Academiejaar 2009 - 2010

TRANSDUCTIE VAN HIV-NEF IN T-CELLIJNEN:

ANALYSE VAN RETRO- EN LENTIVIRALE VECTOREN.

Laurens VELDEMAN

Promotor: Prof. Dr. Bruno Verhasselt

Scriptie voorgedragen in de 2de

Master in het kader van de opleiding tot

MASTER IN DE GENEESKUNDE

Academiejaar 2009 - 2010

TRANSDUCTIE VAN HIV-NEF IN T-CELLIJNEN:

ANALYSE VAN RETRO- EN LENTIVIRALE VECTOREN.

Laurens VELDEMAN

Promotor: Prof. Dr. Bruno Verhasselt

Scriptie voorgedragen in de 2de

Master in het kader van de opleiding tot

MASTER IN DE GENEESKUNDE

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en

delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het

auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij

het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

30 april 2010

Laurens Veldeman Prof. Dr. Bruno Verhasselt

Voorwoord

Met het afronden van deze thesis komt een einde aan het „studentenhoofdstuk‟ van de opleiding

geneeskunde. De lessen in de auditoria, het zwoegen op de talrijke cursussen en het befaamde

studentenleven lijken definitief tot het verleden te behoren. De stagejaren worden aangevat, het „echte

leven‟ staat voor de deur. Met spijt in het hart en met een terugblik op vele mooie jaren neem ik met

dit werk afscheid van deze fijne periode.

Deze thesis is niet het werk van mezelf alleen en ik wil dan ook graag enkele personen bedanken die

dit mede mogelijk maakten.

Vooreerst wil ik graag mijn promotor Professor Dr. Bruno Verhasselt bedanken voor de houvast

tijdens mijn eerste kennismaking met het wetenschappelijk onderzoek. U was niet enkel een promotor

maar ook een aanspreekpunt waarbij ik steeds terecht kon, zowel voor vragen in het kader van dit

werk als voor medische problemen of bedenkingen omtrent verdere carrièreplanning. Daarnaast

uiteraard ook veel dank voor het kritisch nalezen en het formuleren van opmerkingen die deze tekst

mee vorm gaven.

Daarnaast wil ik ook mijn begeleider Dr. Kevin Ariën bedanken. U leerde me de kneepjes van het

onderzoeksvak, terwijl we ondertussen konden nakaarten over wielrennen, het studentenleven en

andere levenswijsheden. Ook nadat u een nieuwe uitdaging in Antwerpen aanging, was u steeds bereid

om mijn tekst te analyseren en van commentaar te voorzien. Ik wil ook graag de andere medewerkers

van het HIV-lab bedanken: Evelien, Hanne, Jolien, Valerie, Veronica, Mostafa en Pieter, bedankt dat

jullie steeds klaar stonden om de vele praktische probleempjes te helpen oplossen. Ook gaat mijn dank

uit naar Nathalie, omdat je me bijstond tijdens het praktische werk en daarnaast steeds bereikbaar was

om hierover na te praten. Zonder jullie was er van deze thesis geen sprake geweest!

Ten slotte wil ik enkele mensen bedanken die minder nauw bij dit wetenschappelijk werk betrokken

waren. Vooreerst mijn ouders, omdat jullie me de kans gaven voor deze studie te kiezen. Dankzij jullie

leerde ik ook op mijn eigen benen te staan en met vallen en opstaan mijn eigen weg te vinden.

Daarnaast mijn zus Lynn, voor onze talrijke cliënt en patiënt gerelateerde discussies die me leerden

nadenken over de sociale aspecten van de geneeskunde. Tot slot wil ik ook mijn vriendin Anneleen

bedanken. Jouw gedeelde interesse in de geneeskunde maakte vele geanimeerde discussies in de

voorbije vijf jaar mogelijk. Bedankt ook voor je geduld en luisterend oor tijdens het werken aan dit

project.

Iedereen van harte bedankt!

Inhoudstafel

1. Abstract .......................................................................................................................................... 1

2. Afkortingen .................................................................................................................................... 2

3. Figurenlijst ..................................................................................................................................... 4

4. Inleiding .......................................................................................................................................... 5

4.1 Humaan Immunodeficiëntie Virus ...................................................................................... 5

4.1.1 HIV ontdekking en taxonomie ........................................................................................ 5

4.1.2 HIV Genoom ................................................................................................................... 6

4.1.3 HIV Virion ...................................................................................................................... 7

4.1.4 HIV Replicatie cyclus...................................................................................................... 7

4.2 HIV-Nef .................................................................................................................................. 8

4.2.1 Nef structuur en functie ................................................................................................... 8

4.2.2 Downregulatie van CD4 expressie ................................................................................ 10

4.3 Onderzoeksproject: Transductie van HIV-nef in T-cellijnen ......................................... 10

4.4 Retro- en Lentivirale gentransfer ...................................................................................... 12

4.4.1 Retrovirale vectoren ...................................................................................................... 12

4.4.2 Procedure retrovirale gentransfer .................................................................................. 13

4.4.3 Types retrovirale vectoren ............................................................................................. 13

4.4.4 Transfectie en transductie efficiëntie verhogen ............................................................. 14

4.4.5 Lentivirale vectoren ....................................................................................................... 14

4.4.6 SIN vectoren .................................................................................................................. 15

4.4.7 Retro- en lentivirale vectoren in het onderzoeksproject ................................................ 16

a. Lentivirale TRIP-CMV-GFP-WPRE vector ..................................................................... 16

b. Retrovirale LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP vector. ............................................................... 16

4.5 Humane T-cellijnen ............................................................................................................. 17

5. Methodologie ................................................................................................................................ 17

5.1 Methodologie: Sequentie-analyse TRIP deelonderzoek ................................................... 18

5.1.1 Uitplaten van getransformeerde bacteriële cellen ......................................................... 18

5.1.2 Plasmide DNA purificatie ............................................................................................. 18

5.1.3 Polymerase Chain Reaction ........................................................................................... 19

5.1.4 Agarosegel-electroforese ............................................................................................... 19

5.1.5 DNA Sequencing ........................................................................................................... 20

5.2 Methodologie: Transductie van HIV-nef in T-cellijnen ................................................... 21

5.2.1 Celcultuur. ..................................................................................................................... 21

5.2.2 Cellen tellen ................................................................................................................... 21

5.2.3 Transfectie ..................................................................................................................... 21

5.2.4 Transductie .................................................................................................................... 22

5.2.5 Fluoresence Activated Cell Sorting (FACS) ................................................................. 22

5.2.6 Sorteren van getransduceerde SupT1-cellen ................................................................. 23

5.2.7 Cellen invriezen en ontdooien ....................................................................................... 23

5.2.8 Western Blot .................................................................................................................. 24

a. Stap 1: Cellysaten .............................................................................................................. 24

b. Stap 2: Eiwit concentratie .................................................................................................. 24

c. Stap 3: Eiwit Electroforese ................................................................................................ 25

d. Stap 4: Blotting .................................................................................................................. 26

e. Stap 5: Kleuring. ................................................................................................................ 26

5.2.9 Isolatie en purificatie van DNA ..................................................................................... 27

5.2.10 Isolatie en purificatie van RNA ..................................................................................... 28

5.2.11 Reverse transcriptie mRNA naar cDNA ....................................................................... 28

5.2.12 qPCR ............................................................................................................................. 28

5.2.13 PCR ............................................................................................................................... 29

6. Resultaten ..................................................................................................................................... 30

6.1 Sequentie-analyse TRIP-CMV-EGFP-WPRE .................................................................. 30

6.1.1 Sequencing-PCR strategie Extra TRIP .......................................................................... 30

6.1.2 PCR analyse .................................................................................................................. 32

6.1.3 Extra TRIP in andere TRIP constructen ........................................................................ 33

6.1.4 Extra TRIP BLAST ....................................................................................................... 35

6.2 Transductie van HIV-nef in T-cellijnen ............................................................................ 35

6.2.1 Abnormale fenotype niet exclusief voor Pex Nef transducties ..................................... 35

6.2.2 Getransduceerde SupT1-cellen sorteren ........................................................................ 37

6.2.3 Expressie Nef eiwit........................................................................................................ 38

a. Actine Western Blot: ......................................................................................................... 39

b. Nef Western Blot ............................................................................................................... 39

6.2.4 Verschil in nef transcripten tussen CD4+ en CD4

- celpopulaties .................................. 40

6.2.5 Deletie of mutatie in genomisch DNA nef .................................................................... 42

a. Verschil in lengte nef......................................................................................................... 43

b. Mutatie in nef .................................................................................................................... 44

7. Discussie ....................................................................................................................................... 44

8. Referenties .................................................................................................................................... 49

9. Bijlage ........................................................................................................................................... 54

1

1. Abstract

Wereldwijd zijn er 33,4 miljoen mensen geïnfecteerd met het Humaan Immunodeficiëntie Virus

(HIV). HIV veroorzaakt een verworven immuundeficiëntie syndroom of AIDS, gekenmerkt door een

progressief verlies van CD4-positieve T-cellen en T-helpercel functie.

Nef is een accessoir eiwit van HIV, dat mede door het downreguleren van de CD4 oppervlakte

receptor op cellen van het immuunsysteem, een essentiële rol speelt in de progressie naar AIDS. In dit

project werd gentransfer met retrovirale LZRS-vectoren in humane T-cellen uitgevoerd, waarbij een

onverwachte afwezigheid van CD4 dowregulatie bij Nef Pex allelen werd aangetoond. Om de oorzaak

van dit abnormale fenotype te achterhalen, werden zowel de expressiepatronen van Nef eiwit als het

mRNA van Nef-getransduceerde cellen geanalyseerd. Uit onze analyses blijkt dat in deze cellen geen

volledige Nef eiwit tot expressie komt, terwijl er wel transcript aanwezig is. Hieruit kan besloten

worden dat er een fout op het mRNA niveau aanwezig is, waarschijnlijk berustend op een mutatie in

het reading frame van het nef gen. Toekomstig confirmatie onderzoek zal moeten uitwijzen of deze

veronderstelling gewettigd blijft.

Daarnaast werd in dit project een niet eerder gekarakteriseerde regio in een lentivirale TRIP-vector

onderzocht, waardoor een meer nauwkeurige vectormap opgesteld kon worden.

