UNIVERSITEIT GENT -...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bio-analyse

Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

Academiejaar 2008-2009

DE INVLOED VAN LEVERLIJDEN OP DE METABOLISERENDE

CAPACITEIT VAN DE LEVER BIJ KINDEREN:

BEREIDING, KARAKTERISATIE EN KWALITATIEVE

CONTROLE VAN MICROSOMEN.

Els DUMOULIN

Eerste master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer

Commissarissen

Prof. Dr. Apr. S. De Saeger

Prof. Dr. Apr. W. Lambert

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

28 mei 2009

Promotor Auteur

Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer Els Dumoulin

DANKWOORD

Eerst en vooral wil ik van de gelegenheid gebruik maken om mijn promotor, Prof. Dr. Apr. J.

Van Bocxlaer, van harte te bedanken voor de uitstekende begeleiding van deze leerrijke

ervaring en om mij deze kans te bieden mijn kennis uit te breiden.

Vervolgens wil ik mijn begeleidster, Apr. Lies De Bock, van harte bedanken voor de goede

begeleiding. Bedankt voor het grondig verbeteren van mijn masterproef, het begeleiden van

alle experimenten en de talrijke leuke momenten tijdens mijn onderzoekstage.

Daarnaast wil ik Dr. Apr. Koen Boussery, Apr. Julie De Smet, Ing. Sofie Vande Casteele,

Dr. Apr. Ruben t’Kindt, Wim Goeteyn, en Nadine Cloetens van harte bedanken voor de

begeleiding en aangename sfeer tijdens mijn onderzoeksstage.

Eveneens wil ik mijn medestudenten, Maaike Godefroid, Léonie Van Aelst en Charlotte Van

Impe, bedanken voor de dagelijkse steun en de gezellige sfeer.

Ten laatste wil ik ook mijn ouders, zus en vrienden bedanken voor hun niet te onderschatten

steun bij het verwezenlijken van deze masterproef.

INHOUDSOPGAVE

Auteursrecht

Dankwoord

Inhoudsopgave

Lijst met gebruikte afkortingen

1 INLEIDING ...................................................................................................................... 1

1.1 ALGEMEEN.................................................................................................................. 1

1.2 FARMACOKINETIEK ................................................................................................. 2

1.2.1 Absorptie ............................................................................................................... 2

1.2.2 Distributie ............................................................................................................. 3

1.2.3 Metabolisatie......................................................................................................... 4

1.2.4 Excretie.................................................................................................................. 8

1.3 PROTEÏNEBEPALINGEN ........................................................................................... 9

1.3.1 Algemeen ............................................................................................................... 9

1.3.2 Proteïnebepaling volgens Lowry en Bradford................................................. 10

1.3.3 CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara............................................ 11

1.3.4 MPPGL – Recovery Factor ...............................................................................12

1.4 CYP450-ACTIVITEITSBEPALING........................................................................... 13

1.4.1 Incubatie.............................................................................................................. 13

1.4.2 Chromatografische scheiding............................................................................ 15

1.4.3 Massaspectrometrische detectie en kwantificatie............................................ 16

1.4.4 Activiteitsbepaling.............................................................................................. 17

1.5 PBPK-MODELLEN..................................................................................................... 17

2 OBJECTIEVEN ............................................................................................................. 19

3 MATERIALEN EN METHODEN............................................................................... 21

3.1 BEREIDING BUFFERS.............................................................................................. 21

3.1.1 Buffer 1................................................................................................................ 21

3.1.1.1 Materialen......................................................................................................... 21

3.1.1.2 Methode............................................................................................................ 21

3.1.2 Buffer 2................................................................................................................ 21

3.1.2.1 Materialen......................................................................................................... 21

3.1.2.2 Methode............................................................................................................ 22

3.1.3 Buffer 3................................................................................................................ 22

3.1.3.1 Materialen......................................................................................................... 22

3.1.3.2 Methode............................................................................................................ 22

3.1.4 Buffer 4................................................................................................................ 22

3.1.4.1 Materialen......................................................................................................... 22

3.1.4.2 Methode............................................................................................................ 22

3.2 BEREIDING MICROSOMEN .................................................................................... 23

3.2.1 Materialen ........................................................................................................... 23

3.2.2 Methode............................................................................................................... 23

3.3 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY ........................................................... 25

3.3.1 Materialen ........................................................................................................... 25

3.3.2 Methode............................................................................................................... 25

3.4 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD .................................................... 25

3.4.1 Materialen ........................................................................................................... 25

3.4.2 Methode............................................................................................................... 26

3.5 CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA ............................................................... 26

3.5.1 Materialen ........................................................................................................... 26

3.5.2 Methode (Schenkman & Jansson, 1998)........................................................... 26

3.6 CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA ..................................................... 27

3.6.1 Materialen ........................................................................................................... 27

3.6.2 Methode (Matsubara et al., 1976) ...................................................................... 27

3.7 CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN .................... 28

3.7.1 Kwalitatieve controle microsomen ................................................................... 28

3.7.1.1 Materialen......................................................................................................... 28

3.7.1.2 Methode............................................................................................................ 29

3.7.2 Controle karakterisatiemethoden..................................................................... 30

3.7.2.1 Materialen......................................................................................................... 30

3.7.2.2 Methode............................................................................................................ 30

4 RESULTATEN EN DISCUSSIE .................................................................................. 32

4.1 BEREIDING MICROSOMEN .................................................................................... 32

4.2 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY ........................................................... 33

4.3 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD .................................................... 34

4.4 CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA ............................................................... 36

4.5 CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA ..................................................... 38

4.6 CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN .................... 41

4.6.1 Kwalitatieve controle microsomen ................................................................... 41

4.6.2 Controle karakterisatiemethoden..................................................................... 45

5 CONCLUSIES................................................................................................................ 47

6 LITERATUURLIJST .................................................................................................... 49

7 BIJLAGEN ........................................................................................................................I

7.1 BIJLAGE 1...................................................................................................................... I

7.2 BIJLAGE 2.....................................................................................................................II

7.3 BIJLAGE 3................................................................................................................... III

7.4 BIJLAGE 4................................................................................................................... IV

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ADME: Absorptie, Distributie, Metabolisatie en Excretie

BSA: Bovine Serum Albumine

CO: Koolstofmonoxide

CYP450: Cytochroom P450

DMSO: Dimethylsulfoxide

EDTA: Ethyleendiaminetetraacetaat Dinatriumzout Dihydraat (C10H14N2Na2O8.2H2O)

EMS: Elektromagnetische Spectrum

ER: Endoplasmatisch Reticulum

ESI: Electrospray Ionisatie

FDA: Food and Drug Administration

(HP)LC-MS/MS: (High Performance) Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry

MG: Moleculair Gewicht

MPPGL: Microsomal Protein Per Gram of Liver

MRM: Multiple Reaction Monitoring

MS: Massaspectrometer

MSP: Microsomaal Proteïnegehalte

NADPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Fosfaat

NP: Normal Phase

PBPK: Physiologically Based Pharmacokinetics

RP: Reversed Phase

UV: Ultraviolet

VC: Variatiecoëfficiënt

1

1 INLEIDING

1.1 ALGEMEEN

De lever is veruit het belangrijkste metaboliserende orgaan in ons lichaam (Benedetti &

Baltes, 2003). Om deze belangrijke functie uit te kunnen voeren beschikt het over een hele

reeks aan enzymen. Daartoe behoort onder andere het cytochroom P450-enzymsysteem dat

instaat voor de oxidatieve metabolisatie van een groot aantal lichaamseigen componenten en

xenobiotica. Xenobiotica zijn lichaamsvreemde componenten (xeno = vreemd) zoals

bijvoorbeeld geneesmiddelen. Er zijn verschillende factoren die een invloed kunnen hebben

op de activititeit van dit metaboliserend systeem, zoals genetisch polymorfisme, leeftijd,

geslacht, omgevingsfactoren en ziektetoestanden (Frye, 2004). Bij een verminderde

leverfunctie door leverlijden wordt verwacht dat de metaboliserende capaciteit zal beïnvloed

worden. De lever zal hierdoor geneesmiddelen minder goed kunnen verwerken, waardoor een

dosisaanpassing essentieel is (Verbeeck, 2008). In de literatuur kan reeds veel informatie

gevonden worden over de invloed van leverlijden op de metaboliserende capaciteit van de

lever bij volwassenen, maar over kinderen als specifieke doelgroep is dit beperkt.

Figuur 1.1 toont de lever van een zes maanden oud meisje met biliaire atresie, een

aandoening die gekenmerkt wordt door een afwijking aan de galwegen. De oorzaak is nog

ongekend. Door de afwijking kan de gal niet van de lever naar de darm vloeien, wat voor een

beschadiging van de lever zorgt. Bij deze aandoening is een levertransplantatie meestal

noodzakelijk (Bassett & Murray, 2008). Uit leverstalen afkomstig van een lever zoals in

Figuur 1.1 zou meer informatie kunnen bekomen worden over de invloed van leverlijden op

de metaboliserende capaciteit van de lever bij kinderen.

FIGUUR 1.1: LEVER VAN EEN MEISJE (6 MAANDEN) MET BILIAIRE ATRESIE. DE GELE

KLEUR EN UITSTULPINGEN ZIJN KENMERKEND BIJ EEN ZIEKE LEVER.

2

1.2 FARMACOKINETIEK

De farmacokinetiek bestudeert wat het lichaam met een geneesmiddel doet, m.a.w. het

volgt de concentratie van een geneesmiddel in het lichaam in functie van de tijd. De basis van

de farmacokinetiek wordt gevormd door de zogenaamde ADME-processen: Absorptie,

Distributie, Metabolisatie en Excretie.

1.2.1 Absorptie

De absorptie of resorptie van een geneesmiddel is afhankelijk van de manier waarop

het wordt toegediend. Dit kan enteraal (bv. oraal, sublinguaal of rectaal) of parenteraal (bv.

intramusculair, subcutaan, transdermaal, via de mucosa of intrathecaal) zijn. Wanneer een

geneesmiddel oraal wordt toegediend, zal het via de dunne darmwand in de bloedbaan worden

opgenomen. Dit bloed wordt afgevoerd via de vena portae naar de lever. Bij deze eerste

passage doorheen de lever kan er reeds metabolisatie optreden. Ook kunnen er reeds

enzymatische omzettingen gebeuren in de darmwand. Deze twee fenomenen samen worden

het ‘first-pass’ effect genoemd, dit wordt ook weergegeven in Figuur 1.2. Wanneer een

geneesmiddel sterk onderhevig is aan dit effect, kunnen er grote variaties in

plasmaconcentratie optreden. Door rectale, sublinguale of parenterale toediening kan het

‘first-pass’ effect gedeeltelijk of volledig vermeden worden.

FIGUUR 1.2: ‘FIRST-PASS’ FENOMEEN: PRESYSTEMISCHE METABOLISATIE IN DE

DARMWAND EN DE LEVER.

(Rowland & Tozer, 1995)

3

Door het ‘first-pass’ effect zal slechts een fractie van de toegediende dosis van een

geneesmiddel de algemene circulatie bereiken. Wanneer de moedermolecule het werkzame

bestanddeel is, zal de plasmaconcentatie lager liggen en zal het effect kleiner zijn. Wanneer

echter een metaboliet van de moedermolecule het werkzame bestanddeel is, dan zal de

plasmaconcentratie hoger liggen en het effect bijgevolg groter zijn.

De lever speelt een cruciale rol in de farmacokinetiek van geneesmiddelen, ook op

niveau van absorptie: bij patiënten met een hepatische dysfunctie zal er minder

presystemische metabolisatie optreden waardoor een hogere fractie van het geneesmiddel de

algemene circulatie zal bereiken. Dit is hoofdzakelijk van belang bij geneesmiddelen met een

hoge hepatische extractie ratio (= efficiëntie waarmee een geneesmiddel door lever uit de

bloedbaan verwijderd wordt): deze geneesmiddelen kennen een belangrijk ‘first-pass’ effect.

Bij bijvoorbeeld patiënten met levercirrose is een verhoogde orale biologische

beschikbaarheid waargenomen. Deze patiënten zijn gevoeliger voor zowel de gewenste als

ongewenste effecten van een geneesmiddel, aanpassing van de dosering kan bijgevolg

noodzakelijk zijn (Verbeeck, 2008).

1.2.2 Distributie

De distributie of verdeling is het proces waarbij een geneesmiddel zich verplaatst van

de bloedbaan naar de weefsels. Er zijn tal van factoren die dit proces bepalen. Een eerste

factor is de passage doorheen membranen. Daarbij zijn onder andere de vetoplosbaarheid, de

ionisatiegraad en de grootte van de geneesmiddelmolecule van belang. Dit komt omdat

geneesmiddelen membranen hoofdzakelijk passeren door passieve niet-ionische diffusie. Ook

het bloeddebiet bepaalt de distributie. De doorbloeding in het hart, de lever en de nieren is

beter dan bijvoorbeeld in de spieren en het vetweefsel. Daardoor zal het geneesmiddel eerst

vervoerd worden naar het hart, de lever en de nieren. Verder bepaalt de eiwitbinding in

plasma en weefsels ook de distributie van het geneesmiddel. De eiwitbinding in plasma is

belangrijk omdat enkel ongebonden geneesmiddel zich kan verplaatsen naar de

weefselcompartimenten. Eiwitten, die het geneesmiddel in plasma kunnen binden, zijn onder

andere albumine en α1-zure glycoproteïne. Albumine heeft vele bindingsplaatsen met een

wisselende affiniteit en kan zowel zure als basische farmaca binden. α1-zure glycoproteïne

heeft één hoge affiniteitsbindingsplaats en bindt enkel farmaca met een basische structuur.

4

Bij geneesmiddelen die sterk eiwitgebonden zijn, is de fractie ongebonden

geneesmiddel vaak hoger bij patiënten met een chronische leveraandoening dan bij gezonde

personen. Hiervoor bestaan verschillende oorzaken: minder synthese van albumine en α1-zure

glycoproteïne door de lever, accumulatie van endogene componenten (zoals bilirubine)

waardoor competitie voor de plasma-eiwitten optreedt en eventuele kwalitatieve

veranderingen in de plasma-eiwitten. Als de fractie ongebonden geneesmiddel hoger is, kan

meer geneesmiddel zich verplaatsen naar de weefsels. Dit kan aanleiding geven tot

wijzigingen in plasmaconcentratie en hierbij kunnen ook neveneffecten optreden. Dit wijst er

opnieuw op dat een aanpassing van de dosering van een geneesmiddel noodzakelijk kan zijn

bij patiënten met een chronische leveraandoening (Verbeeck, 2008).

