foxman, verschilt de microbiële samenstelling
van populatie tot populatie [23]. Vooral in arme landen, waar een kweek per individu
financieel niet haalbaar is, is kennis van de regionale frequentie van de uropathogenen zeer
belangrijk. Op basis daarvan kan een geschikt blind behandelingsplan voor urineweginfecties
worden uitgewerkt. Naast karakterisatie is ook regionale antibioticumresistentie van groot
belang bij de keuze van therapie. Naar aanleiding van de bevindingen van Muvunyi et al. in
Rwanda [24], werd in deze studie de antibioticumresistentie is Kenia onderzocht. Dit kan
bijdragen tot een conclusie over de huidige behandelingsstrategie in Kenia.
12
3. Materiaal en Methoden
3.1 Bacteriële stammen
Tabel 1: Species en stammen met hun optimale medium en groeicondities. In addendum.
3.2 Kweek- en invriesmedia
Tabel 2: Samenstelling Trypticase Soy Agar + 15 % glycerol (TBSG), MacConkey agar,
Bloedagar en CLED-agar. In addendum.
3.3 Invriezen en terug in cultuur brengen van bacteriële stammen
Voor het invriezen wordt gebruik gemaakt van Trypticase Soy Broth met 15 % glycerol (Zie
3.2 Kweek- en invriesmedia). Het glycerol in dit medium vormt een beschermende laag rond
de bacteriën en voorkomt het barsten van de celmembraan.
Protocol. Invriezen: Verzamel alle kolonies op de plaat met een steriele swab of entnaald.
Breng vervolgens de swab of entnaald in een cryovial met Trypticase Soy Broth + 15 %
glycerol. Suspendeer de bacteriën door goed met de swab of entnaald te draaien. Verwijder de
swab of entnaald voorzichtig en sluit de cryovial. Vries in bij – 80 °C. Terug in cultuur
brengen: Breng de bacteriën met behulp van een wattenstaafje over op de geschikte
voedingsbodem en aeroob of anaeroob geïncubeerd (Zie 3.1 Bacteriële stammen).
3.4 DNA-extracties
3.4.1 Roche DNA-extractie
De Roche DNA-extractie is een kolom gebaseerde extractie. De extractie werd uitgevoerd
volgens de manual van Roche.
3.4.2 Alkalische DNA-extractie
De lysebuffer gebruikt bij alkalische extractie bestaat uit natriumhydroxide (NaOH) en
natrium (sodium) dodecyl (lauryl) sulfaat (SDS). Het detergent SDS zorgt voor lysis van de
cel terwijl NaOH de aanwezige proteïnen denatureert.
Samenstelling alkalische lysebuffer. 1. 0.25 g SDS (C12H25O4Sna) (Sigma) 2. 95 ml sterile
UltraPure water (Reagent Water, molecular Biology Grade, VWR) 3. 5 ml 1 N (1 mol/l)
NaOH (Belgolabo) 4. Oplossing gefilterd met 0.45 µm filter (Sartorius, Minisart).
Protocol. Pipetteer 20 µl ALB in een 1.5 ml eppendorf. Pik één kolonie op met een 1 µl
inoculatieloop, dompel de tip van de entnaald in de ALB en roer enkele seconden. Verwijder
voorzichtig de inoculatieloop en sluit de eppendorf. Incubeer 15 minuten bij 95 °C.
13
Centrifugeer 5 seconden bij maximale snelheid. Pipetteer 180 µl HPLC in de eppendorf.
Centrifugeer 5 minuten bij 8 000g. Bewaar de extracten bij - 20 °C.
3.4.3 NucliSens EasyMAG extractie
De NucliSens EasyMAG extractie (Biomerieux, Marcy l'Etoile, France) is een semi-
automatische DNA extractiemethode gebaseerd op magnetische beats. Protocol Specifiek A
werd ontworpen voor DNA-rijke stalen zoals urine. Het protocol Generic is een meer
algemeen toepasbaar protocol. De belangrijkste verschillen zijn een hogere concentratie
magnetische silica en extra wasstappen bij Specifiek A. Beide protocols werden uitgevoerd
volgens de Manual van Biomérieux.
3.4.4 Koken-vriezen methode
Bij de koken-vriezen methode worden de bacteriën gelyseerd door middel van een hitteschok.
Protocol. Pipetteer 500 µl urine in een 1.5 ml eppendorf. Centrifugeer gedurende 5 minuten
bij maximale snelheid. Giet de urine weg zodat enkel de pellet achterblijft in het epje. Voeg
110 µl HPLC-water toe. Vortex tot de pellet opgelost is. Incubeer 15 minuten bij 95 °C.
Bewaar de stalen bij -20 °C.
3.5 Meten van concentratie en zuiverheid DNA
De concentratie DNA (ng/µl) van een DNA-extract kan gemeten worden met het Nanodrop
toestel (ND-1000, Isogen-Lifescience, Wilmington, USA). DNA absorbeert maximaal bij een
golflengte van 260 nm, eiwitten bij een golflengte van 280 nm. De verhouding van de
absorbantie bij 260 en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van het DNA in te schatten.
Een ratio van 1.8 wordt algemeen beschouwd als zuiver voor DNA. Wanneer de ratio lager is,
kan dit wijzen op de aanwezigheid van eiwitten, ssDNA of ssRNA. Bepaling van de DNA-
concentratie werd uitgevoerd volgens de Nanodrop manual.
3.6 Berekenen van het aantal chromosomen per µl DNA-extract
De exacte hoeveelheid geëxtraheerde genomen wordt berekend op basis van de genoomlengte
en het percentage GC- en AT- basenparen. De massa per chromosoom is gelijk aan (% GC
baseparen x genoomlengte x massa per GC-basepaar) + (% AT baseparen x genoomlengte x
massa per AT-basepaar). De massa per GC-basenpaar is
en de massa per AT-
14
basenpaar is
. Door de DNA-concentratie, gemeten met het NanoDrop toestel, te
delen door de genoommassa wordt het exact aantal chromosomen per µl bekomen.
3.7 Aanmaken van een tienvoudige verdunningsreeks van een DNA-extract
Om een 10x verdunningsreeks van een DNA-extract te bereiden worden een aantal epjes
gevuld met 180 µl 1/10 000 verdund foetaal kalf thymus DNA. Foetaal kalf thymus DNA
verhindert dat het DNA-extract aan de randen van het epje blijft kleven. 20 µl extract wordt in
het eerste epje gepipetteerd. Na goed mengen door op en neer te pipetteren en te vortexen
wordt 20 µl van deze eerste verdunning overgebracht in het tweede epje. 20 µl van deze
tweede verdunning wordt na goed mengen overgebracht in het derde epje. Op deze manier
wordt verder gegaan tot de gewenste DNA-concentratie bereikt is.
3.8 Staalname van de urine
Na het wassen van de handen, spreiden vrouwen de labia met één hand terwijl ze een
urinebeker vasthouden met de andere. Het begin van de urinestaal wordt niet opgevangen, dit
om mogelijke contaminanten in de urethra eerst te verwijderen. Zonder de urinestraal te
onderbreken wordt de rest van de urine opgevangen. De urinebeker wordt zo volledig
mogelijk gevuld.
3.9 Kweek van urine
Het urinestaal wordt voorzichtig geschud om het staal te homogeniseren. Een gekalibreerde 1
µl inoculatieloop wordt vertikaal in de urine gebracht en uitgeplaat op een CLED- of
MacConkey kweekbodem volgens standaardmethoden.
3.10 Nagaan van resistentie met behulp van het antibiogram
Met behulp van een antibiogram kan de antibioticumresistentie van een bacteriële stam
bepaald worden. Hiervoor wordt de te testen stam samen met antibioticumschijfjes (met een
gekende antibioticumconcentratie) op Mueller Hinton agar gekweekt. Afhankelijk van de
antibioticumgevoeligheid van de stam zal de groei rondom de antibioticumschijfjes variëren.
De stam kan in staat zijn om tegen bepaalde antibioticumschijfjes aan te groeien, terwijl hij
bij andere een typische "lege zone" vertoont (Figuur 6). De grootte van deze "lege zone" is
afhankelijk van zowel het antibioticum als de gegroeide stam. Resistentie of gevoeligheid
15
wordt daarom bepaald aan de hand van standaarden. In deze studie gebeurde dat automatisch
door middel van de Adagia machine.
Protocol. Neem een kolonie van een actief groeiende reincultuur en los ze op in fysiologisch
water tot een McFarland 0.5 densiteit wordt bereikt, gemeten met DEN-1 McFarland
Densitometer, Grant-bio. Plaat deze oplossing uit op een Mueller Hinton agar plaat met
behulp van een wattenstaafje. Plaats de antibioticaschijfjes op de plaat (Gebruikte antibiotica:
zie tabel 17 en tabel 18 in addendum). Incubeer de plaat overnacht. Lees het resultaat af met
de Adagia machine (Laboratorium Bacteriologie 2P8).
Figuur 6. Antibiogram
Legende. Een stam wordt op Mueller Hinton agar gekweekt. Op dezelfde plaat worden verschillende
antibioticumschijfjes geplaatst. A: De gekweekte stam is resistent aan het antibioticum, zijn groei wordt niet
verhinderd door aanwezigheid van het antibioticum. B: Of de stam gevoelig is voor dit antibioticum wordt
bepaald aan de hand van standaarden die rekening houden met de grootte van de "lege zone", het geteste antibioticum en de gegroeide stam. C: Spookzone of synergetische zone: de actieve component rechts van de
spookzone zorgt ervoor dat het antibioticum links van de spookzone weer effectief wordt (ESBL: Zie ook 5.3.
Karakterisatie van urineweginfecties in Mombasa, Kenia)
3.11 Detectie en identificatie van stammen
3.11.1 Fenotypische detectie en identificatie van stammen
3.11.1.1 p-nitrophenyl, B-D glucopyranosiduronic acid (PGUA) test
Deze test voor de fenotypische identificatie van E. coli is gebaseerd op de productie van het
enzym beta-glucuronidase. Bacteriën worden opgelost in fysiologisch water in aanwezigheid
van orthonitrophenyl-beta-glucuronide. Productie van beta-glucuronidase zorgt voor afbraak
van orthonitrophenyl-beta-glucuronide waarbij ortho-nitrophenyl vrijgesteld wordt. Deze
molecule is verantwoordelijk voor een gele verkleuring van het fysiologisch water.
Protocol. Pipetteer 250 µl fysiologisch water (0.9 % NaCl) in een 1.5 ml eppendorf. Pik
enkele kolonies op met een steriele inoculatieloop, dompel de tip van de entnaald in het
fysiologisch water en roer enkele seconden. Voeg 1 tablet beta-glucuronidase toe (Diatabs TM
,
Rosco Diagnostics, Taastrup, Denemarken). Incubeer 4 uur bij 37 °C. Lees het resultaat af:
gele verkleuring van de oplossing duidt op aanwezigheid van E. coli.
16
3.11.2 Moleculaire detectie en identificatie van stammen
Voor detectie en kwantificatie van E. coli in urinestalen wordt een qPCR gebruikt. Voor
identificatie van gekweekte bacteriën maken we in deze studie gebruik van MALDI-TOF,
tDNA-PCR en sequencing.
3.11.2.1 Kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) (realtime PCR)
De polymerase kettingreactie (PCR) is een techniek waarbij in vitro een stukje DNA
vermenigvuldigd wordt. Binnen enkele uren kunnen miljoenen zuivere kopieën van dit stukje
DNA gemaakt worden. Het principe is eenvoudig en bestaat uit drie fasen die herhaald
worden in 30 tot 40 cycli. Tijdens de eerste fase, de denaturatie, wordt de temperatuur
opgedreven tot 95 °C. Verhitten van het DNA zorgt ervoor dat de waterstofbruggen die de
complementaire DNA-strengen verbinden breken en de dubbele DNA-helix uit elkaar valt.
Tijdens de volgende fase, de hybridisatie, hybridiseren de primers aan de enkelstrengige
DNA-strengen. Deze primers zijn kleine stukjes chemisch gesynthetiseerd DNA, waarvan de
basenvolgorde complementair is met die van de uiteinden van het te vermenigvuldigen DNA
fragment. Deze primers zorgen ervoor dat aan de opengebroken streng DNA weer nieuwe
nucleotiden gekoppeld kunnen worden. Er wordt steeds gebruik gemaakt van twee primers,
een voor de 5'-streng en een voor de 3'-streng, respectievelijk forward en reverse primer
genoemd. In een derde fase, de elongatie, zal een polymerase de primers verlengen in de 5'-
richting. Tegen beide enkelstrengige DNA-strengen ontstaat zo een nieuwe DNA-streng en
wordt de hoeveelheid DNA verdubbeld. De vermenigvuldiging van het target-DNA is
exponentieel. Na de PCR kan het geamplificeerde DNA gedetecteerd worden met behulp van
gelelektroforese en ethidium bromide.
Met de conventionele PCR is wel detectie maar geen kwantificatie van het geamplificeerde
DNA mogelijk. Bij de real-time PCR of qPCR is in essentie de detectie en kwantificatie van
een fluorescent signaal direct evenredig met het aantal amplicons gegenereerd tijdens de PCR.
qPCR is mogelijk geworden door de ontwikkeling van thermal cyclers die na elke cyclus
fluorescentiemetingen kunnen uitvoeren (real-time cyclers). Hiervoor kan gebruik gemaakt
worden van hybridisatieprobes, hydrolysatieprobes of SYBR Green. Het principe is verder
volledig analoog met de conventionele PCR. In deze thesis werd gekozen voor de
fluorescente kleurstof SYBR Green omwille van de lagere prijs en aanvaardbare specificiteit
(met smeltcurve-analyse - zie verder).
17
In oplossing is SYBR Green weinig fluorescent, maar eens gebonden in de kleine groeve van
dubbelstrengig DNA stijgt de fluorescentie aanzienlijk. Op het einde van de elongatiefase is al
het geamplificeerde DNA in zijn dubbelstrengige vorm aanwezig en zal de fluorescentie
gemeten worden. Door deze fluorescentie na elke cyclus te meten en te vergelijken met de
fluorescentie van een standaardreeks kan het aanwezige DNA gekwantificeerd worden.
SYBR Green bindt elke vorm van dsDNA, dus ook primerdimeren en aspecifieke amplicons.
Dit kan leiden tot een hogere weergave van het PCR product dan er in werkelijkheid is. Om
deze reden gebeurt er op het einde van de qPCR een smeltcurve-analyse. Hiervoor wordt de
temperatuur langzaamaan verhoogd zodat het dsDNA denatureert en het fluorescentiesignaal
afneemt. De temperatuur waarbij de fluorescentie plots sterk afneemt wordt de
smelttemperatuur genoemd. De smelttemperatuur is afhankelijk van de baseninhoud van het
DNA-fragment. Primerdimeren en aspecifieke amplicons zullen daarom een andere
smelttemperatuur hebben dan het gewenste DNA-fragment en snel gedetecteerd worden.
De qPCR wordt uitgevoerd met het LightCycler 480 toestel (LightCycler® 480 Real-Time
PCR System, Roche Applied Science, België) en de LightCycler FastStart SybrGreen I
Master-kit (Roche Applied Science). Het PCR-mengsel in deze kit bevat deoxyribonucleotide
trifosfaten (dNTPs), MgCl2, hot-start Taq DNA polymerase en SybrGreen. Gebruik van een
hot-start polymerase voorkomt aspecifieke amplificatie. Warmte-labiele groepen op het
polymerase verhinderen elongatie bij lage temperatuur door sterische hinder. De reacties
worden uitgevoerd met 0.3 M fw primer, 0.3 M rv primer, 1 x reactiebuffer en 2 l DNA
extract in een totaalvolume van 10 l.
Protocol. Voeg het HPLC-water en de primers toe aan de reactiebuffer. Verdeel het
reactiemengsel uit over een 96-wellplaat (MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate,
Applied Biosystems, Scoresby, Australia). Dit met een volume van 8 µl per well. Pipetteer per
well 2 µl DNA-extract. Kleef een cover op de 96-wellplaat en druk goed aan. Draai de plaat
af gedurende 30 seconden. Het onderstaande PCR-programma werd gebruikt op het
Lightcycler 480 toestel: 10’ bij 95 °C, 40 (15” bij 95 °C, 1’ bij 60°C) gevolgd door een
smeltcurve analyse.
18
3.11.2.2 Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer (MALDI-
TOF)
De identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF (Microflex™ LRF, Brücker) is
gebaseerd op de species-specifieke samenstelling van de bacteriële celwand. De te
identificeren bacteriën worden voorbehandeld in ethanol en vervolgens op een draagplaatje
gelegd en bedekt met een matrix. In het MALDI-TOF toestel wordt deze matrix beschoten
met een laserstraal (337 nm) waardoor deze deels loskomt en geïoniseerd wordt. Ook de
bacteriën worden gefragmenteerd en door overdracht van ladingen vanuit de matrix worden
bacteriële fragmenten geïoniseerd. De geïoniseerde moleculen worden versneld in het
elektromagnetisch veld tussen de matrix en elektrode. Dit is de start van het scheidingsproces
dat gebaseerd is op het time-of-flight (TOF) principe. De snelheid waarmee de ionen de
detector bereiken hangt af van hun massa waarbij zwaardere ionen trager zijn. Op deze manier
wordt een patroon bekomen, specifiek voor het species. Door deze fingerprint te vergelijken
met de database is identificatie mogelijk.
Protocol. Breng de bacteriën als een dunne film direct aan op de Maldi target (= spot), laat
uitdrogen, breng 1 µl HCCA matrix oplossing aan, laat drogen en plaats de plaat in het
toestel.
