UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT …lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/460/626/RUG01-001460626...vrouwelijke...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie

Academiejaar 2009‐2010

EXTRACTIE VAN mRNA UIT GLANDULAIRE TRICHOMEN VAN

ARTEMISIA ANNUA VOOR NEXT‐GENERATION SEQUENCING

Kim DE MARÉ

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Dr. F. Van Nieuwerburgh

Commissarissen

Prof. Dr. D. Deforce

Dr. A. Heyerick

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

masterproef.”

4 mei 2010

Promotor, Auteur,

Dr. Apr. F. Van Nieuwerburgh Kim De Maré

DANKWOORD

Bij deze wens ik mijn promotor, Dr. F. Van Nieuwerburgh

te bedanken voor zijn promotorschap.

In het bijzonder dank ik ook mijn begeleidster, Sandra Soetaert

voor haar dagelijkse begeleiding, aanmoediging en goede raad

bij het verwezenlijken van deze masterproef.

Daarnaast dank ik het personeel van het laboratorium dat altijd

bereid was hulp te bieden en uitleg te geven.

Ook mijn medestudenten

Paulien, Nele, Katrien, Astrid en Tom verdienen dank

voor de aangename werksfeer en deugddoende babbel tussendoor.

Tenslotte wil ik ook mijn ouders, broer, vriend

en mijn vriendinnen bedanken

voor de goede zorgen, steun en nodige ontspanning.

INHOUDSOPGAVE

INHOUDSOPGAVE

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

1 INLEIDING ....................................................................................................................... 1

1.1 ACHTERGROND .......................................................................................................... 1

1.1.1 Malaria ....................................................................................................................... 1

1.1.1.1 Historiek ........................................................................................................... 1

1.1.1.2 Pathogenese ..................................................................................................... 2

1.1.1.3 Behandeling en resistentie ............................................................................... 4

1.1.2 Artemisinine ............................................................................................................... 5

1.1.2.1 Bron van artemisinine: Artemisia annua L. ...................................................... 5

1.1.2.2 Werkingsmechanisme van artemisinine .......................................................... 6

1.1.2.3 Biosyntheseplaats van artemisinine: glandulaire trichomen ........................... 7

1.1.2.4 Biosynthese pathway ....................................................................................... 8

1.2 PRODUCTIE VAN ARTEMISININE VERHOGEN ............................................................ 11

1.3 OPHELDEREN BIOSYNTHESE ..................................................................................... 12

1.3.1 Vergelijking apicaal‐subapicaal ................................................................................ 12

1.3.2 Isoleren van cellen: Laser Microdissection Pressure Catapulting ........................... 13

1.3.3 Metabolietstudie ..................................................................................................... 14

1.3.4 Transcriptoomstudie ................................................................................................ 14

1.4 ARTEMISININEPREPARATEN ALS KANKERTHERAPIE ................................................. 15

2 OBJECTIEVEN ................................................................................................................ 17

3 MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................................... 19

3.1 ALGEMEEN ............................................................................................................... 19

3.1.1 Opkweken van A. annua .......................................................................................... 19

3.1.2 Laser Microdissection Pressure Catapulting ............................................................ 19

3.2 METABOLIETSTUDIE ................................................................................................. 20

3.2.1 Doel .......................................................................................................................... 20

3.2.2 Sampling en staalvoorbereiding .............................................................................. 21

3.2.2.1 Verzamelen van incubatiewater van A. annua .............................................. 21

3.2.2.2 Verzamelen van munttrichomen uit incubatiewater van A. annua .............. 21

3.2.2.3 Verzamelen van glandulaire en filamenteuze trichomen van A. annua na

wassen van versneden bloemknoppen ........................................................................ 21

3.2.2.4 Chloroformextractie van fytopreparaten ....................................................... 22

3.2.3 Kwantitatieve analyse van de stalen ....................................................................... 22

3.2.3.1 Principe: HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS .................................................................. 22

3.2.3.2 Ijklijn ............................................................................................................... 24

3.2.3.3 Chromatografische condities ......................................................................... 25

3.2.3.4 Massaspectrometrische condities ................................................................. 25

3.2.4 Dataverwerking ........................................................................................................ 26

3.3 TRANSCRIPTOOMSTUDIE ......................................................................................... 26

3.3.1 Doel .......................................................................................................................... 26

3.3.2 Sterilisatie van het glaswerk .................................................................................... 27

3.3.3 Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen .............................................. 27

3.3.3.1 NanoDrop spectrofotometer ......................................................................... 27

3.3.3.2 RiboGreen RNA Quantitation Kit .................................................................... 28

3.3.3.3 Experion RNA Analysis Kit .............................................................................. 29

3.3.4 Vergelijking verschillende extractiekits ................................................................... 29

3.3.4.1 Absolutely RNA Nanoprep Kit ........................................................................ 30

3.3.4.2 RNAqueous®‐Micro Kit ................................................................................... 30

3.3.5 Extractie van een referentiestaal ............................................................................ 30

3.3.6 LMPC stalen ............................................................................................................. 31

3.3.6.1 Preliminaire test ............................................................................................. 31

3.3.6.2 Verschillende samplingvolumes ..................................................................... 32

3.3.6.3 Invloed fixatie ................................................................................................. 32

3.3.7 Optimalisatie met meer plantenmateriaal .............................................................. 33

3.3.7.1 RNA‐extractie uit grote hoeveelheden plantenmateriaal ............................. 33

3.3.7.2 Invloed DNase behandeling ........................................................................... 34

3.3.7.3 Invloed fixatie ................................................................................................. 34

3.3.7.4 Verschillende samplingtijden ......................................................................... 35

3.3.8 Nanoprep bij verschillende temperatuur ................................................................ 35

4 RESULTATEN ................................................................................................................. 36

4.1 METABOLIETSTUDIE ................................................................................................. 36

4.1.1 Concentratiebepaling van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren ........ 36

4.1.1.1 In incubatiewater van A. annua ..................................................................... 36

4.1.1.2 In munttrichomen geïsoleerd uit incubatiewater van A. annua .................... 36

4.1.1.3 In filamenteuze en glandulaire trichomen na wassen van versneden

bloemknoppen van A. annua ....................................................................................... 37

4.1.2 Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten ..................................... 38

4.2 TRANSCRIPTOOMSTUDIE ......................................................................................... 38

4.2.1 Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen .............................................. 38

4.2.2 Vergelijking verschillende extractiekits ................................................................... 39

4.2.3 Extractie van een referentiestaal ............................................................................ 40

4.2.4 LMPC stalen ............................................................................................................. 41

4.2.4.1 Preliminaire test ............................................................................................. 41

4.2.4.2 Verschillende samplingvolumes ..................................................................... 41

4.2.4.3 Invloed fixatie ................................................................................................. 42

4.2.5 Optimalisatie met meer plantenmateriaal .............................................................. 43

4.2.5.1 Invloed DNase behandeling ........................................................................... 43

4.2.5.2 Invloed fixatie ................................................................................................. 43

4.2.5.3 Verschillende samplingtijden ......................................................................... 44

4.2.6 Nanoprep bij verschillende temperatuur ................................................................ 45

5 DISCUSSIE ..................................................................................................................... 46

5.1 Contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen ..................... 46

5.2 Concentratie van artemisinine in fytopreparaten .................................................... 46

5.3 Optimalisatie RNA‐extractie voor next generation sequencing ................................ 47

6 CONCLUSIE ................................................................................................................... 49

7 LITERATUURLIJST .......................................................................................................... 50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

acetylCoA acetyl‐coenzyme A

ACT Artemisinin‐based Combination Therapie

ADS Amorphadieen synthase

ATP Adenosine Triphosphate

cDNA copy DNA

DEPC Diethylpyrocarbonaat

DHA Dihydro‐artemisinine

DMAPP Dimethylallyldiphosphate

DNA Deoxyribonucleic acid

DXP Deoxyxylulose‐5‐phosphate

ESI Electrospray Ionization

FPP Farnesyldifosfaat

GGPP Geranylgeranyldifosfaat

GPP Geranyldifosfaat

HBRR Human Brain Reference RNA

HIF1‐α Hypoxie Induceerbare Factor 1α

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IPP Isopentenyldifosfaat

IS Interne Standaard

LMPC Laser Microdissection Pressure Catapulting

MEP 2‐C‐methylerythritol‐4‐phosphate

mRNA messenger RNA

MVA Mevalonaat

m/z massa‐over‐ladingverhouding

P.A.L.M. Photoablation And Laser Microdissection

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

Q‐TOF MS/MS Quadrupool Time‐Of‐Flight tandem

massaspectrometrie

RBC Rode bloedcellen / erythrocyten

rf radiofrequentie

RNA Ribonucleic acid

rpm rotations per minute

rRNA ribosomaal RNA

SERCA Sarco‐Endoplasmatisch Reticulum Ca2+ ATPase

SDS Sodiumdodecylsulfaat

tRNA transfer RNA

VEGF Vasculair Endotheliale Groeifactor

VIB Vlaams Instituut voor Biotechnologie

WHO World Health Organisation

I N L E I D I N G | 1

1 INLEIDING

1.1 ACHTERGROND

1.1.1 Malaria

1.1.1.1 Historiek

Sinds de Oudheid worden vele populaties geteisterd door malaria. In de 17de eeuw

dachten Italiaanse wetenschappers dat de infectie veroorzaakt werd door inademing van

giftige dampen afkomstig van moerassen. Malaria verwijst dan ook naar ‘mala aria’, wat

‘slechte lucht’ betekent. De ziekte is meer dan alleen een dodelijke infectie maar vormt ook

een hindernis voor de economische ontwikkeling van de getroffen landen. Om die reden

werd het ophelderen van het mysterie rond de oorzaak en transmissie van malaria de focus

van veel wetenschappelijk onderzoek (Capanna, 2006).

In 1880 beschreef de Franse fysicus Charles Louis Alphonse Laveran als eerste

malariaparasieten in het bloed van patiënten en noemde ze Oscillaria malariae. Later werd

het bestaan van deze parasiet bevestigd door andere onderzoekers die de naam Plasmodium

voorstelden. Eind 19de eeuw werd ook de transmissie van malaria opgehelderd. Zowel de

Engelse fysicus Ronald Ross als de Italiaan Battista Grassi ontdekten dat malaria

overgedragen wordt via de beet van de vrouwelijke Anopheles mug (Capanna, 2006). Deze

muskiet wordt enkel in tropische gebieden met malaria besmet, aangezien de parasieten

niet overleven bij middelmatige temperaturen (de Ridder et al., 2008).

Malaria blijft daarom vooral een belangrijk gezondheidsprobleem in tropische

gebieden zoals delen van Azië, Zuid‐Amerika en vooral het Sub‐Saharisch Afrika waar 90%

van de doden veroorzaakt wordt door malaria (Greenwood & Mutabingwa, 2002). Over de

hele wereld worden jaarlijks zo’n 515 miljoen mensen ziek en veroorzaakt de ziekte één à

drie miljoen doden. Aangezien vele landen zich geen dure campagnes kunnen veroorloven, is

een effectieve en betaalbare behandeling vereist (Miller et al., 2002).

Er zijn echter steeds nieuwe medicijnen nodig omdat malariaparasieten in staat zijn

tot snelle ontwikkeling van resistentie. Het eerste antimalariamiddel, quinine, werd gemaakt

uit de schors van de Cinchona boom. Later werd het van quinine afgeleide synthetisch

middel chloroquine ontwikkeld, wat veilig en goedkoop was. Nadeel is het ontstaan van


chloroquine‐resistente Plasmodium parasieten (Tuteja, 2007). Ook andere malariamiddelen

vertonen steeds meer resistentieproblemen. In de jaren ’60 werd artemisinine ontdekt als

nieuw antimalariamiddel waartegen tot nu toe geen zorgwekkende resistentieproblemen

zijn vastgesteld. Sindsdien raadt de Wereld Gezondheid Organisatie (WHO) het gebruik van

combinatietherapieën aan gebaseerd op artemisinine of semisynthetische artemisinine‐

derivaten (Olliaro & Taylor, 2004).

In de toekomst kan malaria zich verspreiden naar regio’s die tot op de dag van

vandaag als veilig gezien werden. Het voorkomen van de malariaparasiet hangt namelijk af

van klimatologische factoren zoals temperatuur, vochtigheid en neerslag. Vooral de

temperatuur is kritisch aangezien malariaparasieten geen volledige levenscyclus kunnen

doormaken bij temperaturen lager dan 20 °C en dus niet verder kunnen overgedragen

worden. Als gevolg van de opwarming van de Aarde en de ontwikkeling van resistentie

wordt verwacht dat malaria zich verder zal verspreiden (de Ridder et al., 2008).

1.1.1.2 Pathogenese

Malaria wordt veroorzaakt door parasieten behorend tot het genus Plasmodium dat

meer dan 125 species bevat die reptielen, vogels en zoogdieren infecteren. Vier types

infecteren de mens: P. falciparum, P. vivax, P. malariae en P. ovale. Het is de vrouwelijke

Anopheles mug die de parasieten draagt en verantwoordelijk is voor hun transmissie.

Plasmodium falciparum is de meest kwaadaardige van de vier species. Infectie met deze

parasiet veroorzaakt de zogenaamde malaria tropica of cerebrale malaria (de Ridder et al.,

2008).

De symptomen van malaria zijn niet‐specifiek zoals koortsaanvallen, rillingen,

misselijkheid, hoofdpijn, pijn in rug en ledematen, enz. Cerebrale malaria, veroorzaakt door

Plasmodium faliciparum, wordt naast deze niet‐specifieke symptomen ook gekenmerkt door

verstopping van de nauwe bloedvaten van vitale organen, zoals de hersenen. Plasmodium

falciparum produceert namelijk adhesieve proteïnen zodat geïnfecteerde rode bloedcellen

aan de wanden van de nauwe bloedvaten kleven. Op die manier wordt passage doorheen de

milt verhinderd en kan het immuunsysteem niet geactiveerd worden. De verstopping van de

nauwe bloedvaten verhindert ook de doorbloeding van de vitale organen. Indien

onbehandeld, leidt deze vorm van malaria binnen enkele uren of dagen tot de dood.


In de ontwikkeling van de malariaparasiet onderscheiden we drie cycli: een exo‐

erythrocytaire, een erythrocytaire en een sporogene cyclus, zoals geïllustreerd in Figuur 1.1.

FIGUUR 1.1. : LEVENSCYCLUS MALARIAPARASIET: 1. INJECTIE VAN SPOROZOIETEN IN DE HUID 2.

SPOROZOIETEN VERMENIGVULDIGEN ZICH IN HEPATOCYTEN. 3. LEVERCELLEN BARSTEN OPEN MET

VRIJSTELLING VAN MEROZOIETEN IN DE BLOEDBAAN. 4. MEROZOIETEN VERMENIGVULDIGEN ZICH IN

RBC 5. RBC BARSTEN OPEN EN TROFOZOIETEN DRINGEN NIEUWE ERYTHROCYTEN BINNEN. 6. IN

SOMMIGE RBC ONTWIKKELEN MEROZOIETEN ZICH TOT GAMETOCYTEN. 7. OPNAME VAN

GAMETOCYTEN DOOR NIEUWE ANOPHELES MUG. 8. NA BEVRUCHTING IN DE ANOPHELES MUG

VORMEN GAMETOCYTEN ZICH OM TOT OÖCYSTEN. 9. OÖCYSTEN PRODUCEREN OPNIEUW

SPOROZOIETEN.

1. Een malaria‐infectie begint met een beet van een geïnfecteerde muskiet, waarbij

sporozoieten geïntroduceerd worden in de huid. De sporozoieten vinden snel hun

weg naar de lever waar ze hepatocyten invaderen. Binnenin de hepatocyten

vermenigvuldigen en differentiëren ze waardoor extra‐erythrocytaire schizonten

ontstaan die een paar duizenden merozoieten bevatten.

2. Na een bepaalde incubatietijd breken de levercellen open waardoor merozoieten

vrijgesteld worden in de bloedbaan die rode bloedcellen infecteren. Na een fase

van vermenigvuldiging en differentiatie ontstaan erythrocytaire schizonten. Deze

bevatten een klein aantal trofozoieten, die op hun beurt nieuwe erythrocyten

invaderen.


3. In sommige rode bloedcellen ontwikkelen merozoieten zich tot mannelijke en

vrouwelijke gametocyten, die slapend in de bloedbaan blijven tot ze opgepikt

worden in het bloedmaal van een nieuwe bijtende Anopheles mug. Na

bevruchting in de muskiet verlaten ze de maag en vormen ze oöcysten, die op

hun beurt sporozoieten produceren. Deze migreren naar de speekselklieren en

kunnen zo bij een volgende beet aan de mens overgedragen worden.

1.1.1.3 Behandeling en resistentie

Sinds de ontdekking van het antimalariamiddel quinine werd malaria behandeld met

op quinoline gebaseerde geneesmiddelen zoals chloroquine, mefloquine, primaquine en met

antifolaten zoals sulfadoxine‐pyrimethamine (Wongsrichanalai et al., 2002). Deze middelen,

die in het verleden de voornaamste aanpak vormden tegen malaria, zijn nu ondoeltreffend

in de meeste malariagebieden wegens het ontstaan van resistentie (de Ridder et al., 2008).

