Samenvatting

Moleculaire biologie: Chapter 6: The Mechanisms of transcrition in bacteria

1 RNA Polymerase structure

In 1960-1961 werden RNA-polymerases ontdekt, dieren planten en bacteriën. De structuur van hetpolymerase werd in bacteriën als eerste in detail bestudeerd. In 1969 werden de subeenheden die het polymerase vormde geïdentificeerd. Dit gebeurde met volgende experiment:

Via SDS-PAGE werden de subunits van elkaar gescheiden na zuivering uit E.coli (laan 1). Deze preparatie bevat twee grote subeenheden (β en β'. De subeenheden zijn in deze gel niet goed van elkaar gescheiden). De andere subeenheden die zichtbaar zijn σ en α. Er is nog een andere subeenheid ω, die niet noodzakelijk is voor de viabiliteit of de enzymactiviteit (niet aangetoond op de gel). Uit deze analyse bleek de compositie van het holoënzyme α2 ββ'σ. Door de uitvoering van cation Exchange Chromatography werden drie pieken bekomen die ook op gel werden geplaatst. Uit dit scheidingspatroon bleek dat de σ subeenheid van de andere werd gescheiden. α2 ββ' word de core van het holoënzyme genoemd.

Figuur 1: A: Resultaten experiment. B: Schematische structuur van het Holoënzyme. C: Schematische weergave van core en sigma.

1.1 Sigma As a Specificity factor

In een volgend deel va het onderzoek werd de enzymatische activiteit getest van het holoënzyme en het core polymerase. Het core polymerase vertoonde een lagere activiteit dan het holoënzyme., maar was nog steeds in staat om transcriptie uit te voeren, want het was nog steeds in staat om genicked DNA te transcripteren

1

Als de sigma factor terug werd toegevoegd aan het core polymerase was het terug instaat om intact DNA te transcripteren. Uit verder onderzoek bleek dat zonder de sigma-factor het enzym aspecifiek is en beide DNA strengen transcripteerd. Dit werd aangetoond met volgend experiment:

T4 RNA werd aangemaakt in vivo. Dit is asymmetrisch (slechts 1 DNA streng is getranscripteerd). In vivo werd ditzelfde proces uitgevoerd met het core- en het holoeÅNnzyme. Indien deze een assymtrische RNA keten maken, dan zal er geen hybridisatie tussen beide strengen optreden (want niet comlementair). Worde echter beide strengen getranscripteerd, da is een deel van de strengen complementair aan het in vivo RNA. DsRNA is resistent teen afbraak door Rnase. In het experiment werd gevonden dat 30% van de gelabelde in vitro DNA, dat aangemaakt werd door het core enzym hybridiseerde.

Door het scheiden van het core enzyme van de sigma-factor levert een enzym op dat kan transcripteren, maar niet specifiek is.

2 Promotors

De plaats waar een RNA polymerase bind aan het DNA wordt een promotor genoemd.

2.1 Binding RNA polymerase to promotors

Hoe wordt het bindingsgedrag van RNA polymerase veranderd door de aanwezigheid van sigma. Dit werd aangetoond met volgende studie:

T7 DNA gelabeld met 3H werd gebonden met core enzym/ holoënzyme; Aan beide mengsels werd een overmaat ongelabeld T7 DNA toegevoegd, zodat als het Polymerase loskomt van het gelabeld DNA de

2

kans veel groter was dat het bind met ongelabeld DNA. Van deze mengsels werd om de zoveel tijd een staal genomen en gescheiden op een nitrocellulose filter (bind proteïne en DNA-proteïne complexen). In dit experiment werd de dissociatie van het complex gemeten in functie va de tijd. Uit deze resultaten blijkt dat het holoënzyme het DNA beter bind dan het core enzym (het holoënzyme heeft een hogere halfwaardetijd). De sigma factor is dus noodzakelijk voor de goede binding van het DNA op specifiek sites. Het core enzym kan echter ook binden op het DNA, wat dus impliceert dat er twee soorten bindingssites zijn voor het polymerase.

In een ander experiment werd de procedure omgekeerd en werd. Het polymerase werd gebonden aan ongemerkt DNA en in een overmaat gemerkt DNA gebracht. Met dit experiment werd de dissociatie van de eerste en dus minst strak gebonden polymerasen gemeten. Hieruit bleek dat ook het holoënzyme losse bindingsplaatsen heeft. Dus het holoënzyme kan zowel los als strak gebonden worden, wat twee soorten bindingssites impliceert. De strakke bindingssites worden promotors genoemd.

In een derde experiment werd de temperatuur- afhankelijk op het binden van het holoënzyme getest. Hieruit bleek dat de bindingssterkte vergoot met de stijgende temperatuur. Door de stijging van de temperatuur woord het smelten van DNA gepromoot, wat er o wijst dat voor strak te kunnen binden op het DNA, er lokaal Denaturatie moet optreden. Uit deze experimenten werd een hypothese voor de binding van RNA polymerase gemaakt:

Het holoënzyme bind eerst los aan het DNA en scant dit af naar de promotorsequentie.

Eens het holoënzyme de promotorsequentie heeft gevonden zal het hierop los binden. Het gevormde complex wordt het Closed promotor complex genoemd (DNA is nog steeds dubbelstrengig).

Het holoënzyme zal een kort stuk DNA is promotor denatureren zodat het open promotor complex gevormd wordt en bind het polymerase strak op het DNA. Voor de conversie van los naar strak gebonden vereist de sigma factor.

3

Figuur 2: Principe Nitrocellulose binding assa

4

Nitrocellulose binding assay

Nitrocellulose kan enkelstrengig DNA en proteïnes binden. Als dubbelstrengig DNA echter een complex vormt met een proteïne, dan wordt het wel gebonden op het membraan. Dit is de basis voor de Nitrocellulose binding assay.

In figuur 2a , wordt gelabeld dubblestrengig DNA over een nitrocellulose memebraan geleid. De hoeveelheid van de label wordt zowel gemeten in het filtraat als in het residu. De resultaten hiervan toonde aan dat DNA door de filter heen gaat.

