UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Laboratorium voor Analytische ChemieAcademiejaar 2008-2009

VALIDATIE VAN EEN GC METHODE VOOR DE BEPALING VAN DI-N-OCTYLFTALAAT

Jeroen GEERAERTS

Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor

Prof. Dr. Apr. L.Thienpont

Commissarissen

Prof. Dr. B. De Spiegeleer

Dr. K. Van Uytfanghe

DANKWOORD

Graag zou ik Prof. Dr. Apr. Thienpont, Dr. Van Uytfanghe en Dr. Stöckl bedanken voor hun welgekomen begeleiding, hulp en ondersteuning bij het uitvoeren van de experimenten in het laboratorium en het schrijven

van deze masterproef.

 

 

 

 

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING 1

1.1 Achtergrond 1

1.1.1 Algemeen 1

1.1.2 Di-n-octylftalaat 2

1.2 Chemisch bekeken 3

1.3 Methodevalidatie 4

2. OBJECTIEVEN 6

3. MATERIAAL EN METHODEN 7

3.1 Apparatuur 7

3.2 Reagentia 8

3.3 Opstarten van de GC 8

3.4 Testmengsel 9

3.5 Oplossingen 11

3.6 Protocollen 14

3.7 Statistiek 15

3.8 Literatuurstudie 17

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 18

4.1 Experimenteel onderzoek 18

4.1.1 Lineariteit 18

4.1.2 Imprecisie 21

4.1.3 Terugvinding 26

4.1.4 Aantoonbaarheidsgrens 28

4.1.5 Methodevergelijking 29

4.1.6 Besluit experimenteel onderzoek 36

4.2 Literatuurstudie 36

4.2.1 Analysemethoden voor ftalaten 38

4.2.1.1 Staalvoorbereiding 38

4.2.1.2 Chromatografie en detectoren 39

4.2.2 Betekenis van ftalaten in de farmaceutische 40

context

4.2.3 Validatie van analytische methoden in het 41

domein van het milieu

5. LITERATUURLIJST 46

 

 

 

 

 

 

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

AUC: Oppervlakte onder de piek

AUCDNOP/AUCC29: Oppervlakte onder de DNOP-piek tot de oppervlakte

onder de C29-piek

C26: Hexacosaan

C28: Octacosaan

C29: Nonacosaan

CAP: Cellulose-acetatoftalaat

Chi²exp: Experimentele Chi²-waarden

Chi²krit: Kritische Chi²-waarden

CI: Betrouwbaarheidsinterval

CL: Betrouwbaarheidsgrens

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

CMA: Compendium voor Monstername en Analyse

CV: Variatiecoëfficiënt

CVBA: Binnen-analyse variatiecoëfficiënt

CVT: Totale variatiecoëfficiënt

DEHP: diëthylhexylftalaat

df: Aantal vrijheidsgraden

DNOP: Di-n-octylftalaat

GC: Gaschromatograaf

HIV: Human Immunodefficiency Virus

IMP2: Imprecisiestaal 2

IMP4: Imprecisiestaal 4

LLE: Vloeistof-vloeistof extractie

LoD: Aantoonbaarheidsgrens

LMPE: Vaste-fase microextractie

MS: Massaspectrometer

PVC: Polyvinylchloride

REC1: Terugvindingsstaal 1

REC2: Terugvindingsstaal 2

REC3: Terugvindingsstaal 3

RSCA: Resource Conservation and Recovery Act

SD: Standaarddeviatie

SDBA: Standaarddeviatie binnen analyse

SDDD: Standaarddeviatie tussen dagen

SDT: Totale standaarddeviatie

S/N: Signaal tot ruis verhouding

SE: Systemische fout

SPE: Vaste-fase extractie

SPME: Vaste-fase microextractie

SOA: Sexueel overdraagbare aandoening

TE: Totale fout

TQD: Warmtegeleidbaarheidsdetector

UCL: Bovenste grens van het betrouwbaarheidslimiet

USEPA: US Environmental protection agency

VITO: Vlaamse instelling voor technologisch onderzoek

1. INLEIDING

1.1 Achtergrond

1.1.1 Algemeen

Commerciële producten die gebruik maken van ftalaten, bestaan reeds 75

jaar. Gedurende die periode is het toepassingsgebied alsmaar groter

geworden. Van speelgoed, medische apparatuur, cosmetica, kledij tot

bouwmaterialen maar we vinden ze vooral terug als weekmaker in

polyvinylchloride (PVC). Elk jaar wordt er wereldwijd meer dan 3 miljoen

ton ftalaten geproduceerd (Schettler, 2005).

Gezien de massale en wijd verspreide aanwezigheid is er nood aan

zekerheid over hun veiligheid. En alhoewel bij hun intrede ook meteen

toxicologische studies werden uitgevoerd, zijn de zorgen over hun

negatieve effecten slechts 25 jaar oud.

Uit resultaten van een recente review blijkt nu echter, de blootstelling

eraan in rekening gehouden, dat deze totaal ongegrond zijn: “analyse van

alle beschikbare data leidt tot de conclusie dat de risico’s laag zijn, zelfs

lager dan oorspronkelijk gedacht, en dat er geen overtuigend bewijs is

van negatieve effecten op mensen” (Kamrin, 2009).

Oorspronkelijk werd de aandacht gericht op diëthylhexylftalaat (DEHP),

dat kanker zou veroorzaken in knaagdieren na een hoge, levenslange

blootstelling (Kluwe et al., 2002). En aangezien ftalaten kunnen lekken uit

plastieken voorwerpen is de vergelijking met patiënten die een intensieve

medische behandeling zoals dialyse ondergaan eenvoudig te maken. In de

loop van het volgend decennium nam de publieke aandacht voor het

onderwerp dan ook toe. Wat zijn de mogelijke effecten van

milieucontaminanten? Zijn er gevaren bij het gebruik van cosmetica? Maar

vooral, wat zijn de risico’s van bootstelling aan plastieke objecten voor

kinderen? In het bijzonder deze die veel in de mond gestopt worden.

- 1/55 -

Het Koninklijk besluit van 25 februari 1996, dat Richtlijn 2005/84/EG van

het europees parlement omzet in Belgisch recht, legt de volgende

regelgeving op:

‐ DEHP, dibutylftalaat en benzylbutylftalaat mogen niet worden

gebruikt als stoffen of als bestanddelen van preparaten in

concentraties van meer dan 0,1 % massaprocent van het week

gemaakte materiaal in speelgoed- en kinderverzorgingsartikelen.

‐ Di-isononylftalaat, di-isodecylftalaat en di-n-octylftalaat (DNOP)

mogen niet worden gebruikt als stoffen of als bestanddelen van

preparaten in concentraties van meer dan 0,1 % massaprocent van

het week gemaakte materiaal in speelgoed- en

kinderverzorgingsartikelen die door kinderen in de mond kunnen

worden gestopt.

1.1.2 Di-n-octylftalaat

Er zijn geen commerciële toepassingen voor zuiver DNOP bekend. Het

commerciële mengsel C6-C10 ftalaat bestaat voor 20% uit DNOP. Dit

mengsel heeft een brede waaier van toepassingen: PVC, vloeren,

schoenen en tuinslangen. In de voedingsindustrie komt het vooral terug in

schroefdoppen, sluitingsnaden en transportbanden. Medische apparaten

die DNOP bevatten, bestaan tot op heden nog niet. De overgang van

DNOP naar het milieu vanuit deze producten kan voorkomen gedurende

productie, gebruik of de afvalverwerking ervan aangezien het niet

gebonden is aan de plastics (Kavlock et al., 2002).

- 2/55 -

En alhoewel het Koninklijk besluit van 25 februari 1996 ook beperkingen

oplegt aan DNOP, is het bewijs daartoe verwaarloosbaar:

‐ Het is duidelijk, rekening houdend met onzekerheden en het

ontbreken van data, dat het risico van DNOP niet significant is.

(Kamrin, 2009)

‐ De zorgen over de mogelijke negatieve effecten van DNOP op

mensen zijn te verwerpen. (Kavlock et al., 2002)

Desalniettemin is een gevalideerde methode voor de bepaling van DNOP

een noodzaak aangezien controles op het naleven van de wetgeving

dienen te gebeuren.

1.2 Chemisch bekeken

De synthese van ftalaatesters, de eigenlijke weekmakers, begint bij

ftalaatanhydride dat via een alcoholyse een dubbele esterificatie

ondergaat.

Ftalaatester

C6H4(CO)2O + ROH → C6H4(CO2H)CO2R

C6H4(CO2H)CO2R + ROH C6H4(CO2R)2 + H2O

Met R=C8H17 bij de synthese van DNOP (Lorz, 2002)

- 3/55 -

Het ftalaatanhydride zelf, wordt gevormd vanuit naftaleen door oxidatie

met een mengsel van kwiksulfaat (HgSO4) en kopersulfaat (CuSO4) in de

aanwezigheid van zwavelzuur (H2SO4).

