UNIVERSITEIT - lib.ugent.belib.ugent.be/fulltxt/RUG01/000/839/382/RUG01-000839382_2010_0001... ·...
-
Upload
hoangquynh -
Category
Documents
-
view
242 -
download
0
Transcript of UNIVERSITEIT - lib.ugent.belib.ugent.be/fulltxt/RUG01/000/839/382/RUG01-000839382_2010_0001... ·...
UNIVERSITEITGENT
FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE
EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN
____________________
Academiejaar 2003 - 2004
Co-enzymafbraak en -regeneratie in deegsystemen
Joeri BEAUPREZ
Promotor : Prof. dr. ir. E.J. Vandamme
Ir. Sofie Parmentier
Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van
BIO-INGENIEUR IN DE SCHEIKUNDE
De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking totde verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subjected to the copyright laws; more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.
De promotoren, De auteur,
Woord vooraf
Het schrijven van een thesis vertoont vele analogiën met een enzymatische redoxreactie. In de eerste
plaats heb je de enzymen die de activatie-energie van de reactie en versnellen de reactie. Daarnaast
spelen de co-enzymen een cruciale rol, ze brengen immers de elektronen aan. Dit geheel wordt in
stress-toestand – een veel voorkomend gegeven bij het schrijven van een thesis – de werking van het
geheel gewaarborgd door chaperonne-eiwitten.
Voor dit werk hebben verschillende mensen één of meerdere van deze rollen op zich genomen. Ik wil
ze hier dan ook in het bijzonder bedanken.
Als eerste wil ik Sofie Parmentier bedanken voor de fantastische begeleiding en samenwerking. In de
rol van ‘enzym’ speelde ze een cruciale rol in het tot stand komen van deze thesis.
De rol van ‘co-enzym’ werd door verschillende mensen vervuld. In het bijzonder door Prof. Dr. ir.
Vandamme en Dr. ir. Wim Soetaert. De verschillende cursussen die ze doceren gaven een stevige
basis en leidden tot heel wat nieuwe ideeën met betrekking tot de experimenten. Samen met Filip
Arnaut, Thierry Dauvrin, Fabienne Verté en Inge Van Haesendonck zorgden ze voor een kritische
beschouwing van de experimenten. Ze gaven die extra wendingen en impulsen die een onderzoek
nodig heeft.
Mijn ouders en mijn broer, Sven, mogen hier zeker niet ontbreken in dit dankwoord. Als ‘chaperonne-
eiwitten’ waren ze essentieel de afgelopen 5 jaar.
SamenvattingCo-enzym regeneratie wordt vooral toegepast voor de synthese van chirale stoffen zoals (R)-(-)-1,2-
propaandiol. De kostprijs van co-enzymen ligt immers zo hoog dat een regeneratie noodzakelijk is om
een economisch rendabele productie op te kunnen zetten.
Nieuw is de toepassing van co-enzym regeneratie in de bakkerijsector. Hierbij wordt er vanuit gegaan
dat het regenereren van het geoxideerde co-enzym NAD+ een positief effect heeft op de deegreologie
en bijgevolg op de broodkwaliteit. Het mechanisme dat hierachter schuil gaat werd tot op heden nog
niet opgehelderd.
Het opzetten van een co-enzym regeneratie start bij de productie van enzymen, meer bepaald
dehydrogenasen. Hier werd geopteerd voor de mannitol dehydrogenases van Leuconostoc
pseudomesenteroides (ATCC 12291) en Gluconobacter oxydans (LMG 1489). In tweede instantie
werd ook een formiaat dehydrogenase uitgetest voor de regeneratie van NADH in een bloemextract.
De productie van het L. pseudomesenteroides mannitol dehydrogenase wordt gestimuleerd door de
aanwezigheid van D-fructose in het fermentatiemedium. De sonicatie gebeurt het best op ijs en
reducerende agentia zoals L-cysteïne en gereduceerd glutathion hebben een positief effect op de
enzym stabiliteit. Het enzym blijkt ook een metaalion als cofactor te bezitten, het wordt immers
geïnhibeerd door de chelator EDTA.
Over het dehydrogenase van Gluconobacter bestaat nog geen duidelijkheid of het zowel sorbitol als
mannitol als substraat heeft of dat er twee enzymen aanwezig zijn in het enzymextract.
De volgende stap is het karakteriseren van de bloemenzymen die een rol spelen in de co-enzym
regeneratie. Deze zijn alcohol dehydrogenase (106 kDa), NADH-oxidase (120 kDa) en nucleotide
pyrofosfatase (100 kDa)(NPP). Ze worden allemaal geïnhibeerd door chelatoren zoals EDTA en
pyrofosfaat. NADH-oxidase en NPP worden eveneens geïnhibeerd door de reducerende agentia L-
cysteïne en gereduceerd glutathion.
NPP is een zeer thermostabiel enzym (stabiel na 10 minuten verhitten bij 70˚C) dat als producten
AMP en NMN(H) heeft. Het temperatuursoptimum ligt eveneens hoog en het pH-optimum bevindt
zich in het alkalische gebied. AMP in een concentratie hoger dan 1 mM treedt op als productinhibitor.
Deze inhibitie is echter afhankelijk van de co-enzym concentratie. Het NADH-oxidase is zeer
thermostabiel en heeft een pH-optimum in het zure gebied.
Alcohol dehydrogenase heeft een optimale activiteit bij 60˚C maar bij deze temperatuur treedt al zeer
snel inactivatie op. Het enzym is het meest stabiel bij 40˚C.
De combinatie van deze enzymen levert een efficiënte co-enzym regeneratie op waarbij in het formiaat
dehydrogenase systeem de NADH-concentratie hoog wordt gehouden en in het mannitol
dehydrogenase systeem de NAD+-concentratie.
AbstractCoenzyme regeneration is mainly applied in the synthesis of chiral compounds such as (R)-(-)-1,2-
propanediole. Since the prices of these co-enzymes are quite high, regeneration is necessary to make
the process economical feasible.
The application of the coenzyme regeneration system in baking is a new concept. The hypothesis
behind this is that the regeneration of the oxidized co-enzyme NAD+ a positive effect has on dough
rheology and thus bread quality. The mechanism for this bread quality improving effect has not been
uncovered yet.
The setup of a regeneration system starts with the production of enzymes, namely dehydrogenases. In
this research the mannitol dehydrogenases of Leuconostoc pseudomesenteroides (ATCC 12291) and
Gluconobacter oxydans (LMG 1489) were used. Also formate dehydrogenase was tested for
regeneration of NADH in a flour extract.
The production of the L.pseudomesenteroides mannitol dehydrogenase is stimulated by the presence
of D-fructose in the fermentation broth. Sonication of the cells was best performed on ice and reducing
agents such as L-cysteine and reduced glutathione have a positive effect on the enzyme stability. The
enzyme seems to be dependent on a metal ion as cofactor, since it is inhibited by the chelating agent
EDTA.
The next step is the characterization of the flour enzymes, which have a role in the coenzyme
regeneration and coenzyme conversion. These enzymes are alcohol dehydrogenase (106 kDa),
NADH-oxidase (120 kDa) and nucleotide pyrophosphatase (100 kDa) (NPP). Chelating agents such as
EDTA and pyrophosphate inhibit all these enzymes. NADH-oxidase and NPP are also inhibited by the
reducing agents L-cysteine and reduced glutathione.
NPP is a very thermostable enzyme (still active after an incubation of 10 minutes at 70˚C). The
reaction products of NAD+ degradation are AMP en NMN(H). The optimal temperature for activity is
also high and the enzyme has an alkaline pH-optimum. AMP in a concentration higher than 1mM acts
as a product inhibitor. This inhibition seems to be dependent on the coenzyme concentration. The
NADH-oxidase is as well very thermostable and has a pH-optimum in the acidic region.
Alcohol dehydrogenase has an optimal activity at 60˚C but is deactivated quickly at this temperature.
It is most stable at 40˚C.
The combination of these enzymes results in an efficient coenzyme regenerationsystem, which keeps
the NADH-concentration high in the formate dehydrogenase system and the NAD+-concentration in
the mannitol dehydrogenase system.
INHOUDSTAFEL
Inhoudstafel
INHOUDSTAFEL
INLEIDING 1
1 LITERATUURSTUDIE 3
1.1 INLEIDING 3
1.2 MANNITOL 4
1.2.1 Mannitol 4
1.2.1.1 Polyolen 4
1.2.1.2 Voorkomen van mannitol 4
1.2.1.3 Toepassingen van mannitol 5
1.2.2 Mannitolproductie 6
1.2.2.1 Hydrogenatie 6
1.2.2.2 Fermentatieproces 7
1.2.2.3 Enzymatische productie 9
Co-enzym regeneratie 9
Toepassing van een gekoppeld enzymsysteem in de mannitol productie 11
1.3 NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE (NPP) 13
1.3.1 Inleiding 13
1.3.2 Nudix hydrolasen 14
1.3.2.1 De Nudix-box sequentie 14
1.3.2.2 De tertiaire structuur 15
1.3.2.3 Substraten van de Nudix Hydrolasen 16
1.3.3 NADH pyrofosfatase van de Nudix familie 18
1.3.3.1 Eigenschappen en voorkomen 18
1.3.3.2 Fysiologische functie 21
1.3.4 NAD pyrofosfatase 22
i
INHOUDSTAFEL
1.3.5 Aantonen van NPP-activiteit 24
1.3.6 Inhibitie van NPP 26
1.4 DEEG 30
1.4.1 Inleiding 30
1.4.2 Bloem 30
1.4.2.1 Triticum aestivum 30
1.4.2.2 Bloemproteïnen 31
Algemene indeling 31
Gliadinen 31
Gluteninen 31
1.4.3 De deegvorming en bakken 32
1.4.4 Oxiderende en reducerende agentia als broodverbeteraars 33
1.4.4.1 Inleiding 33
1.4.4.2 Ascorbaat 33
1.4.4.3 Thioredoxine-systeem 35
1.4.4.4 Oxidatieve enzymen 36
1.4.4.5 Co-enzymen en dehydrogenasen 37
2 MATERIAAL EN METHODEN 39
2.1 ENZYMPRODUCTIE 39
2.1.1 Gluconobacter oxydans (LMG 1489, IFO 3257) 39
2.1.1.1 Bewaren van de stam 39
2.1.1.2 Opkweken van de stam 39
2.1.1.3 Vrijstellen van het enzym 40
2.1.1.4 Enzymactiviteit en inhibitie 40
2.1.2 Leuconostoc pseudomesenteroides (ATCC 12291) 41
2.1.2.1 Bewaren van de stam 41
2.1.2.2 Opkweken van de stam 42
2.1.2.3 Correlatie tussen de optische densiteit (OD) en de cel-droge-massa (CDM) 43
2.1.2.4 Effect van de koolstofbron op de enzymproductie 43
ii
INHOUDSTAFEL
2.1.2.5 Vrijstellen van het enzym 43
2.1.2.6 Enzymactiviteit en inhibitie 44
2.1.2.7 Protease test 44
2.1.2.8 Opzuivering van het enzym 45
2.2 HPLC-METHODEN 47
2.2.1 Bepalen van co-enzymen en afbraakproducten 47
2.2.1.1 Chromatografie 47
2.2.1.2 Staalname 48
2.2.2 Suikers, ethanol, acetaldehyde en glutathion 48
2.2.2.1 Chromatografie 48
2.2.2.2 Staalname 48
2.3 KARAKTERISERING VAN BLOEMENZYMEN 49
2.3.1 Bloemextract 49
2.3.2 Alcohol dehydrogenase 49
2.3.2.1 Enzymtest: Inhibitie, temperatuursoptimum en -stabiliteit 49
2.3.2.2 Incubatie van bloem en NAD bij verschillende gistconcentraties 49
2.3.2.3 Incubatie van ethanol met NAD in aanwezigheid van gist+ 49
2.3.3 Nucleotide pyrofosfatase 50
2.3.3.1 Identificatie en kwantificering van de afbraakproducten 50
2.3.3.2 Vergelijking met commerciële enzymen 50
2.3.3.3 Screening naar inhibitoren en reactivatie na inhibitie en stimulatie 50
2.3.3.4 Thermostabiliteit en temperatuursoptimum 51
2.3.3.5 Afbraaksnelheid NAD en NADH+ 51
2.3.3.6 Effect van verschillende NAD -concentraties+ 51
2.3.3.7 NAD(H)-shots 52
2.3.3.8 Alternatieve methoden voor NPP-activiteit detectie 52
2.3.4 Incubatie van NAD(H) en bloemextract bij verschillende pH’s 53
2.3.5 Inhibitie van NADH-oxidase met reducerende agentia 54
2.3.6 Fosfatase 54
iii
INHOUDSTAFEL
2.4 GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN 55
2.4.1 Bloem, gist, NAD en mannitol dehydrogenase systeem+ 55
2.4.1.1 Bepalen van de enzymactiviteit 55
2.4.1.2 Incubatie 55
2.4.2 Bloem, NADH en formiaat dehydrogenase systeem 56
2.5 NATIEVE PAGE EN ZYMOGRAMMEN 57
2.5.1 Natieve PAGE 57
2.5.2 Coomassiekleuring 57
2.5.3 Zymogrammen 58
2.5.3.1 Dehydrogenasen 58
2.5.3.2 NADH-oxidase 59
2.5.3.3 Nucleotide pyrofosfatase (NPP) 59
3 RESULTATEN EN BESPREKING 60
3.1 PRODUCTIE EN OPZUIVERING VAN MICROBIEEL MANNITOL DEHYDROGENASE60
3.1.1 MDH productie door L. pseudomesenteroides: constitutief of geïnduceerd? 60
3.1.2 Vrijstellen van het enzym 63
3.1.2.1 Inleiding 63
3.1.2.2 Variëren van verschillende parameters bij sonicatie 63
3.1.3 Protease test op het enzymextract 64
3.1.4 Opzuivering van mannitol dehydrogenase 64
3.1.4.1 Inleiding 64
3.1.4.2 Ethanol precipitatie 64
3.1.4.3 Ammoniumsulfaat precipitatie 65
3.1.4.4 Natieve PAGE van het enzymextract 66
3.1.4.5 Stabiliserende agentia 68
3.1.5 Inhibitie van MDH met chelaterende stoffen 69
iv
INHOUDSTAFEL
3.1.5.1 EDTA 69
3.1.5.2 Pyrofosfaat 71
3.1.6 Gluconobacter mannitol dehydrogenase 72
3.2 BLOEM ALCOHOL DEHYDROGENASE 75
3.2.1 Inleiding 75
3.2.2 Temperatuursoptimum 75
3.2.3 Thermostabiliteit 75
3.2.4 Inhibitie door EDTA 76
3.2.5 Inhibitie door pyrofosfaat 76
3.2.6 Natieve PAGE 77
3.3 NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE EN NADH-OXIDASE 78
3.3.1 Inleiding 78
3.3.2 Identificatie van de afbraakproducten 78
3.3.3 Kwantificering van de afbraakproducten 82
3.3.4 Identificatie van het enzym 83
3.3.4.1 Commerciële (nucleotide pyro-)fosfatasen 83
3.3.4.2 Bepalen van fosfatase activiteit in bloem 84
3.3.4.3 Natieve PAGE 84
Thymidine-5’-p-nitrofenylfosfaat (5’-pNPT) als substraat voor NPP 84
Nucleotide pyrofosfatase 85
NADH-oxidase 86
3.3.5 Screening naar inhibitoren van nucleotide pyrofosfatase 87
3.3.5.1 Eerste selectie 87
3.3.5.2 EDTA: verschillende concentraties, synergisme met glycine en reactivatie 88
EDTA concentraties 88
Synergisme met glycine 89
NADH afbraak met EDTA 90
v
INHOUDSTAFEL
Reactivatie met een bivalent metaalion 91
3.3.5.3 L-cysteïne en gereduceerd glutathion 92
3.3.5.4 Fosfaten 93
3.3.5.5 Productinhibitie 95
AMP inhibitie 95
NAD(H)-shots 95
Afbraaksnelheid NAD en NADH+ 96
3.3.6 Kinetiek van NPP 97
3.3.7 Temperatuursoptimum en thermostabiliteit 98
3.3.8 pH-optima 100
3.3.8.1 Effect van de pH op eiwitten 100
3.3.8.2 Effect op NPP en NADH-oxidase 101
3.3.9 Thiolen als inhibitoren van NADH-oxidase 105
3.3.10 Samengevat 105
3.4 OPTIMALISATIE VAN DE HPLC-PROCEDURE 107
3.4.1 Inleiding 107
3.4.2 Mogelijke technieken 107
3.4.2.1 EDTA 107
3.4.2.2 Ethanol 108
3.4.2.3 SDS + methanol 108
3.4.3 Alternatieven voor de HPLC-methode 109
3.4.3.1 ADH-methode 109
3.4.3.2 Fosfaat-methode 110
3.5 GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN 112
3.5.1 Inleiding 112
3.5.2 Formiaat dehydrogenase-systeem 112
3.5.2.1 Additie van formiaat dehydrogenase (FDH) 112
3.5.2.2 Effect van verschillende concentraties FDH en Na-formiaat 114
vi
INHOUDSTAFEL
3.5.3 Mannitol dehydrogenase-systeem 115
3.5.3.1 Gist 115
3.5.3.2 Additie van mannitol dehydrogenase (MDH) van L. pseudomesenteroides 116
3.5.3.3 Effect van verschillende MDH-concentraties (L. pseudomesenteroides) 117
3.5.3.4 Opvolgen van de reactieproducten 118
3.5.3.5 Enzymextract van G. oxydans als alternatieve dehydrogenase-bron 119
4 ALGEMEEN BESLUIT 120
ADDENDUM
LITERATUURLIJST
vii
INLEIDING
InleidingEen enzymatische redoxreactie heeft een co-enzym nodig dat bij een substraatoxidatie gereduceerd
wordt en bij een substraatreductie geoxideerd. Een voorbeeld van zo een reactie is de omzetting van
D-fructose naar D-mannitol door mannitol dehydrogenase. Hierbij wordt NADH dan geoxideerd tot
NAD+. Een ander voorbeeld is de conversie van formiaat tot CO2 en H2O door formiaat
dehydrogenase, waarbij NAD+ dan wordt gereduceerd tot NADH (Slatner et al., 1998 a&b). Deze co-
enzymen moeten voor deze reactie in stoïchiometrische hoeveelheden worden toegevoegd, wat ze dan
ook zeer duur maakt. De co-enzym regeneratie biedt hier soelaas (Wichmann et al., 2000). De twee
voorgaande voorbeelden kunnen perfect gecombineerd worden zodanig dat ze het co-enzym
regenereren. Bijvoorbeeld wil men D-mannitol gaan produceren uit D-fructose dan gebruikt men
mannitol dehydrogenase en voegt men een kleine hoeveelhheid NADH toe. Deze wordt omgezet tot
NAD+, maar wordt onmiddellijk geregenereerd tot NADH door het formiaat dehydrogenase. Dit
resulteert dan in de vorming van moleculen als water en koolstofdioxide (figuur 1).
D-fructose D-mannitol
NADH NAD+
MDH
formiaatCO2 + H2OFDH
Figuur 1.1 Een gekoppeld enzym systeem voor co-enzym regeneratie van formiaat dehydrogenase (FDH) en mannitol dehydrogenase (MDH) (Slatner et al., 1998 a&b)
Deze regeneratie kan ook toegepast worden in andere systemen, bijvoorbeeld een deegsysteem.
Tijdens de deegvorming wordt alcohol, gevormd door gist, omgezet tot acetaldehyde door alcohol
dehydrogenase. Hierbij wordt NAD+ omgezet naar NADH. Dit NAD+ is dus niet meer beschikbaar
voor de thiolgroepen van de gluten in de bloem om te cross-linken. Wordt deze NADH terug omgezet
tot NAD+ dan kan er meer cross-linking optreden en zal dus de deegstructuur worden verbeterd. Het
doel van deze thesis is zo een systeem te optimaliseren (Tomlinson et al., 1988). Omdat in deeg het
opvolgen van de verschillende omzettingen in de tijd zeer omslachtig is, werd eerst het systeem
uitgetest met bloemsuspenties en een bloemextract.
De regeneratie van NADH werd uitgevoerd met de enzymsystemen van twee verschillende stammen,
namelijk Leuconostoc pseudomesenteroides en Gluconobacter oxydans. Deze beide organismen
worden zijn volkomen ‘food grade’ en hun enzymen kunnen dus ook vrij toegepast worden in
levensmiddelen.
Het grote verschil tussen de enzymatische productie van mannitol en de enzymatische optimalisatie
van deegvorming is dat deeg een complex systeem is. Deeg is samengesteld uit bloem, water en gist.
1
INLEIDING
De bloem bevat verscheidene dehydrogenasen en blijkt in staat te zijn co-enzymen af te breken. Deze
complicatie vereist nadere studie van al deze enzymen en hun invloed op de co-enzym regeneratie.
Indien een van deze enzymen een nadelig effect veroorzaken moet gezocht worden naar potentiële
inhibitoren. Deze moeten dan ook ‘food- grade’ zijn, het doel is immers om het systeem toe te passen
in brood.
2
INLEIDING LITERATUURSTUDIE
1 Literatuurstudie
1.1 Inleiding Voor de regeneratie van co-enzymen in deeg moeten 3 verschillende aspecten bestudeerd worden. In
de eerste plaats moet gezocht worden naar enzymen die in staat zijn in een deegsysteem co-enzymen
te regenereren. Daarnaast is het noodzakelijk enzymen te identificeren die interfereren in de co-
enzymregeneratie, bijvoorbeeld enzymen die co-enzymen afbreken. Uiteindelijk moet het effect van
de regeneratie op de deegstructuur bestudeerd worden.
Micro-organismen bezitten verschillende mechanismen om co-enzymen te regenereren. Hierbij
wenden ze dehydrogenasen aan. Leuconostoc mesenteroides, een heterofermentatieve melkzuur
bacterie, gebruikt mannitol dehydrogenase NAD+ te regenereren uit NADH (Wisselink et al., 2002).
Hierbij wordt gelijktijdig D-fructose omgezet naar D-mannitol, een suikeralcohol. Dit proces werd
reeds geoptimaliseerd tot een productie van 150 gram mannitol per liter fermentatiemedium (Soetaert,
W. et al., 1999). Het feit dat dit micro-organisme zo efficiënt mannitol produceert maakt het mannitol
dehydrogenase dat het bezit interessant voor de toepassing in een in vitro co-enzymregeneratie-
systeem.
Een van de voornaamste componenten in deeg is bloem, afkomstig uit tarwe, Triticum aestivum.
Hierin zijn heel wat enzymen aanwezig. Tijdens de experimenten werd vastgesteld dat een van deze
enzymen co-enzymen kan afbreken. Deze afbraak kan op verschillende manieren gebeuren naargelang
het enzym. Degelijke kennis van de karakteristieken van dit enzym is dus noodzakelijk om het te
kunnen uit schakelen. Hierbij moeten de potentiële inhibitoren van het enzym aan verscheidene
vereisten voldoen. Ze moeten onder andere ‘food-grade’ en mogen geen nadelig effect hebben op de
reologie van de deeg.
Kennis over de verschillende enzymen die kunnen interfereren en het regeneratie-enzym, mannitol
dehydrogenase, is niet voldoende. Het is eveneens noodzakelijk inzicht te hebben over hoe deeg
precies wordt gevomd en welke factoren en rol kunnen spelen. De bloemproteïnen, voornamelijk de
gluten (Osborne, 1924), spelen hier een belangrijke rol. Ze vormen de disulfide bruggen die
noodzakelijk zijn om visco-elastische eigenschappen aan deeg te geven (Trufanov et al., 2000). Deze
disulfide brug vorming werd reeds op veschillende wijzen beïnvloed. Zo worden L-cysteïne en
gereduceerd glutathion als reducerende agentia gebruikt om de deegstructuur te verzwakken (Shewry
et al., 1997; Udeh et al., 1999) en wordt ascorbaat (Gujral et al., 2003) als oxiderend agens gebruikt
om de deegstructuur te verstevigen. Ook enzymen zoals lipoxygenasen (Honold et al., 1968; Borch et
al., 2004) en dehydrogenasen (Xu, F et al., 1999) worden aangewend als broodverbeteraars.
3
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
1.2 Mannitol
1.2.1 Mannitol
1.2.1.1 Polyolen
Suikeralcoholen of polyolen zijn de gereduceerde vorm van suikers. Deze reductie vindt plaats op de
carbonylfunctie (Mathews et al., 1995). In het geval van de reductie van D-fructose, vindt de reactie
plaats op het tweede koolstof atoom en leidt dit tot de vorming van D-mannitol of D-sorbitol (figuur
1.2.1). Andere voorbeelden van polyolen zijn erythritol (uit D-erythrulose gevormd), xylitol (uit
xylose) en ribitol (uit ribose).
HO
CH2OH
H
HHO
OHH
OHH
CH2OH
D-mannitol
H
CH2OH
OH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
D-sorbitol
H
CH2OH
O
HHO
OHH
OHH
CH2OH
D-fructose
Figuur 1.2.1 De chemische structuur van D-fructose (een ketohexose) en D-mannitol en D-sorbitol (twee polyolen) (Mathews et al., 1995)
Ribitol, Erythritol en xylitol hebben verschillende interessante eigenschappen (Vandamme et al.,
1995). Erythritol bijvoorbeeld is ‘tand-vriendelijk’ omdat het geen substraat is voor cariogene
bacteriën en is matig zoet. Het wordt daarenboven noch opgenomen door het spijsverteringstelsel,
noch gefermenteerd in het colon. Bijgevolg is het een laagcalorisch product dat perfect bruikbaar is als
suikervervanger in levensmiddelen. Een andere toepassing van erythritol is van een heel andere aard.
Het wordt namelijk in de polymeerchemie gebruikt voor de productie van polyurethanen en
alkylharsen.
Ook xylitol is een niet-cariogene zoetstof. Het wordt onder andere toegepast in kauwgom. Dit polyol
wordt voornamelijk via chemische hydrogenatie van xylose geproduceerd. Xylose is een suiker dat uit
natuurproducten als maïskolven, noten en hout wordt geproduceerd. In gist wordt het eerst omgezet tot
xylitol en daarna tot xylulose. De overmaat aan xylitolproductie wordt uitgescheiden. Het is dus ook
mogelijk via fermentatieve weg xylitol te produceren.
1.2.1.2 Voorkomen van mannitol
Mannitol is een veel voorkomend suikeralcohol in planten en dieren. Het worden gevonden in planten
zoals pompoenen, selderij, uien, grassen, olijven en korstmossen. Door de plant Fraxinus ornus wordt
het geëxcreteerd als manna. Deze excreties waren vele jaren de enige commerciële bron van mannitol
en werd geproduceerd in Sicilië (Soetaert, W. et al., 1999; von Weymarn, 2002).
4
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
Voor vele gisten en fungi is mannitol een voorraadproduct dat in het mycelium opgeslagen wordt
(Vandamme et al., 1996). Naast suikerreserve vervult mannitol nog verschillende andere functies voor
schimmels. Zo speelt het een rol in de translocatie van verschillende essentiële moleculen en reguleert
het de co-enzymconcentratie in de cel. Zoals in figuur 1.1.1 wordt weergegeven wordt mannitol uit
fructose gevormd met oxidatie van NADH. Deze reactie is reversibel en in geval van overmaat aan
NAD+ kan mannitol als reducerend agens optreden om NADH te vormen. Het fungeert dus ook als een
soort voorraad van reducerende kracht in de cel. Daarnaast is mannitol een osmoregulator die in geval
van osmotische stress geaccumuleerd wordt (Wisselink et al., 2002). Deze accumulatie zorgt voor het
in stand houden van de turgor in de cel en stabiliseert de membranen van de cel door interactie met de
fosfolipiden en de proteinen.
Het anti-oxiderend effect van mannitol werd reeds in verschillende systemen bij de mens aangetoond
(Gilmour et al., 1995; Li et al., 1996). Veelal wordt het omschreven als een efficiënte hydroxyl-
radicaal scavenger. Stratford (1997) toonde echter aan in het onderzoek naar anti-oxidanten voor in
vitro vloeistoffen dat mannitol geen hydroxyl-radicalen kan inactiveren. Het feit dat in andere studies
een mengsel van reactieve zuurstofspecies werd gebruikt deed hem besluiten dat mannitol mogelijks
andere zuurstofradicaal-vormen inactiveert dan hydroxylradicalen.
1.2.1.3 Toepassingen van mannitol
(Soetaert, W. et al., 1999; von Weymarn, 2002; Wisselink et al., 2002; SPI Polyols Inc., 2003)
Het beschermend effect van mannitol voor micro-organismen bij lage wateractiviteit maakt dit polyol
een potentiële stabilisator van microbiële starterculturen. Dit zou de levensvatbaarheid van deze
culturen sterk verbeteren, wat leidt tot hogere residuele activiteit na transport of opslag.
Zoals de eerder beschreven polyolen is ook mannitol een zoetstofvervanger en heeft een veel lagere
calorische waarde dan sucrose. Daarenboven vertoont kristallijn mannitol een opmerkelijk lage
hygroscopiciteit. Deze eigenschappen impliceren dus dat het toepassingsgebied van dit polyol zich
vooral situeert in de voedingssector als additief (E421). Omdat de kracht als zoetstof echter half zo
groot als die van sucrose is, wordt het suikeralcohol vaak in combinatie met andere polyolen gebruikt
zoals xylitol, waarvan de zoetkracht even groot is als die van sucrose. Dit gebeurt bijvoorbeeld in
suikervrije kauwgum. Het gebruik van mannitol wordt echter beperkt door zijn lage laxatieve
drempelwaarde. De maximale dagelijkse inname mag daarom 20 gram niet overschreiden.
Voor farmaceutische toepassingen beschikt mannitol eveneens over interessante eigenschappen.
Mannitol vertoont een lage chemische reactiviteit en heeft uitstekende mechanische compressie-
eigenschappen. Samen met de eigenschap van lage hygroscopiciteit maakt dit het gebruik van
mannitol uitstekend voor geneesmiddelformuleringen als tabletten en poeders.
In de geneeskunde wordt mannitol als osmotisch diureticum toegepast bij intoxicatie therapie. Het
wordt tijdens verschillende chirurgische ingrepen gebruikt, onder andere om nierfalen en hersen-
oedemeem te voorkomen. Het hexanitraat derivaat wordt toegepast als vasodilator.
5
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
1.2.2 Mannitolproductie
1.2.2.1 Hydrogenatie
Tot op heden is de hydrogenatie van een glucose/fructose (1:1) mengsel de belangrijkste
productiemethode van mannitol. Door middel van een nikkel katalysator (Raney Nickel) en
waterstofgas bij hoge druk (70-140 atm) en temperatuur (120-160˚C) worden de carbonylfuncties van
beide suikers gereduceerd (Soetaert, W. et al., 1999; Wisselink et al., 2002). Hierbij wordt glucose
volledig omgezet tot sorbitol en fructose tot zowel mannitol als sorbitol. De uiteindelijke
samenstelling van het gehydrogeneerde mengsel is 30% mannitol en 70% sorbitol, wat impliceert dat
een kostelijk opzuiveringsproces noodzakelijk is. Dit proces is gebaseerd op de lagere oplosbaarheid
van mannitol, 220 gram per liter, in vergelijking met sorbitol, 2350 gram per liter. Het startmengsel
van glucose en fructose wordt op twee verschillende manieren enzymatisch bereid. Een eerste
bereidingsmethode maakt gebruik van het enzym invertase dat sucrose volledig omzet in een
equimolair glucose-fructose mengsel. Bij de tweede methode wordt glucose via een isomerase
omgezet naar fructose (Makkee et al., 1985; von Weymarn, 2002).
De lage mannitolopbrengst (30%) die dit proces oplevert heeft geleid tot verschillende alternatieve
hydrogenatieprocessen. Daarbij was de hoge meerwaarde van mannitol ten opzichte van sorbitol zeker
een stimulans. Een kilogram mannitol levert zo een 7,32$ op tegenover 1 kilogram sorbitol 1,61$
(Chemical Market Reporter, 2003).
Makkee, Kieboom en van Bekkum (1985) beschreven verschillende variaties van het proces. Een
eerste aanpassing die kan gemaakt worden is het vervangen van de katalysator. In het klassieke proces
wordt Raney-Nikkel of nikkel op silica gebruikt die weinig selectief is. D-Fructose wordt door deze
katalysatoren omgezet tot sorbitol en mannitol in een 50:50 verhouding. Verschillende andere
transitiemetalen werden getest. In het geval van rhodium en platina werd nog een derde product, D-
gluconzuur, gevormd. Koper daarentegen leverde wel een beter resultaat op. Een koper op silica
katalysator levert tussen de 65 en de 90% mannitol op uit fructose. Voor een proces dat uitgaat van
een 1:1 glucose/fructose mengsel resulteert dat in een opbrengst van 65% mannitol.
Een extra epimerisatiereactie na de hydrogenatie kan het rendement enigzins nog verhogen. Door
middel van een ruthenium katalysator kan sorbitol gedeeltelijk omgezet worden tot mannitol.
Naast verschillende katalysatoren werden ook verschillende substraten en substraat- combinaties
geprobeerd. Mannose is een logisch alternatief voor fructose gezien het bij hydrogenatie slechts één
product oplevert, namelijk mannitol. Maar hiervoor moet mannose eerst geproduceerd worden. Dit
gebeurt via een epimerisatiereactie van glucose met molybdaat bij een temperatuur tussen 90 en
130˚C. Dit proces heeft echter een zeer laag rendement, ongeveer 30% mannose wordt gevormd. Als
onmiddellijk na deze reactie de hydrogenatie wordt uitgevoerd dan levert dat weer de verhouding 7:3
sorbitol:mannitol op. Aanrijken van het mannose en recyclage van glucose levert een veel hogere
opbrengst op. Een andere methode is nog een epimerisatiestap invoeren die het glucose omzet tot
6
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
fructose. Dit fructose kan dan in een derde stap door hydrogenatie omgezet worden tot sorbitol en
mannitol.
Mannose zou in principe puur kunnen worden gekatalyseerd maar dan zou het productie-proces
economisch niet haalbaar meer zijn. De prijs van mannose ligt veel te hoog in verhouding met de
verkoopsprijs van mannitol (von Weymarn, 2002).
1.2.2.2 Fermentatieproces
Heel wat micro-organismen zijn is staat mannitol te produceren. Hieronder vallen verschillende gisten,
zoals Saccharomyce cerevisiae (Quain et al., 1987) en Candida magnoliae (Song et al., 2002) en
schimmels zoals Aspergillus candidus (Strandberg, 1969). Daarnaast zijn verschillende, voornamelijk
azijnzuur- en melkzuur-, bacteriën bekend die fructose kunnen omzetten tot mannitol. Twee
beschreven azijnzuurbacteriën zijn Gluconobacter oxydans en Acetobacter xylinum (Oikawa et al.,
1997).
Melkzuurbacteriën kunnen ingedeeld worden in twee groepen die beide op een analoge doch subtiel
verschillende wijze melkzuur genereren. De homofermentatieve melkzuurbacteriën maken gebruik
van de Embden-Meyerhof-Parnas route voor hun hexose fermentatie (addendum A). Hierbij worden
glucose en fructose eerst gefosforyleerd voordat ze de cel binnenkomen. Hun verdere fermentatie
levert de cel, voor elke mol substraat, 2 mol ATP en 2 mol lactaat op. De mannitolproductie gebeurt
via een zijtak van deze biochemische route. Deze zet fructose-6-fosfaat om in mannitol-1-fosfaat met
mannitol-1-fosfaat dehydrogenase. Een fosfatase zet dit dan om naar mannitol (Wisselink et al., 2002).
De tweede groep zijn de heterofermentatieve melkzuurbacteriën. Zij maken gebruik van een andere
biochemische route voor de fermentatie van hexosen, namelijk een combinatie van de
hexosemonofosfaat route en de fosfoketolase route (addendum B). Hierin worden naargelang het
substraat verschillende producten gevormd. Voor Leuconostoc pseudomesenteroides werd dit bepaald.
Is een combinatie van fructose en glucose aanwezig in het medium dan zal het omgezet worden tot
koolstofdioxide, lactaat, acetaat en mannitol volgens reactie (2.1). Deze fermentatie levert de cel 2 mol
ATP op per mol glucose (Grobben et al., 2001).
mannitol2acetaat1lactaat1CO1fructose2glucose1 2 (2.1)
Indien enkel fructose als koolstofbron aan het fermentatiemedium wordt toegevoegd, wordt er naast de
producten uit reactie (2.1) ook nog ethanol gevormd (reactie 2.2) (Erten, 1998).
mannitol1ethanol1.5acetaat0.5lactaat1CO2fructose3 2 (2.2)
Hierbij levert een mol fructose slechts 1.25 mol ATP op voor de cel.
Een glucose/fructose mengsel 1:2 levert dus meer mannitol op dan fructose alleen en is energetisch
gunstiger voor de cel.
Het verschil met de homofermentatieve melkzuurbacteriën zit hem in het soort mannitol
dehydrogenase dat wordt gebruikt. Het dehydrogenase van de homofermentatieve melkzuurbacteriën
7
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
heeft fructose-1-fosfaat als substraat, dat van de heterofermentatieve melkzuurbacteriën kan fructose
rechstreeks omzetten naar mannitol.
Yun en Kim (1997) vergeleken de mannitol productie van twee heterofermentatieve
melkzuurbacteriën, Leuconostoc sp. Y-002 en Lactobacillus sp. Y-107. Beide bleken een maximale
mannitolproductie te vertonen met fructose als enige koolstofbron. Dit is in tegenspraak met de
resultaten van Erten (1998) maar wordt bevestigd door Grobben et al. (2001) die een reactie (2.3)
vooropstelt.
mannitol2acetaat1lactaat1CO1fructose3 2 (2.3)
Hierbij wordt 2 mol ATP gevormd per mol gefermenteerde fructose. Het verschil tussen beide
resultaten kan verklaard worden door het verschil in concentratie aan fructose die aanwezig is in het
medium. Indien fructose in overmaat aanwezig is zal reactiemechanisme (2.3) gevolgd worden, indien
dat niet het geval is dan zal reactiemechanisme (2.2) geprefereerd worden. Dit is het gevolg van de
hoge Km-waarde (35 mM) (Sakai, S. et al., 1968a) van mannitol dehydrogenase van L.
pseudomesenteroides voor D-fructose. Bij hoge concentraties fructose zal dit enzym het
leeuwenaandeel van NADH opeisen voor de reductie. Wordt de fructose concentratie echter te laag
dan moet de cel een andere pathway aanwenden om NADH te regenereren tot NAD+. Dit gebeurt door
middel van een alcohol dehydrogenase met vorming van ethanol (Soetaert, W., 1992), een
mechanisme die in afwezigheid van fructose ook wordt aangewend. Glucose wordt dan gefermenteerd
volgens reactie (2.4) met vorming van 1 mol ATP per mol substraat – het minst energetisch gunstig
(Wisselink et al., 2002).
ethanol1lactaat1CO1glucose1 2 (2.4)
73 gram mannitol per liter medium werd geproduceerd uit 100 gram per liter fructose door
Lactobacillus sp.. Leuconostoc sp. haalde slechts 26 gram per liter. Verschillende parameters hadden
een gelijkaardig effect voor de stammen. Zo was het temperatuursoptimum voor beide 35ºC en leverde
een neutrale pH maximale mannitolproductie.
Voor Leuconostoc pseudomesenteroides werd door Soetaert et al. (1995 & 1999) een productieproces
geoptimaliseerd. Hierbij wordt het glucose/fructose mengsel (1:2) gebruikt in een batch of fed-batch
cultuur. Door de pH onder controle te houden met natriumhydroxyde en de fructose concentratie
voldoende hoog te houden werd een mannitol concentratie van 150 gram per liter bereikt. De totale
conversie van fructose bedroeg door deze parameters in rekening te brengen 94%.
De opwerking van mannitol bij zo een hoge concentratie is relatief eenvoudig. De oplosbaarheid is
immers slechts 180 g/L en kan eenvoudig bereikt worden door indampen van het medium. De
organische zuren werden verwijderd door elektrodialyse.
8
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
1.2.2.3 Enzymatische productie
Co-enzym regeneratie
De enzymatische productie van mannitol vereist toevoegen van NAD(P)H aan het reactie- mengsel.
Dit zal samen met mannitol dehydrogenase (MDH) fructose gaan reduceren (reactie 2.4).
NAD(P)mannitolDNAD(P)HfructoseD MDH (2.4)
Voor de vorming van elke molecule mannitol is er dus een molecule NAD(P)H nodig, wat het proces
economisch zeer oninteressant maakt. Een oplossing voor dit probleem wordt geboden door de co-
enzymregeneratie. Hierbij wordt een tweede reactie uitgevoerd waarbij het gevormde NAD(P)+
opnieuw gereduceerd wordt.
Deze tweede reactie kan op verschillende manieren uitgevoerd worden. Een eerste methode is de
elektrochemische regeneratie. Een voorbeeld van zo een regeneratie werd beschreven voor een alcohol
dehydrogenase (EC 1.1.1.1) van gist. Hierbij wordt ethanol omgezet tot acetaldehyde met reductie van
NAD+ tot gevolg (reactie 2.5).
Ethanol + NAD+ ADHAcetaldehyde + NADH
Elektrode
(2.5)
Deze reactie is thermodynamisch ongunstig en wordt door het regeneratie systeem in de richting van
acetaldehyde geduwd. Daarom zal men bij dergelijke reacties een membraanreactor gebruikt worden
waarbij de reactieproducten selectief verwijderd worden (Laval et al., 1991).
Een tweede methode is het gebruik van microbiële cellen voor de regeneratie van co-enzymen. Ze
bieden verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van opgezuiverde enzymen voor
regeneratie. Deze zijn immers vaak onstabiel in een extracellulair milieu. De activiteit kan
bijvoorbeeld verloren gaan door verlies van de 3-dimensionele structuur, het verlies van de
membraanassociatie of door vorming van intermoleculaire aggregaatvorming.
De extractie van een enzym uit een cel brengt eveneens een extractie met zich mee van de proteasen
van het organisme. Deze zullen het gewenste enzym onmiddellijk gaan aanvallen wat een significant
verlies betekend. De bereiding van intracellulaire enzymen is dus duur en omslachtig (Vandamme et
al., 2003).
Maakt men nu gebruik van cellen dan treden deze verliezen niet op. Gebruik makend van het
celmetabolisme kunnen co-enzymen perfect worden geregenereerd. Gistcellen worden bijvoorbeeld
gebruikt om (R)-(-)-1,2-propaandiol en (S)-(+)-ethyl-3-hydroxybutanoaat te produceren uit
respectievelijk ethyl acetoacetaat en acetol (Kometani et al., 1994). Hierbij wordt ethanol als substraat
voor de gistcellen gebruikt (figuur 1.2.2).
Aan het gebruik van volledige cellen hangen ook enkele nadelen vast. Extra substraat moet aan het
reactiemengsel toegevoegd worden voor regeneratie die grotendeels gemetaboliseerd wordt door de
9
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
cel. Dit leidt tot meer metabolieten, dus een complexere opzuivering van de gewenste stof. Daarnaast
zijn de chirale synthons vaak toxisch voor de cel in hogere concentraties wat de potentiële opbrengst
sterk reduceerd (Leonida, 2001).
ethanol acetaat CO2
NAD+ NADH NAD+ NADHO2
acetol1,2-propaandiol1,2-propaandiol acetol
Krebs cyclus en respiratie keten
ethanol acetaat CO2
NAD+ NADH NAD+ NADHO2
ethyl acetoacetaatethyl-3-hydroxy-butanoaat
Krebs cyclus en respiratie keten
(R)-(-)-1,2-propaandiol productie
(S)-(+)-ethyl-3-hydroxybutanoaat productie
O2
Figuur 1.2.2 De bioconversie van acetol en ethyl acetoacetaat door gistcellen met NAD(P)H-regeneratie door middel van de oxidatieve route van ethanol (Kometani et al., 1994)
De enzymstabiliteitsproblemen die zich stellen bij de enzymatische regeneratie kunnen opgelost
worden door bijvoorbeeld de enzymen te immobiliseren. De voornaamste zijn inclusie, adsorptie,
covalente binding en cross-linked enzyme crystals (CLEC’s) (Machtelinckx et al., 2003).