1.2.3 Metabolisatie

De metabolisatie of de biotransformatie van een geneesmiddel is de omzetting van de

moedermolecule naar een meer polaire, wateroplosbare molecule die in de urine kan

uitgescheiden worden. Deze omzetting gebeurt door fase I en fase II reacties in de lever. Fase

I reacties zijn zogenaamde functionalisatiereacties: hydrolyses, reducties en oxidaties,

waarvan de laatste veruit de belangrijkste zijn. Deze functionalisatiereacties hebben een meer

polaire molecule als resultaat en kunnen eventueel aanleiding geven tot meer reactieve of

toxische componenten. Fase II reacties zijn zogenaamde conjugatiereacties. Dit kan de

conjugatie van het geneesmiddel of een fase I metaboliet met onder andere glucuronzuur,

glutathion of sulfaat voorstellen. Het resultaat hiervan is een meer wateroplosbare en meestal

minder actieve molecule (Donato & Castell, 2003).

De lever is het belangrijkste metaboliserende orgaan in het lichaam (Benedetti &

Baltes, 2003). Zoals te zien is in Figuur 1.3, is de lever onderverdeeld in twee delen, een

rechter- en een linkerlob. De twee lobben zijn verder opgebouwd uit vele lobules. Een lobule

is opgebouwd uit levercellen of hepatocyten. De leverlobules bevatten sterk permeabele

capillairen, de sinusoïden. In de sinusoïden zijn de Kupffer cellen aanwezig, dit zijn

gefixeerde fagocyten die deel uit maken van het immuunsysteem (Tortora & Derrickson,

2006).

5

FIGUUR 1.3: ANATOMIE VAN DE LEVER

(http://www.biomed.metu.edu.tr/courses/term_papers/bioartf-liver_kenar.htm)

De belangrijkste detoxificatiereacties in de lever zijn de oxidatiereacties door de

microsomale cytochroom P450 enzymen (CYP450-enzymen). Deze enzymen komen

hoofdzakelijk tot expressie in de lever, maar komen ook in extrahepatisch weefsel, zoals de

longen, de nieren, de gastro-intestinale tractus en de placenta (Donato & Castell, 2003). Deze

enzymen maken deel uit van het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem: een systeem

gelokaliseerd ter hoogte van het glad endoplasmatische reticulum, bestaande uit de CYP450-

enzymen, het NADPH-afhankelijke CYP450-reductase en het cytochroom b5. Deze enzymen

zorgen samen voor een fase I oxidatie. De cofactoren van deze enzymen zijn zuurstof en

NADPH (Verbeeck, 2008). In Figuur 1.4 staat weergegeven hoe een geneesmiddel (DH)

geoxideerd wordt door het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem.

CYP450-enzymen zijn hemoproteïnen. Dit werd voor het eerst aangetoond door

Omura in 1964. Ze bevatten een niet-covalent gebonden heemfunctie, wat een

protoporphyrine IX ring is met een ijzeratoom, zie Figuur 1.5 (Schenkman & Jansson, 1998).

6

FIGUUR 1.4: OXIDATIE VAN EEN GENEESMIDDEL DOOR HET ‘MICROSOMALE MIXED

FUNCTION OXIDASE’ SYSTEEM (DH = GENEESMIDDEL, DOH = GEOXIDEERD

GENEESMIDDEL).

(Rang et al., 2003)

FIGUUR 1.5: PROTOPORPHYRINE IX RING MET IJZERATOOM, AANWEZIG IN DE

HEEMFUNCTIE VAN HEMOPROTEÏNEN ZOALS DE CYP450-ENZYMEN, MYOGLOBINE,

HEMOGLOBINE, EN ANDERE.

7

De CYP450-enzymen zijn een verzameling van verschillende iso-enzymen die

ingedeeld worden in families en subfamilies op basis van hun homologie op genniveau in

nucleotidensequentie, waar de eerste pogingen om ze te classificeren gebeurden op basis van

de reacties die ze katalyseren. Bij de huidige indeling krijgt elke iso-vorm een 3-delige code.

Daarbij wijst bij bijvoorbeeld CYP1A2: de 1 op de familie, de A op de subfamilie en de 2 op

het specifiek enzym. In mensen zijn er tot nu toe 16 families en 29 subfamilies gekend.

Familie 1, 2 en 3 zijn het belangrijkst voor de biotransformatie van geneesmiddelen. De

belangrijkste iso-enzymen zijn: CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 en

CYP3A4. CYP3A4 maakt 30-40% van het totale CYP450-gehalte in de lever uit (Donato &

Castell, 2003).

Er kunnen grote interindividuele verschillen optreden in de metabolisatie van

geneesmiddelen. Dit komt meestal door een variabiliteit in de CYP450-genexpressie tussen

verschillende individuen. Er bestaan verschillende varianten van de CYP450-genen, en de

resulterende enzymen hebben elk hun eigen katalytische activiteit. Afhankelijk van welke

variant wordt overgeërfd, wordt een geneesmiddel minder of meer gemetaboliseerd. Dit wordt

respectievelijk aangeduid als een trage metabolizeerder en een snelle metabolizeerder. Dit

verschil in genetische aanleg wordt ook genetisch polymorfisme genoemd. Wanneer een

geneesmiddel grotendeels door één bepaald CYP450-enzym gemetaboliseerd wordt, kan dit

leiden tot grote verschillen in farmacokinetiek en farmacodynamiek (Donato & Castell,

2003).

Bij de geboorte kunnen de metabolische pathways nog immatuur zijn. Naarmate een

pasgeborene ouder wordt, ontwikkelen de verschillende enzymsystemen zich. Dit wordt de

maturatie van de metabole enzymen genoemd. Het totale CYP450-gehalte van een foetale

lever is slechts één derde van dat van een volwassene. Er wordt meestal aangenomen dat

enkel de isovormen van de CYP3A subfamilie aanwezig zijn (Benedetti & Baltes, 2003).

Wanneer de CYP450-activiteit zou bestudeerd worden bij kinderen met leverlijden, wordt

verwacht dat de activiteit lager ligt door het leverlijden zelf, echter de activiteit zal ook

afhankelijk zijn van de leeftijd. Wanneer bij kinderen een levertransplantatie wordt

uitgevoerd, kan een deel van een volwassen lever worden gebruikt (de ‘split-liver’-techniek,

(Spada et al., 2009)). Daarbij is nog weinig geweten over hoe de metaboliserende capaciteit

van de volwassen lever evolueert na transplantatie in het kind.

8

Om de CYP450-enzymen te bestuderen en de activiteit ervan in vitro te bepalen, wordt

de microsomale fractie van leverstalen afgezonderd. Deze subcellulaire fractie wordt

bekomen door disruptie van het endoplasmatisch reticulum (ER). Ze bevat gesloten vesikels

(microsomen), meestal omsloten met het buitenste membraan van het ER, met daarin alle

componenten uit het ER. De microsomen in de microsomale fractie kunnen zowel van het

glad als van het ruw ER afkomstig zijn. In de microsomen zijn tal van enzymen aanwezig,

zoals het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem, het deacetylase, en de UDP-

glucuronyltransferasen. De microsomale fractie kan bekomen worden door homogenisatie en

differentiële ultracentrifugatie (Onbekend, 2009). Ze bevat 96% van het CYP450-gehalte in

de lever. De andere 4% zijn niet-microsomale CYP450-enzymen en zijn gebonden op de

mitochondriën. (Wilson et al., 2003).

Bij patiënten met een chronische leveraandoening wordt een daling van de

enzymactiviteit en eiwitconcentratie gezien, en de daling neemt toe naarmate de ziekte erger

wordt. Dit zal natuurlijk een negatieve invloed hebben op de metaboliserende capaciteit van

de lever. Daarbij komt nog de capillarisatie van de sinusoïden, waardoor de transfer van

geneesmiddelen en zuurstof van het bloed naar de hepatocyten in het gedrang kan komen (Le

Couteur et al., 2005). Ook dit heeft een negatieve invloed op de metaboliserende capaciteit

van de lever. Dit alles toont nógmaals aan dat een aanpassing van de dosering van een

geneesmiddel nodig is bij chronische leveraandoeningen (Verbeeck, 2008).

1.2.4 Excretie

De excretie van een onveranderd geneesmiddel of een metaboliet van het

geneesmiddel kan op verschillende manieren gebeuren. De belangrijkste is daarbij de

uitscheiding via de nieren in de urine. Daarnaast kan ook biliaire excretie (via gal en faeces)

optreden. Minder belangrijke vormen van excretie zijn o.a. traanvocht, huid, speeksel, melk

en longen.

Vergevorderd leverlijden gaat heel vaak gepaard met nierfalen. Het wordt aangeduid

als het hepatorenaal syndroom: een onverklaarbaar progressief nierfalen bij patiënten met een

chronische leveraandoening. Bij deze patiënten kan het dus nodig zijn om niet enkel de dosis

van geneesmiddelen die hoofdzakelijk door lever worden geklaard te verminderen, maar ook

van geneesmiddelen die hoofdzakelijk door de nieren worden geklaard (Verbeeck, 2008).

9

Geneesmiddelen die in grote mate biliair uitgescheiden worden, zullen bij een eventuele

galwegenobstructie accumuleren in het lichaam. Daardoor kan er ook schade optreden aan de

hepatocyten waardoor de metaboliserende capaciteit van de lever achteruitgaat. Bij patiënten

met cholestasis (galstuwing) zal dosisaanpassing bijgevolg ook noodzakelijk zijn (Verbeeck,

2008).

1.3 PROTEÏNEBEPALINGEN

1.3.1 Algemeen

Een eiwit of proteïne is een polypeptide opgebouwd uit aminozuren. De aminozuren

zijn met elkaar verbonden via een peptidebinding. In Figuur 1.6 worden de peptidebindingen

tussen meerdere aminozuren weergegeven. Wanneer een groot aantal aminozuren verbonden

wordt met elkaar, wordt gesproken van een polypeptide.

FIGUUR 1.6: PEPTIDEBINDING.

De in vitro evaluatie van de activiteit van CYP450-enzymen gebeurt in een

microsomale suspensie. Naast de CYP450-enzymen als hemoproteïnen zijn er natuurlijk ook

nog andere proteïnen aanwezig in de suspensie. Voor het bestuderen van de CYP450-

enzymen is het belangrijk om de suspensie op twee manieren de karakteriseren, enerzijds door

een totale proteïnebepaling en anderzijds door een specifieke CYP450-bepaling. In de

literatuur wordt voor de proteïnebepaling meestal een colorimetrische methode gebruikt. De

methoden van Lowry en van Bradford zijn de meest toegepaste. Voor de CYP450-bepaling

wordt een spectrofotometrische methode gebruikt, dit kan de methode van Omura of de

methode van Matsubara zijn.

10

1.3.2 Proteïnebepaling volgens Lowry en Bradford

De methoden van Lowry en Bradford zijn beiden spectrofotometrische bepalingen in

het zichtbare gebied (380-780 nm). Ze zijn gebaseerd op een chemische reactie waardoor

chromoforen gegenereerd worden. Een chromofoor is het deel van een molecule die absorptie

in het UV-gebied of het zichtbare gebied van het elektromagnetisch spectrum (EMS) vertoont.

Geconjugeerde dubbele bindingen kunnen licht met een golflengte in het UV-gebied of het

zichtbare gebied absorberen. Chromogene groepen van eiwitten zijn bijvoorbeeld aminozuren

met een aromatische ringstructuur (Lucarini & Kilikian, 1999). Twee voorbeelden zijn

weergegeven in Figuur 1.7.

FIGUUR 1.7: TRYPTOFAAN (LINKS) EN TYROSINE (RECHTS).

Bij de methode van Lowry wordt gebruik gemaakt van twee kleurvormende reacties.

In de eerste reactie complexeren de peptidebindingen met de koperionen van kopersulfaat, dit

gebeurt in aanwezigheid van een base en natriumkaliumtartraat. Dit is in principe de biureet

reactie. Het resultaat is een blauwe kleur (Lucarini & Kilikian, 1999). In de tweede reactie

wordt het fosfomolybdaat bevattende Folin-Ciocalteu reagens toegevoegd. Chromogene

groepen zoals tryptofaan, tyrosine (en in mindere mate cysteïne en histidine) reduceren het

fosfomolybdaat waardoor ook een blauwe kleur ontstaat. Hierbij worden de aromatische

groepen geoxideerd via een koper-gekatalyseerd mechanisme. Het uiteindelijke resultaat is

een intense blauwe kleur die gemeten wordt bij 750 nm (Lucarini & Kilikian, 1999). De

gevormde kleur is niet recht evenredig met het proteïnegehalte. Met behulp van een gekende

standaardoplossing (BSA) wordt op voorhand een standaardcurve opgesteld en uit de

standaardcurve kan dan het onbekende proteïnegehalte bepaald worden (Lowry et al., 1977).

Het nadeel aan de methode van Lowry is dat ze zeer gevoelig is aan interferenties. Dit kan

zorgen voor verhoging of vermindering van de absorbantie, maar ook kan een precipitaat

gevormd worden bij hoge zoutconcentraties. Voorbeelden van interfererende substanties zijn:

detergenten, glucose, sucrose, kalium, glycerol en magnesium (Peterson, 1979).

11

Bij de methode van Bradford wordt gebruikt gemaakt van het Coomassie Brilliant

Blue G-250, een kleurstof dat in twee verschillende gekleurde vormen bestaat, namelijk rood

en blauw. In zuur milieu treedt binding op tussen de kleurstof en de proteïne waarbij de rode

vorm wordt omgezet in de blauwe vorm. Bij deze interactie zijn hoofdzakelijk basische

aminozuren zoals arginine, lysine en histidine betrokken. De blauw kleur kan gemeten

worden bij 595 nm (Bradford, 1976; Lucarini & Kilikian, 1999). De methode van Bradford

biedt enkele voordelen t.o.v. die van Lowry: ze is vlugger, minder omslachtig en er zijn veel

minder interferenties (Bradford, 1976).

1.3.3 CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara

De heemmolecule in de CYP450-enzymen is enkel in zijn gereduceerde vorm in staat

om kleine moleculen, zoals koolstofmonoxide (CO), te binden (Garfinkel, 1958). Van deze

eigenschap wordt gebruik gemaakt om specifiek het CYP450-gehalte te bepalen in

microsomen. Wanneer dit complex gevormd wordt, ontstaat een molecule die een

absorptiemaximum vertoont in het zichtbare gebied van het EMS. Op deze manier kan het

gehalte bepaald worden door gebruik te maken van de Wet van Lambert-Beer (zie

vergelijking 1).