Om die reden was er in de farmaceutische industrie nood aan nieuwe antimalariamiddelen.

Eind jaren 60 zijn Chinese wetenschappers op zoek gegaan naar nieuwe

geneesmiddelen tegen malaria. Planten die gebruikt werden in de traditionele Chinese

geneeskunde werden getest. Artemisia annua L. en extracten van deze plant toonden een

goede antimalaria‐activiteit. Over de jaren heen werd de actieve stof, artemisinine, uit de

plant geïsoleerd en de structuur opgehelderd. Naast deze component werden ook

semisynthetische derivaten zoals artemether, arteether en artesunaat ontwikkeld (Davis et

al., 2005).

Tot nu toe is nog geen zorgwekkende resistentie tegen artemisinine gesignaliseerd.

Een studie in 2009 rapporteert echter wel een verminderde gevoeligheid aan artemisinine

bij bepaalde personen in West‐Cambodja, waar artemisinine meer dan 30 jaar als

monotherapie beschikbaar was (Dondorp et al., 2009; Maude et al., 2009). Om resistentie te

vermijden, raadt De Wereld Gezondheid Organisatie artemisinine‐gebaseerde

combinatietherapieën (ACT) aan als behandeling tegen malaria (Covello, 2008). Onder

combinatietherapie verstaat men het simultaan gebruik van twee of meer geneesmiddelen

met een verschillend werkingsmechanisme. Op die manier kan resistentie tegen de

afzonderlijke geneesmiddelen uitgesteld worden. Nadelen van combinatietherapie zijn

echter de hogere kosten en het grotere risico op nevenwerkingen.


1.1.2 Artemisinine

1.1.2.1 Bron van artemisinine: Artemisia annua L.

Artemisia annua behoort tot de familie van de Asteraceae, een plantenfamilie die

deel uitmaakt van de klasse van de Magnoliopsida. Het is een eenjarige struik van 50‐150 cm

hoog. De plant is ook gekend als zomeralsem of zoete alsem en vindt zijn oorsprong in China,

waar het gekend is als qing hao (de Ridder et al., 2008).

Volgens sommigen is de plant genoemd naar Artemis, de Griekse godin van de

vruchtbaarheid, aangezien bepaalde planten van dit genus gebruikt werden om

bevallingspijn te controleren. Belangrijker is dat Artemisia annua nu wereldwijd gekend is

voor zijn antimalaria‐eigenschappen (Willcox et al., 2009). Het actieve bestanddeel is

artemisinine. Aangezien chemische synthese van artemisinine een duur meerstappenproces

is, rest de plant als enige commerciële bron van het geneesmiddel. Het probleem is dat

artemisinine slechts in kleine hoeveelheden aanwezig is in de bladeren en bloemen van de

plant, namelijk 0,01 % à 0,8 % van het droge gewicht (van Agtmael et al., 1999). Naast

Artemisia annua is artemisinine ook aanwezig in Artemisia apiacea en Artemisia lancea,

echter in nog kleinere hoeveelheden (Hsu, 2006).

FIGUUR 1.2. : MORFOLOGIE EN CLASSIFICATIE VAN ARTEMISIA ANNUA L. (de Ridder et al., 2008).


1.1.2.2 Werkingsmechanisme van artemisinine

In 1972 werd de structuur van artemisinine gedefinieerd als een sesquiterpeen lacton

met een endoperoxidebrug (Ferreira & Janick, 1996), geïllustreerd in Figuur 1.3. De

endoperoxidebrug is verantwoordelijk voor de antimalaria activiteit. De complexe

ringstructuur is niet noodzakelijk voor de activiteit maar kan essentieel zijn voor de stabiliteit

van de molecule.

Artemisinineverbindingen induceren een snelle reductie van malariaparasieten

praktisch onmiddellijk na toediening aan de patiënt (Balint, 2001). Artemisinine is niet alleen

actief tegen malaria maar zou ook werkzaam zijn tegen bepaalde kankers, virale infecties,

hepatitis en als pesticide (Romero et al., 2005; Efferth, 2007; Firestone & Sundar, 2009).

Het exacte werkingsmechanisme van artemisinine tegen malaria is nog ongekend. Er

worden twee hypothesen voorgesteld. Beide steunen op de activatie van de endoperoxide

groep waarbij reactieve species gevormd worden (de Ridder et al., 2008). Volgens de eerste

hypothese interfereert artemisinine met het SERCA of sarco‐endoplasmatisch reticulum

ATPase van Plasmodium falciparum (Eckstein‐Ludwig et al., 2003; Liu et al., 2006). Het SERCA

is verantwoordelijk voor het behoud van de calciumconcentraties, die belangrijk zijn voor de

correcte post‐translationale modificatie van proteïnen. Er is aangetoond dat artemisinine

hydrofobe interacties aangaat met het SERCA waardoor de endoperoxidebrug gesplitst

wordt met vrijstelling van koolstofradicalen tot gevolg. Het tweede voorgestelde

mechanisme berust op de vorming van reactieve species door interactie met de

geïnfecteerde rode bloedcellen. Er werd gevonden dat de heemgroep of Fe2+ het breken van

de endoperoxidebrug in artemisinine katalyseert met vorming van vrije radicalen tot gevolg.

De gevormde koolstofradicalen kunnen essentiële proteïnen en DNA alkyleren wat leidt tot

de dood van de malariaparasieten (de Ridder et al., 2008).

FIGUUR 1.3. : STRUCTUUR VAN ARTEMISININE (Willcox et al., 2009); EEN SESQUITERPEEN LACTON

MET ENDOPEROXIDEBRUG.


1.1.2.3 Biosyntheseplaats van artemisinine: glandulaire trichomen

Artemisinine wordt gesynthetiseerd in een specifiek soort cellen van Artemisia

annua, namelijk de glandulaire trichomen (geïllustreerd in Figuur 1.4). In het algemeen zijn

trichomen de haren die voorkomen op het oppervlak van de meeste planten. Ze worden

beschouwd als uitsteeksels van de epidermis en zijn genoemd naar het Griekse ‘trichos’ wat

‘haar’ betekent. De functie van trichomen bestaat in de verdediging van de plant tegen

herbivoren en insecten. Dit doen ze door sterische hinder en productie van toxines (Wagner

et al., 2004; Romero et al., 2008). Daarnaast vormen ze een belangrijke biosyntheseplaats

van secundaire metabolieten die gebruikt kunnen worden voor farmacologische en

economische doeleinden.

Bij Artemisia annua onderscheiden we twee types trichomen: de glandulaire en de

niet‐glandulaire of filamenteuze trichomen. Aangezien enkel de glandulaire trichomen

artemisinine produceren, zal deze scriptie enkel op dit type verdergaan. Vooral de bladeren

en de stengels van deze species zijn bedekt met glandulaire trichomen (Duke & Paul, 1993).

Vanuit morfologisch standpunt zijn de glandulaire trichomen van het Artemisia genus 10‐

cellig, bestaande uit twee apicale cellen, vier subapicale cellen, twee basale cellen en twee

stalk cellen (Duke & Paul, 1993). De stalk cellen staan in voor de vasthechting van de

trichomen aan de epidermis. De glandulaire trichomen bevatten ook een klierblaas of

subcuticulaire ruimte die dienst doet als opslagplaats voor artemisinine en andere

sesquiterpenoïden (Duke & Paul, 1993; Van Nieuwerburgh et al., 2006), alsook voor

monoterpenoïden (Tellez et al., 1999).

FIGUUR 1.4. : 10‐CELLIG GLANDULAIR TRICHOOM OP EEN BLOEMKNOP VAN ARTEMISIA ANNUA L.

(Scan gemaakt met het P.A.L.M. Laser Microbeam System 10x40x)


Er zijn belangrijke morfologische verschillen gerapporteerd tussen de apicale en

subapicale cellen van de glandulaire trichomen. Bijvoorbeeld in de aanwezigheid van

chloroplasten: enkel de vier subapicale cellen bevatten chloroplasten (Olsson et al., 2009).

Deze cellen met fotosynthetische activiteit doen waarschijnlijk dienst als energie‐ en

koolstofbron voor het metabolisme in de aangrenzende apicale cellen.

1.1.2.4 Biosynthese pathway

Inzicht in de biosynthese pathway van artemisinine en karakterisatie van de

betrokken enzymen is noodzakelijk om de productie van artemisinine te kunnen verhogen.

In de literatuur heerst nog verwarring, maar dankzij recente studies is de pathway voor het

grootste deel opgehelderd (Bertea et al., 2005; Covello, 2008; Zhang et al., 2008). Een

overzicht van de biosynthese pathway van artemisinine wordt gegeven in Figuur 1.5.

Artemisinine behoort tot de groep van de isoprenoïden. De termen ‘isoprenoïden’,

‘terpenoïden’ en ‘terpenen’ duiden algemeen de gehele klasse van verbindingen aan

afgeleid van de universele precursoren isopentenyldifosfaat (IPP) en zijn isomeer

dimethylallyldifosfaat (DMAPP). Er zijn twee onafhankelijke biosynthetische pathways die tot

de vorming van IPP en DMAPP leiden: de mevalonaat pathway (MVA) gelokaliseerd in het

cytosol en de mevalonaat‐onafhankelijke pathway (MEP) in de plastiden (Withers & Keasling,

2007).

De mevalonaat pathway start met de samensmelting van drie molecules acetylCoA

met vorming van mevalonaat gevolgd door fosforylatie tot difosfomevalonaat, wat

gedecarboxyleerd wordt tot IPP en zijn isomeer DMAPP. De mevalonaat‐onafhankelijke

pathway begint met de condensatie van pyruvaat en glyceraldehyde‐3‐fosfaat tot 1‐

deoxyxylulose‐5‐fosfaat (DXP). Via intermoleculaire herschikking ontstaat hieruit 2‐C‐methyl‐

D‐erythritol 4‐fosfaat (MEP). MEP wordt vervolgens via een reeks van reacties omgezet tot

IPP (Withers & Keasling, 2007).

IPP en DMAPP worden door terpeen synthases omgezet tot de C10, C15 en C20

precursoren, respectievelijk geranyldifosfaat (GPP), farnesyl difosfaat (FPP) en

geranylgeranyldifosfaat (GGPP).

De cyclisatie van farnesyldifosfaat tot amorpha‐4,11‐dieen wordt beschouwd als de

eerste stap in de biosynthese van artemisinine. Het enzym amorpha‐4,11‐dieen synthase


(ADS) katalyseert deze stap (Bouwmeester et al., 1999). Vervolgens wordt amorpha‐4,11‐

dieen via oxidatie op C12 omgezet tot artemisinine alcohol. Deze eerste stappen in de

biosynthese worden ondersteund door verschillende biochemische studies, de volgende

stappen zijn nog onderwerp van discussie.

Volgens Bertea et al. (2005) wordt artemisinine alcohol geoxideerd tot artemisinine

aldehyde. Vanaf dit punt worden twee routes gesuggereerd. Volgens sommigen volgt er een

oxidatie tot artemisininezuur, anderen suggereren een omzetting tot

dihydroartemisininezuur. Het is nog niet duidelijk of artemisininezuur of

dihydroartemisininezuur de hoofdprecursor is van artemisinine. Recente bevindingen tonen

echter aan dat zowel artemisininezuur als dihydroartemisininzuur omgezet kunnen worden

tot artemisinine (Brown & Sy, 2004; Brown & Sy, 2007). De omzetting van artemisininezuur

tot zowel arteannuin B als artemisinine werd volgens Liu et al. (2006) ook gerapporteerd in

Sangwan et al. (1993). Er werden echter nog geen enzymen voor deze stap geïdentificeerd.

Hoogst waarschijnlijk treden beide verbindingen dus samen op als de twee

hoofdprecursoren van artemisinine.

Teoh et al. (2006) toonden aan dat een cytochroom P450, CYP71AV1, de oxidatie

katalyseert van de biosynthetische intermediairen amorphadieen, artemisinine alcohol,

artemisinine aldehyde en dihydroartemisinine aldehyde. Zhang et al. (2008)

karakteriseerden een artemisinine aldehyde Δ11(13) reductase, wat suggereert dat

dihydroartemisininezuur gevormd wordt via reductie van artemisinine aldehyde tot

dihydroartemisinine aldehyde en vervolgens oxidatie tot dihydroartemisininezuur. Voor de

omzetting van dihydroartemisininezuur tot artemisinine werden nog geen enzymen

gevonden. Er is een vermoeden dat de omzetting via een serie van niet‐enzymatische

reacties zou plaatsvinden (Brown and Sy, 2004; Teoh et al., 2006; Zhang et al., 2008).


FIGUUR 1.5. : BIOSYNTHESE PATHWAY VAN ARTEMISININE (aangepast van Liu et al., 2006)


1.2 PRODUCTIE VAN ARTEMISININE VERHOGEN

Door het wereldwijde gebruik van artemisinine gebaseerde combinatietherapieën

(ACT) is de vraag naar artemisinine groot. Aangezien Artemisia annua slechts kleine

hoeveelheden aanmaakt (0,01 – 0,8 %) en chemische totaalsynthese economisch niet

haalbaar is, heerst er tegenwoordig een tekort aan artemisinine. In het verleden werden

vele pogingen ondernomen om de productie van artemisinine te verhogen, zowel in vivo als

in vitro (Abdin et al., 2003).

In eerste instantie kan de productie in vivo verhoogd worden door kruising van

verschillende plantentypes. De hoeveelheid aan artemisinine en biosynthetische

precursoren varieert in planten van verschillende origine. Dit wijst op het feit dat er

verschillende chemotypes van Artemisia annua bestaan. Selectie en kruising van types met

een hoge concentratie aan artemisinine gaf aanleiding tot hybride planten die tot 1.4 %

artemisinine bevatten (Delabays et al., 2001). Deze hoeveelheden zijn echter nog te laag

voor een efficiënte commerciële productie van artemisinine. Daarnaast blijken ook de

resultaten van in vitro methoden niet veelbelovend. In vitro culturen van Artemisia annua

bevatten tot nu toe lagere concentraties artemisinine dan de intacte plant (Abdin et al.,

2003).

Een andere benadering is de aanmaak van artemisinine of biosynthetische

precursoren in gistcellen. Ro et al. (2006) rapporteerde de genetische modificatie van

Saccharomyces cerevisiae voor de productie van grote hoeveelheden artemisininezuur. De

gistcellen werden in drie stappen gemodificeerd. In eerste instantie werd de productie van

farnesyldifosfaat (FPP) verhoogd door de upregulatie van de expressie van verscheidene

genen verantwoordelijk voor de FPP synthese en door downregulatie van een gen

verantwoordelijk voor de omzetting van FPP tot sterolen. Daarna werd het amorphadieen‐

synthase‐gen afkomstig van Artemisia annua in de gistcellen geïntroduceerd zodat de

omzetting van FPP tot amorphadieen kan plaatsvinden. Als laatste stap werd een nieuw

cytochroom P450 gekloneerd dat instaat voor de oxidatie van amorphadieen tot

artemisininezuur. Het gesynthetiseerde artemisininezuur wordt uit de gistcel

getransporteerd zodat slechts een eenvoudige opzuiveringsstap nodig is. Dit

artemisininezuur is dan geschikt voor een kostenefficiënte semisynthese van artemisinine.

De gistcellen produceren grotere hoeveelheden artemisininezuur dan Artemisia annua. Toch


is er verdere optimalisatie vereist om de productie tot een niveau te brengen dat hoog

genoeg is om de huidige kosten van de artemisinine gebaseerde combinatietherapieën te

reduceren (Ro et al., 2006).

Zowel de klassieke als de biotechnologische pogingen hebben als doel artemisinine

beschikbaar te maken aan aanvaardbare prijzen. Tot nu toe is nog geen economisch

haalbare methode gevonden om artemisinine op grote schaal te produceren. Meer

duidelijkheid omtrent de biosynthese pathway van artemisinine kan helpen om hierin

vorderingen te maken.

1.3 OPHELDEREN BIOSYNTHESE

1.3.1 Vergelijking apicaal‐subapicaal

Wat betreft de biosynthese van artemisinine zijn er belangrijke verschillen

geapporteerd tussen apicale en subapicale cellen van de glandulaire trichomen van

Artemisia annua. Zo toonden Olsson et al. (2009) aan dat de tot nu toe gekende enzymen

nodig voor de artemisinine biosynthese gelokaliseerd zijn in de apicale cellen. Hiervoor

extraheerden ze RNA uit volledige glandulaire trichomen, apicale en subapicale cellen. Uit

het RNA werd cDNA gesynthetiseerd dat vervolgens dienst deed als template in een PCR

amplificatie van de gekende transcripten coderend voor de artemisinine biosynthese‐

enzymen. Hieruit bleek dat de transcripten coderend voor de drie enzymen: amorphadieen

synthase, cytochroom P450 monoöxygenase CYP71AV1 en artemisinine aldehyde Δ11(13)

reductase enkel uit de apicale cellen geamplificeerd werden. Er werd geen amplificatie

gedetecteerd in de subapicale cellen. Hoogstwaarschijnlijk wordt artemisinine dus enkel

gesynthetiseerd in de apicale cellen van de glandulaire trichomen. Aangezien de laatste stap

naar artemisinine in de biosynthese nog opgehelderd moet worden, bestaat er geen

zekerheid dat ook deze stap in de apicale celen plaatsvindt.

Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, zullen we

apicale cellen, die vermoedelijk wel artemisinine produceren, vergelijken met subapicale

cellen, die geen artemisinine produceren. Dit kan uiteindelijk nuttige informatie opleveren

om de productie van artemisinine efficiënt te verhogen.


1.3.2 Isoleren van cellen: Laser Microdissection Pressure Catapulting

Wegens technische beperkingen werd men in vroegere studies gedwongen om gebruik

te maken van volledige weefsels, waardoor celspecifieke verschillen gemaskeerd werden.

Om de functie van apicale en subapicale cellen volledig te begrijpen, is echter een methode

vereist voor de specifieke isolatie van deze cellen uit het plantenweefsel.

De afgelopen jaren werd een techniek ontwikkeld waarvoor geen specifieke merkers

vereist zijn, namelijk Laser Microdissection Pressure Catapulting (LMPC) (Day et al., 2005).

LMPC maakt gebruik van een UV‐laser om specifieke targets los te snijden uit weefsels die

gevisualiseerd worden met conventionele microscopie. Plantenmateriaal is uitermate

geschikt voor deze techniek: hun regelmatige weefselstructuur en stabiele celwanden

vergemakkelijkt visuele identificatie van de meeste celtypes. De losgesneden doelwitcel

wordt bij deze techniek van op het microscoopglaasje in een epje gekatapulteerd (Nelson et

al., 2006). Op die manier kunnen volledige glandulaire trichomen op een efficiënte manier

verzameld worden. Een aangepaste weefselvoorbereiding, namelijk fixatie met 4%

formaldehyde, maakt het mogelijk om ook apicale cellen en subapicale cellen van de

glandulaire trichomen te isoleren (Olsson et al., 2009). Fixatie is nodig voor de stabilisatie

van de celinhoud en het bewaren van de weefselintegriteit tijdens dit proces. Dit staat in

competitie met het feit dat een groot deel van het RNA door formaldehyde‐fixatie

gecrosslinked wordt en de RNA‐extractie dus negatief beïnvloedt (Kerk et al., 2003).

LMPC heeft als voordeel dat het snel en efficiënt is en dat contaminatie met

ongewenst plantenmateriaal tot een minimum beperkt is. Door manipulatie op cellulair

niveau kan de targetcel namelijk geïsoleerd worden van naburige weefsels (Nelson et al.,

2006).

FIGUUR 1.6. : MICRODISSECTIE VAN GLANDULAIRE TRICHOMEN VAN A. ANNUA (Olsson et al., 2009).

(A) INTACT GEFIXEERD GLANDULAIR TRICHOOM. (B) TRICHOOM NA DISSECTIE EN COLLECTIE VAN

HET PAAR APICALE CELLEN. (C) OVERBLIJVENDE CELLEN NA DISSECTIE EN COLLECTIE VAN DE VIER

SUBAPICALE CELLEN. (D) APICAAL CELPAAR NA DISSECTIE EN VÓÓR COLLECTIE. (E) TWEE PAAR

SUBAPICALE CELLEN NA DISSECTIE EN VÓÓR COLLECTIE.


1.3.3 Metabolietstudie

Verdergaand op de vergelijkende studie van apicale en subapicale cellen uitgevoerd

door Olsson et al. (2009), besproken bij 1.3.1, werd vorig jaar een metabolietstudie

uitgevoerd. Deze studie had als doel te testen dat de volledige artemisinine biosynthese in

de apicale cellen plaatsvindt. In de studie van Olsson et al. (2009) werden namelijk enkel de

gekende enzymen bekeken. Er is dus geen zekerheid dat ook de laatste biosynthese‐stappen,

waarvan het mechanisme ongekend is, ook in de apicale cellen plaatsvindt. Om dit na te

gaan, werden de concentraties aan artemisinine en zijn biosynthetische precursoren in

apicale en subapicale cellen vergeleken nadat deze met LMPC verzameld werden (Van

Valckenborgh, 2009). Deze analyse werd verschillende keren uitgevoerd. In sommige

gevallen werd artemisinine enkel in de apicale cellen gedetecteerd, waardoor de hypothese

ontstond dat artemisinine inderdaad enkel in de apicale cellen geproduceerd wordt. Maar

aangezien de resultaten in deze studie veel variatie vertoonden, kon toch geen eenduidig

besluit gevormd worden. Daarom werden op dezelfde manier filamenteuze trichomen

verzameld. Ook hier werd artemisinine gedetecteerd, alhoewel artemisinineproductie in

filamenteuze trichomen nog nooit gerapporteerd werd. Om die reden ontstond er een

vermoeden dat er sprake is van contaminatie. Normaal is bij LMPC contaminatie tot een

minimum beperkt maar omdat deze techniek hier in water uitgevoerd wordt, is het mogelijk

dat metabolieten in het water migreren en zo contaminatie veroorzaken. Om deze

contaminatie al dan niet te bevestigen, werden een aantal testen uitgevoerd die verder in

deze scriptie besproken worden.

1.3.4 Transcriptoomstudie

Naast een metabolietstudie kan ook een transcriptoomanalyse uitgevoerd worden.

Hierbij wordt het transcriptoom van apicale cellen vergeleken met dat van subapicale cellen.

Het transcriptoom is de verzameling aan RNA van een specifieke cel en geeft informatie over

welke eiwitten tot expressie komen in de cel. Voor de transcriptoomanalyse moet dus eerst

het RNA uit de apicale en subapicale cellen geëxtraheerd worden. Indien het geëxtraheerde

RNA van voldoende hoge kwaliteit is, kan vervolgens het volledige transcriptoom

gesequeneerd worden.


Gebaseerd op het artikel van Olsson et al. (2009) zal in deze studie ook RNA

geëxtraheerd worden uit apicale en subapicale cellen verzameld via LMPC. De bedoeling is

echter om RNA van hoge kwaliteit te bekomen zodat later de volledige lengte van het

transcriptoom gesequeneerd kan worden. Op die manier kan niet alleen de expressie van

gekende enzymen gedetecteerd worden, zoals bij Olsson et al. (2009), maar is het ook

mogelijk om ongekende enzymen te ontdekken. Dit zou bijvoorbeeld inzicht kunnen geven in

het tot nu toe nog ongekende mechanisme van de laatste stap in de biosynthese.

Na de RNA‐extractie zal gebruik gemaakt worden van state of the art next generation

sequencing. Eind 2009 werd reeds de sequenering van het transcriptoom van volledige

glandulaire trichomen uit Artemisia annua gerapporteerd (Wang et al., 2009). In deze

scriptie is het echter de bedoeling om het transcriptoom te sequeneren van apicale cellen en

subapicale cellen afzonderlijk, in tegenstelling tot de volledige glandulaire trichomen zoals in

Wang et al. (2009). Op die manier kan het transcriptoom van apicale cellen vergeleken

worden met dat van subapicale cellen en kan meer inzicht verkregen worden in de

biosynthese pathway van artemisinine. In eerste instantie wordt op zoek gegaan naar

ongekende enzymen die een rol spelen bij de biosynthese van artemisinine, vooral het

mechanisme van de laatste stap moet nog opgehelderd worden. Ten tweede kan ook

gezocht worden naar transcriptiefactoren. Daarnaast zijn er hoogst waarschijnlijk ook

membraantransportproteïnen aanwezig die artemisinine uit de glandulaire trichomen

pompen, wat ook met deze transcriptoomanalyse nagegaan kan worden.

1.4 ARTEMISININEPREPARATEN ALS KANKERTHERAPIE

Artemisinine is vooral gekend als antimalaria‐middel. De afgelopen jaren blijken

artemisinine en zijn biosynthetische derivaten echter ook werkzaam te zijn tegen bepaalde

types kanker (Nakase et al., 2008). Interessant is dat het cytotoxisch effect van artemisinine

specifiek is voor kankercellen en dus geen gezonde lichaamscellen aantast. De cellen worden

gedood door vrije radicalen gevormd door openbreken van de endoperoxide brug na

interactie met Fe2+. Omdat kankercellen wegens hun snelle proliferatie nood hebben aan de

opname van grote hoeveelheden ijzer brengen ze een grotere concentratie aan transferrine‐

receptoren tot expressie op hun celoppervlak. Transferrine is een bindingsproteïne dat

instaat voor de opname van serumijzer in cellen via endocytose. Aangezien kankercellen dus


een hogere ijzer‐influx vertonen, zijn ze vatbaarder voor het cytotoxisch effect van

artemisinine dan normale cellen. De gevormde vrije radicalen zouden ook angiogenese

inhiberen door een verminderde expressie van VEGF (vasulair endotheliale groeifactor) en

zijn activerende factor HIF1‐α (hypoxie‐induceerbare factor 1α) (Firestone & Sundar, 2009).

Een nog betere kankertherapie wordt verkregen door covalente binding van

artemisinine aan transferrine (Nakase et al., 2008). Op die manier worden zowel

artemisinine als het activerende ijzer selectief opgenomen in de kankercellen, die een

hogere expressie van transferrine‐receptoren vertonen.

Tegenwoordig zijn er verschillende artemisinine‐preparaten op de markt maar de

vraag is echter of de bestaande preparaten echt waardevol zijn. Daarom zal in deze scriptie

de werkelijke artemisinineconcentratie bepaald worden van een aantal van deze

fytopreparaten, geïllustreerd in Figuur 1.7.

FIGUUR 1.7. : DRIE ARTEMISININE‐PREPARATEN: EEN GEDROOGD THEE‐EXTRACT (MIN TONG),

CAPSULES (AOV) EN GEDROOGDE A. ANNUA BLAADJES (MINISTERIO DA SAUDE).

O B J E C T I E V E N | 17

2 OBJECTIEVEN

Artemisinine wordt wereldwijd gebruikt als behandeling tegen malaria. Aangezien

Artemisia annua slechts kleine hoeveelheden artemisinine aanmaakt en chemische

totaalsynthese economisch niet haalbaar is, heerst er tegenwoordig een tekort aan dit

antimalaria‐middel. Om de productie te kunnen verhogen, is echter meer kennis vereist over

de biosynthese pathway van deze verbinding. Artemisinine wordt geproduceerd in de 10‐

cellige glandulaire trichomen, opgebouwd uit 2 apicale cellen, 4 subapicale cellen, 2 basale

cellen en 2 stalk cellen. Transcripten coderend voor gekende artemisinine biosynthese‐

enzymen werden enkel gedetecteerd in de apicale cellen (Olsson et al., 2009). Dit suggereert

dat artemisinine enkel in dit celtype gesynthetiseerd wordt. Er is echter geen zekerheid dat

nog ongekende biosynthese‐stappen ook enkel in de apicale cellen plaatsvinden.

Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, kunnen

apicale cellen die vermoedelijk wel artemisinine produceren, vergeleken worden met

subapicale cellen die geen artemisinine produceren. De Laser Microdissection Pressure

Catapulting techniek (LMPC), besproken in 1.3.2, wordt hierbij gebruikt voor isolatie van de

verschillende cellen uit het plantenmateriaal. Vervolgens kan op de verzamelde cellen een

metabolietstudie of een transcriptoomstudie uitgevoerd worden.

Het eerste luik van deze scriptie gaat verder op een vorige metabolietstudie waarbij

artemisinine in eerste instantie enkel gedetecteerd werd in apicale cellen en niet in

subapicale cellen. Hierdoor ontstond de veronderstelling dat artemisinine inderdaad in de

apicale cellen geproduceerd wordt. In een aantal hierop volgende testen werd echter ook

artemisinine gedetecteerd in filamenteuze trichomen, alhoewel artemisinineproductie hierin

nog nooit gerapporteerd werd. Om die reden ontstond er een vermoeden dat er sprake is

van contaminatie bij LMPC als samplingtechniek. Om deze contaminatie al dan niet te

bevestigen, wordt in deze scriptie de concentratie aan artemisinine en zijn biosynthetische

precursoren bepaald in munttrichomen, waarvan bewezen is dat er geen

artemisininesynthese plaatsvindt. Deze munttrichomen worden via LMPC geïsoleerd uit

water dat geïncubeerd werd met Artemisia annua bloemknoppen. Vervolgens worden ze

geanalyseerd met behulp van HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS zoals besproken in 3.2.3.

O B J E C T I E V E N | 18

Het tweede luik van deze scriptie gaat verder in op artemisinine als kankertherapie.

Artemisinine blijkt, naast zijn antimalaria‐werking, namelijk ook actief te zijn tegen bepaalde

kankertypes. Aangezien kankerpatiënten steeds op zoek gaan naar nieuwe genezende

middelen, wordt artemisinine ook meer en meer als therapie aangewend. Tegenwoordig zijn

er verschillende fytopreparaten op de markt die artemisinine zouden bevatten maar de

vraag is echter of deze echt waardevol zijn. Daarom zal in deze scriptie de werkelijke

artemisinine‐concentratie nagegaan worden in een aantal preparaten. Hiervoor worden

chloroformextracten bereid die geanalyseerd worden via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS.

Als derde luik van de scriptie wordt gestart met een transcriptoomstudie. Hierbij

wordt het transcriptoom van apicale en subapicale cellen vergeleken zodat eventueel

nieuwe genen die betrokken zijn in de biosynthese pathway van artemisinine ontdekt

kunnen worden. Voor deze transcriptoomanalyse worden apicale en subapicale cellen via

LMPC gescheiden en gekatapulteerd in lysis buffer. Hieruit wordt vervolgens het RNA

geëxtraheerd. Daarna kunnen de mRNA‐molecules gesequeneerd worden via next

generation sequencing. Voor de bepaling van de volledige lengte van de transcripten is de

kwaliteit van het geëxtraheerde RNA echter van groot belang. Kwaliteits‐ en

kwantiteitsanalyses van het RNA worden uitgevoerd met Experion, RiboGreen en NanoDrop.

Om aan de hoge kwaliteitseisen te voldoen, zullen we in eerste instantie zowel de RNA‐

extractiemethode als de samplingmethode optimaliseren voor volledige glandulaire

trichomen. Wanneer dit op punt staat, kan uiteindelijk overgeschakeld worden op RNA‐

extracties van apicale en subapicale cellen afzonderlijk.

Als eerste optimalisatiestap wordt nagegaan welke RNA‐extractiekits de beste

resultaten opleveren. Hierbij moet rekening gehouden worden met eventuele problemen

met secundaire plantenmetabolieten die de RNA‐extractie en ‐kwantificatie kunnen

beïnvloeden. Naast de extractiemethode wordt ook de samplingmethode geoptimaliseerd.

Fixatie van de stalen kan bijvoorbeeld de RNA‐opbrengst door cross‐linking negatief

beïnvloeden, maar is noodzakelijk om apicale en subapicale cellen te kunnen verzamelen.

Ook de samplingtijd en het samplingvolume worden geoptimaliseerd. Wanneer uiteindelijk

voldoende RNA van hoge kwaliteit bekomen wordt, kan dit in de toekomst geamplificeerd

worden met het Ovation RNA‐Seq System. Vervolgens kan de next‐generation sequencing

uitgevoerd worden met de Illumina Genome Analyzer II.

M A T E R I A L E N E N M E T H O D E N | 19

3 MATERIALEN EN METHODEN

3.1 ALGEMEEN

3.1.1 Opkweken van A. annua

De zaden, geleverd door anamed international (Winnenden, Duitsland) werden

gesteriliseerd in drie stappen. In eerste instantie werden ze twee minuten ondergedompeld

in een 70% ethanoloplossing (Merck, Darmstadt, Duitsland). Daarna werden ze tien minuten

behandeld met een oplossing bereid door 3,84 mL NaOCl (Sigma‐Aldrich, Steinheim,

Duitsland) aan te lengen met 5 µL Tween 20 (MP Biomedicals, Illkirch, Frankrijk) en 10 mL

steriel water (Sartorius, Goettingen, Duitsland). Na vier à vijf keer wassen, werden de zaden

vervolgens op een filtreerpapiertje (Whatman, Kent, UK) in een petrischaal gelegd en

bevochtigd met water. Na één week werden de kiemen overgebracht in potgrond en in een

groeikamer (VIB) geplaatst bij een temperatuur van 21°C en een dagritme van 8 uur licht en

16 uur donker. De eerste week werden de plantjes overdekt met plastiek om een serre‐

effect te creëren. Vooraleer de volgroeide planten voor wetenschappelijk onderzoek

gebruikt werden, lieten we ze ongeveer een week wennen aan natuurlijk daglicht.

