UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE...

of 77 /77
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2011-2012 Optimalisatie van de radiosynthese van [ 11 C]- raclopride en kwaliteitscontrole volgens de normen van de Europese Farmacopee Dieter DE MEESTERE Eerste master farmaceutische zorg Promotor Prof. Dr. Apr. F. De Vos Commissarissen Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer Dr. K. Kersemans

Transcript of UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Farmaceutische Analyse

Laboratorium voor Radiofarmacie

Academiejaar 2011-2012

Optimalisatie van de radiosynthese van [11C]-raclopride en kwaliteitscontrole volgens de normen

van de Europese Farmacopee

Dieter DE MEESTERE Eerste master farmaceutische zorg

Promotor

Prof. Dr. Apr. F. De Vos

Commissarissen

Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Dr. K. Kersemans

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Farmaceutische Analyse

Laboratorium voor Radiofarmacie

Academiejaar 2011-2012

Optimalisatie van de radiosynthese van [11C]-raclopride en kwaliteitscontrole volgens de normen

van de Europese Farmacopee

Dieter DE MEESTERE Eerste master farmaceutische zorg

Promotor

Prof. Dr. Apr. F. De Vos

Commissarissen

Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Dr. K. Kersemans

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

23 mei 2012

Promotor Auteur

Prof. Dr. Apr. F. De Vos Dieter De Meestere

SAMENVATTING

Deze onderzoeksstage heeft als doel het optimaliseren van de radiosynthese van [11C]-

raclopride. [11C]-raclopride is een, met de β+-straler 11C gelabelde, reversibele dopamine D2-

receptor antagonist en wordt gebruikt als radiotracer bij PET-scanning. Dit [11C]-raclopride

treedt in competitie met het endogeen dopamine in bepaalde delen van de hersenen, ter hoogte

van de D2-receptoren. Het verschil in bindingspotentiaal van [11C]-raclopride kan in de D2-

receptor rijke regio’s (bv. striatum) goed in beeld gebracht worden en is bijgevolg nuttig om

verstoringen in de dopaminebalans te monitoren bij verschillende pathologieën in het

dopaminerg systeem.

Het [11C]-isotoop wordt, via een 14N (p,α) nucleaire reactie, met behulp van een

cyclotron deeltjesversneller, onder de vorm van [11C]-CH4, geproduceerd. Dit [11C]-CH4 wordt

doorgestuurd naar de synthesemodule die zich in een hot cell bevindt. Daar reageert het [11C]-

CH4 via een radicalaire reactie bij 600 °C met I2, tot [11C]-CH3I. Dit wordt op zijn beurt over

een AgOTf-kolom gestuurd, waar het reageert tot [11C]-CH3OTf. Doordat het triflaat een

bijzonder goede leaving group is, zal het via een SN-2 reactie in aceton reageren met de

nuceofiele hydroxylgroep van O-DMR tot [11C]-raclopride. Dit [11C]-raclopride wordt via

reversed phase HPLC uit het reactiemengsel opgezuiverd.

Tijdens deze onderzoeksstage is het opzuiveringsproces geoptimaliseerd door gebruik

te maken van een base deactivated HPLC kolom, waarbij [11C]-raclopride voor zijn precursor

elueert. Dit levert een betrekkelijke tijdwinst op van om en bij de 5 minuten. Dit is relatief

veel aangezien de totale radiosynthese slechts 28 minuten duurt en het halfleven van 11C

20,38 minuten bedraagt. Een andere mogelijke optimalisatie is gesitueerd ter hoogte van de

omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf in de triflaatkolom. Het testen van verschillende

samenstellingen van deze kolom levert echter weinig verschil in rendement op. Ook worden

verschillende loopvolumes voor de HPLC-opzuivering getest.

De Europese Farmacopee 7.2 standaarden leggen enkele kwaliteitseisen op voor het

eindproduct dat [11C]-raclopride bevat. De oplossing moet steriel en pyrogeenvrij zijn en moet

een hoge specifieke activiteit, radiochemische en radionuclidische zuiverheid hebben en de

identiteit moet bevestigd worden. Verder mag het ook geen residueel aceton bevatten en moet

het een geschikte pH hebben om intraveneus geïnjecteerd te mogen worden bij patiënten.

Dankwoord

Mijn dank gaat uit naar mijn promotor Prof. Dr. Apr. F. De Vos om het mogelijk te maken deze masterproef uit te voeren in het labo Radiofarmacie.

In het bijzonder bedank ik Nick Van Laeken voor de constructieve begeleiding en de aangename werksfeer tijdens de vele uren in de cyclotronafdeling van het UZ Gent.

Een woordje van dank gaat uit naar Johan Sambre en Dr. K. Kersemans voor hun vakkennis en behulpzaamheid.

Ook bedank ik mijn ouders en broer voor de steun en motivatie tijdens mijn onderzoeksstage.

Tenslotte wil ik mijn vriendin bedanken om er altijd te zijn voor mij.

INHOUDSTAFEL

1 INLEIDING ....................................................................................................................... 1 1.1 HET DOPAMINERG SYSTEEM ............................................................................... 1

1.1.1 Dopamine ............................................................................................................ 1 1.1.2 Dopaminerge receptoren ................................................................................... 2 1.1.3 Aandoeningen gerelateerd aan de dopamine D2-receptor .............................. 4

1.1.3.1 De ziekte van Parkinson ................................................................................... 4 1.1.3.2 Schizofrenie ...................................................................................................... 4 1.1.3.3 Chorea van Huntington ..................................................................................... 4 1.1.3.4 Myoclonus dystonia .......................................................................................... 5

1.2 [11C]-RACLOPRIDE ................................................................................................... 5 1.2.1 Algemeen ............................................................................................................. 5 1.2.2 Gebruik van [11C]-raclopride ............................................................................ 5

1.3 POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY ................................................................. 7 2 OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 11 3 MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................ 12

3.1 CYCLOTRON: PRODUCTIE VAN 11C .................................................................. 12 3.2 MODULE VOOR DE RADIOSYNTHESE VAN [11C]-RACLOPRIDE ................ 14

3.2.1 Productie van [11C]-CH3I uit [11C]-CH4 ......................................................... 16 3.2.1.1 De ‘natte’-methode ......................................................................................... 16 3.2.1.2 De ‘gas fase’-methode .................................................................................... 16

3.2.2 Productie van [11C]-CH3OTf uit [11C]-CH3I .................................................. 17 3.2.3 Productie van [11C]-raclopride ........................................................................ 18

3.3 HPLC OPZUIVERING VAN [11C]-RACLOPRIDE ................................................ 19

3.3.1 Mobiele fase ...................................................................................................... 20 3.3.2 Loop en injector ................................................................................................ 20 3.3.3 Pomp .................................................................................................................. 21 3.3.4 Kolom ................................................................................................................ 21

3.3.4.1 Semi –preparatieve kolom .............................................................................. 21 3.3.4.2 Analytische kolom .......................................................................................... 21

3.3.5 Detector ............................................................................................................. 22 3.3.5.1 Ultraviolet/visible light ................................................................................... 22 3.3.5.2 Radioactiviteitsdetectoren .............................................................................. 23

3.3.6 Integrator .......................................................................................................... 24 3.4 KWALITEITSCONTROLE ...................................................................................... 24

3.4.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide .................. 25 3.4.1.1 Meting van het halfleven ................................................................................ 25 3.4.1.2 Meting van het gamma-spectrum ................................................................... 25

3.4.2 Kwaliteit van de opzuivering door analytische HPLC ................................. 27 3.4.2.1 System Suitability Test (SST) ........................................................................ 28 3.4.2.2 Identiteit .......................................................................................................... 28 3.4.2.3 Chemische zuiverheid ..................................................................................... 28 3.4.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP) ................................................................. 28 3.4.2.5 Specifieke activiteit ........................................................................................ 29

3.4.3 Farmaceutische kwaliteit ................................................................................. 29 3.4.3.1 pH meting ....................................................................................................... 29 3.4.3.2 Controle op residuele solventen via GC ......................................................... 29 3.4.3.3 Endotoxinetest ................................................................................................ 31 3.4.3.4 Steriliteitstesten .............................................................................................. 32

4 RESULTATEN EN DISCUSSIE ................................................................................... 33 4.1 OPTIMALISATIE VAN DE OPBRENGST ............................................................ 33

4.1.1 Optimalisatie van de omzetting [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf ................. 33 4.1.2 Testen van verschillende loopvolumes ............................................................ 35

4.2 OPTIMALISATIE VAN DE OPZUIVERING ......................................................... 37 4.2.1 Analytische C18-kolom ..................................................................................... 37 4.2.2 Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom .......................... 38

4.2.2.1 'Koude' testen .................................................................................................. 38 4.2.2.2 'Warme' testen ................................................................................................. 40

4.3 KWALITEITSCONTROLE ...................................................................................... 42 4.3.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide .................. 42

4.3.1.1 Meting van het halfleven ................................................................................ 42 4.3.1.2 Meting van het gamma-spectrum ................................................................... 42

4.3.2 Kwaltiteit van de opzuivering door analytische HPLC ................................ 43 4.3.2.1 System Suitability Test (SST) ........................................................................ 43 4.3.2.2 Identiteit .......................................................................................................... 44 4.3.2.3 Chemische zuiverheid ..................................................................................... 44 4.3.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP) ................................................................. 45 4.3.2.5 Specifieke activiteit ........................................................................................ 45

4.3.3 Farmaceutische kwaliteit ................................................................................. 45 4.3.3.1 pH meting ....................................................................................................... 45 4.3.3.2 Controle op residuele solventen via GC ......................................................... 46

4.3.3.3 Endotoxinetest ................................................................................................ 47 4.3.3.4 Steriliteitstesten .............................................................................................. 49

5 CONCLUSIE ................................................................................................................... 50

6 LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 51

6.1 LITERATUUR .......................................................................................................... 51 6.2 INTERNETBRONNEN ............................................................................................ 54

LIJST MET AFKORTINGEN

[11C]-CH3OTf [11C]-methyltriflaat

[11C]-CH3I [11C]-methyliodide

AADC L-aminozuur decarboxylase

AC adenylaatcyclase

ADH aldehydedehydrogenase

BGO bismuthgermanaat

Bp bindingspotentiaal

Bq becquerel

C concentratie

ATP adenosine-5’-trifosfaat

cAMP cyclisch adenosinemonofosfaat

COMT catechol-O-methyltransferase

CT computer tomografie

DMF dimethylformamide

DMSO dimethylsulfoxide

DNA desoxyribonucleic acid

FDG 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose

FID flame ionization detector

FLT fluorothymidine

GSO gadolinium oxyorthosilicate

GPCRs G-proteïne gekoppelde receptoren

HPLC high performance liquid chromatography

ID interne diameter

IU international unit

IV intraveneus

keV kilo elektronvolt

L lengte

LAF laminaire air flow

LAL limulus amoebocyt lysaat

L-DOPA 3,4-dihydroxyfenylalanine

LoD limit of detection

LOR line of response

LoQ limit of quantification

LSO lutetium orthosilicate

MAO monoamineoxidase

NBP 4-(4-nitrobenzyl)pyridine

O-DMR S-(+)-O-desmethylraclopride

PET positron emission tomography

PIN p-intrinsic-n

PMT photon multiplier tube

QC quality control

R resolutie

RCP radiochemical purity

RSD relatieve standaarddeviatie

SD standaarddeviatie

SOP standard operating procedure

SST system suitability test

TBAOH tetrabutylammonium hydroxide

TEA triethylamine

tR retentietijd

UV ultraviolet

Inleiding

1

1 INLEIDING

1.1 HET DOPAMINERG SYSTEEM

Dopamine is een belangrijke neurotransmitter in het menselijk lichaam en is cruciaal

voor het functioneren van neurologische processen in het centraal en perifeer zenuwstelsel.

Het wordt al sinds zijn ontdekking in verband gebracht met het moduleren van het cognitief

vermogen en motorische activiteit. Dopamine medieert deels de endocriene secreties in de

perifere stelsels en speelt verder ook een kritische rol bij emotie, motivatie, verslaving en

diverse pathologische aandoeningen (Cumming, 2009).

1.1.1 Dopamine

Figuur 1.1: Dopamine (Le Foll et al., 2009).

Dopamine of 2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethylamine (Figuur 1.1) is een catecholamine, in

het bijzonder een monoamine. Het bezit één basische aminegroep (pKb=4,95) en twee

fenolgroepen (pKa=10,60 en 12,05). Het is een relatief polaire verbinding (log P=-2,36), die

bovendien oxidatiegevoelig is.

Dopamine wordt in het lichaam gesynthetiseerd vanuit L-tyrosine, afkomstig van het

aminozuur L-fenylalanine. Dit L-tyrosine wordt eerst omgezet tot L-DOPA door tyrosine 3-

hydroxylase en daarna wordt vanuit L-DOPA, via het aromatisch L-aminozuur decarboxylase

(AADC), dopamine gevormd. De hydroxylatie tot L-DOPA is de snelheidsbepalende stap bij

de biosynthese vanuit L-tyrosine. Dopamine wordt intracellulair opgeslagen in vesikels in de

zenuwcel (Figuur 1.2), die bij een zenuwimpuls versmelten met het presynaptisch membraan

waardoor de neurotransmitter in de synaps terecht komt. Vervolgens kan dopamine zijn effect

uitoefenen op een dopamine receptor (Le Foll et al., 2009; Winlow en Markstein, 1986).

De voornaamste enzymen die verantwoordelijk zijn voor de metabolisatie van

dopamine zijn het cytoplasmatisch en synaptisch catechol-O-methyltransferase (COMT),

monoamineoxidase A en B (MAO A en B), die geassocieerd zijn met het buitenste

mitochondriaal membraan, en aldehydedehydrogenase (ADH) (Okada et al., 2010).

Inleiding

2

1.1.2 Dopaminerge receptoren

Vijf belangrijke subtypes dopamine receptoren zijn gekarakteriseerd en worden

opgedeeld in twee klassen, namelijk de D1-like (D1, D5) en de D2-like (D2, D3, D4)

receptoren. Deze indeling wordt hoofdzakelijk gemaakt op basis van het

signaaltransductiesysteem van de receptoren (Jaber et al., 1996).

Alle dopamine receptoren zijn G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs). Hierbij

wordt de signaaltransductie gemedieerd door het guanosinemonofosfaat (GMP)-bindend

proteïne (G-proteïne). Deze superfamilie van receptoren wordt ook wel de 7-

transmembranaire receptoren genoemd omdat ze het celmembraan 7 maal doorkruisen.

Figuur 1.2: Dopaminerg neuron en synaps: (1) syntheseweg dopamine vanuit L-

tyrosine; (2) transport en opslag; (3) exocytose dopamine; (4) binding op de D2-like of

D1-like receptoren (5) binding op de presynaptische D2-receptoren; (6) heropname van

dopamine door een dopamine transporter; (7) afbraak door enzymes zoals MAO en

COMT.1

De D1-like (D1, D5) en de D2-like (D2, D3, D4) receptoren verschillen vooral in de

koppeling met het adenylaatcyclase. De D1-like receptoren stimuleren het adenylaatcyclase

(AC) via het Gαs–proteïne en dit resulteert in de omzetting van ATP tot cAMP (Gainetdinov

et al., 2004). Dit cAMP bindt aan de regulatoire subeenheden van het proteïnekinase A en 1fhttp://www.psych.ndsu.nodak.edu/mccourt/Psy486/Biochemistry%20and%20Neuropharmacology/synaptic%20transmission%20and%20neuropharmacology.htm

Inleiding

3

activeert de katalytische eenheid van dit enzym. Het is een fosforylase dat verschillende

eiwitten fosforyleert die belangrijk zijn bij de signaaltransductie en genexpressie in de cel. Bij

de D2-like receptoren gebeurt net het omgekeerde. Hier wordt het adenylaatcyclase

geïnhibeerd en wordt minder cAMP gevormd. Er worden dan ook minder proteïnen

gefosforyleerd. G-proteïnen kunnen ook rechtstreekse effecten uitoefenen op Ca2+ en K+

kanalen (Neve et al., 2004).

Een ander verschil is dat D2-receptoren ook presynaptisch, als autoreceptoren, kunnen

fungeren en zo de synthese en vrijstelling van dopamine regelen (Figuur 1.2). Opmerkelijk is

dat dopamine receptoren zich in verschillende toestanden kunnen bevinden. Zo bezit zowel de

post- als presynanaptische D2-receptor een toestand met hoge of lage affiniteit voor dopamine

(Kilbourn et al., 2011).

De belangrijkste dopaminerge banen zijn gelokaliseerd in de middenhersenen

(tegmentum en substantia nigra) en projecteren in het corpus striatum, bestaande uit het

putamen en de nucleus caudatus, en de frontale cortex, die deel uitmaakt van het limbisch

systeem. Het corpus striatum wordt geassocieerd met de motorische activiteit en beloning en

wordt beschouwd als een van de belangrijkste regio’s in het dopaminerg systeem. Het

limbisch systeem op zijn beurt, speelt een rol in verband met emotioneel gedrag. Het effect

van dopamine op zijn receptoren wordt gestopt door heropname via een dopamine transporter

in de presynaptische neuronen en in mindere mate door metabolisatie (COMT, MAO) in de

synaps (Minagar et al., 2010).

Figuur 1.3: Schema van de dopaminerge banen en projecties (Kandel et al., 1991).

