UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013-2014

ANTIOXIDANTEN IN DE VOEDING VAN MELKKOEIEN: BELANG VOOR DE GEZONDHEID EN

DE VRUCHTBAARHEID

Door

Kirsten PROOST

Promotor: Prof.Dr. Jo Leroy Literatuurstudie in het kader

Copromotor: Prof.Dr. Geert Janssens van de Masterproef

©2014 Kirsten Proost

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of

volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk

uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor

enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013-2014

ANTIOXIDANTEN IN DE VOEDING VAN MELKKOEIEN: BELANG VOOR DE GEZONDHEID EN

DE VRUCHTBAARHEID

Door

Kirsten PROOST

Promotor: Prof.Dr. Jo Leroy Literatuurstudie in het kader

Copromotor: Prof.Dr. Geert Janssens van de Masterproef

©2014 Kirsten Proost

VOORWOORD

Graag zou ik enkele mensen willen bedanken die hebben geholpen bij het ontstaan van deze

masterproef.

Allereerst zou ik graag mijn promotor Prof.Dr. Leroy willen bedanken voor de hulp bij deze

masterproef. Bedankt voor het kritisch nalezen van mijn masterproef, het snelle antwoord op mijn

mails, de artikels en de goede begeleiding. Mijn copromotor Prof.Dr. Geert Janssens wil ik graag

bedanken voor het nalezen van mijn tekst. Ook Drs. Jessie De Bie zou ik willen bedanken voor de tips

in verband met mijn inhoudstabel en de vele artikels die ze mij ter beschikking gesteld heeft.

Tevens wil ik mijn mama, Hilde Vertenten bedanken voor het veelvuldig nalezen van mijn masterproef

op schrijffouten. Tenslotte wil ik ook nog mijn familie en vrienden bedanken voor de nodige steun en

het geduld.

INHOUDSOPGAVE

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING ................................................................................................................................. p.1

INLEIDING ............................................................................................................................................ p.2

LITERATUURSTUDIE .......................................................................................................................... p.3

1. Oxidatieve stress en antioxidanten............................................................................................... p.3

1.1. ROS-vorming en oxidatieve schade aan cellen ................................................................... p.3

1.2. Belangrijkste antioxidanten in de voeding van herkauwers ................................................. p.4

1.3. Werkingsmechanismen van de belangrijkste antioxidanten ................................................ p.5

1.3.1. Vitamine E .................................................................................................................... p.6

1.3.2. Vitamine C .................................................................................................................... p.7

1.3.3. Selenium ....................................................................................................................... p.7

1.3.4. β-caroteen ..................................................................................................................... p.8

2. Factoren die de antioxidantstatus van melkvee beïnvloeden ...................................................... p.9

3. Invloed van antioxidanten in het dieet op reproductieve parameters en aandoeningen ............ p.11

4. Mechanisme van antioxidanten die de vruchtbaarheid beïnvloeden ......................................... p.13

4.1. Inwerking op de eicel .......................................................................................................... p.13

4.2. Inwerking op de granulosacel ............................................................................................. p.15

4.3. Inwerking op de luteale cellen ............................................................................................ p.16

4.4. Inwerking op het embryo .................................................................................................... p.17

5. Belang van antioxidanten voor de immuniteit ............................................................................. p.18

6. Voorgestelde optimale voedingsstrategie .................................................................................. p.20

BESPREKING .................................................................................................................................... p.23

REFERENTIELIJST ........................................................................................................................... p.24

1

SAMENVATTING

Tijdens het normale metabolisme van zoogdieren worden reactive oxygen species geproduceerd.

Deze reactive oxygen species kunnen wanneer ze in overmaat aanwezig zijn aanleiding geven tot

oxidatieve stress. Antioxidanten zijn belangrijk om het ontstaan van deze oxidatieve stress te

voorkomen. Lage concentraties reactive oxygen species zijn noodzakelijk voor de normale cellulaire

functies. Een overmaat zorgt echter voor schade aan DNA, proteïnes, lipiden en ander

macromolecules.

In de voeding van herkauwers zijn van nature antioxidanten aanwezig. De belangrijkste antioxidanten

opgenomen via de voeding zijn β-caroteen, vitamine E en selenium. Voor vitamine C zijn de

herkauwers aangewezen op endogene synthese. Deze antioxidanten opgenomen via de voeding

dragen bij tot de plasma antioxidantstatus. Deze is het resultaat van de interacties tussen de

verschillende antioxidanten. Hij kan beïnvloed worden door verschillende factoren zoals onder andere

de voeding, de energiebalans, de productie van colostrum alsook door ziekte en stressperiodes.

Na supplementatie van bovenvermelde antioxidanten zijn vaak positieve effecten op de

vruchtbaarheid en incidentie van reproductieve aandoeningen waarneembaar. Deze positieve effecten

kunnen verklaard worden door de inwerking van antioxidanten op het niveau van de eicel, de

granulosacel, de luteale cel en het embryo. Antioxidanten zijn ook belangrijk voor de bescherming van

immuuuncellen. Tijdens de respiratory burst van de neutrofielen is er een enorme productie van

reactive oxygen species. De immuuncellen zelf zijn heel gevoelig aan oxidatieve stress door het hoog

gehalte polyonverzadigde vetzuren aanwezig in hun membraan. Bij een verminderde immuunrespons

zijn de koeien veel vatbaarder voor verschillende aandoeningen. De supplementatie van antioxidanten

kent echter niet alleen voordelen. Zo ziet men bij een hoge vitamine E supplementatie een verhoogde

incidentie van mastitis.

De behoefte van hoogproductief melkvee aan antioxidanten is waarschijnlijk hoger dan eerst

aangenomen. Zelfs bij een licht tekort aan antioxidanten kan er een verminderde fertiliteit

waargenomen worden vooraleer zich duidelijke deficiëntiesymptomen manifesteren. Supplementatie is

dus aangewezen bij tekorten. Met vitamine E supplementatie dient voorzichtig omgesprongen te

worden in verband met de mastitisproblematiek.

Na een algemene bespreking over de belangrijkste antioxidanten in de voeding van melkvee volgt een

uiteenzetting over de plasmaantioxidantstatus. Binnen deze thesis ligt het accent op het effect van de

supplementatie van antioxidanten op de vruchtbaarheid en de gezondheid van melkvee.

Sleutelwoorden: Antioxidanten – Immuniteit - Melkkoeien – Oxidatieve stress – Vruchtbaarheid

2

INLEIDING

Antioxidanten zijn moleculen die de laatste tijd sterk onder de aandacht zijn gekomen. Ze zijn van

belang om de oxidatieve stress te beperken (Sies, 1993). Hoogproductief melkvee zou een hogere

behoefte aan antioxidanten hebben dan voordien werd aangenomen (Miller en Brzezinska-

Slebodinska, 1993). Hoogproductief melkvee ondergaat immers sterke metabole en fysiologische

veranderingen tijdens de overgang van dracht naar lactatie. Door het verhoogde metabolisme ontstaat

er een verhoogde zuurstofbehoefte met een hogere productie van reactive oxygen species tot gevolg

(Sordillo en Aitken, 2009). Oxidatieve stress ontstaat wanneer de productie van reactive oxygen

species te hoog is ten opzichte van de antioxidatieve beschermingsmechanismen aanwezig in het

lichaam (Spears en Weiss, 2008). Deze oxidatieve stress is een belangrijke onderliggende factor voor

een dysfunctionele immuunrespons. Hierdoor kunnen de melkkoeien gevoeliger zijn voor een groot

aantal aandoeningen en dit vooral tijdens de transitieperiode (Sordillo en Aitken, 2009). Een tekort aan

antioxidanten kan een negatieve invloed uitoefenen op de vruchtbaarheid (Hemken en Bremel, 1982).

Zelfs bij een licht tekort aan antioxidanten is er reeds een verminderde fertiliteit waarneembaar (Hurley

en Doane, 1987).

De supplementatie van antioxidanten kent economische voordelen. Zo ziet men na supplementatie

van antioxidanten verhoogde melkproductie, een verbeterde reproductie, een verminderde prevalentie

van mastitis en minder reproductieve aandoeningen. De economische winst die men kan halen door

verbetering van deze parameters is moeilijk te kwantificeren maar er kan gesteld worden dat de netto

opbrengst door supplementatie vooral via een verbeterde reproductieve functie zal verlopen (Weiss,

1998).

Deze literatuurstudie valt uiteen in 2 grote delen. Het eerste deel van de literatuurstudie omvat een

algemene bespreking van oxidatieve stress en antioxidanten. De verschillende antioxidanten en hun

werkingsmechanismen worden toegelicht, alsook de antioxidantstatus in het plasma van melkkoeien

samen met de factoren die deze beïnvloeden. In het tweede deel wordt de invloed van antioxidanten

op de vruchtbaarheid besproken alsook op de immuniteit. Tot slot volgt er een bespreking van de

voorgestelde optimale voederstrategie om een optimale vruchtbaarheid te ondersteunen.

3

LITERATUURSTUDIE

1. Oxidatieve stress en antioxidanten

Tijdens het aerobe metabolisme van zoogdieren wordt zuurstof verbruikt en een basale hoeveelheid

aan reactive oxygen species (ROS) geproduceerd (Sies, 1993). ROS zijn een verzameling van vrije

radicalen die gevormd worden door reductie van moleculaire zuurstof (Sies, 1997). Tijdens periodes

met een verhoogd metabolisme zal er een verhoogd zuurstofverbruik zijn waardoor ook meer ROS

geproduceerd worden (Miller en Brzezinska-Slebodzinska, 1993). Het is van wezenlijk belang dat de

productie van deze ROS gecontroleerd wordt en dat een overmaat geïnactiveerd wordt om het

evenwicht tussen oxidanten en antioxidanten te behouden. Oxidatieve stress ontstaat wanneer dit

evenwicht verstoord wordt in het voordeel van de oxidanten. Er kan geprobeerd worden om de schade

veroorzaakt door deze oxidanten te repareren. Een andere mogelijkheid is het opbouwen van een

adaptieve respons (Sies,1993).

Er zijn zowel directe als indirecte effecten van oxidatieve stress. Het directe effect houdt in dat er

peroxidatieve veranderingen optreden in de membranen en andere cellulaire componenten. Bij de

indirecte effecten is er een interferentie met belangrijke metabole functies door de competitieve

consumptie van reducerende equivalenten (bv. Gereduceerd nicotinamide adenine dinuclueotide

fosfaat (NADPH)). Door de daling van de beschikbaarheid van deze reducerende equivalenten zal de

productie ervan gestimuleerd worden door activatie van de monofosfaat shunt. Bij activatie van de

monofosfaat shunt wordt glucose-6-fosfaat vanuit andere pathways afgeleid (Miller en Brzezinska-

Slebodzinska, 1993). Glucose-6-fosfaat zal voornamelijk verwerkt worden in de monofosfaat shunt bij

hoge concentraties nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP+). Bij een verminderde behoefte

aan NADPH kan glucose-6 fosfaat gebruikt worden in de glycolyse. Hierbij wordt pyruvaat gevormd

dat geoxideerd kan worden in de citroenzuurcyclus met productie van adenosinetrifosfaat (ATP)

(Nelson en Cox, 2008). Halliwel en Gutteridge (1989) definieerden een antioxidant als ‘een substantie

die de oxidatie van een substraat significant vertraagt of inhibeert wanneer deze substantie aanwezig

is in een lage concentratie vergeleken met deze van een oxideerbaar substraat.

1.1. ROS-vorming en oxidatieve schade aan cellen

Tijdens de reductie van moleculaire zuurstof tot water worden ROS geproduceerd. De intermediaire

stappen zijn de vorming van een superoxide anion radicaal (•O2‾), waterstofperoxide (H2O2) en een

hydroxyl radicaal (OH•) (Sies, 1997). Het

•O2‾ kan beschouwd worden als het belangrijkste ROS dat

geproduceerd wordt. Het wordt geproduceerd door NAD(P)H oxidasen, xanthine oxidasen en vooral

non-enzymatisch in de mitochondriën binnen de elektronentransportketen bij de productie van ATP

(Valko et al., 2007). Dit geproduceerde •O2‾ gaat reacties aan met een variëteit aan moleculen waarbij

verschillende andere ROS geproduceerd worden in een kettingreactie. Hierbij kan onder andere een

sterker reactief radicaal gevormd worden, nl. OH•. Dit ontstaat door een interactie tussen

•O2‾ of H2O2

4

en transitie elementen zoals koper (Cu) en ijzer (Fe) in de metaalion gekatalyseerde Haber-Weis (1)

en Fenton (2) reacties (Sordilo en Aitken, 2009).

