Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve methodes voor...

Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve

methodes voor tamoxifen zijn actieve

metabolieten en analogen in biologische

matrices

Lien ADRIAENSENS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo

Vakgroep: Klinische biologie,

microbiologie en immunologie

Academiejaar 2012-2013

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Handtekening student Handtekening promotor

Lien Adriaensens Prof. Dr. Ir. P. Van Eenoo

Woord vooraf

Het tot stand brengen van deze thesis zou niet mogelijk geweest zijn zonder de hulp van vele

mensen en langs deze weg zou ik hen graag willen bedanken.

Op de eerste plaats wil ik Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo bedanken voor de mogelijkheid die hij

mij geboden heeft om dit onderzoek uit te voeren. Tijdens mijn stage in DoCoLab kon ik

steeds bij hem terecht met al mijn vragen en heeft hij heel wat kostbare tijd vrijgemaakt voor

het nalezen en corrigeren van dit werk. Hiervoor wil ik wil hem oprecht bedanken, alsook

voor de aangename samenwerking en alle steun die hij mij gegeven heeft waardoor ik mijn

laatste jaar met succes en met plezier kon voltooien.

Ik zou graag het volledige team van DoCoLab willen bedanken voor hun grote hulp. Zonder

hen had ik dit nooit tot een goed einde kunnen brengen. Bij ieder van hen ben ik wel eens

langs geweest met de vraag ‘Mag ik eens iets vragen?’ en steeds weer kon ik rekenen op hun

bereidwilligheid. De tijd in DoCoLab is voorbij gevlogen en ik ben blij en vereerd dat ik met

dit team heb mogen samenwerken. In het bijzonder wil ik Wim bedanken voor het oneindig

veel geduld en alle wijsheid die hij mij heeft bijgebracht. Hij heeft mij tijdens mijn stage

enorm goed begeleid en er zo voor gezorgd dat alles vlot kon verlopen. Fiona wil ik graag

bedanken voor de extra uitleg en voor het duwtje in de rug dat ik af en toe eens nodig had.

Voor praktische informatie kon ik steeds bij Simone terecht waarvoor ik hem ook oprecht wil

bedanken. Ten slotte wil ik mijn medestudente Leen bedanken voor de leuke momenten.

Dr. Geert Braems, Marleen De Block, Katrien Devalez en Isabel Vlerick wil ik graag

bedanken voor de goede samenwerking.

Uiterst dankbaar ben ik mijn vrienden en familie en in het bijzonder mijn ouders en vriend

voor de financiële en emotionele steun. Ook wanneer het allemaal wat moeilijker ging heb ik

steeds op hun steun kunnen rekenen. Verder dien ik hen ook te bedanken voor het vele

naleeswerk van deze thesis.

Als laatste wil ik mijn medestudenten Liesbeth, Laura, Femke, Jonathan, Fréderique, Jolien en

Aurélie bedanken voor een onvergetelijke studententijd die wij samen hebben beleefd en die

voor veel mooie herinneringen heeft gezorgd.

Inhoudsopgave

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

1. Inleiding ................................................................................................................................. 2

1.1 Tamoxifen en borstkanker ................................................................................................ 2

1.2 Detectie van TAM zijn actieve metabolieten ................................................................... 5

1.2.1 Gaschromatograaf (GC) ............................................................................................. 5

1.2.1.1 De injector ........................................................................................................... 6

1.2.1.2 Chromatografische scheiding .............................................................................. 6

1.2.2 Massaspectrometer (MS) ........................................................................................... 7

1.2.2.1 Elektron ionisatie ................................................................................................. 8

1.2.2.2 De quadrupool analysator .................................................................................... 8

1.2.2.3 Triple quadrupool analysator .............................................................................. 9

1.3 Staalvoorbereiding ............................................................................................................ 9

1.3.1 Urinestalen ................................................................................................................. 9

1.3.1.1 Hydrolyse ............................................................................................................ 9

1.3.1.2 Extractie ............................................................................................................ 10

1.3.1.3 Derivatisatie ...................................................................................................... 10

1.3.2 Plasmastalen ............................................................................................................. 10

1.3.2.1 Extractie ............................................................................................................ 10

1.3.2.2 Derivatisatie ...................................................................................................... 10

1.4 Methodevalidatie ............................................................................................................ 11

1.4.1 De lineariteit ............................................................................................................. 11

1.4.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid......................................................................... 12

1.4.3 De juistheid en precisie ............................................................................................ 12

1.4.4 De specificiteit en de selectiviteit ............................................................................ 13

1.4.5 Het rendement .......................................................................................................... 14

1.4.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 14

1.5 Probleemstelling ............................................................................................................. 14

2. Materialen en methode ......................................................................................................... 15

2.1 Producten en reagentia .................................................................................................... 15

2.2 Bereidingen ..................................................................................................................... 16

2.2.1 Metabolietenoplossingen ......................................................................................... 16

2.2.2 ISTD-oplossingen .................................................................................................... 16

2.2.3 Buffers ...................................................................................................................... 17

2.2.4 Derivatisatiemengsel ................................................................................................ 17

2.2.5 SPE-oplossingen ...................................................................................................... 17

2.3 Instrumentatie ................................................................................................................. 18

2.4 Staalvoorbereiding .......................................................................................................... 19

2.4.1 Protocol urine ........................................................................................................... 19

2.4.2 Protocol plasma ........................................................................................................ 20

2.5 Validatieprotocol ............................................................................................................ 21

2.5.1 Lineariteit ................................................................................................................. 21


2.5.3 Juistheid en precisie ................................................................................................. 22

2.5.4 Selectiviteit en specificiteit ...................................................................................... 23

2.5.5 Rendement ............................................................................................................... 23

2.5.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 24

3. Resultaten en bespreking ...................................................................................................... 25

3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 25

3.1.1 Full scan ................................................................................................................... 25

3.1.2 Product Ion scan ....................................................................................................... 27

3.1.3 MRM ........................................................................................................................ 27

3.2 Methodevalidatie ............................................................................................................ 28

3.2.1 Lineariteit ................................................................................................................. 28


3.2.3 Juistheid en precisie ................................................................................................. 30

3.2.4 Selectiviteit en specificiteit ...................................................................................... 31

3.2.5 Rendement ............................................................................................................... 31

3.2.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 32

3.3 Analyse patiëntenstalen .................................................................................................. 36

3.3.1 Patiënten ................................................................................................................... 36

3.3.2 Analyse urinestalen .................................................................................................. 37

3.3.3 Analyse plasmastalen ............................................................................................... 44

4. Besluit ................................................................................................................................... 47

5. Referenties ............................................................................................................................ 48

Afkortingenlijst

4-OH-3-Me-TAM 4-hydroxy-3-methoxy tamoxifen

4-OH-TAM 4-hydroxy-tamoxifen

CYP Cytochroom P450

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

EM Extensive Metabolizer

ER Oestrogeen Receptor

FDA Food and Drug Administration

GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry

IM Intermediate Metabolizer

ISTD Inwendige standaard

KT Kamertemperatuur

LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

LLE Liquid-Liquid Extraction

LLOD Lower Limit Of Detection

LLOQ Lower Limit Of Quantification

MG Moleculair Gewicht

MRM Multipe Reaction Monitoring

MSTFA N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide

PM Poor Metabolizer

PTV Programmed Temperature Vaporisation

QC1 Kwaliteitscontrole 1

QC2 Kwaliteitscontrole 2

RSD Relatieve standaardafwijking

S/N Signaal/Ruis

SCAN Full Scan

SD Standaardafwijking

SIM Selected Ion Monitoring

SPE Solid-Phase-Extraction

SSRI Selective Serotonin Reuptake Inhibitor

TAM Tamoxifen

TMS Ttrimethylsilyl

UM Ultrarapid Metabolizer

1

Samenvatting

Tamoxifen (TAM) wordt wereldwijd gebruikt voor de endocriene behandeling van

borstkanker. In de lever wordt TAM gemetaboliseerd door fase I enzymen tot zijn actieve

metabolieten, waarvan endoxifen therapeutisch het meest relevant is. Interindividuele

verschillen in de metabolisatie van tamoxifen kunnen lagere plasmaconcentraties van

endoxifen veroorzaken en bijgevolg ook een verschil in therapeutisch effect.

In deze studie werd gebruik gemaakt van een gaschromatograaf gekoppeld aan een

massaspectrometer (GC-MS) om de concentraties van endoxifen, 4-hydroxy-tamoxifen (4-

OH-TAM) en 4-hydroxy-3-methoxy-tamoxifen (4-OH-3-Me-TAM) te bepalen in urine en in

plasma. Na een eenvoudige staalvoorbereiding werd een extract gescheiden in zijn individuele

substanties door middel van GC. Moleculen werden geïoniseerd door middel van elektron

ionisatie. Een triple quadrupool werd gebruikt voor de analyse. Ondanks het feit dat urine

onderhevig is aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie en de hiermee verbonden

hoeveelheid uitgescheiden urine, koos men er toch voor om concentratiebepalingen ook in

urine uit te voeren gezien afname van urine minder invasief is dan afname van plasma.

Borstkankerpatiënten die therapeutisch in behandeling waren met TAM werden verzameld in

samenwerking met professor Braems, na goedkeuring van het ethisch comité.

Zowel de methode in urine als de methode in plasma werd volledig gevalideerd. Ondanks een

geslaagde validatie was enkel de methode in urine ‘gevoelig’ genoeg om concentraties van de

metabolieten op een betrouwbare manier te bepalen. Verder onderzoek is noodzakelijk om de

methode in plasma te optimaliseren.

In alle urinestalen van de deelnemende patiënten werd een consistente schommeling

teruggevonden over de verschillende tijdstippen van de urineafname. Verhoudingen van

endoxifen op 4-OH-TAM bleken minder uitgesproken dan verhoudingen teruggevonden in

plasma. Dit zou verklaard kunnen worden door een verschil in fase II metabolisatie tussen

beide metabolieten. Bij vier patiënten werd er een verhouding gevonden kleiner dan 1. De

verklaring kan men opnieuw vinden bij factoren die de eliminatie beïnvloeden, maar

opmerkelijk waren patiënt 3 en patiënt 5 in behandeling met dezelfde selective serotonin

reuptake inhibitor (SSRI), escitalopram. Deze medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd

door CYP3A4. Dit kan inhibitie van CYP3A4 tot gevolg hebben en lagere concentraties van

endoxifen veroorzaken. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine

groep patiënten in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van

escitalopram en TAM noodzakelijk.

2

1. Inleiding

1.1 Tamoxifen en borstkanker

Borstkanker is een ernstig gezondheidsprobleem met een wereldwijd leeftijds-

gestandaardiseerd incidentiecijfer van 37.4/100000. Huidige therapieën tegen borstkanker

evolueren snel maar drugresistentie en toxiciteit vormen een grote beperking. Het observeren

van interetnische en interindividuele verschillen tussen patiënten kan mogelijke verklaringen

opleveren. Men spreekt van de studie van de farmacogenetica (1).

Hormonale therapie, chemotherapie en doelgerichte therapie vormen de drie belangrijkste

behandelingsmogelijkheden bij borstkanker (1). De oestrogeenreceptor (ER) α is bij 75% van

de patiënten aanwezig en is een belangrijke prognostische factor en een determinant in het

verloop van de behandeling. ER-positieve borsttumoren vertonen over het algemeen een

betere prognose. In deze gevallen is endocriene behandeling mogelijk (2). Tamoxifen (TAM)

is een selectieve oestrogeenreceptormodulator en wordt de laatste 25 jaar wereldwijd gebruikt

voor de endocriene behandeling van borstkanker (3,5). Tamoxifen is een niet-steroïdaal

geneesmiddel met een trifenylethyleenstructuur (figuur 1). Het vertoont ter hoogte van

verschillende weefsels een complex spectrum van farmacologische aspecten, steunend op

zowel oestrogeenantagonisme als oestrogeenagonisme (6). Bij borstkankerpatiënten werkt het

ter hoogte van de tumor voornamelijk als anti-oestrogeen, waarbij het de binding van

oestrogeen op de receptor verhindert (6,7).