Inleiding

4

1.1.3 Aandoeningen gerelateerd aan de dopamine D2-receptor

Toen werd vastgesteld dat dopamine in bepaalde delen van het lichaam (striatum,

longen, urine, glomuscaroticum, pancreas) meer voorkwam dan norepinephrine, werd

aangenomen dat dopamine een fysiologische functie moest hebben en niet louter een

precursormolecule was. Verschillende pathologieën zijn dan ook gerelateerd aan een

onevenwicht of dysfunctie in het dopaminerg systeem (Barbeau et al., 1970).

1.1.3.1 De ziekte van Parkinson

De ziekte van Parkinson is een progressieve neurodegeneratieve aandoening, met als

primaire oorzaak het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra. De ziekte van

Parkinson kan zowel sporadisch als erfelijk ontstaan. De eigenlijke aanleiding tot verlies van

dopaminerge neuronen is onbekend. Momenteel zijn tien genen in verband gebracht met de

aandoening, maar er is verder nog weinig bekend over de erfelijke etiologie (Saiki et al.,

2012). De aanwezigheid van lewy inclusion body's in de dopaminerge neuronen zou

eventueel een factor in de pathologie kunnen zijn. Typische symptomen zijn tremor,

bradykinesie en rigiditeit. Parkinson wordt ook gekenmerkt door niet-motorische symptomen

zoals cognitieve, sensorische en autonome stoornissen. De gedaalde dopamineconcentratie in

het striatum kan in beeld gebracht worden met behulp van radioliganden zoals [11C]-

raclopride (Brooks et al., 2006) (infra). In tegenstelling tot de lage dopamineconcentratie is de

hoeveelheid acetylcholine in het striatum verhoogd.

1.1.3.2 Schizofrenie

Schizofrenie is een neuropsychotische ontwikkelingsstoornis, met een genetische

voorbeschiktheid, die meestal ontstaat tijdens de adolescentie. De aandoening wordt

gekenmerkt door positieve (hallucinaties, wanen) en negatieve (vermindering van psychisch

en sociaal functioneren) symptomen alsook cognitieve tekorten (Freedman et al., 2003).

Momenteel wordt aangenomen dat er een verhoogde synaptische dopamineconcentratie en

upregulatie van postsynaptische D2-receptoren aanwezig is in het striatum. Anderzijds werd er

bij schizofreniepatiënten een verminderde D2-receptor binding in de regio's buiten het

striatum vastgesteld, in bijzonder in de thalamus, wat gerelateerd is aan de sensorische

abnormaliteiten bij schizofrenie (Harrison et al., 2004; Faludi et al., 2011).

1.1.3.3 Chorea van Huntington

Chorea van Huntington is een progressieve neurodegeneratieve aandoening,

Inleiding

5

veroorzaakt door mutaties in het Huntington gen (IT15 gen) en is autosomaal dominant.

Huntington wordt gekarakteriseerd door het ontstaan van choreatische bewegingen, depressie

en dementie op middelbare leeftijd, als gevolg van de destructie van medium spiny neuronen

in het striatum en neuronen in de cortex. Studies met radiotracers toonden aan dat er een

significant verlies is van D1-en D2-receptoren in het striatum (Weeks et al., 1996; Raymond et

al., 2011).

1.1.3.4 Myoclonus dystonia

Myoclonus dystonia is een bewegingsstoornis gekenmerkt door korte ongewilde

spiercontracties en abnormale houding. De ziekte kan zowel autosomaal dominant

overgedragen worden als sporadisch voorkomen. De aandoening wordt hoofdzakelijk

veroorzaakt door een missense of nonsense mutatie in het epsilon-sarcoglycan gen, dat

codeert voor de D2-receptor (Schüle et al., 2004).

1.2 [11C]-RACLOPRIDE

1.2.1 Algemeen

Raclopridej(3,5-dichloro-N-[[(2S)-1-ethyl-2-pyrrolidinyl]methyl]-2-hydroxy-6-

methoxy-benzamide) is een synthetisch benzamide en behoort tot de selectieve D2-receptor

antagonisten. Het bezit net als enkele andere benzamiden antipsychotische eigenschappen.

Het eerste benzamide dat een duidelijke anti-psychotische werking werd toegeschreven was

sulpiride. Raclopride is relatief hydrofiel en daarom goed oplosbaar in waterige solventen. De

log P van raclopride is 3.576 (±0.493). De fenolische hydroxylgroep heeft een pKa van 5.93

(±0,50), terwijl de amidegroep een pKa heeft van 8.97 (±0.50) (scifinder). Bij fysiologische

pH, komt raclopride voor meer dan 96% voor onder de vorm van het zwitterion (Tsai et al.,

1993).

Figuur 1.4: [11C]-raclopride (Iwata et al., 2001).

1.2.2 Gebruik van [11C]-raclopride

Raclopride is niet als antipsychotisch geneesmiddel geregistreerd. De [11C]-gelabelde

Inleiding

6

vorm van raclopride wordt echter wel als diagnostisch radioligand gebruikt. Het bindt

reversibel op de D2-receptoren in het striatum. [11C]-raclopride is namelijk onderhevig aan

competitie met het endogeen dopamine en kan gebruikt worden om veranderingen in de

synaptische dopamineconcentratie, via PET, op een reproduceerbare manier in beeld te

brengen (Farde et al., 1985). De binding van [11C]-raclopride aan de D2-receptor wordt

uitgedrukt via de bindingspotentiaal (BP) (formule 1.1) (Innis et al., 2007).

𝐵𝑃 = Bmax

𝐾D (formule 1.1)

Waarin: BP: bindingspotentiaal

Bmax: concentratie [11C]-raclopride waarbij alle receptoren bezet zijn

KD: dissociatieconstante

Belangrijk is dat raclopride een grote affiniteit bezit voor de D2-receptor en daardoor ook een

hoge Bmax en lage KD heeft, welke ideale eigenschappen zijn voor een radioligand. KD is

omgekeerd evenredig met de affiniteit, terwijl Bmax een maat is voor de receptordensiteit

(Farde et al., 1989). De verhouding van Bmax/KD moet minstens 4 zijn om een PET-opname te

verkrijgen met voldoende contrast (Elsinga et al., 2002). Raclopride gaat weinig aspecifieke

bindingen aan, waardoor het cerebellum, dat bijna geen D2-receptoren bezit, als

referentieregio kan worden gebruikt (Farde et al., 1985).

Aangezien raclopride een vrij hydrofiele molecule is, zal het niet door de membranen

van de zenuwcellen kunnen diffunderen. Het blijft extracellulair aanwezig in de synaps en kan

enkel binden op D2-receptoren op het oppervlak van neuronen (Elsinga et al., 2002). Als er

veel dopamine aanwezig is ter hoogte van de synaptische spleet, dan zullen ook veel D2-

receptoren geoccupeerd zijn. Hierdoor zullen er minder receptoren met [11C]-raclopride

kunnen binden en zal er minder radioactiviteit, ter hoogte van receptorrijke regio’s, gemeten

worden door de detector (Volkow et al., 2009). Daarom is [11C]-raclopride belangrijk bij de

diagnose van pathologieën zoals de ziekte van Parkinson en schizofrenie, waar een verstoorde

dopaminebalans aanwezig is. Door depletie van dopamine in het striatum, zoals bij de ziekte

van Parkinson, zal een hogere bindingspotentiaal van [11C]-raclopride geconstateerd worden

(Ishibashi et al., 2010).

Via de [11C]-raclopride binding op de centrale D2-receptoren kunnen de doeltreffendheid en

neveneffecten van antipsychotica worden nagegaan (Kim et al., 2011). Een ander toepassing

van [11C]-raclopride is het in beeld brengen van de dopaminevrijstelling in het striatum bij

Inleiding

7

injectie van amfetamines, alcohol of andere drugs bij proefdieren (Martinez et al., 2003;

Sullivan et al., 2011).

Figuur 1.5: Links wordt de normale [11C]-raclopridebinding weergegeven, rechts deze

bij een verhoogde dopamine release in de synapsen (Brooks et al., 2003).

1.3 POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY

Positron emission tomography (PET) scanning is een niet-invasieve nucleaire

medische beeldvormingstechniek, die een radioactieve tracer gebruikt om een bepaald

biochemisch proces in het lichaam te onderzoeken en eventueel ziektebeelden te verklaren.

Een PET-onderzoek vereist een kleine hoeveelheid radiotracer, die vervolgens intraveneus

wordt geïnjecteerd en zich via het bloed naar de organen verdeelt. Om de hoeveelheid

radiotracer in een bepaald weefsel te kunnen kwantificeren in verloop van de tijd, is een PET-

camera nodig. Deze is opgebouwd uit verschillende detectorringen, bestaande uit

scintillatiekristallen en elektronenvermenigvuldigaars (PMT's).

Bij PET worden radiotracers met een kort halfleven gebruikt, die positronen uitstralen.

De meest gebruikte radionucliden zijn 11C (T1/2=20,38 min), 13N (T1/2=9,97 min), 15O (T1/2=2

min) en 18F (T1/2=110 min) (Paans et al., 2002). Dit zijn allemaal β+-stralers. Wanneer een

kern β+-verval ondergaat, wordt een proton naar een neutron omgezet. Hierbij worden een

positron (e+) en een neutrinodeeltje uitgestraald (Figuur 1.6). β+-verval komt voor bij isotopen

met een protonenexcedent en vereist een energieoverschot van 1,02 MeV. De energie van het

uitgezonden positron varieert van 0 tot Emax (0,968 MeV) (Wong et al., 1954). Het neutrino (ν)

bezit geen lading of massa maar wel een hoeveelheid energie, afhankelijk van de energie van

het uitgezonden positron (Turkinton et al., 2001; De Vos, 2012).

Inleiding

8

Figuur 1.6: β+-verval (De Vos, 2012).

Positron-emitters hebben een speciale eigenschap, annihilatie genaamd. Een positron

afkomstig van het radionuclide annihileert met een elektron uit de omgeving waarbij twee

fotonen met een energie van 511 keV in een hoek van 180° worden uitgezonden. Een positron

is namelijk een onstabiel deeltje dat, wanneer het zijn kinetische energie verliest, onmiddellijk

intrageert met een negatief geladen elektron. De massa van beide deeltjes wordt hierbij

omgezet naar energie, onder de vorm van twee fotonen (Patton, 1998). Deze fotonen worden

gedetecteerd door een PET-camera en worden in de literatuur vaak als γ-stralen aangeduid,

hoewel ze stricto sensu niet rechtstreeks door de kern worden uitgezonden (Figuur 1.7)

(Turkinton et al., 2001).

Bij detectie van de gamma-stralen, met een PET-camera, worden enkel fotonen gedetecteerd

als deze op eenzelfde tijdstip (5-10 nanoseconden interval) de detector bereiken. Dit wordt

coïncidentie genoemd. Als coïncidentie optreedt, wordt aangenomen dat beide vrijgestelde

fotonen afkomstig zijn van één annihilatie. De lijn tussen de twee detectiepunten wordt ook

wel de Line of Response (LOR) genoemd. Vanuit deze wetenschap kan het punt bepaald

worden waar annihilatie heeft plaatsgevonden (De Vos, 2012; Humm et al, 2003).

Figuur 1.7: Het annihilatiemechanisme (De Vos, 2012).

De eigenlijke radioactiviteitsdetector van een PET-camera is een

scintillatiedetector, waarbij anorganische scintillatiekristallen gebruikt worden. Een PET-

camera bestaat uit verschillende detectorringen, die opgebouwd zijn uit detectorblokken

(Figuur 1.8), die in circuit met elkaar geschakeld zijn (De Vos, 2012). Het principe van deze

detector is gebaseerd op het proces van excitatie en de-excitatie. De kristallen die vroeger veel

Inleiding

9

gebruikt werden bij PET-camera's zijn bismuthgermanaat (BGO) kristallen. Deze hebben

echter het nadeel dat ze een relatief lange dode tijd en een beperkte lichtopbrengst hebben.

Momenteel worden bij de meeste PET-camera’s lutetium oxyorthosilicate (LSO) en

gadolinium oxyorthosilicate (GSO) kristallen gebruikt. Deze bezitten een veel betere

lichtopbrengst en een kortere dode tijd dan de standaard NaI-kristallen (3.4.7.2) en BGO

kristallen. De fotonen, uitgezonden bij annihilatie, zorgen voor excitatie van de atomen in de

kristalroosters. Bij dergelijke roosters bevinden alle elektronen zich in eenzelfde valentieband

en worden ze geëxciteerd naar de conductieband. Bij het terugvallen naar de grondtoestand

zenden deze kristallen fotonen uit in het zichtbare of UV gebied. Deze lichtbundels worden

via het foto-elektrisch effect omgezet tot foto-elektronen die vervolgens versterkt worden aan

de hand van een PMT (Figuur 1.8) (Turkinton et al., 2001).

Een PMT bestaat uit een vacuümbuis met daarin een fotokathode, dynodes en één

anode. Tussen de verschillende dynodes wordt een potentiaalverschil van 50 V aangelegd.

Eerst wordt het invallende foton omgevormd tot een foto-elektron dat vervolgens, ten gevolge

van het spanningsverschil tussen de fotokathode en de eerste dynode, naar de dynode zal

migreren en daardoor versneld zal worden. Door botsingen bij verhoogde snelheid met de

dynodes zullen er nog meer elektronen worden vrijgesteld. Doordat dit proces meerdere

malen na elkaar plaatsvindt, wordt uiteindelijk een groot en meetbaar signaal gecreëerd ter

hoogte van de anode. De PET-camera opstelling bevat meerdere PMT's en alle

detectiesignalen van deze verschillende naast elkaar gelegen PMT's worden verwerkt en via

een matrixsysteem tot een bruikbaar beeld omgevormd (De Vos, 2012; Turkinton et al.,

2001).

Figuur 1.8 : Detectorblok met PMT’s (Paans et al., 2002).

Inleiding

10

PET-scanners kunnen ontworpen worden om een 2D of 3D beeld weer te geven. Om

een bruikbaar beeld te verkrijgen, moeten bepaalde technieken toegepast worden om dit beeld

te reconstrueren. Een veelgebruikte techniek is ‘filtered back’-projectie en ook iteratieve

reconstructie wordt gebruikt.

Door de korte halfwaardetijd van de gebruikte isotopen worden deze meestal ‘in

house’ aangemaakt via een cyclotron. Een PET-scan wordt gebruikelijker wijs gecombineerd

met een CT-scan om het beeld dat met PET bekomen werd, anatomisch te lokaliseren (Humm

et al., 2003). PET heeft veel toepassingen en naargelang het biochemisch proces dat wordt

geobserveerd, wordt een specifieke radiotracer gebruikt. Tijdens de onderzoeksstage wordt

gebruik gemaakt van [11C]-raclopride dat bindt op de striatale D2-receptoren. Een ander

veelgebruikt radioligand is 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG), voor visualisatie van

tumoren. Tumoren hebben een verhoogde glucoseopname, waardoor ook FDG meer

opgenomen wordt. Ook 39-deoxy-39-[18F] fluorothymidine (FLT) dient om tumoren op te

sporen. FLT is een thymidineanaloog en wordt ingebouwd in DNA. Zo wordt de verhoogde

celproliferatie van tumorcellen gevisualiseerd (Phelps et al., 2000).

Objectieven

11

2 OBJECTIEVEN

Deze onderzoeksstage wordt uitgevoerd op basis van twee primaire doelstellingen. Ten eerste

is het de bedoeling om de radiosynthese van [11C]-raclopride in de cyclotronafdeling van het

UZ Gent aan te leren en te optimaliseren. Het tweede doel omvat het aanleren en uitvoeren

van kwaliteitscontroles voor [11C]-raclopride, opgelegd door de Europese Farmacopee 7.2

standaarden.

De twee belangrijkste aspecten bij het optimaliseren van het syntheseproces zijn het verkorten

van de synthesetijd en het verhogen van de opbrengst van [11C]-raclopride.

Een eerste potentiële optimalisatie is gesitueerd ter hoogte van het opzuiveringsproces van het

reactiemengsel. Deze gebeurt tot op heden aan de hand van een hydrofobe C18 analytische

HPLC-kolom. Raclopride elueert via een dergelijke kolom later dan zijn precursormolecule.

De bedoeling tijdens deze onderzoeksstage is om een analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-

100 HPLC kolom te testen, die mogelijks de retentietijden van raclopride en zijn precursor

omkeert. Dit zou een belangrijke tijdswinst kunnen betekenen voor het opzuiveringsproces .

Om een hogere opbrengst aan [11C]-raclopride te bekomen, wordt gestreefd naar een groter

rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf aan de hand van

verschillende samenstellingen en bereidingswijzen van de triflaatkolom in de module. Ook

wordt getracht om smallere pieken te bekomen bij de opzuivering, door loopvolumes bij de

HPLC-injectie te laten variëren. Dit mag echter niet ten koste gaan van de totale hoeveelheid

activiteit die geïnjecteerd wordt.

Het tweede belangrijke luik tijdens deze onderzoeksstage houdt in dat de kwaliteitscontrole

moet voldoen aan de eisen van de Europese Farmacopee 7.2 standaarden. Dit is vooral

belangrijk in functie van bepaalde klinische studies, waar PET-scanning met [11C]-raclopride

als radioligand wordt uitgevoerd.

Tenslotte zal door middel van proefdierexperimenten de invloed van D-amfetamine sulfaat,

agonisten/antagonisten en beloning op de beschikbaarheid/concentratie van dopamine D2

receptoren in het striatum van ratten worden nagegaan, gebruik makend van PET met [11C]-

raclopride als radiotracer.

