27-09-05

Practicum Gentechnologie

Handleiding

Ir. R. Lavigne, Prof. J. Robben Prof. G. Volckaert

Academiejaar 2005-2006

Katholieke Universiteit Leuven Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen

Laboratorium voor Gentechnologie

Practicum Gentechnologie 2005-2006 2

27-09-2005

INLEIDING Het practicum Gentechnologie is opgevat als één groot experiment waarbij een eiwitcoderende sequentie van een bacteriofaag gekloond worden in E. coli en tot expressie gebracht als een fusieproteïne met thioredoxine. Vooreerst wordt een PCR-amplificatie uitgevoerd op 3 open leesramen (open reading frames, ORF's) in het genoom van de Bacteriofaag. De primers zijn zo ontworpen dat ze de coderende sequentie, zonder stopcodon, precies aflijnen. Na controle via agarose-gelelectroforese worden de PCR-producten rechtstreeks geïnsereerd in een commerciële expressievector die "geactiveerd" is met topoisomerase ("Topo-kloning") en getransformeerd naar competente E. coli-cellen. Bekomen klonen worden geverifieerd op de aanwezigheid en de oriëntatie van de insertie door middel van PCR en restrictiesplitsing. Van positieve klonen wordt ook de DNA-sequentie bepaald met behulp van cycle-sequencing met fluorescent-gemerkte dideoxy-terminatoren en geautomatiseerde sequentieaparatuur. Bij correcte insertie is het faag-ORF stroomopwaarts gefusioneerd met het leesraam van thioredoxine, en stroomafwaarts met twee "tags", het V5-epitoop en een 6xHis. Het gen staat onder controle van de araBAD-promoter en kan geïnduceerd worden met arabinose. Positieve klonen worden in cultuur gebracht en op het gepaste tijdstip geïnduceerd. Enkele uren na inductie worden de cellen geoogst en gelyseerd. Geproduceerde fusieproteïnen worden gezuiverd door geïmobiliseerd-metaal-affiniteitschromatografie (IMAC) en geanalyseerd met SDS-polyacrylamide-gel-elektroforese (SDS-PAGE). Het experiment "van gen tot kloon tot eiwit" is opgedeeld in 10 opeenvolgende stappen (proeven) die als losstaande deelexperimenten kunnen worden uitgevoerd. In een aantal gevallen moeten opgegeven tijden tussen twee opeenvolgende stappen gerespecteerd worden. Gezien het concept van één groot experiment, is het essentieel dat alle deelexperimenten zo correct mogelijk worden uitgevoerd en waar nodig DNA en culturen bewaard worden voor verdere stappen. Vermeld daarom steeds je groepsnummer op alle gebruikt materiaal (eppendorfbuisjes, cultuurbuisjes, petriplaten, …) Aansluitend op het practicum worden in de Theoretische Oefeningen Gentechnologie een aantal stappen in het kloningsexperiment gesimuleerd op computer en worden tijdens het practicum bekomen DNA-sequenties geanalyseerd zodat de bekomen practicumresultaten bioinformatisch geanalyseerd kunnen worden ter vervollediging van het verslag.

VERSLAG Per groep wordt één verslag gemaakt. Dit dient ingediend te worden nadat alle proeven zijn afgelopen. Het verslag moet een inzichtelijk overzicht geven van de uitgevoerde experimenten. Het is niet de bedoeling alle uitgevoerde stappen in detail te beschrijven. Wel dienen eventuele berekeningen, alle resultaten en tussenresultaten, alsook een bespreking van de resultaten vermeld te worden. Ook negatieve resultaten (proeven die niet gelukt zijn) dienen vermeld te worden, samen met een eventuele verklaring. Neem daarom zorgvuldig nota's tijdens de proeven! Beantwoord tevens de vragen gesteld in de handleiding.

Practicum Gentechnologie 2005-2006 3

27-09-2005

INDELING EN TIMING

Proef Beschrijving Nodige tijd (uur) Tussentijd (uur)

0 Inleiding 2 (Di 24/9) 1 PCR-amplificatie van ORFs

- Inleiding (gebruik van materiaal) - Bereiding stalen voor PCR - Opstarten PCR-toestel

1 1/2 Overnacht

2 Agarose-gelelektroforese - Gieten agarosegel (0.8%) - Bereiding van stalen uit proef 1 en elektroforese

2 -

3 TOPO™-kloning - Keuze van twee PCR-producten uit proef 1 voor kloning - Ligatie in topoisomerase-geactiveerde vector - Transformatie naar competente E. coli cellen - Uitplaten op LB-medium met ampicilline - Incubatie

2 Overnacht

4 Kloonanalyse door PCR - PCR-analyse van verschillende transformanten - Inzetten overnachtculturen voor plasmidenbereiding (proef 5)

1 (liefst in

namiddag!)

Overnacht

5 Kloonanalyse door restrictie - Mini-prep plasmide-DNA-isolatie overnachtculturen (proef 4) - Restrictiesplitsing met BglII

2 1/2 (liefst in

voormiddag!)

1

6 Agarosegel-elektroforese - Gieten agarosegel (1,2%) - Bereiding en elektroforese van stalen uit proeven 4 en 5 - Interpretatie van de bandenpatronen

2 1/2 -

7 DNA-Sequentieanalyse - Bereiding sequentiereacties voor twee gekloonde fragmenten - Opstarten PCR-toestel (cycle sequencing)

1/2 4 (Overnacht)

8 Opzuiveren sequentiestalen - Opzuiveren sequentiestalen - Demonstratie van geautomatiseerde DNA-sequentieanalyse - Analyse en interpretatie van bekomen resultaten tijdens de Theoretische Zitting

1

9 Expressie en zuivering van gekloond ORF als fusieproteïne - Inzetten preculturen - Overenten culturen en groeien tot in exponentiële groeifase - Inductie van expressie door toevoeging van arabinose - Cellysis en affiniteitszuivering van het recombinante eiwit, en staalbereiding voor SDS-PAGE-analyse

Plan zorvuldig!

1/2 1/2 1/2 2

Overnacht

1 1/2 3-4

10 SDS-PAGE-analyse - Bereiding polyacrylamidegel (scheidingsgel plus stapelgel) - Laden van stalen uit proef 9 en elektroforese - Blauwkleuring - Drogen en bewaren van eiwitgel

4

4

27-09-05

PROEF 1

PCR-AMPLIFICATIE VAN ORFs IN HET GENOOM VAN DE FAAG

Het genoom van de bacteriofaag werd in 2002 ontrafeld (op het Laboratorium voor Gentechnologie) en bevat 48 open leesramen (ORF's) waarvan veel van de overeenkomstige eiwitten nog een onbekende functie hebben. In dit practicum zullen enkele van deze genen worden bestudeerd. Een eerste stap is de PCR-amplificatie van de coderende sequentie voor latere kloning in een E. coli expressievector. Elke groep voert een PCR uit op deze drie open leesramen. PCR laat toe een gewenste sequentie in een complex DNA-mengsel specifiek te amplificeren met behulp van twee primers die complementair zijn het DNA dat de doelwitsequentie begrenst (zie cursus Gentechnologie). Er wordt een lineair PCR-product gevormd, aan beide uiteinden bergrensd door de primers en in hoeveelheden die gedetailleerde analyse en/of kloning toelaten. In de eerste oefening worden drie verschillende sequenties uit het genoom van faag geamplificeerd met een standaard PCR-protocol. Naast matrijs-DNA en twee primers bevat een PCR-reactiemengsel ook nog gepaste hoeveelheden dATP, dCTP, dGTP en dTTP (tesamen ook dNTP's genoemd), een thermostabiel DNA-polymerase en MgCl2. Mg2+-ionen zijn een co-factor voor het polymerase en beïnvloeden de primerbinding en de specificiteit van de PCR-reactie. De Mg2+-concentratie dient bijgevolg soms te worden geoptimaliseerd. Een typische PCR-reactie is opgebouwd uit een initiële denaturatiestap, gevolgd door 25-35 cycli van (1) DNA-smelting, (2) primerbinding en (3) primerextensie. Vaak wordt finaal een extra extensiestap toegevoegd om de vorming van volledige dubbelstrengen te verzekeren alsook, zoals in dit experiment, de additie van een extra 3'-terminale A (zie proef 2). Tabel: PCR-primers voor amplificatie van de ORFs RL-KMVgp16-F GAGAGATCTATGCAAGCTAAGCATAG RL-KMVgp16-R GTAAGATCTCACGTTCTCCCATCCGT RL-KMVgp23-F GAGAGATCTATGACGAATGATCCCA RL-KMVgp23-R GTAAGATCTTACGTTCCTCGCGTTGT RL-KMVgp28-F GAGAGATCTATGACCAAATCCATCTGG RL-KMVgp28-R GTAAGATCTGCGAGTTTGCCGATGATG RL-KMVgp31-F GTAAGATCTATGACCCAACCGAACGA RL-KMVgp31-R GTAAGATCTGATACCCTGCGCCATAC RL-KMVgp32-F GAGAGATCTATGAGCTTTCTGAACGAC RL-KMVgp32-R TATAGATCTCGCGGTGATGTCGAAG RL-KMVgp36B-F GTGAGATCTATGCTGAAGCAGGACGTGT RL-KMVgp36-R TATAGATCTCTCCGCTGTTGCGG RL-KMVgp40-F GAGAGATCTATGTACCATAGCAGCACC RL-KMVgp40-R GAGAGATCTTACCCGATTGAAGATGTG RL-KMVgp47-F TATAGATCTATGGCGAACACCCGCGA RL-KMVgp47-R TATAGATCTGCCCGCCGGTGCGGTGT Proctocol

5

27-09-2005

Opgelet! Vermijd contaminaties van reagentia en PCR-mengsels door steeds nieuwe tipjes te gebruiken. Voer uit op ijs.

