Nieuwe laboratorium- ontwikkelingen · Nadelen traditionele PCR Resultaten zijn niet erg...
46
Nieuwe laboratorium- ontwikkelingen Arjan Jansz
Transcript of Nieuwe laboratorium- ontwikkelingen · Nadelen traditionele PCR Resultaten zijn niet erg...
Nieuwe laboratorium-ontwikkelingenArjan Jansz
InhoudIntroductieMultiplex PCRMaldiTOFWhole genome Sequencing
Veranderd perspectief voor de Medische Microbiologie
RAC scholingsmiddag | 29 september 2014 | A.R. Jansz
(potentiële) belangenverstrengeling Geen
Voor bijeenkomst mogelijk relevante relaties met bedrijven Bedrijfsnamen
Sponsoring of onderzoeksgeld Honorarium of andere
(financiële) vergoeding Aandeelhouder Andere relatie, namelijk …
RIVM PAMM
Disclosure belangen A.R. Jansz
Kernbegrippen bacteriologie● Kweken
– voedingsbodems● Determineren
– Voorlopig: kleuring volgens Gram– Uiteindelijk: Biochemisch
● Sneldiagnostiek– Antigeen– PCR (polymerase chain reaction)– Antistof (indirect, reactie van het lichaam)
Wat is van belang voor OGZ● Aangifteplichtige ziekten: A, B en C
● Kweken: A : Pokken en PolioB1: Humane infectie met dierlijk influenzavirus,B2: Difterie, Pest,Rabiës,Tuberculose
Kinkhoest, Buiktyfus,Paratyfus choleraEHEC, ShigelloseInvasieve groep-A streptokokken
C: PneumococcenMeningococcenAntraxLegionellaListeriaBrucella
Wat is van belang voor OGZ(2)● Serologie
› Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Mazelen, Rubella› Chikungunya, Dengue, Gele koorts, West-Nilevirus› Hantavirus› Legionellose, Leptospirose› Psittacose, Q-koorts,Tetanus,› Trichinose
Wat is van belang voor OGZ(3)● Moleculaire detectie
› Legionella, Psittacose, TBC, Q-koorts, Kinkhoest› Bof,› Chlamydia, GO,› Salmonella, Shigella, EHEC
Polymerase chain reaction
Snel t.o.v. kweek● Uren (dagen)● Voorbeeld
– Tuberculose– Ziehl-Neehlsen direct, gevoeligheid 60%– Kultuur 4-6 weken
Nadelen traditionele PCR● Resultaten zijn niet erg nauwkeurig. ● Het duurt relatief lang voor de micro-organismen geïdentificeerd
zijn. ● De opbrengst van de PCR varieert van monster tot monster. ● Deze techniek is hooguit semi-kwantitatief, er kunnen geen exacte
hoeveelhedenmicro-organismen bepaald worden.
● Er is nog een aanvullende analyse nodig (hybridisatie duur en tijdrovend)
RAC scholingsmiddag | 29 september 201410
Neisseria gonorrhoeae
Real-time Multiplex PCR
● Fully automated● No separate DNA extraction needed● Multiplex● Internal control to detect inhibitory substances in sample
● CT/NG/TV● Feaces PCR
Multiplex
Multiplex
Real-time
De hybridisatiestap niet meer na de PCR maar tijdens de PCR. Zodat gedurende de reactie in “real-time” een eventueelpositief signaal gemeten kan worden.
RAC scholingsmiddag | 29 september 201415
Principe real-time● De bindingsreactie kan zichtbaar gemaakt worden door het
nagemaakte stukje DNA te voorzien van een fluorescerend label met quencher (een stofje dat de fluorescentie uitschakeld)
● Wanneer een organisme waarnaar gezocht wordt in het materiaal aanwezig is, zal dit gevlagde stukje DNA binden aan het specifieke DNA en later in het proces uit elkaar vallen, waarbij de quencherlos komt van het fluorescerende label, zodat er licht uitgestraald kan worden.
RAC scholingsmiddag | 29 september 201416
Real time PCR
Real time PCR
Quantitative Real time PCR● Relation with severity of disease (CMV)● Monitoring of therapy (HBV)● Development of resistance (HIV)
Real-time en multiplex● Meer targets tegelijkertijd
● Zeer kwantitatief en kan het exacte aantal kopieën in een monster bepalen.