3.1.2 Laser Microdissection Pressure Catapulting

De Laser Microdissection Pressure Catapulting (LMPC) techniek, ontwikkeld door

Zeiss (P.A.L.M.®‐Microlaser Technologies), werd in deze studie toegepast voor de isolatie van

verschillende celtypes uit plantenmateriaal. Hiervoor werd gebruik gemaakt van het

P.A.L.M.® MicroLaser systeem voorzien van een P.A.L.M.® RoboMover (PALM,

Wolfratshausen, Duitsland). Dit systeem bevat een snijdende 377‐nm UV stikstofgas laser die

gekoppeld is aan een lichtmicroscoop (Axiovert 135; Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland) en

gefocuseerd wordt door een 40x objectief. De laser beam heeft een diameter kleiner dan

1µm. Met een gedefocuseerde laser worden de geselecteerde cellen in een verzamelepje

(Eppendorf, Hamburg, Duitsland) gekatapulteerd. De RoboMover is een computergestuurd

microscoopplatform en micromanipulator. De positionering van het object wordt bekomen

door horizontale beweging van dit platform (Nelson et al., 2006; Olsson et al., 2009).

FIGUUR 3.1. : LASER MICRODISSECTION PRESSURE CATAPULTING, DE LOSGESNEDEN TARGETCEL

WORDT DOOR DE LASER IN HET DEKSEL VAN HET VERZAMELEPJE GEKATAPULTEERD (Day et al., 2005).


3.2 METABOLIETSTUDIE

3.2.1 Doel

3.2.1.1 Nagaan van contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen

In een vorige metabolietstudie, besproken in 1.3.3, werd artemisinine gedetecteerd

in filamenteuze trichomen die via LMPC uit A. annua bloemknoppen geïsoleerd werden.

Aangezien hierin nooit eerder artemisinineproductie gerapporteerd werd, ontstond het

vermoeden dat er sprake is van contaminatie. Om dit al dan niet te bevestigen, zal de

concentratie nagegaan worden van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren in

water geïncubeerd met bloemknoppen van A. annua. Deze test zal een idee geven welke

hoeveelheden artemisinine in het water migreren.

Als volgende stap wordt een muntblad fijngehakt in dit incubatiewater van A. annua,

waaruit vervolgens via LMPC munttrichomen geïsoleerd worden. Daarna wordt de

concentratie bepaald van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren in deze

munttrichomen, waarvan bewezen is dat er geen artemisininesynthese plaatsvindt. Zo

kunnen we nagaan of de metabolieten aanwezig in het incubatiewater inderdaad samen met

de munttrichomen via LMPC in het epje gekatapulteerd worden of migreren in de

trichomen.

In laatste instantie worden glandulaire en filamenteuze trichomen geïsoleerd na

versnijden en wassen van de bloemknoppen om te zien hoeveel artemisinine er overblijft na

wassen. De stalen werden geanalyseerd met behulp van een aangepaste HPLC‐ESI Q‐TOF

MS/MS methode gepubliceerd in Van Nieuwerburgh et al. (2006), deze techniek zal in detail

besproken worden in 3.2.3.

3.2.1.2 Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten

Aansluitend op de metabolietstudie werd HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS ook gebruikt om

de werkelijke artemisinineconcentratie te bepalen van drie artemisinine‐preparaten die

tegenwoordig op de markt te vinden zijn: een poedervormig thee‐extract (Min Tong Co,

Taichung, Taiwan) waarbij geen artemisinineconcentratie wordt vermeld, capsules (aov,

Almere, Nederland) die volgens hun verpakking 15 mg artemisinine per capsule zouden

bevatten en gedroogde Artemisia blaadjes (Ministério da saúde, Esplanada dos Ministérios


Bloco G, Brazilië) die 0,8% ‐ 1,0% artemisinine per 1,25 gram (1 zakje blaadjes) zouden

bevatten.

3.2.2 Sampling en staalvoorbereiding

3.2.2.1 Verzamelen van incubatiewater van A. annua

Er werden drie pools verzameld van elk 20 gesloten bloemknoppen. Elke pool werd

genomen van dezelfde zeven‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant en werd

gedurende 30 minuten geïncubeerd met 400 µL UltraPure Water (Biosolve, Valkenswaard,

Nederland). Daarna werd de waterfase afgepipetteerd en verzameld in een apart epje. Deze

behandeling werd voor elke pool tien keer na elkaar herhaald. Na deze tien wasstappen

werden de bloemknoppen versneden en vervolgens nog driemaal geïncubeerd met water.

Het incubatiewater werd voor elke stap afzonderlijk bij ‐20 °C bewaard om via HPLC‐ESI Q‐

TOF MS/MS de hoeveelheid vrijgekomen artemisinine en biosynthetische precursoren bij

elke incubatiestap te bepalen. Hiervoor werd 50 µL van het incubatiewater aangelengd met

50 µL Ultra Pure Water (Biosolve, Valkenswaard, Nederland) en 100 µL mix‐oplossing

samengesteld uit 1 mL IS 1; 1,5 mL ACCN en 4 µL FA.

3.2.2.2 Verzamelen van munttrichomen uit incubatiewater van A. annua

Een stuk muntblad werd op een microscoopglaasje gelegd en met een mesje

fijngehakt in 20 µL water afkomstig van de eerste incubatiestap van Artemisia annua. In het

deksel van een 0,2 mL epje (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) werd 25 µL UltraPure Water

(Biosolve, Valkenswaard, Nederland) gepipetteerd. Via LMPC werden munttrichomen in het

deksel van dit epje gekatapulteerd. Op die manier werden 60 munttrichomen verzameld in

66 µL water. Dit werd aangelengd met 66 µL mix‐oplossing samengesteld uit 1 mL IS 1; 1,5

mL ACCN en 4 µL FA. Om de cellen open te breken en hun inhoud vrij te stellen, werd het

staal gedurende tien minuten gesoniceerd en vervolgens geanalyseerd met HPLC‐ESI Q‐TOF

MS/MS.

3.2.2.3 Verzamelen van glandulaire en filamenteuze trichomen van A. annua na wassen

van versneden bloemknoppen

Na tien incubatiestappen werden de volledige bloemknoppen versneden. Na

driemaal wassen van deze versneden bloemknoppen werden ze op een microscoopglaasje in


20 µL UltraPure Water (Biosolve, Valkenswaard, Nederland) gelegd. In het deksel van een

verzamelepje werd 25 µL UltraPure Water gepipetteerd. Via LMPC werden glandulaire en

filamenteuze trichomen in het deksel van dit epje gekatapulteerd. Op die manier werden in

twee aparte stalen 53 glandulaire trichomen en 60 filamenteuze trichomen verzameld.

Vervolgens werd de inhoud van elk epje aangelengd tot 50/50 H2O/MIX. De mix‐oplossing

werd bereid door 1 mL IS 1 te mengen met 1,5 mL ACCN en 4 µL FA. Om de cellen open te

breken en hun inhoud vrij te stellen, werden de stalen gedurende tien minuten gesoniceerd.

Via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS werd vervolgens de concentratie aan artemisinine en zijn

biosynthetische precursoren in deze trichomen bepaald.

3.2.2.4 Chloroformextractie van fytopreparaten

Vooraleer de concentratie aan artemisinine in de fytopreparaten geanalyseerd kon

worden, werd van elk preparaat een chloroformextract bereid. Hiervoor werd 552,50 mg

poedervormig thee‐extract, de inhoud van één aov‐capsule (588,60 mg) en één zakje met

1,25 g gedroogde blaadjes gemengd met 50 mL chloroform (Acros, Geel, België). Na

anderhalf uur schudden en soniceren, werd de chloroform overgebracht in een aparte

proefbuis. Deze chloroformextracten werden geanalyseerd via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS. Ter

voorbereiding van de stalen voor injectie werd de chloroform 1000 keer verdund door aan te

lengen met interne standaard 2 (zie 3.2.3.2).

3.2.3 Kwantitatieve analyse van de stalen

3.2.3.1 Principe: HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS

High performance liquid chromatography (HPLC) is een analytische techniek die

aangewend wordt voor scheiding van mengsels. De meeste stalen, die voor analytisch

onderzoek aangeboden worden, zijn namelijk mengsels van opgeloste substanties. Er wordt

gebruik gemaakt van vloeistofchromatografie gekenmerkt door een vaste stationaire fase en

een vloeibare mobiele fase, hierbij toegepast onder verhoogde druk.


Na chromatografische scheiding van de stalen via HPLC werden de afzonderlijke

componenten gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van een massaspectrometer.

Massaspectrometrie is een spectrometrische techniek die gebaseerd is op de vorming van

ionen in één of ander ionisatieproces. De ionisatievorm die in dit onderzoek toegepast werd,

is elektrospray ionization (ESI). Het HPLC effluent wordt hierbij door een naald gedwongen,

waarop aan het uiteinde een potentiaal is aangelegd. Deze laatste is voldoende hoog om de

uittredende oplossing in een fijne spray te dispergeren zodat uiteindelijk individueel geladen

‘naakte’ analytionen in de gasfase gevormd worden. Na dit ionisatieproces worden de ionen

naar de massa‐analysator getransfereerd. De elektrospray vormt dus de koppeling tussen

het HPLC‐toestel en de Q‐TOF massaspectrometer.

Bij tandem massaspectrometrie (MS/MS) worden meerdere massaspectrometrische

technieken gecombineerd. Hier wordt gebruik gemaakt van een Q‐TOF massaspectrometer.

Dit is een combinatie van een quadrupool (Q) en een Time‐Of‐Flight (TOF)

massaspectrometer, verbonden door een botsingscel (zie Figuur 3.2).

De quadrupool bestaat uit vier parallelle hyperbolische staven met daarop een

radiofrequentie‐ (rf) en een directe stroomspanning. De combinatie van rf‐ en

stroomspanning bepaald of een gegeven ion, afhankelijk van de m/z‐waarde, al dan niet

door de quadrupool doorgelaten wordt. De quadrupool is gebonden aan de TOF

massaspectrometer via een botsingscel. Door een potentiaalverschil aan te brengen tussen

FIGUUR 3.2. : Q‐TOF MASSSASPECTROMETER; BIJ Q‐TOF MASSASPECTROMETRIE WORDEN

VERSCHILLENDE MASSASPECTROMETRISCHE TECHNIEKEN GECOMBINEERD, NAMELIJK EEN

QUADRUPOOL (MS1), BOTSINGSCEL (MS2) EN TIME‐OF‐FLIGHT MASSASPECTROMETER (MS3).


het begin en het einde van deze botsingscel zullen de doorgelaten ionen versneld worden en

botsen met de edelgasatomen (Ar). Dit zorgt voor fragmentatie van de ionen. Deze

specifieke fragmentionen kunnen verder geanalyseerd worden in de TOF analyser.

Een TOF (Time‐Of‐Flight) massaspectrometer gebruikt het verschil in transittijd

doorheen een buis (“flight tube”) met een bepaalde afstand om ionen van verschillende

m/z‐verhouding van elkaar te scheiden. De ionen worden vervolgens gedetecteerd via een

elektronmultiplier. Hierbij maken de ionen een groot aantal elektronen vrij waardoor een

elektrisch signaal wordt geproduceerd dat evenredig is met het aantal invallende ionen. De

relatieve hoeveelheid waarin elk soort ion voorkomt, wordt geregistreerd in de vorm van

een spectrum. Aangezien de aard en het aantal van de gevormde ionen karakteristiek is voor

de samenstelling en structuur van een molecule, kan men stellen dat het massaspectrum

haar vingerafdruk is.

3.2.3.2 Ijklijn

Voor de aanmaak van de verdunningsreeks werd vertrokken van stockoplossingen in

methanol met gekende concentraties aan artemisinine (1mg/ml), artemisininezuur

(1mg/ml), arteannuin B (1mg/ml), dihydroartemisinine (1mg/ml), dihydroartemisininezuur

(5mg/ml), artemisinine alcohol (5mg/ml), artemisinine aldehyde (5mg/ml) en

dihydroartemisinine alcohol (4mg/ml). De referentiestandaard artemisinine 98% werd

verkregen door Sigma‐Aldrich (Bornem, België). Artemisininezuur en arteannuin B werden

geleverd door het Walter Reed Army Institute of Research (Washington, USA).

Dihydroartemisinine, dihydroartemisininezuur, artemisinine alcohol, artemisinine aldehyde

en dihydroartemisinine alcohol werden door Patrick Covello van het National Research

Council Canada geschonken. Methanol werd verkregen door Biosolve (Valkenswaard,

Nederland). Elke analytische standaard werd bereid als een mengsel van elke stockanalyt en

interne standaard.

Als interne standaard werd een santonine stockoplossing gebruikt met een

concentratie van 1 mg/mL in MeOH. De eerste interne standaard (IS 1), met een

concentratie van 0.5 ng/µL, werd bereid door 25 µL uit de stock aan te lengen tot 50 mL met

50/50 ACCN/H2O en 0,1% FA. Vervolgens werd de tweede interne standaard (IS 2) bereid

door 20 mL uit IS 1 aan te lengen tot 100 mL met 50/50 ACCN/H2O en 0.1 % FA. Het


acetonitril, water en methaanzuur werden geleverd door Biosolve (Valkenswaard,

Nederland).

In eerste instantie werden de 10ng/µL en 8ng/µL verdunningen bereid door de

stockoplossingen en IS 1 aan te lengen met 50/50 ACCN/H2O en 0,1% FA tot de gewenste

concentratie. Bij de volgende verdunningen (6ng/µL t.e.m. 0.001ng/µL) werd uitgegaan van

deze 10ng/µL en 8ng/µL oplossingen en IS 2.

3.2.3.3 Chromatografische condities

Van elk staal werd 100 µL geïnjecteerd in een Waters Alliance 2695 HPLC systeem

gecombineerd met een capillaire reversed‐phase kolom, namelijk Alltech Ultrasphere C18 IP

5 µm kolom (150 mm x 2,1 mm) beschermd door een Waters XTerra MS C18 5 µm pre‐kolom

(10 mm x 2,1 mm). De stalen werden vervolgens geëlueerd met een typische gradiënt. De

mobiele fase (eluens A: H2O en 0,1% FA; eluens B: 90/10 ACCN/H2O en 0,1% FA) heeft hierbij

een debiet van 0,2 mL/min. De beginsamenstelling, een 40/60 verhouding, werd gedurende

8 minuten aangehouden. Daarna werd overgeschakeld op een 15/85 verhouding, wat 9

minuten aangehouden werd. Voor de volgende 5 minuten werd overgeschakeld op een

0/100 verhouding. De laatste 12 minuten werd terug een verhouding van 40/60

aangehouden. Een LC Packings ACUrate ICP‐04‐20 post‐kolom splitter werd gebruikt om ¼

van het effluens op de elektrospray interface te brengen.

3.2.3.4 Massaspectrometrische condities

Voor de massaspectrometrische detectie werd gebruik gemaakt van een Q‐TOF

massaspectrometer (Micromass, Manchester, UK) uitgerust met een electrospray bron in

positieve modus (ESP+). Het HPLC effluent wordt hierbij door een elektrospray ionisatie (ESI)

capillair gedwongen, waarop aan het uiteinde een potentiaal van 2,8 kV is aangelegd. De

bron en desolvatie temperaturen werden geoptimaliseerd op respectievelijk 130 en 300 °C.

Hierbij werd stikstofgas (N2) gebruikt als desolvatiegas met een debiet van 400 L/u. Als

collisiegas voor MS/MS analyse werd argon (0,8 bar) gebruikt. Hierbij werd de

botsingsenergie geoptimaliseerd op 7 eV voor artemisinine, 8 eV voor dihydroartemisinine

en artemisinine alcohol, 9 eV voor santonine en dihydroartemisinine alcohol, 10 eV voor

arteannuin B, 11 eV voor artemisininezuur en artemisinine aldehyde en 12 eV voor

dihydroartemisininezuur en dihydroartemisinine aldehyde. De MS/MS methode werd


gebruikt voor de kwantificatie van artemisinine (m/z 283 219 + 229 + 247 + 265),

arteannuin B (m/z 249 185 + 189), artemisininezuur (m/z 235 189 + 199 + 217),

artemisinine alcohol (m/z 221 203), artemisinine aldehyde (m/z 219 145 + 159 + 201),

DHA‐zuur (m/z 237 163 + 191 + 201 + 219), DHA (m/z 221 163) en DHA‐alcohol (m/z

223 149 + 165 + 205).

3.2.4 Dataverwerking

Dataverwerking en analyse werd verricht met behulp van de Masslynx versie 4.0

software. Genormaliseerde piekoppervlaktes werden verkregen door berekening van de

ratio van de piekoppervlakte van het analyt t.o.v. deze van de interne standaard. De ijklijn

werd in drievoud bepaald en opgesteld door de gekende concentraties van de analyten uit

te zetten t.o.v. hun genormaliseerde piekoppervlaktes. De concentraties van de

respectievelijke analyten in de stalen werden berekend t.o.v deze ijklijnen.

3.3 TRANSCRIPTOOMSTUDIE

3.3.1 Doel

Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, kan het

transcriptoom van apicale cellen vergeleken worden met subapicale cellen. Hiervoor moet in

eerste instantie het RNA uit de cellen geïsoleerd worden. Daarna kunnen de mRNA‐

molecules gesequeneerd worden via next generation sequencing. Hiervoor is echter zowel

de kwantiteit als de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA van groot belang. Vooraleer next

generation sequencing kan plaatsvinden, zal het RNA namelijk geamplificeerd worden met

de Ovation® RNA‐Seq System kit (NuGen, Bemmel, Nederland). Deze kit vereist RNA van

hoge kwaliteit en een minimale input van 500 pg in een maximum volume van 5 µL. Een

hoge RNA‐kwaliteit is eveneens belangrijk om de volledige lengte van het transcriptoom te

kunnen bepalen. Dit is namelijk niet haalbaar indien het RNA in te kleine fragmenten

gedegradeerd is. Om aan de hoge kwaliteitseisen te voldoen, is dus een optimale RNA‐

extractie vereist. In eerste instantie wordt zowel de RNA‐extractiemethode als de

samplingmethode geoptimaliseerd voor volledige glandulaire trichomen. Wanneer dit op

punt staat, kan overgeschakeld worden op RNA‐extracties van apicale en subapicale cellen

afzonderlijk.