1. Bereid in steriele kleine (6x 500 µl), gemerkte microcentrifugeerbuisjes: drie 50 µl-PCR-mengsels, één voor elk van de drie ORFs (zie tabel voor primers) x2 Voeg daarvoor in deze volgorde samen:

- 42 µl PCR-kloonanalysebuffer (KAB bij –20°C) bevat 33 µl steriel milliQ-water

5 µl 10x PCR-buffer: 200 mM Tris-HCl pH 8,3 500 mM KCl 1% Tween 20 20 mM MgCl2

4 µl dNTP's (2,5 mM van elk dNTP) - 1.5 µl forward + 1.5 µl reverse ORF primer (20 µM)

- 1 µl genomisch DNA (50 ng/µl) - 1 µl SuperTaq polymerase (15 x verdund: 0,33U/µl)

2. Bewaar de buisjes op ijs totdat het PCR-toestel beschikbaar/geprogrammeerd is.

3. Programmeer het PCR-toestel met het volgende programma:

1. 1 min 95°C (initiële denaturatie) 2. 1 min 95°C ← (Denaturatie) 3. 30 s 54°C ↑35 x (Primer-binding) 4. 3 min 72°C → (Primer-extensie) 5. 20 min 72°C 6. hold 4°C (of KT) (Bewaren)

4. Spreek zo nodig af met andere groepen om stalen tesamen te laten lopen. Start de PCR. Wanneer het toestel een temperatuur aangeeft van ongeveer 90°C, plaats dan vlug alle stalen (na even afdrogen met papieren doekje) in het toestel.

5. Bewaar/maak de stalen klaar voor agarose-gelelektroforese (Proef 2)

6

27-09-05

PROEF 2

AGAROSE-GELELEKTROFORESE

De resulterende PCR-producten uit proef 1 worden geanalyseerd met behulp van agarose-gelelektroforese en gecontroleerd op lengte en opbrengst. Op een agarosegel kunnen DNA-fragmenten gescheiden worden volgens grootte. Hierbij is de afgelegde weg omgekeerd evenredig met de logaritme van het aantal baseparen en is afhankelijk van de concentratie van de gebruikte agarosegel (Zie tabel A). Als referentie wordt een gekend DNA-ladderpatroon (vb. λ/PstI) en/of een positief staal gebruikt. Toevoegen van ethidiumbromide aan het gel of kleuring in een bad met ethidiumbromide is noodzakelijk voor visualisatie van de DNA-fragmenten onder UV-licht. Protocol

1. Weeg voor een 1% agarosegel 1,5 g agarose af in een erlenmeyer. (Pas eventueel de hoeveelheid aan indien je een gel van een ander percentage agarose wil). Voeg hieraan 150 ml 1xTAE-buffer toe en verwarm in de microgolfoven tot de agarose volledig is gesmolten (± 2 min op stand 10). Schud af en toe voorzichtig (Let op voor plots overkoken. Draag handschoenen!).

2. Voeg ethidiumbromide toe tot een finale concentratie van ± 100 ng/ml (dit is 3 µl per 150 ml) en meng goed. Laat de oplossing afkoelen tot ± 60°C.

Opgelet!: Ethidiumbromide is een sterk mutagene en cancerogene stof. Draag dus steeds handschoenen wanneer je met deze stof werkt en draag er zorg voor niet te morsen. Raak een ethidiumbromide-bevattende gel nooit aan met blote handen. Raak ook nooit na contact van de handschoenen met ethidiumbromide andere voorwerpen aan zoals deurklinken, boekentas, pipetten enz.!!

3. Sluit de randen van de gelhouder af met kleefband. Giet het gel in de gelhouder en plaats de kam. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder of tussen de tanden van de kam zijn.

4. Laat het gel stollen en bereid ondertussen de stalen: - neem 5 µl van de PCR-mengsels, voeg 5 µl water en 2 µl 6x laadbuffer toe. - neem 6 µl van de referentie (500 ng λ/Pst I met laadbuffer).

Bewaar de rest van de PCR-mengsels (eenduidig merken!) tot de volgende proef in de koelkast (maximaal enkele dagen) of de diepvriezer.

Laadbuffer wordt aan de stalen toegevoegd om drie redenen: het verhoogt de dichtheid van het staal zodat het DNA in het sleufje zinkt; het geeft kleur aan de stalen en vergemakkelijkt zo het laden; en de kleurstof die in een elektrisch veld naar de anode beweegt met een voorspelbare snelheid geeft de vordering aan van de elektroforese. Soms wordt aan de laadbuffer RNase A toegevoegd om het eventueel aanwezige RNA te herleiden tot niet-storende oligonucleotiden.

7

27-09-2005

5. Vul de elektroforesetank met 1x TAE-buffer tot een hoogte waarbij het gel juist door de buffer bedekt zal zijn.

6. Wanneer het gel volledig gestold is verwijder dan voorzichtig de kam en de kleefband en plaats de gelhouder in het elektroforesetoestel. Zorg ervoor dat het gel volledig is ondergedompeld en dat er geen luchtbellen achterblijven in de sleufjes.

7. Pipetteer de stalen volledig in de sleufjes (niet door de bodem prikken!). Noteer de volgorde van de stalen.

8. Sluit het elektroforesetoestel aan op de stroombron (let op de polariteit!) en stel de stroom in op maximum 150 mA.

9. Laat de elektroforese lopen tot de kleurstof enkele cm gevorderd is. Evalueer het gel onder UV-licht (OOGBESCHERMING!!). Laat eventueel de elektroforese nog verder lopen indien de scheiding van de fragmenten nog onvoldoende is.

10. Maak een schatting van de lengte en de hoeveelheid (in ng) van de DNA-fragmenten.

11. Bezorg het gel, voorzien van groepsnummer aan de assistent. Die zal een foto maken voor het verslag.

Bereken de hoeveelheid en de concentratie aangemaakt PCR-product uitgaande van een visuele schatting van de hoeveelheid PCR-product in het agarosegel. Gebruik hierbij als referentie de banden van de λ/PstI-merker waarvan de hoeveelheden exact zijn gekend (er werd in totaal 500 ng λ-DNA geladen; ongesplitst λ-DNA is 48,5 kbp). ____________________________________ Tabel A : Scheidingsgrenzen in gels met verschillende concentraties aan agarose % Agarose (w/v) Grenzen waartussen efficiënte scheiding

van lineair DNA (kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 Oplossingen 1xTAE 40 mM Tris-acetaat 1 mM EDTA 6x Laadbuffer 40 % (w/v) sucrose in water 0,25 % bromofenol blauw

8

27-09-2005

Scheidingspatroon van λ-PstI (1,4% agarose)

11509

5080464945052840257724542443214019801700

11591092

805

516

467448

339

265

247

216 ,210 ,200 164, 150, …

λ/Pst I bp ng (op 500 ng totaal)

119

524846

292725252220

17,5

1211

8,3

5,3

4,84,6

3,5

2,7

2,5

±10

147

77

42

9

27-09-05

PROEF 3

TOPO™-KLONING

DNA-fragmenten kunnen op ten minste 5 verschillende wijzen aan elkaar worden gezet (zie cursus Gentechnologie). Ligatie met behulp van topoisomerase is er één van. In deze proef maken we gebruik van Topo™-cloning (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) om PCR-producten zonder voorafgaandelijke behandeling rechtstreeks te insereren in een daartoe bereide "topoisomerase-geactiveerde" vector. DNA-polymerasen met een terminaal-transferase-activiteit zoals Taq voegen een enkel 3'-overhangende deoxyadenosine (A) toe aan de uiteinden van een PCR-product. Topo™-kloneervectoren worden ter beschikking gesteld als gelineariseerde vectoren met een 3'-overhangende deoxythymidine (T) en covalent gebonden topoisomerase I. Het volstaat PCR-product en vector samen te voegen en kort te incuberen alvorens het mengsel naar competente E. coli-cellen te transformeren.