Het geneesmiddel wordt gemetaboliseerd door het cytochroom P450 (CYP), een

enzymsysteem ter hoogte van de lever (1,3-20,31). Tamoxifen ondergaat hierbij sterke fase I

en fase II metabolisatie waarbij verschillende metabolieten gevormd worden. 4-hydroxy

tamoxifen (4-OH-TAM) en 4-hydroxy-N-desmethyl tamoxifen (endoxifen) zijn therapeutisch

de meest relevante fase I metabolieten (figuur 1). Dit wegens de hoge affiniteit voor de

oestrogeenreceptor. Gezien de steady state plasmaconcentratie van endoxifen vijf- tot

tienmaal hoger ligt dan van 4-OH-TAM wordt dit gezien als de belangrijkste metaboliet

(4,7,9,10,13,18-20).

3

Bij metabolisatie van TAM tot zijn actieve metabolieten 4-OH-TAM en endoxifen spelen

verschillende CYP enzymen een rol, onder andere CYP2D6 (1,3-5,7,9-11,13,18-20).

Inactivatie van de metabolieten gebeurt door sulfatatie of glucuronisatie, wat wordt

bewerkstelligd door fase II enzymen (1,11,18).

Figuur 1: de metabolisatie van tamoxifen (3).

Interindividuele verschillen in de metabolisatie van tamoxifen kunnen de oorzaak zijn voor

het verschil in therapeutisch effect (1,3-6,8-20). Er zijn al meer dan 80 genetische variaties

beschreven van CYP2D6 waarvan velen geassocieerd worden met afgenomen of toegenomen

activiteit van het enzym (1,18). Deze varianten uiten zich in verschillende fenotypen. Poor

metabolizers (PM) hebben een sterk verlaagde metabole capaciteit ten gevolge van een

mutatie. Intermediate metabolizers (IM) hebben een verlaagde metabole capaciteit,

gewoonlijk ten gevolge van een mutatie in één allel. Extensive metabolizers (EM) hebben 2

functionele allelen en hebben dus een normale metabole capaciteit. Ultrarapid metabolizers

(UM) vertonen een verhoogde metabole capaciteit veroorzaakt door genduplicatie (1,4,5,18-

20). Men ziet hierbij belangrijke interetnische verschillen. Zo vindt men PM voornamelijk

terug in Europa, IM in Azië en UM het meest in Noord-Afrika en Oceanië (figuur 2) (8).

4

Figuur 2: globale distributie van CYP2D6 fenotype (8).

Steady state plasma concentraties van endoxifen liggen lager bij fenotypes met een

gereduceerde metabole activiteit van CYP2D6 wat een mogelijke impact heeft op de klinische

respons bij behandeling met tamoxifen (9,10,18). Verschillende publicaties rapporteerden een

slechtere klinische uitkomst met verminderde relapse-free en disease-free survival bij PM en

IM in vergelijking met EM (5,19,20).

Genetische polymorfismen ter hoogte van CYP2D6 zijn niet de enige mutaties die invloed

kunnen hebben op de klinische uitkomst bij behandeling met tamoxifen. Zo kunnen enzymen

verantwoordelijk voor eliminatie en inactivatie van tamoxifen en zijn metabolieten,

belangrijke genetische variaties vertonen (1,18). Ook genetische mutaties in de tamoxifen

transporter kunnen invloed hebben op de therapeutische werking (11,18).

Verder wordt het concomitant gebruik van selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI)

antidepressiva geassocieerd met een verminderde klinische uitkomst. SSRI’s worden ook

gemetaboliseerd door het CYP2D6 enzym en remmen bijgevolg de metabolisatie van

gelijktijdig toegediende geneesmiddelen die door CYP2D6 worden gemetaboliseerd. Dit kan

leiden tot verlaagde plasmaconcentraties van endoxifen (3,4,6,9,18,19).

5

De ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve methode voor de bepaling van tamoxifen

zijn actieve metabolieten in biologische matrices is van groot belang om een mogelijke

verklaring te kunnen bieden voor de beperkingen van de therapie. Een gepersonaliseerde dosis

van de medicatie zou hier een oplossing kunnen schenken (12). Zo leidt volgens Irvin WJ et

al. een verhoogde dosis tamoxifen bij PM en IM tot een hogere plasma concentratie van

endoxifen wat tot een betere klinische uitkomst kan leiden (10).

Verschillende publicaties hebben tot nu toe verslag uitgebracht over een kwantitatieve

methode voor de determinatie van tamoxifen en zijn fase I metabolieten (12-17). Het aantal en

variëteit van de gebruikte metabolieten is echter gelimiteerd, en slechts een beperkt aantal van

deze essays zijn volledig gevalideerd. Gevalideerde kwantitatieve bio-analytische studies voor

determinatie van fase I metabolieten van tamoxifen in biologische matrices, zijn dus van

hoogst klinisch belang (12).

1.2 Detectie van TAM zijn actieve metabolieten

1.2.1 Gaschromatograaf (GC)

Gaschromatografie is specifiek voorbehouden aan vluchtige verbindingen of verbindingen die

vluchtig te maken zijn d.m.v. temperatuursverhoging. Verbindingen met een moleculaire

massa tot 800 komen hiervoor in aanmerking (21).

Lopend in de stroomrichting van de mobiele fase, het draaggas bij de GC, kunnen volgende

onderdelen aangetroffen worden (figuur 3) (21):

- Het injectiesysteem waar het monster wordt ingebracht.

- De kolom hangend in een oven waar scheiding van het monster plaats vindt.

- De detector, in dit geval de massaspectrometer.

- Een computer voor de signaalregistratie en -analyse.

6

Figuur 3: schema van de gaschromatograaf (21).

1.2.1.1 De injector

In de ‘Programmed Temperature Vaporisation’ (PTV) injector wordt de temperatuur in de

liner gereguleerd via een temperatuurprogramma. Op deze manier kunnen er grotere volumes

geïnjecteerd worden. Het solvent heeft het laagste kookpunt en zal dus als eerste verdampen

en de liner verlaten (21).

1.2.1.2 Chromatografische scheiding

Een chromatisch systeem bestaat uit twee niet mengbare fasen. De mobiele fase beweegt

langs de stilstaande fase, de stationaire fase. Componenten in het monster worden gescheiden

wanneer ze zich verschillend over de mobiele en stationaire fase verdelen. Een component die

langer in de stationaire fase verblijft, wordt minder snel getransporteerd en zal pas later de

uitgang van de kolom bereiken (21).

7

1.2.2 Massaspectrometer (MS)

Massaspectrometrie is een analysemethode gebaseerd op het scheiden van ionen naar hun

massa/lading verhouding (m/z). In een GC-MS systeem zullen dampmoleculen van neutrale

organische componenten die de kolom verlaten, al dan niet via een interface naar een

ionenbron worden geleid (figuur 4). D.m.v. een ionisatieproces, vacuüm of onder lage druk,

worden de dampmoleculen omgezet in ionen. In de analysator worden de ionen gescheiden

naar hun massa/lading verhouding. Na scheiding worden de deeltjes met behulp van een

elektron-multiplier gedetecteerd. De versterkte detectorsignalen worden omgezet in

massawaarden met een bijbehorende intensiteit (21).

GC-MS heeft zich ontwikkeld tot een bedrijfszekere betrouwbare analysetechniek met veel

toepassingsmogelijkheden, zowel op het gebied van structuuranalyse als kwantitatieve

detectietechniek op basis van de moleculaire massa en/of specifieke fragmenten van het

molecuul (21).

Figuur 4: schematische voorstelling van een GC-MS opstelling (21).

8

1.2.2.1 Elektron ionisatie

Bij elektron ionisatie bevindt zich een gloeidraad die elektronen emitteert. Deze elektronen

worden de ionisatiekamer ingestuurd en door de collectorplaat weer opgevangen. In deze

ruimte wordt ook damp van het monster gebracht. Het elektronenbombardement zorgt ervoor

dat er geïoniseerde fragmenten ontstaan. Bovendien treedt er ook fragmentatie op. Vervolgens

worden de positief geladen fragmenten gecollecteerd en doorgestuurd naar de analysator (21).

1.2.2.2 De quadrupool analysator

De quadrupool analysator bestaat uit vier evenwijdig geplaatste cilindrische of hyperbolische

staven die in een vierkant zijn opgesteld (figuur 5). Tegenoverliggende staven zijn elektrisch

met elkaar verbonden. Elk paar staven wordt gevoed met een gelijkspanningscomponent VDC

en een radiofrequente wisselspanningscomponent VRF.cosϖt, waarbij ϖ = 2πf (f=

radiofrequentie wisselspanning). Ionen worden gescheiden naar hun m/z waarden op basis

van de elektrische velden binnen de quadrupool. Ionen met een welbepaalde massa zullen,

afhankelijk van de VRF en VCD, in een stabiel oscillerende beweging getransporteerd worden

naar de detector. Alle andere ionen zullen door instabiele oscillaties neerslaan op de staven

van de quadrupool en daar worden ontladen (21).

Figuur 5: de quadrupool analysator (21).

9

1.2.2.3 Triple quadrupool analysator

Hier wordt er gebruik gemaakt van 3 quadrupolen Q1 Q2 en Q3. Q2 wordt ook de collisiecel

genoemd en dient voor de fragmentatie van ionen terwijl Q1 en Q3 dienen voor de scheiding

van ionen op basis van m/z (22).

In Full scan (SCAN) wordt het volledige massaspectrum gescand. Selected Ion Monitoring

(SIM) daarentegen wordt gebruikt om slechts een deel van het massaspectrum te scannen,

meestal een beperkt aantal massa-units. Wanneer Q1 in SCAN staat worden Q2 en Q3 niet

gebruikt en wordt er een full scan massaspectrum opgenomen. Men spreekt van Product Ion

Monitoring wanneer Q1 in SIM staat en Q3 in SCAN en van Multiple Reaction Monitoring

(MRM) wanneer zowel Q1 als Q3 in SIM staan (23).

1.3 Staalvoorbereiding

Concentratiebepalingen werden uitgevoerd in urine en in plasma. De afname van urine is

minder invasief ten opzichte van de afname van bloed. Concentratiebepalingen in plasma

daarentegen zijn klinisch meer correct gezien deze niet onderhevig zijn aan effecten

veroorzaakt door (de)hydratatie en de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine

(24).

1.3.1 Urinestalen

Voor er werd overgegaan tot de analyse van urinestalen werden eerst drie voorbereidende

stappen uitgevoerd.

1.3.1.1 Hydrolyse

Metabolieten van tamoxifen kunnen voorkomen in hun vrije of geglucuronideerde vorm. In

urine vinden we voornamelijk de geglucuronideerde vorm terug. Om de totale hoeveelheid te

meten werd het geglucuronideerd deel eerst vrijgesteld door middel van enzymatische

hydrolyse met β-glucuronidase (12).

10

1.3.1.2 Extractie

Wanneer men de metabolieten wil identificeren met behulp van een massaspectrometer

kunnen endogene componenten in urine aanleiding geven tot ionsuppressie, wat de

gevoeligheid, de precisie en de accuraatheid van de MS in het gedrang brengt. Daarom wordt

er preanalytisch een extractie uitgevoerd (12-17).

In deze studie werd voor de extractie uit urine een Liquid-Liquid Extraction (LLE)

uitgevoerd. Deze techniek steunt op de verschillen in relatieve oplosbaarheid van

verschillende componenten in twee niet-mengbare oplossingen. In dit geval urine en een

organisch solvent (25).

1.3.1.3 Derivatisatie

Gezien er gewerkt werd met GC was een bijkomende derivatisatiestap nodig om de te

analyseren componenten vluchtig te maken (12,17).

1.3.2 Plasmastalen

Vooraf aan de analyse van plasmastalen werden twee voorbereidende stappen uitgevoerd.