In figuur 2b wordt een gelabeld proteïne over een nitrocellulose memebraan geleid. De metingen van het label in het residu en in het filtraat toonde aan dat het proteïne was achtergebleven op het membraan.

In figuur 2cwordt een proteïne DNA complex (gelabeld) over een nitrocellulose membraan geleid. Metingen van het label toonde aan dat het complex gebonden was op het membraan.

2.2 Promotor Structure

Core promotor elements

Wat is er zo speciaal aan een promotor sequentie, dat deze wordt herkend door RNA polymerase. Pribnow vergeleek verschillende promotors van bacteriën en fagen en ontdekte hierin een sequentie die voor allen gelijk was. Deze sequentie is 6 tot 7 bp lang en ligt ongeveer 10 bp upstream voor het startpunt van de transcriptie. Deze regio wordt de -10 box (= “TATAAT-box” = “Pribnow-box”). genoemd. Hierna werd er nog een andere sequentie ontdekt die gelegen is op ongeveer 35 bp upstream van de de startplaats van de transcriptie. Deze word de -35 box genoemd. Door het vergelijken van duizenden bacteriële promotoren werd voor deze regio’s zogenaamde consensus sequenties opgesteld (zie Figuur 3). De basen die met hoofdletters zijn aangegeven geven aan dat ze met een kans van meer dan 50% op die plaats worden aangetroffen, de kleine letters gevende basen aan die met een kans kleiner dan 50% op die plek worden aangetroffen. De kans is zeer klein dat een promotorsequentie volledig overeenkomt met de consensus. Als de -10 en -35 box perfect overeenkomen met de consensus, dat blijkt het dat deze promotoren zeer sterk zijn, en dat het achterliggende gen zeer actief wordt getranscripteerd. Als er mutaties in de promotor optreden die ervoor zorgen dat deze minder gelijkend wordt met de consensus, dan zal dit er toe lijden dat de transcriptie minder actief is. Dit worden down mutations genoemd. Mutaties die ertoe lijden dat de -10 box en de -35box meer gelijkend worden op de consensus sequentie, zorgen voor een verhoogde transcriptie en worden up mutations genoemd. Ook de afstand tussen beide promotor elementen is belangrijk. Indien zij door mutaties dichter of verder bij elkaar komen te liggen, dan zal dit schadelijk zijn voor de werking van de promotor.

Figuur 3: Core promotor elements

UP element

Sommige zeer sterke promotoren hebben nog een extra element, dat verder stroomopwaarts ligt gelegen is. Dit wordt het UP element (gelegen tussen -40 en -60) genoemd. Het komt voor bij promotors die de transcriptie bevorderen voor de rrn genen (van E.coli). Deze genen staan in voor de productie van rRNA. Indien bacteriën in omstandigheden zijn, waarin zij snel groeien, dan zijn er zeer veel rRNA moleculen noodzakelijk. De transcriptie van de rrn genen neemt dan het grootste deel van de totale transcriptie voor zijn rekening. Dit is enkel mogelijk door de aanwezigheid van een zeer sterke promotor, wat gedeeltelijk verklaart wordt door de aanwezigheid van het UP element. De aanwezigheid van dit element zorgt voor een stimulans van de transcriptie met een factor 30. Doordat het herkend word door het polymerase wordt het UP element ook gerekend bij de promotor elementen.

Het UP element is ook geassocieerd met 3 Fis-sites (upstream; tussen -60 en -150). Op deze sites kan het transcriptie activernde proteïne Fis binden. Daar het niet wordt herkend door de polymerase zelf, is het geen promotor element, maar een andere klasse van transcriptie activatie elementen : de enhancers.De rrn genen worden ook gereguleerd door volgende kleine moleculen: iNTP (intiation BTP) en het alarmoon ppGpp. Indien iNTP’s in overvloed aanwezig zijn, geeft dit aan dat de concentratie aan nucleotiden voldoende hoog is, en dat het het juiste moment is voor de synthese van RNA. iNTP stabiliseert het open promotor complex en stimuleert zo de transcriptie. Als er echter een tekort is aan AZ, dan kan er geen eiwitsynthese plaatsgrijpen (en is er geen nood aan

5

rRNA). Ribosomen merken een tekort aanAZ als tRNA erop binden zonder dat ze een AZ gebonden hebben, op de plaats waar aminoacetyl – tRNA zou moeten binden. Als dit gebeurd, dan zal het ribosoom-geassocieerde proteïne RelA ppGpp produceren, dat het open promotor complex destabiliseerd en dus de transcriptie inhibeert.Verder is ook het DskA porteïne van belang. Dit zorgt voor destabilisatie van de rrn open promotor, zodat het gevoelig wordt voor veranderingen in iNTP en ppGpp concentraties.

Figuur 4: Promotor met UP element. Een voorbeeld hiervan is de rrnB P1 promotor

3 Transcriptie initiatie

In het begin werd verondersteld dat de initiatie eindigde zodra RNA polymerase de eerste fosfodiësterbinding vormde. Carpousis en Gralla toonde in 1980 aan dat initiatie complexer was dan dat. Zij vonden namelijk bewijs dat RNA polymerase eerst kleine nucleotiden aanmaakt zonder de promotor te verlaten. Deze transcripten worden abortive transcripten genoemd en zijn tot 10 nt lang. Dit werd aangetoond met volgend experiment:

E.coli DNA polymerase werd geïncubeerd met DNA, met lac UV5 als promotor. Aan dit reactiemengsel werd ook heparine aan teogevoegd. Dit is een negatief geladen polysacharide dat in competitie met DNA voor de binding van vrij RNA polymerase. Heparine voorkomt de reassociatie van DNA en RNA polymerase op het einde van de transcriptiecyclus. In het experiment werd gebruik gemaakt van γ32P-gelabeld ATP (eerst ingebouwde nucleotide. Bij het eerst ingebouwde nucleotide wordt geen PP geknipt ⇒ RNA keten is gelabeld). De bekomen transcripten werden gescheiden met gel-elektroforese om de grootte te schatten. Hierbij werden zeer kleine transcripten gevonden, variërend tussen dimeren en hexameren. Na sequentieanalyse werd gevonden dat deze overeenkwamen met de eerste verwachtte nucleotiden van het transcript. Als zij de hoeveelheid oligo’s vergeleken met de hoeveelheid aanwezige RNA polymerasen, kwam men tot de conclusie dat er verschillende transcripten per polymerasen waren. Doordat heparine de reassociatie verhinderd impliceert dit dat er verschillende abortieve transcripten werden aangemaakt, zonder dat de promotor verlaten werd.