3.3.2 Sterilisatie van het glaswerk

Vóór de start van de transcriptoomstudie werden microscoopglaasjes vrijgemaakt

van RNA en RNasen door behandeling met SDS buffer en naspoelen met DEPC water. SDS

buffer zorgt voor denaturatie van proteïnen en peptiden en werd bereid door 5 g SDS

(sodiumdodecylsulfaat, MP Biomedicals, Illkirch, Frankrijk) te mengen met 100 mL DEPC

water, dit vormt de 5% SDS‐stockoplossing. Na 10 maal verdunnen, werd de 0,5% SDS‐

werkoplossing verkregen. DEPC water is als RNase‐vrij water. DEPC vernietigt alle

enzymatische activiteit in het water. Het werd bereid door 1 mL DEPC

(dieethylpyrocarbonaat, Sigma‐Aldrich, Steinheim, Duitsland) overnacht op te lossen in 1 L

Sartorius gezuiverd water (Sartorius, Goettingen, Duitsland) in een schudwarmwaterbad bij

37°C en vervolgens te autoclaveren. Na reiniging van de microscoopglaasjes met 0,5 % SDS‐

buffer en afspoelen met DEPC water, werden de glaasjes verpakt in aluminiumfolie en 9u

gebakken in een oven bij 190°C.

3.3.3 Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen

Om na te gaan welke methoden het best geschikt zijn voor de concentratiebepaling

en/of kwaliteitsbepaling van de verschillende RNA‐stalen werden zowel de NanoDrop

spectrofotometer, de RiboGreen RNA Quantitation Kit als de Experion RNA Analysis Kit

uitgetest. Hiervoor werd elke methode toegepast voor de analyse van RNA dat via de

Absolutely RNA Nanoprep kit (zie 3.3.4.1) geëxtraheerd werd uit een referentiestaal,

namelijk Human Brain Reference RNA (HBRR). Ook de concentratie van een 4x‐verdunning

van dit staal werd met de verschillende methoden gemeten. De werkingsprincipes worden

hieronder kort besproken.

3.3.3.1 NanoDrop spectrofotometer

De NanoDrop spectrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA) meet de

absorbantie van een staal in het gebied van 200 nm tot 350 nm, wat relevant is om de RNA‐

concentratie en ‐zuiverheid te kunnen bepalen. De NanoDrop ND‐1000 maakt de analyse

van 1µL staal mogelijk. Hiervoor wordt een druppel (1µL) van het staal op de “measurement

pedestal” gepipetteerd. Bij het sluiten van het apparaat, wordt de druppel samengeperst en

wordt als het ware een kolom gevormd. Het staal wordt op zijn plaats gehouden door de

oppervlaktespanning. Op die manier kan de absorbantie van het licht door het staal gemeten


worden. Aan de hand van de absorbantie bij 260 nm (A260) kan vervolgens de concentratie

aan RNA bepaald worden. De ratio A260/A280 geeft een indicatie van de zuiverheid van het

staal. Een waarde tussen 1,8 en 2,0 indiceert dat het RNA‐staal zuiver is. Hiernaast moet

echter ook gekeken worden naar de ratio A260/A230. Deze waarde moet zo dicht mogelijk bij

2,0 liggen. Een afwijking hiervan wijst op contaminatie met proteïnen, phenolen of

chaotropische zouten zoals guanidine isothiocyanaat.

3.3.3.2 RiboGreen RNA Quantitation Kit

Het RiboGreen Quantitation Reagens (Molecular Probes, Eugene, USA) is een

fluorescente kleurstof dat bindt op alle nucleïnezuren aanwezig in het staal. Afhankelijk van

de ‘high‐range methode’ (20 ng/mL tot 1 µg/mL RNA) of de ‘low‐range methode’ (1 ng/mL

tot 50 ng/mL RNA) wordt een andere concentratie aan kleurstof gebruikt. In deze studie

werd gebruik gemaakt van de ‘low‐range assay’.

In eerste instantie werden de reagentia bereid. Een 1x TE‐buffer (10mM Tris‐HCl, 1

mM EDTA, pH 7,5) werd bereid door 500 µL van de 20x TE‐buffer (geleverd bij de kit) aan te

lengen met 9,5 mL DEPC water. Vervolgens werd het RiboGreen Reagens 2000 keer verdund

met de 1x TE‐buffer. Om een standaardcurve te kunnen opstellen, werden ijklijnpunten in

drievoud bereid volgens Tabel 3.1. Aangezien het RNA in alle stalen na extractie met de

Nanoprep kit geëlueerd werd in elutiebuffer, werd ook het controle RNA voor de

ijklijnpunten met dezelfde elutiebuffer verdund. Deze ijklijnpunten en alle stalen werden in

de welletjes van een microplaat gepipetteerd. Vervolgens werd de microplaat gelezen met

behulp van de Safire² Multiplate Reader in combinatie met MagellanTM Software (Tecan,

Männedorf, Zwitserland) en werd de gemeten fluorescentie van de ijklijn uitgezet ten

opzichte van de gekende RNA‐concentratie. Door omrekening ten opzichte van deze

standaardcurve kon vervolgens de RNA‐concentratie van de stalen berekend worden.

Tabel 3.1. : DE HOEVEELHEDEN ELUTIEBUFFER, CONTROLE RNA EN RIBOGREEN REAGENS TER

BEREIDING VAN DE STANDAARDCURVE BIJ DE RIBOGREEN RNA QUANTITATION KIT.

Finale concentratie (ng/mL) Elutiebuffer 100 ng/mL controle RNA RiboGreen 2000x verdund

50 0 µL 50 µL 50 µL

25 25 µL 25 µL 50 µL

5 45 µL 5 µL 50 µL

1 49 µL 1 µL 50 µL

0 50 µL 0 µL 50 µL


3.3.3.3 Experion RNA Analysis Kit

Het Experion systeem (Bio‐Rad, Hercules, Canada) is een geautomatiseerd

elektroforese systeem dat gebruik maakt van microfluïde‐chips. Deze chips bevatten een

serie van plastieken welletjes gebonden op een dunne glasplaat, die geëtst is met een

netwerk van microkanalen. Eens de microkanalen geprimed zijn met een gelmatrix en de

welletjes geladen zijn met het overeenkomstig staal, stuurt het elektroforese station de

stalen door deze microkanalen via controle van de aangelegde spanning en stroom. Om de

concentratie aan nucleïnezuren te meten, wordt gebruik gemaakt van een intercalerende

dye en laser‐geïnduceerde fluorescentie. De snelle microfluïdische scheiding, vergelijkbaar

met gelelektroforese, levert daarbovenop kwalitatieve informatie over de integriteit van het

staal. Hiervoor wordt een RNA ladder gebruikt die bestaat uit 8 zuivere RNA fragmenten.

Door de lengte van deze RNA‐fragmenten uit te zetten in functie van hun migratietijden kan

een standaardcurve opgesteld worden. De lengte van de RNA‐fragmenten in de stalen wordt

vervolgens berekend door vergelijking van de migratietijden met deze standaardcurve. Om

te compenseren voor variaties in de verschillende stalen, maakt het Experion systeem

gebruik van een lower internal marker om de migratietijden tussen de verschillende stalen

te normaliseren.

Voor de LMPC stalen werd gebruik gemaakt van de ExperionTM RNA HighSens Analysis

Kit met een kwalitatieve range van 100 ‐ 5000 pg/µL totaal RNA. De ExperionTM RNA

StandardSens Analysis Kit werd toegepast voor analyse van het RNA geëxtraheerd uit

grotere hoeveelheden plantenmateriaal. Deze kit heeft een kwalitatieve range van 5 ‐ 500

ng/µL totaal RNA en een kwantitatieve range van 25 ‐ 500 ng/µL totaal RNA.

3.3.4 Vergelijking verschillende extractiekits

Om een optimale RNA‐extractie te verkrijgen, werden twee extractiekits vergeleken,

namelijk de Absolutely RNA Nanoprep kit en de RNAqueous®‐Micro kit. Hiervoor werd

plantenmateriaal gebruikt van een zeven‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Voor

een eerste staal werd met een mesje over een Artemisia blad geschraapt. Een tweede staal

bestond uit twee bloemknoppen, waarvan één fijngehakte en één intacte bloemknop.

Uiteindelijk werd de RNA‐opbrengst, qua kwaliteit, bij de verschillende kits vergeleken met

behulp van de Experion RNA Analysis Kit, waarvan de werking uitgelegd wordt in 3.3.3.3.


3.3.4.1 Absolutely RNA Nanoprep Kit

De Absolutely RNA Nanoprep kit (Stratagene, La Jolla, Canada) is ontworpen voor een

snelle opzuivering van totaal RNA van hoge kwaliteit. De kit kan toegepast worden voor

RNA‐isolatie uit cellen verzameld via Laser Microdissection Pressure Capture (LMPC). Het

design van de RNA‐bindende spin cups, geleverd bij de Absolutely RNA Nanoprep kit, laat

toe om het RNA‐staal in een zeer klein volume (10 µL) te verzamelen. Dit maakt verdere

toepassingen op het volledige staal mogelijk zonder de nood aan verdere

aanconcentreringsstappen, wat tot verlies van RNA zou kunnen leiden.

De Nanoprep procedure start met de lyse van de cellen in een lysis buffer. Deze lysis

buffer bevat het chaotropisch zout guanidine thiocyanaat dat instaat voor cellyse en

proteïnedenaturatie waardoor degradatie van het RNA door ribonucleasen (RNases)

verhinderd wordt. Na de cellyse wordt het staal overgebracht in een nano‐spin cup waar het

RNA aan een silica‐filter bindt. Een behandeling met het enzym DNase elimineert

contaminerend DNA. Vervolgens wordt het DNase en andere proteïnen verwijderd door een

serie van wasstappen. Als laatste stap wordt het zuiver RNA van de silicia‐filter geëlueerd

met behulp van 10‐20 µL elutiebuffer. In deze testen werd telkens 10 µL elutiebuffer

gebruikt.

3.3.4.2 RNAqueous®‐Micro Kit

De RNAqueous®‐Micro kit (Ambion, Foster City, USA) werd eveneens ontworpen voor

isolatie van totaal RNA. De procedure begint met de lyse van het staal in een lyserende

oplossing die, net zoals bij de Absolutely RNA Nanoprep Kit, guanidine thiocyanaat bevat.

Het lysaat wordt vervolgens gemengd met ethanol en overgebracht op een silica‐filter die

selectief RNA bindt. De hoeveelheid ethanol die aan het staal wordt toegevoegd, bepaalt de

grootte van het RNA die op de filter bindt. In deze studie werden zowel de grote als kleine

RNA species geïsoleerd door aan het lysaat 1,25 volumes van 100% ethanol toe te voegen.

Aangezien de silica‐filter uiterst klein is, kan het RNA in kleine volumes (16‐20µL) geëlueerd

worden. Een post‐elutie DNase behandeling elimineert contaminerend DNA.

3.3.5 Extractie van een referentiestaal

Als controle werd de Absolutely RNA Nanoprep Kit toegepast op een referentiestaal,

namelijk Human Brain Reference RNA (HBRR) met een gekende concentratie van 10 ng/µL.


Het referentiestaal bestaat uit zuiver totaal RNA van humane oorsprong waardoor geen

rechtstreekse vergelijking gemaakt mag worden met RNA‐extracties uit het

plantenmateriaal. Toch biedt deze positieve controle de mogelijkheid om een idee te

vormen over het eventuele RNA‐verlies en ‐degradatie tijdens de procedure. Vooral de

intactheid van 18S en 28S rRNA wordt bekeken.

3.3.6 LMPC stalen

Vooraleer RNA uit de glandulaire trichomen geëxtraheerd kon worden, moesten de

trichomen in eerste instantie van de Artemisia plant geïsoleerd worden. Voor de isolatie van

de trichomen werd gebruik gemaakt van de Laser Microdissection Pressure Catapulting

(LMPC) techniek. LMPC is als sampling techniek echter niet 100% sluitend. Er bestaat nooit

zekerheid dat alle geschoten trichomen ook effectief in het deksel van het epje

terechtkomen. Om deze techniek te optimaliseren, werden verschillende LMPC‐condities

vergeleken. Het manueel tellen van het aantal volledige trichomen die de vloeistof bereikt

hebben, bleek echter niet haalbaar. Omwille van degradatie van de meerderheid van de

geschoten trichomen werden vooral celmembranen en cuticula teruggevonden. Om toch te

kunnen nagaan welke samplingmethode het meest efficiënt is, werd daarom de RNA‐

opbrengst bij de verschillende condities vergeleken.

3.3.6.1 Preliminaire test

In eerste instantie werd geprobeerd om het totale RNA te extraheren uit 150

volledige glandulaire trichomen. Hiervoor werd een bloemknop van een zeven‐maand‐oude

Artemisia annua anamed plant op een microscoopglaasje fijngehakt in 20 µL UltraPure

Water (Biosolve, Varkenswaard, Nederland). In het deksel van een RNase‐vrij epje

(Eppendorf, Hamburg, Duitsland) werd 20 µL lysis buffer en 0,14 µL β‐mercaptoethanol van

de Absolutely RNA Nanoprep kit gepipetteerd. Vervolgens werden via LMPC volledige

glandulaire trichomen in het deksel van het epje gekatapulteerd. Indien het staal op het

microscoopglaasje aan het uitdrogen was, werd een nieuw preparaat gemaakt. Op die

manier werden vijf epjes van elk 30 trichomen verzameld. Per epje werd maximaal twee uur

gewerkt. Na het verzamelen van de trichomen werd de vloeistof kort afgecentrifugeerd op

1200 à 1600 rpm (1‐15P Sartorius centrifuge, Sigma, Bornem, België) en bij ‐80 °C bewaard.

De verschillende stalen werden vervolgens in één epje verzameld. Daarna werd het RNA uit


dit staal geëxtraheerd met behulp van de Absolutely RNA Nanoprep kit. Zelfs bij deze 150

volledige trichomen bleek de RNA‐opbrengst echter te laag voor een waardevolle meting

van de RNA‐kwaliteit en ‐kwantiteit. In de volgende testen werd daarom meestal

overgeschakeld op grotere hoeveelheden plantenmateriaal voor verdere optimalisatie.

3.3.6.2 Verschillende samplingvolumes

Bij de voorgaande eerste test werden trichomen via LMPC verzameld in 20 µL lysis

buffer. Om na te gaan wat het optimale samplingvolume is, werden opnieuw trichomen

verzameld in zowel 20 µL lysis buffer als in 40 µL, waarbij het vloeistofoppervlak dichter bij

het preparaat staat en dus verwacht zou worden dat meer geschoten trichomen het

vloeistofoppervlak effectief bereiken. Om na te gaan of er effectief een verschil is tussen

deze twee sampling condities werd daarom de RNA‐opbrengst bij deze twee stalen

vergeleken.

3.3.6.3 Invloed fixatie

In eerste instantie werden de trichomen geschoten vanuit water. Aangezien water

een hoge oppervlaktespanning heeft, ontstond het vermoeden dat de trichomen moeilijk uit

het wateroppervlak geschoten kunnen worden. Daarom werden ook trichomen verzameld

vanuit een gefixeerd preparaat. Als fixatief werd PBS (phosphate buffered saline) 4%

formaldehyde gebruikt. Dit werd bereid door 8 mL 37 % formaldehyde (Merck, Hohenbruhn,

Duitsland) toe te voegen aan 66 mL PBS buffer pH 7,4 1x (Gibco, Paisly, UK) en vervolgens te

mengen. In eerste instantie werden enkele takjes met bloemknoppen geplukt van een acht‐

maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Vervolgens werd het plantenmateriaal in een

bekerglas, gevuld met PBS 4% formaldehyde, ondergedompeld en gedurende 3,5 à 4 uur

vacuüm getrokken op ijs. Hierdoor kan het fixatief makkelijker in de cellen dringen. Na de

FIGUUR 3.3. : ISOLATIE VAN CELLEN VIA LMPC WAARBIJ HET DEKSEL VAN HET EPJE 20µL (LINKS) OF

40µL (RECHTS) LYSIS BUFFER BEVAT.


fixatie werd een bloemknop op een microscoopglaasje gelegd en fijngehakt in 20 µL PBS 4%

formaldehyde. Aangezien deze fixeervloeistof een lagere oppervlaktespanning heeft dan

water wordt verondersteld dat trichomen die hieruit geschoten worden gemakkelijker in het

verzamelepje geraken. Volgens deze denkwijze zou men dus verwachten dat de gefixeerde

stalen een grotere RNA‐opbrengst opleveren dan de stalen verzameld uit water.