Materialen en methoden

12

3 MATERIALEN EN METHODEN

3.1 CYCLOTRON: PRODUCTIE VAN 11C

De β+-straler 11C wordt gebruikt om bepaalde liganden zoals raclopride radioactief te

labelen. 11C heeft als voordeel dat het in een molecule ingebouwd kan worden zonder de

chemische eigenschappen te wijzigen, in tegenstelling tot bijvoorbeeld 18F. Het lichaam kan

geen onderscheid maken tussen het 11C en het 12C isotoop. Het is ook een kortlevend isotoop,

hetgeen de stralingsdosis voor de patiënt beperkt.

11C wordt meestal aangemaakt via een 14N (p,α) nucleaire reactie met behulp van een

Cyclone 18/9 cyclotron deeltjesversneller (IBA, Louvain-la-Neuve, België). Bij de 14N (p,α)

nucleaire reactie worden positief geladen protonen gebruikt om een bepaald targetgas te

beschieten. Een cyclotron bestaat uit een vacuüm waarin twee koperen schijven (D's)

geplaatst zijn met daartussen een ionenbron. Deze bestaat uit een waterstofgasstroom, die

langs een gloeidraad wordt gestuurd, waardoor H+ en H- ionen worden gevormd. De ionen

worden onderworpen aan een verticaal homogeen magneetveld en een oscillerend

potentiaalverschil tussen de twee D's. Hierdoor leggen de H- ionen halve cirkels af in de D's

en worden ze telkens versneld in de ruimte tussen deze twee schijven. De straal van de

afgelegde halve cirkels wordt geleidelijk groter tot de H- ionen de rand van de D's bereiken.

Figuur 3.1: Cyclotron deeltjesversneller.3

Eens de H- ionen voldoende kinetische energie hebben, verlaten ze de versneller via

een elektrostatische deflector en worden ze langs een stripper geleid. Een stripper capteert de

elektronen van H- zodat H+ gevormd wordt. Deze versnelde protonen kunnen nu de

3 http://images.yourdictionary.com/cyclotron

Materialen en methoden

13

coulombbarriere van de targetatomen overwinnen, zodat er kernreacties kunnen optreden

wanneer ze in contact komen met het targetgas. De protonen hebben een kinetische energie in

de MeV grootteorde (De Vos, 2012).

Voor de productie van 11C wordt meestal N2-gas als targetgas gebruikt, dat zich onder

verhoogde druk (10 - 12 bar, volume 1 – 4 L) in een konische cilinder bevindt. Een 14N atoom

heeft zeven protonen en zeven neutronen in zijn kern. Als 14N met protonen wordt beschoten,

verwerft het een extra proton. Hierdoor wordt er een α-deeltje afgesplitst, waarna er een

element met zes protonen en vijf neutronen wordt gecreëerd, 11C genaamd (Wuest et al.,

2007). Doordat N2 gas geen koolstof bevat, wordt een grote specifieke radioactiviteit

gerealiseerd.

De radioactieve 11C kan via een cyclotron, vanuit N2-gas, onder twee vormen

geproduceerd worden. 11C kan als [11C]-CO2 vrijgesteld worden, wanneer 0,5-2% O2 wordt

toegevoegd aan het N2-gas. Een andere mogelijkheid is het toevoegen van 5-10% H2 gas.

Onder deze omstandigheden wordt [11C]-CH4 geproduceerd (Elsinga et al., 2002).

Er kunnen ook nevenproducten gevormd worden. Tijdens de productie waarbij

gebruik gemaakt wordt van [11C]-CH4 kan NH3 als nevenproduct bekomen worden. Bij de 11C- productie onder de vorm van 11CO2 , wordt ook deels 13N en 11CO geproduceerd

(Schlyler et al., 2004; De Vos, 2012).

Het syntheseproces voor raclopride, dat tijdens de onderzoeksstage wordt gebruikt,

maakt gebruik van [11C]-CH4 als koolstof-11 bron. Het mengsel dat na bestraling wordt

bekomen, wordt via een heliumstroom naar de hot cell gevoerd. Daar komt [11C]-CH4 in een

spiraal terecht die kan worden ondergedompeld in een beker met vloeibaar argon. Bij de

temperatuur van dit argon (-185,9 °C) zal [11C]-CH4 uitvriezen en N2 niet, want stikstofgas

heeft een lager kookpunt dan [11C]-CH4. Het nevenproduct NH3 wordt vooraf al gecapteerd

via een P2O5-kolom die bij de aanvoer vanuit het cyclotron is geplaatst.

De opbrengst is afhankelijk van de flux en energie van de positief geladen deeltjes, de

werkzame doorsnede en de hoeveelheid targetmateriaal die wordt bestraald. De productie is

optimaal als de energie van de protonen 16 MeV bedraagt (De Vos, 2012; Andersson et al.,

2009)

Materialen en methoden

14

3.2 MODULE VOOR DE RADIOSYNTHESE VAN [11C]-RACLOPRIDE

De module en de bijhorende software, die gebruikt worden voor de radiosynthese van

[11C]-raclopride tijdens de onderzoeksstage, zijn niet commercieel aangemaakt. Het geheel

werd ontworpen door Johan Sambre in de cyclotron-afdeling van het UZ Gent. De

computergestuurde module bevindt zich in een hot cell. Dit is een met lood afgesloten ruimte

die bij onderdruk wordt gehouden en die noodzakelijk is om met relatief hoge radioactiviteit

te werken.

Figuur 3.2 Overzicht programma modulebesturing A: links de heliumkraan en rechts de

gewone perslucht, B: de loop die gekoeld kan worden in vloeibaar argon, C: reactor met

I2, D: Porapak N, P2O5 kolom en AgOTf-kolom, E: reactievial, F: HPLC, G:

opvangflesje H: SEP-PAK (Buiten gebruik).

Voor de synthese moeten enkele stappen ondernomen worden om te controleren of de

module volledig operationeel is. Belangrijk is dat er in totaal vijf lektesten worden uitgevoerd,

zodat geen radioactiviteit geloosd wordt tijdens de radiosynthese. Hierbij worden bepaalde

circuits in het systeem doorlopen en wordt de druk gecontroleerd (zie bijlage 1).

De HPLC-kolom wordt vooraf 20 min voorgespoeld aan 2 mL/min met mobiele fase.

De leiding tussen overloopvial en reactievial, en de vials zelf worden ook gereinigd met

aceton. Achteraan in de module bevindt zich een tedlar opvangzak die als waste fungeert.

Deze moet voor iedere synthese leeggemaakt worden.

Materialen en methoden

15

Tussen de porapak en de triflaatkolom is een P2O5 trap voorzien. P2O5 heeft sterke

hygroscopische eigenschappen en kan daardoor sporen van water capteren.

De reactievial wordt vooraf gevuld met 100 µg precursor en een equimolaire

hoeveelheid NaOH in 200 µl aceton. Het overloopvat wordt gevuld met een bepaald volume

HPLC-buffer. Dit volume is afhankelijk van de HPLC-loop die gebruikt wordt tijdens de

synthese. Vervolgens wordt de reactorbuis opgewarmd, zodat deze tijdig een constante

temperatuur van 600 °C bereikt.

Daarna start de bestraling van de gastarget N2 + 5% H2 met versnelde protonen,

afkomstig van het cyclotron. Voor een volledige synthese wordt 30 min bestraald aan 14 µA.

Hierbij wordt [11C]-CH4 geproduceerd. Het [11C]-methaan wordt getrapt in de loop die op

voorhand gekoeld werd in vloeibaar argon. De loop is gevuld met porapak N 80/100 (Grace,

Deerfield, USA), waarop het [11C]-CH4 kan binden. Ter hoogte van deze loop is er een

radioactiviteitsdetector aanwezig. Als het detectiesignaal daar stabiel is, wordt de spiraal

‘geflushd’. Na 30 seconden wordt de spiraal terug opgewarmd, door deze uit de argon te

halen. Het [11C]-CH4 komt vrij en zal richting de reactor vorderen. Daar wordt [11C]-CH3I

gevormd bij een temperatuur van 600 °C (zie 3.2.1), dat daarna over een sodalime-kolom

wordt gestuurd, waar ongewenst HI wordt gecapteerd. Vervolgens wordt dit [11C]-CH3I

gecapteerd op de kolom gevuld met porapak N 80/100 bij kamertemperatuur, waar ook een

radioactiviteitsdetector geplaatst is. Bij een constant signaal, wordt de porapak N opgewarmd

tot 120 °C zodat [11C]-CH3I wordt vrijgesteld. Hierna reageert het in de zilvertriflaat-kolom

tot [11C]-CH3OTf (zie 3.2.2).

Het gevormde [11C]-CH3OTf wordt opgevangen in de reactievial, waar het reageert

met de precursor van [11C]-raclopride, S-(+)-O-desmethylraclopride. Ter hoogte van de

reactievial is een derde detector aanwezig. Het opvangen wordt gestopt zodra dit signaal

stabiel is en op dat moment wordt er een bepaald volume 0.05 M ammoniumacetaat pH 6

buffer vanuit het overloopvat naar de reactievial gestuurd. Door de gedaalde pH wordt de

reactie gestopt. De detectoren in de hot cell zijn PIN (p-intrinsic-n) fotodiode-detectoren (zie

3.3.5.2).

[11C]-raclopride wordt opgezuiverd uit het reactiemengsel via HPLC (zie 3.3). De

bedoeling is zoveel mogelijk van het mengsel op de loop te kunnen overbrengen en te

injecteren op de HPLC-kolom. Daarna wordt de fractie [11C]-raclopride gecollecteerd in de

reactievial.

Materialen en methoden

16

Figuur 3.3: Signalen van de verschillende radioactiviteitsdetectoren. De blauwe curve is

afkomsig van de detector ter hoogte van de loop. De rose curve representeert het signaal

van de detector bij de porapak N-kolom. Tenslotte staat de groene curve voor het

signaal afkomstig van de detector ter hoogte van de reactievial, die niet gekalibreerd is.

3.2.1 Productie van [11C]-CH3I uit [11C]-CH4

[11C]-Methyliodide kan op verschillende manieren gesynthetiseerd worden. De

bedoeling van deze jodering van [11C]-methaan is om een leaving group te creëren, zodat de

fenolgroep van O-DMR in een SN-2 reactie als nucleofiel kan optreden.

3.2.1.1 De ‘natte’-methode

Deze methode is gebaseerd op de reductie van [11C]-CO2 door LiAlH4 in

tetrahydrofuraan en diethylether (0,05-0,1 M). Hierbij wordt [11C]-CO2 omgezet tot [11C]-

methanol als lithiumzout (Wuest et al., 2007). Vervolgens wordt het solvent uitgedampt en

HI, P2I4 of PPh3I2 toegevoegd met vorming van [11C]-CH3I (Figuur 3.4). Deze methode is

betrouwbaar op vlak van radiochemische opbrengst, maar er bestaat een risico op lage

specifieke activiteit door contaminatie van LiAlH4 met ‘koud’ CO2 en door te grote volumes

(Elsinga et al., 2002; Andersson et al., 2009).

Figuur 3.4: De ‘natte’-methode (Wuest et al., 2007).

3.2.1.2 De ‘gas fase’-methode

Via deze methode wordt [11C]-CH4 naar [11C]-CH3I omgezet via een radicalaire

0 500

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000

0 10 20 30 40 50 60 Activiteit CH4 MeI RV t (min)

Materialen en methoden

17

iodering met iodide-damp bij verhoogde temperatuur (600 °C) (Wuest et al., 2007). Deze

methode is eenvoudiger te construeren en het risico op verlaagde specifieke activiteit wordt

uitgesloten. De omzetting levert normaal slechts een rendement op van 20-30%. Het

gevormde [11C]-CH3I wordt gecapteerd op de porapak N-kolom bij kamertemperatuur. Dit is

een kolom bezet met poreuze polymeren, bestaande uit polystyreen divenylbenzeen. De rest

van het niet gereageerde [11C]-CH4 wordt teruggestuurd via een circuit naar de reactor. Daar

wordt opnieuw een fractie naar [11C]-CH3I omgezet, waardoor het rendement wordt verhoogd

tot maximaal ± 38%. Wanneer de porapak N wordt opgewarmd tot 120 °C komt het

gecapteerde [11C]-CH3I vrij. Er wordt opgewarmd wanneer het signaal van de

radioactiviteitsdetector op de porapak N-kolom constant blijft (Andersson et al., 2009).

Figuur 3.5: Radicalaire iodering [11C]-CH4 (Elsinga et al., 2002).

3.2.2 Productie van [11C]-CH3OTf uit [11C]-CH3I

Tegenwoordig wordt steeds meer geopteerd voor [11C]-methyltriflaat als methyldonor

voor de methylatie van O-DMR. [11C]-CH3OTf heeft verschillende voordelen ten opzichte

van het traditionele [11C]-CH3I. [11C]-methyltriflaat is veel reactiever dan [11C]-CH3I, omwille

van het feit dat triflaat een betere leaving group is in de SN-2 reactie. [11C]-CH3OTf is minder

vluchtig dan [11C]-CH3I en kan daarom minder snel verdampen uit kleine volumes. Ook gaat

de reactie tussen O-DMR en [11C]-CH3OTf door bij kamertemperatuur, terwijl bij [11C]-CH3I

de temperatuur moet worden opgedreven, met een lager rendement tot gevolg. Door de hoge

reactiviteit is er minder O-DMR precursor nodig, wat de kostprijs drukt. Kortom, [11C]-

CH3OTf zorgt voor een grotere radiochemische opbrengst en een korte reactietijd (Wuest et

al., 2007). Het [11C]-CH3I dat vrijkomt van de porapak N-kolom bij 120 °C wordt over een

zilvertriflaat-kolom (Figuur 3.4) bij een temperatuur van 230 °C gestuurd. Deze kolom bestaat

uit een mengsel van actieve koolstof en triflaat, waarbij verschillende verhoudingen mogelijk

zijn (zie 4.1.1). Het is belangrijk dat de kolom afgeschermd is van licht en volledig droog is,

omwille van de reactiviteit van zilvertriflaat met sporen water.

Materialen en methoden

18

Figuur 3.4: Zilvertriflaat.3

3.2.3 Productie van [11C]-raclopride

De reactie waarbij [11C]-raclopride wordt gevormd, uitgaande van [11C]-CH3OTf en

O-DMR, is een SN-2 (nucleofiele substitutie) reactie. De vrije base van O-DMR moet hierbij

gebruikt worden, omdat de tevens commercieel beschikbare zoutvorm O-DMR HBr reageert

met [11C]-CH3OTf tot [11C]-CH3Br. De meest frequent gebruikte solventen zijn DMSO,

DMF, aceton en acetonitrile. Dit zijn allen polaire aprotische solventen, die de

transitietoestand van een SN-2 reactie stabiliseren. Er wordt ook een equimolaire hoeveelheid

base toegevoegd, meestal NaOH of TBAOH. Dit om de fenolgroep te deprotoneren, zodat de

zuurstof negatief geladen wordt en betere nucleofiele eigenschappen krijgt (Langer et al.,

1999).

Figuur 3.5: 11C-methylering van O-DMR (Iwata et al., 2001).

Er bestaan verschillende methoden om de methylatie uit te voeren. Een eerste is de

‘bubbling’-methode. Deze wordt momenteel ook in het cyclotron UZ Gent gebruikt. Hierbij

wordt het gevormde [11C]-CH3OTf in een reactievial geborreld met helium als dragergas.

Deze reactievial bevat 100 µg precursor en een equimolaire hoeveelheid NaOH (Sigma

aldrich, St. Louis, US) in 200 µL aceton (Sigma aldrich, St. Louis, US) (Langer et al., 1999;

Iwata et al, 2001). De reactietijd bedraagt ongeveer 3,5 min, waarna het signaal van de

radioactiviteitsdetector ter hoogte van de reactievial constant is.

Een tweede methode is de ‘on-column’-methode. [11C]-CH3OTf wordt hierbij door

een heel hydrofobe en gedroogde SEP-PAK C18 Plus kolom (Waters Chromatography, Etten-

Leur, Nederland) gestuurd, die geladen wordt met 1-4 µl NaOH-oplossing (1 M) en een 50

µL- 300 µL precursoroplossing (1 mg). De kolom wordt daarna gespoeld met helium en het

3 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/176435?lang=en&region=BE

Materialen en methoden

19

[11C]-CH3OTf wordt erdoor gestuurd. [11C]-CH3OTf reageert met de precursor en wordt

daarna geëlueerd met 1-2 mL aceton.

Als derde mogelijkheid is er de ‘loop’-methode. De precursor (1 mg), opgelost in

NaOH (1 M, 2 µl) bevattend solvent, wordt geïnjecteerd in een PTFE (polytetrafluorethyleen)

-buis (0,75 mm x10-50 mm), die verticaal gepositioneerd is. Deze wordt gespoeld met

heliumgas, zodat er nog 10-130 µL precursoroplossing achterblijft. Het [11C]-CH3OTf wordt

door deze loop gestuurd en reageert met de precursor (Iwata et al., 2001).

De aard van het reactiesolvent kan ook invloed hebben op de opbrengst van de reactie.

Voor de ‘bubbling’-methode wordt aceton als het beste en meest gebruikte reactiesolvent

beschouwd. Bij de ‘on column’-methode is dit echter niet het geval omdat aceton te vluchtig

is. Bij deze methode is het beter om cyclohexanon (CHO) te gebruiken, dat een hoger

kookpunt heeft (Iwata et al, 2001).

Een andere parameter is de hoeveelheid precursor. Als de precursorconcentratie wordt

opgedreven, neemt de radiochemische opbrengst toe. Dit gebeurt echter tot op een bepaalde

hoeveelheid precursor. Er wordt meestal geopteerd om een kleinere hoeveelheid te gebruiken

dan het maximum, omdat de chromatografische scheiding, via een reverse phase kolom, beter

doorgaat als kleinere hoeveelheden staal worden geïnjecteerd. Er moet ook rekening

gehouden worden met het feit dat maximum 10 µg [11C]-raclopride en 1 µg O-DMR mag

worden geïnjecteerd bij patiënten volgens de Europese Farmacopee 7.2 standaarden.