2

2. Afkortingen

AIDS Acquired Immuno-Deficiency Syndrome

ALL Acute Lymfatische Leukemie

AP Adaptor Protein

bp Basenparen

BSA Bovine Serum Albumin

CD Cluster of Differentiation

cDNA copy DNA

CMV Cytomegalovirus

Cppt Central Polypurine Tract

ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP Deoxyribonucleotide

DOTAP Dioleoyl-Trimethylammonium-Propane

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein

Env Envelope

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FCS Fetal Calf Serum

Gag Group-specific antigen

HEPES Hydroxyethyl-Piperazineethanesulfonic Acid

HIV Humaan Immunodeficientie Virus

HRP Horseradish Peroxidase

HTLV Human T Cell Leukemia Virus

IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium

IRES Internal Ribosome Entry Site

kDa kilo Dalton

LTNP Long-Term Nonprogressor

LTR Long Terminal Repeat

MHC Major Histocompatibility Complex

mRNA Messenger RNA

MuLV Murine Leukemia Virus

Nef Negative Factor

NFW Nuclease Free Water

ORF Open Reading Frame

PBS Phosphate Buffered Saline

PBS Primer Binding Site

PCP Pneumocystis Carinii Pneumonie

PCR Polymerase Chain Reaction

PE Fycoërythrine

PI Propidium Iodide

PIC Pre Integratie Complex

Pol Polymerase

PVDF Polyvinylideenfluoride

qPCR Real-Time quantitative PCR

Rev Regulator Of Viral Protein Expression

RNA Ribonucleic Acid

RRE Rev Responsive Element

RT Reverse Transcriptase

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SIN Self Inactivating

SIV Simian Immunodeficientie Virus

SupT1 Stanford University Pediatric T-Celline

3

SV40 Simian Virus 40

TAE Tris-Acetaat-EDTA

Tat Transcriptional Activator

TBS Tris Buffered Saline

TCR T-Cel Receptor

Vif Viral Infectivity Factor

Vpr Viral Protein R

Vpu Viral Protein U

Vpx Viral Protein X

WPRE Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element

WT Wild-Type

XGPRT Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase

Ѱ Psi Packaging Signal

4

3. Figurenlijst

FIGUUR 1 HIV taxonomie.

FIGUUR 2 Vergelijking genoom eenvoudig en complexe retrovirussen.

FIGUUR 3 Structuur HIV.

FIGUUR 4 Replicatiecyclus HIV.

FIGUUR 5 Overzicht functies HIV-1 Nef.

FIGUUR 6 Vergelijking CD4-downregulatie Nef (niet) getransduceerde SupT1-cellen.

FIGUUR 7 Abnormaal fenotype na Pex Nef transductie.

FIGUUR 8 Essentiële cis-acting elements in retrovirale vectoren en vector replicatie cyclus.

FIGUUR 9 Overzicht proces gentransfer.

FIGUUR 10 Types van retrovirale vectoren.

FIGUUR 11 Voorstelling LTR configuratie in de replicatiecyclus van een eenvoudig retroviraal

genoom.

FIGUUR 12 Schematische weergave SIN-vector en provirale vorm.

FIGUUR 13 TRIP-CMV-GFP-WPRE vector plasmide.

FIGUUR 14 Schematische voorstelling van Nef+ en Nef

- retrovirale vector genomen.

FIGUUR 15 Standaardcurve Western Blot.

FIGUUR 16 Inhoud Xcell II Blot Module.

FIGUUR 17 Afbeelding van de sequentie homologie tussen TRIP-CMV-GFP-WPRE en pHsCXW.

FIGUUR 18 Primer posities in de TRIP-CMV-EGFP-WPRE vector sequentie.

FIGUUR 19 Voorstelling van de gegenereerde TRIP-sequenties op basis van primers 1 t.e.m. 9.

FIGUUR 20 Agarosegel-electroforese TRIP-CMV-EGFP-WPRE.

FIGUUR 21 Agarosegel-electroforese TRIP-CMV-EGFP-WPRE, pTRIP-EF1α, pTRIP-EF1α-

WPRE, pTRIP-CMV en pTRIP-delta U3-CMV-GFP.

FIGUUR 22 Flowcytometrische evaluatie van CD4-receptor downregulatie in niet-getransduceerde

Jurkat-cellen.

FIGUUR 23 Flowcytometrische evaluatie van CD4-receptor downregulatie in SIVsm FWr-nef,

SIVgor-nef en NL4-3 nef getransduceerde SupT1- cellen.

FIGUUR 24 Flowcytometrische evaluatie van CD4-receptor downregulatie in SIVsm FWr-nef,

SIVgor-nef en NL4-3 nef getransduceerde Jurkat-cellen.

FIGUUR 25 Sorteringsstrategie Nef getransduceerde SupT1-cellen.

FIGUUR 26 Flowcytometrische evaluatie Nef gemediëerde CD4-downregulatie 7 dagen post-sort.

FIGUUR 27 Western Blot actine.

FIGUUR 28 Western Blot Nef.

FIGUUR 29 Amplificatie plots actine en nef qPCR.

FIGUUR 30 Primers gebruikt voor PCR amplificaties van LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP.

Inleiding

5

4. Inleiding

4.1 Humaan Immunodeficiëntie Virus

4.1.1 HIV ontdekking en taxonomie

In het begin van de jaren 1980 merkten Amerikaanse artsen een opmerkelijke toename op in de

incidentie van Pneumocystis Carinii Pneumonie (PCP) en Kaposi‟s sarcoma bij jonge homoseksuele

mannen en intraveneuze druggebruikers. De verwekker van deze epidemie, het Humaan

Immunodeficiëntie Virus (HIV) werd in 1983 ontdekt door twee Franse virologen, Dr. Barré-Sinoussi

en Dr. Montagnier (gedeelde Nobelprijs Geneeskunde 2008) (Sanjay 2008, Institute of Tropical

Medicine 2010).

Het Humaan Immuno Deficiëntie Virus (HIV) is een lentivirus dat een tropisme heeft voor cellen van

het immuunsysteem die de membraangebonden CD4 oppervlakte receptor tot expressie brengen (T-

helper cellen, monocyten, macrofagen, dendritische cellen, Langerhans en microglia cellen).

Wereldwijd zijn er 33,4 miljoen mensen geïnfecteerd met HIV (UNAIDS 2009). Een HIV-infectie

wordt gekenmerkt door het progressief verdwijnen van CD4 helper T-lymfocyten. Omdat deze cellen

een centrale rol spelen in de menselijke immuun respons op een infectie leidt dit tot het ontstaan van

een verworven immuundysfunctie syndroom of AIDS, gekenmerkt door opportunistische infecties en

kanker, waaraan jaarlijks 2 miljoen mensen overlijden (Butel, Brooks et al. 1995, Levinson 2006,

UNAIDS 2009) (voor een review zie: „HIV and the Pathogenesis of AIDS‟ Levy 1998).

Er zijn twee verschillende varianten van het humane aidsvirus, het HIV type 1 (HIV-1) en het HIV

type 2 (HIV-2). Deze HIV types blijken af te stammen van Simian Immunodeficiëntie Virussen (SIV),

een groep aan HIV verwante maar unieke lentivirussen die bij verschillende aapsoorten infecties

veroorzaken. Deze SIV‟s zijn via afzonderlijke zoönotische overgangen in de menselijke populatie

terecht gekomen. Het HIV-1 genoom vertoont een sterke genetische verwantschap met SIV afkomstig

van Chimpansees (Pan troglodytes) SIVcpz , terwijl HIV-2 eerder verwant is aan SIV geïsoleerd uit

Sooty Mangabey‟s (Cercocebus atys) SIVsm. (Mims, Dockrell et al. 2004, Ariën, Abraha et al. 2005,

Ariën & Verhasselt 2008, Kumar & Clark 2009, Los Alamos 2009)

HIV-1 heeft in de hele wereld nieuwe epidemieën gesticht en breidt zich nog steeds verder uit. Op

basis van de nucleotide sequentie wordt HIV-1 verder onderverdeeld in drie verschillende groepen: M

(Major), O (Outlier) en N (Non M-Non O). Het zijn de groep M virussen die verantwoordelijk zijn

voor de wereldwijde AIDS epidemie (Mims, Dockrell et al. 2004, Ariën, Abraha et al. 2005, Los

Alamos 2009). Op FIGUUR 1 naar Bailes, Gao et al. 2003 en Ariën, Abraha et al. 2005 wordt de

onderverdeling van de verschillende HIV stammen naargelang hun oorsprong weergegeven.

Inleiding

6

4.1.2 HIV Genoom

Het HIV-virus behoort tot de familie van Retrovirussen, meer specifiek tot de Lentiviridae (lenti,

Latijn: traag), omwille van de lange klinische latentie periode die de AIDS gerelateerde symptomen

voorafgaat (Butel, Brooks et al. 1995, Mims, Dockrell et al. 2004, Kumar & Clark 2009).

Retrovirussen omvatten een grote en diverse groep van met een envelop omgeven RNA-virussen, die

gebruik maken van een specifieke replicatie strategie om zich te vermenigvuldigen. Deze virussen

bezitten namelijk het vermogen om via een reverse transcriptase hun virale ribonucleïnezuur (RNA)

genoom om te zetten tot desoxyribo-nucleïnezuur (DNA). Dit genoom kunnen ze hierna met behulp

van het integrase integreren in het gastheercel genoom waarna ze de capaciteiten van de gastheercel

gebruiken om nieuwe retrovirussen te creëren (Butel, Brooks et al. 1995, Levinson 2006).

Retrovirussen bezitten een lineair RNA genoom dat tussen zeven en twaalf kilobasenparen (kbp) groot

is. Het retrovirale genoom bevat steeds de drie essentiële genen gag, pol en env, die noodzakelijk zijn

om de structuur van een virion op te bouwen. De genen worden aan elk uiteinde geflankeerd door een

Long Terminal Repeat (LTR), een herhaalde nucleotide sequentie die functioneert als een promotor en

transcriptie initiator en die daarnaast ook mee de integratie in het genoom aanstuurt (Coffin, Hughes et

al. 1997, Peterlin & Trono 2003).

Het Murine Leukemia Virus (MuLV) is een voorbeeld van een eenvoudig retrovirus enkel opgebouwd

uit de drie essentiële genen. Meer complexe retrovirussen zoals Humaan T-lymfotroop virus (HTLV),

HIV-1 en HIV-2 bevatten daarnaast nog enkele extra

genen. Het 9,7 kbp genoom van HIV bevat bv. naast

gag pol en env nog twee regulerende genen tat en rev

en vier accessoire genen nef, vif, vpr en vpu (voor hun

functie zie onderstaande tabel) (Peterlin & Trono 2003,

Mims, Dockrell et al. 2004, Levinson 2006). We

gebruiken FIGUUR 2 naar Fields, Knipe et al. 2001 om

deze verschillen tussen eenvoudige en meer complexe

retrovirale genomen te verduidelijken.

FIGUUR 2. Vergelijking genoom eenvoudige en meer complexe retrovirussen.

De genen van MuLV, HTLV-I, HIV-1 and HIV-2 worden voorgesteld in hun provirale vorm.

De lengte van de verschillende provirale DNA‟s wordt vergeleken met het 9.7 kb HIV provirus.

Bron: “Fields’ Virology” 4th; Fields, Knipe et al. 2001 Lippincott Williams & Wilkins.

FIGUUR 1. HIV taxonomie: onderverdeling HIV stammen in groepen en subtypes naar SIV oorsprong.

SIVcpz= SIV Chimpansee; SIVgor= SIV Gorilla; SIVsm = SIV Sooty Mangabye

Inleiding

7

In onderstaande tabel vatten we de functies van de verschillende HIV genen samen (Greene & Peterlin

2002, Mims, Dockrell et al. 2004, Levinson 2006).

4.1.3 HIV Virion

Het HIV nucleaire capside, gevormd door gag-eiwitten (p24),

wordt omgeven door een matrix (p17) en een lipide membraan

(de envelop) afgeleid van zowel gastheer plasmamembraan als

door env gecodeerde virale glycoproteïnen (gp120 en gp41).

In het capside bevindt zich het enkelstrengig RNA-genoom,

alsook enzymen gecodeerd door het pol-gen (reverse

transcriptase en integrase) (Levy 1998, Levinson 2006).