Een voorbeeld van inclusie is het fysisch omsluiten van het enzym met polyethyleenglycol (PEG). De
enzymen zijn beschermd maar de transportproblemen van de veschillende substraten zijn groot.
Hiervoor werd een oplossing gevonden in de copolymerizatie van NAD+ met PEG. Hierbij moet enkel
nog het te converteren substraat in de matrix diffunderen. Het NAD+-copolymeer vertoont een
activiteit van dezelfde grootte orde als die van het vrij co-enzym (Furukawa et al., 1980).
Een gelijkaardig systeem werd beschreven door st Clair, Wang en Margolin (2000). Zij construeerden
een CLEC van alcohol dehydrogenase (ADH). Hierbij werd het enzym eerst uitgekristalliseerd en
daarna gecrosslinked met glutaaraldehyde. Gebeurt dit in de aanwezigheid van NADH dan ontstaat
een ADH-NADH-CLEC. Dit kristal vertoont 64% van de activiteit van de niet-geïmmobiliseerde
variant, maar deze activiteit kan verhoogd worden tot 92% indien extra NADH wordt toegevoegd.
10
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
Het voordeel van zo een systeem is dat het veel robuuster is tegenover extreme omstandigheden. Het
enzym blijft veel langer actief bij verhoogde temperatuur en kan makkelijk extreme
alcoholconcentraties verdragen. Bijvoorbeeld is het na twee dagen bij 90% isopropanol nog steeds
volkomen actief.
In de CLEC is slechts één enzym aanwezig dat instaat voor zowel de omzetting van het substraat en de
regeneratie van het co-enzym. Daarom wordt dit regeneratiesysteem aangeduid als gekoppelde-
substraat regeneratie. Indien een tweede enzym instaat voor de regeneratie van het co-enzym, wordt
het systeem een gekoppelde-enzym regeneratie genoemd (Leonida, 2001).
Toepassing van een gekoppeld enzymsysteem in de mannitol productie
Een mannitol dehydrogenase (MDH) van Pseudomonas fluorescens – overgeproduceerd in E. coli –
werd gebruikt voor de reductie van D-fructose. Dit in combinatie met een formiaat dehydrogenase van
Candida boidinii geeft aanleiding tot een regeneratieproces dat een mannitolconcentratie oplevert van
75 gram per liter (figuur 1.2.3) (Slatner et al., 1998a; Slatner et al., 1998b). Dit is nog niet competitief
met de 150 gram per liter die werd bereikt door Soetaert et al.(1995 & 1999).
D-fructose D-mannitol
NAD+ NADH
MD H
formiaatCO2 + H2OFDH
Figuur 1.2.3 Het gekoppelde enzym regeneratie systeem van formiaat dehydrogenase (FDH) en mannitoldehydrogenase (MDH) voor de productie van mannitol (Slatner et al., 1998 a&b)
Na 48 uur reactie wordt hierbij ongeveer 98% van het fructose omgezet naar mannitol. Het formiaat
wordt omgezet naar koolstofdioxide, wat het opzuiveringsproces veel vereenvoudigt. Het resterende
formiaat blijft tijdens de kristallisatie van het mannitol in oplossing.
Drie problemen stellen zich bij deze productiemethode. Een eerste is een pH-shift naar het alkalische
gebied door de katalyse van formiaat tijdens de regeneratie van NAD+. Dit kan eenvoudig opgelost
worden door waterstofchloride toe te voegen aan het reactiemengsel.
De stabiliteit van de enzymen, vooral mannitol dehydrogenase, vormt een tweede probleem. Om het
enzym stabiel te houden voor langere tijd bij 25˚C was 1mM dithiothreitol nodig, een reducerend
thiol. Dit is echter een toxische stof die bij de product recovery verwijderd moet worden. Mannitol
wordt immers vaak gebruikt in voedingstoepassingen waarin dergelijke stoffen niet thuis horen (§
1.2.1.3). Ook het roeren van het reactiemengsel zorgt voor inactivatie van MDH. Deze moet dus
aangepast worden om inactivatie door shear stress te minimaliseren (Slatner et al., 1998a; Slatner et
al., 1998b).
Omdat er in veel gevallen van een enzymatische synthese productinhibitie optreedt eens een bepaalde
concentratie is bereikt, wordt geprobeerd het product continu af te voeren. Wichmann et al. (2000)
11
MANNITOL LITERATUURSTUDIE
beschreven een continue enzymatische transformatie in een membraanreactor die aan deze voorwaarde
voldoet. Ze maakten hierbij gebruik van een ultrafiltratiemembraan die selectief het reactieproduct van
laag moleculair PEG-gelinkte co-enzymen scheidde. Deze copolymeren van NAD+ en NADH zijn
noodzakelijk om uitspoelen te vermijden. Deze co-enzym polymeren hebben verschillende nadelen.
Veelal vertonen ze minder gunstige kinetische eigenschappen en worden ze door bepaalde enzymen
niet meer als substraat aanvaard. De kostprijs van de co-enzymen ligt ook veel hoger door verliezen
tijdens de polymerisatie (Howaldt et al., 1988).
Een membraan enzym reactor werd gebruikt voor de simultane productie van mannitol en gluconaat.
Hierbij werd geen gebruik gemaakt van polymeergebonden co-enzymen omdat het glucose
dehydrogenase niet in staat is dit als cofactor te gebruiken. Daarom werd geopteerd voor een
aangepast membraan. Uitgaande van het feit dat de co-enzymen netto negatief geladen zijn, werd een
negatief geladen membraan ontwikkeld die door repulsie selectief het medium filtreert (Nidetzky et
al., 1996).
Het mechanisme van de simultane synthese van mannitol en gluconaat wordt gegeven in figuur 1.2.4.
Het fructose wordt hier omgezet door een mannitol dehydrogenase van Torulaspora delbrückii. De
regeneratie gebeurt door het glucose dehydrogenase van Bacillus megaterium. Dit enzym oxideert
glucose eerst tot D-glucono-1,5-lacton, wat spontaan reageert met water met vorming van gluconaat
(Howaldt et al., 1988).
D-fructoseD-mannitol
NAD+NADH
MDH
glucose D-glucono-1,5-lactonGDH
Gluconaat
H2O
Figuur 1.2.4 Een co-enzym regeneratiesysteem waarbij gluconaat en mannitol worden geproduceerd uit respectievelijk glucose en fructose door een glucose dehydrogenase (GDH) van Bacillus megaterium en een mannitol dehydrogenase (MDH) van Torulaspora delbrückii. (Nidetzky et al., 1996)
Vooral de enzymstabiliteit is de beperkende factor in deze systemen, enkel als dit kan opgelost worden
kan dit competitief zijn tegenover de fermentatieve productie van mannitol (Nidetzky et al., 1996).
12
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
1.3 Nucleotide pyrofosfatase (NPP)
1.3.1 Inleiding
Zoals uit het experimentele gedeelte zal blijken bevat bloem een enzym dat in staat is nicotinamide
adenine dinucleotide (NAD+) af te breken. De afbraak kan op verschillende wijzen gebeuren
naargelang het enzym (figuur 1.3.1). Deze enzymen werden reeds in verschillende (micro-)
organismen beschreven. Elzainy en Ali (2000) beschrijven de afbraak van NADP+ en NAD+ door een
Aspergillus niger extract (addendum D). Hierin werden twee fosfatasen gekarakteriseerd (een zure en
een alkalisch) die in staat zijn NADP+ te defosforyleren naar NAD+ en dit verder af te breken naar
ADP (adenosinedifosfaat) en nicotinamide-ribonucleoside (NR). ADP kan op zijn beurt nog verder
afgebroken worden over AMP (adenosinemonofosfaat) naar adenosine.
In menselijke monocyten (Pfister et al., 2001) is een NAD+-glycohydrolase (E.C. 3.2.2.6)
verantwoordelijk voor de afbraak van het co-enzym. Het is in staat de glycosidische binding tussen
nicotinamide en ribose te hydrolyseren met vorming van ADP-ribose. Voor hepathocyten (levercellen)
wordt een gelijkaardig mechanisme verondersteld (Inoui et al., 1989). De intracellulaire concentratie
aan NAD+ werd behouden bij toevoeging van nicotinamide, een precursor in de NAD-biosynthese
(addendum C). Het inhibeert daarnaast de activiteit van poly(ADP-ribose)-synthetase. Dit enzym
speelt een belangrijke rol in de NAD+-afbraak. Het verwijdert immers een primair afbraakproduct van
NAD+, ADP-ribose, dat in staat is NAD-glycohydrolase te inhiberen.
Naast fosfatasen en glycohydrolasen is er nog een derde enzymgroep in staat om NAD+ af te breken,
de nucleotide pyrofosfatasen (E.C. 3.6.1.9 en E.C. 3.6.1.22). Voor Haemophilus parainfluenza is dit
enzym van levensbelang (Cynamon et al., 1988a). Het is een transmembraan enzym dat NAD+
afbreekt tot AMP + NMN (nicotinamide mononucleotide) of NR + ADP die dan naar het cytoplasma
worden getransporteerd. NMN wordt door een fosfatase omgezet tot NR dat op zijn beurt afgebroken
wordt tot ribose en nicotinamide door een NAD-glycohydrolase (addendum E).
Bessman et al. (1996) beschrijven een nucleotide pyrofosfatase dat NADH als substraat prefereert over
NAD+. Het maakt deel uit van de Nudix hydrolase familie (zie § 1.3.2).
13
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
PO
O
O-
O
HO
HH
HH
PO
O
O
O-
HO
+ N
C
O
NH2
NAD+
enzym: Nucleotide pyrofosfatase of niet-specifiek fosfatase (zuur of alkalisch)afbraakproducten: >> Nicotinamideribonucleoside (NR) >> ADP
enzym: Nucleotide pyrofosfataseafbraakproducten:
>> Nicotinamide mononucleotide(NMN) >> AMP
enzym: NAD glycohydrolaseafbraakproducten:
>> nicotinamide>>ADP-ribose
Verdere afbraak:
NRNAD glycohydrolase
ribose + nicotinamide
ADP AMPfosfatase
adenosinefosfatase
adenosine ribose + adeninezure hydrolyse
pH 4
NMNalkalisch fosfatase
NR
Figuur 1.3.1 Overzicht van de mogelijke afbraakreacties die NAD+ kan ondergaan
1.3.2 Nudix hydrolasen
1.3.2.1 De Nudix-box sequentie
Uit studies rond het MutT proteïne van Escherichia coli en het MutX proteïne van Streptococcus
pneumoniae blijkt dat er een kleine regio van aminozuren bestaat die homoloog is voor beide eiwitten
(Bessman et al., 1996). Deze eiwitten zijn nucleoside trifosfatasen. Hetzelfde onderzoek heeft aan de
hand van verscheidene gendatabanken aan het licht gebracht dat deze homologe aminozuursequentie
ook in andere organismen voorkomt. Meestal bezitten ze een proteïne gecodeerd door een open
14
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
reading frame (Orf)1 met dezelfde signatuur als MutT. Deze aminozuur-signatuursequentie is
GXVEX2ETX6REVXEEX2I (O'Handley et al., 1996) – aangeduid als de Nudix-box – waarbij X een
aminozuur voorstelt dat variabel is van organisme tot organisme (Overzicht van de aminozuurcodes in
addendum F).
Over het algemeen is het genproduct of de functie van het genproduct onbekend, maar de reeds
gekarakteriseerde producten blijken enzymen te zijn. Op het eerste zich – door de grote variëteit van
ongerelateerde substraten – hebben deze enzymen weinig gemeenschappelijk, maar allen zijn ze in
staat een nucleoside difosfaat gebonden aan een molecule ‘X’ te hydrolyseren. Vandaar de naam
‘nudix’-hydrolasen.
1.3.2.2 De tertiaire structuur
Naast de primaire structuur zijn er reeds indicaties dat de tertiaire structuur homoloog is voor de
Nudix-proteinen. De structuur van het E. coli MutT proteine bestaat uit 5 -sheets sandwiches tussen
twee - helices die verbonden zijn met lange loops van aminozuren (figuur 1.3.2 (A)).
A B
Figuur 1.3.2 A:De tertiaire structuur van het E. coli MutT-proteine waarbij de geconserveerde aminozuren zijn aangeduid (Abeygunawardana et al., 1995); B: Het actief centrum van NUDT9, een Nudix-hydrolase teruggevonden in menselijk weefsel, waarbij de geconserveerde aminozuren van de Nudixfamilie aangegeven zijn (Shen et al., 2003)
Het geconserveerde stuk tertiaire structuur bestaat uit een loop-helix-loop conformatie, die deel
uitmaakt van het actief centrum (figuur 1.3.2 (A & B)). Twee magnesium ionen vormen in het actief
centrum van NUDT9 een complex met 6 watermoleculen, Glu230, Gly214 en ribose-5-fosfaat (figuur
1.3.3(A)). Het eerste magnesiumion wordt octaëdrisch gecoördineerd door 5 watermoleculen en
1 Open Reading Frame (Orf): in het coderende deel van het DNA of mRNA de regio die een reeks codons bevat
die niet worden onderbroken door een stop codon en dus codeert voor een polypeptide keten (Hartl, D.L. et al.,
2000).
15
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Glu230. Het tweede zit in een complex van de carbonylzuurstof van Gly214 (niet op de figuur
zichtbaar), een vrij zuurstofatoom van de fosfaatgroep van ribose-5-fosfaat en 2 watermoleculen,
waarvan 1 gedeeld wordt met het eerste magnesium ion. In dit geval is ribose-5-fosfaat, een
afbraakproduct, noodzakelijk om een stabiel complex te vormen (Shen et al., 2003). Een nudix
familielid van Caenorhabditis elegans (Bailey et al., 2002) vertoont een gelijkaardig actief centrum
(figuur 1.3.3 (B)). Glu52, Glu56 en Glu103 samen met de fosfaatgroep van één van de
afbraakproducten, in dit geval ADP en negen water moleculen zorgen voor de coördinatie van twee
magnesium ionen. A B
Figuur 1.3.3 A: Metaal-enzym complex van NUDT9 (Shen et al., 2003); B: Schema van het metaal-enzymcomplex van een diadenosine tetrafosfaat hydrolase van Caenorhabditis elegans
1.3.2.3 Substraten van de Nudix Hydrolasen
De MutT en MutX genproducten zijn enzymen die voornamelijk nucleoside-trifosfaten afbreken
waarbij dGTP geprefereerd wordt (reactie 3.1).
i2 PPdGMPOHdGTP (3.1)
Beide enzymen spelen een belangrijke rol als anti-mutator. 8-Oxo-7,8-dihydroxy-2’-dGTP (8-oxo-
dGTP) wordt beschreven als een zeer krachtig mutageen analoog van dGTP (Maki et al., 1992;
Zaccolo et al., 1996).
Figuur 1.3.4 Mechanisme van mutatie door basepaarsubstitutie, meer bepaald transversie tijdens de DNA replicatie, het symbool ‘~’ staat voor misparing van de nucleotiden
T~C
A~G
C:GA:T
16
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Het wordt spontaan in de cel gevormd en veroorzaakt AT CG transversie (figuur 1.3.4). In de eerste
replicatie ronde wordt A met G gemispaard, waarna in een tweede ronde een juiste paring optreedt wat
leidt tot de finale basepaarsubstitutie (Vandamme et al., 2003).
De snelheid van dit mutatiemechanisme wordt door het mutT-proteine, een nucleoside trifosfatase,
sterk gereduceerd. Het breekt immers de mutagene analogen sneller af dan de reguliere
deoxynucleosidetrifosfaten (dNTP) (Bessman et al., 1991; Bhatnagar et al., 1991; Mo et al., 1992)
waardoor de dNTP wordt ‘opgeruimd’.
Naast de MutT open reading frame bezit E. Coli verschillende andere Orf’s die ook de geconserveerde
signatuur sequentie bevatten. Orf172 codeert voor een nucleoside –trifosfaat pyrofosfohydrolase dat
dATP prefereert (reactie 3.2) als substraat boven de andere dNTP’s.
i2 PPdAMPOHdATP (3.2)
Orf1.9 is een DNA fragment in de cps-regio – verantwoordelijk voor de synthese van het
kapselpolysacharide of het M-antigeen. Het codeert voor een proteine dat GDP-mannose hydrolyseert
(reactie 3.3).
mannoseGDPOHmannose-GDP 2 (3.3)
Op gelijkaardige wijze wordt ADP-ribose door het genproduct van orf209 gehydrolyseerd naar ADP
en ribose-5-fosfaat.
Interessanter is de activiteit van de proteinen die afgeleid zijn van orf 186 en orf 257. Deze proteinen
zijn enzymen die geen activiteit vertonen als nucleoside trifosfatase, maar als dinucleotide
pyrofosfatase (EC 3.6.1.9). Het orf186 enzym hydrolyseert moleculen van de diadenosine polyfosfaat
klasse ApnA, met n = 2-6 (figuur 1.3.5), het is een ApnA-ase.
O
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
OP
O-
O
N
N N
N
NH2
O
OH OH
H H
H Hn
n = 2-6
Figuur 1.3.5 Structuur van diadenosine polyfosfaten (McLennan, 2000)
Deze moleculen spelen bij prokaryoten een belangrijke rol in stress-stituaties (hitte shock en
oxidatieve stress). Zo zal Ap4A in geval van DNA schade de replicatievork gaan vertragen in de S-fase
2 Orf 257, Orf 209, en Orf 186 zijn enzymen die respectievelijk 257, 209 en 186 aminozuren bevatten, Orf17 is
een proteine van 17 kDa en Orf1.9 is een locus op een DNA fragment (Bessman, M.J. et al., 1996)
17
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
van de celdeling door binding met DNA-polymerase (McLennan, 2000). Dit systeem zou het DNA
repair systeem voldoende tijd moeten geven om schade te herstellen.
Bij eukaryoten is de functie van nucleoside polyfosfaten uitgebreider. Ze krijgen een belangrijke rol
toebedeeld als extra- en intracellulaire signaalmoleculen (Kisselev et al., 1998).
Reactie 3.4 geeft het algemene afbraakschema van Ap3A (diadenosine-5’,5”’-P1,P3-trifosfaat) door het
ApnA-ase.
ADPAMPOHAAp 23 (3.4)
Naast deze moleculen is het orf186 enzym ook in staat ADP-ribose en NADH af te breken (O'Handley
et al., 1998), een activiteit die voornamelijk wordt toegeschreven aan het genproduct van orf257. Dit
enzym heeft een unieke specificiteit voor het gereduceerde co-enzym NADH. De katalytische
efficiëntie ligt namelijk 100 keer hoger voor NADH in vergelijking met NAD+. Het is ook de, tot op
heden, enige bekende biochemische route waarbij NMNH gevormd wordt (reactie 3.5).
NMNHAMPOHNADH 2 (3.5)
1.3.3 NADH pyrofosfatase van de Nudix familie
1.3.3.1 Eigenschappen en voorkomen
Het eerste enzym met de eigenschap NADH te prefereren als substraat boven NAD+ werd beschreven
door Jacobson en Kaplan in 1956. Het was een gedeeltelijk opgezuiverd enzym uit duivenlever. Het
feit dat dit enzym ook -NAD als substraat heeft en ADP-ribose twee keer zo snel gehydrolyseerd
wordt in vergelijking met NADH, maakt het verschillend van de nudix NADH pyrofosfatasen (Frick
et al., 1995).
NADH hydrolasen ••••••• •
E. coli Orf 257 GVHTVLAGFVEV-GETLEQAVAREVMEESGIKVKNLR-YVTSQPWPFPQSLMT S. cerevisiae YGL067w VLYSTIAGFMEP-SETIEEACIREIWEETGISCKNID-IVRSQPWPYPCSLMI C. elegans F13H10.2 GVFTAVAGFAHVSGESMAECARREIAEEVGEIVDSIRSLDMSQPWPMPDSSLM H. sapiens EST KMYSALAGFCDI-GESVEETIRREVAEEVGLEVESLQ-YYASQHWPFPSGSLM
H. influenza HI0432 GIYTTLAGFVEV-GETFEQAVQREVFEETGISIKNLR-YFGSQPWAFPNSQMV P. aeruginosa (Contig637) GVYSTLAGFVEA-GESVEQCVVREVREEVGVEVANLE-YIGSQNWPFPHSLML M. muslculus EST RGYILPGGFCDI-GESVEETVHREVAEEVGLEVENIQ-YSASQHWPFPNSSLM M. tuberculosis MTV014 RMFSLLAGFVEA-GESFEVCVAREIREEIGLTVRDVR-YLGSQQWPFPRSLMV A. actinomyces (Contig583) GIYTTLAGFVEV-GETFEDAVHREIWEETQIKVKNLR-YFDSQPWAFPNSQMV D. radiodurans (Contig33) DVFTTLAGFVEP-SETLEAAVHREVGEEVGVKVRQVQ-YRFSQPWPFPHSLML R. capsulatus RRC00965 GLHSCPAGFMEP-GETPAAAVRREVFEETGIRVGAVR-FLAAQPWPFPASLML C. acetobutylum (Contig186) GMYALISGFVDA-GENLESTVRREVFEEVGIRVKNIR-YYNSSAWPFPDSLML B. perstussis (Contig1167) ARYTALAGFVEV-GESIEDAVHREVEEEVGLRVRDLR-YFGSQSWPFPHSLMI S. typhi (Contig753) GVHTVLAGFVEV-GETLEQAVAREVMEESGIKVKNLR-YVTSQPWPFPQSLMT Y. pestis (Contig735) GINTVLAGFVEV-GETLEQAVSREVLEESNIHIKNLR-YVTSQPWPFPHSLMM V. cholerae (Asm836) GMYTVIAGFVEV-GETLEQCVAREVLEETGIVVTNIR-YFGSQPWAFPSSMMM
Figuur 1.3.6 Overzicht van de NADH hydrolasen of pyrofosfatasen. De in vet aangeduidde aminozurenbehoren tot de Nudix-box, de sequentie die aangeduid is met puntjes is de sequentie specifiek voor NADH hydrolasen. De organismen die aangevinkt zijn, bezitten een reeds gekarakteriseerd enzym (Dunn, C. A. et al., 1999)
18
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Deze pyrofosfatasen bezitten naast de nudix-box, GX5EX7REUXEEX2U (U stelt hier een hydrofoob
aminozuur voor, Ile, Leu of Val), een tweede specifieke sequentie stroomafwaarts (Dunn et al., 1999).
Figuur 1.3.6 geeft een overzicht weer van alle met BLAST3 gevonden organismen die deze sequentie
bezitten. De NADH-hydrolase specifieke sequentie is SQPWPFPXS. De eigenschappen van de reeds
gekarakteriseerde enzymen worden weergegeven in tabel 1.3.1
Tabel 1.3.1 Vergelijkende tabel van verschillende NADH pyrofosfatasen van de Nudix familie (Frick et al.,1995; Xu, WL et al., 2000; Dobrzanska et al., 2002; Abdebraheim et al., 2003; Abdelbraheim et al., 2003)
S. cerevisiae C. elegans E. coli H. sapiens A. thalianaIntrons 0 5 0 ? ?
Aminozuren 385 345 257 462 147
Moleculair gewichtsubunit (kDa)
43,5 39,1 29,7 52 18,5
Quaternairestructuur
dimeer dimeer dimeer dimeer dimeer
Metaal-ion Mg2+ of Mn2+ Mg2+ of Mn2+ Mg2+ of Mn2+ Mg2+ of Mn2+ Mn2+
Substraat-voorkeur NADH NADH NADH NADH NADH
pH-optimum 7,5 8,5 8,5 8-9 7
Vmax (units/mg) 12,3 6,6 7,6 12 12,7
Km (mM) 1,6 1,4 0,11 0,011 0,36
Het zijn allemaal dimeren die magnesium of mangaan als cofactor bezitten. Het pH optimum is over
het algemeen alkalisch, met uitzondering van de NADH pyrofosfatasen van S. Cerevisiae (pH 7,5) en
A. thaliana (pH 7) (Frick et al., 1995; Xu, WL et al., 2000; Dobrzanska et al., 2002; Abdebraheim et
al., 2003; Abdelbraheim et al., 2003).
ACCESSIE DEEL SEQUENTIE
AAD25835 KVPTGTIKEGESIWAGAVREVKEETDIDAEFVEVLSFMESHQAVWQAAD25833 KLPTGVVKEGENIWEGALREVEEETGIKTKFVEVLAFRESHQAFLEAAF78493 VFPKGGWEDDETVLEAASREAIEEAGVKGILRELPLGVWEFRSKSSAAG52038 ALPGGHLEFGESFEECAAREVMEETGLKIEKMKLLTVTNNVFKEAPAAL47357 KFPTGVVNEGEDIHDGSVREVKEETGVDTEFDQILAFRQTHKAFFGBAA97158 KLPTGFINESEEIFSGAVREVKEETGVDTEFSEVIAFRHAHNVAFECAB78314 KLPTGVINEGEDIWTGVAREVEEETGIIADFVEVLAFRQSHKAILKNP189303 VFPKGGWEDDETVLEAASREAMEEAGVKGILREDPLGVWEFRSKSS
Figuur 1.3.7 Deel van de sequenties van de leden van de Nudix familie in A. thaliana. De Nudix-box is invet aangeduid, de sequentie van het reeds beschreven enzym is omkaderd (Dobrzanska et al., 2002)
3 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): Een zoekmachine die proteine en nucleotide sequenties gaat
vergelijken met reeds gekarakteriseerde sequenties aanwezig in verschillende databanken. De kracht van het
systeem zit hem in het feit dat het in staat is regio’s van homologie te herkennen, bijvoorbeeld de Nudix-box.
Het systeem is terug te vinden op http://www.ncbi.nih.gov/
19
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Interessant is het feit dat het beschreven enzym van A. thaliana de specifieke NADH- hydrolase
sequentie niet vertoont – hoewel het alle katalytische eigenschappen gemeenschappelijk heeft. Het
heeft een aminozuursequentie die meer gelijkenissen vertoont met het orf186 hydrolase of ApnA
hydrolase van E. coli. Figuur 1.3.7 geeft de BLAST resultaten weer voor A. thaliana.
Uit het onderzoek naar een menselijk NADH hydrolase (Abdelbraheim et al., 2003) bleek dat A.
thaliana toch een sequentie bezat homoloog aan die van deze nudix-subfamilie. Het proteine
aangeduid als AT 5g20070 (figuur 1,3.8), bezit 438 aminozuren en heeft een tot op heden onbekende
functie.
G GE RE EE G SQPWPFP S
271 MWSCLAGFIEPGESLEEAVRRETWEETGIEVGDVVYHSSQPWPVGPSSMP 315
Figuur 1.3.8 NADH-hydrolase sequentie voor A. Thaliana (Abdelbraheim et al., 2003)
Een tweede plant waarbij een NADH pyrofosfatase is aangetroffen is Lens esculentum (linzen)
(Medda et al., 2000). Het is een enzym met een moleculair gewicht van 75 kDa, pH optimum van 10
en mangaan, magnesium of calcium als mogelijke cofactoren. De quaternaire structuur is echter
monomerisch en de preferentie van NADH over NAD+ is niet zo sterk uitgeproken. De activiteit
tegenover NAD+ is slechts 1,5 keer die tegenover NADH, wat sterk in contrast staat met de 100 keer
van het E. coli NADH hydrolase. Uit deze gegevens is het niet mogelijk te besluiten of het
linzenenzym al dan niet tot de Nudix familie behoort gezien de sequentie nog onbekend is
(Dobrzanska et al., 2002). Een mogelijk indicatie dat het om een andere enzymgroep gaat is het feit
dat fenylglyoxaal niet inhibitorisch werkt. Deze molecule reageert immers specifiek met
arginylresidu’s (Takahashi, 1996; Medda et al., 2000). Figuur 1.3.2 geeft duidelijk aan dat het arginine
(R) van de Nudix-box zich in het actief centrum bevindt. Een reactie met dit aminozuur van
fenylglyoxaal zou een conformatieverandering van het actief centrum teweeg brengen. Hierdoor zou
de enzymactiviteit verlaagd of geëlimineerd worden. Maar dit gebeurt voor het linzenenzym niet.
BLAST kan ook toegepast worden op het genoom van Triticum aestivum. The Institute for Genomic
Research (TIGR) bezit een databank met het volledige genoom van tarwe die kan doorzocht worden.
(http://www.tigr.org/tdb/tgi/tagi/). Door de sequentie van het reeds gekarakteriseerde Arabidopsis
enzym in te voeren werden de proteinen in figuur 1.3.9 bekomen.
Hierbij worden TC127881, TC127879, CA603977 en TC127882 beschreven als sterk gelijkaardig
diadenosine tetrafosfaat hydrolasen van Lupinus angustifolius (de blauwe lupine). TC109443 is zeer
gelijkaardig aan een MutT-proteine van Oryza sativa (rijst). (Dit wordt weergegeven in de resultaten
van BLAST)
20
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
proteine Gedeeltelijke sequentie aantal aminozuren
Nudix-box G GE RE EE GTC109443 434 GGWENDETVEQAAAREAIEEAGVRG 523 1164TC136731 298 GHISAGDSSLSSARRELQEELGIKL 372 1034TC111091 774 GFIQESEEIYTGAIREVQEETGVDT 872 1431TC127881 16 GGIDPGEEPRAAAVRELREETGVRS 94 481TC127879 61 GGIDQGEEPRAAAIRELREETGVRS 139 672CA603977 6 GGIDPGEEPRAAAIRELREETGVRS 84 470TC127882 272 GGIDQGEEPRAAAIRELREETGVRS 350 841
Figuur 1.3.9 Verschillende aminozuursequenties bekomen met BLAST op de website van TIGR. Enkel deNudix-box is weergegeven met de code van het proteine
1.3.3.2 Fysiologische functie
Welke rol NADH pyrofosfatase is toebedeeld in het metabolisme van de cel is tot op heden nog
onbekend. Bessman en Frick (1996) stellen als hypothese dat NMNH, één van de afbraakproducten,
een nog onbekende rol speelt in het metabolisme. De afbraak van NADH is immers de enig bekende
biochemische route die NMNH als product heeft. Een tweede hypothese werd door Jacobsen en
Kaplan (1956) uitgewerkt. Tijdens hun onderzoek naar een NADH pyrofosfatase in duivenlever
gingen ze na welk effect het enzym heeft op het reactie-evenwicht. Drie reactiemengsels werden
hierbij parallel geïncubeerd. In het eerste werd alcoholdehydrogenase (ADH) van gist geïncubeerd met
NAD+ en ethanol (in Tris-HCl buffer pH 7,5) over een periode van 20 minuten, waarna NADH
pyrofosfatase (NADH-NPP) werd toegevoegd. Deze laatste stap werd voor het tweede mengsel
overgeslagen. In de blanco werd geen van beide enzymen toegevoegd. Op het einde van de incubatie
(ongeveer na 75 minuten) werd acetaldehyde toegevoegd aan alle mengsels om de ADH activiteit stil
te leggen.
Figuur 1.3.10 geeft de resultaten van dit experiment weer. De blanco gaf nauwelijks absorbantie aan.
De twee andere mensgels vertoonden in de eerste 20 minuten een gelijkaardig verloop. Ethanol werd
geoxideerd tot acetaldehyde door ADH en NAD+ werd hierbij omgezet tot NADH (reactie 3.6).
NADHCHOCHNADOHHC 3ADH
52 (3.6)
Na 20 minuten stopt deze reactie als gevolg van productinhibitie (aangeduid met in de figuur).
Wordt er echter NADH-NPP toegevoegd dan blijft ze, weliswaar trager, doorgaan (aangeduid met in
de figuur). De afbraak van NADH (reactie 3.5) impliceert een verschuiving van de reactie naar de
producten – acetaldehyde en NADH.
Deze resultaten wijzen er dus op dat NADH pyrofosfatase mogelijks een rol speelt in het reguleren
van de NADH/NAD+ verhouding in de cel. Deze verhouding speelt immers een belangrijke rol in het
evenwicht van vele metabolische routes. In normale omstandigheden zijn de redox-reacties met NAD+
en NADH omkeerbaar. Selectief verwijderen van NADH zou dus de oxidatiereacties gaan
bevoordelen. Onder anaërobe omstandigheden, waarbij NADH reoxidatie uitgeschakeld wordt, zal er
21
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
inhibitie optreden van de oxidatieve route. Afbraak van NADH biedt tijdelijk een oplossing voor een
cel die zich in een toestand van anoxie bevindt.
Figuur 1.3.10 De resultaten van het experiment van Jacobsen en Kaplan (1956) waarbij de absorptie van het reactiemengsel bij een golflengte van 340nm wordt uitgezet in functie van de tijd. (bij 340 nm wordt devorming van NADH gemeten). geeft de evolutie van de NADH-absorptie weer van het volledige systeem (ADH +NADH-NPP); geeft de evolutie weer van het systeem zonder NADH-NPP; is het blanco mengsel
1.3.4 NAD pyrofosfatase
Naast de Nudix-familie NADH-hydrolasen werden er reeds een hele reeks andere enzymen
beschreven die co-enzymen afbreken. Deze enzymen bezitten over het algemeen een veel breder
spectrum van substraten. Een nucleotide pyrofosfatase in Saccharomyces sp. hydrolyseert naast de co-
enzymen ook een hele reeks suikernucleotiden (zoals GDP-mannose en UDP-glucose). Het enzym is
daarenboven in staat synthetische substraten als deoxythymidine-5’-p-nitrofenylfosfaat af te breken.
Hierbij komt nitrofenol vrij, een makkelijk detecteerbare molecule vanwege zijn gele kleur (Haroz et
al., 1972).
Dit enzym heeft twee eigenschappen gemeenschappelijk met de Nudix hydrolasen. Het heeft een
alkalisch pH-optimum (pH 8,5) en heeft een metaal-ion nodig als cofactor. Uit reactievatieproeven
met EDTA en atoomabsorptie spectrometrie tijdens de opzuivering van het enzym blijkt dat zink (II+)
deze cofactor is. Interessant om op te merken is het feit dat zink een typisch metaalion is voor de
metallo-enzymen van gist. Het komt onder andere voor in alcohol dehydrogenase, fructose-1,6-
difosfaat aldolase, D-lactaat cytochroom reductase, pyruvaat carboxylase en fosfo-mannose isomerase
(Twu et al., 1977).
22
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Kornberg beschreef in 1950 een regeneratiesysteem van NAD+ en FAD in gist. Hierbij breekt NPP
het NAD+ af tot NMN en AMP, maar wordt NMN samen met ATP door een adenyltransferase (EC
2.7.7.1) geresynthetiseerd. Zo onstaat een systeem waarbij pyrofosfaat (PPi) wordt geacummuleerd
(figuur 1.3.11).
NAD+
fermentatie
ATP
NMN AMP+
PPi
NPP
adenyltransferase
Figuur 1.3.11 De omzetting van NAD+ in gist zoals voorgesteld door Kornberg (1950)
Deze accumulatie leidt in de eerste plaats tot een inhibitie van het NPP (Jacobson et al., 1956). Deze
inhibitie kan het gevolg zijn van de chelaterende eigenschappen van pyrofosfaat (Swartz et al., 1958).
Maar kan ook het gevolg zijn van een competitieve inhibitie waarbij het enzym een grotere preferentie
vertoont voor PPi dan voor NAD+ (O'Handley et al., 1996). Pyrofosfaat zorgt dus voor een regulatie
van de co-enzymconcentratie.Sucrose
fructoseglucose
UDP-glucose
InvertaseSuSy
PPi
UTP
glucose-6-fosfaat
fructose-1,6-bisfosfaat
fructose-6-fosfaat
fosfoglucoisomerase
PPi
Pi
ATP
ADP
fosfofructopyrofosfatasefosfofructokinase
UDP-glucose pyrofosfatase
respiratie biosynthese
Figuur 1.3.12 Alternatieve route voor de sucrose afbraak, de SuSy-reactie
23
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Een andere rol speelt het in het koolstofmetabolisme van de aardappel (Farré et al., 2000). Hierin
wordt sucrose omgezet via de Susy-reactie (een alternatieve reactie voor de sucrose afbraak met
invertase) naar fructose en UDP-glucose (figuur 1.3.12). Dit zal verder omgezet worden tot glucose-6-
fosfaat met pyrofosfaat (PPi). Een derde stap waarin PPi een rol speelt is de omzetting van glucose-6-
fosfaat naar fructose-1,6-bisfosfaat. Deze biochemische route zal dus in de richting van fructose-1,6-
bisfosfaat geduwd worden bij accumulatie van PPi.
De aardappel bevat tevens een nucleotide pyrofosfatase. Het werd voor het eerst geïsoleerd door
Kornberg en Pricer (1950). Dit enzym heeft zoals voor de meeste NAD+-pyrofosfatasen het geval is
een brede waaier van substraten. Naast de pyrofosfaatverbinding op de 5’OH plaats van nucleosiden
en de fosfodiësterverbinding in de arylesters van nucleoside-5’-fosfaat is het in staat nog heel wat
andere verbindingen te hydroliseren. Zo behoren ook de arylesters van nucleoside-3’-fosfaat en
orthofosfaat, de nucleotide pyrofosfaat verbindingen type 3’-pp-3’ en de GpppG-eindfragmenten van
viraal mRNA tot de substraten (Kole et al., 1976; Bartkiewicz et al., 1984).
Van de eigenschap dat het enzym een reversibele werking heeft en arylesters van nucleoside fosfaat
als substraat heeft wordt gebruik gemaakt om een methylester te maken van AMP (Agudo et al.,
1998). Deze esters zijn vanuit een farmaceutisch standpunt interessant. Ze blijken de eigenschap te
hebben enzymen te inhiberen die een rol spelen in de nucleoside turnover. De binding van receptoren
die reageren op nucleosiden is een tweede eigenschap die farmaceutisch potentieel heeft.
Bij de productie wordt AppA met methanol geïncubeerd bij een pH van 9 en 0˚C. Deze twee laatste
parameters zijn noodzakelijk om het enzym te sturen naar de estersynthese. Een eigenschap die
specifiek is voor het aardappel nucleotide pyrofosfatase, want dit is niet het geval voor een
fosfodiesterase uit slangegif.
Een tweede toepassing van NPP uit aardappelen is de productie van NMN en NMNH (Jeck et al.,
1974). Vooral het laatste product is interessant omdat er geen enkele andere biochemische route
bekend is die NMNH genereert (Bessman et al., 1996).
NPP werd ook aangetroffen op de zoektocht naar potentiële geneesmiddelen voor Haempophilus
influenza type b, de hoofdoorzaak van meningitis bij mensen (Kahn et al., 1986; Reidl et al., 2000) en
Haemophilus parasuis, de oorzaak van Glässer’s ziekte bij varkens (Wise et al., 1997). NAD+ werd
hier geïdentificeerd als een groeifactor voor het species Haemophilus. Omdat NAD+ sterk polair is kan
het niet door het cytoplasma-membraan diffunderen. Een nucleotide pyrofosfatrase in het periplasma
van Haemophilus breekt eerst NAD+ af tot AMP en NMN. Deze beide afbraakproducten kunnen dan
wel door membraan getransporteerd worden (Kahn et al., 1986). In de cel zorgt een NMN:ATP
adenyltransferase (EC 2.7.7.1) voor de reconstructie van NAD+ uit NMN en AMP (Wise et al., 1997).
1.3.5 Aantonen van NPP-activiteit
Eén van de eenvoudigste manieren om NPP-activiteit aan te tonen is een spectrofotometrische (Wise
et al., 1997). Hierbij wordt de absorbantie bepaald van NADH bij 340 nm – NMN, AMP en NAD
24
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
absorberen hierbij immers niet. Indien NAD+ het substraat is van het nucleotide pyrofosfatase dan
moet dit eerst omgezet worden naar NADH. Hiervoor wordt alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1)
gebruikt met ethanol als substraat. De omzetting van ethanol naar acetaldehyde gaat immers gepaard
met de reductie van NAD+ naar NADH. NADH is dan een maat voor het resterende NAD+. Een nadeel
hierbij is het feit dat het NPP niet wordt geïnactiveerd en dus worden de co-enzymen ook tijdens de
meting gehydrolyseerd. In het geval een NAD-pyrofosfatase is het dus noodzakelijk dat de omzetting
naar NADH zo snel mogelijk gebeurt – bijvoorbeeld door toevoegen van overmaat ethanol.
Een andere spectrofotometrische methode wordt beschreven door Han en Kim (2002 & 2003). Zij
beschrijven de visuele detectie van AMP-vorming uit cAMP met een fosfaat chelaterend complex.
Hiervoor synthetiseren ze eerst H-bpmp4 uit bis(2-pyridylmethyl)amine en 2,6-bis(chloromethyl)-4-
methylfenol (Torelli et al., 2000). Daarna wordt een complex geconstrueerd met zinkperchloraat en
pyrocatecholviolet. Dit complex gaat reageren met AMP met uitstoot van pyrocatecholviolet (figuur
1.3.13). De vrijstelling van het pyrocatecholviolet kan gevolgd worden met de spectrofotmeter bij een
golflengte van 444 nm. Het verdwijnen van het complex kan gevolgd worden bij een golflengte van
620 nm.
Figuur 1.3.13 De complexatiereactie van AMP met zink-H-bpmp bij pH 7 (Han et al., 2002; Han et al., 2003)
Deze methode brengt enkele nadelen met zich mee. In de eerste plaats kunnen chelaterende inhibitoren
niet worden geanalyseerd. Deze kunnen immers het zink-H-bpmp-complex verbreken indien ze een
grotere affiniteit hebben voor zink dan H-bpmp. Een tweede nadeel is dat de reactie moet doorgaan bij
neutrale pH. Hierdoor kan het pH-optimum met deze methode niet bepaald worden. Daarnaast blijken
de meeste NPP’s een alkalische pH-optimum te hebben waardoor met dit systeem het optimaal
werkende enzym niet kan bestudeerd worden.
44 H-bpmp: 2,6-bis[(bis(2-pyridylmethyl)amino)methyl]-4-methylfenol
25
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
De beperkingen van de vorige methoden treedt niet op
bij een fluorimetrische methode beschreven door
Muller et al. (1984). Hierbij worden analogen van
NAD+ gemaakt die bij afbraak fluoresceren. Op basis
van de relatieve ongevoeligheid van hun fluorescentie-
eigenschappen werden PdAD+ en hy4PdAD+
geselecteerd5 (figuur 1.3.14). De synthese en
opzuivering van deze moleculen zijn echter complex.
HPLC-analyse van de reactiemengsel is een veel
beschreven methode. Hiermee kunnen alle substraten
en producten gevolgd worden in de tijd en gescheiden
worden over een chromatografische kolom. De detectie
van de co-enzymen gebeurt met een UV-detector bij
260 nm, een golflengte waarbij zowel NAD+, NADH,
AMP als NMN absorberen.
N
N
N
NN
O
HOOH
HH
HH
O
P-O O
O
O
P O
O
OH
OH
H
H
H
H
N+
X
-O
PdAD+ (X=H)hy4PdAD+ (X=CONHNH2)
Figuur 1.3.14 NAD+-analogen metfluorescerende eigenschappen (Muller et al., 1984)
De eenvoudigste methode werd beschreven door Aso et al. (1989). Deze scheidt de co-enzymen met
een isocratisch elutieprogramma over een reversed phase chromatografische kolom. Indien meer
gelijkaardige moleculen in het reactiemengsel aanwezig zijn, is het vaak noodzakelijk een
elutiegradiënt in te voeren om een optmale scheiding te bekomen. Micheli et al. (1993) beschrijft een
methode die een gradiëntelutie toepast. Hiermee werden de pyridine co-enzymen in erythrocyten
bepaald (Aso et al., 1989; Micheli et al., 1993).
1.3.6 Inhibitie van NPP
In de literatuur worden verschillende inhibitoren beschreven, veelal chelatoren en afbraakproducten.