(Fe3+

) +

•O2‾ + (Fe

2+) + H2O2 (Fe

2+) + O2 +(Fe

3+) + OH

‾ + OH

• (1)

Fe2+

+ H2O2 Fe3+

+ OH‾+ OH• (2)

Vrij Fe kan zo zorgen voor een sterke stijging van de productie van ROS. Daarom is het belangrijk dat

Fe gecapteerd wordt door metaalbindende proteïnes (Kakhlon en Cabantchik, 2002). Lage

concentraties van ROS zijn noodzakelijk voor de normale cellulaire functies (Eaton, 2006).

Opstapeling van ROS daarentegen veroorzaakt schade aan de weefsels. De belangrijkste targets zijn

DNA, proteïnes, lipiden en andere macromolecules (Sordilo en Aitken, 2009). De halfwaardetijd van

de verschillende ROS kan sterk variëren. Dit maakt dat sommige ROS gelimiteerd zijn in hun diffusie

en hun werking enkel kunnen uitoefenen op de plaats waar ze gevormd worden. Een voorbeeld

hiervan is het hydroxyl radicaal, dat een korte halfwaardetijd heeft. Andere ROS, zoals bijvoorbeeld

peroxyl radicalen, zullen relatief stabiel zijn en een lange halfwaardetijd hebben. Dit zorgt ervoor dat

deze radicalen naar andere target moleculen getransporteerd kunnen worden (Sies,1993).

1.2. Belangrijkste antioxidanten in de voeding van herkauwers

In de voeding van herkauwers spelen verschillende antioxidanten zoals β-caroteen, vitamine E,

Selenium en vitamine C een belangrijke rol. Deze antioxidanten kunnen van nature aanwezig zijn in

bepaalde voedermiddelen of kunnen synthetisch aangemaakt en gesupplementeerd worden.

β-caroteen is één van de belangrijkste vetoplosbare antioxidanten in de voeding van herkauwers. De

hoogste concentratie β-caroteen wordt gevonden in planten. In granen en gefermenteerde voeders

worden slechts minimale hoeveelheden β-caroteen gevonden mede door hitteschade en afbraak die

optreedt gedurende bewaring (de Ondarza en Engstrom, 2009). De concentratie van β-caroteen in

planten wordt sterk beïnvloed door volgende factoren: de fysieke vorm, de pH-waarde, de

aanwezigheid van zuurstof en de temperatuur. Tijdens de maturatie van de plant zal het gehalte β-

caroteen afnemen. Wanneer de plant geoogst wordt, treedt er oxidatie op waardoor het gehalte β-

caroteen verder daalt. De concentratie β-caroteen daalt ook naarmate de geoogste plant langer

bewaard wordt (Chauveau-Duriot et al, 2005). Bij de meeste diersoorten wordt β-caroteen omgezet

naar vitamine A door intestinale enzymen in de dunne darm. Bij herkauwers wordt slechts een klein

deel van het β-caroteen (24%) omgezet naar vitamine A. De normale concentratie van vitamine A in

het bloed kan bij koeien desondanks hoger zijn dan bij paarden (Kuhl et al., 2012; Rizzo et al., 2013).

Hierbij dient opgemerkt te worden dat de normale concentratie β-caroteen in het bloed bij het paard

veel lager is dan bij de koe (Mäenpää et al., 1988). De capaciteit om β-caroteen op te slaan in het

lichaam is sterk variërend per ras (Calsamiglia en Rodriguez, 2012).

Vitamine E is een belangrijk vetoplosbaar antioxidant en een component in celmembranen. De

vitamine E concentratie in de voeding is sterk variërend. Het gehalte in krachtvoeders is meestal laag.

5

De variant met de hoogste biologische activiteit is α-tocopherol (Oram et al., 2001). Dit is ook de

meest courante vorm in planten (Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Wanneer de plant geoogst wordt,

zal het gehalte aan α-tocopherol snel dalen. Langdurige blootstelling aan zuurstof en zonlicht zal

ervoor zorgen dat de concentratie verder zal afnemen (Thafvelin en Oksanen, 1966). De efficiëntie

van absorptie is de limiterende factor voor de biologische beschikbaarheid en is relatief laag

(ongeveer 30%). De absorptie van vitamine E is sterk gerelateerd aan de vertering en de absorptie

van vetten (Baldi, 2005). Vooral het type en de hoeveelheid vet in de darm zijn hierbij van groot

belang (Weiss en wyatt, 2003). De opslag van vitamine E vindt vooral plaats in vetweefsel of in

hydrofobe domeinen van moleculaire structuren zoals lipoproteïnes. Binnen de cel wordt Vitamine E

vooral gevonden in de hydrofobe kern van celmembranen. Het gehalte aan vitamine E in de

membranen is sterk variërend tussen de verschillende membranen (Wang en Quinn, 1999).

Selenium is een sporenelement en een belangrijke component van het enzym glutathione peroxidase

(GPX). Het seleniumgehalte in planten en granen is sterk gecorreleerd met de concentratie selenium

in de bodem. Dit verklaart waarom men in streken met een bodem arm aan selenium vaak aan

selenium bemesting doet. Selenium kan in de natuur voorkomen zowel in een organische vorm als in

een anorganische vorm. Er zijn geen data beschikbaar over de absorptie van selenium bij ruminanten.

De data die men bekomen heeft bij niet-ruminanten moeten met voorzichtigheid benaderd worden. De

oorzaak hiervan ligt bij het ruminale metabolisme van selenium (NRC, 2001).

Vitamine C (L-ascorbinezuur) is een wateroplosbaar vitamine. Zoogdieren kunnen uitgaande van

glucuronzuur in de lever zelf L-ascorbinezuur aanmaken. D-glucose of D-galactose worden verbruikt

tijdens dit proces (Ranjan et al., 2012). Kalveren zijn tot de leeftijd van 2-3 weken incompetent voor

wat betreft de productie van vitamine C. De aanvoer van vitamine C voor het kalf gebeurt dan ook via

het colostrum en de melk van het moederdier (Cummins en Brunner, 1991). Vitamine C afkomstig van

de voeding van herkauwers wordt bijna volledig afgebroken in de pens. Dit zorgt ervoor dat de

endogene aanmaak van vitamine C voor herkauwers extra belangrijk is. Nieuwere formulaties zouden

hier een oplossing kunnen bieden daar zij gedeeltelijke bescherming kunnen bieden tegen

metabolisatie in het rumen (NRC, 2001). Bij de mens is aangetoond dat Vitamine C vrij circuleert in

het plasma, in de leukocyten en in rode bloedcellen. Het kan zo binnendringen in alle weefsels en

lichaamsvloeistoffen (Iqbal et al., 2004). De geadviseerde dagelijkse opname voor melkkoeien wordt

in hoofdstuk 6 besproken.

1.3. Werkingsmechanismen van de belangrijkste antioxidanten

Antioxidanten kunnen werkzaam zijn tegen ROS op 4 verschillende manieren. Allereerst kunnen

bepaalde antioxidanten zorgen voor de preventie van ROS vorming. Deze preventie kan gebeuren

via verschillende strategieën zoals de binding van metaalionen, de modificatie van de potentiële

targetsite, de controle van de ROS concentraties of een afleiding van ROS in andere reacties met de

vorming van minder schadelijke producten. Ook de opmerkelijke bouw van de ROS genererende

enzymen dient hierbij vermeld te worden. De binding van metaalionen werd reeds aangehaald. Eén

6

van de andere strategieën bestaat uit het aanpassen van de potentiële targetsite. Dehydroascorbaat

zal bijvoorbeeld zorgen voor een stabilisatie van low density lipoproteïnen (LDL). De controle van de

concentratie ROS is vooral belangrijk om een cascade te voorkomen waarin nieuwe oxidanten

geproduceerd worden. Deze strategieën zijn echter niet 100% efficiënt waardoor nog steeds een

gehalte aan ROS geproduceerd wordt dat op andere manieren geneutraliseerd dient te worden (Sies,

1993).

Interceptie kan zorgen voor neutralisatie van geproduceerde ROS. De interceptie kan enzymatisch en

niet-enzymatisch verlopen. Bij de niet-enzymatische interceptie wordt onder meer getracht om reeds

gevormde ROS te onderscheppen en te neutraliseren vooraleer ze schade kunnen aanrichten. Een

andere werkingsmechanisme is om de gevormde ROS af te leiden van gevoelige targets naar

compartimenten van de cel waar de ROS minder schade kunnen aanrichten. De meest efficiënte

antioxidanten binnen deze categorie combineren beide werkingsmechanismen. Het belangrijkste en

meest efficiënte voorbeeld hiervan in de hydrofobe fase is het R,R,R-α-tocopherol (Sies, 1993). Ook

β-caroteen en vitamine C werken via niet-enzymatische interceptie (Sordillo en Aitken, 2009). Een

andere vorm van interceptie is de enzymatische interceptie. Alle cellen in een eukaryoot organisme

bevatten een bepaald gehalte aan antioxidatieve enzymes. De belangrijkste antioxidatieve enzymes

zijn het superoxide dismutase, catalase en glutathione peroxidase (Sies, 1993).

Ondanks de hierboven beschreven werkingsmechanismen van antioxidanten, kan er toch nog vaak

schade optreden. De preventie en interceptie van antioxidanten is immers niet 100% efficiënt. Een

derde functie van de antioxidanten is dan ook het herstellen van de schade die opgetreden is door

ROS. De schade die meestal hersteld wordt is DNA-schade, schade aan de membranen en schade

aan proteïnen. Er zijn verschillende enzymsystemen die zorgen voor het herstel (Sies, 1993).

Een laatste werkingsmechanisme van de antioxidanten omvat het opbouwen van een adaptieve

respons ten opzichte van oxidatieve stress. Er is een belangrijke relatie tussen veranderingen in

redoxstatus, de celcyclus en cellulaire proliferatie (Sies, 1993).

1.3.1. Vitamine E

Vitamine E is een lipofiel antioxidant. De belangrijkste targets van vitamine E zijn de peroxylradicalen,

dewelke belangrijke mediatoren zijn binnen de lipide peroxidatie. Bij deze kettingreactie wordt er

telkens een waterstofatoom van een lipide onttrokken door een peroxylradicaal.

LO.2 + LH LOOH + L

.

LO.2 is het lipide peroxylradicaal, LH is het lipide, LOOH is een lipide hydroperoxide en L

. is een

lipideradicaal. Dit lipideradicaal kan opnieuw een reactie aangaan met zuurstof en zo een nieuw

peroxylradicaal genereren. α-tocopherol dient dus het lipide peroxylradicaal te onderscheppen

vooraleer het zijn aanval op het lipide kan uitvoeren.

LO.2 + TOH LOOH + TO

.

7

TOH is hierbij het α-tocopherol en TO. is het α-tocopheroxyl radicaal. (Wang en Quinn, 1999). Dit α-

tocopheroxyl radicaal kan verschillende reacties ondergaan. Het kan stabiele producten vormen na

reactie met een ander radicaal, lipiden aanvallen of opnieuw gereduceerd worden tot vitamine E door

andere moleculen zoals bijvoorbeeld vitamine C (Niki, 2014). Tocopherolen zullen ook reageren met

andere ROS zoals vrij zuurstof, alkoxyl radicalen, peroxynitriet, stikstofdioxide, ozon en superoxide.

Door de hoge reactiviteit van onder andere alkoxyl en hydroxyl radicalen zal de concentratie van

vitamine E in de membranen onvoldoende hoog zijn voor een voldoende bescherming van deze

membranen. De bescherming van de membranen tegen minder reactieve oxidanten zoals het

peroxylradicaal daarentegen is van veel groter biologisch belang. De efficiëntie van vitamine E wordt

sterk bepaald door de mate waarin het geregenereerd wordt. De regeneratie van vitamine E in een

redoxcyclus wordt gemedieerd door vitamine A, C en coenzyme Q (Wang en Quinn, 1999).

1.3.2. Vitamine C

Ascorbinezuur of vitamine C is een wateroplosbaar antioxidant dat zijn functie kan uitoefenen via

verschillende mechanismen (Bendich et al., 1986). Vitamine C kan zijn functie als antioxidant direct

uitoefenen door een reactie aan te gaan met o.a. wateroplosbare peroxylradicalen, superoxide

anionradicalen, waterstofperoxide, hypochloriet, hydroxylradicalen en vrij zuurstof (Sies en Stahl,

1995). Vitamine C functioneert in deze reactie dan als kettingbrekende antioxidant. In hydrofiele

oplossing met een pH van 7 zoals ongeveer aanwezig in het bloed is de predominante vorm van

ascorbinezuur (AH2), het ascorbaatanion (AH-). Dit ascorbaatanion kan een reversibele oxidatie

ondergaan die in 2 stappen verloopt. Hierbij wordt dehydroascorbinezuur gevormd (A) met als

tussenstap de vorming van het ascorbylradicaal (A-). Het ascorbylradicaal is weinig reactief en kan

reageren met andere radicalen waardoor de kettingreactie van deze andere radicalen onderbroken

wordt. Het ascorbaatanion kan onvoldoende penetreren in de fosfolipide dubbellaag. Daarom oefent

het zijn werking uit door de peroxylradicalen gevormd in de hydrofiele fase te neutraliseren vooraleer

zij binnendringen in de fosfolipiden dubbellaag. De indirecte werking van vitamine C bestaat uit het

regenereren van Vitamine E zodat deze laatste zijn oxidatieve functies verder kan uitvoeren. Vitamine

C reduceert hierbij het α-tocopheroxyl radicaal met de vorming van α-tocopherol. De werking van

vitamine C zorgt zo voor een controle over de lipide peroxidatie van cellulaire membranen, inclusief

deze die zich binnen in de cel bevinden. Ook de aanval van vrije radicalen op nucleair materiaal kan

vermeden worden (Bendich et al., 1986).