3.11.2.3 Transfer DNA-PCR (tDNA-PCR)
tRNA-genen bevatten aan het 5’- en 3’- uiteinde geconserveerde gebieden. Door gebruik te
maken van fluorescent gemerkte primers die complementair zijn aan deze gebieden maar naar
buiten gericht zijn, kunnen de spacer regio's tussen opeenvolgende tRNA-genen
geamplificeerd worden. Deze spacer regio's variëren in lengte en aantal naargelang het
species. Door koppeling van deze techniek met capillaire elektroforese worden species-
specifieke DNA-PCR-fingerprints verkregen. Vergelijking van deze fingerprints met de
databank die ter beschikking is in het LBR maakt identificatie van de bacteriën mogelijk.
Protocol tDNA-PCR. Bereid de PCR-mix. Per DNA-extract bestaat deze uit 9.1 µl
polymerase supermix HiFi, 0.1 µl primer T3B + T3BFAM en 0.1 µl primer T5A. Verdeel de
mix uit over een 96-wellplaat met een volume van 8 µl per well. Pipetteer per well 0.7 µl
DNA-extract. Kleef een cover op de 96-wellplaat en druk goed aan. Plaats de 96-wellplaat in
de Veriti 96-well thermal cycler en start de run. Maak gebruik van volgend programma: 2’ bij
94 °C, 30 x (10" bij 96 °C, 15" bij 45 °C, 30" bij 72 °C), 30" bij 72 °C, blijvend bij 4 °C.
Denatureer vervolgens het geamplificeerde DNA: Protocol denaturatie. Pipetteer 148 µl
HiDi-formamide + 4.2 µl size standard (GS500LIZ) in een 1.7 ml eppendorf (hoeveelheden
19
per tDNA-PCR run). Meng het mengsel goed op met een pipet. Verdeel 9.0 µl van het
mengsel in elk van de 16 wells van de microtiterplaat. Voeg 1.0 µl van het PCR-product toe.
Gebruik als positieve controle LIS27. Als negatieve controle gebruik je het mengsel zonder
PCR-product. Plaats 3 min bij 95 °C om het DNA te denatureren. Plaats 10 min op ijs. Draai
de microtiterplaat kort af. Breng de plaat in het capillair: principe en protocol zie 3.11.2.5.1.
Capillaire elektroforese voor fragmentanalyse.
3.11.2.4 16S rRNA sequencing gebaseerde identificatie
Het 16S rRNA is een ribosomale RNA streng dat deel uitmaakt van de kleine subunit (30S)
van prokaryote ribosomen. Het gen dat codeert voor het 16S rRNA is ongeveer 1550 bp lang
en bevat erg geconserveerde gebieden met ertussen variabele regio’s. De variabele regio’s
bevatten phylogenetische informatie, het bepalen van de sequentie ervan geeft ons een
species-identificatie.
3.11.2.4.1 16S rRNA PCR
Van een geïsoleerde kolonie wordt het 16S rRNA gen geamplificeerd, na alkalische DNA-
extractie (zie 3.4.2 Alkalische DNA-extractie).
Protocol. Maak voor elke te identificeren kolonie een mengsel met 10 l FastStart PCR
mastermix (Roche, Mannheim, Duitsland), 0.1 l van elke primer (not en MP2, zie Tabel
3: Primers en hun sequentie, in addendum), 7.8 l HPLC water en 2 l DNA extract. Maak
gebruik van volgend programma: 5’ bij 95 °C, 3 (1’ bij 95 °C, 2’ bij 58 °C, 1’ bij 72 °C), 30 x
(20” bij 95 °C, 1’ bij 58 °C, 1’ bij 72 °C), 5’ bij 27 °C, blijvend bij 4 °C.
3.11.2.4.2 Sequencing
3.11.2.4.2.1 Zuiveren van PCR-producten voor sequentiebepaling
Het PCR-product moet gezuiverd worden van primers en dNTP’s, omdat deze kunnen
interfereren met de sequentiebepalingsreactie. Hierbij wordt gebruik gemaakt van
exonuclease dat enkelstrengig DNA (primers en enkelstrengige aspecifieke producten)
afbreekt in de 3’- 5’ richting en alkalisch fosfatase dat niet ingebouwde dNTP’s afbreekt.
Protocol. Meng 5 µl PCR-product met 0.5 µl Exonuclease I (Fermentas) en 1 µl FastAP
Thermosensitive Alkaline Phosphatase of Schrimp Alkaline Phosphatase (Fermentas).
Incubeer 15 min bij 37 °C en inactiveer de enzymen door het mengsel 15 min te verhitten bij
85 °C.
20
3.11.2.4.2.2 Cycle sequencing-reactie
Er wordt gewerkt volgens het Sanger-principe om de basensequentie van enkelstrengig DNA
te bepalen.
Protocol. Maak een mengsel met per well: BigDye v3.1 mastermix 1x (Invitrogen), BigDye
v3.1 buffer 1x (Invitrogen), primer not 0.2 M (Eurogentec), primer MP2 0.2 M en 2 l
PCR amplicon in een totaalvolume van 10 l. Voer de cycle sequencing reactie uit als volgt:
30 x (10” bij 96 °C, 5” bij 50 °C, 4’ bij 60 °C).
3.11.2.4.2.3 Ethanolprecipitatie
Het doel van deze reactie is het neerslaan van de DNA-moleculen zodat ze geen
interfererende componenten (niet-geïncorporeerde fluorescent gemerkte dideoxyterminatoren)
meer bevatten die kunnen leiden tot storingen in de sequentieanalyse.
Protocol. Bereid het ethanol/natriumacetaat-mengsel bestaande uit 50 µl 96 % ethanol
(Merck), 2 µl 3 M natriumacetaat (NaAc) pH 4.6 en 0.2 µl dextraanblauw (om de DNA-pellet
zichtbaar te maken). Pipetteer in elke buis van de PCR-strip 52 µl van het ethanol/NaAc-
mengsel. Voeg hieraan 20 µl PCR-product toe en homogeniseer het mengsel met de schudder
(Super-mixer, Lab-line instruments, Illinois). Centrifugeer de strips gedurende 30 minuten op
maximum snelheid (13000g). Maak ondertussen een 70 % ethanol-oplossing door per 10
stalen 1.85 ml ethanol 96 % met 0.65 ml HPLC water te mengen. Verwijder na het
centrifugeren het supernatans met behulp van een pipet. Breng 150 µl van de 70 % ethanol-
oplossing bij de pellet en homogeniseer het mengsel met de schudder. Centrifugeer het
mengsel 5 minuten bij maximale snelheid (13000g). Verwijder opnieuw het supernatans en
droog het pellet 2 minuten bij 95 °C. Voeg 15 µl gedeïoniseerde formamide toe (Amresco).
Denatureer het DNA in de formamide door de strips 2 min te verhitten bij 95 °C. Plaats 10
minuten op ijs. Pipetteer het gedenatureerde mengsel over in een plaat. Breng de plaat in het
capillair: principe en protocol: zie 3.11.2.5.2 Capillaire elektroforese voor sequentieanalyse.
3.11.2.5 Capillaire elektroforese
Bij capillaire elektroforese worden de DNA-moleculen gescheiden in een elektrisch veld,
aangebracht overheen een capillair. Een laser detecteert de fluorescente DNA fragmenten.
21
3.11.2.5.1 Capillaire elektroforese voor fragmentanalyse
De fluorescent gemerkte tDNA-PCR amplicons dragen een lading die verschilt naargelang
hun lengte. Op basis van deze lading en dus hun migratiesnelheid, zullen de fluorescent
gemerkte DNA-fragmenten van elkaar gescheiden worden. De scheiding gebeurt door gebruik
te maken van een gebufferde elektrolytoplossing en een hoge elektrische spanning waardoor
een elektro-osmotische en elektroforetische stroom van de buffer ontstaat in het capillair.
Wanneer de DNA-fragmenten een detectorvenster in het capillair passeren, worden de
fluorescerende labels geëxciteerd door een Argon laser. De uitgezonden fluorescentie wordt
door middel van een ‘charge-coupled device’ (CCD) camera gedetecteerd waarbij de signalen
omgezet worden in een elektroferogram.
Protocol. Breng de plaat met gedenatureerde tDNA-PCR producten in het capillair
elektroforese-toestel en start de run. Analyseer de resultaten na afloop met behulp van
speciale software, GeneMapper Version 4.0 (AB). Exporteer de resultaten naar een PC voor
analyse met BaseHopper: Analyse van de tDNA-PCR-fingerprints met behulp van
“BaseHopper”. De verkregen tDNA-PCR-fingerprint wordt geanalyseerd door een in-house
programma genaamd “BaseHopper” dat de digitale fingerprint vergelijkt met een bestaande
bibliotheek van tDNA-PCR-fingerprints, waaruit een identificatie van de bacterie volgt. Voor
de meeste kweekbare vaginale soorten werden reeds tDNA-PCR referentie-fingerprints
geproduceerd.
3.11.2.5.2 Capillaire elektroforese voor sequentieanalyse
Het doel is het bepalen van de lengte van de eindstandig gekleurde DNA-fragmenten
waardoor uiteindelijk de sequentie bepaald kan worden. Een onderscheid tussen de basen
wordt gemaakt op basis van de verschillende golflengtes van de fluorochromen die aan de
dideoxyterminatoren gekoppeld zijn. Elke base komt met een bepaalde golflengte en
bijhorende kleur overeen. DNA-fragmenten die gekleurd zijn met 1 van de 4 verschillende
fluorochromen zullen elektroforetisch in het capillair migreren. Bij passage langs de laser
worden de fluorescent gelabelde DNA-fragmenten geëxciteerd waardoor deze licht zullen
emitteren dat wordt opgevangen door de CCD camera. De “Sequencing Analysis 2.2
Software” zet het fluorescentiesignaal om in digitale gegevens (pieken). Het chromatogram
geeft aanleiding tot de bepaling van de sequentie.
Protocol. Maak op de computer een “sample sheet” aan. Breng de plaat met gezuiverde
sequentie-producten (zie 3.11.2.4.2.3 Ethanolprecipitatie) in het capillair elektroforese-toestel
en start de run.
22
In silico analyse van de resultaten. De bekomen sequentie kan verbeterd worden met het
software programma 4Peaks. De sequentie wordt vergeleken met de GenBank door de
sequentie in FASTA-formaat in te geven in BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
waarna identificatie volgt.
3.12 Primerparen
Vier primerparen voor de amplificatie van E. coli werden gezocht in de literatuur, te vinden in
Tabel 3: Primers en hun sequentie, in addendum. Via de website
‘http://www.ncbi.nlm.nih.gov’ werd gebruik gemaakt van het BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) programma. BLAST is een algoritme dat DNA sequenties in
verscheidene databases vergelijkt en werd gebruikt om de ampliconlengte, de sequenties
waarmee de primer kan hybridiseren en de maximum percentage identiteit (max. ID) na te
gaan. De max. ID is een weergave van het aantal basen dat perfect matcht met de gevonden
DNA sequentie. Voor de selectie van het primerpaar werd tevens gekeken naar de GC-inhoud
(%), lengte en smelttemperatuur van de primers. De smelttemperatuur (Tm) is de temperatuur
waarbij de helft van de basen van de dubbelstrengige primer gedenatureerd is en kan berekend
worden via de formule (geldig voor primerlengtes tussen 5 en 60 basen): Tm = 4 * (G+C) + 2
* (A+T).
3.13 Bestellen en uitverdelen van de primers
De primers E. coli Fw en E. coli Rv werden besteld op www.eurogentec.com. Bij de optie
'hoeveelheid' werd '10 nmol schaal' gekozen en bij de optie 'zuivering' 'RP-cartridge Gold'. Na
het ontvangen van de primers werden stockoplossingen (100 µM) en werkoplossingen (20
µM) bereid.
Protocol. Stockoplossing (100 µM): Voeg HPLC water toe aan de Fw-primer en Rv-primer in
de hoeveelheid vermeld op het bijgeleverde document. Verdeel deze stockoplossingen over
drie epjes. Bewaar deze buisjes bij - 20 °C. Werkoplossing (20 µM): Pipetteer 20 µl
stockoplossing in een nieuw epje. Voeg 80 µl HPLC-water toe. Bewaar deze werkoplossing
bij - 20 °C.
23
4. Resultaten
4.1 Ontwikkeling van een qPCR specifiek voor E. coli
4.1.1 Primers
Verschillende E. coli specifieke primersets, beschreven door Chern et al. [25] [26] en Ludwig
et al. [27], werden bestudeerd in BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). De resultaten
hiervan worden voorgesteld in Tabel 4.
Tabel 4. Resultaten BLAST-analyse.
Legende: Fw: Forward primer, Rv: Reverse primer, GC-inhoud: Aantal cytosines en guanines in de primer als
percentage van het totaal aantal basen, Tm: Smelttemperatuur van de primer, Max ID: Maximum percentage
identity; het aantal basen van het primerpaar dat matcht met de gevonden DNA sequentie.
De optimale lengte voor qPCR primers is 18-30 basenparen [30]. Op deze manier is de primer
lang genoeg om een adequate specificiteit te voorzien en kort genoeg om vlot het
gedenatureerde DNA te binden. Zoals blijkt uit Tabel 4 voldoen de primerparen E. coli
Fw/Rv, RodA984 Fw/Rv en EC23S857 Fw/Rv hieraan.
Het percentage GC-basenparen van een primer is idealiter 40 tot 60 % [30]. Een minimum
van 40 % is nodig om voldoende stabiliteit van de primer/template binding te garanderen. De
G-C binding draagt met haar drie waterstofbruggen immers meer bij tot de stabiliteit van de
primer/template binding dan de A-T binding met twee waterstofbruggen. De GC-inhoud van
Targetgen
(primernaam)
Primer-
lengte
GC-
inhoud
(%)
Tm (°C)Geamplificeerde species
met een max ID > 75 %
Amplicon-
lengteMax ID
uidA Fw: 20 Fw: 50 Fw: 60 Shigella flexneri 103 100%
(E. coli Rv: 18 Rv: 50 Rv: 54 Shigella sonnei 103 100%
Fw/Rv) Escherichia coli 103 100%
rodA Fw: 18 Fw: 56 Fw: 56 Shigella flexneri 177 100%
(RodA984 Rv: 20 Rv: 50 Rv: 60 Shigella boydii 177 100%
Fw/Rv) Escherichia coli 177 100%
23S rDNA Fw: 17 Fw: 65 Fw: 56 Shigella sonnei 77 100%
(EC23S) Rv: 26 Rv: 42 Rv: 74 Escherichia coli 77 100%
23S rDNA Fw: 20 Fw: 50 Fw: 60 Escherichia coli 68 95%
(EC23S857 Rv: 22 Rv: 45 Rv: 64 Shigella flexneri 68 95%
Fw/Rv) Shigella sonnei 68 100%
Salmonella bongori 73 100%
Salmonella enterica 87 100%
24
de primers E. coli Fw/Rv, RodA984 Fw/Rv en EC23S857 Fw/Rv ligt binnen deze grenzen
(Tabel 4).
De primer smelttemperatuur (Tm) is een maat voor de stabiliteit van de DNA-helix en
cruciaal bij het bepalen van de annealingstemperatuur (Ta). Hierbij geldt algemeen de formule
Ta = Tm - 1 à 2 °C [31]. Een te hoge Tm (en dus ook Ta) resulteert in lage primer-template
hybridisatie met weinig PCR-product tot gevolg. Een te lage Tm leidt mogelijk tot niet-
specifieke PCR-producten door mismatches. De Tm ligt best tussen de 55 en 60 °C [30]. De
smelttemperatuur van primerpaar RodA984 Fw/Rv valt binnen deze grenzen (Tabel 4).
Om een qPCR specifiek voor E. coli te ontwikkelen bindt de primer het best zo weinig
mogelijk species naast E. coli. Het primerpaar E. coli Fw/Rv bindt naast E. coli enkel Shigella
flexneri (Tabel 4).
Het werkingsmechanisme van SYBR Green (Zie 3.11.2.1 Kwantitatieve polymerase ketting
reactie) vereist een minimale lengte van het amplicon. Een ampliconlengte vanaf 100
basenparen is acceptabel. Te lange amplicons en de bijhorende secundaire structuren moeten
eveneens vermeden worden. De optimale lengte voor het amplicon ligt tussen de 100 en 150
basenparen [30]. Dit is het geval bij het primerpaar E. coli Fw/Rv (Tabel 4).
De max. ID is een weergave van het aantal basenparen dat matcht met de gevonden DNA
sequentie. Logischerwijs heeft een max. ID van 100 % de voorkeur. Dit is bij alle
primerparen, behalve bij primerpaar EC23S857 Fw/Rv, het geval voor E. coli. (Tabel 4).
4.1.2 Standaard verdunningsreeks
Het gebruik van een standaardreeks bij de qPCR heeft meerdere doeleinden. Zo wordt met
behulp van de standaardreeks het dynamisch bereik, de precisie en de amplificatie-efficiëntie
van de reactie bepaald. Bovendien is de kwantificatie bij qPCR gebaseerd op deze curve.
Voor het opstellen van deze standaard verdunningsreeks werd E. coli ATCC-25922
opgekweekt waarna DNA werd geëxtraheerd met behulp van de Roche DNA extractie kit.
Met behulp van het Nanodrop toestel werd de concentratie van het DNA-extract bepaald op
208.71 ng/µl. Hieruit werd het aantal chromosomen per µl berekend. Het genoom van E. coli
is 4 639 221 nucleotiden lang, bestaat voor 50.8 % uit GC-basenparen en voor 49.2 % uit AT-
25
basenparen [32]. Hieruit volgt dat het gewicht van het genoom van E. coli per chromosoom
4.76 x 10-6
ng bedraagt. Vervolgens werd van het DNA extract een tienvoudige
verdunningsreeks bereid (4.6 x 107 chromosomen/µl
- 4.6 x 10
3 chromosomen/µl).
