Faculteit Geneeskunde en GezondheidswetenschappenVakgroep Inwendige Ziekten

Laboratorium voor Klinische en Experimentele Neurofysiologie

Academiejaar 2010/2011

Optimalisatie van de stimulatieplaats voor diepe hersenstimulatie als behandeling van

epilepsie

Parthoens Joke

Promotor: Prof. Dr. Bart BraeckmanCo-Promotor: Dr. Tine WyckhuysBegeleider: Bregt Van Nieuwenhuyse

Scriptie voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Biologie

© May, 2011. Faculty of Medicine and Health Sciences – Laboratory for Clinical and Experimental Neurophysiology, Department of Neurology, Institute for Neuroscience, Ghent University Hospital, Belgium

All rights reserved. This thesis contains confidential information and confidential research results that are property to the UGent. The contents of this master thesis may under no circumstances be made public, nor complete or partial, without the explicit and preceding permission of the UGent representative, i.e. the supervisor. The thesis may under no circumstances be copied or duplicated in any form, unless permission granted in written form. Any violation of the confidential nature of this thesis may impose irreparable damage to the UGent. In case of a dispute that may arise within the context of this declaration, the Judicial Court of Gent only is competent to be notified.

Deze masterproef bevat vertrouwelijke informatie en vertrouwelijke onderzoeksresultaten die toebehoren aan de UGent. De inhoud van de masterproef mag onder geen enkele manier publiek gemaakt worden, noch geheel noch gedeeltelijk zonder de uitdrukkelijke schriftelijke voorafgaandelijke toestemming van de UGent-vertegenwoordiger, in casu de promotor. Zo is het nemen van kopieën of het op eender welke wijze dupliceren van het eindwerk verboden, tenzij met schriftelijke toestemming. Het niet respecteren van de confidentiële aard van het eindwerk veroorzaakt onherstelbare schade aan de UGent. Ingeval een geschil zou ontstaan in het kader van deze verklaring, zijn de rechtbanken van het arrondissement Gent uitsluitend bevoegd daarvan kennis te nemen.

Inhoudsopgave

1. Inleiding 4

1.1 Epilepsie 41.1.1 Situering 41.1.2 Classificatie 41.1.3 Temporale kwab epilepsie 51.1.4 Oorzaken 51.1.5 Behandelingen 51.1.5.1 Anti-epileptische medicatie 51.1.5.2 Epilepsiechirurgie 61.1.5.3 Neurostimulatie 6

1.2 Proefdiermodellen 71.2.1 Genetische modellen 81.2.2 Elektrisch geïnduceerde modellen 81.2.3 Chemisch geïnduceerde modellen 8

1.3 Diepe Hersenstimulatie 91.3.1 Inleiding 91.3.2 Optimalisatie stimulatieprotocol 101.3.2.1 Stimulatieparameters 101.3.2.2 Stimulatieplaats 10

1.4 De midline thalamische nuclei 111.4.1 Anatomie en functie 111.4.2 De MTN als stimulatietarget 12

1.5 De hippocampale commissuur 131.5.1 Anatomie en functie 131.5.2 De VHC als stimulatietarget 15

2. Doelstellingen 16

3. Materiaal en methoden 1723

3.1 Aanmaak van de elektrodes 173.1.1 Scalpelektrode en referentie-elektrode 173.1.2 Quadripolaire registratie-elektrode 173.1.3 Bipolaire stimulatie-elektrode 17

3.2 Dieren 18

3.3 Optimalisatie van de coördinaten 18

3.3.1 De hippocampus 193.3.2 De MTN 203.3.3 De VHC 20

3.4 DHS-experimenten 213.4.1 Experimenteel protocol 213.4.2 SE inductie en selectie 213.4.3 Implantatie van de elektrodes 213.4.4 EEG-afname en data analyse 233.4.5 Diepe hersenstimulatie 243.4.6 Transcardiale perfusie en histologie 253.4.7 Statistische analyse 26

4. Resultaten 27

1.2.3.

4.1 Optimalisatie van de VHC-coördinaten 274.2 DHS-experimenten 284.2.1 Histologie 284.2.1.1 De MTN 284.2.1.2 De VHC 29

4.2.2 Evaluatie van het effect van DHS 304.2.2.1 Effect op aanvalsduur 304.2.2.2 Effect op aanvalsfrequentie 30

5. Discussie 34

5.1 Optimalisatie van de MTN-coördinaten 345.2 Het effect van VHC-stimulatie 345.3 Extrapolatie naar klinische studies en neveneffecten 365.4 Het werkingsmechanisme van DHS 375.5 Toekomstperspectieven 38

6. Conclusie 40

7. Samenvatting 41

8. Summary 44

Dankwoord 47

Afkortingenlijst 48

Referentielijst 49

Bijlage

1. Inleiding

1.1. Epilepsie

1.1.1. Situering

Wereldwijd lijden er ongeveer 50 miljoen mensen aan epilepsie. Het is, na cerebrovasculaire ziekten, de tweede meest voorkomende chronische neurologische aandoening en treft 0,5-1% van de populatie. In Europa komen er jaarlijks 50-70 nieuwe epilepsiepatiënten bij per 100 000 mensen (BRODIE ET AL., 1997). Epilepsie is een chronische neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door het herhaald en spontaan optreden van epileptische aanvallen met mogelijks neurobiologische, cognitieve, psychologische en sociale disfuncties tot gevolg. Epileptische aanvallen worden veroorzaakt door abnormaal excessieve of synchrone neuronale activiteit in de hersenen. Deze ongecontroleerde elektrische activiteit kan een invloed hebben op sensorische, motorische en autonome functies; het bewustzijn, de emotionele status, het geheugen, de cognitie, of het gedrag (FISHER ET AL., 2005).

1.1.2. Classificatie

Epileptische aanvallen kunnen ingedeeld worden in primair gegeneraliseerde aanvallen en focale of partiële aanvallen (tabel 1).

Zonder bewustzijnsverlies Met bewustzijnsverliesPrimair gegeneraliseerde aanvallen

Myoclone aanvallen Typische absences en tonisch-clonische aanvallen

Partiële aanvallen Enkelvoudige partiële aanvallen Complex partiële aanvallen

Tabel 1: Classificatie van epileptische aanvallen.

Bij primair gegeneraliseerde aanvallen lijkt de abnormale activiteit in beide hemisferen tegelijkertijd te ontstaan en is er geen aantoonbare epileptische focus (ENGEL, 2006). Tot deze categorie behoren myoclone aanvallen, typische absences en tonisch-clonische aanvallen. Bij myoclone aanvallen treedt er geen bewustzijnsverlies op en vertoont de patiënt min of meer symmetrische schokken in de lichaamsmusculatuur. Typische absences zijn korte aanvallen (10 tot 30 seconden) die vooral bij kinderen voorkomen. Ze kunnen wel honderd keer per dag optreden en gaan gepaard met een korte indaling van het bewustzijn, waarbij de patiënt de activiteiten stopt en een wazige blik krijgt of de ogen omhoog draait (DANOBER ET AL., 1998). Tonisch-clonische aanvallen worden gekenmerkt door een bewustzijnsverlies en een tonische en clonische fase. Tijdens de tonische fase treedt er contractie op van vrijwel de gehele lichaamsmusculatuur. Hierna volgt de clonische fase die gekenmerkt wordt door clonieën over het hele lichaam. Wanneer de aanvallen kort na elkaar optreden zonder tussentijdse terugkeer van het bewustzijn spreekt men van status epilepticus (SE).

4

Bij partiële aanvallen is er activering van een neuronencomplex in één hemisfeer. Deze aanvallen kunnen secundair generaliseren naar de andere hemisfeer. Partiële aanvallen worden onderverdeeld in enkelvoudige en complexe partiële aanvallen, afhankelijk van het al dan niet optreden van bewustzijnsverlies (tabel 1). Complexe partiële aanvallen worden ook psychomotorische of temporale epileptische aanvallen genoemd. Ze worden gekenmerkt door een bewustzijnsdaling en automatismen. Partiële aanvallen kunnen secundair generaliseren tot tonisch-clonische aanvallen.

1.1.3. Temporale kwab epilepsie

Eén van de meest voorkomende en moeilijkst behandelbare vormen van humane epilepsie is temporale kwab epilepsie (Temporal Lobe Epilepsy, TLE). Bij TLE ontstaan de epileptische aanvallen in temporale kwab structuren. Als de aanvallen ontstaan aan de buitenkant van de temporale kwabben, spreekt men van laterale TLE. Bij mesiale TLE (MTLE), ontstaan de aanvallen voornamelijk in de limbische structuren van de temporale kwab.

1.1.4. Oorzaken

Epilepsie kan niet beschouwd worden als één enkele ziekte; het is eerder een verzamelnaam voor verschillende aandoeningen die, als gevolg van verschillende oorzaken, epileptische aanvallen als belangrijkste symptoom hebben.Epileptische syndromen kunnen volgens de International League Against Epilepsy (ILAE) ingedeeld worden in drie groepen naargelang de onderliggende oorzaak (BERG ET AL., 2010). Men maakt een onderscheid tussen epileptische syndromen met een genetische oorzaak, een structureel/metabolische oorzaak en een onbekende oorzaak. Een genetisch (vroeger idiopatisch) epileptisch syndroom is het directe resultaat van een genetisch defect waarbij aanvallen het belangrijkste symptoom zijn. Vaak gaat het om defecten aan genen die ionenkanalen (bv. natrium-, kalium- en calciumkanalen) vormen. Bij een structureel/metabolisch (vroeger symptomatisch) epileptisch syndroom kan men een cerebrale beschadiging veronderstellen op grond van neurologische, psychische en EEG veranderingen. Deze beschadiging kan o.a. het gevolg zijn van infecties, degeneratieve ziekten, intoxicaties, langdurige anoxie bij de geboorte, trauma’s, bloedingen of tumoren. Wanneer men geen anatomische afwijkingen of genetisch defect vindt, spreekt men van epileptische syndromen met onbekende oorzaak (vroeger cryptogene epileptische syndromen).

1.1.5. Behandelingen

1.1.5.1. Anti-epileptische medicatie

Wanneer epilepsie wordt gediagnosticeerd zal men de patiënt eerst proberen te helpen met anti-epileptische medicatie (Anti-epileptic drugs, AEDs). Het belangrijkste doel van AEDs is aanvallen voorkomen zonder acute of chronische neveneffecten te veroorzaken. De medicatie wordt gekozen op basis van het type aanvallen en het epilepsiesyndroom (BRODIE & DICHTER, 1996; BRODIE ET AL., 1997). De AEDs herstellen het evenwicht tussen excitatie en inhibitie in de neuronen door in te werken op spanningsgevoelige natrium- of

5

calciumkanalen, op de glutamaat receptor of op elementen van het γ-aminoboterzuur (GABA) systeem. De inname van deze medicatie kan leiden tot diverse bijwerkingen zoals verwarring, hoofdpijn, misselijkheid, stemmingsstoornissen, slaperigheid en duizeligheid.Ondanks de recente vooruitgang in de diagnose en farmacologische behandeling van epilepsie, blijven ongeveer 30% van de patiënten oncontroleerbare aanvallen vertonen na pogingen met diverse AEDs (BRODIE & DICHTER, 1996) en/of ondervinden de patiënten onaanvaardbare neveneffecten (KWAN & BRODIE, 2000). Voor de patiënten waarbij geen enkel medicijn werkt, kan geopteerd worden voor combinatietherapie met verschillende medicijnen. De optimale combinaties van AEDs zijn echter nog niet gekend en de kans op neveneffecten stijgt met het aantal voorgeschreven AEDs (BRODIE & DICHTER, 1996). Een andere optie is het uitproberen van nieuw ontwikkelde AEDs.

1.1.5.2. Epilepsiechirurgie

Patiënten met farmacologisch oncontroleerbare partiële aanvallen, kunnen chirurgische resectie van de aanvalsfoci ondergaan. Hierbij is vereist dat deze “epileptogene zone” gekend is. Patiënten met MTLE kunnen bijvoorbeeld in aanmerking komen voor hippocampectomie of amygdalohippocampectomie. Deze procedures leiden bij 64% van de patiënten tot aanvalsvrijheid (ENGEL ET AL., 2003). Bij patiënten met symptomatische gegeneraliseerde epilepsie met ernstige en gevaarlijke aanvallen, grote hemisferische laesies of secundaire bilaterale synchronie, kan callosotomie overwogen worden (BRODIE ET AL., 1997). Bij deze ingreep wordt een deel van het corpus callosum doorgesneden.Hoewel epilepsiechirurgie tot zeer goede resultaten kan leiden, blijft dit een ingrijpende, onomkeerbare behandeling met risico’s op post-operatieve neurologische en/of neuropsychologische problemen (HELMSTAEDTER ET AL., 2003; GLEISSNER ET AL., 2004). Ook komen veel patiënten die ‘farmacoresistent’ zijn niet in aanmerking voor epilepsiechirurgie, zoals patiënten met bilaterale MTLE.

1.1.5.3. Neurostimulatie

Voor patiënten met refractaire epilepsie die niet in aanmerking komen voor epilepsiechirurgie, kan neurostimulatie een oplossing bieden. Neurostimulatie is de directe toediening van elektrische pulsen aan zenuwweefsel om een pathologisch substraat te moduleren en een therapeutisch effect te bereiken (BOON ET AL., 2007). De stimulatie kan ofwel extracranieel (nervus vagus stimulatie en transcraniële stimulatie) ofwel intracranieel (diepe hersenstimulatie) worden toegediend. Bij nervus vagus stimulatie (NVS) wordt een elektrode gewonden rond de linker nervus vagus ter hoogte van de hals. Deze elektrode is verbonden met een pulsgenerator die subclaviculair geïmplanteerd is. Het precieze werkingsmechanisme van NVS is nog niet gekend en ongeveer een derde van de patiënten die deze behandeling ondergaan, ondervindt geen verbetering in aanvalsfrequentie (BOON ET AL., 2009).Repetitieve transcraniële magnetische stimulatie (rTMS) is een niet-invasieve vorm van extracraniële stimulatie, die momenteel wordt onderzocht als potentiële behandeling van refractaire epilepsie. Hierbij wordt een spoel die magnetische velden uitzendt over de scalp gehouden, waardoor er een elektrische stroom wordt geïnduceerd in de hersenen. Hoewel

6

de eerste resultaten veelbelovend zijn (FREGNI ET AL., 2005; KINOSHITA ET AL., 2005), is er verder placebo-gecontroleerd onderzoek nodig om het anti-epileptisch potentieel van deze behandeling verder te karakteriseren (BAE ET AL., 2011). Een andere vorm van transcraniële stimulatie is transcraniële “direct current” stimulatie (tDCS). Bij deze behandeling wordt de elektrische stroom (1-2 mA) rechtstreeks naar de schedel gestuurd met elektroden. tDCS moduleert corticale exciteerbaarheid en kan verschillende motor, somatosensorische, visuele, affectieve en cognitieve functies beïnvloeden (BEEN ET AL., 2007).Een veelbelovende experimentele therapie is diepe hersenstimulatie (DHS). Bij deze behandeling worden specifieke hersenstructuren rechtstreeks elektrisch gestimuleerd door één of meer geïmplanteerde elektroden, die via een subcutane draad verbonden zijn met een geïmplanteerde pulsgenerator (figuur 1). De vooruitgang in de technologie en de ervaring met de behandeling van andere neurologische ziektes in het afgelopen decennium, leidde tot een nieuwe interesse in DHS voor de behandeling van epilepsie (BOON ET AL., 2007). Deze behandeling komt verder in deze scriptie meer gedetailleerd aan bod.

Figuur 1: Diepe hersenstimulatie (naar www.thehealthage.com).

1.2 Proefdiermodellen

Er zijn verscheidene diermodellen voor epilepsie beschikbaar om behandelingen te optimaliseren. Een voordeel van diermodellen is dat de neuronale fysiologie en de effecten van experimentele behandelingen kunnen bestudeerd worden op manieren die niet mogelijk zijn bij mensen (BERTRAM, 2009). Experimenteel onderzoek bij mensen blijft beperkt omwille van het grote aantal patiënten dat hiervoor nodig is, de variabiliteit tussen de patiënten en ethische aspecten (WYCKHUYS ET AL., 2009). Bovendien kan het effect van de stimulatie vaak niet onafhankelijk van andere therapieën onderzocht worden (LOCKMAN & FISHER, 2009).

