UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Klinische biologie en Reumatologie

Laboratorium voor niet-infectieuze serologie

Academiejaar 2011-2012

DIAGNOSTISCHE PERFORMANTIE VAN AUTOMATISCHE ANTINUCLEAIRE

ANTISTOF DETECTIE MET BEHULP VAN INDIRECTE

IMMUNOFLUORESCENTIE IN PATIËNTEN MET SYSTEEMSCLEROSE

Hanan KHAJOU

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. dr. Filip De Keyser

Commissarissen

Prof. dr. Apr. Dieter Deforce

Prof. dr. Apr. Jan Van Bocxlaer

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking

tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten

uit deze masterproef.”

24 mei 2012

Promotor Auteur

Prof. dr. Filip De Keyser Hanan Khajou

SAMENVATTING

Volgens de American College of Rhematology is de manuele indirecte

immunofluorescentie test de gouden standaard voor screening naar antinucleaire

antilichamen die belangrijke diagnostische merkers zijn voor systemische auto-

immuunziekten (o.a. systeemsclerose). Door heel wat nadelen verbonden aan deze

test zijn de laatste jaren alternatieven ontwikkeld. Eén hiervan is de geautomatiseerde

indirecte immunofluorescentie test (combinatie van hoge gevoeligheid enerzijds en

automatisatie en standaardisatie anderzijds) (cfr. Inleiding).

Het doel van dit onderzoek was om de diagnostische performantie van de

automatische indirecte immunofluorescentie test te evalueren in patiënten met

systeemsclerose versus controlegroepen (gezonde bloeddonoren en zieke controles).

Bovendien werd de correlatie tussen de klassieke titer en de kwantitatieve waarde

(index) van de automatische fluorescentiemicroscoop onderzocht (cfr. Objectieven).

Hiervoor werd gebruik gemaakt van de Zenit G-sight (automatische digitale

immunofluorescentiemicroscoop), na voorafgaand inzetten van de plaatjes met een

pipetteertoestel. De resultaten (differentiatie positief/negatief en patronen) bekomen

met de automatische microscoop, werden bijgestuurd indien de gebruiker hier niet mee

akkoord was (cfr. Resultaten).

De optimale cut-off waarden (voor maximale sensitiviteit en specificiteit) werden

bepaald a.h.v. een ROC-analyse. De resultaten (titers, patronen, gevoeligheid voor

antistof-subsets en differentiatie positief/negatief) bekomen met behulp van de Zenit G-

sight met en zonder bijsturing van de gebruiker werden vergeleken. Hiernaast werden

de likelihoodratio’s van de titers en de index-intervallen berekend (cfr. Discussie).

Men kon besluiten dat de automatische indirecte immunofluorescentie test (Zenit G-

sight) een goede performantie vertoont voor screening naar antinucleaire antilichamen

in patiënten met systeemsclerose, maar dat actie door een expert noodzakelijk blijft.

Hiernaast is er mogelijkheid om in de toekomst, de index als alternatief te gebruiken

voor de titer aangezien deze significant gecorreleerd zijn (cfr. Besluit).

DANKWOORD

Ten eerste wil ik mijn promotor

Prof. dr. Filip De Keyser bedanken voor de kans die hij mij gaf om mijn masterproef uit

te voeren in het laboratorium voor Klinische biologie, niet-infectieuze serologie in

samenwerking met de dienst Reumatologie. Hierna wil ik dr. Carolien Bonroy superveel

bedanken voor de tijd die ze voor mij maakte voor het opstellen van een planning,

dagelijkse begeleiding, verbeteren van de masterproef en het ter beschikking stellen

van al het materiaal dat ik nodig had voor mijn masterproef. Dankzij Prof. De Keyser en

dr. Bonroy heb ik een interessante studie kunnen opbouwen en veel bijgeleerd. Ik

bedank ook de laboranten Vicky, Virgie en Anette voor de hulp in het labo bij het

uitvoeren van de experimenten (en de aangename werksfeer!) en Heidi voor de

begeleiding tijdens het werken met de nieuwe toestellen. Evy wil ik bedanken voor haar

begeleiding bij het schrijven van de thesis en de leuke momenten. Ik zal ook MLT

student en collega in het labo Hanife nooit vergeten en bedank haar voor de steun

tijdens de moeilijke momenten. Tenslotte wil ik zeker en vast mijn familie vooral mijn

ouders bedanken voor hun steun tijdens mijn masterproef en tijdens mijn

studentenjaren. Ik dank jullie allemaal en zal deze leerrijke ervaring

nooit vergeten !

INHOUDSTABEL

1. INLEIDING……………………………………………………………………………......1

1.1 HET IMMUUNSYSTEEM……………………………………………………………..1

1.2 AUTO-IMMUNITEIT............................................................................................2

1.3 SYSTEEMSCLEROSE........................................................................................3

1.3.1 Epidemiologie.............................................................................................3

1.3.2 Pathogenese……………..............................................................................3

1.3.3 Klinische manifestaties………………………………………………………..4

1.3.4 Classificatie criteria…………………………………………………………….5

1.4 ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN…………………………………………………6

1.4.1 Definitie ANA…………………………………………………………………….6

1.4.2 Diagnostische waarde van ANA……………………………………………...6

1.4.3 Detectie van ANA…………………………………………………………….....7

1.4.3.1 Indirecte immunofluorescentie….................................................................7

1.4.3.2 Enzyme immunoassay………………………………………………………….9

1.4.3.3 Voor- en nadelen van ANA detectie…………………………………………...9

1.4.3.4 Geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie…………......................10

1.4.4 Identificatie van ENA……………………………………………………….....10

1.4.5 Reflextesting……………………………………………………………………12

2. OBJECTIEVEN………………………………………………………………………..13

3. MATERIALEN EN METHODEN………………………………………………….14

3.1 STAALVERZAMELING……………………………………………………………...14

3.2 STAALVOORBEREIDING…………………………………………………………..15

3.2.1 Principe………………………………………………………………………….15

3.2.1.1 Aanmaak van de verdunningsreeksen………………………………….......15

3.2.1.2 Inzetten van de IIF plaatjes……………………………………………..........16

3.2.2 Materialen……………………………………………………………………….16

3.2.3 Methode………………………………………………………………………….17

3.3 GEAUTOMATISEERDE AFLEZING VAN ANA IIF………………………………18

3.3.1 Principe………………………………………………………………………….18

3.3.2 Materialen………………………………………………………………………..20

3.3.3 Methoden………………………………………………………………………..21

3.4 BEPALING VAN SSC-GEASSOCIEERDE ANTISTOFFEN MET BEHULP VAN

EEN LINE IMMUNO ASSAY…………………………...................................................24

3.4.1 Principe………………………………………………………………………….25

3.4.2 Materialen……………………………………………………………………….26

3.4.3 Methode…………………………………………………………………………27

3.4.4 Digitalisatie en interpretatie van de resultaten…………………………..28

3.5 DATA-ANALYSE…………………………………………………………………..28

4. RESULTATEN…………………………………………………………………………..29

4.1 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN

ZENIT G-SIGHT ZONDER BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER………………………..29

4.1.1 Distributiecurve en ROC analyse………………………………………….29

4.1.2 ANA IIF titers zonder bijsturing in elke subset………………………….32

4.1.3 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets zonder

bijsturing……………………………………………………………………………………….32

4.1.4 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight zonder

bijsturing……………………………………………………………………………………….33

4.1.5 Berekening van likelihoodratio’s van de index-intervallen…………...34

4.2 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN

ZENIT G-SIGHT NA BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER…………………………….....35

4.2.1 ANA IIF titers na bijsturing in elke subset……………………………….35

4.2.2 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets na

bijsturing……………………………………………………………………………………….36

4.2.3 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight met

bijsturing……………………………………………………………………………………….36

4.2.4 Berekening van likelihoodratio’s van de titers……………...................37

4.3 VERGELIJKING VAN DE ANA IIF RESULTATEN (POSITIEF/NEGATIEF)

BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT G-SIGHT MET EN ZONDER BIJSTURING VAN

DE GEBRUIKER……………………………………………………………………………….38

4.4 CORRELATIE TUSSEN TITER EN INDEX…………………………………………41

5. DISCUSSIE……………………………………………………………………………….43

6. BESLUIT…………………………………………………………………………………..45

7. LITERATUURLIJST…………………………………………………………………...46

BIJLAGEN

BIJLAGE 1: DISCORDANTIES TUSSEN HET ANA IIF RESULTAAT

(POSITIEF/NEGATIEF) BEKOMEN MET DE ZENIT G-SIGHT ZONDER EN MET

BIJSTURING

BIJLAGE 2: LEZINGEN

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ACR American College of Rheumatology

AIZ Auto-immuunziekte

ALT Alanine aminotransferase

ANA Antinucleaire antilichamen

ANF Antinucleaire factoren

AST Aspartaat aminotransferase

AUC Oppervlakte onder curve

BCR B-cel antigen receptor

CD: Centers for Disease Control

CREST Calcinosis, Raynaud fenomeen, stoornis slokdarmmotiliteit (Oesofagus),

Sclerodactylie en Teleangiëctasieën

CRP C-reactief proteïne

CTD Connective tissue disease

DC Disease controls

DcSSc Diffuse cutaneous systemic sclerosis

DNA Desoxyribonucleïnezuur

EIA Enzyme immunoassay

ENA Extraheerbare nucleaire antigenen

FITC Fluoresceïne isothiocyanaat

HD Healthy donors

HEp Human epithelioma

IIF Indirecte immunofluorescentie

LcSSc Limited cutaneous systemic sclerosis

LED Light-emitting diode

LIA Line immunoassay

LR Likelihoodratio

lSSc Limited Systemic Sclerosis

MHC Major histocompatibility complex

NBT/ BCIP Nitrobluetetrazoliumchloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate

NCCLS National committee for Clinical Laboratory Standards

NK-cellen Natural Killer-cellen

PAH Pulmonaire arteriële hypertensie

PBS Phosphate buffer saline

PI Probabiliteitsindex

RNA Ribonucleïnezuur

ROC-curve Receiver Operating Characteristic-curve

SSc Systeemsclerose

TSH Thyroïd-stimulerend-hormoon

WB Western blot

WHO Wereldgezondheidsorganisatie

1

1. INLEIDING

1.1 HET IMMUUNSYSTEEM

Het immuunsysteem is een heel complex systeem van effectorcellen en moleculen dat

het organisme verdedigt tegen lichaamsvreemde componenten zoals micro-organismen

en afwijkende cellen zoals tumorcellen. Klassiek wordt onderscheid gemaakt tussen het

aangeboren en het adaptieve immuunsysteem.(1, 2)

Het aangeboren immuunsysteem is een snelle maar niet-specifieke bescherming

(m.a.w. onafhankelijk van het antigen) waarbij geen immunologisch geheugen wordt

opgebouwd. In deze eerstelijns verdediging spelen mechanische (bv. huid en mucosa),

biochemische (bv. lage pH in de maag) en microbiologische barrières (bv. normale

commensale flora) een belangrijke rol. In sommige omstandigheden volstaan deze

barrières echter niet en slaagt het micro-organisme er toch in om het lichaam binnen te

dringen en zich te vermenigvuldigen. In dit geval zullen fagocyten (o.a. macrofagen en

neutrofielen), na herkenning via oppervlakte receptoren, optreden om het pathogeen te

vernietigen. Door deze interactie wordt eveneens een inflammatoire respons

geïnitieerd, die op zijn beurt zorgt voor de accumulatie van plasmaproteïnen (o.a.

complement factoren en cytokines) en de rekrutering van neutrofielen en natural killer

(NK)-cellen op de plaats van de infectie.(1, 2)

Naast het aangeboren immuunsysteem bestaat ook het adaptief of verworven

immuunsysteem. Dit systeem is de tweedelijns verdediging en treedt in actie bij falen

van het aangeboren immuunsysteem. Het adaptieve immuunrespons is niet vanaf de

geboorte aanwezig en moet bij elk individu worden opgebouwd door contact met

verschillende antigenen. Hierdoor ontwikkelt er zich eveneens een immunologisch

geheugen dat toelaat om bij blootstelling aan een specifiek antigen snel te anticiperen

door de ontwikkeling van een antigen specifieke respons. De belangrijkste cellen van

het adaptief immuunsysteem zijn de T-cellen en B-cellen. Deze cellen zijn

respectievelijk de belangrijkste componenten van de cellulaire en humorale immuniteit.

Beide systemen lopen echter in elkaar over.(1, 2)

De cellulaire immuniteit is een samenspel van T-cellen en antigen presenterende cellen

zoals B-cellen, macrofagen en dendritische cellen. De T-cel voorlopers ontwikkelen zich

in het beenmerg en migreren naar de thymus. Na een proces van positieve en

negatieve selectie ter hoogte van de thymus herkennen de T-cellen normaal enkel

2

lichaamsvreemde antigenen die gebonden zijn aan de major histocompatibility complex

(MHC)-moleculen.(1, 2)

De humorale immuniteit wordt gemedieerd door de B-cellen die specifieke antilichamen

(immunoglobulines) produceren. De B-cel ontwikkeling vindt plaats in het beenmerg.

Voordat deze cellen het beenmerg verlaten, worden ze getest op autoreactiviteit

(negatieve selectie). De B-cel antigen receptor (BCR), een immunoglobuline gebonden

op het oppervlak van de B-cellen, herkent oplosbare antigenen. Binding van deze

antigenen aan de BCR leidt tot B-cel activatie, proliferatie en finaal differentiatie tot

antistof-secreterende plasmacellen of geheugencellen. De nood aan T-cel hulp voor de

activatie van de B-cellen is afhankelijk van het type antigen (eiwitten of

polysacchariden). De antistoffen hebben verschillende functies zoals neutralisatie (bv.

door binding van toxines op het oppervlak van het pathogeen), opsonisatie voor

fagocytose en activatie van de complementcascade.(1, 2)

1.2 AUTO-IMMUNITEIT

Een heel belangrijke eigenschap van het immuunsysteem is het vermogen om

onderscheid te maken tussen lichaamseigen (self) en lichaamsvreemde (non-self)

elementen. Dit vermogen ontstaat door de aanwezigheid van centrale (o.a. verwijdering

van potentieel autoreactieve lymfocyten door negatieve selectie) en perifere tolerantie.

Een deel van deze autoreactieve lymfocyten ontsnapt echter aan dit eliminatieproces en

kan aanleiding geven tot het ontstaan van auto-immuniteit.(1, 2) Auto-immuniteit

betekent dat er een immuunrespons is tegen lichaamseigen componenten. Doordat

deze auto-antigenen niet volledig kunnen worden verwijderd ontstaat chronische

activatie van het immuunsysteem met eventueel functionele en structurele schade van

lichaamseigen weefsels tot gevolg. In dit geval spreekt men van een auto-immuunziekte

(AIZ).(1, 2)

Ongeveer 5% van de Westerse populatie heeft een AIZ. Vanuit klinisch standpunt

bestaan er twee soorten AIZ, namelijk de orgaanspecifieke en de systemische AIZ. In

het eerste geval wordt slechts één bepaald orgaan aangetast. Een voorbeeld hiervan is

de ziekte van Graves waarbij de schildklier wordt aangetast door de aanwezigheid van

auto-antistoffen tegen het thyroïd-stimulerend-hormoon (TSH) receptor.(1, 2) In het

tweede geval worden meerdere weefsels aangetast. Een voorbeeld hiervan is

systeemsclerose (SSc). Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van

3

Fibrose ter hoogte

van de huid en

organen

Proliferatie van

fibroblasten

Vasculaire schade

Activatie van het

immuunsysteem/

Inflammatie

Genetische

voorbeschiktheid Omgevingsfactoren

auto-antistoffen gericht tegen antigenen die in gans het lichaam voorkomen, namelijk

antinucleaire componenten.(3)

1.3 SYSTEEMSCLEROSE

1.3.1 Epidemiologie

SSc is een zeldzame ziekte. De prevalentie in West-Europa bedraagt ongeveer 150 per

106 inwoners.(4) De ziekte komt 4 tot 7 maal meer voor bij vrouwen dan bij mannen.(5-

8) De incidentie bedraagt ongeveer 1 per 105 en neemt toe met de leeftijd.(9) De

diagnose wordt meestal gesteld rond de leeftijd van 44 à 55 jaar.(10) Bij het zwarte ras

is de incidentie hoger en heeft de ziekte vaak een ernstiger verloop.(5, 11)

1.3.2 Pathogenese

De pathogenese van SSc is zeer complex en nog onvoldoende gekend.(12) Tot op

heden verklaart geen enkele hypothese alle aspecten van de ziekte.(13) In het

algemeen wordt aanvaard dat er een interactie bestaat tussen de belangrijkste

pathofysiologische kenmerken van de ziekte, met name vasculaire schade, overmatige

fibrose ter hoogte van de huid en de organen en chronische activatie van het

immuunsysteem.(12) Verder zouden ook genetische factoren en omgevingsfactoren

een belangrijke rol spelen.(14, 15) Een overzicht van deze interacties wordt

weergegeven in Figuur 1.1.