4.1.3 Bepalen assay set-up
Hiervoor werd uitgegaan van het standaard qPCR-programma van het LBR (Laboratory
Bacteriology Research). De standaard verdunningen van de E. coli ATCC 25922 stam (Zie
4.1.2 Standaard verdunningsreeks) waren de DNA-extracten. Een vergelijking werd gemaakt
tussen twee verschillende primerconcentraties. In het LBR wordt standaard een
primerconcentratie van 0.3 µM gebruikt. In de studie van Chern et al. daarentegen wordt een
primerconcentratie van 1.0 µM gebruikt [25]. De E. coli qPCR heeft bij een een
primerconcentratie van 0.3 µM een efficiëntie van 1.973 (Figuur 7). Bij een
primerconcentratie van 1.0 µM heeft de E. coli qPCR een efficiëntie van 2.000.
Figuur 7. Standaardcurve van de verdunningsreeks van de E. coli ATCC 25922 stam, bij een
primerconcentratie van 0.3 µM
Gebruik van een primerconcentratie van 1.0 M geeft lagere Cq-waarden (cycles of
quantification) dan gebruik van een primerconcentratie van 0.3 µM (Figuur 8). Bij een
primerconcentratie van 1.0 µM zijn er echter extra pieken in de smeltcurve (Figuur 9)
(Principe smeltcurve-analyse: Zie 3.11.2.1).
Figuur 8. Amplificatiecurve van de verdunningsreeks van de E. coli ATCC 25922 stam bij
primerconcentraties van 0.3 µM (bruin) en 1.0 M (rood).
26
Figuur 9. Smeltcurve van de verdunningsreeks van de E. coli ATCC 25922 stam bij
primerconcentraties 0.3 µM en 1.0 M.
4.1.4 Validatie van de E. coli qPCR met behulp van gekende bacteriële stammen
Om de specificiteit van de E. coli qPCR na te gaan werd een panel van in totaal 55 stammen,
behorende tot 42 soorten, meegenomen in de run. Zie tabel 5: Stammen om de specificiteit
van de E. coli qPCR te testen, in addendum. Het betrof soorten die urineweginfecties kunnen
veroorzaken (n = 40) maar ook potentieel contaminerende stammen uit de genitale microflora
(n = 2) zoals Gardnerella vaginalis die bij onnauwkeurige staalname in het urinestaal kunnen
terechtkomen. Shigella werd eveneens meegenomen in de run, omwille van de grote
gelijkenis met het genoom van E. coli.
Van al deze stammen werden Enterobacter amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus, E.
cowanii, E. dissolvens, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, Escherichia fergusonii, G.
vaginalis, S. boydii en S. flexneri opgepikt door de E. coli qPCR (Figuren 10 en 12). De
Enterobacteria hadden een Cq-waarde groter of gelijk aan 35 (Figuur 10) en waren eenvoudig
te onderscheiden van E. coli op basis van hun smeltcurve (Figuur 11).
Figuur 10. Amplificatiecurve
standaarden (verdunningsreeks
van de E. coli ATCC 25922 stam)
en Enterobacteria
Figuur 11. Smeltcurve
standaarden (verdunningsreeks
van de E. coli ATCC 25922 stam)
en Enterobacteria
27
Shigella had een Cq-waarde van 12, G. vaginalis en E. fergusonii een Cq-waarde hoger dan 35
(Figuur 12). E. fergusonii was eenvoudig te onderscheiden van E. coli op basis van de
smeltcurve (Figuur 13).
4.1.5 Validatie van de E. coli qPCR met behulp van klinische stalen
Voor de verdere validatie van de E. coli qPCR werden urinestalen uit het UZ gebruikt,
verkregen via Professor Claeys. De validatie met klinische stalen had meerdere doeleinden.
Eerst en vooral diende er een methode voor DNA-extractie uit urine op punt gesteld te worden.
Verder diende de diagnostiek in het routinelaboratorium vergeleken te worden met de diagnose
door middel van de E. coli qPCR om na te gaan of beide methoden alle E. coli serotypes
oppikken. Ook bevat urine veel PCR-inhibitoren en vaak een lage DNA-concentratie. Dit in
tegenstelling tot de alkalische extracten waarmee de validatie van de PCR-efficiëntie en PCR-
specificiteit is uitgevoerd.
4.1.5.1 DNA-extractie uit urine
Er werden verschillende formats voor DNA-extractie uit urine getest: EasyMag protocol
Generic, EasyMag protocol Specifiek A en de koken-vriezen methode. Van tien urinestalen
werd met elk van deze drie protocols een DNA-extract bereid. Deze DNA-extracten werden
meegenomen in de E. coli qPCR run. De resultaten worden weergegeven in Tabel 6.
Figuur 12. Amplificatiecurve standaarden
(verdunningsreeks van de E. coli ATCC
25922 stam), E. fergusonii, G. vaginalis,
S. flexneri en S. boydii
Figuur 13. Smeltcurve standaarden
(verdunningsreeks van de E. coli ATCC
25922 stam), E. fergusonii, G. vaginalis,
S. flexneri en S. boydii
28
Tabel 6. Cq-waarde bij de verschillende formats voor DNA-extractie uit urine
Voor urinestalen 11L0523, 11L0428 en 11L0433 geldt dat de DNA-extracten verkregen door
EasyMag protocol Specifiek A een lagere Cq-waarde hadden. Gebruik van het protocol Generic
gaf een lagere Cq-waarde bij de urinestalen 11L0535 en 11L0460. De koken-vriezen methode
gaf een lagere Cq-waarde bij urinestaal 11L0460.
4.1.5.2 Diagnose van E. coli urineweginfecties: E. coli qPCR vs. routinelaboratorium
In het routinelaboratorium is aerobe kweek op CLED-platen de gouden standaard voor de
diagnose van urineweginfecties [18]. Daarom werd in deze studie elk urinestaal op deze manier
gekweekt (n = 150). De gegroeide stammen werden vervolgens geïdentificeerd met tDNA-PCR
of sequencing. Hiervoor werden eerst alkalische DNA-extracten bereid. Voor de E. coli qPCR
werd het DNA uit de urinestalen geëxtraheerd met behulp van EasyMag Specifiek A. Het
primerpaar E. coli Fw/Rv werd gebruikt, met een primerconcentratie van 0.3 µM. Om de aan-
of afwezigheid van het β-glucuronidase aan te tonen, werd een β-glucuronidasetest uitgevoerd.
Een overzicht van al deze resultaten wordt weergegeven in Tabel 7: Diagnose van E. coli UWI:
E. coli qPCR vs. routinelaboratorium, in addendum.
De urinestalen werden gerangschikt volgens aantal CFU/ml en op basis daarvan verdeeld en
besproken in drie categorieën: < 104
CFU/ml, 104-10
5 CFU/ml en ≥ 10
5 CFU/ml (gebaseerd op
de Kass Criteria). In de categorie "≥ 105
CFU/ml" waren volgens het routinelaboratorium 22
van de 52 urinestalen positief voor een E. coli urineweginfectie. Wanneer de diagnose gesteld
werd met de ontwikkelde E. coli qPCR waren 23 van de 52 urinestalen positief voor een E. coli
UWI. In totaal verschilde de diagnose in deze categorie bij 8 urinestalen (Tabel 8). De categorie
"104-10
5 CFU/ml" bestaat uit 22 urinestalen. Door toepassing van de Kass criteria op het aantal
CFU/ml (< 105) was de diagnose van het routinelaboratorium voor alle stalen negatief. De op
Urinestaal EasyMag Generic EasyMag Specifiek A Koken-vriezen
11L0430 35 35 >40
11L029 35 35 >40
11L0523 35 33.1 35
11L0468 35 35 35
11L0428 35 30.46 35
11L0518 > 40 35 35
11L0535 32.39 > 40 > 40
11L0433 20.35 14.72 19.19
11L0459 > 40 > 40 35
11L0460 33.3 35 35
29
qPCR-gebaseerde diagnose verschilde hier voor 7 urinestalen (Tabel 8). De categorie "< 104
CFU/ml" bevat 76 urinestalen. In het routinelaboratorium werden de gegroeide bacteriën door
hun lage aantal beschouwd als contaminanten. Bijgevolg werden alle urinestalen vrij van
infectie geacht. De E. coli qPCR toonde daarentegen een E. coli infectie aan bij 4 urinestalen
(Tabel 8).
Tabel 8. Diagnose van E. coli UWI: E. coli qPCR vs. routinelaboratorium
Legende. De diagnose van een E. coli UWI door middel van qPCR werd vergeleken met de huidige diagnostiek in
het routinelaboratorium. De urinestalen werden hiervoor opgesplitst in 3 categorieën op basis van het aantal
CFU/ml.
E. coli qPCR: Het resultaat van de E. coli qPCR wordt weergegeven met de berekende E. coli concentratie (E.
coli/ml). Voor de diagnose van een E. coli UWI, op basis van de berekende E. coli concentratie, werd in deze
studie de grenswaarde vastgelegd op een E. coli concentratie van minstens 105 E. coli/ml. Deze waarde werd
afgeleid van de Kass criteria voor kweek. Een 1 in de kolom "E. coli UWI volgens qPCR" staat voor infectie.
Routinelaboratorium: Het resultaat van de aerobe kweek op CLED-agar wordt weergegeven door het aantal CFU/ml. Een groei van 105 of meer CFU wordt volgens de Kass criteria als een urineweginfectie aanschouwd. De
β-glucuronidasetest werd uitgevoerd om aanwezigheid van het β-glucuronidase na te gaan. Identificatie van de
gegroeide bacteriën gebeurde door middel van tDNA-PCR en/of sequencing. De urinestalen gemarkeerd met *
werden wegens praktische redenen geïdentificeerd met behulp van biochemische testen. De biochemische testen
vonden plaats in het routinelaboratorium onder leiding van Professor Claeys. Nb staat voor "niet bepaald". De
diagnose van een E. coli UWI werd gesteld op basis van het aantal CFU/ml (≥ 105) en de identificatie van de
gegroeide stammen als E. coli. Een 1 in de kolom "E. coli UWI volgens routinelaboratorium" staat daarbij voor
infectie.
4.1.5.3 Kweek: vergelijking van kweekmethoden
In de diagnostiek worden urinestalen standaard uitgeplaat op CLED-agar en overnacht aeroob
geïncubeerd. Om na te gaan of deze standaardprocedure een infectie zou kunnen missen,
werden de urinestalen zowel op CLED- als MacConckey agar, aeroob als anaeroob gekweekt.
Na overnachte incubatie werd het aantal CFU geteld. De gegroeide bacteriën werden
E. coli /ml volgens
qPCR
E.coli UWI
volgens qPCRCFU/ml
β-glucuronidase-
test
Identificatie -
tDNAPCR/Sequencing
E. coli UWI volgens
routinelaboratorium
11K3043 0,00E+00 0 ≥ 105
- E. coli 1
12552 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. coli 1
51034 0,00E+00 0 ≥ 105
1 E. coli 1
41994 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. coli 1
11L2322 5,88E+05 1 ≥ 105
- P. rettgeri + P. aeruginosa * 0
12B5230 2,60E+05 1 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12B5716 3,66E+05 1 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12B5763 6,72E+06 1 ≥ 105
0 P. aeruginosa 0
11L2413 2,10E+06 1 4,70E+04 - E. coli 0
12B5172 4,22E+07 1 4,70E+04 1 E. coli 0
12B5277 4,00E+07 1 2,70E+04 1 E. coli 0
12B5779 4,20E+05 1 1,20E+04 1 Mengflora 0
11K0301 1,00E+06 1 1,10E+04 - E. coli * 0
12B5214 1,45E+05 1 1,30E+04 0 P. aeruginosa 0
12B5782 3,40E+07 1 1,30E+04 1 Mengflora 0
12B5410 9,00E+07 1 8,00E+03 1 E. coli 0
11698 1,06E+08 1 4,00E+03 0 S. simulans 0
12B5260 3,00E+03 1 3,00E+03 1 E. coli 0
12125 1,87E+05 1 0,00E+00 - - 0
< 104 CFU/ml
104
- 105
CFU/ml
Diagnose E. coli urineweginfecties
dmv qPCRDiagnose E. coli urineweginfecties in routinelaboratoria
Categorie Staal
≥ 105
CFU/ml
30
geïdentificeerd door middel van tDNA-PCR of sequencing. Hiervoor werden alkalische DNA-
extracten bereid. Een overzicht van de resultaten van alle urinestalen wordt weergegeven in
Tabel 9: Resultaten kweek urinestalen, in addendum.
4.1.5.3.1 Aeroob vs. anaeroob: CLED-agar
Op de CLED-agar groeiden 75 van de 150 urinestalen aeroob en 77 anaeroob. Er werd opnieuw
opgesplitst in drie categorieën: < 104
CFU/ml aeroob CLED, 104-10
5 CFU/ml aeroob CLED en
≥ 105
CFU/ml aeroob CLED. Volgens deze categorieën zijn er 13 urinestalen die aeroob beter
groeiden dan anaeroob (Tabel 10). Er waren eveneens 9 urinestalen die anaeroob tot een hogere
categorie behoorden dan aeroob (Tabel 11).
Tabel 10. Groei op CLED-agar: aeroob vs. anaeroob
Legende: Elk urinestaal werd op CLED-agar gekweekt, zowel aeroob als anaeroob. Na overnachte incubatie werd
het aantal CFU geteld. De stammen werden geïdentificeerd door middel van tDNA-PCR en/of sequencing. De
urinestalen gemarkeerd met * werden wegens praktische redenen geïdentificeerd met behulp van biochemische
testen. Deze testen vonden plaats in het routinelaboratorium onder leiding van Professor Claeys. Nb staat voor
"niet bepaald". De urinestalen waarbij de groei aeroob beter was dan anaeroob (geredeneerd met de drie
categorieën: < 104 CFU/ml aeroob CLED, 104-105 CFU/ml aeroob CLED en ≥ 105 CFU/ml aeroob CLED), worden
weergegeven in deze tabel.
Tabel 11. Groei op CLED-agar: aeroob vs. anaeroob
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-
PCR/ SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
11K3224 ≥105
Gist * 0,00E+00 Nb
42050 ≥105
Gist * 0,00E+00 Nb
41878 ≥105
Gist * 0,00E+00 Nb
12B5319 ≥105
Enterococcus sp. * 5,60E+04 E. faecalis
291949 ≥105
E. faecalis 8,90E+04 E. faecalis
11K3061 9,20E+04 Gist * 0,00E+00 Nb
11K0231 8,60E+04 S. agalactiae * 0,00E+00 Nb
11K3137 5,70E+04 Gist * 0,00E+00 Nb
11K0301 1,10E+04 E. coli * 0,00E+00 Nb
11L0430 1,10E+04 E. faecalis 9,00E+03 E. faecalis
12B5214 1,30E+04 P. aeruginosa 4,00E+03 K. oxytoca
12B5782 1,30E+04 Mengflora 8,00E+03 Nb
12B5373 1,10E+04 P. aeruginosa * 5,00E+03 E. faecalis
104
- 105
cfu/ml
aeroob CLED
Aeroob Anaeroob
≥ 105
cfu/ml
aeroob CLED
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-PCR/
SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
11L2413 4,70E+04 E. coli ≥105
P. mirabilis
12B5275 4,40E+04 K. pneumoniae + E. aerogenes ≥105
E. faecalis
11K3033 9,00E+03 E. faecalis ≥105
L. gasseri
11L0459 0,00E+00 Nb ≥105
Nb
12B5756 0,00E+00 Nb ≥105
Nb
12B5410 8,00E+03 E. coli 3,00E+04 E. coli
12B5260 3,00E+03 E. coli 1,10E+04 E. coli
12B5778 0,00E+00 Nb 1,70E+04 A.urogenitalis
12688 0,00E+00 Nb 4,00E+04 L. crispatus
Aeroob Anaeroob
104-10
5 cfu/ml
aeroob CLED
< 104 cfu/ml
aeroob CLED
31
Legende. Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij de groei anaeroob beter was dan aeroob (geredeneerd met de
drie categorieën: < 104 CFU/ml aeroob CLED, 104-105 CFU/ml aeroob CLED en ≥ 105 CFU/ml aeroob CLED),
worden weergegeven in deze tabel.
Voor 9 urinestalen binnen de categorie "≥ 105
CFU/ml aeroob CLED" verschilde de aeroob
gegroeide stam met de anaeroob gegroeide stam. Voor de vergelijking van de gegroeide species
beperkten we ons in deze studie tot de urinestalen met een UWI volgens de gouden standaard
(≥ 105 CFU/ ml aeroob CLED) (Tabel 12).
Tabel 12. Vergelijking van de gekweekte species: aeroob vs. anaeroob
Legende: Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij het species dat aeroob gegroeid is verschilde met het species
dat anaeroob gegroeid is, worden weergegeven in deze tabel. Voor de vergelijking van de gegroeide species
beperkten we ons in deze studie tot de urinestalen met een UWI volgens de gouden standaard (≥ 105 CFU/ ml aeroob CLED).
4.1.5.3.2 Aeroob vs. anaeroob: MacConckey
Op de MacConckey agar groeiden 38 van de 102 urinestalen aeroob en 40 anaeroob. Er werd
opnieuw geredeneerd met de drie categoriën: "< 104
CFU/ml aeroob MacConkey, 104-10
5
CFU/ml aeroob MacConkey en ≥ 105
CFU/ml aeroob MacConkey". Volgens deze categorieën
waren er in totaal 3 urinestalen die aeroob beter groeiden dan anaeroob (Tabel 13). Er waren
eveneens 2 urinestalen die anaeroob beter groeiden dan aeroob (Tabel 14).
Tabel 13. Groei op MacConkey agar: aeroob vs. anaeroob
Legende: Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij de groei aeroob beter was dan anaeroob (geredeneerd met de
drie categorieën: < 104 CFU/ml aeroob MacConkey, 104-105 CFU/ml aeroob MacConkey en ≥ 105 CFU/ml aeroob
MacConkey), worden weergegeven in deze tabel.