Transformatie is een proces waarbij naakt DNA getransfereerd wordt naar bacteriën of hogere cellen. Bij natuurlijke transformatie (vb. Bacillus subtilis) worden specifieke genen tot expressie gebracht waarbij de cellen competent worden (d.i. in staat om DNA op te nemen). Bij geïnduceerde transformatie zijn alternatieve methoden nodig om DNA in de doelwitcel te introduceren. Twee methoden worden veelvuldig toegepast nl. chemisch (CaCl2) geïnduceerde transformatie (in combinatie met een temperatuursschok) en elektroporatie (door aanleggen van een sterk elektrisch veld). Wij gebruiken de CaCl2-methode voor onze transformatie. Bij de CaCl2-transformatie wordt competentie verkregen door E. coli cellen in exponentiële groei te isoleren en te incuberen bij 0 °C in 100 mM CaCl2. Competente cellen kunnen worden bewaard op -70 °C na toevoeging van glycerol. Competente cellen worden voor deze proef ter beschikking gesteld. Na transformatie worden de cellen uitgespreid op een selectieve agarvoedingsbodem die alleen cellen met vector toelaat zich te ontwikkelen tot kolonies.

10

27-09-2005

De ORF-PCR-producten worden in deze proef geïnsereerd in de expressievector pBad/ThioTopo van Invitrogen. Bij correcte insertie resulteert dit in de vorming van een leesraamfusie van het ORF in een thioredoxine-coderende sequentie en een dubbele 'tag' bestaande uit de coderende sequenties voor het V5-epitoop en een 6xHis (zie ook proef 9). De ORF-primers zijn zo gekozen dat het PCR-product hiermee aangemaakt precies passen in het leesraam. De gevormde fusies staan onder controle van de reguleerbare promoter PBAD.

Figuur 3.1. Kenmerken van de expressievector pBAD/Thio-Topo. - PBAD-promoter: basen 1-276 - Thioredoxine-V5-6xHis-leesraam: basen 346-674 - Ampicillineresistentie-leesraam (bla): basen 1341-2201 - pMB1-ori (pUC-afgeleid): basen 2346-3019 - AraC-leesraam: basen 3550-4428

Voorbereiding

- Kies voor kloning twee van de drie ORF-PCR-producten (X en Y) uit de vorige proeven. - Controleer of er een waterbad bij 42°C beschikbaar is. - Laat 6 LB-platen met ampicilline (100 µg/ml) opwarmen tot kamertemperatuur. - Laat twee buisjes competente ("One Shot™") cellen ontdooien op ijs. Koel een leeg 500 µl eppendorfbuisje op ijs voor de controle-transformatie.

11

27-09-2005

Protocol

A. LIGATIE

1. Merk twee 500 µl eppendorfbuisjes en voeg samen per buisje:

- 3 µl MilliQ-water - 2 µl PCR-product X OF Y (of ~10 ng) - 1 µl pBAD/Thio-TOPO-vector (10 ng/µl) Meng voorzichtig en centrifugeer het reactiemengsel naar de bodem van het buisje.

2. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur (~25°C).

3. Plaats op ijs en ga voort met de transformatie. B. TRANSFORMATIE

1. Voeg telkens 2 µl ß-mercapto-ethanol 0.5 M (ONDER DE TREKKAST!) bij de twee buisjes met 50 µl competente cellen op ijs en vermeng door voorzichtig roeren met de pipettip (niet op-en-neer pipetteren!).

2. Breng voorzichtig 10 µl cellen uit beide buisjes over naar het voorgekoelde controlebuisje. Voeg hierbij 1 µl controle-DNA (pBAD/Thio, 10 pg/µl). Voeg bij de 2 overige buisjes telkens 3 µl ligatiemengsel (merken!). Vermeng door voorzichtig roeren met de pipettip (niet pipetteren!).

3. Incubeer de drie transformatiemengsels gedurende 30 min op ijs.

4. "Heat shock" de cellen gedurende 30 s bij 42°C zonder schudden.

5. Plaats de cellen onmiddellijk terug op ijs.

6. Voeg 250 µl SOC-medium toe, sluit de buisjes zorgvuldig en incubeer horizontaal gedurende 30 min bij 37°C in de schudincubator. Merk ondertussen de selectieve LB/Ap100-platen. Voor elk transformatiemengsel merk je twee platen.

7. Strijk telkens 50 en 200 µl ligatiemengsel gelijkmatig uit op een LB-plaat tot ze droog zijn. (Om kleinere volumina gelijkmatig te kunnen uitstrijken kan je eerst 50-100 µl SOC op de plaat aanbrengen).

8. Incubeer de platen (omgekeerd!) overnacht bij 37°C in de broedstoof. _________________________________ Samenstelling van gebruikte oplossingen SOC-medium: 2% Trypton; 0.5% faagextract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose LB-agar: 1% Trypton; 0.5% faagextract; 1% NaCl; 1.5 % agar in water. LB/Ap100-agar: LB-agar met 100 µg/ml ampicilline. Genotype van de E. coli TOP10-stam: F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

12

27-09-05

PROEF 4

PCR-KLOONANALYSE Na overnacht groeien zijn de kolonies van de transformanten (klonen) zichtbaar en dus groot genoeg voor analyse. Klonen kunnen worden gekarakteriseerd door PCR- of restrictieanalyse. PCR-kloonanalyse kan rechtstreeks gebeuren op suspensies van E. coli-cellen en vereist geen DNA-isolatie. Ze kan uitgevoerd worden op gesuspendeerde cellen van kolonies de dag na de transformatie. Restrictieanalyse echter, vereist isolatie van relatief grote hoeveelheden plasmide-DNA. Hiervoor moeten eerst vloeibare cultuurtjes worden aangelegd die overnacht gegroeid moeten worden. Met PCR-analyse kan men dus één dag winnen om het resultaat van een kloning te kennen. In het practicum zullen klonen op beide wijzen geanalyseerd worden. Plasmide-DNA van positieve klonen zal later ook gebruikt worden voor DNA-sequentieanalyse (Proef 7). In deze proef wordt een PCR-analyse uitgevoerd op gesuspendeerde cellen met één primer die bindt op de vectorsequentie en 1 primer die intern in het gekloneerde ORF bindt. (zie figuur 4.1). Zo kan men met behulp van agarose-gelelectroforese van de PCR-producten de kloons met correct insert bepalen. De gebruikte vectorprimer is: pTOPOf: 5'-GTTCCTCGACGCTAAC-3' En voor elk ORF de specifieke reverse primer (zie proef 1)

13

27-09-2005

Figuur 4.1. Kloonplaats en omgevende sequenties van pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen).

14

27-09-2005

Protocol

A. BEREIDING CELSUSPENSIES

1. Tel het aantal transformanten op de platen van proef 3.

☞ Bereken de transformatie-efficiëntie (theoretisch aantal transformanten bij transformatie van 1 µg DNA). Hoe verhouden zich de transformatie-efficiënties van intact (supercoil) vector-DNA en van vector met topoisomerase-geligeerd PCR-product?

2. Kies voor beide ORFs telkens vijf kolonies voor analyse en merk deze op de bodem van de agarplaat met een volgnummer. Kies ook één kolonie van de pBAD/Thio-controleplaat.

3. Teken een rooster op de bodem van een verse LB/Ap100-agarplaat en nummer 10 vakjes van 1 tot 11. Bereid een buisje met 4 ml LB-medium + 100 µg/ml ampicilline. (Stock: 1000x)

4. Neem een steriele microtiterplaat en vul 10 kuipjes met telkens 100 µl medium.

5. Stip met een steriel entstokje de 10 gekozen kolonies aan en resuspendeer de opgepikte cellen in de microtiterplaatkuipjes door het stokje enkele malen met de punt tegen de wand rond te draaien. Maak onmiddellijk (zonder opnieuw de kolonie aan te stippen) met hetzelfde stokje een streepenting van ~1 cm in een vakje van de LB/Ap100-agarplaat. Noteer de volgorde van de stalen.

6. Sluit de microtiterplaat en laat de celsuspensies incuberen bij 37°C tot de PCR-reactiemengsels zijn voorbereid. Incubeer de agarplaat overnacht bij 37°C (= backup van de bestudeerde klonen). Bewaar de oude LB-platen in de koelkast.