Ftalaatanhydride

Tabel 1.1: Fysicochemische eigenschappen van DNOP (Merck Index)

Chemische formule C24H38O4

Moleculair gewicht 390,54

Smeltpunt -25°C

Kookpunt 390°C

Oplosbaarheid in water Praktisch onoplosbaar (0,5 µg/l)

1.3 Methodevalidatie

Volgens de ISO 9000 norm is validatie: “een bevestiging, door het leveren

van objectief bewijs, dat de vereisten voor een specifiek bedoeld gebruik

of toepassing vervuld zijn”.

Volgens Stöckl (2007) moeten we dus:

‐ het vooropgesteld doel van de methode specifiëren

‐ de prestatievereisten definiëren

‐ een dataset aanmaken door het uitvoeren van validatie-

experimenten

‐ interpreteren en evalueren van de bekomen dataset aan de hand

van de specificaties

- 4/55 -

Bij een methodevalidatie evalueren we dus of de prestatieparameters

voldoen om een bepaald analytisch probleem op te lossen. Dit is

essentieel wanneer een nieuwe methode wordt ontwikkeld voor een

specifiek probleem, bij indicaties dat de huidige methode varieert in

functie van de tijd, wanneer er veranderingen worden aangebracht aan

een bestaande methode of gewoon om de equivalentie tussen twee

methoden aan te tonen (Chandran & Singh, 2007).

De experimenten die moeten uitgevoerd worden hangen af van de

prestatiekenmerken die we willen valideren (Stöckl, 2007). In deze

masterproef wordt hoofdzakelijk het experimenteel protocol van het

“Clinical and Laboratory Standards Institute” ofwel CLSI (Suite 1400

Wayne, PA, VS) gevolgd.

De specificaties waaraan de methode dient te voldoen worden vooraf door

de onderzoeker vastgelegd. Ze kunnen opgelegd worden door

regelgevende instanties of worden bepaald afhankelijk van het

toepassingsgebied van de methode, wat het resultaat van statistisch of

analytisch onderzoek is.

- 5/55 -

2. OBJECTIEVEN

Het hoofobjectief van deze masterproef is de methodevalidatie voor de

GC-bepaling van DNOP. Daarnaast wordt er nog een literatuuronderzoek

uitgevoerd.

Via de methodevalidatie proberen we objectief bewijs te leveren dat de

vereisten voor een specifiek bedoeld gebruik of toepassing vervuld zijn

(ISO 9000).

Het proces is onder te verdelen in 4 belangrijke stappen:

- het vooropgesteld doel van de methode specifiëren.

- de prestatievereisten definiëren.

- een dataset aanmaken door het uitvoeren van validatie-experimenten.

- interpreteren en evalueren van de bekomen dataset aan de hand van de

specificaties.

Een methodevalidatie is essentieel alvorens een analytische methode in

gebruik kan genomen worden als routinemethode. De cursus “Method

validation With Confidence” (Stöckl, 2007), werd hiervoor gebruikt als

leidraad. Hij beschrijft de verschillende prestatiekenmerken, bijhorende

protocollen, specificaties en gebruikte statistiek. De meetresultaten dienen

dan getoest te worden aan de vooropgestelde specificaties door middel

van statistische testen, waarbij de cursus “Laboratory Statistics & Grapics

with Excel®” (Stöckl, 2007) gebruikt werd als handleiding.

Het literatuuronderzoek behandelt drie thema’s die nauw aansluiten bij

het experimenteel onderzoek. Ze werden zo opgesteld dat de context van

bovenstaande methodevalidatie beter geplaatst kon worden.

- Alternatieve analysemethoden voor ftalaten

- Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context

- Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu

- 6/55 -

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1 Apparatuur

De metingen werden uitgevoerd met een gaschromatograaf (GC)

(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Het toestel beschikt over een

direct inlet, warmtegeleidbaarheidsdetector (TQD) en een methylsilicone

kolom, type DB1 (J&W Scientific, Folsom, CA, VS) met een lengte van

15m, een interne diameter van 0,53mm en een filmdikte van 1µm. De

meetresultaten werden verwerkt met het Shimadzu GC Solution-

programma.

De TQD is een vaak gebruikte detector bij gaschromatografie, die

verschillen in warmtegeleidbaarheid registreert tussen het kolomeffluens

en een referentiestroom van zuiver dragergas (hier stikstof, N2).

Aangezien de meeste verbindingen een lagere warmtegeleidbaarheid

hebben dan het doorgaans gebruikte dragergas zal, wanneer het analyt

elueert van de kolom, de warmtegeleidbaarheid dalen en een

detecteerbaar signaal produceren.

Het staal wordt op de kolom gebracht via een direct inlet systeem

waardoor de injectietechniek van groot belang is. Dit kan variatie

veroorzaken in de meetresultaten aangezien manueel werd geïnjecteerd

(splitless).

De injectie van het staal gebeurde met een microliter spuit (Hamilton,

Zwitserland). Het geïnjecteerde volume bedroeg ongeveer 0,5 µl;

onafhankelijk van het staal dat gemeten werd.

Afwegen van reagentia gebeurde op een Mettler Toledo AT261 Delta

Range balans (Greifensee, Zwitserland), met een nauwkeurigheid van

10-5g.

- 7/55 -

3.2 Reagentia

Alle reagentia (hexacosaan(C26), octacosaan(C28), nonacosaan(C29) en

DNOP) werden aangekocht via Sigma-Aldrich (Steinheim, Duitsland). Zij

hadden een zuiverheid van respectievelijk 99%; 98,5%; 99,5% en 98%.

Cyclohexaan pro analyse, gebruikt als oplosmiddel, werd aangekocht bij

Merck (Darmstadt, Duitsland) met een zuiverheid van 99,5%. Bij de

berekening van de concentraties werd hiermee telkens rekening

gehouden.

3.3 Opstarten van de GC

De opstartprocedure is kritiek voor de levensduur van de TQD en de

kwaliteit van het geproduceerde signaal. Na het aanschakelen van de GC

moet het systeem eerst volledig op temperatuur gebracht worden.

Ondertussen is de detectorcel gespoeld met voldoende dragergas en kan

de stroom ingeschakeld worden (45mA).

Alvorens de metingen kunnen beginnen, moeten we zeker zijn dat het

systeem geen afwijkingen vertoont. Om dit te garanderen werden er 2

controlestappen ingebouwd. De ruis van de basislijn mag niet groter zijn

dan 3µV en het interval ervan over een tijdspanne van 5 minuten niet

meer dan 10µV; dit om na te kijken of de basislijn (en dus het signaal van

de detector) wel stabiel is. Als laatste stap van de systeemcontrole, wordt

nog een testmengsel gemeten (zie 3.4 Testmengsel).

In Tabel 3.1 staan alle instellingen van het Shimadzu GC Real Time-

programma, waarmee alle metingen werden uitgevoerd, samengevat.

- 8/55 -

Tabel 3.1 Instellingen van het GC Real Time-programma

Referentiegas N2

Debiet 15 ml/min

Injector Temperatuur 290,0°C

Rate Flow Hold Time

- 20,0 ml/min 0,00 min

4,00 min 22,0 ml/min 0,00 min

-0,71min 20,0 ml/min 0,02 min

Kolom Temperatuur 238,0°C

Detector Temperatuur 260°C

3.4 Testmengsel

Nog voor het aanvatten van de experimenten moet eerst een testmengsel

aangemaakt worden. Deze cyclohexaanoplossing met C26 en C28 is

representatief (inzake concentratie, retentietijd en chemische structuur)

voor de experimentele stalen met DNOP en C29, en dus ook voor de

metingen hiermee. Het Shimadzu GC Postrun-programma berekent de

eigenschappen zoals retentietijd, resolutie en oppervlakte van de gemeten

chromatogrammen. Via herhaalde metingen van het testmengsel kunnen

we voor elke van deze eigenschappen aanvaardingslimieten opstellen, die

werden samengevat in Tabel 3.2. Deze worden dan elke dag vergeleken

met de resultaten van het testmengsel.

- 9/55 -

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

uV(x100)

Chromatogram

Figuur 3.1: Voorbeeldchromatogram van het testmengsel

Tabel 3.2 Aanvaardingslimieten voor het testmengsel

Resolutie Minimum 3,5

Retentie Tijd (min) C26

C28

2,8 +/- 0,2

4,9 +/- 0,2

Oppervlakte Minimum 1000

Hoogte Minimum 100

Theoretisch Aantal

Platen

C26

C28

Minimum 500

Minimum 750

Tailing Factor C26

C28

Maximum 1,35

Maximum 1,25

k’ C26

C28

Minimum 7,5

Minimum 9,0

- 10/55 -

Bereiding van het testmengsel: 5,11mg C26 en 6,20mg C28 werd

opgelost in 2,1ml cyclohexaan.