7

Er bestaan zowel genetische als geïnduceerde diermodellen voor epilepsie. TLE aanvallen kunnen zowel elektrisch (door o.a. het kindling model) als chemisch (o.a. met kaïnaat of pilocarpine) geïnduceerd worden. In volgende paragraaf worden enkele vaak gebruikte modellen belicht. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van de verschillende diermodellen voor epilepsie wordt verwezen naar de literatuur.

1.2.1 Genetische modellen

Een voorbeeld van een genetisch model is het GAERS-model: de Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg. Dit is een gevalideerd model voor humane absence epilepsie gezien de farmacologische gelijkenissen en overeenkomsten in EEG- en gedragsabnormaliteiten (DANOBER ET AL., 1998).Een ander genetisch model is de Q54 muis met een gain-of-function mutatie in het natriumkanaal gen Scn2a. Dit model kan gebruikt worden voor het testen van behandelingen van aanvallen veroorzaakt door natriumkanaal disfunctie. De muizen ontwikkelen spontane aanvallen die progressief in aantal toenemen met de tijd en vertonen neuronaal celverlies en gliosis in de hilus van de dentate gyrus en de CA1, CA2 en CA3 regio’s van de hippocampus (KEARNEY ET AL., 2001). Genetische modellen voor TLE zijn momenteel niet beschikbaar.

1.2.2 Elektrisch geïnduceerde modellen

In het Kindling model voor TLE worden aanvallen uitgelokt door kindling stimulatie in de limbische structuren. De stimulatie veroorzaakt gedragsveranderingen en ‘afterdischarges’ (ritmische, synchrone ontladingen met hoge amplitude) op het EEG. Het model is snel, stabiel en voorspelbaar en de afterdischarges worden opgewekt wanneer een kindling puls gegeven wordt. Aangezien de aanvallen niet spontaan optreden, kan het model niet gebruikt worden om een verandering in aanvalsfrequentie te onderzoeken.In het chronisch limbisch epilepsiemodel wordt een SE geïnduceerd door 90 minuten continue hippocampale stimulatie (400 µA, 50 Hz, elke 11 s). Na een periode van twee tot zes weken vertonen de dieren spontane TLE aanvallen (BERTRAM ET AL., 2001).

1.2.3 Chemisch geïnduceerde modellen

TLE kan eveneens geïnduceerd worden door injectie met excitotoxische chemicaliën, zoals pilocarpine of kaïnaat. TLE wordt vaak veroorzaakt door een cerebrale beschadiging die gevolgd wordt door een latente periode van enkele jaren, waarin geen aanvallen optreden. Deze latente periode wordt beëindigd door de eerste elektrografische of de eerste klinische aanval. Hierna treden er spontane aanvallen op, die soms progressief in aantal toenemen (FRENCH ET AL., 1993). Zowel het Pilocarpine model als het Kaïnaat model zijn gebaseerd op een SE als voorafgaande schade. Hieronder volgt een beschrijving van het Kaïnaat model met meervoudige injecties met lage dosis, volgens het protocol van HELLIER ET AL. (1998).Het neurotoxische kaïnaat (Kainic Acid, KA) is een zuur dat geëxtraheerd wordt uit Digenea simplex en dat een analoog is van L-glutamaat. Via verschillende KA-receptor subtypes exciteert het zowel de pyramidale neuronen als de interneuronen in de hippocampus. Hoewel dit de inhiberende tonus van de interneuronen enorm verhoogt, kan deze de

8

epileptiforme activiteiten niet tegenhouden. Dit komt door de sterke excitatie van de CA3 pyramidale neuronen, waar gesynchroniseerde activiteiten worden gegenereerd in dense netwerken van collaterale synapsen en mossy fiber synapsen (BEN-ARI & COSSART, 2000).KA zorgt bij ratten, na herhaaldelijke intraperitoneale injecties met lage dosis, voor een onafgebroken opeenvolging van epileptische aanvallen die meer dan drie uur duurt, namelijk SE. Dit veroorzaakt een cascade van neuronale schade die leidt tot de reorganisatie van neuronale netwerken. De relatief lage mortaliteitsgraad van de behandeling (15%) is te danken aan de meerdere injecties met lage dosis, tegenover een enkele injectie met hoge dosis (soms >50%) (HELLIER ET AL., 1998). De SE wordt gevolgd door een latente periode van enkele dagen tot weken. Na de latente periode vertonen de ratten chronische spontane gegeneraliseerde aanvallen met motorische convulsies die tijdens de eerste maanden na de behandeling in frequentie toenemen met de tijd en vergelijkbaar zijn met de ontwikkeling van complex-partiële aanvallen bij TLE patiënten. Ook vertonen de ratten een gelijkaardig patroon van neurodegeneratie in de hippocampus en de aanwezigheid van mossy fiber sprouting in de binnenste moleculaire laag van de dentate gyrus (HELLIER ET AL., 1998). Epileptogenese zou zich dus voortzetten na de eerste spontane aanval en progressief de frequentie van spontane aanvallen verhogen, wellicht door verschillende epileptogene mechanismen (zoals neuronaal verlies, gliosis, sprouting van axonen en/of synaptische reorganisatie) in de dentate gyrus en andere hersengebieden (HELLIER ET AL., 1998; WILLIAMS ET AL., 2007). Verschillende studies toonden aan dat de stijgende aanvalsfrequentie uiteindelijk een plateau bereikt (HELLIER ET AL., 1993; WILLIAMS ET AL., 2009). In dit geval zou de epileptogenese kunnen omschreven worden als de tijd die nodig is om de stabiele aanvalsfrequentie te bereiken (WILLIAMS ET AL., 2007, 2009).Opvallend is dat de ratten na de KA-behandeling significant meer spontane motorische aanvallen doen tijdens inactieve staat (weinig of geen beweging, inclusief schijnbare slaap) dan tijdens actieve perioden (beweging zoals lopen, grooming, eten, enz.). Het effect van inactiviteit op de aanvalsfrequentie komt overeen met sommige vormen van menselijke gegeneraliseerde en partiële epilepsie (HELLIER & DUDEK, 1999).

1.3 Diepe Hersenstimulatie

1.3.1 Inleiding

DHS is momenteel één van de meest veelbelovende therapieën in de functionele neurochirurgie wegens de weinige bijwerkingen en de ‘omkeerbaarheid’ van de behandeling. DHS wordt reeds enkele decennia toegepast als behandeling voor bewegingsproblemen zoals de ziekte van Parkinson. Momenteel wordt DHS onderzocht als potentiële therapie voor andere neurologische aandoeningen zoals depressie, Tourette syndroom, obsessieve-compulsieve stoornis en epilepsie, met gunstige resultaten. De applicatie van DHS in diverse neurologische aandoeningen is mogelijk dankzij de flexibiliteit in stimulatieparameters zoals de locatie, timing en intensiteit (KILE ET AL., 2010).

1.3.2 Optimalisatie stimulatieprotocol

9

Hoewel DHS als behandeling van epilepsie al goede resultaten heeft opgeleverd, kan deze behandeling nog sterk worden geoptimaliseerd. Zo is het bijvoorbeeld nog onduidelijk wat het precieze werkingsmechanisme is van DHS (GWINN & SPENCER, 2004; JENSEN & DURAND, 2009) en is er nog geen consensus bereikt over de optimale stimulatieplaats en -parameters. Om DHS te kunnen toepassen als succesvolle behandeling van epilepsie moeten de voorgestelde combinaties van stimulatietargets en stimulatieparameters worden geëvalueerd in realistische diermodellen.

1.3.2.1 Stimulatieparameters

Wegens het succes van DHS bij de behandeling van bewegingsstoornissen, werden de hiervoor gebruikte en geoptimaliseerde stimulatieparameters (zoals intensiteit, amplitude, pulsduur, frequentie, duur van interpulsintervallen, elektrodeconfiguratie, …) initieel vaak overgenomen in de zoektocht naar een goed stimulatieprotocol ter behandeling van refractaire epilepsie. De optimale combinatie van parameters is echter sterk afhankelijk van de te behandelen aandoening en van de stimulatieplaats. In dierexperimenteel onderzoek gaat men op zoek naar de beste combinaties. Zo werd bij gekindlede ratten aangetoond dat DHS met hoge frequentie van 130 Hz (Hoogfrequente stimulatie, HFS) in de hippocampus effectiever aanvallen kan onderdrukken dan laagfrequente stimulatie (LFS) van 5 Hz (WYCKHUYS ET AL., 2010b). Bovendien bleek in het KA-model stimulatie van 130 Hz met Poisson verdeelde interpuls intervallen (PVS) effectiever te zijn dan de conventionele HFS (130 Hz) met synchrone interpuls intervallen (WYCKHUYS ET AL., 2010a).

1.3.2.2 Stimulatieplaats

De optimale stimulatieplaats om epileptiforme activiteit te moduleren is één van de belangrijkste, maar tevens moeilijkst te bestuderen variabele in de zoektocht naar de meest effectieve DHS behandeling voor epilepsie. Drie strategieën kunnen onderscheiden worden i) men kan als target cruciale structuren van het centraal zenuwstelsel gebruiken, waarvan men denkt dat ze een pacemaker of triggerende rol hebben in het epileptogeen netwerk. Voorbeelden hiervan zijn de subthalamische nucleus of de thalamus; ii) bij een andere benadering interfereert men met structuren die bij het uitlokken van de aanval betrokken zijn, zoals de hippocampus (BOON ET AL., 2009); iii) bij de laatste benadering worden structuren gestimuleerd die de exciteerbaarheid van neuronale netwerken beïnvloeden, zoals de locus coeruleus.Gezien de grote diversiteit aan regio’s die betrokken zijn bij de initiatie en propagatie van aanvallen, zijn er reeds vele targets voor stimulatie onderzocht (figuur 2). In de jaren ’70 en ’80 van vorige eeuw werd DHS bij epilepsiepatiënten al toegepast in het cerebellum, de locus coeruleus, de caudate nucleus en de thalamus. Bij sommige patiënten leidde DHS reeds tot een reductie van aanvallen bij stimulatie van de anterieure thalamische nucleus (FISHER ET AL., 2010), de caudate nucleus, centromediane thalamische nucleus (VELASCO ET AL., 2006, 2007), het cerebellum (WRIGHT ET AL., 1984) de hippocampus (VELASCO ET AL., 2000, 2001b; BRAGIN ET AL., 2002; VONCK ET AL., 2002) en de subthalamische nucleus. Ook in diermodellen voor epilepsie leidde stimulatie van diverse targets tot aanvalsreductie (VERCEUIL ET AL., 1998; YANG

10

ET AL., 2006; ZU-GHE ET AL., 2007; WYCKHUYS ET AL., 2010a,b).

Figuur 2: Geteste stimulatieplaatsen voor de behandeling van epilepsie (LOCKMAN & FISHER, 2009).

1.4 De midline thalamische nuclei

1.4.1 Anatomie en functie

De midline thalamische nuclei (MTN) zijn een groep kleine kernen die bij ratten mediaal over de volledige dorsoventrale lengte van de thalamus gelegen zijn (figuur 3). Rostrocaudaal reiken ze van het meest rostrale punt van de thalamus tot ongeveer een derde van zijn totale lengte. De MTN behoren tot het Ascending Reticulair Activating System (ARAS) dat ontstaat in de reticulaire formatie van de middenhersenen. Ze zijn betrokken bij cognitieve functies en zouden corticale activering stimuleren, die leidt tot een verhoogde waakzaamheid (VAN DER WERF ET AL., 2002). Samen met de intralaminaire nuclei, werden deze kernen lang beschouwd als niet-specifieke kernen die diffuus projecteren naar de cortex. Deze nuclei zijn echter anatomisch en functioneel heterogeen. Ze ontvangen verschillende inputs van de hersenstam en projecteren naar specifieke targets in de prefrontale cortex, het striatum, de amygdala en de hippocampus (BENARROCH, 2008).

Figuur 3: De midline thalamische nuclei op coronale doorsnede bij de rat. Links: AP -1,88. Rechts: AP -2,30. PT parataeniale nucleus, PV paraventriculaire nucleus, IMD intermediodorsale nucleus, Rh rhomboïde nucleus, Re

reuniens nucleus (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

11

De MTN kunnen onderverdeeld worden in twee groepen naargelang hun subcorticale en corticale connecties. De dorsale midline groep, die de paraventriculaire nucleus (PV), de parataeniale nucleus (PT) en de intermediodorsale nucleus (IMD) bevat, heeft sterke connecties met de mediale prefrontale cortex, nucleus accumbens en de amygdala. Deze groep is betrokken bij viscero-limbische functies (VAN DER WERF ET AL., 2002). De PV zou een rol spelen bij viscerosensorische stimuli, controle van het circadiaan ritme (NASCIMENTO ET AL., 2008), emotie en chronische stress responsen.De ventrale midline groep bevat de reuniens nucleus (Re) en de rhomboïde nucleus (Rh) en projecteert naar de hippocampus, de parahippocampale cortex en associatieve corticale gebieden. Deze groep zou betrokken zijn in declaratief geheugen en multimodale sensorische verwerking (VAN DER WERF ET AL., 2002). De Re krijgt een diverse en wijdverspreide input van de cortex, de hippocampus, de basale voorhersenen, de amygdala, de hypothalamus en de hersenstam. Deze nucleus is betrokken bij het doorgeven van limbische informatie (emotioneel/cognitief) naar zijn targets (MCKENNA & VERTES, 2004).

1.4.2 De MTN als stimulatietarget

Sinds de ontdekking dat chirurgische verwijdering van mesiale structuren van de temporale kwab tot aanvalsonderdrukking kan leiden, wordt aangenomen dat de focus van MTLE aanvallen voornamelijk de hippocampus en de amygdala omvat (BERTRAM, 2009). De aanvallen lijken echter simultaan te ontstaan in meerdere temporale limbische structuren en gaan gepaard met pathologische veranderingen in zowel de amygdala en de hippocampus als in de entorhinale en de olfactorische cortex en sommige nuclei van de thalamus. De functionele anatomie van limbische epilepsie zou dus kunnen beschreven worden als meervoudige, onafhankelijke generatoren van aanvallen (BERTRAM, 2009). Deze diffuse verspreiding van het aanvalsbegin over het limbisch systeem zou volgens BERTRAM ET AL. (2001) kunnen veroorzaakt worden door een subcorticale structuur die werkt als gemeenschappelijke synchronizer. Deze structuur zou neuromodulatorische input leveren aan de aanvalsfoci en ervoor zorgen dat een potentiële aanval de aanvalsdrempel overschrijdt. Goede kandidaten voor deze rol zijn de MTN. Deze nuclei hebben sterke reciproke connecties met de limbische structuren (ANDRIOLI ET AL., 2009; BERTRAM, 2009) (figuur 4). Ook lijkt de aanvalsactiviteit in de MTN simultaan te starten met het aanvalsbegin geregistreerd in de hippocampus in verschillende proefdiermodellen voor MTLE (BERTRAM ET AL., 2001). Wanneer de MTN farmacologisch geïnactiveerd worden met lidocaïne, of wanneer de exciteerbaarheid van deze regio gemanipuleerd wordt, heeft dit een inhiberende invloed op de aanvalsactiviteit in de hippocampus van gekindlede ratten (BERTRAM ET AL., 2001, 2008). Daarenboven vertonen epileptische dieren anatomische en fysiologische veranderingen die de exciteerbaarheid van het thalamolimbisch circuit zouden veroorzaken, met aanvalsactiviteit als gevolg (BERTRAM ET AL., 2001). Ook toonden metabolische studies bij mensen een betrokkenheid aan van de MTN in limbische aanvallen (NORDEN & BLUMENFELD, 2002).Vooral het Rh/Re complex van de MTN heeft sterke excitatorische projecties naar de CA1 regio van de hippocampus (BERTRAM & ZHANG, 1999; BOKOR ET AL., 2002) en de entorhinale

12

cortex (VAN DER WERF ET AL., 2002). Bovendien gaat MTLE niet enkel gepaard met hippocampale sclerose en atrofie, maar ook met neuronaal verlies in de Re/Rh nuclei. Zowel in het Kaïnaat model als in het Pilocarpine model werd neuronaal verlies in de Re waargenomen (BERTRAM & SCOTT, 2000; BERTRAM ET AL., 2001). De ventrale midline groep van de MTN zou dus noodzakelijk kunnen zijn voor de versterking en verspreiding van aanvallen doorheen het systeem (BERTRAM ET AL., 2001).