In een studie van een nucleotide pyrofosfatase in Haemophilus parasuis (Wise et al., 1997) wordt
beschreven dat adenine verbindingen volgens de sequentie ADP > AMP > adenine inhiberend werken.
Het tweede afbraakproduct NMN en zijn analoog AMN (nicotinezuur mononucleotide) werken niet
inhiberend bij concentraties lager dan 20 M. N1-Alkylnicotinamide chlorides met verschillende
ketenlengtes inhiberen compititief met het substraat NAD+. Ketenlengte heeft geen invloed op de
inhiberende eigenschap.
De inhibitie door een chelator wijst op de noodzaak van een metaalion voor de werking van het
nucleotide fosfatase (Haroz et al., 1972; Faltynek et al., 1981). Reeds uitgetest zijn EDTA, O-
phenanthroline en 2,3-di-mercaptopropan-1-ol. Hierbij werd in inhibitieproeven op ratlever nucleotide
pyrofosfatase/fosfodiesterase I een verhoogd effect van EDTA waargenomen als glycine aanwezig is
5 PdAD+ = pyridine-1,N6-ethenoadenine dinucleotide en hy4PdAD+ = 4-hydrazinocarbonylpyridine-1,N6-
ethenoadenine dinucleotide
26
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
(Lopez-Gomez et al., 1998). Haroz (1971) beschrijft ook het effect van reducerende stoffen zoals L-
cysteïne, dithiothreitol (DTT) en mercaptoëthanol. De inhibitie door deze stoffen wordt echter eerder
toegeschreven aan hun metaalion-bindende eigenschappen, dan aan hun reducerend vermogen.
Ascorbaat heeft geen effect.
Het gebruik van de eerder genoemde stoffen heeft verschillende beperkingen, enerzijds de prijs van de
stof en anderzijds de toxiciteit. Adenine verbindingen zijn duur en vallen dus uit de boot als toepassing
in de bereiding van brood. De stoffen DTT, mercaptoëthanol en O-phenanthroline zijn erg toxisch en
kunnen niet worden gebruikt in levensmiddelen. L-Cysteïne is daarentegen de enige reducerende stof
met potentieel inhiberend effect die toegelaten wordt in levensmiddelen. In de directive van het
Europees parlement en de Europese commisie (European Parliament and Council Directive, 1995)
wordt de ADI6 van L-cysteïne aangeduid als ‘not specified’. Hiermee wordt aangeduid dat op basis van
de beschikbare toxicologische, biochemische en klinische gegevens, de totale inname van L-cysteïne,
van nature aanwezig en/of huidig gebruikt in de voeding in hoeveelheden nodig om een technologisch
effect te bereiken, geen gevaar voor de gezondheid zal betekenen. Daarom wordt er geen numerische
waarde voor ADI vastgelegd.
2,3-Di-mercaptopropan-1-ol, beter bekent als British antilewisite, is een antigif voor het op het
arsenaat gebaseerde chemische wapen Lewisite. Het werd in de eerste wereld oorlog ontwikkeld. Nu
wordt het in de medische sector gebruikt voor de behandeling van Wilson’s disease. Dit is een
neurologische aandoening ten gevolge van leverschade, veroorzaakt door chronische intoxificatie met
zware metalen (Vilensky et al., 2002). Over de effecten op lange termijn van deze stof is nog weinig
bekend, dus als inhibitor in een levensmiddel minder geschikt.
EDTA of ethyleendiaminetertraacetaat is een algemeen aanvaard additief in de Verenigde Staten van
Amerika. Hierbij worden er strenge voorwaarden gesteld. Het FDA laat concentraties tot 240 ppm toe.
Dit kan lager of hoger zijn naargelang het levensmiddel (US code of Federal Regulation, 1995). De
Europese overheid stelt echter nog strengere voorwaarden en laat slechts in bepaalde klassen van
levensmiddelen EDTA toe (tabel 1.3.2). Hieruit blijkt dat in deegwaren het gebruik van EDTA niet
toegelaten is in de EU (European Parliament and Council Directive, 1995).
Natuurlijke chelatoren kunnen ook overwogen worden. Deze hebben als voordeel dat ze niet toxisch
zijn, maar kunnen wel complex in productie zijn. Caseïnofosfopeptides zijn hiervan en voorbeeld
(McDonagh et al., 1998; Meisel, 1998; Park et al., 1998). Ze hebben de eigenschap macro-elementen
zoals calcium, magnesium en ijzer te complexeren naast spoorelementen als zink, barium, chroom,
6 ADI: aanvaardbare dagelijkse inname, de hoeveelheid voedingsadditief uitgedrukt in mg/kg lichaamsgewicht,
die dagelijks mag opgenomen worden gedurende een volledig mensenleven zonder gevaar voor de gezondheid.
Het is gebaseerd op een evaluatie van toxicologische gegevens en opgesteld aan de hand van de No-Observed-
Adverse-Effect-Level (NOAEL, niet obeserveerbaar nadelig effect niveau). Deze werd bepaald in de meest
gevoelige studies met proefdieren en werd geëxtrapoleerd door deling met een veiligheidsfactor van 100.
27
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
cobalt, en selenium. Fitzgerald (1998) oppert hun gebruik als functioneel voedingssupplement en
anticariogene substantie (Warner et al., 2001). Een toepassing als enzyminhibitor werd nog niet
beschreven maar lijkt potentieel te hebben. Een direct nadeel van deze eiwitten is de mogelijkheid tot
afbraak door proteasen en gist. De gecomplexeerde ionen worden dan opnieuw vrijgesteld en het
inhiberend effect verdwijnt dan.
Tabel 1.3.2 De maximaal aanvaardbare concentratie aan EDTA in verschillende klassen van levensmiddelen
Klasse levensmiddel Maxinaal toegelaten hoeveel-heid (ppm)
Geëmulgeerde sauzen 75
Peulvruchten, groenten, paddestoelen en artichoken inblik of flessen.
250
Schaal- en weekdieren en vis in blik of flessen 75
Spreidbare vetten met een vetgehalte van 41% of minder
100
Gevroren en diepgevroren schaaldieren 75
Zoals eerder vermeld kunnen ook adenylaten (AMP, ADP, ATP) inhiberend werken op nucleotide
pyrofosfatase. Voor NPP van Phaseolus aureus (groene boon) werd het inhibitie-mechanisme zeer
uitgebreid bestudeerd (Balakrishnan et al., 1974; Balakrishnan et al., 1975; Venugopala Reddy et al.,
1975; Balakrishnan et al., 1977). Van dit enzym bestaan er drie verschillende vormen, het natieve
enzym is een dimeer met pH optimium 9,4 en een temperatuursoptimum van 49˚C. Zowel zink (II+)
als cobalt(II+) reactiveren het enzym na inhibitie met EDTA. De Km en de Vmax van deze vorm zijn
respectievelijk 0,2 mM en 3,2 µmol/min. Een denaturatie-renaturatie reactie met ureum veranderde
deze beide parameters tot 1,8 mM en 8 µmol/min.
Indien er AMP wordt toegevoegd aan een reactiemengsel dan treedt er inhibitie op. Opmerkelijk aan
deze inhibitie is dat ze bifasisch verloopt in functie van de concentratie. Bij lagere concentraties wordt
een Km voor het enzym waargenomen van 0,58 mm en een Vmax van 2,6 µmol/min. Hogere
concentraties verlagen de maximale reactiesnelheid nog eens zeer sterk tot 0,8 µmol/min. De
evenwichtsconstante wordt dan 0,40 mM. Dit wordt verklaard door een verandering in de quaternaire
structruur. Het enzym is namelijk overgegaan van een dimeer naar een tetrameer met lagere
reactiesnelheid. Na een denaturatie-renaturatie reactie treedt dit fenomeen niet meer op. Dit kan wijzen
op het feit dat het enzym in meer dan één actieve vorm kan bestaan. ATP en ADP treden op als niet-
competitieve inhibitoren van de dimere vorm van het enzym, de tetramere vorm werd sigmoïdaal
geïnhibeerd.
28
NUCLEOTIDE PYROFOSFATASE LITERATUURSTUDIE
Een derde vorm van het enzym wordt bekomen door behandeling met parahydroxymercuribenzoaat.
Dit dissocieert het enzym in zijn twee subunits en maakt het ongevoelig voor lage AMP concentraties.
ATP en ADP hadden hetzelfde effect als voor het dimeer.
Dit monomeer heeft nog steeds een pH optimum van 9,4 maar het temperatuursoptimum ligt iets lager,
nl. 37˚C. De Km-waarde is 0,5 mM en Vmax is 7 µmol/min. Dit betekent dat het monomeer het meest
reactieve is van de 3 enzymconformaties en het tetrameer het minst. Daartegenover is het monomeer
het minst stabiel. De denaturatie met ureum en de inactivatie met EDTA zijn in dit geval irreversibel.
Tabel 1.3.3 Overzicht van de eigenschappen van de drie enzymconformaties van het nucleotidepyrofosfatase in Phaseolus aureus (Balakrishnan, et al., 1977)
EnzymconformatieEigenschap
monomeer dimeer tetrameer
Moleculair gewicht 32700 65000 136000
pH optimum 9,4 9,4 9,4
Temperatuursoptimum 37˚C 49˚C 49˚C
Km voor FAD 0,50 mM 0,25 mM 0,58 mM
Vmax 7,0 3,3 2,5
Tijdsverloop lineair bifasisch lineair
Inhibitie door AMP
10µM
1 mM
0
100%
25%
100%
0
100%
EDTA inhibitie + + +
Zn2+ als cofactor - + +
Ureum denaturatie + + +
Activiteit na ureumverwijdering
0 100% 0
29
DEEG LITERATUURSTUDIE
1.4 Deeg
1.4.1 Inleiding
Voor vele culturen door de eeuwen heen is brood één van de belangrijkste levensmiddelen. De
productie ervan is schijnbaar eenvoudig. Het is in principe het bakken van een mengsel van bloem,
water en gist. Deze drie componenten vormen de hoofdbestandelen van deeg. Het water is
noodzakelijk voor het oplossen van de suikers en enzymen uit de bloem en hydratreert de
bloemproteïnen. De vrijgestelde suikers worden door gist gefermenteerd tot ethanol en CO2. Deze
gasvorming is essentieel voor het rijzen van de deeg.
Bloem levert – naast de suikers voor gist – de bouwstenen voor de deeg. Dit zijn proteïnen, gluten
genaamd, die rijk zijn aan thiolgroepen.
1.4.2 Bloem
1.4.2.1 Triticum aestivum
De bloem die aangewend wordt voor de broodproductie is over het algemeen afkomstig van tarwe,
Triticum aestivum. Dit is een graansoort behorende tot de familie van de Poaceae en het genus
Triticum (van der Meijden, 1996).
Figuur 1.4.1 De structuur van een graankorrel of caryops van Triticum aestivum (Encyclopedia Britannica CD '99. Multimedia edition., 1999)
De graankorrel of caryops is opgebouwd uit een endosperm, een embryo en een zaadhuid (figuur
1.4.1). Hiervan is het endosperm de belangrijkste component die tot bloem wordt vermalen. Dit is
voornamelijk samengesteld uit zetmeel en proteïnen (Raven et al., 1999; Dewettinck, 2002).
30
DEEG LITERATUURSTUDIE
1.4.2.2 Bloemproteïnen
Algemene indeling
De graankorrel bevat zo een 8 tot 15% eiwit die in 4 verschillende groepen kan ingedeeld worden,
namelijk albuminen, globulinen, gliadinen en gluteninen. Deze worden volgens hun
wateroplosbaarheid ingedeeld in de niet-gluten en de gluten fractie (Osborne, 1924).
De albuminen en globulinen zijn respectievelijk in water en zoutwater oplosbare proteïnen. Ze zijn
over he algemeen biologisch actief en zijn verantwoordelijk voor onder andere de afbraak van zetmeel
(e.g. amylase). Samen vormen ze de zogenaamde niet-gluten fractie.
De glutenfractie, die de grootste fractie van het graaneiwit vormt (63 à 90%) omvat de gliadinen en de
gluteninen. Het zijn de bouwstenen van de deegstructuur. Ze vormen samen met andere
deegcomponenten (bijvoorbeeld lipiden, suikers of of oplosbare eiwitten) een viscoelastisch netwerk.
Dit netwerk is perfect in staat gas vast te houden, zodat een mooie open schuimstructuur tijdens het
bakken kan ontstaan (Pomeranz, 1968).
Gliadinen
De gliadinen zijn monomerische proteïnen met inwendige disulfide bruggen. Het is een heterogene
groep met een gelijkaardig laag-moleculair gewicht. Dit bedraagt ongeveer 35000 kDa. Gebaseerd op
hun aminozuursamenstelling en electroforetische mobiliteit bij lage pH worden ze in drie groepen
ingedeeld, de - ( - en -), - en -gliadinen. De twee eerste ( - en -gliadinen) vormen voornamelijk
disulfidebruggen binnen de polypeptide keten. Ze worden ingedeeld in de groep van de zwavel-rijke
prolaminen en hebben een karakteristieke sequentie. Aan het N-terminale einde van de polypeptide
keten herhalen de peptide-sequenties zich. Deze sequenties zijn rijk aan proline en glutamine residu’s.
De herhaalde regio’s komen echter niet voor aan het C-terminale einde. Daar bevatten alle -gliadinen
8 en -gliadinen 6 cysteïne residu’s, belangrijk voor de vorming van de disulfide bruggen en dus de
structuurstabiliteit (Shewry et al., 1997). Ze nemen echter beperkt deel aan de intermoleculaire
disulfide-brug vorming in de deeg. Hun structuurstabiliserende functie speelt een meer indirecte rol.
De specifieke structuur van de gliadinen induceert sterke niet-covalente proteïne-proteïne interacties
(waterstof bruggen en hydrofobe interacties) die een viskeus karakter aan de deeg geven.
De tweede groep binnen de gliadinen is de groep van de zwavelarme prolaminen. De -gliadinen
behoren tot deze groep.
Gluteninen
De gluteninen zijn proteïnen die aan elkaar covalent gebonden zijn met disulfide bruggen tot
polymeren waarvan het moleculair gewicht 1MDa kan overstijgen. Worden deze bruggen
gereduceerd, dan ontstaat een heterogeen mengsel. Dit kan opgedeeld worden in twee fracties, een
fractie met een hoog moleculair gewicht (HMG) en een fractie met een laag moleculair gewicht
(LMG). Over het algemeen bestaat een glutenine-molecule uit 3, 4 of 5 HMG-subunits en 15 LMG-
31
DEEG LITERATUURSTUDIE
subunits. Het gewicht van een HMG-subunit is ongeveer 70kDa (Type A-glutenine). De LMG-
subunits beslaan de gewichtsgebieden van 30 tot 40 kDa (Type B) en van 40 tot 50 kDa (Type C).
Structureel vormen de HMG-subunits een elastische ruggegraat in de gluten die met elkaar en met de
LMG-subunits verbonden zijn met zwavelbruggen. De structuur van deze subunit is opgebouwd uit
drie regio’s, namelijk twee globulaire eindstandige domeinen (N-terminaal en C-terminaal) die
verbonden zijn met een -helixstructuur. De globulaire delen bevatten bijna alle cysteïne residu’s wat
betekent dat in die domeinen de meeste disulfidebruggen worden gevormd (Emanuelson et al., 2003).
Gluten-proteinen
Gluteninen(polymeren)
Gliadinen(monomeren)
HMG-subunits LMG-subunits -gliadinen -gliadinen -gliadinen
IntermoleculaireS-bruggen
IntramoleculaireS-bruggen
GeenS-bruggen
HMG-prolaminen S-rijkeprolaminen
S-armeprolaminen
Figuur 1.4.2 Nomenclatuur en klassificatie van de glutenproteïnen
1.4.3 De deegvorming en bakken
Deeg wordt gevormd door gist, bloem en water te mengen. Hierbij wordt over het algemeen een
water-bloem verhouding van 55 à 61 kg per kg bloem aangewend, afhankelijk van de hoeveelheid
zetmeel en eiwit. Dit water fungeert als oplosmiddel van de suikers en de globulaire eiwitten en
hydrateert de gluten. In deze gluten spelen de cysteïne residu’s een belangrijke rol. Zij staan in voor de
cross-linking van onder andere de glutenine-moleculen door S-brug vorming (Trufanov et al., 2000).
Na het kneden zal de deeg rijzen. In dit stadium zal de deegstructuur zich ontwikkelen. Dit houdt een
ontwinden van de proteïnemoleculen in en een cross-linking door middel van S-bruggen. Daarnaast
ontstaan heel wat niet-covalente interacties tussen de verschillende proteïnen, zoals waterstofbruggen
en hydrofobe interacties (Bloksma, 1990). Deze interacties geven samen aanleiding tot een visco-
elastisch netwerk. De sterkte van dit netwerk is sterk afhankelijk van de glutenine en gliadine gehaltes
(Field et al., 1983; MacRitchie, 1987; Gupta et al., 1993).
Tijdens dit hele proces zullen verschillende bloem- en gistenzymen het zetmeel afbreken tot maltose
en oligosachariden. Deze suikers worden door de gist gefermeteerd tot CO2 en ethanol, waarvan de
uiteindelijke concentratie ongeveer 0,8% (m/m) bedraagt. Het gevormde CO2 zal, samen met de door
32
DEEG LITERATUURSTUDIE
kneden geïncorporeerde lucht, gascellen vormen. CO2 vormt hierbij geen nieuwe cellen maar zorgt
voor een expantie van de bestaande (Baker et al., 1941; Bloksma, 1990; He et al., 1991).
De hele structuur van de deeg wordt tijdens het bakken vastgelegd. De gascellen expanderen tot op
zekere hoogte (geïnhibeerd door korstvorming) en geven het geheel de typische sponsstructuur van
brood.
1.4.4 Oxiderende en reducerende agentia als broodverbeteraars
1.4.4.1 Inleiding
Oxiderende en reducerende agentia ageren direct op respectievelijk de thiolgroepen en de
disulfidebruggen in de gluten. Reducerende agentia, zoals L-cysteïne of gereduceerd glutathion breken
de disulfidebruggen. Ze worden toegepast bij bloemsoorten die aanleiding geven tot te sterke degen
door een hoog glutenine gehalte. Het breken van de bruggen zorgt hierbij voor een verzwakking van
de structuur en dus voor een makkelijkere behandelbare deeg (Shewry et al., 1997; Udeh et al., 1999).
Oxiderende agentia werken net omgekeerd. Ze construeren nieuwe zwavelbruggen zodat de
deegstructuur sterker vernet wordt. Dergelijke degen kunnen beter gassen vasthouden en zullen
aanleiding geven tot een regelmatiger kruimstructuur in het brood.
Een voorbeeld van een chemisch oxiderend agens is kaliumbromaat. Het is als reagens traag werkend
en is bijgevolg voornamelijk werkzaam tijdens de laatste stadia van het rijzen en de eerste stadia van
het bakken. Hierbij zullen voornamelijk de gereduceerde thiolen van peptiden met laag moleculair
gewicht worden geoxideerd.
Aan het gebruik van oxidantia zoals bromaten, maar ook jodaten en persulfaten, hangt er echter een
groot nadeel vast. Ze zijn erg toxisch en bovendien carcinogeen. Een mogelijk alternatief is
azodicarbonamide. Deze stof is echter zeer reactief, wat de toepasbaarheid enigzins limiteert.
Ascorbaat daarentegen kampt niet met dit probleem (Bloksma, 1972; Ranum, 1992).
1.4.4.2 Ascorbaat
L-threo-ascorbaat of vitamine C (E300) is een van de meest gebruikte oxiderende agentia. Het
deegvolume wordt erdoor vergroot en de kruimstructuur verbeterd (Gujral et al., 2003).
Gedurende het kneden wordt het ascorbaat snel geoxideerd tot dehydroascorbaat, het eigenlijke
oxiderende agens. Hierbij speelt de zuurstof, die tijdens het kneden wordt geïncorporeerd, een
belangrijke rol. Samen met een enzym, ascorbaat oxidase (E.C. 1.10.3.3), zorgt zuurstof voor een
snelle omzetting oxidatiereactie (Meredith, 1965; Grant et al., 1980; Cherdkiatgumchai et al., 1986;
Every, 1999; Grosch et al., 1999). De hoeveelheid van dit enzym met optimale activiteit bij pH 6,5 en
30ºC blijkt echter geen rol te spelen. Enkel de zuurstofconcentratie is van belang voor een optimale
omzetting van ascorbaat (Elkassabany et al., 1980; Every et al., 1996).
33
DEEG LITERATUURSTUDIE
Naast de enzymatische omzetting zouden ook metaalionen bijdragen tot de oxidatie van ascorbaat. Ze
kunnen een rol spelen als deegverbeteraars door de productie van zuurstofradicalen. Deze radicalen
oxideren de thiolen in de deeg tot intermoleculaire disulfide bindingen (Nakamura et al., 1997a;
Nakamura et al., 1997b).
Van de vier bestaande chirale vormen van ascorbaat (L-threo-, D-threo-, L-erythro- en D-erythro-
ascorbaat) en hun overeenkomstige geoxideerde vormen is er slechts 1 vorm een efficiënte
deegverbeteraar, namelijk de L-threo-vorm (Walther et al., 1987). De reactie met de gereduceerde
thiol-groepen is dus stereospecifiek, wat de tussenkomst van een enzym suggereert. Dit enzym is
glutathion dehydrogenase (E.C. 1.8.5.1) (Kahnt et al., 1975).
Het oxideert gereduceerd glutathion (GSH) samen met L-threo-dehydroascorbaat tot zijn geoxideerde
disulfide vorm (GSSG). Op L-cysteïne blijkt het enzym geen activiteit te vertonen, hoewel de activiteit
door dit thiol wordt gestimuleerd (Boeck et al., 1976; Kaid et al., 1997).
Grosch et al. (1999) stelden op basis van dit mechanisme een reactiesequentie op. De eerste twee
reacties worden gekatalyseerd door enerzijds ascorbaat dehydrogenase en anderzijds glutathion
dehydrogenase (reactie (4.1)).
Ascorbaat oxidaseof mixen
L-threo-ascorbaat
L-threo-dehydroascorbaat
GSSG
2 GSH
Glutathion dehydrogenase
O2
H2O
(4.1)
Het gevormde geoxideerde glutathion reageert vervolgens met een thiolgroep in de gluten, waardoor
een S-brug tussen het glutathion en de gluten ontstaat (reactie (4.2)), deze potentiële cross-link plaats
wordt dus door glutathion geblokkeerd.
GSHSGSglutenSHglutenGSSG (4.2)
Dit leidt tot de vorming van gereduceerd glutathion, dat op zijn beurt reageert met reeds gecross-linkte
glutenproteïnen (reactie(4.3)).
SHGlutenSGSGlutenGSHglutenSSgluten (4.3)
Dit is dus een depolymerisatie van het glutennetwerk, een verzwakking van de deeg. Hiervoor blijken
– aangetoond via 35S-gelabeled glutathion – de gluteninen voornamelijk gevoelig. Het effect van
ascorbaat wordt dan ook aan de bescherming van deze gluteninen toegeschreven. Deze niet
enzymatische reactie verloopt immers veel trager dan de enzymatische oxidatiereactie van glutathion
(reactie (4.1)) (Sarwin et al., 1992; Dong et al., 1995).
Indien geen ascorbaat aan het deegsysteem wordt toegevoegd dan zal het gereduceerde glutathion
cystine (CSSC) omzetten tot cysteïne (CSH) (reactie (4.4)).
GSSCCSHGSHCSSC (4.4)
34
DEEG LITERATUURSTUDIE
Het cysteïne is in staat S-bruggen in de gluten te breken, heeft dus een negatief effect op de
deegreologie (reactie (4.5)).
SHglutenSCSglutenCSHglutenSSgluten (4.5)
De impact van deze laatste twee reacties wordt sterk verminderd door het toevoegen van ascorbaat.
Cystine wordt niet meer gereduceerd maar kan wel een rol spelen in het blokkeren van de thiolen in de
gluten (reactie (4.6)).
CSHSCSglutenSHglutenCSSC (4.6)
Naast het verwijderen van gereduceerd glutathion, blijkt hydroascorbaat ook een meer direct effect te
hebben op de intermoleculaire S-brugvorming. Every et al (1999) toonde aan dat een derde enzym –
een dehydroascorbaat reductase – een rol speelt in dit reactiemechanisme.
1.4.4.3 Thioredoxine-systeem
Thioredoxines zijn 12 kDa proteïnen die in zowat alle organismen voorkomen. Ze bezitten een
katalytisch actieve disulfide group die zich in een -helix bevinden. Deze functionele groep zou in
deegsystemen een kwaliteitsverhogend effect hebben (Buchanan et al., 1998; Taiz et al., 1998).
In planten komen er drie verschillende types thioredoxinen (h, m en f) voor waarvan twee in de
chloroplasten voorkomen (m en f) en één type in het cytosol, endoplasmatisch reticulum en de
mitochondriën voorkomt (h). Hun functie in de chloroplasten bestaat uit het reduceren van specifieke
enzymen van de Calvin-cyclus. Dit gebeurt door een licht-activatie van fotosysteem I waardoor
ferredoxine – een klein wateroplosbaar ijzer-zwavel-proteïne – wordt gereduceerd. Dit ferredoxine
reduceert op zijn beurt, met het enzym ferredoxine-thioredoxine reductase, thioredoxine. Deze laatste
geeft zijn elektronen dan door aan een enzym (Kobrehel et al., 1992; Bess et al., 1997).
Het h-type thioredoxine komt tussen in het NADP/thioredoxine-systeem. Hierin reduceert NADPH-
thioredoxine reductase (NTR) – een flavoenzym – het thioredoxine dat op zijn beurt kleine proteïnen
kan reduceren (Serrato et al., 2002). Zo wordt de activiteit van -amylase en trypsine gereguleerd door
de al dan niet gereduceerde status van de thiolgroepen in hun inhibitor proteïnen (Kobrehel et al.,
1991). Daarnaast blijkt het enzym pullulanase gestimuleerd te worden bij een overexpressie van het
thioredoxine h-gen (Cho et al., 1999).
In kiemende zaden wordt het thioredoxine de mobilisatie van koolstof en stikstofbronnen
toegeschreven. Hierbij worden de thiolen van de voorraadproteïnen gereduceerd wat hun structuur
meer open maakt en bijgevolg onderheviger voor proteolytische afbraak. Voor tarwe zijn deze
proteïnen de gliadinen en de gluteninen (Kobrehel et al., 1992).
Het thioredoxine-systeem in deeg zal dus in principe S-bruggen breken en de deegstructuur
verzwakken. Het tegendeel blijkt echter waar. Waarschijnlijk is het systeem veel specifieker ten
aanzien van bepaalde zwavelbruggen. Het zal vooral de intramoleculaire zwavelbruggen reduceren.
Bijgevolg zijn meer thiolgroepen beschikbaar voor intermoleculaire bruggen (Wong et al., 1993).
35
DEEG LITERATUURSTUDIE
Een van de belangrijkste parameters voor het thioredoxine systeem in deeg is de concentratie aan
NADPH. In een patent werd dit co-enzym vervangen door glucose-6-fosfaat, NADP+ en glucose-6-
fosfaat dehydrogenase, die samen NADPH genereren. Hierin werd ook het genetisch modificeren van
de gistcellen voorgesteld om een overexpressie van thioredoxine en NADP-thioredoxine reductase te
bewerkstelligen (Buchanan et al., 1998).
Glutaredoxine is in vele gevallen een goed alternatief voor thioredoxine (Kobrehel et al., 1991).
Hierbij zal in de eerste plaats het enzym Glutathion:NADP+ oxidoreductase (E.C. 1.8.1.7) geoxideerd
glutathion reduceren met NADPH. Dit glutathion kan dan op zijn beurt glutaredoxine reduceren
(reactie (4.7)) (Harding, 1973; de Lamotte et al., 2000).NADPH GSSG
2 GSHNADP+
glutathion:NADP+
oxidoreductase
glutaredoxineox
glutaredoxinered
(4.7)
1.4.4.4 Oxidatieve enzymen
Reeds heel wat oxidatieve enzymen werden beschreven in tarwe waarvan enkele reeds een aangetoond
effect hebben op het deegvormingsproces. Hun activiteit is afhankelijk van het zuurstofgas die in deeg
wordt gebracht tijdens het kneden. In het geval van de oxidasen is deze zuurstof een
elektonenacceptor, in het geval van een oxygenase wordt zuurstof in de substraatmolecule ingebouwd.
Lipoxidase (E.C. 1.99.2.1.11.12) is zo een enzym dat direct inwerkt op de polymerisatie van
bloemproteïnen. Hierbij zou het ook als een soort bleekmiddel van de deeg optreden door oxidatie van
de carotene pigmenten. Een activiteit die ook aan lipoxygenase (E.C. 1.13.11.12) wordt toe-
geschreven. Dit enzym zou een synergistisch effect hebben met lipolytische enzymen op het
deegvolume en de broodkleur (Honold et al., 1968; Borch et al., 2004).
Peroxidase (E.C. 1.11.1.7) is in de niet-groene plantendelen het sterkst vertegenwoordigde oxido-
reductie enzym. In een patent – over het gebruik van soya-peroxidase in brood – wordt het beschreven
als een uitstekent deegverbeteraar (Garti et al., 1996).Het zou thiolgroepen in de gluten cross-linken,
pentosanen via ferulaat-groepen verbinden zoals in hemicellulose, tyrosine residu’s van proteïnen
cross-linken en carotenoiden en chlorofyllen bleken. Allemaal activiteiten die bijdragen tot een
verbeterde deegstructuur. Aanverwant aan het peroxidase is catalase (E.C. 1.11.1.6) dat
waterstofperoxide omzet tot water en zuurstof. In deeg blijkt dit enzym actief te zijn ter hoogte van
aminozuurresidu’s zoals van tyrosine. Het treedt op als waterstofdonor, waardoor het een invloed heeft
op de eiwit-polymerisatie.
36
DEEG LITERATUURSTUDIE
Andere oxidasen die in deeg beschreven werden, maar nog geen specifieke functie in deeg werd
toegeschreven zijn polyfenol oxidase (E.C. 1.10.3.1) en cytochroom oxidase (E.C. 1.9.3.1) (Honold et
al., 1968).
Ook niet-tarwe oxidasen worden in de bakkerij-sector toegepast. Zo wordt glucose oxidase van
Asperigillus niger of Cladosporium oxysporum aangewend om de deegstructuur te versterken.
Waarschijnlijk speelt de vrijstelling van waterstofperoxide hierbij een belangrijke rol (Oxenboll et al.,
1995; Vemulapalli et al., 1998a; Vemulapalli et al., 1998b).
Laccase, dat benzenodiolen naar benzenoquinonen converteert, wordt eveneens een positief effect op
deeg toegeschreven. In bloem staat het in voor de oxidatieve gelvorming van feruloyl-arabinoxylanen
door dimerisatie van hyn ferulaat-esters. Hierdoor zou het glutennetwerk verstevigd worden (Si, 1994;
Figueroa-Espinoza et al., 1998; Primo-Martin et al., 2003) .
1.4.4.5 Co-enzymen en dehydrogenasen
Honold et al (1966) toonde verschillende dehydrogenasen aan in bloem. Deze enzymen behoren tot de
klasse van de oxidoreductasen (E.C. klasse 1) en worden afhankelijk van het gebruik van een co-factor
ingedeeld in twee subfamilies, namelijk de NAD(P)+-afhankelijke en -onafhankelijke. De NAD(P)+-
afhankelijke subfamilie reduceert NAD+ of NADP+ tot respectievelijk NADH of NADPH. Deze beide
co-enzymen worden ook door vele gistenzymen gebruikt, wat betekent dat het fermentatieproces
beïnvloed wordt door de activiteit van de dehydrogenasen in bloem. Daarnaast kunnen ze als
oxiderende of reducerende agentia de polymerisatie van de bloemproteïnen beïnvloeden. Hoge
concentraties aan NADH zullen een negatief effect hebben op de deegreologie omdat het in staat is het
glutennetwerk te reduceren.
Voorbeelden van dergelijke enzymen in bloem zijn glucose-6-fosfaat, 6-fosfogluconaat, isocitraat en
alcohol dehydrogenase. Ze vertonen allemaal een gelijkaardige activiteitsgraad. Hiernaast bestaan 3
uitzonderingen, malaat dehydrogenase is 1000 maal zo actief, glutamaat dehydrogenase is 10 maal
minder actief en lactaat dehydrogenase blijkt nauwelijks activiteit te vertonen (Honold et al., 1967).
Het gebruik van dehydrogenasen in de bakkrij wordt beschreven door een patent van Novo Nordisk
(Denemarken) (Xu, F et al., 1999). Het effect van NAD(P)+-onafhankelijke dehydrogenasen kan
worden toegeschreven aan de oxidatie van bijvoorbeeld reducerende suikers met gelijktijdige reductie
van een geschikt oxiderend substraat. Hierbij zal het reducerend agens elektronen transferen naar
bijvoorbeeld een flavine of een flavine/haem centrum in het enzym. Dit centrum transfereert dan de
elektronen naar het oxiderend substraat, dat op zijn beurt secundaire reacties veroorzaken. Deze
reacties beïnvloeden dan de deeg- en broodkarakteristieken. Een voorbeeld van een substraat dat
gereduceerd wordt door een dehydrogenase is een quinone. Het vormt, na reductie, een semiquinon of
fenoxy radicaal dat een radicalaire ketenreactie in de gluten en lipiden van de deeg kan initiëren.
37
DEEG LITERATUURSTUDIE
Een tweede voorbeeld is de oxidatie van een suiker tot zijn corresponderende lacton of carboxylaat.
De oxidatie verandert de interacties tussen het zetmeel, de gluten, de lipiden en de pentosanen door
een verandering in ladingen of hydrofobiciteit. De reducerende agentia zijn hierbij mono- en
oligosachariden (bijvoorbeeld glucose, maltose en maltotriose), hun derivaten (gluconolacton,
methylglucopyranoside) en alfa-hydroxy carboxylaten zoals lactaat. Onder de oxiderende agentia
worden zowel redox-actieve organische (benzoquinone, dichlorofenol-indofenol en nitroblauw
tetrazolium) als biologische (cytochroom c) moleculen teruggevonden.
De NAD(P)+-afhankelijke enzymen werken op gelijkaardige wijze in op de deegkarakteristieken. Het
enige verschil met de voorgaande reacties is het gebruik van co-enzymen. NAD+ en NADP+ worden
door het enzym gereduceerd tot respectievelijk NADH en NADPH met een reducerend substraat. De
gereduceerde co-enzymen kunnen op hun beurt met zuurstof reageren, met vorming van superoxide
radicalen. Ook hier wordt dus een radicalaire ketenreactie geïnitieerd.
Het patent van George Weston Foods Limited (Australië) beschrijft het gebruik van biologische
oxido-reducerende stoffen als broodverbeteraars (Tomlinson et al., 1988). Tot deze groep behoren
NAD(P)+, FAD, FMN, de ubiquinonen, de cytochromen en nog vele anderen.
Vier verschillende mechanismen voor NAD+ en NADP+ worden beschreven in dit patent. Een eerste
mechanisme is de oxidatie van alcoholen, aldehyden, - en -hydroxy carboxylaten en -aminozuren
door een NAD+-afhankelijk dehydrogenase. Hierbij treden de co-enzymen op als elektronen donors of
acceptors, naargelang hun oxidatieve status.
In het tweede mechanisme spelen de flavine co-enzymen een belangrijke rol. FAD of FMN ontvangen
van NADH elektronen die ze kunnen doorgeven aan een substraat. Een voorbeeld hiervan is de
reductie van glutathion door glutathion reductase dat FAD als prostetische groep bezit. Dergelijke
reductie in deeg heeft, zoals eerder aangegeven, een negatieve invloed op de deegreologie. Het effect
van NAD+ en NADH wordt echter niet toegeschreven aan de oxidatie en de reductie van glutathion.
NAD+ wordt eerder beschouwd als een sterk oxiderend agens met een direct effect op de gluten.
De co-enzymen treden ook op als elektronenbron voor de hydroxylatie en desaturatie van aromatische
en alifatische componenten in bijvoorbeeld de -oxidatie van lipiden. Een functie in de DNA-repair,
gekatalyseerd door DNA-ligase, is het vierde en laatste beschreven mechanisme.
38
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
2 Materiaal en methoden
2.1 Enzymproductie
2.1.1 Gluconobacter oxydans (LMG 1489, IFO 3257)
2.1.1.1 Bewaren van de stam
De stam werd maandelijks overgeënt en geïncubeerd bij 30ºC op een petriplaat met
mediumsamenstelling weergegeven in tabel 2.1.1 (Mortier, 2002). Zodra voldoende er voldoende
kolonievorming werd waargenomen, werd de cultuur bewaard bij 4ºC.
Voor de sterilizatie werd de stikstofbron en de koolstofbron gescheiden gehouden om Maillard reactie
te voorkomen. Na autoclaveren gedurende 15 minuten bij 121ºC en 1 atmosfeer overdruk werden
beide samengevoegd en werden platen gegoten gegoten.
Tabel 2.1.1 Samenstelling van het medium voor G. oxydans (Mortier, 2002)
Component Concentratie (g/l)
Gistextract 5
Pepton 3
D-mannitol 25
Agar 15
2.1.1.2 Opkweken van de stam
Het opkweken van deze stam gebeurde in twee stappen, een inoculum stap en een fermentatie stap.
Hierbij was de mediumsamenstelling voor beide stappen dezelfde (tabel 2.1.2) (Mortier, 2002). De
procedure voor de medium-sterilisatie is gelijkaardig aan het voorgaande.
Tabel 2.1.2 Samenstelling van het groeimedium van G. oxydans geoptimaliseerd door Mortier (2002)
Component Concentratie (g/l)
Glycerol 20
Gistextract 1,8
Pepton 7,2
In de eerste stap werden de micro-organismen bij 30ºC geïncubeerd in 100 ml erlemeyers. Elke
erlemeyer bevatte 25 ml medium en werd geschud aan 200 toeren per minuut. Na 15 uur groei werd 8
ml van dit inoculum overgebracht in 2 liter erlemeyers met elk 400 ml medium. Dit werd onder
dezelfde condities voor 28 uur geïncubeerd. Hierna werden de cellen 15 minuten bij 10000 toeren per
minuut afgecentrifugeerd (Sorvall RC 5B centrifuge, GSA rotor). Deze cellen werden twee maal
gewassen met een 0,01 M kaliumfosfaatbuffer (pH 6) en bewaard in de diepvries bij -20ºC.
39
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
2.1.1.3 Vrijstellen van het enzym
Het vrijstellen van mannitol en sorbitol dehydrogenase van Gluconobacter oxydans gebeurt het meest
efficiënt door middel van sonicatie (De Wolf, 2002; Mortier, 2002). In deze procedure werd 1 g cellen
(nat gewicht) opgelost in 10 ml 0,01 M kaliumfosfaatbuffer (in een 10 ml falconbuis) en 4 keer 30
seconden gesoniceerd (Branson sonifier 250) telkens met 30 seconden interval. Dit gebeurde bij de
sonicatie-intesiteit 3 en op ijs, wat de warmte-ontwikkeling van het proces compenseert.
De opengebroken cellen werden afgecentrifugeerd bij 7000 toeren per minuut voor 15 minuten. Het
supernatans, ruw enzym extract, bevat het enzym en werd bewaard in de diepvries bij -20ºC.
2.1.1.4 Enzymactiviteit en inhibitie
Drie verschillende activiteiten werden bepaald op het ruw enzymextract, nl. de sorbitol en mannitol
oxidatie en de fructose reductie. De sorbitol en mannitol reductie werd gemeten in een 0,05 M glycine-
NaOH buffer, pH 9,5. De substraatconcentratie was telkens 1,5 M en de co-enzym concentratie, NAD+
in het geval van een oxidatie, was 0,006 M.
Bij de fructose reductietest werd een 0,1M kaliumfosfaatbuffer gebruikt bij pH 6. De suiker- en co-
enzymconcentraties waren dezelfde als bij de oxidatiereacties, met als enige verschil dat nu NADH als
reducerend agens werd gebruikt. Indien een inhibitor werd getest werd deze aan de buffer toegevoegd
in de vereiste concentraties. Voor de Gluconobacter enzymen werd enkel EDTA getest.
Tabel 2.1.3 Samenstelling van de reactiemengsels voor het meten van de activiteit van de dehydrogenases in G. Oxydans
Component Volume (µl)
Buffer 260
Substraat 20
NAD+/NADH 10
Enzym 10
Het reactiemengsel wordt weergeven in tabel 2.1.3. Hiervan werd de activiteit opgevolgd bij 340 nm
en 25ºC over een tijdspanne van 2 à 3 minuten (in het dubbel). Hiervan werd de absorbantie uitgezet
tegenover de tijd en werd via lineaire regressie de helling bepaald. Deze helling is gelijk aan de
activiteit van het enzym uitgedrukt in absobantieverandering bij 340 nm per minuut. Dit kan
omgerekend worden naar een aantal units enzym per liter reactiemengsel door middel van de formule
van Beer-Lambert (vergelijking 2.1). Hierbij is de molaire extinctie coëfficient, C de concentratie
uitgedrukt in mol per liter en l de weglengte door de oplossing uitgedrukt in cm.
lCeAbsorbanti (2.1)
Voor NADH is de extinctiecoëfficient gelijk aan 6220 M-1cm-1 bij 340 nm en de weglengte door de
vloeistof is 1 cm. Daarnaast wordt de enzymactiviteit gebruikelijk uitgedrukt in units. Dit is de
40
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
hoeveelheid enzym die 1 µmol substraat per minuut omzet. De uitwerking wordt gegeven in
vergelijking 2.2.
U/l106,220
e/minAbsorbantiC/min
minlµmol10
6,220e/minAbsorbantiC/min
minM6220
e/minAbsorbantiC/min
le/minAbsorbantiC/min
3
3 (2.2)
Deze vergelijking geld echter alleen voor het aantal units enzym in het reactiemengsel. Tabel 2.1.4
geeft de verschillende conversiefactoren voor enzymoplossing, massa cellen, fermentatie vloeistof en
eiwitconcentratie in het enzymextract.
Tabel 2.1.4 Overzicht van de verschillende conversiefactoren voor de uitdrukking van de enzymactiviteit
Uitdrukking Conversie
U/l enzymoplossing vergelijking10300
)2.2(
U/g cellen U/l enzymoplossingcelleng
l-210
U/l fermentatievloeistof U/g cellenevloeistoffermentatil
celleng
U/g eiwit in enzymextract U/l enzymoplossingeiwitg
enzymopll
2.1.2 Leuconostoc pseudomesenteroides (ATCC 12291)
2.1.2.1 Bewaren van de stam
Het micro-organisme werd maandelijks overgeënt door middel van streepenting op een sucrose
medium met een samenstelling weergegeven in tabel 2.1.5. Deze plaat werd geïncubeerd bij 30ºC tot
er voldoende kolonies zichtbaar. Uiteindelijk werd ze bewaard bij 4ºC.
41
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
Tabel 2.1.5 Samenstelling van het sucrose medium
Component Concentratie (g/l)
Trypton 10
Gistextract 10
K2HPO4 10
Sucrose 20
Agar 20
Het medium werd op pH 7,5 ingesteld met natriumhydroxide of waterstofchloride en werd 15 minuten
bij 121ºC en 1 atmosfeer overdruk gesteriliseerd. Afzonderlijk werd een vitamine-mineraal oplossing
bereid (tabel 2.1.6). Dez oplossing kan ten gevolge van de thermolabiele eigenschappen van de
vitaminen niet worden gesteriliseerd door middel van hitte. Hiervoor werd een filtersterilisatie
toegepast met een filter met 0,2 µm diameter poriën-grootte. Dit filtraat werd onder steriele
omstandigheden toegevoegd aan het medium in een concentratie van 10 ml per liter medium.