● Zeer snel. ● Zeer gevoelig (10 kopieën per monster aantonen)
● De kans op fouten is kleiner (geen extra technieken nodig om te identificeren)
Revolution in Medical Microbiology● Menual biochemical testing● Automated biochemical testing● PCR technologies● 2010 MALDI biotyper in routine testing
Succes factors● Easy in use● Qualaty of data● Compatability with excisting methode
● FAST● Cheap
Het apparaat
(Routine) Applications● Determination Taxonomie resolotion comparable to sequencing● AST resistance detection● Epidemiology subtyping
● Bloodculture direct analysis● Urine direct analysis
Determinatie
● Morfologisch- Kleur- geur
● Groeiwijze– aeroob /anaeroob
● Biochemisch– Glucose fermentatie– Oxidase
Laser Desorption/Ionization
Detector
Time-of-Flight
DriftAcceleration
m/z
Electrodes
+ + ++ + +
Kennismaking MALDI-TOF
26
(Routine) Applications● Determination Taxonomie resolotion comparable to sequencing● AST resistance detection● Epidemiology subtyping
● Bloodculture direct analysis● Urine direct analysis
IdentificationSelection of colony
UnknownMicrorganism
?
MALDI-TOF MS Data interpretationPreparation ontoMALDI target plate
time to result for one sample: ~ 10 min
October 9, 2014, [email protected]
Kennismaking MALDI-TOF
● MALDI Biotyper workflow:
28
Determinatie van Mycobacteriënmet de Maldi Biotyper
Ellen Retera/Arjan Jansz
Resultaat atypische mycobacteriën(n=52)45
4
12
goed 2.000 ‐ 3.000 goed 1.700 ‐ 1.999 goed < 1.700 fout 1.700 ‐ 1.999
(Routine) Applications● Determination Taxonomie resolotion comparable to sequencing● AST resistance detection● Epidemiology subtyping
● Bloodculture direct analysis● Urine direct analysis
29 september 201432
Workflow for the MBT_MSBL assay
MALDI Biotyper
Targetpreparation
Cultureplate
1µl-loop filledwith bacteria Resuspension
in antibioticsolution
Incubation1-2 h, 37°C
centrifugation supernatant
050010001500200025003000
0
2000
4000
6000Inte
ns. [a
.u.]
320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420m/z
Spectra analysisData output
Ampicillin hydrolysis andinhibition of hydrolysis byclavulanic acid
29/09/201433
DH5
ESBL strain
ESBL strain/clavulanic acid
379,
1
350,
1
372,
1
0
2000
4000
6000
Inte
ns. [a
.u.]
390,
0
368,
1
324,
2
412,
0
0
500
1000
1500
2000
2500
Inte
ns. [a
.u.]
350,
1
372,
1
324,
2
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.254x10
Inte
ns. [a
.u.]
320 330 340 350 360 370 380 390 400 410m/z
394,
1
[M+H
]+
[M+N
a]+
[M+2
Na]
+
[Mhy
dr+H
]+
[Mhy
dr+N
a]+
[Mhy
dr+2
Na]
+
[Mhy
dr–
CO
2+H
]+
07/11/1334
Limitations
Negative result
Positive result ß-lactamase activity Resistance
No ß-lactamase activity
Alternative resistancemechanisms
Resistance
Susceptibility
??
(Routine) Applications● Determination Taxonomie resolotion comparable to sequencing● AST resistance detection● Epidemiology subtyping
● Bloodculture direct analysis● Urine direct analysis
Limitaties
RAC scholingsmiddag | 29 september 201436
Whole Genome Sequencing
RAC scholingsmiddag | 29 september 201437
Whole Genome Sequencing
RAC scholingsmiddag | 29 september 201438
39
Easy, automatic fluid connections.Match the size of the Ion chip to your application.
Low cost, convenient, single use device.
40
● Paper describing the underlying principles of the Ion technology
● Outlines how the technology scales to Ion Proton chips
Rothberg J. et al, 2011, Nature, doi:10.1038/nature10242
How Ion Torrent Technology Works
Whole Genome Sequencing
● Shotgun sequencing is gebruikt om de sequentie van het humane-genoom te onthullen
● VRE typeringen● Detectie van specifiek DNA/RNA fragmenten. Lymphocytic
Choriomeningitis Virus (LCMV)
RAC scholingsmiddag | 29 september 201441
WGS: VRE-typeringen @PAMM
VanA ST2031325/1336 ZH4
VanB ST117ZH2
VanB ST0061349/ZH3 1425/ZH4
VanB ST117ZH1
VanB ST117ZH4
VanB ST018ZH4
29/09/2014
clasical microbiology
29/09/14
Future lab ?
4000 m/z 8000
20s 20s
7h
4h
-
+
-
+
microbial
Nieuwe laboratorium-ontwikkelingenArjan Jansz