B. PCR

1. Bereid voor elk van de geselecteerde ORFs (2) in een 1,5 ml eppendorfbuisje een PCR-mengsel ('master mix') voor een 8-tal reacties van 50 µl: - 350 µl KAB

- 12 µl forward primer ( 20 µM) (vectorprimer) - 12 µl interne primer ( 20 µM) (ORF-specifiek)

- 2,5 µl SuperTaq polymerase (1U/µl) Meng voorzichtig door enkele malen op en neer pipetteren zonder hierbij schuim (Tween 20 is een detergent!) te veroorzaken.

2. Breng telkens 50 µl PCR-mengsel over in 10 kleine(500 µl), gemerkte, eppendorfbuisjes.

3. Voeg per buisje 3 µl celsuspensie toe, en aan één buisje medium zonder cellen

4. Centrifugeer eventueel kort om luchtbellen te verdrijven.

5. Bewaar de buisjes op ijs totdat het PCR-toestel beschikbaar/geprogrammeerd is.

15

27-09-2005

6. Programmeer het PCR-toestel met het volgende programma:

1. 2 min 95°C (initiële denaturatie) 2. 30 s 95°C ← (Denaturatie) 3. 30 s 52°C ↑35 x (Primer-binding) 4. 2 min 72°C → (Primer-extensie) 5. hold 4°C (of KT) (Bewaren)

7. Spreek zo nodig af met andere groepen om stalen tesamen te laten lopen. Start de PCR. Wanneer het toestel een temperatuur aangeeft van ongeveer 90°C, plaats dan vlug alle stalen (na even afdrogen met papieren doekje) in het toestel.

☞ In de theoretische zitting kunnen we nagaan hoe lang de verwachte fragmenten zullen zijn

aan de hand van de primersequentie. Bespreek ook de primers in je verslag.

8. Bewaar/maak de stalen klaar voor agarose-gelelektroforese (Proef 6)

C. ENTEN VAN CULTUREN VOOR PROEF 5

Indien proef 5 niet werd gepland voor de volgende dag, bewaar dan de microtiterplaat met celsuspensies in de koelkast tot de dag vóór proef 5.

Om grote hoeveelheden bacteriën van één kolonie te bekomen, wordt de kolonie geënt op vloeibaar medium. Meestal gebruikt men daarvoor een rijk medium, zoals hier het LB-medium (Luria-Bertani). Om verlies van de aanwezige plasmiden tegen te gaan moeten de bacteriële culturen altijd gegroeid worden in aanwezigheid van selectieve agentia, zoals antibiotica. Vele hedendaagse plasmiden bevatten het par-gen niet meer zodat plasmidensegregatie tijdens de celdeling niet altijd meer op gaat. Dochtercellen zonder plasmiden zullen sneller delen dan andere met plasmiden en kunnen al gauw een cultuur overnemen in afwezigheid van selectieve agentia.

1. Voeg aan elf 4 ml LB-buisjes telkens 4 µl Ap (1000x) toe. Merk de buisjes met de kloonnummers en je groepsnummer.

2. Ent 10 µl celsuspensie van elke kloon uit de microtiterplaat.

3. Incubeer overnacht bij 37°C in de schudincubator.

4. Ga 's anderendaags verder met bereiding van plasmide-DNA (Proef 5).

16

27-09-05

PROEF 5

RESTRICTIE-KLOONANALYSE De transformanten kunnen eveneens worden gekarakteriseerd door het plasmide-DNA te isoleren en vervolgens te onderwerpen aan een restrictieanalyse. Er bestaan verschillende technieken om plasmide-DNA te isoleren uit E. coli, die variëren in zuiverheid, opbrengst en snelheid. De keuze van een "miniprep"-methode wordt ondermeer bepaald door het aantal te analyseren klonen en verdere gebruik van het DNA (kloning, restrictiesplitsing, mutagenese, sequentieanalyse …). Meer en meer komen 'kits' op de markt waarbij men snel zuiver DNA kan isoleren zonder toxische stoffen zoals vaak gebruikte chloroform en fenol.

Wij gebruiken hier voor plasmide-DNA-bereiding de QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland) waarbij tot 20 µg (voldoende voor restrictieanalyse) plasmide-DNA van hoge kwaliteit/zuiverheid (essentieel voor sequentieanalyse), per kolommetje kan worden geïsoleerd. De zuiveringsprocedure is gebaseerd op een geoptimaliseerde alkalische cellyse volgens Birnboim en Doly en op de adsorptie van DNA op een silicagelmembraan in de aanwezigheid van hoge zoutconcentraties. De procedure bestaat uit drie basisstappen: 1. Bereiding van een helder cellyssaat: bacteriën worden gelyseerd in alkalische omstandigheden (NaOH) in de aanwezigheid van SDS (Na-dodecylsulfaat) en RNase A (buffer P1). SDS , (een detergent) zorgt voor lysis van de cel; de alkalische condities zorgen voor denaturatie van proteïnen en van het chromosomaal en plasmide DNA. Het lysaat wordt geneutraliseerd en aangepast aan hoge-zoutbindingscondities door toevoeging van buffer N3. Door de hoge zoutconcentratie zullen gedenatureerde proteïnen, chromosomaal DNA (dat celwand-gebonden is), cellulair debris en SDS precipiteren, terwijl het kortere plasmide-DNA renatureert en in oplossing blijft. Tijdens de lysis is het belangrijk nooit te vortexen om shearing van het chromosomaal DNA te vermijden, waardoor losse chromosomale DNA fragmenten in het supernatant zouden kunnen achterblijven. 2. Adsorptie van het DNA op de QIAprep-membraan: door optimale buffercondities en de eigenschappen van de silicagelmembraan bindt alleen DNA aan de membraan, terwijl RNA, proteïnen en metabolieten niet adsorberen. 3. Wassen en elutie van het plasmide-DNA bij lage zoutconcentraties: zouten worden weggewassen met buffer PE. Het geadsorbeerde plasmide-DNA wordt geëlueerd met water of Tris-buffer. De meeste restrictie-endonucleasen van het type II zijn commercieel verkrijgbaar. Ze worden geleverd samen met hun specifieke restrictiebuffer (10x geconcentreerd), met een buffersamenstelling geoptimaliseerd voor de werking van het enzym. Eveneens wordt de optimale incubatietemperatuur (meestal 37°C) vermeld. Hoeveelheden enzym worden in units uitgedrukt: 1U = de hoeveelheid enzym die 1 µg λ-DNA volledig splits in 1 uur onder voorgeschreven omstandigheden. In praktijk wordt meestal een kleine overmaat enzym gebruikt (2 tot 5 maal de nodige geschatte hoeveelheid) en duurt een digestie 1-2 uur. De splitsing en de lengte van de bekomen fragmenten worden gecontroleerd met behulp van agarose-gelelektroforese.

17

27-09-2005

Protocol A. PLASMIDENBEREIDING

1. Breng van de vloeibare culturen van de 10 geselecteerde kolonies uit proef 4 en van de controlecultuur telkens 1,5 ml over in gemerkte microcentrifugeerbuisjes en centrifugeer 1 min op maximale snelheid (zorg voor evenwicht in de rotor!). Giet het supernatans weg. Centrifugeer nogmaals 1,5 ml cultuurvloeistof in dezelfde buisjes. Giet het supernatans weg en verwijder zoveel mogelijk van de resterende bovenstaande vloeistof met een pipettip.

2. Resuspendeer de bacteriële pellet in 250 µl buffer P1 (resuspensiebuffer met RNase A) door vortexen en/of pipetteren. Zorg ervoor dat de pellet volledig in suspensie is (geen klonters meer te zien).

3. Voeg 250 µl buffer P2 toe (lysis-buffer met NaOH/SDS). Sluit de fles met P2-buffer onmiddellijk na gebruik. Meng voorzichtig door de buisjes een vijftal maal om te keren (niet vortexen !). Incubeer 5 min bij kamertemperatuur (niet langer !).

4. Voeg 350 µl buffer N3 toe (neutralisatiebuffer). Meng onmiddellijk maar voorzichtig door de buisjes een vijftal keren om te keren.

5. Centrifugeer 10 min op maximale snelheid. Plaats ondertussen de QIAprep-spin-kolommetjes in de bijgevoegde 2 ml collectiebuisjes.

6. Pipetteer het supernatans van stap 5 over in de QIAprep-kolommetjes.

7. Centrifugeer 1 min. Het plasmide-DNA zit nu geadsorbeerd op het kolommetje. Giet de doorgelopen vloeistof weg en plaats de kolommetjes terug in dezelfde buisjes.

8. Voeg 500 µl buffer PB (wasbuffer) toe en centrifugeer 1 min. Giet de doorgelopen vloeistof weg en plaats de kolommetjes terug in dezelfde buisjes.