Tabel 2.1.6 Samenstelling van de vitamine-mineraal-oplossing van het sucrose medium
Component Concentratie (g/l)
MgSO4 40
FeSO4.7H2O 1
MnSO4.4H2O 20
Thiamine.HCl 1
Ascorbaat 5
Citraat 3
2.1.2.2 Opkweken van de stam
Het opkweken van Leuconostoc pseudomesenteroides gebeurde in twee stappen, een inoculumstap en
een fermentatiestap. Beide stappen vereisen een eigen medium samenstelling (tabel 2.1.7). De
bereidingsprocedure loopt gelijk met de bereiding van het sucrose medium. Aan beide media werd 10
ml per liter vitamine-mineraaloplossing toegevoegd door middel van filtersterilisatie (0,2 µm Ø) na de
hitte-sterilisatie.
Het 50 ml inoculummedium werd, na inoculatie, 15 uur bij 100 toeren per minuut en 30ºC
geïncubeerd in 100 ml erlemeyers. Hiervan werd 25 ml overgebracht in een 2 liter erlenmeyer met 750
ml fermentatiemedium. Dit werd eveneens bij 100 toeren per minuut en 30ºC geïncubeerd, voor 6,5
uur. De bekomen cellen werden hierna afgecentrifugeerd voor 15 minuten aan 10000 toeren per
minuut (Sorvall RC 5B centrifuge, GSA rotor). De cellen werden hierbij twee maal gewassen met een
0,05 M acetaat buffer op pH 6. Het pellet werd ingevroren bij -20ºC.
42
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
Tabel 2.1.7 Samenstelling van het inoculum en het fermetatiemedium
Component Concentratie in inoculum-
medium (g/l)
Concentratie in fermentatie-
medium (g/l)
Trypton 10 10
Gistextract 10 10
K2HPO4 20 10
Glucose 40 7,5
Fructose 80 15
2.1.2.3 Correlatie tussen de optische densiteit (OD) en de cel-droge-massa (CDM)
Leuconostoc pseudomesenteroides werd opgekweekt op het hierboven beschreven medium voor 6,5
uur. Na deze groeitijd werd 200 ml van de cultuur afgecentrifugeerd volgens de gebruikelijke
procedure en 2 maal gewassen met gedestilleerd water. Het bekomen pellet werd opnieuw opgelost in
50 ml gedestilleerd water. Hiervan werd 10 ml gefiltreerd (0,22 µm, Sartorius). De cel droge massa
werd bepaald op een CDM-balans van Precisa (XM60). De OD werd bepaald van een
verdunningsreeks bij 600 nm met een spectrofotometer (Uvikon 922). Deze verdunningsreeks werd
aangemaakt met cel-vrij fermentatie medium, dit is het supernatans van de gecentrifugeerde cultuur.
2.1.2.4 Effect van de koolstofbron op de enzymproductie
In de klassieke Leuconostoc pseudomesenteroides fermentatie wordt een fructose/glucose verhouding
van 2:1 aangewend. De totale concentratie aan koolstofbron bedraagt telkens 120 g per liter inoculum
medium en 22,5 g per liter fermentatie medium (tabel 2.1.7). Deze concentratie werd toegepast voor
een glucose/fructose (verhouding 1:2), een glucose en een D-mannitol medium. Dezelfde procedure
werd toegepast voor de fermentatie als beschreven in § 2.1.2.2, zij het in een kleiner
fermentiemediumvolume van 190ml (in 500ml erlenmeyers). Hierop werd echter een kleine variatie
geïmplementeerd, er werd namelijk eens na 6,5 en na 24 uur een staal genomen waarvan de OD (§
2.1.2.3) en de enzymactiviteit (§ 2.1.2.5 & 6) werd bepaald volgens de geoptimaliseerde procedure.
Op basis van deze gegevens kan de enzymactiviteit per liter fermentatievloeistof (U/l) en de
enzymactiviteit per gram droge celmassa (U/g) worden berekend. Deze conversie werd reeds
aangegeven in tabel 2.1.4.
2.1.2.5 Vrijstellen van het enzym
Initieel werd 1 g cellen (nat gewicht) opgelost in 10 ml 0,05 M acetaatbuffer (pH 6, in een 10 ml
falconbuis) en 5 keer 1 minuut gesoniceerd (Brandson sonifier 250) telkens met 1 minuut interval. Dit
gebeurde bij een sonicatie-intesiteit 3 en op ijs, wat dewarmte-ontwikkeling van het proces
compenseert.
43
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
Deze procedure werd geoptimaliseerd door verschillende combinaties van celmassa, sonicatie-
intensiteit, sonicatiefrequentie en grootte van falconbuisjes te testen en hierbij de enzymactiviteit te
bepalen (§ 2.1.1.6). Hieruit bleek (zie resultaten en besprekingen) dat 2 gram cellen in een 10 ml
falconbuis met 10 ml acetaatbuffer op ijswater het beste resultaat geeft na 15 minuten sonicatie.
Hierbij werd gebruik gemaakt van een 50% sonicatiefrequentie7 en een intensiteit van 3. Om de
ontwikkelde warmte efficiënter af te voeren werd ijswater in plaats van ijs gebruikt.
Uiteindelijk werd het enzymextract gecentrifugeerd voor 15 minuten bij 7000 toeren per minuut. Het
supernatans werd bewaard bij -20ºC.
2.1.2.6 Enzymactiviteit en inhibitie
De enzymactiviteit werd analoog bepaald als in §2.1.1.4. Hierbij werd nu een 0,025 M acetaatbuffer
gebruikt bij pH 5,35. Het substraat voor het mannitol dehydrogenase is D-fructose in een concentratie
van 1,5 M toegevoegd. De toegevoegde concentratie aan NADH is 3 mM. Het uiteindelijke
reactiemengsel wordt weergeven in tabel 2.1.8. Indien nodig werd het enzymextract verdund met 0,05
M acetaatbuffer op pH 6.
Tabel 2.1.8 Samenstelling van het reactiemengsel voor de bepaling van de mannitol dehydrogenase activiteit van L. pseudomesenteroides
Component Volume (µl)
Buffer 240
D-fructose 20
NADH 10
Enzym 10
Deze procedure werd ook gebruikt om inhibitoren van mannitol dehydrogenase te testen. Hierbij werd
in de buffer de inhibitor in een verschillende concentraties toegevoegd. Voor dit enzym werden
pyrofosfaat en verschillende vormen van EDTA getest.
2.1.2.7 Protease test
De aanwezigheid van proteasen werd getest op het ruw enzymextract, bereid op de hierboven
beschreven wijze. Op het onverdund, 10 maal en 100 maal verdunde extract werd telkens in het dubbel
de procedure beschreven door Megazyme uitgevoerd. Hierbij werd telkens een blanco meegenomen.
Tijdens deze procedure werd eerst een protazyme AK-tablet (Megazyme) in 1 ml 100 mM
fosfaatbuffer (pH 7) opgelost en geroerd gedurende 5 minuten bij 25ºC. Daarna werd 1 ml staal
toegevoegd en opnieuw geïncubeerd voor 10 minuten bij 25ºC. Bij de blanco werd niks toegevoegd.
Na deze 10 minuten werd 10 ml 2% natriumfosfaat op pH 12 toegevoegd (stopreagens) en 5 minuten
7 50 % sonicatiefrequentie betekent 1 seconde sonicatie met telkens 1 seconde interval.
44
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
bewaard op kamertemperatuur. Na deze stap werd bij de blanco 1 ml van het overeenkomstige staal
toegevoegd. Het geheel werd gefiltreerd over een Whatman nr. 1 filter en gemeten in een
spectrofotometer (Uvikon 922) bij 590nm ten opzichte van de standaard.
Indien de absorbantie hoger is dan 0,8 dan moet het staal verdund worden in een 100 mM
fosfaatbuffer op pH 7 totdat de absorbantie tussen 0,2 en 0,8 ligt. De uiteindelijke protease activiteit in
het mengsel wordt berekend met vergelijking 2.3.
verdunningeabsorbantimlmUactiviteit )6,0)2,34((/ (2.3)
2.1.2.8 Opzuivering van het enzym
Eiwitbepaling - Biureetmethode
Het eiwitgehalte werd met de Biureetmethode bepaald (Sigma Diagnostics). Hierbij worden de blanco,
0,2 ml fysiologische oplossing en 0,2 ml verdund staal (in het dubbel) 10 minuten geïncubeerd bij
kamertemperatuur met 2,2 ml Biureet-reagens. Na deze incubatie werd 0,1 ml Foline en Ciocalteu’s
reagens toegevoegd en 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De absorbatie van het staal
werd ten opzichte van de blanco gemeten bij 725 nm met een spectrofotometer (Uvikon 922).
De standaardcurve werd opgesteld aan de hand van een 0,5 ml eiwitstandaard (Bovine serum
albumine) die 100 keer verdund werd met fysiologische oplossing. Hieruit werd een verdunningsreeks
gemaakt zodat er oplossingen werden bekomen van 0, 25, 50, 75 en 100 mg eiwit per dl fysiologische
oplossing. Deze oplossingen werden op dezelfde wijze als de stalen behandeld en gemeten. Dit
resulteerd in een standaardcurve gegeven door vergelijking 2.4.
0,053mg/dleiwitieconcentrat0,012e(725nm)absorbanti (2.4)
Ethanolprecipitatie
Aan 2 ml van het ruw enzymextract, bereid zoals beschreven in §2.1.2.5 werd 8 ml ethanoloplossing
toegedruppeld onder continu roeren en gekoeld op ijswater. De ethanolconcentraties hierbij besloegen
een range van 0 tot 100% met telkens een 20% interval.
Nadat de ethanol volledig werd toegevoegd werd het precipitaat in 10 ml falonbuisjes
afgecentrifugeerd voor 15 minuten bij 7000 toeren per minuut. Het pellet werd opnieuw opgelost in
0,05 M acetaatbuffer (pH 6), zoals het supernatans dat vooraf werd gelyofiliseerd. Op beide
oplossingen werd zowel de mannitol dehydrogenase activiteit (§2.1.2.6) als het eiwitgehalte (Biureet-
methode) bepaald.
Ammoniumsulfaat precipitatie en dialyse
Aan verschillende recipiënten met ruw enzymextract werd stapsgewijs onder roeren en gekoeld op
ijswater ammoniumsulfaat toegevoegd. De hoeveelheid ammoniumsulfaat werd bepaald aan de hand
van de verzadigingsgraad. De gebruikte range ging van 100% verzadiging tot 0% verzadiging met een
20% interval.
45
ENZYMPRODUCTIE MATERIAAL EN METHODEN
Het precipitaat werd afgecentrifugeerd (15 minuten, 7000 toeren per minuut in een 10 falconbuis) en
het pellet werd opnieuw opgelost in 0,05 M acetaatbuffer (pH 6). Op zowel het supernatans als de
heropgeloste pellet werd de mannitol dehydrogenase activiteit (§2.1.2.6) en het eiwitgehalte (Biureet-
methode) bepaald.
Na bepaling van de optimale ammoniumsulfaat verzadigingsgraad voor opzuivering werd het
enzymextract alsdusdanig behandeld en gedialyseerd (Membraan van Medicell international Ltd., 21,5
mm Ø) tegenover 0,05 M acetaatbuffer (pH 6). Ook hierop werd de activiteit van het enzym en de
eiwitconcentratie bepaald.
Stabiliseren van mannitol dehydrogenase met reducerende agentia
De stabiliteit van mannitol dehydrogenase werd bij twee verschillende temperaturen gemeten, bij 0ºC
en 25ºC. Bij het bereide enzymextract werd een gelijke hoeveelheid 0,05 M acetaatbuffer gevoegd met
al dan niet een reducerend agens. Deze agentia zijn DTT, mercapto-ethanol ( beide in een 1mM
concentratie), gereduceerd glutathion (10mM) en L-cysteïne (4mM). De activiteit van het enzym werd
op verschillende tijdstippen gemeten. Voor de incubatie bij 25ºC was dit na 0, 1, 2, 3, 6 en 24 uur,
voor 0ºC werd nog eens extra gemeten na 48 uur.
46
HPLC-METHODEN MATERIAAL EN METHODEN
2.2 HPLC-methoden2.2.1 Bepalen van co-enzymen en afbraakproducten
2.2.1.1 Chromatografie
De co-enzymen werden – zoals beschreven in de literatuur (Aso et al., 1989; Micheli et al., 1993) –
bepaald met reversed fase chromatografie. Dit is een vorm van chromatografie waarbij de meest
polaire componenten in het staal eerst elueren met het polaire eluens en de meest apolaire retenderen
op de apolaire kolompakking. Het kolomsysteem dat werd gebruikt, bestaat uit een 1 cm Chrompack
reversed phase voorkolom en een C18 Chrompack Chromsep Microspher kolom (4,6 x 100 mm) (3
µm). Het HPLC-systeem zelf is een Varian HPLC met een 20 µl injectiesysteem, een UV detector en
een RI-detector. Voor de co-enzym bepaling werd enkel de UV-detector gebruikt bij een golflengte
van 260 nm, waarbij zowel NAD(P)+ , NAD(P)H, AMP als NMN kunnen worden gedetecteerd.
De analyse van de co-enzymen werd op twee manieren gedaan. Een eerste is een methode beschreven
door Aso et al. (1989), een isocratische methode, waarbij een flow van 0,5 ml/min werd gebruikt. Het
eluens hierbij is een 96% 0,15 M citraat-fosfaat buffer (pH 6,8) met 1 mM Na2EDTA en 4% methanol.
De tweede methode werd beschreven door Micheli et al. (1993) en maakt gebruik van een
elutiegradiënt (tabel 2.2.1) bij een flow van 1 ml/min. De samenstelling van de eerste elutiebuffer (A)
is 0,1 M kaliumfosfaatbuffer met 4 mM tetrabutylammonium waterstofsulfaat op pH 6. De tweede (B)
is een 7:3 verhouding van de eerste buffer met methanol.
Tabel 2.2.1 Elutiegradiënt voor de bepaling van co-enzymen
Tijd (min) %A B%
0 100 0
2,5 100 0
5 70 30
10 40 60
18 100 0
Deze gradiëntmethode werd enkel gebruikt ter bevestiging van de identificatie van de
afbraakproducten van de co-enzymen en indien bepaalde stoffen gelijke retentietijden vertonen.
Telkens werd een standaard aangemaakt van NAD+, NADH, NADPH (telkens 62,5 µM) NADP+
(31,25 µM), AMP en NMN (telkens 100 µM). De kolom werd op een temperatuur van 30ºC
gehouden.
2.2.1.2 Staalname
In eerste instantie werd een telkens een staal van 200 à 300 µl na 0, 10, 20, 30 en 60 minuten incubatie
genomen. Dit werd gecentrifigeerd gedurende 5 minuten bij 10000 toeren per minuut (Biofuge
47
HPLC-METHODEN MATERIAAL EN METHODEN
centrifuge). Van het supernatans werd 100 µl genomen en verdund in 900 µl 25mM Tris-HCl buffer
op pH 8,7. Deze verdunning werd over een 0,22 µm filter (Millipore) gefilterd in een vial die gekoeld
werd in de autosampler op 4ºC.
Tijdens de experimenten werd deze staalname-methode geoptimaliseerd aan de hand van de
verschillende bevindingen. De centrifugetijd werd ingekort tot 1 minuut bij 13000 toeren per minuut
en de tijdstippen waarop staalname werd genomen werden aangepast aan een online-meetsysteem. Dit
is een systeem waarbij elk staal quasi onmiddellijk geïnjecteerd wordt op de kolom. Deze
omschakelingen waren noodzakelijk omdat uit de experimenten bleek dat in de vial nog reacties
doorgingen en deze niet konden stilgelegd worden zonder de resultaten te beïnvloeden. Hierop zal
uitgebreider teruggekomen worden in de bespreking van de experimenten.
2.2.2 Suikers, ethanol, acetaldehyde en glutathion
2.2.2.1 Chromatografie
Suikers, ethanol, acetaldehyde en glutathion kunnen niet gescheiden worden met reversed phase
chromatografie. Hiervoor werd een Aminex HPX-87C (Bio-Rad) kolom (7,8 x 300 mm) (9 µm)
gebruikt met een 3 cm voorkolom. Dit is een calcium-ion kolom waarop de verschillende
componenten iongestuurd worden gescheiden.
Het eluens van deze chromatografische methode is een 5mM calciumchloride oplossing met een flow
van 0,6 ml/min. Hierbij werd een kolomtemperatuur van 85ºC aangehouden.
De detectie gebeurde hier met een RI-detector van Varian. Dit is een detector die gebruikt maakt van
de brekingsindex van de verschillende componenten. Alle te analyseren stoffen werden als standaard
geïnjecteerd in een concentratie van 250 mM zodat op eenvoudige wijze de concentraties van de
verschillende componenten kunnen berekend worden.
2.2.2.2 Staalname
Bij de suikerbepaling werd telkens een staal van 1 ml genomen. De reacties hierbij werden in eerste
instantie geïnactiveerd door hitteshock bij 100ºC. Het staal werd hierna 1 minuut gecentrifugeerd aan
13000 toeren per minuut. Het supernatans hiervan werd met een 0,22 µm filter (Millipore) gefilterd in
een vail die in de autosampler tot 8ºC werd gekoeld.
48
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
2.3 Karakterisering van bloemenzymen
2.3.1 Bloemextract
5 g bloem (Surbi) werd gedispergeerd in 25 ml 12,5 % sucroseoplossing. Deze oplossing werd met
een ultraturrax mixer (Janke & Kunkel IKA-WERK ultraturrax) 4 maal gemixt in een ijsbad. De
uiteindelijke dispersie werd met een Sorvall RC 5B in SS34 centrifugeerbuisjes gecentrifugeerd, 5
minuten bij 1000 tpm en een temperatuur van 10°C. Het uiteindelijke extract vertoont 3 lagen waarvan
de bovenste een vetlaag is, de middelste het gewenste extract en de onderste vaste stof. De middelste
laag werd gepippeteerd en gefilterd op Whatman nº 1 filtreerpapier. Deze filtratie gebeurde op ijs
(Honold et al., 1966). Het filtraat wordt gebruikt als bloemextract.
2.3.2 Alcohol dehydrogenase
2.3.2.1 Enzymtest: Inhibitie, temperatuursoptimum en -stabiliteit
Deze enzymtest en de berekeningen zijn analoog aan deze van de enzymtest beschreven in §2.1.1.4.
Enkel de samenstelling van het reactiemengsel verschilt. Dit is samengesteld uit 260 l 100 mM Tris
HCl buffer (pH 7,5), 20 L 9M ethanol oplossing (600 mM in reactiemengsel), 10 L 6 mM NAD-
oplossing (200 M in reactiemengsel) en 10 L bloemextract, al dan niet voorgeïncubeerd.
De thermostabiliteit werd gemeten van 30°C tot 70°C. Het temperatuursoptimum werd bij 30°C tot
90°C bepaald. Hierbij werd een voorincubatie van 4 minuten van de buffer uitgevoerd zodat het
volledige reactiemengsel onmiddellijk op temperatuur is bij meten.
Inhibitie door EDTA werd bepaald voor concentratie aan EDTA van 10 mM tot 100mM (in het
reactiemengsel) met intervallen van 10 mM. De pyrofosfaatinhibitie werd voor de concentraties 100,
50, 25, 10, 7.5, 5, 2.5, 1, 0.5 mM en een blanco bepaald.
2.3.2.2 Incubatie van bloem en NAD bij verschillende gistconcentraties
Een reactiemengsel van 10% bloem, 0,5 mM NAD, 10% glucose en verschillende gistconcentraties
werd geïncubeerd bij 25˚C. De verschillende gistconcentraties zijn 0, 1, 10 en 100 keer de
gistconcentratie die voorkomt in een deeg. Deze concentratie is 0,3 g gist per 100 g bloem. De co-
enzymen werden bepaald met de eerder beschreven HPLC-methode.
2.3.2.3 Incubatie van ethanol met NAD+ in aanwezigheid van gist
Een mengsel van 10% (m/v) gist, 3% ethanol en 0,5 mM NAD+ werd bereid in een 0,1 M
acetaatbuffer (pH 5,5). Daarnaast werd een blanco mengsel samengesteld waarbij de ethanol
vervangen werd door water. Beide werden 10 minuten geflushed met stikstofgas en geïncubeerd bij
25˚C. De co-enzymomzettingen werden via de HPLC-methode gevolgd.
49
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
2.3.3 Nucleotide pyrofosfatase
2.3.3.1 Identificatie en kwantificering van de afbraakproducten
De identificatie van de afbraakproducten werd in eerste instantie uitgevoerd door een hele range van
mogelijke afbraakproducten te injecteren en hun retentietijden te bepalen. De stoffen waarvan de
retentietijden overeenkomen met de retentietijden in het afbraakprofiel van NAD+ werden
aangenomen als de afbraakproducten. Dit afbraakprofiel werd bekomen door 2,5 ml bloemextract te
incuberen met 2,5 ml van een 0,2 M acetaatbuffer (pH 5,5) en 0,5 mM NAD+. Hiervan werd na 1 uur
een staal genoemen en volgens de isocratische HPLC-methode (§ 2.2.1) gemeten.
Ter bevestiging werd op analoge wijze een afbraakprofiel opgesteld, maar werd aan het staal 1 mM
aan geïdentificeerd afbraakproduct toegevoegd. Dit resulteerde in een piekverhoging in het
afbraakprofiel. Deze bevestiging werd zowel met de isocratische HPLC-methode als met de HPLC-
methode met elutiegradiënt uitgevoerd.
De kwantificering van de afbraakproducten gebeurde door een extra standaard van de
afbraakproducten te injecteren.
2.3.3.2 Vergelijking met commerciële enzymen
Twee commerciële enzymen werden hiervoor aangekocht:
nucleotide pyrofosfatase (Crotalus adementeus venom) (Sigma)
zuur fosfatase (tarwekiem) (Fluka)
Van beide fosfatasen werd een oplossing bereid van 50 U/ml (volgens verpakking, uiteindelijke
concentratie 10 U/ml) in de geschikte buffer (NPP: 0.1 M KPB, pH 7.4 + 20 mM MgCl2; fosfatase: 0.1
M acetaatbuffer, pH 4.8). Deze enzymoplossing werd zowel met NAD+ als met NADH (uiteindelijke
concentratie = 0.5 mM) geïncubeerd bij 25°C in de geschikte buffer (NPP: 0.1 M KPB, pH 7.4;
fosfatase: 0.1 M acetaatbuffer, pH 4.8). Op verschillende tijdstippen werd een monster genomen dat
geanalyseerd werd met de HPLC (§ 2.2.1).
2.3.3.3 Screening naar inhibitoren en reactivatie na inhibitie en stimulatie
Het totale volume van het mengsel was telkens 5 ml waarvan 2,5 ml bloemextract, 1,5 ml NAD+ of
NADH-oplossing (1,66 mM) en 1 ml potentiële inhibitor. De concentraties van de verschillende
inhibitoren in het uiteindelijke reactiemengsel worden gegeven in tabel 2.3.1 samen met de
uiteindelijke concentratie van de co-enzymen. Naast deze inhibitoren werden tevens verschillende
fosfaten in een concentratie van 10g per liter getest. Deze waren kaliumfosfaat, metafosfaat,
tripolyfosfaat, Na-pyrofosfaat en Ca-pyrofosfaat.
De metaalionen die werden getest werden getest ter reactivatie na inhibitie met 10mM EDTA waren
zink, calcium, magnesium en mangaan. De stimulatie van NPP werd enkel met magnesium en
mangaan getest.
50
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
Voor de reactivatie van NPP en het synergistisch effect van glycine werd het mengsel aangepast.
Hierbij werd slechts 500 µL inhibitor toegevoegd en 500µL kation of glycine.
De NAD+- en de verschillende inhibitor/metaalion-oplossingen werden aangemaakt in een 0,2 M
acetaat buffer (pH 5,5).
De werking van de verschillende inhibitoren en metaalionen werd geanalyseerd met de HPLC (§
2.2.1).
Tabel 2.3.1Concentratie van de potentiële inhibitoren in het reactiemengsel
Inhibitor/Co-enzym Concentratie (mM)
EDTA 0,003 tot 10
AMP 0,5 tot 10
ADP 1
Nicotinamide 10
DTT 4
L-cysteïne 0,1 tot 40
Gereduceerd glutathion 10
Mercapto-ethanol 16
Na-pyrofosfaat 20 en 100
Ca-pyrofosfaat 100, 50, 20 en 10
Glycine 5 en 100
NAD/NADH 0,5
2.3.3.4 Thermostabiliteit en temperatuursoptimum
Het temperatuursoptimum werd voor 4, 25, 37, 50, 60 en 70°C bepaald voor een reactiemengsel van
2,5 ml bloemextract en 2,5 ml acetaatbuffer (0,2 M, pH 5,5) met NAD+ (1mM). Bij de bepaling van de
thermostabiliteit werd het bloemextract onderworpen aan een voorincubatie bij 30 tot 90°C voor 10
minuten. Hierna werden de verschillende stalen onmiddellijk op ijs geplaatst. De afbraak van NAD+
werd bepaald met de HPLC (§ 2.2.1) aan de hand van de online methode.
2.3.3.5 Afbraaksnelheid NAD+ en NADH
Een reactiemengsel van 2,5 ml bloemextract en 2,5 ml acetaatbuffer (0,2 M, pH 5,5) met co-enzym (1
mM) werd gedurende 15 minuten met stikstof geflushed zodat anaëroob geincubeerd kon worden bij
25°C. Om het half uur werd een staal genomen dat online gemeten werd met de HPLC (§ 2.2.1).
2.3.3.6 Effect van verschillende NAD+-concentraties
Een reactiemengsel van 1,25 ml bloemextract, 1,15 ml 0,22 M acetaatbuffer (pH 5,5) en 0,1 ml NAD+-
oplossing werd geïncubeerd bij 25°C. De concentraties aan NAD+ waren hierbij 1, 0.75, 0.5, 0.25 en
0.125 mM. De afbraak van NAD+ werd bepaald met de HPLC (§ 2.2.1) aan de hand van de online
methode.
51
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
2.3.3.7 NAD(H)-shots
NAD(H) werd geïncubeerd met bloemextract bij pH 8 en 25°C. Het reactiemengsel bestond uit 1,25
ml bloemextract, 1,15 ml 0,22 M Tris-buffer (pH 8) en 0,1 ml 12,5 mM NAD(H)-oplossing.
Er werd 100 µl staal genomen op 0, 90, 180 en 270 minuten. Na staalname op 90 en 180 minuten werd
telkens 100 µl NAD(H)-oplossing ( 2 µmol) toegevoegd. De omzettingen werden bepaald met de
HPLC (§ 2.2.1).
2.3.3.8 Alternatieve methoden voor NPP-activiteit detectie
ADH-methode
Het principe om alcohol dehydrogenase (ADH) te gebruiken in een activeitsbepaling van NPP berust
op het feit dat ADH de niet-afgebroken NAD+ moleculen met ethanol kan omzetten tot NADH. Deze
gereduceerde vorm van het co-enzym kan gemeten worden bij 340nm, zonder interferentie van de
afbraakproducten (Kornberg et al., 1950; Jacobson et al., 1956; Swartz et al., 1958; Haroz et al., 1972;
Wise et al., 1997; Medda et al., 2000). Het betreft hier dus een tweestapsreactie waarbij op het staal
dat genomen wordt een nieuwe reactie wordt uitgevoerd.
De eerste reactie was de afbraakreactie van 2mM NAD+ in 5 ml 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 8,5) en 5
ml bloemextract. Dit reactiemengsel werd geïncubeerd bij 25°C. Om het half uur werd hieruit een
staal genomen. Hiervan werd 100 µl met de HPLC geanalyseerd en 10 µl toegevoegd aan het
reactiemengsel van de tweede stap. Dit mengsel bevatte 260 µl 0,1 M pyrofosfaatbuffer (pH 8,8), 20
µl ethanol-oplossing (7,5 M) en 10 µl gist-ADH.
Hiernaast werd een ijklijn van de verschillende activiteiten van ADH bij verschillende concentraties
NAD+ opgesteld in eenzelfde mengsel. De activiteit gemeten in het staal kan hiermee gecorreleerd
worden aan een concentratie van niet-afgebroken NAD+.
Fosfaat-methode
In de literatuur werd deze methode veelvuldig beschreven ter bepaling van de activiteit van NPP
(Jacobson et al., 1956; Kole et al., 1976; Bartkiewicz et al., 1984; Frick et al., 1995; Xu, WL et al.,
2000; Dobrzanska et al., 2002; Abdelbraheim et al., 2003). Het principe van deze methode bestaat erin
van de afbraakproducten NMN en AMP de fosfaatgroep af te splitsten en deze te bepalen met de
ammoniummolybdaat methode voor fosfaatbepaling (Lowry et al., 1945; Ames et al., 1960).
Hier werd een reactiemengsel van 4 ml bloemextract met 4 ml (1 mM) NAD+ oplossing in een 0,2 M
Tris-buffer (pH 8) geïncubeerd. Hiervan werd 700 µl staalgenomen op verschillende tijdstippen, dit
werd 1 minuut bij 13000 toeren per minuut gecentrifugeerd en opgesplitst in 475 µl voor de eigenlijke
fosfaat test en 100 µl voor HPLC analyse. De 475 µl werd met 25 µl fosfatase (13,5 U/ml) voor 30
minuten bij 37°C geïncubeerd waarna 500 µl 30 mM EDTA oplossing werd toegevoegd om de reactie
te stoppen. Van dit mengsel werd uiteindelijk 100 µl bij een 100 µl perchloraatoplossing (0,3N) en een
0,1 M natriumacetaatoplossing gevoegd. Uit dit mengsel werd 300 µl gepippeteerd in 700 µl
52
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
molybdaat/ascorbaat oplossing. Deze oplossing is een 1:7 verhouding van een 10% ascorbaatoplossing
en een 1% ammoniummolybdaatoplossing in 1N zwavelzuur opgelost.
Dit geheel werd onderworpen aan een 30 minuten incubatie bij 60°C. De kleurintensiteit werd met de
spectrofotometer bij 820 nm gemeten.
De standaarcurve voor deze methode werd met een standaard reeks van fosfaatoplossingen bepaald.
De concentraties van deze reeks waren 0, 0.2, 0.4, 0.6 en 0.8 mM. Daarnaast werden twee blanco’s
(zonder co-enzym) van het bloemextract gemeten volgens dezelfde procedure als hierboven
beschreven. Het verschil tussen beide blanco’s zit hem in het al dan niet incuberen van het
bloemextract met fosfatase.
Thymidine-5’-p-nitrofenylfosfaat (5’-pNPT)
In de literatuur wordt 5’-pNPT veelvuldig als een substraat voor nucleotidepyrofosfaat beschreven.
Het enzym splitst de fosfaat groep af waardoor een gele kleur gevormd wordt. Dit kan
spectrofotometrisch bepaald worden (Haroz et al., 1972; Kole et al., 1976; Bartkiewicz et al., 1984;
Medda et al., 2000).
De samenstelling van het reactiemengsel was 900µl 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) buffer met 100 µl 0,1 M
5’-pNPT en 1 ml bloemextract. Hiervan werd de absorbantie bij 400 nm gemeten met de
spectrofotometer in functie van de tijd.
Een standaardreeks werd opgesteld om deze absorbantie om te rekenen naar de verandering van de
concentratie aan 5’-pNPT in de tijd. Hierbij werd een verdunningsreeks van 40, 20, 10, 5, 2.5 en 0 mM
aangemaakt van p-nitrofenol in 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) buffer. Hiervan werd 50 µl in 450 µl buffer
gebracht en 500 µl sucrose-oplossing (12,5%). Dit werd eveneens gemeten bij 400 nm.
2.3.4 Incubatie van NAD(H) en bloemextract bij verschillende pH’s
Het mengsel dat bij de verschillende zuurtegraden werd geïncubeerd bestaat uit 1,25 ml bloemextract
of water met 1,15 ml buffer en 0,1 ml co-enzym. Het bloemextract werd hierbij eventueel verhit
gedurende 10 minuten bij 80°C of geautoclaveerd (121°C, 21 min.).
Tabel 2.3.2 Overzicht van de gebruikte buffers bij de incubatie van co-enzymen bij verschillende pH’s
pH Buffer
5,5 Acetaatbuffer
7 Fosfaatbuffer
8,5 Tris-HCl buffer
9,5 Glycine-NaOH buffer
10,5 en 11,9 Verdund NaOH
53
BLOEMENZYMEN MATERIAAL EN METHODEN
De concentraties van de co-enzym- en bufferoplossingen werden zo gekozen dat de finale concentratie
co-enzym 0,5 mM bedroeg en de bufferconcentratie 0,1 M. Een overzicht van de verschillende buffers
wordt weergegeven in tabel 2.3.2.
Bovenstaand mengsel werd geïncubeerd bij 25°C en werd zowel onder anaërobe (d.m.v. stikstofflush)
als aërobe condities uitgevoerd. De analyses gebeurden door middel van de online HPLC methode (§
2.2.1).
2.3.5 Inhibitie van NADH-oxidase met reducerende agentia
Een mengsel van 1,25 ml bloemextract, 1,15 ml 0,22 M acetaatbuffer (pH 5,5) al dan niet met 4 mM
inhibitor en 0,1 ml NADH (in uiteindelijke concentratie van 0,5 M) werd geïncubeerd bij 25°C. De
geteste inhibitoren zijn L-cysteïne, DTT, gereduceerd en geoxideerd glutathion.
2.3.6 Fosfatase
Een klassieke methode voor de bepaling van fosfatasen is de p-nitrofenolfosfaat-methode. Hierbij
wordt de afbraak van p-nitrofenolfosfaat gemeten bij 400 nm. Om de verschillende soorten fosfatasen
(zure en alkalische) te detecteren moet dit gebeuren bij verschillende zuurtegraden.
Voorafgaand aan de eigenlijke proef werd een standaard reeks van p-nitrofenol gemeten bij
verschillende pH’s zodat voor elke pH een standaardcurve werd bekomen. Deze reeks was 12, 6, 3,
1.5 en 0.75 µg/ml. De beschouwde pH’s werden telkens bereid in een 0,2 M bufferconcentratie. Een
overzicht wordt weergegeven in tabel 2.3.3. De standaardoplossingen ondergingen dezelfde procedure
als de stalen, weliswaar met water in plaats van bloemextract.
Deze procedure was een 10 minuten durende incubatie van 250 µl buffer, 250 µl p-nitrofenolfosfaat-
oplossing (2,5 mg/ml) en 100µl bloemextract bij 37°C waarna 2 ml 0,1 M natriumhydroxide oplossing
werd toegevoegd. De absorbantie werd gemeten bij 400nm met de spectrofotometer (Uvikon 922).
Tabel 2.3.3 Overzicht van de buffers en hun overeenkomstige pH's gebruikt in de p-nitrofenolfosfaat test
pH Buffer
2 Glycine-HCl buffer
4 Acetaatbuffer
6 Na-fosfaatbuffer
8 Na-fosfaatbuffer
10 Glycine-NaOH buffer
54
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN MATERIAAL EN METHODEN
2.4 Gekoppelde enzymsystemen
2.4.1 Bloem, gist, NAD+ en mannitol dehydrogenase systeem
2.4.1.1 Bepalen van de enzymactiviteit
50 L Mannitol dehydrogenase enzymextract (10 * verdund) werd toegevoegd aan een reactiemengsel
van 200 L 10% D-glucose oplossing, 200 L 1,25 mM NADH oplossing (bereid in een 0,125 mM
acetaat buffer op pH 5,5), 100 L fysiologische oplossing en 50 L 1,2 M D-fructose oplossing
(eveneens bereid in een 0,2 M acetaat buffer op pH 5,5).
De concentratieverandering aan NADH werd gemeten in functie van de tijd met een spectrofotometer
bij een golflengte van 340 nm. De richtingscoëfficient van deze lineare verandering is de activiteit van
het enzym uitgedrukt in absorbantie bij 340 nm per minuut. Aan de hand van de berekeningsmethode
die in § 2.1.1.4 is besproken kan dan de activiteit van mannitol dehydrogenase worden bepaald.
2.4.1.2 Incubatie
Een initiële voorfermentatie van het reactiemengsel bestaande uit 0,5 g bloem (10% (m/v)), 1 ml gist
(100 maal de normale concentratie in deeg) en 2 ml 10% glucose-oplossing werd uitgevoerd voor 20
minuten bij 25°C. Figuur 2.4.1 geeft aan dat in deze voorfermentatie (I) ethanol wordt gevormd,
waarna deze ethanol wordt opgezet naar acetaldehyde. Hierbij wordt NAD+ gereduceerd tot NADH
(II). Deze NADH wordt dan geregenereerd tot NAD+ met mannitol dehydrogenase en fructose,
waaruit mannitol wordt gevormd (III).
Op basis van deze reactiesequentie werden twee incubatiemethodieken opgesteld na de
voorfermentatie, genaamd additie op T0 en additie op T1. Additie op T0 betekent dat na de
voorfermentatie 2 ml NAD+ oplossing (0,5M uiteindelijke concentratie), 0,5 ml mannitol
dehydrogenase, 0,5 ml D-fructose (100 mM) en 0,66 g glucose (10% uiteindelijke concentratie) aan
het reactiemengsel toegevoegd. De fructose en NAD+ oplossing werden in een 0,2 M acetaatbuffer
bereid op pH 5,5.
Een additie op T1 betekent dat de mannitol dehydrogenase, fructose en glucose pas na een extra
incubatieperiode van 30 minuten worden toegevoegd zodat een zekere hoeveelheid NAD+ kan
omgezet worden naar NADH door het alcohol dehydrogenase.
Naast de incubatie met mannitol dehydrogenase werd telkens een blanco incubatie uitgevoerd waarbij
het MDH werd vervangen door een 0,05M acetaatbuffer (pH5,5) waarin het enzymextract van MDH
werd bereid.
55
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN MATERIAAL EN METHODEN
gist + bloem (zetmeel) + glucose
Fermentatie
Ethanol acetaldehyde
NAD+ NADH
ADH
MDH
D-fructoseD-mannitol
I
II
III
I: vorming van ethanol door gist
II: omzetting van NAD+ tot NADHdoor alcohol dehydrogenase (ADH)van bloem
III: de co-enzymregeneratie doormannitol dehydrogenase (MDH)
Figuur 2.4.1 De regeneratie van NADH tot NAD+ door MDH na NADH-vorming uit NAD+ in aanwezigheid van bloem, glucose en gist
2.4.2 Bloem, NADH en formiaat dehydrogenase systeem
Ook hier werd een onderscheid gemaakt tussen een additie van het enzym en zijn substraat op T0 en
T1. Hier verloopt de incubatie echter iets anders omdat geen voorfermentatie nodig is. Bij additie op T0
werd een reactiemengsel samengesteld bestaande uit NADH (0.5 mM), bloemextract (~ 10% (w/v)
bloem), Na-formiaat (100 mM) en formiaat dehydrogenase (100 U/l). Voor de blanco werd formiaat
dehydrogenase vervangen door 0.1 M Bis-Tris buffer (pH 6.5) (buffer waarin FDH is opgelost). Dit
mengsel werd geïncubeerd bij 25°C in een 0.1 M acetaatbuffer op pH 5.5. Hieruit werden op
verschillende tijdstippen staal genomen en met de HPLC gemeten (§ 2.2.1). Voor de additie op T1
werd een voorincubatie van NADH met bloemextract ingelast.
De variaties op dit systeem die werden getest waren variaties op formiaat dehydrogenase concentratie
(0, 10 en 100 U/l) en variaties op formiaat concentratie (0, 10 en 100mM).
56
NATIEVE PAGE EN ZYMOGRAMMEN MATERIAAL EN METHODEN
2.5 Natieve PAGE en zymogrammen
2.5.1 Natieve PAGE
Natieve PAGE (polyacrylamide-gelelektroforese) is een vorm van elektroforese waarbij de eiwitten
niet worden gedenatureerd op de gel. Het voordeel hiervan is dat op de gel zelf een enzym kan
aangetoond worden aan de hand van zijn katalytische activiteit (principe van een zymogram).
De elektroforese werd uitgevoerd met het PhastSystemTM (Amersham Pharmacia Biotech). De
methode die gebruikt werd, staat vermeld in tabel 2.5.1. Gedurende de tweede stap werden de stalen
geladen op de gel. Eventueel vond een concentratiestap van het staal plaats met Amicon Centricons
(MWCO = 10.000 kDa).
Tabel 2.5.1 Natieve PAGE scheidingsprogramma
Stap n°
1 400 V 10.0 mA 2.5 W 15°C 10 Vh
2 400 V 1.0 mA 2.5 W 15°C 2 Vh
3 400 V 10.0 mA 2.5 W 15°C 268 Vh
Bij dit systeem wordt een PhastGel Gradient 8-25 geschikt voor natieve eiwitten in het MW-bereik
van 50 kDa tot 750 kDa gebruikt met PhastGel Native Gradient Buffer Strips (beide van Amersham
Pharmacia Biotech). De standaardreeks (tabel 2.5.2) werd bepaald met een High Molecular Weight
Calibration Kit for native electrophoresis (Amersham Pharmacia Biotech) die opgelost werd in 100 µl
0.01 M K-fosfaatbuffer pH 6.0.
Tabel 2.5.2 Standaard eiwitreeks
eiwit MW
Thyroglobuline 669 kDa
Ferritine 440 kDa
Catalase 232 kDa
Lactate dehydrogenase 140 kDa
Bovine serum albumin 67 kDa
2.5.2 Coomassiekleuring
Een coomassiekleuring is een eiwitkleuring die blauwe bandjes geeft op een gel. In tabel 2.5.3 staat
de procedure beschreven van een snelle coomassiekleuring. Deze bestaat uit drie grote fasen, een
kleuringsfase waarbij de gel gekleurd wordt (stain), een ontkleuringsfase waarbij de overtollige
kleurstof wordt weggewassen (destain) en een bewaringsfase waarbij de gekleurde eiwitten worden
gefixeerd. De stain-oplossing is een 0.1 % PhastGel Blue R (Amersham Pharmacia Biotech) oplossing
57
NATIEVE PAGE EN ZYMOGRAMMEN MATERIAAL EN METHODEN
in 30 % methanol en 10 % azijnzuur in water. De destain is een analoge oplossing, zonder het
kleuringsagens. De bewaringsoplossing bestaat uit 10 % glycerol en 10 % azijnzuur in water.
Tabel 2.5.3 Snelle Coomasssie kleuring voor natieve PAGE
Stap n° Oplossing Tijd (min) Temperatuur (°C)
1 Stain 7 50
2 Destain 1 50
3 Destain 10 50
4 Destain 15 50
5 Bewaaroplossing 15 50
2.5.3 Zymogrammen
2.5.3.1 Dehydrogenasen
In de literatuur worden methoden beschreven voor de bepaling van dehydrogenasen gebaseerd op de
vorming van formazan (figuur 2.5.1), een product met blauw-bruine kleur.
Product
enzym
NA D+
NA DHelektrontransfer
agensox
elektrontransfer agensred
oxiderend agens
formazan
Substraat
Figuur 2.5.1 Principe dehydrogenase-bepaling gebaseerd op de vorming van formazan
Als elektron transfer agens worden hierbij fenazine methosulfaat (PMS) (Honold et al., 1966; Adachi
et al., 1980; Mills et al., 1990) en 5-ethyl phenazinium ethyl sulfaat (PES) (Theobald et al., 1997)
vermeld. De beschreven oxiderende agentia zijn nitro-blauw tetrazolium (NBT) (Honold et al., 1966;
Adachi et al., 1980), 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromide (Mills et al., 1990)
en thiazylolyl blauw (MTT) (Theobald et al., 1997). Hiervan werden NBT en PMS toegepast in de
opzet van de zymogrammen.
Tabel 2.5.4 Algemene samenstelling van het reactiemengsel voor de zymogrammen
Component Volume
Buffer 16,8 ml
Substraat 1,4 ml
0.006 M NAD 0,7 ml
1.2 mg/ml NBT 0,7 ml
4.2 mg/ml PMS 0,7 ml
58
NATIEVE PAGE EN ZYMOGRAMMEN MATERIAAL EN METHODEN
Tabel 2.5.4 toont het de algemene samenstelling van het reactiemengsel voor de zymogrammen van de
verschillende dehydrogenasen. De specificaties voor de buffers en de substraten worden gegeven in
tabel 2.5.5. De reacties werden hierbij gestopt in een azijnzuur-oplossing (7%).