4.1.4 HIV Replicatie cyclus

Zoals alle retrovirussen kan HIV zich niet zelfstandig repliceren en maakt het hiervoor gebruik van de

capaciteiten van de gastheercel. De replicatiecyclus van HIV wordt geïllustreerd aan de hand van

FIGUUR 4 naar Peterlin & Trono 2003.

(1) Alle primaat lentivirussen gebruiken een CD4 oppervlakte receptor om een doelwitcel te

infecteren. De eerste stap in de replicatie cyclus van HIV is dan ook de binding van het virale gp120

envelop eiwit aan de CD4-receptor van het gastheerceloppervlak. Daarnaast bindt het virale gp120

eiwit ook nog een tweede receptor of co-receptor. Deze binding is noodzakelijk om celmembraan fusie

mogelijk te maken. De co-receptor waar HIV mee interageert is een chemokine-receptor, meestal de

CCR5- of CXCR4-receptor.

(2) De binding van gp 120 met de co-receptor veroorzaakt conformationele veranderingen in het gp41,

waardoor een fusiepeptide gevormd wordt dat de cel penetreert. Dit peptide trekt de twee cellen naar

elkaar toe wat leidt tot de versmelting van virale- en gastheercelmembraan (de entry). Recente

gegevens wijzen er op dat deze fusie vnl. in een endosoom na endocytose van het virion gebeurt.

Gemeenschappelijke retrovirale genen HIV specifieke genen

Gen Functie genproduct Gen Functie genproduct

gag codeert voor interne structurele eiwitten (oa p24) vif Bevordert virale infectiviteit.

pol Codeert voor reverse transcriptase, Rnase H

(afbraak RNA in RNA-DNA-hybride molecuul)

integrase en protease

vpr Bevordert transport virale preïntegratie

complex van cytoplasma naar kern.

env codeert voor gp 160, voorloper glycoproteïne van

gp120 en gp41 vpu Versnelt virion release uit de cel.

tat Verhoogt virale gentranscriptie.

rev Vergemakkelijkt de export van

unspliced mRNA uit de kern.

nef Bevordert CD4 en MHCI downregulatie,

verhoogt virion infectiviteit en cellulaire

activatie.

FIGUUR 3.Structuur HIV: HIV bolvormig virion opgebouwd uit een nucleocapside (p24)

en een matrix (p17), omgeven door een envelop (o.a. gp120 en gp41). Bron: “Review of

medical microbiology and immunology” Levinson 2006 McGraw-Hill Medical.

Inleiding

8

(3) Hierop volgt uncoating van het virale capside waardoor het pre-integratie complex (PIC) in het

cytoplasma vrijkomt. Het PIC wordt hierna langs het microtubuli netwerk getransporteerd naar de

nucleus.

(4) Het reverse transcriptase schrijft het genomisch RNA over waardoor lineair en cirkelvormig

dubbelstrengig DNA ontstaat. Het lineaire DNA wordt met behulp van het integrase geïntegreerd in

regio‟s van het gastheer genoom actief in transcriptie.

(5) De 5‟ LTR initieert daarop de transcriptie van het provirus tot retroviraal mRNA. Sommige genen

zoals nef vormen hierop een uitzondering en worden reeds voor integratie tot expressie gebracht.

(6) Na transcriptie volgt de translatie van het mRNA, waardoor enzymatische eiwitten betrokken in de

replicatie gesynthetiseerd worden. Nadien worden late domeinen van gag tot expressie gebracht

waarna deze producten het genoom omkapselen en een nieuw virion vormen.

(7) Na budding uit de gastheercel worden de eiwitten door cellulaire en virale proteasen gesplitst

waardoor uiteindelijk een matuur en infectieus HIV partikel ontstaat (Butel, Brooks et al. 1995,

Levinson 2006, Kirchhoff 2009).

4.2 HIV-Nef

4.2.1 Nef structuur en functie

Nef is een 27-29 kDa accessoir eiwit dat vroeg in de virale levenscyclus, nog voor integratie, tot

expressie wordt gebracht. Nef zorgt voor een downregulatie van de CD4 oppervlakte receptor wat een

centrale rol speelt in de progressie van een HIV infectie naar AIDS.

FIGUUR 4. HIV replicatie cyclus. Voor een verklaring van de nummering wordt verwezen naar de tekst. Env: envelop

proteïne; IN: integrase; LTR: long terminal repeat; MA: matrix; Nef: negative factor; Rev: regulator of virion protein

expression; ssRNA: enkelstrengig RNA; Tat: transcriptional transactivator protein; Vif: viral infectivity factor; Vpr: viral

protein r; Vpu: viral protein u. Bron: “Hide, shield and strike back: how hiv-infected cells avoid immune eradication.” Peterlin

& Trono 2003 Nature Reviews Immunology

7

6

5

4

3

2

1

Inleiding

9

De aanwezigheid van het nef gen is in alle primaat lentivirussen (HIV-1, HIV-2 en SIV) sterk

geconserveerd maar de sequentie kan tussen deze verschillende species sterk verschillen (Raney, Shaw

et al. 2007). Nef werd eerst geïdentificeerd als een open reading frame (ORF) dat gedeeltelijk overlapt

met de 3' LTR van HIV-1. Men dacht dat het een negatief effect had op de virale replicatie vandaar de

naam 'negatieve factor' of Nef. Een totaal verkeerde benaming, want ondertussen hebben diverse

studies aangetoond dat meerdere cellulaire routes opgereguleerd worden na Nef expressie en dit ook

bijdraagt tot de virale replicatie (Das & Jameel 2005).

Nef is functioneel complex en functioneert waarschijnlijk als een moleculaire adapter die via eiwit-

eiwit interacties cellulaire signalen onderschept (Raney, Shaw et al. 2007). De grote flexibiliteit van

het eiwit zorgt ervoor dat Nef kan interageren met een groot aantal cellulaire partners (Geyer &

Peterlin 2001, Ariën & Verhasselt 2008, Kirchhoff, Schindler et al. 2008).

Het belang van Nef in de pathogenese van een HIV infectie werd aan het licht gebracht na het

bestuderen van SIV infecties bij Makaken en HIV infecties bij Long-term Nonprogressors (LTNP).

Men stelde vast dat Rhesus Makaken besmet met een SIVmacδ239 mutante stam die Nef niet tot

expressie kon brengen, geen hoge virale load en in overeenstemming hiermee ook geen AIDS tekenen

ontwikkelden (Luciw, Shaw et al. 1992, Kirchhoff, Greenough et al. 1995, Chakrabarti, Metzner et al.

2003). Overeenstemmend met dit resultaat bleken LTNP, HIV geïnfecteerde individuen die na meer

dan tien jaar infectie klinisch en ook biologisch asymptomatisch blijven, soms geïnfecteerd te zijn met

een stam die deleties in het nef-gen bevat (Kirchhoff, Greenough et al. 1995, McIntyre, Geczy et al.

1999, Verity, Zotos et al. 2007). Deze beide resultaten geven aan dat de aanwezigheid van het Nef

eiwit in vivo de progressie naar AIDS versnelt of eventueel zelfs essentieel is in de pathogenese ervan

(Verhasselt, Naessens et al. 1999, Kirchhoff, Schindler et al. 2008).

HIV-1 Nef voert een opvallende diversiteit aan activiteiten uit die samengevat worden in FIGUUR 5

naar Kirchhoff 2009. De belangrijkste functies zijn de CD4, Major Histocompatibiliteits Complex

(MHC)-I en MHC-II downregulatie en de versterking van de virale infectiviteit en replicatie.

FIGUUR 5. Overzicht functies HIV-1 Nef. Gele kaders geven de meest en oranje de minst prominente functies van HIV-1 Nef

weer. Blauwe kaders zijn functies specifiek voor Nef. Er:endoplasmatisch reticulum; IL:interleukine; LCK: lymfocyt specifiek

tyrosine kinase; MHC: major histocompatibility complex; TgFβ: transforming growth factor‑β; sDF:stromal cell-derived factor 1; Ub:ubiquitine. Bron: “Is the high virulence of HIV-1 an unfortunate coincidence of primate lentiviral evolution?” Kirchhoff 2009

Nature Reviews Microbiology.

Inleiding

10

4.2.2 Downregulatie van CD4 expressie

HIV-1 gebruikt drie genproducten (Vpu, Env en Nef), om zijn primaire receptor te downreguleren wat

het belang van CD4-modulatie in de pathogenese van HIV duidelijk beklemtoont. In tegenstelling tot

Nef worden Vpu en Env laat tot expressie gebracht en verstoren ze het transport van de nieuw

gesynthetiseerde receptoren naar het oppervlak. Nef is het enige eiwit dat inwerkt op CD4 moleculen

die reeds voor de infectie op het celoppervlak aanwezig zijn, waardoor dit eiwit de meest prominente

rol in de CD4 downmodulatie van HIV-1-geïnfecteerde T-cellen speelt. Nef rekruteert adaptor

proteïne (AP)- 2 -complexen die de endocytose van de CD4-receptor stimuleren, waarna dit endosoom

naar de lysosomen gedirigeerd wordt voor afbraak.

De CD4-downmodulatie is de belangrijkste functie van Nef en heeft dan ook talrijke gevolgen. Omdat

CD4 met het MHC-II op antigeen presenterende cellen (APCs) reageert kan CD4-downmodulatie de

antivirale immuunrespons verzwakken. CD4 is ook een belangrijke co-stimulatoire factor van T cel

receptor (TCR)-gemedieerde activering van T cellen. Bovendien is aangetoond dat CD4-

downmodulatie de release en besmettelijkheid van HIV-1 partikels verhoogt (Foster & Garcia 2008,

Kirchhoff, Schindler et al. 2008).

4.3 Onderzoeksproject: Transductie van HIV-nef in T-cellijnen

In aanwezigheid van HIV-1 Nef verwacht men een downregulatie van de CD4 oppervlakte receptor

zoals voorgesteld in FIGUUR 6 naar Verhasselt, Naessens et al. 1999.

Na gentransfer van Pex Nef retrovirus (LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP) in humane SupT1-cellen werden

op flowcytometrische analyse afwijkende resultaten in membraangebonden CD4-downmodulatie

gevonden. Deze downregulatie bleek namelijk in een gedeelte van de met Pex Nef retrovirus

getransduceerde cellen niet plaats te grijpen, waardoor een celpopulatie met een abnormaal fenotype

tot stand kwam. Deze SupT1-transducties werden herhaald met zowel LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP

Wild Type plasmide DNA, als met LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP F191R Mutant plasmide DNA

bevattend retrovirus (voor meer informatie betreffende de vectorconstructen zie „4.4.7 Retro- en

lentivriale vectoren in het onderzoeksproject‟).

FIGUUR 6. Vergelijking van CD4-downregulatie tussen Nef

getransduceerde (rechts) en niet-Nef getransduceerde SupT1-cellen

(links). Bivariate dotplots (CD4-fycoërythrine en EGFP) van

flowcytometrische metingen. Kwadranten ingesteld om 99% van de

gekleurde niet getransduceerde cellen in bovenste linker kwadrant te

bevatten. De tabellen geven het percentage cellen in elk kwadrant

weer. Bron: “Human immunodeficiency virus nef gene expression

affects generation and function of human T cells, but not dendritic

cells” Verhasselt, Naessens et. al. 1999 Blood.