3.3 HPLC OPZUIVERING VAN [11C]-RACLOPRIDE

Nadat de reactie is doorgegaan, moet het gevormde [11C]-raclopride uit het

reactiemengsel geïsoleerd worden. De andere componenten die nog aanwezig zijn in het

mengsel zijn: een hoeveelheid niet-gereageerde precursor, restanten [11C]-CH3I en/of [11C]-

CH3OTf, solventen (aceton) en een base (NaOH). Het doel is zo snel mogelijk de zuivere

fractie [11C]-raclopride te isoleren.

De opzuivering wordt gerealiseerd aan de hand van High Performace Liquid

Chromatography (HPLC). Dit is een chromatografische techniek waarbij een mengsel

gescheiden wordt op basis van de interactie met de stationaire fase gepakt op een kolom.

Hierbij wordt een mobiele fase gebruikt, die met een hoge druk over de kolom gepompt wordt

(Snyder et al., 2003). De stationaire fase kan hydrofiele (normal phase) of hydrofobe

(reversed fase) eigenschappen hebben. Vaak wordt silica, al dan niet gemodificeerd, als

Materialen en methoden

20

stationaire fase gebruikt. Hoe goed het mengsel gescheiden wordt, hangt af van verschillende

factoren. De belangrijkste zijn de samenstelling van de mobiele fase, de eigenschappen van de

stationaire fase, de flow (mL/min), lengte en diameter van de kolom en de pakkingsdichtheid.

De fractie [11C]-raclopride wordt, via twee filters met een poriëngrootte van 0,22 µm, naar

een steriele opvangvial geleid. Deze wordt dan in een loodcontainer geplaatst en kan de de

opvangvial uit de hot-cell genomen worden.

Nadat de opzuivering is doorgegaan, wordt op het af te leveren product een kwaliteitscontrole

uitgevoerd. Hierbij wordt eveneens de HPLC-techniek toegepast om enkele kwaliteitseisen na

te gaan (zie 3.4.2).

3.3.1 Mobiele fase

De mobiele fase die gebruikt wordt bij de HPLC-opzuivering is steriele 0.05 M

ammoniumacetaat buffer/ethanol: 70/30 (V/V) bij pH 6. Het water dat hierbij gebruikt wordt

is water voor injectie (B. Braun Medical, Melsungen, Duitsland). Steriele bereiding in een

LAF (laminair air flow)-kast (klasse 2) is vereist, omdat [11C]-raclopride intraveneus wordt

geïnjecteerd. Tijdens het bereiden van de mobiele fase wordt ook de buffer aangemaakt, die

gebruikt wordt om de reactie tussen O-DMR en [11C]-CH3OTf te beëindigen.

715 µL azijnzuur (Sigma aldrich, St. Louis, US) en 1190 µL ammoniumhydroxide

25% oplossing (Sigma aldrich, St. Louis, US) worden aan een fles van 250 mL water voor

injectie toegevoegd, zodat pH 6 bereikt wordt. 75 mL hiervan wordt op een Millipore express

TM plus filter (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) gebracht die aangesloten is op een

vacuümpomp. Deze filter heeft een poriëngrootte van 0,22 µm en kan alle bacteriën en

virussen tegenhouden. Enkel de pyrogenen kunnen door de filter diffunderen. Het filtraat van

deze 75 mL wordt als buffer gebruikt. Bij de resterende 175 mL wordt 75 mL ethanol

toegevoegd (Chem-Lab, Zedelgem, België) en wordt de pH gecorrigeerd tot pH 6. Dit

mengsel wordt opnieuw op een Millipore express TM plus filter overgebracht. Daarna wordt

het filtraat in een steriele fles overgebracht, waarop een ventilatienaald (BD microlance 3, BD

Medical, Heidelberg, Duitsland) wordt geplaatst, die vervolgens 10 minuten in een

ultrasoonbad wordt ontgast.

3.3.2 Loop en injector

De injectie van het reactiemengsel op een HPLC-loop is een van de meest precaire

Materialen en methoden

21

delen van het syntheseproces om te automatiseren. Een loop wordt gebruikt om een

reproduceerbare hoeveelheid reactiemengsel op de kolom te kunnen injecteren. Bij de

opzuivering wordt een groot loopvolume gebruikt (500-1000 µL) in vergelijking met de

kwaliteitscontrole (20 µL).

3.3.3 Pomp

De pomp gebruikt voor de HPLC-opzuivering tijdens de synthese is een Waters 510

HPLC pomp (Meadows Instrumentation, Bristol, UK).

3.3.4 Kolom

Klassiek wordt bij de opzuivering van [11C]-raclopride reversed phase HPLC

toegepast. Hierbij heeft de stationaire fase apolaire en het eluens polaire eigenschappen. Dit

kan zowel via een semi-preparatieve als een analytische kolom gebeuren.

3.3.4.1 Semi –preparatieve kolom

Vroeger werd een semi-preparatieve kolom gebruikt voor de opzuivering van [11C]-

raclopride. Semi-preparatieve kolommen zijn de link tussen preparatieve en analytische

HPLC en zijn breder en langer dan analytische kolommen, waardoor ze een grotere

staalcapaciteit hebben.4 De kolom die vroeger in de module in het UZ Gent cyclotron werd

gebruikt is een Alltima C18-kolom (Grace, Deerfield, USA). Dit is een reversed phase kolom

waar silanolgroepen van de silica gesubstitueerd zijn met octadecyl groepen. De kolom heeft

een lengte (L) van 250 mm en een interne diameter (ID) van 10 mm en kan gebruikt worden

bij een flow van 5 mL/min.

3.3.4.2 Analytische kolom

Momenteel wordt een analytische reversed phase Alltima C-18 kolom (250 mm x4,6 mm)

(Grace, Deerfield, USA) gebruikt om [11C]-raclopride op te zuiveren uit het reactiemengsel.

De stationaire fase bestaat eveneens uit, met octadecyl gederivatiseerde, silica. Normaal

gezien is de staalcapaciteit voor een dergelijke kolom beperkt. In vele gevallen wordt in de

literatuur daarom een semi-preparatieve C18-kolom gebruikt. Echter wanneer in de praktijk

getest wordt met een analytische C18-kolom, worden alsnog bruikbare chromatogrammen

verkregen. De pieken vertonen wel wat tailing, maar daarvoor wordt gecompenseerd door de

fracties langer op te vangen. In figuur 3.6 is een opzuiveringschromatogram weergegeven.

4 https://www.chem.agilent.com/Library/applications/59801660.pdf

Materialen en methoden

22

Ook worden andere analytische kolommen getest om het opzuiveringsproces te optimaliseren,

waaronder de analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 kolom (zie 4.2).

Figuur 3.6: Chromatogram van de opzuivering van het reactiemengsel van de synthese.

(1) injectiepiek UV-detector en activiteitspiek [11C]-methanol; (2) UV-piek O-DMR en

activiteitspiek [11C]-methyliodide; (3) UV piek raclopride en activiteitspiek [11C]-

raclopride.

3.3.5 Detector

3.3.5.1 Ultraviolet/visible light

[11C]-raclopride en O-DMR bevatten een aromatische ring in hun structuur. Deze

aromatische ring is rijk aan π-elektronen, die in staat zijn om UV-licht te absorberen. De π-

elektronen vertonen een elekronenovergang naar het π* antibindend molecuulorbitaal. De

absorbantie is het omgekeerde van de transmissie en wordt als volgt geformuleerd.5

A = -log(T) (formule 3.1)

T = I/I0 (formule 3.2)

Waarin: I: intensiteit uittredende EMS

I0: intensiteit intredende EMS

T: transmissie

A: absorbantie

Het rechtlijnig verband tussen de absorbantie en de concentratie absorberend

bestanddeel in een oplossing wordt weergegeven door de wet van Lambert-Beer (formule

3.3). 5fhttp://www.plant.uoguelph.ca/research/homepages/raizada/Equipment/RaizadaWeb%20Equipment%20PDFs/5B.%20UV%20VIS%20theory%20ThermoSpectric.pdf

-1000 0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

0 5 10 15 20 HPLC UV Activiteit t (min)

1 2 3

Materialen en methoden

23

A = ε. c. l (formule 3.3)

Waarin: A: absorbantie

c: concentratie absorberende component (mol/L)

l: afgelegde weg licht (cm)

ε: molaire extinctiecoëfficiënt (L/(mol.cm))

Belangrijk is om het absorptiespectrum goed te interpreteren bij het kiezen van de

optimale absorptiegolflengte. Deze wordt zo gekozen dat het verschil in absorptie tussen het

analyt en andere eventueel aanwezige interfererende solventen maximaal is.

Voor raclopride en O-DMR werd dit absorptiespectrum al eerder opgenomen. De

golflengte wordt gekozen zodat zowel raclopride als O-DMR voldoende absorberen. Als er

geen interferentie is van de mobiele fase of solvent, wordt best geopteerd voor een golflengte

van 220 nm. Aceton absorbeert weinig bij 220 nm en is mede daarom een ideaal

reactiesolvent.

De spectrofotometer die gebruikt wordt voor de opzuivering is een Smartline Knauer

UV detector (Knauer, Berlijn, Duitsland). De UV detector maakt gebruik van een

deuteriumlamp als lichtbron. Een deuteriumlamp heeft een continu spectrum, zodat de

gewenste golflengte eenvoudig geselecteerd kan worden. Er wordt een cuvet uit kwarts

gebruikt omdat glas absorbeert in het UV gebied.

3.3.5.2 Radioactiviteitsdetectoren

De radioactiviteitsdetector van het HPLC-systeem in de hot cell is een p-intrinsic-n

(PIN) fotodiode-detector. Deze is opgebouwd uit twee elektroden met daartussen een junctie

bestaande uit een klein kristal (zonder activator), met aan weerszijden semi-geleidend

materiaal. Dit semi-geleidend materiaal bestaat uit p- en n-type regio’s. De n-type regio heeft

een elektronenexcedent, terwijl de p-type regio holes’bezit. Onder invloed van een aangelegd

potentiaalverschil migreren elektronen naar de p-type regio en holes naar de n-type regio en

worden, door de achtergebleven kationen en anionen, depletiezones gevormd. Door

invallende ioniserende straling worden nieuwe holes geproduceerd, die een meetbaar

elektrisch stroomsignaal met zich meebrengen. Dit type detector is wel temperatuurgevoelig.

Hiervoor wordt gecorrigeerd door middel van een klein verwarmelement in de detector,

Materialen en methoden

24

verbonden met een thermokoppel, zodat de temperatuur constant blijft.6

De detector die de activiteit in de opvangvial meet bij de productie van [11C]-raclopride is een

Shaft ionization chamber type 70-130 (Vacutec, Dreesden, Duitsland). Dit is een gasdetector

waarbij een potentiaalverschil van 150 – 200 V is aangelegd tussen twee elektroden, die zich

in een afgesloten meetkamer met argongas bevinden. Tussen deze twee elektroden zal de

invallende straling het gas ioniseren en aanleiding geven tot ionenparen. De ontstane

elektronen en positieve ionen migreren respectievelijk naar de anode en de kathode, wat een

stroompuls oplevert. De intensiteit van de stroompuls is evenredig met de vrijgestelde energie

ten gevolge van de invallende ioniserende straling. Deze energie is afhankelijk van de

activiteit (Bq) en van de energie (eV) van de straling. Een ionisatiekamer heeft een relatief

hoge gevoeligheid voor β+-straling. Hoe groter een ionisatiekamer, hoe gevoeliger die is (De

Vos, 2012).

Figuur 3.7: Ionisatiekamer (De Vos, 2012).

3.3.6 Integrator

Bij de opzuivering wordt geïntegreerd door een computer. Deze zet het signaal van de

detector om in een chromatogram en berekent de hoogte van de verschillende pieken en het

tijdstip waarop deze elueren.

3.4 KWALITEITSCONTROLE

Volgens de Europese farmacopee 7.2 standaarden moet een injectie, die [11C]-raclopride

bevat, voldoen aan bepaalde kwaliteitseisen. Deze kwaliteitscontroles worden allemaal

uitgevoerd op het eindproduct van de synthese, al dan niet voor de vrijgave van het product.

Vooraf moeten alle kwaliteitscontroles reeds uitgevoerd zijn tijdens testsyntheses, vooraleer

de radiotracer voor klinische toepassingen gebruikt mag worden.

6 http://goldbook.iupac.org/P04598.html

Materialen en methoden

25

De kwaliteitscontroles worden uitgevoerd op de onverdunde vorm van het eindproduct. Voor

intraveneuze injecties moet de concentratie ethanol echter gereduceerd worden tot 10%

(V/V). Aangezien het eindproduct momenteel 30% (V/V) ethanol bevat, wordt driemaal

verdund alvorens te injecteren bij een patiënt.

3.4.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide

3.4.1.1 Meting van het halfleven

Om de identiteit van het geproduceerde isotoop van het radiofarmacon te bevestigen

wordt het halfleven (T1/2) ervan bepaald. Deze controle moet voor de vrijgave worden

uitgevoerd.

Het meten van het halfleven van [11C]-raclopride gebeurt met behulp van een Atomlab

100 plus gekalibreerde ionisatiekamer (dosiskalibrator) (Biodex Medical Systems, New York,

USA). De activiteit wordt tweemaal gemeten en het tijdsinterval wordt gechronometreerd.

Aan de hand van deze gegevens en formule 3.4 kan het halfleven van [11C]-raclopride

berekend worden. De T1/2 moet gelegen zijn tussen 19,9-20,9 minuten.

𝑇1/2 = 𝑙𝑛(2)×(𝑇2−𝑇1)ln(𝐴1) −𝑙𝑛(𝐴2)

(formule 3.4)

Waarin: T1/2: Halfleven = halfwaardetijd (min)

T2-T1: tijdsverschil (min)

A1: activiteit bij begin van de meting (MBq)

A2: activiteit bij het einde van de meting (MBq)

3.4.1.2 Meting van het gamma-spectrum

De radionuclidische zuiverheid wordt uitgedrukt als de fractie van de totale

radioactiviteit afkomstig van het gewenste radionuclide. 11C-radioliganden hebben meestal

een hoge radionuclidische zuiverheid omdat de meeste radioactieve nevenproducten ofwel

een zeer korte halfwaardetijd hebben (15O) of geëlimineerd worden tijdens het syntheseproces

(13N onder de vorm van 13N2 of 13NH3). Een hoge radionuclidische zuiverheid is gewenst om

de stralingsbelasting van de patiënt te beperken en de interferentie op de beeldkwaliteit zo

laag mogelijk te houden (De Vos, 2012). Deze kwaliteitscontrole wordt voor de vrijgave van

de [11C]-raclopride oplossing uitgevoerd.

Het gamma-spectrum wordt opgenomen aan de hand van een NaI(Tl)-detector

(Ludlum measurements, Sweetwater, Texas, USA). Deze is geschikt voor het bepalen van de

Materialen en methoden

26

ioniserende straling afkomstig van een radio-isotoop dat β+-verval vertoont. De gamma-

stralen gevormd bij het annihilatiemechanisme (1.3) worden gedetecteerd.

De anorganische scintillatiekristallen zijn zo gerangschikt dat alle atomen eenzelfde

elektronenconfiguratie hebben en de elektronen zich grotendeels in eenzelfde energieniveau

bevinden, namelijk de valentieband. Als er gamma-stralen door deze kristallen worden

gestuurd, dan worden een deel van de elektronen geëxciteerd naar de conductieband. Wanneer

deze terugvallen naar de valentieband worden lichtfotonen uitgezonden. De energie die

vrijkomt, kan ook worden omgezet in thermische bewegingen. Om dit te beperken wordt

thalium aan deze kristallen toegevoegd (activator, doping). Deze thaliumatomen hebben een

lagere conductieband en een hogere valentieband. Wanneer een elektron uit het NaI-kristal

geëxciteerd wordt, zal het niet terugvallen naar zijn valentieband, maar eerst naar de

conductieband van thalium, waarbij thermische energie wordt vrijgesteld. Daarna valt het

elektron terug naar de valentieband van thalium met vrijstelling van een foton. Dit foton is

niet in staat om andere elektronen te exciteren. Dit in tegenstelling tot de hoog energetische

fotonen, bij zuivere NaI-kristallen, die ongewenste excitaties teweeg brengen. Uiteindelijk

valt het elektron terug naar de valentieband van NaI. Om geen interferentie te ondervinden

afkomstig van omgevingslicht wordt de detector omsloten door een laagje lood, waar de

gamma-stralen wel nog door kunnen (De Vos, 2012; Humm et al., 2003).

Figuur 3.8: De bandstructuur van een NaI(Tl)-detector (Humm et al., 2003).

Er zijn drie belangrijke effecten te zien op het spectrum. Ten eerste is er het foto-

elektrisch effect. Hierbij veroorzaken de foto-elektronen, onstaan onder invloed van de

gamma-stralen, een cascade van excitaties en de-excitaties met bijhorende lichtfotonen. Deze

worden allen versterkt tot een elektrisch signaal via een PMT-fototube. De sterkte van het

elektrisch signaal is evenredig met de energie van de uitgezonden foto-elektronen en dus ook

evenredig met de sterkte van de gamma-stralen (De Vos, 2012).