E = ε.c.l (vergelijking 1)

waarin: E: extinctie

ε: molaire extinctiecoëfficient (mM-1.cm-1)

c: concentratie (mM)

l : weglengte (cm)

Bij de methode van Omura worden zowel de referentie als het staal (beiden een

verdunde hoeveelheid microsomen) gereduceerd, waarna enkel het staal verzadigd wordt met

CO. De bekomen verbinding, een complex van het gereduceerde CYP450-enzym met CO,

vertoont een absorptiepiek bij 450 nm. Aangezien referentie en staal op een andere manier

behandeld worden, ontstaan er spectrale verschillen. De twee spectra worden van elkaar

afgetrokken en zo wordt een ‘difference’ spectrum bekomen. Op deze manier worden

interfererende bestanddelen uitgeschakeld. In dit spectrum worden 2 pieken teruggevonden.

Een piek bij 450 nm, die de gereduceerde CYP450-enzymen in complex met CO voorstellen,

en een piek bij 420 nm. Deze laatste piek kan zowel de gedenatureerde, inactieve vorm van de

CYP450-enzymen (aangeduid als CYP420) in complex met CO als het carboxyhemoglobine

12

voorstellen. Met behulp van de wet van Lambert-Beer kan de concentratie vervolgens

berekend worden (Omura & Sato, 1964).

In aanwezigheid van hemoglobine verschuift de piek in het spectrum van 450 nm naar

454 nm. Bij stalen die gecontamineerd zijn met hemoglobine, wordt bijgevolg beter de

methode van Matsubara toegepast. Hierbij worden zowel de referentiecuvet als de staalcuvet

doorborreld met CO, waarna enkel het staal gereduceerd wordt. De piek bij 420 nm stelt bij

de methode van Matsubara de gedenatureerde, inactieve vorm van de CYP450-enzymen

(aangeduid als CYP420) in complex met CO en het gereduceerde cytochroom b5 voor. Het

hemoglobine wordt als interferentie uitgeschakeld omdat het carboxyhemoglobine in beide

stalen gevormd wordt. Ook hier kan met behulp van de wet van Lambert-Beer de concentratie

afgeleid worden (Matsubara et al., 1976).

Cytochroom b5 is ook een hemoproteïne: het bevat een niet-covalent gebonden

heemfunctie (Figuur 1.5). In tegenstelling tot de CYP450-enzymen kan dit hemoproteïne geen

CO binden. Het speelt een belangrijke rol in de transfer van elektronen naar de CYP450-

enzymen, een proces waarbij ook het NADPH-afhankelijke CYP450-reductase betrokken is

(Schenkman & Jansson, 2003).

1.3.4 MPPGL – Recovery Factor

Om de microsomen verder te karakteriseren, wordt gebruik gemaakt van een extra

factor: de MPPGL, of Microsomal Protein Per Gram of Liver. Om de MPPGL-waarden te

berekenen moet rekening gehouden worden met het verlies aan microsomale eiwitten tijdens

de bereiding van microsomen. Door de bepaling van een bepaalde merker die specifiek is

voor de microsomale fractie, bijvoorbeeld het totale CYP450-gehalte, kan het verlies

berekend worden. Aangezien meer dan 96% van het CYP450-gehalte in de lever microsomaal

is, kan het totale CYP450-gehalte in het homogenaat en in de microsomale suspensie gebruikt

worden. De recovery factor geeft weer hoeveel microsomale eiwitten overblijven na de

bereiding van de microsomen en kan berekend worden met vergelijking 2. Met behulp van

deze waarde en het microsomaal proteïnegehalte (MSP) kan de MPPGL bepaald worden

(vergelijking 3) (Barter et al., 2008; Wilson et al., 2003).

13

f = CYP450microsomaal / CYP450homogenaat (vergelijking 2)

waarin: f: recovery factor

CYP450microsomaal: CYP450-gehalte in de microsomen (nmol/g lever)

CYP450homogenaat: CYP450-gehalte in het homogenaat (nmol/g lever)

MPPGL = MSP / f (vergelijking 3)

waarin: MPPGL: microsomal protein per gram of liver (mg/g lever)

MSP: microsomaal proteïnegehalte (mg/g lever)

f: recovery factor

1.4 CYP450-ACTIVITEITSBEPALING

Een CYP450-activeitsbepaling gebeurt in verschillende stappen (hieronder beschreven):

1) Incubatie van de microsomale suspensie met selectieve probes.

2) Chromatografische scheiding.

3) Massaspectrometrische detectie en kwantificatie.

4) Activiteitsbepaling en vergelijking met een referentie.

1.4.1 Incubatie

Om de CYP450-activiteit te bepalen wordt de microsomale suspensie met specifieke

probes of substraten geïncubeerd. De probes worden daarbij door de CYP450-enzymen

omgezet tot metabolieten. Bij een ideale probe weerspiegelt de vormingssnelheid van de

metaboliet de activiteit van het enzym. Bij voorkeur ondergaat de gevormde metaboliet geen

verdere omzettingen meer. De reactie moet selectief zijn, d.w.z. dat de vorming van de

metaboliet zoveel mogelijk door één enkel enzym moet worden uitgevoerd (Yuan et al.,

2002). Een aantal veelgebruikte probes zijn weergegeven in Tabel 1.1.

TABEL 1.1: PROBES EN HUN METABOLIETEN VOOR DE BEPALING VAN DE ACTIVITEIT

VAN CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, EN CYP3A4.

(Kim et al., 2005)

CYP450-enzym probe metabolietCYP1A2 phenacetine acetaminophenCYP2C9 tolbutamide 4-hydroxytolbutamideCYP2C19 s-mephenytoïne 4'-hydroxyphenytoïneCYP2D6 dextromethorphan dextrorphanCYP2E1 chlorzoxazone 6-hydroxychlorzoxazoneCYP3A4 midazolam 1-hydroxymidazolam

14

De concentratie van de probes tijdens de incubatie moet rond de Michaëlis-Menten

constante (Km) liggen. Km is de substraatconcentratie waarbij de helft van de maximale

reactiesnelheid van het enzym bereikt wordt. Bij deze concentratie is er een lineair verband

tussen de reactiesnelheid en de probeconcentratie, zoals weergegeven in Figuur 1.8. De

concentratie moet echter wel hoog genoeg zijn om een metabolietconcentratie te bekomen die

met de gebruikte analysemethode kan gedetecteerd worden (Walsky & Obach, 2004).

FIGUUR 1.8: MICHAËLIS-MENTEN PLOT: V=REACTIESNELHEID, VMAX=MAXIMALE

REACTIESNELHEID (VERZADIGING VAN DE ENZYMEN), KM=MICHAËLIS-

MENTENCONSTANTE, S=PROBECONCENTRATIE.

(http://depts.washington.edu/wmatkins/kinetics/michaelis-menten.html)

Om de analysetijd te verkorten en de methode minder arbeidsintensief te maken, wordt

tegenwoordig gebruik gemaakt van een zogenaamde cocktail-strategie. Waar vroeger de

microsomen apart met elke probe werden geïncubeerd en de metabolieten elk afzonderlijk

werden gedetecteerd, worden in een cocktail-methode alle probes in één incubatie

toegevoegd. Vervolgens worden de metabolieten allen tegelijk gescheiden en gedetecteerd

met LC-MS/MS (zie 1.4.2). Bij cocktail-incubaties kunnen echter problemen optreden zoals

interacties tussen de verschillende probes. Door de lipofiele aard van veel probes is het nodig

om een organisch solvent te gebruikten voor de solubilisatie. Busby en Chauret toonden reeds

aan dat organische solventen een belangrijke invloed kunnen hebben op de enzymactiviteit

(Busby et al., 1999; Chauret et al., 1998). Methanol bij een concentratie van 0,5 % of 1%

wordt het meest aangeraden. Bij andere solventen zoals DMSO en acetonitrile of hogere

concentraties van methanol vindt inhibitie van de CYP450-enzymen plaats (Kim et al., 2005).

15

1.4.2 Chromatografische scheiding

Vloeistofchromatografie of ‘Liquid Chromatography’ (LC), is een analytische

techniek die gebruikt wordt om verschillende componenten in een mengsel te scheiden. Na

injectie wordt het mengsel via een mobiele fase langs een stationaire fase (op een kolom)

geleid. Voor de eigenlijke kolom is er ook meestal een pre-kolom aanwezig, dit om eventuele

contaminatie en storende elementen tegen te houden. De verschillende componenten die in het

mengsel aanwezig zijn verdelen zich over de beide fasen. Als een component interactie

vertoont met de stationaire fase dan wordt die vertraagd. Verschillende componenten vertonen

een verschillende affiniteit voor de stationaire fase en zullen op verschillende tijdstippen de

kolom verlaten (= elueren). Het tijdstip waarop dit gebeurt wordt de retentietijd (tr) genoemd.

Het scheidingsproces kan gevisualiseerd worden met behulp van een detector, in dit geval de

massaspectrometer (zie 1.4.3). De visualisatie van het elutieprofiel wordt een chromatogram

genoemd. Op basis van de retentietijd kan afgeleid worden welke component elueert. Ook kan

op basis van de piekhoogte of piekoppervlakte de concentratie van het eluerende bestanddeel

bepaald worden. Bij vloeistof-vaste fase chromatografie onder verhoogde druk (‘High

Performance Liquid Chromatography’, HPLC) is de mobiele fase vloeibaar en de stationaire

fase vast. De mobiele fase wordt samen met het staal onder verhoogde druk over de kolom

gestuurd. Dit kan gebeuren volgens isocratische elutie, wat wil zeggen dat gedurende de

volledige run dezelfde mobiele fase gebruikt wordt, of het kan gebeuren volgens

gradiëntelutie. Bij gradiëntelutie wordt er overgeschakeld van een zwak naar een sterk eluens.

Voordelen hierbij zijn onder andere een beter scheiding, een kortere analysetijd, en een

toename in gevoeligheid. Als stationaire fase kan een apolair adsorbens gebruikt, waardoor

van omgekeerde fase chromatografie gesproken wordt (reversed phase chromatography, RP).

In geval van een polair adsorbens als stationaire fase wordt er gesproken van normale fase

chromatografie (normal phase chromatography, NP) (Simpson, 1976).

De in de literatuur beschreven methoden voor de CYP450-activiteitsbepaling maken

meestal gebruik van RP-LC met gradiëntelutie. Als mobiele fase kan bijvoorbeeld water met

mierenzuur en acetonitrile met mierenzuur worden gebruikt die volgens een bepaalde gradient

gepompt worden (Kim et al., 2005). Mierenzuur wordt toegevoegd om de ionisatie van de

componenten in de massaspectrometer te vergemakkelijken. Water is hier het zwakke eluens,

terwijl acetonitrile het sterke eluens is. De hoeveelheid acetonitrile wordt geleidelijk aan

opgevoerd. De polaire verbindingen zullen daardoor eerst elueren en de apolaire pas later. Als

16

stationaire fase wordt meestal een C18-RP kolom gebruikt (Lahoz et al., 2008). Deze

stationaire fase is chemisch gemodificeerd silica met daarop een lange alkylketen gebonden.

De interacties die zullen plaatsvinden tussen deze stationaire fase en de eluerende

componenten zijn Van der Waalse attractiekrachten (Perry et al., 1972). Dit zijn krachten ten

gevolge van het elektronencorrelatie-effect. Elektronen veranderen continu van positie

waardoor kortstondig plaatsen kunnen ontstaan met een teveel of een tekort aan

elektronendensiteit. Zo kunnen aantrekkingskrachten ontstaan tussen plaatsen met een teveel

en een tekort aan elektronendensiteit. Deze krachten zijn afhankelijk van afstand, van zodra

de elektronenwolken elkaar overlopen ontstaat er repulsie tussen de 2 moleculen.

1.4.3 Massaspectrometrische detectie en kwantificatie

De detectie en visualisatie van de metabolieten die elueren van de kolom gebeurt met

behulp van een massaspectrometer (MS) (Kim et al., 2005). Een massaspectrometer is

gebaseerd op de vorming van ionen. Bij deze techniek wordt de vloeistof (mobiele fase en

metabolieten) die van de kolom elueert, geleid naar een capillair. Dit capillair staat onder

spanning en daardoor vernevelt de vloeistof. Er ontstaat zo een spray van geladen druppels en

deze ionisatie methode wordt ‘electrospray’ ionisatie (ESI) genoemd (Manisali et al., 2006).

Afhankelijk van het ionisatieproces kunnen positieve of negatieve ionen gevormd worden.

Door een stroom van warm stikstofgas rond het capillair verdampt de mobiele fase en

ontstaan ionen in de gasfase aan het uiteinde van het capillair. Deze stap gebeurt bij

atmosferische druk, alle volgende stappen gebeuren echter in vacuüm. Na ionisatie worden de

ionen gescheiden volgens hun massa-over-ladingsverhouding (m/z) door de quadrupolen.

Wanneer MS gebruikt wordt als detectiemethode na LC, wordt vaak gebruik gemaakt van

‘multiple reaction monitoring’, of MRM. Daarbij wordt het precursorion (meestal het

moleculair ion) van de te detecteren component geselecteerd en doorgelaten door een eerste

quadrupool. In een botsingscel wordt het precursorion gefragmenteerd in productionen bij een

bepaalde spanning (botsingsenergie) en door botsing met argongas. De productionen worden

geleid naar een tweede quadrupool waar ook één bepaald production geselecteerd en

doorgelaten wordt. Op deze manier wordt slechts één precursorion en één production gevolgd

en verhogen de selectiviteit en gevoeligheid van de detectie. Het algemene schema van MRM

is weergegeven in Figuur 1.9. Vervolgens gaan de productionen richting de detector, een

elektronenmultiplier. Het resultaat is een (massa-)chromatogram.

17

FIGUUR 1.9: PRINCIPE MULTIPLE REACTION MONITORING

(http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=514467)

1.4.4 Activiteitsbepaling

De hoeveelheid gevormde metaboliet is een maat voor de activiteit van de CYP450-

isovorm (uitgedrukt in pmol/mg proteïne x min). Deze activiteiten kunnen vergeleken worden

met de CYP450-activiteit van commercieel beschikbare referentie-microsomen. Op deze

manier kan bepaald worden of de metaboliserende capaciteit van de lever veranderd is en in

welke mate.