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-
PCR/ SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
11K3043 ≥105
E. coli ≥105
K. pneumoniae
11K3138 ≥105
Enterococcus sp. ≥105
E. faecalis
11K3031 ≥105
Enterococcus sp. * ≥105
E. faecalis
12B5319 ≥105
Enterococcus sp. * 5,60E+04 E. faecalis
11K3040 ≥105
K. pneumoniae ≥105
E. coli
11K3162 ≥105
E. coli ≥105
Gist
11L2491 ≥105
E. coli ≥105
M. morganii
12B5230 ≥105
E. faecalis ≥105
E. coli
51038 ≥105
Serratia ≥105
K. pneumoniae
Aeroob Anaeroob
≥ 105
cfu/ml
aeroob
CLED
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-
PCR/ SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
≥ 105
cfu/ml aeroob
MacConkey52141 ≥ 10
5 P. aeruginosa 3,00E+04 P. aeruginosa
12B5289 5,00E+04 Nb 0,00E+00 Nb
12B5214 2,00E+04 P. aeruginosa 6,00E+03 P. aeruginosa
Aeroob Anaeroob
104
- 105
cfu/ml aeroob
MacConkey
32
Tabel 14. Groei op MacConkey agar: aeroob vs. anaeroob
Legende: Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij de groei anaeroob beter was dan aeroob (geredeneerd met de drie categorieën: < 104 CFU/ml aeroob MacConkey, 104-105 CFU/ml aeroob MacConkey en ≥ 105 CFU/ml aeroob
MacConkey), worden weergegeven in deze tabel.
4.1.5.3.3 CLED- vs. MacConckey agar
De standaard in het routinelaboratorium - aerobe kweek op CLED-agar - werd verder
vergeleken met het alternatief: aerobe kweek op MacConkey agar. Er werden 102 urinestalen
zowel op CLED- als MacConckey agar uitgeplaat. Ook hier werd gewerkt met drie categorieën:
≥105
CFU/ml aeroob CLED, 104-10
5 CFU/ml aeroob CLED en <10
4 CFU/ml aeroob CLED.
Geredeneerd met deze categorieën waren er in totaal 15 urinestalen die beter groeiden op de
CLED-agar (Tabel 15). Er waren eveneens 2 stalen die beter groeiden op de MacConckey agar
(Tabel 16).
Tabel 15. Aerobe groei: CLED agar vs MacConkey agar
Legende: Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij de groei op CLED-agar beter was dan die op MacConkey
agar (geredeneerd met de 3 categoriëen: < 104 CFU/ml aeroob CLED, 104-105 CFU/ml aeroob CLED en ≥ 105
CFU/ml aeroob CLED), worden weergegeven in deze tabel.
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-
PCR/ SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
11L0428 0,00E+00 Nb ≥105
Gist + E. coli
51789 7,00E+03 E. coli 1,20E+04 E. coli
< 104 cfu/ml aeroob
MacConkey
Aeroob Anaeroob
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-PCR/
SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
11L0428 ≥105
Gist * 0 Nb
12B5319 ≥105
Enterococcus sp. * 0 Nb
12B5787 ≥105
E. faecalis 0 Nb
291949 ≥105
E. faecalis 0 Nb
42087 ≥105
E. faecalis 5,40E+04 E. coli
12B5349 9,80E+04 Enterococcus sp. 0 Nb
12B5168 2,50E+04 E. faecalis 0 Nb
11L0535 2,40E+04 S. epidermis 0 Nb
12B5777 2,00E+04 E. faecalis 0 Nb
12B5314 1,90E+04 C. imitans 0 Nb
12B5782 1,30E+04 Mengflora 0 Nb
11L0430 1,10E+04 E. faecalis 0 Nb
12B5779 1,20E+04 Mengflora 4,00E+03 E. coli
12B5373 1,10E+04 P. aeruginosa * 5,00E+03 P. aeruginosa
41998 1,00E+04 E. aerogenes 4,00E+03 E. aerogenes
CLED-agar MacConkey agar
≥ 105
cfu/ml
aeroob CLED
104
- 105
cfu/ml
aeroob CLED
33
Tabel 16. Aerobe groei: CLED-agar vs MacConkey agar
Legende: Ut supra (Tabel 10). De urinestalen waarbij de groei op MacConkey agar beter was dan die op CLED-
agar (geredeneerd met de 3 categoriëen: < 104 CFU/ml aeroob CLED, 104-105 CFU/ml aeroob CLED en ≥ 105
CFU/ml aeroob CLED), worden weergegeven in deze tabel.
Verder viel ook verschil in species op, afhankelijk van de gebruikte voedingsbodem. Dit valt
echter buiten het doel van deze studie en zal bijgevolg niet verder besproken worden.
4.2 Urineweginfecties in Mombasa, Kenia
Voor dit luik van het onderzoek bestond de studiepopulatie uit 42 Keniaanse vrouwen met een
urineweginfectie, bevestigd door kweek en interpretatie volgens Kass criteria in Mombasa,
Kenia. De urinemonsters werden verzameld tussen maart en oktober 2011.
4.2.1 Moleculaire karakterisatie met behulp van MALDI-TOF
De urinestalen werden in het LBR aeroob op CLED-agar gekweekt waarna de gegroeide
stammen door middel van MALDI-TOF werden geïdentificeerd. De prevalentie (%) van de
geïdentificeerde UWI species wordt weergegeven in Figuur 14.
Figuur 14. Prevalentie van de UWI species in een studiepopulatie van 42 Keniaanse vrouwen
Categorie Urinestaal CFU/mlIdentificatie mbv tDNA-PCR/
SequencingCFU/ml
Identificatie mbv tDNA-
PCR/ Sequencing
104
- 105
cfu/ml
aeroob CLED12B5275 4,40E+04 K. pneumoniae + E. aerogenes ≥10
5 K. pneumoniae
< 104 cfu/ml
aeroob CLED52141 8,00E+03 E. faecalis ≥10
5 P. aeruginosa
CLED-agar MacConkey agar
45.2%
16.7%
11.9%
9.5%
7.1%
2.4% 2.4% 2.4% 2.4% Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus sp.
Enterobacter sp.
Micrococcus luteus
Corynebacterium minutissimum
Acinetobacter junii
Lactobacillus jensenii
Candida albicans
34
Bij 45.2 % van de UWIs werd E. coli geïdentificeerd, bij 16.7 % K. pneumoniae, bij 11.9 %
Staphylococcus spp, bij 9.5 % Enterobacter spp, bij 7.1 % M. luteus, bij 2.4 % C.
minutissimum, bij 2.4 % A. junii, bij 2.4 % L. jensenii en bij 2.4 % C. albicans.
4.2.2 Nagaan van resistentie
Recent werd aangetoond dat in Rwanda de UWI-veroorzakende species nagenoeg resistent zijn
aan standaard therapie [24]. Naar aanleiding hiervan werd in deze studie de resistentie in Kenia
onderzocht met behulp van een antibiogram. Uit de studiepopulatie van 42 Keniaanse vrouwen
met een UWI werd een selectie gemaakt: enkel de resistentie van de twee meest prevalente
species (Zie 4.2.1 Moleculaire karakterisatie met behulp van MALDI-TOF) werd onderzocht.
Een overzicht van deze resultaten wordt weergegeven in Tabel 17: Antibioticumresistentie in
Kenia - E. coli, in addendum en in Tabel 18: Antibioticumresistentie in Kenia - K. pneumoniae,
in addendum.
Van de Keniaanse vrouwen met een E. coli UWI (n = 19) was 100 % gevoelig voor amikacin,
100 % voor amoxicilline + clavulaanzuur, 50.0 % voor ampicilline, 94.4 % voor cefotaxime,
100 % voor cefotaxime + clavulaanzuur, 94.4 % voor ceftazidime, 94.4 % voor cefuroxime,
100 % voor colistin, 100 % voor fosfomycin, 94.4 % voor gentamicine, 100 % voor
meropenem, 100 % voor nitrofurantoïne, 83.3 % voor ofloxacin (waarvan echter 1 stam met
een intermediaire gevoeligheid), 100 % voor piperacillin + tazobactam, 100 % voor temocilline
en 33.3 % voor trimethoprim/sulfamethoxazole. De resistentie van de E. coli stam in urinestaal
1621 kon om praktische redenen niet bepaald worden. (Tabel 17)
Van de Keniaanse vrouwen met een K. pneumoniae UWI (n = 7) was 100 % gevoelig voor
amikacin, 66.6 % voor amoxicilline + clavulaanzuur, 0.0 % voor ampicilline, 83.3 % voor
cefotaxime, 100 % voor cefotaxime + clavulaanzuur, 83.3 % voor ceftazidime, 83.3 % voor
cefuroxime, 100 % voor colistin, 100 % voor fosfomycin, 66.6 % voor gentamicine, 100 %
voor meropenem, 100 % voor nitrofurantoïne, 100 % voor ofloxacin, 100 % voor piperacillin +
tazobactam (waarvan echter 2 stammen met een intermediaire gevoeligheid), 100 % voor
temocilline en 66.6 % voor trimethoprim/sulfamethoxazole. De resistentie van de K.
pneumoniae stam in urinestaal 1819 kon om praktische redenen niet bepaald worden. (Tabel
18)
35
5. Discussie
5.1 Ontwikkeling van een E. coli qPCR
Een eerste doelstelling van deze studie was de ontwikkeling van een moleculair diagnostische
methode voor detectie van E. coli UWIs. Er werd gekozen voor een kwantitatieve E. coli PCR.
Het is de eerste keer dat een goed gevalideerde E. coli qPCR voor UWIs ontwikkeld werd.
Eerder ontwikkelde E. coli qPCRs voor UWIs zijn onvoldoende gevalideerd [33] of detecteren
enkel de meest frequente uropathogene E. coli (UPEC) [11]. Andere studies beperken zich tot
kwantitatieve of niet-kwantitatieve E. coli PCRs voor (grond)water [25] [34] [35] [36].
De ontwikkeling van de E. coli qPCR voor UWIs startte met de selectie van een primerpaar.
Verschillende primersets werden met elkaar vergeleken in BLAST [25] [26] [27]. Het
primerpaar dat het best aan alle voorwaarden voor een qPCR-primerpaar voldeed, namelijk een
primerlengte van 18-30 basenparen, een GC-inhoud van 40-60 %, een smelttemperatuur van
55-60 °C, een hoge specificiteit voor E. coli en een ampliconlengte van 100-150 basenparen
[30], was het primerpaar E. coli Fw/Rv, dat het β-glucuronidasegen, uid-A, bindt. Dit
primerpaar werd in de rest van de studie gebruikt.
Vervolgens werden twee primerconcentraties vergeleken: de primerconcentratie die standaard
gebruikt wordt in het LBR (0.3 µM) en de primerconcentratie uit de studie van Chern et al. (1
µM) [25]. De Cq-waarden bij primerconcentratie 1.0 µM waren gemiddeld 1 Cq-waarde lager
maar tegelijkertijd werden er bij deze concentratie extra pieken waargenomen in de smeltcurve.
De aanwezigheid van deze extra pieken wijst op een minder specifieke amplificatie. Daarom
werd in deze studie gekozen voor een primerconcentratie van 0.3 µM.
Na in silico validatie van de primers en bepalen van de optimale primerconcentratie qua
specificiteit en qua amplificatie-efficiëntie voor de type-stam van E. coli werd de specificiteit
van de E. coli qPCR getest met een panel van welgekozen stammen. Van de 55 geteste
stammen werd de overgrote meerderheid niet opgepikt door de E. coli qPCR: naast E. coli
werden enkel Enterobacter amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus, E. cowanii, E.
dissolvens, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, Escherichia fergusonii, Gardnerella
vaginalis, Shigella boydii en S. flexneri opgepikt. Hierbij moet opgemerkt worden dat het bij de
Enterobacter spp., E. fergusonii en G. vaginalis gaat om Cq-waarden ≥ 35, die als negatief
36
worden beschouwd.
Dat de qPCR Shigella oppikt met Cq-waarde 12, kan gelinkt worden aan de studie van Dibb et
al. Deze auteurs merkten op er dat geen onderscheid gemaakt kan worden tussen E. coli en
Shigella op basis van de β-glucuronidasetest [37]. Aangezien onze qPCR gebaseerd is op
detectie van het uid-A-gen, dat codeert voor β-glucuronidase, verwachtten we dus dat de E. coli
qPCR Shigella ook zou oppikken. Onderscheid tussen de 2 species op basis van de
smelttemperatuur was niet mogelijk (zowel voor E. coli als voor Shigella: 81 °C). Ook dit was
een te verwachten resultaat: E. coli en Shigella zijn grotendeels identieke species en hebben
beiden een sterk gelijkend uid-A-gen [38]. Deze 'aspecifiteit' van de primers is voor detectie van
E. coli in urine niet echt een probleem omdat UWIs met Shigella bijzonder zeldzaam zijn [39].
Bovendien zal de therapie voor een Shigella UWI niet verschillen van die voor een E. coli
UWI.
De Enterobacter spp. die werden meegenomen in de E. coli qPCR run hebben een Cq-waarde ≥
35. Zoals reeds besproken werden dergelijke hoge Cq-waarden in deze studie als een negatief
resultaat beschouwd. Bovendien waren de Enterobacter species eenvoudig te onderscheiden
van E. coli op basis van hun smeltcurve. Op deze manier hadden ze geen invloed op het doel
van onze qPCR, de diagnose van E. coli UWIs. Waarom de Enterobacter spp. toch werden
opgepikt door de E. coli qPCR, weliswaar met een zeer hoge Cq-waarde, is nog onduidelijk.
Een mogelijke verklaring is dat ook de Enterobacter spp. uid-A hebben, hetzij in een licht
gewijzigde vorm. Dit wordt tegengesproken door eerdere E. coli PCR studies met uid-A als
target, die de Enterobacter spp. niet detecteerden [38] [40]. Nu is het zo dat een qPCR lagere
DNA-concentraties kan detecteren dan een klassieke PCR. Mogelijk zijn de lage Enterobacter
DNA-concentraties die wij hier gemeten hebben, niet opgemerkt door de klassieke PCR,
gevolgd door detectie met ethidium bromide kleuring. Verder toonden Tapsall en collega's in
hun studie aan dat de β-glucuronidase test ook bij Enterobacter spp. positief kan zijn. De
verkleuring treedt dan wel pas op na 24 u, in tegenstelling tot na 4 u bij E. coli [41]. Dit
ondersteunt het vermoeden dat ook Enterobacter spp. het enzym β-glucuronidase hebben, hetzij
minder abundant of in een minder actieve vorm. Verder onderzoek naar de aanwezigheid van β-
glucuronidase bij Enterobacter spp. is aangewezen.
37
Van alle stammen in het testpanel werd ook G. vaginalis opgepikt door de E. coli qPCR. Ook
dit had geen invloed op het doel van onze qPCR omdat G. vaginalis pas werd opgepikt bij een
Cq-waarde van ≥ 35 wat als een negatief resultaat beschouwd wordt. Onderscheid tussen G.
vaginalis en E. coli op basis van de smelttemperatuur was niet mogelijk. Net als bij de
Enterobacter spp. is het mogelijk dat G. vaginalis codeert voor het uid-A, hetzij in een licht
gewijzigde vorm. Over G. vaginalis en β-glucuronidase is zeer weinig gekend. Een onderzoek
naar G. vaginalis bij merries identificeerde 6 isolaten als G. vaginalis waarvan minstens 4
isolaten β-glucuronidase positief waren [42]. Dit ondersteunt onze hypothese. Gezien UWIs
met G. vaginalis reeds beschreven zijn [43] is verder onderzoek naar de aanwezigheid van uid-
A en β-glucuronidase bij dit species aan te raden.
Ook E. fergusonii werd door de E. coli qPCR opgepikt met een Cq-waarde van ≥ 35.
Aangezien dergelijk hoge Cq-waarde beschouwd werd als een negatief resultaat, vormde dit
geen probleem voor het gebruik van de E. coli qPCR. Bovendien was E. fergusonii eenvoudig
te onderscheiden van E. coli op basis van de smeltcurves. Gezien E. coli en E. fergusonii tot
hetzelfde genus behoren is het aannemelijk dat uid-A ook bij E. fergusonii voorkomt. Dit wordt
echter tegengesproken door Rice et al. bij wie de β-glucuronidasetest voor E. fergusonii telkens
negatief was [44]. Dit is mogelijk te wijten aan een te kleine studiepopulatie (17 isolaten) zodat
ook hier verder onderzoek aangewezen is.
Uit de validatie met alkalische extracten van een uitgebreid testpanel kon algemeen besloten
worden dat de ontwikkelde E. coli qPCR specifiek is voor E. coli.
Na deze validatie werd de E. coli qPCR verder gevalideerd met klinische stalen. Hierbij werd
eerst en vooral een methode voor DNA-extractie uit urine op punt gesteld. Verschillende
methoden voor DNA-extractie uit urine werden getest: EasyMag protocol Generic, EasyMag
protocol Specifiek A en de koken-vriezen methode. Protocol Specifiek A gaf het vaakst de
laagste Cq-waarde en werd daarom gekozen en aangeraden als format voor DNA-extractie uit
urine. Deze analyse zou in een volgende studie uitgebreid kunnen worden met meer E. coli
positieve urinestalen. Eventueel is de eenvoudige koken-vriezen methode, met bvb. additionele
proteïnase K behandeling een mogelijk alternatief, dat even gevoelige detectie toelaat en
financieel voordeliger is.