1.3.2.1 Extractie

Voor de extractie uit plasma werd gebruik gemaakt van Solid-Phase Extraction (SPE). Hierbij

worden stoffen gescheiden op basis van verschillen in affiniteit voor de mobiele fase en de

stationaire fase. Retentie treedt op als gevolg van interactie tussen de polaire groepen van de

analyt en de polaire groepen van de stationaire fase (26).

1.3.2.2 Derivatisatie

Een derivatisatiestap werd uitgevoerd om de componenten vluchtig te maken (12,17).

11

1.4 Methodevalidatie

Om na te gaan of een methode voldoet aan vooropgestelde eisen en dus voldoende

betrouwbaar is om een vooropgesteld doel te verwezenlijken wordt een methodevalidatie

uitgevoerd. Er werd een volledige validatie uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Food and

Drug Administration (FDA) (27).

Volgende parameters werden geëvalueerd:

1.4.1 De lineariteit

De calibratiecurve geeft de relatie weer tussen de respons van de meetmethode en de gekende

concentratie van de analyt. Deze wordt opgesteld ter controle van de lineariteit. De

calibratiecurve bestaat uit zes tot acht stalen gespreid over het verwachte lineaire bereik van

de meetmethode, inclusief de Lower Limit Of Quantification (LLOQ) (28).

De calibratiecurve wordt opgesteld door negatieve urine aan te rijken met de analyten en de

inwendige standaard (ISTD). De calibratielijn volgt de wiskundige functie y=ax+b. Hierbij is

x de verhouding tussen de theoretische concentratie van de analyt en de theoretische

concentratie van de ISTD, en y de verhouding tussen het piekoppervlak van de analyt en het

piekoppervlak van de ISTD. De lineariteit kan uitgedrukt worden door middel van de

correlatiecoëfficiënt (R²), deze moet groter zijn dan 0,98 (Waarde vooropgesteld DoCoLab).

Dit is op zich geen goede parameter gezien deze enkel uitdrukt in hoeverre de variatie in y

uitgedrukt kan worden door de variatie in x. De goodness of fit factor (g) geeft een meer

correcte evaluatie van de lineariteit. Wanneer de meerderheid van de calibratoren groter is dan

10 ng/ml moet de g-factor kleiner zijn dan 10% (28).

(28)

12

1.4.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid

De LLOQ of de bepaalbaarheidsgrens is de laagste concentratie van de analyt die

gedetecteerd kan worden met aanvaardbare precisie en juistheid. Dit punt vormt het laagste

punt van de calibratiecurve (28).

De Lower Limit Of Detection (LLOD) of de aantoonbaarheidsgrens is de laagste concentratie

verschillend van nul die een significant signaal geeft, duidelijk verschillend van het signaal

verkregen van een blanco staal. De signaal/ruis (S/N) verhouding dient hierbij groter dan drie

te zijn. Criteria van precisie en juistheid dienen hier niet te worden voldaan (28).

1.4.3 De juistheid en precisie

De juistheid is de overeenstemming tussen het gemiddelde van een groot aantal gemeten

waarden en de ware waarde. De systematische afwijking (bias of onjuistheid) wordt gebruikt

als maat voor de juistheid (28).

(28)

De (on)juistheid wordt bepaald door minimum 5 bepalingen per concentratie. De gemiddelde

waarde mag niet meer dan 15% van de werkelijke waarde liggen, met uitzondering van de

LLOQ die maximum 20% van de werkelijke waarde mag verschillen (27,28).

De precisie is de mate van overeenstemming tussen onafhankelijke resultaten. De precisie

wordt uitgedrukt als de relatieve standaardafwijking (imprecisie) (28).

Standaardafwijking (SD):

(28)

13

Relatieve standaardafwijking (RSD):

(28)

Bij precisie onderscheidt men herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. De herhaalbaarheid is

de mate van overeenstemming tussen opeenvolgende resultaten die verkregen worden onder

identieke omstandigheden. De herhaalbaarheid mag niet meer zijn dan 2/3 RSDMAX. RSDMAX

wordt berekend aan de hand van de Horwitz vergelijking waarin de concentratie (C) wordt

uitgedrukt in g/ml. De RSD wordt berekend door minimaal 5 bepalingen per concentratie

(28).

(28)

De reproduceerbaarheid is de mate van overeenstemming tussen resultaten die worden

verkregen door gebruik van dezelfde methode maar uitgevoerd onder verschillende

omstandigheden. De reproduceerbaarheid mag niet meer zijn dan RSDMAX (28).

1.4.4 De specificiteit en de selectiviteit

De specificiteit is de eigenschap van een methode om enkel en alleen de analyt te meten (28).

Een methode is selectief wanneer deze het onderscheid kan maken tussen de analyt en de

achtergrond/interferenties. Het retentiegedrag van andere componenten, behorend tot dezelfde

klasse van stoffen als de analyt, moet hiervoor worden nagegaan (28).

Deze factoren kunnen gecontroleerd worden door analyse van blancostalen en stalen

aangerijkt met eventueel interfererende componenten (27,28).

14

1.4.5 Het rendement

Het rendement is de fractie van een analyt dat aan een staal wordt toegevoegd die effectief

gemeten wordt. Hierbij wordt de detectorrespons, verkregen door een hoeveelheid van de

analyt toe te voegen en te extraheren uit een biologische matrix, vergeleken met de

detectorrespons verkregen na analyse van het staal wanneer de analyt pas na extractie wordt

toegevoegd (28).

1.4.6 Stabiliteit

De stabiliteit van het geneesmiddel in een biologische vloeistof is afhankelijk van de

temperatuur, de chemische eigenschappen van de stof, de matrix en het opslagsysteem.

Stabiliteitsprocedures moeten geëvalueerd worden na korte of lange opslagprocedures (27).

1.5 Probleemstelling

Het verschil in de metabolisatie van tamoxifen kan een invloed hebben op de klinische

uitkomst bij borstkankerpatiënten. Er is al reeds veel onderzoek gevoerd omtrent dit

onderwerp maar tot op heden is er nog steeds nood aan nieuwe inzichten. In deze studie zal

getracht worden een kwantitatieve, volledig gevalideerde GC-MS methode te ontwikkelen

voor een beperkt aantal fase I metabolieten van tamoxifen. De concentratie van 4-OH-TAM,

4-hydroxy-3-methoxy tamoxifen (4-OH-3-Me-TAM) en endoxifen zal bepaald worden in

urine en in plasma.

Het finale doel zal een kwantitatieve bepaling zijn in urine en plasma van

borstkankerpatiënten die medicamenteus behandeld worden met tamoxifen. Stalen zullen

worden aangevraagd via het ethisch comité in samenwerking met professor Braems,

gynaecoloog en staflid aan de Vrouwenkliniek, UZ Gent.

Op deze manier kunnen eventuele interindividuele verschillen in de metabolisatie van

tamoxifen gevisualiseerd worden door belangrijke verschillen in steady state

plasmaconcentraties. Vermits de donatie van urine minder invasief is, zal ook in urine

onderzocht worden of er bepaalde waarnemingen kunnen gedaan worden.

15

2. Materialen en methode

2.1 Producten en reagentia

4-OH-TAM, 4-OH-3-Me-TAM en de gedeutereerde ISTD’en 4-OH-TAM-d5 en endoxifen-

d5 werden verkregen via Toronto Research Chemicals (North York, Canada) en endoxifen via

Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

De urinestalen voor de methode ontwikkeling en validatie waren afkomstig van eigen

productie. Plasmastalen voor de methode ontwikkeling en validatie waren afkomstig van het

Rode Kruis Oost-Vlaanderen (Gent).

Na goedkeuring van het ethisch comité (EC 2012/869) werden bloed- en urinestalen van

borstkankerpatiënten verkregen op de afdeling gynaecologie van het UZ Gent via Dr. G.

Braems. Deze patiënten werden medicamenteus behandeld met TAM (Nolvadex, 1

tablet/dag). Rekening houdend met de instelling van de steady state concentratie werd

verwacht dat de patiënten reeds 8 weken (of langer) in behandeling waren (7). Bloedstalen

werden afgenomen in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bloedbuizen. Bloedstalen

werden gecollecteerd voor inname van de medicatie en vervolgens één en twee uur na

inname. Urinestalen werden gecollecteerd voor inname van de medicatie en vervolgens één,

twee, vier en acht uur na inname.

Patiënten werden gevraagd de geboortedatum, het geslacht, de start van het gebruik van TAM

en de inname van eventueel andere geneesmiddelen te vermelden.

Diethylether, ammonium formaat, methanol en natrium waterstofcarbonaat werden verkregen

via Fisher Scientific (Loughborough, United Kingdom). Waterstofchloride, natriumsulfaat,

ammoniakoplossing 25%, dinatriumwaterstoffosfaat-dihydraat, natriumdiwaterstoffosfaat

monohydraat, fosforzuur, kaliumcarbonaat en natriumhydroxide werden verkregen via Merck

(Darmstadt, Duitsland). Ammoniumjodide en ethaanthiol waren afkomstig van Sigma Aldrich

(St. Louis, USA). N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) was afkomstig

van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland). Acetonitril was afkomstig van Biosolve BV

(Valkenswaard, Nederland). Ten slotte werd β-glucuronidase (E. coli) verkregen via Roche

(Mannheim, Duitsland).

16

SPE werd uitgevoerd met behulp van een Oasis MCX 3cc (60mg) extraction cartridge van

Waters Corporation (Massachusetts, USA).

2.2 Bereidingen

2.2.1 Metabolietenoplossingen

De stockoplossing van endoxifen hydrochloride hydraat werd aangemaakt door 5 mg

endoxifen hydrochloride hydraat op te lossen in methanol en aan te lengen tot 50 ml

(concentratie endoxifen hydrochloride hydraat: 100 µg/ml; concentratie endoxifen: 91,11

µg/ml). De stockoplossing werd 10, 100 en 1000 maal verdund.

De stockoplossing van 4-OH-TAM werd aangemaakt door 1 mg 4-OH-TAM op te lossen in

methanol en aan te lengen tot 10 ml (concentratie 100 µg/ml). De stockoplossing werd 10,

100 en 1000 maal verdund.

De stockoplossing 4-OH-3-Me-TAM werd aangemaakt door 1,04 mg 4-OH-3-Me-TAM op te

lossen in methanol en aan te lengen tot 10 ml (concentratie 104 µg/ml). De stockoplossing

werd 10, 100 en 1000 maal verdund.

Aan de hand van het concentratiebereik werd de samengestelde werkoplossing aangemaakt

door 1,1 ml endoxifen hydrochloride hydraat (10 µg/ml), 0,5 ml 4-OH-TAM (10 µg/ml) en

4,81 ml 4-OH-3-Me-TAM (10,4 µg/ml) samen te voegen en aan te lengen met methanol tot

10 ml. De concentratie van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM bedragen

respectievelijk 1 µg/ml, 0,5 µg/ml en 5 µg/ml. Deze werkoplossing werd nog 10 maal

verdund.

2.2.2 ISTD-oplossingen

De stockoplossing van endoxifen-d5 werd aangemaakt door 1 mg endoxifen-d5 op te lossen

in 10 ml methanol (concentratie 100 µg/ml) en de stockoplossing van 4-OH-TAM-d5 werd

aangemaakt door 2,5 mg 4-OH-TAM-d5 op te lossen in 25 ml methanol.

17

De samengestelde werkoplossing werd aangemaakt door 1 ml van de stockoplossing van

endoxifen-d5 en 1 ml van de stockoplossing van 4-OH-TAM-d5 samen te voegen en aan te

lengen met methanol tot 25 ml. De concentratie van endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5 bedroeg

voor beiden 4 µg/ml.

2.2.3 Buffers

De fosfaatbuffer (0,1M; pH=7) werd aangemaakt door 140 g dinatriumwaterstoffosfaat

dihydraat en 28 g natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat af te wegen en op te lossen in 2000

ml aqua bidest. Nadien werd de buffer bijgesteld met fosforzuur.