6

Figuur 5: resultaten Carpousis & Gralla

Andere wetenschappers hebben deze resultaten bevestigd en abortieve transcripten gevonden tot 10 nt.

Volgende stappen worden nu aangegeven voor de initiatie :

1. Vorming van een closed promotor complex2. Conversie van het closed promotor complex naar een open promotor complex3. Aanmaak van de abortieve transcripten4. Promotor claereance

Figuur 6: Transcriptie initiatie

3.1 Sigma Stimulates transcription initiation

Sigma zorgt voor een sterke binding van RNA polymerase aan de promotor, zodat het enzym op de juiste positie zit, voor de initiatie. Hierdoor kan men verwachten dat sigma de initiatie zal stimuleren. Dit werd onderzocht met volgend experiment:

Travers en Burgess merkte de nucleotiden aan de γ32P groep (enkel het eerste ingebouwde nucleotide behoud deze fosfaat groep, de andere enkel de α-fosfaat-groep). De onderzoekers incubeerde de core van het polymerase in aanwezigheid van toenemende sigma concentraties. In een tweede set werd er 14C gelabelde nucleotiden toegevoegd (in aanwezigheid van toenemende sigmaconcentratie.) (14C dien als maat voor de elongatie). In Figuur 7 is te zien dat sigma zowel de incorporatie van γ32P als 14C lijkt te stimuleren. Dit suggereert, dat sigma zowel de initiatie als de elongatie versterkt. Initiatie is echter de snelheid limiterende factor in transcriptie, dus het kan lijken dat sigma de elongatie stimuleert, doordat het de initiatie stimuleert, zodat er meer geïnitieerde ketens zijn om te elongeren. Travers en Burgess toonde aan dat dit het geval is door aan te tonen dat sigma de elongatiesnelheid niet verhoogt. Dit werd gedaan met volgend experiment: In een reactiemengsel werd het aantal gevormde RNA ketens constant gehouden. Hierna werd in aan of afwezigheid van sigma de lengte van de ketens bepaald, en dat sigma hierop geen

7

Figuur 7: Sigma lijkt zowel de initiatie als de elongatie te stimuleren

enkel invloed had (de ketens die in aanwezigheid van sigma werden gemaakt zij n niet langer of korter dan in afwezigheid). Het aantal RNA moleculen werd constant gehouden door een zekere hoeveelheid initiatie te laten doorgaan, en dan de initiatie te blokkeren door toevoeging van rifampicine, dat de initiatie inhibeert, maar niet de elongatie. De lengte van de keten werd bepaald met behulp van ultracentrifugatie. Uit de resultaten blijkt dat aan- of afwezigheid geen invloed heeft op de lengte van de ketens, en daar door dus geen invloed heeft op de elongatie.

3.2 Reuse of sigma

Travers en Burgess toonde ook aan dat σ kan gerecycleerd worden. Dit werd aangetoond met volgend experiment:

In dit experiment werd de transcriptie uitgevoerd bij een lage ionsterkte . Dit verhinderd dat de core na terminatie kan dissociëren van het DNA. Dit zorgt ervoor dat transcriptie-initiatie vertraagd (gemeten door het inbouwen van γ32P gelabelde purines in RNA) tot het uiteindelijk stopt. Dan werd new core polymerase toegevoegd, wat ertoe leidde dat de transcriptie opnieuw begon (blauwe lijn). Dit betekent dat de core σ bindt die is vrijgekomen van het originele holoënzym. In een ander experiment toonde zij aan dat de nieuwe transcriptie kon optreden op een andere DNA keten, die samen met het core polymerase werd toegevoegd. Dit leidde tot het opstellen van de σ cyclus. In Figuur 8 staat nog een ander stuk belangrijke informatie. Als Travers en Brugess rifampicine toevoegde aan het reactiemengsel (het core polymerase is een rifampicine resistente mutant; sigma is afkomstg van een rifampicine gevoelig polymerase) toevoegde, dan trad er nog steeds initiatie op. Omdat σ wordt erkend als de initiatie factor, werd verwacht dat deze gevoelig zou zijn voor rifampicine (dat de initiatie inhibeert). Dit is echter niet het geval, de core is gevoelig voor rifampicine). Dat er toch een verlaagde initiatie werd waargenomen komt doordat het polymerase nog steeds een beetje gevoelig is voor rifampicine.

3.3 The stochastic σ-cycle model

De σ cyclus bekomen van de experimenten van Travers en Burgess wordt het obligate release model genoemd. Volgens dit model komt σ los van het core polymerase tegelijkertijd met de promotor cleareance. Hoewel dit model het dertig jaar heeft uitgehouden en het voldoende bewezen werd geact met experimentele resultaten, kon dit model toch niet al de data verklaren. Bijvoorbeeld J. Roberts et al toonde aan dat σ betrokken was bij het pauseren op de positie +16/+17 downstream de late promotor in faag λ. Om dit te kunnen bewerkstelligen moet σ nog steeds gebonden zijn aan het core polymerase.

8

Figuur 8: Sigma kan herbruikt worden

Figuur 9: De σ cyclus: het obligate release model

Op basis van dit en andere dat werd het stochastic release model voorgesteld. Deze hypothese houdt in dat σ loskomt van het core polymerase, maar dat er geen vast punt tijdens de transcriptie waarop dit gebeurd, maar ad random.