Materialen en methoden

27

Het tweede waargenomen effect, is compton-scatter. Hierbij wordt een elektron uit

zijn baan geschoten door een gamma-straal met een relatief hoge energie. Dit elektron kan op

zich opnieuw aanleiding geven tot excitaties en de-excitaties en daardoor fotonen opwekken.

Als het elektron echter de detector verlaat zonder volledig zijn energie af te staan, dan zal de

PMT enkel voor dit elektron een signaal opvangen. Dit fenomeen verklaart de compton-rug in

het gamma-spectrum .

Het derde fenomeen is backscatter, dat optreedt wanneer de gamma-straal intrageert

met het omhulsel van de detector. De weerkaatste gamma-straal ondergaat compton-

interacties met het kristal en geeft aanleiding tot een continu energiespectrum (De Vos, 2012).

Het spectrum van [11C]-raclopride mag enkel gamma-fotonen met een energie van 511

eV bevatten en mag niet afwijken van een gestandaardiseerde 18F oplossing.

3.4.2 Kwaliteit van de opzuivering door analytische HPLC

Via analytische HPLC wordt de chemische identiteit, de chemische en radiochemische

zuiverheid en concentratie aan eindproduct bepaald. Er wordt een staal van 0,1 mL genomen

uit de [11C]-raclopride oplossing. De kwaliteitscontrole via analytische HPLC gebeurt altijd

voor de vrijgave van de [11C]-raclopride oplossing. Indien niet voldaan aan de eisen van de

Europese Farmacopee 7.2 standaarden kan het staal niet worden vrijgegeven.

De kolom gebruikt voor de kwaliteitscontrole is een Alltima C18 HPLC-kolom (Grace,

Deerfield, USA) (250 mm x4,6 mm). Er wordt gebruik gemaakt van een 0,05M Natrium

acetaat buffer/acetonitrile: 60/40 (V/V) waaraan 5 mmol triethylamine (TEA) (Sigma aldrich,

St. Louis, USA) wordt toegevoegd. De pH bedraagt 5,5 en er wordt ultrapuur water (Nanopin

ultrapore water system) gebruikt. UV-detectie gebeurt met een Smartline Knauer UV detector

(Knauer, Berlijn, Duitsland) bij 220 nm. De radioactiviteitsdetector gebruikt bij de HPLC-

kwaliteitscontrole is een Bricon frisk-tech detector. Het injectievolume is 20 µL en de flow

bedraagt 1 mL/min. Het HPLC-systeem voor de kwaliteitscontrole maakt gebruik van een C-

R8A Shimadzu chromatopac integrator (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, USA).

Er kunnen verschillende parameters aangepast worden. Attenuatie is daarbij een van de

belangrijkste. Door deze parameter aan te passen wordt de weergave van een piek groter of

kleiner. Dit is noodzakelijk om een bruikbaar chromatogram te verkrijgen bij zowel relatief

grote als kleine hoeveelheden analyt. De gebruikte pomp is een Waters 515 HPLC pomp

(Meadows Instrumentation, Bristol, UK).

Materialen en methoden

28

De kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd aan de hand van verschillende

referentieoplossingen. Een eerste bevat 0,29 µmol raclopride-tartraat (Sigma aldrich, St.

Louis, USA) per mL water voor injectie (referentieoplossing A), ter identificatie van de

raclopridepiek. Een tweede bevat bepaalde hoeveelheden O-DMR HBr (ABX, advanced

biochemical compounds, Radeberg, Duitsland) en raclopride-tartraat die overeenkomen met 1

µg O-DMR en 10 µg raclopride in 2 mL (referentieoplossing B).

Belangrijk is ook dat de limit of detection (LoD) en de limit of quantification (LoQ)

bepaald worden voor raclopride en O-DMR. De LoD is de laagste concentratie van een

substantie die kan onderscheiden worden van de blanco met een UV-detector. Deze bedraagt

voor raclopride 0,21 µM en voor O-DMR 0,23 µM. De LoQ wordt gedefinieerd als de

concentratie die op een kwantitatieve manier en met voldoende accuraatheid en precisie kan

bepaald worden. Voor raclopride is dit 0,71 µM en voor O-DMR 0,35 µM.

3.4.2.1 System Suitability Test (SST)

Het doel van een system suitability test is om een adequate HPLC-analyse te

verzekeren. De HPLC-analyse moet aan twee belangrijke eisen voldoen. Ten eerste moet de

resolutie tussen de pieken voor raclopride-tartraat en O-DMR HBr minstens 5 bedragen bij

injectie van referentieoplossing B. Ten tweede moet de relatieve retentietijd van O-DMR ten

opzichte van raclopride 0,65 (±0,10) zijn. Dit laatste is een maat voor reproduceerbaarheid.

3.4.2.2 Identiteit

De grootste piek in het radiogram van de testoplossing moet een gelijkaardige tR

hebben ten opzichte van de grootste piek in het UV chromatogram verkregen door injectie

van referentieoplossing A.

3.4.2.3 Chemische zuiverheid

Er worden eisen gesteld in verband met de aanwezigheid van onzuiverheden in het

eindproduct. De belangrijkste onzuiverheid in het eindproduct met [11C]-raclopride is de

precursor O-DMR. De piekoppervlakte van O-DMR op het UV chromatogram van de

testoplossing mag niet groter zijn dan de piekoppervlakte van O-DMR van referentieoplossing

B.

3.4.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP)

Het percentage van het gewenste radio-isotoop, dat zich bevindt onder de correcte

Materialen en methoden

29

chemische vorm, wordt gedefinieerd als de radiochemische zuiverheid. Deze wordt berekend

aan de hand van de volgende formule.

% 𝑅𝐶𝑃 = �𝑃MRC

𝑃TRC� × 100 (formule 3.5)

Waarin: PMRC: piekoppervlakte van de gewenste component op het

radioactiviteitchromatogram

PTRC: som van de piekoppervlaktes op het radioactiviteitchromatogram

3.4.2.5 Specifieke activiteit

Specifieke activiteit wordt gedefinieerd als de ratio van de radioactiviteit, uitgedrukt in

GBq van een bepaald radio-isotoop ten opzichte van de hoeveelheid uitgedrukt in eenheid van

massa (µmol). De specificaties betreffende specifieke activiteit stellen dat de piekoppervlakte

van raclopride op het UV chromatogram van de testoplossing niet groter mag zijn dan de

piekoppervlakte van raclopride op het UV chromatogram van de referentieoplossing B.

3.4.3 Farmaceutische kwaliteit

3.4.3.1 pH meting

De pH van de racloprideoplossing, die IV wordt geïnjecteerd, moet gelegen zijn tussen

pH 4 en pH 8,5. Om de pH te bepalen worden pH-strips (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland)

gebruikt die meten binnen het pH 2,0- pH 9,0 gebied. Het bepalen van de pH gebeurt voor de

vrijgave van het [11C]-raclopride product.

3.4.3.2 Controle op residuele solventen via GC

Om na te gaan of er geen residueel aceton aanwezig is in het eindproduct wordt een

gaschromatografie (GC)-analyse uitgevoerd. GC is een scheidingstechniek die gebruik maakt

van een vloeibare (GLC) of vaste stationaire (GSC) fase en een inert gas (He, N2, H2) als

dragergas.

De voorwaarde om een bepaald bestanddeel via GC te kunnen analyseren is dat de stof

in kwestie een laag kookpunt heeft en het moleculair gewicht kleiner is dan 1000 Da. De

meeste organische solventen voldoen aan deze vereisten en kunnen dan ook perfect aan de

hand van een GC-run geanalyseerd worden. Het scheidingsproces gebeurt op basis van twee

eigenschappen. Ten eerste op basis van de dampspanning en ten tweede volgens affiniteit

voor de stationaire fase.

Materialen en methoden

30

Een gaschromatograaf bestaat uit een oven waar zich een GC-kolom en een

injectiepoort in bevindt. Door deze kolom wordt een dragergas gestuurd. De GC aanwezig in

de cyclotronunit maakt gebruik van een headspace-injector. Bij deze techniek wordt een

bepaalde hoeveelheid vloeibaar staal afgesloten in een vial met een septum en dop. Deze is

slechts voor een deel gevuld. De vrije ruimte boven de vloeistof wordt de headspace

genoemd. De headspace laat toe dat er staal verdampt wanneer het gethermostatiseerd wordt.

Uit de gasfase wordt, met behulp van een naald, een monster met een bepaald volume

genomen, dat vervolgens geïnjecteerd wordt op de kolom. Deze methode voor injectie is

ideaal voor vluchtige analyten in waterige stalen (Grob et al., 2004).

Tabel 3.1: Eigenschappen gaschromatograaf.

Toestel Thermo Focus GC Gaschromatograph (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)

Kolom capillaire Crossbond kolom (L: 30 m; ID: 0,65 mm; filmdikte: 3 μm) Stationaire fase 6% polycyanopropylphenylsiloxaan– 94% dimethyl polysiloxane Dragergas helium 5 ml/min Injectiesysteem Thermo Triplus headspace (Thermo Fisher Scientific, Waltham,

Massachusetts, USA) Detector Flame Ionization Detector (FID) Injectievolume 1 mL

Voor de analyse van residuele solventen wordt hier temperatuursprogrammatie

toegepast. Eerst wordt de kolom voor 20 min bij 40 °C gethermostatiseerd. Daarna 20 min bij

50 °C en tenslotte wordt de temperatuur tot 240 °C opgedreven aan 10 °C per min. De

injector wordt bij 140 °C gethermostatiseerd en de detector bij 250 °C.

Als detector wordt een FID (flame ionization detector) gebruikt. Hierbij wordt het

mengsel, met carrier gas, gemengd met H2-gas en door een hete jet gestuurd. Het H2 mengsel

vloeit samen met een O2 stroom en dit zorgt voor een continue diffusievlam. Deze

bewerkstelligt de ionisatie van de te analyseren moleculen. Hierbij worden zowel kationen als

anionen gevormd. Een positief geladen collectorelektrode trekt de negatief geladen ionen aan

en er wordt een signaal gegenereerd door een elektronenmultiplier. Het signaal is afhankelijk

van de hoeveelheid koolstofatomen in de te analyseren molecule. De gevoeligheid tussen de

C-verbindingen onderling verschilt weinig. FID kan beschouwd worden als een universele en

massastroomgevoelige detector. De GC-analyse wordt pas na de vrijgave uitgevoerd, omdat

een dergelijke analyse veel tijd in beslag neemt (Beesley et al., 2000).

Materialen en methoden

31

Figuur 3.9: FID.7

3.4.3.3 Endotoxinetest

Endotoxines, of ook wel pyrogenen of lipopolysachariden genoemd, zijn biologische

toxines die deel uit maken van het buitenste cytoplasmatisch membraan van bepaalde gram

negatieve bacteriën. Endotoxines lokken een sterke inflammatoire reactie uit. Bij systemische

infectie veroorzaken ze een levensbedreigende sepsis en shock (Wang, 1998). Vandaar dat de

[11C]-raclopride oplossing vrij moet zijn van pyrogenen volgens de Europese Farmacopee 7.2

standaarden. Deze test wordt uitgevoerd na de vrijgave van de [11C]-raclopride oplossing.

Om eventueel aanwezige pyrogenen te detecteren in een radiofarmacon wordt een

LAL-test uitgevoerd. LAL staat voor Limulus Amoebocyte Lysate ofwel het amoebelysaat

van de Limulus krab. De test die hier werd uitgevoerd is een Kinetic Chromogenic Bacterial

Endotoxin Determination. Hierbij wordt een gemodificeerd amoebelysaat gebruikt. Dit is een

zymogeen of pro-enzym dat geactiveerd wordt door pyrogenen. In aanwezigheid van

pyrogenen zal het geactiveerde LAL para-nitroaniline (pNA) afsplitsen van het LAL-

substraat.

Figuur 3.10: Principe LAL-test.8

Para-nitroaniline heeft een gele kleur, dewelke spectrofotometrisch kan gekwantificeerd

worden. Er wordt gemeten bij 405 nm en bij een temperatuur van 37 °C. De gebruikte LAL-

kit werd aangekocht bij de firma Lonza (Walkersville, USA). Om deze LAL-test uit te voeren,

7 http://www.srigc.com/FID.pdf 8 http://www.lonza.co.jp/bioscience/rapid-testing-solutions/endotoxin/pdf/647u.pdf

Materialen en methoden

32

wordt in een LAF-kast (type 2) gewerkt.

Momenteel wordt gewerkt aan een methode om via een nieuw toestel de endotoxines voor de

vrijgave van het eindproduct te bepalen.

3.4.3.4 Steriliteitstesten

Aangezien het eindproduct wordt gebruikt voor intraveneuze injecties bij de mens, zijn

steriliteit en afwezigheid van pyrogenen absolute vereisten.

Twee testen die jaarlijks één maal extern uitgevoerd moeten worden, zijn een

Bioburden analyse en een gewone steriliteitstest op het eindproduct. Deze analyses worden

door de firma LCA Laboratoire de Contrôle et d'Analyse (Avenue Jean Jaurès 46, Brussel,

België) uitgevoerd.

Er worden verder ook interne steriliteitstesten uitgevoerd. Twee verschillende

voedingsbodems worden gebruikt om te testen op aanwezigheid van micro-organismen. De

eerste soort voedingsbodem is TSB bodem (tryptic soy broth for microbiolgy (500 g), Merck

KGaA, Darmstadt, Duitsland). Ten tweede wordt een VTM-bodem (fluid thioglycolate

medium for microbiology (500 g), Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) aangemaakt. Deze

worden overgebracht in serumflessen (100 mL), afgesloten met een rubberen stop en een

aluminium kapsel en worden vervolgens geautoclaveerd gedurende 15 min bij 121 °C.

Na een synthese wordt met een steriele spuit 0,1 mL radiofarmacon aan de TSB en

VTM-voedingsbodem toegevoegd en gewacht tot alle activiteit verdwenen is. Daarna wordt

de TSB-bodem geïncubeerd bij 20-25 °C en de VTM bodem bij 30-35 °C gedurende 14

dagen. Er wordt gecontroleerd op microbiële groei na 7 en 14 dagen.

Resultaten en discussie

33

4 RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1 OPTIMALISATIE VAN DE OPBRENGST

4.1.1 Optimalisatie van de omzetting [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf

Om de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf te optimaliseren worden

triflaatkolommen getest, die een verschillende hoeveelheid of verhouding van triflaat (Sigma

aldrich, St. Louis, USA) en koolstof (Graphpac-GC 80/100) (Grace, Deerfield, USA)

bevatten. Deze mengsels worden in een glasbuisje afgesloten met glaswol.

Er worden in totaal drie verschillende triflaatkolommen getest. Een eerste bevat 1250

mg in een 1:1 verhouding. Vervolgens wordt ook een triflaatkolom met 1250 mg triflaat/kool

mengsel in een 3:1 verhouding aangemaakt. Deze twee kolommen worden aan de hand van

dezelfde methode aangemaakt. De hoeveelheden worden afgewogen, gemengd en daarna

opgewarmd met een warmtepistool.

Een derde kolom wordt op een alternatieve manier aangemaakt. Er wordt opnieuw

1250 mg triflaat/koolstofmengsel (1:1) afgewogen. Vervolgens wordt dit gesuspendeerd in

droge acetonitrile (Acros Organics, Geel, België) en uitgedampt met behulp van een rotavapor

R 114 (Büchi, Flawil, Zwitserland). Daarna wordt dit mengsel tot poeder gemalen (stamper en

mortier) en in de kolom overgebracht.

Om de activiteit van het omgevormde [11C]-CH3OTf rechtstreeks te kunnen meten,

wordt tijdens de synthese gebruik gemaakt van een precursor die enkel met [11C]-CH3OTf

reageert en niet met [11C]-CH3I. Hiervoor wordt 4-(4-nitrobenzyl)pyridine (NBP) gebruikt.

NBP is een relatief slecht nucleofiel maar reageert toch met [11C]-CH3OTf (Jewett, 1992). Dit

kan verklaard worden door de kinetiek van een SN-2 nucleofiele substitutie. Deze reactie kent

een 2e orde kinetiek, waarbij zowel de leaving-group als het nucleofiel een invloed hebben op

de reactiesnelheid. Enkel triflaat, dat een zeer goede leaving group is, reageert met het matig

nucleofiele NBP. 20 mg NPB/0,5 mL aceton oplossing wordt voor de synthese in de

reactievial overgebracht. Het [11C]-CH3OTf, [11C]-CH3I en [11C]-CH3OH worden allen naar

de reactievial geleid, waar enkel het [11C]-CH3OTf kan reageren met het NBP. Vervolgens

wordt een He-stroom door de reactievial gestuurd, waardoor het niet gereageerde en tevens

vluchtige [11C]-CH3I en [11C]-CH3OH verdampen en enkel het gereageerde [11C]-CH3-NPB

overblijft. Als alle aceton verdampt is, wordt de activiteit gemeten. Belangrijk is dat de

tijdspanne van de reactie wordt gechronometreerd, zodat gecorrigeerd kan worden voor het

Resultaten en discussie

34

verval. Op deze manier kan de hoeveelheid [11C]-CH3OTf uitgedrukt worden in MBq. Dit

wordt voor alle triflaatkolommen toegepast, zodat de methode met het hoogste rendement,

kan worden onderscheiden. Het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-

CH3OTf kan hieruit ook berekend worden.