Tabel 2.5.5 Substraat en buffer specificaties voor de verschillende dehydrogenasen
Dehydrogenase Substraat Buffer
ADH 9 M ethanol 0,1 M Tris-buffer, pH 7,5
MDH (L. pseudomesenteroides) 1,5 M D-mannitol 0,1 M Tris-buffer, pH 8,5
SDH/MDH (G. oxydans) 1,5 M D-sorbitol/
1,5 M D-mannitol
0.05 M glycine-NaOH buffer,
pH 9.5
2.5.3.2 NADH-oxidase
Om de NADH-oxidase-activiteit aan te tonen werd de gel geïncubeerd in een mengsel bestaande uit ½
0,1 M acetaatbuffer pH 5,5 die 6 mM NADH bevatte en ½ NBT-oplossing (1,2 mg/ml). Deze gel
werd bij 60°C geïncubeerd tot kleurontwikkeling optrad.
De reactie werd gestopt door de gel in een 7% azijnzuuroplossing te brengen.
2.5.3.3 Nucleotide pyrofosfatase (NPP)
Het aantonen van NPP op een gel werd gedaan aan de hand van de reactie met thymidine-5’-p-
nitrofenylfosfaat. Het afbraakproduct thymidine-5’-p-nitrofenyl blijft echter niet op de gel, maar
diffundeert na de reactie naar het incubatiemengsel (zelfde samenstelling als bij de
spectrofotometrische test). Een oplossing werd hier geboden door dit mengsel te verwerken in een
agar-gel die op de Phastgel werd gebracht in “overlay”. Dit voorkwam de diffusie en gaf gele spots op
de gel weer.
59
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
3 Resultaten en bespreking
3.1 Productie en opzuivering van microbieel mannitol dehydrogenase
3.1.1 MDH productie door L. pseudomesenteroides: constitutief of geïnduceerd?
In de literatuurstudie werd beschreven hoe heterofermentatieve melkzuurbacteriën de verschillende
koolstofbronnen aanwenden (§ 1.2.2.2). Hierbij werd een pathway-verschuiving aangeduid naargelang
de fructose concentratie. De vraag die zich hierbij stelt is of de koolstofbron en de pathway een
invloed hebben op de productie van MDH, of anders geformuleerd: wordt MDH constitutief of
geïnduceerd geproduceerd?
Voor hetero-fermentatieve melkzuurbacteriën zijn beide mogelijk (Yamanaka et al., 1968):
Lactobacillus brevis produceert MDH geïnduceerd door fructose, Leuconostoc pseudomesenteroides
wendt een constitutieve transcriptie aan in aanwezigheid van fructose. Beide organismen zouden
inductie vertonen in aanwezigheid van D-mannitol.
In een eerste experiment werden drie media getest bij een fermentatieduur van 6,5 uur. Figuur 3.1.1
geeft de enzymactiviteit per liter fermentatiemedium hiervan weer. Hieruit blijkt dat een glucose-
fructose (1:2) de hoogste activiteit geeft en een glucose het laagst. Dus zou besloten kunnen worden
dat fructose de transcriptie van MDH stimuleert. Maar ook de verschillende fermentatieroutes moeten
in rekening worden gebracht (§ 1.2.2.2 & addendum B). De hoeveelheid ATP-opbrengst voor de cel in
een glucose-medium is slechts de helft van deze in een fructose-glucose-medium. Het is dus mogelijk
dat het waargenomen activiteitsverschil niet aan een hogere enzymproductie per cel ligt maar wel aan
een hogere celproductie in het algemeen.
0
20
40
60
80
glucose fructose glu+fru
Enzy
mac
tivite
it(U
/l fe
rmen
tatie
vloe
isto
f)
0
20
40
60
80
100
glucose fructose glu+fru
Enzy
mac
tivite
it(U
/g d
roge
celle
n)
Figuur 3.1.1 Enzymopbrengst na 6,5 uur fermenteren op media met verschillende koolstofbronnen
Deze theorie wordt echter weerlegt door de berekening van de enzymactiviteit per gram droge cellen
(figuur 3.1.1). Dit werd berekend aan de hand van een correlatiecurve van de cel droge massa en de
optische densiteit (figuur 3.1.2). Hierbij geeft het glucose-fructose mengsel nog steeds een hogere
activiteit aan. De enzymproductie blijkt dus gestimuleerd te worden door fructose.
Voor het fructose medium en het glucose-fructose mengsel zou een gelijke enzymactiviteit per gram
cellen verwacht worden. Beide media resulteren immers in een gelijke hoeveelheid ATP-productie en
bevatten fructose om de enzymproductie te stimuleren.
60
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Het experiment lost echter deze verwachting niet in. De activiteit van het fructose-medium ligt lager
dan dat van het mengsel. Het is mogelijk dat het tussenproduct, fructose-6-fosfaat, in de
fermentatiepathway hierin een hand heeft. Deze stof kan een rol spelen in de regulatie van de
transcriptie van mannitol dehydrogenase.
OD = 3,439*CDM (g/l) - 0,0061R2 = 0,9995
0
0,5
1
1,5
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
CDM (g/l)
OD
(600
nm)
Figuur 3.1.2 Correlatie OD en CDM
Indien de cellen langere tijd in een glucose-medium worden opgekweekt verhoogt de enzymactiviteit
per liter medium significant. Daarnaast werd mannitol als koolstofbron uitgetest. Hierbij werd
nauwelijks groei waargenomen. Dit wijst op het feit dat mannitol dehydrogenase een lage affiniteit
vertoont voor mannitol. Wat impliceert dat eens fructose omgezet is tot mannitol, dit moeilijk door de
cel kan aangesproken worden als koolstofbron (figuur 3.1.3).
050
100150200250300
glucose,6,5 h
mannitol,6,5 h
glucose,24 h
mannitol,24 h
Enzy
mac
tivite
it (U
/lfe
rmen
tatie
vloe
isto
f)
Figuur 3.1.3 Enzymopbrengst na 6,5 uur en 24 uur fermenteren op media met verschillende koolstofbronnen
In een 3de experiment werd het effect van de fermentatieduur bestudeerd. Figuur 3.1.4 geeft het
resultaat van dit experiment. Hieruit blijkt nogmaals dat na 6,5 uur fermentatie, de glucosefermentatie
een lagere enzymactiviteit vertoont, zowel per liter fermentatievloeistof als per gram cellen. Na 24 uur
fermentatie komt deze activiteit echter op gelijke hoogte met de fermentatie van het glucose-fructose
mengsel. Hiernaast bemerken we een activiteitsdaling voor het mengsel.
Van een geïnduceerde transcriptie kan hier geen sprake zijn omdat in het geval van een
glucosefermentatie nauwelijks MDH activiteit zou waargenomen worden (cfr. L. Brevis beschreven
door Yamanaka et al. , 1968). Daarnaast zou deze activiteit per gram celmassa niet stijgen bij langere
fermentatie.
61
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
0100200300400500
glucose,6,5 h
glucose +fructose,
6,5 h
glucose,24 h
glucose +fructose,
24 hEn
zym
activ
iteit
(U/l
ferm
enta
tievl
oeis
tof)
0100200300400500
glucose,6,5 h
glucose +fructose,
6,5 h
glucose,24 h
glucose +fructose,
24 h
Enzy
mac
tivite
it (U
/gdr
oge
celle
n)
Figuur 3.1.4 Enzymopbrengst na 6,5 uur en 24 uur fermenteren op media met verschillende koolstof-bronnen
Een ander transcriptiecontrole systeem is dat van de silencers en enhancers (Hartl et al., 2000). Hierbij
zal een proteïne op het DNA binden en bijgevolg de transcriptie vertragen (silencer) of stimuleren
(enhancer). De transcriptie van dergelijke proteïnen kan worden geïnduceerd door bijvoorbeeld een
suiker – fructose. Dergelijk systeem zou de vertraagde MDH-productie per cel bij een glucose
fermentatie kunnen verklaren maar niet de activiteitsdaling van het fructose-glucose mengsel na 24
uur.
De verklaring van deze activiteitsdaling moet gezocht worden bij de groeicyclus van een populatie
micro-organismen. Deze bestaat uit een lag-fase, een exponentiële fase, een stationaire fase en een
afstervingsfase. Gezien het fructose-glucose mengsel een lagere concentratie aan koolstofbron bevat
voor energieproductie zal deze cyclus hierbij sneller doorlopen worden dan bij een glucosebron met
eenzelfde totale suikerconcentratie. De cultuur, in het suikermengsel opgegroeid, zit dus al in de
afstervingsfase na 24 uur terwijl de cultuur bij glucose nog exponentieel kan groeien. Wordt deze
groei dus gemeten via de optische densiteit – waarbij zowel de levende als de dode cellen worden
gemeten – dan wordt een verlaagde enzymactiviteit per gram cellen waargenomen. Per gram levende
cellen zou deze activiteit waarschijnlijk gelijkaardige resultaten geven voor beide media.
Het principe van de groeicyclus biedt ook een alternatieve verklaring voor de vertraagde MDH-
productie in het glucosemedium. Na 6,5 uur is het mogelijk dat de cultuur in het glucose medium zich
nog steeds in de lagfase bevindt. Het is dus mogelijk dat de enzymproductie afhankelijk is van de
groeifase waarin de cultuur zich bevindt.
Dergelijke groeicyclus-afhankelijke transcriptie werd reeds aangetoond bij de afbraak van aromatische
stoffen door Pseudomonas putida (Marques et al., 1999). Het verschil in transcriptie wordt hierbij
toegeschreven aan een veranderlijke samenstelling van RNA polymerase. Dit enzym is opgebouwd uit
6 sububits, nl. ’ 2 (Hartl et al., 2000). De sigma subunit zorgt voor het binden van het polymerase
op het DNA voor de transcriptie. Deze subunit blijkt nu te verschillen in de verschillende fasen van de
groeicuclus van Pseudomonas putida. In de lag en het begin van de exponentiële fase is 32
verantwoordlijk voor de aanhechting, een subunit die eerder werd teruggevonden bij stress. Dit wordt
verklaard aan de hand van het feit dat bij het overenten van een cultuur deze in een tijdelijke stress-
62
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
situatie komt en hierop met de gepaste mechanismen reageert. In de late exponentiële fase en de
stationaire fase wordt overgeschakeld op 38 voor transcriptie.
Indien dergelijk systeem ook optreedt bij de transcriptie in Leuconostoc pseudomesenteroides, waarbij
de beide sigma-subunits een verschillende bindingsaffiniteit hebben voor het DNA zou dit een
mogelijke verklaring bieden voor het verschil in activiteitsmeting tussen de media. Het
glucosemedium heeft immers als gevolg van een lagere ATP-opbrengst per verbruikte suikermolecule
een langere lag-fase. Dit leidt tot een langer gebruik van de stress-sigma-subunit die verlaagde
transcriptie met zich meebrengt. Om dit te bevestigen is er echter meer informatie nodig rond de
transcriptie van MDH in Leuconostoc.
3.1.2 Vrijstellen van het enzym
3.1.2.1 Inleiding
Enzymen zijn relatief gevoelig voor denaturatie. Bij het openbreken van de microbiële cellen is het
dus noodzakelijk de verschillende parameters zodanig in te stellen dat een optimale vrijstelling en een
minimale denaturatie van het enzym bekomen wordt.
3.1.2.2 Variëren van verschillende parameters bij sonicatie
In tabel 3.1.1 worden de resultaten van deze test weergegeven, hierbij is de celopbrengst (natte cellen)
per liter fermentatiemedium 9 gram per liter.
Tabel 3.1.1 Overzicht van verschillende sonicatiebehandelingen voor vrijstelling MDH
U/Lreactiemengsel
U/Lenzymextract
U/g cellen U/L fermentatiemedium
1 g cellen in 10 ml, smalle falcon 10 mintijdschema: 1 min aan /1min uit, intensiteit 3
1373± 55
16473± 660
165± 7
1484± 59
1 g cellen in 10 ml, smalle falcon 15 mintijdschema: 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 3
771± 60
9255± 720
93± 7
834± 65
2 g cellen in 10 ml, smalle falcon 15 mintijdschema: 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 3
2572± 2
30863± 24
309± 0,2
2781± 2
2 g cellen in 10 ml, smalle falcon 20 mintijdschema: 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 3
1071± 4
12847± 48
128± 0,5
1157± 5
2 g cellen in 10 ml, smalle falcon 15 mintijdschema: 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 5
2640± 142
31681± 1704
317± 17
2854± 154
5 g cellen in 25 ml, brede falcon 15 mintijdschema : 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 3
1375± 27
16498± 324
165± 3
1486± 29
5 g cellen in 25 ml, brede falcon 30 mintijdschema: 50% sonicatiefrequentie, intensiteit 3
1935± 51
23223± 612
232± 6
2092± 55
63
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Uit deze tabel blijkt dat 2 gram cellen opgelost in 10 ml 0,05 M acetaat buffer (pH 6) in een smalle
falcon het beste resultaat geeft als bij 50% sonicatiefrequentie en intensiteit 3 of 5 wordt gesoniceerd
gedurende 15 minuten in ijswater. Één sonicatie levert dan uiteindelijk 309 units per gram cellen op,
wat dus neerkomt op een totaal van 618 units per sonicatie.
3.1.3 Protease test op het enzymextract
Proteasen breken het gluten netwerk in deeg af en hebben dus een nadelig effect op de deegstructuur.
Indien proteasen in hoge concentratie aanwezig zijn in het enzymextract van Leuconostoc
pseudomesenteroides kunnen we dit extract niet als dusdanig gebruiken.
Voor het celextract lag de absorbantie (590 nm) onder de detectielimiet ( een absorbatie van 0,2 is
vereist) van de protease test. Dit betekent dat geen proteasen in het enzymextract aanwezig zijn.
3.1.4 Opzuivering van mannitol dehydrogenase
3.1.4.1 Inleiding
In een enzymextract van microbiële cellen zijn verscheidene onzuiverheden aanwezig die een effect
kunnen hebben op de co-enzymregeneratie of op de deegreologie. Hiervoor worden twee methodes
courant gebruikt, namelijk ethanol en ammoniumsulfaat precipitatie.
Bij dergelijke opzuiveringsmethodes wordt gestreeft naar een zo hoog mogelijke specifieke
enzymactiviteit in de geprecipiteerde of de oplosbare eiwitfractie. Dit is een maximale enzyme-
activiteit per gram eiwit. Hiervoor moet dus de hoeveelheid eiwit en de enzymactiviteit bepaald
worden. Het quotiënt van deze twee metingen geeft dan de specifieke enzymactiviteit.
Voor de ammoniumsulfaat precipitatie is nadien nog een dialyse noodzakelijk om het
ammoniumsulfaat te verwijderen.
3.1.4.2 Ethanol precipitatie
Figuur 3.1.5 geeft het resultaat weer van de ethanolprecipitatie. Hierbij werd de eiwitconcentratie en
de mannitol dehydrogenase activiteit bepaald voor elke concentratie toegevoegde ethanol op zowel de
oplosbare als geprecipiteerde fractie. De figuur toont aan dat vanaf een 60% ethanolconcentratie bijna
alle eiwit wordt neergeslaan maar dat bij deze concentratie geen activiteit meer terug te vinden is. Bij
de concentraties van 0 tot en met 40 % werd wel degelijk activiteit teruggevonden in de oplosbare
fractie maar werd er nauwelijks eiwit geprecipiteerd. Bijgevolg kon de specifieke activiteit niet
verhoogd worden. Deze methode is dus niet efficiënt om mannitol dehydrogenase op te zuiveren.
64
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Eiw itconcentratie
0
2
4
6
8
10
12
14
0 20 40 60 80Ethanolconcentratie (%)
Eiw
it (g
/l)MDH (U/l enzymoplossing)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 20 40 60 80Ethanolconcentratie (%)
MD
H (U
/l en
zym
opl.)
Specif ieke MDH-activiteit(U/g eiw it)
0
50
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80Ethanolconcentratie (%)
spec
. MD
H-a
ct. (
U/g
eiw
it)
precipitaat oplosbare fractie
Figuur 3.1.5 Zuivering van MDH door ethanolprecipitatie
3.1.4.3 Ammoniumsulfaat precipitatie
In de literatuur wordt ammoniumsulfaat precipitatie vaak beschreven als de eerste stap in het
opzuiveringsproces van MDH (Sakai, Shuzo et al., 1968b; Hahn et al., 2003). Figuur 3.1.6 toont het
resultaat van deze precipitatie. Een verzadigingsgraad van 60 % ammoniumsulfaat blijkt het efficiënst.
Het precipiteert het meeste eiwit bij de hoogste activiteit van MDH in oplossing.
specif ieke MDH-activiteit(U/g eiw it)
0200400600800
100012001400160018002000
0 20 40 60 80 100Ammoniumsulfaatconcentratie
(%)
spec
. MD
H-a
ct. (
U/g
eiw
it)
Eiw itconcentratie
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100Ammoniumsulfaatconcentratie
(%)
Eiw
it (g
/l)
MDH (U/l enzymoplossing)
0
10002000
3000
40005000
6000
70008000
9000
0 20 40 60 80 100Ammoniumsulfaatconcentratie
(%)
MD
H (
U/l
enzy
mop
l.)
precipitaat oplosbare fractie
Figuur 3.1.6 Zuivering van MDH door ammoniumsulfaatprecipitatie
Als eerste zuiveringsstap kan dus een precipitatie uitgevoerd worden met ammoniumsulfaat (60 %),
waarbij de oplosbare fractie behouden wordt. Om het zout te verwijderen kan een dialyse uitgevoerd
worden tegenover 0,05 M acetaatbuffer pH 6,0. De resultaten worden weergegeven in tabel 3.1.3.
65
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Tabel 3.1.2 Eerste opzuiveringsstappen van Leuconostoc pseudomesenteroides MDH
Stap Eiwitconcentratie(mg/l)
MDH(U/l enzymopl.)
Specifieke MDH(U/ g eiwit)
Ruw celextract (I) 1413 ± 60 3886 ± 180 2749 ± 170
Ammoniumsulfaat (II) 168 ± 4 3666 ± 108 7738 ± 238
Dialyse (III) 474 ± 4 2090 ± 224 4410 ± 475
Wat opvalt is dat na dialyse een hogere eiwitconcentratie wordt teruggevonden dan ervoor. Dit kan
verklaard worden door het feit dat ammoniumsulfaat interfereert met de Biuret-methode. Er treedt
immers minder kleurontwikkeling op in aanwezigheid van ammoniumsulfaat. Voor de berekening van
de specifieke MDH activiteit voor dialyse werd daarom de eiwitconcentratie van na de dialyse
gebruikt. Er wordt hierbij verondersteld dat tijdens de dialyse geen eiwit door de poriën van het
dialysemembraan kan.
Bij het bepalen van de MDH-activiteit blijkt dat na ammoniumsulfaat precipitatie ongeveer alle
enzymactiviteit wordt behouden. Tijdens de dialyse treedt echter een groot verlies op. Een eerste
verklaring hiervoor is dat de poriëngrootte van de membranen mogelijks te groot is. Een andere
verklaring is dat er mogelijks ionen uitspoelen die essentieel zijn voor de MDH-activiteit.
3.1.4.4 Natieve PAGE van het enzymextract
In figuur 3.1.8 wordt de natieve PAGE van het Leuconostoc pseudomesenteroides enzymextract
weergegeven, samen met de zymogrammen van MDH en NADH-oxidase. Hierbij valt op dat het ruwe
enzymextract een eiwitsmeer op de gel veroorzaakt, wat minder het geval is na opzuivering. Toch
blijken er nog heel wat eiwitmoleculen aanwezig te zijn na de eerste opzuiveringsstappen.
Afstand tot de kleinste standaard (cm) = 2,3651*ln (MW (kDa) - 9,7322
0
1
2
3
4
5
6
7
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7
ln (Moleculair gewicht (kDa))
Afs
tand
totd
e kl
eins
te s
tand
aard
(cm
)
Figuur 3.1.7 De regressiecurve van het logaritme van het moleculair gewicht van de standaardeiwitten enhun afstand tot de eerste standaard op de gel
66
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Aan de hand van de standaard kan van de verschillende enzymen het moleculair gewicht bepaald
worden (figuur 3.1.7). Dit gebeurt aan de hand van een logaritmische schaal waarbij het moleculair
gewicht telkens wordt uitgezet tegenover de afstand tot de laagste standaard in centimeter. Dit levert
vergelijking (3.1) op.
9,7322-(kDa))ln(MW2,3651(cm)standaardkleinstede tot Afstand (3.1)
Uit het mannitol dehydrogenase zymogram kan hiermee afgeleid worden (enkel accent) dat het
moleculair gewicht van dit enzym ongeveer 136 kDa is. Dit is in overeenstemming met een L.
pseudomesenteroides-MDH dat in de literatuur beschreven werd, nl. 137 kDa (Yamanaka, 1975). Het
MDH bandje is voor het opgezuiverd extract iets intenser omdat dit werd geconcentreerd met Amicon
Centricons (MWCO = 10.000 kDa).
Figuur 3.1.8 Coomassie kleuring, MDH en NADH-oxidase zymogram van Leuconostocpseudomesenteroides enzymextract. A: standaard eiwitmengsel; B: ongezuiverd enzymextract; C:geconcentreerd opgezuiverd enzymextract na dialyse; de enkele accenten duiden het MDH zymogramaan, de dubbele accenten het NADH-oxidase zymogram. (de gels werden digitaal samengezet in 1 figuur en de achtergrondkleuring werd hierbij weggewerkt ter verduidelijking van de verschillende eiwitbandjes)
Naast MDH werd ook een NADH-oxidase aangetroffen met een moleculair gewicht van ongeveer 101
kDa. Dit enzym werd reeds in de literatuur beschreven voor L. pseudomesenteroides (Koike et al.,
1985). Een overzicht van de eigenschappen wordt gegeven in tabel 3.1.4. Opmerkelijk voor dit enzym
is dat het noch reageert met waterstofperoxiden noch peroxiden vormt. Het eindproduct na reactie met
zuurstof is water.
67
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Tabel 3.1.3 Overzich van de eigenschappen van NADH-oxidase van L. pseudomesenteroides (Koike et al.,1985)
Eigenschap
Moleculair gewicht
Dimeer
Monomeer
104 kDa
53 kDa
Substraten O2, dichlorofenollindofenolen methyleen blauw
Km (NADH) 0,12 mM
pH-optimum 6,5
Temperatuursoptimum 35-45˚C
Inhibitoren
Niet-competitief
Competitief
Thiolen, quinacrine, quinine en Cu2+
Adenine, AMP, ADP en ATP
Interessant om op te merken is de toepassing van een NADH-oxidase van Lactobacillus brevis, een
naaste verwante van Leuconostoc pseudomesenteroides, voor co-enzym regeneratie (Geueke et al.,
2003; Hummel et al., 2003). Figuur 3.1.9 toont de toepassing van het enzym voor de synthese van
chirale alcoholen.
R1R2
OH
+ NAD+
R1R2
O
R1R2
OH
racemisch alcoholmengsel
keton
+ + NADH + H+
S-alcohol
R-specifiek ADH
NADH oxidase
1/2 O2H2O
Figuur 3.1.9 Schematische voorstelling van de NAD+ regeneratie bij de synthese van een S-alcohol uit een racemisch mengsel (Geueke et al., 2003)
3.1.4.5 Stabiliserende agentia
In de literatuur (Hahn et al., 2003) wordt beschreven dat een kleine hoeveelheid mercapto-ethanol of
DTT toegevoegd aan de gebruikte buffers, de S-bruggen in het mannitol dehydrogenase van L.
pseudomesenteroides kunnen stabiliseren. Figuur 3.1.10 toont het resultaat van de verschillende
thiolen die getest werden. Het is duidelijk dat er weinig effect merkbaar is als de incubatie gebeurt bij
0˚C. Bij 25˚C bleken L-cysteïne en gereduceerd glutathion de beste reducerende agentia. DTT en
mercaptoëthanol blijken eerder een nadelig effect te hebben op de enzymstabiliteit.
68
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
L-Cysteïne en gereduceerd glutathion worden beide gebruikt in de bakkerijsector als reducerend
agens. De combinatie van een co-enzymregeneratiesysteem in deeg met cysteïne of glutathion zou
eventueel de effectiviteit van de co-enzymregeneratie kunnen verbeteren.
Enzymstabiliteit bij 0ºC
0 1 2 3 4 5
Blanco
mercaptoethanol
glutathion
L-cysteine
DTT
MDH acitiviteit (A340/min)
48 uur24 uur6 uur3 uur2 uur1 uur0 uur
Enzymstabiliteit bij 25ºC
0 1 2 3 4 5
Blanco
mercaptoethanol
glutathion
L-cysteine
DTT
MDH activiteit (A340/min)
24 uur6 uur3 uur2 uur1 uur0 uur
Figuur 3.1.10 Effect van reducerende agentia op de stabiliteit van MDH bij 0 en 25ºC
3.1.5 Inhibitie van MDH met chelaterende stoffen
3.1.5.1 EDTA
In een inhibitie-experiment met EDTA moet in gedachte gehouden worden dat EDTA in drie
verschillende vormen bestaat, tetra-natrium (Na4EDTA), di-natrium (Na2EDTA) en de zure vorm
(EDTA). Wordt elk van deze toegevoegd aan een bepaalde buffer in een bepaalde concentratie dan
69
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
kunnen ze optreden als zuur of base, waardoor (in hoge concentratie) de pH van het reactiemengsel
kan veranderen.
Vanaf een concentratie lager dan 25 mM EDTA bleek er geen noemenswaardige pH verandering van
de gebruikte buffer meer op te treden. Figuur 3.1.10 toont het resultaat van de inhibitie met tetra-
natrium-EDTA. Concentraties van 5 mM EDTA en hoger brachten een volledige inactivatie teweeg.
00,10,20,30,40,50,60,70,8
0 10 20
concentratie EDTA (mM)
MD
H a
ctiv
iteit
(A34
0/m
in)
Figuur 3.1.11 Effect van EDTA op de mannitol dehydrogenase activiteit
Het effect van EDTA is te wijten aan de aanwezigheid van een metaalion als cofactor van het enzym.
Hahn et al. (2003) beschrijven dat dit metaalion zink is. In een reactivatie-experiment met
verschillende metaalionen (Zn2+, Mn2+, Mg2+ en Ca2+) werd gepoogd dit aan te tonen. Alle ionen
brachten echter een gelijkaardige reactivatie teweeg.
Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is het feit dat in het de literatuur beschreven experiment
een volledig opgezuiverd enzym werd gebruikt dat veel gevoeliger was voor EDTA inactivatie. Het
enzymextract dat in het inhibitie/reactivatie-experiment werd gebruikt, had slechts twee stappen van
een opzuiveringsproces doorlopen, nl. ammoniumsulfaat precipitatie en dialyse. Mogelijks zijn er
interfererende componenten aanwezig in het extract.
Het resultaat van een reactivatie-experiment kan in twijfel worden getrokken. In dergelijk experiment
staan twee chelatoren, nl. het enzym en de inhibitor, in competitie voor de cofactor. Het enzym is vaak
zeer selectief als chelator en kan hierdoor slechts zijn cofactor en zeer sterk verwante ionen chelateren
(bijvoorbeeld calcium en magnesium). EDTA daarentegen is weinig selectief en chelateert alle
bivalente ionen. Wordt een ion in overmaat aan een EDTA-enzym mengsel toegevoegd waarvoor het
enzym geen affiniteit heeft maar EDTA wel dan zal de cofactor vrijkomen uit het EDTA-complex.
Hierdoor kan het enzym gereactiveerd worden. Er zal dus verkeerdelijk besloten worden dat het
toegevoegde ion de noodzakelijke cofactor is (figuur 3.1.12).
Een andere methode die wordt toegepast om metaalionen als cofactor te bepalen is atoom absorptie
spectrometrie (Twu et al., 1977). Hiervoor is echter een volledig opgezuiverd enzym nodig omdat in
70
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
ruwe enzymextracten vele verschillende ionen aanwezig zijn. Indien de ionconcentratie wordt gevolgd
tijdens het opzuiveringsproces dan zal een bepaald ion geconcentreerd worden, de andere ionen
verdund.
Enzym-C2+ + EDTA
Enzym (inactief) + EDTA-C2+
+M2+
M2+ = C2+ M2+ ? C2+
Reactivatie Kan het enzym M2+ chelateren ?
Ja Nee
Geen reactivatie Reactivatie mogelijk de cofactor komt vrij
uit het EDTA-complex
M2+: toegevoegd metaal-ionC2+: cofactor van het enzym
Figuur 3.1.12 overzicht van de mogelijke effecten van een bivalent metaalion op de reactivatie van eenenzym, geïnhibeerd door EDTA
3.1.5.2 Pyrofosfaat
Pyrofosfaat is een inhibitor van het nucleotide pyrofosfatase in bloem (§ 3.3.5.4). Gezien pyrofosfaat
een potent chelator is werd het effect uitgetest op MDH. Figuur 3.1.13 geeft de resultaten die
verschillende concentraties pyrofosfaat opleveren. Al vanaf een concentratie van 0,3 mM werd
inhibitie van mannitol dehydrogenase waargenomen.
0
20
40
60
80
100
120
0 0,3 3 7,5 15 30
concentratie pyrofosfaat (mM)
% M
DH a
ctivi
teit t
egen
over
de
blanc
o
Figuur 3.1.13 Overzicht van de inhibitie van MDH door pyrofosfaat
71
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
3.1.6 Gluconobacter mannitol dehydrogenase
Gluconobacter oxydans LMG 1489 celextract kan ook gebruikt worden als enzymbron voor mannitol
dehydrogenase. In de literatuur worden voor Gluconobacter oxydans twee enzymen vermeld die in
staat zijn fructose te reduceren, een NAD+-afhankelijk MDH (D-fructose D-mannitol) en een
NAD+-afhankelijk SDH (sorbitol dehydrogenase, D-fructose D-sorbitol) (Adachi et al., 1999a;
Adachi et al., 1999b). Beide enzymen worden vergeleken in tabel 3.1.5. Het gaat dus om twee
enzymen, gezien de moleculaire gewichten en Km-waarden verschillen voor beide enzymen. Wel
moet opgemerkt worden dat het NAD-SDH afkomstig was van Gluconobacter suboxydans IFO 3257
(= LMG 1489), terwijl het NAD-MDH afkomstig was van Gluconobacter suboxydans IFO 12528. Er
wordt dus niet vermeld dat de twee enzymen voorkomen bij dezelfde stam.
Tabel 3.1.4 Vergelijking van de eigenschappen van Gluconobacter MDH en SDH (Adachi et al., 1999a;Adachi et al., 1999b).
NAD-MDH NAD-SDH
Moleculair gewicht 130 kDa 98 kDa
Subunit nb 26kDa
Aantal subunits nb 4
Substraat D-mannitol
D-fructose
D-sorbitol
D-fructose
Km voor
D-mannitol 20 mM -
D-sorbitol - 5 mM
D-fructose 33 mM 20 mM
NAD+ 2.5. 10-4 M 2.1.10-4 M
NADH 1.0.10-5 M 2.8.10-4 M
Optimum pH
D-mannitol 9.0 -
D-sorbitol - 9.0-11.0
D-fructose 6.0 5.0-6.0
Thermostabiliteitsexperimenten toonden aan dat na een verhitting van 10 minuten bij 50˚C de D-
sorbitol oxidatie niet meer doorging, terwijl de D-mannitol wel nog plaatsvond. Tabel 3.1.6 geeft de
halfwaardetijden van de reacties en dus ven de verschillende enzymen (De Wolf, 2002; Mortier,
2002). Daarnaast bleek uit gekoppelde enzymreacties met het ruwe enzymextract dat zowel mannitol
als sorbitol werden geproduceerd uit fructose. Dit werd bevestigd door optimalisatieproeven van de
enzymproductie van Gluconobacter. Hierbij werden verschillende verhoudingen sorbitol/mannitol
concentraties teruggevonden naargelang de mediumsamenstelling (Mortier, 2002). Een natieve PAGE
moet uitsluitsel geven of er twee enzymen actief zijn in het enzymextract of slechts 1.
72
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Tabel 3.1.5 Halfwaardetijd (min) van het Gluconobacter MDH en SDH bij 40°C en 50°C (Mortier, 2002).
ReactieT (°C)
D-fructose reductie D-mannitol oxidatie D-sorbitol oxidatie
40 16.7 34.5 3.6
50 1.45 3.1 0.9
In eerste instantie werd getest of de NBT-test geschikt was voor de bepaling van de sorbitol en
mannitol dehydrogenase activiteit op gel. De resultaten worden weergegeven in figuur 3.1.14. Uit deze
figuur blijkt dat de NBT-test geschikt is om de enzymactiviteit te meten, de NBT-test is echter minder
gevoelig dan de klassieke test (NAD+-test).
Mannitol dehydrogenase
00,020,040,060,08
0 0,5 1 1,5 2
Tijd (min)
A (3
40 n
m)
00,020,040,060,08
A (5
70 n
m)
NADH-test NBT-test
Sorbitol dehydrogenase
00,050,1
0,150,2
0,25
0 0,5 1 1,5 2
Tijd (min)
A (3
40 n
m)
00,050,10,150,20,25
A (5
70 n
m)
NADH-test NBT-test
Figuur 3.1.14 Vergelijking klassieke test en NBT-test voor de bepaling van MDH en SDH activiteit.
Figuur 3.1.15 geeft de resultaten van de gelelektroforese weer. Hierbij werd een standaard (A) samen
met enzymextract (B), 10 maal verdund enzymextract (C) en 10 maal verdund enzymextract met 10
minuten voorbehandeling bij 50˚C (D) gescheiden op gel en gekleurd door middel van een coomassie
kleuring. Door middel van de standaard kan een vergelijking opgesteld worden die de afstand van een
eiwitbandje tot de laagste standaard uitdrukt in functie van het moleculair gewicht (vergelijking (3.2)).
9,5869-(kDa))ln(MW2,3512(cm)standaardkleinstede tot Afstand (3.2)
Het is duidelijk dat het onverdunde enzymextract door de hoge eiwitconcentratie een troebel beeld
geeft. De verdunningen geven duidelijkere gescheiden eiwitbandjes weer.
Naast deze kleuring werd op gelijkaardige gels een zymogram van D-mannitol dehydrogenase (enkele
accenten) en D-sorbitol dehydrogenase opgesteld (dubbele accenten). Ook hier blijkt dat het
onverdunde extract een te hoge concentratie aan eiwit bevat om een goede scheiding te bekomen. Het
verdunde en het verhitte extract geven duidelijkere resultaten. Beide zymogrammen verschillen echter
niet. Beide geven bij het onverhit, verdunde enzymextract een bandje op 140 kDa en 83 kDa, en geven
slechts 1 bandje bij 140 kDa na verhitting. De activiteit van het lichtste enzym verdwijnt dus na de
hittebehandeling. Er werd echter verwacht dat de sorbitol activiteit zou verdwijnen na de
hittebehandeling, gezien de halfwaardetijden die weergegeven zijn in tabel 3.1.6. Een beter afgelijnde
temperatuursbehandeling zal hier noodzakelijk zijn om de SDH activiteit op de gel uit te schakelen.
73
ENZYMPRODUCTIE RESULTATEN EN BESPREKING
Uit de PAGE resultaten blijkt dat er wel degelijk twee enzymen aanwezig zijn, nl. met moleculair
gewicht 140 kDa en 83 kDa, en dat beide zowel sorbitol als mannitol als substraat hebben. Een andere
mogelijkheid is dat het bandje met het laagste moleculair gewicht in feite afkomstig is van een nog
actieve subunit van het bandje met het grootste moleculair gewicht. Dit zou eventueel de grotere
thermolabiliteit kunnen verklaren. Deze hypothese zou kunnen getest worden aan de hand van de
sequentie-bepaling van beide eiwitten. Hierbij zal de sequentie van het lichtste eiwit een deel zijn van
de sequentie van het zwaarste.
Figuur 3.1.15 Gelelektroforese van G. oxydans. A: de standaard eiwit reeks; B: onverdund enzymextract;C: 10 maal verdund enzym extract; D: 10 maal verdund enzymextract 10 minuten bij 50˚Cvoorgeïncubeerd. De enkele accenten duiden het D-sorbitol zymogram aan, de dubbele accenten het D-mannitol zymogram. (De foto’s werden digitaal naast elkaar gezet en de achtergrond werd digitaalweggewerkt ter verduidelijking van het resultaat)
74
ALCOHOL DEHYDROGENASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.2 Bloem alcohol dehydrogenase
3.2.1 Inleiding
In verschillende leden van de Triticum familie komt alcohol dehydrogenase (E.C. 1.1.1.1) voor, net als
in Triticum aestivum (Langston et al., 1979; Langston et al., 1980). Dit enzym vormt een belangrijke
schakel in het co-enzym regeneratiesysteem in deeg. In een deeg wordt immers, door gist, uit suikers
en zetmeel alcohol, ethanol, gevormd. Dit alcohol wordt door het alcohol dehydrogenase omgezet tot
acetaldehyde. Hierbij wordt NAD+ gereduceerd tot NADH, een co-enzym voor het eerder beschreven
mannitol dehydrogenase.
3.2.2 Temperatuursoptimum
Figuur 3.2.1 toont de activiteit van het enzym bij verschillende temperaturen. Hierbij moet in acht
genomen worden dat vanaf 60°C de meting slechts 2 minuten duurde in plaats van 3 omdat vanaf deze
temperatuur na 2 minuten het enzym werd geïnactiveerd. De activiteit is het sterkst bij 60°C, maar
hierbij treedt dan ook snel inactivatie op. Bij 30°C en 40°C vertoont het enzym een gelijkaardige
activiteit.
Temperatuursoptimum
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
30 40 50 60 70 80 90
temperatuur (°C)
activ
iteit
(A34
0/m
in)
Figuur 3.2.1 Bepaling van de activiteit van ADH bij verschillende temperaturen over een zekere tijd
3.2.3 Thermostabiliteit
Zoals eerder opgemerkt treedt vanaf 60°C al na 2 minuten inactivatie op. Dit wordt aan de hand van
dit experiment nogmaals bevestigd. ADH is helemaal niet stabiel bij hogere temperaturen (figuur
3.2.2).
Een derde van de activiteit is al verloren bij een 50°C voorincubatie en vanaf 60°C is de activiteit bijna
volledig verdwenen. Voorincubaties van bloem bij deze temperaturen zullen dus het effect van dit
enzym uitschakelen.
Dit resultaat is een interessant gegeven indien meer thermostabiele enzymen in bloem bestudeerd
moeten worden en de interferrentie van ADH moet worden uitgeschakeld.
75
ALCOHOL DEHYDROGENASE RESULTATEN EN BESPREKING
Thermostabiliteit van ADH
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
30 40 50 60 70temperatuur (°C)
activ
iteit
(A34
0/m
in)
Figuur 3.2.2 Bepaling van de activiteit van ADH na voorincubatie bij verschillende temperaturen. De eigenlijke meting gebeurde hier bij 25˚C
3.2.4 Inhibitie door EDTA
De resultaten voor EDTA inhibitie worden weergegeven in figuur 3.2.3. Het meest significante
activiteitsverlies wordt bereikt tussen 10 en 20 mM EDTA, namelijk 50%. Vanaf een concentratie van
70mM valt de activiteit op 5% van de blanco. ADH heeft dus een ion nodig voor optimale werking.
Procentuele activiteit van ADH in functie vande EDTA concentratie
0102030405060708090
100
0 20 40 60 80 100
concentratie EDTA (mM)
% a
ctiv
iteit
tov
blan
co.
Figuur 3.2.3 Het procentueel verloop van de ADH-activiteit in functie van de concentratie toegevoegdeEDTA
3.2.5 Inhibitie door pyrofosfaat
Figuur 3.2.4 toont het resultaat van dit experiment. Hieruit kan afgeleid worden dat tot 10 mM
pyrofosfaat weinig effect heeft (30% inhibitie). Vanaf 25 mM treedt er beduidend meer inhibitie op
van ADH, vanaf deze concentratie vertoont ADH slechts 15% van zijn oorspronkelijke activiteit.
Uit deze resultaten blijkt dus dat, als alcohol dehydrogenase behouden moet worden, een pyrofosfaat
concentratie van 10 mM niet mag overschreden worden.
76
ALCOHOL DEHYDROGENASE RESULTATEN EN BESPREKING
Procentuele ADH activiteit in functievan de pyrofosfaat concentratie
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100concentratie pyrofosfaat (mM)
% A
DH a
ctiv
iteit
tov
debl
anco
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Figuur 3.2.4 De procentuele activiteit van ADH in functie van de pyrofosfaat concentratie.
3.2.6 Natieve PAGE
Drie eiwitpreparaten werden door middel van gelelektroforese gescheiden (figuur 3.2.5) en gekleurd
door middel van een coomassie kleuring: een standaard, bloemextract en geconcentreerd bloemextract
(Amicon Centricons MWCO = 10.000 kDa). De standaard levert een standaarcurve op gegeven door
vergelijking (3.3).
9,4973-(kDa))ln(MW2,3366(cm)standaardkleinstede tot Afstand (3.3)
Samen met het zymogram van ADH, gegeven in figuur 3.2.5, kan het moleculair gewicht bepaald
worden, nl. 106 kDa. De in de literatuur beschreven aanverwanten van Triticum aestivum bezitten
alcohol dehydrogenasen met gelijkaardige moleculaire gewichten. Zowel Triticum monococcum als
Triticum turgidum bezitten een ADH van 116 kDa (Langston et al., 1979; Langston et al., 1980).
Figuur 3.2.5 Gelelektroforese van bloemextract. A: de standaard eiwit reeks; B: bloemextract; C:geconcentreerd bloemextract; D: zymogram van ADH (De foto’s werden digitaal naast elkaar gezet en de achtergrond werd digitaal weggewerkt ter verduidelijking van het resultaat)
77
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.3 Nucleotide pyrofosfatase en NADH-oxidase
3.3.1 Inleiding
Dit hoofdstuk spitst zich toe op de identificatie en karakterisatie van twee enzymen, nl. nucleotide
pyrofosfatase en NADH-oxidase. Hun activiteit werd tijdens de in vitro-experimenten (hoofdstuk 3.5)
vastgesteld, enerzijds door co-enzymafbraak en anderzijds door oxidatie van NADH tot NAD+ zonder
toevoegen van een substraat. In eerste instantie werden alle mogelijke afbraakproducten van de co-
enzymen bepaald aan de hand van de literatuur (hoofdstuk 1.3). Hieruit werd afgeleid dat een
nucleotide pyrofosfatase verantwoordelijk is voor afbraak. Het NADH-oxidase werd aangetoond en
uitgeschakeld door de incubaties anaëroob te laten verlopen.
De experimenten in dit hoofdstuk werden hoofdzakelijk uitgevoerd met een HPLC, zoals beschreven
in hoofdstuk 2.2. Vanaf een zeker ogenblik werd overgeschakeld naar een ‘on-line’ HPLC-analyse-
methode. Dit volgde uit het feit dat tijdens de experimenten werd opgemerkt dat afbraak- en
omzettingsreacties bleven doorgaan in de gekoelde autosampler. Deze omschakeling wordt – om de
overzichtelijkheid te bewaren – in hoofdstuk 3.4 besproken.
3.3.2 Identificatie van de afbraakproducten
Tijdens de experimenten van co-enzymen met bloemextract werd opgemerkt dat de co-enzymen
afgebroken werden. Op het chromatogram verschenen bij afbraak twee nieuwe pieken. Zoals in de
literatuurstudie werd aangegeven kunnen NAD+ en NADH op verschillende manieren worden
gehydrolyseerd. De retentietijden van de verschillende mogelijke afbraakproducten werden daarom
bepaald (tabel 3.3.1). Vergelijken we deze tijden met de retentietijden die de afbraakproducten
opleveren, nl. 2.247-2.261 min. en 3.247 min, dan kunnen we concluderen dat nicotinamide
mononucleotide (NMN) en adenosine monofosfaat (AMP) de afbraakproducten zijn. Deze vorm van
afbraak is typisch voor een nucleotide pyrofosfatase.