Figuur 4: Connecties tussen limbische structuren en de MD en MTN. Dit diagram toont gekende pathways aan tussen limbische regio's die sterk geassocieerd zijn met aanvalsactiviteit en de MD (mediodorsale thalamische

nucleus) en MTN (BERTRAM, 2009).

1.5 De hippocampale commissuur

1.5.1 Anatomie en functie

Het telencephalon van zoogdieren bevat drie commissurale systemen: het corpus callosum, de anterieure commissuur en de hippocampale commissuur (figuur 5). De hippocampale commissuur bestaat uit een ventraal en een dorsaal vezelsysteem. De ventrale hippocampale commissuur (VHC) kruist de middellijn rostraal aan de caudale rand van het septum, net achter het interventriculair foramen en net rostraal aan het subfornicaal orgaan (figuur 5). De vezels lopen in de fimbria fornix naar voor, waar ze kruisen en contralateraal hun weg vervolgen naar de hippocampi. Bij de meeste zoogdieren (inclusief de rat) bevat deze pathway vele vezels en voorziet zij een sterke commissurale connectie tussen de twee hippocampi die ontstaat over de hele lengte van de hippocampale as. In tegenstelling tot knaagdieren, is bij primaten de VHC gereduceerd en bij apen is zijn oorsprong beperkt tot een klein deel van het rostrale gedeelte van de hippocampus binnen de uncus. Ook bij mensen vond men hier dun gemyeliniseerde vezels die de middellijn kruisen en die waarschijnlijk de commissurale vezels voorstellen (GLOOR ET AL., 1993).

13

De dorsale hippocampale commissuur (DHC) ontstaat uit het presubiculum en de entorhinale cortex, en in primaten ook uit de parahippocampale gyrus. Zijn vezels volgen de alveus en de fimbria tot ze de ventrale zijde van het splenium van het corpus callosum bereiken. Aan dit deel van het corpus callosum zijn ze vastgehecht, evenals aan de fimbria fornix, terwijl ze naar de contralaterale zijde kruisen (figuur 6). Ze dalen af naar de contralaterale hippocampale regio langs hetzelfde traject. Het DHC systeem is ook bij mensen goed ontwikkeld en vormt een aanzienlijke vezelbaan (GLOOR ET AL., 1993) die de commissura fornicis genoemd wordt.De normale functie van de DHC is nog niet opgehelderd. Deze vezels laten waarschijnlijk toe om informatie die initieel in de isocortex van de ene hemisfeer werd verwerkt, gedeeltelijk verder te verwerken door het contralateraal hippocampaal systeem (GLOOR ET AL., 1993).

Figuur 6: De fimbria fornix, met de commissura fornicis (naar psychology.wikia.com).

14

Figuur 5: Het limbisch systeem, met het corpus callosum, de anterieure commissuur en de fimbria fornix (naar www.med.wayne.edu).

1.5.2 De VHC als stimulatietarget

TLE gaat gepaard met hippocampale sclerose en verwijdering van mesiale temporale structuren kan aanvallen onderdrukken. Er is dan ook reeds veel aandacht geschonken aan de hippocampus en aan de anatomische en fysiologische veranderingen ervan die geassocieerd worden met de epileptische conditie (BERTRAM ET AL., 1998; BERTRAM & SCOTT, 2000; BERTRAM, 2009). Men toonde aan dat meer dan de helft van de patiënten een aanvalsvermindering van >50% vertoont door een behandeling met hippocampale DHS (VELASCO ET AL., 2001; VONCK ET AL., 2002; BOON ET AL., 2007).Bij proefdieren werd aangetoond dat stimulatieparameters die op µSPECT de meest uitgebreide hypoperfusie veroorzaakten, eveneens leidden tot de sterkste aanvalsonderdrukking (WYCKHUYS ET AL., 2010a, 2010c). Wellicht zou de efficiëntie van DHS in de hippocampus kunnen verhoogd worden door een groter volume van de hippocampus te beïnvloeden. Dit kan bekomen worden door de hippocampale commissuur te stimuleren. In de plaats van voornamelijk de regio binnen het elektrisch veld opgewekt door de elektrode te stimuleren, zou de stimulatie zich via de witte vezelbanen bilateraal naar een groot deel van de hippocampus kunnen verspreiden. Laag frequente stimulatie (3 Hz) in de VHC resulteerde in een significante reductie in aanvalsfrequentie en aanvalsduur (21% en 35%, p<0,05) in het genetisch Q54 model voor epilepsie. De vermindering in aanvalsfrequentie en – duur was niet onmiddellijk en had een blijvend effect na stopzetten van de stimulatie (KILE ET AL., 2010). De bescheiden reductie van 21% in aanvalsfrequentie zou kunnen verklaard worden doordat de betrokken hersenfoci in het Q54 model nog veel minder gelimiteerd zijn tot de temporale kwab dan in de modellen voor TLE. Vermoedelijk leidt stimulatie van de VHC in een proefdiermodel voor TLE, zoals het KA-model, tot een grotere aanvalsreductie.

15

2. Doelstellingen

Dit onderzoek draagt bij tot de optimalisatie van de behandeling van epilepsie met DHS. Meer specifiek streeft het de optimalisatie na van de stimulatieplaats voor DHS. Het effect van DHS in twee verschillende stimulatieplaatsen werd geëvalueerd in het KA-model, een diermodel voor TLE met spontane aanvallen.

Dit onderzoek omvatte drie doelstellingen:

1) Optimalisatie van de coördinaten voor de implantatie van de DHS elektrode in de VHC2) Evaluatie van het effect van DHS in het Re/Rh-complex van de MTN3) Evaluatie van het effect van DHS in de VHC

De hypothese luidt dat stimulatie in beide targets leidt tot een lagere aanvalsfrequentie en/of aanvalsduur.

Om dit effect te evalueren werd het EEG van de ratten continu geregistreerd (24u/24u). Voor elke rat werden de aanvalsfrequentie en –duur tijdens een periode van vijftien dagen vóór de stimulatie (baseline EEG) vergeleken met de aanvalsfrequentie en –duur tijdens een stimulatieperiode van tien dagen. Om na te gaan of de stimulatie na stopzetten een blijvend effect veroorzaakt had, werden eveneens de aanvalsfrequentie en –duur tijdens een periode van vijftien dagen na stimulatie (wash-out) vergeleken met de aanvalsfrequentie en –duur tijdens baseline – en stimulatieperioden.

16

17

3. Materiaal en methoden

Het gehele onderzoek werd uitgevoerd in het Laboratorium voor Klinische en Experimentele Neurofysiologie (LKEN) in het UZ Gent, tenzij anders vermeld.

3.1 Aanmaak van de elektrodes

3.1.1 Scalpelektrode en referentie-elektrode

De scalpelektrode werd gebruikt om oppervlakte-EEG ter hoogte van de frontale cortex te registreren. Hetzelfde type elektrode diende als referentie-elektrode voor het scalp- en diepte EEG. Deze elektrodes werden gemaakt door een stukje dunne geïsoleerde koperdraad aan één kant te solderen aan een juweliersschroefje (1,57 mm, Bilaney, Duitsland) en aan de andere kant aan een connectiepin. De overgang tussen de draad en de connectiepin werd geïsoleerd met krimpkous (figuur 7A).

3.1.2 Quadripolaire registratie-elektrode

Voor diepte-EEG-registratie werd gebruik gemaakt van een quadripolaire elektrode (figuur 7B). Er werden vier fijne roestvrije stalen draden met polyimide coating (125 µm diameter, Bilaney, Duitsland) aan elkaar gelijmd met secondelijm. De uiteinden werden onder een binoculaire microscoop op 1 mm van elkaar afgesneden, waardoor de tip van de kortste draad 3 mm verwijderd was van die van de langste draad (figuur 7D). De vier losse uiteinden aan de andere kant werden afzonderlijk gesoldeerd aan een connectiepin. Opnieuw werd de overgang tussen de draad en de connectiepin geïsoleerd met krimpkous.

3.1.3 Bipolaire stimulatie-elektrode

Om de stimulatie toe te dienen werd een bipolaire elektrode gebruikt (figuur 7C). Deze werd op een gelijkaardige manier gemaakt als de quadripolaire elektrode, maar dan met twee draden (125 µm, Bilaney, Duitsland) waarvan de uiteinden op 1 mm van elkaar werden afgesneden (figuur 7E).

Figuur 7: De elektrodes. A. Scalpelektrode, B. Quadripolaire registratie-elektrode, C. Bipolaire stimulatie-elektrode, D. Elektrodetip quadripolaire elektrode, E. Elektrodetip bipolaire elektrode.

18

3.2 Dieren

Mannelijke Sprague-Dawley ratten (Harlan, Nederland) werden behandeld volgens de regels van het Europees ethisch comité (decreet 86/609/EEC). Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van UZ Gent (ECP 04/08). Zowel voor als tijdens het experiment, werden de ratten onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden gehouden (12u normaal licht/donker cycli; 20-23°C en 50% relatieve vochtigheid) met voedsel en water ad libitum. Tijdens het experiment kregen de ratten een nestlet als kooiverrijking (figuur 8).

3.3 Optimalisatie van de coördinaten

De quadripolaire en bipolaire diepte-elektrodes werden geïmplanteerd met behulp van een stereotactisch kader (David Kopf instruments, USA). Als referentiepunt op de schedel werd bregma gebruikt. Dit is de plaats op de schedel waar de sutura sagittalis en de sutura coronalis samenkomen (figuur 9). In de stereotactische atlas van PAXINOS EN WATSON (1998) kan worden opgezocht hoe ver een gegeven locatie in de hersenen verwijderd is van bregma volgens de anteroposterieure (AP), mediolaterale (ML) of dorsoventrale (DV) as. De coördinaten uit deze atlas moesten voor dit onderzoek enigszins worden aangepast. De atlas is namelijk bedoeld voor ratten met een gewicht van 250-350 g (PAXINOS & WATSON, 1998), terwijl de ratten in dit experiment 300-510 g wogen.

Figuur 9: Locatie van bregma (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

Om na te gaan of de juiste structuren werden gestimuleerd, werden na de DHS-experimenten de locaties van de stimulatie-elektroden histologisch geïdentificeerd (3.4.6 Transcardiale perfusie en histologie).

19

Figuur 8: Een rat in de opstelling voor EEG-afname.

3.3.1 De hippocampus

De coördinaten voor de implantatie van de registratie-elektrode in de rechter hippocampus (AP -5,60; ML -5,10; DV -7,40; figuur 10) werden overgenomen uit voorgaand onderzoek in het LKEN (WYCKHUYS ET AL., 2010c).

Figuur 10: Registratie-elektrode in de rechter hippocampus (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

3.3.2 De MTN

Voor de implantatie van de stimulatie-elektrodes in de MTN werd gebruik gemaakt van coördinaten die in een vorige masterproef in het LKEN geoptimaliseerd werden aan de hand van 22 ratten (VAN ZEVEREN, 2010). Deze coördinaten werden enigszins aangepast, gezien in het huidige experiment de elektroden werden geïmplanteerd onder een hoek van 12° ten opzichte van de verticale as in de plaats van 5°. Deze aanpassing was noodzakelijk om de sagittale sinus te vermijden (VAN ZEVEREN, 2010). De stimulatie-elektrode werd geïmplanteerd met volgende coördinaten: -2,3 AP; -2,0 ML; -8.4 DV; 12° (figuur 11).

Figuur 11: Stimulatie-elektrode in de MTN (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

20

3.3.3 De VHC

De ratten (n=4, gewicht: 394g +24g) werden geanestheseerd met een mengsel van isofluraan (5% tijdens de inductie, 2% tijdens de operatie) en medische O2 en vervolgens in een stereotactisch kader geplaatst. Na het blootleggen van de schedel, werden drie kleine gaten geboord. Eén voor de bipolaire stimulatie-elektrode en twee voor de verankeringschroefjes. De stimulatie-elektrode werd stereotactisch geïmplanteerd met volgende coördinaten: -2,3 AP; -1,5 ML; -4,5 DV (PAXINOS EN WATSON, 1998, figuur 12). De elektrode werd aan de schedel en de schroefjes gecementeerd met acryl tandcement (Belgica Dental, België).

Figuur 12: Stimulatie-elektrode in de VHC (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

De rat werd diep geanestheseerd met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een overdosis pentobarbital (Nembutal, 180 mg/kg) en de toevoer van isofluraan werd gestopt. Hierna werd voor 10 s een gelijkstroom van 10 V over de beide stimulatiepolen gegeven om een ijzerafzetting in het omliggend weefsel te veroorzaken. De kop werd ontdaan van vacht, spieren en onderkaak en in een oplossing van 98% paraformaldehyde (4%) en 2% ferrocyanide ondergedompeld. De gevormde ijzerafzetting reageert met het ferrocyanide en veroorzaakt een blauwkleuring rond de elektrodetippen. De dag nadien werden de hersenen uit de schedel verwijderd, en opnieuw in een oplossing van 98% paraformaldehyde (4%) en 2% ferrocyanide opgeborgen. De volgende dag werd een coupe van + 1 mm gemaakt ter hoogte van het gaatje dat de elektrode achterliet in de hersenen. Deze coupe werd onder een binoculaire microscoop bekeken om de plaatsing van de elektrode te verifiëren aan de hand van de gevormde blauwkleuring. De coördinaten werden lichtjes aangepast en een laatste rat werd geopereerd om deze nieuwe coördinaten te testen alvorens de eerste operaties voor het DHS-experiment te starten.

21

3.4 DHS-experimenten

3.4.1 Experimenteel protocol

Er werden twee DHS-experimenten uitgevoerd, één met de MTN en één met de VHC als stimulatietarget. Beide experimenten verliepen volgens het protocol weergegeven in figuur 13. Na de operatie kregen de ratten minstens een week rust in hun vertrouwde kooi in het animalarium, alvorens de continue EEG-afname gestart werd in een daarvoor voorziene opstelling. Om de baseline aanvalsfrequentie en –duur te bepalen, werd eerst het EEG van de ratten vijftien dagen opgenomen. Hierna kregen de ratten tien dagen continue DHS (3.4.5 Diepe hersenstimulatie). Tenslotte volgde een wash-out periode van vijftien dagen om na te gaan of de DHS een blijvend effect veroorzaakt had.

3.4.2 SE inductie en selectie

De ratten (n=89) (175g +3g) werden i.p. geïnjecteerd met KA (Cambridge Pharma Chem, USA) volgens het protocol van HELLIER ET AL. (1998). Er werd elk uur KA (5mg/kg) toegediend tot een stabiele zelfonderhoudende SE waargenomen werd van meer dan drie uur. Bij ratten met overdreven motorische activiteit of overdreven lethargie werd de dosis gehalveerd. Na ongeveer 55 dagen werden alle ratten gedurende zes uur geobserveerd. De ratten (n=20) die tijdens de observatie meer dan twee tonisch-clonische aanvallen vertoonden, werden geselecteerd voor implantatie.

3.4.3 Implantatie van de elektrodes

Voor de operatie werd het oppervlak en het stereotactisch kader gedesinfecteerd met ethanol (70%) en werd het gesteriliseerde materiaal klaargelegd (figuur 14A). Er werd een warmtekussentje op de operatietafel gelegd om hypothermie te voorkomen.De geselecteerde ratten (n=20, gewicht: 403g +25g) werden geanestheseerd met een mengsel van isofluraan (5% tijdens de inductie, 2% tijdens de operatie) en medische O2

(figuur 14B) en vervolgens in het stereotactisch kader geplaatst. Er werd een vochtig doekje over de ogen gelegd om uitdroging te voorkomen.

22

Figuur 13: Schematische voorstelling van het experimenteel protocol van de twee DHS-experimenten.

Figuur 14: Implantatie van de elektrodes. A. Materiaal, B. Anesthesie, C. Geboorde gaten, D. Implantatie registratie-elektrode, E. Cementeren, F. Connector.