9. Voeg 750 µl buffer PE (verwijdering zouten) en centrifugeer 1 min. Giet de doorgelopen vloeistof weg en plaats de kolommetjes terug in dezelfde buisjes. Centrifugeer nogmaals 1 min en verwijder restanten wasbuffer.

10. Zet de QIAprep-kolommetjes over op nieuwe, gemerkte Eppendorf-buisjes. Pipetteer vervolgens 50 µl 10 mM Tris-HCl pH 8,5 (elutiebuffer EB) op het centrum van ieder kolommetje, laat 1 min staan, en centrifugeer 1 min.

De verwachte opbrengst is 10-20 µg plasmide-DNA per miniprep, opgelost in ~50 µl.

18

27-09-2005

B. RESTRICTIEDIGESTIE Een standaard restrictiedigestie wordt uitgevoerd op 0,5-1 µg DNA in 10 µl reactievolume: - x µl plasmide-DNA oplossing - 1 µl 10x geconcentreerde restrictiebuffer - 0.5 µl restrictieënzymes (5 U) - H2O tot 10 µl Bij restrictieanalyse van grotere aantallen stalen wordt een "master mix" gemaakt om het aantal pipetteerstappen te reduceren. Zo bereid men voor digestie van n DNA-stalen van 4 µl in 10 µl finaal volume een reactiemengsel van: - n µl 10x geconcentreerde, enzym-specifieke restrictiebuffer - n x 0,5 µl restrictieënzym (5 U per DNA-staal) - steriel water tot een totaal volume van n x 10 - n x 4 = n x 6 µl Tip: Maak 10% (of voor n+1 stalen) meer stockoplossing dan nodig. Zo heb je bij het uitverdelen nooit tekort aan stockoplossing.

Er worden een restrictiedigest uitgevoerd op alle 10 klonen waarvan plasmide-DNA werd bereid met BglII (A/GATCT). Door deze reactie uit te voeren kunnen we nagaan of de kloon al dan niet een insert bevat. Protocol

Houd restrictieënzymen waarmee gewerkt wordt steeds op ijs. Veelvuldige temperatuurs-schommelingen veroorzaken activiteitsverlies! Enzymen worden bewaard in een glycerol-oplossing. Steek de pipettip daarom niet te diep in de enzymoplossing. Pipetteren vanop de het oppervlak vermijdt dat druppels enzym aan de buitenkant van de tip blijven kleven!

1. Maak voor digestie met BglII telkens een reactiemengsel klaar voor een twaalf-tal reacties van 10 µl elk en verdeel vervolgens over evenveel microcentrifugeerbuisjes.

2. Voeg aan de BglII -reactiemengsels telkens 4 µl van de zopas bereide plasmide-DNA-oplossingen toe (dit stemt naar verwachting overeen met ongeveer 1 µg DNA).

3. Incubeer 60 min op 37°C. Bewaar de rest van de DNA-bereidingen voor verder gebruik in de diepvriezer (of eventueel in de koelkast).

4. Bewaar/maak de stalen klaar voor agarose-gelelectroforese, tesamen met de PCR-stalen (Proef 4)

☞ Bedenk een strategie waarbij je door middel van restrictie-analyse niet alleen de aanwezigheid van een insert kan aantonen, maar tevens de oriëntatie van dit insert.

19

27-09-2005

PROEF 6

AGAROSE-GELELEKTROFORESE De PCR-producten uit Proef 4 en restrictiedigesties uit Proef 5 van de bestudeerde klonen worden geanalyseerd door middel van agarose-gelelectroforese. Op basis van de resultaten wordt beslist welke kloon zal gebruikt worden voor DNA-sequentieanalyse en expressie (Proeven 7 en 9). Protocol 1. Weeg voor een 1.3% agarosegel 2.0 g agarose af in een erlenmeyer. Voeg hieraan 150 ml 1xTAE-buffer toe en verwarm in de microgolfoven tot de agarose volledig is gesmolten (± 2 min op stand 10). Schud af en toe voorzichtig (Let op voor plots overkoken. Draag isolerende handschoenen!).

2. Voeg ethidiumbromide (handschoenen!) toe tot een finale concentratie van ± 100 ng/ml (dit is 3 µl per 150 ml) en meng goed. Laat de oplossing afkoelen tot ± 60°C.

3. Sluit de randen van de gelhouder af met kleefband. Giet het gel in de gelhouder en plaats drie kammen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder of tussen de tanden van de kammen zitten.

4. Laat het gel stollen en bereid ondertussen de stalen: - Voeg aan het gesplitste DNA (2 x 10 stalen) 2 µl 6x laadbuffer toe. - Pipetteer 10 µl van de 10 PCR-stalen van in een eppendorfbuisje en voeg er 2 µl 6x laadbuffer toe. - Neem van de referentie (λ/Pst I) drie stalen van 6 µl (voor drie rijen stalen).

5. Vul de elektroforesetank met 1x TAE-buffer tot een hoogte waarbij het gel juist door de buffer bedekt zal zijn.

6. Wanneer het gel volledig gestold is verwijder dan voorzichtig de kammen en de kleefband en plaats de gelhouder in het elektroforesetoestel. Zorg ervoor dat het gel volledig is ondergedompeld en dat er geen luchtbellen achterblijven in de sleufjes.

7. Pipetteer de stalen volledig in de sleufjes. Zorg ervoor dat de restrictie- en PCR-stalen van een zelfde kloon onder elkaar (in dezelfde 'kolom') worden geladen. Noteer de volgorde van de stalen!

8. Schakel het elektroforesetoestel aan en stel de stroom in op maximum 150 mA.

9. Laat de elektroforese lopen tot de kleurstof enkele cm gevorderd is. Evalueer het gel onder UV-licht (OOGBESCHERMING!!). Laat eventueel de elektroforese nog verder lopen indien de scheiding van de fragmenten nog onvoldoende is.

10. Bezorg het gel, voorzien van groepsnummer aan de assistent. Die zal een foto maken voor het verslag.

11. Maak een schatting van de lengte van de DNA-fragmenten.

20

27-09-05

PROEF 7

DNA-SEQUENTIEANALYSE

Genetische informatie is vervat in de specifieke opéénvolging van de vier nucleotiden A, C, G en T in een DNA-molecule. De ontrafeling van die opéénvolging wordt DNA-sequentiebepaling genoemd. De verschillende methoden voor de bepaling van de nucleotidenvolgorde van DNA worden uitvoerig besproken in de cursus Gentechnologie. In deze proef worden sequentiereakties uitgevoerd volgens de dideoxy-ketenterminatiemethode van Sanger, maar gebruik makend van vier verschillende, base-specifieke, fluorescent-gemerkte terminatoren. Hiervoor gebruiken we de ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer). Het gebruikte DNA-polymerase is het AmpliTaq® DNA-polymerase FS. Dit enzym is een gemuteerd Taq-polymerase dat speciaal ontwikkeld werd voor DNA-sequentieanalyse. Het vertoont bijna geen 5'→3' exonuclease-activiteit en kan snel en efficiënt vanaf het 3'-OH-uiteinde van de primer zowel normale deoxy- als gemerkte dideoxynucleotiden inbouwen. Door de thermostabiliteit van het enzym is het mogelijk de sequentiereactie (DNA-smelting, primerbinding, primerextensie en ketenterminatie) meermaals te herhalen in een cyclisch programma ('cycle sequencing') gebruik makend van een PCR-toestel. Hierdoor is voor de sequentiereactie slechts een relatief kleine hoeveelheden matrijs-DNA nodig. Er worden twee verschillende klonen telkens twee sequentiereacties uitgevoerd, de eerste met een primer die bindt vóór het gekloond fragment (primer pTOPOf), de tweede met een primer die bindt op de andere streng, stroomafwaarts van het gekloond fragment en terugwaarts gericht (primer pTOPOr). De concentratie aan primer in de stockoplossingen is vaak onbekend en kan spectrofotometrisch bepaald te worden. Hierbij wordt de hoeveelheid UV-straling (260 nm) die door de basen wordt geabsorbeerd gemeten. Voor oligonucleotiden komt een OD260 (optische densiteit bij 260 nm) van 1 overeen met 33 µg/ml DNA. Voor de meeste PCR-toepassingen worden 20 µM primerstocks aangemaakt. De concentratie van primer in een 20 µM oplossing wordt als volgt bepaald: 6,48 x n = ng/µl, met n = aantal nucleotiden. Bij commercieel verkregen primers wordt tegenwoordig de concentratie door de leverancier vermeld. Voor deze proef worden primer-stockoplossingen van 1 mM ter beschikking gesteld. Protocol 1. Meng de volgende reagentia in kleine (500 µl) microcentrifugeerbuisjes op ijs, één voor de forward reactie (primer pTOPOf) en één voor de reverse reactie (primer pTOPOr) :

13.4 µl milliQ-water 1.6 µl primer (1,6 pmol) 1 µl matrijs-DNA (200-500 ng plasmide) 4 µl Terminator Ready Reaction Mix

Als matrijs-DNA wordt het DNA gebruikt dat geïsoleerd werd uit twee klonen met een verschillende, éénduidig geïdentificeerde insertie (zie Proef 6; overleg met de assistent). De concentratie van het DNA zou normaal 200-500 ng/µl moeten zijn, en kan geverifieerd worden aan de hand van de resultaten van de gelelektroforese.