38
Als tweede onderdeel van de validatie met klinische stalen werd de diagnostiek in het
routinelaboratorium vergeleken met de diagnose door middel van de E. coli qPCR. In de
routine wordt de diagnose van een E. coli UWI gesteld volgens de Kass criteria, die stellen dat
er sprake is van een UWI indien ≥ 105 CFU/ml gegroeid zijn na overnachte aerobe kweek op
CLED-agar. Voor de diagnose door middel van de E. coli qPCR stelden wij de drempel op een
E. coli concentratie van minstens 105 E. coli/ml, gebaseerd op de Kass criteria voor kweek.
De op qPCR gebaseerde en op kweek gebaseerde diagnose van E. coli UWIs was identiek voor
103 van de 150 urinestalen (87 %). Een eerste discrepantie was dat de qPCR bij 4 urinestalen
geen E. coli detecteerde terwijl in het routinelaboratorium meer dan 105 E. coli/ml gedetecteerd
werd. Bij 2 van deze urinestalen was de β-glucuronidasetest positief en was uid-A dus zeker
aanwezig. Aangezien urine PCR-inhibitoren kan bevatten [45], verhinderden PCR-inhibitoren
in deze DNA-extracten mogelijks een goede werking van de qPCR.
Bij de 2 andere urinestalen was de β-glucuronidasetest negatief. Een hypothese om het
negatieve resultaat van de E. coli qPCR bij deze twee urinestalen te verklaren, is de
afwezigheid van uid-A bij bepaalde E. coli stammen. Deze hypothese wordt ondersteund door
meerdere studies. Martins et al. vonden het uid-A-gen bij slechts 97.7 % van 435 E. coli
isolaten door middel van DNA-DNA hybridisatie [46]. Gebruik van probes en van PCRs met
primers gericht tegen uid-A gaven een overeenstemmend resultaat [38] [47] [48]. Interessant
hierbij is dat uid-A in al deze studies ook gevonden werd bij E. coli isolaten met een negatieve
β-glucuronidasetest. Zo heeft in de studie van Martins et al. 5.3 % van de E. coli isolaten een
negatieve β-glucuronidasetest maar toch het uid-A-gen [46]. De ontwikkelde qPCR zal de uid-
A-negatieve E. coli stammen niet oppikken maar bij uid-A-positieve E. coli stammen zal de
hogere gevoeligheid van de qPCR ten opzichte van de β-glucuronidasetest een belangrijk
voordeel zijn.
Een tweede discrepantie tussen qPCR en kweek was dat 15 urinestalen, die geen E. coli UWI
waren volgens het routinelaboratorium (kweek geïnterpreteerd met de Kass criteria), wel een E.
coli UWI waren volgens de qPCR. Een eerste mogelijke verklaring hiervoor is dat deze urines,
naast de kweekbare E. coli, een tweede vorm van E. coli bevatten die zich onvoldoende deelt
voor een zichtbare groei op een kweekmedium. De studie van Anderson et al. ondersteunt deze
stelling. In deze studie werden de levende bacteriën in urine geteld met behulp van
39
fluorescentie waarna dit aantal werd vergeleken met het aantal gegroeide bacteriën op een
kweekbodem. De levende bacteriën bleken significant hoger in aantal. Dit suggereert het
bestaan van levende maar niet-kweekbare bacteriën in urine [49]. We vermoeden een link
tussen deze levende maar niet-kweekbare E. coli en de quiescent intracellular reservoirs (QIRs),
de bacteriële reservoirs die bij een urineweginfectie gevonden worden in de transitionele
urotheelcellaag. Verder onderzoek hiernaar zou bijzonder interessant zijn. Een tweede
mogelijke verklaring is de aanwezigheid van dode bacteriën of chromosomaal DNA in de urine.
De qPCR kan hierin namelijk geen onderscheid maken. Maar qPCR voorafgegaan door
propidium monoazide (PMA)-behandeling wel, omdat PMA het DNA van afgedode bacteriën
niet-amplificeerbaar maakt [50]. Verdere studie zou vergelijking van beide qPCRs kunnen
inhouden.
5.2 Vergelijking aerobe en anaerobe kweek op CLED- en MacConkey agar
In dit onderzoek is ook dieper ingegaan op de standaardprocedure voor diagnose van UWIs in
het routinelabo: aerobe kweek op CLED-agar [18]. Om de invloed van de zuurstofgraad van de
omgeving na te gaan werden alle urinestalen zowel aeroob als anaeroob gekweekt. Om te
verifiëren dat CLED-agar de meest geschikte voedingsbodem is voor de diagnose van UWIs
werden de urinestalen op zowel CLED- als MacConckey agar gekweekt. Imirzalioglu et al.
hebben, met behulp van moleculaire methoden rechtstreeks op urine, reeds aangetoond dat
urine moeilijk groeiende en anaerobe species kan bevatten die niet of traag groeien bij aerobe
kweek [51]. De eventueel toegevoegde waarde van een anaerobe kweek bij de diagnose van
urineweginfecties werd hierbij niet onderzocht. Daarom was dit onderwerp van onze studie.
We deelden de resultaten in volgens aantal CFU/ml in 3 categorieën: ≥ 105 CFU/ml , 10
4-10
5
CFU/ml en < 104 CFU/ml. Wanneer we de aerobe groei vergeleken met de anaerobe zagen we
dat in totaal 16 urinestalen aeroob beter groeiden dan anaeroob (d.i. tot een hogere categorie
behoren). Dit was een verwacht resultaat aangezien in de studie van Foxman aerobe en
facultatief anaerobe bacteriën geïdentificeerd werden als voornaamste veroorzakers van UWIs
[23].
Rekening houdend met het belangrijkste reservoir van uropathogenen, met name het rectum [9],
en zijn grotendeels anaerobe microflora, verwachtten we ook stammen die anaeroob beter
groeien. Dit was het geval: 11 urinestalen groeiden beter anaeroob in die zin dat het staal tot
40
een hogere categorie werd gerekend bij anaerobe kweek in vergelijking met aerobe kweek.
Bij 5 urinestalen (11L2413, 12B5275, 11K3033, 11L0459 en 12B5756), uitgeplaat op CLED-
agar, en bij 1 staal (11L0428) op MacConkey agar groeiden er anaeroob ≥ 105 CFU terwijl er
aeroob slechts < 105 CFU groeiden. Wanneer de Kass criteria werden toegepast op de anaerobe
kweek kreeg de patiënt de diagnose van een UWI, dit in tegenstelling tot de aerobe kweek. Dus
alleen al in deze studie, met een beperkt aantal urinestalen, zouden 6 patiënten een vals negatief
resultaat krijgen wanneer enkel aeroob gekweekt werd. Deze resultaten suggereren de
toegevoegde waarde van een anaerobe kweek, bovenop aerobe kweek.
Om de sterkere groei in anaerobe omstandigheden te verklaren werden deze urinestalen meer in
detail bestudeerd. Bij urinestaal 12B5275 groeiden aeroob op CLED-agar 4.4 x 104 CFU
Enterobacter spp. en K. pneumoniae en anaeroob ≥ 105 CFU E. faecalis. Dus indien enkel
aeroob zou gekweekt worden, zou een infectie met E. faecalis gemist worden. Een mogelijke
reden waarom E. faecalis aeroob minder goed groeide dan anaeroob is de aanwezigheid van
ROS (Reactive Oxygen Species) bij aerobe kweek. ROS zijn zeer reactieve chemische
moleculen die partieel gereduceerde zuurstof bevatten. Deze ROS kunnen ontstaan als
bijproduct van de aerobe ademhaling, door oxidatie van de nutriënten in de voedingsbodem
wanneer deze geautoclaveerd wordt of door foto-oxidatie van componenten in het groeimedium
na autoclavering [52]. Bij afwezigheid van zuurstof wordt er veel minder ROS geproduceerd
door afwezigheid van het bacterieel aeroob metabolisme, wordt E. faecalis niet afgeremd door
deze ROS, en kan de bacterie toch groeien door middel van fermentatie. Eigenaardig is dat
Enterobacter spp. ook facultatief anaeroob kunnen groeien, maar dat we deze soort niet konden
oppikken na anaerobe incubatie.
Bij urinestaal 11L0428 was er aeroob op MacConkey geen groei terwijl er anaeroob ≥ 105 CFU
E. coli en een gist groeiden. Het is mogelijk dat, net als bij E. faecalis, de groei van E. coli
aeroob gehinderd wordt door ROS. Deze verklaring kan ook gelden voor de anaeroob
gegroeide gist, want gisten zijn ook gevoelig voor ROS in hoge concentraties [53].
Bij urinestaal 11L2413 groeiden er aeroob op CLED 4.7 x 104 CFU E. coli en anaeroob ≥ 10
5
CFU P. mirabilis. Dit is een intrigerende bevinding, aangezien P. mirabilis een van de
belangrijkste urinewegpathogenen is [23]. Andere studies die P. mirabilis enkel anaeroob
41
konden identificeren werden niet teruggevonden in de literatuur. Een eerste mogelijke
verklaring waarom de P. mirabilis stam in deze studie enkel anaeroob groeide is opnieuw een
prominente aanwezigheid van ROS. We vermoeden dat ook hier eigen aerobe groei en de
aerobe groei van andere bacteriën de belangrijkste oorzaken van ROS zijn. Een tweede
mogelijke verklaring is gebaseerd op de studie van Allocati en collega's. Die toonden aan dat
het glutathione S-transferase B1-1 van P. mirabilis betrokken is bij de bescherming van dit
species tegen oxidatieve en chemische stress [54]. Het is daarom mogelijk dat de gegroeide
stam dit enzym niet heeft of een mutant is met een inactief glutathione S-transferase B1-1.
Dergelijke stam zou de oxidatieve stress bij aerobe kweek niet overwinnen en bijgevolg ook
niet groeien.
Bij urinestaal 11K3033 groeiden er aeroob 9 x 103 CFU E. faecalis en anaeroob ≥ 10
5 CFU L.
gasseri. Of het hier effectief gaat om een Lactobacillus gasseri UWI of contaminatie van het
urinestaal is onduidelijk. Een tweede urinestaal van deze patiënt zou hierin duidelijkheid
kunnen scheppen. Dit was in deze studie jammer genoeg niet mogelijk. Er werden er tot nu toe
slechts 2 case-reports van Lactobacillus spp. UWI gepubliceerd [55], maar Imirzalioglu en
collega's identificeerden, met behulp van moleculaire technieken rechtstreeks op urine,
Lactobacillus spp. als veroorzaker van de UWI in 16 % van de geteste urines. Geen van deze
stammen groeide bij een aerobe kweek [51]. Dit resultaat suggereert dat tal van eerdere
Lactobacillus spp. UWIs niet of verkeerd gediagnosticeerd werden op basis van de standaard in
de diagnose; aerobe kweek. Verder onderzoek hiernaar is bijzonder belangrijk aangezien
Lactobacillus spp. vaak als probiotica ingenomen worden om urineweginfecties te vermijden
[51], en omdat soorten zoals L. gasseri en L. iners ook geassocieerd worden met afwijkende
vaginale microflora [56]. Het zou dus interessant kunnen zijn om in een vervolgstudie
urinestalen ook op MRS (DeMan, Rogosa en Sharpe) te kweken, een milieu voor lactobacillen
(alhoewel L. iners daar niet op groeit) of om specifieke qPCR voor deze species uit te voeren
op de voorhanden zijnde DNA-extracten van de bestudeerde urinestalen.
Bij urinestalen 12B5756 en 11L0459 was er aeroob geen groei terwijl anaeroob ≥ 105 CFU van
een niet-geïdentificeerde stam groeide. Een verklaring voor de groei van deze stammen is
jammer genoeg niet mogelijk door gebrek aan identificatie.
42
Deze eerste vergelijking tussen aerobe en anaerobe kweek, gebaseerd op het aantal gegroeide
CFU, suggereert dat een anaerobe kweek een toegevoegde waarde kan hebben voor de diagnose
van urineweginfecties. Om de maat van deze toegevoegde waarde beter te kunnen inschatten is
er nood aan een vervolgstudie met een grotere studiepopulatie en met verfijnde
analysetechnieken, zoals kweek op andere media en qPCR voor E. faecalis, P. mirabilis, L.
gasseri en L. iners.
Naast het verschil in aantal CFU tussen aerobe en anaerobe kweek is ook het verschil in de
gekweekte species van belang. Het succes van de therapie is namelijk afhankelijk van de
gevoeligheid van de stam die de UWI veroorzaakt. Een mogelijk scenario is dat er bij aerobe
kweek een stam groeit die gevoelig is voor een bepaald antibioticum terwijl andere stammen in
de urine, resistent aan het antibioticum, niet of amper groeien bij aerobe kweek, maar wel bij
anaerobe. Indien enkel aeroob gekweekt zou worden, zouden de stammen die aeroob niet of
amper groeien, niet in rekening gebracht worden bij het voorschrijven van antibiotica. Deze
niet behandelde stammen zouden een belangrijke rol kunnen spelen bij persistente en/of
recurrente urineweginfecties. Bovendien draagt toediening van verkeerde antibiotica bij tot de
ontwikkeling van bacteriële resistentie.
Alvorens na te gaan of in deze studie dergelijke scenario's plaatsvonden, bespreken we eerst de
werkzaamheid van de eerste keuze antibiotica bij urineweginfecties; nitrofuranen en
trimethoprim [20]. Nitrofuranen interfereren met de bacteriële enzymen betrokken bij de Krebs-
cyclus en zijn bactericide. Deze antibiotica hebben een breed werkingsspectrum en zijn actief
tegen zowel Gram +, Gram -, aerobe als anaerobe bacteriën. E. coli is het meest gevoelig en
Klebsiella spp. en Enterobacter spp. zijn minder gevoelig. Proteus spp. en Pseudomonas spp.
zijn resistent. Trimethoprim verstoort de nucleotide synthese en is bacteriostatisch. Dit
antibioticum is actief tegen zowel Gram+ als Gram- bacteriën maar niet tegen anaeroben.
Pseudomonas spp. zijn resistent [57].
Voor de vergelijking van de gekweekte species en het gevolg daarvan op de gebruikte therapie
beperkten we ons in deze studie tot de urinestalen met een UWI volgens de gouden standaard
(≥ 105 CFU/ µl aeroob CLED) en de eerste keuze antibiotica nitrofuranen en trimethoprim. Bij
urinestaal 11K3043 groeide aeroob E. coli en anaeroob K. pneumoniae en bij urinestaal
11L2491 groeide aeroob E. coli en anaeroob M. morganii. Al deze species zijn Gram-negatief
43
en gevoelig voor zowel nitrofuranen als trimethoprim. Het effect van de therapie zou bij deze 2
patiënten misschien iets minder sterk zijn dan verwacht op basis van de aerobe kweek, door
ongekende aanwezigheid van de minder gevoelige K. pneumoniae en M. morganii. Bij
urinestaal 11K3040 groeide aeroob K. pneumoniae en anaeroob E. coli en bij urinestaal
12B5230 groeide aeroob E. faecalis en anaeroob E. coli. Het effect van de therapie bij deze 2
patiënten zou misschien iets sterker zijn dan verwacht op basis van de aerobe kweek, door
ongekende aanwezigheid van de meer gevoelige E. coli. Bij urinestalen 11K3138, 11K3031 en
12B5319 groeide aeroob Enterococcus spp. en anaeroob E. faecalis en bij urinestaal 51038
groeide aeroob Serratia spp. en anaeroob K. pneumoniae. De antibioticumgevoeligheid van al
deze species is gelijkaardig. Bij urinestaal 11K3162 groeide aeroob E. coli en anaeroob een
gist. Dit is een belangrijk resultaat gezien bij aerobe kweek enkel E. coli zou gedetecteerd
worden en de patiënt op basis daarvan een antibioticum zou ontvangen. Dit antibioticum zou
naast E. coli ook de normale urinaire en vaginale microflora beïnvloeden waardoor de
gistinfectie mogelijk zou verergeren. Deze gistinfectie zou behandeld moeten worden met
antifungale middelen.
In de categorie "≥ 105 CFU/ µl aeroob CLED" was de invloed van het verschil tussen het
aeroob en anaeroob gegroeide species op de therapie gering. Slechts bij 1 urinestaal (11K3162)
zou de therapie, gekozen op basis van een aerobe kweek, de infectie niet klaren en is het zelfs
mogelijk dat de behandeling gistvaginitis in de hand zou werken. Als we echter ook buiten deze
categorie kijken zien we dat bij urinestaal 11L2413 aeroob op CLED 4.7 x 104 CFU E. coli
groeiden en anaeroob ≥ 105 CFU P. mirabilis, een soort die resistent is aan nitrofuranen [57].
Deze tweede vergelijking tussen aerobe en anaerobe kweek, gebaseerd op het gekweekte
species, suggereert opnieuw dat een anaerobe kweek een toegevoegde waarde kan hebben voor
de diagnose en behandeling van urineweginfecties. Om de mate van toegevoegde waarde beter
te kunnen inschatten is er tevens nood aan een vervolgstudie met een grotere studiepopulatie.
Een laatste vergelijking binnen dit onderdeel was die tussen CLED-agar en MacConkey agar.
In totaal groeiden 15 urinestalen beter op CLED-agar (geredeneerd met de 3 categorieën)
terwijl er slechts 2 urinestalen beter groeiden op MacConckey agar. Deze resultaten stemmen
overeen met de studie van Muñoz et al. die concludeerde dat CLED-agar beter geschikt is voor
kweek van urine dan MacConkey agar [58].
44
5.3 Urineweginfecties in Mombasa, Kenia
In een derde en laatste luik van deze studie werden UWIs in Mombasa gekarakteriseerd en
werd de antibioticumgevoeligheid van de voornaamste uropathogenen bepaald. Het verzamelen
van deze regionale data is belangrijk voor de Keniaanse gezondheidszorg om tot een
gefundeerd blind behandelingsplan voor urineweginfecties te komen.
Eerdere studies die urineweginfecties in Kenia gekarakteriseerd hebben, beperkten zich tot een
studiepopulatie van kinderen tot 12 jaar met malaria [59] of gekatheteriseerde
ziekenhuispatiënten [60]. Onze studie is de eerste die urineweginfecties bij de Keniaanse, niet-
nosocomiale, vrouwelijke bevolking tracht te karakteriseren.