3.5 Oplossingen

Alle DNOP-oplossingen werden gemaakt in een 2,496 mg/ml interne

standaardoplossing. Deze werd aangemaakt door 250,90mg C29 af te

wegen in 100ml cyclohexaan.

Een eerste stockoplossing, met hoge concentratie, werd aangemaakt door

122,76mg DNOP op te lossen in 50ml (2,406 mg/ml). De tweede

stockoplossing, met lage concentratie, is een 1 op 10 verdunning van de

eerste stockoplossing (0,241 mg/ml).

Tabel 3.3 geeft een overzicht van de stalen gebruikt in de experimenten.

Alle aangemaakte stalen, reeds voor beide stockoplossingen, werden

onderverdeeld in kleine vials om contaminatie na veelvuldig gebruik of bij

het aanmaken van verschillende stalen te vermijden.

Tabel 3.3: Concentratie van de stalen per experiment

EXPERIMENT STAAL CONCENTRATIE

Lineariteit Stockoplossing 1 2,406 mg/ml

Stockoplossing 2 0,241 mg/ml

Imprecisie IMP2 0,782 mg/ml

IMP4 1,865 mg/ml

Terugvinding REC1 0,818 mg/ml

REC2 1,330 mg/ml

REC3 1,837 mg/ml

Aantoonbaarheidsgrens Tussenverdunning 0,498 mg/ml

- 11/55 -

Voor het lineariteitsexperiment werd een standaardreeks gemaakt vanuit

stockoplossing 1 en 2 welke overeenkomen met respectievelijk standaard

5 en 1. Tabel 3.4 beschrijft het gebruikte mengprotocol.

Tabel 3.4: Mengprotocol lineariteit model 1, CLSI EP-6

STAAL #delen

stockoplossing 1

#delen

stockoplossing 2

Concentratie

DNOP

Standaard 1 1 - 0,241 mg/ml

Standaard 2 3 1 0,782 mg/ml

Standaard 3 2 2 1,324 mg/ml

Standaard 4 1 3 1,865 mg/ml

Standaard 5 - 1 2,406 mg/ml

De standaardreeks werd eenmaal voor en eenmaal na een experiment

gemeten. Eventuele variaties van de meetomstandigheden werden zo

gecompenseerd aangezien de standaardreeks hieraan ook onderhevig is.

Elke meetwaarde, met uitzondering van deze voor het

aantoonbaarheidsexperiment, wordt weergegeven als de verhouding van

de oppervlakte onder de piek (AUC) van DNOP tot de oppervlakte onder

de piek van de interne standaard (AUCDNOP/AUCC29).

Voor elke standaard werd het gemiddelde van AUCDNOP/AUCC29 uitgezet in

functie van de concentratie. Een passende trendlijn werd door de punten

getrokken. De keuze tussen een 1e of 2e orde regressiemodel wordt

bepaald naargelang de uitkomst van het lineariteitsexperiment. Door het

invullen van de AUCDNOP/AUCC29 van een gemeten staal in de inverse

vergelijking van de trendlijn, kan de concentratie berekend worden.

- 12/55 -

De 2 stalen van het imprecisie-experiment IMP2 en IMP4 zijn dezelfde als

standaard 2 en 4. Ze werden aangemaakt volgens het mengprotocol van

de standaardreeks hierboven beschreven, doch aangemaakt uit aparte

vials van beide stockoplossingen.

Voor het terugvindingsexperiment werden de stalen (REC1, REC2 en

REC3) met gekende concentratie aan DNOP gemeten, deze bedroegen

respectievelijk 0,818 mg/ml; 1,330 mg/ml en 1,837 mg/ml.

De stalen voor het aantoonbaarheidsexperiment werden dagelijks vers

aangemaakt. Ze werden bereid als een 1 op 8 tussenverdunning van een

0,498 mg/ml oplossing (0,241mg DNOP in 5ml interne

standaardoplossing).

De aantoonbaarheidsgrens (LoD) wordt hier berekend aan de hand van

het laag geconcentreerd staal met een signaal tot ruis verhouding (S/N)

van ongeveer 6 (lagere verhoudingen zijn slecht te onderscheiden van de

basislijn).

Van elk chromatogram werd de S/N telkens manueel bepaald zoals

geïllustreerd in Figuur 3.2. Vervolgens werd de concentratie berekend die

correspondeert met een S/N van 3. Hiertoe werd in het voorbeeld de

concentratie van het gemeten staal, met signaal 6 en ruis 1, gehalveerd.

Via de berekening van de standaarddeviatie kan dan ook de LoD bepaald

worden.

- 13/55 -

1.2uV(x10)

Figuur 3.2: Manueel bepalen van de signaal tot ruis verhouding

3.6 Protocollen

Het uitvoeren van de experimenten gebeurde volgens verschillende

protocollen, deze staan in Tabel 3.5 samengevat met bijhorende

specificaties.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

Chromatogram Signaal/Ruis=6

Ruis=0,9

Signaal=5,4

- 14/55 -

Tabel 3.5: Gehanteerde protocollen en specificaties per experiment

PROTOCOL SPECIFICATIES

Lineariteit CLSI EP6

Model 1

- 5 concentraties

- Reeks 4 maal meten

binnen 1 serie

- Metingen in

verschillende volgorde

- Afwijking van

lineariteit<5%

- Regressieanalyse (2e

orde)

Imprecisie CLSI EP5

- 2 concentraties

- Metingen in duplicaat

- 20 dagen

- Binnen-analyse

variatiecoëfficiënt

CVBA=1,5%

- Totale

variatiecoëfficiënt

CVT=3%

Terugvinding - 5 concentraties

- 5 dagen

- Relatieve terugvinding

<5%

Aantoonbaarheidsgrens - 20 metingen

- Staal met S/N~6 LoD <0,030 mg/ml

Methodevergelijking CLSI EP9

- Minstens 40 stalen

- In duplicaat

- 1/meerdere dagen

- Systematische fout

SE<2,2%

- Totale fout TE<6,9%

3.7 Statistiek

De data werden statistisch verwerkt in Microsoft Office Excel (2000,

Microsoft Corporation, Verenigde Staten) met behulp van het “Data

analysis toolpack”. De statische testen stonden voorgeprogrammeerd in

het Methval templaat, opgemaakt door Dr. Stöckl (STT Consulting).

Het Methval templaat werd verder verduidelijkt in de cursussen

“Laboratory Statistics & Grapics with Excel®” (Stöckl, 2007) en “Method

validation With Confidence” (Stöckl, 2007). Alle data werden

gecontroleerd op uitschieters met de Grubb’s-test, die werd geïntegreerd

in een Microsoft Office Excel templaat door Dr. Stöckl. - 15/55 -

Een tweedegraads-polynomiale regressieanalyse werd bij het

lineariteitsexperiment uitgevoerd met het programma CB Stat (versie 5.1,

K.Linnet & Riskov, Denemarken). Een overzicht van de gebruikte statistiek

per experiment werd samengevat in Tabel 3.6.

Tabel 3.6: Gebruikte statische testen per experiment

EXPERIMENT STATISTISCHE TEST*

Lineariteit Tweedegraads-polynomiale,

Regressieanalyse

Imprecisie Eenzijdige F-test (Chi²-test)

ANOVA

Terugvinding CL van het gemiddelde

Aantoonbaarheidsgrens CL van het 3SD-centiel

Methodevergelijking Regressieanalyse, Bland & Altman

Met: *alle datasets werden gecontroleerd op uitschieters met de Grubb’s-

test

- 16/55 -

3.8 Literatuurstudie

In de literatuurstudie werden drie thema’s verder gedocumenteerd:

‐ Analysemethoden voor ftalaten

‐ Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context

‐ Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu

De eindresultaten hiervan werden verder besproken in het hoofdstuk 4

“Resultaten en discussie”. Naargelang het soort informatie dat gezocht

werd, konden we 4 werkwijzen onderscheiden:

‐ Algemeen: Google (www.google.com)

‐ Wetenschappelijk: Electronische databanken zoals Web of Science

en Pubmed, ter beschikking gesteld door de Universiteit Gent

‐ Regelgeving en richtlijnen: Europese Unie (www.europa.eu), VITO

(www.vito.be), USEPA (www.epa.gov), ...

‐ Chemisch: De Merck index

- 17/55 -

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE

Alle meetresultaten worden weergegeven als AUCDNOP/AUCC29. C26, C28

en C29 werden getest als interne standaard. C29 werd gekozen aangezien

de retentietijd van de C29-piek het beste lag tegenover die van DNOP. Te

dicht zou voor interferentie kunnen zorgen, te ver zou onze meettijd

onnodig langer maken.