1.3.3. Selenium

De antioxidatieve functies van Selenium worden gemedieerd door selenoenzymes.

Glutathionperoxidase dat gevonden wordt in het cytosol, wordt het meest geassocieerd met

antioxidatieve functies. Recent werd echter aangetoond dat ook andere selenoenzymes zoals

selenoproteïne P, 5 verschillende isovormen van glutathionperoxidase en 3 thioredoxin reductase

(TrxR) isoenzymes een sterke activiteit kunnen uitoefenen als antioxidant. Zowel GPX als TrxR zijn

belangrijk voor de reductie van waterstofperoxides en hydroperoxides. Tijdens de glutathione (GSH)

oxidatie-reductiecyclus zal waterstofperoxide gereduceerd worden tot 2 moleculen water waarbij 2

8

moleculen glutathione geoxideerd zullen worden. Deze reactie wordt gekatalyseerd door

glutathioneperoxidase (3). Het geoxideerd glutathione (GSSG) dat tijdens deze reactie geproduceerd

wordt zal opnieuw gereduceerd worden door glutathione reductase (GR) waarbij NADPH dat

geproduceerd wordt door de monofosfaat shunt zal fungeren als electronendonor (4).

H2O2 + 2GSH GPX 2H2O2 + GSSG (3)

GSSG + NADPH GR 2GSH + NADP

+ (4)

Geoxideerde cysteïnegroepen op proteïnes kunnen gereduceerd worden door het thioredoxine

systeem. Het Trx wordt hierbij gebruikt om disulfidebindingen te vormen (5), die hieropvolgend

gereduceerd worden door thioredoxinereductase en NADPH (6) (Sordillo en Aitken, 2009).

Trx-(SH)2 + ROOH Trx-S2 + ROH + H2O (5)

Trx-S2 + NADPH + H+ 1TrxR

Trx-(SH)2 + NADP+ (6)

Vitamine E en Selenium vertonen een synergistische werking. Beiden kunnen hun werking uitoefenen

via glutathion peroxidase om zo de productie van peroxylradicalen te doen verminderen. Dit verklaart

waarom vaak wordt waargenomen dat een voldoende hoge concentratie aan selenium

deficiëntiesymptomen van Vitamine E kan voorkomen en omgekeerd (Machlin en Bendich, 1987).

1.3.4. β-caroteen

β- caroteen is een lipofiel vitamine met een uitgebreid systeem van geconjugeerde dubbele bindingen.

Deze chemische structuur is belangrijk voor de antioxidatieve functie van β-caroteen (Sies en Stahl,

1995). Vroeger werd beweerd dat β-caroteen het meest efficiënte antioxidant is voor het neutraliseren

van 1O2 (Machlin en Bendich, 1987). Er werd gesteld dat dit neutraliseren gebeurt door middel van

een fysische reactie dewelke de chemische structuur van β-caroteen intact laat waardoor regeneratie

niet nodig blijkt (Sies en Stahl,1995). Bij deze neutralisatiereactie vindt er een energieoverdracht

plaats van 1O2 naar het β-caroteen waarbij 3β-caroteen gevormd wordt (7). Dit 3β-caroteen kan dan in

een volgende reactie excitatie-energie afgeven aan zijn omgeving door interacties steunend op rotatie

en vibratie (8).

1O2 + carotenoïd

3O2 +

3carotenoïd (7)

3carotenoïd carotenoïd + thermische energie (8)

Tijdens deze laatste reactie wordt de originele carotenoïd molecule geregenereerd (Krinsky, 1989).

Het belang van dit mechanisme in zoogdiercellen was lang onduidelijk (Burton, 1989). Bosio et al.

(2013) hebben echter recent aangetoond dat 1O2 niet geneutraliseerd wordt door β-caroteen in cellen

van zoogdieren. β-caroteen kan een functie uitoefenen als kettingbrekende antioxidant die de vorming

van secundaire ROS kan voorkomen (Sordillo en Aitken, 2009). Verschillende radicalen worden hierbij

gereduceerd zoals bijvoorbeeld trichloromethylperoxylradicalen, peroxylradicalen en alkoxylradicalen

(Sies en Stahl, 1995). Door de geconjugeerde dubbele bindingen is het β-caroteen heel gevoelig aan

oxidatie (Machlin en Bendich, 1987). Wanneer het β-caroteen aangevallen wordt door

9

peroxylradicalen krijgen we de vorming van een β-caroteenradicaal (9). Bij een hoge zuurstofspanning

zal dit β-caroteenradicaal een reactie aangaan met zuurstof, met de vorming van een ander radicaal

nl. β-Car-OO. (10).

β-caroteen + ROO. β-car

. (9)

β-car. + O2 β-car-OO

. (10)

Door deze auto-oxidatie ontstaat er een kettingreactie. Wanneer de zuurstofdruk laag genoeg is, zoals

vaak het geval is in de weefsels van zoogdieren, zal het evenwicht van deze reactie naar links

verschuiven. Het β-caroteenradicaal zal dan eerder een antioxidatieve werking hebben en een reactie

aangaan met het peroxylradicaal. Hierbij worden inactieve producten gevormd.

β-car. + ROO

. inactieve producten

Deze reactie is veel sneller dan de zelfterminatiereactie van peroxylradicalen (Burton, 1989). Andere

antioxidanten zoals Vitamine E kunnen β-caroteen tegen oxidatie beschermen (Machlin en Bendich,

1987).

2. Factoren die de antioxidantstatus van melkvee beïnvloeden

Het meten van antioxidanten in het plasma kan zich focussen op de algemene antioxidant capaciteit

of op het bepalen van de concentratie van individuele antioxidanten (Lykkesfeldt en Svendsen, 2006).

De plasma antioxidantstatus is het resultaat van interacties tussen verschillende antioxidanten. Het

samenwerkingsverband tussen de verschillende antioxidanten zorgt voor een betere bescherming

tegen ROS dan elke antioxidant afzonderlijk. Dit verklaart waarom de totale antioxidantcapaciteit

biologisch informatiever is dan de waarden bekomen na meting van de afzonderlijke componenten.

Figuur 1: Interacties tussen de belangrijkste antioxidanten (uit Machlin en Bendich, 1987).

De antioxidant capaciteit gemeten in het plasma wordt vooral bepaald door antioxidanten afkomstig uit

de voeding, terwijl degene van de cel hoofdzakelijk bepaald worden door enzymsystemen. De

antioxidanten in het plasma worden snel geconsumeerd bij verhoogde ROS productie en moeten snel

10

aangevuld worden door antioxidanten uit de voeding. De plasma antioxidantstatus wordt dus enerzijds

beïnvloed door de productie van ROS, anderzijds door de hoeveelheid antioxidanten die opgenomen

worden via de voeding (Ghiselli et al., 2000).

Er bestaan verschillende methoden om de algemene antioxidant capaciteit te bepalen.

Gemeenschappelijk hierbij is dat er getracht wordt om de activiteit van alle antioxidanten in één

waarde samen te vatten. Methoden die hierbij gebruikt kunnen worden zijn de totale antioxidantstatus

(TAS), de Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC), de total radical-trapping antioxidant

parameter (TRAP), de ferric reducing-antioxidative power colometric assays (FRAP) en cyclische

voltametrie (Lykkesfeldt en svendsen, 2006). De belangrijkste methode is de totale antioxidantstatus

(Castillo et al., 2005). Men kan ook informatie trachten te vergaren over de concentratie van

individuele antioxidanten. Hierbij wordt vooral belang gehecht aan de meting van ascorbaat of

glutathione peroxidase, dit vooral omdat ze in staat zijn om andere antioxidanten te regenereren

(Lykkesfeldt en Svendsen, 2006). Ook de oxidatieve schade aan DNA, proteïnes en lipiden kan

gemeten worden. Dit is een indirecte aanduiding van evenwicht tussen prooxidanten en antioxidanten.

De oxidatieve stress index is een recente methode om de redox status te evalueren. Bij de meting van

deze index wordt zowel rekening gehouden met de prooxidanten als met de antioxidanten. Deze

methode zorgt voor een objectieve bepaling om te bepalen of dieren al dan niet onderhevig zijn aan

oxidatieve stress ( Abuelo et al., 2013).

Melkkoeien staan gedurende de postpartum periode onder zware metabole druk. In deze periode is

de energiebehoefte groter dan de energie die opgenomen wordt via de voeding. Hierdoor zullen de

dieren een negatieve energiebalans (NEB) ontwikkelen. Door dit tekort aan energie zullen katabole

processen geactiveerd worden waarbij ROS geproduceerd worden (Pedernera et al., 2010). Door de

NEB worden vetten gemobiliseerd en verbrand tot vrije vetzuren in de mitochondriën. Bij deze

verbranding zullen er ROS geproduceerd worden in de elektronentransportketen (Marco-Ramell et al.,

2012). Wanneer de productie van deze ROS sneller verloopt dan de snelheid waarmee ze

geneutraliseerd kunnen worden door antioxidatieve mechanismen zal oxidatieve stress ontstaan. De

body condition score (BCS) van de koeien bij de partus is hierbij van groot belang (Pedernera et al.,

2010). Bernabucci et al. (2005) hebben aangetoond dat koeien met een hoge BCS tijdens afkalven en

later een hoge NEB, een verhoogde ROS productie vertonen. De hogere oxidatieve stress bij koeien

in extreme NEB kan gedeeltelijk verklaard worden door een verminderde productie van precursoren

voor de productie van endogene antioxidanten. De leverfunctie kan immers aangetast worden door

extreme vetimmobilisatie met intracellulaire vetaccumulatie (Pedernera et al. 2010).

Bij de productie van colostrum is er ook een hoge behoefte aan antioxidanten. De vetoplosbare

antioxidanten worden in grote hoeveelheden uitgescheiden in het colostrum. Dit is mede

verantwoordelijk voor de daling van de plasmaconcentratie vitamine A, vitamine E en β-caroteen

peripartum (Calsamiglia en Rodriguez, 2012; Chawla en Kaur, 2004; Kawashima et al., 2010).

De antioxidantstatus kan beïnvloed worden door de voeding. Door hoge concentraties of

supplementatie van bijvoorbeeld β-caroteen in de voeding kan er een verhoogde concentratie plasma

11

β-caroteen in het plasma ontstaan (Wang et al., 1982) Tijdens de droogstand van melkkoeien wordt

vaak een voeder verstrekt van lage kwaliteit waardoor er peripartum een lage concentratie aan β-

caroteen en Vitamine E en selenium in het plasma aanwezig is (Calsamiglia en Rodriguez, 2012;

Harrison et al., 1982). Ook is er een verminderde voederopname tijdens deze periode (Calsamiglia en

Rodriguez, 2012). Niet enkel het antioxidantgehalte in het voedermiddel is belangrijk, ook de andere

componenten spelen een belangrijke rol. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat bij supplementatie van

vetten in het dieet bij melkvee met een lage plasmalipidenconcentratie zoals bv. peripartum, een

verhoogde plasmaconcentratie aan vetoplosbare antioxidanten zoals α-tocopherol en β-caroteen

ontstaat. Bij een lage concentratie plasmalipiden zal ook een lage concentratie vetoplosbare

antioxidanten waargenomen worden in het plasma. De vetoplosbare antioxidanten worden immers

getransporteerd door lipoproteïnes aanwezig in het plasma. Een daling van deze moleculen zal ook

een vermindering geven van de transportcapaciteit voor vetoplosbare antioxidanten. Ook belangrijk is

dat de absorptie van vetoplosbare antioxidanten verhoogd kan worden door toevoegen van vetten aan

het voeder (Weiss et al., 1994).

Tijdens ziekte en stressperiodes werd bij ruminanten reeds aangetoond dat het gehalte aan

antioxidanten in het bloed daalt (Ranjan et al., 2012). Bij vele aandoeningen wordt waargenomen dat

de oxidatieve stress verhoogd is wat de antioxidantstatus in het bloed verlaagt (Lykkesfeldt en

Svendsen, 2007). Bij vitamine C kan een verlaagde antioxidantstatus ook ontstaan door een

verminderde endogene synthese in lever en nier (Ranjan et al., 2012). Elke aandoening die leidt tot

een verminderde beschikbaarheid van precursoren zoals glucose en galactose, kan voor een

gecompromitteerde vitamine C productie zorgen (Santos et al, 2001). Deze hypothese wordt echter

niet bevestigd door alle auteurs. Padilla et al. (2005) toonden aan dat zelfs koeien met ketonemie in

staat waren om voldoende vitamine C te produceren.