Inleiding

11

In de flowcytometrische analyse van deze getransduceerde cellen (FIGUUR 7), kan een duidelijk

verschil in CD4-downregulatie opgemerkt worden, wat aanleiding geeft tot het ontstaan van twee

aparte populaties: enerzijds een celpopulatie met de verwachte downmodulatie, de CD4-negatieve

(CD4-) populatie (niet afgebakende populatie, onderaan op FIGUUR 7 A en B) en anderzijds een

populatie waarbij Nef functie afwezig is, de CD4-positieve (CD4+) (afgebakende populatie bovenaan

op FIGUUR 7 A en B). Het lijkt alsof deze CD4+-cellen Nef niet tot expressie brengen, ofwel in een

onvolledige vorm, waardoor het eiwit zijn functie niet langer kan uitoefenen.

Het doel van dit onderzoek bestaat er in om na te gaan hoe het mogelijk is dat het HIV-1-Nef, via

retrovirale gentransfer ingebracht in humane CD4-positieve T-cellen, zijn CD4 downregulerende

vermogen kan verliezen. Om de oorzaak van het ontstaan van dit abnormale fenotype te achterhalen,

werd onderzoek op drie niveaus uitgevoerd:

1. Op het niveau van het eiwit zelf werd gekeken of er tussen de CD4-positieve en negatieve

populatie een duidelijk verschil in Nef expressie waarneembaar is. De eiwit expressie werd

geanalyseerd aan de hand van Western Blot, waarbij gebruik gemaakt werd van specifieke

antilichamen gericht tegen Nef.

2. Op het niveau van mRNA werd bekeken of er in de CD4+-populatie nef transcript aanwezig was

en of er een verschil in het aantal nef transcripten bestond tussen de CD4+ en CD4

--cellen.

Hiervoor werd kwantitatieve Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) aangewend.

3. Op DNA niveau werd nagegaan of het vector genoom zijn juiste configuratie behield en of er

mutaties in het genoom ingebouwd werden. Hiervoor werd PCR en sequencing-PCR toegepast.

Voor de praktische toepassingen in dit deelproject werd samengewerkt met Nathalie Van Tittelboom

(“De rol van HIV-1 Nef in virale fitness: analyse van onverwachte expressieprofielen na transductie in

T-cellijnen”). Om de vereiste labotechnieken, besproken in Methodologie, voor dit onderzoek onder

de knie te krijgen, werd me eerst een ander deelproject toegewezen. Hierbij was het de bedoeling om

een niet eerder gekarakteriseerd gedeelte van de lentivirale TRIP-CMV-GFP-WPRE vector sequentie

dat zich tussen de LTR en Ampicilline resistentie regio bevindt, te achterhalen. Aan de hand van dit

deelproject konden enkele specifieke technieken ingeoefend worden.

FIGUUR 7.

A) Bivariate dotplot (CD4-PE en EGFP) B) Bivariate dotplot (CD4-PE en EGFP)

LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP Wild Type LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP F191R Bevestiging van 2 verschillende populaties, zowel zonder (afgebakende populatie) als met CD4-downregulatie.

Inleiding

12

4.4 Retro- en Lentivirale gentransfer

4.4.1 Retrovirale vectoren

We haalden reeds aan dat retrovirussen zich efficiënt kunnen integreren in het genomisch DNA van

zoogdiercellen om zo hun genen tot expressie te brengen. Van deze eigenschap maakt men gebruik om

vreemde genen in het genomisch DNA van een doelwitcel in te brengen (gentransfer).

Men construeert hiervoor retrovirale vectoren, waarbij men genen van een retrovirus vervangt door

andere genen (transgenen) waarvan men de effecten wenst te bestuderen (met een transgen packaging

capacity tot 7500 basenparen). In tegenstelling tot Herpes Simplex of Adenovirussen bieden

Retrovirussen een stabiele en langdurige transgen expressie. De constructen behouden hun infecterend

potentieel en kunnen in een breed scala van celtypes getransduceerd worden, maar zijn niet in staat om

opnieuw de volledige retrovirale replicatie cyclus te doorlopen. De geïnfecteerde cel brengt vervolgens

de getransduceerde genen tot expressie waarna hun functie geanalyseerd kan worden (Coffin, Hughes

et al. 1997, Walther & Stein 2000, Pluta & Kacprzak 2009).

Voor een efficiënt en veilig retroviraal vector construct dienen alle virale genen die niet noodzakelijk

zijn om gentransfer mogelijk te maken, verwijderd te worden. Enkel de regio‟s betrokken bij de eerste

stappen van de retrovirale levenscyclus (de entry, reverse transcriptie en integratie) worden behouden.

Deze sequenties worden cis-acting elements genoemd, omdat ze in het genoom aanwezig moeten zijn

om hun functie te kunnen uitoefenen. Op FIGUUR 8 naar Coffin, Hughes et al. 1997 staan de cis-

acting sequenties noodzakelijk voor retrovirale vector replicatie aangeduid. Trans-acting elements

zoals de genen gag pol en env, worden uit het construct verwijderd en naast het genoom in de

producer cel tot expressie gebracht (Coffin, Hughes et al. 1997, Buchschacher 2001).

(1) Een promoter in de U3 LTR

(2) Een polyadenylatie signaal in de U5 LTR

(3) een viraal verpakking signaal () voor

incorporatie van vector RNA in virionen

(4) reverse transcriptie signalen:

transfer-RNA bindingsplaats (PBS)

polypurine tract (PPT) voor initiatie van

synthese eerste en tweede DNA streng

een herhaalde (R) regio aan beide

uiteinden van het virale RNA nodig in DNA-

synthese

(5) korte, gedeeltelijk geïnverteerde herhaalde sequenties

op het eind van LTR noodzakelijk voor integratie (niet

aangeduid op figuur) (Coffin, Hughes et al. 1997,

Buchschacher 2001).

FIGUUR 8. Essentiële cis-acting elements in retrovirale

vectoren en vector replicatie cyclus. Legende : zie tekst.

Bron : “Retrovirusses” Coffin,. Hughes et. al. 1997 Cold

Spring Harbor Laboratory Press

Inleiding

13

Zoals hierboven vermeld moeten de virale eiwitten Gag, Pol en Env uiteraard wel aanwezig zijn om

een infectieuze virale vector te produceren. Deze eiwitten worden gecodeerd van afzonderlijk RNA

verpakkingsconstructen (zie ook FIGUUR 9). Om de kans op het ontstaan van een replicatie-

competent infectieus retrovirus te minimaliseren, zal men de gag-pol genen op een ander construct dan

het env gen tot expressie brengen (Buchschacher 2001).

4.4.2 Procedure retrovirale gentransfer

In FIGUUR 9 naar Buchschacher 2001 worden de verschillende stappen van retrovirale gentransfer

samengevat:

1) Gentische manipulatie van retroviraal RNA tot vector en verpakkingsconstructen.

2) Transfectie, het inbrengen van de retrovirale vector en verpakkingsconstructen in een cellijn

geschikt om retroviraal vectorvirus te produceren (in ons geval Phoenix Ampho cellen).

3) Productie van virale proteïnen.

4) Assemblage van virionen bestaande uit vector RNA en het virale eiwit uit de

verpakkingsconstructen.

5) Oogsten van de mature virionen.

6) Transductie of het infecteren van doelwitcellen (in ons geval SupT1-cellen) met retrovirale

vectorvirionen.

7) Reverse transcriptie en integratie van het vector genoom.

8) Expressie van het gen van interesse.

4.4.3 Types retrovirale vectoren

In het basis construct wordt een transgen door een LTR promotor tot expressie gebracht (A, FIGUUR

10). Het is echter mogelijk om wijzigingen in dit construct aan te brengen die meer controle over de

genexpressie mogelijk maken of toelaten meer dan 1 gen gelijktijdig tot expressie te brengen. Het gen

kan via een interne promotor tot expressie gebracht worden (B).

1

2

3

4

5

6

7

8

FIGUUR 9. Overzicht retrovirale gentransfer. Bron: “Introduction to Retroviruses and Retroviral Vectors”

Buchschacher 2001 Somatic Cell and Molecular Genetics.

Inleiding

14

Men kan door alternatieve splicing twee transcripten

genereren waaruit twee verschillende genen tot expressie

gebracht worden (C). Dit is ook vanuit één transcript

mogelijk door een heterologe promotor tussen de twee

genen te plaatsen (D).

Een andere mogelijkheid is een interne ribosomaal

entry site (IRES) te gebruiken die cap-

onafhankelijke translatie van het downstream gen

mogelijk maakt (E) (Coffin, Hughes et al. 1997,

Palu, Parolin et al. 2000).

4.4.4 Transfectie en transductie efficiëntie verhogen

Transfectie en transductie zijn zelden volledig geslaagd, wat wil zeggen dat niet elke productie- of

doelwitcel respectievelijk virus aanmaakt of er mee geïnfecteerd wordt. Om analyse enkel op de

succesvol getransfecteerde of getransduceerde celpopulaties toe te spitsen, werden technieken

ontwikkeld die het mogelijk maken om deze populaties af te zonderen (Lodish 2004).

Om de transfectie efficiëntie op te drijven wordt een puromycine resistentie gen aan de vector

toegevoegd wat de transfectanten (producer cellen) immuun maakt voor dit antibioticum. Na

transfectie stelt men de cellen bloot aan puromycine waarna enkel deze producer cellen opgroeien die

het resistentiegen en dus het vectorconstruct bevatten. Aan de vector wordt eveneens een ampiciline

resistentie gen toegevoegd, wat toelaat om bacteriën na transformatie te selecteren voor het opgroeien

van de plasmide vector. Om getransduceerde cellen te kunnen onderscheiden van cellen die geen

vector-virus bevatten wordt in het construct een Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) gen

ingebracht, wat voor een groen fluorescerend eiwit codeert. De doelwitcellen die vectorvirus bevatten

(geslaagde transductie) zijn zodoende in staat om naast het gen van interesse eveneens het EGFP eiwit

te produceren, wat visuele controle onder de fluorescentiemicroscoop mogelijk maakt. Het is op basis

van dit EGFP eveneens mogelijk om via Fluorescence-activated cell sorting (FACS) de

getransduceerde cellen fysiek te scheiden van de niet-getransduceerde populatie (zie ook

Methodologie) (Tsien 1998, Kittler & Moss 2006).

4.4.5 Lentivirale vectoren

Lentivirussen bezitten de eigenschap om zowel delende als niet delende cellen (zoals o.a. primaire

hepatocyten, progenitor- en stamcellen, niet-delende monocyten en macrofagen) te infecteren, wat het

zeer bruikbare vectoren voor gentransfer maakt (Pluta & Kacprzak 2009). Zeven jaar na de ontdekking

van HIV werd een eerste op HIV-1 gebaseerd vectorconstruct beschreven (Page, Landau et al. 1990).

Om HIV-1 als veilige vector te kunnen gebruiken is er een uitgebreide genetische manipulatie van het

FIGUUR 10. Types van retrovirale vectoren. X,Y: genen van interesse; P:promoter. Bron: “Retrovirusses”

Coffin,. Hughes et. al. 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press.