Figuur 1.1: Interactie tussen de vasculaire, fibrotische, immunologische, genetische en

omgevingsfactoren bij SSc. Opgemaakt op basis van (9)

4

Als onderdeel van de auto-immuunrespons ontstaan bij meer dan 95% van de SSc

patiënten antinucleaire antilichamen (ANA) (cf.1.4.).(2) (16) Verdere identificatie van

deze ANA draagt bij in de diagnose en prognose van de ziekte.(17-19)

De belangrijkste auto-antistoffen specifiek geassocieerd met SSc zijn anti-Scl-70, anti-

centromeer, anti-RNA-polymerase I/III, anti-Th/To, anti-fibrillarine en anti-PM/Scl.(20)

De precieze rol van deze ANA in de pathogenese van SSc is nog niet gekend.(20-22)

1.3.3 Klinische manifestaties

De twee voornaamste pathofysiologische kenmerken van SSc zijn fibrose en

vasculopathie.(23) Fibrose uit zich voornamelijk in xerose en verdikking van de huid

(sclerodermie) (cfr. Figuur 1.2.).(24) Het tweede kenmerk van SSc is vasculopathie

(aantasting van de bloedvaten) en komt vooral tot uiting in de aanwezigheid van het

Raynaud fenomeen (cfr. Figuur 1.2.). Raynaud is vaak het eerste symptoom van SSc

en komt voor bij de meeste SSc patiënten. Hierbij worden de vingers of tenen wit en

koud door vasoconstrictie van de arteriolen.(25) Andere symptomen ter hoogte van de

huid bij SSc zijn onder andere teleangiëctasieën en verzweringen ter hoogte van de

vingers.(26) Op microvasculair niveau is de schade waarneembaar met behulp van een

capillaire microscoop. Naast het diagnostische belang heeft dit onderzoek, dat wordt

uitgevoerd door de reumatoloog, vermoedelijk ook een prognostische waarde.(27)

Figuur 1.2: Sclerodermie (links). (cfr. http://www.dermis.net/dermisroot/en/39210/image.htm)

en het Raynaud fenomeen (rechts).(cfr. http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm)

Naast aantasting van de huid komt fibrose en vasculopathie ook voor ter hoogte van de

interne organen.(3) Dit uit zich onder andere in maag-darmstoornissen (vertraagde

maaglediging, slikstoornissen, constipatie, malabsorptie,…), longaandoeningen

(interstitieel longlijden en pulmonaire arteriële hypertensie (PAH)), nierfalen (gepaard

gaande met een verhoogde bloeddruk), myocard fibrose leidend tot hartfalen en

hartritmestoornissen en aantasting van het musculoskeletaal systeem (gewrichtspijnen,

http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm

5

immobiliteit en krampen).(3) De belangrijkste orgaancomplicaties geassocieerd met een

slechte prognose en hoge mortaliteit zijn longaantasting (PAH en interstitieel longlijden,

respectievelijk het gevolg van vasculopathie en fibrose) en niercrisissen.(10)

De klinische manifestaties en het ziekteverloop bij SSc patiënten is dus heel

variabel.(12) Globaal kunnen we stellen dat de ernst van de huid- en orgaan aantasting

het klinisch verloop en de prognose bepalen.(3)

1.3.4 Classificatie criteria

Gezien het variabel ziektebeeld en ziekteverloop van SSc zijn classificatie criteria

belangrijk met het oog op vergelijkbaarheid van studies.(12) In 1980 stelde het

American College of Rheumatology (ACR) de eerste classificatie criteria voor.(28) Deze

criteria waren vooral specifiek maar niet zeer gevoelig, waardoor patiënten met een

gelimiteerde huidaantasting soms werden gemist.(29) Vervolgens werden de patiënten

opgedeeld op basis van de uitgebreidheid van de huidaantasting in patiënten met een

gelimiteerde huidaantasting (LcSSc) en patiënten met een uitgebreide, diffuse

huidaantasting (DcSSc) (cfr. Figuur 1.3.).(30)

A B

Figuur 1.3: A) LcSSc versus B) DcSSc waarbij voor elke subset de potentieel aangetaste

cutane zones rood gemarkeerd zijn.(31)

Meer recent werden nieuwe classificatie criteria voorgesteld door Leroy en

Medsger.(25) Zij onderscheiden, naast de klassieke subsets LcSSc en DcSSc, een

derde subset van patiënten zonder huidaantasting (ook wel gelimiteerde of vroege SSc

genoemd) maar met een verhoogd risico op evolutie naar SSc. Centraal in deze nieuwe

criteria staat de aanwezigheid van het Raynaud fenomeen. Daarnaast is de

6

aanwezigheid van ofwel een afwijkend capillaroscopisch beeld of de aanwezigheid van

SSc specifieke antistoffen (anti-Scl-70, anti-centromeer, anti-RNA-polymerase I/III, anti-

Th/To, anti-fibrillarine antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen) vereist. Indien

patiënten zowel een afwijkende capillaroscopische beeldvorming als een SSc specifieke

ANA hebben, is de kans 60 maal groter op het ontwikkelen van systeemsclerose in

vergelijking met patiënten die niet voldoen aan deze criteria.(32)

1.4 ANTINUCLEAIRE ANTILICHAMEN

1.4.1 Definitie ANA

ANA staat voor antinucleaire antilichamen, ook antinucleaire factoren (ANF) genoemd.

Dit zijn antilichamen gericht tegen auto-antigenen in de celkern zoals

desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA), eiwitten of celkernextract.(33)

1.4.2 Diagnostische waarde van ANA

ANA zijn aanwezig in 95 % van de patiënten met SSc maar komen ook voor bij andere

CTD (bv. systeemlupus, Sjögren syndroom, polymyositis/dermatomyositis),

orgaanspecifieke AIZ, bacteriële en virale infecties en maligniteiten.(34-36)

Ook medicatie kan de vorming van ANA opwekken (bv. procaïnamide en

hydralazine).(37) Bovendien neemt de aanwezigheid van ANA toe met de leeftijd.(38)

Kortom, ANA is een gevoelige maar weinig specifieke merker in de diagnose van

systeemsclerose. Dit impliceert dat indien er een negatieve ANA gevonden wordt bij

een patiënt waarbij men klinisch SSc vermoedt (bv. omwille van de aanwezigheid van

fibrotische letsels), de ziekte nagenoeg kan uitgesloten worden. Positiviteit voor ANA is

daarentegen onvoldoende om de ziekte te bevestigen. Gezien de lage specificiteit is

verdere identificatie van de ANA vereist (cfr. 1.4.5.). Een overzicht van de specificiteit

en sensitiviteit van ANA in het kader van de verschillende CTD wordt weergegeven in

Tabel 1.1.

7

Tabel 1.1: Sensitiviteit en specificiteit van ANA

voor de voornaamste reumatische aandoeningen.

Specificiteit t.o.v. controlepopulatie (%)

Reumatische

aandoeningen

Aantal

studies

Sensitiviteit

(%)

Andere

eCTD

Niet reumatische

eCTD

Gezonde

controles

Totaal

SLEa 21 93 75 78 78 57

SScb 30 85 75 71 71 54

PM/DMc 14 61 91 82 82 63

SSd 16 48 91 71 71 52

RAe 14 41 85 82 82 56

aSLE: systemische lupus erythematosus,

bSSc: systeemsclerose,

cPM/DM: polymyositis/

dermatomyosistis, dRA: reumatoïde artritis,

eCTD: connective tissue disease. Tabel overgenomen uit (39).

Naast de lage specificiteit beperkt eveneens de lage prevalentie van SSc het

diagnostisch nut van ANA in de diagnose van deze ziekte. De diagnostische waarde

kan verhoogd worden door pas te gaan testen indien er een klinisch vermoeden is van

SSc (hoge pre-test probabiliteit).

1.4.3 Detectie van ANA

1.4.3.1 Indirecte immunofluorescentie

Klassiek wordt de indirecte immunofluorescentie (IIF) test gebruikt voor detectie van

ANA. Volgens ACR advies blijft ook vandaag IIF de aangewezen techniek voor ANA

screening. (cfr. http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf)

Het principe van deze test wordt afgebeeld in Figuur 1.4. HEp2(000) cellen gefixeerd op

draagglaasjes worden geïncubeerd met patiënt serum. Indien er ANA aanwezig zijn

wordt er een stabiel antigen-antilichaam complex gevormd. Aankleuring van dit complex

gebeurt met een secundair anti-humaan IgG antilichaam gebonden aan een

fluorochroom (bv. FITC), waardoor detectie onder een fluorescentiemicroscoop mogelijk

wordt.(40) Zowel het patroon (het microscopisch beeld van de HEp2(000) cellen) als de

intensiteit van de ANA fluorescentie worden beoordeeld.(39)

http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf

8

Figuur 1.4: Het principe van de indirecte immunofluorescentie.

Het te testen serum voor ANA IIF analyse wordt vooraf verdund. De aanbevolen

startdilutie (ook wel de screeningstiter genoemd) varieert van 1:40 tot 1:160.

Verschillende richtlijnen, o.a. the National committee for Clinical Laboratory Standards

(NCCLS), Centers for Disease Control (CDC), de Wereldgezondheidsorganisatie

(WHO) geven ieder hun aanbevelingen over de meest nuttige screeningstiter.(41) Bij

het detecteren van een positief staal kunnen dan verdunningsreeksen gemaakt worden

om de eindtiter te bepalen. De eindtiter is de hoogste verdunning van het serum dat nog

een positieve fluorescentie met een duidelijk patroon geeft en is recht evenredig met de

antilichaamconcentratie. Een alternatief is het visueel scoren van de ANA fluorescentie-

intensiteit (negatief of een score van 1+ t.e.m. 5+). (42)

In talloze naslagwerken zijn er meer dan 40 ANA IIF patronen beschreven, maar niet

alle patronen zijn even klinisch relevant.(33) Daarnaast komen, in geval van

aanwezigheid van verschillende auto-antilichamen in het serum, ook gecombineerde

patronen voor. Er is geen eenduidig verband tussen patroon en auto-antistof, noch

tussen patroon en ziekte.(33, 43) ANA patronen zijn dus noch specifiek, noch

diagnostisch. Een uitzondering hierop is het centromeer patroon dat sterk suggestief is

voor de aanwezigheid van anti-centromeer-B antistoffen.(39, 44) Op HEp-2(000) cellen

worden klassiek vier hoofpatronen onderscheiden: het homogeen, gespikkeld,

nucleolair en centromeer patroon. Figuur 1.5. geeft foto’s weer van deze

fluorescentiepatronen.

Fluorochroom (FITC)

Secundair antilichaam

Primair antilichaam

Antigen

9

Figuur 1.5: De vier voornaamste patronen (homogeen, gespikkeld, nucleolair en

centromeer) met telkens een cel in rust en een cel in deling (mitosefase) omcirkeld.

1.4.3.2 Enzyme Immunoassay

Alternatief kan een enzyme immunoassay (EIA) gebruikt worden voor de ANA

analyse.(45, 46) Hierbij worden nucleaire antigenen, gebonden op een vaste drager,

geïncubeerd met patiëntenserum. Indien er ANA in het serum van de patiënt aanwezig

zijn, binden ze met hun specifieke antigenen. Aankleuring van deze antigen-antilichaam

complexen gebeurt met een secundair enzym-gebonden anti-humaan IgG antilichaam.

Visualisatie gebeurt door toevoeging van een chromogeen substraat dat door het

enzym wordt omgezet in een gekleurd product. De kleurintensiteit is recht evenredig

met de ANA concentratie. In het routine laboratorium gebeuren EIA meestal op

geautomatiseerde systemen die de hoeveelheid kleurreactie spectrofotometrisch meten

en vergelijken met die van standaarden met gekende concentraties aan de hand van

een kalibratiecurve.(47)

De nucleaire antigenen aanwezig in commerciële EIA voor ANA analyse zijn vaak van

verschillende samenstelling. Hierdoor hebben deze EIA een verschillende sensitiviteit.

In sommige kits is volledig HEp-2 kernextract aangebracht op de drager, in andere kits

is een selectie van gezuiverde of recombinante antigenen aanwezig (meestal een

combinatie van SSA/Ro, SSB/La, Sm, U1-RNP, Jo-1 en Scl-70).(39, 48, 49)

1.4.3.3 Voor- en nadelen van ANA detectie

De manuele IIF heeft vele nadelen, o.a. inter- en intra-laboratorium variabiliteit.

Vandaar zijn er enkele alternatieven ontwikkeld.(50) Het eerste alternatief is de EIA.

Volgens de ACR blijft de IIF echter de aangewezen techniek voor ANA detectie. Dit

HO

MO

GE

EN

CE

NT

RO

ME

ER

GE

SP

IKK

EL

DN

UC

LE

OL

AIR

Positief

Egale kern

Negatief

Granulair

Nucleoli

zichtbaar

Positief of

negatief’46’ puntjes

GespikkeldH

OM

OG

EE

NC

EN

TR

OM

EE

R

GE

SP

IKK

EL

DN

UC

LE

OL

AIR

Positief

Egale kern

Negatief

Granulair

Nucleoli

zichtbaar

Positief of

negatief’46’ puntjes

Gespikkeld

10

voornamelijk o.w.v. de hogere sensitiviteit van IIF in vergelijking met de EIA waarbij

slechts een beperkt aantal antigenen getest worden. Dit kan verbeterd worden door

toevoeging van nieuwe gezuiverde of recombinante antigenen. Daarentegen detecteert

EIA wel anti-ENA antilichamen (o.a. anti-SSA en anti-Jo1) die vaak gemist worden bij

IIF.(43) Een globaal overzicht van de voor- en nadelen van IIF en EIA is terug te vinden

in Tabel 1.2.

Tabel 1.2: Voor- en nadelen van IIF versus EIA. (42, 44)

IIF EIA

Prijs Goedkope reagentia Dure reagentia

Werkbelasting Arbeidsintensief en tijdrovend

Automatisatie mogelijk

Informatie over patroon Ja Neen

Sensitiviteit Hoog Afhankelijk van de uitgebreidheid in geïncludeerde antigenen als

substraat. (Maar theoretisch steeds minder dan IIF).

Specificiteit Laag Hoog

Reproduceerbaarheid Moeilijk te standaardiseren + subjectiviteit van de

analist

Hoog door automatisatie

1.4.3.4 Geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie

Een recente evolutie in ANA detectie is het beschikbaar worden van commerciële

systemen die een geautomatiseerde IIF aflezing toelaten. Dergelijk systeem combineert

de voordelen van IIF (hoge gevoeligheid) en EIA (automatisatie en standaardisatie) met

als gevolg minder werkbelasting en een lagere inter- en intra-laboratorium

variabiliteit.(50, 51) Deze geautomatiseerde IIF systemen differentiëren hoofdzakelijk

tussen positief versus negatief voor ANA. Sommige systemen laten zelfs een objectieve

patroonherkenning toe.(51) Daarnaast wordt er vaak een kwantitatieve waarde per staal

toegekend. De bruikbaarheid van deze waarde als alternatief voor de ANA titer is tot op

heden nog niet gedocumenteerd en vermoedelijk systeemafhankelijk.