3. Invloed van antioxidanten in het dieet op reproductieve parameters en aandoeningen

De verschillende hierboven beschreven antioxidanten hebben een invloed op reproductieve

parameters en aandoeningen (Hemken en Bremel, 1982). Wanneer er slechts een licht tekort

aanwezig is aan bepaalde nutriënten zoals antioxidanten kan men vaak reeds een verminderde

fertiliteit waarnemen vooraleer zich duidelijke deficiëntiesymptomen manifesteren (Hurley en Doane,

1987). De bekomen resultaten zijn niet in alle uitgevoerde studies gelijk. Wanneer de β-

caroteenopname laag is, worden verschillende reproductieve problemen waargenomen zoals de

geboorte van dode of zwakke kalveren, abortussen, een hoge incidentie van retentio secundinarum en

luteale cysten. Andere waargenomen fenomenen zijn onder andere een langere oestrusperiode, een

langer interval tussen de start van de oestrus en de ovulatie, een verminderde intensiteit van de

oestrus, verminderde uteriene contracties, harder aanvoelende follikels bij rectaal onderzoek op de

eerste dag van de oestrus en een kleiner corpus luteum. Deze langere oestrusperiode werd visueel

waargenomen bij koeien die langer bronstig bleven alsook door rectaal onderzoek. De

bevruchtingsresultaten zijn lager, wat zich uit in een verhoogde hoeveelheid inseminaties nodig

12

vooraleer bevruchting optreedt. In een andere studie echter werden geen verschillen waargenomen in

de bevruchtingsresultaten. Ook de duur van de oestrus, de lengte van de oestrische cyclus en het

interval tussen LH-piek en ovulatie bleven constant. Er werd gesuggereerd dat deze inconsistentie in

resultaten eventueel verklaard kan worden door verschillende methoden van oestrusdetectie en

inseminatie (Hemken en Bremel, 1982).

Supplementatie van β-caroteen kan zorgen voor betere bevruchtingsresultaten en een intensere

oestrus (Hemken en Bremel, 1982; Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Voldoende aanvoer van β-

caroteen aan het einde van de droogstand ondersteunt de start van de luteale activiteit tijdens de

vroege lactatie waardoor deze vroeger kan optreden (Kawashima et al., 2010). Om een positief effect

te bekomen is het noodzakelijk om een langdurige supplementatie uit te voeren. Ook acht men het

mogelijk dat er een strategisch venster bestaat binnen de reproductieve cyclus waarbinnen de

supplementatie het grootste voordelig effect heeft (de Ondarza en Engstrom, 2009). Het herstel van

de uterus na de partus verloopt sneller bij supplementatie en het interval partus-conceptie is korter. De

incidentie van verschillende reproductieve aandoeningen zoals metritis, folliculaire cysten en retentio

secundinarum daalt bij supplementatie. De incidentie van vroeg embryonale sterfte vermindert ook (de

Ondarza en Engstrom, 2009). Sommige auteurs observeerden echter geen positieve effecten

(Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Zulke verschillen waargenomen in de experimenten kunnen onder

andere veroorzaakt worden door de leeftijd van het dier, het tijdstip van de start van supplementatie,

het lactatiestadium, de lengte van de behandelingsperiode, de concentratie van β-caroteen in het

basale dieet en het vetgehalte in het dieet (Hurley en Doane, 1987; Weiss et al., 1994).

In verschillende studies wordt een verminderde incidentie van retentio secundinarum, cysteuze ovaria,

mastitis en metritis vastgesteld bij supplementatie van vitamine E en selenium tijdens de droogstand

(Calsamiglia en Rodriguez, 2012; Spears en Weiss, 2008; Harrison et al., 1984). Koeien met retentio

secundinarum hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van mastititis en metritis tijdens de

vroege lactatie. Indirect zorgt retentio secundinarum voor een verlaat optreden van de oestrus en een

verminderde vruchtbaarheid (Eger et al., 1985). Ook cysteuze ovariële follikels worden geassocieerd

met het voorkomen van retentio secundinarum (Campbell en Miller, 1998). Na supplementatie van

vitamine E is er een vermindering van het aantal dagen tussen partus en de eerste oestrus die

waargenomen wordt (Harrison et al, 1982; Campbell en Miller, 1998). Door toevoegen van vitamine E

aan het voeder zullen er ook minder inseminaties nodig zijn voor een bevruchting (Calsamiglia en

Rodriguez, 2012). De supplementatie van vitamine E aan het voeder is slechts effectief wanneer er

geen tekort bestaat aan Selenium en omgekeerd (Miller en Brzezinska-Slebodzinska, 1993). Deze

voordelige effecten van vitamine E en selenium supplementatie worden niet in alle experimenten

waargenomen. De plasmaconcentratie voor de supplementatie speelt hierin een belangrijke rol alsook

het niveau van oxidatieve stress (Harrison et al., 1982; Campbell en miller, 1998; Brozos et al., 2009).

De effectiviteit van vitamine E supplementatie zou bij mastitis kunnen afhangen van het type kiem die

de ziekte veroorzaakt. Vitamine E supplementatie zou effectiever zijn ter preventie van mastitis

veroorzaakt door uierpathogenen aanwezig in de omgeving zoals Escherichia coli en Streptococcus

Uberis. Men verwacht dat het belang van uierpathogenen in de omgeving zal toenemen. De boeren

13

zullen immers steeds beter opgeleid zijn, waardoor de transmissie van uierinfecties tijdens het melken

zal afnemen. Hierdoor zullen de uiergebonden kiemen relatief van minder belang zijn (Politis, 2012).

In een recente studie werd een hogere incidentie mastitis waargenomen bij koeien die

gesupplementeerd werden met een hoog gehalte vitamine E ten opzichte van een andere groep

gesupplementeerd met een laag gehalte vitamine E. In deze studie werd 3000IU/koe per dag

gesupplementeerd gedurende de droogstand bij koeien met een plasmaconcentratie hoger dan

14.5µmol/l. De hoge α-tocopherol concentratie in het bloed tijdens het droogzetten en gedurende de

droogstand voor de supplementatie zou hiermee gecorreleerd kunnen zijn. Verder onderzoek is

noodzakelijk om deze resultaten te bevestigen (Bouwstra et al., 2010b). Politis (2012) daarentegen

toonde aan dat een hoge vitamine E concentratie tijdens het droogzetten geen risicofactor voor

mastitis is. Hoge concentraties vitamine E gaan meestal gepaard met een verminderde concentratie

biomerkers voor mastitis en een reductie van de incidentie van mastitis. Deze reductie van de

incidentie van mastitis wordt echter niet gemedieerd door een reductie van concentratie biomerkers

voor oxidatieve stress (Politis et al., 2012).

Koeien met een lebmaagverplaatsing naar links hebben een plasma α-tocopherolconcentratie die 40%

lager is dan bij koeien zonder deze aandoening. Het is nog steeds onduidelijk of deze lage

concentraties ontstaan voor de lebmaagverplaatsing en of ze blijven bestaan bij het verder vorderen

van deze aandoening. Een lage vitamine E spiegel in het serum kan een indicator zijn bij multipare

koeien voor het ontwikkelen van een lebmaagverplaatsing naar links (Qu et al., 2013).

Vitamine C is belangrijk voor het ondersteunen van de dracht bij koeien die problemen ondervinden bij

het behouden van de dracht. Een belangrijke voorwaarde hierbij is dat de genitaaltractus anatomisch

normaal is en er geen reproductieve aandoeningen zoals cysteuze ovaria aanwezig zijn (Hurley en

Doane, 1987).

4. Mechanisme van antioxidanten die de vruchtbaarheid beïnvloeden

Antioxidanten hebben een invloed op reproductieve aandoeningen en parameters. Een verklaring

hiervoor kan gevonden worden op het niveau van de cel. Om dit te verhelderen, wordt

achtereenvolgens de werking van de antioxidanten op niveau van de eicel, de granulosacel, de luteale

cel en het embryo besproken.

4.1. Inwerking op de eicel

Oöcyten worden geproduceerd gedurende het foetale leven. De ontwikkeling van de oöcyten wordt

gestopt in de profase van de eerste meiotische deling. Na de puberteit zullen bij elke oestruscyclus

enkele oöcyten maturatie ondergaan (Ikeda et al., 2005). Tijdens de maturatie van de eicel wordt er

binnen de cumulus cellen een belangrijk antioxidant gesynthetiseerd, namelijk het glutathione (de

14

Matos et al., 1997). Er volgt een verderzetting van de meiose tot de metafase van de tweede

meiotische deling na de LH-piek (Ikeda et al, 2005).

Na de ovulatie zal de oöcyt die zich in het metafase 2 stadium bevindt een belangrijke kwalitatieve

achteruitgang ondergaan. Dit proces wordt aangeduid als postovulatoire veroudering van de oöcyt.

Oxidatieve stress staat in voor de initiatie van de cascade die zorgt voor deze veroudering. De

oxidatieve stress kan een daling van kritische celfactoren induceren, de calciumhomeostase

verstoren, mitochondriale dysfunctie induceren en intracellulaire componenten rechtstreeks

beschadigen (Lord en Aitken., 2013). Het DNA, de proteïnen en de vetten van de mitochondriën zijn

enorm gevoelig aan oxidatieve stress. Dit is vooral omdat de ROS geproduceerd worden in de

elektronentransportketen. Specifiek voor het mitochondriale DNA dient opgemerkt te worden dat het in

tegenstelling tot normaal DNA geen histonen en mechanismen voor herstel bevat (Shigenaga et al.,

1994). Post-ovulatoire veroudering wordt geassocieerd met verminderde fertilisatie ratio’s, slechte

embryo kwaliteit, fouten na de implantatiefase en afwijkingen bij de nakomelingen. Na de ovulatie

zullen ROS en dan vooral waterstofperoxide, superoxideanion en peroxynitriet opstapelen in de

oöcyten (Lord en Aitken, 2013).

Oxidatieve stress kan ook het begin van de apoptose induceren. Bij een verhoogd gehalte

waterstofperoxides is er een daling van de anti-apoptotische Bcl-2 molecule. De expressie van pro-

apoptotische molecules Bax en caspase-3 wordt gestimuleerd waardoor DNA-fragmentatie kan

optreden en cytochroom c vrijstelling geïnduceerd worden. Na antioxidant behandelingen vertraagt de

start van de DNA-fragmentatie en caspaseactivatie die beiden geassocieerd zijn met postovulatoire

veroudering (Lord en Aitken, 2013).

De grootste hoeveelheid ROS wordt geproduceerd als bijproduct van de oxidatieve fosforylatie (Lord

en Aitken, 2013). De intracellulaire bescherming binnen de oöcyt wordt voornamelijk verzorgd door het

antioxidant glutathione. Hoe groter het tijdsinterval na de ovulatie, hoe minder glutathione nog

aanwezig is binnen de eicel (Yoshida et al., 1993). Een hoge concentratie glutathione binnen de

oöcyt is noodzakelijk bij de fertilisatie voor de vorming van een mannelijke pronucleus alsook voor de

embryonale ontwikkeling tot het blastocystenstadium (Devine et al., 2012). Ook Cysteamine (CSH)

zorgt voor het behoud van het evenwicht tussen oxidanten en antioxidanten, alsook voor een

adequate glutathione peroxide functie. Binnen de oöcyten is een grote hoeveelheid taurine en

hypotaurine aanwezig. Ze worden beiden gesynthetiseerd en gesecreteerd door epitheliale cellen van

het oviduct. Hypotaurine zorgt ondermeer voor de neutralisatie van hydroxylradicalen. Wanneer

hypotaurine vrije radicalen neutraliseert wordt er als bijproduct taurine gevormd. Dit taurine heeft een

indirect antioxidatief effect, het zorgt namelijk voor neutralisatie van cytotoxische aldehydes die

geproduceerd worden door ROS als eindproduct bij peroxidatie cascade reacties (Guérin et al., 2001).

Dehydroascorbaat modificeert lipoproteïnes zodat ze beter resistent zijn tegen metaal geïnduceerde

oxidatie. Ook zorgt het ascorbaat voor de stimulatie van de vrijstelling van hypotaurine en taurine door

de epitheelcellen van het oviduct. In de aanwezigheid van transitiemetalen vertoont het ascorbaat een

pro-oxidatieve werking (Guérin et al, 2001).