A) LTR

B) Interne promoter

C) Alternatieve splicing

D) Multipele promoters

E) IRES

Inleiding

15

virale genoom nodig. De sequenties die coderen voor de virale eiwitten worden verwijderd. Deze

worden wel in trans aangeboden, weliswaar met een ander enveloppe eiwit, om naast de 'natuurlijke'

doelwitten de CD4-positieve cellen, een meer uitgebreid gamma van doelwitcellen te bereiken (Coffin,

Hughes et al. 1997, Walther & Stein 2000). Voor een volledige review zie: „Use of HIV as a gene

transfer vector‟ Pluta & Kacprzak 2009.

4.4.6 SIN vectoren

Omdat er bij het gebruik van deze vectoren steeds gevreesd werd voor het ontstaan van een replicatie

competent virus, in het geval van lentivirale vectoren een infectieuze HIV-stam, werden self-

inactivating (SIN) vectoren geconstrueerd (Palu, Parolin et al. 2000, Buchschacher 2001).

In het retrovirale RNA bestaat de LTR uit een direct herhaalde sequentie R (repeat), en een U5 (5‟

unieke) of U3 (3‟ unieke) sequentie zoals geïllustreerd in “Virion RNA” op FIGUUR 11 naar Coffin,

Hughes et al. 1997. Tijdens reverse transcriptie verandert deze configuratie waardoor de LTR in het

provirus gevormd wordt door de opeenvolging van U3 R U5. Na transcriptie neemt LTR weer zijn

oorspronkelijke R U5 / U3 R configuratie aan (Coffin, Hughes et al. 1997).

In SIN vectoren heeft men een deletie aangebracht in de U3 regio aan het 3‟ einde van het virale

genoom (ΔU3) waardoor regio‟s noodzakelijk voor transcriptie (de TATA-box en bindingsplaatsen

voor transcriptiefactoren) uit het 3‟ LTR verwijderd zijn. Na reverse transcriptie bevat de 5' LTR

regio van het provirus hierdoor geen enkele transcriptionele activiteit meer. LTR fungeert in het

provirus dus niet langer als een promotor. De vector maakt dus zelf via reverse transcriptie de

transcriptie vanuit LTR onmogelijk, vandaar self-inactivating.

Op FIGUUR 12 naar Kittler & Moss 2006 worden een SIN-lentivirale vector (boven, zoals aanwezig

in de producer cel) en de geïntegreerde provirale vorm (onder, zoals aanwezig in de target cel)

schematisch weergegeven.

FIGUUR 12. Schematische weergave SIN lentivirale

vector (boven) en provirale vorm (onder). Witte

balken geven cis-acting elementen weer. Grijze balken

de retrovirale promotor en gearceerde het transgen.

Pr.: promotor; Ѱ: Psi verpakkingssignaal; cPPT: central

olypurine tract; WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus

Posttranscriptional Regulatory Element.

Bron: “The Dynamic Synapse: Molecular Methods in

Ionotropic Receptor Biology” Kittler & Moss 2006 CRC

Press Taylor & Francis Group.

FIGUUR 11. Voorstelling LTR configuratie in de replicatiecyclus van een eenvoudig retroviraal

genoom. Bron: “Retrovirusses” Coffin,. Hughes et. al. 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press

Inleiding

16

De inactieve LTR noodzaakt een andere promotor om het retrovirale construct tot expressie te

brengen. Meestal gebruikt men hiervoor de cytomegalovirus (CMV) promotor, waardoor de

transcriptie meer onder controle kan gehouden worden (Palu, Parolin et al. 2000, Buchschacher 2001).

Het transgen wordt van een interne promotor tot expressie gebracht, zoals geïllustreerd in FIGUUR 10

(B). Het Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) wordt

toegevoegd om de expressie van het transgen te verhogen. De centrale polypurine tract (cPPT) vormt

een DNA flap die de nucleaire import van dsDNA bevordert (Kittler & Moss 2006). In elke vector

wordt ook een Rev-responsief element (RRE) gekloneerd, wat de efficiënte van de nucleaire RNA

export verhoogt (Kittler & Moss 2006).

4.4.7 Retro- en lentivirale vectoren in het onderzoeksproject

a. Lentivirale TRIP-CMV-GFP-WPRE vector

Het SIN-lentivirale TRIP-CMV-GFP-WPRE vector plasmide (9831 bp) is afgebeeld in FIGUUR 13.

1) Het pUC replication origin is de DNA sequentie waar de replicatie gestart wordt. Het pUC is een

replicatie origin van E. coli.

2) De Simian virus 40 (SV40) promotor-enhancer is een DNA sequentie die de transcriptie efficiëntie

van de promotor verhoogt, noodzakelijk om een hoge expressie van de transcripten mogelijk te

maken (Griffiths, Miller et al. 2000).

3) Xanthine-guanine fosforibosyl transferase (XGPRT) is een E. coli purine enzyme dat xanthine of

guanine samen met phosphoribosylpyrofosfaat omzet tot xanthine of guanine monofosfaat. In een

medium bestaande uit antibiotica en xhantine kunnen enkel deze cellen overleven die het Xanthine-

guanine fosforibosyl transferase enzym en dus het vector construct bevatten wat een meer

nauwkeurige selectie mogelijk maakt (Pratt & Subramani 1983).

b. Retrovirale LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP vector.

Het onderzoek werd uitgevoerd op een replicatie incompetent retroviraal LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP

vectorvirus. Hierin wordt de Pex Nef-IRES-EGFP sequentie onder de controle van een retrovirale

LTR promotor geplaatst zoals geïllustreerd in FIGUUR 14 (een voorbeeld van FIGUUR 10 (E)).

FIGUUR 13. TRIP-CMV-GFP-WPRE vector plasmide (9831 bp), samengesteld met VectorNti Advance 10.

Inleiding

17

Deze Pex-Nef is een consensus sequentie afgeleid van een 91 tal HIV-1 subtype B geïnfecteerden in

een verschillend ziektestadium (Schindler, Rajan et al. 2007, Foster & Garcia 2008). (Voor de

gebruikte Pex Nef sequentie zie BIJLAGE 1.) Het genoom wordt afgeschreven tot een polycistronisch

mRNA waaruit gelijktijdig de individuele Nef als EGFP eiwitten tot expressie gebracht worden,

waardoor aanwezigheid van Nef uit EGFP expressie afgeleid kan worden (Verhasselt, Naessens et al.

1999).

4.5 Humane T-cellijnen

Hematopoietische cellijnen worden in immunologische of hematologische studies dikwijls gebruikt als

model voor een cel in een bepaald stadium van differentiatie. Meestal worden hiervoor Acute

Lymfatische Leukemie (ALL) cellen gebruikt, B of T cel voorlopers waarbij de differentiatie halt

gehouden heeft in een bepaald stadium, maar die zich wel sterk kunnen vermenigvuldigen. ALL-cellen

kunnen als maligne equivalenten model staan voor hun normale tegenhangers in T- of B-cel

differentiatie.

T-ALL cellijnen worden sinds 1965 gebruikt voor immunologische en moleculaire studies als

vertegenwoordigers van de normale T-cel differentiatie stadia. Afhankelijk van het stadium worden

andere receptoren tot expressie gebracht. De CD7 receptor wordt doorheen heel de differentiatie

episode tot expressie gebracht waardoor hij op alle T-cellen aangetroffen kan worden, de CD3 receptor

daarentegen komt enkel bij de meer mature cellen tot expressie (Smith, Shatsky et al. 1984).

De cellijn die wij in dit onderzoek gebruiken is een Stanford University Pediatric T-cellijn (SupT1),

afkomstig uit het pleuravocht van een lymfoblastair lymfoom gekenmerkt door een chromosoom 14

inversie (Robberecht, Waelbroeck et al. 1988). SupT1- cellen zijn CD3-negatief (immatuur T-cel

stadium) en zowel CD4 als CD8-positief (Smith, Shatsky et al. 1984). De expressie van de CD4-

receptor maakt hen zeer geschikt als model voor de effecten van HIV-Nef op humane T-cellen.

5. Methodologie

De laboratoriumtechnieken die aangewend werden in het kader van deze thesis, zijn gebaseerd op

standaardprotocols gebruikt door het HIV-lab. Het merendeel van deze technieken heb ik volledig

zelfstandig uitgevoerd en wordt hieronder dan ook meer uitvoerig besproken. Het gaat hierbij om: het

invriezen, ontdooien en in cultuur brengen van eukaryote cellen, transformatie van bacteriële cellen,

FIGUUR 14. Schematische voorstelling van retrovirale LZRS vectoren. (A) Nef- genoom codeert voor het EGFP

gen 3‟ van een IRES, onder controle van een long terminal repeat (LTR) promotor. Ѱ verpakkingssignaal, AAAA:

poly(A) eind van mRNA. (B) Nef+ genoom codeert voor zowel het HIV Pex-nef gen als EGFP. Translatie van

mRNA produceert 2 proteïnes. Bron: “Human immunodeficiency virus nef gene expression affects generation and

function of human T cells, but not dendritic cells” Verhasselt, Naessens et. al. 1999 Blood.

Methodologie

18

extractie van plasmide DNA, PCR, qPCR, sequencing-PCR, DNA purificatie en Western Blot. Voor

enkele andere technieken (transfectie en transductie, FACS-analyse en -sorteren, RNA isolatie en

RNA reverse transcriptie tot cDNA) werd beroep gedaan op de expertise van mijn begeleiders, die de

procedure uitvoerden terwijl ik de opeenvolgende stappen observeerde. Deze technieken worden

minder gedetailleerd beschreven.

5.1 Methodologie: Sequentie-analyse TRIP deelonderzoek

5.1.1 Uitplaten van getransformeerde bacteriële cellen

In dit project werd gewerkt met ingevroren (-80°C) glycerolstocks van E. coli cellen die volgende

plasmiden bevatten:

- pTRIP-CMV-EGFP-WPRE verkregen van het lab van Prof. dr. Thielemans (VUB, Brussel).

- pTRIP-delta U3-CMV-GFP verkregen van het lab van Dr. Charneau (Institut Pasteur, Parijs).

- pTRIP-EF1α verkregen van het lab van Prof. dr. De Byser (KUL, Leuven).

- pTRIP-CMV verkregen van het lab van Dr. Charneau.

- pTRIP-EF1α-WPRE verkregen van het lab van Prof. dr. De Byser.

De cellen bevonden zich per staal in 500 µL van een mix bestaande uit 250 µL glycerol (Merck

KGaA, Darmstadt, Duitsland) en 250 µL Difco LB broth lennox medium (Beckton Dickinson (BD)

Biosciences, Erembodegem, België). Van deze glycerolstocks werd 5 µL uitgeplaat op een met

ampicilline gesuplementeerde Difco LB agar lennox plaat (BD). Na overnacht incubatie bij 37 °C in

een vochtige atmosfeer (7% CO2), werd 1 kolonie geïsoleerd die bij 37 °C geïncubeerd werd in een

schudtafel (225 toeren per min (tpm)), nu in 12 mL LB ampicilline (100 mg/mL) medium (Roche

Diagnostics, Bazel, Zwitserland).

5.1.2 Plasmide DNA purificatie

Voor de purificatie van het plasmide DNA (ook Miniprep geheten) werd een methode gebaseerd op de

adsorptie van DNA aan een silicium membraan toegepast, gebruik makend van de QIAprep Spin

Miniprep Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Deze omvat een drieledige procedure:

1) Preparatie van bacterieel lysaat op basis van natrium dodecyl sulfaat (SDS) en natrium

hydroxyde (NaOH), voor denaturatie van respectievelijk bacteriële proteïnen en

chromosomaal en plasmide DNA.