Na het blootleggen van de schedel, werden tien kleine gaten geboord: zes voor de positionering van de verankeringsschroefjes, twee voor de diepte-elektrodes, één voor de aarding en één om oppervlakte-EEG te meten (figuur 14C, 15). Op de linkerzijde van de schedel ter hoogte van de frontale cortex werd de oppervlakte-EEG elektrode geplaatst. De referentie-elektrode werd geplaatst op de rechterzijde, posterieur van de sutura lambdoidea. De diepte-elektrodes werden stereotactisch geïmplanteerd t.o.v. bregma: de registratie-elektrode (figuur 14D) in de rechter hippocampus (-5,6 AP; +5.1 ML; -7.4 DV) en de stimulatie-elektrode ofwel in de MTN (n=8; -2,3 AP; -2,0 ML; -8,4 DV; 12°) ofwel in de VHC (n=12; -2,3 AP; -1,2 ML; -4,7 DV). De elektrodes werden naar een connector geleid (figuur 14E,F) die met acryl tandcement (Belgica Dental, België) gefixeerd werd aan de schroeven en de schedel.

Figuur 15: Overzicht van de elektrodes en schroefjes op een rattenschedel (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

23

3.4.4 EEG-afname en data analyse

Na de operatie kregen de ratten minstens een week rust in het centraal animalarium, alvorens ze in de opstelling werden geplaatst voor continue EEG-monitoring (figuur 16). De EEG-signalen werden eerst gestabiliseerd door een voorversterker en vervolgens versterkt door een versterker (x510) voor ze via NI-DAQ kaart (National Instruments, USA) naar een computer gestuurd werden. Tijdens de DHS-periode werden de stimulatie-elektrodes aan de stimulatoren aangesloten. Al deze bedrading was verbonden via een swivel die de dieren in staat stelt zich vrij te bewegen. Tijdens de gehele proef werd continu EEG opgenomen. De EEG analyse werd offline uitgevoerd met behulp van met MATLAB R2007 geprogrammeerde software.

Er werden vier registratie-kanalen opgenomen (figuur 17); het eerste kanaal gaf het EEG-signaal van de oppervlakte-elektrode op de linkerzijde van de schedel ter hoogte van de frontale cortex, de drie andere het EEG-signaal van de diepte-registratie elektrode in de rechter hippocampus.Enkel de epileptische aanvallen van minstens tien seconden die zich gegeneraliseerd hadden naar de contralaterale scalpelektrode, werden aangeduid. Het begin van de aanvallen werd typisch gekenmerkt door een grote positieve of negatieve potentiaal, gevolgd door een toename in oscillatiefrequentie en/of een daling van de amplitude, gevolgd door een stijging in amplitude en frequentie. Het begin en het einde van de aanvallen werden aangeduid zoals weergegeven in figuur 17.

Figuur 17: Twee aangeduide aanvallen (verticale stippellijnen duiden begin en einde van de aanvallen aan).

24

Figuur 16: De opstelling voor EEG-afname en stimulatie

3.4.5 Diepe hersenstimulatie

De ratten kregen gedurende tien dagen continue DHS met een intensiteit van 100 µA toegediend via de bipolaire stimulatie-elektrode. De rechthoekige golfpulsen waren bifasisch, hadden een pulsbreedte van 100 µs per fase en waren lading-gebalanceerd. Dit betekent dat de totale lading die werd geleverd tijdens de positieve fase gelijk was aan de totale lading in de negatieve fase.De pulsen werden gegeven met Poisson verdeelde interpuls intervallen (PVS) met een gemiddeld interval van 7,69 ms (of 1/130 s) en dus een gemiddelde frequentie van 130 Hz (figuur 18).

Figuur 18: De Poisson verdeelde stimulatie. Het gemiddelde interpuls interval duurde 7,69 ms, waardoor de gemiddelde frequentie 130 Hz bedroeg (WYCKHUYS ET AL., 2010a).

Er werd een constant-current pulsgenerator gebruikt. Deze levert een bepaalde stroom en zal automatisch de spanning aanpassen afhankelijk van de variërende impedantie. Aangezien de neuronale klinische respons voornamelijk wordt bepaald door de geleverde elektrische stroom zou het moeilijker zijn klinische effecten van DHS te vergelijken tussen ratten wanneer met een constant-voltage stimulator wordt gewerkt (MONTGOMERY, 2010).Gedurende de stimulatieperiode van tien dagen werd dagelijks de impedantie berekend, na de meting van de spanning over het circuit met een oscilloscoop (figuur 19). Dit was nodig om na te gaan of de rat continu gestimuleerd werd. Bij deze meting werd nagegaan of het circuit gesloten was, er geen kortsluiting was opgetreden, en of de impedantie niet te hoog opliep waardoor de spanning die de stimulator moest leveren zijn maximum (= 40 V) zou overschrijden. Op de oscilloscoop kon eveneens de pulsduur gecontroleerd worden en kon worden nagegaan of er geen gelijkstroomcomponent in de stroom zat. De stroom moet namelijk een zuivere wisselstroom zijn, aangezien ladingsophoping kan leiden tot neuronale schade (MONTGOMERY, 2010).

25

Figuur 19: Meten van de impedantie. 1. Eerst werd geverifieerd of er aan 100 µA gestimuleerd werd door te spanning (= 1 V) te meten over een weerstand van 10 kΩ. 2. Vervolgens werd de spanning over het hele circuit

gemeten om de totale impedantie te bepalen. 3. Uit deze totale impedantie werd de impedantie in de rat berekend.

3.4.6 Transcardiale perfusie en histologie

Na de wash-out periode werden de ratten diep geanestheseerd door toediening van pentobarbital (180 mg/kg, i.p.). Hierna werd voor 10 s een gelijkstroom van 10 V over de beide stimulatiepolen gegeven om een ijzerafzetting in het omliggend weefsel te veroorzaken. De ratten werden transcardiaal geperfuseerd met phosphate-buffered saline (PBS), gevolgd door paraformaldehyde (4%). De hersenen werden minstens twee dagen verder gefixeerd in een oplossing van 98% paraformaldehyde (4%) en 2% ferrocyanide. Dit ferrocyanide reageert met de eerder gevormde ijzerafzetting waardoor een blauwkleuring rond de elektrodetippen ontstaat. Vervolgens werden de hersenen enkele dagen in een oplossing van 30% sucrose gebracht voor cryoprotectie. Hierna werden de hersenen bewaard in een diepvries (-20 °C). In het Innovative Flemish IN vivo TechnologY lab (INFINITY-Ugent) werden vervolgens coronale vriescoupes (70 µm) gesneden met een vriesmicrotoom (Leica CM3050 S, Leica Microsystems). Deze coupes werden op draagglaasjes aangebracht en gekleurd met een Nissl kleuring (0,1% Cresyl Violet Acetaat). Aan de hand van een binoculaire microscoop werd de locatie van de elektroden geïdentificeerd. Een onderzoeker die blind was voor de respons van de ratten in aanvalsfrequentie en –duur, controleerde eveneens de locatie van de elektrodetippen om een onbevooroordeelde verificatie te garanderen.

26

3.4.7 Statistische analyse

De data worden weergegeven als gemiddelde +/- standaard afwijking van het gemiddelde (Standard Error of the Mean, SEM). De aanvalsfrequenties van de drie periodes (baseline, stimulatie en wash-out) werden met elkaar vergeleken door middel van de niet-parametrische Friedman test. Om na te gaan tussen welke periodes aanvalsfrequenties significant verschillend waren, werd een post hoc analyse uitgevoerd met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon signed ranks test. Omdat meerdere (drie) periodes met elkaar vergeleken werden, diende het significantieniveau van de individuele post hoc testen gecorrigeerd te worden met een Bonferroni correctie. Na deze correctie, werd voor de individuele testen een P-waarde < 0,017 (= 0,05/3) beschouwd als significant verschillend.

27

4. Resultaten

5.

6.

4.1 Optimalisatie van de VHC-coördinaten

Van de vier ratten was er één rat waarbij de elektrode te ver posterieur was geïmplanteerd (figuur 20, A), terwijl deze bij de drie andere ratten juist zat op de AP-as. Bij deze ratten zat de elektrode in de VHC (figuur 20, B en C). De AP-coördinaat (-2,3 mm) werd niet gewijzigd. Aangezien de elektrode bij de drie ratten op de rand van de VHC zat, werd de coördinaat van de ML-as 0,3 mm naar het midden toe verschoven (van -1,5 mm naar -1,2 mm) en werd de diepte aangepast van -4,5 mm naar -4,7 mm.

Dit leidde tot de geoptimaliseerde coördinaten voor de VHC: -2,3 AP; -1,2 ML; -4,7 DV.

28

Figuur 20: Coupes (+ 1mm) met elektrodetract. De pijl duidt de positie van de elektrodetip aan.A. Elektrode in de hippocampus (te veel posterieur), B. en C. Elektrode in de VHC.

4.2 DHS-experimenten

4.2.1 Histologie

4.2.1.1 De MTN

Bij acht ratten werd de stimulatie-elektrode geïmplanteerd met volgende coördinaten: -2,3 AP; -2,0 ML; -8,4 DV. Bij één van deze ratten was er te veel weefselschade door de retractie van de elektrode, waardoor verificatie van de locatie onmogelijk was. Figuur 21 toont de locatie van de diepste elektrodetip van de zeven overblijvende ratten.Bij geen enkele rat zat de elektrodetip in de MTN. Wel zat de stimulatie-elektrode bij twee ratten in de VHC. Deze twee ratten werden gebruikt voor analyse van het effect van DHS in de VHC.

Figuur 21: Locatie van de elektrodes bij gebruik van de coördinaten van de MTN. De bedoelde stimulatieplaats (Re/Rh-complex van de MTN) is groen omcirkeld. De coupes liggen geordend van anterieur naar posterieur. VHC ventrale hippocampale commissuur, MPO mediale preoptische nucleus, AHP posterieur deel van het anterieur hypothalamisch gebied, Pe periventriculaire hypothalamische nucleus, MD mediodorsale nucleus, Re reuniens

nucleus, Rh rhomboïde nucleus (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

29

4.2.1.2 De VHC

Bij twaalf ratten werd de stimulatie-elektrode geïmplanteerd met volgende coördinaten: -2,3 AP; -1,2 ML; -4,7 DV. Op figuur 22 werd telkens de locatie van de diepste elektrodetip aangeduid met een rode stip.

Figuur 22: Locatie van de elektrodes bij gebruik van de coördinaten van de VHC. Links: Foto's van drie verschillende ratten genomen tijdens het snijden van de coupes. Rechts: Locatie van de elektrodes van de

twaalf ratten. CC corpus callosum, VHC ventrale hippocampale commissuur (naar PAXINOS & WATSON, 1998).

Bij tien ratten zat de elektrode op de juiste positie, bij twee ratten zat ze in het corpus callosum. Figuur 23 toont foto’s van coupes van drie verschillende ratten met elektrode in de VHC.

Figuur 23: Drie coupes met elektrodenpositie in de VHC. De pijlen duiden de locaties aan van de diepste

30

elektrodetippen.

4.2.2 Evaluatie van het effect van DHS

De ratten die stierven of hun elektrodes kwijtraakten voor het einde van de stimulatieperiode, werden uit de analyse gelaten. Er werden elf ratten gestimuleerd in de VHC (ratten VHC1 tot VHC11). Bij drie ratten bleek na meting van de impedantie dat het circuit niet gesloten was, en dat zij dus niet gestimuleerd werden (ratten NS1 tot NS3). Drie ratten uit het MTN-experiment werden gestimuleerd op een andere locatie, namelijk: het posterieur deel van het anterieur hypothalamisch gebied (rat AHP), de mediodorsale thalamische nucleus (rat MD) en het mediaal preoptisch gebied (rat MPO). Hieronder volgt een evaluatie van het effect van DHS, met nadruk op stimulatie van de VHC.

4.2.2.1 Effect op aanvalsduur

Figuur 24 toont de gemiddelde aanvalsduur van de drie behandelingsperiodes voor elke rat die VHC-stimulatie kreeg. Deze resultaten blijken inconsistent te zijn; vaak verandert de aanvalsduur bij stimulatie niet veel, soms stijgt ze of daalt ze. Gemiddeld over alle ratten wordt een zeer lichte, niet-significante daling in aanvalsduur waargenomen van 4% (+/- 10%).

Figuur 24: Effect van VHC-stimulatie op de aanvalsduur. Per rat wordt de gemiddelde aanvalsduur in de drie periodes weergegeven.

4.2.2.2 Effect op aanvalsfrequentie

Bij vergelijking van de gemiddelde dagelijkse aanvalsfrequenties van alle ratten met VHC-stimulatie (n=11) over de drie behandelingsperiodes wordt een significante daling in aanvalsfrequentie waargenomen van 52% (p<0,01) tijdens de VHC-stimulatie ten opzichte van de baseline periode (figuur 25).De gemiddelde aanvalsfrequentie tijdens de wash-out periode verschilt niet significant van die in de baseline periode, maar ook niet van de gemiddelde aanvalsfrequentie in de stimulatie periode. Bij aanschakelen van de stimulatie, had dit effect op de aanvalsfrequentie

31

vanaf de eerste dag. Na stopzetten van de stimulatie, blijft de aanvalsfrequentie initieel laag, maar stijgt ze weer vanaf de veertiende dag. Voor de elf ratten afzonderlijk, wordt het verloop van de aanvalsfrequentie over de drie behandelingsperiodes weergegeven in de bijlage.

Figuur 25: De gemiddelde aanvalsfrequentie (in aantal aanvallen per dag) voor alle ratten met VHC-stimulatie (n=11) als functie van de dag. De baseline-periode (15 dagen) werd gevolgd door 10 dagen DHS en dan 15 dagen wash-out. De blauwe horizontale lijnen geven het gemiddelde en de SEM weer voor elke periode

(uitgemiddeld over de 11 ratten) (* p<0,01; over de behandelingsperiodes).

Figuur 26 geeft een gemiddelde circadiane curve van de aanvalsfrequentie weer tijdens de stimulatie, vergeleken met deze in de baseline periode. Er werd een schalingsfactor gebruikt om aan te geven dat DHS de aanvalsfrequentie wel deed dalen, maar weinig effect had op het circadiaan ritme van de aanvalsfrequentie.

Figuur 26: Het gemiddeld aantal aanvallen per uur voor alle ratten met VHC-stimulatie (n=11) tijdens de baseline periode en tijdens de 10 dagen stimulatie als functie van het uur van de dag. De zwarte continue lijn

geeft de baseline waardes weer die verminderd werden met 48%. Dit illustreert dat de vorm van het circadiaan ritme tijdens de stimulatie behouden blijft in vergelijking met de baseline curve, en dat enkel de amplitude van

de curve verlaagd is met gemiddeld 48%.

32

In tabel 2 en figuur 27 zijn de gemiddelde aanvalsfrequenties van alle ratten met VHC-stimulatie (n=11) te zien tijdens de drie verschillende behandelingsperiodes. Gezien de respons van de ratten op stimulatie sterk varieerde, liet dit toe de ratten op te delen in responders en non-responders. Een responder wordt hier gedefinieerd als een rat met een daling in aanvalsfrequentie van minstens 50% tijdens VHC-stimulatie ten opzichte van baseline. Zes (55%) van de 11 ratten zijn responders, met een reductie in aanvalsfrequentie van 53% tot 94%. Drie (60%) van de 5 non-responders, vertonen wel een duidelijke daling in aanvalsfrequentie (tussen 30 en 50%).

RatAanvalsfrequentie (aantal aanvallen / dag) Verschil Baseline

en StimulatieBaseline Stimulatie Wash-outVHC1VHC2

32 (+/-1)12 (+/- 2)

2 (+/-1)1 (+/- 1)

4 (+/-1)4 (+/- 1)

-94%-92% Responders

VHC3 54 (+/- 2) 14 (+/- 2) 33 (+/- 2) -73%VHC4 34 (+/- 2) 14 (+/- 2) 7 (+/- 1) -58%VHC5 30 (+/- 1) 13 (+/- 1) 17 (+/- 1) -56%VHC6 2 (+/- 1) 1 (+/- 1) 2 (+/- 1) -53%VHC7 35 (+/- 2) 19 (+/- 1) 27 (+/- 1) -46% N

on-responders

VHC8 28 (+/- 1) 17 (+/- 1) 53 (+/- 2) -40%VHC9 47 (+/- 3) 32 (+/- 2) 25 (+/- 2) -32%

VHC10 44 (+/- 2) 38 (+/- 4) 32 (+/- 1) -11%VHC11 26 (+/- 1) 26 (+/- 1) 32 (+/- 2) +3%

Tabel 2: Aanvalsfrequentie van de ratten met VHC-stimulatie. De waarden zijn weergegeven als gemiddelde (+/- SEM). Ratten met een aanvalsreductie van minstens 50% worden beschouwd als responders.