7.5

uV(x100)

Figuur 4.1: Chromatogram van C29 en DNOP

4.1 Experimenteel onderzoek

4.1.1 Lineariteit

Om de lineariteit te onderzoeken werd de AUCDNOP/AUCIS voor een

standaardreeks met 5 standaarden 4 maal in een verschillende volgorde

gemeten binnen één serie. Tabel 4.1 geeft de AUCDNOP/AUCIS voor alle

standaarden.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

Chromatogram

- 18/55 -

Alle data werden met behulp van de Grubb’s-test gecontroleerd op

uitschieters, die bleek negatief.

Tabel 4.1: Bekomen resultaten van het lineariteitsexperiment

Meting 1 Meting 2 Meting 3 Meting 4 STAAL

Concentratie

(mg/ml) AUCDNOP/AUCIS

Standaard 1 0,241 0,149 0,149 0,157 0,149

Standaard 2 0,782 0,452 0,441 0,455 0,445

Standaard 3 1,324 0,713 0,706 0,695 0,713

Standaard 4 1,865 0,922 0,930 0,933 0,931

Standaard 5 2,406 1,126 1,110 1,125 1,120

y = 0.447x + 0.0792

R2 = 0.9926

0.0

0.5

1.0

1.5

0 1 2 3-0.1

0.0

0.1

0 1 2 3

AUC D

NOP

/ A

UC IS

Concentratie (mg/ml)

AUC D

NOP

/ A

UC IS

Concentratie (mg/ml)

Figuur 4.2: Spreidingsdiagram, Figuur 4.3: Residuediagram, data lineariteitsexperiment verschil tussen data en 1e orde regressielijn

- 19/55 -

De ligging van de datapunten tegenover de 1e orde regressielijn (Figuur

4.2) doen een niet-lineair verband vermoeden. De middelste 3 punten

liggen boven de curve en de 2 buitenste eronder, een 2e orde vergelijking

zou de punten beter bevatten. Het feit dat de residuen (Figuur 4.3) een U-

vormig verloop vertonen staaft dit vermoeden.

De statistische software CB Stat werd aangewend om de data te

verwerken via een tweedegraads polynomiale regressieanalyse. We

maken hier dus de afweging tussen het lineair en het tweedegraads

model. De bekomen resultaten met bijhorende verschillen staan hieronder

samengevat in Tabel 4.2. Hierbij wordt getest of de X²-coëfficiënt uit een

2e orde vergelijking significant verschillend is van nul.

Tabel 4.2: Verschil tussen het 1e en 2e orde regressie model

Concentratie

standaard

(mg/ml)

Gemeten

gemiddeldea

Voorspelling

via 1e orde

regressieb

Voorspelling

via 2e orde

regressiec

Verschil

(c-b)

%Verschil

(c-b)

0,241 0,151 0,187 0,152 -0,035 -18,845

0,782 0,448 0,429 0,446 0,018 4,109

1,342 0,706 0,671 0,706 0,035 5,253

1,865 0,929 0,913 0,930 0,018 1,929

2,406 1,120 1,155 1,119 -0,035 -3,052

Tabel 4.3: Resultaat t-test voor de X²-coëfficiënt

Standaard fout van de X²-coëfficiënt 0,0026

t-waarde -21,8661 P 0

Tabel 4.2 toont aan dat het gemiddelde beter aansluit bij de voorspelling

via een 2e orde regressie dan bij die van een 1e orde regressie (c-a>b-a).

Tabel 4.3 staaft dit vermoeden statistisch: de t-test toont aan dat de X²-

coëfficiënt significant verschillend is van nul (P=0). Onze ijklijn zal dus

- 20/55 -

een 2e orde functie zijn aangezien de X²-component niet wegvalt uit de

vergelijking.

Men kan nu afwegen of de afwijking tegenover 1e orde regressie

verwaarloosbaar is en dus toch een lineair verband mag gebruiken; dit

zou het verwerken van data op basis van een kalibratiecurve

vereenvoudigen. Er werd een maximale afwijking van 5% vooropgesteld.

In Tabel 4.2 zien we dat 2 van de 5 concentraties de specificatie van 5%

overschrijden (Figuur 4.4).

- - - - - - 5% limiet, verschil (%) tussen het 1e en 2e orde regressiemodel

Figuur 4.4: Absoluut verschil tussen 1e en 2e orde regressie model

Er is statistisch bewijs geleverd dat de verhouding tussen de

concentratiestaal en AUCDNOP/AUCIS van niet-lineaire aard is. Bij herhaling

van dit lineariteitsexperiment werden deze resultaten bevestigd.

4.1.2 Imprecisie

Voor het imprecisie-experiment worden 2 stalen, IMP2 en IMP4,

gedurende 20 dagen in duplicaat gemeten. Als specificaties gelden een

binnen-analyse variatiecoëfficiënt (CVBA) van 1,5% en een totale

- 21/55 -

variatiecoëfficiënt (CVT) van 3,0%. Tabel 4.4 vat de resultaten samen, die

vergeleken worden met de specificaties via een Chi²-test.

Tabel 4.4: Resultaten van het imprecisie-experiment

STAAL IMP2 (0,782 mg/ml) IMP4 (1,865 mg/ml)

Meting 1 Meting 2 Meting 1 Meting 2

DAG AUCDNOP/AUCIS

1 0,784 0,789 1,88 1,90

2 0,796 0,804 1,94 1,86

3 0,814 0,785 1,87 1,80

4 0,785 0,787 1,87 1,87

5 0,779 0,773 1,94 1,94

6 0,780 0,769 1,89 1,87

7 0,784 0,780 1,90 1,91

8 0,772 0,808 1,91 1,95

9 0,785 0,802 2,04 1,91

10 0,820 0,798 1,88 1,88

11 0,815 0,791 1,95 1,93

12 0,774 0,756 1,95 1,89

13 0,797 0,816 1,91 1,88

14 0,769 0,776 1,89 1,93

15 0,786 0,774 1,91 1,93

16 0,791 0,796 1,92 1,92

17 0,788 0,785 1,90 1,91

18 0,773 0,780 1,86 1,85

19 0,775 0,770 1,88 1,85

20 0,786 0,794 1,94 1,91

- 22/55 -

De gemiddelden van de duplicaten voor IMP2 (Figuur 4.5) geven mooi

verdeelde meetresultaten. Volgens het CLSI-protocol (een uitschieter is

een waarde die meer dan 4SD verwijderd is van het gemiddelde) is er

geen uitschieter aanwezig, een Grubbs-test bevestigt dit. Bij het verschil

tussen de duplicaten (Figuur 4.6) bleek de Grubbs-test eveneens negatief.

0.7

0.8

0.9

Gemiddelde

Con

cent

ratie

(mg/

ml)

-0.1

0.0

0.1

1

∆(meting1-meting2)

Con

cent

ratie

(mg/

ml)

Figuur 4.5: Puntdiagram van de Figuur 4.6: Puntdiagram van

gemiddelden van de duplicaten verschil tussen de duplicaten

voor IMP2 voor IMP2

Figuur 4.7, die de gemiddelden van de duplicaten voor IMP4 weergeeft,

geeft een symmetrisch verdeeld puntendiagram rond de doelwaarde van

1,865 mg/ml. Zowel het CLSI protocol als de Grubb’s-test bevestigen dat

er geen uitschieters zijn. Ook voor het verschil tussen de duplicaten

(Figuur 4.8) wordt geen uitschieter gevonden (Grubb’s-Test).

- 23/55 -

Uit de data werden voor IMP2 en IMP4 de standaarddeviatie binnen

analyse (SDBA), de standaarddeviatie tussen dagen (SDDD), de totale

standaarddeviatie berekend (SDT), de binnen analyse variatiecoëfficiënt

(CVBA) en de totale variatiecoëfficiënt (CVT) berekend (Tabel 4.5).

1.7

1.8

1.8

1.9

1.9

2.0

2.0

2.1

2.1

Con

cent

ratie

(mg/

ml)

Gemiddelde   

-0.2

-0.1

0.1

0.2

1

∆(meting1-meting2)C

once

ntra

tie (m

g/m

l) 

Figuur 4.7: Puntdiagram van de Figuur 4.8: Puntdiagram van

gemiddelden van de duplicaten verschil tussen de duplicaten

voor IMP4 voor IMP4 

Tabel 4.5 vergelijkt de resultaten met de specificaties. Via een Chi²-test

wordt geverifiëerd of aan de specificaties voldaan is.