2) Adsorptie van DNA aan QIAprep membraan.

3) Wassen en elueren van het plasmide DNA.

De afzonderlijk uitgevoerde stappen worden hieronder meer gedetailleerd weergegeven. Alle stappen

werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Voor stap 1 werd gewerkt onder de LaminAir HBB 2448

(Holten, Allerød, Denemarken).

1) Van elke uit 5.1.1 verkregen kolonie werd na 5 min centrifugeren aan 6800 g in een Eppendorf

5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland), een celpellet gemaakt. Deze bacteriële pellet werd

geresuspendeerd in 250 μL Buffer P1 (bestaande uit een combinatie van tris-

Methodologie

19

hydroxymethylaminomethane-hydrochloorzuur (Tris-HCl), ethyleen-diaminetetraacetaat (EDTA)

en ribonuclease A). Aan de verkregen suspensie werd 250 μl Buffer P2 (bestaande uit

natriumhydroxide (NaOH) en sodium dodecyl sulfaat (SDS)) toegevoegd. Het mengsel kleurde

door het vooraf toegevoegde LyseBlue aan de buffer, bij deze reactie blauw. Vervolgens werd

350 μL Buffer N3 (de samenstelling van Buffer N3 wordt niet vrijgegeven door Qiagen)

toegevoegd waarna de suspensie wit kleurde. Na 10 min centrifugatie (13200 tpm) met Eppendorf

5415D, vormde er zich een duidelijk wit neerslag op de bodem van de buis, met daarboven het

supernatans.

2) Dit supernatans werd voorzichtig op een QIAprep spin kolom gedruppeld en via 1 min

centrifugatie (13200 tpm) werd het plasmide DNA aan de QIAprep spinkolom gebonden.

3) De QIAprep spinkolom werd vervolgens gewassen met 0,75 mL Buffer PE (de samenstelling van

Buffer PE wordt niet vrijgegeven door Qiagen) en 1 min centrifugatie (13200 tpm). Om het DNA

ten slotte van de kolom te elueren, werd 50 μl Buffer EB (bestaande uit tris-(hydroxymethyl)-

aminomethaan en hydrochloorzuur) in het midden van de kolom gedruppeld, gevolgd door 1 min

incubatie en 1 min centrifugatie (13200 tpm).

Het verkregen supernatans bevatte het plasmide DNA, waarvan de concentratie met behulp van de

NanoDrop bepaald werd.

5.1.3 Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek om bepaalde regio‟s in DNA te vermenigvuldigen

met behulp van een enzym en sequentie specifieke primers (Alberts 2002).

Elk PCR reactiemengsel bevatte volgende componenten: 5 µL 10 X PCR buffer (Applied Biosystems

(ABI), Perkin Elmer, Foster City, USA), 3 µL 3,75 mM MgCl2 (ABI), 1 µL dNTPs (10 μM van elk

dNTP) (Fermentas, St. Leon-Rot, Duitsland), 0.2 µL van 5 units Taq polymerase (ABI), 34,8 µL

nuclease-vrij water (NFW) (ABI) en 0.5 µL van 50 nmol/mL sense en anti-sense primer.

Aan elke reactiemix werd 100 ng template DNA toegevoegd, wat afhankelijk van het volume

aangelengd werd met NFW tot een totaal reactievolume van 50 µL. Als negatieve controle werd in

plaats van het template DNA, 5 µL NFW toegevoegd. PCR reacties werden met de Mastercycler

Gradient (Eppendorf) uitgevoerd onder volgende condities: 5 min initiële denaturatie bij 94°C, 30

cycli van amplificatie bestaande uit 30 s denaturatie (94 °C), 30 s annealing (58 °C) en 2 min extensie

(72 °C), hierop volgde telkens een finale 7 min extensiestap bij 72 °C. Voor de gebruikte primers

verwijzen we naar „5.1.5 DNA sequencing‟.

5.1.4 Agarosegel-electroforese

Voor het analyseren van de PCR reactieproducten werd gel-electroforese toegepast, een techniek om

DNA te scheiden op basis van een verschil in basenpaarlengte (Alberts 2002).

Er werd een 2% Agarosegel gebruikt, gevormd uit een suspensie van 3 g Agarose Multi Purpose

(Roche) en 150 mL 1 X Tris-acetate-EDTA (TAE) Buffer (Invitrogen, Merelbeke, België). Voor het

Methodologie

20

aanleggen van het elektrisch veld werd gebruik gemaakt van een PowerPac HC (Bio-Rad

Laboratories, Hercules, USA) gevuld met 0.5 X TAE Buffer. Het PCR product werd op de gel geladen

samen met 6 X Loading Dye (ladingsbuffer en moleculaire gewichtsmerker van Fermentas). Als

referentie ladders werden de Gene Ruler 100 bp Plus DNA Ladder (1 µg/µL, 50 µg, Fermentas) en de

Gene Ruler 1 Kb Plus DNA Ladder (1 µg/µL, 50 µg, Fermentas ) gebruikt. Het DNA werd gedurende

1 u aan 150 Volt en 30 mA gescheiden op gel. Voor visualisatie van het DNA werd de agarose gel na

electroforese, 30 min ondergedompeld in een EtidiumBromide oplossing (Sigma-Aldrich, St.Louis,

USA), waarna via blootstelling aan UV licht een foto van de gel gemaakt kon worden.

5.1.5 DNA Sequencing

Om de sequentie van DNA te bepalen hebben we ons gebaseerd op de Sanger methode (besproken in

Sanger 1981). Deze methode maakt gebruik van dideoxynucleotide trifosfaats (ddNTPs) of DNA chain

terminators (nucleotiden die een fosfaatgroep ontbreken), die na inbouw in DNA verdere amplificatie

onmogelijk maken. Om DNA te sequencen wordt eerst een PCR amplificatie van het template DNA

uitgevoerd in de aanwezigheid zowel ddNTPs gelabeld met een verschillende fluorescentie als dNTPs.

Het laatste nucleotide van elke streng kan bepaald worden doordat het terminale ddNTP van elk

amplicon na excitatie door een laser, een welbepaalde kleur uitstuurt. Op deze manier kan de

nucleotiden volgorde van een hele regio bepaald worden (Alberts 2002).

Voor het sequencen werd gebruik gemaakt van de Big Dye Terminator cycle sequencing kit (ABI) en

de Mastercycler Gradient (Eppendorf). Het pTRIP-CMV-EGFP-WPRE plasmide DNA verkregen uit

„5.1.2 Plasmide DNA purificatie‟ werd gebruikt als template DNA. Elk PCR reactiemengsel bevatte:

3,5 µL 5X Big Dye Sequencing buffer; 1 µL Ready Reaction mix; 2,5 µL van de gekozen primer (2

nM) en 100 ng template DNA (2 µL) aangevuld met NFW tot een totaal reactievolume van 20 µL.

Sequencing PCR reacties werden onder volgende condities uitgevoerd: 6 min initiële denaturatie bij

96 °C, 25 cycli bestaande uit 10 s denaturatie (96 °C) en 5 s annealing (50 °C), en ten slotte 4 min

extensie bij 60 °C.

Deze sequencing reactieproducten werden vervolgens opgezuiverd via een natriumacetaat-ethanol

precipitatie. Aan de 20 µL van elk PCR staal werd 52 µL van een oplossing bestaande uit 50 µL 100%

ethanol (VWR International, Leuven, België) en 2 µL natriumacetaat (3M; pH 5,5) (ABI) toegevoegd.

Na 10 min incubatie op ijs, werden de stalen gecentrifugeerd (30 min) in de Eppendorf 5415D (13200

tpm) waarna aan elk precipitaat 250 µL van een 70% ethanol oplossing toegevoegd werd, gevolgd

door centrifugatie (10 min). De verkregen pellet werd 2 min gedroogd (95 °C) op een Stuart Block

Heater 200D (Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK). Nadien werd het DNA geresuspendeerd in

20 µL Hi-Di-formamide (ABI) waarna de finale oplossing 2 min op het hitteblok geïncubeerd werd

(95 °C), gevolgd door enkele min incubatie op ijs. De verschillende PCR-sequencing stalen konden

vervolgens geanalyseerd worden met de ABI 3130XL genetic analyzer (ABI).

Methodologie

21

In onderstaande tabel worden de 10 gebruikte primers weergegeven met hun respectievelijke richting

(sense (S) of anti-sense (AS)) en hun positie op basis van de aangepaste TRIP-CMV-GFP-WPRE

vectorsequentie (besproken in „resultaten sequentie-analyse TRIP-CMV-GFP-WPRE‟).

Primer Sequentie Richting Sequentie in vector1

1 CAA-GGC-AGC-TGT-AGA-TCT-TAG-C S 4319 – 4340

2 ATA-CCC-ACG-CCG-AAA-CAA-GC AS 6212 – 6231

3 CTG-CAC-ATA-CCT-GGC-TAA-TCC S 4799 – 4819

4 GCC-AGA-AAA-ATT-TAT-CCC-TTG-C AS 5284 – 5305

5 GCT-CCG-GCG-TAG-AGG-ATC-TGG AS 6088 – 6108

6 CTT-AGG-ATC-TGG-GAT-TAG-CCA-GG AS 4808 – 4803

7 GCA-AGG-GAT-AAA-TTT-TTC-TGG-C S 5284 – 5305

8 CTG-CAG-TCA-ACT-TAA-TTG-AAT-GC AS 5516 – 5538

9 TAA-AGT-CAG-CCT-TCC-TCA-TCT-GC S 5907 – 5929

10 GCT-TCT-TCC-AAG-TAC-TTC-TGC-AGC AS 4755 – 4778

5.2 Methodologie: Transductie van HIV-nef in T-cellijnen

5.2.1 Celcultuur.

De CD4-CD8 positieve humane lymfatische SupT1-cellijn (AIDS Research and Reference Reagent

Program, NIH, Bethesda) en de CD4-CCR5 positieve Jurkat-cellen (American Type Culture

Collection, Rockville, MD) werden in vochtige omgeving (37 °C, 7% CO2) in Iscove modified

Dulbecco medium (IMDM) (Invitrogen) gesuplementeerd met 10 % (v/v) Fetal Calf Serum (FCS)

(Thermo Fisher Scientific) en 200 mM L-glutamin (Invitrogen) in cultuur gehouden. Deze IMDM

suspensie wordt in de hieronder volgende stappen benoemd als IMDM compleet.

5.2.2 Cellen tellen

Cellen werden steeds manueel geteld aan de hand van een 0,1 mm diepe Bürker telkamer (Blau Brand,

Wertheim, Duitsland). Om dode van levende cellen te kunnen onderscheiden werd 20 μL

trypaanblauw (Invitrogen) aan 20 µL cellen toegevoegd.