Figuur 4.1: Structuurformule NBP.9

Om de opbrengst aan [11C]-CH3OTf correct te kunnen berekenen is een kalibratie van

de reactievial vereist. De vial werd in een specifieke geometrische positie geplaatst en

vervolgens werd deze gevuld met een welbepaalde hoeveelheid 18F. Nadat de activiteit

voldoende gedaald is, wordt de hot cell geopend en de radioactiviteit gemeten met een

dosimeter. Er wordt teruggerekend voor het verval op verschillende tijdstippen. Zo kan de

absolute radioactiviteit (MBq) ter hoogte van de vial uitgedrukt worden in functie van het

nettosignaal afkomstig van de detector. Aan de hand van verschillende meetpunten werd een

ijklijn opgesteld (Figuur 4.2).

Figuur 4.2: Ijklijn kalibratie reactievial. Metingen zijn in het blauw weergegeven. De

zwarte rechte is de extrapolatie van de ijklijn.

De berekening van het rendement gebeurt als volgt. Nadat de reactie tussen [11C]-

CH3OTf en NBP is doorgegaan, wordt het aceton verdampt samen met [11C]-CH3I en [11C]-

CH3OH. De detector blijft gedurende dit proces meten (Figuur 4.3). Wanneer alle aceton 9 http://www.rdchemicals.com/chemicals.php?mode=details&mol_id=2592

y = 12,74x + 20,097 R² = 0,9998

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

Net

tosi

gnaa

l

MBq

CALIBRATIE DETECTOR REACTIEVAATJE

Resultaten en discussie

35

verdampt is, wordt op dit tijdstip teruggerekend voor het verval. Via de kalibratiecurve wordt

afgeleid hoeveel MBq [11C]-CH3-NBP aanwezig was in de vial, nadat de reactie volledig was

doorgegaan. Vervolgens wordt dit aantal MBq gedeeld door het werkelijke aantal MBq in de

reactievial. Zo wordt het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf

verkregen.

Figuur 4.3: NBP-test 1250 mg (1:1).

Het rendement van de omzetting met behulp van de verschillende triflaatkolommen

wordt in de tabel 4.1 weergegeven.

Tabel 4.1: Rendement triflaatkolom.

Inhoud triflaatkolom Rendement omzetting 1250 mg (1:1) 90% 1250 mg (3:1) 91% 1250 mg (1:1) (alternatieve methode) 91%

Uit de resultaten blijkt dat de verschillende samenstellingen van de triflaatkolom

weinig tot geen effect hebben op het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-

CH3OTf.

4.1.2 Testen van verschillende loopvolumes

Om het chromatogram van het reactiemengsel te optimaliseren worden verschillende

loopvolumes getest. Het volume van een loop heeft namelijk invloed op de piekbreedte. Een

kleinere loop levert smallere pieken op, wat de resolutie ten voordele komt en het eindvolume

in de opvangvial reduceert. Desondanks moet er ook rekening gehouden worden met het feit

dat nooit alles perfect op de loop geïnjecteerd kan worden. Er is telkens een kleine fractie van

de te injecteren vloeistof, die achterblijft in de vial en in de leidingen. Bij een kleiner

startvolume is de oplossing meer aangeconcentreerd. Bij kleinere injectievolumes zal het

Resultaten en discussie

36

relatief verlies van vloeistof tegenover het totaalvolume ook groter zijn. Vandaar dat bij een

kleiner loopvolume er een groter absoluut verlies van activiteit zal zijn. Er worden drie

loopvolumes getest.

Tabel 4.2: Samenstelling loopvolume.

Loopvolume Solvent/ buffer verhouding 1000 µL 200 µL aceton/800 µL buffer 750 µL 200 µL aceton/550 µL buffer 500 µL 200 µL aceton/300 µL buffer

Figuur 4.4: Activiteitsgrafieken syntheses verschillende loopvolumes (bovenaan 1000 µL

loop, midden 750 µL loop, onderaan 500 µL loop).

Tabel 4.3 beschrijft het procentueel volume dat geïnjecteerd is op de loop. Dit wordt

Resultaten en discussie

37

bekomen door de activiteit die geïnjecteerd werd te delen door de activiteit in de reactievial

(RV) voor injectie. De activiteit in de reactievial wordt berekend door het verschil te nemen

van de maximale waarde van de groene curve en zijn baseline voor de injectie. De

geïnjecteerde hoeveelheid activiteit wordt berekend door het verschil te nemen van maximale

waarde van de groene curve en de basislijn na de injectie (Figuur 4.4). De waarden van de

geïnjecteerde activiteit zijn gecorrigeerd voor het verval.

Tabel 4.3: Resultaten loop-testen.

Volume Signaal RV Activiteit geïnjecteerd % geïnjecteerd % verlies 1000 µL 2706 2675 99% 1% 750 µL 2335 2231 96% 4% 500 µL 2842 2453 86% 14%

Uit de resultaten kan de conclusie worden getrokken dat er weinig activiteit verloren

gaat wanneer voor de 750 µL loop wordt gekozen in plaats van de 1 mL loop. Het gebruik

van de 750 µL loop is daardoor perfect verantwoord. De loop met het volume van 500 µL

geeft echter wel aanleiding tot een relatief groot verlies van activiteit. Dit alles in

beschouwing genomen, wordt geopteerd voor de loop van 750 µL. Deze zal smallere pieken

opleveren dan de 1000 µL loop, zonder dat hierbij een significant activiteitsverlies optreedt.

4.2 OPTIMALISATIE VAN DE OPZUIVERING

4.2.1 Analytische C18-kolom

Scheiding via de analytische reversed phase Alltima C-18 kolom (250 mm x4,6 mm)

tijdens de opzuivering van [11C]-raclopride, gebeurt momenteel bij een flow van 2 mL/min.

Omdat een dergelijke relatief hoge flow voor een analytische kolom niet zo gunstig is, wordt

gestreefd naar een scheiding bij 1 mL/min. Aan de hand van een gelijkaardige Alltima C-18

kolom (150 mm x4,6 mm) worden verschillende nieuwe mobiele fasen getest. De beste

resultaten worden in tabel 4.4 weergegeven.

Tabel 4.4: Resultaten verschillende 0,010 M fosfaatbuffers (flow 1 mL/min).

% EtOH tR Raclopride-tartraat (min) tR O-DMR HBr (min) tR CH3I (min) pH 7 40,0 12,20 6,359 9,699 45,0 9,384 4,911 8,152

Deze verschillende mobiele fasen kunnen later getest worden tijdens syntheses. Eerst

wordt vooral gefocust op de kolom gebruikt in 4.2.2.

Resultaten en discussie

38

4.2.2 Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom

4.2.2.1 'Koude' testen

Zowel analytische als semi-preparatieve C18 reversed phase kolommen leveren een

relatief goede scheiding op van het reactiemengsel. Scheiding gebeurt op basis van het

verschil in lipofiliciteit tussen O-DMR en [11C]-raclopride. De extra gemethyleerde

hydroxylfunctie bij [11C]-raclopride is verantwoordelijk voor de langere retentietijd van [11C]-

raclopride ten opzichte van O-DMR. Deze lipofiele methoxy-functie van [11C]-raclopride

vertoont een sterkere interactie met de octadecyl-substituenten op de silica pakking dan de

hydroxylgroep van O-DMR, waardoor [11C]-raclopride langer wordt weerhouden.

Literatuurgegevens tonen echter een gunstigere scheiding aan bij gebruik van een

semi-preparatieve Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom (Supelco-analytical, St.

Louis, USA) (Lehel et al., 2009). Aan de hand van deze kolom wordt er geprobeerd om het

effect van het verschil in lipofiliciteit op de retentievolgorde te verminderen. Dit gebeurt door

een minder hydrofobe stationaire fase te kiezen en in te spelen op het feit dat O-DMR, een

zuurder karakter heeft dan [11C]-raclopride. Daarom wordt voor een basische kolom

geopteerd, meerbepaald een zogenaamde base deactivated kolom, die een grotere polaire

activiteit bezit (Lehel et al., 2009).

Figuur 4.5: Omgekeerde retentievolgorde met semi-preparatieve Supelcosil™ Suplex™

pKb-100 HPLC kolom (Lehel et al., 2009).

De stationaire fase van deze semi-preparatieve HPLC kolom bestaat uit sferische

poreuze silica partikels, waarvan het oppervlak gemodificeerd is. Een deel van de vrije

silanolgroepen is gesubstitueerd met C16-alkylamide.

Doordat de scheiding van O-DMR en [11C]-raclopride nu meer gebaseerd is op de

polaire interacties met de alkylamide-groepen, zal O-DMR later elueren dan [11C]-raclopride.

Resultaten en discussie

39

De vrije hydroxylgroep van O-DMR kan namelijk een extra waterstofbinding aangaan

met de stationaire fase en zal zo langer weerhouden worden (Figuur 4.5). Acetaatbuffer 0,025

M pH 3/ethanol 75/25 (V/V) werd als mobiele fase gebruikt bij 6 mL/min (Lehel et al., 2009).

In dit onderzoek wordt echter nagegaan of deze scheiding met omgekeerde

retentietijden ook mogelijk is met behulp van een analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100

HPLC kolom (Tabel 4.5). Deze analytische kolom heeft verschillende voordelen tegenover de

semi-preparatieve kolom. Een dergelijke kolom levert een gelijkaardige of snellere

opzuivering op als een semi-preparatieve kolom. Maar bovendien zal door de lagere flow (1

mL/min i.p.v. 6 mL/min) en de korte opvangtijd het eindvolume veel kleiner zijn.

Tabel 4.5

Eigenschappen analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom Stationaire fase Silica gemodificeerd met C16-alkylamide Diameter partikels 5 μm L × I.D. 150 mm x4.6 mm pH-range 2 - 7.5 Poriëngrootte 120 Å

Om testen te kunnen uitvoeren met de kolom, wordt een standaard met O-DMR HBr

en raclopride-tartraat aangemaakt. De concentraties in de oplossing zijn bij benadering

analoog aan deze van het eindproduct tijdens de synthese.

De keuze van mobiele fase is heel belangrijk. Deze heeft een grote invloed op het

elueren van de verschillende componenten. Om de retentietijd te optimaliseren worden

verschillende mobiele fasen getest. 0,025 M citraatbuffers pH 2,5 tot pH 5 worden getest,

telkens met een variërende ethanolconcentratie tussen de 10% (V/V) en 30% (V/V). Ethanol

fungeert hier als modifier. De buffers bij pH 4 en 5 bleken meteen onbruikbaar, omdat de

fracties veel te laat elueerden.

Tabel 4.6: Resultaten verschillende 0,025 M citraatbuffers (flow 1 mL/min).

% EtOH tR Raclopride-tartraat (min) tR O-DMR (min) tR CH3I (min) pH 3 25,0 6,163 12,710 9,774 30,0 4,443 8,645 7,981 27,5 5,146 10,871 9,470 pH 2,5 25,0 5,012 9,652 8,942

Bij de buffers, waarmee een basislijn scheiding werd gerealiseerd, wordt tevens de

retentietijd van CH3I nagegaan. De resultaten zijn weergegeven in tabel 4.6.

Deze resultaten in beschouwing genomen lijkt de 0,025 M citraatbuffer pH 3/ethanol:

Resultaten en discussie

40

72,5/27,5 (V/V) de beste mobiele fase. Er is een goede baseline scheiding tussen raclopride-

tartraat en het ongewenste O-DMR HBr en MeI. Ook de 0,025 M citraatbuffer pH

2,5/ethanol: 75/25 (V/V) en de 0,025 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 75/25 (V/V) mobiele

fasen zijn veelbelovend en kunnen later getest wordens tijdens een synthese. Als de fracties

vroeger dan vijf minuten elueren, bestaat er echter een kans dat de piek van raclopride

samenvalt met deze van methanol, die een retentietijd heeft van 2-3 min. Daarom wordt toch

eerder geopteerd voor een mobiele fase waar raclopride slechts na 5,5 à 6 minuten elueert.

Bijgevolg wordt gesteld dat de Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC kolom twee

belangrijke voordelen heeft ten opzichte van vorige kolommen bij de opzuivering van [11C]-

raclopride. Ten eerste wordt er een omgekeerde retentievolgorde gerealiseerd met de nieuwe

kolom ten opzichte van de klassieke C18-kolom. Dit levert een kortere retentietijd op voor

[11C]-raclopride, wat een voordeel is, aangezien de radiochemische opbrengst hoger zal zijn.

Tenslotte is de precursor meestal in relatief hoge concentratie aanwezig, waardoor er tailing

optreedt. Hierdoor moeten de pieken van O-DMR en [11C]-raclopride ver van elkaar gelegen

zijn om geen grote hoeveelheden O-DMR in het eindproduct te bekomen. Met deze nieuwe

kolom is dit niet meer nodig aangezien [11C]-raclopride eerst elueert.

4.2.2.2 'Warme' testen

De componenten voor de aanmaak van mobiele fase (citroenzuur en sodium citrate

tribasic dehydrate, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) werden vooraf getest op aanwezigheid van

pyrogenen. Deze testen waren negatief. Om de succesvolle mobiele fasen te testen tijdens een

synthese van [11C]-raclopride, wordt tien minuten bestraald bij 14 µA. Voor de opzuivering

wordt 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 72,5/27,5 (V/V) als mobiele fase gebruikt. Zoals

verwacht zijn de retentietijden van [11C]-raclopride en O-DMR omgekeerd (Figuur 4.6). Op

het signaal van de radioactiviteitsdetector is te zien hoe [11C]-raclopride elueert na ongeveer

4,5 minuten en basislijn gescheiden is van [11C]-methanol dat na 3 minuten elueert en [11C]-

CH3I dat pas na 11 minuten elueert. Op het UV-chromatogram is de piek van O-DMR terug te

vinden bij 11 minuten.

De fractie [11C]-raclopride wordt opgevangen gedurende 2 min, bij een flow van 1

mL/min. De HPLC-kwaliteitscontrole toonde aan dat de hoeveelheid O-DMR nu onder de

LoD en LoQ ligt en er geen andere onzuiverheden, die absorberen in het UV-gebied,

aanwezig zijn in het eindproduct (Figuur 4.6).

Resultaten en discussie

41

Figuur 4.6: Chromatogram opzuivering [11C]-raclopride met Analytische Supelcosil™

Suplex™ pKb-100 kolom en 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 72,5/27,5 (V/V) als

mobiele fase.

In vergelijking met de analytische C18-kolom wordt de fractie [11C]-raclopride veel

vroeger bekomen en is er geen O-DMR meer aanwezig in het eindproduct (3.3.4.2: Figuur

3.6). Dit betekent een tijdswinst van minstens 5 minuten. Ook wordt slechts 2 mL

opgevangen, terwijl de ethanolconcentratie nog lager ligt dan bij de C18-kolom met 0.05 M

ammoniumacetaat buffer/ethanol: 70/30 (V/V) als mobiele fase. Na de verdunning tot 10%

(V/V) ethanol wordt een eindproduct verkregen waarbij het aantal MBq/mL veel hoger zal

zijn.

Figuur 4.7: HPLC-QC: (A) Het activiteitchromatogram bevat enkel een piek voor [11C]-

raclopride. (B) Op het UV-chromatogram is enkel een piek van raclopride te zien, die

onder de limiet van 10 µg/mL gelegen is.

De mobiele fase voor deze Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 is hierna verder

-1000 0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

10000 11000 12000 13000

0 5 10 15 20 HPLC UV Activiteit

t (min)

Resultaten en discussie

42

geoptimaliseerd. Een 0,010 M citraatbuffer pH 3/ethanol: 75/25 (V/V) mobiele fase bij 1

mL/min leverde een [11C]-raclopride piek op na 5 minuten. Deze is nog beter gescheiden van

het [11C]-methanol. Op het UV- en activiteitchromatogram zijn geen onzuiverheden terug te

vinden en er wordt een hoge chemische zuiverheid geconstateerd (Figuur 4.7).

In de toekomst zal deze opzuivering gebruikt worden voor de synthese van [11C]-

raclopride en zullen nieuwe SOP's (standard operating procedures) voor de kwaliteitscontroles

worden opgesteld.

4.3 KWALITEITSCONTROLE

4.3.1 Radionuclidische identiteit en zuiverheid van het radionuclide

4.3.1.1 Meting van het halfleven

Bij alle halfwaardetijdopnames wordt een halfleven bekomen dat zich binnen het

interval 19,9-20,9 bevindt (Tabel 4.7). Hiermee wordt zowel de radionuclidische identiteit en

radionuclidische zuiverheid bevestigd. Het tijdsinterval tussen de twee activiteitsmetingen

bedraagt exact 5 minuten.

Tabel 4.7

Datum QC Achtergrond (MBq) Meting 1 (MBq) Meting 2 (MBq) T1/2 (min) 30-3-2012 0,333 83,62 70,30 20,0 18-4-2012 0,189 219,8 184,6 19,9 19-4-2012 0,171 203,5 171,3 21,3 20-4-2012 0,185 345,6 272,0 21,5 04-5-2012 0,148 175,4 148,4 20,7 08-5-2012 0,152 162,1 136,2 19,9 10-5-2012 0,222 105,1 88,43 20,0 14-5-2012 0,148 126.2 106.9 20.9 21-5-2012 0.150 829.5 699.3 20,3 22-5-2012 0,222 202.0 167.98 20,6

4.3.1.2 Meting van het gamma-spectrum

Bij alle kwaliteitscontroles is een gamma-piek vastgesteld bij ongeveer 511 keV. Uit

dit resultaat kan besloten worden dat het eindproduct een positronstraler bevat. Via het

halfleven kan verder bevestigd worden dat het om het isotoop 11C gaat (zie 4.3.3.1).

Resultaten en discussie

43

Figuur 4.8: Gamma-spectrum [11C]-raclopride.