In 2001 merkte R. Ebright et al op dat al het bewijs voor het obligate release model afkomstig waren van dat bekomen van scheidingstechnieken zoals elektroforese (als deze in denaturerende omstandigheden gebeuren, worden proteïnen verdeeld in subunits) en chromatografie. Deze technieken kunnen σ van de core (door zijn zwakke binding) verwijderen gedurende elongatie, zodat het lijkt dat het onmiddellijk na het beëindigen van initiatie is vrijgekomen. Om de obligate release hypothese te testen maakte Ebright et al gebruik van FRET, dat toelaat om de relatieve positie van σ ten opzichte van een bepaalde site te bepalen zonder scheidingstechnieken. FRET is gebaseerd op het feit dat twee fluorescente moleculen in elkaars buurt hun energie op elkaar overdragen (van donor naar acceptor) in plaats van licht uit te zenden. De efficiëntie van deze energie transfer neemt af naarmate de moleculen verder uit elkaars buurt zijn.R. Ebright et al. Koppelde de fluorescentie donor aan σ en de fluorescentie acceptor aan het DNA. In een deel van de experimenten was de acceptor gebonden aan het 5’ uiteinde (upstream, tailing edge FRET) en soms aan het 3’ uiteinde (downstream, leading edge FRET). Tailing edege FRET laat de onderzoekers toe om de vermindering in FRET (Fluorescence Resconance Emmision Transfer) waar te nemen als het polymerase zich verwijderd van de promotor, terwijl leading edge FREt het toelaat om de toename in FRET waar te nemen als het polymerase zich verplaats naar het downstream uiteinde.Tailing edge FRET kan geen onderscheid maken tussen beide release modellen. In beide gevallen zal de donor fluorofoor op σ zich buiten bereik van de acceptor verplaatsen. Leading edege FRET daarentegen maakt het wel mogelijk om tussen beide modellen een onderscheid te maken. Als σ loskomt van het core polymerase, dan zal FRET wegvallen, als dit niet het geval is, dan zal de efficiëntie ervan toenemen. De bekomen resultaten van het onderzoek suggereerden dat 100% van de complexen na promotor clearance nog steeds hun σ factor bezaten.

9

Figuur 10: Principe van tailing edge en leading edge FRET

3.4 Local DNA melting at the promotor

De onderzoeken van Chamberlin op de interactie van RNA polymerase en promotor toonde aan dat de complexen stabieler waren bij hogere temperatuur, wat suggereert dat er lokaal een gedeelte van DNA smelt op plaatsen waar het polymerase sterk bind op het DNA. In 1978 brachten Hsieh en Wang een extra bewijs voor deze hypothese. Zij bonden een E.coli polymerase aan een restricitiefragment met 3 T7 promotors en meette de hyperchromische shift ten gevolge hiervan. De toename in absorptie bij 260 nm is niet enkel indicatief voor keten separatie, maar hieruit kan ook de grootte van het enekelstrengig stuk mee bepaald worden. Uit hun berekeningen kwam naar voor dat deze zogenaamde transcription bubble ongeveer 10 bp groot is. Uit andere experimenten kwam naar voren dat deze 12 bp en 17-18 bp groot is.In 1979 toonde Siebenlist aan welke bp er gesmolten werden in een T7 promotor met volgend experiment:

In een eerste stap werd het DNA op het einde van de keten gelabeld. Aan dit gelabelde DNA werd RNA polymerase toegevoegd om een open promotor complex te vormen. De vorming van het open promotor complex gaat samen met het lokaal smelten van het DNA. Als de ketens van elkaar gescheiden worden, dan is N1 van adenine (normaal betrokken bij de vorming van waterstofbruggen met T in de andere keten) vrij voor een aanval van chemicaliën, zoals DMS (Dimethyl sulfaat). Dit lijdt tot methylatis van N1, waardoor er geen baseparing meer mogelijk is. Na verwijdering van het RNA polymerase, sluiten de gesmolten regio’s zich terug (behalve tussen A en T in de promotor). Hierna werd dit mengsel behandeld met S1 nuclease (knipt enkelstrengige nucleïnezuren) en dus op de plaatsen waar basepparing verhinderd is. Dit levert in principe end labeled fragmenten, elk eindigend aan een A in de gesmolten regio. Na elektroforetische scheiding werd de exacte lengte van de fragmenten bepaald. Na het te weten komen van de lengtes en de exacte posities van het gelabelde eind, was het mogelijk de precieze locatie van de gesmolten regio te bepalen.

10

3.5 Promotor clearance

RNA polymerase kan niet werken indien het niet kan binden op de promotor. Doordat het zo sterk hierop bind, rijst de vraag hoe het deze verlaat bij de start van de elongatie. Hierover zijn verschillende hypotheses opgesteld. Uit onderzoek (hier verder niet beschreven) blijkt dat het E.coli RNA polymerase zijn abortieve transcripten maakt door middel van Scrunching. Hierbij wordt downstream DNA in het polymerase getrokken, zonder de promotor te verlaten. Door het scrunchen wordt er energie opgeslagen in het DNA, die voldoende is om de binding tussen promotor en he polymerase te verbreken.

3.6 Structure and function of σ

Op het einde van de jaren tachtig zijn genen die coderen voor verschillende σ van verschillende species gekloneerd en gesequenced. Door vergelijking van de verschillende AZ sequenties zag men dat er verschillende overeenkomsten zijn die geclusterd zijn in 4 regio’s. De conservatie van deze regio’s doet vermoeden dat zij een belangrijke functie hebben. Al deze regio’s zijn betrokken bij de binding van de core en bij de binding van het DNA.Uit onderzoek blijkt dat bacteriën verschillende types van σ-factoren hebben. De primaire σ factoren zorgen voor de transcriptie van de vegetatieve genen (deze die nodig zijn voor de groei). Voorbeelden van deze zijn σ70 (E.coli) en σ43 (B.subtilis) (70 en 43 wijzen op grootte in kDa van het proteïne).