5.2.3 Transfectie

Voor de productie van retrovirus werd gebruik gemaakt van eukaryote Phoenix-Ampho cellen, een

producer en packaging cellijn afgeleid van de 293T-cellijn (Phoenix Retrovirus Expression System

Manual Orbigen Inc.). Omdat dit een adherente cellijn is, werd eerst Tryple Express (Invitrogen)

gebruikt om de cellen los te maken (trypsinisatie). Voor de transfectie van PhoenixA-cellen werd een

op calciumfosfaat gebaseerde methode toegepast, waarbij met behulp van de Calcium Phosphate

Transfection Kit (Invitrogen) een calciumfosfaat precipitaat op basis van HEPES-buffer oplossing

(NaCl, HEPES en NaP) (Invitrogen) werd gevormd, wat de opname van DNA door de celmembraan

1 Op basis van de aangepaste TRIP-CMV-EGFP-WPRE vectormap

Methodologie

22

medieerde. De Phoenix-A cellen werden getransfecteerd met Nef-bevattende LZRS-IRES-EGFP

plasmide DNA, met Nef afkomstig van SIVsm FWr, SIVgor, en NL4-3, verkregen van Dr. Kirchhoff,

Ulm, Duitsland. Daarnaast werden eveneens transfecties met LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP Wild Type

en LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP F191R Mutant plasmide DNA uitgevoerd, met Pex Nef eveneens

verkregen van Dr. Kirchhoff en door Dr. Ariën (Gent, België) in LZRS-IRES-EGFP ingekloneerd.

Voor deze transfecties werd het vector DNA vooraf geprecipiteerd (10 min, 1400 tpm) en gewassen in

500 µL 75% ethanol. Na centrifugatie (10 min,1400 tpm) werd de celpellet geresuspendeerd in 264 µL

voor transfectie gekwalificeerd water (Invitrogen) waarna 36 µL CaCl2 (Invitrogen)

werd toegevoegd.

Deze suspensie werd druppelsgewijs onder een constant flow van luchtbellen, aan 300 µL van een 2 X

HEPES buffered saline oplossing (Invitrogen) toegevoegd. Na 30 min incubatie (7% CO2) bij

kamertemperatuur, werd dit mengsel aan de PhoenixA cellen in IMDM compleet medium (vooraf

gesuplementeerd met 25 µM chloroquine (Sigma-Aldrich)) toegevoegd. Na een volledige dag

incubatie, wassen met 5 mL Phosphate Buffered Saline (PBS; Cambrex Corporation, East Rutherford,

USA) en verversen van het medium werd twee dagen na transfectie het viraal supernatant geoogst. Dit

werd na 10 min centrifugatie bij 4 °C (1700 tpm) op ijs bewaard.

5.2.4 Transductie

De CD4-CD8 positieve SupT1-cellijn werd getransduceerd met het verkregen retrovirale supernatant.

Een mengel van 100 µL retroviraal sup en 4 µL DOTAP Liposomaal Transfectie Reagent (Roche)

werd hiervoor gedurende 10 min geïncubeerd en vervolgens aan vijftigduizend SupT1-cellen

toegevoegd. Deze cellen werden vervolgens 90 min gecentrifugeerd bij 32 °C (2500 tpm), waarna ze

in 10 µL IMDM compleet in de incubator (37 °C, 7% CO2) werden geplaatst. De transductie-

efficiëntie werd na 48 u gecontroleerd door middel van Fluoresence Activated Cell Sorting (FACS)

analyse. Op dezelfde wijze werden ook CD4-positieve - CD8 negatieve Jurkat-cellen getransduceerd.

5.2.5 Fluoresence Activated Cell Sorting (FACS)

Voor het bestuderen van CD4-receptor downregulatie werden de FACScan Flow Cytometer (BD) en

de CellQuest software (BD) gebruikt. De FACS technologie maakt het mogelijk om cellen te

karakteriseren op basis van de fluorescentie (Forward Scatter) en de verstrooiing van het licht (Side

Scatter) na excitatie met een 488 nm Argon laser (Alberts 2002).

Om de CD4 oppervlakte receptor aan te kleuren werd CD4-PE gebruikt, een fycoërythrine (PE)

fluorochroom geconjugeerd anti-CD4 antilichaam (BD) dat na excitatie een golflengte in het oranje-

rode gebied (575 nm) uitzendt.

Er werd gewerkt met de nef-getransduceerde SupT1- en Jurkat-cellen. Honderdduizend nef-

getransduceerde cellen werden geresuspendeerd in 50 µL medium bestaande uit PBS gesuplementeerd

met 1% Bovine Serum Albumine Fraktion (BSA) (Roche) en 0.1% Natrium Azide (Merck). Na

aankleuring van de cellen met CD4-PE werd de suspensie 30 min bij 4 °C in het donker geïncubeerd.

http://www.bdbiosciences.com/nvCategory.jsp?action=SELECT&form=formTree_catBean&item=620433

Methodologie

23

De gekleurde cellen werden na wassen met 2 mL van de hierboven beschreven PBS oplossing 5 min

bij 4 °C gecentrifugeerd (1500 tpm), waarna de cellen geanalyseerd konden worden.

Net voor de meting werd 4 μL propidium iodide (PI, 1 mg/mL) (Invitrogen) toegevoegd. PI kan enkel

aanwezig zijn in dode cellen, waardoor het de differentiatie tussen levende en dode cellen mogelijk

maakt. Er werden telkens minstens tienduizend cellen per staal geanalyseerd. Er werd gevensterd op

PI negatieve cellen, zodat de al dan niet aanwezigheid van CD4-downregulatie (CD4-PE negatieve of

positieve cellen) enkel bij de levende cellen bestudeerd werd.

5.2.6 Sorteren van getransduceerde SupT1-cellen

Celpopulaties kunnen met behulp van FACS-cell-sorting, ook fysiek opgesplitst worden. De nef-

getransduceerde cellen werden gesorteerd op basis van het al dan niet tot expressie brengen van de

CD4-receptor molecule, waarvoor ze aangekleurd werden met een PE-gelabeld CD4-antilichaam. Het

toestel werd zodanig ingesteld dat enkel de EGFP of transductie positieve celpopulatie (waar het nef

gen aanwezig is) gesorteerd werden op de aan- of afwezigheid van de CD4-receptor.

De celpopulatie bestond uit zeven miljoen SupT1-cellen getransduceerd met Pex WT of Pex F191R

gekleurd met CD4-PE. Voor het instellen van de settings werden een miljoen niet-getransduceerde en

ongekleurde SupT1-cellen gebruikt. Ter voorbereiding werden de cellen eerst 5 en 2 min

gecentrifugeerd (1500 tpm, 4°C), waarna ze geresuspendeerd werden in 10 mL (gekleurd) en 100 µL

(ongekleurd) FACS buffer (bestaande uit 976 µL PBS, 200 µL FCS en 4 µL Gibco Ultrapure 0,5 M

EDTA (Invitrogen)). Aan de cellen werd vervolgens al dan niet 40 µL antilichaam toegevoegd. Na

1 u. incubatie op ijs werd 10 mL FACS buffer aan zowel de niet- als wel gekleurde cellen toegevoegd.

Deze suspensies werden voor 5 en vervolgens 2 min gecentrifugeerd bij 4°C (1500 tpm). Na

resuspenderen in 500 µL FACSsort buffer werden de cellen op ijs gehouden.

Voor het sorteren zelf werd gebruik gemaakt van de FACS Vantage (BD). De gesorteerde celpopulatie

werd opgevangen in 2 mL collectie medium bestaande uit IMDM, 50% FCS, penicilline en

streptomycine (Invitrogen) en L-glutamate (Invitrogen). Na het sorteren werden de cellen 5 min bij

4 °C gecentrifugeerd (1500 tpm). De celpellet werd vervolgens geresuspendeerd in 500 µL IMDM

compleet met antibiotica (IMDM, 10% FCS, penicilline, streptomycine en L-glutamaat). Nadien

werden de gesorteerde cellen in IMDM compleet in cultuur gebracht (37°C, 7% CO2).

5.2.7 Cellen invriezen en ontdooien

Voor het invriezen van cellen in vloeibaar stikstof werd gewerkt met de Isopropanolol methode. Alle

stappen werden uitgevoerd onder de LaminAir HBB 2448 (Holten).

De gesorteerde cellen werden voor 5 min gecentrifugeerd bij 4 °C (1500 tpm) en na verwijderen van

het supernatant gewassen met 10 mL PBS en opnieuw gecentrifugeerd voor 5 min. De verkregen

celpellet werd geresuspendeerd in 500 µL FCS (Thermo Fisher Scientific) gevolgd door enkele

minuten incubatie op ijs. Hieraan werd 500 µL van een FCS-20% Dimethylsulfoxide (DMSO)

(SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Duitsland) oplossing toegevoegd waardoor er een finale

Methodologie

24

concentratie van FCS-10% DMSO met cellen verkregen werd. Deze suspensie werd in Nalgene

cryogenic tubes (VWR) overgebracht, die op hun beurt in een „Mr Frosty‟ Cryobox (VWR) geplaatst

werden. Deze Cryobox werd bij -80 °C ingevroren, waarna de cellen de volgende dag naar vloeibaar

stikstof (-196 °C) konden overgebracht worden.

Om in vloeibaar stikstof ingevroren cellen te ontdooien, werden deze eerst kortstondig in een warm

waterbad (37 °C) geplaatst en vervolgens overgebracht naar een 15 mL Falcon buis (VWR) op ijs,

waarin het totale volume verdubbeld werd door langzaam toevoegen van IMDM compleet

(achtereenvolgens 1 mL, 2 mL en 4 mL IMDM compleet telkens gevolgd door 1 min incubatietijd).

De cellen werden vervolgens voor 5 min bij 4°C centrifugeerd (1500 tpm), waarna ze geresuspendeerd

werden in 10 mL IMDM compleet en geïncubeerd (37 °C, 7% CO2) in een small tissue culture flask

(VWR).

5.2.8 Western Blot

Western Blotting (Immunoblotting) is een techniek om eiwitten aan te tonen d.m.v specifieke

antilichamen. Na het lyseren van de cellen worden de eiwitten op basis van moleculair gewicht

gescheiden in een Bis-Tris gel, waarna ze via electroforese getransfereerd worden naar een

polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan, wat „blotten’ wordt genoemd. Geblotte eiwitten kunnen

vervolgens aangetoond worden, dankzij de vorming van specifieke primair-secundair antilichaam

complexen getagged met Horseradish Peroxidase, een enzyme dat na het toevoegen van luminol licht

uitstuurt op basis van een chemiluscente reactie, wat met een X-stralengevoelige film gedetecteerd kan

worden. Omdat de hoeveelheid lichtemissie evenredig is met de aanwezigheid van het onderzochte

eiwitantigen, kunnen na vergelijking met een ladingscontrole zoals actine, besluiten betreffende

proteïne expressie op basis van Western Blot geformuleerd worden (Coligan 1992).

a. Stap 1: Cellysaten

De gesorteerde SupT1-cellen getransduceerd met Pex Nef allelen dienen voor Western Blot eerst

gelyseerd te worden. Ter voorbereiding hierop werd van de SupT1-cellen eerst een celpellet gemaakt

(5 min centrifugatie, 4000 g), die gewassen werd met 1 mL 1X PBS en vervolgens opnieuw

gecentrifugeerd (5 min, 6000 g). Pellets werden geresuspendeerd in 100 µL Triton-Lysis buffer

(samengesteld uit 800 µL Lysis Buffer A, 100 µL Triton X100 (10%) (Sigma-Aldrich) en 100 µL

Protease Inhibitor (10x) (Roche)). Deze suspensie werd geïncubeerd (20 min op ijs), gevolgd door 5

min centrifugatie (16000 g). In de volgende stappen werd verder gewerkt met het supernatant

(cellysaat).

b. Stap 2: Eiwit concentratie

Om besluiten betreffende proteïne expressie te kunnen formuleren dienden per staal dezelfde

hoeveelheid totaal eiwit vergeleken te worden. De proteïneconcentratie van de cellysaten werden

berekend met behulp van de RC DC Protein Assay (Bio-Rad), op basis van de absorbanties bij een

Methodologie

25

golflengte van 750 nm. Deze absorbanties werden vergeleken met deze van een verdunningsreeks van

1,38 mg/mL BSA en Triton-Lysis Buffer in volgende samenstelling:

Verdunning

(mg/mL)

blanco

0,125

0,250

0,500

0,750

1,000

1,250

1,380

BSA (µL)

0

5

10

20

30

40

50

50

Triton-Lysis

buffer (µL)

50

50,2

45,2

35,2

25,2

15,2

5,2

0

Per verdunning werd 250 µL reagens A‟ toegevoegd, samengesteld uit 20 µL DC reagens S (Bio-Rad)

en 1 mL Lysis Buffer A (samengesteld uit 50 mM Tris-HCl (Merck KGaA), 1 mM EDTA (Sigma-

Aldrich) en 150 mM Natriumchloride (VWR)). Per verdunning werd vervolgens 2 mL DC reagens B

(Bio-Rad) toegevoegd, gevolgd door incubatie (15 min), waarna de absorbanties in duplo gemeten

werden (750 nm) met de Spectrofotometer DU 600 (Beckman Coulter, Brea, USA).