De carbonaatbuffer (pH=9,5) werd aangemaakt door 135 g kaliumcarbonaat en 111 g natrium

watersctofcarbonaat af te wegen en op te lossen in 900 ml aqua bidest. Vervolgens werd de

pH bijgesteld met natriumhydroxide (6M) of waterstofchloride (1M).

2.2.4 Derivatisatiemengsel

De stockoplossing van het trimethylsilyl (TMS)- derivatisatiemengsel (REA 19) werd

aangemaakt door 200 mg ammoniumjodide af te wegen en op te lossen in 10 ml MSTFA.

Vervolgens werd 400 µl ethaanthiol toegevoegd. Voor de werkoplossing werd 3 ml

stockoplossing overgebracht in een recipiënt en aangelengd met MSTFA tot 10 ml.

ANAL-60 derivatisatiemengsel werd aangemaakt door 5 ml van de REA 19 werkoplossing, 5

ml MSTFA en 2 ml acetonitril samen te voegen.

2.2.5 SPE-oplossingen

HCl oplossing (0,1M) werd aangemaakt door 10 ml HCl (1M) op te lossen in 100 ml aqua

bidest.

5% ammoniakoplossing in methanol werd aangemaakt door 5 ml ammoniakoplossing aan te

lengen met methanol tot 100 ml.

18

2.3 Instrumentatie

Voor het indampen van de stalen werd gebruik gemaakt van de Reacti-Vap III van Pierce

(Rockford, USA) en de TurboVap LV van Caliper (Massachusetts, USA). Om de stalen te

vortexen werd gebruik gemaakt van Techmatic TM1 van Merck Belgolabo (Overijse, België).

Tijdens hydrolyse werden urinestalen gerold op de RM 5 rollers van CAT (Staufen,

Duitsland). Bloedstalen werden gecentrifugeerd in een C412 centrifuge van Jouan (Nantes,

Frankrijk).

Voor de analyse van de stalen werd een GC-MS opstelling gebruikt die bestaat uit een Agilent

7000 MS gekoppeld aan een Agilent 6890 GC van Agilent Technologies (Palo Alto, USA). Er

werd een capillaire kolom (fused silica) gebruikt: 15 m HP1MS kolom van J&W Scientific

(Folsom, USA) met een inwendige diameter van 0,32 mm en een filmdikte van 0,25 µm. De

stationaire fase van de kolom bestaat uit cross-linked dimethylsilicone. Helium werd gekozen

als draaggas met een constante flow van 2 ml/min. Het collisiegas in de collisiecel van de MS

was stikstofgas.

Het geïnjecteerd volume was 6 µl en werd via de PTV injector van Gerstel ( Mülheim en der

Ruhr, Duitsland) in solvent vent modus opgespoten. Om injectie van zo’n groot volume toe te

laten werd gebruik gemaakt van een ‘baffled liner’. Het temperatuurprogramma voor de PTV

was initieel 80°C (0,03 min), 12°C/s 310°C (1 min), 12°C/s 380°C (4min).

Het temperatuurprogramma van de oven werd geoptimaliseerd, vertrekkend vanaf de methode

zoals beschreven in P. Van Eenoo et al. (30). De initiële temperatuur was 120°C (0 min),

50°C/min 220°C (0 min), 25°C/min 270°C (0 min), 70°C/min 320°C (1 min). De

bron werd gehouden op 280°C en de transferline op 300°C. De totale run time was 5,6 min.

Bij een full scan massaspectrum werd er gescand van de m/z waarden 50 tot 800 met een

scantijd van 350 ms en stappen van 1 amu. Als MS resolutie werd steeds de voorkeur gegeven

aan ‘widest’. Bij een product Ion scan werd er gescand van een m/z waarde van 40 tot een m/z

van het precursorion + 5.

Analyse werd uitgevoerd met Masshunter Workstation software. Verdere verwerking van de

resultaten gebeurde met Excel.

19

Tabel I illustreert de transities gevolgd voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3Me-TAM,

endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5.

Tabel I: transities gevolgd voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3Me-TAM, endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5.

Analyt Precursor Ion Product Ion Collisie Energie (V)

Endoxifen 460 369 10

460 294 10

460 279 20

460 179 30

4-OH-TAM 459 72 10

459 58 20

4-OH-3-Me-TAM 489 72 5

489 58 15

Endoxifen-d5 465 447 10

465 387 10

465 298 10

4-OH-TAM-d5 464 72 10

464 58 10

2.4 Staalvoorbereiding

Aan elke batch stalen werd steeds een systeem blanco (water), een blanco (negatieve urine- of

plasmastaal) en twee positieve kwaliteitscontroles (QC1 en QC2) toegevoegd. QC1 en QC2

werden aangerijkt op niveau 2 en 6 (tabel II en III) met alle componenten en met 25 µl van de

samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en. Na indampen van QC1 en QC2

onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C werd er negatieve urine/plasma toegevoegd waarna al

deze stalen voorbereid werden volgens standaard protocol (zie 2.4.1 protocol urine en 2.4.2

protocol plasma).

2.4.1 Protocol urine

Het gebruikte protocol werd gebaseerd op een bestaande methode: SOP ANAL-60 D.

25 µl van de samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en (4µg/ml) werd

ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C. Vervolgens werd 1 ml urine toegevoegd.

Voor de hydrolysestap werd aan elk staal 1 ml fosfaatbuffer (0,1M) pH = 7 en 50 µl β-

20

glucuronidase toegevoegd waarna de buizen werden dichtgedraaid en de stalen voor 90

minuten in de oven werden geplaatst bij 56 +/- 5°C.

Voor de extractiestap werd 250 µl carbonaatbuffer (pH = 9,5) en 5 ml diethylether

toegevoegd nadat de stalen waren afgekoeld tot kamertemperatuur. De buizen werden

dichtgedraaid en 20 minuten gerold. Vervolgens werd de organische fase afgenomen en

overgebracht in een nieuwe buis. De organische fase werd gedroogd met 100 mg

natriumsulfaat en vervolgens ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C.

De stalen werden gederivatiseerd door 100 µl van het ANAL-60 derivatisatiemengsel toe te

voegen en nadien te vortexen. Uiteindelijk werden de stalen overgebracht in een vial waarna

analyse volgde met GC-MS.

De dichtheid van urine werd bepaald met een refractometer UG-1van Atago (Tokyo, Japan).

Vervolgens werden de concentraties van de metabolieten gemeten in urine, gecorrigeerd via

onderstaande formule (C = concentratie):

(29)

2.4.2 Protocol plasma

Bloedstalen werden eerst vijf minuten in de centrifuge geplaatst bij kamertemperatuur (1300

toeren/minuut). Vervolgens werd het gebruikte protocol gebaseerd op een bestaande methode

van Madlensky et al (31).

25 µl van de samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en (4µg/ml) werd

ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C. Vervolgens werd 200 µl plasma en 800 µl

ammoniumformaat 0,5 mM (pH = 3) toegevoegd.

SPE gebeurde met behulp van MCX kolommen. De MCX kolommen werden geactiveerd met

1 ml methanol en nadien geconditioneerd met 1 ml water. Vervolgens werden de stalen op de

kolommen geladen waarna twee wasstappen volgden met 1 ml waterstofchloride (0,1M) en 1

ml methanol. Elutie gebeurde met 1 ml 5% ammoniakoplossing in methanol.

21

Na elutie werden de stalen ingedampt onder een stikstofstroom bij 60 +/- 5°C. De stalen

werden gederivatiseerd met 100 µl ANAL-60 derivatisatiemengsel en overgebracht in een

vial waarna analyse volgde met GC-MS.

2.5 Validatieprotocol (gebaseerd op QUAL 12)

2.5.1 Lineariteit

Negatieve urine en negatief plasma werden in drievoud aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM

en 4-OH-3-Me-TAM op zeven verschillende niveaus (tabel II en III).

Tabel II: validatie lineariteit: negatieve urine op 7 niveaus aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-

TAM.

Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM

(ng/ml)

Niveau 1 1 0,5 5

Niveau 2 2,5 1,25 12,5

Niveau 3 10 5 50

Niveau 4 25 12,5 125

Niveau 5 50 25 250

Niveau 6 75 37,5 375

Niveau 7 100 50 500

Tabel III: validatie lineariteit: negatief plasma op 7 niveaus aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-

Me-TAM.


(ng/ml)

Niveau 1 5 2,5 25

Niveau 2 12,5 6,25 62,5

Niveau 3 50 25 250

Niveau 4 125 62,5 625

Niveau 5 250 125 1250

Niveau 6 375 187,5 1875

Niveau 7 500 250 2500

22

Vervolgens werd het protocol voor urine of plasma doorlopen, zoals hierboven beschreven bij

de staalvoorbereiding, en werden de stalen geanalyseerd.

De lineariteit kan uitgedrukt worden door middel van de R² of de g-factor. De validatie was

geslaagd indien R² > 0,98 (waarde vooropgesteld DoCoLab) en wanneer g < 10% (28).


De bepaalbaarheidsgrens is de laagste concentratie met aanvaardbare juistheid en precisie. Dit

is het laagste punt van de calibratiecurve (28).

De aantoonbaarheidsgrens werd arbitrair gelijk gesteld aan de helft van de

bepaalbaarheidsgrens (QUAL 12).

2.5.3 Juistheid en precisie

Negatieve urine en negatief plasma werden in zesvoud aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM

en 4-OH-Me-TAM op drie verschillende niveaus (tabel IV en V).

Tabel IV: validatie juistheid en precisie: negatieve urine werd op 3 verschillende niveaus aangerijkt met

endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.


(ng/ml)

Niveau 1 1 0,5 5

Niveau 2 25 12,5 125

Niveau 3 100 50 500

Tabel V: validatie juistheid en precisie: negatief plasma werd op 3 verschillende niveaus aangerijkt met

endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.


(ng/ml)

Niveau 1 25 2,5 25

Niveau 2 125 62,5 625

Niveau 3 500 250 2500

23



De gemiddelde waarde mag niet meer dan 15% van de werkelijke waarde liggen, behalve de

LLOQ mag maximum 20% van de werkelijke waarde verschillen (27).

De herhaalbaarheid wordt uitgedrukt in de RSD en deze mag niet meer zijn dan zijn dan 2/3

RSDMAX (28).

2.5.4 Selectiviteit en specificiteit

Een negatief urinestaal en een negatief plasmastaal, alsook zeven referentiemengsels,

overgenomen uit P. Van Eenoo et al. (30), werden geanalyseerd en gecontroleerd op

interfererende pieken.

Een methode is selectief wanneer deze het onderscheid kan maken tussen de analyt en de

achtergrond/interferenties (27, 28).

2.5.5 Rendement

Om het rendement van de extractie na te gaan werd negatieve urine aangerijkt op één niveau

met endoxifen, 4-0H-TAM en 4-OH-3-Me-TAM bij de start van de staalvoorbereiding en

vlak voor derivatisatie ( tabel VI).

Negatief plasma werd aangerijkt op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-

TAM bij de start van de staalvoorbereiding en vlak voor derivatisatie (tabel VI).

Tabel VI: validatie rendement: negatieve urine en negatief plasma werden op 1 niveau aangerijkt met endoxifen,

4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.

Matrix Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM

(ng/ml)

Urine 25 12,5 125

Plasma 125 62,5 625

24



Het rendement werd berekend door de verhouding te nemen tussen het piekoppervlak van het

staal aangerijkt bij de start van de staalvoorbereiding en het piekoppervlak van het staal

aangerijkt vlak voor derivatisatie (27).

2.5.6 Stabiliteit

Negatieve urine werd aangerijkt in 160-voud op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-

OH-3-Me-TAM. Meer specifiek voor endoxifen met 25 ng. Voor 4-OH-TAM met 12,5 ng en

voor 4-OH-3-Me-TAM met 125 ng.

Negatief plasma werd ook aangerijkt in 160-voud op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM

en 4-OH-3-Me-TAM. Meer specifiek voor endoxifen met 125 ng. Voor 4-OH-TAM met 62,5

ng en voor 4-OH-3-Me-TAM met 625 ng.