1.4.4 Identificatie van ENA

Aangezien IIF weinig specifiek is voor ENA (extraheerbare nucleaire antigenen)

detectie, zijn er meer specifieke testen nodig (cfr. 1.4.5.). ENA zijn oplosbare

nucleoplasmatische eiwitten die in het verleden vanuit de kern geëxtraheerd werden

met zout. Volgens de richtlijnen moeten volgende anti-ENA antilichamen routinematig

11

opgespoord worden: antilichamen tegen Jo-1, histonen, ribosomaal P, Scl-70, SSA/Ro,

SSB/La, Sm en RNP.(39) Een veel gebruikte techniek voor de uitwerking van anti-ENA

antilichamen is de line immunoassay (LIA).

In Tabel 1.3. worden auto-antilichamen besproken die klinisch relevant zijn voor SSc.

Antilichamen gericht tegen centromeer, topoisomerase I (synoniem Scl-70), Th/To en

RNA-polymerase III komen nagenoeg uitsluitend voor bij SSc patiënten. Deze vier

antilichamen vertegenwoordigen 75 à 80% van de ANA in SSc. Anti-PM/Scl en anti-

fibrillarine zijn geassocieerd met SSc maar in overlap met andere CTD.(52) Deze SSc

specifieke/geassociëerde antistoffen komen in theorie mutueel exclusief voor.(3) Er zijn

associaties gelegd tussen het voorkomen van deze antistoffen en de subclassificatie op

basis van de uitgebreidheid van huidaantasting.(16) Verder hebben deze specifieke

antistoffen ook een diagnostisch belang (cfr. 1.3.4). Bijgevolg is het zinvol om deze

antistoffen verder te identificeren.

Tabel 1.3: Prevalentie van SSc-geassocieerde antistoffen, functie van hun antigenen en

de belangrijkste identificatiemethoden. Tabel opgemaakt op basis van volgende

referenties (20, 21, 53, 54).

Antistof Prevalentie

in fSSC

Functie van het antigen Identificatie

Anti-topoisomerase I

(Scl-70)

9-39% ontvouwen van DNA aLIA, bWB of cproteïne

radio-IP

Anti-centromeer 16-39% scheiden van

chromosomen bij celdeling

dIIF, bWB of aLIA

Anti-RNA-polymerase I/III 4-25% RNA synthese cproteïne radio-IP

Anti-fibrillarine ( U3RNP) 1-6% bewerken van pre-

ribosomaal RNA

bWB of

cproteïne radio-IP

Anti-Th/To 1-7% bewerken van transfer

RNA en ribosomaal RNA

eRNA IP

Anti-PM/Scl 0-6% RNA bewerken bWB of

c proteïne radio- IP

aLIA: line immunoassay;

bWB:

western blotting,

cproteïne radio-IP: proteïne radio-immunoprecipitatie,

dIIF:

indirecte immunofluorescentie, eRNA IP: RNA immunoprecipitatie,

fSSc: systeemsclerose.

12

1.4.5 Reflextesting

Zoals reeds vermeld is de ANA IIF een screeningstest met hoge sensitiviteit maar lage

specificiteit. Verdere identificatie van de ANA met meer specifieke testen is belangrijk

om de diagnostische waarde te verhogen. Deze testen worden vaak pas in tweede lijn

uitgevoerd bij een positieve ANA IIF. Deze ‘getrapte’ analyse wordt cascade-testing of

reflextesting genoemd.(55, 56) In het klinisch laboratorium UZ Gent wordt momenteel

een driestapscascade uitgevoerd waarbij tussen IIF en LIA een geautomatiseerde EIA

met een mengsel van antigenen is geplaatst (cfr. Figuur 1.6.)

Figuur 1.6: De driestapscascade met twee sceeningsstappen (IIF en EIA), gevolgd door

een identificatiestap van anti-ENA antilichamen.

ANA screening met IIF

ANA screening met EIA

Anti-ENA identificatie met LIA

(anti-CENP-B, anti-Jo1,

anti-histonen, anti-ribosomaal P,

anti-topoisomerase I, anti-SSA,

anti-SSB, anti-Sm, anti-PM/Scl, anti-

RNA-polymerase III en anti-U1RNP)

13

2. OBJECTIEVEN

Detectie van ANA is belangrijk in de diagnostiek van CTD. Volgens ACR is de manuele

IIF de gouden standaard voor screening naar ANA. Er zijn echter heel wat nadelen

verbonden aan de manuele IIF test (cfr.1.4.3.3.). Hierdoor zijn de laatste jaren een

aantal alternatieven gecommercialiseerd. Een eerste alternatief is een ANA

screeningstest op basis van EIA met een beperkt aantal recombinante antigenen. Dit

impliceert dat niet alle antistoffen geassociëerd met SSc kunnen worden opgepikt. Een

tweede alternatief is de geautomatiseerde ANA IIF analyse. Hierbij wordt de brede

screening (hoge sensitiviteit voor de SSc geassociëerde antistoffen) gecombineerd met

het aspect van automatisatie en standaardisatie (gezien een visuele waarneming wordt

omgezet in een gestandaardiseerde kwantitatieve waarde) (cfr.1.4.3.4.).

De algemene doelstelling van deze thesis is de diagnostische performantie van de

automatische ANA IIF evalueren in SSc patiënten. Hiervoor zal een geautomatiseerde

ANA IIF met behulp van de Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België)

worden uitgevoerd op drie cohorten (systeemsclerose patiënten (SSc), healthy donors

(HD) en disease controls (DC)). Dit systeem geeft in eerste lijn een interpretatie op

basis van een kwantitatieve waarde (probabiliteitsindex) die in tweede lijn kan worden

bijgestuurd door de gebruiker op basis van de digitale beelden. Om die reden zal de

diagnostische waarde voor beide strategieën worden geëvalueerd (cfr. 4.1. en 4.2.) en

vergeleken (cfr. 4.3). Bovendien zal onderzocht worden of er een correlatie bestaat

tussen de klassieke ANA IIF titer en de kwantitatieve waarde bekomen m.b.v. de

geautomatiseerde analyse (cfr. 4.4.).

In de eerste fase zal een ROC analyse worden gebruikt om de optimale afkapwaarden

op de probabiliteitsindex te evalueren (cfr. 4.1.1.). Deze in huis cut-off’s zullen dan

worden gebruikt ter berekening van de performantie-karakteristieken (sensitiviteit en

specificiteit (cfr. 4.1.1.), likehoodratio’s (cfr. 4.1.5. en 4.2.4.)). Ook de verdeling van de

titers en de patronen bekomen met en zonder bijsturing zullen in kaart worden gebracht

(cfr. 4.1.2., 4.1.4. en 4.2.1, 4.2.3.). Voor de SSc populatie zal ook onderscheid worden

gemaakt tussen de antistof subsets (cfr. 4.1.3. en 4.2.2.) en zal gekeken worden naar

de gevoeligheid en juistheid voor het oppikken van het centromeer patroon (cfr. 4.2.3.).

14

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1 STAALVERZAMELING

De geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie test werd uitgevoerd op drie

cohorten (SSc, HD en DC). De analyse gebeurde voor alle patiënten op serum,

gescheiden van de bloedcellen door middel van centrifugatie (bij 1880g gedurende 10

min). Het staal werd eerst op kamertemperatuur gebracht alvorens de analyse uit te

voeren. Serum werd bewaard bij 2-8°C (>7 dagen) of -20°C (langdurige bewaring).

De eerste cohorte bestaat uit 141 patiënten met systeemsclerose (SSc), afkomstig van

de UGent Scleroderma unit (dienst reumatologie UZ Gent). Deze SSc patiënten werden

volgens een bepaald algoritme opgevolgd om de kennis omtrent deze zeldzame ziekte

uit te breiden. Alle patiënten voldeden aan de Leroy en Medsger criteria.(25) Het serum

dat in deze studie werd gebruikt, is afkomstig van de bloedafname bij diagnose. De

leeftijd varieert van 20 tot 82 jaar met het hoogste percentage (6.40%) bij 46 jaar, M:V

ratio bedraagt ongeveer 1/3 (76.6% vrouwen en 23.4% mannen).

De tweede cohorte bevat 78 disease controls (DC), dit zijn patiënten met een andere

ziekte dan de bestudeerde ziekte (SSc) en zonder geassocieerde ANA (polymyalgia

rheumatica, osteoarthritis, ANCA geassociëerde vasculitis, spondyloarthritis). De

verdeling en classificatie van de disease controls wordt weergegeven in Tabel 3.1. De

M:V ratio bedraagt ongeveer 1/1.3 (56.4% vrouwen en 43.6% mannen).

Tabel 3.1: Verdeling en classificatie van de disease controls.

Disease controls Aantal (n) Percentage (%)

PMRa 13 16.7

OAb 22 28.2

AAVc 5 6.4

SpAd 38 48.7

Totaal 78 100

aPMR: Polymyalgia rheumatica,

b OA: Osteoarthritis,

c AAV:

ANCA geassociëerde vasculitis, dSpA: Spondyloarthritis.

De laatste cohorte bestaat uit 100 gezonde bloeddonoren (HD) afkomstig van het Rode

kruis Vlaanderen (patiënten zonder een auto-immuunziekte). Op al deze stalen werd

aspartaat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) en C-reactief

15

proteïne (CRP) bepaald en een waarde binnen de referentiewaarden gevonden. Hoge

serumlevels van AST/ALT en CRP in het bloed wijzen respectievelijk op leverschade en

inflammatie of weefseldestructie. Deze testen werden uitgevoerd ter confirmatie dat

deze donoren inderdaad gezond waren (analyse gebeurde op de Cobas 6000, Roche

diagnostics, Brussels, Belgium - dit toestel werd verder niet besproken aangezien dit

toestel geen deel uitmaakt van de studie).

3.2 STAALVOORBEREIDING

3.2.1 Principe

De staalvoorbereiding bestaat uit twee stappen: ten eerste de aanmaak van

verdunningsreeksen van de sera in een microtiterplaat, vervolgens pipettering van deze

verdunningen op de IIF plaatjes. Beide stappen werden uitgevoerd m.b.v. een

automatische pipetteerautomaat (PhD toestel) (cfr. Figuur 3.1).

Figuur 3.1: Het PhD toestel is een automatische pipetteerautomaat

gestuurd door een computer. (cfr. http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product.htm)

Het PhD toestel heeft 2 naalden. De afzuignaald zuigt gedurende verschillende

wasstappen de overtollige vloeistof weg naar de afvalfles m.b.v. de peristaltische pomp,

terwijl de kortere naald exacte volumina opzuigt en pipetteert m.b.v. een volumetrische

pomp.(57)

3.2.1.1 Aanmaak van de verdunningsreeksen

Voor elk patiëntenstaal werd een verdunningsreeks gemaakt van 1:40 tot 1:2560. De

DC en HD werden eerst in een dilutiereeks van 1:40 en 1:80 ingezet en pas verder

uitgetitreerd indien ze nog positief waren bij deze verdunningen. Tabel 3.2. toont een

overzicht van hoe de verdunningen gemaakt werden door het PhD toestel.

http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product.htm

16

Tabel 3.2: Verdunningen PhD toestel.(57)

Verdunning Aantal µl staal Aantal µl PBS

1:40 5 195

1:80 3 237

1:160 2 318

1:320 20 µl uit 1:40 140

1:640 10 µl uit 1:40 150

1:280 6 µl uit 1:40 186

1:2560 3 µl uit 1:40 189

3.2.1.2 Inzetten van de IIF plaatjes

Het inzetten van de IIF plaatjes bestaat uit verschillende stappen (cfr. Inleiding 1.4.3.1):

Aanbrengen van het staal op het draagglaasje waarop substraat gefixeerd

is (=ANA plaatje).

Een eerste incubatie van 30 minuten.

Wassen met PBS-buffer om de niet gebonden antilichamen van het ANA-

plaatje te verwijderen.

Aanbrengen van het conjugaat (anti-humaan IgG gebonden aan FITC) op

het ANA-plaatje.

Een tweede incubatie van 30 minuten.

Wassen met PBS-buffer om de niet gebonden antilichamen van het ANA-

plaatje te verwijderen.

Tegenkleuring met Evans Blue.

Monteren van het ANA-plaatje.

Als substraat werd gebruik gemaakt van HEp-2000 cellen, dit staat voor Human

Epithelia cellen type 2000, afkomstig van een larynxcarcinoma cellijn. Deze cellen zijn

HEp2-cellen getransvecteerd met humaan cDNA dat codeert voor SSA/Ro60 waardoor

10 tot 15% van deze cellen een overproductie van dit antigen vertonen. Hierdoor

verhoogt de sensitiviteit voor antistoffen gericht tegen dit antigen.(58)

3.2.2 Materialen

Toestellen

17

Pipetteerautomaat (PhD, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)

Reagentia:

PBS buffer poeder (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)

Gedestilleerd water (Laboratoire Aguetant, Lyon, France)

Monteervloeistof (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)

Evans Blue (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA)

HEp-2000 ANA-Ro kit (Immunoconcepts, Sacramento, CA, USA) bevat:

- HEp-2000 plaatjes (14 wellen per plaat)

- Geit anti-humaan IgG gemerkt met FITC (conjugaat)

3.2.3 Methode

1. Haal de stalen, plaatjes en reagentia (conjugaat, Evans Blue, monteervloeistof)

uit de koelkast en laat 10-15 minuten op kamertemperatuur staan.

2. Maak PBS buffer aan als volgt: los een zakje PBS poeder op in 1 liter

gedestilleerd water (1 maand houdbaar in de koelkast bij 2-8°C).

3. Maak Evans blue aan als volgt: voeg aan 30 ml PBS buffer 10 µl 0.5% Evans

Blue toe in een reagensflesje en zwenk goed om.

4. Zet de computer en het PhD toestel aan (cfr. Figuur 3.1.).

5. Lijn de naalden van het toestel uit. (cfr. Figuur 3.2. voor de correcte posities).

Figuur 3.2: Juiste positie van de naalden.(57)

6. Spoel het toestel met gedestilleerd water en vervolgens met PBS buffer

7. Plaats de reagentia en stalen op het toestel (cfr. Figuur 3.3. voor een plattegrond

van de posities).

8. Start de run op de PhD. De PhD voert de stappen beschreven onder 3.2.1.2.

geautomatiseerd uit.

18

9. Breng, nadat de run is afgelopen, in een aantal welletjes een druppel mounting

medium aan en dek de plaatjes af met een dekglaasje (vermijd luchtbellen en

beweging van het dekglaasje). De immuonfluorescentieplaatjes kunnen nu op de

geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop geladen worden. Gemonteerde

plaatjes kunnen 2 dagen in het donker in de koelkast bewaard worden.

Opmerking:

Een positieve (bv. een gekend, gespikkeld 4+/5+ serum) en een negatieve controle

(pool van negatieve stalen) wordt meegenomen in elke run. Hiermee wordt

gecontroleerd of het proces goed verlopen is (technische validatie). Indien de resultaten

van de controles niet overeenkomen met de vooropgestelde waarden wordt de

aanmaak van de plaatjes herhaald.

Figuur 3.3: Het PC-scherm geeft een plattegrond van de staalposities, de

immunofluorescentieplaatjes en de reagentia op het PhD toestel.

3.3 GEAUTOMATISEERDE AFLEZING VAN ANA IIF

3.3.1 Principe

De aflezing van de ANA-plaatjes gebeurt met behulp van fluorometrie. Dit meetprincipe

betekent dat wanneer er elektromagnetische straling met een bepaalde golflengte

geabsorbeerd wordt, de moleculen in een geëxciteerde, hogere energietoestand

worden gebracht (excitatie). Hierna vallen de moleculen terug naar een grondtoestand

met lagere energie door het uitzenden van een foton (licht) met een lagere energie

(langere golflengte) in vergelijking met de geabsorbeerde energie

IIF plaatjes stalen

Controles en

reagentia Verdunningen

(microtiterplaat)

19

(emissie/fluorescentie) (cfr. Figuur 3.4.).(47) Het absorptiespectrum van de meeste

fluorescente verbindingen is 300 tot 550 nm.(47)

Figuur 3.4: Het ontstaan van fluorescentie.