Dit staat in competitie met het feit dat een groot deel van het RNA door

formaldehyde‐fixatie gecrosslinked wordt en de RNA‐extractie dus negatief beïnvloedt (Kerk

et al., 2003). Om die reden werden ook testen uitgevoerd om de invloed van fixatie op de

RNA‐kwaliteit na te gaan. De hoeveelheid RNA geëxtraheerd uit de glandulaire trichomen,

die verzameld werden via LMPC, is echter te laag voor een optimale kwaliteitsbepaling. Om

de invloed van fixatie op de RNA‐kwaliteit toch te kunnen nagaan, werd daarom overgestapt

op grotere hoeveelheden plantenmateriaal (zie 3.3.7.3).

3.3.7 Optimalisatie met meer plantenmateriaal

3.3.7.1 RNA‐extractie uit grote hoeveelheden plantenmateriaal

De RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) is ontwikkeld voor de

opzuivering van totaal RNA uit grotere hoeveelheden plantencellen en ‐weefsels. Hierbij

wordt tot 100 mg plantenmateriaal verbrijzeld in vloeibaar stikstof en vervolgens gelyseerd

en gehomogeniseerd in een denaturerende lysis buffer. In deze studie werd telkens 73 mg

plantenmateriaal gebruikt om RNA uit te extraheren. De kit biedt de keuze uit twee buffers,

namelijk RLT of RLC, die respectievelijk guanidine thiocyanaat en guanidine hydrochloride

bevatten. Aangezien RLT een betere cellyse en denaturatie oplevert, gaat de voorkeur naar

deze buffer. Beide buffers inactiveren RNases om de opzuivering van intact RNA te

garanderen. Na de cellyse worden de stalen gecentrifugeerd doorheen een QIAshredder

homogenizer. Hierdoor wordt onoplosbaar materiaal verwijderd en daalt de viscositeit van

het lysaat. Om optimale condities voor selectieve binding van het RNA op de

RNeasymembraan te verkrijgen, wordt het gezuiverd lysaat gemengd met ½ volume ethanol

en overgebracht op een RNeasy Mini spin kolom waarop het totale RNA zal binden.

Vervolgens worden contaminanten weggewassen door een serie van wasstappen. Als laatste

stap wordt het RNA geëlueerd in 30 µL RNase‐vrij water. Met de RNeasy procedure worden

alle RNA moleculen langer dan 200 nucleotiden opgezuiverd. Hierdoor is er een aanrijking


van mRNA aangezien de meeste RNA‐moleculen, zoals rRNA en tRNA, minder dan 200

nucleotiden bevatten. Bij deze testen wordt standaard geen DNase behandeling uitgevoerd

omdat er bij deze methode een aanconcentrering gebeurt van het RNA. Daarnaast wordt

een DNase behandeling ook vermeden om de kwaliteit van het RNA zo intact mogelijk te

houden. Om toch een idee te krijgen over de hoeveelheid contaminerend DNA werd bij één

staal achteraf nog een DNase behandeling uitgevoerd.

3.3.7.2 Invloed DNase behandeling

Om een idee te hebben over de hoeveelheid contaminerend DNA bij een RNA‐

extractie met de RNeasy Plant Mini kit en het nut van een DNase‐behandeling werd RNA

geëxtraheerd met de RNeasy Plant Mini Kit uit 73 mg plantenmateriaal van een acht‐maand‐

oude Artemisia annua anamed plant dat verbrijzeld werd in vloeibaar stikstof. Vervolgens

werd op 4 µL van dit staal een DNase‐behandeling uitgevoerd volgens een DNase‐

behandelingsprotocol van Promega (Madison, USA). Hierbij werd per µg RNA één unit van

RQ1 RNase‐vrij DNase toegevoegd. Per staal werd ook 1 µL RQ1 RNase‐vrij DNase 10x

Reaction Buffer toegevoegd en vervolgens aangelengd met nuclease‐vrij water tot een finaal

volume van 10 µL. Dit mengsel werd gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Om de

reactie te stoppen werd 1 µL van RQ1 DNase Stop Solution toegevoegd. Vervolgens werd 10

minuten geïncubeerd bij 65° C om het DNase te inactiveren. Daarna werd het RNA terug

opgezuiverd met de RNeasy Plant Mini Kit en geëlueerd in 30 µL water. Uiteindelijk werden

beide stalen, zowel vóór als ná de DNase‐behandeling geanalyseerd met de NanoDrop

Spectrofotometer en het Experion systeem. Op die manier kan ook de invloed van

contaminerend DNA op deze bepalingsmethoden bekeken worden.


Om de invloed van fixatie op de RNA‐kwaliteit na te gaan, werd ongeveer 73 mg

plantenmateriaal van een acht‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant gefixeerd zoals

beschreven in 3.3.6.3. Er werd evenveel niet‐gefixeerd plantenmateriaal afgewogen.

Vervolgens werd het RNA uit deze stalen geëxtraheerd met de RNeasy Plant Mini Kit. Het

plantenmateriaal werd hier voor extractie echter niet verbrijzeld in vloeibaar stikstof. De

concentratie en kwaliteit van het geëxtraheerde RNA werd nagegaan met de NanoDrop

spectrofotometer en het Experion Systeem.


3.3.7.4 Verschillende samplingtijden

Aangezien RNA snel degradeert, moet zo snel mogelijk gewerkt worden. Er moet dus

een optimale balans gevonden worden tussen een korte samplingtijd en voldoende aantal

trichomen. Om de invloed van tijd op de RNA‐kwaliteit na te gaan, werden RNA extracties

uitgevoerd na verschillende samplingtijden, namelijk na 0 minuten, 10 minuten en 2 uur. De

hoeveelheid RNA geëxtraheerd uit LMPC‐stalen is echter te laag voor een optimale

kwaliteitsbepaling. Daarom werd het RNA voor deze test ook uit grotere hoeveelheden

plantenmateriaal geëxtraheerd. Voor elk staal werd ongeveer 73 mg afgewogen van een

acht‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Dit plantenmateriaal werd hier niet

verbrijzeld in vloeibaar stikstof maar onmiddellijk overgebracht in lysis buffer met β‐

mercaptoethanol voor lyse van de cellen. Vervolgens werden de stalen ofwel zo snel

mogelijk, ofwel na tien minuten, ofwel na twee uur ingevroren in vloeibaar stikstof en in de

diepvries bewaard bij ‐80 °C. Daarna werd het RNA uit elk staal geëxtraheerd met behulp van

de RNeasy Plant Mini Kit. De kwantiteits‐ en kwaliteitbepaling van de RNA‐stalen werd

uitgevoerd met de NanoDrop spectrofotometer en het Experion Systeem.

3.3.8 Nanoprep bij verschillende temperatuur

Het protocol van de RNeasy Plant Mini Kit dient bij kamertemperatuur uitgevoerd te

worden, ondanks de labiele eigenschappen van RNA. De Absolutely RNA Nanoprep kit werkt

volgens dezelfde principes als de RNeasy Plant Mini kit. In het protocol van de Nanoprep kit

wordt echter geen informatie gegeven over de optimale temperatuur tijdens de

extractieprocedure. Om die reden werd de invloed van de omgevingstemperatuur op een

RNA‐extractie nagegaan door RNA bij verschillende temperaturen te extraheren uit twee

intacte bloemknoppen van een acht‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Hiervoor

werd het plantenmateriaal in eerste instantie verbrijzeld in vloeibaar stikstof en

overgebracht in 100 µL lysis buffer met 0,70 µL β‐mercaptoethanol. Dit lysaat werd

vervolgens gecentrifugeerd doorheen een Qiashredder kolom. Daarna werd het RNA

geëxtraheerd met behulp van de Absolutely RNA Nanoprep kit. Een eerste extractie werd

uitgevoerd op ijs, waarbij ook de centrifuge op 4° C werd ingesteld. Een tweede extractie

werd bij kamertemperatuur toegepast. De concentratie en kwaliteit van de twee stalen werd

gemeten met de NanoDrop spectrofotometer en het Experion analyse systeem.

R E S U L T A T E N | 36

4 RESULTATEN

4.1 METABOLIETSTUDIE

4.1.1 Concentratiebepaling van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren

4.1.1.1 In incubatiewater van A. annua

De resultaten van deze test tonen aan dat artemisinine en zijn biosynthetische

precursoren vanuit de glandulaire trichomen in het omringende water migreren en dus

mogelijk contaminatie kunnen veroorzaken. In Figuur 4.1. wordt de concentratie van

artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur in het water afkomstig van tien opeenvolgende

incubatiestappen met 20 A. annua anamed bloemknoppen weergegeven. Na het versnijden

van de bloemknoppen is een stijging van artemisinine en DHA zuur te zien, artemisininezuur

vertoont daarentegen geen duidelijk merkbare stijging.

FIGUUR 4.1. : GEMIDDELDE CONCENTRATIE AAN ARTEMISININE, DHA ZUUR EN ARTEMISININEZUUR

VAN 3 POOLS WATER NA INCUBATIE MET A. ANNUA BLOEMKNOPPEN.

4.1.1.2 In munttrichomen geïsoleerd uit incubatiewater van A. annua

De munttrichomen, geschoten uit het water afkomstig van de eerste incubatiestap

van A. annua, bleken per trichoom 0,011 ng artemisinine, 0,038 ng DHA zuur en 0,023 ng

artemisininezuur te bevatten. Aangezien bewezen is dat er in munttrichomen geen

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Concentratie (ng/µL)

Gemiddelde concentratie van 3 pools incubatiewater van A. annua

artemisinine

DHA zuur

artemisininezuur


artemisininesynthese plaatsvindt, kunnen we besluiten dat er hier sprake is van

contaminatie. De contaminatie in de munttrichomen blijkt van dezelfde grootte‐orde te zijn

als de concentraties aan artemisinine en zijn biosynthetische precursoren gedetecteerd in de

apicale en subapicale cellen van A. annua bij de eerder uitgevoerde metabolietstudie, wat

geïllustreerd wordt in Figuur 4.2.


PER MUNTTRICHOOM GESCHOTEN UIT INCUBATIEWATER VAN A. ANNUA IN VERGELIJKING MET

APICALE EN SUBAPICALE CELLEN VAN A. ANNUA.

4.1.1.3 In filamenteuze en glandulaire trichomen na wassen van versneden bloemknoppen

van A. annua

De glandulaire trichomen, geïsoleerd uit de versneden en gewassen bloemknoppen,

bleken geen detecteerbare hoeveelheid artemisinine meer te bevatten. Dit toont aan dat

artemisinine weggewassen is. Ook in de filamenteuze trichomen werd na wassen geen

artemisinine gedetecteerd.


PER TRICHOOM GEÏSOLEERD NA WASSEN VAN VERSNEDEN BLOEMKNOPPEN VAN A. ANNUA.

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

munttrichomen apicale cellen subapicale cellen

ng/munttrichoom

of ng/A.annua‐cel

Hoeveelheid artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur in munttrichomen in vergelijking met apicale en subapicale cellen van A. annua

artemisinine

DHA zuur

artemisininezuur

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

Glandulaire Trichomen Filamenteuze Trichomen

ng/trichoom

Hoeveelheid artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur in glandulaire en filamenteuze trichomen

artemisinine

DHA zuur

artemisininezuur


4.1.2 Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten

De hoeveelheid aan artemisinine, bepaald via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS, in de

chloroformextracten van de drie artemisinine‐preparaten wordt weergegeven in Tabel 4.1.

Hieruit blijkt dat in 552,50 mg gedroogd thee‐extract (min tong) geen artemisinine

gedetecteerd werd. Aangezien de detectielimiet 0,9 ng/mg bedraagt, kan besloten worden

dat dit preparaat inderdaad geen noemenswaardige hoeveelheid artemisinine bevat. De

artemisinineconcentratie van de gedroogde Artemisia blaadjes (minésterio da saùde) ligt

rond de waarden die op de verpakking vermeld staan. Het preparaat met de hoogste

concentratie aan artemisinine zijn de capsules van aov die 3,35 % artemisinine blijken te

bevatten, wat zelfs meer is dan de vermelde concentratie op de verpakking van dit product.

TABEL 4.1. : HOEVEELHEID ARTEMISININE, BEPAALD VIA HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS, IN

CHLOROFORMEXTRACTEN VAN DRIE ARTEMISININE‐PREPARATEN.

4.2 TRANSCRIPTOOMSTUDIE

4.2.1 Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen

Zowel NanoDrop, RiboGreen als Experion werden gebruikt voor concentratie‐ en

kwaliteitsbepalingen van RNA dat geëxtraheerd werd uit een referentiestaal, namelijk

Human Brain Reference RNA. Ook een 4x‐verdunning van dit geëxtraheerde RNA werd met

de verschillende methoden gemeten. Experion en NanoDrop detecteerden in dit verdunde

staal echter een hogere concentratie dan in het oorspronkelijke staal, waardoor we kunnen

besluiten dat deze methoden niet betrouwbaar zijn voor kwantificatie van lage RNA‐

concentraties. RiboGreen kan dus beschouwd worden als de meest betrouwbare methode

voor de concentratiebepaling van het RNA. Nadeel is dat deze methode grote hoeveelheden

staal vereist voor de meting van stalen met een lage RNA‐concentratie. Om die reden werd

mg preparaat

mL chloroform

mg artemisinine

actueel gew% artemisinine

theoretisch gew% artemisinine

(volgens verpakking)

1 capsule poeder

(min tong) 552,50 50,00 0,00 0,00 niet vermeld

1 zakje gedroogd blad

(min. da saude) 1250,00 50,00 9,17 0,73 0,8 tot 1

1 capsule (aov)

588,60 50,00 19,74 3,35 2,55


een RiboGreen meting in deze studie niet veel uitgevoerd om staal te bewaren voor verdere

analyses. Bovendien kan met RiboGreen ook geen informatie verkregen worden over de

RNA‐kwaliteit, waardoor voor kwaliteitsbepalingen overgeschakeld werd op het Experion

systeem.

TABEL 4.2. : CONCENTRATIE VAN RNA GEËXTRAHEERD UIT EEN REFERENTIESTAAL, GEMETEN MET

EXPERION, RIBOGREEN EN NANODROP. RIBOGREEN BLIJKT DE MEEST BETROUWBARE METHODE

VOOR KWANTITEITSBEPALING.

Experion RiboGreen NanoDrop

RNA‐concentratie RNA‐concentratie RNA‐concentratie

ng/µL ng/µL ng/µL

EXTRACTIE REFERENTIESTAAL 0,0780 1,58 3,79

EXTRACTIE REFERENTIESTAAL 4 x VERDUND

0,106 0,440 5,19

4.2.2 Vergelijking verschillende extractiekits

De RNA‐stalen, verkregen na extractie uit plantenmateriaal met behulp van de

RNAqueous®‐Micro kit en de Absolutely RNA Nanoprep kit, werden geanalyseerd met het

Experion RNA Analyse systeem. Er werden geen verschillen in RNA‐concentratie

waargenomen, beide kits extraheerden dus evenveel RNA. Uit de bekomen

chromatogrammen (zie Figuur 4.4) bleek het RNA geëxtraheerd via de Absolutely RNA

Nanoprep kit uit langere fragmenten te bestaan en dus van hogere kwaliteit te zijn dan het

RNA geëxtraheerd via de RNAqueous®‐Micro kit. Om die reden werd voor de volgende

FIGUUR 4.4. : CHROMATOGRAMMEN, VERKREGEN MET HET EXPERION SYSTEEM, VAN RNA

GEËXTRAHEERD UIT A. ANNUA. MET VERSCHILLENDE EXTRACTIEKITS. DE ABSOLUTELY RNA

NANOPREP KIT (RECHTS) EXTRAHEERT RNA MET HOGERE KWALITEIT DAN DE RNAQUEOUS®‐MICRO

KIT (LINKS).


testen gebruik gemaakt van de Absolutely RNA Nanoprep kit. Er moet ook opgemerkt

worden dat in deze stalen geen rRNA gedetecteerd werd. Om na te gaan of het rRNA

verloren gegaan of gedegradeerd is tijdens de extractieprocedure, zal RNA uit een

referentiestaal geëxtraheerd worden met de Absolutely RNA Nanoprep kit.

4.2.3 Extractie van een referentiestaal

TABEL 4.3. : HOEVEELHEID TOTAAL RNA (ng) IN 10 µL REFERENTIESTAAL (10 ng/µL), VÓÓR EN NA

EXTRACTIE MET DE ABSOLUTELY RNA NANOPREP KIT.