11

Figuur 11: Homologe regio's in bacteriële σ-factoren

Regio 1: Deze regio komt enkel voor bij primaire σ factoren. Het verhinderd σ om te binden op het DNA. Indien dit niet zou gebeuren, dan zou σ ervoor kunnen zorgen dat het holoënzym wordt verhinderd. Dit zou lijden tot de inhibitie van de transcriptie.

Regio 2: Deze regio komt voor in alle σ factoren en is zeer sterk geconserveerd. Het kan opgedeeld worden in 4 subdivisies, 2.1 – 2.4. Er zijn voldoende aanwijzingen die aangeven dat de subdivisie 2.4 de -10 box van de promotor herkent en bind. Uit de AZ sequentie is gehaald dat 2.4 een α-helix structuur is.

Regio 3: Deze regio is betrokken bij zowel de binding van de core als het DNA. Regio 4: Regio 4 kan net zoals regio 2 worden opgedeeld in subdivisies. Het speelt ook een

rol bij de herkenning van de promotor. Subdivisie 4.2 heeft een heeft een helix-turn-helix structuur, wat suggereert dat het betrokken is bij DNA binding. Het blijkt dat deze zorgt voor de binding van de -35 box.

Figuur 12: Schematische voorstelling van σ

Figuur 13: Specifieke interacties tussen σ en promotor. In regio 4.2 zijn R 584 en R 588 verantwoordelijk voor de binding van C en G in de -35 box. Q 437 en T440 zijn verantwoordelijk voor de binding van T in de -10 box.

Figuur 14: Schematische voorstelling van de interactie van σ met de promotor

12

σ kan niet zelf met het DNA binden, maar door interactie tussen het DNA en de core wordt de bindingsregio voor σ blootgelegd. Het is Regio tussen AZ 262 en 309 van de β’ subunit die zorgt voor de stimulatie van σ binding op de non template keten in de -10 regio van de promotor.

3.7 The role of the α-subunit in UP element recognition

RNA polymerase kan naast de -10 en -35 box nog een derde element herkennen, namelijk het UP element. Uit onderzoek blijkt dat dit herkend wordt door de α subunit van het RNA polymerase. R.Gource et al. toonde dit aan met volgend experiment:

Er werden E.coli stammen gemaakt met muaties in de α-subunit. Deze stammen waren niet in staat om te reageren op promotors met het UP element. Genen die werden voorafgegaan door zulke promotors werden niet meer sterker getranscripteerd als genen die werden voorafgegaan door promotors zonder het UP element. Om de hoeveelheid transcriptie te kunnen meten, bouwde zij een rrnB P1 (WT) promotor in een vector. In een andere vector plaatste zij een mutant wwarvan het UP element was verwijderd. Beide stalen werden getranscipteerd door 3 verschillende RNA polymerasen, die allen opgebouwd werden uit de verschillende opgezuiverde sub-eenheden: (1) α-WT, (2) α-235, een polymerase dat 94 AZ mist van zijn C terminus van de α-subeenheid en (3) α-R265C, waarbij het AZ R op positie 265 is vervangen door C inde α-subeenheid. Het aangemaakte RNA werd zichtbaar gemaakt met behulp van gemerkte nucleotiden.

Figuur 15: Deverschillende promotors gebruikt in dit experiment: -88 = WT promotor. SUB: In dieze promotor is het UP element vervangen door een irrelevante sequentie. -41, bevat het UP element gedeelte upstream van positie 41 lacUV5 is een promotor zonder UP element (om de normale transcriptiegraad weer te geven)

In Figuur 16 zijn de resultaten van het experiment weergegeven. Als de transcriptie wordt uitgevoerd met het XT polymerase, dan is te zien dat er meer RNA wordt aangemaakt indien de promotor zijn UP element heeft (laan 1 en 2), dan dat dit element is vervangen (laan 4 en 5) of dan dat het element is verwijderd (laan 5 en 6). Als het experiment wordt uitgevoerd met α-235 (94 AZ verwijderd uit α subunit), dan ziet men dat het enzym even actief is, als dat de promotor enkel de core herkenningssequentie bevat.Als in de α subunit arginine wordt vervangen door cytosien, dan zit men dat het niet meer kan reageren op het UP element (3e gel – lanen 7 tot 10). Dit experiment geeft een indicatie dat de α subeenheid verantwoordelijk is voor de herkenning van het UP element. Door de uitvoering van DNase footprinting . Het gebruikte DNA bevat de rrnB P1 promotor. Hierbij werd of het WT RNA polymerase of een mutant dat het C-terminaal domein van de α subunit niet meer bevat, aan toegevoegd. Uit de elektroforese patronen blijkt dat het WT RNA polymerase een footprint maakt in het core element en in het UP element. De mutant maakt enkel een footprint in het core

13

Figuur 16: resultaten experiment Gourse et al

element. Dit geeft een indicatie dat het C-terminaal domein van de α subunit noodzakelijk is voor de herkenning van het UP element (data niet weergegeven). Verder bewijs voor deze hypothese kwam van een experiment waarbij opgezuiverde α subunit dimeren werden gebruikt voor footprinting het UP element van rrn B P1. Figuur 17 Geeft de resultaten van dit experiment weer. Hierin is een duidelijke footprint te zien in het UP element, veroorzaakt door de binding van de α subunit dimeer zelf.

Figuur 17

Verder voerde zij een gelimiteerde proyeolyse uit. Hieruit blijkt dat het N-terminaal domein en het C-terminaal domein van de α subunit zich onafhankelijk van elkaar opvouwen en zo twee aparte domeinen vormen die bij elkaar worden gehouden door een linker. Uit deze experimenten werd volgend model (weergegeven in Figuur 18) voor de binding van RNA polymerase aan de promotor. Als een promotor geen UP element bevat, dan bind het RNA polymerase aan de promotor met behulp van de σfactor, zonder hulp van het α-CTD domein. Is er een UP element aanwezig, dan zal naast de binding van de σ factor, ook het α –CTD binden aan de promotor, meer bepaald aan het UP element. Dit zorgt voor een zeer sterke binding en daardoor voor een zeer hoge transcriptie graad.