(cfr. http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/a250/public_html/theorie.shtml)

Het principe van de fluorescentiemicroscoop is als volgt: invallend licht afkomstig van

een lichtbron (kwiklamp of light emitting diode-lamp (LED-lamp)), gaat door de excitatie-

monochromator (dit is een filter die enkel straling doorlaat met een specifieke golflengte,

nodig om het fluorochroom te exciteren). Licht met de geselecteerde golflengte wordt

door een dichromatische spiegel (‘beam splitter’) weerkaatst en via het objectief op het

preparaat gericht dat het licht absorbeert. Het uitgestraalde licht met een bepaalde

golflengte gaat via hetzelfde objectief door een dichromatische spiegel (die het

fluorescerende emissie-licht doorlaat i.t.t. tot het excitatie-licht). Het fluorescerende

emissie-licht gaat naar een emissie-monochromator (dit is een filter die enkel straling

doorlaat met een specifieke golflengte, nodig voor detectie), die vervolgens doorheen

het oculair wordt bekeken. (cfr. http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm)

Bij een automatische fluorescentiemicroscoop wordt een digitale kleurencamera

gebruikt in plaats van een oculair. De digitale kleurencamera neemt foto’s van de

wellen, die dan op een PC-scherm worden getoond. Het principe van een

fluorescentiemicroscoop wordt in Figuur 3.5. weergegeven.

http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm

20

Figuur 3.5: Principe van een fluorescentiemicroscoop.

(cfr. http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html)

De werkstroom en automatische interpretatie van een digitale fluorescentiemicroscoop

wordt weergegeven in Figuur 3.6. De automatische fluorescentiemicroscoop doet

achtereenvolgens een focussering, differentiatie positief/negatief en een

patroonherkenning van de positieve wellen.

Figuur 3.6: Werkstroom van een digitale fluorescentiemicroscoop.

3.3.2 Materialen

Toestellen:

Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem, België):

Hardware: (cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-

features-and-specifications.htm)

- Software van de computer (Windows XP SP3 Professional, harde schijf:

4x500GB, Processor: Xeon quadcore, 4GB RAM)

- Lichtbron: LED (2W Power) met B2A filter (Ex: 450-490nm, DM: 505 nm)

- Digitale kleurencamera (QiCam QImaging 12bit x pixel, 1392x1040 pixels,

1/2" optical format)

- Gemotoriseerd revolver met objectief lenzen 4x en 40x

- Monitor (LCD Eizo 24’’ – 16/9, Scherm Resolutie, 1920x1200 pixels)

- Gemotoriseerd platform voor maximaal 5 plaatjes

Focussering Differentiatie pos/neg Scanning Patroon

http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-and-specifications

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-and-specifications

21

3.3.3 Methode

De Zenit G-sight is een automatische fluorescentiemicroscoop ontwikkeld door de

Italiaanse firma HESP en in België verdeeld door A. Menarini Diagnostics. Vanaf maart

2012 beschikbaar in het laboratorium klinische biologie van het UZ Gent (cfr. Figuur

3.7.). De Zenit G-sight maakt gebruik van een LED lamp als lichtbron. Het gebruik van

een LED-lamp zorgt voor minder snelle fotobleaching (zwakkere excitatie en emissie).

Bovendien hebben deze lampen een langere levensduur en verbruiken ze minder

energie in vergelijking met kwiklampen die vroeger gebruikt werden in de conventionele

manuele fluorescentiemicroscoop.

(cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-

Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm)

De Zenit G-sight maakt volautomatisch digitale beelden van de IIF-plaatjes, die

vervolgens met een hoge resolutie op het verbonden computerscherm kunnen bekeken

worden.

Figuur 3.7: Zenit G-sight met gekoppelde computer.

(cfr. http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm)

Voor het inscannen van de plaatjes heeft men de keuze tussen drie instellingen: een

small, medium of een full scan. Tabel 3.3. geeft de verschillen tussen de drie scan

opties weer. In het UZ Gent is geopteerd om te werken met de instelling ‘medium scan’

gezien dit een compromis is tussen de snelheid en het aantal foto’s.

22

Tabel 3.3: Vergelijking van de verschillende scanmodi

Scanmodus Aantal

focuspunten

Aantal

foto’s

Tijdsduur (min)

Small scan 5 6 2

Medium scan 5 50 3

Full Scan 13 220 6

Eerst zoekt de microscoop met het 4x objectief het meest optimale beeld (ruwe

focussering) ter hoogte van de gekleurde coating van het plaatje. Eens het optimale

beeld is vastgesteld, gebruikt de Zenit G-sight het 40x objectief voor de fijne focussering

in de well zelf. De microscoop focust, naargelang de gekozen scanmodus, op 5 of 13

verschillende plaatsen in 1 well (cfr. Figuur 3.8.). Bij de medium scan, gaat de

microscoop focussen op 5 punten, het gemiddelde van de focusafstand maken en deze

afstand gebruiken voor het inscannen van het plaatje (1/4 van de well). Bij de full scan,

gebeurt dit op basis van 13 punten en wordt de volledige well gescand.

Figuur 3.8: Well met 13 focuspunten (links –full scan)

of 5 focuspunten (rechts – medium scan/small scan).

Gedurende de focussering maakt de microscoop onderscheid tussen een positief en

een negatief beeld op basis van een cut-off waarde voor de probabiliteitsindex (PI) (cfr.

Tabel 3.4). Deze index wordt per well afgeleid uit de tijd nodig voor het vinden van een

scherp beeld en is omgekeerd evenredig met de fluorescentie-intensiteit.

(cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-features-

of-Zenit-G-Sight.htm)

23

Tabel 3.4: De verschillende probabiliteitsindexen met hun respectievelijke kwalitatieve

beoordeling.

Probabiliteitsindex Interpretatie

<8 Negatief

8-50 Onzeker negatief (negative uncertain)

> 50 Positief

NB.: De cut-off’s van 8 en 50 werden door de firma gekozen om respectievelijk een zo hoog mogelijke sensitiviteit en specificiteit te

behalen.

Vervolgens zal de Zenit G-sight verschillende naast elkaar liggende foto’s nemen met

de digitale kleurencamera (cfr. Tabel 3.3.) die finaal als één beeld voor de gebruiker

worden weergegeven op het computerscherm.

Indien het beeld door de Zenit G-sight als positief wordt beoordeeld, wordt een

patroonherkenning uitgevoerd. Het systeem is getraind om 5 patronen te herkennen,

namelijk homogeen, gespikkeld, centromeer, nucleolair en mitochondriaal. Deze

patroonherkenning is gebaseerd op een combinatie van statistische, geometrische en

morfologische kernmerken (> 100 distinctieve kenmerken voor patroonherkenning). (cfr.

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-

autoimmune-disorder-diagnostics.htm) Verdere details m.b.t. het theoretisch algoritme achter

de patroonherkenning worden niet vrijgegeven door de firma. Zie Figuur 3.9 voor een

schematische voorstelling van de opeenvolgende stappen uitgevoerd door Zenit G-sight

bij de patroonherkenning.

Figuur 3.9: Schematische voorstelling van de werkwijze Zenit G-sight.

Focussering en scanning

Probabiliteitsindex

Negatief

Positief

Homogeen

Gespikkeld

Centromeer

Nucleolair

Mitochondriaal

Onzeker negatief

24

Het hoofdmenu van de software bestaat uit drie onderdelen: scanning, validatie en

archief. (cfr. figuur 3.10.).

Na inbreng van de te analyseren stalen op niveau van de software en plaatsing van de

plaatjes op het platform (maximale capaciteit van 5 plaatjes per run) kunnen de IIF-

plaatjes via het scanning-menu worden gescand. Eens de sessie is afgelopen, kunnen

de beelden met een hoge resolutie bekeken worden op het computerscherm ter hoogte

van het validatie-menu. Validatie (beelden bekijken en beoordelen) gebeurt best in een

donkere kamer. Er wordt bijgestuurd indien de gebruiker niet akkoord is met het

resultaat (interpretatie positief/negatief en patroon) gesuggereerd door de Zenit G-sight.

De software archiveert vervolgens de genomen beelden die nadien nog kunnen

bekeken worden. (cfr.http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-

Sight/What-are-the-key-features-of-Zenit-G-Sight.htm)

Figuur 3.10: Hoofdmenu Zenit G-sight.

(cfr. http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm)

3.4 BEPALING VAN SSC-GEASSOCIEERDE ANTISTOFFEN MET BEHULP VAN

EEN LINE IMMUNOASSAY

Identificatie van de meest voorkomende SSc geassocieerde antilichamen (anti-

centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werd uitgevoerd met

behulp van een LIA op 141 patiënten met SSc. Deze test vertoont een goede correlatie

met de tijdrovende en werkbelastende conventionele confirmatietechnieken (zoals

western blot, immunodiffusie, immunoprecipitatie,..) voor de detectie van de SSc

specifieke antilichamen.(59)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm

25

3.4.1 Principe

LIA is een test voor het opsporen van specifieke auto-antilichamen. Hierbij wordt een

selectie van relevante antigenen gecoat op een vaste drager in de vorm van een strip

(bv. een polystyreen strip) (cfr. Figuur 3.11.). De gecoate antigenen kunnen van

recombinante of natieve oorsprong zijn.

Indien in het serum auto-antistoffen aanwezig zijn gericht tegen de gecoate antigenen

ontstaat antistof – antigen binding. Vervolgens wordt een secundair anti-humaan IgG

antilichaam gebonden aan een enzym (bv. alkalisch fosfatase) toegevoegd. Dit complex

wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van een substraat dat door het enzym

wordt omgezet in een gekleurd product (bv. NBT/BCIP (nitrobluetetrazoliumchloride/5-

Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate).(60) De resultaten kunnen vervolgens visueel

worden afgelezen of worden ingescand met behulp van een gekalibreerde scanner om

een kwantitatief resultaat te bekomen.

Figuur 3.11: Een strip gecoat met 13 antigenen en een controle.

(cfr. http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=aak_gegen_zellkerne_ana&L=1.htm)

Het inzetten van de strips bestaat uit verschillende stappen:

Aanbrengen van het verdund serumstaal op de strips waarop de

antigenen gecoat zijn.

Een eerste incubatie van 30 minuten.

Wassen met wasbuffer om de niet gebonden antilichamen van de strips te

verwijderen.

Aanbrengen van het verdund conjugaat (secundair anti-humaan IgG

antilichaam gebonden aan een enzym) op de strips.

Een tweede incubatie van 30 minuten.

26

Wassen met wasbuffer om de niet gebonden antilichamen van de strips te

verwijderen.

Toevoegen van het substraat.

Een derde incubatie van 10 minuten.

Stopzetten van de reactie door afzuigen van het substraat, nadien wassen

met gedestilleerd water.

Na het drogen zijn de strips zijn klaar om visueel af te lezen of in te

scannen.

In het UZ Gent worden de stalen automatisch ingezet met het was- en incubatietoestel,

de EuroBlotmaster (cfr. Figuur 3.12.). Digitalisatie van de resultaten gebeurt met behulp

van de EuroLineScan software (cfr. Figuur 3.13.).

Figuur 3.12: de EuroBlotmaster is een automatische was- en incubatietoestel.

(cfr. http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm)

Figuur 3.13: De strips in de incubatietray (links) worden gescand m.b.v. EUROLineScan

(rechts). (cfr. http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm)

3.4.2 Materialen

Toestellen

EuroBlotmaster (Euroimmun, Lübeck, Germany)

EUROLineScan software (Euroimmun, Lübeck, Germany)

http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm

http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm

27

Reagentia

De Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay test kit

(Euroimmun, Lübeck, Germany) bevat:

- 16 strips gecoat met de 13 antigenen: Scl-70, CENP-A, CENP-B, twee

RNA-polymerase III subunits, fibrillarine, NOR90, Th/To, PM/Scl100,

PM/Scl75, Ku, PDGFR en Ro-52. Met uitzondering van Scl-70 (gezuiverd

natief) zijn alle antigenen van recombinante oorsprong.

- Positieve controle (IgG, humaan)

- Alkalisch fosfatase gelabeld anti-humaan IgG (geit) (conjugaat)

- Substraat (NBT/BCIP)

- Sample buffer

- Wasbuffer

Opmerking: enkel de data voor de meest voorkomende antistoffen (anti-centromeer,

anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) zijn gebruikt in deze studie.

3.4.3 Methode(60)

1. Haal de stalen, strips en reagentia (conjugaat, wasbuffer en sample buffer) uit de

koelkast en laat 30 minuten op kamertemperatuur komen.

2. Zet de Euroblotmaster aan (cfr. Figuur 3.12.).

3. Laad de strips en reagentia op het toestel.

4. Verdun de serum stalen en positieve controle in sample buffer als volgt: 15µl

staal/controle + 1,5 ml sample buffer.

5. Breng deze verdunningen aan op de strips.

6. De EuroBlotmaster voert vervolgens de stappen beschreven onder 3.4.1.

geautomatiseerd uit (vanaf eerste incubatie).

7. Digitaliseer de resultaten m.b.v. de EuroLineScan software. Interpreteer de

resultaten vervolgens op basis van de in huis afgeleide criteria.(59) (cfr. 3.4.4.)

Opmerking:

Een positieve commerciële controle wordt meegenomen in elke run. Hiermee wordt

gecontroleerd of het proces goed verlopen is (technische validatie). Indien de resultaten

van de controles niet voldoen aan de criteria vooropgesteld door de producent van de

kit wordt het inzetten van de strips herhaald.

28

3.4.4 Digitalisatie en interpretatie van de resultaten

De EuroLineScan is een gekalibreerde scanner die toelaat om de resultaten te

digitaliseren en om te zetten in een kwantitatief resultaat (Units (U)). Een staal wordt als

positief beschouwd als de cut-off voor de signaalsterkte overschreden wordt. (cfr. Tabel

3.5.)

Tabel 3.5: De auto-antistof met bijhorende criteria voor de signaalsterkte.(59)

Auto-antistof Cut-off voor positiviteit

Anti-centromeer anti-cenp-A of anti-cenp-B

>10U

Anti-Scl-70 anti-Scl-70 >10U

Anti-RNA-

polymerase III

anti-RNA-polymerase III/RP11

en RP155 >10U

Anti-PM/Scl anti-PM/Scl-75 en anti-

PM/Scl-100 >10U

3.5 DATA-ANALYSE

Statistische analyse werd uitgevoerd met PasW 19.0 statistical package (SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA).

29

4. RESULTATEN

4.1 DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT

G-SIGHT ZONDER BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER

4.1.1 Distributiecurve en ROC analyse

De algemene doelstelling van deze thesis is evaluatie van de diagnostische

performantie van de automatische ANA IIF in SSc patiënten. Geautomatiseerde ANA

IIF m.b.v. de Zenit G-sight werd uitgevoerd op drie cohorten (141 SSc patiënten, 78 DC

en 100 HD). Differentiatie positief/negatief werd gedaan met behulp van een cut-off op

de PI. Figuur 4.1. geeft een distributiecurve weer van de indexen bij een dilutie 1:40 per

cohorte.

Figuur 4.1: Distributiecurve van de indexen per cohorte.

In de SSc populatie varieert de index van 1.5 tot 90.6 (mediaan= 86.6) en komen de

hoogste indexen voor. In de controlepopulatie varieert de index van 2.1 tot 88.8

(mediaan=9.1). De meeste gezonde bloeddonoren geven lage indexen, die variëren

van 0.9 tot 57.7 (mediaan= 7.2).