4.3.2 Kwaltiteit van de opzuivering door analytische HPLC

4.3.2.1 System Suitability Test (SST)

Het gebruikte HPLC-systeem kan als conform beschouwd worden met de gestelde

eisen. De relatieve retentie van O-DMR en raclopride is telkens gelegen binnen het 0,55-0,75

interval (Tabel 4.8).

Tabel 4.8

Datum QC tR O-DMR (min) tR [11C]-raclopride (min) relatieve retentie 30-3-2012 6,53 10,9 0,599 18-4-2012 5,77 10,5 0,550 19-4-2012 5,89 10,7 0,550 20-4-2012 5,98 10,8 0,554 04-5-2012 5,40 8,89 0,607 08-5-2012 5,51 9,09 0,606 10-5-2012 5,36 9,04 0,592 14-5-2012 5.62 9.55 0.588 21-5-2012 6,47 10,4 0.622 22-5-2012 6.21 10.7 0.581

𝑅 = 2 × 𝑡R(1)−𝑡R(2)𝑊(1)+𝑊(2)

(formule 4.1)

Waarin: tR(1): retentietijd [11C]-raclopride (min)

tR(2): retentietijd O-DMR (min)

W(1): piekbreedte O-DMR (min)

W(2): piekbreedte [11C]-raclopride (min)

De resolutie tussen de piek van O-DMR en deze van [11C]-raclopride is bij elke

Resultaten en discussie

44

kwaliteitscontrole groter dan de vijf (Tabel 4.9). De resolutie wordt aan de hand van formule

4.1 berekend.

Tabel 4.9

Datum QC Piekbreedte O-DMR (min) Piekbreedte [11C]-raclopride (min) R 30-3-2012 0,5 0,8 6,69 18-4-2012 0,4 1,0 6,76 19-4-2012 0,3 1,0 7,37 20-4-2012 0,3 1,0 7,46 04-5-2012 0,3 1,0 6,36 08-5-2012 0,3 0,8 6,51 10-5-2012 0,3 0,8 6,70 14-5-2012 0,3 0,8 7,14 21-5-2012 0,3 0,8 7,18 22-5-2012 0,3 0,8 8,13

4.3.2.2 Identiteit

De tR van de grootste piek op het radiochromatogram moet gelijkaardig zijn aan de tR

van raclopride op het UV chromatogram van de referentieoplossing A. Aan deze eis is voor

alle kwaliteitscontroles voldaan.

4.3.2.3 Chemische zuiverheid

Tabel 4.10

Datum QC Chemische zuiverheid [11C]-raclopride (µg/2 mL)

Chemische zuiverheid O-DMR (µg/2 mL)

30-3-2012 3,68 <LoD 18-4-2012 8,93 0,124 19-4-2012 2,81 0,073 20-4-2012 2,36 <LoD 04-5-2012 1,57 <LoD 08-5-2012 1,41 <LoD 10-5-2012 161 <LoD 14-5-2012 2,28 <LoD 21-5-2012 3,59 <LoD 22-5-2012 4,05 <LoD

De chemische zuiverheid wordt berekend aan de hand van de volgende formule.

Craclopride (µg/2 mL) = 10 ×𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑟𝑎𝑐𝑙𝑜𝑝𝑟𝑖𝑑𝑒 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑡𝑒𝑠𝑡

𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑟𝑎𝑐𝑙𝑜𝑝𝑟𝑖𝑑𝑒 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒

(formule 4.2)

Resultaten en discussie

45

CO-DMR (µg/2 mL) = 𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑂 − 𝐷𝑀𝑅 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑡𝑒𝑠𝑡

𝑂𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑂 − 𝐷𝑀𝑅 𝑈𝑉 𝑐ℎ𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒

(formule 4.3)

De concentratie raclopride en O-DMR moet lager zijn dan de concentratie van de

referentieoplossing, respectievelijk 10 µg raclopride/2 mL en 1 µg O-DMR/2 mL (Tabel

4.10). Er kan geconcludeerd worden dat alle geanalyseerde stalen conform zijn wat betreft de

chemische zuiverheid.

4.3.2.4 Radiochemische zuiverheid (RCP)

De radiochemische zuiverheid voor alle radiofarmaceutische preparaten moet hoger

zijn dat 95%. Voor alle kwaliteitscontroles werd een radiochemische zuiverheid van meer dan

99% bekomen.

4.3.2.5 Specifieke activiteit

De specifieke activiteit wordt berekend aan de hand van formule 4.4. De 2 staat voor de

oppervlakte van de UV-fractie raclopride en de 1 de oppervlakte van de UV-fractie O-DMR.

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑒𝑘𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑒𝑖𝑡 = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 (𝑀𝐵𝑞)×(2)×0,06947𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝑚𝐿)×(1)

(formule 4.4)

Tabel 4.11

Datum QC Specifieke activiteit (GBq/µmol) 30-3-2012 112 18-4-2012 46,6 19-4-2012 153 20-4-2012 163 04-5-2012 196 08-5-2012 221 10-5-2012 134 14-5-2012 147 21-5-2012 109 22-5-2012 100

De specifieke activiteit moet meer of evenveel bedragen als 21,40 GBq/µmol, uit tabel

4.11 kan besloten worden dat voldaan is aan de specificaties.

4.3.3 Farmaceutische kwaliteit

4.3.3.1 pH meting

Bij alle pH metingen werd een pH vastgesteld in het interval 5,5-6.

Resultaten en discussie

46

4.3.3.2 Controle op residuele solventen via GC

Van het eindproduct met [11C]-raclopride mag maximaal 2 mL geïnjecteerd worden bij

een patiënt. De concentratie van het residueel aceton moet hierbij minder bedragen dan 50

mg/2 mL of 25000 ppm. Om dit na te gaan wordt een testoplossing aangemaakt van het

eindproduct en een referentieoplossing die zowel eindproduct als een bepaalde hoeveelheid

aceton bevat. De testoplossing bevat 50 mg eindproduct en wordt aangelengd tot 6 mL met

water voor injectie (B. Braun Medical, Melsungen, Duitsland). De referentieoplossing bevat

1,25 mg aceton (Sigma aldrich, St. Louis, USA) en 50 mg eindproduct in een totaal volume

van 6 mL met water voor injectie. Beiden worden in drievoud via GC geanalyseerd.

Tabel 4.12: Resultaten GC-analyse staal A (08/02/2012) en B (24/02/2012).

A Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Test 1 1228172 1225793 71736 5,85 Test 2 1296310 Test 3 1152898 Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Ref 1 82808021 81834671 1000779 1,22 Ref 2 80808550 Ref 3 81887441 B Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Test 1 1140789 1221865 169138 13,84 Test 2 1108527 Test 3 1416279 Oppervlakte Gemiddelde oppervlakte SD RSD (%) Ref 1 80686020 79309953 1562478 1,97 Ref 2 77611391 Ref 3 79632448

Voor de oppervlaktes van de 3 pieken van zowel de referentie- als testoplossingen

worden de relatieve standaarddeviatie berekend. Deze mogen niet hoger zijn dan 15%. Dit

geldt als een system suitability test. Als criterium voor het aanvaarden van de [11C]-raclopride

oplossing wordt gesteld dat de piek voor aceton van de testoplossing kleiner of gelijk aan de

helft van de oppervlakte van de piek van de referentie-oplossing mag zijn.

Voor beide stalen bedraagt de RSD minder dan 15% en is de oppervlakte van de

testoplossing kleiner dan de helft van de oppervlakte van de referentie (Tabel 4.12). De twee

stalen kunnen als conform beschouwd worden voor wat betreft de contaminatie met residueel

aceton.

Resultaten en discussie

47

4.3.3.3 Endotoxinetest

Om een LAL-test uit te voeren, wordt in een LAF-kast gewerkt. De stalen [11C]-

raclopride worden 1/50 verdund met LAL-trisbuffer om de ethanolconcentratie voldoende te

verlagen, zodat er geen interferentie optreedt bij de spectrofotometrische detectie. Er worden

ook spikes aangemaakt. Daarvoor wordt 20 µL van een 5 IU/ml pyrogeenoplossing

toegevoegd aan 180 µL staal. Dit wordt gedaan om na te gaan of het staal de activiteit van

LAL niet inhibeert.

Om de pyrogenen te kunnen kwantificeren moet eerst een standaardreeks met een

gekende pyrogeenconcentratie worden aangemaakt (0,005 IU/mL, 0,050 IU/mL, 0,500 IU/mL

tot 5,000 IU/mL). Hiervoor worden E. Coli bacteriën (E.coli 055:B5) gebruikt. Deze bevatten

endotoxines in hun celwand. IU staat voor International units. Dit is een bepaalde hoeveelheid

die vastgelegd werd door experts. Om te verdunnen wordt pyrogeenvrij LAL-water gebruikt.

De standaarden worden gemeten en uitgezet via een semi-logaritmische grafiek in functie van

de onset-time (Figuur 4.10).

Figuur 4.9: Weergave van LAL-test resultaat voor 2 stalen. In kolom 2 en 3 zijn mean

values van de standaardreeks uitgedrukt. De laagste standaard begint bij C(2-3) en de

hoogste is weergegeven in F(2-3). In B1 en B2 bevindt zich een blanco. De 2 stalen

bevinden zich in B(4-5) en D(4-5) en de spikes in C(4-5) en E(4-5).

50 µL van alle testoplossingen en standaarden wordt overgebracht op een

microtitterplaat en na 10 minuten incuberen bij 37 °C wordt 50 µL van het LAL-reagens

toegevoegd. Dit bevat het LAL-zymogeen en het LAL-substraat. Daarna worden de

Resultaten en discussie

48

absorbanties gemeten in een spectrofotometer gedurende drie uur. Geleidelijk wordt p-

nitroaniline gevormd, dat gedetecteerd wordt. De absorbantie is omgekeerd evenredig met de

onset-time, namelijk de tijd die nodig is om een enige detectie te registreren. Hoe groter de

onset-time, hoe kleiner de concentratie aan endotoxines (Figuur 4.9).

Tabel 4.13: Waarden ijklijn standaarden.

Staal C (IU/mL) Wells Onset (s) Gemiddelde (s) SD RSD (%) Standaard 1 0,005 C2 5202,00 5098,50 146,4 2,9 C3 4995,00 Standaard 2 0,050 D2 2454,00 2502,00 67,88 2,7 D3 2550,00 Standaard 3 0,500 E2 1258,11 1281,82 33,53 2,6 E3 1305,53 Standaard 4 5,000 F2 732,000 735,947 4,913 0,7 F3 738,947

Rekening houdend met de eisen in verband met de ijklijn, wordt gesteld dat de

correlatiecoëfficiënt van de ijklijn groter of gelijk aan 0,98 moet zijn. De ijklijn voldoet aan

de eisen en heeft een correlatiecoëfficiënt van 0,997 (Figuur 4.10). De rico van de ijklijn moet

tevens een waarde hebben tussen -1 en 0,1. Bij dit staal is dit ook voldaan want de rico

bedraagt -0,281.

De vergelijking van de best passende rechte voor de ijklijn is de volgende:

log(𝑦) = 3,045 − 0,281 × log (𝑥) (formule 4.5)

Figuur 4.10: Ijklijn pyrogeenstandaarden.

De absolute gemiddelde waarde voor de blanco (BL) moet kleiner zijn dan de absolute

gemiddelde waarde van de 0,005 IU/mL standaard. De gemiddelde waarde voor de blanco is

R² = 0,997

500

1000

2000

4000

8000

0 1 2 3 4 5 Gem

indd

elde

ons

et st

alen

(s)

Concentratie standaard (IU/mL)

Ijklijn standaarden

Resultaten en discussie

49

0,015 IU/mL en deze voor de 0,005 IU/mL standaard 0,0947. Hiermee is aan de

vooropgestelde eis voldaan.

Tabel 4.14: Waarden blanco's.

Staal C (IU/mL) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddeld (IU/mL) SD RSD (%) BL 1 0,500 B2 0,012 0,015 0,003 22,9 BL 2 0,500 B3 0,017

De terugvinding van de spikes moet gelegen zijn tussen 50% en 200%. De

concentratie van de geanalyseerde spikes bedraagt 0,424 IU/mL en 0,408 IU/mL. De

verwachte waarde is 0,500 IU/mL. Er wordt een terugvinding berekend van respectievelijk

84,8% en 81,6%, waarmee deze beide in het interval 50-200% vallen.

Tabel 4.15: Waarden spikes.

Staal C (IU/mL) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddelde (IU/mL) SD RSD (%) Spike 1 0,500 C4 0,416 0,424 0,012 2,8 C5 0,408 Spike 2 0,500 E4 0,259 0,408 0,21 51,5 E5 0,557

Het aanvaardingscriterium voor de stalen stelt dat de concentratie aan endotoxine lager

moet zijn dan 175/V IU/ml, waarbij V het maximaal volume is aan radiofarmacon dat zal

toegediend worden.

Tabel 4.16: Waarden stalen [11C]-raclopride.

Staal Onset (s) Wells Resultaat (IU/mL) Gemiddeld (IU/mL) SD RSD (%) 03-02-12 5274,0 B4 0,004 0,008 0,005 69,7 3892,5 B5 0,012 08-02-12 7587,0 D4 0,001 0,001 0,000 0 Masked D5 Masked

De stalen bevatten 0,008 en 0,001 IU/mL. Rekening houdend met de verdunning

wordt dit respectievelijk 0,4 IU/mL en 0,05 IU/mL voor de oorspronkelijke oplossing. Dit ligt

ver beneden de grens van 87,5 IU/ml, waardoor er kan geconcludeerd worden dat beide stalen

conform zijn wat betreft het endotoxinegehalte. Er wordt 5 mL raclopride-eluens opgevangen

gedurende de opzuivering via HPLC. Dit volume wordt daarna nog drie maal verdund om de

ethanolconcentratie van 30% (V/V) terug te brengen naar 10% (V/V), zodat het aantal IU/mL

voor de injectie in werkelijkheid nog lager ligt.

4.3.3.4 Steriliteitstesten

Alle steriliteitstesten waren negatief op microbiële groei.

Conclusie

50

5 CONCLUSIE

De radiosynthese van de, met 11C gelabelde D2-receptorantagonist, [11C]-raclopride is

een complex multi-step proces. Tijdens deze onderzoeksstage werd getracht enkele van deze

stappen te optimaliseren of te perfectioneren. Ook werd de kwaliteitscontrole op het [11C]-

raclopride eindproduct geëvalueerd.

De pogingen om het rendement van de omzetting van [11C]-CH3I naar [11C]-CH3OTf

te verhogen, aan de hand van verschillende samenstellingen van de triflaat-kolom, leverden

weinig resultaat op. Allen leverden ze een rendement op van ± 90%. Uit de syntheses met

verschillende loopvolumes kan geconcludeerd worden dat best geen te klein loopvolume

gekozen wordt, omwille van het absoluut verlies aan reactiemengsel. Er werd geopteerd voor

een loopvolume van 750 µL.

De optimalisatie ter hoogte van het opzuiveringsproces was erg succesvol. Aan de

hand van een Analytische Supelcosil™ Suplex™ pKb-100 HPLC-kolom slaagden we erin

[11C]-raclopride voor de precursor O-DMR te laten elueren. Hierdoor wordt de totale

synthesetijd met minstens 5 minuten ingekort. Aangezien de synthesetijd momenteel 28

minuten bedraagt en 11C een T1/2 van 20,38 minuten heeft, is dit een significante verbetering.

De radiochemische opbrengst zal hierdoor hoger zijn. Bovendien wordt, door de lage flow (1

mL/min) met deze kolom, slechts 2,5 mL (25% EtOH) opgevangen, met als gevolg dat het

[11C]-raclopride meer aangeconcentreerd is. Het eindproduct bevat ook geen sporen O-DMR

meer, aangezien dit ver na de [11C]-raclopride fractie elueert. Deze opzuiveringsmethode zal

binnenkort operationeel zijn.

Gedurende de onderzoeksstage zijn een aantal kwaliteitscontroles, opgelegd door de

Europese farmacopee 7.2 standaarden, uitgevoerd op het [11C]-raclopride eindproduct. Uit de

resultaten kan geconcludeerd worden dat meestal ruim aan alle specificaties wordt voldaan.

Helaas zijn de verschillende onderdelen van de module, die instaan voor de synthese

van [11C]-raclopride, soms onderhevig aan hardware problemen. Hierdoor zijn

herstellingswerken noodzakelijk, waardoor de experimenten wat vertraging hebben

opgelopen. Enkele testen zijn niet kunnen doorgaan omwille van deze problemen en ook het

proefdierexperiment met behulp van PET-scanning is pas na het afwerken van de

onzoeksstage gepland.

Literatuurlijst

51

6 LITERATUURLIJST

6.1 LITERATUUR

Minagar, M. (2010). Basic Aspects of Catechol-O-Methyltransferase and the Clinical Applications of Its Inhibitors. Elsevier Science. Andersson, J., Truong, P., and Halldin, C. (2009). In-target produced [11C]methane: Increased specific radioactivity. Appl Radiat Isot 67, 106-10. Barbeau, A. (1970). Dopamine and disease. Can Med Assoc J 103, 824-32. Beesley, T. E., and Buglio, B. (2000). Quantitative Chromatographic Analysis. Marcel Dekker. Brooks, D. J. (2003). PET studies on the function of dopamine in health and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 991, 22-35. Cumming, P. (2009). Imaging Dopamine. Cambridge University Press. De Vos, F. (2010-2011). Cursus medische stralingsfysica en kernchemie.