Tabel 3.3.1 Retentietijden van verschillende afbraakproducten en analogen
Component Retentietijd (min.)
NZM 2.218
NMN 2.230
ADP 2.971
AMP 3.241
ADP-ribose 3.440
NZ 3.684
NZD 4.060
Adenine 6.966
Nicotinamide 7.498
78
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Ter bevestiging van dit resultaat werden twee extra chromatografische experimenten uitgevoerd. Het
eerste experiment houdt een piekverhoging in van de afbraakpiek door additie van AMP of NMN. Het
resultaat van deze proef wordt weergegeven in figuur 3.3.1. Hierbij is het blauwe chromatogram het
afbraakprofiel van NAD+ (A) of NADH (B). Het rode en het groene chromatogram geven de
piekverhogingen weer bij addittie van respectievelijk AMP en NMN. Het is duidelijk dat de pieken
van de afbraakproducten samenvallen met AMP en NMN.
Een tweede bevestiging werd bekomen door een alternatieve chromatografische methode, namelijk
gradiënt elutie (§ 2.2.1.1), toe te passen op het voorgaande principe. De retentietijden voor de
verschillende componenten worden weergegeven in tabel 3.3.2, het resultaat is weergegeven in figuur
3.3.2. Ook hier namen, door standaardadditie van AMP (rode chromatogrammen) of NMN (groene
chromatogrammen), de oppervlaktes van de afbraakpieken toe.
Tabel 3.3.2 Retentietijden met aangepaste HPLC-methode
Component Retentietijd (min)
NMN 1.5
NAD 6.8
AMP 8.7
NADP 9.5
NADH 13.9
NADPH 17.0
Bij deze chromatogrammen moeten enkele opmerkingen gemaakt worden. Het chromatogram van de
NADH afbraak vertoont geen piek voor NADH maar wel voor NAD+. Hier speelt dus nog een ander
enzym een rol dat NADH kan omzetten naar NAD+. De aangewende incubatietijd van het co-
enzym/bloemextract mengsel blijkt hierbij te voldoen om een volledige omzetting te bewerkstelligen.
Een tweede bemerking is het feit dat een afbraakproduct van NADH, nl. NMNH, niet onmiddelijk
wordt teruggevonden in de chromatogrammen. De retentietijd van NMNH kon immers niet bepaald
worden aan de hand van een standaard omdat deze niet commercieel beschikbaar is.
Het is dus mogelijk dat de afbraak van NADH afhankelijk is van de omzetting naar NAD+, wat wel
afgebroken wordt. Om dit te bevestigen zullen de afbraakproducten aan de hand van externe
standaarden gekwantificeerd moeten worden. In tweede instantie kan gepoogd worden het enzym dat
verantwoordelijk voor de omzetting van NADH naar NAD+ uit te schakelen. Hiervoor is er echter een
goede kennis nodig van de karakteristieken van dit enzym.
79
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
Minutes
5
10
20
30
40
50
60
70
mVolts
NM N AMP
NAD
NADNAD + AMPNAD + NMN
WI:4 WI:8 WI:16
A
Figuur 3.3.1 Identificatie van de afbraakproducten van NAD (A) en NADH (B). Blauwe chromatrogram:het afbraakprofiel van NAD+ en NADH; Rood chromatogram: standaardadditie van AMP; Groen chromatogram: standaardadditie van NMN
B
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
Minutes
4
10
20
30
40
50
60
70
mVolts
NMNAMP
NAD
NADH
NADH + NMN
WI:16 WI:32
NADH + AMP
80
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
5 10 15 20
Minutes
5
10
20
30
40
50
60
70
80mVolts NAD
NAD ++ AMPNAD + NMN
NMN
NAD
AMP
A
5 10 15 20
Minutes
4
10
20
30
40
50
60
70
80
mVolts
NMN 6
NAD
AMP
\NADHNADH + AMPNADH + NMN
:
B
Figuur 3.3.2 Identificatie van de afbraakproducten van NAD+ (A) en NADH (B) met de aangepaste HPLC-methode. Blauwe chromatrogram: het afbraakprofiel van NAD+ en NADH; Rood chromatogram: standaardadditie van AMP; Groen chromatogram: standaardadditie van NMN
81
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.3.3 Kwantificering van de afbraakproducten
Aan de hand van standaardoplossingen van NMN en AMP werd de concentratie van de
afbraakproducten berekend. Op die manier werd vastgesteld dat de concentraties van NMN en AMP
gelijklopend toenemen. Gezien de piekoppervlakte voor de NMN-piek (2.2 min) steeds kleiner is dan
voor de AMP-piek (3.2 min), betekent dit dat de UV-respons voor NMN kleiner is dan voor AMP.
De resultaten worden weergegeven in figuur 3.3.3. Uit deze figuur kan afgeleid worden dat NAD
afgebroken wordt tot NMN en AMP. Hierbij nemen de concentraties van de afbraakproducten
gelijklopend toe naarmate de afbraak van NAD+ verder doorgaat.
Afbraakprofiel van NAD door NPP inbloem
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NMN AMP
NADH omzetting tot NAD en afbraak totNMN en AMP
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NADH NMN AMP
Figuur 3.3.3 Kwantificering van de afbraakproducten van NAD(H)
Voor NADH werd vastgesteld dat in het begin de AMP-concentratie hoger was dan de NMN-
concentratie. Mogelijks wordt een deel NADH afgebroken tot NMNH en AMP, waarna NMNH
geoxideerd wordt tot NMN. Een ander deel NADH wordt waarschijnlijk omgezet tot NAD+, dat
nadien afgebroken wordt tot AMP en NMN. Vanaf het moment dat er geen NADH meer aanwezig is,
nemen de AMP- en NMN-concentraties bovendien gelijkmatig toe.
Figuur 3.3.4 toont een overzicht van alle mogelijke reacties die hierboven beschreven werden.
NAD+
NAD+-afbraak
NMN + AMP
NADH-afbraak
NADH NMNH + AMP
NAD+NMN + AMP
Figuur 3.3.4 Overzicht van de NAD+ -afbraak en NADH omzettingen en afbraak
82
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.3.4 Identificatie van het enzym
3.3.4.1 Commerciële (nucleotide pyro-)fosfatasen
In § 3.3.2 en de literatuurstudie omtrent NPP werd geopperd dat een nucleotide pyrofosfatase
verantwoordlijk is voor de afbraak van de co-enzymen. Om dit te bevestigen werd van twee
commerciële enzymen het afbraakpatroon bepaald. Deze waren een zuur fosfatase uit tarwe en een
nucleotide pyrofosfatase uit het gif van een ratelslang. Beide vertonen een karakteristieke afbraak
(figuur 3.3.5).
NAD afbraak door commercieel NPP
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NMN AMP
NADH afbraak door commercieel NPP
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NADH NMN AMP
NAD afbraak door zuur fosfatase
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NMN AMP
NADH afbraak door zuur fosfatase
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NADH NMN AMP
Figuur 3.3.5 De co-enzymafbraakpatronen van twee commerciële fosfatasen
Het NPP van de slang is zo krachtig dat het ogenblikkelijk alle co-enzymmoleculen afbreekt. Het is
echter niet in staat om de afbraakproducten verder af te breken zoals het zure fosfatase van tarwe. Dit
enzym breekt ook meteen alle co-enzymen af maar splist dan ook nog eens de fosfaatgroepen af. De
eerste afbraakstap door het zure fosfatase preparaat kan evenwel in twijfel worden getrokken gezien de
zuiverheidsgraad van enzympreparaten onzeker zijn. Bij incubatie van NAD(H) met bloemextract
83
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
daalde de concentratie van AMP en NMN geen enkele keer bij de kwantificering van de
afbraakproducten (§ 3.3.2). Indien, voor een bepaald staal, de som van de resterende concentratie co-
enzym en de concentratie van een van de afbraakproducten wordt gemaakt, wordt telkens de initiële
concentratie bekomen. In het bloemextract blijkt verdere afbraak dus niet op te treden.
3.3.4.2 Bepalen van fosfatase activiteit in bloem
Zure fosfatasen komen voor in tarwe, ze zijn immers te verkrijgen in de handel en werden veelvuldig
in de literatuur beschreven (Joyce et al., 1960; Akiyama et al., 1986; Waymack et al., 1991). In de
vorige paragraaf werd ook aangetoond dat de mogelijkheid bestaat dat deze fosfatasen ook co-
enzymen afbreken. Er is dus een methode nodig om dit enzym uit te schakelen en zo een onderscheid
te maken tussen het zure fosfatase en een mogelijk aanwezig nucleotide pyrofosfatase. De pH is
hiervoor een uitgelezen parameter om te variëren gezien het pH-optimum van dit type enzym varieert
tussen pH4 en 5 (Joyce et al., 1960).
Om dit uit te testen werd de p-nitrofenolfosfaat test uitgevoerd. Tabel 3.3.3 geeft het resultaat weer
van deze test. Hieruit blijkt dat enkel een zuur fosfatase in het bloemextract aanwezig is en werkzaam
bij een pH van 4, bij pH 6 is vertoont het nauwelijks activiteit. De pH van 5.5, waarbij de
verschillende afbraakprofielen van de co-enzymen werden bepaald, is dus hoog genoeg om het
nucleotide pyrofosfatase van het zure fosfatase te differentiëren.
Tabel 3.3.3 Standaardcurven en concentraties (C) gevormde p-nitrofenol bij verschillende pH’s
pH Standaardcurve Concentratie p-nitrofenol (µg/ml)
2 Abs (400nm) = 0,1294 x C (µg/ml) 2,59 ± 0,03
4 Abs (400nm) = 0,1310 x C (µg/ml) 39,35 ± 0,15
6 Abs (400nm) = 0,1394 x C (µg/ml) 1,862 ± 0,002
8 Abs (400nm) = 0,1325 x C (µg/ml) 1,020 ± 0,001
10 Abs (400nm) = 0,1435 x C (µg/ml) 1,209 ± 0,002
3.3.4.3 Natieve PAGE
Thymidine-5’-p-nitrofenylfosfaat (5’-pNPT) als substraat voor NPP
Nucleotide pyrofosfatase splitst 5’-pNPT in p-nitrofenol en thymidine-5’-fosfaat. De p-nitrofenol-
vorming kan bij een golflengte van 400 nm (geel) gemeten worden. Een standaardcurve bij de
gebruikte pH van p-nitrofenol wordt weergegeven door vergelijking (3.4).
0,0032C(mM)26,685eAbsorbanti (3.4)
De omzetting van 5’-pNPT per minuut in bloemextract wordt gegeven door de helling van de
vergelijkingen (3.5) en (3.6).
84
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
0,0201t(min)0,2753eAbsorbanti (3.5)
0,0177t(min)0,2760eAbsorbanti (3.6)
Omgerekend naar aantal units per liter bloemextract geeft dit een activiteit van (20,90 ± 0,04) U/l.
Dit bewijst dat in het bloemextract een enzym aanwezig is, verschillend van een zuur fosfatase
(incubatie bij pH 8,5), dat 5’-pNPT afbreekt. Daarnaast levert dit een perfecte molecule aan voor
gelelektroforese en dus de bepaling van het moleculair gewicht van de molecule. p-nitrofenol kleurt
immers geel op gel.
Nucleotide pyrofosfatase
Op de gel werden drie verschillende eiwitpreparaten, naast een standaardmengsel, gescheiden (figuur
3.2.5) en gekleurd door middel van een coomassie kleuring: bloemextract, geconcentreerd
bloemextract (Amicon Centricons MWCO = 10.000 kDa) en bloemextract dat 10 minuten bij 80ºC
werd verhit. De standaard levert een standaarcurve op gegeven door vergelijking (3.7).
8,882-(kDa))ln(MW2,1792(cm)standaardkleinstede tot Afstand (3.7)
Figuur 3.3.6 Gelelektroforese van bloemextract. A: de standaard eiwit reeks; B: bloemextract; C:geconcentreerd bloemextract; D: bloemextract dat 10 minuten bij 80ºC werd voorbehandeld; De accenten geven de zymogrammen aan van NPP. (De foto’s werden digitaal naast elkaar gezet en de achtergrond werd digitaal weggewerkt ter verduidelijking van het resultaat)
De zymogrammen, ontwikkeld met een overlaygel, geven gele spots. Samen met de standaard geven
deze een moleculair gewicht van ongeveer 100 kDa aan voor het nucleotide pyrofosfatase. Dit is veel
zwaarder dan de moleculaire gewichten van de zure fosfatasen beschreven in de literatuur, 58 en 60
85
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
kDa (Waymack et al., 1991), maar leunt dicht aan bij enkele Nudix-hydrolasen. De monomeren van S.
cerevisiae en menselijk NADH-hydrolasen wegen respectievelijk 43,5 en 52 kDa (Xu, WL et al.,
2000; Abdelbraheim et al., 2003). Het is dus mogelijk dat dit een NADH-hydrolase van de Nudix
familie is.
Merk op dat een voorbehandeling van 10 minuten bij 80ºC de activiteit van het enzym volledig
uitschakelt.
NADH-oxidase
Naast een nucleotide pyrofosfatase blijkt nog een tweede enzym in het bloemextract aanwezig die
interferreert met de bepalingen van de NPP activiteit op NADH. Dit enzym blijkt werkzaam zonder
additie van een extra substraat. Dit is echter schijn, zuurstof kan immers ook als substraat fungeren,
namelijk voor een NADH-oxidase (cfr. L. pseudomesenteroides).
Figuur 3.3.7 Gelelektroforese van bloemextract. A: de standaard eiwit reeks; B: bloemextract; C:geconcentreerd bloemextract; de accenten geven het zymogram van NADH-oxidase aan (De foto’s werden digitaal naast elkaar gezet en de achtergrond werd digitaal weggewerkt ter verduidelijking van het resultaat)
Via Natieve PAGE werd dit enzym aangetoond. Hierbij werden naast een standaard, het bloemextract
in geconcentreerde en ongeconcentreerde vorm gescheiden en gekleurd (figuur 3.3.7). De
standaardreeks levert een curve op gegeven door vergelijking (3.8).
9,4973-(kDa))ln(MW2,3366(cm)standaardkleinstede tot Afstand (3.8)
Hieruit volgt dat het moleculair gewicht van het NADH-oxidase in tarwe ongeveer 120 kDa is.
86
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Interessant om op te merken is dat dit enzym op eenvoudige wijze kan worden geïnhibeerd, namelijk
door het substraat, zuurstof, weg te nemen. De experimenten met betrekking tot de activiteit van NPP
op NADH gebeuren dus best onder anaërobe condities.
3.3.5 Screening naar inhibitoren van nucleotide pyrofosfatase
3.3.5.1 Eerste selectie
Zoals in de literatuurstudie aangegeven, werden reeds heel wat inhibitoren van nucleotide
pyrofosfatases beschreven. Hieronder vallen chelatoren, reducerende agentia en afbraakproducten met
hun analogen. Figuur 3.3.8 geeft een overzicht van de eerste screening van deze inhibitoren.
Relatieve NAD afbraak bij verschillende potentiëleinhibitoren.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
rela
tieve
NA
D c
once
ntra
tie(%
)
Blanco 500µM AMP10mM NA 10mM EDTA4mM DTT 4mM L-cysteïne16mM Mercaptoethanol 1mM ADP
Figuur 3.3.8 Een eerste screening naar inhibitoren. De NAD+-concentratie werd op relatieve basis uitgezettegenover de incubatietijd, dit betekent dat de eerst gemeten concentratie (t = 0 minuten) als 100% werd genomen
Het eerste wat opvalt is de sterke inhibitie van het enzym door EDTA, wat betekent dat het enzym een
metaalion nodig heeft als cofactor. Nicotinamide (NA), mecapto-ethanol en AMP hebben helemaal
geen effect in de geteste concentratie. AMP is nochtans een afbraakproduct dus zou productinhibitie
verwacht kunnen worden. Waarschijnlijk is de gebruikte concentratie hier te laag om enig effect waar
te nemen. ADP is wel een – weliswaar een zwakke – inhibitor van het NPP. Deze molecule werd reeds
door Wise et al. (1997) beschreven als inhibitorisch samen met AMP en adenine in een reeks van
inhibitorische kracht : ADP > AMP > adenine. Er zal dus minstens een zo hoge AMP-concentratie als
die van ADP toegevoegd moeten worden om inhibitie waar te nemen.
De reducerende agentia L-cysteïne en DTT hebben een gelijkaardig effect als ADP. Hun inhibitorisch
effect wordt in de literatuur echter toegeschreven aan hun chelaterende eigenschappen en niet aan hun
reducerend vermogen (Haroz et al., 1972).
87
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Twu et al. (1979) beschrijft dat de chelatoren en reducerende agentia een verbeterd effect vertonen na
een voorincubatie van 1 uur. Figuur 3.3.9 toont het resultaat van zo een voorincubatie met
verschillende inhibitoren.
Relatieve NAD afbraak bij verschillendeinhibitoren na 1 uur voorincubatie.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
relat
ieve
NAD
conc
entra
tie (%
)
blanco 4mM DTT4mM L-cystëine 10mM EDTA16mM Mercaptoethanol
Figuur 3.3.9 Een eerste screening naar inhibitoren: 1 uur voorincubatie van het bloemextract met de inhibitor
Voor EDTA had deze behandeling weinig effect gezien er reeds volledige inhibitie optrad zonder
voorincubatie. De NAD+-afbraakcurves van DTT, L-cysteïne en mercaptoethanol verschillen
significant van deze in figuur 3.3.8. Daar waar er tot 60% afbraak was voor L-cysteïne zonder
voorincubatie, treedt nu slechts 25% afbraak meer op. Mercaptoethanol en DTT vertonen gelijkaardige
evoluties.
3.3.5.2 EDTA: verschillende concentraties, synergisme met glycine en reactivatie
EDTA concentraties
10 mM EDTA blijkt voldoende metaalionen te complexen om NPP te inhiberen. De Europese
wetgeving laat het gebruik van EDTA in deegwaren niet toe (cfr. § 1.3.6), de FDA laat 240 ppm toe in
levensmiddelen. Indien rekening gehouden wordt met de samenstelling van deeg (100g bloem, 56g
water en 3 g gist) en de concentratie van bloem in het incubatie-experiment is slechts een concentratie
van 102 M toegestaan in het testmengsel.
In figuur 3.3.10 wordt de afbraak weergegeven van NAD+ bij de, door de FDA, maximaal toegelaten
concentratie 102 M en bij 5 en 3 M, gebruikt in een studie van rattenlever nucleotide pyrofosfatase
(Lopez-Gomez et al., 1998). Hieruit blijkt dat deze lage concentraties helemaal geen inhibitie van het
enzym veroorzaken, hoewel deze lage concentratie wel inhibitie veroorzaakten van het rattenlever
nucleotide pyrofosfatase. Dit is waarschijnlijk het gevolg van de verregaande opzuivering van het
beschreven rattenlever NPP, waardoor geen interferrerende bivalente ionen meer aanwezig zijn zoals
in bloem het geval is.
88
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
NAD afbraak bij verschillende concentratiesEDTA
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
rela
tieve
NAD
con
cent
ratie
(%)
Blanco 102 µM 5 µM 3 µM
Figuur 3.3.10 Effect van lagere EDTA concentraties op de NAD+-afbraak
Ergens tussen 10 mM en 102 M moet het punt liggen waarbij alle ionen, essentieel voor het NPP,
gecomplexeerd zijn. De afbraak van NAD+ bij hogere concentraties EDTA wordt weergegeven in
figuur 3.3.11. De concentraties 10, 8, 6 en 4 mM EDTA geven hierbij een gelijkaardig patroon. Ze
fluctueren allen rond de 100%. Vanaf een concentratie van 3 mM blijkt het enzym enige activiteit te
vertonen. Die stijgt bij dalende EDTA-concentratie.
NAD afbraak bij verschillende concentraties EDTA(II)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
rela
tieve
NA
D c
once
ntra
tie(%
)
Blanco10 mM8 mM6 mM4 mM3 mM2 mM1 mM
Figuur 3.3.11 Het effect van verschillende concentraties EDTA op de NAD+-afbraak
Synergisme met glycine
Het is duidelijk dat geen van de voorgaande concentraties voldoen aan de normen opgelegd door de
FDA (EU-wetgeving buiten beschouwing gelaten). Een synergisme met een andere component is dus
interessant om te onderzoeken. Dergelijk synergisme werd eveneens beschreven voor rattenlever
89
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
nucleotide pyrofosfatase. Hierbij werd glycine met EDTA aan het reactiemengsel toegevoegd
waardoor het inhibitorisch effect van EDTA versterkt werd (Lopez-Gomez et al., 1998).
Synergistisch effect van glycine met EDTA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60tijd (min)
rela
tieve
NA
D-c
once
ntra
tie (%
)
Blanco 5 mM Glycine1000µM EDTA 1000µM EDTA + 5 mM glycine500µM EDTA + 5mM glycine
Figuur 3.3.12 Verloop van de NAD+-afbraak in bloem, in aanwezigheid van EDTA en/of glycine
Dit is echter niet het geval voor het NPP in bloem (figuur 3.3.12). Het glycine blijkt op zich de NPP
activiteit de stimuleren (de curve heeft een sterkere helling dan de blanco). Daarnaast beïnvloedt het
de inhibitorische activiteit van EDTA negatief. Van synergisme is hier dus geen sprake.
Naast de wettelijke beperkingen omtrent het EDTA gebruik bestaan er ook nog enkele meer praktische
beperkingen. Alcohol dehydrogenase en mannitol dehydrogenase worden, zoals NPP, geïnhibeerd
door de chelator. Gezien het uiteindelijke doel het toepassen van MDH in deeg is, kan EDTA niet als
inhibitor gebruikt worden. Verschillende processen, essentieel voor de deegvorming en de co-
enzymregeneratie, zouden immers stilvallen.
Daarnaast hebben chelaterende agentia een effect op de hydrofobiciteit. Hydrofobe interacties tussen
glutenfibrillen zouden bijdragen tot de elasticiteit van deeg en bijgevolg tot de reologische
eigenschappen. Het toevoegen van EDTA aan gluten bleek een opzwellen teweeg te brengen wat wijst
op toenemende interactie met water. De gluten worden dus hydrofieler als gevolg van het chelateren
van calcium en magnesium ionen en dus daalt de elasticiteit van de deeg (Clements, 1992).
NADH afbraak met EDTA
Hierboven werd enkel NAD+ geïncubeerd met het bloemextract en EDTA. De vraag is nu of ook de
afbraak van NADH wordt geïnhibeerd door EDTA. Indien dit niet het geval is, dan breken
waarschijnlijk twee enzymen co-enzymen af, een NADH-NPP en een NAD+-NPP.
90
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Uit het experiment blijkt echter dat dit niet het geval is. NADH wordt niet meer afgebroken bij een
incubatie met 4 mM EDTA. Daarnaast is het opmerkelijk dat de omzetting van NADH naar NAD+ ook
niet meer doorgaat. Ook NADH-oxidase heeft dus een metaalion als cofactor nodig voor zijn werking.
Reactivatie met een bivalent metaalion
Zowat elke NPP beschreven in de literatuur heeft een bivalent kation nodig om te functioneren. Welke
deze zijn is sterk afhankelijk van het organisme.
Het nucleotide pyrofosfatase in gist heeft Zn2+ nodig als cofactor, bij toevoegen na inhibitie gaf dit ion
de grootste reactivatie. Toch gaven bivalente ionen zoals mangaan, cobalt, ijzer, koper en magnesium
gedeeltelijke reactivatie (Haroz et al., 1972; Twu et al., 1977). Gelijkaardige resultaten zijn bekomen
voor NPP´s in kippenembryo´s en het serum van ratten (Faltynek et al., 1981; Lau et al., 1981).
In plantaardig materiaal werden NPP´s beschreven in linzen zaailingen en in bloemkool (Medda et al.,
2000; Moorhead et al., 2003). In beide gevallen worden zink-, nikkel- en koperionen als inhibitorisch
beschreven. Voor de linzen specifiek wordt mangaan als de cofactor beschreven. Magnesium en
calcium geven in dit geval een lagere graad van reactivatie.
De Nudix NADH-hydrolasen, uitgebreid beschreven in de literatuurstudie, vertonen enkel reactivatie
met twee kationen, nl. magnesium en mangaan (Frick et al., 1995; Xu, WL et al., 2000; Dobrzanska et
al., 2002; Abdelbraheim et al., 2003).
Inhibitie en reactivatie van NPP
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250tijd (min)
rela
tieve
NA
D c
once
ntra
tie (%
)
Blanco 10 mM EDTA10 mM EDTA + 20 mM MgCl2 10 mM EDTA + 20 mM MnCl210 mM EDTA + 20 mM ZnCl2 10 mM EDTA + 20 mM CaCl2
Figuur 3.3.13 De inhibitie van NPP met EDTA en de reactivatie met verschillende bivalente kationen
De resultaten voor de reactivatie van het tarwe-NPP worden gegeven in figuur 3.3.13. Hieruit blijkt
dat zowel magnesium als mangaan een reactivatie veroorzaken van het enzym. Deze reactivatie is
slechts de helft van de blanco, mogelijks een gevolg van de onzuiverheid van het enzympreparaat, nl.
het bloemextract. Het ontnemen van het metaalion door een chelator kan immers leiden tot het
91
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
uiteenvallen in subunits. Over het algemeen zijn deze subunits veel gevoeliger voor denaturatie dan
het holoënzym. Een reactie met componenten in het preparaat kunnen deze subunits dus permanent
inactiveren.
Bij deze reactivatieproef moet echter een gelijkaardige opmerking gemaakt worden als voor de
reactivatie van mannitol dehydrogenase (§ 3.1.5.1). Het is mogelijk verkeerdelijke conclusies te
trekken uit deze proef, hoewel de literatuur dezelfde ionen beschrijft met een gelijkaardige methodiek.
De Nudix-hydrolasen geven dan het meest gelijkaardige resultaat, mogelijks is het tarwe-NPP ook lid
van deze familie.
Indien de redenering van inactivatie en reactivatie wordt doorgedreven is het mogelijk dat er
enzymmoleculen aanwezig zijn in het bloemextract die niet of minder actief zijn omdat ze een ander
metaalion dan hun cofactor chelateren. Het bloemextract is immers een mengsel van ionen waarin een
evenwicht zal heersen tussen de gecomplexeerde en de vrije species. Wordt er een overmaat aan ion
toegevoegd – zonder EDTA als inhibitor – dan is een stimulatie van het enzym mogelijk.
Het resultaat van dergelijke proef wordt weergegeven in figuur 3.3.14. Dit geeft aan dat er geen
stimulatie optreedt in aanwezigheid van de reactiverende ionen, magnesium en mangaan. Dit betekent
dat waarschijnlijk het enzym geen affiniteit heeft voor andere bivalente kationen. Bijgevolg gaat de
redenering van paragraaf 3.1.5.1 hier niet op. Mangaan en magnesium zijn dus cofactoren voor het
nucleotide pyrofosfatase in het bloemextract.
Stimulatie van NPP
0102030405060708090
100
0 50 100 150 200 250
tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
con
cent
ratie
(%)
blanco 0,01 M MgCl2 0,01 M MnCl2
Figuur 3.3.14 Stimulatie van NPP door magnesium en mangaan
3.3.5.3 L-cysteïne en gereduceerd glutathion
Zoals chelatoren zijn reducerende agentia niet-competitieve inhibitoren voor een enzym. Deze
inhibitie is echter van irreversibele aard. L-cysteïne en glutathion reageren immers met de
thiolgroepen in de enzymmolecule en vormen hierbij zwavelbruggen. Hierdoor verandert de
conformatie van het enzym irreversibel, wat kan leiden tot inactivatie. Gezien deze reactie niet
onmiddellijk bij toevoeging gebeurt, is een zekere voorincubatie nodig. Deze tijdsafhankelijke
inhibitie werd reeds eerder aangetoond in figuur 3.3.9.
92
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Inhibitie van NPP door cysteïne englutathion met voorincubatie
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150tijd (min)
rela
tieve
NAD
-con
cent
ratie
(%)
Blanco 4 mM cysteïne 10 mM glutathion
Inhibitie van NPP door cysteïne englutathion zonder voorincubatie
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150tijd (min)
rela
tieve
NAD
-con
cent
ratie
(%)
Blanco 4 mM cysteïne 10 mM glutathion
Figuur 3.3.15 Inhibitorisch effect van L-cysteïne en glutathion met en zonder voorincubatie
Figuur 3.3.15 toont het resultaat ven een inhibitieproef met en zonder voorincubatie van L-cysteïne en
glutathion. Hieruit volgt dat een 4 mM cysteïne concentratie een gelijkaardig effect heeft als een 10
mM glutathion concentratie.
Deze beide inhibitoren zijn interessant omdat ze een stabiliserend effect hebben voor mannitol
dehydrogenase (§ 3.1.4.4) en reeds in de bakkerijsector worden gebruikt. Als reducerende agentia
breken ze zwavelbruggen in de gluten van het deeg tijdens het mengen en kneden. Dit leidt over het
algemeen tot een zwakkere deegsterkte en dus kortere meng-en kneedtijden (Shewry et al., 1997;
Udeh et al., 1999). Hun toepasbaarheid beperkt zich echter tot glutenrijke degen, waarbij de gluten te
sterk vernetten.
3.3.5.4 Fosfaten
In de levensmiddelensector worden verscheidene fosfaten gebruikt, met uiteenlopende doeleinden. De
Europese levensmiddelen reglementering beschrijft deze moleculen dan ook uitgebreid. De
aanbevolen dagelijkse inname wordt algemeen vastgelegd op 70 ppm. Hierop bestaan echter striktere
normen naargelang het soort levensmiddel. Deegwaren worden niet in deze beperkende lijst
opgenomen waardoor de algemeen aanvaarde concentratie van 70 ppm mag toegepast worden
(European Parliament and Council Directive, 1995).
Pyrofosfaat (E450) specifiek wordt in de bakkerijsector toegepast als broodverbeteraar. De preciese
modus operandi is nog niet gekend. Deze eigenschap is interessant voor de inhibitie van NPP, hoewel
een competitieve inhibitie hier ook tot de mogelijkheden behoort.
93
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Inhibitie met pyrofosfaat
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6Tijd (h)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tieN
AD
(%)
blanco 100 mM Ca-pyrofosfaat 50 mM Ca-pyrofosfaat20 mM Ca-pyrofosfaat 10 mM Ca-pyrofosfaat 20 mM Na-pyrofosfaat
Figuur 3.3.16 Inhibitie van NPP door pyrofosfaten: effect van de concentratie
Figuur 3.3.16 toont een incubatie van NAD+, bloemextract en verschillende concentraties pyrofosfaat.
100 en 50 mM calciumpyrofosfaat veroorzaakt hierbij een volledige inhibitie van de afbraak. 20 mM
calciumpyrofosfaat en 10 en 20 mM natriumpyrofosfaat inhiberen slechts voor de helft de activiteit
van NPP.
Inhibitie door middel van verschillende fosfaten
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 90 180tijd (min)
rela
tieve
NA
D-c
once
ntra
tie(%
)
270
blanco fosfaat metafosfaat trifosfaat pyrofosfaat
Figuur 3.3.17 Inhibitie van NPP met verschillende fosfaatvormen
Andere fosfaten die worden toegepast zijn dinatriumfosfaat (E339) en pentanatriumtrifosfaat (E451).
Ook deze fosfaatvormen, samen met metafosfaat zijn in staat NPP te inhiberen in een concentratie van
10 ppm (mg/kg), ruim onder de norm (figuur 3.3.17). Enkel dinatriumfosfaat heeft een minder sterk
inhiberend vermogen.
Het gebruik van fosfaten en pyrofosfaat in het bijzonder als inhibitor in een deegsysteem heeft een
belangrijk nadeel. Ze inhiberen ook alcohol dehydrogenase en mannitol dehydrogenase (§ 3.1.5.2 &
94
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.2.4). Dit is tevens een bewijs dat de inhiberende werking van deze stoffen waarschijnlijk te wijten is
aan hun chelaterende eigenschappen.
3.3.5.5 Productinhibitie
AMP inhibitie
Tijdens een eerste screening vertoonde AMP in de gebruikte concentratie (500 µM) geen inhibitie.
Deze concentratie was echter lager dan de concentratie toegepast voor ADP, die in de literatuur als een
krachtiger inhibitor werd beschreven (Wise et al., 1997). Een herhaling van deze proef bij hogere
concentratie leverde een verbeterd effect van AMP op (figuur 3.3.18). Er is dus een minimale
hoeveelheid eindproduct nodig om de enzymwerking te stoppen. Dit wijst op een negatieve feedback
controle van het enzym.
Indien dit het geval is, dan gaat voor dit enzym de hypothese dat het instaat voor de NADH/NAD+
verhouding in de cel niet op (§1.3.3.2). Bij een te hoge AMP concentratie zal het regulatorisch effect
immers stilvallen, zelfs al is de co-enzymverhouding uit balans. Dit enzym heeft dus waarschijnlijk
een andere functie.
Productinhibitie
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250
tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-con
cent
ratie
(%)
blanco 1 mM AMP 5 mM AMP 10 mM AMP
Figuur 3.3.18 De inhibitie van NPP door middel van AMP
NAD(H)-shots
Om de productinhibitie te bevestigen werd een experiment uitgevoerd met ‘NAD(H)-shots’ waarbij na
elke staalname een hoeveelheid co-enzym werd toegevoegd. Indien productinhibitie optreedt dan zal
na zekere tijd de co-enzymafbraak stilvallen.
Figuur 3.3.19 toont echter het tegendeel. De afbraak van de co-enzymen blijft doorgaan ongeacht de
concentratie van de afbraakproducten. Deze concentratie gaat tot 1 mM AMP, wat betekent dat,
rekening houdend met het resultaat uit figuur 3.3.18, voldoende inhibitie kan optreden. De
concentratie aan co-enzym speelt dus eveneens een belangrijke rol. Waarschijnlijk bestaat er een
optimale afbraakproduct/co-enzym verhouding waarnaar gestreefd wordt. Indien AMP extra wordt
95
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
toegevoegd is deze te hoog en zal er geen afbraak meer optreden, indien co-enzym wordt toegevoegd
is deze verhouding te laag en zal de afbraak verder doorgaan.
NAD shots
0
500
1000
1500
2000
0 100 200Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NMN AMP NAD NADH
NADH shots
0
500
1000
1500
2000
0 100 200Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NMN AMP NAD NADH
Figuur 3.3.19 Het effect van NAD(H)-shots op de co-enzymafbraak
De NADH-shots geven gelijkaardige resultaten als de NAD+-shots. Het enige nadeel hierbij is dat
verschillen in afbraaksnelheden niet merkbaar zijn in deze figuren. NADH wordt merendeels omgezet
tot NAD+ en van daaruit afgebroken. Besluiten omtrent de regulatie van de NAD+/NADH-verhouding
kunnen slechts genomen worden indien het verschil in afbraaksnelheid gemeten wordt.
Afbraaksnelheid NAD+ en NADH
Om de afbraaksnelheid van NADH te meten was het noodzakelijk de incubatie onder anaërobe
condities uit te voeren zodat het NADH-oxidase in het bloemextract uitgeschakeld werd. Figuur 3.3.20
geeft de afbraakpatronen van zowel NAD+ als NADH weer onder anaërobe condities.
Afbraak van NAD onder anaërobeatmosfeer
050
100150200250300350400
0 50 100 150 200tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NADH AMP NMN
Afbraak en omzetting van NADH onderanaërobe atmosfeer
0
50
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NADH AMP NMN
Figuur 3.3.20 afbraakpatronen van NAD+ en NADH onder anaërobe condities
De NAD+-afbraak verloopt gelijk aan die in aërobe condities, de NADH-afbraak daarentegen is
beduidend verschillend. De omzetting van NADH naar NAD+ is significant gedaald, wat de
vergelijking in afbraaksnelheid tussen de beide co-enzymvormen sterk vereenvoudigt. De NMN
concentratie vertoont een grillig verloop als gevolg van de vorming van NMNH dat niet kan
waargenomen worden.
96
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
De evoluties van de NAD en de NADH concentraties worden naast elkaar weergegeven in figuur
3.3.21. Indien de kleine hoeveelheid NADH die omgezet wordt in NAD+ niet in rekening wordt
gebracht, verlopen de curves parallel maar verschillen hun x-as intercepten. Wordt deze omzetting wel
in rekening gebracht dan vallen de beide curves bijna volledig samen.
Vergelijking afbraaksnelheid NAD en NADH
0102030405060708090
100
0 50 100 150 200
tijd (min)
rela
tieve
con
cent
ratie
(%)
NADH NAD
Vergelijking van NAD en NADH afbraaksnelheidmet NADH omzetting in rekening gebracht
0102030405060708090
100
0 50 100 150 200
tijd (min)
rela
tieve
con
cent
ratie
(%)
NAD aangepast NADH
Figuur 3.3.21 De afbraaksnelheid van NAD+ en NADH tegenover elkaar uitgezet
De concentratie aan NAD+ die waargenomen wordt bij de NADH incubatie is het gevolg van twee
reacties, enerzijds een afbraakreactie van NAD+ en anderzijds de omzetting van NADH. De
verandering van de waargenomen NAD+ concentratie ( C), over een zekere tijd t, is dus de
verandering in concentratie door NADH-omzetting ( Comzetting) verminderd met de verandering in
concentratie als gevolg van afbraak ( Cafbraak) (vergelijking (3.9)).
afbraakomzetting CCC (3.9)
De afbraak kan theoretisch berekend worden aan de hand van de afbraaksnelheid. Deze snelheid wordt
afgeleid door middel van een lineaire regressie van de afbraakcurve van NAD+. De helling is hierbij de
afbraaksnelheid, nl. 1,2848 µM/min. Het product van t en de afbraaksnelheid geeft Cafbraak. Wordt
dit gesommeerd met de waargenomen NAD+-concentratieverandering dan wordt de NADH-omzetting
bekomen. Dit vormt dan de corrigerende term voor de NADH-afbraakcurve.
Het feit dat de beide curves samenvallen betekent echter niet dat het enzym geen van beide co-
enzymvormen prefereert. Het betekent enkel dat het enzym bij de gegeven omstandigheden de co-
enzymen met gelijke snelheid afbreekt. Welke vorm van het co-enzym het enzym prefereert, kan enkel
bepaald worden aan de hand van de Michaelis-Menten kinetiek. Voor de Nudix-hydrolasen ligt de
katalystische efficiëntie 100 maal hoger voor NADH in vergelijking met NAD+ (Frick et al., 1995).
Een gelijkaardige preferentie zou een mogelijke aanwijzing zijn dat het bloem-NPP tot deze hydrolase
familie behoort.
3.3.6 Kinetiek van NPP
Van verschillende concentraties NAD+ werd de afbraak opgevolgd in de tijd. Dit geeft de
afbraaksnelheid V (mM/min). Indien het inverse van deze snelheid uitgezet wordt tegenover het
97
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
inverse van de beginconcentratie wordt de Michaelis-Menten kinetiek bekomen (vergelijking (3.10)).
Hieruit kan de snelheidsconstante Km en de maximale snelheid Vmax afgeleid worden.
maxmax
m
V1
S1
VK
V1 (3.10)
Figuur 3.3.22 geeft deze vergelijking weer. Hierbij is de snelheidsconstante gelijk aan 89,5 µM en de
maximale afbraaksnelheid van NAD+ 0,5 µM/min, dit is 2 mU/mg bloem.
Michaelis-Menten kinetiek
1/V = 179,38(1/S) + 2,0034R2 = 0,9821
0
1
2
3
4
-0,02 -0,01 0 0,011/S
1/V
Figuur 3.3.22 De Michaelis-Menten Kinetiek van NPP met NAD+ als substraat
3.3.7 Temperatuursoptimum en thermostabiliteit
Thermostabiliteit
Het nucleotide pyrofosfatase is opmerkelijk thermostabiel (figuur 3.3.23). Het blijft actief tot en met
een voorincubatie van 10 minuten bij 70ºC. Deze eigenschap is interessant om het enzym te
differentiëren van het NADH-oxidase.
Thermostabiliteit van NPP
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
rela
tieve
NA
D c
once
ntra
tie (%
)
Blanco30°C40°C50°C60°C70°C80°C90°C
Figuur 3.3.23 Thermostabiliteit van het nucleotide pyrofosfatase in tarwe
Indien NADH wordt geïncubeerd bij een voorverhit bloemextract van 70ºC, dan blijkt het NADH-
oxidase nog steeds actief. Een voorbehandeling van 80ºC schakelt merkwaardig genoeg wel het
98
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
nucleotide pyrofosfatase uit, maar niet het NADH-oxidase. Dergelijke voorbehandeling is dus
uitstekend voor verdere studie van het NADH-oxidase in bloem. Weinig enzymen verdragen zo een
hoge temperaturen waardoor nauwelijks interferentie zal optreden (figuur 3.3.24).
NAD + bloemextract (70°C)
0500
100015002000
0 100 200
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
NADH + bloemextract (70°C)
0
500
1000
1500
0 100 200
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
NAD + bloemextract (80°C)
0500
100015002000
0 100
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
NADH + bloemextract (80°C)
0
500
1000
1500
0 100
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
NAD + bloemextract (90°C)
0500
100015002000
0 100
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
NADH + bloemextract (90°C)
0
500
1000
1500
0 100 200
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NAD
NADH
NMN
AMP
Figuur 3.3.24 Een overzicht van het effect van verschillende temperatuursvoorbehandelingen op de werking van het nucleotide pyrofosfatase en het NADH-oxidase in bloem
Temperatuursoptimum
Figuur 3.3.25 geeft de verandering van de NAD+-concentratie weer in de tijd bij verschillende
incubatietemperaturen. De figuur geeft duidelijk aan dat bij stijgende temperatuur de activiteit ook
stijgt. Een temperatuursoptimum is moeilijker te onderscheiden. Vanaf 37°C vallen de
eindconcentratie van de verschillende incubaties allemaal rond de 150 µM, enkel het verloop van de
curve is anders. Voor 37°C loopt de reactie initieel trager maar neemt daarna de snelheid toe, voor
50°C is het verloop min of meer lineair en voor de hogere temperaturen is er een initieel snellere
afbraak met een afremmen naar het einde toe.
99
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Activiteit van NPP bij verschillendetemperaturen
0
100
200
300
400
500
600
0 100 200tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
4°C 25°C 37°C50 °C 60°C 70°C
Figuur 3.3.25 Het temperatuursoptimum van NPP
3.3.8 pH-optima
3.3.8.1 Effect van de pH op eiwitten
Het effect van de pH op enzymactiviteit wordt bepaald door de samenstellende aminozuren. Deze
aminozuren hebben een -carboxylgroep, een -aminogroep en eventueel een zijketen, elk met een
specifieke pKa. De carboxyl- en aminogroep worden binnen het proteïne niet onmiddellijk beïnvloed
omdat ze een amide-binding of peptide-binding vormen. Om deze binding te breken zijn nogal
extreme condities nodig. Typisch is een lange verhitting bij 6 M zoutzuur of 40% natriumhydroxyde
(aq) (Wade, 1999).
De pKa’s van de zijketens en de eindstandige carboxyl- en aminogroepen spelen dus vooral een rol.
Tabel 3.3.4 geeft een overzicht van alle zijketens met hun pKa. Deze zullen bij een gegeven pH al dan
niet geprotoneerd zijn naargelang hun zuurtegraad. Een pH groter dan pKa zal ervoor zorgen dat de
groepen voornamelijk gedeprotoneerd zijn, een pH kleiner dan de pKa zorgt voor protonering.