ROC-curve (receiver operating characteristic-curve) is een grafiek waarbij sensitiviteit in

de y-as wordt uitgezet tegenover 1 – specificiteit in de x-as. Elk punt op de curve stelt

een cut-off voor overeenkomstig met een bepaalde sensitiviteit en specificiteit.(61) De

sensitiviteit is het percentage patiënten met de bestudeerde ziekte die een positief

testresultaat hebben (% echt positieven) en specificiteit is het percentage patiënten

zonder de ziekte die een negatief testresultaat hebben (% echt negatieven).(62)

30

ROC-curven worden gebruikt om de optimale cut-off te kiezen. Een optimale test heeft

een sensitiviteit en een specificiteit van 100%. De cut-off waarde overeenkomstig met

de hoogste sensitiviteit en een specificiteit is het punt op de grafiek in de

linkerbovenhoek. Bij een lage cut off, is de sensitiviteit van een test hoger, maar is de

specificiteit lager en omgekeerd. De oppervlakte onder deze curve (AUC) is een maat

voor de accuraatheid van een diagnostische test (hoe dichter de AUC bij 1, hoe beter

de accuraatheid van de test).(61)

Figuur 4.2. en 4.3. geven de ROC-curves van respectievelijk de SSc versus HD en de

SSc versus DC. De oppervlakte onder de curve bedraagt respectievelijk 0.955 en 0.919

wat betekent dat de Zenit G-sight heel goed onderscheid kan maken tussen SSc

patiënten en gezonde bloeddonoren, maar ook tussen SSc patiënten en de zieke

controles.

De software van de firma van de Zenit G-sight (A. Menarini Diagnostics, Zaventem,

België) gebruikt verschillende afkapwaarden of cut-off’s op de PI (cfr. Tabel 3.4.). De

cut-off van 8 is door de firma gekozen met de bedoeling een zo hoog mogelijke

sensitiviteit (percentage vals negatieven minimaliseren) te hebben. Bij deze

afkapwaarde bekomen wij een sensitiviteit en specificiteit van respectievelijk 95.0%

(n=134/141) en 59.0% (n=59/100).

Aangezien de indirecte immunofluorescentie test een screeningstest is, wordt er

gestreefd naar maximale sensitiviteit. De gouden standaard (manuele microscopie)

heeft een sensitiviteit van 95.7% (n=135/141). Dit wil zeggen dat 95.7% van de SSc

patiënten positief zijn op de manuele microscopie. Met de automatische microscoop

wordt op onze cohorte een vergelijkbare sensitiviteit gehaald bij een cut-off van 6.

Sensitiviteit en specificiteit bij deze cut-off bedragen respectievelijk 96.5% (n=136/141)

en 39.0% (n=39/100).

Aangezien specificiteit afhankelijk is van de samenstelling van de controlegroep,

werden beide cut-off’s (PI ≥8 en PI ≥6) eveneens toegepast op de DC.(62) Bij deze

populatie wordt een specificiteit van respectievelijk 37.2% (n=29/78) en 23.1%

(n=18/78) teruggevonden.

31

Figuur 4.2: ROC-curve van de SSc patiënten versus gezonden met AUC=0.955.

Figuur 4.3: ROC-curve van de SSc patiënten versus zieke controles met AUC=0.919.

Naast de cut-off van 8 op de PI stelt de firma een tweede cut-off van 50 voor met de

bedoeling een zo hoog mogelijke specificiteit (percentage vals positieven

minimaliseren) te hebben. Door toepassing van deze cut-off op onze populaties wordt

een sensitiviteit van 83,7% (op SSc patiënten) en specificiteit van 93.6% (op HD)

gehaald. Met de gouden standaard (manuele microscopie) wordt daarentegen een

specificiteit van 94,0% (n=94/100, op de HD) bekomen. Gezien de interesse om

vergelijkbare specificiteit te bekomen met de geautomatiseerde analyse als de manuele

microscopie werd nagegaan bij welke cut-off dit criterium werd gehaald. Bij een cut-off

op de PI’s van 61.7 wordt respectievelijk een sensitiviteit en specificiteit van 79.4% en

94.9% gehaald.

32

4.1.2 ANA IIF titers zonder bijsturing in elk subset

Om inzicht te krijgen in de ANA titers bekomen op de Zenit G-sight werd van elk

patiënten staal een verdunningsreeks gemaakt (1:40 t.e.m. 1:2560). De controles

werden eerst 1:40 en 1:80 verdund en pas uitgetitreerd indien een positief beeld werd

bekomen bij deze titers. Een eindtiter is de hoogste verdunning van het serumstaal

waarbij nog een PI ≥8 wordt gezien. Dezelfde analyse werd uitgevoerd op basis van de

in huis afgeleide cut-off (PI ≥6).

Een overzicht van de ANA titers bekomen op de Zenit G-sight zonder bijsturing in

patiënten (SSc) en de controlegroepen (HD en DC) op basis van de onderste cut-off

waarden (PI ≥6 of ≥8) wordt weergegeven in Tabel 4.1. Er is geen verschil in distributie

van de titers voor beide cut-off’s waardoor slechts 1 tabel moest worden opgemaakt.

Tabel 4.1: Overzicht van de ANA titers op basis van de PI’s.

Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560 aSSc

(n=141)

3.5

(5)

3.5

(5)

5.0

(7)

17.7

(25)

9.2

(13)

28.4

(40)

15.6

(22)

17.0

(24) bHD

(n=100)

59.0

(59)

32.0

(32)

7.0

(7)

1.0

(1)

/ 1.0

(1)

/ /

cDC

(n=78)

39.7

(31)

38.5

(30)

15.4

(12)

5.1

(4)

1.3

(1)

/ / /

aSSc: systeemsclerose,

bHD: healthy donors,

cDC: disease controls. De getallen geven percentages per

subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de titers in elk subset is aangeduid in het vet.

Bij de cohorte van SSc patiënten, HD en DC is de titer met het hoogste percentage

respectievelijk 1:640 (28.4%), negatief (59.0%) en negatief (39.7%). Bij de HD en DC

wordt ook een relatief hoog percentage (respectievelijk 32.0% en 38.5%) gevonden dat

positief is met een titer van 1:40.

4.1.3 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets zonder bijsturing

Naast de globale performantie van de geautomatiseerde ANA analyse zonder bijsturing

werd ook gekeken naar de sensitiviteit voor het oppikken van de ANA positiviteit binnen

de verschillende antistof-subsets in de SSc populaties. Tabel 4.2. geeft een overzicht

van de gevoeligheid van Zenit G-sight in functie van de antistof-subsets. De analyse

gebeurde op basis van de cut-off van firma (PI ≥8) en de in huis cut-off (≥6). Beide cut-

off’s geven dezelfde resultaten waardoor slechts 1 tabel moest worden opgemaakt.

Enkel de PI’s bij een serum dilutie van 1:40 werden in rekening gebracht.

33

Tabel 4.2: Overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight in functie van de antistof-

subsets (op basis van PI’s bij serum dilutie van 1:40).

Patiënten positief met volgende antistof:

Anti-centromeer

(n=69)

Anti-Scl-70

(n=26)

Anti-RNA-polymerase III

(n=11)

Anti-PM/Scl

(n=3)

Sensitiviteit (%)

97.0%

(n=67/69)

100%

(26/26)

100%

(11/11)

100%

(3/3)

De antistof-subsets (anti-centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werden gedefinieerd op basis van LIA (Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay

(Euroimmun, Lübeck, Germany)).

De geautomatiseerde ANA analyse pikt alle patiënten op met anti-Scl-70 antilichamen,

RNA-polymerase III antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen (100% sensitiviteit). De

sensitiviteit voor anti-centromeer antilichamen is ook hoog en bedraagt 97.0%. Slechts

2 patiënten met anti-centromeer antilichamen worden gemist bij een startdilutie van

1:40. Eén van beide patiënten heeft een lage ANA titer (1:80) bij beoordeling op de

digitale beelden. De andere patiënt (staal: LP240171) heeft daarentegen een hoge ANA

titer (>1:2560) op de digitale beelden (cfr. Figuur 4.4. en Figuur 4.5.).

4.1.4 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight zonder bijsturing

Met behulp van Zenit G-sight is naast differentiatie positief/negatief (aan de hand van

de PI) ook patroonherkenning mogelijk. Tabel 4.3. geeft de spreiding weer van de

patronen over de 4 voornaamste patronen (homogeen, gespikkeld, nucleolair en

centromeer) bij een serum dilutie van 1:40. Het SSA-patroon wordt niet herkend door de

Zenit G-sight (de software is hiervoor niet getraind).

Tabel 4.3: Overzicht van de ANA patronen in alle subsets zonder bijsturing.

Negatief Homogeen gespikkeld Nucleolair centromeer Geen patroon

aSSc

(n=141)

3.5

(5) 4.3

(6) 25.5

(36) 19.1

(27) 44.0

(62) 3.5

(5) bHD

(n=100)

59.0

(59) 7.0

(7) 2.0

(2) 4.0

(4) 0.0

(0) 28.0

(28) cDC

(n=78)

39.7

(31) 9.0

(7) 6.4

(5) 9.0

(7) 0.0

(0) 35.9

(28) aSSc: systeemsclerose,


cDC: disease controls. Bij een geïsoleerd cytoplasmatisch

patroon werd ANA als negatief gezien. De getallen geven percentages per subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de patronen in elk subset is

aangeduid in het vet.

Het patroon met het hoogste percentage in SSc, HD en DC zonder bijsturing is

respectievelijk centromeer patroon (44.0%), negatief (59.0%) en negatief (39.7%). Bij

34

de DC en HD worden ook relatief hoge percentages (respectievelijk 35.9% en 28.0%)

gevonden voor stalen waaraan Zenit G-sight geen patroon toekent.

4.1.5 Berekening van likelihoodratio’s van de index-intervallen Bij een dichotome test, zijn er 4 probabiliteiten of likelihoods van een testresultaat die

de ziektestatus geven: P(T+/D+), P(T-/D+), P(T+/D-) en P(T-/D-). (P staat voor

probabiliteit, T voor testresultaat en D voor ‘diseasestate’). De likelihood ratio’s (LR) van

een specifiek testresultaat voor een bepaalde ziekte is de probabiliteit van het

testresultaat in personen met de bestudeerde ziekte (hier, systeemsclerose) gedeeld

door de probabiliteit van hetzelfde testresultaat in controles zonder deze ziekte.(62) De

positieve likelihoodratio stemt overeen met sensitiviteit / [1-specificiteit]. De negatieve

likelihoodratio stemt overeen met [1-sensitiviteit]/ specificiteit. Tabel 4.4. geeft de

interpretatie van de beide likelihoodratio’s weer. Een heel hoge positieve LR (bv.

LR>10) geeft aan in welke mate een ziekte aannemelijker wordt na het vinden van een

positief testresultaat, terwijl een heel lage negatieve LR (bv. LR<0.1) aangeeft in welke

mate een ziekte minder aannemelijk wordt bij een negatief testresultaat. Als LR = 1 dan

zal de post-testprobabiliteit niet van de pre-testprobabiliteit verschillen en is de test dus

waardeloos.(62)

Om inzicht te krijgen in de likelihoodratio per interval op de index werd voor volgende

intervallen de likelihoodratio berekend: PI≤6, 6<PI≤61.7 en PI >61.7 (cfr. ROC analyse

4.1.1.). Likelihood ratio’s voor testresultaat-intervallen zijn meer informatief dan

likelihoodratio’s op basis van één cut-off waarde.(62) De resultaten zijn weergegeven in

Tabel 4.5.

Tabel 4.4: Interpretatie van positieve en negatieve likelihoodratio’s.(62)

Interpretatie LR+ LR-

Geen verschil tussen pre- en post-test probabiliteit (test heeft geen klinisch nut)

1 1

Klein verschil (zelden klinisch significant) 1-2 0.5-1

Klein verschil dat relevant kan zijn in een specifieke situatie (test is niet bruikbaar)

2-5 0.2-0.5

Bescheiden maar substantieel klinisch verschil (test is bruikbaar)

5-10 0.1-0.2

Vaak een klinisch significant verschil >10 <0.1

35

Tabel 4.5: Likelihoodratio’s van de index-intervallen.

PI≤6 6<PI≤61.7 PI >61.7

aSSc 0.11 0.26 35.35

aSSc: systeemsclerose. De controlegroepen (HD + DC) werden

opgeteld voor de berekening van de likelihoodratio’s.

Bij een PI≤ 6 bekomen we een LR van 0.11. Dit impliceert een bescheiden maar

substantieel klinisch verschil (test is bruikbaar). Indien de PI >6 en ≤ 61.7 is de test niet

erg bruikbaar. Bij een PI >61.7 is de LR>10 wat wijst op een klinisch significante

bijdrage van het testresultaat.

4.2. DIAGNOSTISCHE WAARDE VAN ANA IIF BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT

G-SIGHT NA BIJSTURING VAN DE GEBRUIKER

4.2.1 ANA IIF titers na bijsturing in elke subset

Tabel 4.6 geeft een overzicht van de titers in alle subsets op basis van de aflezing van

de digitale beelden (= Zenit G-sight resultaat na bijsturing door de gebruiker).

Bij de cohorte van patiënten met SSc, HD en DC is de titer met het hoogste percentage

na bijsturing respectievelijk >1:2560 (51.8%), negatief (70.0%) en negatief (61.5%). Bij

vergelijking van deze resultaten met de resultaten bekomen met de Zenit G-sight

zonder bijsturing van de gebruiker valt op dat er meer SSc patiënten zijn met een

hogere titer (51.8 % heeft titer >1:2560 versus 17.0%, p<0.05, Chi-kwadraattest). In

contrast zijn er voor de controle groepen opvallend meer negatieve stalen (70.0%

versus 59.0% voor de HD (p=0.14, Chi-kwadraattest), 61.5% versus 39.7% voor de DC

(p<0.05, Chi-kwadraattest)).

Tabel 4.6: Overzicht van de ANA titers op basis van aflezing van de digitale beelden.

Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560

aSSc

(n=141)

5.0

(7)

2.1

(3)

0.7

(1)

5.7

(8)

7.1

(10)

11.3

(16)

16.3

(23)

51.8

(73) bHD

(n=100)

70.0

(70)

18.0

(18)

8.0

(8)

3.0

(3)

/ 1.0

(1)

/ /

cDC

(n=78)

61.5

(48)

15.4

(12)

9.0

(7)

6.4

(5)

2.6

(2)

3.8

(3)

1.3

(1)

/



cDC: disease controls. De getallen geven percentages per

subset weer – de getallen tussen haakjes het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van titers in elk subset is aangeduid in het vet.

36

4.2.2 Sensitiviteit van de Zenit G-sight voor antistof-subsets na bijsturing

Naast de globale performantie van de geautomatiseerde ANA analyse na bijsturing

(aflezing van de digitale beelden), werd ook gekeken naar de sensitiviteit voor het

oppikken van de ANA positiviteit binnen de verschillende antistof-subsets in de SSc

populaties. Tabel 4.7. geeft een overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight na

bijsturing in functie van de antistof-subsets. Enkel de digitale beelden bij een serum

dilutie van 1:40 worden in rekening gebracht.

Tabel 4.7: Overzicht van de gevoeligheid van Zenit G-sight op basis van digitale beelden

in functie van de antistof subset (serum dilutie van 1:40).

Patiënten positief met volgende antistof:

Anti-centromeer

(n=69)

Anti-Scl-70

(n=26)

Anti-RNA-polymerase

(n=11)

Anti-PM/Scl

(n=3)

Sensitiviteit

(%)

100%

(n=69/69)

100%

(n=26/26)

91%

(n=10/11)

100%

(n=3/3)

De antistof-subsets (anti-centromeer, anti-Scl-70, anti-RNA-polymerase III en anti-PM/Scl) werden gedefiniëerd op basis van LIA (Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile Euroline (IgG) lineblot assay

(Euroimmun, Lübeck, Germany)).

Sensitiviteit van de geautomatiseerde ANA analyse na bijsturing bedraagt 100% voor

anti-Scl-70 antilichamen, anti-PM/Scl antilichamen en anti-centromeer antilichamen. De

sensitiviteit voor RNA-polymerase III antilichamen na bijsturing bedraagt 91.0%. Eén

patiënt met RNA-polymerase III antistoffen wordt gemist. Dit staal wordt wel opgepikt

voor de bijsturing (PI=66.8 bij serum dilutie 1:40).