14

Figuur 18

4 Elongation

4.1 Core polymerase functions in elongation

The Role of β in phosohodiester bond formationZilig was de eerste onderzoeker die de verschillende subeenheden van het core enzym onderzocht. Hiervoor startte hij met het scheiden van het E.coli core RNA polymerase in zijn 3 verschillende subeenheden. Hierna werden deze verschillende subeenheden weer gecombineerd tot een actief polymerase. The scheiding werd op volgende manier uitgevoerd: het core enzyme werd elektroforestisch gescheiden in via ureum cellulose acetaat elektroforese. Het voordeel van ureum t.o.v SDS is dat de subeenheden na scheiding terug in hun natieve vorm kunnen gebracht worden (enkel bindingen tussen de subeenheden worden verbroken, de 3D conformatie en lading worden niet verstoord). Na scheiding werden de proteïnen opgzuiverd uit het cellulose acetaat en werd er via een elektroforese een controle gedaan op onzuiverheden. Na scheiding werden de subeenheden opnieuw gerecombineerd tot een actief enzym. Dit proces gaat het beste in aanwezigheid van σ. Dankzij deze techniek is het mogelijk om de subeenheden van verschillende RNA polymerasen met elkaar te recombineren, en zo te onderzoeken welk subeenheid gevoelig is voor een bepaald antibioticum. Via deze techniek is achterhaald dat de gevoeligheid voor rifampicine gelegen is op de β subunit (α,β’ en σ van een rifampicine-gevoelig RNA polymerase werden gerecombineerd met een β subunit van een rifampicine resistent polymerase). Rifampicine is een antibioticum dat de initiatie blokkeert. Via deze techniek kwam men ook te weten dat de gevoeligheid voor het antibioticum streptolydigine, dat de elongatie blokkeert, ook gelegen is op de β subunit. Dit werd als paradoxaal beschouwd, aangezien het lijkt dat beide subeenhden betrokken zijn bij initiatie en elongatie. Het antwoord hierop is dat rifampicine de vroege elongatie blokkeert, door het verhinderen dat RNA ketens langer dan 3 nt lang worden. Hierdoor wordt de initiatie geblokkeerd, omdat de vorming van abortieve RNA oligo’s wordt verhinderd.

15

In 1987 kwamen Gravech et al met extra bewijs dat de elongatie activiteit gelegen was op de β-subunit. Dit werd gedaan door gebruik te maken van een techniek genaamd affinity labeling.Bij deze techniek wordt er gebruik gemaakt van een derivaat van het normaal substraat dat zorgt voor crosslinking met het enzym. Hierdoor wordt er een tag aangebracht op de active site, en de subunit waarop deze gelegen is. Naderhand worden de subeenheden met elektroforese van elkaar gescheiden en kan nagegaan worden aan welke subeenheid de tag aanwezig is. Gravech et al. Maakte gebruik van ATP of GTP analogen (meestal eerste nucleotide dat wordt ingebouwd) Eén van deze analoge werd reagent I genoemd, en heeft een structuur zoals weergegeven in onderstaande figuur.

Het gaat naar de active site zoals een ATP zou doen bij transcriptie initiatie, en vormt dan een covalente binding met de aminogroep gelegen op de active site, volgens de reactie weergegeven in onderstaande figuur. In theorie hadden de onderzoekers dit reagentia kunnen labelen, maar aangezien dat het ook kan reageren met andere aminogroepen, werd er gekozen voor het labelen met [α32P]UTP of CTP) dat een fosfodiësterbinding vormt met het reagens op de active site. Nadien werd het enzym gedissocieerd en gescheiden met SDS –PAGE.In de bekomen elektroforese patronen is enkel de β subunit te zien, wat suggereert dat deze dicht inde buurt of op de site zit waarde fosfodiësterbinding gevormd wordt.

Figuur 19: Reactie met Reagens I

16

4.2 Structure of the elongation complex

Structure of the core polymerase

Om een duidelijk beeld te krijgen van de structuur van het elongatie complex is het noodzakelijk eerst een idee te hebben van de structuur van het core enzym. De beste manier om dit te doen is door gebruik te maken X-ray kristallografie. In 1999 zijn Darst et al. Er is geslaagd 3D kristallen te maken van het RNA polymerase van T. aquanticus en een kristalstructuur te bekomen met een resolutie van 3,3 Å, die zeer gelijkend was op de lagere resolutiestructuur van het E.coli polymerase (bekomen via elektronenmicroscopie). In onderstaande figuur is de structuur van het core poymerase weergegeven. Elke subeenheid is weergegeven met een andere kleur. De vorm van het enzym is die van een schaar van een crab. Uit de structuur blijkt dat één helft van de klauw is opgebouwd uit β subeenheid en de andere helft uit de β’ subeenheid. De beide α-subeenheden liggen in de scharnier van de klauw, één geassocieerd (αI) met β; de andere (αII) met β’). Onderaan ligt de ω subeenheid. In een kanaal door het enzym is de katalytische site gelegen. Hier wordt Mg(II) gebonden door 3 Asp residu’s van β’. In dit kanaal wordt het DNA gebonden. Het is in dit kanaal dat de rifampicine bindingsplaats aanwezig is (op β). Een verklaring voor de werking van rifampicine is dat het, het kanaal waar het groeiende RNA moet passeren blokkeert, en zo de initiatie inhibeert. (grote afbeelding zie handboek of slides)

Structure of the holoenzyme DNA complex

Om een hogeen holoënzym-DNA complex te bekomen, gebruikten darst et al een synthetische oligonucleotide. Dit DNA is hoofdzakelijk dubblestranded (ook -35), maar heeft een single stranded in de -10 regio. Dit simuleert de structuur van het open promotor complex.

Figuur 20: DNA gebruikt voor holoënzym-DNA complex kristallen te maken

Figuur 21: Structuur van het holoënzym-DNA complex

Het DNA is hoofdzakelijk gebonden met σ. Verder is ook te zien dat σ interageert met β en β’. Het Mg2+ ion zorgt mee voor de eigenlijke katalyse.