21

27-09-2005

2. Voeg twee druppels minerale olie toe. Centrifugeer eventueel kort om luchtbellen te verdrijven of indien niet alle waterige componenten onder de olielaag zitten.

5. Bewaar de buisjes op ijs totdat het PCR-toestel beschikbaar/geprogrammeerd is.

6. Programmeer het PCR-toestel als volgt:

1. 2 min 96°C (initiële denaturatie) 2. 30 s 96°C ← (Denaturatie) 3. 15 s 50°C ↑30 x (Primer-binding) 4. 4 min 60°C → (Primer-extensie) 5. hold 4°C (of KT) (Bewaren)

7. Spreek zo nodig af met andere groepen om stalen tesamen te laten lopen. Start het programma. Wanneer het toestel een temperatuur aangeeft van ongeveer 80°C, plaats dan vlug alle stalen (na even afdrogen met papieren doekje) in het toestel.

☞ Cycle sequencing wordt uitgevoerd in een 'PCR'-toestel maar is in feite geen PCR. Waarom niet?

22

27-09-05

PROEF 8

OPZUIVEREN VAN DE DNA-SEQUENTIESTALEN

Om overschotten aan niet geïncorporeerde fluorescent gemerkte dideoxyterminatoren uit de sequentiereacties te verwijderen, is een opzuivering van de stalen nodig. Restanten van terminatoren veroorzaken storende signalen in het sequentiepatroon en dienen dus zorgvuldig verwijderd te worden. Dit kan gebeuren door een eenvoudige ethanol-precipitatie waarbij DNA-strengen, in tegenstelling tot mono- en oligonucleotiden, neerslaan. Deze stap is ESSENTIEEL voor het slagen van de DNA-sequentieanalyse Protocol

1. Bereid voor elke reactie een gemerkt 1,5 ml microcentrifugeerbuisje met 2 µl 3M Na(OAc) pH 4,6 en 50 µl 95% ethanol.

2. Breng het volledige sequentiereactiemengsel hierin over. Pipetteer daarvoor de waterlaag zorgvuldig van onder de olie. Verwijder eventuele olieresten aan de buitenkant van de tip met een papieren doekje.

3. Vortex en plaats 10 min op ijs.

4. Centrifugeer gedurende 15 min op maximale snelheid. Let op de positie van de buisjes in de rotor zodat je weet langs welke zijde van het buisje zich de pellet moet bevinden. Breng eventueel met een stift een merkteken aan.

5. Verwijder de ethanol zo volledig mogelijk met een kleine pipettip zonder de pellet te verstoren (deze is niet of nauwelijks zichtbaar!). Dit is belangrijk om zo veel mogelijk niet geïncorporeerde terminatoren te verwijderen.

6. Was de pellet met 250 µl 70% ethanol. Centrifugeer nogmaals 5 min.

7. Verwijder de ethanol zo volledig mogelijk en laat de stalen enkele minuten drogen aan de lucht. Geef ze vervolgens aan de assistent.

De verdere procedure verloopt in het Laboratorium voor Gentechnologie. Aan de studenten wordt de mogelijkheid geboden na afspraak de sequentietoestellen aan het werk te zien.

- De pellet wordt opgelost in 4 µl gedeïoniseerde formamide/50 mM EDTA (pH 8,0) (5/1 v/v). Aan de EDTA-oplossing werd een kleurstof toegevoegd om later het laden te vergemakkelijken. - Vlak voor het laden worden de stalen gedenatureerd bij 90°C (2 min). De stalen worden geladen op een sequentiegel in een automatische DNA-sequencer (ABI 3130 of 377) en overnacht gelopen. Een hieraan verbonden computer genereert automatisch per laan een bestand met een chromatogram van de waargenomen pieken alsook een tekst-bestand met de geïnterpreteerde DNA-sequentie. De resultaten van de analyse worden medegedeeld en zullen verder besproken worden tijdens de theoretische zitting.

23

27-09-2005

BESCHRIJVING VAN HET ABI 373A SYSTEEM De automatische DNA-sequencer model 3130 van Applied Biosystems is een geautomatiseerd elektroforese-detectiesysteem aangepast voor scheiding, detectie en identificatie van fluorescent gemerkte moleculen. De detectie steunt op de fluorescentie van een chromofore groep aanwezig op het terminator-nucleotide (zoals in deze proef) of aan het 5’-uiteinde van een gemerkte primer. Deze chromofore groep wordt geëxciteerd met een argon-ion laserstraal, die continu de positie onderaan het capillair scant. Voor elk van de vier dideoxynucleotiden is er een verschillende chromofore groep met een maximale emissie bij een verschillende golflengte. Na de excitatie wordt het geëmiteerde licht achtereenvolgens doorheen vier filters gestuurd, één voor elke golflengte. De filter waarvoor de intensiteit van het ontvangen signaal het grootst is, bepaalt dus eenduidig welke chromofore groep langs het detectiepunt passeerde en dus ook welke base. Op deze manier wordt er geen momentopname bekomen van het capillaire scheidingsproces zoals bij een autoradiogram, maar is er een continue on-line refaagratie van het signaal. De informatie van de elektroforese-detectie-eenheid wordt gestuurd naar een computer voor en data-analyse en -display.

24

27-09-05

PROEF 9

RECOMBINANTE EXPRESSIE VAN ORF-FUSIEPROTEINEN De correct gekloonde ORFs bevinden zich ingebed in het leesraam van thioredoxine (thv het 5'-einde van het ORF, i.e. aan de N-terminus van het ORF-expressieproduct) en twee tags, het V5-epitoop en een 6xHis-peptide (thv het 3'-einde van het ORF, i.e. C-terminaal). Thioredoxine (Trx) is een 11,7 kDa eiwit dat in E. coli bij overexpressie kan ophopen tot 40% van de totale cellulaire eiwitten zonder daarbij zijn oplosbaarheid te verliezen. De aanwezigheid van Trx in fusieproteinen verhoogt de translatieëfficiëntie en kan correcte vouwing van de fusiepartner bevorderen. Het V5-epitoop kan gebruikt worden voor immunologische detectie met een anti-V5 monoklonale antistof. De 6xHis-sequentie laat affiniteitszuivering toe op harsen met geïmmobiliseerde metaalionen ("IMAC"). De Trx-ORF-V5-H6-translatiefusie staat onder controle van de araBAD-promoter (PBAD), afkomstig van het araBAD-operon dat de arabinose-metabolisme pathway controleert in E. coli. De promoter laat preciese modulatie van de heterologe expressie toe. Hij is zowel positief als negatief gereguleerd door het product van het araC-gen, meegecodeerd op het plasmide. AraC is een transcriptieregulator die een complex vormt met L-arabinose. In afwezigheid van arabinose bezet een AraC-dimeer de O2- en I1-regio's van het operon waarbij een 210 bp lus wordt gevormd (zie Figuur 9.1). Maximale transcriptieactivatie vereist twee stappen:

(1) Bij binding van arabinose laat AraC de O2-bindingsplaats los en bezet het de I2-plaats langs de I1-plaats. Hierdoor wordt de DNA-lus vrijgemaakt en kan de transcriptie starten.

(2) Binding van cAMP-activator proteïne (CAP) gecomplexeerd met cAMP aan het DNA bevordert binding van AraC aan I1 en I2, en stimuleert bijgevolg de transcriptie.

25

27-09-2005

Basale expressieniveau's kunnen onderdrukt worden door toevoegen van glucose aan het groeimedium ("glucose-" of "catabolietrepressie"). De aanwezigheid van glucose verlaagt immers de cAMP-spiegel wat op zijn beurt de binding van CAP en dus ook van AraC vermindert. De transcriptieactivatie wordt daardoor verlaagd. Door de concentratie van arabinose te variëren kan het expressieniveau van het recombinante eiwit geoptimaliseerd worden. De mogelijkheid tot strikte regulatie laat de expressie toe van toxische en essentiële genen.