In onze studie werd E. coli geïdentificeerd in 45.2 % van de UWIs. E coli was hiermee de
belangrijkste veroorzaker van UWIs. Ook in andere landen, zowel in Westerse als
ontwikkelingslanden, is E. coli nog steeds het voornaamste uropathogeen [23] [24]. Het is nog
onduidelijk of het verschil in percentage, 45.2 % in onze studie versus 74.2 % bij Foxman [23]
en 70.6 % bij Muvunyi et al. [24], te wijten is aan een studiebias, aan onze beperkte
studiepopulatie (160 vrouwen) of aan een daadwerkelijk verschil in prevalentie. Het resultaat
van Okesola et al., een E. coli prevalentie van slechts 25 % bij ziekenhuispatiënten in Nigeria
[61], suggereert het laatste. Verder onderzoek met een grotere studiepopulatie is nodig om dit te
bevestigen.
Naast E. coli bleken ook K. pneumoniae (16.7 %), Staphylococcus spp. (11.9 %) en
Enterobacter spp. (9.5 %) belangrijke uropathogenen te zijn. K. pneumoniae als tweede
belangrijkste veroorzaker van UWIs stemt overeen met studies in zowel Westerse als
ontwikkelingslanden [23] [24]. Zowel in onze studie als die van Muvunyi et al. [24] en Foxman
[23] is K. pneumoniae het tweede belangrijkste uropathogeen. Maar in onze studie en die van
Muvunyi et al. [24], beiden in Afrika (resp. Kenia en Rwanda), is het percentage hoger (16.7 %
resp. 13.7 %) dan in de studie van Foxman in Canada (6.2 %) [23]. Een hypothese hierbij is dat
de prevalentie van K. pneumoniae in Afrika groter is dan die in de Westerse wereld. Dit wordt
ondersteund door de studies van Randrianirina et al. die in Madagaskar K. pneumoniae
identificeerden bij 9.6 % van de patiënten met een UWI [62], Nwadioha et al. die in Nigeria K.
pneumoniae identificeerden bij 15.2 % van de patiënten met een UWI [63] en Okesola et al. die
in Nigeria K. pneumoniae identificeerden bij 40.0 % van de patiënten met een UWI [61].
45
Daarentegen identificeerden Gupta et al. in de Verenigde Staten K. pneumoniae bij slechts 6 %
van de patiënten met een UWI [64].
De bekomen prevalentie van Staphylococcus spp. (11.9 %) en Enterobacter spp. (9.5 %) was
hoger dan we verwachtten op basis van andere studies, terwijl de prevalentie van Enterococcus
spp. (0 %) net lager was dan verwacht [17] [23] [24] [62] [63] [64]. Gezien de beperkte
studiepopulatie zijn studies met een grotere studiepopulatie nodig alvorens een conclusie kan
getrokken worden.
Het meest opvallende resultaat van deze studie is de hoge prevalentie (7.1 %) van M. luteus.
Studies of case-rapporten over M. luteus als uropathogeen zijn niet terug te vinden in de
literatuur. Aangezien Micrococcus spp. deel uitmaken van de normale huidmicroflora [65]
betreft het hier waarschijnlijk vals positieve resultaten, dit ten gevolge van gecontamineerde
urinestalen. Bevestiging door afname van een tweede urinestaal was door de studieopzet niet
mogelijk.
C. minutissimum, A. junii, L. jensenii en C. albicans werden elk bij 2.4 % van de UWIs
geïdentificeerd. Gezien de beperkte grootte van onze studiepopulatie zullen deze resultaten niet
verder besproken worden.
Naast karakterisatie van de bacteriën aanwezig in de urine bij UWIs in Kenia werd ook de
antibioticumgevoeligheid van de Gram-negatieve staven, E. coli en K. pneumoniae, getest. De
toenemende antibioticumresistentie van deze uropathogenen is een globale zorg. Eerdere
studies over het resistentiepatroon van uropathogenen in Kenia beperkten zich tot E. coli en
bestudeerden urineweginfecties binnen een ziekenhuissetting [66] [67]. Deze studie is de eerste
die de resistentie bij de niet-nosocomiale, vrouwelijke bevolking in Kenia nagaat.
De E. coli antibioticumgevoeligheid werd getest bij 18 stammen, geïsoleerd uit Keniaanse
vrouwen met een E. coli UWI. Bij vermoeden van UWI worden in Kenia amoxycilline,
cotrimoxazole of nitrofurantoïne toegediend [21]. Uit onze resultaten blijkt dat alle E. coli
stammen gevoelig waren voor amoxycilline, versterkt met clavulaanzuur, evenals voor
nitrofurantoïne. Dit staat haaks op de resultaten van Muvunyi et al. in Rwanda waar de E. coli
stammen bij 50 % van de niet-nosocomiale patiënten resistent waren aan amoxyciline, versterkt
46
met clavulaanzuur, en bij 26.4 % resistent waren aan nitrofurantoïne [24]. In een ziekenhuis in
Nigeria was 30.3 % (n = 180) van de E. coli stammen resistent aan nitrofurantoïne [63]. Het is
nog onduidelijk of de resistentie in Kenia effectief lager is dan in deze landen of dat dit
resultaat een gevolg is van een verschil in studiepopulatie met de andere studies. De meest
plausibele verklaring lijkt ons te liggen in de studiepopulatie: wij onderzochten 'gezonde
vrouwen' die geen medische hulp zoeken of geen klachten hebben, terwijl studiepopulaties in
andere studies bestaan uit arts- of ziekenhuispatiënten. Er kan aangenomen worden dat de
selectiedruk voor uropathogenen in ziekenhuizen in Rwanda, Nigeria en Kenia even groot is.
Op basis hiervan verwachten we dat resistentie als gevolg van mutaties in ziekenhuizen in
Kenia even groot is als in deze landen. Een hypothese om de mogelijk lagere resistentie bij de
'gezonde vrouwen' in Kenia te verklaren, is dat deze selectiedruk en de tweede vorm van
resistentieverwerving, transfer van het resistentiegen door middel van plasmiden, in veel
mindere mate aanwezig is buiten het ziekenhuis. Onderzoek met een grotere studiepopulatie
moet hierin helderheid scheppen. Cotrimoxazole (een 1:5 ratio combinatie van trimethoprim en
sulfamethoxazole) resistentie werd in deze studie gevonden bij 12 van de 18 stammen (= 66.7
%). Deze resistentie bij 'gezonde vrouwen' is hoog in vergelijking met de resistentie gemeten
door Nwadioha et al. in een ziekenhuis in Nigeria (54.5 %, n = 244) [63]. In de studie van
Muvunyi et al. in Rwanda was 80.6 % van de niet-nosocomiale patiënten resistent aan
cotrimoxazole [24]. Een mogelijke verklaring voor de hogere resistentie bij Muvunyi et al. is
opnieuw dat selectiedruk en transfer van het resistentiegen door middel van plasmiden in veel
mindere mate aanwezig is buiten het ziekenhuis.
Naast deze drie besproken antibiotica - die de WHO aanraadt bij UWI in Kenia -, is ofloxacine
(een tweede generatie fluoroquinolone dat makkelijk oraal kan ingenomen worden) een veel
voorgeschreven antibioticum in Kenia. In onze studie werden 3/18 (= 16.7 %) stammen
resistent bevonden aan dit antibioticum. Opmerkelijk is dat in de studie van Kebira et al. geen
enkele van de 29 E. coli isolaten resistent bevonden werd aan dit antibioticum [66].
De K. pneumoniae antibioticumgevoeligheid werd getest bij 6 Keniaanse vrouwen. Bij 2
vrouwen was de K. pneumoniae stam resistent aan amoxycilline, versterkt met clavulaanzuur.
Dit resultaat stemt overeen met de resultaten van Nwadioha et al. in Nigeria waar 53.2 % van
de stammen resistent was aan dit antibioticum [63]. Net als bij de geteste E. coli stammen
waren alle K. pneumoniae gevoelig voor nitrofurantoïne. Dit in tegenstelling tot de studie van
47
Nwadioha et al. in een ziekenhuis in Nigeria, waar 49.4 % van de stammen resistent was aan dit
antibioticum [63]. Twee van de zes stammen (33.3 %) werden resistent bevonden aan
cotrimoxazole. Dit opnieuw in tegenstelling tot de studie van Nwadioha et al. waar 100 % (n =
79) van de stammen resistent was [63]. In beide gevallen speelt mogelijk de mindere
aanwezigheid van selectiedruk en plasmiden met het resistentiegen bij 'gezonde vrouwen' een
rol. Verder onderzoek met een grotere studiepopulatie is nodig.
Een opvallend resultaat in deze studie is de hoge prevalentie (16.6 %) van ‘extended spectrum
beta-lactamasen' (ESBL)-positieve stammen: 2 van de 18 E. coli stammen en 2 van de 6 K.
pneumoniae stammen. Beta-lactamasen zijn het grootste defensiemechanisme van Gram-
negatieve bacteriën tegen beta-lactam antibiotica. Na ontwikkeling van antibiotica om deze
beta-lactamasen te counteren, reageerden bacteriën met een resem ‘nieuwe’ beta-lactamasen,
waaronder de ‘extended spectrum beta-lactamasen' (ESBL). Door hun belangrijke rol in de
toenemende resistentie van bacteriën zijn zij een 'hot topic'. Dat de prevalentie hoog is bij
ziekenhuispatiënten was reeds gekend [24]. Maar dat ze ook zo hoog is bij gezonde vrouwen is
nieuw. Verder onderzoek hiernaar is dan ook sterk aangeraden.
Voortgaande op onze beperkte studiepopulatie zijn er in Kenia momenteel nog veel antibiotica
mogelijk voor behandeling van UWIs bij de 'gezonde vrouw'. Een confirmatie op een grotere
studiepopulatie is aangewezen. Verder dient ook de prevalentie van ESBL-positieve stammen
bij 'gezonde vrouwen' onderzocht te worden op grotere schaal.
48
6. Referenties
1. Salvatore S, Salvatore S, Cattoni E, Siesto G, Serati M, Sorice P, Torella M. 2011. Urinary tract infections
in women. Eur J Obstet Gyn R B 156: 131-136
2. Franco AV. 2005. Recurrent urinary tract infections. Best Pract Res Cl Ob 19: 861-873
3. Lee J, Neild G. 2007. Urinary tract infections. Medicine 35: 423-428
4. Foxman B. 2002. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity and economic costs. Am J
Med 113: 5S-13S
5. Schmiemann G, Kniehl E, Gebhardt K, Matejczyk MM, Hummers-Pradier E. 2010. The diagnosis of
urinary tract infection. Deutsches Ärzteblatt Intern 107: 361-367
6. Coëlho. Zakwoordenboek der geneenskunde. Elsevier
7. Finer G, Landau D. 2004. Pathogenesis of urinary tract infections with the normal female anatomy. Lancet
Infect Dis 4: 631-635 8. Saadeh SA, Mattoo TK. 2011. Managing urinary tract infections. Pediatr Nephrol 26: 1967-1976
9. Hooton TM. 2000. Pathogenesis of urinary tract infections: an update. J Antimicrob Chemoth 46: 1-7
10. Nataro JP, Kaper JB. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 11: 142-201
11. Li D, Liu B, Chen M, Guo D, Guo X, Liu F, Feng L, Wang L. 2010. A multiplex PCR method to detect 14
Escherichia coli serogroups associated with urinary tract infections. J Microbiol Meth 82: 71-77
12. Croxen MA, Finlay BB. 2010. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nat Rev Microbiol
8: 26-38
13. Justice SS, Hunstad DA, Cegelski L, Hultgren SJ. 2008. Morphological plasticity as a bacterial survival
strategy. Nat Rev Microbiol 6: 162-168
14. Mysorekar IU, Isaacon-Schmidt M, Walker JN, Mills JC, Hultgren SJ. 2009. Bone morphogenetic protein 4
signalling regulates epithelial renewal in the urinary tract in response to uropathogenic infection. Cell Host
Microbe 5: 463-475 15. Vaneechoutte M. 2012. Universiteit Gent. Cursus microbiologie 3e bachelor biomedische wetenschappen
16. Chen SL, Jackson SL, Boyko EJ. 2009. Diabetes mellitus and urinary tract infection: epidemiology,
pathogenesis and proposed studies in animal models. J Urol 182: S51-S56
17. Wilson ML, Gaido L. 2004. Laboratory diagnosis of urinary tract infections in adult patients. Clin Infect Dis
38: 1150-1158
18. Hawkey PM. 1989. Medical bacteriology: a practical approach
19. Kass E. 1956. Asymptomatic infections of the urinary tract. Trans Am Physiol 69: 56-64
20. http://nhg.artsennet.nl/kenniscentrum/k_richtlijnen/k_nhgstandaarden/NHGStandaard/M05_std.htm#N6718
1
21. WHO Clinical Guidelines for Kenya: http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s16427e/s16427e.pdf
22. Siddiqui H, Nederbragt AJ, Lagesen K, Jeansson SL, Jakobsen KS. 2011. Assessing diversity of the female urine microbiota by high throughput sequencing of 16S rDNA amplicons. Biomed Central Microb 11: 244-
256
23. Foxman B. 2010. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol 7: 653-660
24. Muvunyi CM, Masaisa F, Bayingana C, Mutesa L, Musemakweri A, Muhirwa G, Claeys GW. 2011.
Decreased susceptibility to commonly used antimicrobial agents in bacterial pathogens isolated from
urinary tract infections in Rwanda: need for new antimicrobial guidelines. Am J Trop Med Hyg 84: 923-928
25. Chern EC, Brenner K, Wymer L, Haugland RA. 2009. Comparison of fecal indicator bacteria densities in
marine recreational waters by QPCR. Water Qual Expo Health 1: 203–214
26. Chern EC, Siefring S, Paar J, Doolittle M, Haugland RA. 2011. Comparison of quantitative PCR assays for
Escherichia coli targeting ribosomal RNA and single copy genes. Lett Appl Microbiol 52: 298–306.
27. Ludwig W, Schleifer KH. 2000. How quantitative is quantitative PCR with respect to cell counts? Syst Appl
Microbiol 23: 556-562 28. Devriese LA, Vancanneyt M, Baele M, Vaneechoutte M, De Graef E, Snauwaert C, Cleenwerck I, Dawyndt
P, Swings J, Decostere A, Haesebrouck F. 2005. Staphylococcus pseudintermedius sp. nov., a coagulase-
positive species from animals. Int J Syst Evol Micr 55: 1569-1573
29. Muyzer G, De Waal EC, Uitierlinden AG. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing
gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA.
App Environ Microb 59: 695-700
30. Eurogentec: http://www.eurogentec.com/uploads/qPCR-guide.pdf
31. Dieffenbach CW, Lowe TM, Dveksler GS. 1993. General concepts for PCR primer design. Genome Res 3:
S30-S37
32. Blattner FR, Plunkett G, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK,
Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Shao Y. 1997. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453- 1462
49
33. Hinata, Nobuyuk, Shirakawa, Toshir, Okada, Hirosh, Shigemura, Katsum, Kamidono, Sada, Gotoh, Akinob.
2004. Quantitative detection of Escherichia coli from urine of patients with bacteriuria by real-time PCR.
Mol Diagn 8: 179-184
34. Bej AK, McCarty SC, Atlas RM. 1991. Detection of coliform bacteria and Escherichia coli by multiplex-
polymerase chain reaction: comparison with defined substrate and plating methods for water quality
monitoring. Appl Environ Microbiol 57: 2429-2432
35. Juck D, Ingram J, Prevost M, Coallier J, Greer C. 1996. Nested PCR protocol for the rapid detection of
Escherichia coli in potable water. Can J Microbiol 42: 862-866
36. Sandhya S, Chen W, Mulchandani A. 2008. Molecular beacons: a real-time polymerase chain reaction assay for detecting Escherichia coli from fresh produce and water. Anal Chim Acta 614: 208-212
37. Dibb WL, Bottolfsen KL. 1984. Evaluation of Rosco Diagnostic B-glucuronidase tablets in the
identification of urinary isolates of Escherichia coli. APMIS 92: 261-264.
38. Bej AK, DiCesare JL, Haff L, Atlas RM. 1991. Detection of Escherichia coli and Shigella spp. in water by
using the polymerase chain reaction and gene probes for uid. Appl Environ Microbiol 57: 1013-1017
39. Papasian CJ, Enna-Kifer S, Garrison B. 1995. Symptomatic Shigella sonnei urinary tract infection. J Clin
Microbiol 33: 2222-2223
40. Horakova K, Mlejnkova H, Mlejnek P. 2008. Specific detection of Escherichia coli isolated from water
samples using polymerase chain reaction targeting four genes: cytochrome bd complex, lactose permease, b-
D-glucuronidase and b-D-galactosidase. J Appl Microbiol 105: 970-976
41. Tapsall JW, McIver CJ. 1995. P-D-Glucuronidase activity among prototrophic and auxotrophic variants of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae commonly implicated in urinary tract infections. Diagn
Microbiol Infect Dis 22: 261-266.
42. Higgins R, Messier S, Bada R. 1992. Isolation of Gardnerella vaginalis from the genital tract of six mares.
Can Vet J 33: 745-746
43. Fairley KF, Birch DF. 1983. Unconventional bacteria in urinary tract disease: Gardnerella vaginalis.
Kidney Int 23: 862-865
44. Rice EW, Allen MJ, Edberg SC. 1990. Efficacy of beta-glucuronidase assay for identification of
Escherichia coli by the defined-substrate technology. Appl Environ Microbiol 56: 1203-1205
45. Mahony J, Chong S, Jang D, Luinstra K, Faught M, Dalby S, Sellors J, Chernesky M. 1998. Urine
specimens from pregnant and nonpregnant women inhibitory to amplification of Chlamydia trachomatis
nucleic acid by PCR, ligase chain reaction and transcription-mediated amplification: identification of urinary substances associated with inhibition and removal of inhibitory activity. J Clin Microbiol 36: 3122-
3126.