15

β-caroteen is aanwezig in het folliculair vocht in een concentratie die in proportie is met de

bloedconcentratie. β-caroteen kan passief in het folliculair vocht diffunderen. Er zijn echter ook carrier

molecules die β-caroteen actief in het folliculair vocht transporteren waardoor er een

concentratieverschil kan ontstaan tussen de folliculaire en de plasmaconcentratie. De oöcyten kunnen

beschermd worden door β-caroteen tegen schade veroorzaakt door ROS. Dit β-caroteen kan

extracellulair aanwezig zijn in het folliculaire vocht, maar kan ook intracellulair ingebouwd zijn in

oöcyten en folliculaire cellen (Ikeda et al., 2005). Ook Vitamine E is aanwezig in het folliculair vocht en

inhibeert NADPH oxidase-gemedieerde vorming van superoxide anionen (Guérin et al., 2001).

Verder zijn er ook nog de enzymatische verdedingsmechanismen. De belangrijkste zijn superoxide

dismutase (SOD), catalase en GPX. Deze enzymen beschermen oöcyten tegen peroxidatieve schade

veroorzaakt door ROS. H2O2 is een bijproduct tijdens de reacties van SOD. Dit H2O2 wordt op zijn

beurt ook geneutraliseerd door catalase en GPX. Koper, zink superoxide dismutase en mangaan

superoxide dismutase zullen zorgen voor de neutralisatie van superoxideradicalen (Guérin et al.,

2001). De expressie van de verschillende genen die instaan voor de antioxidatieve enzymen kan up-

of downgeruleerd worden. De expressie van deze genen wordt onder andere gestimuleerd door

oxidatieve stress (Maître et al., 1993). De beschermingsmechanismen van antioxidanten zijn

grotendeels gelijkaardig voor de eicel en het embryo (Guérin et al., 2001).

ROS hebben niet enkel een negatieve invloed op de eicel. ROS zijn belangrijk voor de ovulatie. Ze

zullen ook onder andere bijdragen tot een succesvolle interactie tussen de gameten bij de bevruchting

(Blondin et al., 1997).

4.2. Inwerking op de granulosacel

Granulosacellen zijn aanwezig in primordiale follikels. Binnen deze primordiale follikel omgeven ze de

immature eicel. Bij het rund wordt de reserve van primordiale follikels reeds gevormd tijdens het

foetale leven. Door activering van de folliculaire groei gaat de primordiale follikel evolueren naar een

primaire follikel. In de primaire follikel zijn de granulosacellen talrijker en zullen ze een cuboïdale vorm

aannemen. Wanneer de follikel verder ontwikkeld naar een secundaire follikel zijn er 2 of meerdere

lagen granulosa cellen waarneembaar alsook een zona pellucida tussen de granulosacellen en de

oöcyt. Tijdens de verdere ontwikkeling van de follikels zullen steeds meer granulosacellen ontstaan

(Aerts en Bols, 2004). Granulosacellen produceren steroïden en groeifactoren. Ze zijn van groot

belang bij folliculaire atresie en essentieel in de maturatie van de follikels (Jančar et al., 2007).

Een te hoge productie van ROS in de granulosacellen heeft een negatief effect op de oöcyt, de

embryokwaliteit en de implantatie. Ze kan eveneens resulteren in oxidatieve stress in de folliculaire

vloeistof (Jančar et al., 2007).

ROS zijn echter noodzakelijk tijdens het fysiologisch proces van de ovulatie (Rizzo et al., 2009). De

ovulatie gelijkt op een inflammatoire reactie. Een follikel zal cysteus worden wanneer deze niet

16

ovuleert en zal persisteren op het ovarium (Vanholder et al., 2006). De ROS worden geproduceerd

door macrofagen en neutrofielen aanwezig in het ovarium (Fujii et al., 2005). Dit gebeurt in een TNF-α

gemedieerde cascade die zorgt voor de productie van leukotriëne B4. De apoptose van

granulosacellen wordt normaal gestimuleerd door ROS waardoor ovulatie mogelijk is. Het vocht

binnen cystes heeft een lagere concentratie ROS dan het normale follikelvocht. Deze lage

concentratie ROS kan eventueel onvoldoende zijn voor het induceren van apoptose van granulosa en

theca interna cellen waardoor de ovulatie niet kan optreden. ROS zorgen ook voor de vorming van

metalloproteïnasen uit hun proenzymes. Metalloproteïnasen staan in voor de extracellulaire

remodelling die noodzakelijk is voor de ovulatie. Deze mechanismen van ROS die de ovulatie

beïnvloeden moeten dus in acht genomen worden wanneer therapieën met antioxidanten aangewend

worden bij koeien dicht bij de bronst. Wanneer de ROS concentratie door deze therapieën verminderd

wordt kan dit leiden tot een onvermogen om te ovuleren met de vorming van folliculaire cyste (Rizzo et

al., 2009). De follikelgrootte is positief gecorreleerd met de concentratie vitamine E en β-caroteen

aanwezig in het folliculair vocht (Schweigert en Zucker, 1988).

4.3. Inwerking op de luteale cellen

Na de ovulatie wordt een corpus luteum gevormd. Dit corpus luteum staat in voor de productie van

progesteron. Bij de biosynthese van steroïdhormonen zoals progesteron worden zuurstofradicalen

gevormd. De eerste en tevens ook limiterende stap tijdens de productie van steroïden is de splitsing

van een zij-keten van de cholesterolmolecule, gekatalyseerd door een mitochondriaal cytochroom

P450 enzym (P450scc). Hierbij wordt cholesterol in pregnolone omgezet. Via een

elektronentransportketen bestaande uit adrenodexine (Adx) en adrenodexine reductase kunnen

elektronen voor deze reactie afgeleid worden van NADPH. De cytochroom P450 groep zorgt voor de

productie van zuurstofradicalen. Deze zuurstofradicalen kunnen cross-linking en aggregatie van

proteïnes veroorzaken. In dit geval ontstaat er een cross-linking tussen P450scc en Adx waardoor het

P450cc inactief wordt. Normaal dissocieert Adx van P450scc na de elektronentransfer en reageert met

adrenodoxine reductase om een nieuw vrij elektron te bekomen (Young et al., 1995). Het β-caroteen

is aanwezig in hoge concentraties in het corpus luteum om de cross-linking tussen P450scc en zijn

elektrondonor adrenodoxine te voorkomen (Rodgers et al., 1995).

Tijdens de oestrale cyclus van koeien is er een stijging van de plasmaprogesteronconcentratie tot dag

16 van de cyclus. Na dag 16 is er een sterke daling van de plasmaprogesteronconcentratie. De

antioxidatieve enzymen SOD en catalase aanwezig in het corpus luteum vertonen een gelijkaardig

profiel. Vitamine C en β-caroteen in het luteale weefsel vertonen een lage maar significante correlatie

met de plasmaconcentratie van progesteron (Rapoport et al., 1997). De concentratie van β-caroteen

in het corpus luteum vertoont een sterke stijging tussen dag 6 en 16 van de cyclus gevolgd door een

sterke daling bij regressie van het luteaal weefsel (Rapoport et al., 1997). Door het hoge gehalte β-

caroteen verkrijgt het corpus luteum of geel lichaam zijn karakteristieke gele kleur (Young et al., 1995).

17

Figuur 2: Concentraties van β-caroteen en vitamine E in het corpus luteum (uit Rapoport et al., 1997).

De stijging van α-tocopherol is minder sterk en verloopt tussen dag 6 en 9 van de cyclus. Na dag 9 is

er een sterke daling waar te nemen. Dit zou eventueel te wijten zijn aan stijgende consumptie door

hogere gehaltes zuurstofradicalen geproduceerd door cytochroom P450. Tijdens de piek van de

steroïdenproductie is de concentratie aan α-tocopherol reeds aan het dalen, terwijl de concentratie

van β-caroteen stijgt. Deze waarnemingen suggereren dat antioxidanten aanwezig zijn in

steroïdogene weefsels, zoals het corpus luteum om de verhoogde productie van zuurstofradicalen op

te vangen (Rapoport et al., 1997). Tijdens de luteale regressie stijgt het gehalte vitamine E en daalt

het gehalte β-caroteen. Dit kan eventueel verklaard worden door een regeneratie van vitamine E

waarbij Vitamine C verbruikt wordt terwijl er geen regeneratie van β-caroteen is (Aten et al., 1992).

Hoge gehaltes aan antioxidanten zoals vitamine C, E, β-caroteen en antioxidatieve enzymes zoals

SOD, catalase, GPX, glutathione-S-transferase en glutathione reductase zijn aanwezig in het corpus

luteum. Nochtans vervullen zuurstofradicalen binnen het corpus luteum ook een functie. Superoxide

en H2O2 mediëren de phospholipase A2 activatie. Dit enzym is de limiterende factor voor de synthese

van prostaglandine F2α. Zo zorgen zuurstofradicalen voor luteolyse en apoptose in het corpus luteum

tijdens elke cyclus (Rapoport et al., 1997).

Behne et al. (1988) toonden aan dat het ovarium één van de preferentiële lokalisaties is van

Selenium. Accumulatie treedt vooral op in het corpus luteum. In vitro werd aangetoond dat Selenium

een direct effect heeft op de luteale cellen, maar ook de lipide peroxide productie van de luteale cellen

vermindert. Selenium is een component van het glutathione peroxidase dat zorgt voor de bescherming

van de luteale cellen tegen oxidatieve schade. Selenium is dus ook een beschermende antioxidant

tijdens de productie van steroïden (Kamada en Ikumo, 1997).

4.4. Inwerking op het embryo

ROS kunnen geproduceerd worden door het metabolisme van het embryo zelf of door diens

omgeving. De belangrijkste ROS die geproduceerd worden door embryo’s zijn O2-, H2O2 en OH

.

(Guérin et al., 2001). Zuurstofradicalen kunnen fungeren als primaire of secundaire messengers om

18

celgroei te stimuleren of celdood te induceren. De redoxstatus beïnvloedt de transcriptiefactoren die

een invloed hebben op pathways die betrokken zijn bij proliferatie, differentiatie en apoptose. De ROS

spelen zo een belangrijke rol in de embryonale ontwikkeling (Dennery, 2007). Een overmaat aan ROS

is embryotoxisch en kan een verandering induceren in moleculen aanwezig in de cel, de verdere

ontwikkeling van het embryo blokkeren alsook vertraagde groei veroorzaken (Guérin et al., 2001). Het

evenwicht en de timing van de antioxidatieve versus de oxidatieve krachten is enorm belangrijk voor

een normale embryonale ontwikkeling (Dennery, 2007). Embryos kunnen beschermd worden tegen

ROS op verschillende complementaire manieren. Allereerst is er een vorm van bescherming die zich

buiten het embryo bevindt. Het gaat hier om de niet-enzymatische antioxidanten zoals vitamine C,

glutathione, cysteamine, taurine en hypotaurine die aanwezig zijn in de folliculaire en tubaire

vloeistoffen. Binnen het embryo verloopt de bescherming tegen ROS voornamelijk via antioxidatieve

enzymes zoals SOD, GPX en γ-glutamylcysteine synthetase (Guérin et al., 2001).

Glutathione (GSH) is het belangrijkste non-enzymatische antioxidant tegen ROS voor embryo’s. Het

zorgt voor de reductie van de omgeving en is het substraat voor glutathione peroxidase. Een ander

niet-enzymatisch antioxidant is cysteamine. Het zorgt voor een bescherming van de cellen tegen

ioniserende straling en is ook belangrijk om OH. te neutraliseren. Verder zijn ook hypotaurine en

taurine net zoals bij de oöcyt belangrijk. (Guérin et al., 2001).

Dehydroascorbaat zorgt net zoals bij de oöcyten voor een modificatie van lipoproteïnes, waardoor zij

een hogere resistentie verwerven ten opzichte van metaalion geïnduceerde oxidatie (Guérin et al.,

2001). Ascorbinezuur zorgt ook hier voor een bescherming tegen endogene DNA schade. In de

aanwezigheid van transitiemetalen vertoont ascorbaat echter een pro-oxidatieve werking (Wang et al.,

2002). Grote hoeveelheden vitamine E zijn aanwezig in het ovarium of in de folliculaire vloeistof. Het

vitamine E zorgt voor een inhibitie van de generatie van een superoxide anion gemedieerd door

NADPH oxidase. Deze vetoplosbare antioxidanten beschermen de membranen tegen oxidatieve

stress (Guérin et al., 2001).

De enzymatische antioxidatieve verdedigingsmechanismen bij het embryo zijn dezelfde als bij de

oöcyt. Ook metaalbindende moleculen zoals albumine en transferrine zijn aanwezig in de omgeving

van het embryo. Zij gaan een binding aan met metaalionen, die katalysatoren kunnen zijn van

enzymatische reacties. Binnen het embryo reageren SOD, GPX en catalase met superoxides en

peroxides vooraleer ze kunnen reageren met metaalkatalysatoren om meer reactieve ROS te vormen

(Guérin et al., 2001).