Chi²exp=(SD²exp*df)/SD²claim (Formule 4.1)

Met df: het aantal vrijheidsgraden

SD²exp: hier SD²BA of SD²T, afhankelijk van de berekening

SD²claim= CVspecificatie*(doel/100)

Via Formule 4.1 wordt de onderste grens van het eenzijdige 95%

betrouwsbaarheidsinterval van de Chi²-verdeling voor de experimentele

- 24/55 -

waarden berekend. Vervolgens wordt in het Methval templaat de kritische

Chi²-waarde berekend.

Tabel 4.5: Resultaten van de berekeningen uitgevoerd op de

imprecisiedata

STAAL IMP2 IMP4

SDBA (mg/ml) 0,011 0,031

SDDD (mg/ml) 0,009 0,021

SDT (mg/ml) 0,015 0,038

Experimenteel Specificatie Experimenteel Specificatie

CVBA (%) 1,4 1,5 1,7 1,5

CVT (%) 1,8 3,0 2,0 3,0

Chi²exp Chi²krit Chi²exp Chi²krit

Binnen-analyse 17,0 31,4 23,4 31,4

Totaal 12,1 46,2 16,0 37,4

Voor IMP2 zijn zowel de CVBA als de CVT kleiner dan de specificatie. De

CVBA voor IMP4 is groter dan zijn specificatie, waar de CVT dan weer onder

blijft.

Zowel voor het binnen-analyse als het totale imprecisie-experiment zijn de

experimentele Chi²-waarden lager dan de kritische. We kunnen nu

besluiten dat de experimenteel bepaalde variatiecoëfficiënten voor IMP2

en IMP4 voldoen aan de specificaties.

- 25/55 -

4.1.3 Terugvinding

Bij het terugvindingsexperiment worden 5 stalen respectievelijk IMP2,

IMP4, REC1, REC2 en REC3 gedurende 5 dagen gemeten.

Tabel 4.6: Resultaten van het terugvindingsexperiment

Concentratie (mg/ml)

Staal Meting 1 Meting 2 Meting 3 Meting 4 Meting 5

IMP2 0,779 0,780 0,784 0,808 0,798

IMP4 1,944 1,887 1,903 1,910 1,882

REC1 0,822 0,839 0,811 0,838 0,835

REC2 1,359 1,315 1,362 1,362 1,343

REC3 1,837 1,893 1,877 1,911 1,867

-0.05

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

IMP 2 IMP 4 REC 1 REC 2 REC 3

Con

cent

ratie

(mg/

ml)

Figuur 4.9: Puntdiagram, verschil tussen de meetresultaten en het

gemiddelde.

- 26/55 -

De maximale afwijking tegenover het gemiddelde, van de 5 metingen per

staal die voorkomt in het puntdiagram (Figuur 4.9), is 0,04 mg/ml met

daarbij een gelijkmatige verdeling van zowel positieve als negatieve

waarden. De Grubb’s-Test bevestigt dat er geen uitschieters zijn.

Figuur 4.10 toont de procentuele terugvinding van elk staal tegenover de

doelwaarde, voorgesteld door de 100% lijn. Verder zijn ook voor elk staal

de bijhorende betrouwbaarheidslimieten weergegeven, berekend met

Formule 4.2.

CI=±t(0.1,4) × SD/√5 (Formule 4.2)

IMP 2IMP 4 REC 1 REC 2 REC 3

90

95

100

105

110

Bovenste 5% betrouwbaarheidslimiet

Onderste 5% betrouwbaarheidslimiet

Figuur 4.10: Procentuele terugvinding per staal samen met de 5%

limiet 

Alle punten liggen boven de target waarde. Geen enkele foutenvlag en

bijgevolg ook geen enkele betrouwbaarheidslimiet overschrijdt de 5%

specificatielimiet.

De methode voldoet aan de vooropgestelde specificaties en mag dus

aanvaard worden.

- 27/55 -

4.1.4 Aantoonbaarheidsgrens

De LoD wordt bepaald volgens een algemeen model waarbij een staal met

een S/N van ongeveer 6 gedurende 20 verschillende dagen eenmaal wordt

gemeten.

Tabel 4.7: Resultaten van het

aantoonbaarheidsexperiment

De meerderheid van de waarden in het puntdiagram liggen mooi

gegroepeerd, de marginale waarden zijn evenwichtig verdeeld aan beide

zijden. Er is geen indicatie voor een uitschieter, de Grubb’s-test is

negatief.

Dag Concentratie

(mg/ml)

1 0,036 2 0,026 3 0,026 4 0,033 5 0,034 6 0,028 7 0,030 8 0,031 9 0,029 10 0,031 11 0,029 12 0,028 13 0,029 14 0,029 15 0,030 16 0,030 17 0,029 18 0,032 19 0,030 20 0,030

0.02

0.03

0.03

0.04

0.04

LoD

Con

cent

ratie

(mg/

ml)

Figuur 4.11: Puntdiagram

van de resultaten

- 28/55 -

De LoD is 0,0376 mg/ml, berekend met Formule 4.3. De data hebben een

gemiddelde van 0,0300 mg/ml met een SD van 0,0023 mg/ml. Daaruit

werd met behulp van Formule 4.4 de bovenste grens van het 95%

betrouwbaarheidsinterval rond het gemiddelde (UCL) bepaald (0,0390

mg/ml).

LoD=Gemiddelde + 3.3×SD (Formule 4.3)

UCL=Gemiddelde + t(0.1,19)*SD/√(n) (Formule 4.4)

De UCL (0,0390 mg/ml) ligt boven de specificatie van 0,0300 mg/ml voor

de LoD, de prestatiekenmerken van de methode voldoen niet.

4.1.5 Methodevergelijking

Voor de methodevergelijking wordt een dataset gebruikt, gemeten door

Dr. K. Van Uytfanghe. De bepaling van DNOP gebeurde met GC/MS als

referentiemethode en GC/TQD als routinemethode. De limieten voor de

systematische fout (SE) en totale fout (TE) zijn respectievelijk 2,2% en

6,9%.

- 29/55 -

Tabel 4.8: Opgegeven dataset voor de methodevergelijking

Referentie Routine Referentie Routine Referentie Routine Referentie Routine Concentratie DNOP (mg/ml)

3,365 3,244 8,127 9,164 13,11 13,54 16,08 15,77 3,389 3,469 8,352 8,364 13,42 13,84 16,95 16,65 4,152 4,655 8,847 9,723 13,54 13,27 17,33 15,19 4,374 4,500 9,544 10,20 13,56 11,71 17,34 15,67 4,647 4,654 9,812 9,234 13,69 13,15 17,68 17,81 4,764 4,445 9,944 10,38 13,93 15,39 17,79 18,32 4,967 5,071 10,31 11,05 14,38 14,49 17,86 20,00 5,322 5,486 10,42 10,66 14,39 14,08 18,85 21,72 5,566 5,442 10,52 10,11 14,52 14,84 18,88 18,24 5,793 6,305 10,74 11,61 14,78 14,32 19,07 19,57 6,291 6,065 11,25 10,20 14,83 14,76 19,16 18,89 6,416 6,799 11,54 10,63 14,87 15,54 19,59 18,57 6,422 5,817 12,13 13,65 14,91 16,33 19,71 17,28 6,468 6,740 12,23 11,90 14,94 14,11 19,88 19,59 6,525 6,658 12,40 11,26 14,94 16,75 19,92 19,88 6,914 6,528 12,55 12,68 14,94 14,80 20,68 20,39 7,307 6,332 12,59 14,38 15,40 16,14 20,90 20,78 7,482 7,861 12,63 11,83 15,45 15,16 21,35 21,82 7,739 7,820 12,95 12,71 15,46 14,62 21,92 23,62 7,888 7,678 13,07 12,61 15,52 14,05 21,93 22,43

Ter controle van de dataset wordt eerst een Grubb’s test uitgevoerd op de

absolute verschillen tussen routine-en referentiemethode. Aangezien deze

geen uitschieter aantoont mag de volledige dataset gebruikt worden voor

verdere berekeningen.

Het gemiddeld verschil, zowel absoluut als relatief, wordt samen met het

95% betrouwbaarheidsinterval (CI) voor dataset berekend (Formule 4.5).

Het CI van het 1,96SD centiel werd berekend met Formule 4.6.