46. Martins MT, Rivera IG, Clark DL, Stewart MH, Wolfe RL, Olson BH. 1993. Distribution of uidA gene
sequences in Escherichia coli isolates in water sources and comparison with the expression of beta-
glucuronidase activity in 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide media. Appl Environ Microbiol 59:
2271-2276
47. Feng P, Lum R, Chang GW. 1991. Identification of uidA gene sequences in P-D-glucuronidase-negative
Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 57: 320-323
48. Cleuziat P, Robert-Baudouy J. 1990. Specific detection of Escherichia coli and Shigella species using
fragments of genes coding for B-glucuronidase. FEMS Microbiol Lett 72: 315-322
49. Anderson M, Bollinger D, Hagler A, Hadley H, Rivers B, Ward K, Steck TR. 2004. Viable but
nonculturable bacteria are present in mouse and human urine specimens. J Clin Microbiol 42: 753-758 50. Rawsthorne H, Dock CN, Jaykus LA. 2009. PCR-based method using propidium monoazide to distinguish
viable from nonviable Bacillus subtilis spores. Appl Environ Microbiol 75: 2936-2939
51. Imirzalioglu C, Hain T, Chakraborty T, Domann E. 2008. Hidden pathogens uncovered: metagenomic
analysis of urinary tract infections. Andrologia 40: 66-71
52. Tandon P, Chibber S, Reed RH. 2007. Survival & detection of the faecal indicator bacterium Enterococcus
faecalis in water stored in traditional vessels. Indian J Med Res 125: 557-566
53. Perrone GG, Tan SX, Dawes IW. 2008. Reactive oxygen species and yeast apoptosis. Biochim Biophys
Acta 1783: 1354-1368
54. Allocati N, Favaloro B, Masulli M, Alexeyev MF, Di Ilio C. 2003. Proteus mirabilis glutathione S-
transferase B1-1 is involved in protective mechanisms against oxidative and chemical stresses. Biochem J
373: 305-311 55. Darbro BW, Petroelje BK, Doern GV. 2009. Lactobacillus delbrueckii as the cause of urinary tract
infection. J Clin Microbiol 47: 275-277
56. De Backer E, Verhelst E, Verstraelen H, Alqumber MA, Burton JP, Temmerman M, Vaneechoutte M. 2007.
Quantitative determination by real-time PCR of four vaginal Lactobacillus species, Gardnerella vaginalis
and Atopobium vaginae indicates an inverse relationship between L. gasseri and L. iners. BMC
Microbiology 7: 115-128
50
57. http://www.bcfi.be
58. Muñoz P, Cercenado E, Rodríguez-Créixems M, Díaz MD, Vicente T, Bouza E. 1992. The CLED agar
option in urine culture routine: a prospective and comparative evaluation. Diagn Micr Infec Dis 15: 287-290
59. Okwara FN, Obimbo EM, Wafula EM, Murila FV. 2004. Bacteraemia, urinary tract infection and malaria in
hospitalised febrile children in Nairobi: is there an association? E Afr Med J 81: 47-51
60. Inyama HK, Revathi G, Musandu J, Odero T. 2011. The incidence of nosocomial urinary tract infections:
kenyatta national hospital - intensive care unit. Baraton Interdis Research J 1: 12-21
61. Okesola AO, Aroundegbe TI. 2011. Antibiotic resistance pattern of uropathogenic Escherichia coli in south
west Nigeria. Afr J Med Sci 40: 235-238 62. Randrianirina F, Soares JL, Carod JF, Ratsima E, Thonnier V, Combe P, Grosjean P, Talarmin. 2007.
Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in
Antananarivo, Madagascar. J Antimicrob Chemoth 59: 309-312
63. Nwadioha SI, Nwokedi EOP, Ikeh I, Egesie J, Kashibu E. 2010. Antibiotic susceptibility pattern of
uropathogenic bacterial isolates from aids patients in a Nigerian tertiary hospital. J Med and Med Sc 1: 530-
534
64. Gupta K, Sahm DF, Mayfield D, Stamm WE. 2001. Antimicrobial resistance among uropathogens that
cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Resistance In
Community-Acquired UTI 33: 89-94
65. Kooken JM, Fox KF, Fox A. 2012. Characterization of Micrococcus strains isolated from indoor air. Mol
Cell Probes 26: 1-5 66. Kebira AN, Ochola P, Khamadi SA. 2009. Isolation and antimicrobial susceptibility testing of Escherichia
coli causing urinary tract infections. J Appl Biosci 22: 1320-1325
67. Kariuki S, Revathi G, Corkill J, Kiiru J, Mwituria J, Mirza N, Hart CA. 2007. Escherichia coli from
community-acquired urinary tract infections resistant to fluoroquinolones and extended-spectrum beta-
lactams. J Infect Developing Countries 1: 257-262
I
7. Addendum
Tabel 1. Gebruikte species en stammen met hun optimale medium en groeicondities
Species Stam Kweekbodem Groeicondities
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia fergusonii
Escherichia fergusonii
Escherichia hermannii
Escherichia vulneris
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Klebsiella ozaenae
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae
Citrobacter koseri
Citrobacter amanolaticus
Citrobacter braakii
Citrobacter diversus
Citrobacter farmeri
Citrobacter koseri
Citrobacter youngae
Citrobacter freundii
Serratia marcescens
Morganella morganii
Raoultella ornithinolytica
Raoultella ornithinolytica
Lactobacillus crispatus
Shigella boydii
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Gardnerella vaginalis
Enterobacter aerogenes
Enterobacter amnigenus
DL11-C15
DSM 4830
DSM 30083T
F87 00767
ENT 098
ENT 101
111139
BV0427-FB086-03
BV0594-FB092-02
BV0342-FB022-11
BV1003-FB159-CNA-6
0467-TSW16BA1
140156
ATCC 13883
040639
260531
070918
0502-TSW22BA1
0614-TSW22CAS
010436
U91 15328
U90 11945
LMG14694T
LMG14840
LMG15081
130717
130722
130714
94 90 2761
130726
130717
130706
070353
010531
070128
CCUG56221
CCUG53980
070944
010146
070578
170413
010925
ULB 6101-02 BE1
LMG2784
McConkey
McConkey
McConkey
McConkey
McConkey
McConkey
McConkey
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
McConkey
McConkey
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Anaeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Anaeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
II
Enterobacter asburiae
Enterobacter cancerogenus
Enterobacter cloacae
Enterobacter cowanii
Enterobacter dissolvens
Enterobacter gergoviae
Enterobacter hormaechei
Enterobacter intermedius
Enterobacter kobei
Enterobacter pyrinus
Enterobacter sakazakii
111148
111173
TCC 23355
IP 107300T
LMG 2683T
LMG5739
CIP 103441T
LMG2785T
CIP 105566T
140184
LM W212
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Bloedagar
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
Aeroob, 37 °C
III
Tabel 2. Samenstelling Trypticase Soy Agar + 15 % glycerol (TBSG), MacConkey agar,
Bloedagar en CLED agar
Medium Samenstelling per liter Firma
Trypticase Soy Broth + 15
glycerol
*BBL™ Trypticase™ Soy
Broth (TSB)
17.0 g tryptone*
5.0 g Natriumchoride*
3.0 g papaisch digest van soya*
2.5 g dikaliumfosfaat*
2.5 g glucose*
15 % glycerol
Beckton Dickinson,
Erembodegem,
België
MacConkey agar
17.0 g pancreas digest van gelatine
1.5 g pancreasverteerd caseïne
1.5 g peptisch digest van dierweefsel
10.0 g lactose
1.5 g galzouten
5.0 g s natriumchloride
0.03 g neutraalrood
0.001 g kristalviolet
13.5 g agar
Beckton Dickinson
Bloedagar 14.5 g pancreas digest van caseïne
5.0 g pancreas digest van
soyaboonmeel
5.0 g natriumchloride
14.0 g agar
5-10 % gedefibrineerd schapenbloed
Beckton Dickinson
CLED agar
4 g enzymatisch digest van gelatine
4 g enzymatisch digest van caseïne
3 g rundsextract
10 g lactose
0.128 g L-cysteïne
0.02 g bromthymol blauw
15 g agar
Finale pH: 7.3 ± 0.2 bij 25°C
Beckton Dickinson
IV
Tabel 3. Primers en hun sequentie
Legende. F = Forward primer, R= Reverse primer, t= opzettelijke mismatching.
uidA F: CAACGAACTGAACTGGCAGA [25]
R: CATTACGCTGCGATGGAT
rodA F: GCAAACCACCTTTGGTCG [26]
R: CTGTGGGTGTGGATTGACAT
23S rRNA F: CATAAGCGTCGCTGCCG [27]
R: AAAGAAAGCGTAATAGCTCACTGGTC
23S rRNA F: GGTAGAGCACTGTTTtGGCA [26]
R: TGTCTCCCGTGATAACtTTCTC
16S rRNA αβnot: AGTTTGATCCTGGCTCAG [28]
MP2: ATTACCGCGGCTGCTGG [29]
Targetgen Sequentie Forward en Reverse primers (5'-3') Referentie
V
Tabel 5. Stammen om de specificiteit van de E. coli qPCR te testen
Species Stam
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia fergusonii
Escherichia fergusonii
Escherichia hermannii
Escherichia vulneris
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Klebsiella ozaenae
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae
Citrobacter koseri
Citrobacter amanolaticus
Citrobacter braakii
Citrobacter diversus
Citrobacter farmeri
Citrobacter koseri
Citrobacter youngae
Citrobacter freundii
Serratia marcescens
Morganella morganii
Raoultella ornithinolytica
Raoultella ornithinolytica
Lactobacillus crispatus
Shigella boydii
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Gardnerella vaginalis
Enterobacter aerogenes
Enterobacter amnigenus
Enterobacter asburiae
Enterobacter cancerogenus
DL11-C15
DSM 4830
DSM 30083T
F87 00767
ENT 098
ENT 101
111139
BV0427-FB086-03
BV0594-FB092-02
BV0342-FB022-11
BV1003-FB159-CNA-6
0467-TSW16BA1
140156
ATCC 13883
040639
260531
070918
0502-TSW22BA1
0614-TSW22CAS
010436
U91 15328
U90 11945
LMG14694T
LMG14840
LMG15081
130717
130722
130714
94 90 2761
130726
130717
130706
070353
010531
070128
CCUG56221
CCUG53980
070944
010146
070578
170413
010925
ULB 6101-02 BE1
LMG2784
111148
111173
VI
Enterobacter cloacae
Enterobacter cowanii
Enterobacter dissolvens
Enterobacter gergoviae
Enterobacter hormaechei
Enterobacter intermedius
Enterobacter kobei
Enterobacter pyrinus
Enterobacter sakazakii
TCC 23355
IP 107300T
LMG 2683T
LMG5739
CIP 103441T
LMG2785T
CIP 105566T
140184
LM W212
VII
Tabel 7. Diagnose van E. coli UWI: E. coli qPCR vs. routinelaboratorium
StaalE. coli /ml
volgens qPCR
E.coli UWI
volgens qPCRCFU/ml
β-glucuronidase-
testIdentificatie - tDNAPCR/Sequencing
E. coli UWI volgens
routinelaboratorium
11K0281 1,00E+08 1 ≥ 105
- E. coli * 1
11K0282 6,00E+03 0 ≥ 105
- Enterococcus Sp. * 0
11K0347 1,00E+09 1 ≥ 105
- E. coli * 1
11K0500 0,00E+00 0 ≥ 105
- Mengflora 0
11K3043 0,00E+00 0 ≥ 105
- E. coli 1
11K3224 0,00E+00 0 ≥ 105
- Gist * 0
11K2978 1,16E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11K3037 0,00E+00 0 ≥ 105
- M. morganii 0
11K3138 6,42E+04 0 ≥ 105
- Enterococcus sp. 0
11K3040 0,00E+00 0 ≥ 105
- K. pneumoniae 0
11K3077 3,40E+07 1 ≥ 105
- P. mirabilis + E. coli 1
11K3162 3,80E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11K3031 2,24E+02 0 ≥ 105
- Enterococcus sp. * 0
11K2981 4,58E+08 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L0428 5,28E+04 0 ≥ 105
0 Gist * 0
11L0433 1,51E+09 1 ≥ 105
1 E. coli 1
11L2475 2,16E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L2491 1,25E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L2322 5,88E+05 1 ≥ 105
- P. rettgeri + P. aeruginosa * 0
11L2482 2,18E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L2488 1,04E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L2502 1,45E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
11L2464 1,43E+09 1 ≥ 105
- E. coli 1
12B5230 2,60E+05 1 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12B5367 7,20E+08 1 ≥ 105
1 E. coli 1
12B5103 8,46E+03 0 ≥ 105
0 P. mirabilis * 0
12B5319 6,30E+03 0 ≥ 105
0 Enterococcus sp. * 0
12B5169 6,02E+03 0 ≥ 105
0 K. oxytoca 0
12B5108 2,16E+09 1 ≥ 105
1 E. coli 1
12B5714 1,35E+03 0 ≥ 105
0 K. oxytoca 0
12B5715 6,54E+04 0 ≥ 105
0 M. morganii 0
12B5787 1,50E+04 0 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12B5719 7,00E+09 1 ≥ 105
1 E. coli 1
12B5716 3,66E+05 1 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12B5763 6,72E+06 1 ≥ 105
0 P. aeruginosa 0
291949 2,44E+03 0 ≥ 105
0 E. faecalis 0
12552 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. coli 1
291820 0,00E+00 0 ≥ 105
1 E. aerogenes 0
290393 1,71E+09 1 ≥ 105
1 E. coli 1
293163 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. aerogenes 0
41994 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. coli 1
51038 4,14E+04 0 ≥ 105
0 Serratia 0
52024 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. aerogenes 0
51048 0,00E+00 0 ≥ 105
0 E. cloacae * 0
42087 5,92E+06 1 ≥ 105
1 E. faecalis 1
51034 0,00E+00 0 ≥ 105
1 E. coli 1
51032 0,00E+00 0 ≥ 105
0 K. pneumoniae 0
52118 0,00E+00 0 ≥ 105
0 P. aeruginosa 0
42050 3,36E+03 0 ≥ 105
0 Gist * 0
Diagnose E. coli
urineweginfecties dmv qPCRDiagnose E. coli urineweginfecties in routinelaboratoria
VIII
StaalE. coli /ml
volgens qPCR
E.coli UWI
volgens qPCRCFU/ml
β-glucuronidase-
testIdentificatie - tDNAPCR/Sequencing
E. coli UWI volgens
routinelaboratorium
41878 0,00E+00 0 ≥ 105
0 Gist * 0
51042 0,00E+00 0 ≥ 105
0 K. pneumoniae 0
51842 1,25E+09 1 ≥ 105
1 E. coli 1
12B5349 7,18E+02 0 9,80E+04 0 Enterococcus sp. 0
11K3061 8,00E+02 0 9,20E+04 - Gist * 0
11K0231 5,00E+03 0 8,60E+04 - S. agalactiae * 0
11K3137 0,00E+00 0 5,70E+04 - Gist * 0
11L2413 2,10E+06 1 4,70E+04 - E. coli 0
12B5172 4,22E+07 1 4,70E+04 1 E. coli 0
12B5275 7,18E+02 0 4,40E+04 0 K. pneumoniae + E. aerogenes 0
12B5289 2,46E+03 0 3,40E+04 0 Enterococcus sp. * 0
12B5780 6,39E+03 0 2,90E+04 0 K. pneumoniae 0
12B5277 4,00E+07 1 2,70E+04 1 E. coli 0
12B5168 0,00E+00 0 2,50E+04 0 E. faecalis 0
11L0535 0,00E+00 0 2,40E+04 1 S. epidermis 0
12B5777 7,18E+02 0 2,00E+04 0 E. faecalis 0
12B5314 7,18E+02 0 1,90E+04 0 Corynebacterium imitans 0
11L0460 0,00E+00 0 1,60E+04 0 K. oxytoca 0
12B5214 1,45E+05 1 1,30E+04 0 P. aeruginosa 0
12B5782 3,40E+07 1 1,30E+04 1 Mengflora 0
12B5779 4,20E+05 1 1,20E+04 1 Mengflora 0
11K0301 1,00E+06 1 1,10E+04 - E. coli * 0
11L0430 0,00E+00 0 1,10E+04 0 E. faecalis 0
12B5373 7,18E+02 0 1,10E+04 0 P. aeruginosa * 0
41998 2,16E+03 0 1,00E+04 0 E. aerogenes 0
11K3033 2,24E+02 0 9,00E+03 - E. faecalis 0
51789 0,00E+00 0 9,00E+03 1 E. coli 0
11K3117 0,00E+00 0 8,00E+03 - S. epidermis 0
12B5410 9,00E+07 1 8,00E+03 1 E. coli 0
52141 0,00E+00 0 8,00E+03 0 E. faecalis 0
11698 1,06E+08 1 4,00E+03 0 S. simulans 0
12B5260 5,30E+06 1 3,00E+03 1 E. coli 0
12B5784 1,38E+03 0 3,00E+03 0 S. aereus + E. aerogenes 0
292601 6,64E+03 0 3,00E+03 0 E. faecalis 0
11L0468 8,00E+02 0 2,00E+03 0 - 0
12B5307 6,00E+03 0 0 - - 0
11K0105 0,00E+00 0 0 - - 0
11K0104 0,00E+00 0 0 - - 0
11K2989 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3249 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3053 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3035 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3058 0,00E+00 0 0 - - 0
11K2990 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3038 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3184 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3062 8,00E+02 0 0 - - 0
11K3051 8,00E+02 0 0 - - 0
11K3092 5,80E+04 0 0 - - 0
11K3064 2,42E+04 0 0 - - 0
11K3146 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3214 0,00E+00 0 0 - - 0
11K3091 0,00E+00 0 0 - - 0
11L0429 5,18E+03 0 0 - - 0
11L0523 8,00E+02 0 0 - - 0
11L0518 0,00E+00 0 0 - - 0
11L0459 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5115 2,72E+05 1 0 - - 0
Diagnose E. coli
urineweginfecties dmv qPCRDiagnose E. coli urineweginfecties in routinelaboratoria
IX
Legende. De diagnose van een E. coli UWI door middel van qPCR werd vergeleken met de huidige diagnostiek
in het routinelaboratorium.