17

Promotor binding form -60 tot +25

Transcription initiation model

18

Zipper: sluit DNARudder: opent DNA.

19

DNA scrunching

Topology of elongation

Als het RNA polymerase tijdens de elongatie over het template beweegt, blijft er dan nog steeds een regio van het DNA gesmolten. Logisch gezien zou dit het geval zijn, aangezien het zo voor het polymerase mogelijk is de keten te lezen. Ook experimenteel is dit aangetoond. Het gebruik van de statische modellen om transcriptie te beschrijven zijn een beetje misleidend. Als we transcriptie zouden bekijken als een dynamisch proces, dan ziet men dat de DNA dubbele helix zich zal opnemen voor de transcriptie bubble en zich er juist na weer zal sluiten. Theoretisch gezien zijn er twee manieren hoe RNA polymerase die kan doen, die beide zijn weergegeven in onderstaande figuur.

Eén methode zou zijn zoals beschreven in figuur a. Het geamplificeerde RNA draait dan samen met het polymerase rond het DNA, waarbij de helix van het DNA gevolgd word. Dit zal het DNA niet verdraaien, maar zal een zeer grote hoeveelheid energie vereisen van het polymerase. Een tweede probleem dat hierbij optreed is dat het transcript volledig tussen het DNA gedraaid is en er niet meer zou uitraken.De tweede mogelijkheid is dat het Polymerase in een rechte lijn beweegt en dat het DNA roteert in één richting waarin het ontwind en ronddraait in de andere richting als het terug opwind. Dit model zorgt ervoor dat er spanning op de DNA keten ontstaat. Als dit tweede mechanisme het juiste is, dan moet er een manier zijn om het DNA te relaxeren. Dit is mogelijk dankzij de topoisomerasen, een klasse van enzymen dat tijdelijk breuken kan veroorzaken in de DNA ketens en zo de spanning verlaagt.

20

Pausing, bactracking and proofreading

Gedurende de elongatie treedt er vaak een pauze op, of gaat het polymerase zelfs in achterwaartse richting. Pauzeren tijdens de elongatie heeft minstens twee belangrijke redenen: (1) het zorgt ervoor dat het tragere proces van translatie gelijke tred blijft houden met de transcriptie1. Dit is belangrijk voor de fenomenen attenuatie en het vroegtijdig stoppen met de transcriptie indien de translatie mislukt. (2) het is de eerste stap in terminatie.Soms gaat het prolymerase achterwaarts. De reden hiervoor is de zogenaamde proof reading activiteit. Bij dit proces zijn de proteïnen GreA en GreB betrokken. Zij zorgen voor de stimulatie van de Rnase activiteit van het polymerase, om zo de fout ingebouwde nucleotiden te kunnen verwijderen. Zelfs als deze proteïnen niet aanwezig zijn, kan het polymerase zijn proofreading activiteit vertonen. De verklaring hiervoor is dat het fout ingebouwde nucleotide geen baseparen kan volgen met de DNA keten. Het is hierdoor flexibel genoeg om dubbel te vouwen en zo in contact te komen met het metaal II, en dit op de active site te binden. Dit metaal is betrokken bij de Rnase activiteit. Een tweede verklaring is dat de keten een water molecule kan oriënteren zodat het een beter nucleofiel si bij de aanval op de fotodiësterbinding.

5 Termination of transcription

Als het RNA polymerase aan het einde van een gen komt, dan komt het los van het DNA. Hiervoor zijn er in prokaryoten twee mechanismen gekend:

Intrinsieke terminatie: hierbij gebeurt de terminatie zonder tussenkomst van extra proteïnen ρ afhankelijke terminatie: hierbij is de auxiliaire factor rho betrokken.

5.1 Rho independent termination

Voor dit type van terminatie zijn er twee elementen nodig: een inverted repeat die onmiddellijk gevolgd wordt door een T rijk gebeid in de niet template keten. Het mechanisme van deze terminatie hangt af van de van een hairpin structure in het RNA transcript (dit gebeurd ter hoogte van de inverted repeat).

Inverted repeats and hairpins

De onderste A en U kunnen geen baseparen vormen te gevolgen van fysische beperkingen voor de vorming van een bocht in het RNA.

Structure of an intrisic terminator

Het E.coli trp operonbevat een DNA sequentie die een attenuator wordt genoemd. Deze attenuator bevat de twee elementen die waarvan wordt gedacht dat zij belangrijk zijn bij intrinsieke terminatie. Farnham en Platt gebruikte dit als model voor attenuatie. Farmham en Platt dachten als volgt: als de T-rijke regio van de attenuator wordt getranscripteerd, dan 1 Een rescente studie laat uitschijnen, dat het juist het omgekeerde is. Uit de gegevns blijkt dat de ribosomen sneller zijn dan het RNA polymerase en dat deze het RNA polymerase als het ware vooruit duwen (Proskhin et al, 2010)

21

ontstaan er 8 A-U bp. Zij wisten dat baseparen tussen U en A zeer zwak zijn (Tm is rond 20°C). Dit leidde tot volgende hypothese: het RNA polymerase pauzeert bij de terminator, en door de zwakheid van de A-U baseparen komt het RNA los van het template.Zij toonde dit model aan met volgende experiment:

Als de vorming van de hairpin en de baseparing tussen U en A zo belangrijk is voor de terminatie, dan zal waarschijnlijk een verandering in deze sequenties ertoe leiden dat de functie verdwijnt. Volgende in vitro test werd uitgevoerd. Zij startte van een HpaII restrictie fragment, die de trp attenuator bevat, en voerde een in vitro transciptie uit. Als de attenuatie werkt, dan wordt er een kort transcript bekomen (140 nt). Als de attenuator faalt, dan zal er een lang transcript bekomen worden (260 nt). Beide kunnen van elkaar gescheiden worden via elektroforese.Zij veranderde de keten van 8 T in de niet template keten naar de sequentie TTTTGCAA, dan werd de attenuatie verzwakt. Dit komt overeen met de hypothese dat de zwakke U-A p) pren belangrijk zijn bij terminatie. Deze gevolgen van deze mutatie konden omzeild worden door CTP te vervangen door ICTP (IodoCTP). De verklaring hiervoor is dat de baseparen tussen IC en G sterker zijn dan tussen G en C. Hierdoor wordt de hairpin meer gestabiliseerd en werkt zo de mutatie tegen.Als ook GTP wordt vervangen (door ITP (ionosine trifosfaat). Dan wordt de hairpin gedestabiliseerd en wordt de attenuatie verzwakt. De reden hiervoor is dat de baseparing tussen IMP en C zwakker zijn dan tussen G en C.Al deze effecten komen overeen met de hypothese dat de hairpin en de ketens van U’s belangrijk zijn voor terminatie.