Heterologe expressie is sterk eiwit-afhankelijk (vouwing, stabiliteit, toxiciteit, …) en dient daarom voor elke constructie te worden geoptimaliseerd. In het practicum wordt een pilootexperiment uitgevoerd om expressie van de nieuwe ORF-fusies te onderzoeken in kleine batch-culturen. Daarvoor worden overnachtculturen overgeënt en gegroeid tot in de mid-exponentiële groeifase waarop de expressie wordt geïnduceerd door toevoeging van verschillende concentraties arabinose. Enkele uren later wordt de eiwitproductie geanalyseerd. Een snelle affiniteitszuivering (IMAC) laat toe de kwaliteit en opbrengst van de aangemaakte fusieproteïnen te bepalen. De analyse van eiwitstalen gebeurt met SDS-PAGE (Proef 10).

De proef bestaat uit meerdere korte stappen met daartussen langere wachttijden. Het is niet nodig aanwezig te blijven in de tussenperioden. Het is wel essentieel voor het welslagen van de proef de duur van de tussentijden te respecteren. Plan daarom zorgvuldig!

Voorbereiding (uit te voeren tijdens de namiddag van de dag vóór Proef 9!)

1. Kies in overleg met de assistent één pBAD/Thio-ORF-kloon voor expressie van Trx-ORF-6xHis fusieproteïnen. Localiseer de kloon op de bewaarde agarplaten. Neem als controle een 'lege' pBAD/Thio-kloon voor expressie van Trx-6xHis.

2. Voeg aan twee gemerkte 4 ml LB-buisjes telkens 4 µl Ap (1000x) toe. Ent de buisjes met een entstokje.

3. Incubeer overnacht bij 37°C in de schudincubator.

4. Ga 's anderendaags in de voormiddag verder met het expressie-experiment.

26

27-09-2005

A. EXPRESSIE

Protocol

1. Voeg aan tien gemerkte 4 ml LB-buisjes telkens 4 µl Ap (1000x) toe. Ent vijf buisjes met telkens 1/20 vol (200 µl) overnachtcultuur van de pBAD/ThioORF-kloon, en vijf buisjes met pBAD/Thio-kloon. Incubeer gedurende 1 1/2 uur bij 37°C in de schudincubator.

2. Maak intussen in 4 eppendorfbuisjes een tienvoudige verdunningsreeks van 20% arabinose in milliQ-water. Bewaar de verdunningen voor stap 3.

3. Na 1 1/2 uur groeien zijn de cellen in de mid-logfase (OD600 = ~0,5) en klaar voor inductie. Nummer de vijf buisjes van beide klonen van 1 tot 5 en voeg telkens 40 µl van de arabinoseverdunningen toe volgens onderstaande tabel:

Buisje Stockoplossing Volume (µl) Finale concentratie 1 - - 0% 2 0,02% 40 0,0002% 3 0,2% 40 0,002% 4 2% 40 0,02% 5 20% 40 0,2%

4. Incubeer gedurende 3 tot 4 uur bij 37°C in de schudincubator. Tijdens deze periode worden de fusieproteïnen aangemaakt.

5. Plaats de culturen op ijs. Neem van elke cultuur een staal van 1 ml en breng over in gemerkte eppendorfbuisjes. Centrifugeer gedurende 1 min aan maximale snelheid. Verwijder supernatans. Resuspendeer de pellet door op en neer pipetteren in 75 µl water (Let op dat er geen celklompjes meer overblijven). Breng de celsuspensies volledig over naar kleine (500 µl) eppendorfbuisjes en voeg 25 µl 4x SDS-PAGE-buffer toe. Bewaar de stalen voor SDS-PAGE-analyse. (proef 10)

6. Gebruik de rest van de twee culturen die maximaal werden geïnduceerd (nr. 5) voor affiniteitszuivering.

20% arabinose100 µl 10 µl 10 µl 10 µl

90 µl H2O

20 % 2% 0,2% 0,02%

27

27-09-2005

B. Affiniteitszuivering

De aangemaakte fusieproteïnen kunnen dank zij de 6xHis-tag gezuiverd worden op een Ni2+-kolom (immobilized metal affinity chromatography, IMAC). De affiniteit van Ni2+-ionen is onafhankelijk van de eiwitstructuur en kan zowel op natieve als op gedenatureerde eiwitten gebeuren. De methode is daarom ook geschikt voor de zuivering van onoplosbare eiwitten (inclusion bodies). In het practicum worden kant-en-klare Ni-NTA-spin-kolommetjes (Qiagen) gebruikt. De zuivering wordt uitgevoerd onder denaturerende condities.

Figuur 9.1. Interactie tussen twee naburige His-residu's in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.

Fig 9.2. Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes.

28

27-09-2005

Protocol

1. Neem 2x1,5 ml van de twee maximaal geïnduceerde culturen en centrifugeer gedurende 1 min aan maximale snelheid. Verwijder telkens het supernatans.

2. Resuspendeer de cellen in 400 µl lysisbuffer B. Lyseer de cellen door gematigd vortexen zonder schuimvorming te veroorzaken. De cellen zijn volledig gelyseerd als de troebel is verdwenen.

3. Centrifugeer het lysaat gedurende 20 min aan maximale snelheid om celresten te precipiteren. Breng het supernatans over naar een vers buisje. Neem een 30 µl staal en vermeng dit met 10 µ 4xSDS-PAGE-buffer. Merk dit staal met TL (totaal lysaat) en bewaar voor SDS-PAGE.

4. Equilibreer twee Ni-NTA-kolommetjes met 600 µl buffer B. Centrifugeer gedurende 2 min bij lage snelheid (2000 tpm). Verwijder de doorgelopen vloeistof.

5. Affiniteitsbinding: Breng het supernatans van stap 3 over op de geëquilibreerde kolommetjes en centrifugeer gedurende 2' bij 2000 tpm. De 6xHIS-eiwitten worden in deze stap gebonden op de kolom. Andere componenten lopen door. Het is van belang niet sneller dan aan 2000 tpm te centrifugeren. Hogere snelheden reduceren de bindingstijd en dus de opbrengst. Neem een 30 µl staal van de doorgelopen vloeistof en vermeng dit met 10 µ 4xSDS-PAGE-buffer. Merk dit staal met FT (flow through) en bewaar voor SDS-PAGE. Verwijder de rest van de doorgelopen vloeistof.

6. Was de kolommetjes tweemaal met 600 µl buffer C. Centrifugeer telkens gedurende 2' bij 2000 tpm en verwijder de doorgelopen vloeistof.

7. Elutie: plaats de kolommetjes op een vers buisje en elueer de gebonden eiwitten met 2 x 200 µl buffer E. Centrifugeer telkens bij 2000 tpm. Neem een 30 µl staal van het eluaat vloeistof en vermeng dit met 10 µ 4xSDS-PAGE-buffer. Merk dit staal met EL en bewaar voor SDS-PAGE. Bezorg de rest van het eluaat aan de assistent voor bewaring (-20°C).

In totaal heb je nu 16 stalen voor SDS-PAGE-analyse:

Trx-ORF-6xHis Trx-6xHis 1 1 Geen inductie 2 2 0.0002% arabinose 3 3 0.002% arabinose 4 4 0.02% arabinose 5 5 0.2% arabinose TL TL Totaal lysaat FT FT Flow through EL EL Eluaat

Bewaar alle stalen bij -20°C voor analyse (proef 10). SDS-PAGE-stalen kunnen op kamertemperatuur worden bewaard als ze dezelfde dag worden geanalyseerd. Buffer B (lysisbuffer): 8M ureum; 0,1M NaH2PO4; 0,01 M Tris.HCl pH 8,0 Buffer C (wasbuffer): 8M ureum; 0,1M NaH2PO4; 0,01 M Tris.HCl pH 6,3 Buffer E (elutiebuffer): 8M ureum; 0,1M NaH2PO4; 0,01 M Tris.HCl pH 4,5

29

27-09-2005

PROEF 10

SDS-PAGE-ANALYSE Zoals DNA-fragmentenmengsels snel kunnen geanalyseerd worden met agarose-gelelectroforese, zo is SDS-polyacrylamide-gelelectroforese (SDS-PAGE) de methode bij uitstek om snel en goedkoop proteïnen(-mengsels) te bestuderen. De methode scheidt eiwitten voornamelijk volgens hun moleculair gewicht (Laemmli, 1970). Het detergent SDS (Na+-dodecylsulfaat) bindt aan hydrofobe gedeelten van de eiwitten waardoor deze ontvouwen en stabiel in oplossing blijven als lineaire strengen. SDS wordt bij de ontvouwing bijgestaan door ß-mercapto-ethanol dat eventueel aanwezige cysteïnebruggen reduceert. De lengte van SDS-eiwitcomplexen is proportioneel aan hun moleculair gewicht. De eiwitten worden aldus in een electrisch veld door moleculaire zeefwerking gescheiden volgens lengte (en dus moleculair gewicht). De scheiding gebeurt in een verticaal discontinu polyacrylamidegel bestaande uit een stapelgedeelte (stacking gel, bovenaan) en een scheidingsgedeelte (onderaan). In het licht zure, minder geconcentreerde stapelgel worden alle eiwitten zonder onderscheid tijdens de electroforese geconcentreerd op een scherpe lijn die migreert tot aan het scheidingsgel. Vanaf daar begint de eigenlijke scheiding volgens lengte. Na electroforese moeten de eiwitten gevisualiseerd worden door een kleuring met bvb. Coomassie-blauw of zilver. Eiwitten in het SDS-gel kunnen ook geblot worden op een membraan voor immunologische detectie (Western blot). In deze proef worden de stalen uit proef 9 geanalyseerd om expressie en opzuivering van de recombinante faageiwitten te controleren. Daarvoor zijn twee minigels nodig die gelijktijdig kunnen gelopen worden in een Bio-Rad Mini-Protean II electroforeseapparaat. De kleuring naderhand gebeurt met Coomassie-blauw.