Deze stalen werden bewaard in vier verschillende omstandigheden. 40 urinestalen werden

bewaard bij -20 °C, 40 stalen bij 3 °C, 40 stalen bij kamertemperatuur (KT) en 40 stalen bij

40°C. Hetzelfde werd toegepast voor de plasmastalen.

De stalen werden geanalyseerd op verschillende tijdstippen, meerbepaald na dag 1, 2, 3, 4, 5

en 14 waarna de stabiliteit beoordeeld werd aan de hand van een curve waar de concentratie

werd uitgesteld in functie van de tijd.

25

3. Resultaten en bespreking

3.1 Analyse van referentiestandaarden

3.1.1 Full scan

Bij de start van de methodeontwikkeling is het belangrijk om eerst een full scan spectra op te

nemen van de referentiestandaarden. 50 µl (10 µg/ml) endoxifen hydrochloride hydraat, 50 µl

(10 µg/ml) 4-OH-TAM, 50 µl (10,4 µg/ml) 4-OH-3-Me-TAM, 20 µl (100 µg/ml) endoxifen-

d5 en 20 µl (100 µg/ml) 4-OH-TAM-d5 werden ingedampt, gederivatiseerd en opgespoten.

Aan de hand van deze spectra kunnen de precursorionen geselecteerd worden. Idealiter is een

precursorion een specifiek ion met een hoge m/z waarde en een grote abundantie.

Endoxifen heeft een moleculair gewicht (MG) van 373,49 g/mol en endoxifen-d5 heeft een

MG van 378,49 g/mol. Na derivatisatie worden twee TMS-groepen (73 g/mol) geplaatst op

elk van deze moleculen ter hoogte van de alcohol functie en het amine (figuur 6). 4-OH-TAM

heeft een MG van 387,51 g/mol en 4-OH-TAM-d5 heeft een MG van 392,51. Na derivatisatie

wordt één TMS-groep geplaatst op elk van deze moleculen ter hoogte van de alcohol functie.

4-OH-3-Me-TAM heeft een MG van 417,5 g/mol. Na derivatisatie wordt één TMS-groep

geplaatst ter hoogte van de alcohol functie. Het MG voor endoxifen, endoxifen-d5, 4-OH-

TAM, 4-OH-TAM-d5 en 4-OH-3-Me-TAM bedraagt na derivatisatie respectievelijk 460

g/mol, 465 g/mol, 459 g/mol, 464 g/mol en 489 g/mol. Deze ionen werden teruggevonden op

de massaspectra en werden geselecteerd als precursorion zoals weergegeven in tabel VII.

Bijhorende retentietijd wordt vermeld. Figuur 7 geeft een representatief full scan

massaspectrum weer, meerbepaald het massaspectrum van endoxifen. Het geselecteerde

precursorion is aangeduid.

26

Figuur 6: derivatisatie van endoxifen

Figuur 7: full scan massaspectrum van endoxifen.

Tabel VII: selectie precursorionen

Metaboliet Moleculair ion (M+) Precursorion Retentietijd (RT)

Endoxifen 460 460 3,02

4-OH-TAM 459 459 3,56

4-OH-3-Me-TAM 489 489 3,61

Endoxifen-d5 465 465 3,02

4-OH-TAM-d5 464 464 3,55

27

3.1.2 Product Ion scan

Door een product Ion scan op te nemen van de geselecteerde precursorionen kunnen de

productionen gevisualiseerd worden. Opnieuw verkiest men bij de selectie van de

productionen een hoge m/z waarde, een grote abundantie en ionen die voldoende specifiek

zijn. De collisie-energie wordt hierbij aangepast zodat een zo groot mogelijke abundantie

verkregen wordt van het production. Figuur 8 geeft een representatieve product Ion scan weer,

meerbepaald deze van endoxifen. De geselecteerde productionen zijn aangeduid.

Het ion met m/z 73 komt overeen met TMS. Dit ion is niet specifiek en wordt dus

preferentieel niet geselecteerd als precursorion.

Figuur 8: product Ion scan van endoxifen

3.1.3 MRM

De gekozen transities voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3-Me-TAM, endoxifen-d5 en 4-

OH-TAM-d5 kunnen eerder teruggevonden worden in tabel I in materialen en methode.

Met behulp van een softwareprogramma (MassHunter) kon een kwantitatieve methode

worden opgesteld voor de bepaling van de metabolieten. Hiervoor dienden de gekozen

transities en de retentietijden ingegeven te worden in het programma. Op deze manier werden

de relatieve piekoppervlakten van de metabolieten in het chromatogram bepaald, welke in

verband gesteld werden met een bepaalde concentratie.

28

3.2 Methodevalidatie

3.2.1 Lineariteit

Figuur 9 toont een representatieve calibratiecurve, meerbepaald deze van endoxifen in urine.

Figuur 9: calibratiecurve van endoxifen in urine.

Tabel VIII geeft van elke calibratiecurve (urine en plasma) de correlatiecoëfficiënt weer. R² is

steeds groter dan 0,98.

Tabel VIII: R² van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en r² van de

calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasma.

Metaboliet Matrix R²

Endoxifen Urine 0,998

4-OH-TAM Urine 0,999

4-OH-3-Me-TAM Urine 0,998

Endoxifen Plasma 0,995

4-OH-TAM Plasma 0,997

4-OH-3-Me-TAM Plasma 0,996

29

Tabel IX geeft van elke calibratiecurve (urine en plasma) de g-factor weer. Deze is steeds

kleiner dan 10% behalve voor 4-OH-3-Me-TAM in plasma (g-factor = 11,291).

Tabel IX: de g-factor van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en de g-

factor van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasma.

Metaboliet Matrix g-factor







Hieruit kan geconcludeerd worden dat voor de bepaling in urine de methode lineair is. De

methode in plasma is lineair voor endoxifen en 4-OH-TAM.


De bepaalbaarheid is het laagste punt van de calibratiecurve met voldoende juistheid en

precisie. Tabel X geeft de juistheid en precisie (herhaalbaarheid) weer van het laagste punt

van de calibratiecurve voor zowel de methode in urine als de methode in plasma. De bias is

nooit groter dan 20% en de RSD is steeds kleiner dan 2/3 RSDMAX. De vereisten van de

LLOQ zijn dus voldaan.

Tabel X: juistheid en RSD van het laagste punt van de calibratiecurve van de metabolieten in urine en plasma.

Metaboliet Matrix Ware

waarde

(ng/ml)

Gemeten

gemiddelde

concentratie

(ng/ml)

Juistheid

(%)

RSD

(%)

2/3

RSDMAX

(%)

Endoxifen Urine 1 1,14 13,8 8,2 30,2

4-OH-TAM Urine 0,5 0,51 1,7 7,6 33,5

4-OH-3-Me-TAM Urine 5 5,24 4,7 8,7 23,7

Endoxifen Plasma 5 5,48 9,5 6,5 23,7

4-OH-TAM Plasma 2,5 2,65 6,0 7,0 26,3

4-OH-3-Me-TAM Plasma 25 24,5 -2,0 5,5 26,3

30

De aantoonbaarheidsgrens voor elke metaboliet in urine en plasma wordt weergegeven in

tabel XI.

Tabel XI: de aantoonbaarheidsgrens van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en in plasma.

Metaboliet Matrix Aantoonbaarheidsgrens

(ng/ml)

Endoxifen Urine 0,5

4-OH-TAM Urine 0,25





3.2.3 Juistheid en precisie

Tabel XII geeft de juistheid en de herhaalbaarheid (RSD) weer van de metabolieten op 3

verschillende niveaus in urine en plasma. De bias is nooit groter dan 15% en de RSD was

steeds kleiner dan 2/3 RSDMAX met uitzondering van één punt. Op het niveau van 500 ng/ml

endoxifen in plasma was de bias van de methode 15,3%. Gezien er gewerkt werd onder

strengere voorwaarden dan in DoCoLab (bias < 20%) en de onjuistheid afgerond 15% is,

werd dit punt toch aanvaard. Hieruit kan geconcludeerd worden dat zowel voor de bepaling in

urine als voor de bepaling in plasma de methode juist en herhaalbaar is.

31

Tabel XII: juistheid en RSD op 3 niveaus van de metabolieten in urine en plasma.

Metaboliet Matrix Ware

waarde

(ng/ml)

Gemeten

gemiddelde

concentratie

(ng/ml)

Juistheid

(%)

RSD

(%)

2/3

RSDMAX

(%)

Endoxifen Urine 1 1,14 13,8 8,2 30,2

25 26,41 5,6 4,9 18,6

100 101,03 1,0 10,8 15,1

4-OH-TAM Urine 0,5 0,51 1,7 7,6 33,5

12,5 12,97 3,8 2,8 20,6

50 49,65 -0,7 8,8 16,7

4-OH-3-Me-

TAM

Urine 5 5,24 4,7 8,7 23,7

125 134,95 8,0 4,3 14,6

500 515,2 3,0 9,6 11,8

Endoxifen Plasma 5 5,48 9,5 6,5 23,7

125 122,18 -2,3 10,5 20,6

500 423,29 -15,3 3,8 11,8

4-OH-TAM Plasma 2,5 2,65 6,0 7,0 26,3

62,5 62,37 -0,2 4,1 16,2

250 268,36 7,3 2,4 18,6

4-OH-3-Me-

TAM

Plasma 25 24,5 -2,0 5,5 26,3

2500 2521,73 0,9 2,8 13,1

3.2.4 Selectiviteit en specificiteit

Er konden geen interfererende pieken worden waargenomen ter hoogte van de retentietijd van

de metabolieten in blanco urine en blanco plasma. De analyse van referentiemengsels

vertoonden ook geen interfererende pieken. Hiervan uitgaande kan geconcludeerd worden dat

de methode zowel selectief als specifiek is voor urine en plasma.

3.2.5 Rendement

Tabel XIII geeft het extractierendement weer van de methode voor elke metaboliet in zowel

urine als in plasma. Er wordt een beter rendement waargenomen in urine dan in plasma. Een

mogelijke verklaring kan de onvolledige staaloverdracht zijn vanuit het recipiënt naar de SPE

kolom. Ondanks de lagere resultaten in plasma zijn alle resultaten aanvaardbaar.

32

Tabel XIII: extractierendement.

Metaboliet Matrix Rendement (%)







3.2.6 Stabiliteit

Figuur 10 en 11 geven de stabiliteitsanalyse weer in urine en plasma. De stabiliteitsanalyse

had een looptijd van twee weken. Er werd verondersteld dat stalen binnen deze tijdsperiode

geanalyseerd werden.

Op beide figuren zien we links de stabiliteitscurven van endoxifen bewaard bij -20°C, 3°C,

KT en 40°C (onder elkaar). In het midden zien we de stabiliteitscurven van 4-OH-TAM

bewaard bij -20°C, 3°C, KT en 40°C en rechts de stabiliteitscurven van 4-OH-3-Me-TAM

bewaard bij -20°C, 3°C, KT en 40°C. De standaarddeviatie is per punt weergegeven.

Op het eerste zicht kan er een trend van degradatie worden waargenomen in zowel urine als

plasma. In plasma is dit meer uitgesproken.

De uiterste bewaarcondities (-20°C en 40°C) werden voor elke metaboliet statistisch met

elkaar vergeleken na 14 dagen bewaring. Er werd een t-test uitgevoerd met behulp van Excel.