Experion RiboGreen

VOOR EXTRACTIE 47,5 ng 73,0 ng

NA EXTRACTIE 4,24 ng 17,6 ng

PERCENTAGE GEËXTRAHEERD 10% 25%

De Abslutely RNA Nanoprep extractiekit werd toegepast voor de RNA‐extractie uit

een referentiestaal, namelijk Human Brain Reference RNA (HBRR) met een gekende

concentratie van 10 ng/µL. Volgens RiboGreen bedraagt de concentratie van het

oorspronkelijke referentiestaal 7,30 ng/µL. Aangezien de gegeven concentratie van dit

referentiestaal 10 ng/µL bedroeg, wijst dit erop dat de RNA‐kwaliteit waarschijnlijk door

herhaaldelijk ontdooien en terug invriezen verminderd is. Er werd RNA geëxtraheerd uit 10

µL van dit referentiestaal, wat bij 100% extractie een theoretische opbrengst van 73 ng zou

opleveren. De opbrengst na extractie was echter 17,60 ng. Volgens de RiboGreen‐resultaten

is de Nanoprep methode dus in staat om één vierde van het input RNA te elueren. Volgens

de Experion‐resultaten wordt echter slechts 10 % van het input RNA geëlueerd. In volgende

testen moet er dus rekening mee gehouden worden dat slechts een fractie aan RNA in de

stalen effectief geëlueerd wordt. Er moet ook opgemerkt worden dat de ribosomale pieken,

18S en 28S, hier wel gedetecteerd worden. Na extractie zien we echter een duidelijke

vermindering van het ribosomaal RNA waardoor we kunnen besluiten dat het ribosomaal

RNA tijdens de extractieprocedure degradeert of gedeeltelijk verloren gaat.

FIGUUR 4.5. : EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN VOOR EN NA EXTRACTIE VAN RNA UIT 10µL

REFERENTIESTAAL. NA EXTRACTIE IS ER EEN DUIDELIJKE VERMINDERING VAN RIBOSOMAAL RNA.


4.2.4 LMPC stalen

4.2.4.1 Preliminaire test

In een eerste test werd het totale RNA geëxtraheerd uit 150 ongefixeerde volledige

glandulaire trichomen die in 20 µL verzameld werden. De RNA‐opbrengst, bepaald via de

Experion RNA Analyse Kit en RiboGreen RNA Quantition Kit, bedroeg in dit staal

respectievelijk 290 pg en 2 170 pg. Dit is echter veel lager dan verwacht aangezien 900 cellen

(150 trichomen waarvan minimum 6 cellen verzameld) theoretisch 18 000 à 270 000 pg

totaal RNA zouden bevatten. Hierbij gaan we er van uit dat één cel 1 à 3 pg mRNA bevat, wat

1‐5% van het totale RNA vormt. De lage opbrengst kan te wijten zijn aan de

samplingmethode. Aangezien LMPC als samplingtechniek niet 100 % betrouwbaar is, bestaat

de mogelijkheid dat niet alle cellen in het epje terechtkomen. Dit kan te wijten zijn aan het

kleine samplingvolume (20 µL) dat in deze test gebruikt werd. Om dit na te gaan werd ook

de RNA‐opbrengst bekeken bij een volgende test met als samplingvolume 40 µL, waarbij het

vloeistofoppervlak dichter bij het preparaat staat en de trichomen dus een kortere afstand

moeten afleggen.

4.2.4.2 Verschillende samplingvolumes

De RNA‐opbrengst, verkregen na extractie uit 150 glandulaire trichomen die

verzameld werden in ofwel 20 µL of 40 µL lysis buffer, werd gemeten met zowel het

Experion RNA Analyse systeem als de NanoDrop spectrofotometer (zie Tabel 4.4). Zowel bij

Experion als bij NanoDrop vertoonden de twee samplingmethodes geen duidelijk verschil in

RNA‐kwantiteit. De RNA‐opbrengst bleek echter te laag om de RNA‐kwaliteit via Experion

optimaal te kunnen meten. Aangezien de 260/280 ratio, berekend bij de NanoDrop

spectrofotometer, niet tussen 1,8 en 2,0 ligt, kunnen we wel besluiten dat ons staal niet

zuiver genoeg is. Waarschijnlijk vertonen nog aanwezige plantencontaminanten te veel

interferentie met de absorbantie. Ook de 260/230 ratio ligt onder de optimale waarde. Dit

wijst op contaminatie met proteïnen, phenolen of chaotropische zouten zoals guanidine

thiocyanaat. Bovendien bevinden de RNA‐concentraties in deze stalen zich ook onder de

detectielimiet van de NanoDrop spectrofotometer waardoor de betrouwbaarheid van de

resultaten in vraag kan gesteld worden.


TABEL 4.4. : HOEVEELHEID RNA GEËXTRAHEERD MET DE ABSOLUTELY RNA NANOPREP KIT UIT 150

GLANDULAIRE TRICHOMEN (VERZAMELD IN VERSCHILLENDE SAMPLINGVOLUMES, NAMELIJK 20 µL

EN 40 µL) IN EEN TOTAAL VAN 10 µL ELUTIEBUFFER.

Experion NanoDrop RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit

ng/µL RQI ng/µL 260/280 260/230

20 µL 0,146 RNA‐conc. too low 6,79 1,60 0,08

40 µL 0,134 RNA‐conc. too low 5,21 1,62 0,05

Er moet ook opgemerkt worden dat de test waarbij 20µL gebruikt werd als

samplingvolume in principe een herhaling is van de eerste test besproken in 4.2.4.1. De

opbrengst blijkt hier echter groter te zijn, namelijk 1 460 pg vergeleken met 290 pg bij de

eerste test. Door meerdere testen uit te voeren, zal de reproduceerbaarheid van deze hoge

concentraties nagegaan worden. Dit wordt bij de volgende paragraaf in detail besproken.


De gemiddelde RNA‐opbrengst bedraagt voor de gefixeerde en niet‐gefixeerde LMPC

stalen respectievelijk 100 pg en 170 pg geanalyseerd met het Experion systeem (in een

totaal van 10 µL elutiebuffer), wat veel lager is dan de opbrengst in de stalen bij 4.2.4.2.

(ongeveer 1 500 pg) waardoor we kunnen besluiten dat de hoge waarden in voorgaande

testen niet reproduceerbaar zijn en er waarschijnlijk contaminatie is opgetreden. De

NanoDrop spectrofotometer detecteerde echter een veel hogere RNA‐opbrengst, namelijk

75 600 pg en 213 400 pg, voor de gefixeerde en niet‐gefixeerde stalen respectievelijk. Deze

hoge waarden zijn echter niet betrouwbaar aangezien de RNA‐concentratie onder de

detectielimiet (2 à 5 ng/µL) van de NanoDrop methode ligt. Bovendien kan besloten worden

dat de gefixeerde stalen geen grotere RNA‐opbrengst opleveren dan de niet‐gefixeerde

stalen, ondanks de lagere oppervlaktespanning van de fixeervloeistof.

TABEL 4.5. : HOEVEELHEID RNA GEËXTRAHEERD MET DE ABSOLUTELY RNA NANOPREP KIT UIT 150

GEFIXEERDE EN NIET‐GEFIXEERDE GLANDULAIRE TRICHOMEN IN EEN TOTAAL VAN 10 µL

ELUTIEBUFFER.

Experion (ng/µL) NanoDrop (ng/µL)

FIX 1 0,009 5,84 FIX 2 0,004 gemiddelde = 0,010 6,41 gemiddelde = 7,560 FIX 3 0,015 10,43

NIET FIX 1 0,025 5,80 NIET FIX 2 0,010 gemiddelde = 0,017 8,91 gemiddelde = 21,34 NIET FIX 3 0,015 6,63


4.2.5 Optimalisatie met meer plantenmateriaal

4.2.5.1 Invloed DNase behandeling

Na een DNase behandeling blijkt slechts een percentage van de oorspronkelijke

hoeveelheid RNA over te blijven. Dit wijst er op dat er in eerste instantie contaminerend

DNA aanwezig was waardoor de RNA‐concentraties foutief verhoogd werden. Vooral de

NanoDrop metingen vertonen sterke interferentie met het contaminerend DNA.

TABEL 4.6. : OVERBLIJVEND PERCENTAGE RNA NA DNase BEHANDELING VAN RNA GEËXTRAHEERD

UIT PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA.


Om de invloed van fixatie op de RNA‐kwaliteit te kunnen bepalen, moest

overgeschakeld worden op grotere hoeveelheden plantenmateriaal, namelijk ongeveer 73

mg Artemisia bloemknoppen en ‐blaadjes. De concentratie en kwaliteit van hieruit

geëxtraheerd RNA werd nagegaan met de NanoDrop spectrofotometer en het Experion

Systeem. Hieruit blijkt dat fixatie duidelijk een negatieve invloed heeft op zowel de RNA‐

kwantiteit als –kwaliteit. Er wordt ook opgemerkt dat het niet‐gefixeerd staal een betere

ratio A260/A280 (tussen 1,8 en 2,0) en ratio A260/A230 (ongeveer 2,0) vertoont. In het niet‐

gefixeerd staal zijn dus minder contaminanten aanwezig die interfereren met de

absorbantie.

Experion NanoDrop

VOOR DNase BEHANDELING 2235 ng 3774 ng

NA DNase BEHANDELING 1361 ng 1421 ng

OVERBLIJVEND PERCENTAGE 61 % 38%

FIGUUR 4.6. : EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE RNEASY PLANT

MINI KIT UIT PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA VÓÓR (LINKS) EN NA (RECHTS) DNase BEHANDELING.


TABEL 4.7. : KWANTITEIT EN KWALITEIT VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE RNEASY PLANT MINI KIT

UIT GEFIXEERD EN NIET‐GEFIXEERD PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA IN EEN TOTAAL VAN 30µl

ELUTIEBUFFER

4.2.5.3 Verschillende samplingtijden

Ondanks het feit dat RNA labiel is en we dus een daling in kwaliteit en kwantiteit

verwachten in functie van de tijd, is er toch geen duidelijke dalende trend te zien. De

chromatogrammen, verkregen via Experion, vertonen wel een vermindering van de RNA‐

kwaliteit, maar deze afname is minder dan verwacht. Volgens deze resultaten zou een

langere samplingtijd de RNA‐kwantiteit en ‐kwaliteit dus niet noemenswaardig beïnvloeden.

TABEL 4.8. : KWANTITEIT EN KWALITEIT VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE RNEASY PLANT MINI KIT

UIT PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA NA 0, 10 EN 120 MINUTEN IN EEN TOTAAL VAN 30 µL

ELUTIEBUFFER.

Experion NanoDrop RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit

ng/µL RQI ng/µL 260/280 260/230

FIX 4,57 RNA‐conc.

7,15 1,41 0,47 too low

NIET FIX 552 2,9 345 1,84 1,94

Experion NanoDrop

RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit RNA‐kwantiteit RNA‐kwaliteit

ng/µL RQI ng/µL 260/280 260/230

0 min 353 7,7 523 1,79 1,91

10 min 752 7,6 796 2,03 2,24

120 min 501 7,8 370 2,05 1,38

FIGUUR 4.7. : EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN VAN RNA GEËXTRAHEERD UIT GEFIXEERD (RECHTS)

PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA VERTONEN DUIDELIJK EEN MINDERE RNA‐KWALITEIT EN ‐

KWANTITEIT DAN UIT NIET‐GEFIXEERD PLANTENMATERIAAL (LINKS)


4.2.6 Nanoprep bij verschillende temperatuur

Aan de hand van de chromatogrammen, verkregen via het Experion Analyse Systeem,

kunnen we besluiten dat het RNA geëxtraheerd op ijs van betere kwaliteit is dan het RNA

geëxtraheerd bij kamertemperatuur. Er moet wel opgemerkt worden dat de ratio 260/280

van het RNA geëxtraheerd bij kamertemperatuur beter is dan bij ijs, maar de Experion‐

chromatogrammen en RQI‐waarde vertonen toch een betere kwaliteit voor de RNA‐stalen

geëxtraheerd op ijs. Er zijn echter geen noemenswaardige verschillen in RNA‐kwantiteit.

TABEL 4.9. : KWANTITEIT EN KWALITEIT VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE ABSOLUTELY RNA

NANOPREP KIT, OP IJS OF BIJ KAMERTEMPERATUUR, UIT TWEE VOLLEDIGE BLOEMKNOPPEN VAN A.

ANNUA IN EEN TOTAAL VAN 10 µL ELUTIEBUFFER.

Experion NanoDrop

RNA‐concentratie RNA‐kwaliteit RNA‐concentratie RNA‐kwaliteit

ng/µL RQI ng/µL 260/280 260/230

Ijs 27,06 8,6 9,40 3,81 0,04

Kamertemperatuur 22,72 4,6 21,34 1,97 0,08

FIGUUR 4.9. : HET RNA BEKOMEN NA EXTRACTIE OP IJS (LINKS) IS VAN BETERE KWALITEIT DAN HET

RNA GEËXTRAHEERD BIJ KAMERTEMPERATUUR (RECHTS).

FIGUUR 4.8. : EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN VAN RNA GEËXTRAHEERD UIT A. ANNUA NA 0

MINUTEN (LINKS), 10 MINUTEN (MIDDEN) EN 120 MINUTEN (RECHTS).

D I S C U S S I E | 46

5 DISCUSSIE

5.1 Contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen

Hoewel in een eerder uitgevoerde metabolietstudie artemisinine in eerste instantie

enkel gedetecteerd werd in de apicale cellen en niet in de subapicale cellen, kan hieruit

omwille van contaminatie toch geen besluiten getrokken worden. In het eerste luik van deze

scriptie werd artemisinine namelijk gedetecteerd in munttrichomen die geïsoleerd werden

uit water geïncubeerd met A. annua bloemknoppen, hoewel bewezen is dat muntplanten

geen artemisinine produceren. Dit bewijst dat artemisinine en zijn biosynthetische

precursoren in het omringende water migreren en vervolgens via LMPC samen met de

geschoten cellen in het epje gekatapulteerd worden, zelfs al produceren de cellen zelf geen

artemisinine.

Een aantal hypothesen kunnen deze resultaten ondersteunen. In een eerste

hypothese gaan we ervan uit dat artemisinine vanuit het water via poriën in de cellen

opgenomen wordt of op de celwand of cuticula van de trichomen adheert. Anderzijds is het

ook mogelijk dat waterdruppels met daarin artemisinine op zichzelf meegeschoten worden,

ondanks de grote oppervlaktespanning van water. Dit kan verklaard worden doordat het

wateroppervlak gebroken wordt door het aanwezige plantenmateriaal waardoor de

oppervlaktespanning daalt. Een andere verklaring is dat de geschoten cellen de vorm van

een kuipje aannemen en zo de mogelijkheid vormen dat waterdruppels meegekatapulteerd

worden.

5.2 Concentratie van artemisinine in fytopreparaten

In het tweede luik van deze scriptie werd de artemisinineconcentratie bepaald van

drie artemisinine‐preparaten die tegenwoordig op de markt te vinden zijn. Er werd

vastgesteld dat één preparaat geen detecteerbaar artemisinine bevat en dus niet gebruikt

kan worden als waardevolle therapie. De andere twee preparaten bleken wel voldoende

concentraties artemisinine te bevatten, maar deze zijn tot nu toe nog niet verkrijgbaar in

België. Vooral de aov capsules met een gewichtspercentage 3,35 % aan artemisinine kunnen

beschouwd worden als een veelbelovende therapie bij bijvoorbeeld de behandeling van

bepaalde types kanker.


5.3 Optimalisatie RNA‐extractie voor next generation sequencing

In het derde luik van deze scriptie werd getracht RNA te extraheren uit volledige

glandulaire trichomen om in de toekomst het transcriptoom van apicale en subapicale cellen

te kunnen sequeneren. Vooraleer de next generation sequencing kan plaatsvinden, moet het

RNA eerst geamplificeerd worden met behulp van de Ovation® RNA‐Seq System kit. Deze kit

vereist RNA van hoge kwaliteit en een minimale input van 500 pg in een maximum volume

van 5µL. Een hoge RNA‐kwaliteit is eveneens belangrijk om de volledige lengte van het

transcriptoom te kunnen bepalen. Om aan deze hoge kwaliteitseisen te voldoen, werd in

eerste instantie de RNA‐extractiemethode en samplingmethode geoptimaliseerd voor

volledige glandulaire trichomen.

De RNA‐opbrengst uit 150 volledige glandulaire trichomen werd gemeten met

Experion, RiboGreen en NanoDrop en bedroeg respectievelijk 290 pg, 2 170 pg en 42,5 ng.

De resultaten van NanoDrop zijn hier niet betrouwbaar aangezien de RNA‐concentratie

onder de detectielimiet ligt. De opbrengst was echter veel lager dan verwacht aangezien 900

cellen theoretisch 18 000 à 270 000 pg totaal RNA zouden bevatten. Hierbij gaan we er van

uit dat één cel 1 à 3 pg mRNA bevat, wat 1‐5% van het totale RNA vormt. Ter vergelijking

was er bij Olsson et al. (2009) volgens persoonlijke communicatie een RNA‐opbrengst van 30

ng voor 210 volledige glandulaire trichomen geanalyseerd met de NanoDrop

spectrofotometer. Publicaties van RNA‐extracties uit cellen van verschillende plantensoorten

rapporteren meestal een opbrengst van 1,5 à 3,5 pg per LMPC‐geïsoleerde cel (Nakazono et

al., 2003; Murata & De Luca, 2005; Agusti et al., 2009). Onze opbrengst wijkt hier niet sterk

van af (2,4 pg/cel volgens RiboGreen) maar aangezien het niet haalbaar is om meer dan 150

trichomen te verzamelen, is de totale opbrengst nog onvoldoende voor efficiënte

kwaliteitsbepaling van het RNA. Daarom werd voor verdere optimalisatie overgeschakeld op

grotere hoeveelheden plantenmateriaal. Op die manier konden ook 18S en 28S rRNA

gedetecteerd worden aangezien dit bij de LMPC‐stalen niet waargenomen werd.