Protocol

1. Assemblage glasplaten. Assembleer zoals beschreven in het Bio-Rad-instructieboekje glasplaatjes en spacers voor twee gels en plaats ze in de gietstand (Vraag eventueel assistentie). Plaats met een stift een merkteken op 2 cm van de bovenste rand van de geassembleerde glasplaatjes.

2. Bereiding en gieten van het scheidingsgel. Polyacrylamidegels worden gevormd door co-polymerisatie van acrylamide en bis-acrylamide (crosslinker) in aanwezigheid van initiator TEMED (tetramethylethyleendiamine) en ammoniumpersulfaat (APS). Niet gepolymeriseerd acrylamide is neurotoxisch en carcinogeen. Draag handschoenen en vermijd morsen! Voor het bereiden van twee 12 % gels voeg je samen in een plastieken wegwerpbuisje:

- 3.6 ml milliQ-water - 2 ml Tris/SDS-buffer pH 8.8 (1,5 mM Tris.HCl pH 8.8 + 0,4 % SDS) - 2,4 ml 40% acrylamide-bisacrylamide (37.1:1) oplossing - 60 µl 10% APS - 6 µl TEMED

Meng door voorzicht op en neer pipetteren met een grote pipettip zonder hierbij schuim te vormen (SDS!). Pipetteer vervolgens voorzichtig polymerisatiemengsel tussen de glasplaatjes tot op de hoogte van het merkteken. Plaats hierbij de pippettip aan de zijkant tegen een van de spacers om luchtbellen in het gel te vermijden. Als de beide gels gegoten zijn, pipetteer dan voorzichtig (zonder vermenging) een 1 tot 5 mm waterlaagje bovenop het polymeriserende

30

27-09-2005

scheidingsgel. Laat gedurende 30 min ongemoeid polymeriseren. Het voltrekken van de polymerisatie kan gezien worden aan een gewijzigde lichtbreking aan de rand van het gel. Laat overschotten acrylamideoplossing uitpolymeriseren alvorens bij het vaste afval te werpen!

3. Bereiding en gieten van het stapelgel. Als het scheidingsgel gepolymeriseerd is kan je het bovenstaande waterlaagje afgieten. Verwijder eventueel waterrestjes met een papieren doekje. Plaats beide kammen tussen de glasplaatjes. De tanden moeten tenminste 5 mm boven het scheidingsgel uitkomen. Bereid acrylamidemengsel voor het stapelgel in een wegwerpbuisje:

- 2.1 ml milliQ-water - 800 µl Tris/SDS-buffer pH 6.8 (0,5 mM Tris.HCl pH 6.8 + 0,4 % SDS) - 300 µl 40% acrylamide-bisacrylamide (37.1:1) oplossing - 20 µl 10% APS - 2 µl TEMED

Meng voorzichtig en pipetteer vervolgens het polymerisatiemengsel met een kleine tip voorzichtig tussen de tanden totdat de oplossing de bovenrand van de kleine gelplaat bereikt. Luchtbellen onder de tanden van de kam kunnen vermeden worden door de glasplatenhouder tijdens het gieten lichtjes schuin te houden. Laat gedurende 30 min ongemoeid polymeriseren. Maak ondertussen de stalen klaar (zie stap5).

4. Montage van de gels in het Mini-Protean II-toestel. Verwijder voorzichtig de kammen. Neem de twee gels uit de gietstand en klik ze vast op de electrodenhouder. Vraag hierbij eventueel assistentie. Plaats het geheel in de electroforesekamer. Voeg electroforesebuffer toe aan het buitenste reservoir totdat de onderkant van de gels zijn ondergedompeld. Vul het binnenste reservoir zodanig dat de bovenkant van de gels is ondergedompeld. Spoel de slots met electroforesebuffer (pipet) om eventuele resten niet gepolymeriseerd acrylamide te verwijderen. De slots zijn vrij moeilijk te zien. Tracht ze te lokaliseren alvorens te starten met laden.

5. Laden van de stalen. Ontdooi de 16 stalen van proef 9, alsook één buisje met eiwitstandaard (LMW standaard van Pharmacia). Kook de stalen op door ze gedurende 5 min bij 95°C te plaatsen in het PCR-toestel. Centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij maximale snelheid. Laad 10 µl van elk staal. Laad de stalen in de aangegeven volgorde, de Trx-ORF-stalen in het ene gel, de Trx-stalen in het andere gel. Laad rechts van elke reeks 10 µl standaard. Noteer welke stalen op welk gel worden geladen.

Trx-ORF-6xHis Trx-6xHis Laan 1 1 1 Geen inductie Laan 2 2 2 0.0002% arabinose Laan 3 3 3 0.002% arabinose Laan 4 4 4 0.02% arabinose Laan 5 5 5 0.2% arabinose Laan 6 TL TL Totaal lysaat Laan 7 FT FT Flow through Laan 8 EL EL Eluaat Laan 9 standaard standaard

6. Electroforese. Plaats het deksel op de electroforesekamer en sluit de electroden aan op de stroombron. Zet de stroombron aan en stel in op 150 V (constant voltage). Laat lopen tot het bromofenolblauw van het gel begint te lopen (na 1 uur). Schakel de stroombron uit.

31

27-09-2005

7. Ontmanteling van de gels. Maak de gelplaten los van de electrodenhouder. Verwijder voorzichtig beide spacers. Plaats een van beide spacers tussen de glasplaatjes en maak hiermee beide glasplaten voorzichtig los van elkaar. Het gel zal aan een van beide plaatjes blijven kleven. Maak met behulp van de spacer het stapelgel los van het scheidingsgel. Om beide gels later van elkaar te kunnen onderscheiden kan bij een van de gels onderaan een klein hoekje worden afgesneden.

8. Eiwitkleuring. Maak het scheidingsgel los (handschoenen!) en dompel het onder in gedemineraliseerd water. Laat gedurende 15 min inwerken zodat alle zouten uit de gel worden verwijderd. Vis daarna het gel uit het waterbad (handschoenen!) en breng het vervolgens over in een kleurbad (SimplyBlue Safestain), gedurende 1 uur. Voor volledig ontkleuring van de achtergrond kan het gel overnacht in een waterbad gelaten worden.

9. Bewaring. Gekleurde SDS-PAGE-gels kunnen permanent bewaard worden na droging tussen twee cellofaanblaadjes. Dit zal worden gedemonstreerd. Na droging kunnen de gels opgevraagd worden bij de assistent.

☞ Schat de lengte van het te verwachten ORF-fusieproteïne, rekening houdend met het moleculair gewicht van Trx (~ 14 kDa) en de tags (~ 3kDa). Gebruik als vuistregel een moleculair gewicht van ~ 1,1 kDa per 10 aminozuren. Is er eeneiwitband op deze hoogte te zien op het gel? Is er sprake van overexpressie? Zijn er eventueel extra kortere banden te zien (afbraakproducten). Werd het Trx en het Trx-ORF-fusieproteïne efficiënt gezuiverd? Bespreek.

__________________________________ Gebruikte oplossingen

4 x laadbuffer 200 mM Tris.HCl pH 6,8 8 mM EDTA 40% glycerol 4% SDS 0.4% bromofenolblauw 4% ß-mercapto-ethanol

Electroforesebuffer 0,05 M Tris base 1,44% glycine 0,1% SDS

LMW-standaard (Pharmacia): Eiwit Moleculair gewicht (kDa) µg/10 µl Fosforylase b 94 1,7 Albumine 67 2,1 Ovalbumine 43 3,7 Koolzuuranhydrase 30 2,1 Trypsine-inhibitor 20,1 2,0 α-Lactalbumine 14,4 2,9