Hierbij werd uitgegaan van een 95% betrouwbaarheidsinterval (α = 0,05), ongelijke varianties

en een tweezijdige verdeling. Tabel XIV geeft de resultaten weer. Significante resultaten

worden aangeduid met *. Voor endoxifen en 4-OH-TAM kon in urine een statistisch

significant verschil worden aangeduid tussen de uiterste bewaarcondities. De gemeten

concentraties in urine lagen duidelijk lager na bewaring bij 40°C in vergelijking met bewaring

bij -20°C. Wanneer we de P-waarden van endoxifen en 4-OH-TAM in plasma bekijken dient

te worden opgemerkt dat deze op de significantiegrens liggen. Deze resultaten kunnen nog net

als statistisch significant beschouwd worden. Ook hier lagen concentraties lager na bewaring

bij 40°C in vergelijking met bewaring bij -20°C. Voor concentraties van 4-OH-3-Me-TAM

wordt zowel in urine als in plasma geen significant verschil aangetoond tussen de twee

verschillende bewaarcondities.

33

Het laatste punt (14 dagen) op de grafiek ligt steeds hoger dan de voorgaande. Dit kan

verklaard worden door de meetonzekerheid. Het 95% zekerheidsinterval, rekeninghoudende

met de meetonzekerheid, wordt eveneens op de grafieken aangeduid. Wanneer deze in

rekening wordt gebracht, valt op dat de meeste metingen binnen deze grenzen vallen. Voor

deze metingen kan men dus geen ondubbelzinnige degradatie vast stellen. Dit blijkt ook uit de

laatste meting (na twee weken bewaring). Deze vallen immers steeds binnen de grenzen van

de meetonzekerheid, waaruit blijkt dat de ogenschijnlijke degradatie in de eerste week enkel

toe te schrijven is aan de meetonzekerheid.

Tabel XIV: t-test uitgevoerd voor de uiterste bewaarcondities (-20°C en 40°C) voor elke metaboliet in urine en

plasma. Hierbij werd uitgegaan van een 95% betrouwbaarheidsinterval (α = 0,05), ongelijke varianties en een

tweezijdige verdeling. * duidt de resultaten aan waar een significant verschil kon worden waargenomen.

Matrix Metaboliet P-waarde

Urine Endoxifen 0,005*

4-OH-TAM 0,008*

4-OH-3-Me-TAM 0,202

Plasma Endoxifen 0,050*

4-OH-TAM 0,055*

4-OH-3-Me-TAM 0,166

34

Figuur 10: de stabiliteit in urine onder 4 condities. De standaarddeviatie wordt per punt weergegeven en de

meetonzekerheid wordt per grafiek afgebeeld.

35

Figuur 11: de stabiliteit in plasma onder 4 condities. De standaarddeviatie wordt per punt weergegeven en de

meetonzekerheid wordt per grafiek afgebeeld.

36

3.3 Analyse patiëntenstalen

3.3.1 Patiënten

Tabel XV geeft de gegevens van de deelnemende patiënten weer. In totaal namen 16 patiënten

deel aan de studie. Dit waren allemaal vrouwen. Bij patiënt 2, 7 en 14 ontbreekt de

gebruiksperiode van TAM. Er kan echter vanuit gegaan worden dat deze periode langer was

dan 8 weken gezien dit een criterium was voor deelname (patiënt 3 vormt hier een

uitzondering op en was slechts 3 weken in behandeling). Ook het eventueel concomitant

gebruik van andere geneesmiddelen werd niet opgegeven door patiënt 2, 7 en 14.

Tabel XV: geslacht, leeftijd, gebruiksperiode van TAM en eventueel concomitant gebruik van andere

geneesmiddelen van de deelnemende patiënten.

Patiënt Geslacht Leeftijd

(jaren)

TAM-gebruik

(maanden)

Gebruik andere

geneesmiddelen

1 Vrouw 36 23 Zoladex

2 Vrouw 54 / /

3 Vrouw 48 > 1 Sipralexa

(escitalopram)

4 Vrouw 61 4 Lyrica 150 mg

5 Vrouw 58 6 Citalopram

Pantomed

Zolpidem

6 Vrouw 48 39 Deanxit

Bisoprolol

7 Vrouw 44 / /

8 Vrouw 50 21 Cipramil

9 Vrouw 47 42 Voedingssuplementen

10 Vrouw 48 36 Geen

11 Vrouw 43 7 Geen

12 Vrouw 58 60 Geen

13 Vrouw 52 2 Bisoprolol

Temesta expedit

14 Vrouw 48 / /

15 Vrouw 48 7 Bisoprolol

Herceptine

16 Vrouw 46 6 Herceptine

37

3.3.2 Analyse urinestalen

Tabel XVI geeft de gemeten concentratie weer van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-

TAM in de urinestalen van de deelnemende patiënten. Ook de verhouding endoxifen op 4-

OH-TAM is weergegeven. Het was voor de patiënten niet altijd mogelijk om urinestalen te

doneren op alle gevraagde tijdstippen waardoor de tabel niet helemaal volledig is.

Over de vijf gemeten tijdstippen wordt er een consistente schommeling in de concentratie van

de metabolieten gezien. Na tijdstip A (voor de inname van de medicatie) wordt bij de meeste

patiënten een daling gezien in de concentratie van de metabolieten. Deze daling in de

concentratie wordt waargenomen op tijdstip B (1 uur na inname) en soms verder aangehouden

tot tijdstip C (2 uur na inname). Na inname van de medicatie verloopt de excretie van de

metabolieten in de urine dus met enige vertraging. Vanaf tijdstip C of D (4 uur na inname)

wordt er een stijging waargenomen in de concentratie van de metabolieten. Op tijdstip E (8

uur na inname) wordt deze concentratiestijging aangehouden of neemt deze reeds terug af.

Afwijkende resultaten bij patiënten 6 en 8 doen vermoeden dat de urinestalen omgewisseld

zijn op tijdstip C en D bij patiënt 6 en op tijdstip B en C bij patiënt 8.

Voor patiënten 1, 2, 5, 8 en 16 werd er een directe stijging van de concentratie waargenomen

na inname van de medicatie. Dit kan verklaard worden door het tijdstip van inname van de

medicatie van de voorgaande dag.

Zoals de gegevens in de tabel illustreren worden van 4-OH-3-Me-TAM duidelijk de hoogste

concentraties teruggevonden in de urine in vergelijking met endoxifen en 4-OH-TAM. 4-OH-

3-Me-TAM wordt dus in belangrijke mate gevormd en geëxcreteerd in urine en kan dermate

interessant zijn voor kwalitatieve bepalingen. Therapeutisch gezien is deze metaboliet echter

minder belangrijk.

Absolute concentraties gemeten in urine zijn afhankelijk van verschillende factoren zoals het

individueel metabolisme, het concentrerend vermogen van de nier en de hoeveelheid vocht

die men tot zich neemt (24). Toch werd er gekozen om concentratiebepalingen in urine uit te

voeren vermits afname van urine minder invasief is dan afname van plasma. Verhoudingen

tussen de metabolieten zijn niet onderhevig aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en

de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine. Omwille van deze reden is de

verhouding van endoxifen op 4-OH-TAM ook weergegeven in tabel XVI.

Uit verschillende publicaties blijkt dat de steady state plasmaconcentraties van endoxifen vijf-

tot tienmaal hoger liggen dan van 4-OH-TAM (4,7,9,10,13,18-20). De gegevens in de tabel

38

tonen aan dat deze verhouding in urine veel minder uitgesproken is. Dit kan enerzijds

verklaard worden door een verschillende fase II metabolisatie van beide metabolieten. Zo is

eerder ook gebleken dat bij testosteron en epitestosteron de verschillende genotypen anders

geglucuronideerd worden (32). Het al of niet glucuronideren van een molecule (en zijn

analogen) heeft een invloed op de polariteit van de molecule en bijgevolg ook op de

uitscheiding (33). Anderzijds kunnen reabsorptieprocessen ook een oorzaak zijn voor de

geobserveerde verschillen.

Bij vier patiënten (patiënten 1, 3, 5 en 9) werd een opmerkelijke verhouding gevonden kleiner

dan 1. De endoxifen concentraties lagen bij deze patiënten lager dan de 4-OH-TAM

concentraties. Meerdere verklaringen zijn hier mogelijk.

Een eerste verklaring kan een probleem zijn bij de omzetting van TAM tot zijn actieve

metabolieten door fase I enzymen. Wanneer CYP3A4/5 een verminderde werking vertoont,

kan verwacht worden dat concentraties van endoxifen lager zullen liggen en dat deze van 4-

OH-TAM gelijk blijven (figuur 1). Bij patiënt 3 en patiënt 5 liggen de endoxifen concentraties

in urine lager dan de 4-OH-TAM concentraties. Deze patiënten zijn in behandeling met

dezelfde SSRI (tabel XV). Escitalopram (patiënt 3) is het actieve S-enantiomeer van de SSRI

citalopram (patiënt 5). Deze medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd door CYP3A4

(34). Zo kan het dat, door inwerking van de SSRI, het CYP3A4 isoenzym geïnhibeerd wordt.

Dit zou lagere concentraties van endoxifen tot resultaat hebben en bijgevolg kan dit een effect

hebben op de therapie. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine

groep patiënten in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van

escitalopram en TAM noodzakelijk.

Een tweede verklaring kan een probleem zijn bij de omzetting van de actieve metabolieten

naar inactieve metabolieten door fase II enzymen. Wanneer inactivatie door glucuronidatie of

sulfatatie minder goed verloopt, kan dit leiden tot verlaagde excretie van de metabolieten.

Als laatste kunnen ook andere factoren die de eliminatie beïnvloeden zoals

reabsorptieprocessen, de oorzaak zijn van gewijzigde concentraties van de metabolieten in

urine.

39

Tabel XVI: concentraties van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urinestalen van deelnemende

patiënten. A = urinestaal voor inname TAM, B = urinestaal 1 uur na inname TAM, C = urinestaal 2 uur na

inname TAM, D = urinestaal 4 uur na inname TAM en E = urinestaal 8 uur na inname TAM.

Patiënt Urinestaal Concentratie

endoxifen

(ng/ml)

Concentratie

4-OH-TAM

(ng/ml)

Concentratie

4-OH-3-Me-

TAM (ng/ml)

Verhouding

endoxifen/4-

OH-TAM

1 A 230,68 295,32 3731,78 0,78

B 501,57 683,24 8290,89 0,73

C / / / /

D 1279,36 1749,07 16726,91 0,73

E 675,13 839,70 10273,03 0,80

2 A 225,43 164,33 1105,21 1,37

B 246,33 158,90 1073,20 1,55

C 285,42 192,20 1113,24 1,49

D 138,59 116,38 987,87 1,19

E 187,11 147,76 1452,68 1,27

3 A 18,01 41,05 508,37 0,44

B 8,43 15,29 281,89 0,55

C / / / /

D 12,26 29,34 631,22 0,42

E 25,84 82,25 964,73 0,31

4 A 49,34 41,59 789,81 1,19

B / / / /

C / / / /

D 83,14 72,27 1770,12 1,15

E 53,70 49,87 1042,66 1,08

5 A 3,63 7,90 188,18 0,46

B 4,87 9,90 317,49 0,49

C / / / /

D 27,92 54,80 1496,52 0,51

E 43,24 115,18 2997,42 0,38

6 A 60,49 38,67 500,37 1,56

B 50,89 30,61 475,04 1,66

C 64,53 36,53 540,60 1,77

D 35,93 35,01 519,24 1,03

E 74,74 52,59 968,62 1,42

7 A 35,96 21,33 271,95 1,69

B 23,82 16,99 172,16 1,40

C 13,07 10,62 96,80 1,23

D 21,53 15,51 163,39 1,39

E 73,09 70,44 697,60 1,04

8 A 49,39 41,89 808,64 1,18

B 52,63 48,60 777,59 1,08

40

C 44,92 41,57 724,70 1,08

D 67,52 65,81 1151,35 1,03

E 25,25 33,89 524,43 0,75

9 A 28,59 54,63 785,48 0,52

B 18,97 61,94 737,85 0,31

C 19,13 68,10 814,66 0,28

D 33,60 88,84 1190,79 0,38

E 10,39 36,43 545,81 0,29

10 A 30,40 28,38 283,02 1,07

B 10,91 10,86 105,05 1,00

C 13,08 12,23 124,80 1,07

D 26,31 25,77 248,99 1,02

E 23,12 22,49 250,40 1,03

11 A 40,16 34,45 219,17 1,17

B 23,04 21,98 139,52 1,05

C 38,66 35,86 211,88 1,08

D 99,87 87,21 559,71 1,15

E 64,07 61,64 418,47 1,04

12 A 42,83 34,18 262,50 1,25

B 15,77 9,83 102,50 1,60

C 14,95 10,74 105,92 1,39

D 65,19 50,39 412,19 1,29

E 97,62 64,20 547,18 1,52

13 A 35,23 31,92 353,49 1,10

B 22,09 20,92 286,80 1,06

C 44,74 42,15 570,67 1,06

D 58,37 50,32 529,52 1,16

E 36,05 31,41 301,79 1,15

14 A 140,85 123,60 1496,85 1,14

B 84,01 80,24 1013,75 1,05

C 36,57 33,42 494,09 1,09

D 62,61 51,30 652,00 1,22

E 85,66 92,81 1247,38 0,92

15 A 68,83 53,18 668,02 1,29

B 64,98 42,04 575,37 1,55

C 69,85 48,38 666,08 1,44

D / / / /

E 65,29 53,00 738,50 1,23

16 A 20,59 14,51 133,75 1,42

B 50,94 39,40 402,49 1,29

C 42,06 31,32 338,93 1,34

D / / / /

E / / / /

41

Vermits urineconcentraties onderhevig zijn aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en

de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine, worden in Tabel XVII de

urineconcentraties van de drie metabolieten weergegeven gecorrigeerd voor de dichtheid.