CI(gemiddelde)=±t(0.1,79) × SDverschil/√(80) (Formule 4.5)

CI(1.96SD centiel)=±t(0.1,79)×√[(SD²/80) + (1.96²×SD²/2×80)]

=1.71 × CI(gemiddelde) (Formule 4.6)

- 30/55 -

Tabel 4.9: Samenvatting van alle statistische berekeningen uitgevoerd op

de dataset voor methodevergelijking

GemiddeldeReferentie 12,61 Eenzijdig 95% betrouwbaarheidsinterval

GemiddeldeRoutine 12,64 Plus CI Min CI CI

Gemiddeld verschil (%) 0,35 1,60 -0,90 1,251

1,96*CVverschil 13,17

Gemiddelde+1,96*CVverschil 13,53 15,66 11,39 2,139

Gemiddelde-1,96*CVverschil -12,82 -10,68 -14,96

Tabel 4.9 vat de resultaten samen. De absolute waarden voor het

gemiddeld verschil (%) en bijhorende betrouwbaarheidsinterval, die

representatief zijn voor de SE, vallen binnen diens limiet van 2,2%. De TE

wordt vergeleken met het 1,96CVverschil en zijn betrouwbaarheidsinterval,

er is een 6,9% limiet gesteld. De absolute waarden uit Tabel 4.9 geven

aan dat hieraan niet voldaan wordt, visueel wordt dit bevestigd door

Figuur 4.12.

- 31/55 -

De routinemethode voor de bepaling van glucose wordt niet geschikt

bevonden op basis van de Bland & Altman plot.

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

0 5 10 15 20 25

GC/MS (mg/ml)

Mean Diff. ±1,96 CVdiff. ±95% CL's

SE limit TE limit

Rou

tine

- GC

/TQ

D

Figuur 4.12: Bland & Altman plot, gemiddeld verschil (%) tussen de

routine-en referentiemethode

Bijkomend werden de data geëvalueerd via regressieanalyse. Hierbij

worden de routinedata uitgezet tegenover de referentiedata. Zijn beide

methoden vergelijkbaar dan zal de trendlijn lineair zijn en een helling en

intercept hebben die 1 en 0 benaderen. De minimale en maximale X-

waarde, respectievelijk de voorspelde Y-waarde en

betrouwbaarheidslimieten werden berekend en samengevat in Tabel 4.10

en Tabel 4.11.

- 32/55 -

Tabel 4.10: Resultaten van de regressieanalyse op basis van de maximale

X-waarde

Minimum

X

Voorspelde

Y

CI

(Trendlijn)

Limiet

SE=2,2%

Voorspelde

Y+CL

Voorspelde

Y-CL

3,365 3,420 0,354 3,774 3,066

Δ(%) SE 12,154 -8,896

Minimum

Y

CI

(Punt)

Limiet

TE=6,9%

Voorspelde

Y+CL

Berekende

Y-CL

3,244 1,564 4,984 1,857

Δ(%) TE 48,091 -44,833

Tabel 4.11: Resultaten van de regressieanalyse op basis van de minimale

X-waarde

Maximum

X

Voorspelde

Y

CI

(Trendlijn)

Limiet

SE=2,2%

Voorspelde

Y+CL

Voorspelde

Y-CL

21,925 21,916 0,356 22,272 21,560

Δ(%) SE 1,584 -1,664

Maximum

Y

CI

(Punt)

Limiet

TE=6.9%

Voorspelde

Y+CL

Voorspelde

Y-CL

23,924 1,564 23,480 20,352

Δ(%) TE 7,093 -7,173

De berekende betrouwbaarheidslimieten voor de minimale X-waarde

overschrijden, zowel voor de SE als de TE, ruim de vooropgestelde

specificaties. De specificaties voor de betrouwbaarheidslimieten bij de

maximale X-waarde worden voor de SE gehaald, echter niet voor de TE.

- 33/55 -

De afwijkingen tegenover de SE en TE zijn groter bij de minimale X-

waarde dan bij de maximale X-waarde. Het uitgebreide interval tussen de

lage en hoge meetwaarden zorgt er mee voor dat de procentuele afwijking

van de minimale X-waarde (=een referentiewaarde) tegenover de

betrouwbaarheidslimieten van de voorspelde Y-waarde (=op basis van de

bekomen regressielijn) groter zal zijn.

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

0 5 10 15 20 25Referentie (mgl/ml)

Res

idua

ls (m

g/m

l)

Figuur 4.13: Residueplot, absoluut verschil tussen de referentie-en

routinemethode 

Op Figuur 4.13 is duidelijk een trechtervormige curve te zien. De SD is

niet constant en wordt groter bij een stijgende concentratie, een

concentratieafhankelijke fout.

- 34/55 -

De eindconclusie voor de methodevalidatie zal getrokken worden op basis

van de regressieanalyse aangezien een concentratieafhankelijke fout werd

vastgesteld en de Bland & Altman plot dan best wordt vermeden.

y = 0.9966x + 0.0664R2 = 0.969

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25Referentie (mg/ml)

TE Linear (Data)

Rou

tine

(mg/

ml)

 

Figuur 4.14: Regressieanalyse 

De specificaties voor de betrouwbaarheidslimieten bij de maximale X-

waarde worden voor de SE als enige gehaald. We vinden de getestte

routinemethode dus ongeschikt aangezien 3 van de 4 controlepunten de

limiet overschreden.

- 35/55 -

4.1.6 Besluit experimenteel onderzoek

Tabel 4.12: Resultaten methodevalidatie

EXPERIMENT SPECIFICATIE

Lineariteit NIET VOLDAAN

Imprecisie VOLDAAN

Terugvinding VOLDAAN

Aantoonbaarheidsgrens NIET VOLDAAN

Methodevergelijking NIET VOLDAAN

De resultaten van de uitgevoerde experimenten werden samengevat in

Tabel 4.12. Het imprecisie-experiment en het terugvindingsexperiment

voldoen aan hun vooropgestelde specificatie. Bij het lineariteits-

experiment, de aantoonbaarheidsgrens en de methodevergelijking werd

deze niet gehaald. Aangezien 3 van de 5 experimenten de specificatie

overschreden, voldoet de methode hieraan ook niet. Bijgevolg wordt de

methode niet geschikt bevonden voor de bepaling van DNOP.

4.2 Literatuurstudie

Het uitvoeren van een literatuurstudie heeft de bedoeling bekwaamheid

bij te brengen in het zoeken naar specifieke informatie. De gehanteerde

techniek vereist de juiste vraagstelling, het gebruik van de goede

trefwoorden en een kritische houding tegenover de verworven informatie.

De studie heeft als doel het onderwerp van deze masterproef in een

breder perspectief te bekijken. Het opzoeken van alternatieve

analysemethoden voor ftalaten en het gebruik van ftalaten in de

farmaceutische industrie sluiten als thema rechtstreeks aan bij het

onderwerp van de masterproef. Het derde thema handelt over de validatie

van analytische methoden in het domein van het milieu.

- 36/55 -

Tabel 4.13: Voorbeelden van gehanteerde zoektermen, werkwijzen,

gebruikte limieten en het aantal resultaten.

Database Title And Title AND Topic Refine Results

Phthalate Validation 5

Phthalate Method 48

Phthalate Review 45

Phthalate Analysis 98

Phthalate Solid Phase Extraction

66

Phthalate Determination 148

Phthalate Method Validation 9

Phthalate GC 9

Phthalate MS 16

Phthalate LC 9

Phthalate Packaging 18

Phthalate Pharmaceutical 20

Phthalate Excipiënt 8

Phthalate Use 30

Phthalate Environment 101

Phthalate Environment Review 5

Phthalate Detector 27

Plasticizer Biodegradation 16

Plasticizer Phthalate 186

Di-n-octyl phthalate 73

Di-n-octyl phthalate Review 4

"Method Validation" 304

"Method Validation" Review 10

"Method Validation" Guidelines 32

Protocol "Method Validation" 17

Method Validation Environmental 44

Web Of Science

Validation Guidelines Analytical Methods 19

"Method Validation" Environment 6 IUPAC

"Method Validation" Procedures 13

Phthalate Guidelines 4 Google Scholar

Phthalate Method OR Validation 89

http://europa.eu/index_nl.htm Ftalaten 58

- 37/55 -

4.2.1 Analysemethoden voor ftalaten

4.2.1.1 Staalvoorbereiding

“Een groot probleem in de analyse van milieustalen is de vermindering

van achtergrond contaminatie tot op een lager niveau dan meestal

aanwezig in de stalen (parts per billion). Dit probleem stelt zich meer bij

ftalaten dan bij andere verontreinigende stoffen aangezien ftalaten

aanwezig zijn in bijna alle materiaal en reagentia die gebruikt worden in

een laboratorium” (Fatoki & Noma, 2000).

Er moet veel aandacht besteed worden aan de preventie van contaminatie

van stalen, wat het grootste probleem is bij ftalaatanalyse (Aries et al.,

2004).

LLE (vloeistof-vloeistof extractie) en SPE (vaste-fase extractie) worden

algemeen toegepast voor de bepaling van ftalaten in waterige stalen. Het

USEPA heeft reeds verschillende technieken gepubliceerd voor de bepaling

van ftalaten in afvalwater gebaseerd op deze technieken. Doch zijn deze

methoden duur, tijdrovend en bevorderen ze contaminatierisico’s. De

laatste jaren echter heeft SPME (vaste-fase microextractie) aan belang

gewonnen voor de analyse van semivluchtige componenten, alsook

ftalaten. Deze techniek is een goed alternatief voor de bepaling van

ftalaten in waterige stalen aangezien het risico op contaminatie significant

kan beperkt worden tijdens de staal bewerking (Polo et al., 2005).