A model for termination

Er zijn verschillende hypothesen gemaakt hoe intrinsieke terminatie gebeurd. Eén van deze hypothesen was afkomstig van Yarnell en Roberts. Volgens hun hypothese trekt het RNA zich terug van de active site van het polymerase als het komt aan de terminator, doordat de vorming van de hairpin het RNA eruit trekt, of doordat het polymerase verder beweegt zonder te eleongeren en zo het RNA loslaat. Om hun hypothese te testen gebruikte Yarnell en Roberts twee terminator mutanten gelegen na sterke promotors. De terminators hadden een een T rijk gebied in de niet template keten, maar hadden slechts de helft van hun inverted repeat. Om de hairpin te compenseren voegde zij een oligonucleotide toe, dat complementair was aan de helft van de inverted repeat.Om hun concept te testen, werd de template gekoppeld aan megnetische beads, zodat het makkelijk uit het mengsel verwijderd kan worden. Dan gebruikte zij E.coli RNA polymerase om gelabelde nucleotide in te bouwen in aanwezigheid en afwezigheid van de complementaire oligo. Uiteindelijk werd het template magnetische verwijderd en elektroforetisch gescheiden (zowel de pellet als het supernatant). Pauzering werd in bij neide terminators waargenomen. Dit is een duidelijke indicatie dat de hairpin niet noodzakelijk is voor de terminatie, maar noodzakelijk is voor het efficiënt loslaten van het RNA. Als de oligonucleotide werd toegevoegd, dan zorgde deze voor stimulatie van de terminatie.

22

In een tweede deel van het experiment maakte zij een mutatie in de oligo, waardoor de complementariteit verminderde. Dit zorgde voor een verlaging in terminatie. Als er een mutatie in de halve inverted repeat werd gemaakt, dan werd de terminatie hersteld.Deze resultaten tonen aan dat de hairpin niet noodzakelijk is voor de terminatie, maar dat er baseparing moet optreden met de inverted repeat om de RNA-DNA hybride de destabiliseren.Verder is ook de T rijke regio niet noodzakelijk als men de transcriptie artificieel kan vertragen.

5.2 Rho Dependent Termination

Jeffery Roberts ontdekte een proteïne, dat hij rho noemde, dat ervoor zorgde dat de transcriptie werd onderdrukt. Deze onderdrukking is het gevolg van terminatie. Als rho de transcriptie termineerde, moet het RNA polymerase terug initiëren om de transcriptie te herstarten. Doordat initiatie een tijdrovend proces is, zal de netto transcriptie in aanwezigheid van rho dalen. Om te bepalen dat rho een terminatie factor is deed Roberts volgende experimenten.

Rho affects Chain elongation, but not initiation

Om na te gaan of rho een invloed heeft op de elongatie of de initiatie gebruikte Roberts [γ32P] GTP (om de invloed op de initiatie na te gaan) en [3H]UTP (om de invloed op de elongatie na te gaan). Hij voerde in vitro transcriptie uit, en liet de concentratie rho toenemen. In onderstaande figuur zijn de resultaten te zien. Hierop zien we dat rho een klein effect had op de initiatie. Het zorgde echter voor een significante afname van de elongatie. Dit lijkt de hypothese dat rho een invloed heeft op de terminatie, dus ervoor zorgen dat het tijd vergende initiatie proces moet hernomen worden. Als rho de terminatie stimuleert, dan verwacht men dat de transcripten korter zouden zijn.

Rho causes production of shorter transcripts

Het is zeer makkelijk om de grootte van de transcripten te bepalen met behulp van elektroforese. Roberts toonde aan dat de transcripten korter waren. Dit is echter niet genoeg om aan te tonen of rho een terminator factor is of niet, het zou even goed een RNase zijn. Om dit uit te sluiten voerde Roberts volgend experiment uit. Hij transcripteerde λ-DNA in afwezigheid van rho (gemerkt met [3H]). Hierna werd de grootte bepaald. Nadien wordt aan het mengsel rho toegevoegd. Na een tweede lengte bepaling, blijkt er geen verandering opgetreden. Dus rho heeft geen RNase activiteit. In een derde reactie werd de transcriptie uitgevoerd in aanwezigheid van rho. Deze fragmenten waren korter, dan in de reactie waar de transcriptie zonder rho werd uitgevoerd.

Rho releases transcripts from teh DNA template

23

In een laatste experiment gebruikte Roberts ultracentrifugatie om de sedimentatie eigenschappen van de RNA producten te onderzoeken in aan- en afwezigheid van rho. Als rho afwezig was, dan sedimenteerde het RNA samen met het DNA template. In aanwezigheid sedimenteerde het DNA zonder verbonden te zijn met het DNA.

The mechanism of rho

Rho afhankelijke terminators bestaan uit een inverted repeat, die een hairpin kan vormen. Het bevat echter geen keten van T’s. Rho (een ATPase en RNA-DNA helicase) Rho bind aan het RNA polymerase elongation complex. Als het RNA transcript lang genoeg is, dan bind rho het via de rut site (Rho Utilization), en vormt zo een RNA loop tussen het polymerase en rho. Rho gaat verder met het transcipt door hem te laten lopen, totdat het polymerase pauzeert bij de terminator. Door deze pauze kan rho de RNA loop strakker maken en zo het elongatie complex verbreken en zo de transcriptie termineren.

24