E. coli qPCR: Het resultaat van de E. coli qPCR wordt weergegeven met de berekende E. coli concentratie (E.
coli/ml). Voor de diagnose van een E. coli UWI, op basis van de berekende E. coli concentratie, werd in deze
studie de grenswaarde vastgelegd op een E. coli concentratie van minstens 105 E. coli/ml. Deze waarde werd
afgeleid van de Kass criteria voor kweek. Een 1 in de kolom "E. coli UWI volgens qPCR" staat voor infectie.
Routinelaboratorium: Het resultaat van de aerobe kweek op CLED-agar wordt weergegeven door het aantal
colony forming units (CFU)/ml. Een groei van 105
of meer CFU wordt volgens de Kass criteria als een
StaalE. coli /ml
volgens qPCR
E.coli UWI
volgens qPCRCFU/ml
β-glucuronidase-
testIdentificatie - tDNAPCR/Sequencing
E. coli UWI volgens
routinelaboratorium
12B5351 0,00E+00 0 0 - - 0
12B5227 5,48E+03 0 0 - - 0
12B5261 9,28E+04 0 0 - - 0
12B5316 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5317 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5743 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5778 0,00E+00 0 0 - - 0
12B5785 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5781 8,42E+03 0 0 - - 0
12B5786 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5718 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5767 0,00E+00 0 0 - - 0
12B5776 9,58E+03 0 0 - - 0
12B5764 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5792 7,18E+02 0 0 - - 0
12B5783 0,00E+00 0 0 - - 0
12B5756 2,42E+04 0 0 - - 0
12B5713 4,92E+04 0 0 - - 0
290395 1,46E+04 0 0 - - 0
12688 0,00E+00 0 0 - - 0
290267 0,00E+00 0 0 - - 0
12620 0,00E+00 0 0 - - 0
291737 0,00E+00 0 0 - - 0
12305 0,00E+00 0 0 - - 0
10145 0,00E+00 0 0 - - 0
292885 0,00E+00 0 0 - - 0
12459 7,18E+02 0 0 - - 0
12494 0,00E+00 0 0 - - 0
290361 7,18E+02 0 0 - - 0
12339 7,18E+02 0 0 - - 0
290381 0,00E+00 0 0 - - 0
11893 0,00E+00 0 0 - - 0
12160 0,00E+00 0 0 - - 0
12125 1,87E+05 1 0 - - 0
290402 7,18E+02 0 0 - - 0
52015 0,00E+00 0 0 - - 0
41981 7,18E+02 0 0 - - 0
51430 7,18E+02 0 0 - - 0
41560 7,18E+02 0 0 - - 0
40037 7,18E+02 0 0 - - 0
51398 7,18E+02 0 0 - - 0
51486 0,00E+00 0 0 - - 0
292814 7,18E+02 0 0 - - 0
Diagnose E. coli
urineweginfecties dmv qPCRDiagnose E. coli urineweginfecties in routinelaboratoria
X
urineweginfectie aanschouwd. De β-glucuronidasetest werd uitgevoerd om aanwezigheid van het β-
glucuronidase na te gaan. Identificatie van de gegroeide bacteriën gebeurde door middel van tDNA-PCR en/of
sequencing. De urinestalen gemarkeerd met * werden wegens praktische redenen geïdentificeerd met behulp van
biochemische testen. De biochemische testen vonden plaats in het routinelaboratorium onder leiding van
Professor Claeys. Nb staat voor "niet bepaald". De diagnose van een E. coli UWI werd gesteld op basis van het
aantal CFU/ml (≥ 105) en de identificatie van de gegroeide stammen als E. coli. Een 1 in de kolom "E. coli UWI
volgens routinelaboratorium" staat daarbij voor infectie.
XI
Tabel 9. Resultaten kweek urinestalen
Uri
nest
aal
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
11K
0281
≥10
5E
. co
li *
≥10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11K
0282
≥10
5E
nte
roco
ccus
sp. *
≥10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11K
0347
≥10
5E
. co
li *
≥10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11K
0500
≥10
5M
engf
lora
≥
10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11K
3043
≥10
5E
. co
li≥
10
5K
. pneu
monia
eN
bN
bN
bN
b
11K
3224
≥10
5G
ist *
0N
bN
bN
bN
bN
b
11K
2978
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11K
3037
≥10
5M
. m
org
anii
≥10
5M
. m
org
anii
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3138
≥10
5E
nte
roco
ccus
sp.
≥10
5E
. fa
ecalis
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3040
≥10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11K
3077
≥10
5P
. m
irabilis
+ E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11K
3162
≥10
5E
. co
li≥
10
5G
ist
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3031
≥10
5E
nte
roco
ccus
sp. *
≥10
5E
. fa
ecalis
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
2981
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11L
0428
≥10
5G
ist *
≥10
5G
ist
0N
b≥
10
5G
ist +
E. co
li
11L
0433
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li +
S. m
arc
esce
ns
≥10
5E
. co
li
11L
2475
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11L
2491
≥10
5E
. co
li≥
10
5M
. m
org
anii
Nb
Nb
Nb
Nb
11L
2322
≥10
5P
. re
ttger
i +
P. aer
ugin
osa
*≥
10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11L
2482
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11L
2488
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
11L
2502
≥10
5E
. co
li≥
10
5N
bN
bN
bN
bN
b
11L
2464
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
liN
bN
bN
bN
b
12B
5230
≥10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. co
li
12B
5367
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
12B
5103
≥10
5P
. m
irabilis
*≥
10
5P
. m
irabilis
≥10
5P
. m
irabilis
≥10
5P
. m
irabilis
12B
5319
≥10
5E
nte
roco
ccus
sp. *
5,6
0E
+04
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
12B
5169
≥10
5K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
12B
5108
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
12B
5714
≥10
5 K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
≥10
5K
. oxyt
oca
12B
5715
≥10
5M
. m
org
anii
≥10
5M
. m
org
anii
≥10
5M
. m
org
anii
≥10
5M
. m
org
anii
12B
5787
≥10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. fa
ecalis
0N
bS
mee
rN
b
12B
5719
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
12B
5716
≥10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. co
li e
n Ser
rati
a≥
10
5Ser
rati
a +
Cit
robact
er
12B
5763
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
291949
≥10
5E
. fa
ecalis
8,9
0E
+04
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
12552
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
CL
ED
-ag
ar
McC
on
key-a
ga
r
Aero
ob
An
aero
ob
Aero
ob
An
aero
ob
XII
Uri
nest
aal
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
291820
≥10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es
290393
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
293163
≥10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es
41994
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
51038
≥10
5Ser
rati
a≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e
52024
≥10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es≥
10
5E
. aer
ogen
es
51048
≥10
5E
. cl
oaca
e *
≥10
5E
. cl
oaca
e≥
10
5E
. cl
oaca
e≥
10
5E
. cl
oaca
e
42087
≥10
5E
. fa
ecalis
≥10
5E
. fa
ecalis
5,4
0E
+04
E. co
li4,0
0E
+04
E. co
li
51034
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
51032
≥10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e
52118
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
≥10
5P
. aer
ugin
osa
42050
≥10
5G
ist *
0N
bN
bN
bN
bN
b
41878
≥10
5G
ist *
0N
bN
bN
bN
bN
b
51042
≥10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5K
. pneu
monia
e
51842
≥10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li≥
10
5E
. co
li
12B
5349
9,8
0E
+04
Ente
roco
ccus
sp.
9,1
0E
+04
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
11K
3061
9,2
0E
+04
Gis
t *
0N
bN
bN
bN
bN
b
11K
0231
8,6
0E
+04
S. agala
ctia
e *
0N
bN
bN
bN
bN
b
11K
3137
5,7
0E
+04
Gis
t *
0N
bN
bN
bN
bN
b
11L
2413
4,7
0E
+04
E. co
li≥
10
5P
. m
irabilis
Nb
Nb
Nb
Nb
12B
5172
4,7
0E
+04
E. co
li4,1
0E
+04
E. co
li +
E. fa
ecalis
4,9
0E
+04
E. co
li7,0
0E
+04
E. co
li
12B
5275
4,4
0E
+04
K. pneu
monia
e +
E. aer
ogen
es≥
10
5E
. fa
ecalis
≥10
5K
. pneu
monia
e≥
10
5E
. aer
ogen
es
12B
5289
3,4
0E
+04
Ente
roco
ccus
sp. *
2,4
0E
+04
Nb
5,0
0E
+04
Nb
0N
b
12B
5780
2,9
0E
+04
K. pneu
monia
e2,7
0E
+04
K. pneu
monia
e1,2
0E
+04
M. m
org
anii
1,7
0E
+04
K. pneu
monia
e
12B
5277
2,7
0E
+04
E. co
li3,4
0E
+04
E. co
li3,1
0E
+04
E. co
li2,9
0E
+04
E. co
li
12B
5168
2,5
0E
+04
E. fa
ecalis
7,1
0E
+04
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
11L
0535
2,4
0E
+04
S. ep
ider
mis
4,4
0E
+04
Gis
t0
Nb
2,0
0E
+03
E. co
li
12B
5777
2,0
0E
+04
E. fa
ecalis
4,7
0E
+04
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
12B
5314
1,9
0E
+04
Cory
neb
act
eriu
m im
itans
1,3
0E
+04
Sta
phyl
oco
ccus
sp.
0N
b0
Nb
11L
0460
1,6
0E
+04
K. oxyt
oca
3,8
0E
+04
K. pneu
monia
e2,1
0E
+04
S. m
arc
esce
ns
3,4
0E
+04
K. oxyt
oca
12B
5214
1,3
0E
+04
P. aer
ugin
osa
4,0
0E
+03
K. oxyt
oca
2,0
0E
+04
P. aer
ugin
osa
6,0
0E
+03
P. aer
ugin
osa
12B
5782
1,3
0E
+04
Men
gflo
ra
8,0
0E
+03
Nb
0N
b0
Nb
12B
5779
1,2
0E
+04
Men
gflo
ra
1,1
0E
+04
E. co
li4,0
0E
+03
E. co
li4,0
0E
+03
E. co
li
11K
0301
1,1
0E
+04
E. co
li *
0N
bN
bN
bN
bN
b
11L
0430
1,1
0E
+04
E. fa
ecalis
9,0
0E
+03
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
12B
5373
1,1
0E
+04
P. aer
ugin
osa
*5,0
0E
+03
E. fa
ecalis
5,0
0E
+03
P. aer
ugin
osa
4,0
0E
+03
E. co
li
41998
1,0
0E
+04
E. aer
ogen
es1,4
0E
+04
E. aer
ogen
es4,0
0E
+03
E. aer
ogen
es2,0
0E
+03
Nb
CL
ED
-ag
ar
McC
on
key-a
ga
r
Aero
ob
An
aero
ob
Aero
ob
An
aero
ob
XIII
Uri
nest
aal
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
11K
3033
9,0
0E
+03
E. fa
ecalis
≥10
5L
act
obaci
llus
gass
eri
Nb
Nb
Nb
Nb
51789
9,0
0E
+03
E. co
li2,0
0E
+03
E. co
li7,0
0E
+03
E. co
li1,2
0E
+04
E. co
li
11K
3117
8,0
0E
+03
S. ep
ider
mis
0N
bN
bN
bN
bN
b
12B
5410
8,0
0E
+03
E. co
li3,0
0E
+04
E. co
li0
Nb
0N
b
52141
8,0
0E
+03
E. fa
ecalis
0N
b≥
10
5P
. aer
ugin
osa
3,0
0E
+04
P. aer
ugin
osa
11698
4,0
0E
+03
S. si
mula
ns
0N
b0
Nb
0N
b
12B
5260
3,0
0E
+03
E. co
li1,1
0E
+04
E. co
li9,0
0E
+03
E. co
li6,0
0E
+03
E. co
li
12B
5784
3,0
0E
+03
S. aer
eus
en E
. aer
ogen
es9,0
0E
+03
S. ep
ider
mis
0N
b0
Nb
292601
3,0
0E
+03
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
0N
b
11L
0468
2,0
0E
+03
Nb
0N
b0
Nb
0N
b
12B
5307
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
0105
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
0104
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
2989
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3249
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3053
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3035
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3058
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
2990
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3038
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3184
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3062
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3051
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3092
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3064
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3146
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3214
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
11K
3091
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
11L
0429
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
11L
0523
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
11L
0518
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
11L
0459
0N
b≥
10
5N
b0
Nb
0N
b
12B
5115
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5351
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5227
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5261
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5316
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
CL
ED
-ag
ar
McC
on
key-a
ga
r
Aero
ob
An
aero
ob
Aero
ob
An
aero
ob
XIV
Uri
nest
aal
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
CF
U/m
lId
entif
icat
ie m
bv
tDN
A-P
CR
/
Seq
uenc
ing
12B
5317
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5743
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5778
0N
b1,7
0E
+04
Act
inom
yces
uro
gen
italis
0N
b0
Nb
12B
5785
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5781
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5786
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5718
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5767
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5776
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5764
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5792
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5783
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12B
5756
0N
b≥
10
5N
b0
Nb
0N
b
12B
5713
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
290395
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12688
0N
b4,0
0E
+04
L. cr
ispatu
s0
Nb
0N
b
290267
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12620
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
291737
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12305
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
10145
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
292885
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12459
0N
b5,0
0E
+03
E. fa
ecalis
0N
b0
Nb
12494
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
290361
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12339
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
290381
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
11893
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12160
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
12125
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
290402
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
52015
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
41981
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
51430
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
41560
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
40037
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
51398
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
51486
0N
b0
Nb
0N
b0
Nb
292814
0N
b0
Nb
Nb
Nb
Nb
Nb
CL
ED
-ag
ar
McC
on
key-a
ga
r
Aero
ob
An
aero
ob
Aero
ob
An
aero
ob
XV
Legende. Ieder urinestaal werd zowel op CLED- als MacConckey agar, aeroob als anaeroob gekweekt. Na
overnachte incubatie werd het aantal CFU geteld. De stammen werden geïdentificeerd door middel van tDNA-
PCR en/of sequencing. De urinestalen gemarkeerd met * werden wegens praktische redenen geïdentificeerd met
behulp van biochemische testen. Deze testen vonden plaats in het routinelaboratorium onder leiding van
Professor Claeys. Nb staat voor "niet bepaald".
XVI
Tabel 17. Antibioticumresistentie in Kenia - E. coli
Leg
ende.
Per
uri
nes
taal
wer
d e
en a
nti
bio
gra
m u
itg
evoer
d.
R s
taat
vo
or
resi
sten
t,
S
staa
t voor
sensi
tief
en
I
staa
t v
oo
r ee
n
inte
rmed
iair
e
sen
siti
vit
eit.
Nb s
taat
voor
"nie
t bep
aald
". D
e an
tibio
tica
die
in
Ken
ia
freq
uen
t w
ord
en t
oeg
edie
nd,
zijn
gro
en g
earc
eerd
. E
SB
L s
taat
vo
or
een
Ex
tended
Spec
trum
Bet
a-L
acta
mas
e -
po
siti
eve
stam
.
An
tib
ioti
ca
1264
1418
1601
1396
1704
1925
1253
1263
1615
1672
1736
1247
1259
1678
1858
1844
1404
1691
1621
Am
ikac
inS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SN
b
Am
oxi
cill
in +
cla
vula
an
zuu
rS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SN
b
Am
pic
illi
ne
SS
SR
RR
SS
SS
SR
RR
RS
RR
Nb
Ce
fota
xim
eS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
RN
b
Ce
fota
xim
e +
cla
vula
anzu
ur
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
Nb
Ce
ftaz
idim
eS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
RN
b
Ce
furo
xim
eS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
RN
b
Co
list
inS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SN
b
Fosf
om
ycin
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
Nb
Ge
nta
mic
ine
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SR
Nb
Me
rop
en
em
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
Nb
Nit
rofu
ran
toin
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
Nb
Ofl
oxa
cin
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
IR
RR
Nb
Pip
era
cill
in +
taz
ob
acta
mS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SN
b
Tem
oci
llin
eS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SS
SN
b
Trim
eth
op
rim
/ su
lfa
met
ho
xazo
le
SS
SS
SS
RR
RR
RR
RR
RR
RR
Nb
(= c
otr
imo
xazo
le)
ES
BL
ES
BL
Ken
iaa
nse
vro
uw
en
met
een
UW
I: >
10
5 E
. co
li
XVII
Tabel 18. Antibioticumresistentie in Kenia - K. pneumoniae
Legende. Per urinestaal werd een antibiogram uitgevoerd. R staat voor resistent, S staat voor sensitief en I staat
voor een intermediaire sensitiviteit. Nb staat voor "niet bepaald". De antibiotica die in Kenia frequent worden
toegediend, zijn groen gearceerd. ESBL staat voor een Extended Spectrum Beta-Lactamase - positieve stam.
Antibiotica
1404 1704 1810 1925 1766 1768 1819
Amikacin S S S S S S Nb
Amoxicillin + clavulaanzuur S S S S R R Nb
Ampicillin R R R R R R Nb
Cefotaxime S S S S S R Nb
Cefotaxime + clavulaanzuur S S S S S S Nb
Ceftazidime S S S S S R Nb
Cefuroxime S S S S S R Nb
Colistin S S S S S S Nb
Fosfomycin S S S S S S Nb
Gentamicine S S S S R R Nb
Meropenem S S S S S S Nb
Nitrofurantoin S S S S S S Nb
Ofloxacin S S S S S S Nb
Piperacillin + tazobactam S S S S I I Nb
Temocilline S S S S S S Nb
Trimethoprim/ sulfamethoxazole S S S S R R Nb
ESBL ESBL
Keniaanse vrouwen met een UWI: >105 K. pneumoniae