1.5 PBPK-MODELLEN

PBPK-modellen, of Physiologically Based PharmacoKinetics-modellen, zijn

wiskundige modellen die gebruikt worden om de plasmaspiegels van geneesmiddelen te

voorspellen in specifieke populaties op basis van de populatiekarakteristieken en de

fysicochemische eigenschappen van het geneesmiddel (Nestorov, 2007). Deze modellen

kunnen gebruikt worden om op een efficiëntere manier betere doseringsschema’s op te stellen

voor nieuwe geneesmiddelen. In vergelijking met de conventionele farmacokinetische

modellen bevatten de PBPK-modellen veel meer informatie. De conventionele modellen zijn

eenvoudige één-, twee-, of driecompartimentele structuren die enkel gebruikt worden om het

verloop van de plasmaspiegels te beschrijven. De PBPK-modellen proberen het transport van

een geneesmiddel in het lichaam op een zo realistisch mogelijke manier weer te geven. Ze

maken gebruik van alle informatie die reeds gekend is over de onderliggende

(patho)fysiologische mechanismen die de farmacokinetische eigenschappen van een

geneesmiddel bepalen (deze modellen worden daarom ook vaak aanzien als “mechanistische

modellen”) (Nestorov, 2007). Het is bijvoorbeeld gekend dat bij volwassenen met levercirrose

de activiteit van verschillende CYP450-isovormen sterk gedaald is (Verbeeck, 2008). Deze

informatie kan dan – samen met informatie over andere fysiologische processen die beïnvloed

worden door levercirrose – gebruikt worden in een PBPK-model dat de invloed van

levercirrose op de farmacokinetiek van geneesmiddelen voorspelt. Op deze manier houden

PBPK-modellen dus rekening met alle organen die betrokken zijn in het proces, waardoor ze

18

veel meer compartimenten bezitten. In bijvoorbeeld een twee-compartimenteel model wordt

het lichaam enkel onderverdeeld in een centraal (bloed) en een perifeer (weefsels)

compartiment (Nestorov, 2007). In Figuur 1.10 wordt een PBPK-model vergeleken met een

twee-compartimenteel model. Een PBPK-model is duidelijk veel complexer en vollediger dan

een twee-compartimenteel model.

FIGUUR 1.10: EEN PBPK-MODEL (LINKS; Q=BLOEDDEBIET, CLINT=INTRINSIEKE

KLARING) IN VERGELIJKING MET EEN EENVOUDIG TWEE-COMPARTIMENTEEL

MODEL (RECHTS; D=DOSIS, KE=ELIMINATIESNELHEIDSCONSTANTE, VC=VOLUME

CENTRAAL COMPARTIMENT, VT=VOLUME PERIFEER COMPARTIMENT).

(Nestorov, 2007)

Met behulp van de bekomen resultaten uit de evaluatie van de CYP450-activiteit bij

specifieke doelgroepen, kunnen parameters bepaald worden om PBPK-modellen te

ontwikkelen voor deze specifieke doelgroepen. Er is al veel geweten over de invloed van

leverlijden op de CYP450-activiteit bij volwassenen, maar praktisch niets bij kinderen als

doelgroep. Door meer onderzoek te verrichten kunnen er in de toekomst ook parameters

bepaald worden voor deze specifieke doelgroep en kunnen geneesmiddelen veiliger gedoseerd

worden.

19

2 OBJECTIEVEN

Over de invloed van leverlijden op de activiteit van de CYP450-enzymen bij

volwassenen is al veel geweten, maar bij kinderen als doelgroep is er nog maar zeer weinig

informatie ter beschikking. Wanneer dit aspect beter bij kinderen zou bestudeerd worden,

kunnen met behulp van PBPK-modellen betere doseringsschema’s bepaald worden voor

kinderen met leverlijden.

Het doel van deze masterproef is vierledig.

1) microsomen bereiden

2) proteïnebepaling

3) CYP450-bepaling

4) controle van microsomen en karakterisatiemethoden

Eerst en vooral is het de bedoeling om een methode op punt te stellen om microsomen te

bereiden. Hierbij wordt uitgegaan van het protocol dat gebruikt wordt aan de University of

Sheffield (UK) en in Janssen Farmaceutica te Beerse (België). De microsomen zullen bereid

worden door homogenisatie en differentiële ultracentrifugatie.

Vervolgens zal ook bepaald worden welke methode kan gebruikt worden om het totale

proteïnegehalte van de microsomen te bepalen. Dit is nodig omdat het CYP450-gehalte van

de microsomen wordt uitgedrukt in functie van de proteïneconcentratie. In deze masterproef

zullen de methoden van Lowry en Bradford, beiden spectrofotometrische methoden, met

elkaar vergeleken worden. De meest accurate en minst arbeidsintensieve methode zal

uiteindelijk gekozen worden.

Ten derde zal het CYP450-gehalte in het homogenaat (bekomen na homogenisatie van het

leverstaal) en in de microsomale suspensie bepaald worden. Om dit te doen kan gebruik

gemaakt worden van de methode van Omura of Matsubara. Dit zijn twee spectrofotometrische

bepalingen die gebaseerd zijn op de binding van koolstofmonoxide aan de CYP450-enzymen.

Doordat het homogenaat en de microsomale suspensie meestal gecontamineerd zijn met

hemoglobine zal het waarschijnlijk beter zijn om de methode van Matsubara te gebruiken. De

methode van Omura is gevoelig aan deze interferentie. Het CYP450-gehalte in het

homogenaat en de microsomale suspensie zullen nodig zijn om de MPPGL te bepalen.

20

Aangezien de kwantificatiemethoden nog niet gevalideerd zijn, kunnen nog geen

kwantitatieve activiteitsbepalingen worden uitgevoerd. Wel zal door incubatie met midazolam

en dextromethorphan een kwalitatieve controle van de microsomen uitgevoerd worden.

Hierbij wordt gebruik gemaakt van het incubatieprotocol dat aan de University of Sheffield

(UK) gebruikt wordt. Na incubatie van de microsomen met midazolam en na centrifugatie

wordt het supernatans gecontroleerd op de aanwezigheid van 1-hydroxymidazolam met

behulp van een LC-MS/MS methode. Analoog wordt na incubatie van de microsomen met

dextromethorphan en na centrifugatie, het supernatans gecontroleerd op de aanwezigheid van

dextrorphan. De omzetting van midazolam gebeurt door CYP3A4 en van dextromethorphan

door CYP2D6. Als 1-hydroxymidazolam en dextrorphan aanwezig zijn, kan besloten worden

dat de CYP450-enzymen nog actief zijn en de microsomen op een adequate manier bereid

worden. Om te controleren of de gebruikte proteïnebepaling en CYP450-bepaling nauwkeurig

worden uitgevoerd, worden volledig gekarakteriseerde microsomen gekocht om daar de

gebruikte methoden op te testen.

21

3 MATERIALEN EN METHODEN

3.1 BEREIDING BUFFERS

3.1.1 Buffer 1

Buffer 1 is een fosfaatbuffer met kaliumchloride bij pH 7,25. Deze buffer wordt

gebruikt voor de homogenisatie in de bereiding van microsomen. De voorkeur gaat daarbij uit

naar kaliumzouten in plaats van natriumzouten omwille van hun grotere oplosbaarheid bij

lage temperaturen. Kaliumchloride helpt bij de verwijdering van hemoglobine tijdens de

bereiding van de microsomen (Onbekend, 2009).

3.1.1.1 Materialen

Di-kaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4), kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) en

kaliumchloride (KCl) worden aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.

Millipore-water wordt gebruikt om alle oplossingen te maken (Brussel, België). Om de pH te

meten wordt een Consort C831 (Consort nv., Turnhout, België) gebruikt met een magnetische

roerder 851 ECO_MAG_STIR (Labinco, Breda, Nederland).

3.1.1.2 Methode

Buffer 1 wordt bereid uit de volgende twee componenten:

1) 0,25 M K2HPO4 (MG = 174,18) met 1,15% KCl (MG = 74,55)

2) 0,25 M KH2PO4 (MG = 136,09) met 1,15% KCl (MG = 74,55)

Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,25 bereikt

wordt.

3.1.2 Buffer 2

Buffer 2 is een 30% glycerolbevattende fosfaatbuffer met kaliumchloride bij pH 7,25.

Deze buffer wordt gebruikt om de finale suspensie van microsomen te bereiden. Glycerol is

een cryoprotectant: het beschermt de microsomen tegen beschadiging tijdens invriezen.

Glycerol heeft geen invloed op de pH. Deze buffer wordt gekozen omdat de activiteit van de

enzymen behouden wordt bij lang bewaren (Onbekend, 2009).

3.1.2.1 Materialen

Dezelfde materialen worden gebruikt als bij buffer 1, daarnaast wordt ook glycerol

(C3H5(OH)3) aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.

22

3.1.2.2 Methode

Buffer 2 wordt bereid door aan een hoeveelheid buffer 1 30% glycerol toe te voegen.

3.1.3 Buffer 3

Buffer 3 is een fosfaatbuffer met de dihydraatvorm van het natriumzout van

ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) bij pH 7,4. EDTA is een antioxidans: het complexeert

metaalionen. Deze buffer is nodig voor de CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara.

3.1.3.1 Materialen

Dezelfde materialen (behalve kaliumchloride) worden gebruikt als bij buffer 1,

daarnaast wordt ook ethyleendiaminetetraacetaat dinatriumzout dihydraat

(C10H14N2Na2O8.2H2O) aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.

3.1.3.2 Methode


1) 0,5 M K2HPO4 (MG = 174,18) met 10 mM EDTA (MG = 372,24)

2) 0,5 M KH2PO4 (MG = 136,09) met 10 mM EDTA (MG = 372,24)

Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,4 bereikt wordt.

3.1.4 Buffer 4

Buffer 4 is een fosfaatbuffer bij pH 7,4. Deze buffer wordt gebruikt om de incubatie

uit te voeren bij de kwalitatieve controle van de microsomen.

3.1.4.1 Materialen

Dezelfde materialen (behalve kaliumchloride) worden gebruikt als bij buffer 1.

3.1.4.2 Methode


1) 0,2 M K2HPO4 (MG = 174,18)

2) 0,2 M KH2PO4 (MG = 136,09)

Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,4 bereikt wordt.

23

3.2 BEREIDING MICROSOMEN

3.2.1 Materialen

Om te homogeniseren worden een Potter-elvehjem systeem met teflon pestle (VWR®,

Leuven, België), bevestigd op een automatische roerder (Heidolph, Duitsland), en een Ultra-

turrax T8 (Ika Works, Duitsland) gebruikt. Om te centrifugeren wordt een Beckman

ultracentrifuge L8-70M (Beckman, USA) gebruikt.

3.2.2 Methode

FIGUUR 3.1: ALGEMENE PROCEDURE BEREIDING MICROSOMEN.

1) Homogenisatie.

o Ontdooi het leverstaal op ijs. Elke stap gebeurt op ijs! Ook de rotor van de

centrifuge en de centrifugebuisjes moeten reeds de dag op voorhand in de

koelkast (4°C) staan.

o Was het staal met buffer 1, dit tot de buffer niet meer rood kleurt.

o Dep het staal droog met een kompres.

o Weeg het staal.

o Snij het staal in kleine stukjes met een schaartje en een scalpel.

o Breng het staal over in het Potter-elvehjem systeem.

o Voeg hieraan 5 ml (dispensor) buffer 1 toe.

24

o Spoel het petrischaaltje en de pincet na met 5 ml buffer en voeg dit ook toe aan

het Potter-elvehjem systeem.

o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5).

o Veeg de pestle af om de gal te verwijderen.

o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5) en giet alles over in een

centrifugebuisje.

o Homogeniseer met de Ultra-turrax en giet alles opnieuw in het Potter-elvehjem

systeem.

o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5) en giet alles over in hetzelfde

centrifugebuisje.

o Spoel het Potter-elvehjem systeem 2 keer na met 5 ml buffer 1 en voeg dit ook

toe aan het centrifugebuisje (totale hoeveelheid buffer 1=20 ml, de hoeveelheid

is niet van belang maar voeg maximum 20 ml toe anders loopt het

centrifugebuisje over).

o Indien het nog niet homogeen genoeg is: alles nogmaals homogeniseren met de

Ultra-turrax en het Potter-elvehjem systeem (bij menselijke stalen is dit

meestal nodig).

o Sluit het centrifugebuisje af en zwenk het een aantal keer om. Neem hieruit

150 µl, breng het in een cupje en plaats het in de koelkast (Matsubara).

2) Differentiële centrifugatie.

o Een centrifugebuisje met water tegenwegen en tegenover het staal zetten in de

rotor van de centrifuge.

o Centrifugeer bij 4°C, 20 min bij 10 500 r.p.m.

o Breng met een pasteurpipetje het supernatans over in een nieuw

centrifugebuisje.



o Centrifugeer bij 4°C, 1u 15min bij 33 000 r.p.m.

o Verwijder het supernatans met een pasteurpipet.

o Voeg 5 ml buffer 1 toe aan de pellet en maak los met een roerstaaf.

o Homogeniseer op dezelfde manier als bij stap 1 (homogenisatie), maar gebruik

enkel het Potter-elvehjem systeem. Voeg opnieuw maximum 20 ml buffer 1

toe.

25



o Centrifugeer bij 4°C, 1u 15min bij 33 000 r.p.m.

o Verwijder het supernatans met een pasteurpipet.

o Voeg buffer 2 toe aan de pellet, nl. ongeveer 3 ml per gram lever. Voeg niet

alles in één keer toe maar hou wat over om na te spoelen. Maak de pellet los

met een roerstaaf.

o Homogeniseer op dezelfde manier als bij stap 1 (homogenisatie), maar gebruik

enkel het Potter-elvehjem systeem.

o Sluit het centrifugebuisje en zwenk het om zodanig dat een homogene

suspensie bekomen wordt. Neem hieruit 250 µl, breng het in een cupje en

plaats het in de koelkast (Bradford en Matsubara).

o Breng vervolgens de bekomen suspensie per 0,5 ml over in cryovials.

o Breng deze cryovials in vloeibare stikstof om ze onmiddellijk in te vriezen.

o Bewaar de cryovials bij -80°C. De microsomen zijn tot 5 jaar lang stabiel bij

-80°C (Yamazaki et al., 1997).