Op basis van deze absorbanties werd met Microsoft Excel een standaardcurve berekend (X=

concentratie (mg/mL), Y= absorbantie 750 nm), wat resulteerde in volgende vergelijking: „y =

0,2508x + 0,0269‟.

FIGUUR 15.

Aan de cellysaten (1/5 verdund) werden dezelfde hoeveelheden reagens A‟ en reagens B als voor de

verdunningsreeks toegevoegd, waarna eveneens de absorbanties bij 750 nm gemeten werden. De

standaardvergelijking y = 0,2508x + 0,0269 werd vervolgens gebruikt om de proteïneconcentraties

(1/5 verdund) van de cellysaten te berekenen.

c. Stap 3: Eiwit Electroforese

Van elk lysaat werd 20 µg eiwit genomen waaraan 5 % 2-mercapto-ethanol werd toegevoegd om de

zwavelstof bruggen, die de secundaire structuur van het eiwit mee in stand houden, te verbreken en zo

de proteïnes te denatureren. Er werd ook 5 % Bromofenolblauw (Sigma-Aldrich) - wat een

ladingsmerker en kleurstof is - toegevoegd, gevolgd door 5 min denaturatie bij 95 °C.

Voor de electroforese werd een Nupage 4- 12 % Bis-Tris gel (Invitrogen) gebruikt waarop van elk

staal 20 µL geladen werd samen met 10 µL Multimark gewichtsmerker (Invitrogen). De slotjes

werden vooraf gewassen met 1 X Nupage MES/SDS Running Buffer (Invitrogen) gesuplementeerd

met Nupage anti-oxidantia (Invitrogen) (500 µL anti-oxidans voor 200 mL 1 X running buffer).

Electroforese werd met de Xcell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen) uitgevoerd waarbij het binnenste

compartiment werd gevuld met 1x Nupage MES/SDS running buffer (met anti-oxidantia), het

buitenste compartiment met 1x Nupage MES/SDS running buffer (zonder anti-oxidantia). De eiwitten

werden d.m.v. electroforse gedurende 1 u. aan 200 V en 125 mA gescheiden.

y = 0,2508x + 0,0269

R² = 0,9733

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,35

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6Ab

sorb

an

tie

75

0 n

m

mg/mL BSA

Standaard curve

Reeks1

Lineair (Reeks1)

Methodologie

26

d. Stap 4: Blotting

Voor de eigenlijke transfer van de proteïnen (blotten) werd gebruik gemaakt van de Xcell II Blot

Module (Invitrogen). Ter hoogte van de kathode werd op één zijde van de Bis-Tris gel twee Whatman

chromatografie papiertjes van 3 mm (VWR) gelegd. De papiertjes werden eerst vochtig gemaakt in

Transfer Buffer (849 mL bidi, 50 mL 20 X Nupage transferbuffer, 1 mL Nupage anti-oxidantia,100

mL methanol). Dit stapeltje werd op drie, vooraf bevochtigde, Sponge Pads geplaatst. Op de andere

zijde van de Bis-Tris gel werd een PVDF membraan van 0,2 µm porie grootte (Invitrogen) gelegd, die

eerst werd gewassen: 30 s in methanol, twee maal met gedistilleerd water en tenslotte 5 min in

Transfer Buffer. Twee in Transfer Buffer geweekte Whatmanpapiertjes en vier in Transfer Buffer

geweekte Sponge Pads werden hierop geplaatst, gevolgd door de anode.

Dit geheel wordt in de Xcell II Blot Module (EI9051, Invitrogen) geplaatst. Samengevat bestond de

gebruikte opstelling van katode naar anode uit:

3 Sponge Pads voor Xcell II Blotting

2 Whatman chromatografie papiertjes (3 mm)

1 Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (0,2 µm)

Bis-Tris gel

2 Whatman chromatografie papiertjes van 3 mm

4 Sponge Pads voor Xcell II Blotting

Deze Xcell II Blot Module werd opnieuw in de Xcell Sure Lock Mini-cell (met magneet) en op een

magnetische roerplaat geplaatst. De binnenste kamer werd nu gevuld met Transfer Buffer, het

buitenste compartiment met gedistilleerd water. De electroforese werd voor 1 u. uitgevoerd aan 25 V

en 150 mA.

e. Stap 5: Kleuring.

Na electroforese werd de PVDF membraan 5 min met Ponceau S oplossing (Sigma-Aldrich) gewassen

en vervolgens tweemaal met gedistilleerd water. Het membraan werd hierna voor 1 u. in 12 mL Tris

buffered Saline (TBS)-melkoplossing (Blokking Buffer) op de schudtafel geïncubeerd. Dit is nodig

om de vrije bindingsplaatsen op de eiwitten te bezetten, zodat aspecifieke bindingen met het

antilichaam verhinderd worden. (TBS bestaat uit 50 mM trisbase, 150 mM NaCl, aangelengd met

MilliQ water tot een pH van 7.5; Blokking Buffer bestaat uit 100 mL TBS, 5 g Nestlé Gloria

melkpoeder, 75 µL Tween 20 (Sigma-Aldrich)).

- Actine kleuring:

Voor de kleuring van actine werd 12 mL van een 1/1000 verdunning (in 50% TBS / 50% Blocking

Buffer) van anti-actine muis monoclonaal antilichaam (MP Biomedicals, Solon, USA) aan de

membraan toegevoegd. De PVDF membraan werd na overnacht incubatie op de schudtafel gewassen

(wasstap 1): 1 min met 0.1 % Tris buffered Saline-Tween oplossing (TBS-T, bestaande uit 100 mL

TBS en 100 µL Tween 20 (Sigma-Aldrich), tweemaal 5 min met TBS-T en tweemaal 5 min met een

50% TBS-50% TBS-T oplossing. Hierna werd 12 mL van een 1/3000 verdunning (in 50% TBS-50%

TBS-T) van secundair anti-muis IgG Horseradish Peroxidase (HRP) gelinkt antilichaam (GE

FIGUUR 16. Inhoud Xcell II Blot Module. Uit: handleiding XCell II Blot Module, Invitrogen.

Methodologie

27

Healthcare, Litlle Chalfont, UK) toegevoegd (60 min incubatie op de schudtafel) waarna het

membraan opnieuw werd gewassen (wasstap 2): 1 min met 0.1 % TBS-T, viermaal 5 min met 0,1 %

TBS-T en tweemaal 1 min met MilliQ (MQ) water. Voor visualisatie werd gebruik gemaakt van de

ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences, Roosendaal, Nederland). Er werd

400 µL van beide ECL reagentia samengevoegd en vervolgens al druppelend op een gelijke manier

over het membraan verdeeld. Het membraan werd vervolgens op een Hyperfilm High Performance

Chemiluminiscence Film (Amersham Biosciences) blootgesteld aan chemiluminescent licht met

verschillende blootstellingtijden: 5 s, 1 min, 5 min en 2 u.

- Nef kleuring:

Hiervoor werd het PVDF membraan 5 min in een badje met Ponceau S Solution en daarna tweemaal

met gedistilleerd water gewassen. Na een nacht drogen werd 12 mL van een 1/720 verdunning (in

50% TBS-50% Blocking Buffer) van gebiotinyleerde EH1 anti-Nef monoclonaal muis antilichaam

(verkregen van J. Hoxie, AIDS Research and Reference Reagent Program) toegevoegd (overnacht

incubatie op de schudtafel). De optimale verdunning van dit anti-Nef antilichaam werd in vorige

experimenten in het labo bepaald. Vervolgens werd het PVDF membraan gewassen volgens hetzelfde

protocol als wasstap 1 bij actine kleuring. Hierna werd 12 mL van een 1/1000 verdunning (in 50%

TBS-50% TBS-T) van secundair streptavidine-HRP antilichaam toegevoegd (60 min incubatie op de

schudtafel), waarna het membraan volgens wasstap 2 werd gewassen. Voor de visualisatie werd

opnieuw gebruik gemaakt van de ECL reagentia en de Hyperfilm High Performance

Chemiluminiscence Film met volgende blootstellingtijden: 15 min, 4 u 30 min en overnacht.

5.2.9 Isolatie en purificatie van DNA

Voor de isolatie van genomisch DNA uit de zes (na FACS-sort, zie resultaten) SupT1-celpopulaties

werd een fenol-extractie en op ethanol gebaseerde precipitatie toegepast. Er werd eerst van elk van de

celpopulaties een celpellet van circa 2,5 miljoen cellen gemaakt, die vervolgens werd opgelost in 10

mL PBS. Van deze 10 mL celsuspensie werd 5 mL (125 duizend cellen, waarvan eerst een pellet werd

gemaakt) gebruikt voor mRNA isolatie (zie 5.2.10) en de overige 5 mL voor deze DNA isolatie. In de

volgende stappen werd gebruik gemaakt van de QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) en het

protocol van de fabrikant. Centrifugatie gebeurde met de Eppendorf 5415D (13200 tpm). De

verschillende handelingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. De

celpellet werd geresuspendeerd in 200 µL PBS, waaraan 20 µL proteïnase K (Qiagen) en vervolgens

200 µL Buffer AL (Lysis Buffer) werd toegevoegd. Deze suspensie werd 10 min geïncubeerd (56 °C)

in de SBH 200D hitteblok, gevolgd door het toevoegen van 200 µL 100 % ethanol waarna dit op een

QIAmp Mini spin kolom gedruppeld werd. Na 1 min centrifugatie werd hierop 500 µL Buffer AW1 en

500 µL Buffer AW2 gedruppeld, gevolgd door respectievelijk 1 min en 3 min centrifugatie. Het

genomisch DNA werd ten slotte met 200 µL Buffer AE van de kolom geëlueerd.

Methodologie

28

Deze procedure werd voor de verschillende celpopulaties uitgevoerd, waardoor van elke populatie

afzonderlijk DNA (concentratie bepaald met Nanodrop) verkregen werd. Een tweede extractie werd

volgens dezelfde procedur