5. Belang van antioxidanten voor de immuniteit

Oxidatieve stress kan een belangrijke factor zijn bij het ontstaan van een dysfunctionele

immuunrespons. Immuuncellen zijn enorm gevoelig aan oxidatieve stress. Hun membranen bevatten

namelijk hoge gehaltes aan polyonverzadigde vetzuren. Ze zorgen zelf voor een enorme productie

van ROS. Door een verminderde immuunrespons zijn de koeien veel vatbaarder voor een hele resem

19

aandoeningen en dit vooral tijdens de transitieperiode. De functionele capaciteit van de witte

bloedcellen kan onderdrukt zijn door een tekort aan antioxidanten (Sordillo en Aitken, 2009).

Neutrofielen zijn belangrijke cellen voor de afweer van het organisme tegen bacteriële infecties. Ze

fagocyteren en doden de bacteriën (Bendich et al., 1986). Door fagocytose wordt het NADP oxidase

gestimuleerd (Chew en Park, 2004). Tijdens dit proces worden plotseling grote hoeveelheden zuurstof

verbruikt. Hierdoor is er een enorme productie van ROS zoals onder andere waterstofperoxides,

superoxide en hydroxylradicalen. Dit wordt ook de respiratory burst genoemd (Bendich et al., 1986;

Hogan et al., 1990). De geproduceerde ROS staan in voor de vernietiging van de pathogene

bacteriën. De immuniteitscellen zelf kunnen ook beschadigd worden door de grote hoeveelheid ROS

die vrijgesteld worden. Binnen deze immuniteitscellen is er een hoge concentratie aan vitamine C die

instaat voor de bescherming van deze cellen. Gestimuleerde macrofagen en neutrofielen zorgen ook

voor de excretie van vitamine C in het extracellulaire vocht waardoor de omliggende cellen ook

beschermd worden. Vitamine C stimuleert ook de migratie van de neutrofielen in de richting van

chemotactische factoren (Bendich et al., 1986).

Ook selenium en vitamine E hebben een beschermende functie ten opzichte van de ROS die

geproduceerd worden tijdens de respiratory burst. Ze stimuleren binnen neutrofielen de intracellulaire

afdoding van de bacterie waardoor ze afweer tegen infecties versterken. De combinatie van de

supplementatie van zowel Vitamine E als Selenium zorgt niet voor een grotere capaciteit om bacteriën

intracellulair af te doden dan bij afzonderlijke supplementatie van deze componenten (Hogan et al.,

1990). Supplementatie van Vitamine E en Selenium zorgt voor een hoger metabolisme van de

neutrofielen intramammair en in het perifere bloed (Sordillo en Aitken, 2009). Vitamine E en Selenium

supplementatie bij melkkoeien zorgt voor vermindering van het aantal en de duur van intramammaire

infecties. Ook de incidentie van klinische mastitis daalt (Hogan et al., 1990). Er dient opgelet te

worden voor een overmaat aan vitamine E. Bij een hoge supplementatie van vitamine E zien we

immers een verhoogde incidentie van mastitis (Bouwstra et al., 2010b).

Vitamine E inhibeert de auto-oxidatie van polyonverzadigde vetzuren in de membranen van de

neutrofielen. Het zorgt ook voor een betere migratie van neutrofielen naar de melkklier gedurende de

inflammatie door een verhoogde expressie van het urokinase-plasminogeen activator (u-PA) gen. Dit

enzym is belangrijk voor de neutrofielen tijdens de extravasatie om zo de plaats van de inflammatie te

bereiken (Politis, 2012). De resultaten van effect van supplementatie op de fagocytaire activiteit van

neutrofielen zijn niet consistent. Sordillo en Aitken (2009) melden een verhoogde fagocytosecapaciteit

van de neutrofielen bij melkkoeien na supplementatie van vitamine E. Dit in tegenstelling tot Hogan et

al. (1990) die geen effect op de fagocytose konden vaststellen. Dit verschil kan eventueel te wijten zijn

aan supplementatie met verschillende stereoisomeren van α-tocopherol. De neutrofielen van de

koeien gesupplementeerd met de synthetische all-rac vorm hebben een hogere fagocytotische

capaciteit. De neutrofielen van koeien gesupplementeerd met RRR, de natuurlijke vorm van α-

tocopherol waren niet sterker fagocytotisch (Weiss et al., 2009). Vitamine E zorgt voor de stimulatie

van macrofagen. Het zorgt voor een verhoogde interleukine-1 productie alsook voor een verhoogde

20

expressie van MHC klasse II (Sordillo en Aitken, 2009). Onder invloed van Vitamine E wordt de

productie van antistoffen gestimuleerd (Calsamiglia en Rodriguez, 2012).

Selenium is belangrijk voor de capaciteit van fagocyten om te migreren naar de plaats van infectie.

Ook heeft Selenium een impact op het vasculaire endotheel waardoor de restanten van de

inflammatoire respons efficiënter opgeruimd kunnen worden (Sordillo en Aitken, 2009). Door deze

mechanismen is er een verbetering van de mammaire gezondheid en reproductieve functie wat zich

uit in een verminderde incidentie van mastitis, metritis en retentio secundinarum (Calsamiglia en

Rodriguez, 2012).

Ook β-caroteen heeft een immunomodulerende werking. Het zorgt ondermeer voor een verhoogde

blastogenese van de lymfocyten, een toename van bepaalde subsets van lymfocyten, een verhoogde

cytotoxische werking van de lymfocyten en een stimulatie van de productie van verschillende soorten

cytokines. β-caroteen heeft niet enkel een invloed op de lymfocyten. Het stimuleert ook de fagocytose

en intracellulaire kiemdoding binnen de neutrofielen en peritoneale macrofagen. Deze

immunostimulerende werking heeft een positief effect op de algemene, reproductieve en mammaire

gezondheid (Chew, 1993; Chew en Park, 2004). Deze verbeterde mammaire gezondheid uit zich als

een daling van het celgetal en het aantal nieuwe infecties, dit zowel tijdens lactatie als tijdens de

droogstand (Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Ook Chew et al. (1982) vonden significante verschillen

met behulp van de California Mastitis Test Scores bij evaluatie van mastitis koeien. De koeien met een

lage β-caroteenconcentratie in het plasma hadden hogere somatische celgetallen in de melk. Dit is

(Chew et al, 1982). Deze somatische cellen in de melk zijn een goede weergave van de

immuunrespons die ontstaat bij een intramammaire infectie (Pillai et al., 2001). In tegenstelling tot

deze resultaten is in verschillende studies geen invloed van β-caroteensupplementatie op het celgetal

van de melk vastgesteld (Bindas et al, 1983; Jukola et al., 1996).

6. Voorgestelde optimale voedingsstrategie

Oxidatieve stress draagt bij tot verschillende reproductieve aandoeningen zoals retentio secundinarum

en mastitis, alsook tot een suboptimale voortplanting. De behoeften van hoogproductief melkvee

betreffende antioxidanten kunnen hoger zijn dan algemeen werd aangenomen. De concentratie

antioxidanten in gemiddelde voeders kan te laag zijn ten opzichte van de concentratie ROS die

geproduceerd worden tijdens het metabolisme. Supplementatie van antioxidanten kan dus in veel

gevallen voordeel bieden (Miller en Brzezinska-Slebodzinska, 1993).

Volgens de NRC (2001) zijn er onvoldoende data beschikbaar over β-caroteen om een specifieke

aanbeveling te formuleren. De plasmaconcentratie van β-caroteen daalt nochtans drastisch

peripartum (Chawla en Kaur, 2004). Dit kan verklaard worden door de lage kwaliteit hooi tijdens de

droogstand en de verhoogde immunologische behoeften peripartum. Er zijn er in verschillende studies

voordelen aangetoond van β-caroteen supplementatie. Deze bevindingen suggereren dat in bepaalde

omstandigheden supplementatie voordelen kan bieden. Supplementatie van 300-600 mg/d β-caroteen

21

tijdens de droogstand en 2 tot 3 maanden postpartum verbetert de uiergezondheid en de

reproductieve functies (Calsamigla en Rodriguez, 2012).

Het gehalte aan vitamine E in het basale dieet is sterk variabel en is vaak niet gekend. Daarom wordt

de vitamine E behoefte uitgedrukt door middel van supplementatie. De voederstrategie voor vitamine

E dient opgedeeld te worden in 3 groepen. Men maakt onderscheid tussen kalveren gevoed met melk,

lacterende koeien en droogstaande koeien. Voor kalveren wordt er een gehalte van 50 IU/kg droge

stof aangeraden. Een voldoende opname van colostrum gedurende de eerste 24u en de concentratie

vitamine E in het colostrum zijn van groot belang voor het kalf. De transfer van Vitamine E door de

placenta is namelijk laag. Het gehalte aan Vitamine E in het colostrum kan verhoogd worden door

supplementatie van de koe tijdens droogstand (NRC, 2001). Er is nood aan grootschalige studies die

de effecten van bijkomende vitamine E supplementatie in kaart brengen. Er is namelijk slechts weinig

informatie beschikbaar. Er bestaan 2 situaties waarin een bijkomende vitamine E supplementatie

noodzakelijk is. Enerzijds is er bij kalveren een hoge incidentie aan gastro-intestinale aandoeningen

waardoor de absorptie sterk verminderd is. Anderzijds is er een interferentie met vitamine A wanneer

dit vitamine A gesupplementeerd wordt in een hoge concentratie. Afhankelijk van de specifieke

situatie dient dus nagedacht te worden of supplementatie noodzakelijk is (Calsamiglia en Rodriguez,

2012).

Bij de aanbevolen waarden voor supplementatie bij oudere runderen veronderstelt men dat het

basisrantsoen bestaat uit ingekuilde ruwvoeders. Grazende runderen hebben namelijk een lagere

behoefte aan extra vitamine E. Wanneer het rantsoen vooral bestaat uit krachtvoer en slecht een klein

deel vers ruwvoer zal een hogere supplementatie vereist zijn. Er zijn nog een aantal andere situaties

waarbij een verhoogde vitamine E supplementatie vereist is. Dit is het geval bij een suboptimale

seleniumstatus, tijdens de productie van colostrum waarbij een grote hoeveelheid Vitamine E

geëxcreteerd wordt, bij het voederen met beschermde onverzadigde vetten en tijdens periodes van

immunosuppressie zoals peripartum het geval is (NRC, 2001).

Voor lacterende koeien zijn de aanbevelingen 0.8 IU/kg lichaamsgewicht, ongeveer 20 IU/kg van de

droge stof inname of gewoon 500 IU/d (NRC, 2001). Er werd aangetoond dat supplementatie van

vitamine E aan lacterende koeien zorgt voor een verminderde incidentie van klinische mastitis. Bij een

supplementatie van vitamine E van minder dan 23 IU/kg werd verhoging van het aantal gevallen van

klinische mastitis vastgesteld ten opzichte van het gemiddeld aantal gevallen in deze studie (Weiss et

al., 1990). Dit suggereert dat supplementatie boven de momenteel aanbevolen gehalten een voordeel

kan hebben voor de uiergezondheid (Calsamiglia en Rodriguez, 2012). De opname van vitamine E is

ideaal bij plasmaconcentraties boven de 3-3.5 μg/ml. Boven deze plasmagehaltes worden geen

verdere positieve effecten waargenomen (Baldi, 2005). Een supplementatie boven aanbevolen

gehaltes zou enkel overwogen moeten worden bij een overmaat aan vitamine A of bij een tekort aan

selenium (Calsamiglia en Rodriguez, 2012).

Voor koeien tijdens de droogstand zijn andere aanbevelingen geformuleerd. Weiss et al. (1997)

bevelen peripartum een plasmaconcentratie van 3μg/ml vitamine E aan. Onder deze

22

plasmaconcentratie is het risico op mastitis beduidend hoger (Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Op

basis van deze aanbeveling zijn er richtlijnen met betrekking tot de supplementatie van droogstaande

koeien vastgelegd. Om deze plasmaconcentratie te handhaven bij peripartum koeien wordt er een

supplementatie van 1.6IU/kg lichaamsgewicht, ongeveer 80 IU/kg droge stof of gewoon 1000 IU/d

geadviseerd. De verschillende aanbevelingen voor de 2 groepen van volwassen runderen wordt

vooral veroorzaakt door een verschil in voederopname en een verminderde absorptie bij

droogstaande koeien uit hun droogstand rantsoen (NRC, 2001). Supplementatie van vitamine E via de

voeding kan een daling van de plasmaconcentratie tijdens de partus en gedurende de eerste weken

niet voorkomen. Dit kan opgelost worden met behulp van parenterale supplementatie (Hogan et al.,

1992). Resultaten uit verschillende studies tonen echter aan dat hoewel de daling in

plasmaconcentratie van vitamine E niet vermeden wordt, er toch positieve effecten van orale

supplementatie van vitamine E waarneembaar zijn. Zo ziet men een verbetering van de immuniteit en

een verbeterde uiergezondheid. Uit verschillende studies is gebleken dat supplementatie boven de

momenteel voorgestelde aanbevelingen een voordeel kan bieden (Calsamiglia en Rodriguez, 2012).