3.3 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY

3.3.1 Materialen

Om de proteïnebepaling uit te voeren wordt een Modified Lowry Protein Assay Kit

(Pierce, Rockford, USA) en een VV3 vortex (VWR®, Leuven, België) gebruikt. Een

Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK) wordt gebruikt om de

absorbantie te meten.

3.3.2 Methode

De handleiding voor de proteïnebepaling volgens Lowry wordt meegeleverd met de kit

(zie bijlage 1).

3.4 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD

3.4.1 Materialen

Om de proteïnebepaling uit te voeren wordt een Coomassie (Bradford) Protein Assay

Kit (Pierce, Rockford, USA) gebruikt en een Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia

Biotech, Cambridge, UK) wordt gebruikt om de absorbantie te meten.

26

3.4.2 Methode

De handleiding voor de proteïnebepaling volgens Bradford wordt meegeleverd met de

kit (zie bijlage 2).

3.5 CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA

3.5.1 Materialen

Natriumthiosulfaat (Na2S2O4) wordt aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven,

België. De verdunning wordt gemaakt met Millipore water (Brussel, België).

Koolstofmonoxide (CO) wordt door het laboratorium voor Toxicologie verschaft (cilindergas,

Air Liquide, Luik, België). Een Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia Biotech,

Cambridge, UK) wordt gebruikt om een spectrum op te nemen. SWIFT II Wavescan wordt

daarbij als software gebruikt.

3.5.2 Methode (Schenkman & Jansson, 1998)

o Ontdooi een cryovial met microsomale suspensie op ijs.

o Maak volgende verdunning in een proefbuisje van 5 ml:

TABEL 3.1: VERDUNNING BIJ DE METHODE VAN OMURA.

water 0,875 mlbuffer 3 0,250 mlonverdunde microsomen 0,125 ml

totaal volume 1,250 mlverdunningsfactor 10

o Voeg een spatelpunt Na2S2O4 toe aan het proefbuisje en laat het proefbuisje 5

minuten staan.

o Breng de helft van de inhoud van het proefbuisje in een cuvet (referentie) en

laat de rest in het proefbuisje.

o Laat 1 min CO borrelen door het proefbuisje, de snelheid daarbij is 1 à 2

bubbels per seconde. Breng daarna de vloeistof in een tweede cuvet (sample).

o Neem een spectrum op tussen 400 en 500 nm en bepaal het ‘difference’

spectrum tussen referentie en sample.

o Bepaal het verschil tussen ∆A450 en ∆A490.

27

o Bereken de concentratie aan CYP450-enzymen met behulp van de wet van

Lambert-Beer (zie vergelijking 1). In dit geval wordt de wet van Lambert-Beer

herschreven tot (zie vergelijking 4):

c=(�A(450-490)*f*1000)/91 (vergelijking 4)

waarin: c: CYP450-concentratie (nmol/ml)

�A(450-490): extinctieverschil tussen 450 nm en 490 nm

f: verdunningsfactor

91: extinctiecoëfficient (mM-1.cm-1)

3.6 CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA

3.6.1 Materialen

Zie 3.5 CYP450-bepaling volgens Omura.

3.6.2 Methode (Matsubara et al., 1976)

o Ontdooi een cryovial met microsomale suspensie op ijs.

o Maak dezelfde verdunning als bij de CYP450-bepaling volgens Omura (zie

Tabel 3.1).

o Laat 1 minuut CO borrelen door het proefbuisje, de snelheid daarbij is 1 à 2

bubbels per seconde.

o Breng de helft van de inhoud van het proefbuisje in een cuvet (referentie) en

laat de rest in het proefbuisje.

o Voeg een spatelpunt Na2S2O4 toe aan het proefbuisje en hou het gesloten

zodanig dat het CO niet ontsnapt.

o Breng de vloeistof na 5 minuten in een tweede cuvet (sample).

o Neem een spectrum op tussen 400 en 500 nm en bepaal het ‘difference’

spectrum tussen referentie en sample.

o Bepaal het verschil tussen ∆A450 en ∆A490.

o Bereken de concentratie aan CYP450-enzymen met behulp van de wet van

Lambert-Beer. De formule is analoog als bij de methode van Omura (zie

vergelijking 4) maar de extinctiecoëfficient is nu 104 mM-1.cm-1 in plaats van

91 mM-1.cm-1.

28

3.7 CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN

3.7.1 Kwalitatieve controle microsomen

3.7.1.1 Materialen

o Buffer 4 (zie 3.1.4).

o Kaliumchloride (KCl), aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.

o Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (C21H26N7Na4O17P3, NADPH.4Na),

aangekocht bij AppliChem, Darmstadt, Duitsland.

o Midazolam (C18H13CIFN3), gedoneerd door Roche, Brussel, Belgïe.

o Dextromethorphan (C18H25NO.HBr.H2O), aangekocht bij Sigma-Aldrich,

Bornem, België.

o Acetonitrile (CH3CN), aangekocht bij Biosolve, Valkenswaard, Nederland.

o Millipore-water, Brussel, België.

Verder wordt een Multi Blok Heater (Lab-Line Instruments, Melrose Park, Illinois,

USA) in combinatie met een schudtoestel, VXR basic IKA-VIBRAX (IKA ®, Staufen,

Duitsland), gebruikt tijdens de incubatie. Om de cupjes te centrifugeren wordt een Sigma 2-16

K centrifuge (Sartorius, Vilvoorde, België) gebruikt.

Om de scheiding en detectie van 1-hydroxymidazolam en dextrorphan uit te voeren

wordt een LC-MS/MS methode gebruikt (Kim et al., 2005). De volgende toestellen en

materialen worden hierbij gebruikt:

o HPLC Autosampler 460, Kontron Instruments Ltd., Bletchley, UK.

o Phenomenex Luna C18(2) kolom (50 mm x 2 mm, partikelgrootte: 3 µm),

Utrecht, Nederland.

o Phenomenex Security Guard C18 (4 mm x 200 mm), Utrecht, Nederland.

o Acetonitrile UPLC (CH3CN), aangekocht bij Biosolve, Valkenswaard,

Nederland.

o Mierenzuur UPLC (HCOOH), aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven,

België.

o VG Quattro II, Micromass® Waters, Manchester, UK.

o Masslynx 4.0 software, Micromass® Waters, Manchester, UK.

o Millipore-water, Brussel, België.

29

3.7.1.2 Methode

1) Voorbereiding: bereiding van de oplossingen.

o Buffer 4.

o 1,15 % KCl (MG = 74,55).

o 5 mM NADPH.4Na (MG = 83,35).

o 25 µM midazolam (MG = 325,78).

o 50 µM dextromethorphan (MG = 370,32).

o Verdun de microsomale suspensie tot een proteïneconcentratie van 1,25

mg/ml.

2) Pre-incubatie.

o Breng 50 µl van de midazolam oplossing of de dextromethorphan oplossing,

de fosfaatbuffer en de KCl oplossing in een cupje.

o Plaats ze in een schudtoestel bij 37°C tot alles op temperatuur is.

o Voeg 50 µl van de NADPH.4Na oplossing toe, vortex en plaats exact 3

minuten op het schudtoestel bij 37°C.

3) Incubatie.

o Start de reactie door 50 µl verdunde microsomen toe te voegen en laat de

reactie exact 15 minuten doorgaan in het schudtoestel bij 37°C.

o Stop de reactie door 100 µl koude acetonitrile toe te voegen. Vortex en plaats

de cupjes op ijs.

o Centrifugeer de cupjes 10 minuten bij 20000g (4°C) en breng het supernatans

over in een auto-injector vial.

Voor de scheiding van de metabolieten en de detectie wordt gebruik gemaakt van een

LC-MS/MS methode (Kim et al., 2005). Er wordt 20 µl supernatans op de kolom geïnjecteerd.

De scheiding wordt uitgevoerd met gradiëntelutie bij een debiet van 200 µl/min. Eluens A

bestaat uit water en 0,1% mierenzuur (zwak eluens). Eluens B bestaat uit acetonitrile en 0,1%

mierenzuur (sterk eluens). De gebruikte gradiënt wordt weergegeven in Figuur 3.2.

30

m/z precursorion m/z productionen botsingsenergie (eV) capillair (kV) T (°C) cone (V)1 342,20 203,00 20 4 110 25

324,002 258,29 157,00 25 4 110 25

133,10

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15tijd (min)

pe

rce

nta

ge

elu

en

s B

(%

)

FIGUUR 3.2: GRADIËNT.

De vloeistof die van de kolom elueert wordt geleid naar de massaspectrometer waar de

metabolieten, 1-hydroxymidazolam en dextrorphan, geïoniseerd worden met behulp van

‘electrospray’ ionisatie (ESI) in de positieve modus. Er wordt gebruik gemaakt van ‘multiple

reaction monitoring’ (MRM). De m/z-waarden van de geanalyseerde precursor- en

productionen en de instellingen van de massaspectrometer zijn weergegeven in Tabel 3.2.

TABEL 3.2: INSTELLINGEN MASSASPECTROMETER, 1 = 1-HYDROXYMIDAZOLAM,

2 = DEXTRORPHAN.

3.7.2 Controle karakterisatiemethoden

3.7.2.1 Materialen

Commerciële rattenmicrosomen worden aangekocht bij BD Biosciences Discovery

Labware, Woburn, Massachusetts, USA.

3.7.2.2 Methode

o De methode van Bradford wordt uitgevoerd op de microsomen (zie 3.4).

o De methode van Matsubara wordt uitgevoerd op de microsomen (zie 3.6).

o Vervolgens wordt nagegaan of de bekomen totale proteïneconcentratie en het

bekomen CYP450-gehalte overeenstemmen met de meegeleverde

karakteristieken van de rattenmicrosomen (weergegeven in Tabel 3.3).

31

TABEL 3.3: GEGEVENS COMMERCIËLE RATTENMICROSOMEN.

Catalogus nummer 452511Lot nummer 6176Inhoud 0,5 mlProteïneconcentratie 20 mg/ml in 250 mM sucroseTotaal CYP450-gehalte 740 pmol/mg proteïne

32

4 RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1 BEREIDING MICROSOMEN

De bereiding van de microsomen is gebaseerd op de methode die gebruikt wordt aan de

University of Sheffield (UK) en in Janssen Farmaceutica te Beerse (België). Om de methode

op punt te stellen wordt eerst geëxperimenteerd met ratten- en muizenlevers. De microsomen

kunnen tot 5 jaar bij -80°C bewaard worden, met zeer weinig tot geen verlies aan CYP450-

activiteit (Yamazaki et al., 1997).

Door een fysiologisch zoutoplossing (natriumchloride oplossing) via de portale vene

door de geëxplanteerde lever te laten circuleren, kan een microsomale suspensie vrij van

hemoglobine bekomen worden (Onbekend, 2009). In dit onderzoek gebeurt dit echter niet,

waardoor contaminatie met hemoglobine onvermijdelijk is. Om toch zoveel mogelijk

hemoglobine te verwijderen is het belangrijk om het leverstaal na ontdooien zo goed mogelijk

te wassen met buffer 1. Kaliumchloride helpt bij de verwijdering van hemoglobine

(Onbekend, 2009).

Om de leverstalen te homogeniseren wordt het best gebruik gemaakt van zowel een

Ultra-turrax als een Potter-elvehjem systeem. Na het snijden van het staal in kleine stukjes

met een scalpel en een schaartje, wordt alles overgebracht in het Potter-elvehjem systeem. Na

een eerste keer homogeniseren met het Potter-elvehjem systeem is het belangrijk om de gal te

verwijderen van de pestle, alvorens een tweede keer te homogeniseren. De gal treedt op als

glijmiddel tussen de pestle en de glazen buis van het Potter-elvehjem systeem, waardoor de

efficiëntie waarmee het Potter-elvehjem systeem homogeniseert vermindert. Vervolgens kan

de massa eventueel verder gehomogeniseerd worden met de Ultra-turrax en nog een derde

keer met het Potter-elvehjem systeem. Wanneer eerst gehomogeniseerd wordt met de Ultra-

turrax treedt er verlies op van het staal doordat grote stukken staal blijven kleven aan de

Ultra-turrax. De stukjes die na homogeniseren met het Potter-elvehjem systeem blijven kleven

aan de Ultra-turrax zijn voornamelijk vetweefsel en galwegen. In deze weefsels zijn geen

CYP450-enzymen aanwezig, en er is bijgevolg geen verlies aan activiteit als deze stukjes

achterblijven.

33

Het is uiterst belangrijk dat elke stap in het proces op ijs gebeurt. Indien het staal bij een

hogere temperatuur behandeld zou worden, bestaat de kans dat de CYP450-enzymen niet

meer actief zullen zijn. Wanneer het staal gehomogeniseerd wordt met behulp van de Ultra-

turrax of het Potter-elvehjem systeem moet zéker in ijs gewerkt worden: door de wrijving

komt warmte vrij, waardoor de proteïnen kunnen denatureren en bijgevolg de activiteit van de

CYP450-enzymen verloren gaat. Zowel het centrifugebuisje als het Potter-elvehjem systeem

moeten daarom in een beker met ijs geplaatst worden, om samen op en neer bewogen te

worden bij het homogeniseren.

Na de eerste keer centrifugeren bij 10000g wordt verder gewerkt met het supernatans.

In het supernatans zijn de microsomen en tal van oplosbare en membraangebonden enzymen

aanwezig. De pellet bevat de mitochondria, de kernen en celafval en mag bijgevolg

weggegooid worden (Onbekend, 2009). Na een tweede centrifugatie bij 100000g wordt een

pellet bekomen waarin de microsomen aanwezig zijn. De pellet wordt gehersuspendeerd in

buffer 1 en nog eens aan centrifugatie bij 100000g onderworpen als wasstap (om zo veel

mogelijk van de overgebleven hemoglobine te verwijderen). De volgende pellet die bekomen

wordt, moet gehersuspendeerd worden in buffer 2. De bekomen microsomale suspensie kan

ingevroren worden met behulp van vloeibare stikstof.

4.2 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY

Vooraleer het proteïnegehalte kan bepaald worden in de microsomale suspensie moet

een standaardcurve opgesteld worden. De standaardcurve wordt opgesteld met een

verdunningsreeks van BSA, waarbij als verdunningsmiddel buffer 2 moet gebruikt worden.

De proteïnebepaling volgens Lowry kan echter niet gebruikt worden om het totale

proteïnegehalte in de microsomale suspensie te bepalen: de kaliumionen interfereren met de

bepaling (Peterson, 1979). Kaliumionen worden getolereerd bij een concentratie van 12 mM.