De meeste gecorrigeerde urineconcentraties van endoxifen liggen tussen de 10 en 100 ng/ml.

De eerste twee patiënten vormen hier een uitzondering op.

Ook hier wordt een gelijkaardige schommeling waargenomen over de verschillende

tijdstippen van de urineafname, zoals eerder in tabel XVI.

Concentraties van endoxifen in urine zijn tot op heden nog niet gepubliceerd. Irvin WJ et al.

(10) beschreef eerder plasmaconcentraties van endoxifen in EM’s, IM’s en PM’s. Zoals

verwacht lagen deze plasmaconcentraties hoger bij EM’s (34.3 ng/mL) in vergelijking met

IM’s (18.5 ng/mL) en PM’s (4.2 ng/mL). Er werd echter niets vermeld over het tijdstip van de

bloedafname ten opzichte van de inname van de medicatie. Hierdoor, en omdat concentraties

gemeten in urine ook afhankelijk zijn van het individueel metabolisme, is het moeilijk om de

verkregen resultaten te vergelijken met eerder beschreven plasmaconcentraties.

42

Tabel XVII: concentraties van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urinestalen van patiënten

gecorrigeerd voor de dichtheid. A = urinestaal voor inname TAM, B = urinestaal 1 uur na inname TAM, C =

urinestaal 2 uur na inname TAM, D = urinestaal 4 uur na inname TAM en E = urinestaal 8 uur na inname TAM.

Patiënt Urinestaal Dichtheid

urine (kg/l)

Concentratie

endoxifen

(ng/ml)

Concentratie

4-OH-TAM

(ng/ml)

Concentratie 4-

OH-3-Me-TAM

(ng/ml)

1 A 1,004 230,68 295,32 3731,78

B 1,005 501,57 683,24 8290,89

C / / / /

D 1,017 1279,36 1749,07 16726,91

E 1,007 675,13 839,7 10273,03

2 A 1,026 225,43 164,33 1105,21

B 1,027 246,33 158,9 1073,2

C 1,028 285,42 192,2 1113,24

D 1,020 138,59 116,38 987,87

E 1,012 187,11 147,76 1452,68

3 A 1,022 18,01 41,05 508,37

B 1,019 8,43 15,29 281,89

C / / / /

D 1,023 12,26 29,34 631,22

E 1,026 25,84 82,25 964,73

4 A 1,015 49,34 41,59 789,81

B / / / /

C / / / /

D 1,016 83,14 72,27 1770,12

E 1,015 53,7 49,87 1042,66

5 A 1,003 3,63 7,9 188,18

B 1,003 4,87 9,9 317,49

C / / / /

D 1,015 27,92 54,8 1496,52

E 1,019 43,24 115,18 2997,42

6 A 1,021 60,49 38,67 500,37

B 1,021 50,89 30,61 475,04

C 1,006 64,53 36,53 540,6

D 1,023 35,93 35,01 519,24

E 1,027 74,74 52,59 968,62

7 A 1,011 35,96 21,33 271,95

B 1,009 23,82 16,99 172,16

C 1,006 13,07 10,62 96,8

D 1,010 21,53 15,51 163,39

E 1,018 73,09 70,44 697,6

8 A 1,019 49,39 41,89 808,64

B 1,020 52,63 48,6 777,59

43

C 1,020 44,92 41,57 724,7

D 1,023 67,52 65,81 1151,35

E 1,010 25,25 33,89 524,43

9 A 1,034 28,59 54,63 785,48

B 1,037 18,97 61,94 737,85

C 1,033 19,13 68,1 814,66

D 1,026 33,6 88,84 1190,79

E 1,026 10,39 36,43 545,81

10 A 1,008 30,4 28,38 283,02

B 1,004 10,91 10,86 105,05

C 1,002 13,08 12,23 124,8

D 1,007 26,31 25,77 248,99

E 1,005 23,12 22,49 250,4

11 A 1,010 40,16 34,45 219,17

B 1,008 23,04 21,98 139,52

C 1,012 38,66 35,86 211,88

D 1,017 99,87 87,21 559,71

E 1,017 64,07 61,64 418,47

12 A 1,009 42,83 34,18 262,5

B 1,005 15,77 9,83 102,5

C 1,003 14,95 10,74 105,92

D 1,010 65,19 50,39 412,19

E 1,016 97,62 64,2 547,18

13 A 1,012 35,23 31,92 353,49

B 1,017 22,09 20,92 286,8

C 1,020 44,74 42,15 570,67

D 1,021 58,37 50,32 529,52

E 1,012 36,05 31,41 301,79

14 A 1,025 140,85 123,6 1496,85

B 1,024 84,01 80,24 1013,75

C 1,015 36,57 33,42 494,09

D 1,020 62,61 51,3 652

E 1,028 85,66 92,81 1247,38

15 A 1,021 68,83 53,18 668,02

B 1,020 64,98 42,04 575,37

C 1,023 69,85 48,38 666,08

D / / / /

E 1,023 65,29 53 738,5

16 A 1,011 20,59 14,51 133,75

B 1,021 50,94 39,4 402,49

C 1,018 42,06 31,32 338,93

D / / / /

E / / / /

44

3.3.3 Analyse plasmastalen

In tegenstelling tot concentratiebepalingen in urine zijn concentratiebepalingen in plasma niet

onderhevig aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en de hiermee verbonden

hoeveelheid uitgescheiden urine. In tegenstelling tot het volume urine dat uitgescheiden

wordt, is het bloedvolume vrij constant. Zelfs wanneer urineconcentraties gecorrigeerd

worden voor de dichtheid van de urinestalen zijn deze niet even betrouwbaar als metingen

uitgevoerd in plasma voor het trekken van klinische conclusies. Omwille van deze redenen

werd er ook geopteerd om concentratiebepalingen uit te voeren in plasma, ondanks het feit dat

afname van bloed meer invasief is dan afname van urine.

Tabel XVIII geeft de gemeten concentratie weer van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-

TAM in de plasmastalen van de eerste tien patiënten. Ook de verhouding endoxifen op 4-OH-

TAM is weergegeven. Het was voor de patiënten niet altijd mogelijk om bloedstalen te

doneren op alle gevraagde tijdstippen waardoor de tabel niet helemaal volledig is.

Het analyseren van de verzamelde plasmastalen verliep moeizaam. Hierdoor werden niet alle

plasmastalen geanalyseerd maar slechts deze van de eerste tien patiënten. De plasmastalen

waren na de staalvoorbereiding, ondanks een geslaagde validatie, onvoldoende zuiver om een

optimale ontleding toe te laten met GC-MS. Dit kon gelegen zijn aan de kwaliteit van de

plasmastalen. Deze waren immers licht hemolytisch. Naargelang de omstandigheden werden

de bloedstalen één of twee nachten bewaard in de koelkast voor ze werden afgecentrifugeerd.

Direct afcentrifugeren na afname zou hemolyse kunnen voorkomen. Verder kan men proberen

de S/N te verbeteren door de aanwezige proteïnen in het plasma te precipiteren, vóór het

uitvoeren van SPE, en het extractierendement te verhogen. Anderzijds kan werken met een

groter plasmavolume ook een verbetering opleveren. Wel is de bijdrage van deze opties

beperkt gezien gewerkt wordt met een triple quadrupool en deze methode al reeds zeer

selectief is. Het gebruik van een andere techniek, bijvoorbeeld Liquid Chromatography–Mass

Spectrometry (LC-MS), kan een oplossing zijn. Er dient overigens opgemerkt te worden dat

het gebruikte protocol, waarop SPE gebaseerd werd, voorbestemd was voor LC-MS in plaats

van GC-MS.

Bij het bekijken van de resultaten worden, net zoals in urine, van 4-OH-3-Me-TAM de

hoogste concentraties gemeten in plasma. Er wordt echter geen consistent patroon gezien over

de drie verschillende tijdstippen van de bloedafname.

45

Plasmaconcentraties van endoxifen lagen opmerkelijk lager dan eerder beschreven in Irvin

WJ et al (10), waar plasmaconcentraties van gemiddeld 34.3 ng/mL werden gemeten bij

EM’s.

Uit verschillende publicaties blijkt dat steady state plasmaconcentraties van endoxifen vijf- tot

tienmaal hoger liggen dan van 4-OH-TAM (4,7,9,10,13,18-20). Deze resultaten konden niet

herhaald worden. Concentraties van endoxifen lagen in de meeste gevallen twee- tot vijfmaal

hoger dan 4-OH-TAM, maar in een aantal gevallen werd een verhouding van 2 niet bereikt. In

tegenstelling tot de verhoudingen van endoxifen op 4-OH-TAM in urine bij patiënten 1, 3, 5

en 9, konden in plasma geen verhoudingen gevonden worden kleiner dan 1. Dit zou er kunnen

op wijzen dat factoren die de eliminatie beïnvloeden de oorzaak zijn van de gewijzigde

concentraties van de metabolieten in urine. Helaas kunnen hier geen betrouwbare conclusies

getrokken worden omdat de gemeten concentraties van de drie metabolieten in plasma steeds

lager liggen dan de LLOQ (tabel X). Dit betekent dat de ‘gevoeligheid’ van de gebruikte

methode onvoldoende is om dergelijke metingen uit te voeren.

In de toekomst dient nog verder onderzoek uitgevoerd te worden ter verbetering van de

staalvoorbereiding en de ‘gevoeligheid’ van de methode.

46

Tabel XVIII: concentratie van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasmastalen van deelnemende

patiënten. A = plasmastaal voor inname TAM, B = plasmastaal 1 uur na inname TAM en C = plasmastaal 2 uur

na inname TAM.