Elsinga, P. H. (2002). Radiopharmaceutical chemistry for positron emission tomography. Methods 27, 208-17. Europese Farmacopee 7.2 standaarden. Faludi, G., Dome, P., and Lazary, J. (2011). Origins and perspectives of schizophrenia research. Neuropsychopharmacol Hung 13, 185-92. Farde, L., Ehrin, E., Eriksson, L., Greitz, T., Hall, H., Hedstrom, C. G., Litton, J. E., and Sedvall, G. (1985). Substituted benzamides as ligands for visualization of dopamine receptor binding in the human brain by positron emission tomography. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 3863-7. Farde, L., Eriksson, L., Blomquist, G., and Halldin, C. (1989). Kinetic analysis of central [11C]raclopride binding to D2-dopamine receptors studied by PET--a comparison to the equilibrium analysis. J Cereb Blood Flow Metab 9, 696-708. Freedman, R. (2003). Schizophrenia. N Engl J Med 349, 1738-49. Gomez-Vallejo, V., and Llop, J. Fully automated and reproducible radiosynthesis of high specific activity [(1)(1)C]raclopride and [(1)(1)C]Pittsburgh compound-B using the combination of two commercial synthesizers. Nuclear medicine communications 32, 1011-7. Grob, R. L., and Barry, E. F. (2004). Modern Practice of Gas Chromatography. Wiley-Interscience. Harrison, P. J. (2004). The hippocampus in schizophrenia: a review of the neuropathological evidence and its pathophysiological implications. Psychopharmacology 174, 151-62.

Literatuurlijst

52

Humm, J. L., Rosenfeld, A., and Del Guerra, A. (2003). From PET detectors to PET scanners. Eur J Nucl Med Mol Imaging 30, 1574-97. Innis, R. B., Cunningham, V. J., Delforge, J., Fujita, M., Gjedde, A., Gunn, R. N., Holden, J., Houle, S., Huang, S. C., Ichise, M., Iida, H., Ito, H., Kimura, Y., Koeppe, R. A., Knudsen, G. M., Knuuti, J., Lammertsma, A. A., Laruelle, M., Logan, J., Maguire, R. P., Mintun, M. A., Morris, E. D., Parsey, R., Price, J. C., Slifstein, M., Sossi, V., Suhara, T., Votaw, J. R., Wong, D. F., and Carson, R. E. (2007). Consensus nomenclature for in vivo imaging of reversibly binding radioligands. J Cereb Blood Flow Metab 27, 1533-9. Ishibashi, K., Ishii, K., Oda, K., Mizusawa, H., and Ishiwata, K. (2010). Competition between 11C-raclopride and endogenous dopamine in Parkinson's disease. Nuclear medicine communications 31, 159-66. Iwata, R., Pascali, C., Bogni, A., Miyake, Y., Yanai, K., and Ido, T. (2001). A simple loop method for the automated preparation of (11C)raclopride from (11C)methyl triflate. Appl Radiat Isot 55, 17-22. Jaber, M., Robinson, S. W., Missale, C., and Caron, M. G. (1996). Dopamine receptors and brain function. Neuropharmacology 35, 1503-19. Jewett, D. M. (1992). A simple synthesis of [11C]methyl triflate. Int J Rad Appl Instrum A 43, 1383-5. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., and Jessell, T. M. (1991). Principles of Neural Science. Prentice-Hall International. Kilbourn, M. R., and Domino, E. F. Increased in vivo [11C]raclopride binding to brain dopamine receptors in amphetamine-treated rats. European journal of pharmacology 654, 254-7. Kim, J. H., Son, Y. D., Kim, H. K., Lee, S. Y., Cho, S. E., Kim, Y. B., and Cho, Z. H. (2011). Antipsychotic-associated mental side effects and their relationship to dopamine D2 receptor occupancy in striatal subdivisions: a high-resolution PET study with [11C]raclopride. J Clin Psychopharmacol 31, 507-11. Langer, O., Nagren, K., Dolle, F., Lundkvist, C., Sandell, J., Swahn, C. G., Vaufrey, F., Crouzel, C., Maziere, B., and Halldin, C. (1999). Precursor synthesis and radiolabelling of the dopamine D-2 receptor ligand [C-11]raclopride from [C-11]methyl triflate. J Labelled Compd Rad 42, 1183-1193. Le Foll, B. (2009). Dopamine receptors. In Biotrend, Toronto. Martinez, D., Slifstein, M., Broft, A., Mawlawi, O., Hwang, D. R., Huang, Y., Cooper, T., Kegeles, L., Zarahn, E., Abi-Dargham, A., Haber, S. N., and Laruelle, M. (2003). Imaging human mesolimbic dopamine transmission with positron emission tomography. Part II: amphetamine-induced dopamine release in the functional subdivisions of the striatum. J Cereb Blood Flow Metab 23, 285-300.

Literatuurlijst

53

Neve, K. A., Seamans, J. K., and Trantham-Davidson, H. (2004). Dopamine receptor signaling. J Recept Signal Transduct Res 24, 165-205. Okada, M., Nakao, R., Hosoi, R., Zhang, M. R., Fukumura, T., Suzuki, K., and Inoue, O. (2011). Microdialysis with radiometric monitoring of L-[beta-11C]DOPA to assess dopaminergic metabolism: effect of inhibitors of L-amino acid decarboxylase, monoamine oxidase, and catechol-O-methyltransferase on rat striatal dialysate. J Cereb Blood Flow Metab 31, 124-31. Paans, A. M., van Waarde, A., Elsinga, P. H., Willemsen, A. T., and Vaalburg, W. (2002). Positron emission tomography: the conceptual idea using a multidisciplinary approach. Methods 27, 195-207. Patton, J. A. (1998). Introduction to nuclear physics. Radiographics 18, 995-1007. Phelps, M. E. (2000). PET: the merging of biology and imaging into molecular imaging. J Nucl Med 41, 661-81. Raymond, L. A., Andre, V. M., Cepeda, C., Gladding, C. M., Milnerwood, A. J., and Levine, M. S. (2011). Pathophysiology of Huntington's disease: time-dependent alterations in synaptic and receptor function. Neuroscience 198, 252-73. Saiki, S., Sato, S., and Hattori, N. (2012). Molecular pathogenesis of Parkinson's disease: update. J Neurol Neurosurg Psychiatry 83, 430-6. Schlyer, D. J. (2004). PET tracers and radiochemistry. Ann Acad Med Singapore 33, 146-54. Schüle, B., Kock, N., Svetel, M., Dragasevic, N., Hedrich, K., De Carvalho Aguiar, P., Liu, L., Kabakci, K., Garrels, J., Meyer, E. M., Berisavac, I., Schwinger, E., Kramer, P. L., Ozelius, L. J., Klein, C., and Kostic, V. (2004). Genetic heterogeneity in ten families with myoclonus-dystonia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75, 1181-5. Shao, X., and Kilbourn, M. R. (2009). A simple modification of GE tracerlab FX C Pro for rapid sequential preparation of [11C]carfentanil and [11C]raclopride. Appl Radiat Isot 67, 602-5. Scifinder Snyder, L. R., Kirkland, J. J., and Dolan, J. W. (2009). Introduction to Modern Liquid Chromatography. John Wiley & Sons. Sullivan, J. M., Risacher, S. L., Normandin, M. D., Yoder, K. K., Froehlich, J. C., and Morris, E. D. Imaging of alcohol-induced dopamine release in rats:preliminary findings with [(11) C]raclopride PET. Synapse (New York, N.Y) 65, 929-37. Symposium, N. N. G., Winlow, W., and Markstein, R. (1986). The Neurobiology of Dopamine Systems. Manchester University Press. Tsai, R. S., Carrupt, P. A., Testa, B., Gaillard, P., el Tayar, N., and Hogberg, T. (1993). Effects of solvation on the ionization and conformation of raclopride and other

Literatuurlijst

54

antidopaminergic 6-methoxysalicylamides: insight into the pharmacophore. J Med Chem 36, 196-204. Turkington, T. G. (2001). Introduction to PET instrumentation. J Nucl Med Technol 29, 4-11. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J., Baler, R., and Telang, F. (2009). Imaging dopamine's role in drug abuse and addiction. Neuropharmacology 56 Suppl 1, 3-8. Wang, X., and Quinn, P. J. (2010). Endotoxins: Structure, Function and Recognition. Springer. Weeks, R. A., Piccini, P., Harding, A. E., and Brooks, D. J. (1996). Striatal D1 and D2 dopamine receptor loss in asymptomatic mutation carriers of Huntington's disease. Ann Neurol 40, 49-54. Wong, C. (1954). Beta Decay of F^{17} and C^{11}. Physical Review 95, 765-766. Wuest, F., Berndt, M., and Kniess, T. (2007). Carbon-11 labeling chemistry based upon [11C]methyl iodide. Ernst Schering Research Foundation workshop, 183-213.

6.2 INTERNETBRONNEN

1. http://www.psych.ndsu.nodak.edu/mccourt/Psy486/Biochemistry%20and%20Neuropharm

acology/synaptic%20transmission (10-04-2012)

2. http://images.yourdictionary.com/cyclotron (2-04-2012)

3. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/176435?lang=en&region=BE (25-

03-2012)

4. https://www.chem.agilent.com/Library/applications/59801660.pdf (20-04-2012)

5. http://www.plant.uoguelph.ca/research/homepages/raizada/Equipment/RaizadaWeb%20E

quipment%20PDFs/5B.%20UV%20VIS%20theory%20ThermoSpectric.pdf (2-03-2012)

6. http://goldbook.iupac.org/P04598.html (25-04-2012)

7. http://www.srigc.com/FID.pdf (15-03-2012)

8. http://www.lonza.co.jp/bioscience/rapid-testing-solutions/endotoxin/pdf/647u.pdf (25-03-

2012)

9. http://www.rdchemicals.com/chemicals.php?mode=details&mol_id=2592 (2-05-2012)

Bijlage

BIJLAGE 1

Bijlage

Bijlage

Bijlage

Bijlage

Bijlage

Bijlage

BIJLAGE 2

Bijlage

BIJLAGE 3

Bijlage

BIJLAGE 4

INTERNALISATION AT HOME

1e evening lecture: Improving adherence: from research to policy to practice. Professor Barber- UCL School of Pharmacy

Het onderzoek van Professor Barber heeft alles te maken met het proberen vermijden van schade aan de patiënt door geneesmiddelengebruik. Hij benadrukt dat tegenwoordig veiligheid en voorkomen van risico’s erg belangrijk is geworden. Apothekers spelen daarbij een belangrijke rol. Drie parameters dragen bij tot schade door geneesmiddelgebruik: therapietrouw, het geneesmiddel zelf en fouten gemaakt door de zorgverstrekkers. Hij vermeldt ook dat het beter is de belangrijkste factoren grondig aan te pakken, dan overal iets aan te veranderen. De therapietrouw komt bijvoorbeeld bij 1/3 patiënten voor terwijl voorschrijffouten veel minder vaak voorkomen. De therapietrouw verbeteren is daarom belangrijk. 30-50% van de bevolking gebruikt een geneesmiddel chronisch, vandaar dat een lage therapietrouw nefast is voor de volksgezondheid en dat dit de staat veel geld kost aan extra ziekenzorg. Daarom dat de regering momenteel veel geld pompt in het ontwikkelen van een 'New Medicines Service'. Ook rationeel voorschrijven wordt belangrijker. Een behandeling instellen op basis van Number Needed to Treat (NNT) bijvoorbeeld. Om het effect van een interventie door de zorgverstrekker (apotheker) na te gaan, zette Prof. Barber een RCT op. Men bestudeerde patiënten die nieuwe chronische medicatie moesten nemen voor een cardiovasculaire aandoening of diabetes of ouder waren dan 75. Men maakte twee groepen. Een met en een zonder interventie van apothekers. Uit de resultaten blijkt dat een interventie een positief effect heeft op de veiligheid en effectiviteit en bovendien kosten bespaart. Ook de patiënten zelf vinden het nuttig. Nu is het moeilijkste en belangrijkste dit ook om te zetten in de praktijk en naar een ziekenzorg te evolueren waar voorkomen van ziekte belangrijker is dan genezen. Persoonlijk vind ik het belangrijk dat factoren zoals therapietrouw verbeterd worden. Het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of betere therapieën schiet hun doel anders wat voorbij, aangezien veel patiënten hun medicatie niet eens innemen.

2e evening lecture : counterfeit medicine. Wendy Greenall- Counterfeit Medicines Laboratory Manager Pfizer Counterfeit medicines worden gedefinieerd als een geneesmiddel waarvan de inhoud of verpakking niet overeenkomt met het authentiek product. Het is mogelijk dat het namaakproduct het actieve bestanddeel bevat maar dat kan evengoed ook niet zo zijn. Allerlei klassen geneesmiddelen van het farmaceutisch bedrijf Pfizer werden al nagemaakt(bv. viagra, aricept, cabaser, ...). Deze counterfeit medicines worden in enorme hoeveelheden geproduceerd en verkocht met woekerwinsten. Zeker de inburgering van het internet heeft voor een doorbraak van de namaak-geneesmiddelen gezorgd. Mensen kunnen makkelijk via het internet bestellen en er is weinig controle mogelijk. Pfizer heeft wereldwijd 3 anti-counterfeit laboratoriums (VS, UK, India) waar medicijnen worden geanalyseerd, bewijs tegen criminelen wordt gezocht en databases met informatie over vervalsingen worden aangemaakt. Er wordt geanalyseerd op basis van fysische, visuele en spectrale eigenschappen. Hierbij worden verschillende spectroscopische technieken gebruikt en ook GC en HPLC analyse wordt uitgevoerd. Persoonlijk vond ik het geen interessante lezing. Mvr. Greenall

Bijlage

heeft ,denk ik, niet de aspecten van haar vakgebied uiteengezet die voor ons het meeste nuttig waren.

3e evening lecture : Computational chemistry in drug discovery Alexander Alex- Great Mongeham, Kent, United Kingdom

Deze ‘evening lecture’ spitste zich toe op de ontwikkeling van kleine geneesmiddelmoleculen, met name op het vinden van een ‘lead’-molecule en de optimalisatie ervan. Deze processen kaderen in de ‘discovery’ fase van de geneesmiddelenontwikkeling. Dit wordt ook wel de computationele chemie genoemd. Sinds de jaren 80 is de kost om een nieuw geneesmiddel te ontwikkelen exponentieel gestegen, mede doordat veel potentiële geneesmiddelen falen tijdens de eerste fasen van het ontwikkelingsproces. De ontwikkelingskost van een nieuw geneesmiddel wordt momenteel geraamd op 1,1 biljoen dollar. Momenteel falen de meeste geneesmiddelen door een te lage efficiëntie. Meestal is het belangrijk dat een bepaalde molecule bindt op een proteïne ('docking'). Hierbij is een negatieve Gibbs-energie vereist en treedt interactie op via waterstofbruggen, zoutbruggen en van der Waalse interacties. Met polaire interacties is het moeilijk om een binding te vormen, gezien de vele mogelijke conformaties van de molecules. Computationele chemie is zeer belangrijk in het inschatten van de meest beloftevolle molecules. De software berekent welke molecules qua structuur en lading het meeste kans hebben om te intrageren met de target. Computationele chemie heeft een hogere kost-effectiviteit dan biologisch screenen van molecules. Er moet ook rekening gehouden worden met de absorptie en verdelingseigenschappen van de ‘lead’. Intramoleculaire waterstofbruggen verbeteren bijvoorbeeld de diffusie door celmembranen. Ook het metabolisme kan voorspeld worden door software. Persoonlijk vond ik dit een interessante en nuttige lezing. Het is duidelijk dat het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen efficiënter moet gebeuren om de stijgende kosten te drukken.

4e evening lecture : Applications of antibodies in the analysis of drugs, disease markes, bacteria en toxines. Professor Richard O'Kennedy- Dublin city university, Dublin, Ireland

Het onderzoeksgebied van Professor O'Kennedy is vooral toegespitst op antilichamen (AL). Deze AL kunnen zowel polyclonaal, monclonaal als recombinant zijn. Bij de productie van AL zijn zes zaken belangrijk (specificiteit, gevoeligheid, bronnen, selectie, screening en ‘sensing’). Antilichamen kunnen op verschillende manieren worden aangemaakt. Men kan het genfragment bijvoorbeeld in een plasmide incorporeren en bacteriën dit tot expressie laten brengen via een transformatie. Fagen kunnen deze AL ook op hun oppervlak dragen als ze dergelijke bacteriën infecteren. Er worden zo bibliotheken aangelegd met allemaal fagen die verschillende antilichamen tot expressie brengen. Op deze manier kan men screenen of een bepaald antigen bindt met een van de AL. Gebonden antilichamen kunnen gedetecteerd worden via de faag-ELISA techniek. Eens de correcte faag geselecteerd, worden opnieuw bacteriën hiermee geïnfecteerd om het AL te produceren. Tegenwoordig worden AL-bibliotheken automatisch gescreend via de ‘Surface Plasma Resonance biosensing’ (SPR) techniek. AL hebben verschillende toepassingen. Een eerste belangrijke toepassing is een AL dat bindt op Cardiac Troponin I (cTnI). Dit is een biomerker voor cardiovasculaire schade. Via dit AL is een snelle detectie van een beginnende hartkwaal mogelijk. Een tweede toepassing zijn AL die binden op geneesmiddelen of drug, zodat de plasma of

Bijlage

urineconcentratie kan berekend worden. Bijvoorbeeld een antilichaam dat warfarine kan binden of heroïne. Er bestaan ook antilichamen die binden op bacteriën die aanwezig zijn in voeding (Listeria monocytogenes) of toxines die door bacteriën worden geproduceerd (bv. alfatoxines). Een ander onderzoeksdomein van professor O'Kennedy zijn biochips, die voor meerdere molecules kunnen detecteren. Over het algemeen een zeer interessante lezing.