Tabel 3.3.4 Overzicht van de pKa's van de zijketens van verschillende aminozuren (Mathews et al., 1995)
Aminozuur Zijketen pKa
Arginine Guanidino-groep 12,5
Aspartaat Carbonyl-groep 3,9
Cysteïne Thiol-groep 8,3
Glutamaat Carbonyl-groep 4,2
Histidine Imidazool-ring 6,0
Lysine Amino-groep 10,0
Tyrosine Fenyl-alcohol-groep 10,1
100
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
In welke vorm een functionele groep voorkomt in het proteïne is essentieel voor de secundaire en
tertiaere structuur van het eiwit. Deze structuurvormen worden onder andere door waterstof-bruggen
tussen de functionele groepen bepaald. Een pH-verandering brengt dus een structurele verandering
teweeg, wat voor een enzym inactivatie kan betekenen (Mathews et al., 1995).
Naast structurele veranderingen kan de pH ook de oplosbaarheid van een proteïne beïnvloeden.
Eiwitten zijn immers polyamfolyten die een substantiële netto lading kunnen bezitten. Het proteïne
blijft zolang in oplossing als het thermodynamisch gunstiger is om gehydrateerd te zijn dan een
aggregaat te vormen met andere proteïnen. De aanwezigheid van ladingen op het eiwit resulteert
immers in elektrostatische repulsie die voor aggregatie moet overwonnen worden. Is de pH echter
gelijk aan het iso-elektrisch punt8, dan wordt deze repulsieve barrière uitgeschakeld. Op dat punt is het
thermodynamisch gunstiger om te aggregeren. De vorming van dergelijke aggregaten wordt ook
isoelektrsiche precipitatie genoemd. Precipitatie is echter geen regel, sommige globulaire eiwitten
zoals albumines, behouden nog een aanzienlijke oplosbaarheid bij hun iso-elektrisch punt.
Een V-vormige curve geeft het typische verloop van de oplosbaarheid in functie van de pH (Mathews
et al., 1995; Van Der Meeren, 2003).
3.3.8.2 Effect op NPP en NADH-oxidase
Voor de bepaling van het pH-optimum werd rekening gehouden met verschillende parameters. De co-
enzymen zijn niet stabiel bij elke pH, NADH is stabieler bij hogere pH’s, terwijl NAD+ stabieler is bij
lagere pH’s (Rover et al., 1998). Daarnaast moet bevestigd worden of de co-enzymen niet door
chemische componenten in de bloem worden afgebroken. Hiervoor is het noodzakelijk de enzymen uit
te schakelen via hitte-inactivatie. Dit gebeurde op twee wijzen, een hittebehandeling bij 80ºC en
autoclaveren. De eerste behandeling inactiveert enkel het NPP, de tweede alle enzymen.
Figuur 3.3.26 geeft het overzicht van de stabiliteit en de afbraak van NAD+ bij verschillende pH’s.
Hieruit blijkt dat NAD+ vanaf een pH van 10,5 instabiel wordt. De additionele afbraak bij deze pH
blijkt veroorzaakt te worden door NPP. Dit enzym is merkbaar actiever bij hogere pH’s. Het optimum
ligt waarschijnlijk tussen 8,5 en 10,5.
Omdat de pH van deegsystemen algemeen rond een pH 5,5 ligt zal het effect van NPP
geminimaliseerd worden, hoewel deze in hogere concentraties zal aanwezig zijn. Het enzym wordt
immers niet eerst geëxtraheerd uit de bloem, dus zal het effect tegenover lagere co-enzymconcentraties
duidelijker zijn.
Het afbraakpatroon van het co-enzym bij geautoclaveerde bloemextract vertoont gelijkaardig gedrag
als in een gewone buffer. Dit betekent dat in de bloem geen thermostabiele chemische componenten
aanwezig zijn die NAD+ afbreken. Het is dus wel degelijk het nucleotide pyrofosfatase dat
verantwoordelijk is voor de afbraak.
8 Iso-elektrisch punt = punt waar in het proteïne het aantal positieve ladinge gelijk is aan het aantal negatieve
101
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
Voor NADH werden dezelfde pH’s uitgetest (figuur 3.3.27). Deze proef bevestigt dat NADH relatief
instabiel is bij lagere pH’s. Daarnaast ligt de optimale pH voor NADH-oxidase bij 5,5 tegenover de
optimale pH voor NPP in het alkalische gebied. Toch treedt er geen afbraak van NADH bij pH 12
meer op. Dit betekent dat de nucleotide pyrofosfatase activiteit tegenover NADH volledig wordt
geïnactiveerd bij deze pH. Gezien de afbraak van zowel NAD+ als NADH door EDTA wordt
geïnhibeerd en het enzym voor beide substraten bij een gelijke temperatuur wordt uitgeschakeld gaat
het hoogst waarschijnlijk om een enzym dat beide co-enzymvormen afbreekt. Een pH van 12 zal dus
ook de enzymatische NAD+-afbraak inhiberen. Deze vorm van het co-enzym is echter te onstabiel bij
pH 12 om de activiteit van NPP te kunnen onderscheiden (figuur 3.3.26).
pH 5,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
pH 7
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
pH 12
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
pH 8,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)pH 9,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
pH 10,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
verhit bloemextractbloemextractgeautoclaveerd bloemextractpH-stabiliteit
Figuur 3.3.26 De NAD+ stabiliteit en afbraak bij verschillende pH-waarden
Onder anaërobe conditie kan de werking van NPP bij de lagere pH’s beter worden bestudeerd. Dit
blijkt uit figuur 3.3.28 die toont dat de omzetting van NADH naar NAD+ beperkt wordt onder
anaërobe condities. Bij pH 8,5 kan de wisselwerking tussen de twee enzymen het best worden
waargenomen. Zowel onder anaërobe als aërobe omstandigheden wordt NADH bij deze pH
afgebroken met onverhit bloemextract. Gebeurt de incubatie echter met verhit bloemextract (10
minuten 80ºC) dan wordt onder aërobe omstandigheden NADH omgezet naar NAD+ en onder
anaërobe niet.
102
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
pH 5,5
02040
6080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
H-
conc
entra
tie (%
)
pH 5,5
020406080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 7
020406080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
ADH
-co
ncen
tratie
(%)
pH 7
02040
6080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 8,5
020406080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
H-
conc
entra
tie (%
)
pH 8,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 9,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
H-
conc
entra
tie (%
)
pH 9,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 10,5
020406080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
H-
conc
entra
tie (%
)
pH 10,5
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 12
020406080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
H-
conc
entra
tie (%
)
pH 12
0
2040
6080
100
0 50 100 150 200 250Tijd (min)
Rel
atie
ve N
AD
-co
ncen
tratie
(%)
verhit bloemextractbloemextractgeautoclaveerd bloemextractpH-stabiliteit
Figuur 3.3.27 De Stabiliteit, afbraak en omzetting van NADH bij verschillende pH’s. De linkse grafiekengeven de NADH-evolutie weer, de rechtse geven de NAD+ afbraak en vorming weer
103
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
pH 5,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NADH
-co
ncen
tratie
(%)
pH 5,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NA
D-
conc
entra
tie (%
)
pH 7
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
H-co
ncen
tratie
(%)
pH 7
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NA
D-co
ncen
tratie
(%)
pH 8,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
H-co
ncen
tratie
(%)
pH 8,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 9,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
H-co
ncen
tratie
(%)
pH 9,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
-co
ncen
tratie
(%)
pH 10,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
H-co
ncen
tratie
(%)
pH 10,5
020406080
100
0 100 200Tijd (min)
rela
tieve
NAD
-co
ncen
tratie
(%)
iguur 3.3.28 De Stabiliteit, afbraak en omzetting van NADH bij verschillende pH’s onder anaërobe condities. De linkse grafieken geven de NADH-evolutie weer, de rechtse geven de NAD+ afbraak en vorming weer
verhit bloemextract, anaëroobbloemextract, anaëroobverhit bloemextractbloemextract
F
104
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
3.3.9 Thiolen als inhibitoren van NADH-oxidase
In de literatuur worden thiolen zowel als inhibitoren als substraten beschreven. Als substraat treden ze
p al., 1997). De resultaten van een experiment metin com etitie met NADH (Kole et al., 1976; Morré et
DTT, L-cysteïne en glutathion (geoxideerd & gereduceerd) lijken dit te bevestigen (figuur 3.3.29). L-
cysteïne en gereduceerd glutathion verminderen de omzetting van NADH naar NAD+ aanzienelijk.
DTT en geoxideerd glutathion hebben daarentegen geen effect.
Het is mogelijk dat NADH-oxidase een belangrijke rol speelt in het oxideren van L-cysteïne en
glutathion in deeg. Deze species worden immers gebruikt als reducerende agentia die de vernetting in
deeg verzwakken (Shewry et al., 1997; Udeh et al., 1999). Het doel hiervan is het reduceren van de
mengtijd en het vereenvoudigen van de handelbaarheid.
Indien het doel een sterkere deeg creëren is dan voegt men veelal oxiderende agentia toe om dergelijke
moleculen te elimineren (Bloksma, 1972; Gujral et al., 2003).
Inhibitie van NADH oxidase
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 50 100 150 200
tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
Blanco NAD Blanco NADH4mM L-cysteine NAD 4mM L-cysteine NADH4mM gereduceerd gluthation NAD 4mM gereduceerd gluthation NADH4mM geoxideerd glutathion NAD 4mM geoxideerd glutathion NADHDTT NAD DTT NADH
Figuur 3.3.29 Effect van thiolen op de activiteit van NADH-oxidase
3.3.10 Samengevat
Het nucleotide py dit
it bij alkalische pH, maar blijkt bij de ‘werk-pH’ van 5,5 nog significant+
rofosfatase breek in bloem en dus ook in deeg de co-enzymen af, hoewel
optimaal gebeurt bij d
werkzaam. Naast dit enzym is NADH-oxidase werkzaam dat NADH omzet naar NAD . Beide
enzymen worden geïnhibeerd door chelaterende stoffen en blijken gevoelig voor reducerende agentia.
De manier waarop deze laatste inwerken verschilt voor de beide enzymen. Het nucleotide
pyrofosfatase wordt waarschijnlijk irreversibel geïnactiveerd door reactie met thiolgroepen in en rond
het actief centrum. NADH-oxidase daarentegen ondervindt competitieve inhibitie waarbij het
waarschijnlijk zuurstof omzet naar water met oxidatie van de thiol-groepen van L-cysteïne of
105
NPP EN NADH-OXIDASE RESULTATEN EN BESPREKING
glutathion. Eens alle thiolen omgezet zijn, zal het enzym opnieuw overschakelen op NADH als
substraat.
Figuur 3.3.30 geeft het overzicht van de reacties gekatalyseerd door de beide enzymen en de
karakteristieken van de enzymen.
Figuur 3.3.30 Korte samenvatting van enkele eigenschappen van NADH-oxidase en NPP
NAD+ NADH NADH-oxidase
Actief na 10 minuten bij 80˚CLaag pH-optimumInhibitie:
chelatorenthiolen (competitief)
AMP + AMP + NMNHNMN (?)
NPP Actief na 10 m70˚C, niet 80˚CHoog pH-optimum
NPP
Inhibitiechelatorenthiolen
inuten bij
106
HPLC-PROCEDURE RESULTATEN EN BESPREKING
3.4 Optimalisatie van de HPLC-procedure
3.4.1 Inleiding
In de hierboven beschreven experimenten worden twee staalname methoden toegepast. Bij de eerste
methode werd gedurende een uur gemeten en werden de stalen een zekere tijd gekoeld bewaard in de
autosampler van de HPLC. Een tweede methode is een online methode, waarbij elk staal onmiddellijk
wordt gemeten. Deze omschakeling is een direct gevolg van de experimenten die werden uitgevoerd
omtrent nucleotide pyrofosfatase en NADH-oxidase. Deze enzymen bleken werkzaam te blijven na
verdunning van de stalen en bij lage temperaturen (cfr. temperatuursoptimum van NPP). Bijgevolg
moest een andere meetmethode worden opgesteld. Verschillende mogelijke technieken werden
uitgetest om de NPP- en NADH-oxidase-reactie te stoppen en nadien de co-enzymen en
afbraakproducten te kwantificeren. Klassiek wordt hiervoor een pH-schok of een temperatuursschok
aangewend, maar deze beide technieken behoren niet tot de mogelijkheden bij de analyse van co-
enzymen gezien deze thermolabiel zijn en stabiel zijn in een beperkt pH-gebied.
De gevolgen voor de besluitvorming bij de proeven uitgevoerd met de eerste methode zijn miniem.
Enkel de incubatieperiode moet worden uitgebreid met de verblijftijd in de autosampler.
3.4.2 Mogelijke technieken
3.4.2.1 EDTA
Er werd reeds bewezen dat EDTA heel efficient is als inhibitor van NPP. Indien na centrifugatie in de
Tris-HCl verdunningsbuffer EDTA wordt toegevoegd (uiteindelijke concentratie 5 mM) dan zullen
geen afbraakreacties meer optreden.
NADH afbraak
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NADH NMN AMP
NAD afbraak
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 30 40 50 60
tijd (min)
conc
entra
tie (µ
M)
NAD NADH NMN AMP
Figuur 3.4.1 Het afbraakpatroon van NAD en NADH indien EDTA werd toegevoegd aan de Tris-HCl verdunningsbuffer
Figuur 3.4.1 toont het resultaat van zo een experiment. De reactie wordt stilgelegd door het EDTA,
maar nu blijkt dat er nauwelijks afbraak optreedt in de tijdspanne waarover er gemeten werd.
107
HPLC-PROCEDURE RESULTATEN EN BESPREKING
Omzetting van NADH naar NAD+ treedt wel op. Gezien eerder werd aangetoond dat ook deze
omzetting geïnhibeerd wordt door EDTA, moet hier besloten worden dat de omzetting van NADH
naar NAD+ sneller verloopt dan de afbraak van NAD+ en NADH. De afbraakroute NADH NAD+
AMP + NMN zal het grootste aandeel van het NADH-verlies veroorzaken. Dit sluit echter de
afbraakroute NADH AMP + NMNH niet uit.
Opmerkelijk is ook het grote verschil tussen de AMP en de NMN concentratie van een gegeven staal.
Dit wordt veroorzaakt door EDTA. Het absorbeert namelijk bij 260 nm (ook “zuiver” EDTA) (figuur
3.4.2) en elueert samen met NMN, ook bij de aangepaste HPLC-methode. Door deze interferentie met
de metingen kan EDTA niet worden gebruikt om de afbraak-en omzettingsreacties stil te leggen.
EDTA
00,5
11,5
22,5
33,5
4
0 200 400 600 800 1000
Golf lengte (nm)
Abso
rban
tie
Zuiver EDTA Onzuiver EDTA
Zuiver EDTA + bloemextract Onzuiver EDTA + bloemextract
Figuur 3.4.2 Absorptiespectra EDTA + bloemextract
3.4.2.2 Ethanol
Vaak wordt ethanol gebruikt om enzymreacties te stoppen omdat dit solvent het enzym denatureert.
Noch NAD, noch NADH bleken echter stabiel in aanwezigheid van ethanol, waardoor dit niet gebruikt
kan worden.
3.4.2.3 SDS + methanol
In de literatuur beschrijven Aso et al.(1989) een methode om een oxidoreductase reactie te stoppen
met behulp van SDS en methanol. De reactie wordt gestopt door het toevoegen van een gelijk volume
van 20% methanol die 4 % SDS bevat (= stop1). Voor analyse wordt het staal verdund met loopbuffer
die 2% SDS bevat (= stop2). In eerste instantie werd de stabiliteit van NAD(H) getest door 100 µl
NAD(H) te incuberen met 100 µl stop1 en 800 µl stop2. Dit experiment toonde aan dat NAD(H)
stabiel zijn in aanwezigheid van deze stopmengsels. Nadien werd de NPP inactivatie getest door van
een co-enzym-bloemmengsel de analyse enerzijds on-line uit te voeren en anderzijds na stoppen met
stop1, bewaring overnacht in de koelkast en analyse de dag nadien na verdunning met stop2. De
108
HPLC-PROCEDURE RESULTATEN EN BESPREKING
resultaten worden weergegeven in figuur 3.4.3. Hieruit blijkt dat de resultaten niet 100%
overeenstemmen, maar toch vrij gelijklopend zijn.
NAD + bloemextract
0
500
1000
1500
2000
0 90 180 270 360Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NMN,1 AMP,1 NAD,1 NADH,1NMN,2 AMP,2 NAD,2 NADH,2
NADH + bloemextract
0
500
1000
1500
2000
2500
0 90 180 270 360Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
NMN,1 AMP,1 NAD,1 NADH,1NMN,2 AMP,2 NAD,2 NADH,2
Figuur 3.4.3 Stoppen van NPP-reactie met SDS + methanol (1= analyse “on-line”, 2 = analyse dag nadien)
Het stoppen van de reactie met SDS en methanol om de NPP-activiteit op te volgen is interessant. Het
nadeel van deze methode is echter dat door het gebruik van SDS schuimvorming optreedt, waardoor
het filtreren moeizaam verloopt. Dit heeft als gevolg dat het staal pas geanalyseerd kan worden als het
schuim verdwenen is.
3.4.3 Alternatieven voor de HPLC-methode
3.4.3.1 ADH-methode
De alcohol dehydrogenase methode is gebaseerd op de omzetting van NAD+ naar NADH dat
spectrofotometrisch bij 340 nm kan bepaald worden. In eerste instantie werd hiervoor een ijklijn
opgesteld. Voor elke concentratie NAD+ werd hiervoor de ADH-activiteit bepaald, de absorbantie per
minuut. Deze activiteit uitgezet in functie van de concentratie geeft vergelijking (3.11). dit is in wezen
de
0,0111(mM)NAD0,0838ine(340nm)/mAbsorbanti (3.11)
Voor elk staal kan op gelijkaardige wijze de activiteit van het enzym bepaald worden die onmiddellijk
is gecorreleerd met de concentratie aan NAD+ in het staal via de vergelijking.
109
HPLC-PROCEDURE RESULTATEN EN BESPREKING
Figuur 3.4.4 geeft het resultaat weer van de ADH-test en de vergelijking met de ‘online’-HPLC
methode. De beide curves lopen parallel aan elkaar, wat van de ADH-methode een goed alternatief
maakt voor de HPLC-methode. Het nadeel aan deze methode is echter het gebruik van een enzym, die
bij bijvoorbeeld inhibitieproeven beïnvloed kan worden door de inhibitor. De sterke verdunning van
het staal kan dit effect enigzins opheffen, maar in sommige gevallen zal dit niet voldoende zijn.
Een tweede nadeel in de lage gevoeligheid van de test. Voor de HPLC-analyse is slechts een
concentratie van 0,5 mM nodig, bij de ADH test is een concentratie van 2 mM nodig.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 60 120 180 240 300
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(mM
)
ADH-testHPLC-test
Figuur 3.4.4 Een vergelijking tussen de HPLC en de ADH-methode voor de bepaling van NPP activiteit
Voor de bepaling van de NADH-afbraak wordt de incubatie uitgevoerd met acetaldehyde en wordt dus
de absorbantie daling gemeten in de tijd. Een nadeel is echter dat de NAD+-vorming, als gevolg van de
NADH-oxidase activiteit, niet kan waargenomen worden.
De HPLC-methode biedt dus het meeste informatie en is het meest accuraat.
3.4.3.2 Fosfaat-methode
Ook de fosfaat-methode maakt gebruik van een enzymatische stap. Hierbij worden niet de
uitgangstoffen van de NPP – NAD+ en NADH – bepaald, maar de afbraakproducten – NMN(H) en
AMP. Dit gebeurt aan de hand van hun fosfaatgroep die wordt afgesplitst door een fosfatase. Deze
fosfaat wordt uiteindelijk spectrofotometrisch bepaald.
In de eerste plaats werd een standaardcurve opgesteld aan de hand van verschillende concentraties
fosfaat (vergelijking (3.12)).
0,128M)centratie(fosfaatcon1076,2e(820nm)Absorbanti (3.12)
Voor de berekeningen werd een blanco fosfaatbepaling van het bloemextract bepaald die ook via de
standaardcurve werd omgerekend naar een fosfaatconcentratie. Het verschil van het gehalte in het staal
en het gehalte in de blanco geeft de werkelijk gevormde fosfaatconcentratie. Omdat zowel AMP als
NMN een fosfaatgroep bezitten moet de helft genomen worden van het gemeten fosfaatgehalte. Dit
uitgezet in de tijd geeft de activiteit van NPP weer.
110
HPLC-PROCEDURE RESULTATEN EN BESPREKING
Deze methode is beduidend minder gevoelig in vergelijking met de HPLC-methode (figuur 3.4.5). Dit
is waarschijnlijk te wijten aan de fosfatase tussenstap. Deze stap werd niet uitgevoerd tijdens het
opstellen van de standaard, wat leidt tot een overschatting van de activiteit, namelijk een 100%
defosforylering van NMN(H) en AMP.
Standaarcurves voor deze beide species zouden in principe moeten opgesteld worden om een scherper
beeld bij deze methode te verkrijgen.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 100 200 300
Tijd (min)
Con
cent
ratie
(µM
)
fosfaatbepaling HPLC-bepaling
Figuur 3.4.5 Een vergelijking tussen de HPLC en de fosfaat-methode voor de bepaling van NPP activiteit
111
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
3.5 Gekoppelde enzymsystemen
3.5.1 Inleiding
In de vorige hoofdstukken werden de enzymen, die een rol spelen in de hieropvolgende experimenten,
beschreven. Verschillende eigenschappen zullen een cruciale rol spelen in het ontrafelen van hun
functie in deeg. In eerste instantie werd een regeneratief systeem opgezet van NADH. In bloem wordt
NADH immers door het NADH-oxidase omgezet tot NAD+. Door formiaat dehydrogenase toe te
voegen samen met formiaat – als substraat – kan deze activiteit tegengewerkt worden.
In een tweede regeneratie-systeem werd gist en glucose toegevoegd aan het mengsel. Hierbij zal de
gist ethanol vormen die door alcohol dehydrogenase in bloem kan gebruikt worden om NAD+ om te
zetten tot NADH. Dit NADH kan dan door mannitol dehydrogenase samen met D-fructose – als
substraat – geregenereerd worden tot NAD+.
De gedachte die achter deze systemen schuil gaat, is de hoeveelheid NAD+ als oxiderend agens in de
deeg zo hoog mogelijk te houden zodat deze kan inspelen op de deegreologie. Zoals in de
literatuurstudie beschreven werd, hebben oxiderende agentia een positief effect op de deegsterkte.
Specifiek voor NAD+ zou dit betekenen dat het samen met glutathion dehydrogenase de
kortketenthiolen gaat oxideren. Deze kunnen immers door hun grote mobiliteit makkelijk op de thiolen
in de gluten binden en zo de cross-linking tussen de glutenmoleculen sterk verminderen. Worden deze
moleculen uitgeschakeld, dan zal meer cross-linking mogelijk zijn, met een sterkere deegstructuur tot
gevolg.
Bij de figuren in de volgende experimenten moet worden opgemerkt dat alle concentraties op relatieve
basis werden uitgedrukt. Dit betekent dat op een bepaald tijdstip de co-enzymconcentratie werd
gedeeld door de som van alle co-enzymconcentraties (NAD++NADH) en vermenigvuldigd met 100.
Deze omrekening filtert de activiteit van het nucleotide pyrofosfatase in bloem uit de resultaten.
De regeneratie zal ogenblikkelijk blijken te zijn. Dit is slechts een schijn. In het vorige hoofdstuk
werden de nadelen van de HPLC-methode besproken. Hierbij moeten de stalen even wachten op
analyse en bijgevolg zullen de reacties nog even doorgaan. Dit is echter niet zo uitgesproken als de
afbraakreacties die hier werden uitgefilterd in de berekeningen. Indien de wachttijd in de autosampler
zou in rekening gebracht worden, verandert er nauwelijks iets aan het verloop van de grafiek.
3.5.2 Formiaat dehydrogenase-systeem
3.5.2.1 Additie van formiaat dehydrogenase (FDH)
De regeneratie werd op twee verschillende wijzen uitgevoerd, namelijk met en zonder voorincubatie.
De voorincubatie van 1 uur werd ingelast om het NADH-oxidase de kans te geven NADH te oxideren.
Daarna werd FDH en natrium-formiaat toegevoegd om de gevormde NAD+ opnieuw te gaan
reduceren.
112
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
Figuur 3.5.1 toont het regeneratief systeem naast een blanco. Het gereduceerde co-enzym in de blanco
wordt continu omgezet naar de geoxideerde vorm gedurende het experiment. Voor het testmengsel,
waaraan FDH en natrium-formiaat werd toegevoegd, treedt er een volledige regeneratie op. Deze
regeneratie zal zolang als er substraat aanwezig is doorgaan. Eens alle formiaat is omgezet tot CO2 en
water zullen de co-enzymen hetzelfde lot ondergaan als in de blanco.
FDH-systeem: Blanco
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120
tijd (min)
rela
tieve
con
cent
ratie
(%)
NADNADH
FDH-systeem: Test
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120
tijd (min)re
latie
ve c
once
ntra
tie (%
)
NADNADH
Figuur 3.5.1 Additie van formiaat dehydrogenase en natrium-formiaat na een 60 minuten voorincubatie
Het experiment zonder voorincubatie geeft een gelijkaardig resultaat als het experiment met
voorincubatie vanaf het punt waar FDH wordt toegevoegd. De blanco is hier volledig gelijk (Figuur
3.5.2).
FDH-systeem: Blanco
0102030405060708090
100
0 10 20 30 40 50 60
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
NADNADH
FDH-systeem:Test
0102030405060708090
100
0 10 20 30 40 50 60
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
NADNADH
Figuur 3.5.2 Het FDH-systeem waarbij geen voorincubatie werd gebruikt
113
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
3.5.2.2 Effect van verschillende concentraties FDH en Na-formiaat
Een enzymatische reactie gebeurt in twee stappen. De eerste stap is de vorming van het enzym-
substraat complex, die reversibel wordt geacht. De tweede stap is het omvormen van het substraat in
de reactieproducten, als irreversibel beschouwd. Reactie (3.1) geeft deze stappen schematisch weer.
PEESSE 2k1k
1k (3.1)
Hierbij zal de hoeveelheid enzym-substraat complex dat gevormd wordt gelijk zijn aan de hoeveelheid
dat wegreageert. Dit leidt tot een algemene evenwichtsconstante KM, afhankelijk van de enzym en
substraatconcentratie en een reactiesnelheid die van dezelfde variabelen afhankelijk is. Een verhoging
van de concentratie aan enzym of substraat zal dus de reactie in de richting van de reactieproducten
dwingen en de snelheid van de reactie verhogen (Mathews et al., 1995).
Het effect van de enzymconcentratie wordt weergegeven in figuur 3.5.3. Ook hier werd initieel een
voorincubatie van 1 uur toegepast waarna de verschillende FDH-concentraties werden toegevoegd aan
de reactiemengsels. De kracht van de regeneratie blijkt afhankelijk van deze enzymconcentratie. De
verhouding gereduceerd op geoxideerd co-enzym is beduidend hoger bij hoge enzymconcentraties dan
bij lage. Een ander evenwicht wordt dus ingesteld naargelang de concentratie aan enzym.
020406080
100120
0 20 40 60 80 100 1
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
20
100 U/L NAD 10 U/L NAD 0 U/L NAD100 U/L NADH 10 U/L NADH 0 U/L NADH
Figuur 3.5.3 Het effect van verschillende FDH-concentraties op het regeneratie-systeem
Voor de verschillende concentraties aan natrium-formiaat, bij een gelijke concentratie FDH, geldt
ongeveer hetzelfde. Bij hoge concentraties natriumformiaat zal de NADH/NAD+-ratio veel lager
liggen dan bij lage concentraties. Dit verschil is erg klein tussen 100 en 10 mM wat betekent dat een
zeer kleine hoeveelheid substraat al voldoende is om een sterke regeneratie tot stand te brengen.
114
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 1
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie(%
)
20
100 mM, NAD 10 mM, NAD 0 mM, NAD
100 mM, NADH 10 mM, NADH 0 mM, NADH
Figuur 3.5.4 Het effect van verschillende Na-formiaat concentraties op het FDH-systeem
3.5.3 Mannitol dehydrogenase-systeem
3.5.3.1 Gist
Gist is een belangrijke component in het deegvormingsproces. Het voorziet het alcohol dehydrogenase
in de bloem van ethanol en zorgt voor CO2-productie. Deze gasproductie is essentieel voor de vorming
van een mooie sponzige structuur in het brood zelf.
De noodzaak van ethanol en de vorming van ethanol wordt aangetoont in figuur 3.5.5. Indien helemaal
niks aan het mengsel wordt toegevoegd dan wordt NADH langzaam geoxideerd door NADH-oxidase.
Wordt de gistconcentratie echter opgevoerd dan zal deze oxidatie minder sterk doorgaan. Voor de
normale concentratie aan gist (1 maal de concentratie in deeg) is deze tegenwerkende kracht over de
beschouwde incubatietijd nauwelijks merkbaar. De 10 en 100 maal zo geconcentreerde
gistconcentraties zorgen voor een veel sterkere regeneratie van NADH. Deze leveren een veel hogere
ethanolconcentratie aan het bloem alcohol dehydrogenase om NAD+ te reduceren.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60
Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie (%
) NAD, blancoNAD, gist 100*NAD, gist 10*NAD, gist 1*NADH, blancoNADH, gist 100*NADH, gist 10*NADH, gist 1*
Figuur 3.5.5 Het effect van de aanwezigheid van gist en ethanol op een bloemsuspentie met NADH
Een incubatie van NAD+ in gelijkaardige mengsels geeft gelijkaardige resultaten. Indien geen gist of
ethanol wordt toegevoegd dan kan ADH NAD+ niet reduceren. Ditzelfde geld voor de normale
gistconcentratie, die ook nauwelijks co-enzym-omzettingen induceert. De incubatie met ethanol of een
115
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
verhoogde gistconcentratie geven een sterkere NADH vorming. Voor ethanol gebeurt dit onmiddelijk,
de concentratie is immers onmiddellijk hoog genoeg voor een sterke activiteit van ADH. Bij gist treedt
er enige vertraging op omdat deze eerst voldoende ethanol moet produceren (figuur 3.5.6).
0102030405060708090
100
0 20 40 60Incubatietijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie (%
)NAD, -NAD, ethanolNAD, gist (100*)NAD, gist (1*)NADH, -NADH, ethanolNADH, gist (100*)NADH, gist (1*)
Figuur 3.5.6 Het effect van de aanwezigheid van gist en ethanol op een bloemsuspentie met NAD+
3.5.3.2 Additie van mannitol dehydrogenase (MDH) van L. pseudomesenteroides
Ook bij dit systeem werden het effect van een voorincubatie beschouwd. Bij een voorincubatie krijgt
de gist de kans ethanol te produceren en het alcohol dehydrogenase de kans het geoxideerde co-enzym
te reduceren. Na die voorincubatie zal MDH met D-fructose als substraat het co-enzym opnieuw
oxideren.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie (%
)
Blanco, NAD Blanco, NADHTest, NAD Test, NADH
Figuur 3.5.7 De additie van MDH en D-fructose na een voorincubatie van 1 uur
Figuur 3.5.7 geeft het resultaat weer van dit experiment. In vergelijking met de activiteit van NADH-
oxidase voor NADH, is ADH hier beduidend minder actief voor NAD+. Waarschijnlijk is de
ethanolconcentratie in het reactiemengsel niet hoog genoeg om een snellere omzetting teweeg te
116
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
brengen. NADH-oxidase daarentegen heeft een onbeperkte substraatbron, namelijk zuurstof uit de
lucht.
Opmerkelijk is het feit dat NADH-oxidase hier nauwelijks actief is. De blanco vertoont immers geen
regeneratie van NAD+, die in het FDH-experiment zo sterk optrad. Een mogelijke verklaring hiervoor
kan gezocht worden bij de gistfermentatie. Deze fermentatie zorgt voor een anaërobe omgeving in het
reactiemengsel door een continue CO2-productie. Deze gasvorming zorgt als het ware voor een soort
‘flush’ van het reactiemengsel.
De evolutie van een aërobe naar een anaërobe toestand in reactiemengsel wordt verduidelijkt indien
geen voorincubatie in acht wordt genomen (figuur 3.5.8). Hierbij loopt de blanco de eerste 10 minuten
evenwijdig met het test-mengsel, wat betekent dat ook in het blancomengsel een zekere regeneratie
van co-enzymen optreedt. Deze regeneratie is echter van korte duur, gezien na 30 minuten de
NADH/NAD+-ratio sterk begint te stijgen. Vanaf dit punt zal het merendeel van het zuurstofgas in het
mengsel omgezet zijn tot water of weggeflushed zijn met het gevormde gas.
0102030405060708090
100
0 10 20 30 40 50 6tijd (min)
rela
tieve
con
cent
ratie
(%)
0
Blanco, NAD Blanco, NADHTest, NAD Test, NADH
Figuur 3.5.8 Het effect van MDH en D-fructose zonder voorincubatie
3.5.3.3 Effect van verschillende MDH-concentraties (L. pseudomesenteroides)
Zoals in § 3.5.2.2 aangegeven speelt de concentratie aan enzym een belangrijke rol bij de
reactiesnelheid en de snelheidsconstante van een enzymatische reactie. Deze stelling geldt schijnbaar
niet voor MDH, gezien een incubatie met 90 en 900 units per liter reactiemengsel hetzelfde resultaat
geven. Dit kan verklaard worden door de zeer hoge substraatconcentratie en KM-waarde van MDH.
Deze beide parameters duwen de reactie in de richting van de producten en zorgen voor een lage
NADH/NAD+-verhouding. Een lagere substraatconcentratie zou eventueel deze verhouding kunnen
beïnvloeden omdat dan de enzymconcentratie een grotere rol kan gaan spelen (figuur 3.5.9). Wat wel
verschillend is tussen de twee concentraties enzym is de snelheid waarmee de reactie doorgaat. Het
mengsel 90 U enzym per liter bereikt de evenwichtsverhouding van de co-enzymen iets trager dan 900
117
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
U per liter. Dit is het gevolg van de maximale reactiesnelheid die afhankelijk is van de totale
enzymconcentratie in het reactiemengsel (Mathews et al., 1995).
0102030405060708090
100
0 20 40 60 80tijd (min)
rela
tieve
con
cent
ratie
s (%
)
0 U/L NAD 90 U/L NAD 900 U/L NAD0 U/L NADH 90 U/L NADH 900 U/L NADH
Figuur 3.5.9 Effect van verschillende MDH-concentraties op de co-enzymregeneratie
3.5.3.4 Opvolgen van de reactieproducten
D-mannitol en acetaldehyde zijn de reactieproducten van respectivelijk de reactie van MDH en ADH.
Deze beide producten werden eveneens opgevolgd met een HPLC. Hieruit bleek echter dat geen van
beide kon gedetecteerd worden. Waarschijnlijk liggen de gevormde concentraties onder de
detectielimiet van de RI-detector. De concentraties van de co-enzymen liggen immers in de grootte
orde van micromolair. Het aantal regeneratie-cycli die de co-enzymen ondergaan zullen bepalen welke
grootte orde de product-concentraties hebben. Indien in het mengsel 500 µM aanwezig is dan moeten
alle co-enzymen 2 keer worden geregenereerd om 1 mM mannitol en acetaldehyde te krijgen.
De enzymactiviteit in het reactiemengsel was 500 units per liter reactiemengsel. Dit betekend dat per
minuut 500 µM co-enzym zal omgezet worden door MDH. Indien enkel rekening wordt gehouden met
de MDH-reactie dan zou 1 regeneratie-cyclus 1 minuut duren en een halve millimolair mannitol
opleveren. Na 6 uur incubatie zal dus 180 mM mannitol gevormd worden.
Dit cijfer is een overschatting van de werkelijkheid. Naast het feit dat enkel het meest actieve enzym
in rekening werd gebracht, wordt geen rekening gehouden met enzymdegeneratie. Na 24 uur bij 25ºC
blijkt de totale activiteit van MDH in een reactiemengsel te zijn gereduceerd tot een derde van zijn
initiële waarde.
De enzymdegradatie (§ 3.1.4.4) kan uitgezet worden in functie van de tijd en levert een lineaire
vergelijking op (vergelijking (3.13)).
500t(min)0,2325(U/l)activiteitEnzym (3.13)
Deze vergelijking geïntegreerd over een tijd t geeft de concentratie aan gevormd product (vergelijking
(3.14)).
118
GEKOPPELDE ENZYMSYSTEMEN RESULTATEN EN BESPREKING
µMproductieconcentratt500t0,116525 2 (3.14)
Over een periode van 360 minuten wordt dus niet 180 mM mannitol, maar 165 mM gevormd.
Het aantal units ADH in het mengsel ligt veel lager. Dit blijkt uit de verschillende experimenten die
beschreven zijn in hoofdstuk 3.2. Hieruit kan het aantal units ADH per gram bloem worden bepaald
voor elke blanco. Dit is (0,435 ± 0,017) U/g. Omgerekend naar aantal units per liter reactiemengsel
geeft dit (36,2 ± 1,4) U/l. Zonder rekening te houden met enzymdegradatie komt dit neer een vorming
van 13 mM acetaldehyde over een incubatie van 6 uur. Omdat dit de snelheidsbepalende stap is zal er
dus een gelijkaardige hoeveelheid mannitol gevormd worden.
3.5.3.5 Enzymextract van G. oxydans als alternatieve dehydrogenase-bron
In § 3.1.6 werden sorbitol en mannitol dehydrogenase beschreven van G. oxydans. Beide zijn in staat
D-fructose te reduceren met NADH tot respectievelijk D-sorbitol en D-mannitol. Het toepassen van
het Gluconobacter celextract in het MDH-systeem zou dus hetzelfde effect moeten hebben als het
celextract Leuconostoc (figuur 3.5.10). In relatieve concentraties uitgedrukt klopt deze stelling, maar
in reële concentraties blijken andere factoren ook een rol te spelen. Bij toevoegen van het
enzymextract aan het reactiemengsel blijken de co-enzymen sneller af te breken in vergelijking met
het Leuconostoc-extract. Waarschijnlijk bezit Gluconobacter, net als tarwe, een enzym dat co-
enzymen afbreekt.
0102030405060708090
100
0 30 60 90Tijd (min)
Rel
atie
ve c
once
ntra
tie (%
)
120
Blanco, NAD Test, NADBlanco, NADH Test, NADH
Figuur 3.5.10 De co-enzymregeneratie door middel van een G. oxydans enzymextract
119
ALGEMEEN BESLUIT
4 Algemeen besluitDe verschillende co-enzymregeneratiesystemen, het FDH-systeem en het L. pseudomesenteroides
MDH-systeem, blijken te werken. In een bloemextract kan formiaat dehydrogenase de oxidatieve
kracht van NADH-oxidase tegenwerken (figuur 4.1). Dit regeneratief vermogen is afhankelijk van de
concentratie aan enzym en de concentratie aan substraat, namelijk formiaat, waaruit CO2 en water
wordt gevormd. Hierbij wordt het systeem volledig gestopt indien een chelaterend agens wordt
toegevoegd. NADH-oxidase is immers afhankelijk van een metaalion voor zijn katalytische werking.
Ook thiolen kunnen inhibitorisch optreden. Deze inhibitie is waarschijnlijk te wijten aan de
substraatpreferentie van het enzym. Waarschijnlijk verkiest het enzym gereduceerde thiolen in plaats
van NADH om zuurstofgas te reduceren tot water.
NADH NAD+
O2 H2ONADH-oxidase
formiaatCO2+H2O
Formiaat dehydrogenase
AMP+NMNH AMP+NMNNPPNPP
Figuur 4.1 Het formiaat dehydrogenase co-enzmregeneratie systeem in een bloemextract
De regeneratie van co-enzymen door mannitol dehydrogenase in een vereenvoudigd deegsysteem
verloopt iets complexer. Voordat enige regeneratie kan optreden moet gist glucose en de suikers uit
bloem fermenteren met vorming van ethanol. Deze ethanol zal dan geoxideerd worden door een
alcohol dehydrogenase, aanwezig in bloem, tot acetaldehyde. Hierbij wordt NADH gevormd uit
NAD+. Dit NADH kan door mannitol dehydrogenase aangewend worden om D-fructose te reduceren
tot D-mannitol. Naast het mannitol dehydrogenase is in de eerste stadia van de incubatie NADH-
oxidase nog werkzaam omdat er nog zuurstofgas in het mengsel aanwezig is. Na een zekere tijd
fermenteren wordt dit zuurstofgas uit het mengsel geflushed door de CO2-productie. Vanaf dat
moment zal enkel MDH nog verantwoordelijk zijn voor de regeneratie van de co-enzymen (figuur
4.2).
Mannitol dehydrogenase kan met twee verschillende stammen geproduceerd en vrijgesteld worden,
namelijk Leuconostoc pseudomesenteroides en Gluconobacter oxydans. G. oxydansMDH/SDH
enzymextract kan voor een goede regeneratie van co-enzymen zorgen maar heeft een groot nadeel. Het
bevat enzymen die co-enzymen afbreken, waardoor opzuivering een noodzaak is.
120
ALGEMEEN BESLUIT
Het is nog niet duidelijk of het nu om één enzym gaat met twee verschillende actieve centra die zowel
D-sorbitol als D-mannitol kan oxideren of om twee verschillende enzymen met een gelijk moleculair
gewicht. Differentiëring aan de hand van een temperatuursbehandeling leverden hierover geen
duidelijkheid op.
Het mannitol dehydrogenase extract van L.pseudomesentreroides heeft een groter potentieel. Het
bevat geen proteasen – die de deegstructuur kunnen afbreken – en het bevat geen enzymen die in staat
zijn co-enzymen af te breken. De productie van het enzym gebeurt het best in aanwezigheid van
fructose dat de enzymproductie lijkt te stimuleren. De eerste opzuiveringstappen zijn relatief
eenvoudig (ammonium-sulfaat precipitatie en dialyse).
Het enzym wordt gestabiliseerd door L-cysteïne en glutathion, twee courant gebruikte reducerende
agentia in de bakkerijsector. Ze inhiberen ook de werking van het NADH-oxidase dat zowel aanwezig
is in bloem als in het ruwe L. pseudomesenteroides enzymextract.Bloem + Glucose + Gist
Frementatie
CO2 + EthanolBloem Alcohol dehydrogenase
Acetaldehyde
NAD+ NADH
D-fructoseD-mannitolMannitol dehydrogenase
NPP NPPAMP + NMN AMP + NMNH
NADH-oxidaseO2H2O
Figuur 4.2 De mannitol dehydrogenase co-enzymregeneratie in een deegsysteem
Alle regeneratiesystemen in bloem bleken te kampen te hebben met co-enzym afbraak. Het enzym
hiervoor verantwoordelijk werd geïdentificeerd als een nucleotide pyrofosfatase. Dit enzym (100kDa)
heeft een alkalisch pH optimum, blijkt erg thermostabiel (na een incubatie van 10 minuten bij 70ºC
nog actief) en heeft een relatief hoog temperatuursoptimum. Magnesium en mangaan zijn de metalen
die het aanwendt als cofactor.
De NADH-hydrolasen van de Nudix-familie lijken de meeste eigenschappen met dit enzym
gemeenschappelijk te hebben. Een sequentiebepaling moet hierover uitsluitsel geven. Hiervoor is
slechts een klein stukje van de aminozuursequentie (ongeveer 20 aminozuren) nodig. De volledige
sequentie van Triticum aestivum is immers bekend. Via BLAST kan de volledige proteïne-sequentie
bepaald worden.
121
ALGEMEEN BESLUIT
Efficiënte inhibitoren van het nucleotide pyrofosfatase zijn chelatoren, AMP, ADP, gereduceerd
glutathion en L-cysteïne. Omdat de chelatoren het volledige regeneratief systeem zouden stilleggen en
AMP en ADP te duur zijn om aan te wenden, blijven enkel gereduceerd glutathion en L-cysteïne over
als potentiële inhibitoren, naast pyrofosfaat dat waarschijnlijk als metaalchelator optreedt. Hun
gebruik brengt echter een groot nadeel met zich mee. De concentraties, nodig voor optimale inhibitie,
zijn erg hoog. Hun sterke reducerende kracht zal de deegstructuur dus sterk gaan verzwakken.