Patiënt Plasmastaal Concentratie

endoxifen

(ng/ml)

Concentratie

4-OH-TAM

(ng/ml)

Concentratie 4-

OH-3-Me-

TAM (ng/ml)

Verhouding

endoxifen/4-

OH-TAM

1 A 4,04 1,65 5,62 2,45

B 3,81 1,54 6,32 2,47

C / / / /

2 A 7,14 1,95 12,15 3,66

B 7,57 2,47 14,88 3,06

C 6,02 2,23 8,54 2,69

3 A 1,37 0,38 6,81 3,59

B 1,13 0,58 9,52 1,94

C 2,36 2,28 11,24 1,04

4 A 6,79 1,15 6,75 5,89

B 3,58 0,90 8,31 3,98

C / / / /

5 A 5,34 1,76 25,70 3,03

B 3,06 1,64 15,95 1,86

C 5,57 1,45 24,65 3,84

6 A 4,71 1,26 10,39 3,75

B 3,14 0,93 11,20 3,37

C 2,93 1,06 10,34 2,77

7 A 5,09 1,52 6,54 3,34

B 3,61 0,92 5,53 3,91

C 4,94 1,06 7,40 4,65

8 A 2,25 0,67 7,65 3,36

B 1,14 0,66 6,04 1,73

C / / / /

9 A 1,20 0,58 6,32 2,08

B 0,98 0,83 7,99 1,18

C 0,95 0,66 7,12 1,45

10 A 4,45 1,94 10,76 2,30

B 1,48 0,88 6,05 1,69

C 4,10 1,72 10,28 2,38

47

4. Besluit

Er werd een kwantitatieve GC-MS methode ontwikkeld voor de bepaling van endoxifen, 4-

OH-TAM en 4-OH-3Me-TAM in urine en in plasma. Hierbij werd gebruik gemaakt van een

triple quadrupool analysator. Ondanks het feit dat beide methoden volledig gevalideerd zijn,

is enkel de methode in urine ‘gevoelig’ genoeg om dergelijke metingen uit te voeren. Verder

onderzoek is nodig om de staalvoorbereiding in plasma te verbeteren en een meer ‘gevoelige’

methode te ontwikkelen.

Absolute concentraties gemeten in urine zijn afhankelijk van verschillende factoren zoals het

individueel metabolisme, het concentrerend vermogen van de nier en de hoeveelheid vocht

die men tot zich neemt (24). Toch werd er gekozen om concentratiebepalingen in urine uit te

voeren vermits afname van urine minder invasief is dan afname van plasma.

In alle urinestalen van de deelnemende patiënten werd een consistente schommeling

teruggevonden over de verschillende tijdstippen van de urine afname. Verhoudingen van

endoxifen op 4-OH-TAM blijken minder uitgesproken dan verhoudingen teruggevonden in

plasma (4,7,9,10,13,18-20). Dit zou verklaard kunnen worden door een verschil in fase II

metabolisatie of een verschil in de reabsorptieprocessen van beide metabolieten. Bij vier

patiënten (patiënten 1, 3, 5 en 9) werd er een verhouding gevonden kleiner dan 1. De

endoxifen concentraties lagen bij deze patiënten lager dan de 4-OH-TAM concentraties. Ook

hier kan de verklaring liggen bij factoren die de eliminatie beïnvloeden. Opmerkelijk waren

patiënt 3 en patiënt 5 in behandeling met dezelfde SSRI, escitalopram (tabel XV). Deze

medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd door CYP3A4 (34). Zo kan het dat, door

inwerking van de SSRI, het CYP3A4 isoenzym geïnhibeerd wordt. Dit zou lagere

concentraties van endoxifen tot resultaat hebben en bijgevolg kan dit een effect hebben op de

therapie. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine groep patiënten

in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van escitalopram en

TAM noodzakelijk.

48

5. Referenties

1. Tan S-H, Lee S-C, Goh B-C, Wong J. Pharmacogenetics in Breast Cancer Therapy. Clinical Cancer

Research. 2008;14(24):8027-8041.

2. Baumgarten S C, Frasor J. Minireview: inflammation: an instigator of more aggressive estrogen

receptor (ER) positive breast cancer. Molecular Endocrinology. 2012;26(3):360-371.

3. Jin Y, Desta Z, Stearns V, Ward B, Ho H, Lee KH, Skaar T, Storniolo AM, Li L, Araba A,

Blanchard R, Nguyen A, Ullmer L, Hayden J, Lemler S, Weinshilboum RM, Rae JM, Hayes DF,

Flockhart DA. CYP2D6 genotype, antidepressant use, and tamoxifen metabolism during adjuvant

breast cancer treatment. Journal of the National Cancer Institute. 2005;97(1):30-39.

4. Zhou S-F. Polymorphism of Human Cytochrome P450 2D6 and Its Clinical Significance Part II.

Clinical Pharmacokinetics. 2009;48(12):761-804.

5. Schroth W, Goetz MP, Hamann U, Fasching PA, Schmidt M, Winter S, Fritz P, Simon W, Suman

VJ, Ames MM, Safgren SL, Kuffel MJ, Ulmer HU, Boländer J, Strick R, Beckmann MW, Koelbl

H, Weinshilboum RM, Ingle JN, Eichebaum M, Schwab M, Brauch H. Association Between

CYP2D6 Polymorphisms and Outcomes Among Women With Early Stage Breast Cancer Treated

With Tamoxifen. Jama-Journal of the American Medical Association. 2009;302(13):1429-1436.

6. http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=web&cd=5&ved=0CD8QFjA

E&url=http%3A%2F%2F195.130.154.23%2Furlnotices%2Flid%2Flid.aspx%3FsLID%3D20740%

26sUID%3D2ZP8SQ55&ei=dACdUKGkC8nW0QW__YHIDg&usg=AFQjCNE_bADGMgYdrSrz

CopGVKRnie95ww&sig2=fVlngBMANT4WYETab23_Gg (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).

7. Braems G, Denys H, De Wever O, Cocquyt V, Van den Broecke R. Use of Tamoxifen before and

during pregnancy. The Oncologist. 2011; 16:1547-1551.

8. Ingelman-Sundberg M, Sim SC, Gomez A, Rodriguez-Antona C. Influence of cytochrome P450

polymorphisms on drug therapies: Pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects.

Pharmacology & Therapeutics. 2007;116(3):496-526.

9. Borges S, Desta Z, Li L, Skaar TC, Ward BA, Nguyen A, Jin Y, Storniolo AM, Nikoloff DM, Wu

L, Hillman G, Hayes DF, Stearns V, Flockhart DA. Quantitative effect of CYP2D6 genotype and

inhibitors on tamoxifen metabolism: Implication for optimization of breast cancer treatment.

Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2006;80(1):61-74.

10. Irvin WJ, Jr, Walko CM, Weck KE, Ibrahim JG, Chiu WK, Dees EC, Moore SG, Olajide OA,

Graham ML, Canale ST, Raab RE, Corso SW, Peppercorn JM, Anderson SM, Friedman KJ,

Ogburn ET, Desta Z, Flockhart DA, McLeod HL, Evans JP, Carey LA. Genotype-Guided

Tamoxifen Dosing Increases Active Metabolite Exposure in Women With Reduced CYP2D6

Metabolism: A Multicenter Study. Journal of Clinical Oncology. 2011;29(24):3232-3239.

11. Kiyotani K, Mushiroda T, Nakamura Y, Zembutsu H. Pharmacogenomics of Tamoxifen: Roles of

Drug Metabolizing Enzymes and Transporters. Drug Metabolism and Pharmacokinetics.

2012;27(1):122-131.

12. Teunissen SF, Rosing H, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH. Bioanalytical methods for

determination of tamoxifen and its phase I metabolites: A review. Analytica Chimica Acta.

2010;683(1):21-37.

13. Binkhorst L, Mathijssen RHJ, Moghaddam-Helmentel IMG, de Bruijn P, van Gelder T, Wiemer

EAC, Loos WJ. Quantification of tamoxifen and three of its phase-I metabolitesin human plasma

by liquid chromatography/triple-quadrupole mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis. 2011;56(5):1016-1023.

14. Teunissen SF, Jager NGL, Rosing H, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH. Development and

validation of a quantitative assay for the determination of tamoxifen and its five main phase I

metabolites in human serum using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.

Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences.

2011;879(19):1677-1685.

15. Lee KH, Ward BA, Desta Z, Flockhart DA, Jones DR. Quantification of tamoxifen and three

metabolites in plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection:

application to a clinical trial. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the

Biomedical and Life Sciences. 2003;791(1-2):245-253.

16. Gjerde J, Kisanga ER, Hauglid M, Holm PI, Mellgren G, Lien EA. Identification and quantification

of tamoxifen and four metabolites in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Journal of Chromatography A. 2005;1082(1):6-14.

http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=web&cd=5&ved=0CD8QFjAE&url=http%3A%2F%2F195.130.154.23%2Furlnotices%2Flid%2Flid.aspx%3FsLID%3D20740%26sUID%3D2ZP8SQ55&ei=dACdUKGkC8nW0QW__YHIDg&usg=AFQjCNE_bADGMgYdrSrzCopGVKRnie95ww&sig2=fVlngBMANT4WYETab23_Gg




49

17. Mihailescu R, Aboul-Enein HY, Efstatide MD. Identification of tamoxifen and metabolites in

human male urine by GC/MS. Biomedical Chromatography. 2000;14(3):180-183.

18. Higgins MJ, Stearns V. Pharmacogenetics of endocrine therapy for breast cancer. Annual Review

of Medicine. 2011;62:281-293.

19. Goetz MP, Knox SK, Suman VJ, Rae JM, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynolds C,

Couch FJ, Lingle WL, Weinshilboum RM, Fritcher EGB, Nibbe AM, Desta Z, Nguyen A,

Flockhart DA, Perez EA, Ingle JN. The impact of cytochrome P450 2D6 metabolism in women

receiving adjuvant tamoxifen. Breast Cancer Research and Treatment. 2007;101(1):113-121.

20. Goetz MP, Rae JM, Suman VJ, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynold C, Couch FJ,

Lingle WL, Flockhart DA, Desta Z, Perez EA, Ingle JN. Pharmacogenetics of tamoxifen

biotransformation is associated with clinical outcomes of efficacy and hot flashes. Journal of

Clinical Oncology. 2005;23(36):9312-9318.

21. Lipschitz C, Baars B, van den Berg J, Janssen H-G, Schoenmakers P, Tijssen R, Vonk N.

Gaschromatografie. Ten Hagen en Stam. 1996.

22. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).

23. http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/intro.htm (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).

24. http://www.maasstadziekenhuis.nl/dsresource?objectid=4241&type=org (Laatst geconsulteerd op

16/04/2013).

25. http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).

26. http://nl.wikipedia.org/wiki/solid-phase_extraction (Laatst geconsulteerd op 29/11/2012).

27. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/guidances/UC

M070107.pdf (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).

28. Cursusboek: Pieters I, De logi E, Vandekerckhove B, Van Eenoo P, Plum J, Verhofstede C. Goede

Laboratorium Praktijk. 2011.

29. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-

Laboratories/Technical_Documents/WADA_TD2004EAAS_Reporting_Evaluation_Testosterone_

Epitestosterone_TE_Ratio_EN.pdf (Laatst geconsulteerd op: 02/05/2013).

30. Van Eenoo P, Van Gansbeke W, De Brabanter N, Deventer K, Delbeke FT. A fast, comprehensive

screening method for doping agents in urine by gas chromatography-triple quadrupole mass

spectrometry. Journal of Chromatography A. 2011;1218(21):3306-3316.

31. Madlensky L, Natarajan L, Tchu S, Pu M, Mortimer J, Flatt SW, Nikoloff DM, Hillman G,

Fontecha MR, Lawrence HJ, Parker BA, Wu AHB, Pierce JP. Tamoxifen metabolite

concentrations, CYP2D6 genotype, and breast cancer outcomes. Clinical Pharmacology &

Therapeutics. 2011;89(5):718-725.

32. Van Renterghem P. Alternative steroid profiling - advances in detection of misuse with endogenous

steroids in sports.2010.

33. Cursusboek: Lefebvre RA. Farmacologie. 2011.

34. Rao N. The Clinical pharmacokinetics of escitalopram. Clinical Pharmacokinetics. 2007:46

(4):281-290.

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html

http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/intro.htm

http://www.maasstadziekenhuis.nl/dsresource?objectid=4241&type=org

http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction

http://nl.wikipedia.org/wiki/solid-phase_extraction

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/guidances/UCM070107.pdf

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/guidances/UCM070107.pdf

http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-Laboratories/Technical_Documents/WADA_TD2004EAAS_Reporting_Evaluation_Testosterone_Epitestosterone_TE_Ratio_EN.pdf



Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve methodes voor...

Documents

Transcript of Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve methodes voor...