SPME is een eenvoudige, snelle en efficiënte staalvoorbereidingstechniek,

die bovendien zonder solvent werkt en toelaat om ftalaatesters te bepalen

bij lage concentraties. Recent gaat ook meer aandacht naar LPME

(vloeistof-fase microextractie) dankzij de goedkope apparatuur, praktisch

elimineren van solventen en combinatie van extractie, aanconcentreren en

staalintroductie in één stap (Pei Liang et al., 2008).

- 38/55 -

4.2.1.2 Chromatografie en detectoren

Uit de gevonden literatuur kunnen we afleiden dat staalvoorbereiding de

belangrijkste stap is bij de bepaling van ftalaten, voor de scheiding en

detectie ervan komen steeds dezelfde technieken terug. Op de site van

het USEPA worden 2 werkingswijzen voorgesteld: methode 8061A, die

beschrijft de bepaling van ftalaten via gaschromatografie gekoppeld aan

een electron capture detector en methode 606 die ook met

gaschromatografie werkt echter met een massaspectrometer als detector.

Tijdens mijn literatuuronderzoek heb ik geen documentatie teruggevonden

over dewelke nu de ideale techniek is voor de bepaling van ftalaten. De

verschillende artikels overlopend, kwamen dezelfde methoden echter

constant terug. Scheiding gebeurt via gas-of vloeistofchromatografie,

hieronder staan voor elke techniek de meest voorkomende detectoren.

Gaschromatografie met als detector:

- Massaspectrometer: Peñalver et al. (2000), Del Carlo et al. (2008),

Farahani et al. (2007), Ballesteros et al. (2006), Cortazar et al.

(2002), Mohamed & Amar( 2008), USEPA methode 606

- Electron capture detector: Prokupkovád et al. (2002), USEPA

methode 8061A

- Vlamionisatiedetector: Jing Xu et al. (2007)

(Hoge druk) vloeistofchromatografie met als detector:

- UV detector: Pei Liang et al. (2008), Cai et al. (2003)

- Tandem massaspectrometer: Mortensen et al.(2005), Silva et al.

(2007)

- 39/55 -

4.2.2 Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context?

Ftalaten worden vooral als weekmakers gebruikt, dus ook in medische

materialen zoals verpakkingen, buisjes en apparaten. Daarnaast werd

opgezocht waar ftalaten dienen als excipiënt of zelfs als actief ingrediënt

(Remon, 2001).

Enterische omhulling werd als enige toepassing in farmaceutische

bereidingen teruggevonden, als bescherming van sommige

geneesmiddelen tegen de zure pH in de maag of de afbraak ervan door

maagenzymen. Anderzijds kan het irriterende geneesmiddelen ook

verhinderen de maagwand aan te tasten. Een filmcoating maakt dat de

capsulewand maagsapresistent is, waardoor deze pas oplost in de dunne

darm en daar kan geresorbeerd worden.

De filmomhullingsmiddelen bestaan voornamelijk uit polymeren naast

pigmenten, weekmakers en viscositeitsverhogers. In de practicumcursus

(Remon, 2001) worden twee componenten vermeld die ftalaten bevatten.

- Cellulose-acetoftalaat (CAP): een cellulosepolymeer waarvan de

hydroxylfuncties veresterd zijn met ftalaatzuur waardoor het

onoplosbaar is in zuur milieu. Bij overgang van maag naar dunne

darm stijgt de pH en worden de ester-en zuurfuncties geïoniseerd

waardoor ook de oplosbaarheid stijgt.

- Diëthylftalaat: zorgt als weekmaker voor een elastische film die niet

barst of broos wordt.

Therapeutisch zijn er onderzoeken die microbicide activiteit van CAP

rapporteren tegen sexueel overdraagbare pathogen zoals het HIV-1

retrovirus. Deze resultaten ondersteunen het mogelijke gebruik van CAP

als topische behandeling van sexueel overdraagbare aandoeningen

(SOA’s) (Fengl et al., 2002).

“CAP is een veelbelovende microbicide agens voor de preventie van

infectia met SOA pathogenen, alsook voor HIV-1 (Neurath et al., 2002).”

- 40/55 -

DEHP is het potenste ftalaat, dit is gebleken uit verscheidene

toxicologische studies, alsook het meest gebruikt in medische materialen

zoals buisjes en infuuszakken. Logischerwijze is de blootstelling bij

patiënten die langdurig medische behandelingen zoals dialyse ondergaan

of een infuus krijgen veel groter. (Kamrin, 2009)

“Doch is er geen bewijs voorhanden dat er reeds effecten zijn opgetreden

of dit aannemelijk is voor te komen bij volwassenen en kinderen als

resultaat van een intensieve medische bedandeling (Kamrin, 2009).”

Ftalaten vinden ook toepassingen in cosmetica zoals nagellak en

verschillende shampoo’s, hier werd niet verder op ingegaan.

4.2.3 Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu

Eerst werd in de databank Web of Science gezocht naar een review over

methodevalidatie. De review “Method validation across the disciplines—

Critical investigation of major validation criteria and associated

experimental protocols” (Stöckl et al., 2009) werd gebruikt als leidraad

om verdere informatie op te zoeken. De literatuurlijst werd gecontroleerd

op regelgevende instanties en bruikbare referenties. We vonden het US

Environmental Protection Agency (USEPA) samen met de documenten

“Guidance for methods validation for the Resource Conservation and

Recovery Act (RSCA) program” (USEPA, 1995) en “Method 8000C”

(USEPA, 2003, derde revisie), die opgezocht werden op de site van het

USEPA (www.epa.gov).

Richtlijnen voor validatie van analytische methoden in het domein van het

milieu staan beschreven in het “Guidance for methods validation for the

RSCA-program”. De prestatiekenmerken, protocollen en specificaties

beschreven in het “RSCA-program” en “Method 8000C” staan samengevat

in Tabel 4.14.

- 41/55 -

Tabel 4.14: Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties beschreven

in het RSCA-program en *Method 8000C

PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES

Lineariteit Geen N gegeven r≥0,99*

Precisie

5 en 50 keer LoQ in 3

matrices

N=7

≤15% op lange termijn

≤20% terugvinding

duplicaten

Juistheid

5 en 50 keer LoQ in 3

matrices

N=7

≤20%

Aantoonbaarheidsgrens

(LoD)

Stalen met lage

concentratie

N=7

Bepaalbaarheidsgrens

(LoQ)

Stalen met lage

concentratie

N=7

4×LoD

Op Google (www.google.com) werd verder gezocht naar Belgische

instanties aangezien er geen vermeld staan in de literatuurlijst van de

review. We vonden de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek

(VITO) met op hun site (www.vito.be) het document “Compendium voor

Monstername en Analyse” (CMA) dat de validatie van analytische

methoden in het domein van het milieu beschrijft. De prestatiekenmerken,

protocollen en specificaties beschreven in CMA/6/A (Validatie,

Prestatiekenmerken, 2008) staan samengevat in Tabel 4.15.

- 42/55 -

Tabel 4.15: Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties beschreven

in CMA/6/A

PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES

Precisie

Meervoudige analyse van

hetzelfde monsterb:

N=1, 5 analysen

Duplo-analyse van

verschillende monstersb:

N≥5, analysen in duplo

met voorkeur voor

verschillende dagen

Duplo-analyse van

verschillende monstersa:

N≥5, analysen in duplo

Juistheid

Meervoudige analyse van

een referentiemateriaala:

N=1, 5 analysen

Terugvindingsexperimenten

op een geselecteerd

monstera: N≥10

deelmonsters, 5 paren

analysen

Selectiviteit en

robuustheid

Verschillende deelmonsters

met toenemende

concentratieb

Verhouding tussen

reproduceerbaarheid

en herhaalbaarheid:

maat voor de

robuustheid

(ideaal=1)

Lineariteit en

modelafwijking

N≥6 (concentraties

gespreid over ganse

werkgebied), analysen in

drievoud

- 43/55 -

Tabel 4.15 (vervolg):Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties

beschreven in CMA/6/A

PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES

Werkgebied

Ondergrens ≥

bepalingsgrens en

binnen het

lineariteitsgebied

Rapportagegrens:

waarde beneden welke

een component als niet

kwantificeerbaar wordt

gerapporteerd, is

hoogstens een vijfde

van de toetsingswaarde

voor de gemeten

monsters

LoD en LoQ

Meervoudige analyse

van praktijkmonster

met laag gehaltea,b:

N≥5

Duploanalyse van

verschillende praktijk-

monsters met laag

gehalte:

N≥5 (verschillend),

analysen in duplo (niet

op dezelfde dag),

geheel gespreid over

evenveel dagen als het

aantal monsterparen

S/R voor verschillende

praktijkmonsters met

laag gehaltea:

N≥5

Aantoonbaarheidsgrens:

3×standaardafwijking

Bepalingsgrens:

6×standaardafwijking

aReproduceerbaarheidsvoorwaarden: uitvoering van de metingen onder

variabele omstandigheden, dit wil zeggen in verschillende

- 44/55 -

laboratoriumruimten, door verschillende analisten, met verschillende

apparaten en batches reagentia/standaarden, op verschillende tijdstippen

met grotere tussenpozen (ISO 3534-1) bHerhaalbaarheidsvoorwaarden: uitvoering van alle betreffende metingen

door dezelfde analist, met dezelfde meetapparatuur, op zo dicht mogelijke

bij elkaar gelegen tijdstippen (ISO 3534 -1)

- 45/55 -

5. LITERATUURLIJST

- Aries, E.; Anderson, D. R.; Ordsmith, N.; Hall, K.; Fisher, R. (2004).