Naast het technische probleem, speelt ook de voedselveiligheid een rol. Dergelijke concentraties
zullen nooit aanvaard worden in levensmiddelen.
De gedachte achter het co-enzym regeneratie systeem met mannitol dehydrogenase is de concentratie
aan NAD+ zo hoog mogelijk houden. Als sterk oxiderend agens zal het een rol spelen in het
verstevigen van de deegstructuur door oxidatie van thiolen. Het exacte mechanisme hiervoor is tot op
heden nog onbekend. Een mogelijkheid is dat het NAD+ samen met glutathion dehydrogenase in eerste
instantie alle thiolen met laag moleculair gewicht (LMG) zal oxideren. Deze moleculen kunnen in de
beginfase van de deegvorming immers, samen met de enzymen en co-enzymen, makkelijker dan de
gluten-proteïnen oplossen in de waterige fase. Eens alle LMG-thiolen geoxideerd zijn, kunnen ze niet
meer gaan binden op de thiolen van de gluten. Deze kunnen dus enkel nog onder elkaar gaan cross-
linken, wat tot een sterkere deeg leidt.
122
ADDENDUM
AddendumA. Embden-Meyerhof-Parnas route voor hexose fermentatie in homofermentatieve melkzuurbacteriën.
B. Biochemische pathway van de hexose fermentatie in heterofermentatieve melkzuurbacteriën.
C. Pathway van de NAD+-synthese.
D. Afbraak van NADP+ en NAD+ door Aspergillus niger.
E. Afbraak van NAD+ door Haemophilus parainfluenza.
F. Overzicht van de aminozuurcodes.
i
ADDENDUM
A. Embden-Meyerhof-Parnas route voor hexose fermentatie in homofermentatieve melkzuurbacteriën
(1) en (2); fosfoenolpyruvaat (PEP)-afhankelijk suiker fosfotransferase systeem (PTS); (3) mannitol-
specifiek PTS; (4) fosfoglucose isomerase; (5) mannitol 1-fosfaat dehydrogenase; (6) mannitol 1-
fosfatase; (7) 6-fosfofructokinase; (8) fructose-difosfatase; (9) fructose-1,6-difosfaat aldolase; (10)
triosefosfaat isomerase; (11) glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase en fosfoglyceraat kinase; (12)
fosfoglyceromutase en enolase; (13) pyruvaat kinase; (14) lactaat dehydrogenase; (15) pyruvaat-
formiaat lyase; (16) acetaldehyde dehydrogenase en alcohol dehydrogenase; (17) pyruvaat
dehydrogenase; (18) acetaat kinase; (19) -acetolactaat synthase; (20) -acetolactaat decarboxylase;
(21) 2,3-butanediol dehydrogenase.(Wisselink et al., 2002)
ii
ADDENDUM
B. Biochemische pathway van de hexose fermentatie in heterofermentatieve melkzuurbacteriën.
(1) en (2) glucose en fructose permease; (3) glucokinase; (4) glucose 6-fosfaat dehydrogenase; (5) 6-
fosfogluconaat dehydrogenase; (6) epimerase; (7) fosfoketolase; (8) glucose-fosfaat isomerase; (9)
fructokinase; (10) mannitol dehydrogenase; (11) glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase en
fosfoglyceraat kinase; (12) fosfoglyceromutase en enolase; (13) pyruvaat kinase; (14) lactaat
dehydrogenase; (15) fosfaat acetyltransferase; (16) acetaldehyde dehydrogenase en alcohol
dehydrogenase; (17) acetaat kinase.(Wisselink et al., 2002)
iii
ADDENDUM
C. Pathway van de NAD+-synthese
H2N CH C
CH2
OH
O
HN
NH+ COO-
COO-
PRPP
NH+
CO-
O
PRPP
PPi
OO
OHOH
HHHH
N+
CO-
O
PO32-
PPi
ATP
NH+
CNH2
O
PRPP
PPi
OO
OHOH
HHHH
N+
CNH2
O
PO32-
PPi
ATP
N
N N
N
NH2
O
HO OH
H HH H
P
O
O
O-O
OH
HHHH
P
O
O O
O-
HO
N +
C
O
O-
N
N N
N
NH2
O
HO OH
H HH H
P
O
O
O-O
OH
HHHH
P
O
O O
O-
OH
+
N
C
O
NH2
Tryptofaan
Quinolinaat
PPi + CO2
quinolinaatfosforibosyltransferase
Nicotinaat
nicotinaatfosforibosyltransferase
Nicotinaat mononucleotide
NAD+
pyrofosforylase
Nicotinamide
nicotinamidefosforibosyltransferase
NAD+
pyrofosforylase
Nicotinaat adenine dinucleotide
ATP + glutamine + H2O
ATP + glutamaat
Nicotinamide mononucleotide (NMN)
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)
(Voet et al., 1995)
iv
ADDENDUM
D. Afbraak van NADP+ en NAD+ door Aspergillus niger
N
N N
N
NH2
O
OH OH
H H
H H
P O
O
-O
OHH
HHPO
O
O
O-
OH
+ N
C
O
NH2
NADP+
PO
-O
O-
O
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
PO
O
O-
O
OH
HHHH
PO
O
O
O-
OH
+ N
C
O
NH2
NAD+
Pi
alkalisch of zuurfosfatase
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
P
O
O
-OO
OH
HHHH
P
O
O HO
O-
OH
+
N
C
O
NH2
-O
Adenosinedifosfaat (ADP) Nicotinamide ribonucleoside (NR)
+
alkalisch of zuurfosfatase
alkalisch of zuurfosfatase
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
P
O
O
O-
-O
Adenosinemonofosfaat (AMP)
Pi
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
HO
Adenosine
alkalisch of zuurfosfatase
Pi
zuur milieu
OHO
OHOH
HH
HH
HO
N
NNH
N
NH2
ribose adenine
+
H2O
(Elzainy et al., 2000)
v
ADDENDUM
E. Afbraak van NAD+ door Haemophilus parainfluenza
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
PO
O
O-
O
HO
HHHH
PO
O
O
O-
HO
+ N
C
O
NH2
NAD+
nucleotide pyrofosfatase
O
OH
HHHH
P
O-O O
O-
OH
+
N
C
O
NH2
Nicotinamide mononucleotide (NMN)
+
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
P
O
O
-O
O
OH
HHHH
P
O
O
HO
-O
OH
+
N
C
O
NH2
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
P
O
O
O-
-O
Adenosinemonofosfaat (AMP)
-O
Adenosinedifosfaat (ADP)
Pi
alkalisch fosfatase
Nicotinamide ribonucleoside (NR)
+
N
C
O
NH2
nucleotide pyrofosfatase
NAD glycohydrolase
Nicotinamide (Nam)
(Cynamon et al., 1988b)
vi
ADDENDUM
F. Overzicht van de aminozuurcodes
Alanine Ala A
Cysteine Cys C
Aspartaat Asp D
Glutamaat Glu E
Fenylalanine Phe F
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Ile I
Lysine Lys K
Leucine Leu L
Methionine Met M
Asparagine Asn N
Proline Pro P
Glutamine Gln Q
Arginine Arg R
Serine Ser S
Threonine Thr T
Valine Val V
Tryptofaan Trp W
Tyrosine Tyr Y
(Mathews et al., 1995)
vii
LITERATUURLIJST
LiteratuurlijstAbdebraheim, S. R., Spiller, D. G. & McLennan, A. G. 2003. Mammalian NADH diphosphatases ofthe Nudix family: cloning and characterization of the human peroxisomal NUDT12 protein. Biochemical Journal.374, 329-335.
Abdelbraheim, S. R., Spiller, D. G. & McLennan, A. G. 2003. Mammalian NADH diphosphatases of the Nudix family: cloning and characterization of the human peroxisomal NUDT12 protein. Biochemical Journal.374, 329-335.
Abeygunawardana, C., Weber, D. J., Gittis, A. G., Frick, D. N., Lin, J., Miller, A. F., Bessman, M. J.& Mildvan, A. S. 1995. Solution structure of the MutT enzyme, a nucleotide triphosphatepyrohydrolase. Biochemistry.34, 14997-15005.
Adachi, O., Matsushita, K., Shinagawa, E. & Ameyama, M. 1980. Crystallization and properties of NADP-dependent aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus. Agricultural and Biological Chemistry.44, 155-164.
Adachi, O., Toyama, H. & Matsushita, K. 1999a. Crystalline NADP-dependent D-mannitoldehydrogenase from Gluconobacter suboxydans. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry.63,402-407.
Adachi, O., Toyama, H., Theeragool, G., Lotong, N. & Matsushita, K. 1999b. Crystallization and properties of NAD-dependent D-sorbitol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans IFO 3257. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry.63, 1589-1595.
Agudo, A., Ribeiro, J. M., Canales, J. & Cameselle, J. C. 1998. Use of potato tuber nucleotide pyrophosphatase to synthesize adenosine-5’-monophosphate methyl esters: evidence that the solvolytic preferences of the enzyme are regulated by pH and temperature. Biotechnology and Bioengineering.59, 62-67.
Akiyama, T. & Yamamoto, S. 1986. Immunochemical differences in acid phosphatase isoenzymesfrom wheat germ. Agricultural and Biological Chemistry.50, 437-440.
Ames, B. N. & Dubin, D. T. 1960. The Role of Polyamines in the Neutralization of Bacteriophage Deoxyribonucleic Acid. The Journal of Biological Chemistry.235, 769-775.
Aso, Y., Gotoh, S. & Yamasaki, N. 1989. A HPLC-method for simultaneous analysis of NAD(P)+ and NAD(P)H-its application to the study of spinach ferredoxin: NADP+ reductase-catalyzedtranshydrogenation. Agricultural and Biological Chemistry.53, 1635-1639.
Bailey, S., Sedelnikova, S. E., Blackburn, G. M., Abdelghany, H. M., Baker, P. J., McLennan, A. G. &Rafferty, J. B. 2002. The crystal structure of diadenosine tetraphosphate hydrolase fromCaenorhabditis elegans in free and binary complex forms. Structure.10, 589-600.
Baker, J. C. & Mize, M. D. 1941. The origin of the gas cell in bread dough. Cereal Chemistry.18, 19-34.
Balakrishnan, C. V., Ravindranath, S. D. & Appaji Rao, N. 1974. Studies on nucleotidases in plants: Reversible denaturation of the crystalline mung bean nucleotide pyrophosphatase and the effect ofadenylates on the native and renaturated enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics.164, 156-164.
LITERATUURLIJST
Balakrishnan, C. V., Ravindranath, S. D. & Appaji Rao, N. 1975. Studies on nucleotidases in plants: Dimerization of the crystalline mung bean nucleotide pyrophosphatase by 5'-adenosinemonophosphate and the properties of the dimerized enzyme. Archives of biochemistry andbiophysics.168, 163-170.
Balakrishnan, C. V., Vaidyanathan, C. S. & Rao, N. A. 1977. Studies on nucleotidases in plants: Isolation and properties of the monomeric form of the crystalline and homogeneous mung beannucleotide pyrofosfatase. European Journal of Biochemistry.78, 95-102.
Bartkiewicz, M., Sierakowska, H. & Shugar, D. 1984. Nucleotide pyrophosphatase from potato tubers. Purification and properties. European Journal of Biochemistry.143, 419-426.
Bess, I. & Buchanan, B. B. 1997. Thioredoxin-linked plant and animal processes: the new generation. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei).38, 1-11.
Bessman, M. J., Bullions, L. C., Bhatnagar, S. K., Branden, B. C. & Love, W. E. 1991. Crystallizationand preliminary X-ray diffraction studies on the mutT nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolaseof Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry.266, 9055-9056.
Bessman, M. J., Frick, D. N. & O'Handley, S. F. 1996. The MutT Proteins or 'Nudix' hydrolases, afamily of versatile, widely distributed 'Housecleaning' enzymes. The Journal of BiologicalChemistry.271, 25059-25062.
Bhatnagar, S. K., Bullions, L. C. & Bessman, M. J. 1991. Characterization of the MutT nucleosidetriphosphate of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry.266, 9050-9054.
Bloksma, A. H. 1972. The relation between the thiol disulfide contents of dough and its reological properties. Cereal Chemistry.49, 104-117.
Bloksma, A. H. 1990. Dough structure, dough reology and baking quality. Cereal Foods World.35,237-244.
Boeck, D. & Grosch, W. 1976. Glutathion-dehydrogenase (EC 1.8.5.1) aus Weizenmehl.Reinarstellung und Eigenschaften. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung.162,243-251.
Borch, K., Christiansen, L. & Jensen, M. 2004. Treatment of dough with a lipoxygenase and a lipolytic enzyme. WO2004004467.
Buchanan, B. B. & Kobrehel, K. 1998. Use of thiol redox proteins for reducing protein intramoleculardisulfide bonds, for improving the quality of cereal products, dough and baked goods. EP0863154.
Cherdkiatgumchai, P. & Grant, D. R. 1986. Enzymes that contribute to the oxidation of L-ascorbic acid in flour/water systems. Cereal Chemistry.63, 197-200.
Cho, M., Wong, J. H., Marx, C., Jiang, W., Lemaux, P. G. & Buchanan, B. B. 1999. Overexpression of thioredoxin h leads to enhanced activity of strach debranching enzyme (pullulanase) in barley grain.Plant Biology.96, 14641-14646.
Clements, R. L. 1992. Effect of metal-complexing agents on water binding by gluten. Cereal Chemistry.69, 315-320.
Cynamon, M. H., Sorg, T. B. & Patapow, A. 1988a. Utilization and metabolism of NAD byHaemophilus parainfluenzae. Journal of general microbiology.134, 2789-2799.
LITERATUURLIJST
Cynamon, M. H., Sorg, T. B. & Patapow, A. 1988b. Utilization and metabolism of NAD+ byHaemophilus parainfluenzae. Journal of General Microbiology.134, 2789-2799.
de Lamotte, F., Vianey-Liaud, N., Duviau, M. & Kobrehel, K. 2000. Glutathione reductase in wheat grain. I. Isolation and characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry.48, 4978-4983.
De Wolf, S. 2002. Karakterisering van Candida xylose reductase en Gluconobacter sorbitol dehydrogenase. Gent. Universiteit Gent.
Dewettinck, K. 2002. Technologie van de plantaardige producten, Gent, Universiteit Gent. 275 pp.
Dobrzanska, M., Szurmak, B., Wyslouck-Cieszynska, A. & Kraszewska, E. 2002. Cloning andcharacterization of the first member of the Nudix family from Arabidopsis thaliana. The Journal of Biological Chemistry.277, 50482-50486.
Dong, W. & Hoseney, R. C. 1995. Effect of certain breadmaking oxidants and reducing agens ondough rheological properties. Cereal Chemistry.72, 58-64.
Dunn, C. A., O'Handley, S. F., Frick, D. N. & Bessman, M. J. 1999. Studies on the ADP-ribosepyrophophatase subfamily of the Nudix hydrolases and tentative identification of trgB, a gene associated with tellurite resistance. The Journal of Biological Chemistry.274, 32318-32324.
Elkassabany, M., Hoseney, R. C. & Seib, P. A. 1980. Ascorbic acid as an oxidant in wheat flour dough. I. Conversion to dehydroascorbic acid. Cereal Chemistry.57, 58-91.
Elzainy, T. A. & Ali, T. H. 2000. Pathways of NADP+ and NAD+ degradation by Aspergillus niger extracts. Annals of Microbiology.50, 65-75.
Emanuelson, J., Wollenweber, B., Jorgensen, J. R., Andersen, S. B. F. & Jensen, C. R. 2003. Wheatgrain composition and implications for bread quality. Plant Production (DIAS Report).92, 1-40.
Encyclopedia Britannica CD '99. Multimedia edition. 1999. Encyclopedia Britannica, Inc.
Erten, H. 1998. Metabolism of fructose as an electron acceptor by Leuconostoc mesenteroides. Process Biochemistry.33, 735-739.
European Parliament and Council Directive 94/35/EC, 94/36/EC and 95/2/EC of 20 February on food additives other than colours and sweeteners
Every, D., Gilpin, M. & Larsen, N. G. 1996. Ascorbate oxidase levels in wheat and their relationshipto baking quality. Journal of Cereal Science.23, 145-151.
Every, D. 1999. Purification and characterization of ascorbate oxidase from flour and immature wheat kernels. Journal of Cereal Science.30, 245-254.
Faltynek, C. R., Silbert, J. E. & Hof, L. 1981. Inhibition of the action of pyrophosphatase and phosphate on sugar nucleotides. The Journal of Biological Chemistry.256, 7139-7141.
Farré, E. M., Geigenberger, P., Willmitzer, L. & Tretkewey, R. N. 2000. A possible role for pyrophosphate in the coordination of cytosolic and plastidial carbon metabolism within potato tuber. Plant Physiology.123, 681-688.
Field, J. M., Shewry, P. R. & Miflin, B. J. 1983. Solubilization and characterization of wheat glutenproteins; correlation between the amount of aggregated proteins and baking quality. Journal of the Science of Food and Agriculture.34, 370-377.
LITERATUURLIJST
Figueroa-Espinoza, M. C. & Rouau, X. 1998. Oxidative cross-linking of pentosans by a fungal laccase and horseradisch peroxidase. Mechanisms of linkage between feruloylated arabinoxylans. Cereal Chemistry.75, 259-265.
Fitzgerald, R. J. 1998. Potential uses of caseinophosphopeptides. International Dairy Journal.8, 451-457.
Frick, D. N. & Bessman, M. J. 1995. Cloning, purification, and properties of a novel NADH pyrophosphatase. Evidence for a nucleotide pyrophosphatase catalytic domain in mutT-like enzymes.The Journal of Biological Chemistry.270, 1529-1534.
Furukawa, S., Katayama, N., Iizuka, T., Urabe, I. & Okada, H. 1980. Preparation of polyethyleneglycol-bound NAD and its application in a model enzyme reaction. FEBS Letters.121, 239-242.
Garti, N., Kraus, D. J., Neidleman, S. L., Pinthus, E. J. & Pokora, A. 1996. Baking improver/doughconditioner. WO9606536.
Geueke, B., Riebel, B. & Hummel, W. 2003. NADH oxidase from Lactobacillus brevis: a new catalystfor regeneration of NAD+. Enzyme and Microbial Technology.32, 205-211.
Gilmour, P. S., Beswick, P. H., Brown, D. M. & Donaldson, K. 1995. Detection of surface free radical activity of respirable industrial fibres using supercoiled phi-X174 RF1 plasmid DNA.Carcinogenesis.16, 2973-2979.
Grant, D. R. & Sood, V. K. 1980. Studies on the role of ascorbic acid in chemical dough development.II. Partial purification and characterization of an enzyme oxidizing ascorbate in flour. Cereal Chemistry.57, 46-49.
Grobben, G. J., Peters, S. W. P. G., Wisselink, H. W., Weusthuis, R. A., Hoefnagel, M. H. N.,Hugenholtz, J. & Eggink, G. 2001. Spontaneous formation of a mannitol-producing variant of Leuconostoc pseudomesenteroides grown in the presence of fructose. Applied and EnvironmentalMicrobiology.67, 2867-2870.
Grosch, W. & Wieser, H. 1999. Redox reactions in wheat dough as affected by ascorbic acid. Journal of Cereal Science.29, 1-16.
Gujral, H. S., Gaur, S. & Rosell, C. M. 2003. Note: Effect of barley flour, wet gluten and ascorbic acid on the bread crumb texture. Food Science and Technology International.9, 17-21.
Gupta, R. B., Khan, K. & MacRitchie, F. 1993. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. II. Effects of variations in the quantity and size distribution of polymeric protein. Journal of Cereal Science.18, 23-41.
Hahn, G., Kaup, B., Bringer-Meyer, S. & Sahm, H. 2003. A zinc-containing mannitol-2-dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291: purfication of the enzyme and cloning of the gene. Archives in Microbiology.179,
Han, M. S. & Kim, D. H. 2002. Naked-eye detection of phosphate ions in water at physiological pH: a remarkably selective and easy-to-assemble colorimetic phosphate-sensing probe. Angwandte Chemie - International edition.41, 3809-3811.
Han, M. S. & Kim, D. H. 2003. Visual detection of AMP and real-time monitoring of cyclicnucleotide phosphodiesterase (PDE) activity in neutral aqueous solution. Chemosensor-coupled assayof PDE and PDE inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.13, 1079-1082.
LITERATUURLIJST
Harding, J. J. 1973. Affinity chromatografy in the purification of glutathion reductase. Journal of Chromatography.77, 191-199.
Haroz, R. K., Twu, J. S. & Bretthauer, R. K. 1972. Purification and properties of a yeast nucleotide pyrophosphatase. The Journal of Biological Chemistry.247, 1452-1457.
Hartl, D. L. & Jones, E. W. 2000. Genetics: Analysis of genes and genomes, 5th ed. London, Jones and Bartlett Publishers International. 858 pp.
He, H. & Hoseney, R. C. 1991. Gas retention in bread dough during baking. Cereal Chemistry.68,521-525.
Homepage: http://www.chemicalmarketreporter.com - Prices of chemicals. 2003. Chemical Market Reporter
Homepage: http://www.spipolyols.com - Polyols comparison chart. 2003. SPI Polyols Inc.
Honold, G. R., Farkas, G. L. & Stahmann, M. A. 1966. The oxidation-reduction enzymes of wheat. I.A qualitative investigation of the dehydrogenases. Cereal Chemistry.43, 517-529.
Honold, G. R., Farkas, G. L. & Stahmann, M. A. 1967. The oxidation-reduction enzymes of wheat. II. A quantitative investigation of the dehydrogenases. Cereal Chemistry.44, 373-382.
Honold, G. R. & Stahmann, M. A. 1968. The oxidation-reduction enzymes of wheat. IV. Qualitativeand quantitative investigations of the oxidases. Cereal Chemistry.45, 99-108.
Howaldt, M. W., Gottlob, A., Kulbe, K. D. & Chmiel, H. 1988. Simultaneous conversion ofglucose/fructose mixtures in a membrane reactor. Annals of the New York Academy of Sciences.542,400-405.
Hummel, W. & Riebel, B. 2003. Isolation and biochemical characterization of a new NADH oxidasefrom Lactobacillus brevis. Biotechnology Letters.25, 51-54.
Inoui, C., Yamamoto, H., Nakamura, T., Ichihara, A. & Okamoto, H. 1989. Nicotinamide prolongssurvival of primary cultured hepatocytes without involving loss of hepatocyte-specific functions. TheJournal of Biological Chemistry.264, 4747-4750.
Jacobson, K. B. & Kaplan, N. O. 1956. A reduced pyridine nucleotide pyrophospatase. The Journal of Biological Chemistry.226, 427-437.
Jeck, R., Heik, P. & Woenckhaus, C. 1974. Simple methods in preparing nicotinamidemononucleotide. FEBS Letters.42, 161-164.
Joyce, B. K. & Grisolia, S. 1960. Purification and properties of a nonspecific acid phosphatase fromwheat germ. Journal of Biological Chemistry.235, 2278-2280.
Kahn, D. W. & Anderson, B. M. 1986. Characterization of Haemophilus influenzae nucleotide pyrophosphatase. The Journal of Biological Chemistry.261, 6016-6025.
Kahnt, W. D., Mundy, V. & Grosch, W. 1975. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Dehydrogenase (E.C.1.8.5.1). Vorkommen des Enzyms in verschiedenen Weizensorten. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung.158, 77-82.
Kaid, N., Rakotozafy, L., Potus, J. & Nicolas, J. 1997. Studies on the glutathion-dehydroascorbateoxidoreductase (EC 1.8.5.1) from wheat flour. Cereal Chemistry.74, 605-611.
LITERATUURLIJST
Kisselev, L. L., Justesen, J., Wolfson, A. D. & Frolova, L. Y. 1998. Diadenosine oligophosphates (ApnA), a novel class of signalling molecules? FEBS Letters.427, 157-163.
Kobrehel, K., Yee, B. C. & Buchanan, B. B. 1991. Role of the NADP/thioredoxin system in the reduction of -amylase and trypsin inhibitor proteins. The Journal of Biological Chemistry.266,16135-16140.
Kobrehel, K., Wong, J. H., Balogh, A., Kiss, F., Yee, B. C. & Buchanan, B. B. 1992. Specificreduction of wheat storage proteins by thioredoxin h. Plant Physiology.99, 919-924.
Koike, K., Kobayashi, T., Ito, S. & Saitok, M. 1985. Purification and characterisation of NADHoxidase from a strain of Leuconostoc mesenteroides. Journal of Biochemistry.97, 1279-1288.
Kole, R., Sierakowska, H. & Shugar, D. 1976. Novel activity of potato nucleotide pyrophosphatase.Biochimica et Biophysica Acta.438, 540-550.
Kometani, T., Morita, Y., Furui, H., Yoshii, H. & Matsuno, R. 1994. NAD(P)H regeneration using ethanol as an energy source in baker’s yeast-mediated bioreduction. Journal of Fermentation and Bioengineering.77, 13-16.
Kornberg, A. & Pricer, W. E. 1950. Nucleotide pyrophosphatase. The Journal of BiologicalChemistry.182, 763-778.
Langston, P. J., Hart, G. E. & Pace, C. N. 1979. Purification and partial characterisation of alcohol dehydrogenase from wheat. Archives of Biochemistry and Biophysics.196, 611-618.
Langston, P. J., Pace, C. N. & Hart, G. E. 1980. Wheat alcohol dehydrogenase isozymes. Purification, characterisation and gene expression. Plant Physiology.65, 518-522.
Lau, J. T. Y. & Carlson, D. M. 1981. Galactosyltransferase activities in rat intestinal mucosa. The Journal of Biological Chemistry.256, 7142-7145.
Laval, J. M., Moiroux, J. & Bourdillon, C. 1991. The effect of electrochemical regeneration upon theenzymatic catalysis of a thermodynamically unfavourable reaction. Biotechnology andBioengineering.38, 788-796.
Leonida, M. D. 2001. Redox enzymes used in chiral synthesis coupled to coenzyme regeneration. Current Medical Chemistry.8, 345-369.
Li, X. Y., Gilmour, P. S., Donaldson, K. & Macnee, W. 1996. Free radical activity and pro-inflammatory effects of particulate air pollutoin (PM-10) in vivo and in vitro. Thorax.51, 1216-1222.
Lopez-Gomez, J., Costas, M. J., Ribeiro, J. M., Fernandez, A., Romero, A., Avalos, M. & Cameselle,J. C. 1998. Glycine-enhanced inhibition of rat liver nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-Iby EDTA: a full account of the reported inhibition by commercial preparations of acidic fibroblast growth factor (FGF-1). FEBS Letters.421, 77-79.
Lowry, O. H. & Lopez, J. A. 1945. The determination of inorganic phosphate in the presence of labile phosphate esters. The Journal of Biological Chemistry.162, 421-428.
Machtelinckx, L. & Vandamme, E. J. 2003. Geïmmobiliseerde biokatalysatoren: principes en karakteristieken. In: Industriële Microbiologie en Biokatalyse. Vandamme, E. J. & Soetaert, W. Gent. Universiteit Gent.
LITERATUURLIJST
MacRitchie, F. 1987. Evaluation of the contributions from wheat protein fractions to doughmixing and breadmaking. Journal of Cereal Science.6, 259-268.
Maki, H. & Schiguchi, M. 1992. MutT protein specifically hydrolises a potent mutagenic substrate forDNA-synthesis. Nature.355, 273-275.
Makkee, M., Kieboom, A. P. G. & van Bekkum, H. 1985. Production methods of D-mannitol. Starch-Starke.37, 136-141.
Marques, S., Manzanera, M., Gonzalez-Perez, M. M. & Ramos, J. L. 1999. The XylS-dependent Pmpromotor is transcribed in vivo by RNA polymerase with and depending on the growth phase. Molecular Microbiology.31, 1105-1113.
Mathews, C. K. & Van Holde, K. E. 1995. Biochemistry, 2. Menlo Park, California, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1159 pp.
McDonagh, D. & FitzGerald, R. J. 1998. Production of caseinophosphopeptides (CPPs) from sodiumcaseinate using a range of commercial protease preparations. International Dairy Journal.8, 39-45.
McLennan, A. G. 2000. Dinucleoside polyphosphates - Friend or foe? Pharmacology &Therapeutics.87, 73-89.
Medda, R., Padiglia, A., Lorrai, A., Murgia, B., Agro, A. F., Castagnola, M. & Floris, G. 2000. Purification and properties of a nucleotide pyrophosphatase from lentil seedlings. Journal of Protein Chemistry.19, 209-214.
Meisel, H. 1998. Overview on milk protein-derived peptides. International Dairy Journal.8, 363-373.
Meredith, P. 1965. The oxidation of ascorbic acid and its improver effect in bread doughs. Journal of the Science of Food and Agriculture.16, 474-480.
Micheli, V., Simmonds, H. A., Bari, M. & Pompucci, G. 1993. HPLC determination of oxidized and reduced pyridine coenzymes in human erythrocytes. Clinica Chimica Acta.220, 1-17.
Mills, J. & Allison, N. 1990. A rapid, quantitative microplate assay for NAD-linked D-mannitoldehydrogenase. Letters in Applied Microbiology.11, 211-213.
Mo, J. Y., Maki, H. & Sekiguchi, M. 1992. Hydrolitic elimination of a mutagenic nucleoside, 8-oxodGTP, by human 18-kilodalton protein: Sanitization of nucleotide pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.89, 11021-11025.
Moorhead, G. B. G., Meek, S. E. M., Douglas, P., Bridges, D., Smith, C. S., Morrice, N. &MacKintosh, C. 2003. Purification of a plant nucleotide pyrophosphatase as a protein that interferes with nitrate reductase and glutamine synthetase assays. European Journal of Biochemistry.270, 1356-1362.
Morré, D. J., Jacobs, E., Sweeting, M., de Cabo, R. & Morré, D. M. 1997. A protein disulfide-thiol interchange activity of HeLa plasma membranes inhibited by the antitumor sulfonylurea N-(4methylphenylsulfonyl)-N’-(4-chlorophenyl)urea (LY181984). Biochimica et Biophysica Acta.1325,117-125.
Mortier, E. 2002. Productie-optimalisatie en karakterisering van Gluconobacter suboxydans polyoldehydrogenasen. Gent. Universiteit Gent. 85
LITERATUURLIJST
Muller, C. D., Tarnus, C. & Schuber, F. 1984. Preparation of analogues of NAD+ as substrates for a sensitive fluorimetric assay of nucleotide pyrophosphatase. Biochemistry Journal.223, 715-721.
Nakamura, M. & Kurata, T. 1997a. Effect of L-ascorbic acid and superoxide anion radical on the reological properties of wheat flour-water dough. Cereal Chemistry.74, 651-655.
Nakamura, M. & Kurata, T. 1997b. Effect of L-ascorbic acid on the reological properties of wheat flour-water dough. Cereal Chemistry.74, 647-650.
Nidetzky, B., Haltrich, D., Schmidt, L., Schmidt, H., Weber, A. & Kulbe, K. D. 1996. Simultaneousenzymatic synthesis of mannitol and gluconic acid: II. Development of a continuous process for a coupled NAD(H)-dependent enzyme system. Biocatalysis and Biotransformation.14, 46-53.
O'Handley, S. F., Frick, D. N., Bullions, L. C., Mildvan, A. S. & Bessman, M. J. 1996. Escherichia coli orf17 codes for a nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase member of the MutT family of proteins. The Journal of Biological Chemistry.271, 24649-24654.
O'Handley, S. F., Frick, D. N., Dunn, C. A. & Bessman, M. J. 1998. Orf186 represents a new memberof the Nudix hydrolases, active on adenosine(5')triphospho(5')adenosine, ADP-ribose and NADH. The Journal of Biological Chemistry.273, 3192-3197.
Oikawa, T., Nakai, J., Tsukagawa, Y. & Soda, K. 1997. A novel type of D-mannitol dehydrogenasefrom Acetobacter xylinum: occurence, purification, and basic properties. Bioscience, Biotechnologyand Biochemistry.61, 1778-1782.
Osborne, T. B. 1924. The vegetable proteins, 2nd ed. New York, Longmans Green and Co. 154 pp.
Oxenboll, K. M. & Aagaard, J. 1995. Alkaline glucose oxidase. WO9529996.
Park, O. & Allen, J. C. 1998. Preparation of phosphopeptides derived from S-casein and -caseinusing immobilized glutamic acid specific endopeptidase and characterization of their calcium binding. Journal of Dairy Science.81, 2858-2865.
Pfister, M., Ogilvie, A., da Silva, C. P., Grahnert, A., Guse, A. H. & Hauschildt, S. 2001. NAD degradation and regulation of CD38 expression by human monocytes/macrophages. European Journalof Biochemistry.268, 5601-5608.
Pomeranz, Y. 1968. Relationship between chemical composition and breadmaking potentialities of wheat flour. Advances in Food Research.16, 335-355.
Primo-Martin, C., Valera, R. & Martinez-Anaya, M. A. 2003. Effect of pentosanase and oxidases onthe characteristics of doughs and the glutenin macropolymer (GMP). Journal of Agricultural and Food Chemistry.51, 4673-4679.
Quain, D. E. & Boulton, C. A. 1987. Growth and metabolism of mannitol by strains of Saccharomycescerevisiae. Journal of General Microbiology.133, 1675-1684.
Ranum, P. 1992. Potassium bromate in bread making. Cereal Foods World.37, 253-258.
Raven, P. H., Evert, R. F. & Eichhorn, S. E. 1999. Biology of Plants, 6th ed. New York, W.H.Freeman and Company/Worth Publishers. 944 pp.
Reidl, J., Schlör, S., Krai , A., Schmidt-Braun, J., Kremmer, G. & Soleva, E. 2000. NADP and NAD utilization in Haemophilus parainfluenza. Journal of General Microbiology.134, 2789-2799.
LITERATUURLIJST
Rover, L., Frenandes, J. C. B., de Oliveira Neto, G., Kubota, L. T., Katekawa, E. & Serrano, S. H. P. 1998. Study of NADH stability using ultraviolet-visible spectrophotometric analysis and factorial design. Analytical Biochemistry.260, 50-55.
Sakai, S. & Yamanaka, K. 1968a. Crystalline D-mannitol:NAD oxidoreductase from Leuconostocmesenteroides. Part II. Substrate and coenzyme specificity. Agricultural and Biological Chemistry.32,894-899.
Sakai, S. & Yamanaka, K. 1968b. Crystalline D-mannitol:NAD+ oxidoreductase from Leuconostoc mesenteroides. Biochimica et Biophysica Acta.151, 684-686.
Sarwin, r., Walther, C., Laskawy, G., Butz, B. & Grosch, W. 1992. Determination of free reduced and total glutathione in wheat flours by an isotope dilution assay. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung.195, 27-32.
Serrato, A. J., Perez-Ruiz, J. M. & Cejudo, F. J. 2002. Cloning of thioredoxin h reductase andcharacterization of the thioredoxin reductase-thioredoxin h system from wheat. BiochemicalJournal.367, 491-497.
Shen, B. W., Perraud, A. L., Scharenberg, A. & Stoddard, B. L. 2003. The crystal structure and mutational analysis of human NUDT9. Journal of Molecular Biology.332, 385-398.
Shewry, P. R. & Tatham, A. S. 1997. Disulphide bonds in wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science.25, 207-227.
Si, J. Q. 1994. Use of laccase in baking. PCT/DJ94/00232.
Slatner, M., Nagl, G., Haltrich, D., Kulbe, K. D. & Nidetzky, B. 1998a. Enzymatic production of pure D-mannitol at high productivity. Biocatalysis and biotransformation.16, 351-363.
Slatner, M., Nagl, G., Haltrich, D., Kulbe, K. D. & Nidetzky, B. 1998b. Enzymatic synthesis of mannitol. Reaction engineering for a recombinant mannitol dehydrogenase. Annals of the New YorkAcademy of Sciences.864, 450-453.
Soetaert, W. 1992. Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydrogenation of monosaccharides. Gent. Universiteit Gent. 237
Soetaert, W., Buchholz, K. & Vandamme, E. J. 1995. Production of D-mannitol and D-lactic acid byfermentation with Leuconostoc mesenteroides. Agro-Food-Industry-Hi-Tech.6, 41-44.
Soetaert, W., Vanhooren, P. T. & Vandamme, E. J. 1999. The production of mannitol by fermentation.In: Methods in Biotechnology. Bucke, C. Totowa. Human Press Inc.
Song, K. H., Lee, J.-K., Song, J.-Y., Hong, S.-G., Baek, H., Kim, S.-Y. & Hyun, H.-H. 2002. Production of mannitol by a novel strain of Candida magnoliae. Biotechnology Letters.24, 9-12.
St Clair, N., Wang, Y. F. & Margolin, A. L. 2000. Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC) of alcohol dehydrogenase. Angwandte Chemie - International edition.39, 380-383.
Strandberg, G. W. 1969. D-mannitol metabolism by Aspergillus candidus. Journal of Bacteriology.97,1305-1309.
Stratford, N. 1997. Antioxidant potential of i.v. fluids. British Journal of Anaestesia.78, 757-759.
Swartz, M. N., Kaplan, N. O. & Lamborg, M. F. 1958. A "heat-activated" diphosphopyridinenucleotide pyrophosphatase from Proteus vulgaris.
LITERATUURLIJST
Taiz, L. & Zeiger, E. 1998. Plant Physiology, 2nd ed. Sunderland, MA, Sinaure Associates, Inc. 792 pp.
Takahashi, K. 1996. The reaction of phenylglyoxal with arginine residues in proteins. The Journal of Biological Chemistry.243, 6179-6180.
Theobald, U., Mailinger, W., Baltes, M., Rizzi, M. & Reuss, M. 1997. In vivo analysis of metabolicdynamics in Saccharomyces cerevisiae. I. Experimental observations. Biotechnology andBioengineering.55, 305-316.
Tomlinson, J. D., Robertson, J. A. & Thomson, W. K. 1988. Novel improvers for flour and yeastraised baked goods. WO8803365.
Torelli, S., Belle, C., Gautier-Luneau, I., Pierre, J. L., Saint-Aman, E., Latour, J. M., Le Pape, L. & Luneau, D. 2000. pH-Controlled change of the metal coordination in a dicopper(II) complex of the ligant H-BPMP: crystal structures, magnetic properties, and catecholase activity. InorganicChemistry.39, 3526-3536.
Trufanov, V. A., Kichatinova, S. V., Kazartseva, A. T. & Permyakov, A. V. 2000. Thiol oxidase and disulfide reductase activities of wheat Triticum aestivum L. Caryopsis and its technological quality.Applied Biochemistry and Microbiology.36, 76-79.
Twu, J. S., Haroz, R. K. & Bretthauer, R. K. 1977. Nucleotide pyrophosphatase from yeast. The presence of bound zinc. Archives of Biochemistry and Biophysics.184, 249-256.
Udeh, K. O., Achremowicz, B. & Podgorska, E. 1999. Effect of dough mixing and oxidizing improvers on glutathion and related thiol-containing compounds on bread making quality: A review ofmechanism and controversy. Agro-Food-Industry-Hi-Tech.10, 20-23.
US code of Federal Regulation 21 CFR 172.135§573.360, 42 FR 14491, March 15, 1977 asammended at 48 FR 10815, March 15 1983, 58 FR 52222, October 1993, 60 FR 33710, June 29 1995.
Van Der Meeren, P. 2003. Colloid- en Oppervlaktechemie, Gent, Universiteit Gent. 246 pp.
van der Meijden, R. 1996. Heukel's flora van Nederland, 22 ste ed. Groningen, Wolters-Noordhoff.675 pp.
Vandamme, E. J. & Soetaert, W. 1995. Biotechnological modification of carbohydrates. FEMS Microbiological Reviews.16, 163-186.
Vandamme, E. J., Raemakers, M., Vekeman, N. & Soetaert, W. 1996. Polysaccharides,oligosacharides, special sugars and enzymes via Leuconostoc mesenteroides sp. fermentations. In:Lactic Acid Bacteria: Current Advances in metabolism, genetics and application. Berlin. Springer-Verlag.
Vandamme, E. J. & Soetaert, W. 2003. Industriële Microbiologie en Biokatalyse, Gent, UniversiteitGent. pp.
Vemulapalli, V. & Hoseney, R. C. 1998a. Glucose oxidase effects on gluten and water solubles. Cereal Chemistry.75, 859-862.
Vemulapalli, V., Miller, K. A. & Hoseney, R. C. 1998b. Glucose oxidase in breadmaking systems.Cereal Chemistry.75, 439-442.
LITERATUURLIJST
Venugopala Reddy, A. R., Ananthanarayanan, V. S. & Rao, N. A. 1975. Studies on nucleotidases in plants: fluorescence and kinetic properties of nucleotide pyrophosphatase from Mung bean (Phaseolusaureus) seedlings. Archives of Biochemistry and Biophysics.198, 89-96.
Vilensky, J. A., Robertson, W. M. & Gilman, S. 2002. Denny-Brown, Wilson’s Disease and BAL (British antilewisite [2,3-dimercaptopropanol]). Neurology.59, 914-916.
Voet, D. & Voet, J. G. 1995. Biochemistry, Somerset, John Wiley & sons, Inc. 1361 pp.
von Weymarn, N. 2002. Process development for mannitol production by lactic acid bacteria. Espoo, Finland. Helsinki University of Technology.
Wade, L. G. 1999. Organic Chemistry, 4 th. ed. New Jersey, Prentice Hall. 1221 pp.
Walther, C. & Grosch, W. 1987. Substrate specificity of the glutathione dehydrogenase(dehydroascorbate reductase) from wheat flour. Journal of Cereal Science.5, 299-305.
Warner, E. A., Kanekanian, A. D. & Andrews, A. T. 2001. Bioactivity of milk proteins: 1. Anticariogenicity of whey proteins. International Journal of Dairy Technology.54, 151-153.
Waymack, P. P. & Etten, R. L. 1991. Isolation and characterization of a homologeous isoenzyme of wheat germ acid phosphatase. Archives of Biochemistry and Biophysics.288, 621-633.
Wichmann, R., Wandrey, C. & Kula, M.-R. 2000. Continuous enzymatic transformation in an enzymemembrane reactor with simultaneous NAD(H) regeneration. Biotechnology and bioengineering.57,791-804.
Wise, D. J., Anderson, C. D. & Anderson, B. M. 1997. Characterization of H. parasuis periplasmicnucleotide pyrophosphatase as a potential target enzyme for inhibition of growht. VeterinaryMicrobiology.58, 261-276.
Wisselink, H. W., Weusthuis, R. A., Eggink, G., Hugenholtz, J. & Grobben, G. J. 2002. Mannitolproduction by lactic acid bacteria: a review. International dairy journal.12, 151-161.
Wong, J. H., Kobrehel, K., Nimbona, C., Yee, B. C., Balogh, A., Kiss, F. & Buchanan, B. B. 1993. Thioredoxin and bread wheat. Cereal Chemistry.70, 113-114.
Xu, F. & Wagner, P. 1999. Methods for using dehydrogenases in bread. WO9957986.
Xu, W. L., Dunn, C. A. & Bessman, M. J. 2000. Cloning and characterization of the NADHpyrophosphatases from Caenorabditis elegans and Saccharomyces cerevisiae, members of a nudix hydrolase subfamily. Biochemical and Biophysical Research Communications.273, 753-758.
Yamanaka, K. & Sakai, S. 1968. Production of polyol dehydrogenases in bacteria. Canadian Journal ofMicrobiology.14, 391-396.
Yamanaka, K. 1975. D-Mannitol dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides. Methods in Enzymology.41B, 138-142.
Yun, J. W. & Kim, D. H. 1997. A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria. Journal of Fermentation and Bioengineering.85, 203-208.
Zaccolo, M., Williams, D. M., Brown, D. M. & Gherardi, E. 1996. An approach to randommutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues. Journal of Molecular Biology.255, 589-603.