Figuur 27: Effect van VHC-stimulatie op de aanvalsfrequentie. Per rat worden de gemiddelde aanvalsfrequenties van de drie behandelingsperiodes (baseline = 15 dagen, stimulatie = 10 dagen, wash-out = 15 dagen)

weergegeven.

33

Ter illustratie van het belang van de elektrodepositie en van de stimulatie, wordt in tabel 3 en figuur 28 het verschil in aanvalsfrequentie over de drie periodes weergegeven voor elke rat die niet gestimuleerd werd (NS1 tot NS3) of waarbij de stimulatie-elektrode niet in de VHC zat (AHP, MD en MPO). Enkel bij stimulatie van de mediodorsale thalamische nucleus (rat MD) is er een lichte daling in aanvalsfrequentie te zien bij vergelijking van de gemiddelde aanvalsfrequentie in de baseline periode met deze in de stimulatie periode (-14%).

RatAanvalsfrequentie (aantal aanvallen / dag) Verschil

Baseline en Stimulatie

Baseline Stimulatie Wash-out

NS1 42 (+/- 2) 65 (+/- 2) 74 (+/- 3) +54%NS2NS3

18 (+/- 1)17 (+/- 1)

26 (+/- 2)18 (+/- 1)

21 (+/- 1)23 (+/- 1)

+42%+8%

AHP 33 (+/- 1) 45 (+/- 2) 39 (+/- 1) +35%MD 21 (+/- 1) 18 (+/- 1) 22 (+/- 1) -14%

MPO 26 (+/- 1) 27 (+/- 1) 27 (+/- 1) +3%

Tabel 3: Aanvalsfrequentie van de ratten die niet gestimuleerd werden (NS1 tot NS3) en de ratten die op een andere plaats gestimuleerd werden. AHP posterieur deel van het anterieur hypothalamisch gebied, MD

mediodorsale thalamische nucleus, MPO mediaal deel van het preoptisch gebied. De waarden zijn weergegeven als gemiddelde (+/- SEM).

Figuur 28: De gemiddelde aanvalsfrequenties (aantal per dag) van de drie behandelingsperiodes (baseline = 15 dagen, stimulatie = 10 dagen, wash-out = 15 dagen) voor elke rat. NS niet gestimuleerd, AHP posterieur deel van het anterieur hypothalamisch gebied, MD mediodorsale nucleus, MPO mediaal deel van het preoptisch

gebied.

34

5. Discussie

5.1 Optimalisatie van de MTN-coördinaten

Voor de start van de DHS-experimenten, dienden de coördinaten van de VHC geoptimaliseerd worden. De MTN-coördinaten werden reeds geoptimaliseerd in een voorafgaande masterproef (VAN ZEVEREN, 2010). Tijdens de histologie van het huidige MTN-experiment bleek, net zoals tijdens de voorafgaande optimalisatie, dat het zeer moeilijk is om de MTN te targetten. Bij zes van de zeven ratten zat de elektrode te ver anterieur. De AP-coördinaat zou dus moeten aangepast worden. De drie ratten waarbij de elektrode te dorsaal gepositioneerd was, hadden mogelijks een dikkere schedel dan de rest, aangezien ze alle drie een half jaar ouder waren. In het VHC-experiment zat de elektrode bij 83% van de geïmplanteerde ratten op de juiste locatie. Zelfs met een meer homogene groep dieren en een aanpassing van de AP-coördinaat, is het nog steeds moeilijker om de MTN te targetten dan de VHC: de VHC strekt zich namelijk zowel DV (-3,2 tot -4,6) als ML (-2,4 tot +2,4) over een groter gebied uit dan de MTN (DV: -6,4 tot -7,6; ML: -0,4 tot +0,4). Daarom hebben we besloten om het MTN-experiment niet nogmaals te herhalen en ons toe te leggen op stimulatie van de VHC.

5.2 Het effect van VHC-stimulatie

Het effect op de aanvalsfrequentie en aanvalsduur van continue DHS (10 dagen) van de VHC met Poisson verdeelde stimulatie (PVS) werd onderzocht in het KA-model. Dit onderzoek toonde aan dat VHC-stimulatie met PVS leidt tot een significante reductie in aanvalsfrequentie van gemiddeld 52% (p<0,01) bij ratten met spontane aanvallen (n=11). Vijfenvijftig procent van de ratten vertoonden een reductie in aanvalsfrequentie van >50% (met een range van 53% tot 94%). Eerder werd in hetzelfde diermodel reeds aangetoond dat PVS van de hippocampus bij 54% van de ratten (n=13) leidde tot een significante reductie van het aantal spontane aanvallen van gemiddeld 33% (p<0,01) (WYCKHUYS ET AL., 2010a). PVS in de VHC lijkt dus beter de aanvallen te onderdrukken dan hippocampale PVS. Deze grotere aanvalsonderdrukking wordt vermoedelijk veroorzaakt door een grotere beïnvloeding van de hippocampi door VHC-stimulatie in vergelijking met unilaterale stimulatie. De VHC innerveert namelijk een groot deel van de CA1 en CA3 regio’s van de hippocampus en bevat voornamelijk witte vezelbanen die een lagere exciteerbaarheid hebben dan cellichamen (zie 5.4 Het werkingsmechanisme van DHS). Wegens de heterogeniteit van het weefsel rond de stimulatie-elektrode bij unilaterale hippocampale stimulatie, is het moeilijk het exacte volume te bepalen dat beïnvloed wordt. Mathematische modellen die rekening houden met deze heterogeniteit werden wel reeds op punt gesteld voor stimulatie van de subthalamische nucleus bij de behandeling van de ziekte van Parkinson (o.a. BUTSON & MCINTYRE, 2008). Om een schatting te maken van het verschil in volume dat beïnvloed wordt bij VHC-stimulatie ten opzichte van unilaterale hippocampale stimulatie, is bijkomend onderzoek nodig met i) intracraniële elektrofysiologische metingen, ii) medische beeldvorming of iii) mathematische modellen.

35

Stimulatie van de VHC werd reeds uitgevoerd in het genetisch Q54 model voor epilepsie: Laag frequente stimulatie (LFS, 3 Hz) van de VHC leidde bij 67% van de ratten (n=6) tot een significante reductie (21%, p<0,05) in aanvalsfrequentie (KILE ET AL., 2010). De bescheiden daling in aanvalsfrequentie in vergelijking met de resultaten uit het huidige onderzoek, is mogelijks te wijten aan het gebruik van een ander diermodel. De hersenfoci betrokken bij de generatie van aanvallen in het Q54 model zijn namelijk nog veel minder beperkt tot de temporale kwab dan in de modellen voor TLE. Het aanvalsreducerend effect van de LFS van de VHC in het Q54 model bleef behouden tijdens de vier geregistreerde dagen na de stimulatie (KILE ET AL., 2010). In de huidige studie werd eveneens een blijvend effect geobserveerd: de aanvalsfrequentie bleef gereduceerd tot dertien dagen na het stopzetten van de stimulatie. In hetzelfde diermodel, bij unilaterale hippocampale PVS, stijgt de aanvalsfrequentie echter onmiddellijk terug na het stopzetten van de stimulatie (WYCKHUYS ET AL., 2010a). Mogelijks wordt dit verschil veroorzaakt doordat er ofwel andere werkingsmechanismen aan de basis liggen van stimulatie van de VHC tegenover unilaterale hippocampale stimulatie, ofwel een laesie-effect wordt teweeg gebracht bij implantatie in - of stimulatie van - de VHC. Het zou interessant zijn om in volgende experimenten het EEG van de ratten langer te monitoren na de stimulatie. Dit om na te gaan of de aanvalsfrequentie na vijftien dagen volledig terugkeert naar de baseline aanvalsfrequentie en of deze stabiel blijft.

Uit deze studie bleek dat DHS in de VHC in het KA-model het circadiaan ritme van de aanvalsfrequentie niet beïnvloedt en geen consistent effect heeft op de aanvalsduur. Dit werd eerder aangetoond bij hippocampale DHS in hetzelfde proefdiermodel (WYCKHUYS ET AL., 2010a). Eens een TLE aanval begonnen is, wordt zijn duur blijkbaar niet beïnvloed door stimulatie. LFS in de VHC bij muizen met een natriumkanaal disfunctie, resulteerde echter wel in een significante reductie in aanvalsduur (35%, p<0,05, KILE ET AL., 2010). Dit verschil in effect van DHS is te verklaren doordat, in diverse diermodellen, de epileptogene netwerken verschillend kunnen zijn, of de netwerken op verschillende plaatsen gesitueerd kunnen zijn.

Ook tussen ratten in hetzelfde diermodel, blijkt er een grote variatie te zijn in respons op DHS in de VHC: er waren in dit onderzoek duidelijk ratten met een veel betere respons dan andere. Gelijkaardige observaties werden beschreven in humane studies over hippocampale DHS (VELASCO ET AL., 2000, 2001b; VONCK ET AL., 2002; BOON ET AL., 2007). De opdeling in een groep responders en non-responders gebeurde arbitrair op basis van de reductie in aanvalsfrequentie. De zes ratten met een aanvalsreductie van minstens 50% werden beschouwd als responders. De verschillende respons van de ratten kan veroorzaakt worden door de variabiliteit in genetische achtergrond, alsook door kleine verschillen in de locatie van de stimulatie-elektroden. Deze grote variatie tussen de ratten kan verschillende waarden veroorzaken tussen groepen, afhankelijk van de samenstelling. Daarom is het belangrijk dat de ratten voor statistische analyse als hun eigen controle gebruikt worden.

Dat de locatie van de elektrode een grote invloed heeft op de respons in aanvalsfrequentie, blijkt uit de data van de ratten waarbij de elektrodes niet in de VHC zaten. De

36

aanvalsfrequentie van deze ratten veranderde meestal weinig, of steeg, net zoals bij de ratten die niet gestimuleerd werden. De ratten waarbij een stijging in aanvalsfrequentie werd waargenomen, hadden wellicht hun stabiele aanvalsfrequentie nog niet bereikt. Verschillende studies toonden aan dat de aanvalsfrequentie na KA-injectie initieel stijgt, maar uiteindelijk een plateau bereikt (WILLIAMS ET AL., 2009). Bij de rat die in de mediodorsale thalamische nucleus (MD) gestimuleerd werd, daalde de aanvalsfrequentie met 14% tijdens de stimulatie. Dit zou kunnen verklaard worden doordat de MD connecties heeft met de MTN, de piriforme cortex, de entorhinale cortex, de amygdala en het subiculum (BERTRAM, 2009). Een rationele keuze van de stimulatieplaats speelt dus een primordiale rol in de optimalisatie van DHS voor de behandeling van epilepsie.

5.3 Extrapolatie naar klinische studies en neveneffecten

Hoewel de VHC gereduceerd is bij mensen, is de commissura fornicis goed ontwikkeld. Deze vormt een vezelbaan die de rechter en linker hippocampi verbindt door fornix aanhechtingen. Studies met diepte-EEG opnames van temporale kwab aanvallen, toonden aan dat deze vezelbaan bij mensen functioneel is en contralaterale verspreiding kan teweegbrengen van aanvalsontladingen die ontstaan in mesiale temporale kwab structuren (GLOOR ET AL., 1993). Ook werden bij TLE patiënten met mesiale temporale sclerose eveneens abnormaliteiten waargenomen in de fimbria fornix (CONCHA ET AL., 2010).Stimulatie van vezelbanen werd reeds beschreven in enkele klinische studies. Een voorbeeld hiervan is DHS van de crus anterius van de capsula interna, als succesvolle behandeling van obsessieve-compulsieve stoornis (GREENBERG ET AL., 2006). Ook werden tien patiënten met refractaire gegeneraliseerde epilepsie gestimuleerd in het corpus callosum, als alternatief voor callosotomie, maar dit bleek niet efficiënt epileptische aanvallen te onderdrukken (MARINO & GRONICH, 1989). Een derde voorbeeld van vezelstimulatie, is stimulatie van de columna fornicis. Dit is het anterieure deel van de fornix, op de plaats waar deze uitmondt in de corpora mammilaria (figuur 29). Deze structuur werd accidenteel samen met de hypothalamus gestimuleerd in een zoektocht naar een DHS-behandeling tegen obesiteit. De ingreep bleek echter in te werken op het geheugen van de patiënt (HAMANI ET AL., 2008).

Figuur 29: Locatie van een DHS-elektrode naast de fornix op een sagittale MRI (links) en geprojecteerd op een stereotactische atlas (rechts) (LAXTON ET AL., 2010).

37

Bij veel epilepsiepatiënten die kandidaat zijn voor temporale lobectomie of hippocampectomie bestaat er een hoog risico op geheugenproblemen (HELMSTAEDTER ET AL., 2003; GLEISSNER ET AL., 2004). Hoewel verschillende studies van hippocampale DHS met langetermijn opvolging van de cognitieve functies van de patiënten geen neveneffecten toonden op gebied van geheugen (VONCK ET AL., 2002; BOON ET AL., 2007; VELASCO ET AL., 2007), moet dit potentiële risico met grote oplettendheid blijven onderzocht worden.

De meest frequent gerapporteerde neveneffecten van DHS zijn bloedingen en infecties in het omliggend weefsel rond de elektrode (BOON ET AL., 2007; VELASCO ET AL., 2007). Een ander potentieel neveneffect is directe schade aan het weefsel, veroorzaakt door de stimulatie. Dit kan primair veroorzaakt worden door de lading die van de elektrode komt, of secundair door de effecten van het herhaald activeren van neuronen en neuronale netwerken. Het risico op secundaire schade is moeilijk te bepalen en is afhankelijk van de dynamische respons van het gestimuleerde netwerk (GWINN & SPENCER, 2004). Primaire schade kan het gevolg zijn van overdreven toevoer van lading. Daarom is het belangrijk dat de bifasische golven ladingsgebalanceerd zijn in positieve en negatieve polariteit zodat er geen netto lading wordt geleverd (GWINN & SPENCER, 2004; MONTGOMERY, 2010). In het huidige onderzoek kon er tijdens de histologie niet worden nagegaan of er primaire schade was opgetreden, gezien er voor de lokalisatie van de elektrode schade werd gemaakt bij het leveren van de gelijkstroom van 10 V over beide stimulatiekanalen.

5.4 Het werkingsmechanisme van DHS

DHS blijkt zeer effectief te zijn bij een brede waaier van neurologische aandoeningen die niet kunnen behandeld worden met farmacologische behandelingen (MONTGOMERY & GALE, 2008). Maar hoe kan stimulatie van bepaalde hersenstructuren deze effecten bewerkstelligen? MONTGOMERY (2010) gaf een duidelijke illustratie van het therapeutisch effect van elektrische stimulatie bij neurologische aandoeningen. Hij beschouwt de neurotransmitters als de boodschappers tussen neuronen. De informatie die zij bevatten wordt bepaald door de sequentie van elektrische actiepotentialen die worden verzonden naar de synaptische terminal. Gezien de basiseenheid van informatie de actiepotentialen zijn, wordt de boodschap zelf elektrisch gecodeerd, verwerkt en verzonden. Bij neurologische aandoeningen wordt er foute informatie doorgegeven. In de plaats van in te werken op de boodschappers van deze informatie, zoals de meeste farmacologische behandelingen, werkt neurostimulatie rechtstreeks in op de boodschap zelf. Bij het leveren van elektrische lading aan het extracellulaire medium buiten de neurale membraan, wordt deze buitenkant minder positief en is het verschil tussen buiten en binnenkant relatief minder negatief, waardoor de neurale membraan gedepolariseerd wordt en het optreden van een actiepotentiaal wordt gefaciliteerd (MONTGOMERY, 2010).