In eerste instantie werd nagegaan welke analysekit het meest betrouwbaar is voor

kwaliteit‐ en kwantiteitsbepaling van het RNA in deze studie. De hoge concentraties

verkregen met de NanoDrop spectrofotometer kunnen verklaard worden door de invloed

van contaminanten op de meting aangezien DNA, nucleotiden, fenolen en chaotropische

zouten eveneens absorptie vertonen bij 260 nm waardoor de concentratie valselijk verhoogd


wordt. De NanoDrop methode is dus enkel geschikt voor zuivere stalen, in tegenstelling tot

onze stalen die hoogstwaarschijnlijk nog resterende plantenmetabolieten bevatten. Ook

Experion bleek niet geschikt voor kwantiteitsbepalingen aangezien deze methode in een 4x

verdund staal een hogere concentratie detecteerde dan in het oorspronkelijk onverdunde

staal. De RiboGreen resultaten bleken tussen de hoge NanoDrop‐concentraties en de lage

Experion‐resultaten te vallen. Nadeel is dat het RiboGreen reagens interageert met alle

nucleïnezuren, waardoor deze methode niet kan differentiëren tussen DNA, RNA en losse

nucleotiden. Uiteindelijk werd geconcludeerd dat Experion het meest betrouwbaar is voor

de bepaling van de RNA‐kwaliteit en RiboGreen voor de bepaling van de RNA‐kwantiteit. Een

nadeel van de RiboGreen kwantificatie is dat relatief veel staal nodig is voor analyse van

stalen met een lage RNA‐concentratie.

Voor de isolatie van de glandulaire trichomen uit het plantenmateriaal, werd gebruik

gemaakt van LMPC als samplingtechniek. Aangezien er nooit zekerheid is dat de geschoten

trichomen effectief in het verzamelepje terechtkomen, kan men besluiten dat LMPC geen

100% betrouwbare techniek is. Dit kan een reden zijn voor de lage RNA‐opbrengst, waardoor

getracht werd deze samplingtechniek te optimaliseren. Er werden verschillende

samplingvolumes en samplingtijden vergeleken, maar hierbij werd geen merkwaardig

verschil in opbrengst gezien. Fixatie van de stalen bleek echter wel een duidelijke negatieve

invloed te hebben op de RNA‐kwantiteit en kwaliteit. Dit kan in de toekomst problemen

vormen aangezien fixatie noodzakelijk is om apicale en subapicale cellen te kunnen isoleren.

De lage RNA‐opbrengst kan ook te wijten zijn aan problemen met de

extractiemethode. De Absolutely RNA Nanoprep kit leek hier het meest geschikt. Het

probleem is dat deze kit, zoals de meeste kits die tegenwoordig op de markt zijn, niet

geoptimaliseerd is voor plantenmateriaal. Er wordt vermoed dat fenolische

plantenmetabolieten kunnen geoxideerd worden tot quinonen, die op hun beurt

onoplosbare complexen met nucleïnezuren vormen. Het RNA zou dus verloren gaan door

binding aan fenolen of andere plantenmetabolieten (Liu et al., 1998; Ghangal et al., 2009).

Er is dus duidelijk nog verdere optimalisatie vereist vooraleer overgestapt kan

worden op RNA‐extracties uit apicale en subapicale cellen. Aangezien fixatie van het

plantenmateriaal noodzakelijk is voor de isolatie van deze cellen wordt de haalbaarheid om

uiteindelijk RNA, met voldoende kwaliteit en kwantiteit, uit apicale en subapicale cellen te

kunnen extraheren meer en meer in vraag gesteld.

C O N C L U S I E | 49

6 CONCLUSIE

Een eerder uitgevoerde metabolietstudie leek oorspronkelijk te bevestigen dat

artemisinine enkel in de apicale cellen geproduceerd wordt. Hoewel artemisinine in eerste

instantie enkel in de apicale cellen gedetecteerd werd, kon hieruit omwille van contaminatie

toch geen besluit worden gevormd. In het eerste luik van deze scriptie werd artemisinine

namelijk gedetecteerd in munttrichomen die geïsoleerd werden uit water geïncubeerd met

A. annua bloemknoppen. Aangezien bewezen is dat er in munttrichomen geen

artemisininesynthese plaatsvindt, bewijst deze test dat artemisinine in het omringende

water migreert en contaminatie veroorzaakt.

Als tweede luik van deze scriptie werd op zoek gegaan naar waardevolle artemisinine

fytopreparaten die reeds op de markt te vinden zijn. Hieruit bleek dat vooral de aov‐capsules

met een gewichtspercentage van 3,35% aan artemisinine kunnen beschouwd worden als

een veelbelovende therapie bij bijvoorbeeld de behandeling van bepaalde types kanker.

Voor de verdere opheldering van de biosynthese pathway van artemisinine werd als

derde luik van deze scriptie gestart met een transcriptoomstudie, waarbij het transcriptoom

van apicale cellen vergeleken wordt met subapicale cellen. Vooraleer RNA geëxtraheerd kan

worden uit apicale en subapicale cellen afzonderlijk, werd getracht de RNA‐

extractiemethode en samplingmethode te optimaliseren voor volledige glandulaire

trichomen. De opbrengst bleek echter zelfs bij 150 volledige trichomen te laag, waardoor

voor verdere optimalisaties overgeschakeld werd op grotere hoeveelheden

plantenmateriaal. De lage opbrengst kan te wijten zijn aan de Laser Microdissection Pressure

Catapulting techniek, die waarschijnlijk niet 100% betrouwbaar is, alsook aan de RNA‐

extractiemethode. Ondanks het feit dat vele extractiekits niet geoptimaliseerd zijn voor

plantenmateriaal, bleek de Absolutely RNA NanoPrep het meest geschikt voor kleinere

hoeveelheden. Bij de optimalisatie van de samplingmethode vertoonden zowel verschillende

samplingvolumes als samplingtijden geen merkwaardig verschil in RNA‐opbrengst. Fixatie

van de stalen blijkt wel een duidelijke negatieve invloed te hebben op de RNA‐kwantiteit en

–kwaliteit. Aangezien fixatie noodzakelijk is voor de isolatie van apicale en subapicale cellen

wordt de haalbaarheid om uiteindelijk RNA, met voldoende kwaliteit en kwantiteit, uit deze

afzonderlijke cellen te kunnen extraheren hierdoor meer en meer in vraag gesteld.

L I T E R A T U U R L I J S T | 50

7 LITERATUURLIJST

Abdin, M. Z.; Israr, M.; Rehman, R. U.; Jain, S. K. (2003). Artemisinin, a novel antimalarial drug: biochemical and molecular approaches for enhanced production. Planta Med, 69, 289‐299.

Agusti, J.; Merelo, P.; Cercos, M.; Tadeo, F. R.; Talon, M. (2009). Comparative transcriptional survey between laser‐microdissected cells from laminar abscission zone and petiolar cortical tissue during ethylene‐promoted abscission in citrus leaves. Bmc Plant Biology, 9, 127‐147.

Balint, G. A. (2001). Artemisinin and its derivatives: an important new class of antimalarial agents. Pharmacol Ther, 90, 261‐265.

Bertea, C. M.; Freije, J. R.; van der Woude, H.; Verstappen, F. W.; Perk, L.; Marquez, V.; De Kraker, J. W.; Posthumus, M. A.; Jansen, B. J.; de Groot, A.; Franssen, M. C.; Bouwmeester, H. J. (2005). Identification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua. Planta Med, 71, 40‐47.

Bouwmeester, H. J.; Wallaart, T. E.; Janssen, M. H.; van Loo, B.; Jansen, B. J.; Posthumus, M. A.; Schmidt, C. O.; De Kraker, J. W.; Konig, W. A.; Franssen, M. C. (1999). Amorpha‐4,11‐diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis. Phytochemistry, 52, 843‐854.

Brown, G. D.; Sy, L. K. (2004). In vivo transformations of dihydroartemisinic acid in Artemisia annua plants. Tetrahedron, 60, 1139‐1159.

Brown, G. D.; Sy, L. K. (2007). In vivo transformations of artemisinic acid in Artemisia annua plants. Tetrahedron, 63, 9548‐9566.

Capanna, E. (2006). Grassi versus Ross: who solved the riddle of malaria? Int Microbiol, 9, 69‐74.

Covello, P. S. (2008). Making artemisinin. Phytochemistry, 69, 2881‐2885.

Davis, T. M.; Karunajeewa, H. A.; Ilett, K. F. (2005). Artemisinin‐based combination therapies for uncomplicated malaria. Med J Aust, 182, 181‐185.

Day, R. C.; Grossniklaus, U.; Macknight, R. C. (2005). Be more specific! Laser‐assisted microdissection of plant cells. Trends Plant Sci, 10, 397‐406.

de Ridder, S.; van der Kooy, F.; Verpoorte, R. (2008). Artemisia annua as a self‐reliant treatment for malaria in developing countries. Journal of Ethnopharmacology, 120, 302‐314.

Delabays, N.; Simonnet, X.; Gaudin, M. (2001). The genetics of artemisinin content in Artemisia annua L. and the breeding of high yielding cultivars. Curr Med Chem, 8, 1795‐1801.

Dondorp, A. M.; Nosten, F.; Yi, P.; Das, D.; Phyo, A. P.; Tarning, J.; Lwin, K. M.; Ariey, F.; Hanpithakpong, W.; Lee, S. J.; Ringwald, P.; Silamut, K.; Imwong, M.; Chotivanich, K.; Lim, P.; Herdman, T.; An, S. S.; Yeung, S.; Singhasivanon, P.; Day, N. P.; Lindegardh, N.; Socheat, D.; White, N. J. (2009). Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. N Engl J Med, 361, 455‐467.

Duke, S. O.; Paul, R. N. (1993). Development and Fine‐Structure of the Glandular Trichomes of Artemisia‐Annua L. International Journal of Plant Sciences, 154, 107‐118.


Eckstein‐Ludwig, U.; Webb, R. J.; Van Goethem, I. D.; East, J. M.; Lee, A. G.; Kimura, M.; O'Neill, P. M.; Bray, P. G.; Ward, S. A.; Krishna, S. (2003). Artemisinins target the SERCA of Plasmodium falciparum. Nature, 424, 957‐961.

Efferth, T. (2007). Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity of artemisinin‐‐from bench to bedside. Planta Med, 73, 299‐309.

Ferreira, J. F. S.; Janick, J. (1996). Distribution of Artemisinin in Artemisia annua. ASHSS Press, 579‐584.

Firestone, G. L.; Sundar, S. N. (2009). Anticancer activities of artemisinin and its bioactive derivatives. Expert Reviews in Molecular Medicine, 11.

Ghangal, R.; Raghuvanshi, S.; Chand Sharma, P. (2009). Isolation of good quality RNA from a medicinal plant seabuckthorn, rich in secondary metabolites. Plant Physiol Biochem, 47, 1113‐1115.

Greenwood, B.; Mutabingwa, T. (2002). Malaria in 2002. Nature, 415, 670‐672.

Hsu, E. (2006). The history of qing hao in the Chinese materia medica. Trans R Soc Trop Med Hyg, 100, 505‐508.

Kerk, N. M.; Ceserani, T.; Tausta, S. L.; Sussex, I. M.; Nelson, T. M. (2003). Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol, 132, 27‐35.

Liu, C.; Zhao, Y.; Wang, Y. (2006). Artemisinin: current state and perspectives for biotechnological production of an antimalarial drug. Appl Microbiol Biotechnol, 72, 11‐20.

Liu, J. J.; Goh, C. J.; Loh, C. S.; Liu, P.; Pua, E. C. (1998). A method for isolation of total RNA from fruit tissues of banana. Plant Molecular Biology Reporter, 16, 1‐6.

Maude, R. J.; Pontavornpinyo, W.; Saralamba, S.; Aguas, R.; Yeung, S.; Dondorp, A. M.; Day, N. P.; White, N. J.; White, L. J. (2009). The last man standing is the most resistant: eliminating artemisinin‐resistant malaria in Cambodia. Malar J, 8, 31‐37.

Miller, L. H.; Baruch, D. I.; Marsh, K.; Doumbo, O. K. (2002). The pathogenic basis of malaria. Nature, 415, 673‐679.

Murata, J.; De Luca, V. (2005). Localization of tabersonine 16‐hydroxylase and 16‐OH tabersonine‐16‐O‐methyltransferase to leaf epidermal cells defines them as a major site of precursor biosynthesis in the vindoline pathway in Catharanthus roseus. Plant Journal, 44, 581‐594.

Nakase, I.; Lai, H.; Singh, N. P.; Sasaki, T. (2008). Anticancer properties of artemisinin derivatives and their targeted delivery by transferrin conjugation. Int J Pharm, 354, 28‐33.

Nakazono, M.; Qiu, F.; Borsuk, L. A.; Schnable, P. S. (2003). Laser‐capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: Identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell, 15, 583‐596.

Nelson, T.; Tausta, S. L.; Gandotra, N.; Liu, T. (2006). Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annu Rev Plant Biol, 57, 181‐201.

Olliaro, P. L.; Taylor, W. R. (2004). Developing artemisinin based drug combinations for the treatment of drug resistant falciparum malaria: A review. J Postgrad Med, 50, 40‐44.


Olsson, M. E.; Olofsson, L. M.; Lindahl, A. L.; Lundgren, A.; Brodelius, M.; Brodelius, P. E. (2009). Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L. Phytochemistry, 70, 1123‐1128.

Ro, D. K.; Paradise, E. M.; Ouellet, M.; Fisher, K. J.; Newman, K. L.; Ndungu, J. M.; Ho, K. A.; Eachus, R. A.; Ham, T. S.; Kirby, J.; Chang, M. C.; Withers, S. T.; Shiba, Y.; Sarpong, R.; Keasling, J. D. (2006). Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature, 440, 940‐943.

Romero, G. Q.; Souza, J. C.; Vasconcellos‐Neto, J. (2008). Anti‐herbivore protection by mutualistic spiders and the role of plant glandular trichomes. Ecology, 89, 3105‐3115.

Romero, M. R.; Efferth, T.; Serrano, M. A.; Castano, B.; Macias, R. I.; Briz, O.; Marin, J. J. (2005). Effect of artemisinin/artesunate as inhibitors of hepatitis B virus production in an "in vitro" replicative system. Antiviral Res, 68, 75‐83.

Tellez, M. R.; Canel, C.; Rimando, A. M.; Duke, S. O. (1999). Differential accumulation of isoprenoids in glanded and glandless Artemisia annua L. Phytochemistry, 52, 1035‐1040.

Tuteja, R. (2007). Malaria ‐ an overview. FEBS J, 274, 4670‐4679.

van Agtmael, M. A.; Eggelte, T. A.; van Boxtel, C. J. (1999). Artemisinin drugs in the treatment of malaria: from medicinal herb to registered medication. Trends Pharmacol Sci, 20, 199‐205.

Van Nieuwerburgh, F. C.; Vande Casteele, S. R.; Maes, L.; Goossens, A.; Inze, D.; Van Bocxlaer, J.; Deforce, D. L. (2006). Quantitation of artemisinin and its biosynthetic precursors in Artemisia annua L. by high performance liquid chromatography‐electrospray quadrupole time‐of‐flight tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1118, 180‐187.

Van Valckenborgh A.M. (2009) Trichomen, de sleutel tot een verhoogde productie van artemisinine in Artemisia annua. Master thesis aan Universiteit Gent, België.

Wagner, G. J.; Wang, E.; Shepherd, R. W. (2004). New approaches for studying and exploiting an old protuberance, the plant trichome. Ann Bot, 93, 3‐11.

Wang, W.; Wang, Y.; Zhang, Q.; Qi, Y.; Guo, D. (2009). Global characterization of Artemisia annua glandular trichome transcriptome using 454 pyrosequencing. BMC Genomics, 10, 465‐474.

Willcox, M.; B.M.; M.R.C.G.P.; M.C.P.P.; D.C.H.; D.T.M.&H (2009). Artemisia Species: From Traditional Medicines to Modern Antimalarials‐and Back Again. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 15, 101‐109.

Withers, S. T.; Keasling, J. D. (2007). Biosynthesis and engineering of isoprenoid small molecules. Appl Microbiol Biotechnol, 73, 980‐990.

Wongsrichanalai, C.; Pickard, A. L.; Wernsdorfer, W. H.; Meshnick, S. R. (2002). Epidemiology of drug‐resistant malaria. Lancet Infect Dis, 2, 209‐218.

Zhang, Y.; Teoh, K. H.; Reed, D. W.; Maes, L.; Goossens, A.; Olson, D. J.; Ross, A. R.; Covello, P. S. (2008). The molecular cloning of artemisinic aldehyde Delta11(13) reductase and its role in glandular trichome‐dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua. J Biol Chem, 283, 21501‐21508.

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT …lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/460/626/RUG01-001460626...vrouwelijke...

Documents

Transcript of UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT …lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/460/626/RUG01-001460626...vrouwelijke...