Ook Politis (2012) stelt eerder een supplementatie van 1000-3000 IU/d voor. Er dient bij vitamine E

echter opgelet te worden voor oversupplementatie. Supplementatie zou enkel aangewezen zijn bij

oxidatieve stress. De initiële vitamine E concentratie in het bloed mag niet te hoog zijn en het α-

tocopheroxyl radicaal moet verwerkt kunnen worden door andere antioxidanten zoals onder andere

vitamine C (Bouwstra et al., 2010a).

De NRC (2001) raadt een seleniumgehalte van 0.3mg/kg aan in de droge stof. In vele streken is het

gehalte aanwezig in de planten gebruikt voor de voeding minder dan 0.3mg/kg. Er is vaak dus

supplementatie van Selenium nodig ondanks de lage behoeften (Spears en Weiss, 2008). Selenium

kent een efficiënte passage door de placenta. Kalveren hebben een betere seleniumstatus wanneer

de koe prepartum een adequate seleniumvoorziening heeft gehad ten opzichte van koeien die dit niet

hebben gehad (NRC, 2001). De concentratie van Selenium in de melk stijgt bij supplementatie van de

koe (Grace et al., 1997). Dit kan positieve gevolgen hebben voor het kalf (NRC, 2001). Om mastitis

zoveel mogelijk te voorkomen dient selenium aanwezig te zijn in het bloed aan een concentratie van

180µg/L (Jukola et al., 1996). De behoefte aan selenium wordt sterk beïnvloed door de vitamine E

status. De behoeftes aan selenium zijn verhoogd bij hoge of lage calcium gehaltes en hoge

zwavelgehaltes in het dieet (NRC, 2001).

Zoals reeds eerder vermeld staan herkauwers zelf in voor de synthese van vitamine C (Ranjan et al.,

2012). De enige leeftijdsgroep die voordeel zou kunnen halen uit supplementatie zijn de kalveren

omdat ze zelf nog niet in staat zijn tot endogene productie (Cummins en Brunner, 1991). Ook tijdens

periodes van stress zou er een verhoogde behoefte aan vitamine C kunnen zijn. Het positieve effect

van vitamine C zou vooral te wijten zijn aan de stimulatie van de functie neutrofielen. Er zijn geen data

beschikbaar die zouden kunnen wijzen op een positief effect van supplementatie van vitamine C aan

volwassen dieren (Calsamiglia en Rodriguez, 2012). Na orale opname wordt vitamine C afgebroken in

de pens. Nieuwe formulaties kunnen hiervoor een oplossing bieden (NRC, 2001).

23

BESPREKING

ROS kunnen in bepaalde situaties voordelig zijn. Ze zijn onder meer noodzakelijk voor het proces van

de ovulatie. Binnen het embryo zijn ROS ook belangrijk voor de embryonale ontwikkeling. Een

overmaat aan ROS kan er echter voor zorgen dat de embryonale ontwikkeling wordt vertraagd of

geblokkeerd. ROS zijn ook belangrijk voor de werking van de cellen die instaan voor de immuniteit.

Tijdens de respiratory burst van neutrofielen is er een enorme productie van ROS die zorgen voor de

afdoding van pathogene bacteriën. De neutrofielen zelf hebben echter wel nood aan bescherming

door antioxidanten tegen de grote hoeveelheid ROS die geproduceerd worden. Essentieel zijn de

timing en het evenwicht tussen antioxidatieve en oxidatieve krachten.

Supplementatie van antioxidanten kan voordelig zijn bij een suboptimale plasma antioxidantstatus.

Voor de meeste antioxidanten worden positieve effecten van een hoge supplementatie waargenomen.

Op het niveau van de eicel zorgen antioxidanten voor een remming van de postovulatoire

veroudering. Ook zijn ze aanwezig in het luteale weefsel om de verhoogde productie van ROS op te

vangen tijdens de steroïdogenese. Met de supplementatie van vitamine E daarentegen dient

voorzichtig omgesprongen te worden. Bij een te hoge supplementatie van vitamine E wordt een

negatieve invloed op de uiergezondheid waargenomen. Hierbij kan men in bepaalde studies een

verhoogde incidentie aan klinische mastitis waarnemen. De recentste voedingsrichtlijnen opgesteld

door de NRC dateren al van 2001. Recenter onderzoek toont echter aan dat een supplementatie van

verschillende antioxidanten boven de vastgestelde normen een voordeel kan bieden. Zo zijn er

positieve effecten waarneembaar bij β-caroteen supplementatie waar voordien gesteld werd dat er

onvoldoende informatie beschikbaar was om een voedingsrichtlijn op te stellen. De behoefte aan

supplementatie van vitamine E is sterk afhankelijk van zijn plasmastatus. Afhankelijk van de specifieke

situatie dient nagedacht te worden of er supplementatie nodig is. Er dient opgelet te worden voor

oversupplementatie in verband met de mastitisproblematiek. Voor selenium kan nog steeds dezelfde

richtlijn van 0.3 mg/kg aangehouden worden. De behoefte van selenium wordt sterk beïnvloed door de

vitamine E status. Voor vitamine C zijn nog steeds geen resultaten beschikbaar die zouden kunnen

wijzen op een positief effect van supplementatie bij volwassen dieren. Dit kan te wijten zijn aan de

afbraak van de formulaties in de pens.

Uit deze literatuurstudie kan geconcludeerd worden dat de plasma antioxidantstatus van groot belang

is om de gezondheid en vruchtbaarheid van melkvee optimaal te houden. Supplementatie van

antioxidanten bij melkkoeien met een suboptimale plasma antioxidantstatus kan immers leiden tot een

verbetering van de reproductieve parameters en reductie van het voorkomen van reproductieve

aandoeningen. Bij supplementatie van vitamine E moet echter opgelet worden voor

oversupplementatie in verband met de mastitisproblematiek. Om de nood aan supplementatie van de

verschillende antioxidanten in kaart te brengen zou een onderzoek naar de plasmaconcentraties van

melkkoeien in verschillende populaties nuttig kunnen zijn. Extra onderzoek in de toekomst is nog

nodig om een exacte voedingsrichtlijn voor β-caroteen op te stellen. Ook dienen er voor vitamine E

supplementatie nieuwe formulaties ontwikkeld te worden die niet afgebroken worden in de pens.

24

REFERENTIELIJST

Abuelo A., Hernández J., Benedito J.L., Castillo C. (2013). Oxidative stress index (OSi) as a new tool

to assess redox status in dairy cattle during the transition period. Animal 7 (8), 1374-1378.

Aerts J.M.J., Bols P.E.J. (2004). De boviene ovariële folliculaire dynamiek. Deel I: folliculogenese &

pre-antrale ontwikkeling. Vlaams Diergeneeskundig tijdschrift 73, 238-249.

Aten R.F., Duarte K.M., Behrman H.R. (1992). Regulation of Ovarian Antioxidant Vitamins, Reduced

Glutathione, and Lipid Peroxidation by Luteinizing Hormone and Prostaglandin F2α. Biology of

Reproduction 46, 401-407.

Baldi A. (2005). Vitamin E in dairy cows. Livestock Production Science 98, 117-122.

Behne D., Hilmert H., Scheid S., Gessner H., Elger W. (1988). Evidence for specific selenium target

tissues and new biologically important selenoproteins. Biochimica et Biophysica Acta 966, 12-21.

Bendich A., Machlin L.J., Scandurra O. (1986). The antioxidant Role of Vitamin C. Advances in Free

Radical Biology & Medicine 2, 419-444.

Bernabucci U., Ronchi B., Lacetera N., Nardone A. (2005). Influence of Body Condition Score on

Relationships Between Metabolic Status and Oxidative Stress in Periparturient Dairy Cows. Journal of

Dairy Science 88, 2017-2026.

Bindas E.M., Gwazdauskas F.C., Aiello R.J., Herbein J.H., McGilliard M.L., Polan C.E. (1984).

Reproductive and Metabolic Characteristics of Dairy Cattle Supplemented with β-Carotene. Journal of

Dairy Science 67, 1249-1255.

Blondin P., Coenen K., Sirard M. (1997). The Impact of Reactive Oxygen Species on Bovine Sperm

Fertilizing Ability and Oocyte Maturation. Journal of Andrology 18, 454-460.

Bosio G.N., Breitenbach T., Parisi J., Reigosa M., Blaikie F.H., Pedersen B.W., Silva E.F.F., Mártire

D.O., Ogilby P.R. (2013). Antioxidant β-Carotene Does Not Quench Singlet Oxygen in Mammalian

Cells. Journal of the American Chemical Society 135, 272-279.

Bouwstra R.J., Nielen M., Newbold J.R., Jansen E.H.J.M., Jelinek H.F., Van Werven T. (2010a).

Vitamin E supplementation during the dry period in dairy cattle. Part II: Oxidative stress following

vitamin E supplementation may increase clinical mastitis incidence postpartum. Journal of Dairy

Science 93, 5696-5706.

Bouwstra R.J., Nielen M., Stegeman J.A., Dobbelaar P., Newbold J.R., Jansen E.H.J.M., Van Werven

T. (2010b). Vitamin E supplementation during the dry period in dairy cattle. Part I: Adverse effect on

incidence of mastitis postpartum in a double-blind randomized field trial. Journal of Dairy Science 93,

5684-5695.

25

Brozos C.N., Kiossis E., Georgiadis M.P., Piperelis S., Boscos C. (2009). The effect of chloride

ammonium, vitamin E and Se supplementation throughout the dry period on the prevention of retained

fetal membranes, reproductive performance and milk yield of dairy cows. Livestock Science 124, 210-

215.

Burton G.W. (1989). Antioxidant Action of Carotenoids. Journal of Nutrition 119, 109-111.

Calsamiglia S., Rodriguez M. (2012). Optimum vitamin nutrition in dairy cattle. In: Linden J. (Editor)

Optimum vitamin nutrition in the production of quality animal foods, 1st edition, 5M Publishing,

Sheffield, p.335-385.

Campbell M.H., Miller J.K. (1998). Effect of Supplemental Dietary Vitamin E and Zinc on Reproductive

Performance of Dairy Cows and Heifers Fed Excess Iron. Journal of Dairy Science 81, 2693-2699.

Castillo C., Hernandez J., Bravo A., Lopez-Alonso M., Pereira V., Benedito J.L. (2005). Oxidative

status during late pregnancy and early lactation in dairy cows. The Veterinary Journal 169, 286-292.

Chauveau-Duroit B., Thomas D., Portelli J., Doreau M. (2005). Effet du mode de conservation sur la

teneur en caroténoïdes des fourrages. Rencontres autour des Recherches sur les ruminants 12, 117.

Chawla R., Kaur H. (2004). Plasma antioxidant vitamin status of periparturient cows supplemented

with α-tocopherol and β-carotene. Animal Feed Science and Technology 114, 279-285.

Chew B.P. (1993). Role of Carotenoids in the Immune Response. Journal of Dairy science 76, 2804-

2811.

Chew B.P., Hollen L.L., Hillers J.K., Herlugson M.L. (1982). Relationship Between Vitamin A and β-

Carotene in Blood Plasma and Milk and Mastitis in Holsteins. Journal of Dairy Science 65, 2111-2118.

Chew B.P., Park J.S. (2004). Carotenoid Action on the Immune Response. Journal of Nutrition 134,

257S-261S.

Cummins K.A., Brunner C.J. (1991). Effect of Calf Housing on Plasma Ascorbate and Endocrine and

Immune function. Journal of Dairy Science 74, 1582-1588.

de Matos D.G., Furnus C.C., Moses D.F. (1997). Glutathione synthesis during In Vitro Maturation of

Bovine Oocytes: Role of Cumulus Cells. Biology of Reproduction 57, 1420-1425.

Dennery P.A. (2007). Effects of Oxidative Stress on Embryonic Development. Birth Defects Research

(Part C) 81, 155-162.

de Ondarza M.B., Engstrom M. (2009). Can beta-carotene help dairy reproduction?. Feedstuffs 81

(40), 16-22.

Devine P.J., Perreault S.D., Luderer U. (2012). Roles of Reactive Oxygen Species and Antioxidants in

Ovarian Toxicity. Biology of Reproduction 86 (2), 27.

26

Eaton P. (2006). Protein thiol oxidation in health and disease: Techniques for measuring disulfides

and related modifications in complex protein mixtures. Free Radical Biology & Medicine 40, 1889-

1899.

Eger S., Drori D., Kadoori I., Miller N., Schindler H. (1985). Effects of Selenium and Vitamin E on the

Incidence of Retained Placenta. Journal of Dairy Science 68, 2119-2122.

Fujii J., Iuchi Y., Okada F. (2005). Fundamental roles of reactive oxygen species and protective

mechanisms in the female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology 3, 43.