4.2.3 Evaluatie van de patroonherkenning door Zenit G-sight met bijsturing

Tabel 4.8. geeft de spreiding weer van de patronen met bijsturing over de 4

voornaamste patronen en het SSA patroon, bij een serum dilutie van 1:40.

Tabel 4.8: Overzicht van de ANA patronen in alle subsets met bijsturing.

Negatief Homogeen gespikkeld Nucleolair centromeer SSA aSSc

(n=141)

5.0

(7) 11.3

(16) 21.3

(30) 10.6

(15) 47.5

(67) 4.3

(6) bHD

(n=100)

70.0

(70) 18.0

(18) 8.0

(8) 3.0

(3) 0.0

(0) 1.0

(1) cDC

(n=78)

61.5

(48) 12.8

(10) 21.8

(17) 3.8

(3) 0.0

(0) 0.0

(0) aSSc: systeemsclerose,


cDC: disease controls. Bij meerdere patronen per staal

werd het patroon met de hoogste titer weerhouden. Bij een geïsoleerd cytoplasmatisch patroon werd ANA als negatief gezien. De getallen geven percentages per subset weer – de getallen tussen haakjes

het aantal patiënten/controles. Het hoogste percentage van de patronen in elk subset is aangeduid in het vet.

37

Het patroon met het hoogste percentage in SSc, HD en DC met bijsturing is

respectievelijk centromeer patroon (47.5%), negatief (70.0%) en negatief (61.5%). De

frequenties zijn vergelijkbaar voor en na bijsturing voor alle patronen bij de HD en SSc

patiënten met uitzondering van het homogeen patroon (p<0.05, Chi-kwadraattest). Voor

de DC zijn er meer negatieve en gespikkelde patronen na bijsturing dan zonder

bijsturing (p<0.05, Chi-kwadraattest).

Aangezien het belangrijk is om het centromeer patroon goed te kunnen herkennen,

werd ook nagegaan hoeveel % van de positieve sera met anti-centromeer antilichamen

op LIA, daadwerkelijk als centromeer patroon werden herkend op de digitale beelden

(Zenit G-sight na bijsturing, bij een dilutie van 1:40). In totaal wordt bij 96.9% (n=63/65)

van de anti-centromeer LIA positieve stalen het patroon correct geïdentificeerd. Bij geen

van beide discordante stalen (n=2) kon een centromeer patroon worden teruggevonden

op de digitale beelden van de titratiereeks. Beide stalen worden als gespikkeld

beoordeeld.

4.2.4 Berekening van likelihoodratio’s van de titers Voor elke titer (bekomen op basis van de digitale beelden na bijsturing) werd een

likelihoodratio berekend (cfr. Tabel 4.9.).

Tabel 4.9: De likelihoodratio’s per ANA IIF titer van de Zenit G-sight met bijsturing.

Negatief 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 >1:2560

aSSc 0.07 0.12 0.08 1.27 6.32 5.03 29.01 ∞

aSSc: systeemsclerose. De controlegroepen (HD + DC) werden opgeteld voor de berekening

van de likelihoodratio’s.

De positieve likelihoodratio’s bij 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 en 1:2560

bedragen respectievelijk 0.12, 0.08, 1.27, 6.32, 5.03, 29.01 en ∞. Dit wil zeggen dat een

resultaat met een titer van 1:160 slechts een klein verschil in pre- en post-

testprobabiliteit betekent (slechts zelden klinisch significant, test niet bruikbaar). Titers

van 1:320 t.e.m. 1:640 (LR tussen 5 en10) geven aanleiding tot een bescheiden maar

potentieel klinisch relevant verschil (test is bruikbaar). Resultaten met titers ≥1:1280

(LR>10) hebben vaak een klinisch significant verschil in pre- naar post-testprobabiliteit.

Een negatief test resultaat en resultaten met titers ≤1:80 hebben een negatieve

likelihoodratio ≤0.2. Dit wil zeggen dat bij deze resultaten er een substantieel tot vaak

klinisch significant verschil is tussen pre- en post test probabiliteit.

38

4.3 VERGELIJKING VAN DE ANA IIF RESULTATEN (POSITIEF/NEGATIEF)

BEPAALD MET BEHULP VAN ZENIT G-SIGHT MET EN ZONDER BIJSTURING VAN

DE GEBRUIKER

Bij deze analyse werden de ANA IIF resultaten bekomen m.b.v. Zenit G-sight met en

zonder bijsturing onderling vergeleken. Voor het dichotomiseren van de PI data werd

gebruik gemaakt van een cut-off van 6 (in huis criterium), dit impliceert dat de stalen die

door de Zenit G-sight als ‘negatief uncertain’ werden geklasseerd als positief werden

weerhouden. Tabel 4.10. geeft een kruistabel weer van de resultaten bekomen op de

totale cohorte.

Tabel 4.10: Vergelijking van de resultaten bekomen o.b.v. de digitale beelden versus de

resultaten bekomen o.b.v. de PI (totale cohorte).

Totaal Aflezing digitale

beelden

Totaal

neg pos

Index neg 53 9 62

pos 70 187 257

Totaal 123 196 319

Op de totale cohorte is er een overeenkomst van 75.2% van de geanalyseerde stalen

(n=240/319) voor de interpretatie positief/negatief. Om inzicht te krijgen of de

overeenkomst tussen de Zenit G-sight resultaten met en zonder bijsturing verschillend

is voor de verschillende cohorten werden eveneens kruistabellen gemaakt per cohorte

(cfr. Tabel 4.11.). Het percentage overeenkomst tussen beide aflezingen (met en

zonder bijsturing – per cohorte) is eveneens weergegeven in Tabel 4.11.

Er worden significant meer discordanties gezien in de controle groepen dan in de SSc

groep (p<0.05 zowel voor DC als HD, Chi-kwadraattest).

Een detailoverzicht van de discordanties tussen de resultaten zonder bijsturing (indexen

bij PI ≥6) en met bijsturing (aflezing van de digitale beelden) is terug te vinden in Bijlage

1. De meeste discordanties (63.3%, n=50/79) zijn terug te vinden voor zwakke stalen

(lage PI’s of lage titers ≤1:80). Slechts vier discordante stalen hadden titers van ≥1:80

op basis van aflezing van digitale beelden (twee met een zwak nucleolair patroon, 1 met

een SSA patroon en 1 met een gemengd centromeer + nucleolair patroon). Ook

aspecifieke aankleuring van de plaatjes door de aanwezigheid van vuil (20.3%,

n=16/79) of cytoplasmatische patronen (16.5%, n=13/79) leiden tot discordanties. Het

39

toestel kan immers geen onderscheid maken tussen fluorescentie afkomstig van de

kern of het cytoplasma, terwijl bij beoordeling van de digitale beelden enkel

kernfluorescentie in rekening werd gebracht.

Tabel 4.11: Vergelijking van de resultaten bekomen o.b.v. de digitale beelden versus de

resultaten bekomen o.b.v. de PI (index) per subset.

SSc Aflezing digitale

beelden

Totaal

neg pos

Index neg 3 2 5

pos 2 134 136

Totaal 5 136 141

% overall agreement= 97.2%

DC Aflezing digitale

beelden

Totaal

neg pos

Index neg 16 2 18

Pos 32 28 60

Totaal 48 30 78


HD Aflezing digitale

beelden

Totaal

neg pos

Index neg 34 5 39

Pos 36 25 61

Totaal 70 30 100


Opvallend is de discordantie voor staal LP240171. Dit staal heeft op de digitale beelden

een titer >1:2560, terwijl de PI slechts 4.73 is bij een serum dilutie van 1:40. Bij verdere

serum dilutie neemt de PI eerst toe en nadien weer af (cfr. Figuur 4.5). Figuur 4.4. geeft

de digitale beelden van het staal bij een dilutie van 1:40, 1:320 en 1:2560.

Figuur 4.4: De digitale beelden voor staal LP240171 bij een dilutie van 1:40 (links), 1:320

(midden) en 1:2560 (rechts).

40

Figuur 4.5: Evolutie van de PI in functie van de titer voor staal LP240171

(voor de X-as: 0=dilutie 1:40, 1= dilutie 1:80, 2=dilutie 1:160, 3=dilutie 1:320, 4=dilutie

1:640, 5=dilutie 1:1280, 6=dilutie 1:2560).

Een andere benadering voor de evaluatie van de overeenkomst tussen de resultaten

van Zenit-G-sight met en zonder bijsturing is de berekening van de kappa-coëfficiënt.

De kappa-coëfficiënt (cohen-coëfficiënt) is een statistische waarde om de graad van

overeenkomst tussen dichotome testen (hier, differentiatie positief/negatief met en

zonder bijsturing) weer te geven. Hoe dichter de kappa-waarde bij 1, hoe groter de

overeenkomst. Tabel 4.12. geeft de interpretatie van de kappa-coëfficiënt weer.

De kappa-coëfficiënt in de subset van SSc, HD en DC bedraagt respectievelijk 0.59,

0.25 en 0.23 wat een matig tot redelijke overeenkomst betekent tussen de resultaten

van de Zenit G-sight analyse met en zonder bijsturing. De kappa-coëfficiënt op de totale

cohorte bedraagt 0.42, wat betekent dat er een matig overeenkomst bestaat tussen de

resultaten van de Zenit G-sight analyse zonder en met bijsturing op de globale cohorte.

Tabel 4.12: Interpretatie van Kappa-waarde (volgens Landis & koch).(63)

Interpretatie Kappa-waarde

Goed қ >80

Substantieel 0.61≤ қ ≤ 0.80

Matig 0.41≤ қ ≤ 0.60

Redelijk 0.21≤ қ ≤ 0.40

Zwak қ ≤ 0.20

41

4.4 CORRELATIE TUSSEN TITER EN INDEX

Er werd eveneens nagegaan of er een correlatie bestaat tussen de titer (na bijsturing)

en de index (PI bij een dilutie van 1:40). Bruikbaarheid van de index als alternatief voor

de ANA IIF titer is tot op heden nog niet gedocumenteerd. Figuur 4.6. geeft de indexen

weer in functie van de titer. Stalen met een cytoplasmatisch patroon (al dan niet in

combinatie met een kernfluorescentie) werden geëxcludeerd voor deze analyse (n=10)

aangezien voor het aflezen van de titer op de digitale beelden de cytoplasmatische

patronen niet in rekening werden gebracht. Er wordt een significante correlatie

teruggevonden tussen de titer en de index (r=0.919 (95% CI 0.8922-0.9298), p<0.0001,

pearson correlation).

Uit Figuur 4.6. blijkt dat de PI’s bij stalen met een titer van 1:40 significant hoger zijn

dan de PI’s bij stalen die negatief zijn (p<0.05, Mann Whitney U test). Tussen de stalen

met een titer van 1:40 versus 1:80 is er geen significant verschil in PI’s (P>0.05, Mann

Whitney U test). De PI’s bij stalen met een titer van 1:80 versus stalen met een titer van

1:160 zijn wel significant verschillend (p<0.05, Mann Whitney U test). Idem voor de

vergelijking van titer 1:160 versus 1:320. Vanaf de stalen met titer >1:640 is er geen

significant verschil meer tussen de PI’s (P>0.05, Mann Whitney U test).

Figuur 4.6: Medianen en boxplots (eerste kwartiel (Q1) tot derde kwartiel(Q3)) van de

index (dilutie 1:40) per titer. *betekent dat de observatie een punt is dat buiten Q3±1.5 (Q3-Q1) valt.

°betekent dat de observatie een punt is dat buiten Q3±3 (Q3-Q1) valt.

42

Een overzicht van de stalen die gelegen zijn buiten 1.5 (Q3-Q1) en buiten 3 (Q3-Q1)

zijn opgelijst in Tabel 4.13. en Tabel 4.14. respectievelijk.

Tabel 4.13: Stalen gelegen buiten 1.5 (Q3-Q1).

Staal Volgn° Index Patroon (na

bijsturing)

Titer (na

bijsturing)

Opmerking

53692 260 39.07 Gespikkeld 1 :40 /

DV040654 61 52.93 Gespikkeld 1 :1280 /

LP240171 99 4.73 Centromeer + Nucleolair

>1 :2560 cfr. Figuur 4.4. en 4.5.

CVL201166 106 51.03 Centromeer 1 :1280 /

RB150947 126 58.18 Centromeer + Nucleolair

>1 :2560 /

HVC161032 129 46.15 Centromeer 1 :1280 /

GH040250 139 32.10 Centromeer+ Nucleolair

1 :1280 /

2944 535 37.82 Gespikkeld 1 :40 /

Tabel 4.14: Stalen gelegen buiten 3 (Q3-Q1).

Staal Volgn° Index Patroon (na

bijsturing)

Titer (na

bijsturing)

MDC010461 25 75.00 Centromeer+ Nucleolair

>1 :2560

DM060433 29 68.06 Centromeer+ Nucleolair

>1 :2560

BA110760 92 74.66 Centromeer >1 :2560

JD241062 119 74.57 Gespikkeld >1 :2560

PL111160 123 67.24 Centromeer >1 :2560

MVC161138 140 68.65 Centromeer+ Nucleolair

>1 :2560

52736 228 17.51 Negatief /

53037 243 19.05 Negatief /

57452 325 23.51 Gespikkeld 1 :80

090826-2420 421 17.06 Negatief /

43

5. DISCUSSIE

Geautomatiseerde ANA IIF m.b.v. de Zenit G-sight werd uitgevoerd op drie cohorten

(141 SSc patiënten, 78 DC en 100 HD) met het oog op de evaluatie van de

diagnostische waarde van de automatische ANA IIF met focus op SSc patiënten.

Uit een ROC analyse op de PI’s kon worden afgeleid dat Zenit G-sight heel goed

onderscheid kan maken tussen SSc patiënten en de controlegroepen (HD en DC). We

evalueerden eveneens of de afkapwaarde voorgesteld door de firma (PI ≥8) optimaal

was voor screening (maximale gevoeligheid – vergelijkbaar met manuele microscopie)

en stellen vast dat bij een afkapwaarde ≥6 op de PI dit criterium beter wordt gehaald. Bij

gebruik van deze grens wordt zoals verwacht slechts een lage specificiteit bekomen

(23% en 39%).(36) Naar analogie evalueerden we de tweede afkapwaarde voorgesteld

door de firma (PI>50, maximale specificiteit). Hier wordt vastgesteld dat bij een hogere

afkapwaarde (PI≥61.7) een betere overeenkomst met manuele microscopie voor het

niet oppikken van de controle patiënten kan worden bereikt.

Bij evaluatie van de titers voor onze drie cohorten zien we de hoogste ANA titers bij de

SSc patiënten (1:640 voor bijsturing, >1:2560 na bijsturing). Dit resultaat is vergelijkbaar

met de manuele ANA IIF resultaten bekomen op SSc patiënten.(36) Op De Beeck et al.

vonden hoge frequenties bij titers van 1:640 en 1:1280. Bij de HD en DC zijn de meeste

controles zoals verwacht negatief (met en zonder bijsturing).(36) We vergeleken

eveneens de resultaten van de ANA IIF voor en na bijsturing en stellen vast dat er meer

SSc patiënten met een hogere titer worden gevonden op basis van de digitale beelden

dan op basis van de PI. Ook voor de controle groepen worden opvallend meer

negatieve stalen gevonden na bijsturing. Dit is te verklaren doordat cytoplasmatische

patronen en aspecifieke fluorescentie door vuil een hogere index krijgen, waardoor ze

als positief beschouwd worden door de Zenit G- sight (vals positieven). Hieruit blijkt dat

bijsturing door de gebruiker noodzakelijk blijft.

Wat betreft het patroon bij de SSc populatie kon worden bevestigd wat al eerder in de

literatuur bekend was, namelijk dat het centromeer het meest voorkomend patroon is bij

SSc.(36, 64) We zien voor alle patronen geen significante verschillen bij de vergelijking

voor en na bijsturing bij de HD en SSc patiënten met uitzondering van het homogeen

patroon. Voor de DC zijn er significant meer negatieve en gespikkelde patronen na

bijsturing. Deze verschuivingen zijn vermoedelijk te verklaren doordat voor bijsturing

44

aan een groot percentage van de stalen geen patroon werd toegekend. Dit dient verder

te worden onderzocht.