Development and validation of a method for analysis of ‘‘dioxin-like’’ PCBs

in environmental samples from the steel industry. Chemosphere. 54, 23-

31

- Ballesteros, O.; Zafra A.; Navalon, A.; Vilchez, J. L. (2006). Sensitive

gas chromatographic–mass spectrometric method for the determination of

phthalate esters, alkylphenols, bisphenol A and their chlorinated

derivatives in wastewater samples. J. Chromatogr. A. 1121, 154–162

- Cai, Y.; Jiang, G.; Liu, J. (2003) Solid-Phase Microextraction Coupled

with High Performance Liquid Chromatography–UV Detection for the

Determination of Di-n-Propyl-phthalate, Di-iso-Butyl-phthalate and Di-

Cyclohexyl-phthalate in Environmental Water Samples. Anal. Lett. 36:2,

389–404

- Chandran, S.; Singh, R. S. P. (2007). Comparison of various

international guidelines for analytical method validation. Pharmazie. 62,

4–14

- Compendium voor Monstername en Analyse, Deel 6 Validatie,

Prestatiekenmerken (CMA/6/A), VITO, België, 2008

- Cortazar, E.; Zuloaga, O.; Sanz, J.; Raposo, J. C.; Etxebarria, N.;

Fernàndez L. A. (2002). MultiSimplex optimisation of the solid-phase

microextraction–gas chromatographic–mass spectrometric determination

of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and

phthalates from water samples. J. Chromatogr. A. 978, 165–175

- Del Carlo, M; Pepe, A.; Sacchetti, G.; Compagnone, D.; Mastrocola, D.;

Cichelli, A. (2008). Determination of phthalate esters in wine using solid-

phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry. Food.

Chem. 111, 771–777

- EPA Method 606, Methods For Organic Chemical Analysis Of Municipal

And Industrial Wastewater. EPA, Washington, DC, 1996.

- 46/55 -

- EPA Method 8061A, Phthalate Esters By Chromatography With Electron

Capture Detection (GC/ECD). EPA, Washington, DC, 1996.

EPA Method 8000C, Determinative Chromatographic Separations (Revision

3). EPA, Washington, DC, 2003.

- Farahani, H.; Norouzi, P.; Dinarvand, R.; Ganjali, M. R. (2007).

Development of dispersive liquid–liquid microextraction combined with

gas chromatography–mass spectrometry as a simple, rapid and highly

sensitive method for the determination of phthalate esters in water

samples. J. Chromatogr. A. 1172, 105–112

- Fatoki, O. S.; Noma, A. (2000). Solid phase extraction method for

selective determination of phthalate esters in the aquatic environment.

Kluwer Academic Publ. 140, 85-98

- Guidance for Methods Development and Methods Validation for the

Resource Conservation and Recovery Act (RCRA) Program (SW-846

methods), EPA, Washington, DC, 1995.

- Kamrin, M. A. (2009). Phthalate Risks, Phthalate Regulation, and Public

Health: A Review. J. Toxicol. Env. Heal. B. 12:2, 157 — 174

- Kavlock, R.; Boekelheide, K.; Chapin, R.; Cunningham, M.; Faustman,

E.; Foster, P.; Golub, M.; Henderson, R.; Hinberg, I.; Little, R.; Seed, J.;

Shea, K.; Tabacova, S.; Tyl, R.; Williams, P.; Zacharewski, T. (2002). NTP

Center for the Evaluation of Risks to Human Reproduction: phthalates

expert panel report on the reproductive and developmental toxicity of di-

n-octyl phthalate. Reprod. Toxicol. 16, 721–734

- Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 25

februari 1996 tot beperking van het op de markt brengen en van het

gebruik van bepaalde gevaarlijke stoffen en preparaten, omzetting van de

- Europese Richtlijn 2005/84/EG en 76/769/EEG, België, 2006

- Liang, P.; Xu, J.; Li, Q. (2008). Application of dispersive liquid–liquid

microextraction and high-performance liquid chromatography for the

determination of three phthalate esters in water samples. Analyst. 609,

53–58

- 47/55 -

- Lorz, P. M.; Towae, F. K.; Enke, W.; Jäckh, R.; Bhargava, N.; Hillesheim,

W. (2002). “Phthalic Acid and Derivatives" in Ullmann's Encyclopedia of

Industrial Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim, Germany

- Merck Index 11th Edition (1989). Merck & Co., Inc., Whitehouse Station,

NJ, USA

- Mohamed, M. A.; Ammar A. S. (2008). Quantitative Analysis of

Phthalates Plasticizers in Traditional Egyption Foods (Koushary and Foul

Medams), Black Tea, Instant Coffee and Bottled Waters by Solid Phase

Extraction-Capillary Gas Chromatography-Mass Spectroscopy. American

Journal of Food Technology, 3(5), 341-346

- Mortensen, G. K.; Main, K. M. ; Andersson, A.; Leffers, H.; Skakkebæk,

N. E. (2005). Determination of phthalate monoesters in human milk,

consumer milk and infant formula by tandem mass spectrometry (LC–MS–

MS). Anal. Bioanal. Chem. 382, 1084–1092

- Neurath, R. A.; Strick, N.; Jiang, S.; Li Y.;Debnath, A. K. (2002). Anti-

HIV-1 activity of cellulose acetate phthalate: Synergy with soluble CD4

and induction of "dead-end" gp41 six-helix bundles. BMC Infectious

Diseases. 2:6, 1-13

- Peñalver, A.; Pocurull, E.; Borrull, F.; Marcé, R. M. (2000).

Determination of phthalate esters in water samples by solid-phase

microextraction and gas chromatography with mass spectrometric

detection. J. Chromatogr. A. 872, 191–201

- Prokupková, G.; Holadová, K.; Poustka, J.; Hajšlová, J. (2002)

Development of a solid-phase microextraction method for the

determination of phthalic acid esters in water. Analyst. 457, 211–223

- Polo, M.; Llompart, M.; Garcia-Jares, C.; Cela, R. (2005). Multivariate

optimization of a solid-phase microextraction method for the analysis of

phthalate esters in environmental waters. J. Chromatogr. A. 1072, 63–72

- Remon, J. P. (2001). Handleiding bij het uitvoeren van magistrale

bereidingen. Academia Press, Ghent, Belgium

-Schettler, T. (2005). Human exposure to phthalates via consumer

products. Int. J. Androl. 29, 134-139

- 48/55 -

- Silva, M. J.; Samandar, E.; Preau, J. L. J.; Reidy, J. A.; Needham, L. L.;

Calafat, A. M. (2007). Quantification of 22 phthalate metabolites in

human urine. J. Chromatogr. B. 860, 106–112

- Silva, M. J.; Preau, J. L. Jr.; Needham, L. L.; Calafat, A. M. (2008) Cross

validation and ruggedness testing of analytical methods used for the

quantification of urinary phthalate metabolites. J. Chromatogr. B, 873,

180–186

- Stöckl, D. (2007). Laboratory Statistics & Grapics with Excel®, STT

Consulting, Horebeke, Belgium

- Stöckl, D. (2007). Method validation With Confidence. STT Consulting,

Horebeke, Belgium

- Stöckl, D.; D’Hondt, H.; Thienpont, L.M. (2009). Method validation

across the disciplines—Critical investigation of major validation criteria

and associated experimental protocols. J. Chromatogr. B.

doi:10.1016/j.jchromb.2008.12.056

- Xu, J.; Liang, P.; Zhang, T. (2007). Dynamic liquid-phase

microextraction of three phthalate esters from water samples and

determination by gas chromatography. Analyst. 597, 1–5

- 49/55 -