Buffer 2 bevat een hogere concentratie, ook wanneer de microsomale suspensie 1 op 20

verdund wordt, namelijk iets meer dan 37,5 mM. Hierdoor ontstaat een precipitaat dat

interfereert met de meting (Peterson, 1979). Glycerol wordt getolereerd bij een concentratie

van 100 µl/ml, in buffer 2 is echter 300 µl/ml aanwezig. Wanneer de microsomale suspensie 1

op 20 verdund wordt, is er slecht 15 µl/ml aanwezig. Dus, interferentie door een verhoging

van de absorbantie van de blanco en een verlaging van de absorbantie van de standaardreeks

is niet mogelijk (Peterson, 1979). De bovengenoemde interferentie met de kaliumionen is

34

bijgevolg reeds een aanwijzing dat de voorkeur uit zal gaan naar de methode van Bradford om

het proteïnegehalte in de microsomale suspensie te bepalen.

Wanneer een standaardreeks bereid wordt met buffer 2 en de absorbantie wordt

gemeten, is het onmogelijk om stabiele waarden te bekomen, zodanig dat het ook onmogelijk

is om een standaardcurve op te stellen. Wanneer een standaardreeks bereid wordt met water

kan echter wel een standaardcurve opgesteld worden. Deze is weergegeven in Figuur 4.1.

Zonder standaardcurve kunnen er geen proteïnebepalingen uitgevoerd worden, bijgevolg zal

de methode van Lowry niet gebruikt worden om de totale proteïneconcentratie in de

microsomale suspensie te bepalen.

y = -8E-07x2 + 0,0025x + 0,0163R2 = 0,9986

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

concentratie (µg/ml)

abs

orba

ntie

FIGUUR 4.1: STANDAARDCURVE LOWRY MET WATER ALS VERDUNNINGSMIDDEL.

4.3 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD

Net zoals bij de proteïnebepaling volgens Lowry moet eerst een standaardcurve

opgesteld worden. De standaardcurve wordt opgesteld met een verdunningsreeks van BSA, en

als verdunningsmiddel moet opnieuw buffer 2 gebruikt worden (Figuur 4.2).

y = -3E-07x2 + 0,0013x + 0,0099R2 = 0,9985

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 500 1000 1500 2000 2500


abso

rban

tie

FIGUUR 4.2: STANDAARDURVE BRADFORD MET BUFFER 2 ALS VERDUNNINGSMIDDEL.

35

Om de onbekende proteïneconcentratie van de microsomale suspensie te bepalen

worden de microsomen eerst twintig maal verdund (Wilson et al., 2003). Daarna wordt de

absorbantie, na toevoegen van het Coomassie Brilliant Blue G-250, bepaald en met behulp

van de vergelijking van de standaardcurve kan de onbekende concentratie berekend worden.

Wanneer geen verdunning wordt gebruikt, wordt een absorbantie bekomen die hoger is dan de

bekomen absorbanties in de standaardcurve. Dit wijst erop dat de concentratie hoger is dan

het interval van de standaardcurve. De microsomen worden zodanig verdund dat de totale

proteïneconcentratie in het desbetreffende interval ligt.

In Tabel 7.3 (zie bijlage 3) worden de gemeten absorbanties, de totale

proteïneconcentraties en de variatiecoëfficiënten (VC) per staal weergegeven van negen

stalen. Deze stalen zijn afkomstig van dezelfde humane, gezonde lever. ID 2, ID 3, en ID 4

werden op dag 1 verwerkt tot microsomen. ID 5, ID 6, en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID

13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt. Eerst zal de precisie onder

herhaalbaarheidsvoorwaarden van de methode van Bradford worden nagegaan. Elk staal werd

onder deze voorwaarden drie maal gemeten (met uitzondering van ID 13). Om te besluiten dat

de variabiliteit op de methode van Bradford aanvaardbaar is, mogen de variatiecoëfficiënten

niet meer dan 15% bedragen, zoals aanbevolen wordt in ‘Guidance for Industry –

Bioanalytical Method Validation’, opgesteld door de FDA. Alle variatiecoëfficiënten zijn

kleiner dan 15 %. Er kan bijgevolg besloten worden dat de methode van Bradford herhaalbaar

is.

Vervolgens worden de ‘within-day’ en ‘between-day’ variabiliteit van de totale

proteïneconcentratie nagegaan door de intermediaire precisie te bepalen. Hiervoor worden in

dit experiment stalen afkomstig van dezelfde lever op dezelfde dag en op verschillende dagen

verwerkt. Om de ‘within-day’ variabiliteit te bepalen, wordt de variatiecoëfficiënt berekend

van de gemiddelde totale proteïneconcentratie op dag 1, dag 2 en dag 3 afzonderlijk. Om de

‘between-day’ variabiliteit te bepalen, wordt de variatiecoëfficiënt berekend van de

gemiddelde totale proteïneconcentratie van de 3 dagen. De resultaten zijn samengevat in

Tabel 4.1 en Tabel 4.2.

36

TABEL 4.1: TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE VOLGENS BRADFORD VAN GEZOND,

HUMAAN LEVERWEEFSEL.

staala aantal gram lever [proteïne](mg/ml) [proteïne](mg/gram lever)

ID 2 3,45 4,15 12,03ID 3 3,68 4,41 13,19ID 4 3,35 4,32 12,88ID 5 3,71 4,30 12,76ID 6 3,76 4,19 12,27ID 12 2,79 4,30 12,32ID 13 3,39 3,25 9,59ID 18 3,96 4,26 12,92ID 19 4,37 3,84 11,43

a ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en

ID 19 werden op dag 3 verwerkt.

TABEL 4.2: ‘WITHIN-DAY’ VARIABILITEIT EN ‘BETWEEN-DAY’ VARIAB ILITEIT VAN DE

TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE.

dag gemiddelde [proteïne](mg/gram lever) variantie standaarddeviatie VC (%)1 12,70 0,3601 0,6001 4,722 12,45 0,0714 0,2672 2,153 11,31 2,7737 1,6654 14,72

1 + 2 + 3 12,15 0,5452 0,7384 6,07

Uit de variatiecoëfficiënten kan besloten worden dat de ‘within-day’ variabiliteit op dag

1 (4.72%), dag 2 (2,15%) en dag 3 (14,72%) aanvaardbaar is. De ‘between-day’ variabiliteit is

ook aanvaardbaar (6.07%). Dit is een eerste indicatie dat de microsomen op een

reproduceerbare manier worden bereid. De gemiddelde totale proteïneconcentratie van dit

gezond leverweefsel bedraagt 12,15 mg/gram lever.

4.4 CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA

De methode van Omura is niet de meest geschikte methode om het CYP450-gehalte te

bepalen. De ratten- en muizenlevers die gebruikt worden om te experimenteren worden niet

behandeld met een fysiologische zoutoplossing net na verwijdering, waardoor het moeilijk is

om een staal te bekomen dat volledig vrij is van hemoglobine (Onbekend, 2009). Vooral het

homogenaat is sterk gecontamineerd met hemoglobine, bij de microsomale suspensie is dit

door de extra wasstap in de bereiding minder uitgesproken. Ook bij de humane stalen zal na

transplantatie geen fysiologische zoutoplossing gebruikt worden, zodanig dat ook hier

contaminatie met hemoglobine onvermijdelijk is. Door deze contaminatie schuift de

37

golflengte van de piek in het difference spectrum op van 450 nm naar 454 nm. Het verschil in

absorbantie bij 450 nm en 490 nm daalt hierdoor (Matsubara et al., 1976).

Wanneer het CYP450-gehalte bepaald wordt met behulp van de methode van Omura is

het moeilijk om bij eenzelfde verdunning overeenstemmende spectra te bekomen (zie

bijvoorbeeld Figuur 4.3, Figuur 4.4 en Figuur 4.5). De bekomen concentraties met behulp van

vergelijking 4 zijn ook niet reproduceerbaar en soms worden er zelfs negatieve waarden

bekomen (zie Tabel 4.3).

FIGUUR 4.3: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN OMURA (OMURA20/04E1).



38

TABEL 4.3: CYP450-GEHALTE VOLGENS OMURA VAN EEN GEZONDE RATTENLEVER.

staala �A(450nm-490nm) concentratie (nmol/ml)b verdunningsfactor

Omura20/04E1 0,005 1,10 20Omura20/04E2 -0,010 -2,20 20Omura20/04E3 -0,004 -0,88 20Omura20/04E4 -0,006 -0,66 10Omura20/04E5 -0,002 -0,22 10Omura20/04E6 0,000 0,00 10

a Deze microsomen zijn allemaal afkomstig van hetzelfde leverstaal (rattenlever 8,01 gram). b In de weergegeven concentraties is reeds rekening gehouden met de verdunningsfactor.

4.5 CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA

Om de gebreken van de methode van Omura te omzeilen, wordt de methode van

Matsubara gebruikt om het CYP450-gehalte te bepalen. De interferentie van hemoglobine

wordt bij deze methode uitgeschakeld doordat zowel het referentiecuvet als het staalcuvet

doorborreld worden met CO. Een voorbeeld van een ‘difference’ spectrum is weergegeven in

Figuur 4.6. Het CYP450-gehalte moet bepaald worden in het homogenaat en in de

microsomale suspensie om de recovery factor te bepalen. Deze waarde is nodig om de

MPPGL te bereken. Het homogenaat en de microsomale suspensie worden tien maal verdund

om het CYP450-gehalte te bepalen. Bij de bepalingen op het homogenaat stellen zich op dit

moment nog enkele problemen, dus er zijn nog geen gegevens beschikbaar. Er zijn onder

andere nog tal van interfererende componenten (zoals bindweefsel) aanwezig in het

homogenaat, waardoor een bepaling nog niet mogelijk is (Matsubara et al., 1976). Een

eventuele oplossing zou het gebruik van een soort zeef of filter kunnen zijn, zoals ook bij

Wilson et al. wordt toegepast (Wilson et al., 2003). De bepaling kan daarentegen wel reeds

uitgevoerd worden op de microsomale suspensie.

FIGUUR 4.6: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN MATSUBARA (ID18).

39

dag gemiddelde [CYP450] (pmol/mg proteïne) variantie standaarddeviatie VC (%)1 358,44 1632 40,4034 11,272 334,87 11690 108,1197 32,293 444,90 23013 151,7006 34,10

1 + 2 + 3 379,41 11601 107,7081 28,39

In Tabel 7.4 (zie bijlage 4) worden de absorbantieverschillen, de CYP450-gehaltes

(microsomale suspensie) en de variatiecoëfficiënten per staal weergegeven van dezelfde

negen stalen als in Tabel 7.3 (zie bijlage 3). Ook hier zal eerst de precisie onder

herhaalbaarheidsvoorwaarden van de methode van Matsubara worden nagegaan. Elk staal

werd onder deze voorwaarden drie maal gemeten. Om te besluiten dat de variabiliteit op de

methode van Matsubara aanvaardbaar is, mogen de variatiecoëfficiënten opnieuw niet meer

dan 15% bedragen, zoals aanbevolen wordt in ‘Guidance for Industry – Bioanalytical Method

Validation’, opgesteld door de FDA. De variatiecoëfficiënten liggen per staal meestal beneden

de 15 % (behalve bij ID 4 en ID 13 – merk op: bij ID 4 werd een buisje gebroken en het totale

proteïnegehalte van ID 13 ligt duidelijk lager dan bij de andere stalen), zodus kan besloten

worden dat de methode van Matsubara herhaalbaar is.

Vervolgens worden ook de ‘within-day’ en ‘between-day’ variabiliteit van het CYP450-

gehalte nagegaan door de intermediaire precisie te bepalen (analoog aan de methode van

Bradford). De resultaten zijn weergegeven in Tabel 4.4 en Tabel 4.5.

TABEL 4.4: CYP450-GEHALTE VOLGENS MATSUBARA VAN GEZOND, HUMAAN

LEVERWEEFSEL.

staala [CYP450] (nmol/ml) [CYP450] (pmol/mg proteïne)ID 2 1,57 378,38ID 3 1,70 384,99ID 4 1,35 311,94ID 5 1,92 446,99ID 6 1,38 326,38ID 12 0,99 231,25ID 13 1,92 617,68ID 18 1,63 383,49ID 19 1,28 333,54

a ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden

op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt.

TABEL 4.5: ‘WITHIN-DAY’ VARIABILITEIT EN ‘BETWEEN-DAY’ VARIAB ILITEIT VAN

HET CYP450-GEHALTE.

40

Uit de waarden kan besloten worden dat de ‘within-day’ variabiliteit op dag 1 (11,27%)

aanvaardbaar is. Op dag 2 (32,29%) en dag 3 (34,10%) is deze echter niet aanvaardbaar. De

‘between-day’ variabiliteit is ook niet aanvaardbaar (28,39%). Alle stalen zijn afkomstig van

dezelfde lever, dus in principe zou het CYP450-gehalte in elk staal hetzelfde moeten zijn. Dit

is, zoals blijkt uit Tabel 4.4, niet het geval. De totale proteïneconcentraties in elk staal komen

echter wel goed overeen (zie Tabel 4.1). Hoe kan het dan zijn dat het CYP450-gehalte in elk

staal zo sterk verschilt? De uitvoering van de methode kan niet aan de basis van het probleem

liggen, eerder werd reeds aangetoond dat de methode van Matsubara herhaalbaar is (zie

bijlage 4). De bereiding van de microsomen werd hoogstwaarschijnlijk op een

reproduceerbare manier uitgevoerd want de totale proteïneconcentraties komen overeen. Als

dit niet het geval zou zijn dan zouden er bij het ene staal meer proteïnen verloren gaan dan in

het ander, en dat zou zich zowel weerspiegelen in de totale proteïneconcentratie als in het

CYP450-gehalte en niet - zoals hier het geval - enkel in het CYP450-gehalte.

Een eerste mogelijke oorzaak zou de gevoeligheid van de spectrofotometer kunnen zijn.

Een absorbantieverschil van bijvoorbeeld 0,013 geeft een concentratie van 1,25 nmol CYP450

per ml, een absorbantieverschil van 0,017 geeft een concentratie van 1,63 nmol CYP450 per

ml. Dit is een groot verschil in CYP450-gehalte, maar een klein verschil in absorbantie

(0,004). Zelfs wanneer altijd dezelfde cuvetjes worden gebruikt, kan dit verschil niet

uitgesloten worden. Wanneer het gemiddelde wordt genomen van een groot aantal metingen,

speelt de variatie op de waarden geen zo’n grote rol meer. Maar dit is in dit onderzoek echter

praktisch gezien niet haalbaar omdat er te weinig staal ter beschikking is. Echter, in theorie

zou de methode robuust genoeg moeten zijn om dit probleem, zijnde de gevoeligheid van de

spectrofotometer, te overwinnen.

Een tweede mogelijke oorzaak zou de locatie in de lever van het genomen staal kunnen

zijn. De verschillende stukjes lever zijn afkomstig van verschillende locaties in de lever. Bij

ratten werden reeds significante verschillen in het CYP450-gehalte tussen verschillende zones

vastgesteld. Bij de mens werden geen significante verschillen aangetoond. Hieromtrent is

echter nog maar één studie uitgevoerd, dus verder onderzoek is nodig (Wilson et al., 2003).

41

4.6 CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN

4.6.1 Kwalitatieve controle microsomen

Om na te gaan of de microsomen adequaat bereid zijn, kan een kwalitatieve controle

uitgevoerd worden. Hierbij worden de microsomen geïncubeerd met de selectieve probes

midazolam (CYP3A4) en dextromethorphan (CYP2D6). Deze twee componenten werden

gekozen omdat hun metabolieten, 1-hydroxymidazolam en dextrorphan, reeds goed kunnen

gedetecteerd worden met de huidige methode. Door infusie van standaardoplossingen werden

de m/z-waarden van de precursor- en productionen bepaald (zie Tabel 3.2) en door injectie

van standaardoplossingen werden de retentietijden bepaald. De retentietijd (tr) van 1-

hydroxymidazolam bedraagt ongeveer 5,07 min, en deze van dextrorphan bedraagt ongeveer

4,49 min. De methode is echter nog niet gevalideerd zodus kunnen nog geen kwantitatieve

bepalingen uitgevoerd worden. Om de incubatie uit te voeren wordt uitgegaan van het

protocol dat aan de University of Sheffield (UK) wordt gebruikt.

Een eerste experiment dat wordt uitgevoerd is het incuberen van een blanco. Deze

blanco bevat buffer 4, kaliumchloride, NADPH en microsomen. Er worden geen probes

toegevoegd, dus er kan geen vorming van metabolieten plaatsvinden. In het resulterende

chromatogram zouden dan ook geen pieken mogen waargenomen worden op de geselecteerde

m/z-kanalen. Dit blijkt - zoals te zien is in Figuur 4.7 - het geval te zijn en bewijst dat er geen

andere interfererende bestanddelen aanwezig zijn.

In het volgende experiment wordt nagegaan of de metabolieten wel degelijk in het

supernatans aanwezig zijn na incubatie en centrifugatie. Hierbij wordt het incubatieprotocol

gevolgd zonder het toevoegen van een probe. Na het inhiberen van de enzymen door

toevoegen van acetonitrile worden de incubaten gespiked met een mengsel van 1-

hydroxymidazolam en dextrorphan in een concentratie van 140 ng/ml, 350 ng/ml, 700 ng/ml

en 1750 ng/ml. Dit geeft respectievelijk een concentratie van 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml,

en 250 ng/ml 1-hydroxymidazolam en dextrorphan in het incubaat. De chromatogrammen van

zo’n reeks zijn weergegeven in Figuur 4.8 en Figuur 4.9. Door de aanwezigheid van een piek

op de juiste retentietijden kan besloten worden dat de metabolieten in het supernatans

aanwezig zijn.

42

3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50Time0

100

%

0

100

%

IncBl 090506 03 2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203

1.46e34.92

4.88

4.85

4.82

5.32

5.285.19

5.34

5.44

IncBl 090506 03 1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157

1.80e34.47

4.11

4.03

4.01

4.33

4.49

4.624.67

4.68

4.78

FIGUUR 4.7: CHROMATOGRAM BLANCO: KANAAL 1-HYDROXYMIDAZOLAM (BO VEN)

EN KANAAL DEXTRORPHAN (ONDER).

3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

090511 Spike250 1 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203

1.67e55.06


5.20e45.15


3.64e45.04


8.93e35.15

FIGUUR 4.8: CHROMATOGRAM NA SPIKEN MET EEN MENGSEL VAN

1-HYDROXYMIDAZOLAM EN DEXTRORPHAN: KANAAL 1-HYDROXY MIDAZOLAM (VAN

BOVEN NAAR ONDER: 250, 100, 50 EN 20 NG/ML).

43

3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%


5.39e54.53


2.85e54.43


1.89e54.46


6.64e44.59

FIGUUR 4.9: CHROMATOGRAM NA SPIKEN MET EEN MENGSEL VAN

1-HYDROXYMIDAZOLAM EN DEXTRORPHAN: KANAAL DEXTRORPHAN (VAN BOVEN

NAAR ONDER: 250, 100, 50 EN 20 NG/ML).

Daarna wordt bepaald of er wel degelijk metaboliet wordt gevormd in het incubaat

wanneer het incubatieprotocol gevolgd wordt. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van

commercieel aangekochte rattenmicrosomen, want hiervan is zeker dat de CYP450-enzymen

nog actief zijn. De concentratie van de probes tijdens de incubatie moet rond de Michaëlis-

Menten constante (Km) liggen. Voor midazolam is een finale concentratie van 5 µM vereist en

voor dextromethorphan 10 µM. Uit Figuur 4.10 kan besloten worden dat de metabolieten

aanwezig zijn en dat het incubatieprotocol bijgevolg geschikt is.

Ten laatste wordt een kwalitatieve controle op de zelfbereide microsomen uitgevoerd.

Dezelfde negen stalen als bij de methode van Bradford en Matsubara (zie bijlage 3 en 4)

worden nu geïncubeerd met midazolam en dextromethorphan. Bij alle stalen konden de

metabolieten gedetecteerd worden. Dit wijst erop dat de zelfbereide microsomen actieve

CYP450-enzymen bevatten, wat opnieuw bewijst dat de microsomen op een adequate manier

worden bereid. Het chromatogram van ID 18 is weergegeven in Figuur 4.11.

44

3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50Time0

100

%

0

100

%

090511 Com MDZ2 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203

4.21e45.17

4.81

090511 Com DM2 Sm (Mn, 2x3) 1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157

5.33e54.46

FIGUUR 4.10: CHROMATOGRAM COMMERCIËLE MICROSOMEN: KANAAL 1-

HYDROXYMIDAZOLAM (BOVEN) EN KANAAL DEXTRORPHAN (ONDER).

3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50Time0

100

%

0

100

%

090511 ID18 MDZ3 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203

1.03e55.09

090511 ID18 DM3 Sm (Mn, 2x3) 1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157

2.49e54.58

FIGUUR 4.11: CHROMATOGRAM ID 18: KANAAL 1-HYDROXYMIDAZOLAM (BOV EN) EN

DEXTRORPHAN (ONDER).

45

4.6.2 Controle karakterisatiemethoden

Bij aankoop van commerciële microsomen zorgt de fabrikant steeds voor een volledige

karakterisatie. Zowel de totale proteïneconcentratie als het CYP450-gehalte en de activiteit

van verschillende isovormen van de CYP450-enzymen worden bepaald. Om na te gaan of de

methode van Bradford en Matsubara nauwkeurig worden uitgevoerd, worden deze methoden

toegepast op de volledig gekarakteriseerde commerciële rattenmicrosomen (zie Tabel 3.3).

Eerst wordt nagegaan of de methode van Bradford nauwkeurig wordt uitgevoerd. In

Figuur 4.12 wordt de gebruikte standaardcurve weergegeven en in Tabel 4.6 worden de

gemeten absorbanties van de commerciële rattenmicrosomen weergegeven. Met behulp van

de vergelijking van de standaardcurve kan vervolgens de proteïneconcentratie bepaald

worden: deze bedraagt in dit geval 20,19 mg/ml. De meegeleverde waarde is 20 mg/ml. Dit

bewijst dat de methode van Bradford op punt staat.

y = -3E-07x2 + 0,0013x + 0,0176R2 = 0,9985

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 500 1000 1500 2000 2500


abso

rban

tie

FIGUUR 4.12: STANDAARDURVE BRADFORD MET BUFFER 2 ALS

VERDUNNINGSMIDDEL.

TABEL 4.6: METINGEN COMMERCIËLE RATTENMICROSOMEN.

absorbantie meting 1a 0,137




gemiddelde 0,14575proteïneconcentratie (mg/ml) 20,1855

a De metingen werden uitgevoerd op 200 maal verdunde microsomen en de

absorbantie van de blanco is reeds afgetrokken van de weergegeven absorbanties.

46

Daarna wordt gecontroleerd of methode van Matsubara nauwkeurig wordt uitgevoerd. De

microsomale suspensie wordt eerst 5 maal verdund, zodanig dat de suspensie een totale

proteïneconcentratie bevat die gelijkaardig is aan wat bekomen wordt met het gebruikte

protocol in deze masterproef. De bekomen absorbanties zijn: 0,017; 0,023 en 0,017

(gemiddelde 0,019). Met behulp van de wet van Lambert-Beer wordt een gemiddeld CYP450-

gehalte van 452,43 pmol/mg proteïne bekomen. De meegeleverde waarde is 740 pmol/mg

proteïne. Dit bewijst dus ook dat er nog problemen zijn met de methode van Matsubara. Om

de meegeleverde concentratie te bekomen zou een absorbantieverschil van 0,031

waargenomen moeten worden. Hoogstwaarschijnlijk is dit te wijten aan de gevoeligheid van

de spectrofotometer, maar dit kan niet met zekerheid gezegd worden. Dit probleem moet nog

verder onderzocht worden.

47

5 CONCLUSIES

Het doel van deze masterproef was vierledig.

1) microsomen bereiden

2) proteïnebepaling

3) CYP450-bepaling

4) controle van microsomen en karakterisatiemethoden

Het eerste doel van deze masterproef was de ontwikkeling van een protocol voor de

bereiding van humane microsomen. Daarbij werd eerst geëxperimenteerd met ratten- en

muizenlevers en vervolgens werd ook een stuk gezond, humaan leverweefsel verwerkt. Een

aantal belangrijke bevindingen waren onder andere dat elke stap zoveel mogelijk op ijs moet

gebeuren zodanig dat de enzymactiviteit behouden blijft. Daarnaast is een goede

homogenisatie van het staal van uiterst belang. Menselijke stalen, afkomstig van zieke levers,

zijn vaak taai om te verwerken en een goede homogenisatie verloopt daarom moeizamer dan

bij rattenlevers.

Om het totale proteïnegehalte te bepalen van microsomen werd gekozen voor de

methode van Bradford. De methode van Lowry kan niet gebruikt worden omwille van een te

hoge kaliumconcentratie in de buffer: deze kaliumionen interfereren met de

bepalingsmethode. De methode van Bradford is de beste methode omdat er geen interferenties

zijn en omdat het de minst arbeidsintensieve methode is. Experimenten hebben aangetoond

dat de methode van Bradford op een herhaalbare manier werd uitgevoerd. De ‘within-day’

variabiliteit en ‘between-day’ variabiliteit op de bekomen totale proteïneconcentraties waren

aanvaardbaar en bijgevolg kan besloten worden dat de microsomen op een reproduceerbare

manier werden bereid.

Doordat het homogenaat en de microsomale suspensie gecontamineerd zijn met

hemoglobine, werd geopteerd om de methode van Matsubara te gebruiken om het CYP450-

gehalte te bepalen. Er werd aangetoond dat de methode van Omura gevoelig is aan deze

interferentie. De bepaling van het CYP450-gehalte in het homogenaat lukt nog niet door de

aanwezigheid van interfererende bestanddelen. Een eventuele oplossing zou het gebruik van

een soort zeef of filter kunnen zijn, zoals ook bij Wilson et al. wordt toegepast (Wilson et al.,

2003). De bepaling van het CYP450-gehalte in de microsomale suspensie lukt echter wel al.

Experimenten (microsomale suspensie) hebben aangetoond dat de methode van Matsubara op

48

een herhaalbaare manier werd uitgevoerd. De ‘within-day’ variabiliteit en ‘between-day’

variabiliteit op de bekomen CYP450-gehaltes waren echter niet aanvaardbaar. Het is nog niet

duidelijk wat hiervan de oorzaak is. Mogelijks is er een probleem met de gevoeligheid van de

spectrofotometer, ook de locatie in de lever van het genomen staal zou mogelijks een

verklaring kunnen zijn. Wat betreft de gevoeligheid van de spectrofotometer: dit is een

probleem dat moeilijk op te lossen is. Eventueel zou een groot aantal metingen kunnen

uitgevoerd worden en vervolgens het gemiddelde berekend worden, maar om praktische

redenen is dit echter niet haalbaar.

Om een kwalitatieve controle van de microsomen uit te voeren, werd eerst nagegaan of er

geen interfererende bestanddelen aanwezig zijn in een blanco incubaat. Daarna werd

gecontroleerd of de metabolieten wel effectief in het supernatans van het incubaat aanwezig

zijn na centrifugatie. Vervolgens werd het incubatieprotocol getest op commerciële

rattenmicrosomen. Na incubatie konden metabolieten gedetecteerd worden, waaruit besloten

kon worden dat de gebruikte incubatiemethode geschikt is voor de bepaling van de

enzymactiviteit. Ten laatste werd gecontroleerd of de CYP450-enzymen in de zelfbereide

microsomen nog actief zijn. Na incubatie en centrifugatie konden de metabolieten in het

supernatans gedetecteerd worden, wat bewijst dat de CYP450-enzymen nog actief zijn en dat

de microsomen op een adequate manier werden bereid.

Om na te gaan of de methoden van Bradford en Matsubara nauwkeurig werden

uitgevoerd, werden ze uitgevoerd op volledig gekarakteriseerde commerciële

rattenmicrosomen. De bekomen totale proteïneconcentratie was 20,19 mg/ml, terwijl de

meegeleverde waarde 20 mg/ml was. Dit bewijst dat de methode van Bradford op een punt

staat. Het bekomen CYP450-gehalte was 452,43 pmol/mg proteïne, terwijl de meegeleverde

waarde 740 pmol/mg proteïne was. Dit bewijst dat er nog een probleem is met de methode

van Matsubara, wat nog verder onderzocht moet worden.

Tot slot, deze masterproef heeft geleid tot een reproduceerbaar en adequaat protocol

voor de bereiding van humane microsomen, en er werd besloten dat de methoden van

Bradford en Matsubara de beste methoden zijn voor respectievelijk de bepaling van de totale

proteïneconcentratie en het CYP450-gehalte. De methode van Bradford staat op punt, maar de

methode van Matsubara nog niet. Ook werd besloten dat het gebruikte incubatieprotocol bij

de bepaling van de activiteit van de CYP450-enzymen geschikt is.