We evalueerden ook de gevoeligheid van de Zenit G-sight voor het oppikken van de

patiënten verdeeld over de verschillende antistof-subsets. Voor patiënten met anti-Scl-

70 antilichamen en anti-PM/Scl antilichamen is de gevoeligheid maximaal (met en

zonder bijsturing). De sensitiviteit voor patiënten met anti-centromeer antilichamen is

hoog (ook op niveau van het patroon). Twee patiënten met anti-centromeer

antilichamen worden gemist zonder bijsturing, maar worden toch gevonden op basis

van de digitale beelden. De ene patiënt heeft een lage ANA titer (1:80). De andere

patiënt heeft een hoge ANA titer (>1:2560) op de digitale beelden in combinatie met een

lage index op serum dilutie 1:40. Opvallend is dat voor dit laatste staal de index piekt

met toenemende dilutie, hetgeen ook bevestigd werd op de digitale beelden. Dit beeld

zou kunnen passen bij een ‘prozone’ effect waarbij een vals negatief (of vals verlaagd)

resultaat wordt bekomen in de aanwezigheid van een overmaat aan antistof. Dit effect

is slechts zeldzaam beschreven bij ANA IIF.(65)

Er werden ook LR berekend op basis van de index-intervallen en de titers. Hieruit kon

worden afgeleid dat indexen ≤6 en >61.7 een grote diagnostische bijdrage kunnen

leveren. Titers ≤1:80 hebben een LR<0.2 (test is bruikbaar), terwijl voor stalen met titers

vanaf 1:320 een LR>5 wordt gevonden (test is bruikbaar). Deze resultaten wijken af van

de data van Bossuyt et al. die aantoonden dat stalen met een titer van 1:40 en 1:80

aanleiding gaven tot geen of een klein verschil in pre-test naar post-testprobabiliteit.(36)

Op de totale cohorte, bij SSc, HD en DC is er een overeenkomst voor de differentiatie

positief/negatief met en zonder bijsturing van respectievelijk 75.2%, 97.2%, 59.0% en

56.1% (kappa-coëfficiënt’s geven respectievelijk een matig tot redelijke overeenkomst).

Er worden significant meer discordanties gezien in de controle groepen dan in de SSc

groep. Van de 79 discordanties zijn de meeste stalen zwak (lage PI’s of titers ≤1:80)

wat compatibel is met de aanwezigheid van meer discordanties in de controle groepen.

Tenslotte wordt een significante correlatie teruggevonden tussen de titer (na bijsturing)

en de index (bij dilutie 1:40). Er zijn geen significante verschillen tussen de PI’s van de

stalen met een titer van 1:40 en 1:80. Eveneens is er geen significant verschil meer

tussen de PI bij de stalen met een titer >1:640.

45

6. BESLUIT

Onze resultaten tonen aan dat de geautomatiseerde indirecte immunofluorescentie test

m.b.v een automatische microscoop (Zenit G-sight) heel goed onderscheid kan maken

tussen SSc patiënten en de controlegroepen (HD en DC).

De patronen en titers bekomen met het systeem zijn zoals verwacht voor de SSc

patiënten en de controlegroepen. Hoge titers, vaak met een centromeer patroon worden

gezien in de SSc populatie. Terwijl voor de controlegroepen ANA meestal negatief of

zwak positief zijn. Ook de gevoeligheid binnen de antistof-subsets is hoog.

Op basis van deze resultaten kan worden besloten dat dit systeem goed performeert als

ANA screeningstest in de SSc populatie. Bijsturing door een expert blijft noodzakelijk

gezien het systeem een groot percentage van de stalen niet classificeert (‘negative

uncertain’) en eventuele stalen met een ‘prozone’ effect kan missen.

Verder wordt ook een correlatie vastgesteld tussen de index en de titer hetgeen

mogelijkheden opent om deze kwantitatieve en gestandaardiseerde waarde (index) in

de toekomst te gaan gebruiken als een alternatief voor de klassieke ANA titer in het

routine laboratorium.

46

7. LITERATUURLIJST

1. Sompayrac L. How the immune system works. 4th ed. Chichester, West Sussex ; Hoboken, NJ:

Wiley-Blackwell; 2012.

2. Murphy K, Travers P, Walport M. Janeway's immunobiology. 7th ed: Garland Science; 2007. 888

p.

3. Steen VD. The many faces of scleroderma. Rheumatic diseases clinics of North America.

2008;34(1):1-15; v. Epub 2008/03/11.

4. Le Guern V, Mahr A, Mouthon L, Jeanneret D, Carzon M, Guillevin L. Prevalence of systemic

sclerosis in a French multi-ethnic county. Rheumatology. 2004;43(9):1129-37. Epub 2004/06/24.

5. Mayes MD. Scleroderma epidemiology. Rheumatic diseases clinics of North America.

2003;29(2):239-54. Epub 2003/07/05.

6. Steen VD, Oddis CV, Conte CG, Janoski J, Casterline GZ, Medsger TA, Jr. Incidence of systemic

sclerosis in Allegheny County, Pennsylvania. A twenty-year study of hospital-diagnosed cases, 1963-

1982. Arthritis and rheumatism. 1997;40(3):441-5. Epub 1997/03/01.

7. Roberts-Thomson PJ, Jones M, Hakendorf P, Kencana Dharmapatni AA, Walker JG, MacFarlane

JG, et al. Scleroderma in South Australia: epidemiological observations of possible pathogenic

significance. Internal medicine journal. 2001;31(4):220-9. Epub 2001/07/18.

8. Ferri C, Valentini G, Cozzi F, Sebastiani M, Michelassi C, La Montagna G, et al. Systemic

sclerosis: demographic, clinical, and serologic features and survival in 1,012 Italian patients. Medicine.

2002;81(2):139-53. Epub 2002/03/13.

9. Smith V. Start of the Ghent University, Scleroderma unit: First results. Ghent, Belgium: Ghent

University; 2011.

10. Steen VD, Medsger TA. Changes in causes of death in systemic sclerosis, 1972-2002. Annals of

the rheumatic diseases. 2007;66(7):940-4. Epub 2007/03/03.

11. Laing TJ, Gillespie BW, Toth MB, Mayes MD, Gallavan RH, Burns CJ, et al. Racial differences in

scleroderma among women in Michigan. Arthritis and rheumatism. 1997;40(4):734-42.

12. Balbir-Gurman A, Braun-Moscovici Y. Scleroderma - New aspects in pathogenesis and treatment.

Best practice & research Clinical rheumatology. 2012;26(1):13-24. Epub 2012/03/20.

13. Radic M, Martinovic Kaliterna D, Radic J. Infectious disease as aetiological factor in the

pathogenesis of systemic sclerosis. The Netherlands journal of medicine. 2010;68(11):348-53. Epub

2010/12/16.

14. Diot E, Lesire V, Guilmot JL, Metzger MD, Pilore R, Rogier S, et al. Systemic sclerosis and

occupational risk factors: a case-control study. Occupational and environmental medicine.

2002;59(8):545-9. Epub 2002/08/02.

15. Johnson RW, Tew MB, Arnett FC. The genetics of systemic sclerosis. Current rheumatology

reports. 2002;4(2):99-107. Epub 2002/03/14.

16. Steen VD. Autoantibodies in systemic sclerosis. Seminars in arthritis and rheumatism.

2005;35(1):35-42. Epub 2005/08/09.

47

17. Hu PQ, Fertig N, Medsger TA, Jr., Wright TM. Correlation of serum anti-DNA topoisomerase I

antibody levels with disease severity and activity in systemic sclerosis. Arthritis and rheumatism.

2003;48(5):1363-73. Epub 2003/05/15.

18. Perera A, Fertig N, Lucas M, Rodriguez-Reyna TS, Hu P, Steen VD, et al. Clinical subsets, skin

thickness progression rate, and serum antibody levels in systemic sclerosis patients with anti-

topoisomerase I antibody. Arthritis and rheumatism. 2007;56(8):2740-6. Epub 2007/08/01.

19. Hanke K, Dahnrich C, Bruckner CS, Huscher D, Becker M, Jansen A, et al. Diagnostic value of

anti-topoisomerase I antibodies in a large monocentric cohort. Arthritis research & therapy.

2009;11(1):R28. Epub 2009/02/24.

20. Walker JG, Fritzler MJ. Update on autoantibodies in systemic sclerosis. Current opinion in

rheumatology. 2007;19(6):580-91. Epub 2007/10/06.

21. Nihtyanova SI, Denton CP. OPINION Autoantibodies as predictive tools in systemic sclerosis. Nat

Rev Rheumatol. 2010;6(2):112-6.

22. Senecal JL, Henault J, Raymond Y. The pathogenic role of autoantibodies to nuclear

autoantigens in systemic sclerosis (scleroderma). J Rheumatol. 2005;32(9):1643-9. Epub 2005/09/06.

23. Gabrielli A, Avvedimento EV, Krieg T. Scleroderma. The New England journal of medicine.

2009;360(19):1989-2003. Epub 2009/05/08.

24. Krieg T, Takehara K. Skin disease: a cardinal feature of systemic sclerosis. Rheumatology.

2009;48 Suppl 3:iii14-8. Epub 2009/06/12.

25. LeRoy EC, Medsger TA, Jr. Criteria for the classification of early systemic sclerosis. J Rheumatol.

2001;28(7):1573-6. Epub 2001/07/27.

26. Steen V, Denton CP, Pope JE, Matucci-Cerinic M. Digital ulcers: overt vascular disease in

systemic sclerosis. Rheumatology. 2009;48 Suppl 3:iii19-24. Epub 2009/06/12.

27. Cutolo M, Sulli A, Smith V. Assessing microvascular changes in systemic sclerosis diagnosis and

management. Nat Rev Rheumatol. 2010;6(10):578-87. Epub 2010/08/13.

28. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Subcommittee for

scleroderma criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria

Committee. Arthritis and rheumatism. 1980;23(5):581-90. Epub 1980/05/01.

29. Lonzetti LS, Joyal F, Raynauld JP, Roussin A, Goulet JR, Rich E, et al. Updating the American

College of Rheumatology preliminary classification criteria for systemic sclerosis: addition of severe

nailfold capillaroscopy abnormalities markedly increases the sensitivity for limited scleroderma. Arthritis

and rheumatism. 2001;44(3):735-6.

30. LeRoy EC, Black C, Fleischmajer R, Jablonska S, Krieg T, Medsger TA, Jr., et al. Scleroderma

(systemic sclerosis): classification, subsets and pathogenesis. J Rheumatol. 1988;15(2):202-5. Epub

1988/02/01.

31. Poormoghim H, Lucas M, Fertig N, Medsger TA, Jr. Systemic sclerosis sine scleroderma:

demographic, clinical, and serologic features and survival in forty-eight patients. Arthritis and rheumatism.

2000;43(2):444-51. Epub 2000/02/29.

32. Koenig M, Joyal F, Fritzler MJ, Roussin A, Abrahamowicz M, Boire G, et al. Autoantibodies and

microvascular damage are independent predictive factors for the progression of Raynaud's phenomenon

48

to systemic sclerosis: a twenty-year prospective study of 586 patients, with validation of proposed criteria

for early systemic sclerosis. Arthritis and rheumatism. 2008;58(12):3902-12. Epub 2008/11/28.

33. Bradwell A, Hughes R, Harden E. Atlas of HEp-2 patterns. United Kingdom: The binding site;

2003. 129 p.

34. Reveille JD, Solomon DH, Comm ACRAH. Evidence-based guidelines for the use of immunologic

tests: Anticentromere, Scl-70, and nucleolar antibodies. Arthrit Rheum-Arthr. 2003;49(3):399-412.

35. von Muhlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases.

Seminars in arthritis and rheumatism. 1995;24(5):323-58. Epub 1995/04/01.

36. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al.

Detection of antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence and by solid phase assay.

Autoimmunity reviews. 2011;10(12):801-8. Epub 2011/07/12.

37. Robinson CJ, Balazs T. Drug-induced antinuclear antibodies in the guinea pig. Life sciences.

1982;30(2):199-205. Epub 1982/01/11.

38. de Vlam K, De Keyser F, Verbruggen G, Vandenbossche M, Vanneuville B, D'Haese D, et al.

Detection and identification of antinuclear autoantibodies in the serum of normal blood donors. Clinical

and experimental rheumatology. 1993;11(4):393-7. Epub 1993/07/01.

39. Solomon DH, Kavanaugh AJ, Schur PH, Comm ACRAH. Evidence-based guidelines for the use

of immunologic tests: Antinuclear antibody testing. Arthrit Rheum-Arthr. 2002;47(4):434-44.

40. Sack U, Conrad K, Csernok E, Frank I, Hiepe F, Krieger T, et al. Autoantibody detection using

indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Annals of the New York Academy of Sciences.

2009;1173:166-73. Epub 2009/09/18.

41. Gonzalez DA, Leon AC, Varela AR, Garcia MG, Rahola Mde S, Perez Mdel C, et al. Autoantibody

detection with indirect immunofluorescence on HEp-2 cells: starting serum dilutions for systemic

rheumatic diseases. Immunology letters. 2011;140(1-2):30-5. Epub 2011/06/21.

42. Kumar Y, Bhatia A, Minz RW. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of

connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn Pathol. 2009;4.

43. Peene I, Meheus L, Veys EM, De Keyser F. Detection and identification of antinuclear antibodies

(ANA) in a large and consecutive cohort of serum samples referred for ANA testing. Annals of the

rheumatic diseases. 2001;60(12):1131-6. Epub 2001/11/16.

44. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA. Guidelines for clinical use of

the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arch Pathol Lab

Med. 2000;124(1):71-81.

45. Van Praet JT, Cruyssen BV, Bonroy C, Smith V, Delanghe J, De Keyser F. Validation of a new

screening strategy for anti-extractable nuclear antigen antibodies. Clinical and experimental

rheumatology. 2009;27(6):971-6.

46. Op De Beeck K, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al.

Antinuclear antibody detection by automated multiplex immunoassay in untreated patients at the time of

diagnosis. Autoimmunity reviews. 2012. Epub 2012/03/06.

47. Burtis CA. Fundamentals of clinical chemistry. Sixth edition ed2008 2008.

49

48. Emlen W, O'Neill L. Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with

immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arthritis and rheumatism.

1997;40(9):1612-8. Epub 1997/10/27.

49. Russell AS, Johnston C. Relative value of commercial kits for ANA testing. Clinical and

experimental rheumatology. 2003;21(4):477-80. Epub 2003/08/29.

50. Kivity S, Gilburd B, Agmon-Levin N, Carrasco MG, Tzafrir Y, Sofer Y, et al. A novel automated

indirect immunofluorescence autoantibody evaluation. Clinical rheumatology. 2012;31(3):503-9. Epub

2011/11/08.

51. Sack U, Knoechner S, Warschkau H, Pigla U, Emmrich F, Kamprad M. Computer-assisted

classification of HEp-2 immunofluorescence patterns in autoimmune diagnostics. Autoimmunity reviews.

2003;2(5):298-304. Epub 2003/09/11.

52. Koenig M, Dieude M, Senecal JL. Predictive value of antinuclear autoantibodies: The lessons of

the systemic sclerosis autoantibodies. Autoimmunity reviews. 2008;7(8):588-93.

53. Harvey GR, Butts S, Rands AL, Patel Y, McHugh NJ. Clinical and serological associations with

anti-RNA polymerase antibodies in systemic sclerosis. Clinical and experimental immunology.

1999;117(2):395-402. Epub 1999/08/12.

54. Bell S, Krieg T, Meurer M. Antibodies to Ro/SSA detected by ELISA: correlation with clinical

features in systemic scleroderma. The British journal of dermatology. 1989;121(1):35-41. Epub

1989/07/01.

55. Homburger HA. Cascade Testing for Autoantibodies in Connective-Tissue Diseases. Mayo Clin

Proc. 1995;70(2):183-4.