De werkingsmechanismen van DHS zijn afhankelijk van de aandoeningen, het stimulatietarget, en de gebruikte parameters (WYCKHUYS, 2008). Voor elke aandoening kan er één mechanisme zijn waarin meerdere structuren betrokken zijn, of kunnen er evenveel verschillende mechanismen zijn als dat er targets zijn (MONTGOMERY, 2010). De optimale

38

stimulatieparameter voor DHS in de subthalamische nucleus als behandeling van de ziekte van Parkinson is 130 Hz stimulatie met regelmatige pulsen (BIRDNO ET AL., 2008). Bij de behandeling van epilepsie met hippocampale DHS daarentegen, blijkt dat PDS efficiënter aanvallen kan onderdrukken dan de gangbare HFS (WYCKHUYS ET AL., 2010a). Ook werd reeds aangetoond dat hippocampale HFS een blijvend effect veroorzaakt (VELASCO ET AL., 2007; WYCKHUYS ET AL. 2007), wat niet het geval is bij hippocampale PDS (WYCKHUYS ET AL, 2010a). Zoals uit het huidige onderzoek bleek, veroorzaakt PDS van de VHC wel een transiënt blijvend effect.

Het is nog niet duidelijk hoe hippocampale DHS de exciteerbaarheid van het epileptisch netwerk beïnvloedt. Een plausibele hypothese stelt dat DHS homeostatische mechanismen induceert (WYCKHUYS, 2008). Neuronen kunnen hun exciteerbaarheid aanpassen om te compenseren voor veranderingen in activiteit. Herhaalde activaties kunnen de elektrische responsen in de postsynaptsiche membraan vergroten, zoals bij Long Term Potentiation (LTP), of verkleinen, zoals bij Long Term Depression (LTD). Vermoedelijk liggen LTD en LTP aan de basis van het effect van LFS en HFS. Mogelijks induceren de onregelmatige interpulsintervallen bij PVS gemakkelijker homeostatische plasticiteit (WYCKHUYS, 2008). PVS zou de drempelwaarde voor aanvalsinitiatie verhogen, waardoor aanvallen minder snel worden geïnitieerd doordat neuronen en hun netwerken minder exciteerbaar gemaakt zijn. Als de amplitude onder de drempelwaarde voor aanvalsgeneratie blijft, worden geen aanvallen uitgelokt en wordt er continue sterke synaptische input geleverd aan het neuronaal netwerk. Om deze verhoogde input te compenseren, verlagen neuronen hun intrinsieke exciteerbaarheid, waardoor de kans op aanvallen verlaagt (WYCKHUYS, 2008). Een andere hypothese is dat de onregelmatige pulsintervallen bij PVS verhinderen dat synchrone activiteit optreedt of zich verspreidt (WYCKHUYS ET AL., 2010a).

Gemyeliniseerde axonen zijn meer exciteerbaar dan cellichamen (GWIN & SPENCER, 2004). Bij stimulatie van de VHC worden er hoofdzakelijk witte vezelbanen gestimuleerd, waardoor dit mogelijks een lagere intensiteit vereist dan hippocampale PVS. Ook wordt de efficiëntie nog meer verhoogd doordat de elektrode loodrecht op de vezelbanen staat. Het zijn namelijk enkel de neuronen gelegen dichtbij het negatieve contact van de elektrode en waarvan de neuronale membranen loodrecht op het opgewekte elektrische veld liggen, die worden geactiveerd (MONTGOMERY, 2010). Deze hogere efficiëntie blijkt uit de vergelijking tussen de huidige studie - waarin de intensiteit bij alle ratten 100 µA bedroeg - en de studie van WYCKHUYS ET AL. (2010a), waarbij een significante aanvalsreductie gezien werd bij hippocampale PVS met een hogere gemiddelde intensiteit van 156 µA.

5.5 Toekomstperspectieven

Als gehypotheseerd wordt dat VHC-stimulatie enkel effect zal hebben op de delen van de hippocampi die rechtstreeks geïnnerveerd worden door de VHC pathway, namelijk de CA3 en CA1 regio’s van een deel van beide hippocampi (KILE ET AL., 2010), zou het interessant zijn om in een volgend experiment het effect op de aanvalsfrequentie te vergelijken tussen VHC-stimulatie en zowel uni- als bilaterale hippocampale DHS.

39

Aangezien onze hypothese luidt dat DHS met PVS van de VHC efficiënter aanvallen kan onderdrukken dan hippocampale DHS met PVS, zou in dit volgend experiment eveneens de optimale stimulatie-intensiteit voor elke rat afzonderlijk kunnen bepaald worden, om deze te vergelijken tussen een groep ratten met VHC-stimulatie en een groep met hippocampale stimulatie. Deze intensiteit kan bepaald worden door te starten met een amplitude van 50µA en deze stapsgewijs te verhogen met 10 µA (tot maximum 400 µA) tot gedragsabnormaliteiten of epileptiforme EEG activiteit optreden, en deze waarde te verminderen met 10 µA. Op deze manier worden de ratten gestimuleerd met een intensiteit die onder de drempelwaarde ligt om epileptiforme activiteit uit te lokken, maar hoog genoeg om een therapeutisch effect te bereiken. Dit noemt men de maximale subthreshold stimulatie. Indien deze maximale subthreshold intensiteit lager ligt bij VHC-stimulatie, om dezelfde of een betere aanvalsreductie te bekomen, zou dit een belangrijk voordeel leveren in de humane situatie. De batterij kan hierdoor langer meegaan, waardoor de patiënt minder frequent invasieve ingrepen moet ondergaan om deze te vervangen.

Vooraleer een aanvalsreducerende behandeling van epilepsie uit een preklinische studie kan onderzocht worden bij patiënten, moeten de neveneffecten die zich op lange termijn zouden kunnen voordoen, bestudeerd worden in dierexperimenteel onderzoek. Een belangrijk voorbeeld van een potentieel risico bij zowel hippocampale stimulatie als bij stimulatie van de commissura fornicis, is een achteruitgang van het geheugen, door implantatie van de DHS elektrode en/of de stimulatie zelf.Er bestaan verschillende methoden om het ruimtelijk leren en geheugen van knaagdieren te testen. Eén van de meest bekende is de Morris water navigation task. In dit experiment, wordt het dier geplaatst in een rond bassin met ondoorzichtig gemaakt water. Het moet op zoek gaan naar een platform dat tot net onder het wateroppervlak reikt. Na voldoende oefening, zullen de dieren zonder geheugenprobleem, onmiddellijk naar het platform zwemmen op basis van ruimtelijke aanwijzingen uit de omgeving rond het bassin. Indien de ratten tijdens het experiment moeten gestimuleerd worden, kan eventueel de droge versie van deze test gebruikt worden, namelijk de Oasis maze. Andere voorbeelden zijn de Radial arms maze en de Barnes maze. Als minder arbeidsintensieve en praktisch meer haalbare methode om geheugen te testen tijdens de stimulatie, kan ook de Touchscreen testmethode gebruikt worden. Bij deze procedure leren de ratten reageren op grafische stimuli op een scherm, door er hun snuit tegen te drukken.

Naast mogelijke neveneffecten van de stimulatie op de cognitieve functies, zou herhaalde stimulatie van neuronen en neuronale netwerken op lange termijn schade kunnen toebrengen aan het weefsel. Deze langetermijn effecten, evenals de optimalisatie van DHS en een beter inzicht in het werkingsmechanisme, vormen een belangrijk uitgangspunt voor verder onderzoek naar DHS als behandeling voor de diverse neurologische aandoeningen.

40

6. Conclusie

Uit deze studie kan worden besloten dat DHS in de VHC in het KA-model leidt tot een significante reductie (52%, p<0,01) in aanvalsfrequentie, die behouden blijft tot twee weken na het stopzetten van de stimulatie. Vijfenvijftig procent van de ratten (n=11) vertoonde een daling in aanvalsfrequentie van >50% (met een range van 53% tot 94%) en 27% vertoonde een daling tussen 30% en 50%. Verder onderzoek moet uitwijzen of stimulatie van de VHC efficiënter aanvallen onderdrukt dan hippocampale unilaterale en/of bilaterale DHS. Ook moeten de potentiële neveneffecten op cognitie, de langetermijn effecten van de stimulatie en het werkingsmechanisme van DHS achterhaald worden, vooraleer deze therapie op een veilige manier kan worden vertaald naar een humane toepassing.De stimulatie had geen effect op de aanvalsduur of op het circadiaan ritme van de aanvalsfrequentie. Ook vertoonden de dieren die niet, of op een andere plaats gestimuleerd werden, geen of slechts een kleine daling in aanvalsfrequentie. Dit wijst erop dat een rationele keuze van de stimulatieplaats cruciaal is bij de optimalisatie van DHS voor de behandeling van epilepsie.

41

7. Samenvatting

Epilepsie is een chronische neurologische aandoening, die wordt gekenmerkt door het herhaald en spontaan optreden van epileptische aanvallen. Deze aanvallen worden veroorzaakt door abnormaal excessieve of synchrone neuronale activiteit in de hersenen. Eén van de moeilijkst behandelbare vormen van epilepsie is temporale kwab epilepsie (Temporal Lobe Epilepsy - TLE).Ongeveer dertig procent van de epilepsiepatiënten krijgen nog steeds aanvallen ondanks adequate behandeling met anti-epileptische medicatie. Afhankelijk van de betrokken hersenfoci, is voor veel van deze patiënten epilepsiechirurgie evenmin een optie, zoals patiënten met bilaterale mesiale TLE. Voor hen kan diepe hersenstimulatie (DHS) een oplossing bieden. Bij deze behandeling worden specifieke hersenstructuren die deel uitmaken van het epileptogeen netwerk, of die betrokken zijn bij het begin van de aanvallen, direct gestimuleerd met elektroden. Deze elektroden zijn via een subcutane draad verbonden met een geïmplanteerde pulsgenerator. Stimulatie van verschillende targets leidde reeds tot een reductie van aanvallen bij zowel patiënten als in diermodellen voor epilepsie. Ondanks intensief onderzoek, is het exacte werkingsmechanisme van DHS nog niet opgehelderd en is er nog geen consensus bereikt over de optimale combinatie van stimulatieplaats en stimulatieparameters.Twee potentieel effectieve targets zijn de midline thalamische nuclei (MTN) en de ventrale hippocampale commissuur (VHC). De MTN zijn een groep kleine kernen die betrokken zijn bij cognitieve functies en waakzaamheid. De ventrale midline groep, die de reuniens nucleus (Re) en de rhomboïde nucleus (Rh) bevat, zou een belangrijke rol kunnen spelen bij de versterking en verspreiding van epileptische aanvallen. Deze regio heeft sterke excitatorische projecties naar de entorhinale cortex en de CA1 regio van de hippocampus, en vertoont neuronaal verlies in verschillende diermodellen voor epilepsie.Een andere mogelijks doeltreffende stimulatieplaats is de VHC. De commissuur bestaat uit gemyeliniseerde vezels die de beide hippocampi verbinden. De hippocampus speelt een belangrijke rol bij het ontstaan van aanvallen bij patiënten met TLE. TLE gaat gepaard met hippocampale sclerose en verwijdering van mesiale temporale structuren kan aanvallen onderdrukken. Hippocampale DHS leidde reeds tot aanvalsvermindering van >50% bij meer dan de helft van de behandelde refractaire patiënten. Door stimulatie in de hippocampale commissuur, kan een meer uitgebreid gebied in zowel linker als rechter hippocampus beïnvloed worden, wat mogelijks leidt tot een meer efficiënte aanvalsonderdrukking.

Dit onderzoek draagt bij tot de optimalisatie van de behandeling van epilepsie met DHS. Meer specifiek streeft het de optimalisatie van de stimulatieplaats voor DHS na. Het effect van DHS in twee verschillende stimulatieplaatsen werd geëvalueerd in het KA-model, een diermodel voor TLE met spontane aanvallen. Dit onderzoek omvatte drie doelstellingen: (i) optimalisatie van de coördinaten voor de implantatie van de DHS elektrode in de VHC, (ii) evaluatie van het effect van DHS in het Re/Rh-complex van de MTN en (iii) evaluatie van het effect van DHS in de VHC. De hypothese was dat stimulatie in beide targets leidt tot een lagere aanvalsfrequentie en/of aanvalsduur.

42

Voor de optimalisatie van de coördinaten van de VHC, werden ratten (n=4) geïmplanteerd met een stimulatie-elektrode met gebruik van volgende coördinaten: -2,3 AP; -1,5 ML; -4,5 DV. De ratten werden geanestheseerd en de hersenen werden uit de schedel verwijderd. Hierna werd een coronale coupe (+ 1 mm) gemaakt die de elektrodetract bevatte. De locatie van de elektrode werd geïdentificeerd en de coördinaten werden lichtjes aangepast (-2,3 AP; -1,2 ML; -4,7 DV). Er werd een laatste rat geopereerd met de nieuwe coördinaten alvorens de operaties voor het VHC-experiment begonnen.Voor de evaluatie van het effect van DHS werden 89 mannelijke Sprague-Dawley ratten geïnjecteerd met kaïnaat (Kainic Acid – KA). De ratten (n=20) die minstens twee tonisch-clonische aanvallen vertoonden gedurende een observatieperiode van 6u, werden geselecteerd voor de DHS-experimenten. Er werd een bipolaire stimulatie-elektrode geïmplanteerd in de VHC of de MTN, en een quadripolaire EEG-registratie-elektrode in de rechter hippocampus. Ook werd ter hoogte van de linker zijde van de frontale cortex een oppervlakte-EEG-elektrode geplaatst, en een referentie-elektrode posterieur van de sutura lambdoidea. Na een week rust werd continue EEG-registratie gestart. Tijdens de eerste vijftien dagen, werd een baseline monitoring gedaan om de baseline aanvalsfrequentie en – duur te bepalen. Hierna kregen de ratten gedurende tien dagen continue stimulatie toegediend met een intensiteit van 100 µA en Poisson verdeelde pulsen met een gemiddelde frequentie van 130Hz en een pulsbreedte van 100 µs per fase. Tenslotte volgde een wash-out periode van vijftien dagen, om na te gaan of de stimulatie een blijvend effect veroorzaakt had. Op het einde van het experiment, werden de ratten transcardiaal geperfuseerd en werden er coronale vriescoupes gesneden van de hersenen. De coupes werden gekleurd met een Nissl-kleuring en de exacte positie van de stimulatie-elektrode werd geverifieerd met een binoculaire microscoop. De aanvalsfrequentie en –duur werden voor elke behandelingsperiode bepaald en de drie periodes werden statistisch met elkaar vergeleken aan de hand van de niet-parametrische Friedman test. Om na te gaan tussen welke periodes aanvalsfrequenties significant verschillend waren, werd een post hoc analyse uitgevoerd met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon signed ranks test. Na een Bonferroni correctie, werd voor de individuele testen een P-waarde < 0,017 beschouwd als significant verschillend.

De ratten die stierven of hun elektrodes kwijtraakten voor het einde van de stimulatieperiode werden uit de analyse gelaten. Er werden elf ratten gestimuleerd in de VHC. Tien ratten (83%) vertoonden een daling in aanvalsfrequentie (range 11% tot 94%), waarvan zes ratten (55%) een daling van minstens 50% vertoonden, en aldus beschouwd kunnen worden als responders. De gemiddelde aanvalsfrequentie tijdens de stimulatieperiode lag significant lager (52%, p<0,01) dan tijdens de baseline periode. De stimulatie had geen effect op het circadiaan ritme van de aanvalsfrequentie of op de aanvalsduur. Na het stopzetten van de stimulatie bleef de lage aanvalsfrequentie initieel behouden, maar na veertien dagen begon deze weer te stijgen. Drie ratten uit het VHC-experiment werden niet gestimuleerd. Deze ratten vertoonden een stijging in aanvalsfrequentie (42%, 54% en 8%). Bij geen enkele rat uit het MTN-experiment zat de elektrode juist. Drie ratten uit dit experiment werden gestimuleerd op een andere locatie (het posterieur deel van het anterieur hypothalamisch gebied, de mediodorsale

43

thalamische nucleus en het mediaal preoptisch gebied). Deze ratten vertoonden een stijging of slechts een kleine daling in aanvalsfrequentie.

De effecten van de VHC-stimulatie op de aanvalsfrequentie in het KA-model waren minstens zo goed als de resultaten uit studies met hippocampale DHS, bij zowel patiënten als proefdiermodellen. In een volgend experiment zou het interessant zijn om het effect van VHC-stimulatie op de aanvalsfrequentie te vergelijken met dat van zowel uni- als bilaterale hippocampale stimulatie. Hierbij zou eveneens de maximale subthreshold intensiteit kunnen bepaald worden. Gezien vezels meer exciteerbaar zijn dan cellichamen, en de vezels loodrecht op het elektrisch veld van de elektrode liggen, zal VHC-stimulatie vermoedelijk efficiënter aanvallen onderdrukken (met een lagere intensiteit) dan hippocampale DHS. Hierdoor zou bij patiënten de batterij langer kunnen meegaan, waardoor er minder frequent invasieve ingrepen moeten gebeuren om deze te vervangen.Hoewel de VHC gereduceerd is bij mensen, is de commissura fornicis goed ontwikkeld. Deze vormt een vezelbaan die beide hippocampi verbindt. De vezels zijn functioneel en kunnen contralaterale verspreiding teweegbrengen van aanvalsontladingen die ontstaan in mesiale temporale kwab structuren.Vooraleer een aanvalsreducerende behandeling van epilepsie uit een preklinische studie kan onderzocht worden bij patiënten, moeten de potentiële neveneffecten die zich op lange termijn zouden kunnen voordoen, bestudeerd worden in dierexperimenteel onderzoek. Zo zouden er in de toekomst bij de behandelde ratten cognitietesten moeten uitgevoerd worden, om na te gaan of er zich problemen in het geheugen voordoen.Hoewel DHS zeer effectief blijkt te zijn bij een brede waaier van neurologische aandoeningen die niet kunnen behandeld worden met farmacologische behandelingen, is het exacte werkingsmechanisme nog niet gekend. De opheldering van het werkingsmechanisme zou allicht een grote bijdrage leveren aan de optimalisatie van de behandeling.

Uit deze studie kan worden besloten dat DHS in de VHC in het KA-model leidt tot een significante reductie (52%, p<0,01) in aanvalsfrequentie, die tot twee weken na stopzetten van de stimulatie behouden blijft. Vijfenvijftig procent van de ratten (n=11) vertoonden een daling in aanvalsfrequentie van >50% (met een range van 53% tot 94%).

44

8. Summary

Epilepsy is a chronic neurological disorder, characterized by the repetitive and spontaneous occurrence of epileptic seizures. These seizures are caused by abnormal excessive or synchronous neuronal activity in the brain. One of the most difficult to treat types of epilepsy is temporal lobe epilepsy (TLE). Approximately thirty percent of the epilepsy patients experience no remission of seizures despite adequate treatment with antiepileptic drugs. Depending on the involved brainfoci, epilepsy surgery is also not an option for many of these patients, for example patients with bilateral mesial TLE. For them, deep brain stimulation (DBS) can offer a solution. In this treatment, specific brain structures, which take part in the epileptogenic network or are involved in the onset of the seizures, are directly stimulated with electrodes. These electrodes are connected to an implanted pulse generator by a subcutaneous lead. Stimulation of several targets already caused a reduction of seizures in both patients and animal models for epilepsy. Despite extensive research, the exact mechanism of action of DBS has not yet been elucidated and there is still no consensus on the optimal combination of stimulation target and stimulation parameters. Two potentially effective targets are the midline thalamic nuclei (MTN) and the ventral hippocampal commissure (VHC). The MTN are a group of small nuclei that are involved in cognitive functions and arousal. The ventral midline group, which comprises the reuniens nucleus (Re) and the rhomboid nucleus (Rh), could play an important role in the amplification and spread of epileptic seizures. This region has strong excitatory projections to the entorhinal cortex and the CA1 region of the hippocampus, and shows neuronal loss in various animal models of epilepsy.Another potentially effective stimulation target is the VHC. The commissure consists of myelinated fibers which connect both hippocampi. The hippocampus plays an important part in the onset of seizures in patients with TLE. TLE is associated with hippocampal sclerosis and removal of mesial temporal structures can suppress seizures. A seizure reduction of >50% was observed following hippocampal DBS in more than half of the treated refractory patients. By stimulating the hippocampal commissure, a more widespread region in both the left and right hippocampus can be influenced, which possibly leads to a more efficient seizure suppression.

This research contributes to the optimization of the treatment of epilepsy with DBS. More specific, it aims to optimize the stimulation target for DBS. The effect of DBS in two different stimulation targets was evaluated in the KA-model, an animal model for TLE with spontaneous seizures. This study comprises three objectives: (i) optimization of the coordinates for implantation of the DBS electrode in the VHC, (ii) evaluation of the effect of DBS in the Re/Rh-complex of the MTN and (iii) evaluation of the effect of DBS of the VHC. We hypothesized that stimulation of both targets leads to a lower seizure frequency and/or seizure duration.

45

For the optimization of the coordinates of the VHC, the rats (n=4) were implanted with a stimulation electrode with the use of following coordinates: -2,3 AP; -1,5 ML; -4,5 DV. The rats were anesthetized and the brains were removed from the skull. A coronal slice (+ 1 mm) containing the electrode tract was made. The location of the electrode was identified and the coordinates were slightly adjusted (-2,3 AP; -1,2 ML; -4,7 DV). One last rat was operated on with these new coordinates before the surgeries for the VHC-experiment were started. For the evaluation of the effect of DBS, 89 male Sprague-Dawley rats were injected with kainic acid (KA). The rats (n=20) that showed at least two tonic-clonic seizures during an observation period of 6h, were selected for the DBS-experiments. A bipolar stimulation electrode was implanted in the VHC or the MTN and a quadripolar EEG registration electrode was implanted in the right hippocampus. An epidural EEG electrode was placed along the left side of the frontal cortex and a reference electrode posterior to the sutura lambdoidea. After one week of recovery, continuous EEG monitoring was started. During the first fifteen days, a baseline monitoring was performed to determine the baseline seizure frequency and duration. Then the rats were subjected to ten days of continuous stimulation with an intensity of 100 µA and Poisson distributed pulses with an average frequency of 130 Hz and pulse width of 100 µs per phase. Finally, a wash-out period of fifteen days was monitored to examine whether the stimulation had caused a lasting effect. At the end of the experiment, the rats were perfused transcardially, and coronal slices of the brain were cut. The slices were stained with Nissl and the exact position of the stimulation electrode was verified using a binocular microscope. The seizure frequency and duration were calculated for each treatment period and the three periods were compared statistically using the non-parametric Friedman test. To determine between which periods the seizure frequencies were significantly different, a post hoc analysis was performed using the non-parametric Wilcoxon signed ranks test. After a Bonferroni correction, for the individual tests, a P-value < 0,017 was assumed to indicate a significant difference.

The rats that died or lost their electrodes before the end of the stimulation period were excluded from the analysis. Eleven rats were stimulated in the VHC. Ten rats (83%) showed a decrease in seizure frequency (range 11% to 94%), six of which (55%) showed a decrease of at least 50% and were therefore considered to be responders. The average seizure frequency during the stimulation period was significantly lower (52%, p<0,01) than during the baseline period. The stimulation had no effect on the circadian rhythm of the seizure frequency or on the seizure duration. After the stimulation was stopped, the low seizure frequency was maintained initially, but started increasing again after fourteen days.Three rats of the VHC-experiment were not stimulated. These rats showed an increase in seizure frequency (42%, 54% en 8%). In none of the rats of the MTN-experiment, the electrode was placed in the correct position. Three rats from this experiment were stimulated in another location (the posterior part of the anterior hypothalamic area, the mediodorsal thalamic nucleus and the medial preoptic area). These rats showed an increase or only a small decrease in seizure frequency.

46

The effects of the VHC-stimulation on the seizure frequency in the KA-model were at least as good as the results from studies with hippocampal DBS in both patients and animal models. In a following experiment, it would be interesting to compare the effect of VHC-stimulation on the seizure frequency with both unilateral and bilateral hippocampal stimulation. In this experiment, the maximal subthreshold intensity could be determined. Since fibers are more excitable than cell bodies, and the fibers are placed perpendicular to the electric field of the electrode, VHC-stimulation will probably suppress seizures more efficiently (with lower intensity) than hippocampal DBS. Consequently, the battery life will be prolonged, which results in less frequent invasive battery replacement interventions.Although the VHC is reduced in humans, the commissura fornicis is well developed. It forms a fiber tract which connects both hippocampi. The fibers are functional and can elicit contralateral spreading of seizure discharges that originate in mesial temporal lobe structures.Before a seizure reducing treatment of epilepsy from a preclinical study can be investigated in patients, the potential long-term side effects must be examined in experimental animal studies. In the future, treated rats should be subjected to cognition tests, to check for possible memory problems.Although DBS seems to be effective in a great variety of neurological disorders that cannot be treated with pharmacological treatments, the exact mechanism of action has not yet been elucidated. The elucidation of this mechanism of action would greatly contribute to the optimization of the treatment.

From this study, it can be concluded that DBS in the VHC in the KA-model leads to a significant reduction (52%, p<0,01) in seizure frequency that lasts for two weeks after the stimulation is terminated. Fifty-five percent of the rats (n=11) showed a decrease in seizure frequency of >50% (with a range of 53% to 94%).

47

Dankwoord

Graag zou ik enkele mensen willen bedanken die een bijdrage leverden aan de realisatie van dit eindwerk.Vooreerst zou ik Prof. Dr. Paul Boon willen bedanken voor de kans die ik kreeg om in het LKEN mijn masterproef uit te voeren. Prof. Dr. Bart Braeckman wil ik graag bedanken om de taak als promotor op zich te nemen en voor zijn interesse in dit onderzoek.Mijn grootste dank richt ik naar twee mensen die me dit jaar zeer veel geholpen hebben: Dr. Tine Wyckhuys en Bregt Van Nieuwenhuyse. Tine, bedankt om mij wegwijs te maken in het labo en zowel de rol van co-promotor als van begeleidster met zo veel enthousiasme uit te voeren. Bregt, niemand had de taak als begeleider beter kunnen overnemen. Ik heb van jullie beiden enorm veel geleerd, en jullie gaven mij steeds weer moed wanneer het even wat moeilijker ging. Duizendmaal bedankt!Ook gaat mijn oprechte dank uit naar Prof. Dr. Robrecht Raedt. Mede dankzij hem kreeg ik, als bioloog, deze unieke kans. Ook kon ik de hulp bij de histologie en de vele nuttige tips ten zeerste appreciëren.

Ik dank iedereen op het LKEN voor de hulp en de leuke sfeer. Bovenaan dit lijstje komt Diego De Baere, die me het ganse jaar zeer veel geholpen heeft. Verder wil ik graag de doctoraatsstudenten bedanken: Ine Dauwe, voor het uitleggen van alle stappen voor de histologie; Ine Buffel, voor de bestellingen en de mopjes ;-) en Lies Mollet, om me zo vaak aan het lachen te brengen. Ook de andere studenten en Dr. Dimitri Hemelsoet dank ik voor de leuke momenten. Ik wens al mijn medestudenten veel succes toe met hun plannen voor volgend jaar!

Graag bedank ik de mensen van het INFINTIY-labo voor het gebruik van de vriesmicrotoom en iedereen van het animalarium die mijn ratjes heeft verzorgd. Ook wil ik graag een dankwoord richten naar Prof. Dr. Kristl Vonck, voor de nuttige tips tijdens de presentaties, Prof. Dr. Dirk Van Roost, voor het zeer interessante gesprek en Micah, voor het nalezen van de Engelstalige samenvatting.

Speciale dank gaat uit naar diegenen die het dichtst bij mij staan. Het is dankzij de steun van mijn ouders, dat ik deze studies kon aanvangen en voltooien. Tenslotte richt ik mijn dankwoord naar Wannes: Bedankt voor alles ;-).

48

Afkortingenlijst

AEDs Anti-epileptic drugs (= anti-epileptische medicatie)AHP posterieur deel van anterieur hypothalamisch gebiedAP AnterioposterieurARAS Ascending Reticulair Activating SystemCC Corpus callosumCA Cornu AmmonisDHC Dorsale Hippocampale CommissuurDHS Diepe HersenstimulatieDV DorsoventraalEEG ElectroencephalogramGAERS Genetic Absence Epilepsy Rats from StrasbourgHFS Hoogfrequente stimulatieILAE International League Against EpilepsyIMD Intermediodorsale nucleusINFINITY Innovative Flemish IN vivo TechnologY labi.p. intraperitoneaalKA Kainic Acid (= kaïnaat)LFS Laagfrequente stimulatieLKEN Laboratorium voor Klinische en Experimentele NeurofysiologieLTD Long Term DepressionLTP Long Term PotentiationMD Mediodorsale thalamische nucleusML MediolateraalMPO Mediale preoptische nucleusMTLE Mesial Temporal Lobe Epilepsy (= Mesiale Temporale Kwab Epilepsie)MTN Midline Thalamische NucleiPe Periventriculaire hypothalamische nucleusPT Parataeniale nucleusPV Paraventriculaire nucleusPVS Poisson Verdeelde StimulatieRe Reuniens nucleusRh Rhomboïde nucleusrTMS repetitive Transcranial Magnetic StimulationSE Status EpilepticusSEM Standard error of the mean (Standaard afwijking van het gemiddelde)tDCS transcranial Direct Current StimulationTLE Temporal Lobe Epilepsy (= Temporale Kwab Epilepsie)VHC Ventrale Hippocampale Commissuur

49

Referentielijst

ANDRIOLI, A., FABENE, P. F., SPREAFICO, R., CAVALHEIRO, E. A., BENTIVOGLIO, M. (2009). Different patterns of neuronal activation and neurodegeneration in the thalamus and cortex of epilepsy-resistant Proechimys rats versus Wistar rats after pilocarpine-induced protracted seizures. Epilepsia 50(4): 832-848.

BAE, E. H., THEODORE, W. H., FREGNI, F., CANTELLO, R., PASCUAL-LEONE, A., ROTENBERG, A. (2011). An estimate of placebo effect of repetitive transcranial magnetic stimulation in epilepsy. Epilepsy & Behavior 20: 355-359.

BEEN, G., NGO, T. T., MILLER, S. M., FITZGERALD, P. B. (2007). The use of tDCS and CVS as methods of non-invasive brain stimulaton. Brain research reviews 56: 364-361.

BEN-ARI, Y., COSSART, R. (2000). Kainate, a double agent that generates seizures: two decades of progress. Trends Neuroscience 23:580-587.

BENARROCH, E. E. (2008). The midline and intralaminar thalamic nuclei: Anatomic and functional specificity and implications in neurologic disease. Neurology 71: 944-949.

BERG, A. T., BERKOVIC, S. F., BRODIE, M. J., BUCHHALTER, J., CROSS, J. H., VAN EMDE BOAS, W., ENGEL, J., FRENCH, J., GLAUSER, T. A., MATHERN, G. W., MOSHÉ, S. L., NORDLI, D., PERRINE, P., SCHEFFER, I. E. (2010). Revised terminology and concepts for organization of seizures and epilepsies: Report of the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005-2009. Epilepsia 51(4): 676-685.

BERTRAM, E. H. (2009). Temporal lobe epilepsy: Where do the seizures really begin? Epilepsy & Behavior 14: 32-37.

BERTRAM, E. H., SCOTT, C. (2000). The pathological substrate of limbic epilepsy: Neuronal loss in de medial dorsal thalamic nucleus as the consistent change. Epilepsia 41(Suppl. 6): S3-S8.

BERTRAM, E. H., ZHANG, D. (1999). Thalamic excitation of hippocampal CA1 neurons: a comparison with the effects of CA3 stimulation. Neuroscience 92: 15-26.

BERTRAM, E. H., ZHANG, D., MANGAN, P., FOUNTAIN, N., REMPE, D. (1998). Functional anatomy of limbic epilepsy: a proposal for central synchronization of a diffusely hyperexcitable network. Epilepsy Research 32(1-2): 194-205.

BERTRAM, E. H., MANGAN, P. S., ZHANG, D., SCOTT, C. A., WILLIAMSON, J. M. (2001). The midline thalamus: Alterations and a potential role in limbic epilepsy. Epilepsia 42(8): 967-978.

BERTRAM, E. H., ZHANG, D., WILLIAMSON, J. M. (2008). Multiple roles of midline dorsal thalamic nuclei in induction and spread of limbic seizures. Epilepsia 49(2): 256-268.

BIRDNO, M. J., KUNCEL, A. M., DORVAL, A. D., TURNER, D. A., GRILL, W. M. (2008). Tremor varies as a function of the temporal regularity of deep brain stimulation. Neuroreport 19(5): 599-602.

BOKOR, H., CSÁKI, Á., KOCSIS, K., KISS, J. (2002). Cellular architecture of the nucleus reuniens

50

thalami and its putative aspartatergic/glutamatergic projection to the hippocampus and medial septum in the rat. European Journal of Neuroscience 16: 1227-1239.

BOON, P., VONCK, K., DE HERDT, V., VAN DYCKE, A., GOETHALS, M., GOOSSENS, L., VAN ZANDIJCKE, M., DE SMEDT, T., DEWAELE, I., ACHTEN, R., WADMAN, W., DEWAELE, F., CAEMAERT, J., VAN ROOST, D. (2007). Deep Brain Stimulation in Patients with Refractory Temporal Lobe Epilepsy. Epilepsia 48(8): 1551-1560.

BOON, P., RAEDT, R., DE HERDT, V., WYCKHUYS, T., VONCK, K. (2009). Electrical Stimulation for the Treatment of Epilepsy. Neurotherapeutics 60(2): 218-227.

BRAGIN, A., WILSON, C. L., ENGEL, J. (2002). Rate of interictal events and spontaneous seizures in epileptic rats after electrical stimulation of hippocampus and its afferents. Epilepsia 43: 81-85.

BRODIE, M. J., DICHTER, M. A. (1996). Antiepileptic drugs. The New England Journal of Medicine 334(3): 168-175.

BRODIE, M. J., SHORVON, S. D., CANGER, R., HALÁSZ, P., JOHANNESSEN, S., THOMPSON, P., WIESER, H. G., WOLF, P. (1997). ILAE Commission Report. Commission on European affairs: Appropriate standards of epilepsy care across Europe. Epilepsia 38(11): 1245-1250.

BUTSON, C. R., MCINTYRE, C. C. (2008). Current steering to control the volume of tissue activated during deep brain stimulation. Brain Stimulation 1: 7-15.

CONCHA, L., LIVY, D. J., BEAULIEU, C., WHEATLEY, B. M., GROSS, D. W. (2010). In vivo diffusion tensor imaging and histopathology of the fimbria-fornix in temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience 30(3): 996-1002.

DANOBER, L., DERANSART, C., DEPAULIS, A., VERGNES, M., MARESCAUX, C. (1998). Pathophysiological mechanisms of genetic absence epilepsy in the rat. Progress in Neurobiology 55: 27-57.

ENGEL, J. J., WIEBE, S., FRENCH, J., SPERLING, M., WILLIAMSON, P., SPENCER, D., GUMNIT, R., ZAHN, C., WESTBROOK, E., ENOS, B. (2003). Practice parameter: Temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia 44(6): 741-751.

FISHER, R. S., VAN EMDE BOAS, W., BLUME, W., ELGER, C., GENTON, P., LEE, P., ENGEL, J. (2005). Epileptic seizures and epilepsy: Definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia 46(4): 470-472.

FISHER, R. S., SALANOVA, V., WITT, T., WORTH, R., HENRY, T., GROSS, R., OOMMEN, K, OSORIO, I., NAZZARO, J., LABAR, D., KAPLITT, M., SPERLING, M., SANDOK, E., NEAL, J., HANDFORTH, A., STERN, J., DESALLES, A., CHUNG, S., SHETTER, A., BERGEN, D., BAKAY, R., HENDERSON, J., FRENCH, J., BALTUCH, G., ROSENFELD, W., YOUKILIS, A., MARKS, W., GARCIA, P., BARBARO, N., FOUNTAIN, N., BAZIL, C., GOODMEN, R., MCKHANN, G., KRISHNAMURTHY, B., PAPAVASSILIOU, S., EPSTEIN, C., POLLARD, J., TONDER, L., GREBIN, J., COFFEY, R., GRAVES, N. (2010). Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia 51(5): 899-908.

FREGNI, F., THOME-SOUZA, S., BERMPOHL, F., MARCOLIN, M. A., HERZOG, A., PASCUAL-LEONE, A., VALENTE, K. D. (2005). Antiepileptic effects of repetitive transcranial magnetic stimulation in patients with cortical malformations: an EEG and clinical study. Stereotactic and Functional Neurosurgery 83: 57-62.

51

52

FRENCH, J. A., WILLIAMSON, P. D., THADANI, V. M., DARCEY, T. M., MARSON, R. H., SPENCER, S. S, SPENCER, D. D. (1993). Characteristics of medial temporal lobe epilepsy: I. Results of history and physical examination. Annals of Neurology 34(6): 774-780.

GLEISSNER, U., HELMSTAEDTER, C., SCHRAMM, J., ELGER, C. E. (2004). Memory outcome after selective amygdalohippocampectomy in patients with Temporal Lobe Epilepsy: One-year follow-up. Epilepsia 45: 960-962.

GLOOR, P., SALANOVA, V., OLIVIER, A., QUESNEY, L. F. (1993). The human dorsal hippocampal commissure. Brain 116: 1249-1273.

GREENBERG, B. D., MALONE, D. A., FRIEHS, G. M., REZAI, A. R., KUBU, C. S., MALLOY, P. F., SALLOWAY, S. P., OKUN, M. S., GOODMAN, W. K., RASMUSSEN, S. A. (2006). Three-year outcomes in deep brain stimulation for highly resistant obsessive-compulsive disorder. Neuropsychopharmacology 31(11): 2384-2393.

GWINN, R. P., SPENCER, D. D. (2004). Fighting fire with fire: brain stimulation for the treatment of epilepsy. Clinical Neuroscience Research 4(1-2): 95-105.

HAMANI, C., MCANDREWS, M. P., COHN, M., OH, M., ZUMSTEG, D., SHAPIRO, C. M., WENNBERG, R. A., LOZANO, A. M. (2008). Memory enhancement induced by hypothalamic fornix deep brain stimulation. Annals of Neurology 63(1): 119-123.

HASHIMOTO, T., ELDER, C. M., OKUN, M. S., PATRICK, S. K., VITEK, J. L. (2003). Stimulation of the subthalamic nucleus changes the firing pattern of pallidal neurons. The Journal of Neuroscience 23(5): 1916-1923.

HELLIER, J. L., DUDEK, F. E. (1999). Spontaneous motor seizures of rats with kainate-induced epilepsy: effect of time of day and activity state. Epilepsy Research 35: 47-57.

HELLIER, J. L., PATRYLO, P. R., BUCKMASTER, P. S., DUDEK, F. E. (1998). Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assesment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research 31(1): 73-84.

HELMSTAEDTER, C., KURTHEN, M., LUX, S., REUBER, M., ELGER, C.E. (2003). Chronic epilepsy and cognition: a longitudinal study in temporal lobe epilepsy. Annals of Neurology 54(4): 425-432.

JENSEN, A. L., DURAND, D. M. (2009). High frequency stimulation can block axonal conduction. Experimental Neurology 220: 57-70.

KEARNEY, J. A., PLUMMER, N. W., SMITH, M. R., KAPUR, J., CUMMINS, T. R, WAXMAN, S. G., GOLDIN, A. L., MEISLER, M. H. (2001). A gain-of-function mutation in the sodium channel gene Scn2a results in seizures and behavioral abnormalities. Neuroscience 102(2): 307-317.

KILE, K. B., TIAN, N., DURAND, D. M. (2010). Low frequency stimulation decreases seizure activity in a mutation model of epilepsy. Epilepsia 51(9): 1745-1753.

KINOSHITA, M., IKEDA, A., BEGUM, T., YAMAMOTO, J., HITOMI, T., SHIBASAKI, H. (2005). Low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation for seizure suppression in patients with extratemporal lobe epilepsy – A pilot study. Seizure 14: 387-392.

53

KWAN, P., BRODIE, M. J. (2000). Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine 342(5): 314-319.

LAXTON, A. W., TANG-WAI, D. F., MCANDREWS, M. P., ZUMSTEG, D., WENNBERG, R., KEREN, R., WHERRETT, J., NAGLIE, G., HAMANI, C., SMITH, G. S., LOZANO, A. M. (2010). A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer’s disease. Annals of Neurology 68: 521-534.

LOCKMAN, J., FISHER, R. S. (2009). Therapeutic Brain Stimulation for Epilepsy. Neurologic Clinics 27(4): 1031-1040.

MARINO, J. R., GRONICH, G. (1989). Corpus callosum stimulation and stereotactic callosotomy in the management of refractory generalized epilepsy. Preliminary communication. Arquivos de neuro-psiquiatria 47: 320-5.

MCINTYRE, C. C., GRILL, W. M., SHERMAN, D. L., THAKOR, N. V. (2004a). Cellular effects of deep brain stimulation: Model-based analysis of activation and inhibition. Journal of Neurophysiology 91: 1457-1469.

MCINTYRE, C. C., SAVASTA, M., KERKERIAN-LE GOFF, L., VITEK, J. L. (2004b). Uncovering the mechanism(s) of action of deep brain stimulation: activation, inhibition, or both. Clinical Neurophysiology 115: 1239-1248.

MCKENNA, J. T., VERTES, R. P. (2004). Afferent projections to nucleus reuniens of the thalamus. The Journal of Comparative Neurology 480: 115-142.

MONTGOMERY, E. B. (2010). Deep brain stimulation programming. Principles and practice. Oxford University Press, New York.

MONTGOMERY, E. B., GALE, J. T. (2008) Mechanisms of action of deep brain stimulation (DBS). Neuroscience and Biobehavioral Reviews 32: 388-407.

NASCIMENTO, E. S., DUARTE, R. B., SILVA, S. F., ENGELBERTH, R. C. G. J., TOLEDO, C. A. B., CAVALCANTE, J. S., COSTA, M. S. M. O. (2008). Retinal projections to the thalamic paraventricular nucleus in the rock cavy (Kerodon rupestris). Brain Research 1241: 56-61.

NORDEN, A. D., BLUMENFELD, H. (2002). The role of subcortical structures in human epilepsy. Epilepsy & Behavior 3(3): 219:231.

PAXINOS, G., WATSON, C. (1998). The Rat Brain in stereotaxic coordinates. Fourth Edition. Academic Press, San Diego.

VAN DER WERF, Y., WITTER, M. P., GROENEWEGEN, H. J. (2002). The intralaminar and midline nuclei of the thalamus. Anatomical and functional evidence for participation in processes of arousal and awareness. Brain Research Reviews 39: 107-140.

VAN ZEVEREN, A. (2010). Vergelijking van twee stimulatieplaatsen voor diepe hersenstimulatie in een proefdiermodel voor temporale kwab epilepsie. Niet gepubliceerde masterproef, Universiteit Gent.

54

VELASCO, A. L., VELASCO, M., VELASCO, F., MENES, D., GORDON, F., ROCHA, L., BRIONES, M., MARQUEZ, I. (2000). Subacute and chronic electrical stimulation of the hippocampus on intractable temporal lobe seizures: Preliminary report. Archives of Medical Research 31(3): 316-328.

VELASCO , F., VELASCO, M., VELASCO, A. L., MENEZ, D., ROCHA, L. (2001). Electrical stimulation for epilepsy: stimulation of hippocampal foci. Stereotactic and Functional Neurosurgery 77: 223-227.

VELASCO, A. L., VELASCO, F., JIMÉNEZ, F., VELASCO, M., CASTRO, G., CARRILLO-RUIZ, J. D., FANGHANEL, G., BOLEAGA, B. (2006). Neuromodulation of the centromedian thalamic nuclei in the treatment of generalized seizures and the improvement of the quality of life in patients with Lennox-Gastaut syndrome. Epilepsia 47(7): 1203-1212.

VELASCO, A. L., VELASCO, F., VELASCO, M., TREJO, D., GUILLERMO, C., CARRILLO-RUIZ, J. D. (2007). Electrical stimulation of the hippocampale epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia 48(10): 1895-1903.

VERCEUIL, L., BENAZZOUZ, A., DERANSART, C., BRESSAND, K., MARESCAUX, C., DEPAULIS, A., BENABID, A. L. (1998). High-frequency stimulation of the sub-thalamic nucleus suppresses absence seizures in the rat: comparison with neurotoxic lesions. Epilepsy Research 31: 39-46.

VONCK, K., BOON, P., ACHTEN, E., DE REUCK, J., CAEMAERT, J. (2002). Long-term amygdalohippocampal stimulation for refractory temporal lobe epilepsy. Annals of Neurology 52(5): 556-565.

WILLIAMS, P. A., HELLIER, J. L., WHITE, A. M., STALEY, K. J., DUDEK, F. E. (2007). Development of spontaneous seizures after experimental status epilepticus: Implications for understanding epileptogenesis. Epilepsia 48(Suppl. 5): 157-163.

WILLIAMS, P. A., WHITE, A. M., CLARK, S., FERRARO, D. J., SWIERCZ, W., STALEY, K. J. DUDEK, F. E. (2009). Development of spontaneous recurrent seizures after kainate induced status epilepticus. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 47: 769-774.

WYCKHUYS, T. (2008). Deep brain stimulation in experimental animal models. Doctoral dissertation, Ghent University.

WYCKHUYS, T., DE SMEDT, T., CLAEYS, P., RAEDT, R., WATERSCHOOT, L., VONCK, K., VAN DEN BROECKE, C., MABILDE, C., LEYBAERT, L., WADMAN, W., BOON, P. (2007). High frequency deep brain stimulation in the hippocampus modifies seizure characteristics in kindled rats. Epilepsia 48: 1543-1550.

WYCKHUYS, T., GEERTS, P. J., RAEDT, R., VONCK, K., WADMAN, W., BOON, P. (2009). Deep Brain Stimulation for epilepsy: knowledge gained from experimental animal models. Acta Neurologica Belgica 109(2): 63-80.

WYCKHUYS, T., BOON, P., RAEDT, R., VAN NIEUWENHUYSE, B., VONCK, K., WADMAN, W. (2010a). Suppression of hippocampal epileptic seizuures in the kainate rat by Poisson distributed stimulation. Epilepsia 51(11): 2297-2304.

55

WYCKHUYS, T., RAEDT, R., VONCK, K., WADMAN, W., BOON, P. (2010b). Comparison of hippocampal Deep Brain Stimulation with high (130 Hz) and low frequency (5 Hz) on afterdischarges in kindled rats. Epilepsy Research 88: 239-246.

WYCKHUYS, T., STAELENS, S., VAN NIEUWENHUYSE, B., DELEYE, S., HALLEZ, H., VONCK, K., RAEDT, R., WADMAN, W., BOON, P. (2010c). Hippocampal deep brain stimulation induces decreased rCBF in the hippocampal formation of the rat. Neuroimage 52: 55-61.

YANG, L. X., JIN, C. L., ZHU-GE, Z. B., WANG, S., WEI, E. Q., BRUCE, I. C., CHEN, Z. (2006). Unilateral low-frequency stimulation of central piriform cortex delays seizure development induced by amygdaloid kindling in rats. Neuroscience 138(4): 1089-1096.

ZHU-GE, Z. B., ZHU, Y. Y., WU, D. C., WANG, S., LIU, L. Y., HU, W. W., CHEN, Z. (2007). Unilateral low-frequency stimulation of central piriform cortex inhibits amygdaloid-kindled seizures in Sprague-Dawley rats. Neuroscience 146(3): 901-906.

56

Bijlage

Figuur I: De gemiddelde aanvalsfrequentie (in aantal aanvallen per dag) voor rat VHC1 tot VHC4 als functie van de dag. De baseline-periode (15 dagen) werd gevolgd door 10 dagen DHS en dan 15 dagen wash-out.

Figuur II: De gemiddelde aanvalsfrequentie (in aantal aanvallen per dag) voor rat VHC5 tot VHC8 als functie van de dag. De baseline-periode (15 dagen) werd gevolgd door 10 dagen DHS en dan 15 dagen wash-out.

Figuur III: De gemiddelde aanvalsfrequentie (in aantal aanvallen per dag) voor rat VHC9 tot VHC11 als functie van de dag. De baseline-periode (15 dagen) werd gevolgd door 10 dagen DHS en dan 15 dagen wash-out.