Ghiselli A., Serafini M., Natella F., Scaccini C. (2000). Total antioxidant capacity as a tool to assess

redox status: critical view and experimental data. Free Radical Biology & Medicine 29 (11), 1106-1114.

Grace N.D., Knowles S.O., Lee J. (1997). Relationships between blood Se concentrations and milk

somatic cell counts in dairy cows. New Zealand Veterinary Journal 45, 171-172.

Guérin P., El Mouatassim S., Ménézo Y. (2001). Oxidative stress and protection against reactive

oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Human Reproduction Update 7

(2), 175-189.

Halliwel B., Gutteridge J.M.C. (1989). Free radicals in biology and medicine. 2nd edition. Clarendon

Press, Oxford, UK. Geciteerd door Sies H. (1997).

Harrison J.H., Hancock D.D., Conrad H.R. (1982). Vitamin E and Selenium for Reproduction of the

Dairy Cow. Journal of Dairy Science 67, 123-132.

Hemken R.W., Bremel D.H. (1982). Possible Role of Beta-Carotene in Improving Fertility in Dairy

Cattle. Journal of Dairy Science 65, 1069-1073.

Hogan J.S., Smith K.L., Weiss W.P., Todhunter D.A., Schockey W.L. (1990). Relationships Among

Vitamin E, Selenium, and Bovine Blood Neutrophils. Journal of Dairy Science 73, 2372-2378.

Hogan J.S., Weiss W.P., Todhunter D.A., Smith K.L., Schoenberger P.S. (1992). Bovine Neutrophil

Responses to Parenteral Vitamin E. Journal of dairy Science 75, 399-405.

Hurley W.L., Doane R.M. (1987). Recent Developments in the Roles of Vitamins and Minerals in

Reproduction. Journal of Dairy Science 72, 784-804.

Ikeda S., Kitagawa M., Imai H., Yamada M. (2005). The Roles of Vitamin A for Cytoplasmatic

Maturation of Bovine Oocytes. Journal of Reproduction and Development 51, 23-35.

Iqbal K., Kahn A., Khattak M.A.K. (2004). Biological Significance of Ascorbic Acid (Vitamin C) in

Human Health - A Review. Pakistan Journal of Nutrition 3 (1), 5-13.

27

Jančar N., Kopitar A.N., Ihan A., Klun I.V., Bokal E.V. (2007). Effect of apoptosis and reactive oxygen

species production in human granulosa cells on oocyte fertilization and blastocyst development.

Journal of Assisted Reproduction and Genetics 24, 91-97.

Jukola E., Hakkarainen J., Saloniemi H., Sankari S. (1996). Blood Selenium, Vitamin E, Vitamin A, and

β-Carotene Concentrations and Udder Health, Fertility Treatments, and Fertility. Journal of Dairy

Science 79, 838-845.

Kakhlon O., Cabantchik Z.I. (2002). The labile iron pool: characterization, measurement and

participation in cellular processes. Free Radical Biology and Medicine 33 (8), 1037-1046.

Kamada H., Ikumo H. (1997). Effect of selenium on cultured bovine luteal cells. Animal Reproduction

Science 46, 203-201.

Kawashima C., Nagashima S., Sawada K., Schweigert F.J., Miyamoto A., Kida K. (2010). Effect of β-

Carotene Supply During Close-Up Dry Period on the Onset of First Postpartum Luteal Activity in Dairy

Cows. Reproduction in Domestic Animals 45, e282-e287.

Krinsky N.I. (1989). Antioxidant Functions of Carotenoids. Free Radical Biology & Medicine 7, 617-

635.

Kuhl J., Aurich J.E., Wulf M., Hurtienne A., Schweigert F.J., Aurich C. (2012). Effects of oral

supplementation with β-carotene on concentrations of β-carotene, vitamin A and α-tocopherol in

plasma, colostrum and milk of mares and plasma of their foals and on fertility in mares. Journal of

Animal Physiology and Animal Nutrition 96 (3), 376-384.

Lord T., Aitken R.J. (2013). Oxidative stress and ageing of the post-ovulatory oocyte. Reproduction

146, 217-227.

Lykkesfeldt J., Svendsen O. (2006). Oxidants and antioxidants in disease: oxidative stress in farm

animals. The veterinary Journal 173, 502-511.

Machlin L.J., Bendich A. (1987). Free radical tissue damage: protective role of antioxidant nutrients.

The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology 1, 441-445.

Mäenpää P.H., Koskinen T., Koskinen E. (1988). Serum profiles of vitamins A, E and D in mares and

foals during different seasons. Journal of Animal Science 66, 1418-1423.

Maître B., Jornot L., Junod A. F. (1993). Effects of inhibition of catalase and superoxide dismutase

activity on antioxidant enzyme mRNA levels. American Journal of Physiology 265, L636-L643.

Marco-Ramell A., Arroyo L., Saco Y., García-Heredia A., Camps J., Fina M., Piedrafita J., Bassols A.

(2012). Proteomic analysis reveals oxidative stress response as the main adaptative physiological

mechanism in cows under different production systems. Journal of Proteomics 75, 4399-4411.

28

Miller J.K., Brzezinska-Slebodzinska E. (1993). Oxidative stress, Antioxidants, and Animal function.

Journal of Diary Science 76, 2812-2823.

Nelson D.L., Cox M.M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry. 5th Edition. W.H. Freeman and

Company, New York, p.558-563.

Niki E. (2014). Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and in vivo

evidence. Free Radical Biology and Medicine 66, 3-12.

NRC (2001). Nutrient requirements of dairy cattle. 7th edition. National Academy Press, Washington

D.C., p141-173.

Oram J.F., Vaughan A.M., Stocker R. (2001). ATP-binding Cassette Transporter A1 Mediates Cellular

Secretion of α-Tocopherol. The Journal of Biological Chemistry 276 (43), 39898-39902.

Padilla L., Shibano K., Inoue J., Matsui T., Yano H. (2005). Plasma Vitamin C Concentration is Not

Related to the Incidence of Ketosis in Dairy Cows during the Early Lactation Period. The Journal of

Veterinary Medical Science 67 (9), 883-886.

Pedernera M., Celi P., García S.C., Salvin H.E., Barchia I., Fulkerson W.J. (2010). Effect of diet,

energy balance and milk production on oxidative stress in early-lactating dairy cows grazing pasture.

The Veterinary Journal 186, 352-357.

Pillai S.R., Kunze E., Sordillo L.M., Jayarao B.M. (2001). Application of differential inflammatory cell

count as a tool to monitor udder health. Journal of Dairy Science 84, 1413–1420.

Politis I. (2012). Reevaluation of vitamin E supplementation of dairy cows: bioavailability, animal health

and milk quality. Animal 6 (9), 1427-1434.

Politis I., Theodorou G., Lampidonis A.D., Kominakis A., Baldi A. (2012). Short communication:

Oxidative status and incidence of mastitis relative to blood α-tocopherol concentrations in the

postpartum period in dairy cows. Journal of Dairy Science 95, 7331-7335.

Qu Y., Lytle K., Traber M.G., Bobe G. (2013). Depleted serum vitamin E concentrations precede left

displaced abomasum in early-lactation in dairy cows. Jounal of Dairy Science 96, 3012-3022.

Ranjan R., Ranjan A., Dhaliwal G.S., Patra R.C. (2012). L-Ascorbic acid (vitamin C) supplementation

to optimize health and reproduction in cattle. Veterinary Quarterly 32 (3-4), 145-150.

Rapoport R., Sklan D., Wolfenson D., Shaham-Albalancy A., Hanukoglu I. (1998). Antioxidant capacity

is correlated with steroidogenic status of the corpus luteum during the bovine estrous cycle.

Biochimica et Biophysica Acta 1380, 133-140.

Rizzo A., Ceci E., Pantaleo M., Mutinati M., Spedicato M., Minoia G., Sciorsci R.L. (2013). Evaluation

of blood and milk oxidative status during early postpartum of dairy cows. Animal 7 (1), 118-123.

29

Rizzo A., Minoia G., Trisolini C., Mutinati M., Spedicato M., Jirillo F., Sciorsci R.L. (2009). Reactive

Oxygen Species (ROS): involvement in bovine follicular cysts etiopathogenesis. Immunopharmacology

and Immunotoxicology 31 (4), 631-635.

Rodgers R.J., Lavranos T.C., Rodgers H.F., Young F.M., Vella C.A. (1995). The Physiology of the

Ovary: Maturation of Ovarian Granulosa Cells and a Novel Role for Antioxidants in the Corpus

Luteum. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 53 (1-6), 241-246.

Santos M.V., Lima F.R., Rodrigues P.H.M., Barros S.B.M., Laranja da Fonseca L.F. (2001). Plasma

Ascorbate Concentrations Are Not Correlated With Milk Somatic Cell Count and Metabolic Profile in

Lactating And Dry Cows. Journal of Dairy Science 84, 134-139.

Schweigert F.J., Zucker H. (1988). Concentrations of vitamin A, β-carotene and vitamin E in individual

bovine follicles of different quality. Journal of Reproduction and Fertility 82, 575-579.

Sies H. (1993). Strategies of antioxidant defense. European Journal of Biochemistry 215, 213-219.

Sies H. (1997). Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology 82, 291-295.

Sies H., Stahl W. (1995). Vitamins E and C, β-carotene, and other carotenoids as antioxidants.

American Journal of Clinical Nutrition 62, 1315S-1321S.

Shigenaga M.K., Hagen T.M., Ames B.N. (1994). Oxidative damage and mitochondrial decay in aging.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 10771-10778.

Sordillo L.M., Aitken S.L. (2009). Impact of oxidative stress on the health and immune function of dairy

cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology 128, 104-109.

Spears J.W., Weiss W.P. (2008). Role of antioxidants and trace elements in health and immunity of

transition dairy cows. The Veterinary Journal 176, 70-76.

Thafvelin B., Oksanen H.E. (1966). Vitamin E and Linolenic Acid Content of Hay as Related to

Different Drying Conditions. Journal of Dairy Science 49, 282-286.

Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T.D., Mazur M., Telser J. (2007). Free radicals and

antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology 39, 44-84.

Vanholder T., Opsomer G., De Kruif A. (2006). Aetiology and pathogenesis of cystic ovarian follicles in

dairy cattle: a review. Reproduction Nutrion Development 46, 105-119.

Wang J.Y., Larson L.L., Owen F.G. (1982). Effect of beta-carotene supplementation on reproductive

performance of dairy heifers. Theriogenology 18 (4), 461-473.

30

Wang X., Falcone T., Attaran M., Goldberg J.M., Agarwal A., Sharma R.K. (2002). Vitamin C and

Vitamin E supplementation reduce oxidative stress-induced embryo toxicity and improve the blastocyst

development rate. Fertility and Steriliy 78 (6), 1272-1277.

Wang X., Quinn P.J. (1999). Vitamin E and its function in membranes. Progress in Lipid Research 38,

309-336.

Weiss W.P. (1998). Requirements of Fat-soluble Vitamins for Dairy Cows: A Review. Journal of Dairy

Science 81, 2493-2501.

Weiss W.P., Hogan J.S., Smith K.L., Hoblet K.H. (1990). Relationships Among Selenium, Vitamin E,

and Mammary Gland Health in Commercial Dairy Herds. Journal of Dairy Science 73, 381-390.

Weiss W.P., Hogan J.S., Smith K.L., Williams S.N. (1994). Effect of Dietary Fat and Vitamin E on α-

Tocopherol and β-Carotene in Blood of Peripartum Cows. Jounal of Dairy Science 77, 1422-1429.

Weiss W.P., Hogan J.S., Todhunter D.A., Smith K.L. (1997). Effect of Vitamin E supplementation in

Diets with a Low Concentration of Selenium on Mammary Gland Health of Dairy Cows. Journal of

Dairy Science 80, 1728-1737.

Weiss W.P. Hogan J.S., Wyatt D.J. (2009). Relative bioavailability of all-rac and RRR vitamin E based

on neutrophil function and total alpha-tocopherol and isomer concentrations in periparturient dairy

cows and their calves. Journal of Dairy Science 92, 720-731.

Weiss W.P., Wyatt D.J. (2003). Effect of Dietary Fat and Vitamin E on α-Tocopherol in Milk from Dairy

Cows. Journal of Dairy Science 86, 3582-3591.

Yoshida M., Ishigaki K., Nagai T., Chikyu M., Pursel V.G. (1993). Glutathione Concentration during

Maturation and after Fertilization in Pig Oocytes: Relevance to the Ability of Oocytes to Form Male

Pronucleus. Biology of Reproduction 49, 89-94.

Young F.M., Luderer W.B., Rodgers R.J. (1995). The antioxidant β-carotene prevents covalent cross-

linking between cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 and its electron donor,

adrenodoxin, in bovine luteal cells. Molecular and Cellular Endocrinology 109, 113-118.