49

6 LITERATUURLIJST

Barter, Z. E.; Chowdry, J. E.; Harlow, J. R.; Snawder, J. E.; Lipscomb, J. C.; Rostami-

Hodjegan, A. (2008). Covariation of Human Microsomal Protein Per Gram of Liver with

Age: Absence of Influence of Operator and Sample Storage May Justify Interlaboratory Data

Pooling. Drug Metabolism and Disposition, 36, 2405-2409.

Bassett, W. D.; Murray, K. F. (2008). Biliary artesia - Recent progress. Journal of Clinical

Gastroenterology, 42, 720-729.

Benedetti, M. S.; Baltes, E. L. (2003). Drug metabolism and disposition in children.

Fundamental & Clinical Pharmacology, 17, 281-299.

Bradford, M. M. (1976). Rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram

Quantities of Protein Utilizing Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72,

248-254.

Busby, W. F.; Ackermann, J. M.; Crespi, C. L. (1999). Effect of methanol, ethanol, dimethyl

sulfoxide, and acetonitrile on in vitro activities of cDNA-expressed human cytochromes P-

450. Drug Metabolism and Disposition, 27, 246-249.

Chauret, N.; Gauthier, A.; Nicoll-Griffith, D. A. (1998). Effect of common organic solvents

on in vitro cytochrome P450-mediated metabolic activities in human liver microsomes. Drug

Metabolism and Disposition, 26, 1-4.

Donato, M. T.; Castell, J. V. (2003). Strategies and molecular probes to investigate the role of

cytochrome P450 in drug metabolism - Focus on in vitro studies. Clinical Pharmacokinetics,

42, 153-178.

Frye, R. E. (2004). Probing the world of cytochrone P450 enzymes. Molecular Interventions,

4, 157-162.

Garfinkel, D. (1958). Studies on Pig Liver Microsomes .1. Enzymic and Pigment

Composition of Different Microsomal Fractions. Arch. Biochem. Biophys., 77, 493-509.

http://www.azg.nl/azg/nl/professionals/5139/5158/104089/108327 (7 maart)

http://www.biomed.metu.edu.tr/courses/term_papers/bioartf-liver_kenar.htm (10 maart)

http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=514467 (10 maart)

50

Kim, M. J.; Kim, H.; Cha, I. J.; Park, J. S.; Shon, J. H.; Liu, K. H.; Shin, J. G. (2005). High-

throughput screening of inhibitory potential of nine cytochrome P450 enzymes in vitro using

liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 19, 2651-2658.

Lahoz, A.; Donato, M. T.; Castell, J. V.; Gomez-Lechon, M. J. (2008). Strategies to in vitro

assessment of major human CYP enzyme activities by using liquid chromatography tandem

mass spectrometry. Current Drug Metabolism, 9, 12-19.

Le Couteur, D. G.; Fraser, R.; Hilmer, S.; Rivory, L. P.; Mclean, A. J. (2005). The hepatic

sinusoid in aging and cirrhosis - Effects on hepatic substrate disposition and drug clearance.

Clinical Pharmacokinetics, 44, 187-200.

Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J. (1977). Citation Classics - Protein

Measurement with Folin Phenol Reagent. Current Contents, 7.

Lucarini, A. C.; Kilikian, B. V. (1999). Comparative study of Lowry and Bradford methods:

interfering substances. Biotechnology Techniques, 13, 149-154.

Manisali, I.; Chen, D. D. Y.; Schneider, B. B. (2006). Electrospray ionization source

geometry for mass spectrometry: past, present, and future. Trac-Trends in Analytical

Chemistry, 25, 243-256.

Matsubara, T.; Koike, M.; Touchi, A.; Tochino, Y.; Sugeno, K. (1976). Quantitative-

Determination of Cytochrome-P-450 in Rat-Liver Homogenate. Analytical Biochemistry, 75,

596-603.

Nestorov, I. (2007). Whole-body physiologically based pharmacokinetic models. Expert

Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 3, 235-249.

Omura, T.; Sato, R. (1964). Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes .I.

Evidence for Its Hemoprotein Nature. Journal of Biological Chemistry, 239, 2370-&.

Onbekend (2009). Methods In Drug Metabolism - Analytical Methodology, Onbekend,

Onbekend.

Perry, S. G.; Amos, R.; Brewer, P. I. (1972). Adsorption Chromatography: Mechanism and

Materials. In: Practical Liquid Chromatography.Plenum Press, London, UK, pp. 41-75.

51

Peterson, G. L. (1979). Review of the Foline Phenol Protein Quantitation Method of Lowry,

Rosebrough, Farr and Randall. Analytical Biochemistry, 100, 201-220.

Rang, H. P.; Dale, M. M.; Ritter, J. M.; Moore, P. K. (2003). Pharmacology, Churchill

Livingstone, Edinburgh.

Rowland, M.; Tozer, N. T. (1995). Clinical Pharmacokinetics - Concepts and Applications,

Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, United States of America.

Schenkman, J. B.; Jansson, I. (1998). Spectral Analyses of Cytochomes P450. In: Cytochrome

P450 Protocols - Methods in Molecular Biology, vol 107, Phillips, I. R.; Shepard, E. A.

(Eds.), Humana Press Inc., Totowa, pp. 25-33.

Schenkman, J. B.; Jansson, I. (2003). The many roles of cytochrome b5. Pharmacology &

Therapeutics, 97, 139-152.

Simpson, C. F. (1976). Theoretical Background to HPLC. In: Practical High Performance

Liquid Chromatography. London, UK, pp. 1-69.

Spada, M.; Riva, S.; Maggiore, G.; Cintorino, D.; Gridelli, B. (2009). Pediatric liver

transplantation. World Journal of Gastroenterology, 15, 648-674.

Tortora, G. J.; Derrickson, B. (2006). The digestive system. In: Principles of anatomy and

physiology. John Wiley and Sons, United States of America.

Verbeeck, R. K. (2008). Pharmacokinetics and dosage adjustment in patients with hepatic

dysfunction. European Journal of Clinical Pharmacology, 64, 1147-1161.

Walsky, R. L.; Obach, R. S. (2004). Validated assays for human cytochrome P450 activities.

Drug Metabolism and Disposition, 32, 647-660.

Wilson, Z. E.; Rostami-Hodjegan, A.; Burn, J. L.; Tooley, A.; Boyle, J.; Ellis, S. W.; Tucker,

G. T. (2003). Inter-individual variability in levels of human microsomal protein and

hepatocellularity per gram of liver. British Journal of Clinical Pharmacology, 56, 433-440.

Yamazaki, H.; Inoue, K.; Turvy, C. G.; Guengerich, F. P.; Shimada, T. (1997). Effects of

freezing, thawing, and storage of human liver samples on the microsomal contents and

activities of cytochrome p450 enzymes. Drug Metabolism and Disposition, 25, 168-174.

52

Yuan, R.; Madani, S.; Wei, X. X.; Reynolds, K.; Huang, S. M. (2002). Evaluation of

cytochrome P450 probe substrates commonly used by the pharmaceutical industry to study in

vitro drug interactions. Drug Metabolism and Disposition, 30, 1311-1319.

i

7 BIJLAGEN

7.1 BIJLAGE 1

o Bereid de standaardreeks volgens Tabel 7.1 in een reeks cupjes (hiervoor zijn 2

ampulen BSA nodig). Er moet een standaardcurve opgesteld worden met

buffer 2, want de totale proteïneconcentratie wordt in de microsomale

suspensie bepaald.

TABEL 7.1: BEREIDING STANDAARDREEKS (BSA) BIJ DE

PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY.

vial volume buffer 2 (µl) volume BSA (µl) BSA concentratie (µg/ml)A 250 750 stock 1500B 625 625 stock 1000C 310 310 A 750D 625 625 B 500E 625 625 D 250F 625 625 E 125G 800 200 F 25H 800 200 G 5I 800 200 H 1J 1000 0 0

o Bereid het Folin-Ciocalteu reagens door de 2 N oplossing in de kit te

verdunnen tot een 1 N oplossing. Bereid zoveel als nodig door één deel water

te mengen met één deel Folin-Ciocalteu reagens (2 N).

o Breng van elke standaard (x3) en onbekende (x3) 200 µl in een cupje.

o Voeg om de 30 seconden aan elk cupje 1 ml gemodificeerd Lowry reagens.

Zwenk de cupjes om en laat ze exact 10 min incuberen.

o Voeg 100 µl Folin-Ciocalteu reagens (1 N) toe en vortex onmiddellijk.

o Laat de cupjes 30 minuten incuberen.

o Meet de absorbantie bij 750 nm, zet de spectrofotometer eerst op nul met een

cuvetje gevuld met water.

o Trek de blancowaarde (J) af van alle absorbanties van de standaarden en zet de

bekomen waarden uit in functie van de concentratie. Trek ook de

blancowaarde (J) af van de absorbantie van de onbekende.

o Bepaal op basis van de bekomen ijklijn de concentratie van de onbekende.

ii

7.2 BIJLAGE 2

o Breng een hoeveelheid Coomassie kleurstof na omzwenken in een bekertje

voor equilibratie bij kamertemperatuur.

o Bereid de standaardreeks volgens Tabel 7.2 in een reeks proefbuisjes (hiervoor

is 1 ampule BSA nodig). Er moet een standaardcurve opgesteld worden met

buffer 2 want de totale proteïneconcentratie wordt in de microsomale suspensie

bepaald.

TABEL 7.2: BEREIDING STANDAARDREEKS (BSA) BIJ DE

PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD.

vial volume buffer 2 (µl) volume BSA (µl) BSA concentratie (µg/ml)A 0 300 stock 2000B 125 375 stock 1500C 325 325 stock 1000D 175 175 B 750E 325 325 C 500F 325 325 E 250G 325 325 F 125H 400 100 G 25I 400 0 0

o Breng van elke standaard (x3) en onbekende (x3) 30 µl in een proefbuisje.

o Voeg om de 30 seconden aan elk proefbuisje 1,5 ml Coomassie kleurstof toe,

sluit het proefbuisje met een dopje en zwenk het een aantal keer om.

o Laat alle proefbuisjes 10 min incuberen.

o Meet de absorbantie bij 595 nm, zet de spectrofotometer eerst op nul met een

cuvetje gevuld met water.

o Trek de blancowaarde (I) af van alle absorbanties van de standaarden en zet de

bekomen waarden uit in functie van de concentratie. Trek ook de

blancowaarde (I) af van de absorbantie van de onbekende.

o Bepaal op basis van de bekomen ijklijn de concentratie van de onbekende.

iii

7.3 BIJLAGE 3

TABEL 7.3: TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE VOLGENS BRADFORD VAN GEZOND,

HUMAAN LEVERWEEFSEL.

staala absorbantie [proteïne](mg/ml) [proteïne](mg/g lever) VC (%)ID 2 0,744 4,27 12,38ID 2 0,720 3,86 11,20ID 2 0,747 4,32 12,52

gemiddelde 0,737 4,15 12,03 6,06

ID 3 0,755 4,46 13,33ID 3 0,754 4,44 13,27ID 3 0,748 4,34 12,97

gemiddelde 0,752 4,41 13,19 1,47

ID 4 0,756 4,48 13,36ID 4 0,716 3,79 11,33ID 4 0,768 4,68 13,97

gemiddelde 0,747 4,32 12,88 10,75ID 5 0,738 4,07 12,07ID 5 0,762 4,48 13,28ID 5 0,755 4,36 12,93

gemiddelde 0,752 4,30 12,76 4,90

ID 6 0,732 3,97 11,61ID 6 0,762 4,48 13,10ID 6 0,742 4,14 12,10

gemiddelde 0,745 4,19 12,27 6,21

ID 12 0,750 4,27 12,25ID 12 0,753 4,33 12,40ID 12 0,751 4,29 12,30

gemiddelde 0,751 4,30 12,32 0,61

ID 13 0,716 3,70 10,91ID 13 0,673 2,98 8,79ID 13 0,704 3,50 10,31ID 13 0,648 2,57 7,58ID 13 0,706 3,53 10,41ID 13 0,689 3,25 9,58

gemiddelde 0,689 3,25 9,59 12,86

ID 18 0,734 4,00 12,13ID 18 0,759 4,43 13,42ID 18 0,755 4,36 13,21

gemiddelde 0,749 4,26 12,92 5,37

ID 19 0,707 3,55 10,55ID 19 0,742 4,14 12,31ID 19 0,725 3,85 11,45

gemiddelde 0,725 3,84 11,43 7,69 a ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en


iv

staala �A(450nm-490nm) [CYP450] (nmol/ml) [CYP450] (pmol/mg proteïne) VC (%)ID 2 0,018 1,73 416,99

0,015 1,44 347,500,016 1,54 370,66

gemiddelde 0,0163 1,57 378,38 9,35ID 3 0,018 1,73 392,26

0,018 1,73 392,260,017 1,63 370,46

gemiddelde 0,0177 1,70 384,99 3,27

ID 4 0,017 1,63 378,790,014 1,35 311,940,011 1,06 245,10

gemiddelde 0,0140 1,35 311,94 21,43

ID 5 0,021 2,02 469,340,020 1,92 446,990,019 1,83 424,64

gemiddelde 0,0200 1,92 446,99 5,00ID 6 0,014 1,35 318,79

0,014 1,35 318,790,015 1,44 341,56

gemiddelde 0,0143 1,38 326,38 4,03ID 12 0,009 0,87 201,41

0,011 1,06 246,170,011 1,06 246,17

gemiddelde 0,0103 0,99 231,25 11,17ID 13 0,018 1,73 555,91

0,024 2,31 741,220,018 1,73 555,91

gemiddelde 0,0200 1,92 617,68 17,32ID 18 0,017 1,63 383,49

0,017 1,63 383,490,017 1,63 383,49

gemiddelde 0,0170 1,63 383,49 0,00ID 19 0,013 1,25 325,20

0,013 1,25 325,200,014 1,35 350,21

gemiddelde 0,0133 1,28 333,54 4,33

7.4 BIJLAGE 4

TABEL 7.4: CYP450-GEHALTE (MICROSOMALE SUSPENSIE) VOLGENS MATSUBARA

VAN GEZOND, HUMAAN LEVERWEEFSEL.

a ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en


UNIVERSITEIT GENT -...

Documents

Transcript of UNIVERSITEIT GENT -...