56. Phan TG, Wong RCW, Adelstein S. Autoantibodies to extractable nuclear antigens: Making

detection and interpretation more meaningful. Clin Diagn Lab Immun. 2002;9(1):1-7.

57. PhD-system. CA, USA: Bio-Rad Laboratories, 2007.

58. Peene I, Van Ael W, Vandenbossche M, Vervaet T, Veys E, De Keyser F. Sensitivity of the HEp-

2000 substrate for the detection of anti-SSA/Ro60 antibodies. Clinical rheumatology. 2000;19(4):291-5.

Epub 2000/08/15.

59. Bonroy C, Van Praet J, Smith V, Van Steendam K, Mimori T, Deschepper E, et al. Optimization

and diagnostic performance of a single multiparameter lineblot in the serological workup of systemic

sclerosis. Journal of immunological methods. 2012;379(1-2):53-60. Epub 2012/03/27.

60. Euroimmun Antibodies against systemic sclerosis specific antigens. Test instructions for the

Systemic Sclerose (Nucleoli) Profile EUROLINE (IgG). . Lubeck, Germany: Euroimmuun: Medizinische

labordiagnostica AG., 2010.

61. Zweig MH, Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation

tool in clinical medicine. Clinical chemistry. 1993;39(4):561-77. Epub 1993/04/01.

62. Bossuyt X. Clinical performance characteristics of a laboratory test. A practical approach in the

autoimmune laboratory. Autoimmunity reviews. 2009;8(7):543-8. Epub 2009/02/10.

63. Moor GD. Inleiding tot de biomedische statistiek: Acco 2008.

50

64. Van Praet JT, Van Steendam K, Smith V, De Bruyne G, Mimori T, Bonroy C, et al. Specific anti-

nuclear antibodies in systemic sclerosis patients with and without skin involvement: an extended

methodological approach. Rheumatology. 2011;50(7):1302-9.

65. Bossuyt X, Marien G, Vanderschueren S. A 67-year-old woman with a systemic inflammatory

syndrome and sicca. Clinical chemistry. 2010;56(9):1508-9. Epub 2010/08/31.

URL-lijst:

http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product.htm (05-04-2012)

http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm (10-05-2012)

http://www.dermis.net/dermisroot/en/39210/image.htm (03-05-2012)

http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm (13-05-

2012)

http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm (13-05-2012)

http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=aak_gegen_zellkerne_ana&L=1 (13-05-2012)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery.htm (16-

05-2012)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-

and-specifications.htm (17-05-2012)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-

features-of-Zenit-G-Sight.htm (16-05-2012)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-

autoimmune-disorder-diagnostics.htm (16-05-2012)

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-

Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm (16-05-2012)

http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf. (07-04-2012)

http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/a250/public_html/theorie.shtml (11-05-2012)

http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm (03-05-2012)

http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html (10-05-2012)

http://www3.bio-rad.com/B2B/BioRad/product

http://coo.erasmusmc.nl/Atlas_Microscopie/1-1-3.htm

http://www.dermis.net/dermisroot/en/39210/image.htm

http://www.euroimmunus.com/our-products/automation-processes/euroblotmaster.htm

http://www.euroimmun.de/index.php?id=euroline_automatisierung&L=1.htm

http://www.immunfluoreszenz.de/index.php?id=aak_gegen_zellkerne_ana&L=1

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Photo-Gallery

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-and-specifications.htm

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Technical-features-and-specifications.htm

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-features-of-Zenit-G-Sight

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/What-are-the-key-features-of-Zenit-G-Sight

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-autoimmune-disorder-diagnostics

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-automate-IIF-for-autoimmune-disorder-diagnostics

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm

http://www.menarinidiagnostics.com/Products/Autoimmunity/Zenit-G-Sight/Why-choose-Zenit-G-Sight-over-a-classical-cell-based-IIF-assay.htm

http://www.rheumatology.org/practice/clinical/position/ana_position_stmt.pdf

http://telescript.denayer.wenk.be/2008-09/a250/public_html/theorie.shtml

http://www.umm.edu/patiented/articles/000541.htm

http://www.utoledo.edu/corelabs/amic/fluorescence.html

BIJLAGEN

BIJLAGE 1: DISCORDANTIES TUSSEN HET ANA IIF RESULTAAT

(POSITIEF/NEGATIEF) BEKOMEN MET DE ZENIT G-SIGHT ZONDER EN MET

BIJSTURING

Tabel 1: Stalen die positief werden geïnterpreteerd door de Zenit G-sight en negatief na

bijsturing (Zie volgende drie pagina’s voor vervolg Tabel 1):

Subset Staal Volgn° Patroon(*) Titer(*) Index

(1:40)

Reden

aSSc FK0610325 93 Nucleolair 1:1280 66.76 Cytoplasmatische aankleuring

aSSc NL250572 83 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2601 426 Geen patroon

1:40 14.27 Zwak staal

bHD 2622 436 / / 7.23 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)



bHD 2640

443 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2679 447 / / 6.01 Zwak staal


1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)


1:80 9.11 Cytoplasmatische aankleuring


1:40 11.45 zwak staal



bHD 2820

498 / / 7.23 Cytoplasmatische aankleuring

bHD 2826

501 Geen patroon


bHD 2838 504 / / 7.23 Zwak staal



bHD 2901 510 / / 7.23 Zwak staal



bHD 2921 516 / / 7.23 cytoplasmatisch

bHD 3001 520 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2998 521 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2997

522 Geen patroon


bHD 2974 527 / / 6.44 Cytoplasmatische aankleuring



bHD 2949

533 Geen patroon




bHD 2923

542 Geen patroon


bHD 2910

546 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2811 552 / / 6.01 Zwak staal

bHD 2806 554 / / 7.23 Zwak staal

bHD 2795

559 Geen patroon


bHD 2794

560 Geen patroon






bHD 2769

564 Geen patroon






bHD 2727

576 Geen 1:40 13.40 Cytoplasmatische

patroon aankleuring



cDC 52287

203 Geen patroon


cDC 52349 206 Geen patroon



1:40

37.01 Cytoplasmatische aankleuring + aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)




1:40 17.51

Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)








1:40 9.11

Zwak staal




1:40 28.36

Cytoplasmatische aankleuring

cDC 53359 251 / / 7.23 Aspecifieke fluorescentie (vuil op plaatje)



cDC 53904

266 / / 7.23 Zwak staal

cDC 54015 268 Nucleolair 1:40 9.11

Zwak staal

cDC 54060 271 / / 6.01 Zwak staal



cDC 54708 278 / / 7.23 Zwak staal

cDC 54787

279 Geen patroon












cDC 57019 318 / / 7.23 Zwak staal

cDC 57224

322 Geen patroon






cDC 57680 330 Geen

patroon 1:40 11.45 Aspecifieke fluorescentie

(vuil op plaatje)

cDC 58455 335 / / 7.23 Zwak staal



cDC 090826-2420

421 Geen patroon




cDC: disease controls, (*) Patroon en titer op basis van

Zenit G-sight zonder bijsturing. De stalen zonder patroon en titer zijn positief bij een cut-off op de PI ≥6, maar negatief bij een cut-off op de PI ≥8.

Tabel 2: Stalen die negatief werden geïnterpreteerd door de Zenit G-sight en positief na

bijsturing:

Subset Staal Volgn° Patroon(*) Titer(*) Index (1:40)

Reden

aSSc LP240171 99

Centromeer+Nucleolair

>1:2560

4.73

Toenemende index i.f.v. dilutiereeks

SSc RVH060837 90 Centromeer 1:40 2.12 Zwak staal

bHD 2818 497 SSA 1:80 2.12 Zwak staal

bHD 2842 506 Nucleolair 1:40 5.99 Zwak staal

bHD 2989 524 Nucleolair 1:80 5.99 Zwak staal

bHD 2815 551 Homogeen+Nucleolair


bHD 2730 575 Gespikkeld 1:40 5.99 Zwak staal

cDC 52578 220 Nucleolair 1:80 5.99 Zwak staal

cDC 52679 224 Homogeen 1:40 2.81

Zwak staal



cDC: disease controls, (*) Patroon en titer op basis van

Zenit G-sight met bijsturing.

BIJLAGE 2: LEZINGEN

Lezing 1: Improving adherence. From research to policy to practice. (Professor Nick

Barber, UCL School of Pharmacy) (1-3) (cfr. http://www.cppe.ac.uk/nms.htm)

Onderzoek heeft aangetoond dat medicatiefouten verantwoordelijk zijn voor ongeveer

vijf percent (is ook de prevalentie van kanker!) van de ziekenhuisopnames. Deze

medicatiefouten ontstaan op verschillende stadia o.a. bij het voorschrijven van

medicatie door de arts die druk bezig is met de diagnose waardoor er onvoldoende tijd

wordt gemaakt voor advies- en informatieverstrekking over medicatie aan de patiënt.

Een ander grote oorzaak van schade door medicatie is de slechte therapietrouw (33-

50%). De aanpak hiervan is afhankelijk van de soort ‘therapie-ontrouw’ (intentioneel

versus niet-intentioneel). Hierbij moet respectievelijk, het gedrag van de patiënt t.o.v.

medicatie veranderd worden en de oorzaak van het niet innemen van de medicatie

achterhaald worden. Verandering (om problemen door medicatie op te lossen) kan pas

gebeuren nadat de regering overtuigd wordt en overeenstemt. NMS (New Medicine

service) is een kosten effectieve interventie dat werd geïntroduceerd in Engeland vanaf

1 oktober 2011. Hier lossen opgeleide apothekers heel wat problemen op i.v.m.

medicatie (o.a. ↑therapietrouw, ↓medicatie-verspilling, ↓ziekenhuisopnames door

bijwerkingen van medicijnen,...). Mijn eigen visie: Apothekers kunnen met een juiste

aanpak bijdragen in een heel belangrijk aspect van de gezondheid van hun patiënten

en dat is het verbeteren van de therapietrouw.

Lezing 2: Acces to quality medicines in resources limited setting. The role and

challenges of a humanitarian pharmacist. (Raffaella Ravinetto, Benedetta

Schiavetti)(4) (cfr.http://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/en/index.html)

Biljoenen mensen in lage- en middenlage inkomstenlanden (vnl. Afrika en India),

hebben geen toegang tot essentiële medicatie. In de privésector zijn generica nog veel

duurder dan in de publieke sector. Een lijst met de essentiële medicijnen die werkzaam,

veilig, kwaliteitsvol, kosten- effectief, beschikbaar en betaalbaar moeten zijn werd

opgesteld. Een tekort aan kwaliteitsvolle producten kan leiden tot onderdosering,

contaminatie, slechte biologische beschikbaarheid en stabiliteit,…Naast

beschikbaarheid en goede kwaliteit van medicijnen is opslag, distributie en transport

ook heel belangrijk. Er is een tekort aan menselijke, technische en financiële bronnen

om alle taken van de medicatie regulerende autoriteiten uit te voeren. Zo wordt ook

weinig onderzoek uitgevoerd voor ziekten die zeldzaam zijn in de welvaartslanden,

maar in grote mate aanwezig in ontwikkelingslanden (vb. slaapziekte). Mijn eigen visie:

Apothekers kunnen een belangrijke rol spelen in het helpen toegankelijk maken van

medicatie in ontwikkelingslanden en bijgevolg bijdragen tot de volksgezondheid in deze

landen.

Lezing 3: Counterfeit medicines: Pfizer Forensic Laboratories-EMEA Region.

(Wendy Greenall, Senior Chemist/Counterfeit Medicines Laboratory Manager) (cfr.

http://www.pfizer.co.uk)

Vervalst geneesmiddelen (verschillende indicaties vb. Viagra, Lipitor, Ponstan,...) zijn

fysisch heel moeilijk te onderscheiden van de echte producten en bevatten al dan niet

dezelfde actief bestanddeel (sommigen bevatten enkel lactose, talk,…). Vervalste

geneesmiddelen zijn gemakkelijk te produceren en te verdelen (vb. via het Internet) en

geven bovendien een hoge winst. Bijgevolg komen ze frequent voor. Ze worden bereid

in onhygiënische omstandigheden en soms worden er schadelijke producten

toegevoegd om het te doen lijken op het echte product. Pfizer’s laboratoria (gevestigd in

Amerika, UK en Azië), ontvangen stalen van overal in de wereld. Deze laboratoria

gebruiken verschillende analytische testen om de dosering en de samenstelling te

bepalen (o.a. X-straal diffractie, HPLC, Gaschromatografie, de TruScan®). Hiernaast

worden de geneesmiddelen visueel geëvalueerd (spelfouten op verpakking, vuilheid,

slijtage, uniformiteit van vorm, grootte, kleur,…). Pfizer geeft een donker blauwe logo

aan de echte producten, dat om de 2 jaar verandert. Mijn eigen visie: Pfizer Forensic

Laboratoria die de echtheid van medicatie controleren zijn onmisbaar om de

volksgezondheid te beschermen tegen vervalste geneesmiddelen.

Lezing 4: Application of Antibodies in the Analysis of Drugs, Disease Markers,

Bacteria and Toxins. (Richard O’ Kennedy, Prof. Biological sciences, School of

Biotechnology and Deputy Director/ Biomedical Diagnostics Institute, Dublin City

University, Ireland) (5)

Antilichamen zijn immunoglobulinen die heel goed opgebouwd zijn voor hun functies.

Verschillende soorten (polyclonaal, monoclonaal en recombinant) antilichamen met

verschillende eigenschappen (specificiteit, stabiliteit, beschikbaarheid, affiniteit,…)

worden geproduceerd. Hierna gebeurt een selectie van antilichamen met de gewenste

eigenschappen en karakterisatie a.h.v. de ‘Six-s’ (‘Specificiteit, Sensitiviteit, Sources,

Selectie, Screening en Sensing’). Kwantificatie van vele ziektemerkers (vb. cardiaal

troponine-I voor cardiovasculaire ziektes) gebeurt m.b.v. antilichaamtesten waarbij

ziektemerker-antilichaam interactie omgezet wordt tot een kwantitatief signaal.

Hiernaast hebben antilichaamtesten vele andere toepassingen zoals het opsporen van

heroïne in speeksel (test duurt lang, vandaar de nood aan een snellere en meer

specifieke test). Bij detectie van Listeria Monocytogenes is men ook op zoek naar een

snellere en meer specifieke test m.b.v. antilichamen gelabeld met kwantum dots

(ELISA) en gericht tegen een virulent proteïne van de bacterie. Mijn eigen visie:

Antilichamen zijn heel gebruikelijk omdat ze kunnen gewijzigd worden naargelang de

gewenste eigenschappen. Ze worden meer en meer gebruikt voor verschillende

toepassingen.

REFERENTIELIJST BIJLAGE 2:

1. Clifford S, Barber N, Elliott R, Hartley E, Horne R. Patient-centred advice is effective in improving

adherence to medicines. Pharm World Sci. 2006;28(3):165-70.

2. Clifford S, Barber N, Horne R. Understanding different beliefs held by adherers, unintentional

nonadherers, and intentional nonadherers: application of the Necessity-Concerns Framework. Journal of

psychosomatic research. 2008;64(1):41-6. Epub 2007/12/26.

3. Dean B, Barber N, van Ackere A, Gallivan S. Can simulation be used to reduce errors in health

care delivery? The hospital drug distribution system. Journal of health services research & policy.

2001;6(1):32-7. Epub 2001/02/24.

4. Navarro V. The world situation and WHO. Lancet. 2004;363(9417):1321-3.

5. Conroy PJ, Hearty S, Leonard P, O'Kennedy RJ. Antibody production, design and use for

biosensor-based applications. Semin Cell Dev Biol. 2009;20(1):10-26.

URL-lijst:

http://www.cppe.ac.uk/nms.htm (24-02-2012)

http://www.pfizer.co.uk.htm (15-03-2012)

http://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/en/index.html (01-03-2012)

http://www.cppe.ac.uk/nms

http://www.pfizer.co.uk.htm/

http://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/en/index.html

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE...

Documents

Transcript of UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE...