Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis...

Academiejaar 2015 - 2016

Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in

de muis en de mens: efficiëntie, veiligheid en ethische

aspecten

Swann Crabbé

Promotor: Prof. Dr. De Sutter

Masterproef voorgedragen in de 2de

Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.

This page is not available because it contains personal information.Ghent University, Library, 2021.

VOORWOORD

Deze masterproef was een boeiende ervaring over een fascinerend onderwerp, stamcel-

technologie in de reproductieve geneeskunde.

Graag zou ik hierbij mijn promotor Prof. Dr. Petra De sutter willen bedanken voor haar tijd,

motiverende ondersteuning en snelle, constructieve feedback.

Ik wil ook mijn moeder bedanken voor het nalezen van mijn thesis op taalfouten.

Een bijzondere dank gaat naar het OCMW Gent en Loes voor de financiële ondersteuning die

mij de kans geeft om mijn studie verder te zetten.

Ten slotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken voor hun luisterend oor en steun.

INHOUD

1. ABSTRACT 1

2. INLEIDING 3

2.1 Infertiliteit ....................................................................................................................... 3

2.2 Gametendonatie en adoptie ............................................................................................ 3

2.3 Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten .......................................................... 4

3. DOELSTELLING 4

4. METHODE 5

5. RESULTATEN 6

5.1 ACHTERGRONDINFORMATIE 6

5.1.1 Stamcellen ................................................................................................................... 6

5.1.1.1 Embryonale stamcellen (ESCs) ......................................................................... 6

5.1.1.2 Somatische cel nucleaire transfer (ntESCs) ...................................................... 6

5.1.1.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ................................................. 7

5.1.2 Gametogenese .............................................................................................................. 8

5.1.2.1 Meiose ................................................................................................................ 9

5.1.2.2 Epigenetica ........................................................................................................ 9

5.2 METHODE OM PSCDGs TE DERIVEREN 10

5.2.1 Stap 1: PGCLC-inductie ............................................................................................. 10

5.2.1.1 EBs versus monolayer cultuur .......................................................................... 11

5.2.1.2 Identificatie en isolatie van PGCLCs ............................................................... 11

5.2.1.3 Verhogen van de efficiëntie .............................................................................. 12

5.2.2 Stap 2: in vivo-stap ..................................................................................................... 12

5.3 MUIS PSCDGs 14

5.3.1 PGCLC-inductie ......................................................................................................... 14

5.3.2 In vivo-stap ................................................................................................................. 14

5.3.3 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie .................................................... 14

5.3.4 Meiose ........................................................................................................................ 16

5.3.4.1 Evaluatie van de meiose ................................................................................... 16

5.3.4.2 Pre-meiose ........................................................................................................ 16

5.3.4.3 Beoordeling meiose moeilijk ............................................................................ 16

5.3.4.4 Initiatie van meiose ........................................................................................... 17

5.3.4.5 Volledige meiose ............................................................................................... 17

5.3.5 Epigenetica ................................................................................................................. 17

5.3.5.1 Inprenting verwijdering .................................................................................... 18

5.3.5.2 Instellen paternaal inprenting-patroon ............................................................ 18

5.3.5.3 X-chromosoom activatie ................................................................................... 18

5.3.6 Hormonen ................................................................................................................... 19

5.3.7 Fertilisatie van mESC-gederiveerde gameten ............................................................ 19

5.3.8 miPSC-gederiveerde gameten .................................................................................... 20

5.4 HUMANE PSCDGs 21

5.4.1 PGCLC-inductie ......................................................................................................... 21

5.4.2 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie .................................................... 21

5.4.3 XY-OLCs en XX-SLCs .............................................................................................. 22

5.4.4 Meiose ........................................................................................................................ 22

5.4.4.1 Pre-meiose ....................................................................................................... 22

5.4.4.2 Beoordeling meiose moeilijk ............................................................................ 23

5.4.4.3 Iniatie van meiose ............................................................................................ 23

5.4.4.4 Volledige meiose? Onzekerheid over haploïde cellen ...................................... 23

5.4.4.5 Volledige meiose .............................................................................................. 24

5.4.4.6 Volledige meiose m.b.v. overexpressie van genen ............................................ 24

5.4.4.7 Meiose van OLCs en FLSs grootste barrière ................................................... 24

5.4.5 Epigenetica ................................................................................................................. 24

5.4.5.1 PGCLCs: geen inprenting-verwijdering .......................................................... 24

5.4.5.2 PGCLCs: initiatie inprenting-verwijdering ..................................................... 25

5.4.5.3 SLCs: correct instellen van paternaal inprenting-patroon .............................. 25

5.4.5.4 PGCLCs: correcte histonen-modificatie .......................................................... 25

5.4.6 Sertoli- en leydigcellen ............................................................................................... 26

5.4.6.1 Detectie van merkers ........................................................................................ 26

5.4.6.2 Detectie van hormonen ..................................................................................... 26

5.4.7 hESC- versus hiPSC-gerderiveerde GLCs ................................................................. 27

5.4.7.1 hESCs beter dan hiPSCs .................................................................................. 27

5.4.7.2 hiPSCs beter dan hESCs .................................................................................. 27

5.5 ETHISCHE EN SOCIALE ASPECTEN 29

5.5.1 Natuurlijk versus synthetisch...................................................................................... 29

5.5.2 Genetisch ouderschap ................................................................................................. 30

5.5.3 Veiligheid ................................................................................................................... 30

5.5.4 Psychologische consequenties voor het kind.............................................................. 33

5.5.5 Informed consent ........................................................................................................ 33

5.5.6 Destructie van embryo’s en vergelijking ESCs vs iPSCs........................................... 34

5.5.7 Humane experimenten met PSCDGs ......................................................................... 35

5.5.8 Financiering van PSCDGs en invloed op (on)gelijkheid ........................................... 37

5.5.9 Valse hoop en sociale druk ......................................................................................... 38

5.6 TOEPASSINGEN 39

5.6.1 PSCDGs voor wetenschappelijk onderzoek ............................................................... 39

5.6.2 Klinische toepassingen van PSCDGs ......................................................................... 40

5.6.2.1 Bieden PSCDGs een oplossing voor al deze patiënten? ................................. 40

5.6.2.2 Fertiliteitspreservatie ...................................................................................... 40

5.6.3 Nieuwe vormen van ouderschap ................................................................................. 41

6. DISCUSSIE 46

6.1 Efficiëntie ...................................................................................................................... 46

6.1.1 Samenvatting van resultaten ................................................................................ 46

6.1.2 Waarom is de meiose bij OLCs moeilijker dan bij SLCs? .................................. 47

6.1.3 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens? ....... 47

6.1.4 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij iPSCs als ESCs? ................... 48

6.1.5 Derivatie van gameten uit ntESCs ....................................................................... 48

6.1.6 Variabiliteit tussen de verschillende studies ....................................................... 48

6.2 Veiligheid ...................................................................................................................... 49

6.2.1 Morfologie en merkers ........................................................................................ 49

6.2.2 Meiose .................................................................................................................. 51

6.2.3 Epigenetica .......................................................................................................... 51

6.2.4 Fertilisatie ........................................................................................................... 52

6.2.5 Veiligheid voor de patiënt ................................................................................... 52

6.3 Conclusie ....................................................................................................................... 53

7. REFERENTIES 57

8. BIJLAGEN 61

BIJLAGE 1 ............................................................................................................................... 62

1. Afkortingenlijst

BIJLAGE 2 ............................................................................................................................... 63

Tabel 1: mESC-gederiveerde gameten.

BIJLAGE 3 ............................................................................................................................... 64

Tabel 2: Effecten van inducerende factoren bij mESC-gederiveerde gameten.

BIJLAGE 4 ............................................................................................................................... 65

Tabel 3: mESC-gederiveerde gameten: RNA- en proteïne merkers.

BIJLAGE 5 ............................................................................................................................... 67

Tabel 4 Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde OLCs

BIJLAGE 6 ............................................................................................................................... 69

Tabel 5: Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde SLCs

BIJLAGE 7 ............................................................................................................................... 71

Tabel 6: Overzicht miPSC-gederiveerde GLCs.

BIJLAGE 8 ............................................................................................................................... 72

Tabel 7: Merkers van hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten.

BIJLAGE 9 ............................................................................................................................... 73

Tabel 8: Overzicht hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten.

- 1 -

1. ABSTRACT

Inleiding

Infertiliteit kan een verwoestende aandoening zijn. Ongeveer 1 op 6 koppels kampt met

vruchtbaarheidsproblemen, waarvan 20% niet geholpen kan worden met de bestaande

geassisteerde voortplantingstechnieken. Gametendonatie en adoptie zijn geen ideale

alternatieven, o.a. omdat de patiënt niet genetisch verwant zal zijn met het kind. De creatie

van patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten zou mogelijks een oplossing kunnen

bieden. Bij de muis werden reeds functionele gameten bekomen obv stamceltechnologie,

maar bij de mens staan we nog niet zo ver. Naast wetenschappelijke zijn er nog tal van

ethische hindernissen te overwinnen. In de masterproef geven we een overzicht van de ‘state

of the art’ van de derivatie van gameten uit stamcellen (ESCs en iPSCs) bij de muis en de

mens. Daarnaast bespreken we de ethisch-sociale aspecten en potentiële toepassingen. Op

basis van deze informatie willen we onderzoeken of deze niewe techniek efficiënt, veilig en

ethisch verantwoord zou kunnen zijn in de toekomst.

Methode

Er werd een systematisch literatuuronderzoek uitgevoerd. M.b.v. verschillende zoektermen en

combinaties werd in de online databank Pubmed gezocht naar relevante studies waarin

onderzoek is gedaan naar stamcel-gederiveerde gameten. Om een antwoord te vinden op de

ethisch-sociale vraagstukken en potentiële toepassingen werd eveneens gebruik gemaakt van

Pubmed.

Resultaten

Sinds de eerste creatie van mESC-gederiveerde OLCs in 2003 heeft men m.b.v. ESCs en

iPSCs reeds heel wat kunnen realiseren: zowel bij de muis als de mens is men in staat om

PGCLCs in vitro te deriveren en deze te differentiëren tot SLCs, OLCs en FLSs. De vorming

van functionele OLCs en FLSs vormt de grootste uitdaging. De FLSs ontwikkelden zich

slechts tot secundaire follikels, antrale follikels werden (nog) niet gecreëerd. Volledige

meiose en vorming van mature en bewezen functionele gameten werd tot op heden uitsluitend

gerapporteerd bij mannelijke muizen.

De PSCDGs vertoonden frequent een afwijkende meiose en epigenetische herprogrammatie

(inprenting). Zowel de efficiëntie als de kwaliteit van de meiose waren slecht, de meeste

cellen ondergingen louter een initiatie van de meiose, in het bijzonder bij OLCs. Abnormale

- 2 -

inprenting manifesteerde zich reeds bij de ‘eerste’ stap van herprogrammatie, inprenting-

verwijdering, en werd tevens gezien bij de ‘tweede’ stap, herinstellen van parentaal

inprenting-patroon. Ten slotte werd de fertilisatie van zowel muis SLCs als FLSs succesvol

uitgevoerd. Gezonde en vruchtbare nakomelingen werden geboren, met normale

epigenetische kenmerkern. De efficiëntie van de fertilisatie van FLSs was echter laag,

vermoedelijk door triploïdie-afwijkingen. De bevruchting van humane GLCs is om ethische

redenen (nog) niet mogelijk.

De potentiële toepassing van PSCDGs bij de mens roept heel wat ethische en sociale vragen

op. Zijn PSCDGs slecht omdat ze niet natuurlijk zijn? Wat is de waarde van genetisch

ouderschap? Hoe veilig moet deze techniek zijn om het welzijn van het kind te garanderen?

Zouden PSCDGs een psychologische belasting zijn voor de resulterende kinderen? Zal

informed consent een probleem zijn? Zijn ESCs ethisch even aanvaardbaar als iPSCs?

Zouden humane experimenten met PSCDGs verantwoord zijn? Zal de techniek betaalbaar zijn

voor iedereen? Moeten we opletten met valse verwachtingen die gecreëerd worden bij

patiënten? Voor wie zou deze techniek beschikbaar mogen zijn: enkel voor onvruchtbare

mensen, of ook voor homoseksuele koppels, alleenstaanden, post-menopauzale vrouwen...?

Discussie

De derivatie van PSCDGs is een relatief inefficiënt proces. Voornamelijk de vorming van

OLCs is een uitdaging, de oorzaak hiervan is echter onduidelijk. Mogelijks is de derivatie van

PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens, en zijn ESCs even (in)efficiënt als

iPSCs. Onderzoek met ntESCs zouden nodig zijn als men patiënt-specifieke gameten zou

willen creëren met embryonale stamcellen. Er bestaat een grote variabiliteit tussen de

verschillende studies, mogelijks door het gebruik van verschillende methodes of door een

heterogeen intrinsiek differentiatie potentieel van stamcellijnen. Momenteel zijn PSCDGs

absoluut niet veilig. M.a.w. als PSCDGs ooit toegepast zouden worden in de kliniek, zal

veiligheid de overheersende bezorgdheid zijn. De meeste studies besteden echter relatief

weinig aandacht aan de klinische toepasbaarheid van PSCDGs. Als men pre-klinische of

klinische evaluatie zou willen uitvoeren, zal een meer extensieve analyse van de PSCDGs

noodzakelijk zijn. Mogelijks zullen PSCDGs nooit ‘volledig’ veilig zijn.

Conclusie

Er bestaat een mogelijkheid dat PSCDGs ooit efficiënt, veilig en ethisch verantwoord zouden

kunnen zijn. Er zijn echter veel wetenschappelijke en ethische uitdagingen.

- 3 -

2. INLEIDING

2.1 Infertiliteit

De omvang en de impact van infertiliteit zijn zeer groot. Infertiliteit kan een verwoestende

aandoening zijn voor koppels met een kinderwens en kan leiden tot depressie, een negatief

zelfbeeld, echtscheiding en financiële problemen. [1] Ongeveer 15% tot 20% van alle koppels

heeft vruchtbaarheidsproblemen. [2] De prevalentie van infertiliteit is aan het stijgen, o.a. door

een trend de kinderwens uit te stellen, verhoogde blootstelling aan chronische stress en

milieuvervuiling en gonadotoxische, oncologische behandelingen. [3] Afhankelijk van de

oorzaak kan infertiliteit medisch of chirurgisch behandeld worden, hierbij kunnen

geassisteerde reproductieve technieken (ARTs) gebruikt worden, zoals IVF en ICSI. Sinds de

geboorte van Louise Brown in 1978, de eerste baby in de wereld geboren dankzij IVF, [4] is

er veel vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van ART. Momenteel kan 80% van de

koppels met vurchtbaarheidsproblemen geholpen worden om hun kinderwens te vervullen. [5]

2.2 Gametendonatie en adoptie

Als de beschikbare behandelingen m.b.v. ARTs met eigen gameten niet succesvol of geen

optie zijn, kunnen gametendonatie of adoptie overwogen worden. Adoptie kan goedkoper en

soms minder psychologisch belastend zijn voor een koppel dan ARTs. [6] Er zijn echter lange

en stijgende wachttijden. [7] Bovendien zal het kind niet genetisch verwant zijn met de

ouders, voor veel patiënten heeft genetisch ouderschap echter een belangrijke waarde.

Bij gametendonatie zal het kind meestal wel genetisch verwant zijn met de partner van de

patiënt. Volgens cijfers van het ESHRE werden in 2009 in totaal 21604 cycli uitgevoerd met

donor oöcyten en 29235 met donor sperma in Europa. [8] Gametendonatie is echter geen

ideale oplossing. Ten eerste zal het kind niet genetisch verwant zijn met de patiënt. Ten

tweede bestaat er een prangend tekort aan oöcytdonoren in een aantal landen. [9] Ondermeer

omdat oöcytdonatie een intensieve en risicovolle procedure is. [10] Dit tekort zou volgens

sommigen kunnen worden opgelost door donoren te betalen. Maar dit is ethisch

controversieel, aangezien er een risico bestaat op exploitatie of commercialisatie van de

oöcytdonor. [11] Ten slotte is anonimiteit een complex probleem. De ouders hebben het recht

op autonomie en privacy, de donor het recht op privacy en het kind het recht om zijn/haar

afkomst te kennen. Deze rechten kunnen niet altijd verzoend worden. [12] Daarnaast bestaat

er sinds jaren onenigheid of men het kind moet vertellen over het gebruik van gedoneerde

- 4 -

gameten, alhoewel er recent een trend bestaat om het ‘wel te vertellen’. Omdat dit minder

ontwrichtend blijkt te zijn voor het kind dan men vroeger verwacht had. [13]

2.3 Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten

Gametendonatie en adoptie zijn geen ideale alternatieven voor onvruchtbare patiënten, o.a.

omdat de patiënt niet genetisch verwant zal zijn met het kind. De creatie van patiënt-

specifieke stamcel-gederiveerde gameten zou mogelijks een oplossing kunnen bieden. Dit zijn

oöcyten of spermatozoa die men genereert uit pluripotente stamcellen, meer bepaald

embryonale stamcellen na somatische cel nucleaire transfer of geïnduceerde pluripotente

stamcellen. In 2003 slaagden Hübner et al. er voor de eerste keer in om muis stamcel-

gederiveerde oöcyten te creëren. [14] Sindsdien is er in snel tempo reeds heel wat

gerealiseerd. In 2011 werden met deze techniek muizen geboren, nadat stamcel-gederiveerde

spermatozoa bevrucht werden met oöcyten. [15] Bij de mens staat men nog niet zo ver, maar

sommigen beweren dat deze techniek binnen een aantal jaren reeds haalbaar zou kunnen zijn

bij de mens [16] Maar als het technisch haalbaar zou zijn, zal het dan ook veilig zijn? Want

als men stamcel-gederiveerde gameten bestudeert, merkt men dat deze afwijkingen vertonen,

ondermeer bij de meiose en epigenetische herprogrammatie. Met deze nieuwe techniek

dringen zich ook heel wat ethische en sociale vragen op. Wat is de waarde van genetisch

ouderschap? Hoe belangrijk is het welzijn van het resulterend kind? Voor wie zou deze

techniek beschikbaar mogen zijn: enkel onvruchtbare mensen, of ook homoseksuele koppels,

alleenstaanden, post-menopauzale vrouwen...? Kortom, de opkomst van stamcel-gederiveerde

gameten brengt heel wat wetenschappelijke, ethische en sociale vragen met zich mee.

3. DOELSTELLING

Het doel van deze masterproef is om te onderzoeken of stamcel-gederiveerde gameten een

efficiënt, veilig en ethisch verantwoord proces is of zou kunnen zijn in de toekomst. We

beschrijven de methode om gameten te deriveren uit stamcellen (ntESCs en iPSCs) en geven

een overzicht van de ‘state of the art’ bij de muis en de mens. We focussen ons op de

evaluatie van stamcel-gederiveerde gameten, gecreëerd in verschillende studies, o.b.v.

bepaalde criteria die mogelijks een invloed hebben op de functionaliteit en veiligheid van

gameten: morfologie, merkers, meiose, epigenetica en hormoondetectie. Daarnaast zullen we

een overzicht geven van ethische en sociale aspecten van deze techniek. Ten slotte

beschrijven we potentiële toepassingen van stamcel-gederiveerde gameten.

- 5 -

4. METHODE

De uitwerking van deze thesis werd gestart met een oriënterend onderzoek. Hierdoor kon een

beeld geschetst worden over de thematiek van de thesis. Vervolgens werd een integraal

overzicht samengesteld van relevante studies waarin onderzoek is gedaan naar stamcel-

gederiveerde gameten. Dit liet toe resultaten m.b.t. de evaluatie en moleculaire analyse van de

gederiveerde gameten te vergelijken.

De zoektocht naar relevante artikels werd gestart in de online databank Pubmed. Er werden

verscheidene combinaties toegepast. Aan de ene kant werden volgende termen gebruikt:

‘germ cells’, ‘germ line’, ‘sperm’, ‘oocyte’, ‘egg’, ‘gametes’, ‘primordial germ cell’,

‘primordial germ cell-like cell’… Deze termen werden gecombineerd met één van de

volgende: ‘artificial’, ‘synthetic’, ‘stem cell-derived’, ‘stem cells’, ‘pluripotent stem cells’,

‘embryonic stem cells’, ‘induced pluripotent stem cells’, ‘somatic cell nuclear transfer’,

‘therapeutic cloning’...

Naast het rechtstreeks zoeken van artikels werd ook een significant deel van de artikels

gevonden met behulp van de befaamde ‘sneeuwbalmethode’. Dit is een methode waarbij men

systematisch alle referenties van geselecteerde artikels doorzoekt. Waarna de nieuw verkregen

artikels opnieuw worden nagekeken, enz.

De publicaties werden zorgvuldig gescreend en geselecteerd, volgende exclusie-criteria

werden toegepast: de identificatie en/of differentiatie van spermatogoniale of ovariele

stamcellen; derivatie van gameten uit andere types pluripotente stamcellen dan ESC en iPSC,

zoals foetale SC (FSC), amnionvocht SC,...; in vitro derivatie van spermatozoa en oöcyten uit

voorlopercellen; andere organismen dan muis of mens; in een andere taal dan het engels zijn

geschreven.

Ten slotte werd aandacht geschonken aan de ethische vraagstukken die stamcel gederiveerde

gameten met zich meebrengen. Er is gezocht geweest met de basiswoorden: ‘ethics’ of

‘ethical’. Deze werden gecombineerd met verscheidene termen: ‘artificial’, ‘synthetic’, ‘stem

cells’, ‘pluripotent stem cells’, ‘embryonic stem cells’, ‘induced pluripotent stem cells’,

‘somatic cell nuclear transfer’, ‘therapeutic cloning’, ‘pluripotent stem cell-derived

gametes’,... samen met de begrippen: ‘germ cells’, ‘germ line’, ‘sperm’, ‘oocyte’, ‘egg’,

‘gametes’, ‘primordial germ cell’, ‘primordial germ cell-like cell’.

- 6 -

5. RESULTATEN

5.1 ACHTERGRONDINFORMATIE

5.1.1 Stamcellen

Stamcellen (SCs) zijn niet gedifferentieerde cellen en worden gekenmerkt door hun vermogen

tot onbeperkte zelfvernieuwing en proliferatie. SC kunnen differentiëren in meer mature en

gespecialiseerde cellen. Er zijn 3 soorten SCs: totipotent, pluripotent en multipotent. Een

zygote is totipotent, omdat deze zich kan ontwikkelen tot een volledig organisme.

Pluripotente cellen kunnen differentiëren tot cellen van alle drie de kiemlagen van het

embryo, maar niet meer tot extra-embryonaal weefsel, zoals amnion en chorion. [17]

Pluripotente stamcellen kunnen verkregen worden op 3 manieren: embryonale stamcellen

(ESCs), embryonale stamcellen gederiveerd uit gekloonde embryo’s na SCNT (ntESCs), en

geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).

5.1.1.1 Embryonale stamcellen (ESCs)

De eerste derivatie van embryonale stamcellen gebeurde bij de muis in 1981. [18, 19] ESCs

worden verkregen uit de binnenste cellaag (inner cell mass, ICM) van de blastocyst. De

doorbraak kwam in 1998 met de isolatie van humane ESCs, [20] sindsdien heeft

stamcelonderzoek zich op een adembenemend tempo ontwikkeld. Dit zorgde voor nieuwe

mogelijkheden om inzicht te verkrijgen in de ontwikkelingsbiologie, ziektepathologie en

ontwikkeling van medicatie. Bovendien bezit het een enorm potentieel voor toekomstige

therapeutische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde, om ernstige ziektes te

behandelen, zoals ruggenmergletsels, ziekte van Parkinson, type 1diabetes en blindheid door

maculaire degeneratie. [21] Embryonale stamcellen zijn meestal afkomstig van overtollige

embryo’s bij IVF en dus genetisch verschillend van de patiënt. Twee andere types stamcellen

kunnen wel genetisch patiënt-specifiek zijn: somatische cel nucleaire transfer en geïnduceerde

pluripotente stamcellen.

5.1.1.2 Somatische cel nucleaire transfer (ntESCs)

In 1952 ontwikkelden Briggs en King de techniek ‘somatische cel nucleaire transfer’. [22] Bij

deze ‘nucleaire transfer’ transplanteert men de kern van een somatische cel van een donor in

een oöcyt die geënucleëerd is (de kern werd verwijderd). Deze samengestelde oöcyt kan zich

ontwikkelen tot een embryo. Na plaatsing van dit embryo in de baarmoeder van een

- 7 -

draagmoeder, ontwikkelt zich een organisme met identiek genetisch materiaal als de donor.

Dit noemt men reproductief klonen. In 1996 slaagde men er voor het eerst in om een zoogdier

te klonen, met de geboorte van het wereldberoemde schaap Dolly. [23] Omwille van ethische

en veiligheidsredenen is het algemeen aangenomen dat reproductief klonen van mensen

verboden is. [24]

Fig.1: Schematische voorstelling somatische cel nucleaire transfer. [25]

Naast reproductief klonen, kan men SCNT ook toepassen voor het ontwikkelen van ESCs:

therapeutisch klonen. Bij therapeutisch klonen zijn de eerste stappen van de procedure met

SCNT dezelfde als bij reproductief klonen, maar het gekloond embryo wordt niet ingeplant

bij een draagmoeder, er ontstaat dus geen nieuw organisme. [24] De verkregen blastocyst

dient als bron voor de islolatie van ESCs (nucleaire transfer gederiveerde ESCs, ntESCs), die

hetzelfde genetische materiaal zullen hebben als de donor van de somatische cel-nucleus.

Zowel bij de muis als de mens is men er reeds in geslaagd ntESCs te creëren. [26, 27]

De efficiëntie om muizen te klonen is laag (1-2%). [28] De meeste klonen sterven snel na de

implantatie van het embryo of worden geboren met ernstige afwijkingen. [29] Daarom is het

belangrijk om te beoordelen of patiënt-specifieke ntESCs therapeutisch bruikbaar en veilig

zijn. Men kon echter geen moleculaire of biologische verschillen waarnemen tussen ntESCs

en klassieke ESCs. [26] Bovendien ligt de efficiëntie voor de derivatie van ntESCs veel hoger

(~20%) dan de efficiëntie voor het klonen van organismen (1-2%). [29] Dit indiceert dat

ntESCs even geschikt zijn voor therapeutische applicatie als ESCs. [30]

5.1.1.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

In 2006 verbaasden Takahashi en Yamanaka de wetenschappelijke wereld met de introductie

van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) bij de muis. [31] Hierbij forceerden ze een

volwassen, gedifferentieerde huidcel, een fibroblast, om te de-differentiëren naar een

pluripotente toestand. Dit herprogrammeren kan men door het terug ‘aanschakelen’ van de

- 8 -

genen verantwoordelijk voor pluripotentie, meer bepaald het tot expressie brengen van vier

transcriptiefactoren in een gedifferentiëerde cel m.b.v. vectoren: Oct4, Sox2, Klf4, and c-

Myc. Amper een jaar later slaagden verschillende onderzoeksgroepen erin iPSCs te genereren

uit humane somatische cellen. [32, 33]

Geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn veelbelovend, maar momenteel stellen zich nog

een aantal problemen. Ten eerste is het onduidelijk of iPSCs even potent en

ongedifferentieerd zijn als ESCs, aangezien er mogelijks een risico bestaat dat iPSCs na

herprogrammatie een ‘epigenetisch geheugen’ bewaren afkomstig van hun somatische bron.

[34] Ten tweede zijn er bezorgdheden m.b.t. de veiligheid van iPSCs voor klinische

toepassing. Sommige transcriptiefactoren zijn potentieel oncogeen, zoals c-Myc, deze factor

zou echter niet essentieel zijn voor herprogrammatie. [35] Daarnaast bestaat er een risico op

genetische recombinatie of insertie mutagenese, door onwillekeurige integratie van de vector

in het genoom. Men is echter alternatieve strategieën aan het ontwikkelen om dit probleem op

te lossen, zoals het gebruik van niet-integratieve methodes en DNA-vrije methodes. [35, 36,

37]

5.1.2 Gametogenese

De gameten, geslachtscellen, zorgen voor de transmissie van genetische informatie tussen

generaties en zijn essentieel voor het overleven van een soort. Gameten ontstaan uit

primordiale kiemcellen (primordial germ cells, PGCs). Deze PGCs zijn voor het eerst

waarneembaar op embryonale dag (E) 6.25 in het epiblast aan de basis van de allantoïs. [38]

PGCs ontstaan door een combinatie van inducerende en inhiberende signalen. BMP4, BMP2

en BMP8b zijn belangrijke stimulerende signalen, afkomstig van het extra-embryonaal

ectoderm en het visceraal endoderm. [39] Deze induceren de expressie van

transcriptiefactoren (DPPA3, BLIMP1, PRDM14 en AP2γ), [40] die verantwoordelijk zijn

voor essentiële veranderingen: inductie van PGC genen, repressie van somatische genen,

herverwerven van pluripotentie [41] en epigenetische herprogrammatie. [42]

Na de vorming van PGCs, migreren deze langs de wand van de dooierzak naar de primitieve

gonaden. Tijdens de reis prolifereren de ~40 PGCs zich enkele keren, waarna een ~1000

PGCs zich nestelen in de primitieve geslachtsstrengen op E11.5. Na de kolonisatie van de

gonaden begint de de seksuele differentiatie. [43] De PGCs ontwikkelen zich tot de

mannelijke en vrouwelijke precursoren van de gameten, respectievelijk spermatogonia en

oögonia.

- 9 -

5.1.2.1 Meiose

De differentiatie van spermatogonia en oögonia naar respectievelijk mature spermatozoa en

oöcyten noemt men de spermatogenese en oögenese. De spermatogonia en oögonia ondergaan

mitose en groei. Hieruit ontstaan diploïde primaire spermatocyten en oöcyten. Deze vormen

na meiose haploïde spermatiden en oöcyten. Bij de man zal spermatogenese beginnen vanaf

de puberteit en levenslang worden verder gezet. [44] Bij de vrouw vormen zich tijdens de

embryonale ontwikkeling miljoenen primaire oöcyten die zich in de profase van de eerste

meiotische deling bevinden, de meerderheid van deze cellen zal degenereren. Bij de ovulatie

wordt meiose I voltooid en meiose II gestart tot in de metafase. Meiose II wordt afgerond op

het moment de oöcyt bevrucht. [45]

De meiose bestaat uit een fase van DNA replicatie (de interfase) en 2 celdelingen (met elk

profase, metafase, anafase en telofase). De eerste meiotische deling wordt voorafgegaan door

een lange profase I, waarbij het chromatine condenseert tot chromosomen. De profase kan

onderverdeeld worden in verschillende stadia (leptoteen, zychoteen, pachyteen, diploteen en

diakinese). Crossing-over doet zich voor tijdens het zychoteen en pachyteen tijdens de paring

van de homologe chromosomen, waarbij chiasmata ontstaan. Dit proces is essentieel voor de

recombinatie van genetisch materiaal en een correcte meiose. Het positioneren van de

homologe chromosomen noemt men synaps-vorming en gebeurt m.b.v. het synaptonemaal

complex (SC), dat bestaat uit verschillende meiose-specifieke proteïnen (waaronder SCP3 en

SCP1). De vorming van het SC is essentieel voor het proces van crossing-over. Tijdens

anafase I worden de homologe chromosomen van elkaar weggetrokken en tijdens anafase II

worden de zusterchromatiden gesplitst. [46]

5.1.2.2 Epigenetica

Genomische inprenting is een epigenetisch regulatie mechanisme dat een essentiële rol speelt

bij de ontwikkeling, groei en gedrag van een individu. De epigenetische regulatie van de

genexpressie van inprenting-genen is afhankelijk van de parentale oorsprong: genen die

paternaal of maternaal tot expressie komen. Bij maternaal ingeprente genen (zoals Igf2r en

Snrpn) zal het maternale allel ‘uitgeschakeld’ zijn d.m.v. methylatie. Analoog zal bij paternaal

ingeprente genen (H19 en Peg3), het paternale allel inactief zijn. De inprenting-patronen

worden gevormd tijdens de gametogenese: eerst worden de oude methylatie-patronen

verwijderd, erna worden ze opnieuw ingesteld, afhankelijk van het geslacht van het individu.

[47, 48]

- 10 -

5.2 Methode om PSCDGs te creëren

In theorie zou men voor een patiënt die onvruchtbaar is gameten kunnen creëren uit patiënt-

specifieke, pluripotente stamcellen: pluripotente stamcel-gederiveerde gameten (PSCDGs).

De resulterende spermatozoa en oöcyten noemt men SLCs (spermatozoon-like cells) en OLCs

(oocyte-like cells) respectievelijk, of GLCs (gamete-like cells). Na ICSI met deze patiënt-

specifieke PSCDGs zouden ‘onvruchtbare’ patiënten, in principe, genetisch verwante

kinderen kunnen krijgen. Als bron voor patiënt-specifieke pluripotente stamcellen zou men

gebruik kunnen maken van ntESCs of iPSCs. De eerste stap is dus de creatie van deze

stamcellen, en de tweede stap is de generatie van PSCDGs (Fig 2.).

Voor de verklaringen van afkortingen in deze masterproef, zie Bijlage 1.

Fig.2: Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten. ICSI met gameten afkomstig van patiënt-specifieke

pluripotente stamcellen (ntESCs of iPSCs). SLCs = spermatozoön-like cells. OLC = oöcyt-like cell. ICSI = intra-

cytoplasmatische sperma-injectie (Illustratie gebaseerd op Fig1.B van Yao et al., 2011). [49]

We zullen de algemene methode om PSCDGs te creëren bespreken (Fig 3.). Deze methode is

van toepassing op zowel ESCs als iPSCs bij de muis en de mens. De differentiatie van

PSCDGs gebeurt meestal in 2 stappen: eerst worden stamcellen geïnduceerd om te

differentiëren tot PGC-achtige cellen (PGCLCs) in vitro en erna worden de PGCLCs verder

gedifferentieerd tot GLCs. Deze tweede stap is doorgaans een in vivo stap: rijping in een

testiculaire of ovariele niche.

5.2.1 Stap 1: PGCLC-inductie

Pluripotente SCs kunnen in een ongedifferentieerde staat behouden en geprolifereerd worden

door cultuur van deze stamcellen met LIF (leukemia inhibitory factor) en/of feeder cellen

(MEFs, mouse embryonic fibroblasts). Als men deze factoren verwijderd uit de cultuur zullen

- 11 -

de stamcellen spontaan differentiëren tot verschillende cellijnen afkomstig van de drie

kiemlagen en eveneens tot PGCLCs.

Fig.3: Stamcel-gederiveerde gameten bij de muis: methode. mESCs of miPSCs kunnen geïnduceerd worden

om te differentiëren tot PGCLCs, door wegname van LIF en MEFs. EBs en monolayer zijn 2 belangrijke

cultuur-vormen. Transfectie van een transgen is een methode voor isolatie van PGCLCs. De efficiëntie van

PGCLC-inductie kan verhoogd worden door inducerende factoren toe te voegen aan de cultuur of door

genetische manipulatie. De PGCLCs kunnen na een in vivo rijping SLCs of FLSs/OLCs vormen. Na ICSI

worden mogelijks muizen geboren. Afkortingen: zie tekst en Bijlage 1 (Illustratie gebaseerd op Fig2 van

Imamura et al., 2014). [50]

5.2.1.1 EBs versus monolayer cultuur

Er bestaan 2 veelgebruikte soorten cultuur voor de derivatie van PGCLCs uit mESCs:

adherente cultuur (monolayer vorming) en suspensie cultuur met de vorming van embryoid

bodies (EBs). Deze 2 methodes hebben zowel voor- en nadelen. Een adherente monolayer

cultuur is een planaire structuur, een voordeel hiervan is dat ieder deel van de cultuur uniform

zal blootgesteld worden aan oplosbare medium componenten. [51] De efficiëntie van deze

methode om PGCLCs te induceren was echter laag in verschillende studies. [14, 52] EBs zijn

driedimensionale structuren, waardoor de spatio-temporale organisatie tijdens de in vivo

embryogenese beter nagebootst wordt. [51]

5.2.1.2 Identificatie en isolatie van PGCLCs

Men kan PGCLCs identificeren door de expressie van genen te analyseren die geassocieerd

- 12 -

zijn aan de gametogenese in vivo: mRNA- en proteïne merkers. De isolatie van PGCLCs kan

men op 2 manieren uitvoeren. Een eerste manier gebeurt m.b.v. de transfectie van de

stamcellen met een reporter transgen. [53] Deze reporter kan zowel gelinkt zijn aan vroege

PGC-merkers, als late merkers (spermatogenese-merkers en oögenese-merkers). Een tweede

manier is de isolatie m.b.v. cel-oppervlakte merkers, zoals EpCAM [54] en CXCR4. [55]

De identificatie en isolatie van PGCLCs in de cultuur is een moeilijke opgave, aangezien

weinig merkers 100% specifiek zijn voor PGCLCs. PGCs zijn transcriptioneel en fenotypisch

zeer gelijkaardig aan pluripotente stamcellen, ze hebben veel merkers gemeenschappelijk.

[56]

5.2.1.3 Verhogen van de efficiëntie

PGCLCs kunnen spontaan gedifferentieerd worden uit stamcellen. Deze spontane methode,

zonder externe stimuli, heeft echter een bijzonder lage efficiëntie en is onvoorspelbaar.

[14,57] Er bestaan 2 strategieën om de efficiëntie van PGCLC-inductie te verhogen:

modificatie van de cultuur d.m.v. toevoegen van externe, inducerende factoren en genetische

manipulatie.

5.2.2 Stap 2: in vivo-stap

De meeste studies slaagden erin PGCLCs in vitro te induceren, de differentiatie tot mature en

competente gameten is echter een grotere uitdaging. Daarom introduceerde men een in vivo-

stap: de creatie van een gonadale niche die de rijping stimuleert, meestal door transplantatie

van de PGCLCs naar gonaden van de muis. Men heeft nog geen bewezen functionele GLCs

kunnen deriveren zonder deze in vivo-stap. [58] Transplantatie is bij de mens (nog) niet

mogelijk.

De PGCLCs kunnen rechtstreeks getransplanteerd worden naar de gonaden. [59] Meestal

wordt echter gebruik gemaakt van een tussenstap: co-cultuur met gonadale cellen. Hierdoor

vormen zich aggregaten, gereconstitueerde testes of ovaria (Fig.4), die getransplanteerd

worden naar de gonaden voor maturatie van de PGCLCs. [52] Ectopische transplantatie onder

het nierkapsel van de muis is eveneens mogelijk. [60] Bij de transplantatie bestaat er een

risico op vorming van teratomen, veroorzaakt door een onvoldoende zuiverheid van de

PGCLC-populatie. [52]

- 13 -

Fig.4: Vorming van aggregaten van PGCLCs en gonadale cellen: gereconstitueerde testes. . [61]

Soms wordt de transplantatie-stap niet gedaan, maar creëert men wel een gonadale niche in

vitro: ofwel m.b.v een co-cultuur met gonadale cellen, [58,62] ofwel m.b.v. een cultuur met

geconditioneerd medium (CM) van gonadale cellen. [63]

- 14 -

5.3 MUIS PSCDGs

5.3.1 PGCLC-inductie

Om de efficiëntie van PGCLC-inductie te verhogen werd reeds geëxperimenteerd met een

groot aantal inducerende factoren toegevoegd aan de cultuur (zie Bijlage 3 voor een meer

uitgebreid overzicht dan hier beschreven).

5.3.2 In vivo-stap

Zoals eerder beschreven wordt er frequent gebruik gemaakt van een in vivo-stap voor de

differentiatie van PGCLCs tot GLCs (zie 5.2.2). Voor een overzicht van de gebruikte

methodes voor deze stap verwijzen we naar Bijlage 2.

5.3.3 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie

Enkele studies genereerden uitsluitend PGCLCs, omdat geen in vivo-stap werd toegepast.

Meerdere studies toonden aan dat het mogelijk is mature geëlongeerde spermatiden in vitro te

creëren uit mESCs. Morfologisch zagen deze spermatiden er normaal uit, met een goede

mobiliteit, vorming van een staart-achtige structuur en acrosoom, en nucleaire condensatie.

[52,66,67] Bovendien werden spermatogenese-merkers tot expressie gebracht. [58,59,65,66]

Deze SLCs vertoonden echter epigenetische- en meiose-afwijkingen. Voor een overzicht van

de moleculaire afwijkingen geobserveerd bij mSLCs verwijzen we naar Bijlage 6.

Een aantal studies deriveerden uitsluitend OLCs. [58,67] Anderen vonden wel een beginnende

follikelvorming, maar deze FLSs ontwikkelden zich slechts tot primordiale en primaire

follikels, bovendien was de zona pellucida abnormaal of afwezig. [14,60,63] Ten slotte

genereerden Nitta et al. (2013) en Hayashi et al. (2012) secundaire follikels. Ze observeerden

grote OLCs omgeven door meerdere lagen van granulosa- en theca- achtige cellen. [61,68] De

OLCs hadden echter een abnormale ellips vorm (vermoedelijk door cytoskeletale immaturiteit

en/of fragiliteit), en waren niet omringd door cumulus cellen (COC). [61] Men is er nog niet

in geslaagd tertiaire follikels te creëren. Nitta et al. (2013) stelden dat het falen van de

ontwikkeling tot tertiaire follikel mogelijks veroorzaakt werd door een aantal moleculaire

afwijkingen: het falen van de meiose, ambigue seks determinatie, en abnormale genomische

inprenting, hormonenregulatie en cel-cel interactie. [68] Voor een overzicht van de

moleculaire afwijkingen geobserveerd bij mOLCs verwijzen we naar Bijlage 5.

- 15 -

Fig.5: Schema dat een samenvatting toont van de moleculaire afwijkingen van mESC-gederiveerde

gameten in vitro. [68]

De indentiteit van PGCLCs en GLCs werd bevestigd a.d.h.v. de detectie van een

verscheidenheid aan merkers (zie Bijlage 4). Vroege merkers (PGC-geassocieerde merkers)

werden frequenter geëvalueerd dan late merkers (meiose, spermatogenese, oögenese). Soms

waren specifieke merkers niet detecteerbaar, zoals een aantal meiose-merkers. [69] en

oögenese-merkers (ZP1). [14]

Silva et al. (2009) onderzochten de temporele expressie van 12 genen geassocieerd aan de

gametogenese bij mESC-gederiveerde kiemcellen en concludeerden dat deze expressie-

patronen niet volledig correct de in vivo gametogenese imiteerden. Bij de meeste genen waren

de temporele veranderingen relatief gelijklopend met de geanticipeerde sequentie van de

gametogenese in vivo, maar bij sommige genen vond men discordante patronen. [65] De

meeste studies observeerden echter dat het dynamisch expressie-patroon wel correct

gereproduceerd werd. [15,69,70] Nitta et al. vergeleken de kwantitatieve expressie van genen

van mES-gederiveerde FLSs met deze van ovaria. Hieruit kon men concluderen dat de gen-

expressie profielen van de FLSs eerder gelijkaardig zijn aan embryonale ovaria dan aan

neonatale of volwassen ovaria, wat betekent dat de FLSs nog niet volledig ontwikkeld waren.

- 16 -

[68] Ten slotte ondervonden Hayashi et al. m.b.v. microarray analyse dat de PGCLCs grote

gelijkenissen vertoonden met E9.5 PGCs. [61]

5.3.4 Meiose

Meiose is een uniek en complex proces tijdens de gametogenese. De recapitulatie van de

meiose in vitro is niet evident, en blijkt een grote uitdaging te zijn voor de ontwikkeling van

functionele stamcel-gederiveerde gameten. Momenteel werd volledige meiose uitsluitend

gerapporteerd bij SLCs. Meiose bij OLCs werd wel geïnduceerd in sommige studies, maar

deze ontwikkelden niet verder dan de profase van meiose I. [60] Eerst wordt uitgelegd o.b.v.

welke criteria de meiose geëvalueerd kan worden. Daarna beschrijven we de resultaten m.b.t.

de meiose, die we indelen in 4 groepen afhankelijk van de progressie van de meiose.

5.3.4.1 Evaluatie van de meiose

Er worden verschillende criteria gebruikt om de meiose te beoordelen. Tijdens de meiose

worden specifieke proteïnen tot expressie gebracht, zoals SCP3. In vivo is SCP3 voor het eerst

detecteerbaar als een punctiform patroon t.h.v. de nucleus tijdens het leptoteen. Daarna zal

SCP3 gelokaliseerd zijn t.h.v. de volledige lengte van de zusterchromatiden (= geëlongeerd

patroon) tijdens het pachyteen, waarbij MLH1 noduli plaatsen van chromosoom recombinatie

markeren. Bovendien kan de vorming van een synaps recombinatie doen vermoeden. [71,72]

SCP3 lokalisatie langs de chromosomen (geëlongeerd patroon) is een significante indicator

van de meiose en veel specifieker voor de progressie van meiose dan de expressie van mRNA

of proteïnen. [73]

5.3.4.2 Pre-meiose

Novak et al. (2006) en Qing et al. (2007) deriveerden OLCs/FLSs, maar deze ondergingen

geen meiose. Er werden wel enkele eigenschappen van de meiose waargenomen, die

suggereren dat de cellen zich in een voorbereidingsfase van de meiose bevonden. Novak et al.

detecteerden SCP3, maar verschillende andere proteïnen essentieel voor de meiose waren niet

detecteerbaar. Bovendien was SCP3 niet chromosomaal gelokaliseerd werd er geen synaps

gevormd. [69] Qing et al. (2007) detecteerden eveneens SCP3, maar deze was

cytoplasmatisch gelokaliseerd. [58]

5.3.4.3 Beoordeling meiose moeilijk

Sommige studies onderzochten enkel de expressie van SCP3, deze merker is suggestief voor

- 17 -

een pre-meiose of meiose-stadium. Deze merker is echter aspecifiek waardoor conclusies

m.b.t. een correcte meiose niet mogelijk zijn. [65,67]

5.3.4.4 Initiatie van meiose

De mESC-gederiveerde FLSs van Nicholas et al. (2009) vertoonden een initiatie van de

meiose, maar de meiose werd niet volledig volbracht. Verschillende meiose-merkers waren

nucleair lokaliseerbaar na toevoegen van FAC-medium, wat betekent dat de meiose werd

geïnduceerd. SCP3 en SCP1 vertoonden echter een onvolledige chromosomale alignatie en

synaps-vorming. Bepaalde eigenschappen van de synaps waren wel waarneembaar, zoals de

co-lokalisatie van het centromeer t.h.v. SCP3 en de chromosomen. Deze resultaten betekenen

dat de FLSs zich waarschijnlijk slechts ontwikkelden tot profase I van de meiose. De

efficiëntie van meiose inductie was bovendien heel laag (slechts 1-3% van de PGCLCs). [60]

Hübner et al. (2003) observeerden poollichaampjes-achtige cellen nadat gonadotrofines

werden toegevoegd aan de cultuur, wat betekent dat de eerste meiotische deling mogelijks

volbracht was. [14] Deze bevindingen bewijzen echter geen correcte meiose. Ten slotte

deriveerden Hayashi et al. OLCs met een nucleair, geëlongeerd SCP3 patroon, deze OLCs

bevonden zich m.a.w. in het zygoteen stadium van profase I. Deze observaties waren

suggestief voor een correcte crossing-over tijdens de meiose. [15]

5.1.5 Volledige meiose

Enkel wanneer mannelijke SLCs gederiveerd werden kon een volledige meiose geöbserveerd

worden. [59,66] Geijsen et al. (2004) observeerden dat slechts een kleine hoeveelheid van de

cellen in de cultuur aankleurden voor het proteïne FE-J1 (0.01%), dat normaal gezien tot

expressie wordt gebracht door spermatocyten en spermatiden. Bovendien bleef de

meerderheid van deze FE-J1-positieve cellen diploïd, wat betekent dat de meiose een heel

lage efficiëntie had. [66] Nayernia et al. (2006) genereerden een meer succesvolle meiose. Na

RA-stimulatie en transplantatie in de testes van muizen werden haploïde SLCs gederiveerd.

Bovendien kon synaps-vorming waargenomen worden met een elektronen microscoop. [59]

5.3.5 Epigenetica

De GLCs vertoonden heel wat afwijkingen m.b.t. hun epigenetische status, zowel in de eerste

stap ‘inprenting-verwijdering’ als de tweede stap ‘instellen paternaal inprenting-patroon’.

Deze epigenetische fouten manifesteerden zich zowel bij OLCs als SLCs.

- 18 -

5.3.5.1 Inprenting verwijdering

Young et al. (2010) observeerden geen inprenting-verwijdering van H19. [70] Zij stelden dat

dit overeen kwam met PGCLCs vóór de kolonisatie. [74] Bij Nayernia et al. (2006) werd de

inprenting-verwijdering correct uitgevoerd bij 2 van de 3 bestudeerde genen (H19 en Igf2r),

maar de methylatie van Snrpn steeg contradictorisch. [59] Ten slotte observeerden Wei et al.

(2008) en Hayashi et al. (2011) een volledig correcte inprenting-verwijdering van een aantal

genen. Het herinstellen van een paternaal inprenting-patroon kon echter niet waargenomen

worden. [75]

5.3.5.2 Instellen paternaal inprenting-patroon

Na demethylatie moeten nieuwe inprenting-patronen ingesteld worden, hierbij is een juiste

seksuele differentiatie belangrijk. Bij Nayernia et al. (2006) vertoonden de SLCs een

gedeeltelijk correcte inprenting regulatie. Een aantal genen initieerden namelijk het instellen

van het paternaal inprenting-patroon (Igf2r en Snrpn), terwijl dit proces bij andere genen nog

niet was begonnen (Igf2r en H19). Ten slotte analyseerden ze dat de SLCs een correcte

chromatine condensatie vertoonden die overeenstemde met mature spermatozoa. [59]

Bij de derivatie van OLCs uit XY-mESCs, observeerden Nitta et al. (2013) een paternale

inprenting i.p.v. een verwachte maternale inprenting. [68] Dit zou mogelijks toegeschreven

kunnen worden aan de expressie van Dnmt3L bij de OLCs, wat zorgt voor een

androgenetische genomische inprenting. [76] Andere spermatogenese-geassocieerde genen

(Sry, Nanos, Miwi) werden echter niet tot expressie gebracht.

5.3.5.3 X-chromosoom activatie

Hayashi et al. onderzochten eveneens de activiteit van het X-chromosoom bij PGCLCs. De

EpiLCs vertoonden een correcte initiatie van X-inactivatie. In tegenstelling tot het X-

chromosoom van de PGCLCs dat gereactiveerd werd bij de PGCLCs, zoals bij in vivo PGCs.

[15]

5.3.6 Hormonen

Detectie van oestradiol in de cultuur bij mESC-differentiatie toonde een functionele activiteit

aan van theca- en granulosacellen en mogelijke ondersteuning van de folliculogenese in vitro.

[14,69] Naast de detectie van oestradiol constateerden Hübner et al. (2003) een stijging van

mRNA van enzymen betrokken bij de productie van oestradiol. [14] Deze merkers werden

echter niet waargenomen door Nitta et al. (2013). [68]

- 19 -

Hübner et al. (2003) rapporteerden dat het toevoegen van gonadotrofines aan de cultuur

resulteerde in het uitstoten van OLCs uit de FLSs en de vorming van poollichaampjes-achtige

cellen. Dit suggereert dat receptoren aanwezig zijn voor gonadotrofines en dat de FLSs

kunnen reageren op gonadotrofines. [14] Nitta et al. (2013) konden echter geen expressie van

de gonadotrofine receptoren (FSH-R en LH-R) detecteren. [68] Als gonadotrofine-signalen

afwezig zouden zijn, zal de folliculaire ontwikkeling blokkeren voor het antraal en pre-

ovulatoir stadium respectievelijk. [77] Contrasterend kon men in deze vrouwelijke FLSs een

abnormaal hoge expressie van het mannelijk-geassocieerde antimulleriaans hormoon (AMH)

waarnemen, wat wijst op een aberrante seksuele differentiatie. [78]

Hormonen bij SLCs werden nauwelijks onderzocht. Enkel Geijsen et al. (2004) detecteerden

een expressie van LH-R en AMH, wat de aanwezigheid van respectievelijk leydig- en

sertolicellen suggereert. [66]

5.3.7 Fertilisatie van mESC-gederiveerde gameten

De ultieme test voor het onderzoeken van de competentie en functionaliteit van PSCDGs is

fertilisatie met de PSCDGs en oöcyten of spermatozoa (zie Bijlage 6 en 6). Hübner et al.

(2003) observeerden dat zich na 43 dagen spontaan blastocyst-achtige structuren vormden in

de cultuur, waarschijnlijk veroorzaakt door parthenogenetische activatie van de OLCs. [14]

Geijsen et al. (2004) waren de eersten die oöcyten bevruchten met mESC-gederiveerde SLCs

m.b.v. ICSI. Er vormden zich blastocyst-achtige structuren, deze werden echter niet

getransfereerd naar een uterus. [66] Dit werd wel uitgevoerd door Nayernia et al. (2006). Na

ICSI met SLCs vormden zich embryo’s die resulteerden in de geboorte van 12 nakomelingen.

Deze waren allemaal te klein of te groot vergeleken met controle muizen, bovendien bleven

ze niet langer dan 6 maanden in leven. Nayernia et al. associeerden deze afwijkingen met een

gestoorde paternale inprenting van de SLCs. [59]

De nakomelingen bij Hayashi et al. (2011) waren wel grotendeels gezond, wanneer SLCs zich

ontwikkelden tot embryo’s na ICSI en getransfereerd werden naar draagmoeders. Zowel

mannelijke als vrouwelijke nakomelingen van de PGCLCs ontwikkelden zich normaal tot

vruchtbare volwassen muizen. [15] De fertilisatie van OLCs werd ook reeds gerealiseerd. Vijf

vruchtbare nakomelingen met normale inprenting werden geboren. De efficiëntie was echter

laag.Mogelijk werd dit veroorzaakt door het falen van de extrusie van het 2de

poollichaampje,

waardoor triploïde zygotes ontstonden, die niet verenigbaar zijn met het leven. [61] Hayashi

et al. zijn de enigen die bewezen functionele GLCs ontwikkelden, aangezien vruchtbare

- 20 -

nakomelingen geboren werden. We willen echter opmerken dat de meiose niet bestudeerd

werd bij de gederiveerde SLCs, bovendien vertoonden de SLCs epigenetische afwijkingen.

[15] Daarom is het onduidelijk of deze functionele GLCs ook veilig waren.

5.3.8 miPSC-gederiveerde gameten

Okita et al. toonden in 2007 aan dat miPSCs-chimere muizen in staat zijn om in vivo bij te

dragen aan de vorming van gameten. [79,80] Het was in 2010 dat Imamura et al. er voor het

eerst in slaagden om OLCs in vitro te genereren uit miPSCs. [81] Men heeft reeds FLCs en

SLCs kunnen deriveren uit miPSCs (zie Bijlage 7).

De gebruikte miPS-cellijnen zijn afkomstig van verschillende celtypes. De meest gebruikte

bron voor miPSCs zijn fibroblastcellen, deze zijn meer geschikt, aangezien ze gemakkelijker

te verkrijgen zijn dan b.v. hepatocyten van een patiënt. [82]

Er bestaat een grote heterogeniteit in de capaciteit van miPS-cellijnen om PGCLCs te

induceren, sommigen produceerden zelfs geen PGCLCs. [83] Het is onduidelijk waarom dit

zo is. Mogelijks werd dit veroorzaakt wordt door een mineure kwaliteit van de miPSCs,

omdat deze onvoldoende geherprogrammeerd zouden zijn. Daarom is het belangrijk om de

verschillen tussen de miPSC-klonen, hun oorsprong en generatie-protocol, te evalueren. [81]

Imamura et al. demonstreerden een pre-screening om de optimale klonen te selecteren voor in

vitro kiemcel differentiatie. Ze voerden deze screening uit door de miPSC-klonen te

beoordelen op hun morfologie en expressie van kiemcelmerkers (Mvh). De verdere analyse in

hun studie werd uitgevoerd met de miPSC-kloon met de hoogste Mvh-expressie. [81]

De meiose werd minder uitvoerig geëvalueerd bij de miPSC-gederiveerde gameten

vergeleken met deze bij mESC-gederiveerde gameten, voornamelijk de expressie van meiose-

merkers werd gerapporteerd. [81] Daarnaast observeerden Li et al. de vorming van haploïde cellen,

ondanks het feit dat de mannelijke kiemcellen volledig in vitro werden gederiveerd. [83,84]

De epigenetische eigenschappen werden nauwelijks onderzocht bij miPSC-gederiveerde

gameten. Enkel Imamura et al. observeerden dat de Mvh promotor van de miPSC-

gederiveerde OLCs slechts een gedeeltelijke demethylatie vertoonde. Er kon echter geen

verband gevonden worden tussen de methylatie-status van Mvh en de kiemcel-competentie

van de miPS-cellijnen. [81]

- 21 -

5.4 HUMANE PSCDGs

De muis en de mens vertonen heel wat verschillen m.b.t. de gametogenese en stamcel-

onderzoek. [85,86] Daarom kan men de resultaten van stamcel-gederiveerde gameten bij de

muis niet volledig extrapoleren naar de mens. We beschrijven eerst methodes om PGCLCs te

induceren, daarna bespreken we de functionele evaluatie van GLCs (o.b.v. merkers,

morfologie, meiose en epigenetica) en ten slotte vergelijken we de derivatie van GLCs uit

hESCs en hiPSCs.

5.4.1 PGCLC-inductie

Clark et al. differentieerden EBs uit hESCs en observeerden na 14 dagen een spontane stijging

van PGCLC-merkers. [71] Deze spontane methode werd nadien succesvol herhaald. [87,88]

Men heeft echter geprobeerd om de efficiëntie van dit proces te verhogen: door factoren toe te

voegen aan de cultuur, een co-cultuur of geconditioneerd medium te vormen of door

overexpressie van bepaalde genen (zie Bijlage 9).

5.4.2 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie

In tegenstelling tot eerdere studies die slechts hESC-gederiveerde PGCLCs genereerden,

slaagden Aflatoonian et al. (2009) er voor het eerst in om SLCs en FLSs te deriveren uit

hESCs. De SLCs hadden de morfologie van ronde spermatiden met een compacte nucleus en

sommigen met de vorming van een flagellum. De SLCs brachten proteïne-merkers tot

expressie die specifiek zijn voor de spermatogenese. Men kon ook OLCs en FLSs

(primordiale follikels) observeren in de EBs. Oögenese-specifieke mRNA merkers waren

positief, maar het was niet mogelijk ZP-proteïnen te detecteren. [89]

Hierna bevestigden verschillende studies de derivatie van OLCs en SLCs uit hESCs en

hiPSCs (zie Bijlage 9). Hun evaluatie gebeurde meestal o.b.v. merkers specifiek voor

oögenese of spermatogenese (zie Bijlage 8). De SLCs hadden eveneens de morfologie van

ronde spermatiden, [73,90] en sporadisch konden FLSs geobserveerd worden. [91] Mature

spermatozoa en follikels konden echter niet gegenereerd worden.

Tijdens het proces van GLC-derivatie verliepen de expressie-patronen van verscheidene

mRNA-merkers temporeel consistent met de gametogenese in vivo. [55,71,89,92] Hierbij

werden eerst de vroege kiemcel-specifieke genen (PGC-merkers) tot expressie gebracht en

erna pas de latere stadia van kiemcel-specifieke merkers (geassocieerd aan de meiose,

- 22 -

oögenese en spermatogenese). Het is echter opmerkelijk dat de in vitro inductie-tijd véél

korter is dan de gametogenese in vivo.

Het expressie niveau van een aantal PGC-merkers was bij Tilgner et al. (2008) kwantitatief

equivalent aan deze van humane testes. [92] Lim et al. vergeleken m.b.v. microarray analyse

de expressie van 118 genen van de hESC-gederiveerde SLCs met spermatogonia afkomstig

van humane testes. Van deze 118 genen, werden 112 genen tot expressie gebracht door zowel

de SLCs als spermatogonia. Wanneer men echter het expressie niveau analyseerde bleken

slechts 48 genen een gelijkaardige expressie te hebben tussen beiden. [90]

5.4.3 XY-OLCs en XX-SLCs

We kunnen een merkwaardig fenomeen waarnemen bij de seksuele differentiatie van de

humane pluripotente stamcel-gederiveerde GLCs. [71,89,93,94] De GLCs kunnen simultaan

oögenese- en spermatogenese-specifieke merkers tot expressie brengen, onafhankelijk van het

vrouwelijk of mannelijk karyotype (XX of XY) van de oorspronkelijke hESCs. Dit zou

betekenen dat XX-hESCs zowel SLCs als FLSs kunnen genereren in vitro en dat XY-hESCs

kunnen differentiëren tot zowel SLCs als FLSs.

Het is onduidelijk wat de oorzaak van dit fenomeen is en of deze gederiveerde XX-SLCs en

XY-OLCs functioneel en veilig zijn. Een geslachtsomkering bij mannelijke muizen

resulteerde in XY-oöcyten die een afwijkende meiose vertoonden en niet in staat waren om

embryo’s te vormen na fertilisatie. [68,95] Dit betekent dat het een uitdaging zou zijn om

functionele XY-OLCs te deriveren. Bovendien zou de generatie van XX-SLCs nog moeilijker

zijn, aangezien een Y-chromosoom noodzakelijk is voor de spermatogenese.

5.4.4 Meiose

De grootste hindernis voor de derivatie van functionele en veilige gameten in vitro uit humane

pluripotente stamcellen is de meiose. Er zijn verschillende studies die enkele kenmerken van

de meiose kunnen aantonen, maar er zijn weinig tot geen studies die een volledig normale

meiose bewijzen (zie Bijlage 9). Op basis van progressie door de meiose kunnen we zes

groepen onderscheiden.

5.4.4.1 Pre-meiose

In de studie van Park et al. (2009) genereerde men m.b.v. een co-cultuur met hFGS immature

PGCLCs die geen meiose-merkers tot expressie brachten. Park et al. stelden de hypothese dat

de hFGS (gederiveerd uit humane foetale gonaden) ‘vroegtijdige’ meiose belemmerden

- 23 -

aangezien deze afkomstig waren van het eerste zwangerschapstrimester. [96] Duggal et al.

konden wel Scp3-mRNA opsporen nadat hESC-gederiveerde PGCLCs in cultuur werden

gebracht met IVM medium (in vitro maturatie medium). Het proteïne SCP3 kon echter niet

gedetecteerd worden, wat suggereert dat de PGCLCs zich nog in een pre-meiotisch stadium

bevonden. [97]

5.4.4.2 Beoordeling meiose moeilijk

Vaak werd enkel de expressie van “meiose-merker” SCP3 onderzocht. [91,93,98] Als louter

SCP3 tot expressie wordt gebracht (zonder expressie van andere meiose-merkers), is dit

suggestief dat de cellen zich slechts in een voorbereidings- of initiatie fase van de meiose

bevinden. [69] M.a.w. de afwezigheid van SCP3 betekent dat de meiose (nog) niet plaatsvond

(of in een optimistisch scenario reeds volledig afgelopen is), terwijl de aanwezigheid van

SCP3 aspecifiek is m.b.t. de meiose. West et al. konden wel meerdere meiose-geassocieerde

merkers detecteren: SCP1, SCP3 en MLH1. [87] Maar aanwezigheid van deze proteïnen is

niet voldoende als bewijs dat deze cellen ‘normale’ meiose hebben ondergaan. [99]

5.4.4.3 Iniatie van meiose

In het pionierswerk van Clark et al. kon men wel een stijging van meiotische- en post-

meiotische merkers waarnemen bij de spontane derivatie van PGCLCs, maar er werden geen

haploïde cellen gevormd. De meiose, met als eindproduct haploïde cellen, werd dus niet

vervolledigd; mogelijks omdat deze ‘spontane’ methode ontoereikend was. Er waren wel

aanwijzingen dat de meiose werd geïnitieerd. Een klein aantal cellen vertoonde een nucleaire

lokalisatie van SCP3 in een punctiform patroon, wat suggestief is voor het leptoteen stadium

van de eerste meiotische deling. [71]

5.4.4.4 Volledige meiose? Onzekerheid over haploïde cellen

Men kan haploïde cellen detecteren door de DNA inhoud te bepalen van een cel m.b.v. flow

cytometrie. Dit is echter een minder specifieke techniek dan het bepalen van het aantal

chromosomen m.b.v. FISH. [99] Tilgner et al. (2008) en Aflatoonian et al. (2009) konden

beiden een klein aantal (∼0.5%) haploïde cellen waarnemen. [89,92] Of de cellen effectief

meiose hadden ondergaan was echter onzeker, o.a. omdat gebruik werd gemaakt van flow

cytometrie. Bovendien konden Tilgner et al. geen synaps-vorming observeren en was SCP3

cytoplasmatisch gelokaliseerd (i.t.t. tot de meiose waar SCP3 nucleair gelokaliseerd moet

zijn). [92] Deze gebrekkige meiose zou, zoals bij Clark et al. (2004), veroorzaakt kunnen zijn

door de toegepaste ‘spontane’ methode.

- 24 -

5.4.4.5 Volledige meiose

Een aantal studies observeerden tevens haploïde cellen (SLCs), maar a.d.h.v. de meer

betrouwbare techniek FISH. [73,90,100] Het bewijs van meiose werd versterkt door de

detectie van meiotische- en post-meiotische merkers. Het aantal haploïde cellen was relatief

laag: tussen de 0.4% en 4% afhankelijk van de studie. Er werd gebruik gemaakt van

verschillende methodes om deze haploïde cellen te creëren.

5.4.4.6 Volledige meiose m.b.v. overexpressie van genen

Om de meiose te bevorderen brachten Panula et al. (2011) en Medrano et al. (2012) een

aantal genen tot overexpressie (zie Bijlage). Uitsluitend wanneer overexpressie werd

toegepast konden haploïde cellen gedetecteerd worden. Het aantal haploïde cellen was lager

(0.4-0.7%) vergeleken met de studies zonder overexpressie (0.4-4%). Wat echter een

meerwaarde vormt bij de SLCs gederiveerd door Panula et al. en Medrano et al. is dat bij

deze cellen SCP3 geëlongeerd aankleurde t.h.v. de chromosomen, wat suggestief is voor

crossing-over en recombinatie. [88,94]

5.4.4.7 Meiose van OLCs en FLSs grootste barrière

We willen benadrukken dat deze studies met relatief succesvolle meiose, allemaal mannelijke

SLCs deriveerden. De meiose van gederiveerde OLCs en FLSs vormt een grotere barriëre, dit

kon men tevens waarnemen bij de muis.

5.4.5 Epigenetica

De inprenting-status is de meest onderzochte epigenetische eigenschap van stamcel-

gederiveerde gameten. Net zoals de meiose vormt dit nog een hindernis voor de vorming van

functionele en veilige gameten in vitro (zie Bijlage 9). Sommige PGCLCs vertonen namelijk

geen inprenting-verwijdering of slechts een initiatie van dit proces. Op basis van

epigenetische kwaliteit van de gederiveerde GLCs kunnen we (van ‘slecht’ naar ‘goed’) drie

groepen onderscheiden. Ten slotte bespreken we kort de histonen-modifcatie bij PGCLCs.

5.4.5.1 PGCLCs: geen inprenting-verwijdering

Verschillende studies observeerden dat de gederiveerde PGCLCs geen significante

verwijdering van de inprenting-patronen vertoonden, wat betekent dat de inprenting-

verwijdering (nog) niet geïnitieerd werd. [87,88,96] Daarnaast konden West et al. geen

globale demethylatie waarnemen bij de hESC-gederiveerde cellen, dit versterkt de immature

epigenetische status van de PGCLCs. Deze afwijkingen werden mogelijks veroorzaakt door

- 25 -

een cultuur die de in vivo situatie niet correct zou nabootsen, b.v. door te hoge of te lage

concentraties van groeifactoren. [87]

Uit de resultaten van Park et al. (2009) bleek dat genen die reeds abnormaal gemethyleerd

waren bij de pluripotente stamcellijnen (hypermethylatie van Peg1), eveneens een abnormale

methylatie vertoonden bij de resulterende PGCLCs. De abnormale methylatie bij deze hES-

cellijnen werd hoogstwaarschijnlijk geïnduceerd door manipulatie tijdens de cultuur. Park et

al. stelden de hypothese dat de epigenetische status van de ongedifferentieerde pluripotente

cellen (onafhankelijk van de bron: hESCs of hiPSCs) bepalend is voor de capaciteit van de

PGCLCs om deze inprenting-patronen te verwijderen. Daarom zou het belangrijk zijn om in

toekomstige studies meer aandacht te hebben voor het bepalen van de epigenetische

eigenschappen van de pluripotente cellen, vooraleer men PGCLCs differentieert. [96]

5.4.5.2 PGCLCs: initiatie inprenting-verwijdering

In tegenstelling tot vorige resultaten kon door sommigen wel een correcte initiatie van het

proces van inprenting-verwijdering waargenomen worden. De inprenting-genen H19 en Igf2r

werden gedeeltelijk gedemethyleerd, maar niet volledig. [88,92,96] Dit betekent dat het

inprenting-stadium van de PGCLCs overeenkwam met deze van PGCs. In latere stadia van de

GC-ontwikkeling zal het echter noodzakelijk zijn dat alle inprenting-patronen volledig

verwijderd worden.

Medrano et al. bemerkten dat de overexpressie van VASA de verwijdering van inprenting

induceerde. De spontane differentiatie, noch de overexpressie van DAZL, ondersteunden dit

proces echter niet. [88]

5.4.5.3 SLCs: correct instellen van paternaal inprenting-patroon

Twee studies waarbij een relatief succesvolle meiose geïnduceerd werd, konden een correct

herinstellen van inprenting-patronen waarnemen. Bij Easley et al. was de methylatie van de

genen H19 en Igf2 van de hESC-gederiveerde SLCs gelijkaardig aan de methylatie-gehaltes

van humane spermatozoa. [73] Bij Eguizabal et al. waren vier van de zes pluripotente

stamcellijnen competent om SLCs te deriveren met een juist paternaal inprenting-patroon van

H19. Bovendien was het expressie niveau van 6 andere inprenting-genen gelijkaardig aan het

niveau gezien bij mature spermatozoa. [100]

5.4.5.4 PGCLCs: correcte histonen-modificatie

Histonen spelen een belangrijke rol bij de condensatie van DNA en posttranslationele

modificaties van deze histonen (methylatie, acetylatie) resulteren in de epigenetische regulatie

- 26 -

van de expressie van genen. [101] Bepaalde modificaties zijn activerend (zoals H3K4

dimethylatie) en andere zorgen voor de onderdrukking van de expressie van genen (H3K9

dimethylatie, H3K27 trimethylatie).

De histonen-modificaties geobserveerd bij PGCLCs in de experimenten van Tilgner et al.

(2008) waren sterk gelijkend op deze van PGCs van de muis in vivo. [102] De PGCLCs

vertoonden namelijk een stijging van activerende modificaties (H3K4 dimethylatie) en een

daling van onderdrukkende modificaties (H3K9 dimethylatie, H3K27 trimethylatie)

geassocieerd aan PGC-genen. [92]

5.4.6 Sertoli- en leydigcellen

Aangezien de ontwikkeling van spermatozoa afhankelijk is van de ondersteuning en

paracriene secretie van sertoli- en leydigcellen, [103] is het interessant om na te gaan of de

functie van deze cellen kan teruggevonden worden in de cultuur tijdens GLC-derivatie. Er

zijn 2 manieren om dit te evalueren: detectie van merkers of van hormonen.

5.4.6.1 Detectie van merkers

Bucay et al. en Eguizabal et al. detecteerden in de cultuur mRNA-merkers die specifiek zijn

voor sertoli-en leydigcellen. [55,100] Daarnaast kleurden Bucay et al. de EBs voor sertoli-

geassocieerde proteïne merkers (o.a. FSH-R). Een interessante oberservatie was dat de cellen

die de hoogste concentratie van FSH-R vertoonden zich in de buurt of grenzend aan clusters

van VASA-positieve cellen (PGCLCs) bevonden. [55] Uit deze bevindingen kan men de

aanwezigheid van deze cellen vermoeden, maar dit geeft slechts beperkte informatie over hun

functionaliteit.

5.4.6.2 Detectie van hormonen

Een indirecte manier om sertoli- en leydigcellen aan te tonen is de bepaling van hormonen in

de cultuur. Aflatoonian et al. (2009) detecteerden dihydrotestosterone (DHT) en oestradiol

(E2). Testosteron (T) was niet aanwezig in de cultuur, maar mogelijks werd dit hormoon

omgezet naar DHT en E2. Zowel DHT als E2 zijn cruciaal voor de spermatogenese. [104] De

totale DHT secretie werd geschat op 5 ng/mg EB weefsel, wat vergelijkbaar is met

concentraties gezien bij humane testes (13 ng/ml). [105] Het was echter onduidelijk of deze

hormonen afkomstig waren van zich differentiërende testiculaire cellen in de EBs (zoals

Leydig cellen) of incidenteel werden geproduceerd door niet-testiculaire cellen (zoals

bijniercellen, hepatische cellen,...). [89]

- 27 -

5.4.7 hESC- versus hiPSC-gerderiveerde GLCs

Park et al. (2004) demonstreerden als eersten de derivatie van PGCLCs uit hiPSCs afkomstig

van dermale fibroblasten. [96] Dit werd bevestigd door verschillende studies die tevens

hiPSC-gederiveerde GLCs konden genereren.

Humane iPS cellijnen hebben veel gelijkenissen met hESCs op vlak van morfologie, gen

expressie en capaciteit om te differentiëren tot mesoderm, endoderm en ectoderm, zowel bij in

vitro als in vivo teratoma assays. [106] Ondanks dat hiPSCs de criteria van pluripotente

stamcellen vervullen, is het nog niet gekend of hiPSC en hESCs significant verschillend of

gelijk zijn op klinisch vlak. [107] M.a.w. een belangrijke vraag is of hiPSCs een evenwaardig

potentieel bezitten als hESCs om GLCs te deriveren. Hier bestaat onenigheid over: er zijn

studies die een vermoeden hebben dat hESCs beter zijn, en andere die vermoeden dat hiPSCs

een grotere GLC-potentie bezitten.

5.4.7.1 hESCs beter dan hiPSCs

Park et al. (2009) vergeleken de derivatie van PGCLCs uit hESCs en hiPSCs. Het aantal

gederiveerde PGCLCs was vergelijkbaar tussen beide types cellijnen. Bij de hiPSC-

gederiveerde PGCLCs kon men echter een minder goede inprenting-verwijdering waarnemen:

slechts 1 gen vertoonde initiatie van inprenting-verwijdering versus 2 genen bij hESCs. [96]

Easley et al. ondervonden dat het aantal PGCLCs licht hoger was wanneer deze gederiveerd

werden uit hESCs vergeleken met derivatie uit hiPSCs. Het aantal haploïde cellen was echter

vergelijkbaar tusse beide cellijnen (4.5% en 3.9% respectievelijk). De hiPSC-gederiveerde

SLCs vertoonden eveneens een iets minder goede inprenting-regulatie vergeleken met hESC-

gederiveerde SLCs. [73]

Samenvattend kan men stellen dat de efficiëntie voor de derivatie van GLCs min of meer

evenwaardig was tussen hESCs en hiPSCs, maar dat de hiPSC-gederiveerde GLCs een groter

risico op epigenetische afwijkingen vertoonden. Volgens Park et al. zou dit mogelijks

veroorzaakt kunnen zijn door een onvoldoende de-differentiëren van de hiPSCs wanneer deze

gegenereerd werden. [96]

5.4.7.2 hiPSCs beter dan hESCs

Panula et al. (2011) ondervonden dat het percentage van PGCLCs dubbel zo hoog was bij de

cultuur van hiPSCs (5.27%) vergeleken met de cultuur van hESCs (2.39%). [94] Na

overexpressie van de DAZ-familie genen bij zowel de hESCs en hiPSCs kon men observeren

dat de meiose in dezelfde mate gevorderd was bij de verschillende cellijnen.

- 28 -

Dit laatste was echter niet het geval bij de studie van Eguizabal et al. (2011). Zowel de

hESCs- als de hiPSCs-gederiveerde SLCs konden de meiose initieren, maar uitsluitend de

hiPSCs-gederiveerde SLCs waren instaat om de meiose te vervolledigen en haploïde cellen te

genereren. [100]

De resultaten van Panula et al. en Eguizabal et al. suggereren dat hiPSC beter waren voor de

derivatie van GLCs omdat deze een betere PGCLC-inductie en meiose vertoonden vergeleken

met hESCs. Hiervoor gaven Eguizabal et al. een aantal mogelijke verklaringen. Ten eerste

zou de licht verschillende epigenetische status tussen hiPSCs en hESCs een verklaring kunnen

zijn. Een andere reden zou een predisponerend epigenetisch geheugen kunnen zijn afhankelijk

van de originele somatische bron. Eguizabal et al. onderzochten deze hypothese, maar

ondervonden dat hiPS-cellijnen van verschillende somatische bronnen een evenwaardig

potentieel hadden om te differentiëren tot haploïde cellen in vitro. Ten slotte zou de

reactivatie van het transgen Oct4 (een pluripotentie-gen betrokken bij de vroege ontwikkeling

van PGCs) een rol kunnen spelen in dit fenomeen. In de studie van Eguizabal et al. was Oct4

slechts licht gereactiveerd bij 3 van de 8 onderzochte cellijnen, waardoor dit waarschijnlijk

minder relevant is als verklaring. [100]

- 29 -

5.5 ETHISCHE EN SOCIALE ASPECTEN

De potentiële introductie van de humane toepassing van PSCDGs (Pluripotent Stem Cell

Derived Gametes) roept heel wat ethische vragen op. Het is belangrijk een onderscheid te

maken tussen wat technisch mogelijk is of zou zijn in de toekomst en wat sociaal (on)gewenst

of ethisch (on)verantwoord zou zijn. Problemen rond technische kwesties en veiligheid

hebben het potentieel om opgelost te worden in de toekomst door bijkomend

wetenschappelijk onderzoek en ontwikkelingen, maar de morele overwegingen zouden

mogelijks de focus kunnen blijven van het maatschappelijke debat. Dit wijst op de noodzaak

van publieke discussie en betrokkenheid van zowel wetenschappers, het publiek als

beleidsmakers. [15,108,109]

5.5.1 Natuurlijk versus synthetisch

Eén van de ethische bezwaren rond PSCDGs is dat het de menselijke waardigheid en de

betekenis van wat menselijk is zou kunnen ondermijnen, omdat reproductie met PSCDGs niet

'natuurlijk' is. Dit argument kan ook gebruikt worden bij IVF, maar het proces van IVF kan

als natuurlijker beschouwd worden dan de toepassing van PSCDGs. [110] Volgens Testa et

al. (2005) is de redenering dat de natuurlijke reproductie superieur is aan artificiële methodes

van reproductie niet ethisch gefundeerd is. Bij de introductie van IVF werd er gesuggereerd

dat ‘reageerbuis’ baby’s geen ziel zouden hebben. Kinderen geboren m.b.v. geassisteerde

reproductie zijn echter genetisch hetzelfde en hebben dezelfde morele status als kinderen

geboren via natuurlijke voortplanting. De natuurlijke reproductie zou misschien aangenamer

kunnen zijn dan synthetische reproductie, of goedkoper, veiliger, meer privé,.. dit zijn redenen

om het te verkiezen. Maar het is niet gegrond om een natuurlijk proces te verkiezen gewoon

omdat het natuurlijk is. Het natuurlijke per se is moreel neutraal, alhoewel er mensen zijn die

natuurlijk gezond en gelukkig zijn, is het even natuurlijk om ongezond en ongelukkig te zijn.

Bovendien kan het natuurlijke zelfs heel schadelijk zijn: ziektes, mutaties, overstromingen,

orkanen, brand, aardverschuivingen,… Als we altijd het natuurlijke zouden verkiezen, dan

zouden we de volledige toepassing van de geneeskunde, waaronder vaccinaties en antibiotica,

moeten afzweren, aangezien men de geneeskunde als een poging zou kunnen zien om de loop

van de natuur te dwarsbomen. [111]

- 30 -

5.5.2 Genetisch ouderschap

Het meest geciteerde voordeel van de klinische applicatie van PSCDGs is dat ze onvruchtbare

mensen kunnen helpen om een kind te krijgen dat genetisch verwant is. Een voordeel die ook

van toepassing was bij de ontwikkeling van andere ARTs zoals ICSI. De waarde van

genetisch ouderschap werd als vanzelfsprekend beschouwd in de wereld van medisch

geassisteerde voortplanting. [112]

Mertes & Pennings (2010) stelden deze waarde in vraag door ze te evalueren op basis van 2

verschillende theorieën: welzijn veroorzaakt door een positieve bewuste ervaring of welzijn

veroorzaakt door een wens die vervuld wordt. Vanuit deze eerste theorie bestaat er geen

verschil tussen een vader die geniet van de effectieve genetische relatie met zijn kind en een

vader die geniet van de relatie met een kind waarvan hij foutief gelooft dat het zijn kind is.

Miljoenen mannen hebben kinderen opgevoed waarvan ze foutief overtuigd waren dat het hun

genetische nakomelingen waren, terwijl ze het zelfs niet eens merkten dat het hun eigen

genetisch kind niet was. Een genetische relatie op zichzelf leidt niet tot een andere bewuste

ervaring voor de ouders en kinderen. [113]

Volgens de tweede theorie betekent dit echter dat deze mannen werden aangetast, aangezien

hun wens niet werd gerealiseerd. Mensen willen niet gelukkig zijn omdat ze (al dan niet

foutief) geloven dat hun kinderen genetisch verwant zijn, maar ze willen gelukkig zijn omdat

ze effectief genetisch verwante kinderen hebben. Ondanks dat het welzijn van mensen kan

vergroot worden als we hun wens naar genetisch verwante kinderen invullen, kunnen deze

theorieën niet verklaren of het rationeel is om deze wens te hebben. [113]

De therapiekeuzes die onvruchtbare patiënten maken tonen echter aan dat de voorkeur voor

genetisch verwante kinderen wijdverspreid is. Sommige koppels verkiezen b.v. een gekende

donor boven een een anonieme donor, uit ‘schrik voor genetisch materiaal van ongekende

oorsprong’ (56%) en ‘de genetische link tussen de donor en hunzelf’ (33%). [112,114] Dit

kan o.a. verklaard worden omdat koppels verwachten dat gedeeld genetisch ouderschap

bewijs geeft aan hun relatie en resulteert in gedeelde verantwoordelijkheid. Bovendien kan

men schrik hebben dat contact tussen het kind en de donor een bedreiging zou zijn voor de

familie. [112,115]

5.5.3 Veiligheid

Het wordt algemeen aangenomen dat de psychologische en fysieke gezondheid van de

kinderen resulterend uit ART primair belang heeft. ART beoefenaars en patiënten beweren

hier grote waarde aan te hechten, maar dit strookt meestal niet met de realiteit. Sinds decennia

- 31 -

worden er hoge risico’s genomen door meerdere embryo’s terug te plaatsen bij IVF. De

complicaties van een meerlingzwangerschap worden gerechtvaardigd door een hogere

slaagkans. Meerlinggeboortes zouden nooit getolereerd worden als het welzijn van het kind

werkelijk de voornaamste zorg zou zijn. [116] Als we een nieuwe ART techniek willen

toepassen is het belangrijk verschillende criteria te overwegen. Er moet o.a. een afweging

gemaakt worden tussen de wens van de ouders om een genetisch verwant kind te hebben en

de levenskwaliteit van het kind. De potentiële toepassing van stamcel-gederiveerde gameten

zou waarschijnlijk grote risico’s met zich meedragen voor de mogelijke nakomelingen.

Hierbij moeten we ons de vraag stellen wat de drempel is van aanvaardbaarheid van deze

risico’s. [113]

Er zijn verschillende benaderingen mogelijk om deze drempel van aanvaardbaarheid te

bepalen. [113] Een eerste benadering gebruikt de natuurlijke reproductie als referentiepunt,

waarbij men alle reproductieve methodes met een gelijkaardig of minder aantal risico’s

aanvaardt. Eén van de belangrijkste bezwaren tegen het reproductief klonen van een mens

was dat bv. in het geval van het schaap Dolly slechts één kloon succesvol geproduceerd werd

na 277 pogingen, wat betekent dat dit een inefficiënt proces is en leidt tot een grote verspilling

van embryo’s. Maar volgens Testa et al. (2005) kan de verspilling van embryo’s per se geen

bezwaar zijn voor reproductief klonen als men de natuurlijke reproductie accepteert. Want

ongeveer 80% van de embryo’s sterven af bij natuurlijke voortplanting. Natuurlijke

reproductie is niet alleen inefficiënt, het is tevens onveilig: ongeveer 3-5% van de baby’s

worden geboren met een abnormaliteit en bovendien is de zwangerschap en bevalling onveilig

voor de moeder. [111]

Mertes & Pennings (2010) stellen zich echter een aantal vragen bij het aannemen van

natuurlijke reproductie als referentie. Waarom zouden we natuurlijke voortplanting als de

standaard stellen? En wat betekent ‘gelijkaardig’? Ondanks dat ICSI een hoger risico op

malformaties van de nakomelingen met zich meedraagt, kiest de meerderheid van de ouders

toch voor deze techniek. Dus als 7% geaccepteerd wordt, is 10% dan ook ‘gelijkaardig’? En

wat zou er gebeuren als er eenvoudige manieren (zoals bv. een goedkoop en non-invasief

screening programma om de meeste malformaties te detecteren) zouden bestaan om de

risico’s van 3-5% malformaties te verminderen? Dan zouden we anders kijken naar ouders die

het zogenaamde ‘natuurlijke risico’ zouden nemen als referentie. [113]

Een tweede benadering om de drempel van aanvaardbaarheid van de potentiële risico’s voor

de kinderen resulterend uit PSCDGs te bepalen, probeert een standaard op te stellen om het

- 32 -

welzijn van het kind te evalueren. Wanneer men wil bepalen of een kind resulterend uit een

infertiliteitsbehandeling benadeeld wordt omdat het gecreëerd werd, kan men zich baseren op

3 verschillende principes: het ‘maximale welzijn’, de ‘minimumdrempel’ en het ‘redelijke

welzijn’. [117]

Het principe van ‘maximale welzijn’ stelt dat een kind niet gecreëerd zou mogen worden in

minder dan ideale omstandigheden. Als deze standaard conservatief opgevat wordt kan kritiek

gegeven worden op verschillende toepassingen van ART, [117] stamcel-gederiveerde

gameten en de hiermee gepaarde risico’s zouden waarschijnlijk niet voldoen aan deze

veeleisende standaard. We kunnen het ‘maximale welzijn’ principe ook milder interpreteren:

als een bepaalde optie leidt tot een hogere kans op een gelukkiger kind vergeleken met andere

opties, dan heeft deze eerste optie de voorkeur. Mertes & Pennings (2010) stellen dat ouders

zouden moeten kiezen tussen een kind dat genetisch niet verwant maar gezond is of een

genetisch verwant kind met een groot risico om een genetische ziekte te hebben. Het

referentiepunt om het risico te evalueren voor een kind gecreëerd met PSCDGs is niet ‘geen

kind’ maar een kind gecreëerd met gedoneerde gameten. [113]

Het principe van de ‘minimumdrempel’ is veel minder streng dan deze van het ‘maximale

welzijn’: voortplanting zou enkel afgekeurd worden als het welzijn van het potentiële kind

zeer laag is, m.a.w. onder een minimumdrempel ligt. De meest gebruikte minimumdrempel is

deze van het ‘onrechtmatige leven’: een kind zou niet gecreëerd mogen worden als en slechts

als het beter zou zijn om nooit geboren te worden. [118] M.a.w. stamcel-gederiveerde

gameten zouden enkel veroordeeld kunnen worden als het resulterende kind een leven zou

hebben dat niet de moeite waard zou zijn om te leven, want het alternatief zou zijn dat het

kind nooit zou bestaan zonder de medische interventie. [119] Pennings (1999) stelt echter dat

dit een extreem lage drempel is, die beter niet toegepast zou worden voor de morele

beoordeling van voortplanting, maar wel als referentie zou kunnen dienen voor het opstellen

van wettelijke bepalingen. [117]

Ten slotte is het ‘redelijke welzijn’ een intermediaire standaard die stamcel-gederiveerde

gameten zou accepteren als het resulteert in de geboorte van een redelijk gelukkig kind.

[113,117] Het is echter moeilijk om een omvattende beschrijving te geven van geluk of

welzijn. Pennings (1999) suggereert dat een individu een behoorlijk welzijn heeft als hij de

mogelijkheden bezit om doelstellingen te bereiken die in het algemeen een mensenleven

waardevol maken. [117]

- 33 -

5.5.4 Psychologische consequenties voor het kind

Een bezwaar tegen het gebruik van PSCDGs is dat het een psychologische last zou kunnen

zijn voor de kinderen als ze te weten komen dat ze op een artificiële manier gecreëerd werden.

[120] Studies tonen echter aan dat het psychologisch welzijn van kinderen gecreëerd m.b.v.

IVF en donor inseminatie gelijkaardig is aan deze van kinderen die met natuurlijke

reproductie geboren werden. [110] Daarnaast bestaat er een bijkomend probleem bij hESC-

gederiveerde gameten, aangezien het gekloond embryo van de patiënt strikt genomen als de

'ouder' van het resulterende kind zou kunnen beschouwd worden. Dit zou psychologische

gevolgen kunnen hebben voor een kind, wetende dat zijn/haar ouder nooit geleefd heeft en

vernietigd werd in het proces van zijn/haar eigen creatie. [120]

De vraag kan hierbij gesteld worden óf kinderen wel geïnformeerd moeten worden over de

manier waarop ze gecreëerd werden met PSCDGs. Mertes & Pennings suggereren dat er geen

rechten van het kind geschonden wordt als men het kind niets vertelt. Hoewel er geen plicht

bestaat om het kind te informeren, zou het geen kwaad kunnen, aangezien ze de kans op

nadelige psychologische gevolgen klein inschatten. [113] Uiteraard moet het kind wel

geïnformeerd worden wanneer het betrokken is bij een lange termijn follow-up studie. [121]

Men kan tevens bezwaar hebben tegen de toepassing van PSCDGs uit angst dat nieuwe

vormen van ouderschap, afwijkend van de klassieke familie structuur, psychologische schade

zou kunnen veroorzaken bij het kind (zoals b.v. homoseksuele koppels), deze stelling is

controversieel en vatbaar voor interpretatie (zie 5.6.3). Bovendien tonen studies bij kinderen

afkomstig van reeds bestaande ARTs aan dat deze vrees waarschijnlijk onterecht is. [120,122]

Master (2006) speculeert dat de psychologische ontwikkeling van een kind afkomstig van

PSCDGs afhankelijk zal zijn van een aantal factoren, zoals de liefdevolle zorg door de ouders

en socio-economische factoren, en niet zal afhangen van de manier waarop ze gecreëerd

werden. [123]

5.5.5 Informed consent

Het toepassing van hESC-gederiveerde gameten roept vragen op over het verkrijgen van

informed consent voor hun gebruik. Strikt genomen zijn deze gameten geproduceerd door het

gekloond embryo. Als het embryo beschouwd wordt als een uniek wezen, zou het embryo zijn

informed consent moeten geven om 'zijn' gameten te mogen gebruiken. [110] Maar een

embryo heeft uiteraard niet de capaciteit om dit te doen, een gelijkaardig probleem stelt zich

bij het gebruik van oöcyten afkomstig van geaborteerde foetussen. De beste oplossing lijkt

- 34 -

dan om beslissingsbevoegdheid te geven aan de patiënt die de nucleus biedt (waarvan het

embryo gemaakt is). [113]

Dit is echter niet altijd mogelijk, b.v. bij foetussen, minderjarigen en overleden personen (zie

5.6.3). Mathews et al. wijzen op het belang van een geldig informed consent, daarom zou men

geen gameten mogen deriveren in voorgenoemde situaties. Een uitzondering op deze vereiste

informed consent zou zijn als de PSCDGs enkel gebruikt worden voor in vitro onderzoek.

[108]

Een heel ander probleem met informed consent is deze van diefstal van gameten en

onvrijwillig ouderschap. Het is veel gemakkelijker om zonder toestemming biologisch

materiaal zoals huidcellen te verkrijgen van iemand anders dan toegang tot de gameten van

een persoon. Dit betekent dat de derivatie van PSCDGs en genetische reproductie mogelijk

zouden zijn zonder dat de 'genetische ouder' hiervan op de hoogte is. Men kan financiële

motieven hebben om kinderen te hebben die genetisch verwant zijn aan heel rijke en/of

invloedrijke mensen. Vrouwen zouden b.v. kunnen bewijzen dat de paus of de president de

vader is van hun kinderen. Dit betekent dat het niet voldoende zou zijn om ouderlijke

verantwoorderlijkheid (zowel legaal, financieel als sociaal) enkel te baseren o.b.v. genetische

testen. Smajdor & Cutas argumenteren dat genetische relaties overgewaardeerd worden en

suggereren dat het eventueel beter zou zijn als de intentie tot voortplanting meer wettelijke

waarde zou hebben dan de genetische link. [120]

5.5.6 Destructie van embryo’s en vergelijking ESCs vs iPSCs

Iedere techniek die gebruik maakt van SCNT heeft als gevolg dat een embryo vernietigd

wordt. Dit vormt ethisch een groot probleem voor diegenen die een intrinsieke waarde

hechten aan een embryo, voor hun zullen ntESC-gederiveerde gameten niet aanvaardbaar zijn.

[124] Wanneer iPSCs geïntroduceerd werden in de wetenschappelijke wereld had men hier

vanuit ethisch standpunt een sterke voorkeur voor omdat geredeneerd werd dat bij de derivatie

van iPSCs geen embryo’s worden vernietigd. Maar in 2009 slaagde men erin om volwassen

muizen te genereren van iPSCs m.b.v. de techniek tetraploïde complementatie. [125,126]

Waardoor zowel hESCs als hiPSCs als potentiële humane wezens kunnen aanzien worden,

wat betekent dat er weinig verschil is tussen beiden op vlak van morele waarde. Devolder

argumenteert bovendien dat het ‘potentie’ argument zwak is. Het is niet omdat iets de potentie

heeft om iets anders te worden, dat we het al moeten beschouwen alsof het deze potentie reeds

gerealiseerd heeft. Alle mensen delen een onverbiddelijke potentie: we zijn allemaal

- 35 -

potentieel dood. Maar dat betekent niet dat we behandeld moeten worden alsof we reeds dood

zijn. [127]

Het gebruik van embryo’s met als doel gameten te creëren verschilt licht met het standaard

gebruik van embryo’s voor onderzoek. Deze embryo’s werden namelijk gecreëerd voor

reproductie, maar pas na hun transformatie in stamcellen en gameten. Embryo’s met

reproductieve doeleinden worden als ethisch meer aanvaardbaar beschouwd dan embryo’s

met andere onderzoeksredenen. [113,127]

Ondanks dat hiPSCs en hESCs dezelfde morele waarde hebben, zijn gameten gederiveerd uit

iPSCs ethisch te verkiezen boven hESCs. Aangezien hESCs-gederiveerde gameten een aantal

extra ethische problemen vormen omtrent psychologische gevolgen voor het kind en informed

consent (zie hierboven). [113]

5.5.7 Humane experimenten met PSCDGs

Indien men PSCDGs zou willen toepassen in de kliniek dan is het belangrijk om zeker te zijn

dat de techniek veilig is voor het welzijn van het resulterende kind (afhankelijk van wat men

als ‘veilig’ beschouwd, zie 5.5.3). Experimenten op dieren kunnen een idee geven over de

veiligheid. Maar aangezien deze resultaten niet volledig kunnen vertaald worden naar de

mens, zou men uiteindelijk genoodzaakt zijn om experimenten uit te voeren op de mens, in

eerste instantie door pre-klinisch onderzoek te doen met PSCDGs-gederiveerde humane

embryo's.

Dit betekent echter dat men embryo’s zou moeten creëren en vernietigen voor onderzoek, dit

is ethisch controversieel en verboden in verschillende landen. [113,119,128] Voor velen zijn

gecreëerde embryo's specifiek voor onderzoek onrespectvol en veel problematischer dan het

gebruik van overtollige embryo's na succesvolle IVF-behandeling (men vindt o.a. dat deze

overtollige embryo's anders verspild zouden zijn). Devolder argumenteert dat er echter geen

moreel onderscheid bestaat tussen gecreëerde en overtollige embryo's. Ze worden namelijk

allebei geïnstrumentaliseerd. Bovendien hebben ze beiden het potentieel om te ontwikkelen

tot een mens. Dus als men de creatie van overtollige embryo's bij een IVF behandeling en

onderzoek op deze overtollige embryo's toestaat, is het niet logisch om bezwaar te hebben

tegen het creëren van embryo's voor onderzoek, onafhankelijk van de waarde die men hecht

aan een embryo. [127] Als de doelstellingen hoog gewaardeerd worden door de maatschappij

dan zou het dus gerechtvaardigd zijn om embryo's te creëren voor onderzoek.

- 36 -

Daarnaast kan men de bedenking maken dat het verbod op de creatie van embryo's voor

onderzoek zou kunnen leiden tot een verlies aan pre-klinisch veiligheidsonderzoek, waardoor

kinderen blootgesteld worden aan onnodige risico's. [129] Het antwoord van de tegenstanders

is heel eenvoudig: pas deze nieuwe techniek niet toe. [113]

Er zijn 15 landen waar de creatie van embryo’s voor onderzoek onder bepaalde

omstandigheden en criteria wel is toegelaten, waaronder België. De cultuur van het

gecreëerde embryo is wettelijk beperkt tot 14 dagen of tot de vorming van de primitieve

streep (wat de start van een uniek humaan wezen zou betekenen) . [128]

Pas als intensief en voldoende pre-klinisch onderzoek is uitgevoerd waaruit blijkt dat de

PSCDGs hoogstwaarschijnlijk veilig zijn, zou men eventueel mogen overgaan naar de

volgende stap: de klinische toepassing bij de mens. Het is belangrijk dat deze introductie

uitgevoerd wordt m.b.v. een heel strikt uitgevoerde en goed ontworpen RCT. Aangezien men

complicaties en problemen kan verwachten, is een continue evaluatie noodzakelijk, eveneens

lange termijn follow-up (zelfs transgenerationeel), met informed consent van zowel ouders als

het kind (vanaf deze bekwaam is). [113,121]

De reproductieve geneeskunde is berucht voor haar (te) snelle implementatie en wereldwijde

verspreiding van innovatieve technieken, zonder voldoende evaluatie van de effectiviteit,

veiligheid en sociale en economische gevolgen. [112] Het aanbod door wetenschappelijk

onderzoek en de vraag van ART beoefenaars die de laatste technieken willen bieden en de

patiënten die hun eigen genetisch verwant kind willen is moeilijk te weerstaan. [113,121]

Daarom is het aangeraden dat de klinische studies uitgevoerd zouden worden door een

onafhankelijk onderzoeksteam die niet betrokken zijn bij infertiliteitsbehandelingen. [130]

Mertes & Pennings zeggen zelfs dat regulatie, controle en toezicht door een onafhankelijk

instituut noodzakelijk zou zijn om te verzekeren dat veiligheid centraal blijft staan. [113]

Bij iedere stap naar de klinische toepassing van PSCDGs bij de mens worden we

geconfronteerd met onzekerheid. Palacios-González et al. relativeren dat onzekerheid eigen is

aan innovatieve technieken die voor het eerst worden uitgetest bij de mens. Als onpraktisch

hoge voorzorgsmaatregelen bepalend zouden zijn dan zou men geen vaccinaties, IVF of

andere ontwikkelingen hebben. Niets is volledig veilig, we moeten beslissen wat 'veilig

genoeg' is (zie 5.5.3). [119]

- 37 -

5.5.8 Financiering van PSCDGs en invloed op (on)gelijkheid

De toepassing van PSCDGs zal hoogstwaarschijnlijk een hoogtechnologische en

arbeidsintensieve procedure met een hoge kostprijs zijn, en dit zal waarschijnlijk niet snel

veranderen. [131] Alhoewel men dit zou kunnen relativeren als men kijkt naar andere

technologische ontwikkelingen in de gezondheidszorg: de prijs om de sequentie van het

humaan genoom te bepalen is gekelderd van ongeveer US$10 million naar enkele duizend

dollar in slechts zes jaar tijd. [132]

Men moet als maatschappij beslissen óf en hoeveel men wil investeren in de ontwikkeling en

toepassing van PSCDGs. Wanneer er slechts een beperkt financieel budget is, is men

genoodzaakt om prioriteiten te stellen. M.a.w. de voordelen van PSCDGs moeten afgewogen

worden tegenover de mogelijke investering in andere belangrijke(re) gezondheidsnoden.

Hierbij speelt het belang van het genetische ouderschap een centrale rol. In het bijzonder

wanneer goedkopere en technisch eenvoudigere alternatieven bestaan die resulteren in een

kind dat niet genetisch verwant is. [112,113]

Dit sociaal debat is afhankelijk van culturele waarden, lokale religie en rijkdom van een land

(b.v. Saoedi-Arabië). [112] Daarnaast is het belangrijk om de lokale schaarste van donor

gameten (vnl. van oöcyten) in rekening te brengen, in Spanje is er b.v. voldoende aanbod van

gedoneerde gameten voor reproductie. [131]

Palacios-González et al. stellen dat de ontwikkeling van PSCDGs zou kunnen helpen bij de

democratisering van de reproductieve gezondheidszorg. [119] Maar het zou ook een

tegengesteld effect kunnen veroorzaken en net meer ongelijkheid creëren. Wie zal toegang

krijgen tot deze nieuwe vruchtbaarheidsbehandeling? Een vraag die reeds een probleem

vormde bij de terugbetalingsregulatie van IVF en andere ARTs, maar nu nog veel meer onder

druk zou kunnen staan. Men zou b.v. kunnen opteren dat homoseksuele koppels geen toegang

krijgen tot de behandeling met PSCDGs, wat sociale ongelijkheid en conflict zou kunnen

versterken. Of men zou kunnen kiezen om helemaal niemand een behandeling met PSCDGs

terug te betalen. Hierdoor zou de mogelijkheid van PSCDGs beperkt zijn tot een heel kleine

groep van patiënten die het zich financieel kan veroorloven. Waardoor de reeds bestaande

financiële ongelijkheid in de gezondheidszorg nog groter zou kunnen worden. [131]

- 38 -

5.5.9 Valse hoop en sociale druk

De berichtgeving in de media over de vooruitgang van het onderzoek rond PSCDGs is vaak

onrealistisch of te optimistisch. Met b.v. boodschappen dat 'het einde van de

onvruchtbaarheid' nabij is. [133] Deze kunnen echter valse hoop en verwachtingen creëren bij

potentiële gebruikers. Daarom is het belangrijk dat wetenschappers verantwoordelijk en

voorzichtig zijn met de informatie die naar de buitenwereld wordt gecommuniceerd. [131]

Daarnaast zou de introductie van PSCDGs en de verkeerde perceptie van 'het einde van de

onvruchtbaarheid' de sociale druk kunnen verhogen om tot het extreme te gaan om ouders te

worden die een genetische link hebben met hun kind: als je een kind wilt, moet je koste wat

het kost alles proberen. [131]

- 39 -

5.6 TOEPASSINGEN

PSCDGs hebben nu reeds hun nut in wetenschappelijk onderzoek bewezen en zullen in de

toekomst tevens van groot belang zijn. Het is momenteel nog onduidelijk of de medische

toepassing van PSCDGs voor de behandeling van onvruchtbare mensen ooit werkelijkheid zal

zijn. Daarnaast bespreken we tevens de gevolgen van PSCDGs op nieuwe vormen van

ouderschap.

5.6.1 PSCDGs voor wetenschappelijk onderzoek

Er zijn veel redenen waarom PSCDGs interessant zouden zijn voor wetenschappelijk

onderzoek naar de biologie van de humane gametogenese en de pathologie van infertiliteit.

Momenteel wordt dit onderzoek voornamelijk uitgevoerd bij de muis. Alhoewel er veel

gametogenese-processen geconserveerd zijn onder zoogdieren, bestaan er ook belangrijke

verschillen die de translatie van kennis verworven bij de muis naar de mens belemmeren.

[134,135]

Het is mogelijk om onderzoek uit te voeren op humane foetale oöcyten van geaborteerde

foetussen, oöcyten gedoneerd voor onderzoek door vrouwen na een IVF behandeling of van

ovaria verwijderd tijdens hysterectomie. Het aantal oöcyten dat op deze manier verkregen kan

worden is beperkt, en iedere oöcyt zal afkomstig zijn van een ander individu, waardoor het

moeilijk is om vergelijkingen te maken tussen experimenten. Voor bepaalde onderzoeken is

een groot aantal oöcyten echter noodzakelijk: bv. het bepalen van hot spots bij recombinatie

of om het effect van chemische en toxische stoffen op non-disjunctie te screenen, enz.

PSCDGs zouden mogelijks een oplossing bieden om grote hoeveelheden van verschillende

stadia van de gametogenese te verkrijgen. Onderzoek van PSCDGs van onvruchtbare

patiënten zou de pathogenese van bepaalde vormen van infertiliteit eventueel kunnen

ontrafelen. Samengenomen zouden deze nieuwe inzichten verworven met PSCDGs potentieel

kunnen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe manieren voor de preventie en behandeling

van infertiliteit, genetische ziektes en sommige kankers, waaronder kiemceltumoren.

[108,136,140]

Als illustratie van het wetenschappelijk potentieel van PSCDGs vergeleken Dominguez et al.

(2014) PSCDGs afkomstig van patiënten met het Turner syndroom met PSCDGs van controle

individuen. De resultaten suggereerden dat twee intacte X-chromosomen niet noodzakelijk

- 40 -

zijn voor de vorming van humane gameten, maar eerder nodig zijn voor het behoud van

humane gameten tot de volwassenheid. [137]

Ten slotte zouden PSCDGs tevens een nut kunnen hebben in het algemeen stamcelonderzoek.

Het onderzoek met PSCDGs zou tot nieuwe inzichten kunnen leiden over stamcellen.

Bovendien zouden stamcel-gederiveerde oöcyten het groot gebrek aan oöcyten kunnen

opvullen die nodig zijn voor SCNT. Op voorwaarde dat deze gederiveerde oöcyten even

efficiënt zijn als natuurlijke oöcyten voor deze techniek. [140]

5.6.2 Klinische toepassingen van PSCDGs

Als PSCDGs ooit veilig gebruikt zouden kunnen worden voor reproductieve doelen zou een

grote en diverse groep van onvruchtbare patiënten, die momenteel niet geholpen kan worden

met de bestaande ARTs, de mogelijkheid krijgen om een genetisch verwant kind te krijgen.

PSCDGs zouden een oplossing kunnen bieden wanneer de infertiliteit veroorzaakt is door o.a.

prematuur ovarieel falen (POF), slechte kwaliteit van de oöcyt bij de vrouw of niet-

obstructieve azoöspermie bij de man.

5.6.2.1 Bieden PSCDGs een oplossing voor al deze patiënten?

Bij een groot deel van de patiënten die niet kunnen geholpen worden met de bestaande ARTs

zouden PSCDGs waarschijnlijk een oplossing kunnen bieden. Bij patiënten met een

genetische oorzaak is de situatie echter complexer. Stel dat het genetisch defect ook aanwezig

is t.h.v. andere lichaamscellen zoals huidcellen dan zou de vorming van PSCDGs

vermoedelijk problematisch zijn. Tenzij men germline genetische modificatie toepast (zie

5.6.3 – 10). [108]

5.6.2.2 Fertiliteitspreservatie

PSCDGs bieden een nieuwe manier van fertiliteitspreservatie voor kinderen die

chemotherapie moeten ondergaan voor een maligniteit of voor vrouwen die een zwangerschap

willen uitstellen tot een latere leeftijd. PSCDGs zouden een voordeel betekenen t.o.v.

bestaande methodes van fertiliteitspreservatie: vrouwen zouden waarschijnlijk geen chirurgie

voor ovarieel weefsel of een hormonale stimulatie voor oöcyten moeten ondergaan.

Bovendien zou men PSCDGs pas deriveren als ze werkelijk nodig zijn, terwijl men bij de

bestaande methodes soms jaren op voorhand een beslissing moet maken. Hierdoor zouden

onnodige interventies op vrouwen, omdat ze b.v. op tijd een partner hebben gevonden, kunnen

vermeden worden. [113]

- 41 -

5.6.3 Nieuwe vormen van ouderschap

Men zou PSCDGs in een veel ruimer toepassingsspectrum kunnen plaatsen dan de relatief

nauwe medische indicaties hierboven beschreven. De mogelijkheid om patiënt-specifieke

PSCDGs te genereren suggereert dat mensen die medisch niet per se beschouwd worden als

onvruchtbaar, maar door hun context belemmerd worden in hun voortplanting (zoals

homokoppels, postmenopauzale vrouwen, alleenstaande vrouwen,…) genetisch verwante

kinderen zouden kunnen krijgen. Deze nieuwe vormen van ouderschap zijn voorlopig

hypothetisch, maar zouden wel een revolutie kunnen betekenen binnen de reproductieve

geneeskunde. Sommige van deze potentiële toepassingen vormen technisch een grote

uitdaging, bij andere zijn er al dan niet sterke sociale of ethische bezwaren.

Een argument dat het gebruik van al deze ‘nieuwe’ toepassingen afkeurt is dat dokters zich

zouden moeten beperken tot het genezen van ziektes i.p.v. het heruitvinden van de natuur.

Reproductie m.b.v. PSCDGs zou dan enkel beschikbaar mogen zijn voor diegenen die worden

geconfronteerd met ‘authentieke infertiliteit’. [131]

1. Een eerste toepassing van PSCDGs heeft betrekking op stamcellijnen. Een individu of een

koppel zou de voorkeur kunnen geven om PSCDGs te genereren uit een welbepaalde,

bestaande stamcellijn, i.p.v. een individu, op basis van de genetische superioriteit. Er zijn

echter meerdere wetenschappelijke en ethische redenen om dergelijk gebruik af te raden. De

verlengde cultuur kan een groter risico op DNA schade vormen. Bovendien kan het

herhaaldelijk gebruik van een beperkt aantal cellijnen voor reproductie, evenals bij te

frequente spermadonaties, mogelijks problematisch zijn voor het risico op ongewilde inteelt

tussen nakomelingen. [119,128]

2 Een tweede groep betreft embryo’s, foetussen en kinderen (dit wordt louter beschouwd als

een academische hypothese). Een mogelijk argument tegen de reproductie met PSCDGs

gecreëerd uit deze groep is de schending van hun reproductieve autonomie, gezien hun

onvermogen om te beslissen over óf en hoe ze een genetisch ouder zouden willen worden.

[119]

3. Een derde groep betreft overleden individuen, m.a.w. postume conceptie. [119,128]

Conceptie van een kind met behulp van sperma-cryopreservatie van een overleden man wordt

over het algemeen als ethisch verantwoord beschouwd wanneer de overleden man zijn

‘informed consent’ heeft gegeven. [138,139] Maar PSCDGs zouden vermoedelijk eerder hun

- 42 -

toepassing vinden wanneer een individu reeds gestorven is en ‘informed consent’ niet meer

mogelijk is, waardoor de autonomie van de overleden persoon in het gedrang komt. Tremellen

et al. argumenteren echter dat het welzijn van de levenden (de weduwe en het toekomstige

kind) de primaire focus zou moeten zijn. [138]

4. Een vierde groep betreft alleenstaande individuen die een kind willen waarvan ze de enige

genetische ouder zijn (dus zonder partner of gedoneerde gameten). Het gecreëerde kind zou

geen kloon zijn van zijn ouder zoals bij reproductief klonen, aangezien de meiose zorgt voor

de herschikking van genetische informatie. [140] Dit scenario verhoogt echter het risico dat

schadelijke heterozygote mutaties homozygoot kunnen worden bij de nakomelingen, dit zou

zelfs meer risicovol zijn dan bij inteelt tussen broers en zussen. [119]

5. De vijfde groep betreft postmenopauzale vrouwen, [140] een groep die steeds belangrijker

wordt aangezien er een trend bestaat om de zwangerschap uit te stellen in de westerse wereld.

Vrouwen ouder dan 45 jaar hebben een zeer kleine kans om zwanger te worden, mogelijks

bieden PSCDGs hier een oplossing. Het zou echter kunnen dat een adulte cel van een oudere

vrouw reeds aanzienlijke DNA schade heeft opgelopen, waardoor de kwaliteit van de

PSCDGs slecht zou zijn met nadelige gevolgen voor het kind. [113] Vanuit een ethisch

standpunt redeneerden Palacios-González et al. (2014) dat als postmenopauzale

zwangerschappen met gedoneerde gameten aanvaard worden, de toepassing van PSCDGs

voor deze vrouwen eveneens gerechtvaardigd zou moeten zijn. [119] Een belangrijke vraag

die zich hier echter stelt is of er een leeftijdsgrens zou moeten bestaan om zwanger te worden.

Daarvoor houden we best rekening met een aantal zaken: het welzijn van het kind, de

gezondheidsrisico’s voor de moeder (een zwangerschap op oudere leeftijd), de

maatschappelijke impact, enz. [113]

6. De zesde groep betreft homoseksuele koppels. Resultaten suggereren dat het eventueel

mogelijk zou zijn om spermatozoa te creëren bij een vrouw en oöcyten bij een man. Hierdoor

zouden homoseksuele koppels samen een kind kunnen krijgen dat genetisch verwant is aan

beiden. Momenteel is het onduidelijk of dit technisch mogelijk zou zijn, in het bijzonder bij

de vrouw aangezien een aantal genen noodzakelijk voor de spermatogenese gelokaliseerd zijn

t.h.v. het Y chromosoom. Daarnaast zou deze derivatie waarschijnlijk extra risico’s

meedragen vergeleken met ‘normale’ PSCDGs. [113]

Er bestaan reeds intermediaire oplossingen voor koppels van hetzelfde geslacht die een

genetisch band willen met hun kind. Zo kan b.v. een lesbisch koppel vragen aan de broer van

de ‘sociale’ moeder om spermadonor te zijn, zodat de ‘sociale’ moeder toch een 25%

- 43 -

genetische link heeft met het kind. Het scenario van PSCDGs voor homoseksuele koppels zou

een volledige genetische link betekenen voor beide ouders, er bestaan echter sterke

meningsverschillen over deze toepassing: sommigen zijn hier heel enthousiast over. [119]

anderen noemen het “zonder twijfel een controversieel en hoogst onwaarschijnlijk potentieel

doel van dit onderzoek” . [108]

Sommige mensen veroordelen het gebruik van PSCDGs door homoseksuele koppels als

moreel onaanvaardbaar omdat ze reproductie en/of opvoeding door homoseksuele koppels

afwijzen, onafhankelijk van de manier waarop het kind gecreëerd werd. Deze argumenten zijn

meestal gebaseerd op religieuze overtuigingen of opvattingen over de natuur. [113,141]

Volgens Testa et al. (2005) kan men zelfs spreken van homofobie of discriminatie o.b.v.

gender of seksuele oriëntatie. [111] Een ander mogelijk bezwaar is dat de extra risico’s om

PSCDGs te deriveren van het andere geslacht onaanvaardbaar zouden zijn. [113]

Testa et al. verdedigen het gebruik van PSCDGs door homoseksuele koppels o.b.v. een aantal

argumenten. ARTs zijn momenteel reeds beschikbaar voor homoseksuele koppels in veel

landen, waardoor het eigenaardig zou zijn om PSCDGs te verbieden. Studies tonen aan dat

kinderen van homoseksuele koppels niet verschillend zijn van andere kinderen op vlak van

hun psychologische ontwikkeling. [142] Bovendien zijn Testa et al. van mening dat PSCDGs

zouden helpen om de reproductie verder te democratiseren. [111] Daarnaast stelt Mertes

(2010) dat als men de wens voor een genetisch verwant kind zou accepteren voor

heteroseksuele koppels, dan is het onduidelijk waarom deze wens onaanvaardbaar of

onbelangrijk zou zijn voor homoseksuele koppels. [113]

7. Een zevende hypothetische toepassing is meervoudig genetisch ouderschap. Vier mensen in

een relatie zouden samen een kind kunnen hebben. Hierbij zouden eerst m.b.v. IVF 2

embryo’s gegenereerd worden van 2 koppels, waarna hESCs afkomstig van de embryo’s

gedifferentieerd kunnen worden tot PSCDGs, die kunnen gebruikt worden voor een tweede

IVF ronde. Het resulterend kind zou genetisch verwant zijn aan de vier aanstaande ouders, die

technisch gezien de genetische grootouders zouden zijn. Er zijn verschillende variaties

mogelijk op dit scenario. Vanuit een ethisch standpunt kunnen Palacios- González et al.

(2014) geen overtuigend argument vinden om de mogelijkheid van genetisch verwantschap

m.b.v. PSCDGs te beperken tot specifieke categorieën van individuen of koppels. Het

argument dat meervoudig genetisch ouderschap slecht zou zijn voor het kind verdedigen ze

met het principe van ‘het onrechtvaardige leven’ (zie 5.5.3). [119]

- 44 -

8. Een achtste mogelijkheid voor PSCDGs betreft iteratieve in vitro reproductie. Sparrow

(2014) beschreef een hypothetisch scenario waarbij meerdere generaties van humane

embryo’s in vitro gecreëerd zouden kunnen worden. Hierbij zou men een embryo creëren uit

spermatozoa en oöcyten gederiveerd uit verschillende stamcellijnen, waarna men nieuwe

gameten zou kunnen genereren uit de stamcellen afkomstig van dit eerste embryo. Dit proces

zou, in principe, tot in het oneindige herhaald kunnen worden. Ofwel zou het proces

onderbroken kunnen worden zodat één van de resulterende embryo’s geïmplanteerd zou

worden in de uterus van een vrouw, met mogelijks de geboorte van een kind. [143] Een

belangrijke praktische barrière zou echter zijn dat verlengde cultuur van cellijnen

epigenetische veranderingen zouden veroorzaken, die zouden doorgegeven worden aan de

volgende generaties. Daarnaast stelt hij dat de creatie van embryo’s voor onderzoek een

ethisch probleem zou vormen. Sparrow schat dat in een 10-jaars project men 20-30 humane

generaties in vitro zou kunnen genereren. Iteratieve in vitro reproductie zou volgens Sparrow

een aantal interessante toepassingen kennen: onderzoek naar de erfelijkheid van genetische

aandoeningen; de productie van cellijnen met specifieke genotypes voor onderzoeks- en

therapeutische doeleinden; de creatie van kinderen met gewenst fenotype . Deze laatste

toepassing, het maken van ‘betere baby’s’ of m.a.w. eugenetica, is echter een heel

controversieel doel. [143] Het voorgestelde scenario en stellingen die Sparrow maakte heeft

veel reacties en kritiek uitgelokt. Men argumenteerde o.a. dat de visie van Sparrow

wetenschappelijk en ethisch te optimistisch is. [144]

9. Zoals reeds aangehaald bij 'iteratieve in vitro reproductie' zouden PSCDGs mogelijks

nieuwe eugenetische technologieën kunnen bevorderen. Dit is echter een heel controversieel

gegeven en zou kunnen beschouwd worden als een argument contra PSCDGs. Men zou

namelijk grote hoeveelheden PSCDGs en embryo’s kunnen produceren, waardoor

toekomstige ouders hun ‘beste’ embryo zouden kunnen selecteren o.b.v. genetisch profiel

gerelateerd aan bv. ziekterisico of fenotypische eigenschappen zoals oogkleur. Deze

toepassing is zorgwekkend omdat men ten eerste een groot aantal embryo’s zou creëren, meer

dan klinisch noodzakelijk, en ten tweede omdat het zou kunnen leiden tot ‘designer baby’s’.

[108,128,140]

10. Daarnaast zou men PSCDGs kunnen gebruiken voor germline genetische modificatie.

Door stamcellen genetisch te manipuleren en hieruit gameten te deriveren, zou men

gemodificeerde embryo’s kunnen creëren (ofwel voor de correctie van ziekte-geassocieerde

mutaties of voor eugenetische toepassingen). [113,140] Momenteel is germline genetische

- 45 -

modificatie verboden in de meeste landen, o.a. omdat het technisch nog niet efficiënt en veilig

is en uit angst voor misbruik van de technologie voor eugenetische doelen. [145,146]

PSCDGs zijn echter niet noodzakelijk voor germline genetische modificatie, want men kan

humane embryo's tevens direct genetisch modificeren. [147] Oppositie tegen germline

genetische modificatie betekent dus niet automatisch de oppositie tegen PSCDGs. [113]

- 46 -

6. DISCUSSIE

6.1 Efficiëntie

6.1.1 Samenvatting van resultaten

Sinds de eerste creatie van mESC-gederiveerde OLCs in 2003 heeft men m.b.v. ESCs en

iPSCs reeds heel wat kunnen realiseren: zowel bij de muis als de mens is men in staat om

PGCLCs in vitro te deriveren en deze te differentiëren tot SLCs, OLCs en FLSs. [14] Er

bestaat echter een onmiskenbare discrepantie tussen de ontwikkeling van mannelijke SLCs en

vrouwelijke OLCs en FLSs: volledige meiose en vorming van mature en bewezen functionele

gameten werd tot op heden uitsluitend gerapporteerd bij mannelijke muizen. [15] De FLSs

ontwikkelden zich slechts tot primordiale, primaire of soms secundaire follikels, maar hierna

ondergingen ze degeneratie; antrale follikels werden (nog) niet gecreëerd.

De meiose blijft één van de grootste hindernissen om PSCDGs te deriveren. Men is er nog

niet in geslaagd om OLCs te creëren die de meiose konden volbrengen, hoogstens een initiatie

van de meiose kon geobserveerd worden. De meiose van muis- en humane SLCs kon wel

relatief succesvol gerealiseerd worden. Alhoewel bij de mens een aantal studies geen meiose

of slechts een initiatie van de meiose van de SLCs konden waarnemen. Daarnaast is het aantal

gegenereerde haploïde cellen laag (max 4% werd gerapporteerd; [73]), m.a.w. er is zowel een

slechte kwaliteit als een lage efficiëntie van de meiose.

Epigenetische herprogrammatie vormt een tweede grote hindernis voor de derivatie van

PSCDGs. Zowel bij de muis als de mens en bij de man als de vrouw blijken fouten op te

treden bij de inprenting van PSCDGs. Deze fouten manifesteren zich reeds bij de ‘eerste’ stap

van herprogrammatie, inprenting-verwijdering, en worden tevens gezien bij de ‘tweede’ stap,

herinstellen van parentaal inprenting-patroon. Ten derde bestaat zowel bij de muis als de

mens aanwijzingen voor de vorming van gonadale hormoon-producerende cellen in de

cultuur.

Ten slotte werd de fertilisatie van zowel SLCs als FLSs succesvol uitgevoerd door Hayashi et

al. Gezonde en vruchtbare nakomelingen werden geboren, met normale epigenetische

kenmerkern. De efficiëntie van de fertilisatie van FLSs was echter laag, vermoedelijk door

triploïdie-afwijkingen. [14,61]

- 47 -

6.1.2 Waarom is de meiose bij OLCs moeilijker dan bij SLCs?

Men observeerde meer frequent de differentiatie van SLCs dan de ontwikkeling van OLCs.

Bovendien vertoonde de meerderheid van de gederiveerde OLCs zowel bij de muis als de

mens een abnormale meiose en inprenting-fouten. Het is echter onduidelijk wat de oorzaak is

van deze inefficiënte OLC-derivatie.

Meestal werden XY-stamcellen gebruikt voor de derivatie van OLCs en FLSs. Als bepaalde

spermatogenese-geassocieerde genen niet juist tot expressie worden gebracht, zullen

mannelijke PGCs zich ontwikkelen tot oöcyten. [14,148] Nitta et al. stelt de hypothese dat een

abnormale seksuele differentiatie de oorzaak kan zijn van een afwijkende meiose en

folliculogenese van de OLCs/FLSs. M.a.w. XX-stamcellen zouden meer geschikt zijn voor de

derivatie van FLSs. Nochtans toonden studies met XX-mESCs aan dat de productie van FLSs

eveneens onsuccesvol was. [68] Mogelijks werd dit veroorzaakt door genetische en

epigenetische instabiliteit van XX ESCs. [68,149]

Een tweede hypothese voor het gebrek aan OLCs is dat meest frequent gebruik werd gemaakt

van EBs i.p.v. een monolayer cultuur. Er bestaan namelijk vermoedens dat een monolayer

cultuur de neiging heeft om de oögenese te stimuleren en EBs eerder de spermatogenese

bevorderen. [66,150,151]

Ten slotte is de oögenese in vivo tevens minder efficiënt dan de spermatogenese. Ongeveer 80-90%

van de aneuploïdie gezien bij de humane embryo’s wordt veroorzaakt door non-disjunctie

tijdens de 1ste maternale meiotische deling MI. [152] De oorzaak van deze vrouwelijke MI

‘kwetsbaarheid’ is nog niet volledig duidelijk, maar zou kunnen verklaard worden omdat

meer fouten optreden tijdens de oögenese of (meer waarschijnlijk) door een gebrek aan

herkennen en corrigeren of elimineren van cellen met afwijkingen. Dit zou niet merkwaardig

zijn aangezien de oögenese complexer verloopt dan de spermatogenese, met verschillende

start en stop signalen i.p.v. een continu proces. [153]

6.1.3 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens?

Het is moeilijk om een antwoord te geven op deze vraag, aangezien fertilisatie-experimenten

(nog) niet werden uitgevoerd bij de mens, dit is echter het ultieme bewijs voor functionele

gameten. Als we echter andere parameters bestuderen, zoals meiose en epigenetische

herprogrammatie, merken we dat de muis en humane PSCDGs min of meer dezelfde zwaktes

en sterktes vertoonden. Bij allebei werden vroege- en late merkers tot expressie gebracht. De

meiose en oögenese van OLCs was zowel bij muis als humane PSCDGs overwegend

- 48 -

abnormaal. Allebei vertoonden ze haploïde SLCs met vermoedelijk recombinatie. Bovendien

konden epigenetische afwijkingen bij beiden gedetecteerd worden. Bij humane PSCDGs

rapporteerden echter 2 studies een volledig correct instellen van inprenting-patronen, [73,100]

hoewel dit bij de muis slechts gedeeltelijk geobserveerd werd. [59] Ten slotte konden mature

spermatozoa gecreëerd worden uit muis stamcellen, maar humane SLCs differentieerden

slechts tot ronde spermatiden.

We moeten in rekening brengen dat bij de mens geen in vivo-transplantatie-stap werd

uitgevoerd, in tegenstelling tot muis PSCDGs, waardoor men de efficiëntie van humane

PSCDGs mogelijks zou kunnen onderschat. Om de efficiëntie van humane PSCDG-derivatie

te verhogen zou men, in principe, PSCDGs (of voorstadia hiervan) kunnen transplanteren in

de gonaden van de patiënt. [99] De vraag stelt zich echter of dit haalbaar zou zijn in de

kliniek. Sommige patiënten beschikken b.v. niet over functionele testes, zoals patiënten met

bilaterale criptorchidie. Het is wel reeds mogelijk een xenotransplantatie uit te voeren met

humane PSCDGs naar muis-testes om de functionaliteit van de gameten te beoordelen. [90]

We kunnen concluderen dat er een mogelijkheid bestaat dat de derivatie van muis en humane PSCDGs

even (in)efficiënt is, maar het is nog te vroeg om hierover een sluitend antwoord te bieden.

6.1.4 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij iPSCs als ESCs?

Zijn iPSCs even efficiënt als ESCs? Hier bestaat discussie over: sommige studies vermoeden

dat hESCs efficiënter zijn, andere dat hiPSCs efficiënter zijn. Epigenetische verschillen tussen

hESCs en hiPSCs zou de variatie in efficiëntie kunnen verklaren. Ofwel werd dit louter

veroorzaakt door het heterogeen, intrinsiek differentiatie potentieel van stamcellijnen. Verder

onderzoek is nodig om hierover een besluit te kunnen vormen.

6.1.5 Derivatie van gameten uit ntESCs

Momenteel werden uitsluitend ESCs (of iPSCs) gebruikt voor de derivatie van PSCDGs,

ntESC-gederiveerde gameten werden nog niet onderzocht. Maar als men patiënt-specifieke

gameten zou willen creëren met embryonale stamcellen, volstaan ESCs niet. Dit toont het

belang aan om de mogelijkheid van ntESC-gederiveerde gameten te exploreren.

6.1.6 Variabiliteit tussen de verschillende studies

Er bestaat een aanzienlijke heterogeniteit in efficiëntie van in vitro GLC-derivatie tussen

verscheidene studies, maar eveneens in één studie wanneer meerdere stamcellijnen

onderzocht werden. Hoewel iedere studie in staat was om PGCLCs te induceren, bleek de

- 49 -

progressie door de meiose en correcte epigenetische herprogrammatie complexer en sterk

variërend te zijn. Wat verklaart deze heterogeniteit?

De meest evidente reden is de variabiliteit in differentiatie-methodes tussen de studies .

[88,100] Het aantal uitgevoerde studies rond GLC-derivatie is relatief beperkt in verhouding

met de verscheidenheid aan methodes.

Dit is echter geen allesomvattende verklaring, aangezien ook binnen een studie met één

bepaalde methode variatie kan opgemerkt worden tussen meerdere stamcellijnen. Zowel ES-

als iPS-cellijnen zijn heterogeen in hun intrinsiek differentiatie potentieel. Sommige

stamcellijnen vertonen een sterke neiging om te differentiëren naar een specifiek celtype. Dit

wordt veroorzaakt door epigenetische en transcriptionele variatie tussen de cellijnen.

[154,155] Het zou nuttig zijn om ES- en iPS-cellijnen te screenen o.b.v. DNA-methylatie en

genexpressie, zodat de meest geschikte cellijn geselecteerd kan worden voor de differentiatie

van GLCs. [96,97]

Ten slotte kunnen ongecontroleerde en/of ongekende variabelen in het protocol mede een

oorzaak zijn voor de heterogeniteit. [100]

6.2 Veiligheid

Als PSCDGs ooit toegepast zouden worden in de kliniek, zal veiligheid de overheersende

bezorgdheid zijn. In de eerste plaats de veiligheid van het resulterend kind, maar ook de

veiligheid van de generaties na het kind en van de patiënt zelf zijn belangrijk. De

functionaliteit en de veiligheid van de GLCs kunnen geëvalueerd worden o.b.v. een aantal

parameters: morfologie, merkers, meiose, epigenetica en fertilisatie. Het is echter niet voor

iedere parameter volledig duidelijk wat het effect is op de functionaliteit en/of veiligheid. De

meeste studies besteden relatief weinig aandacht aan de klinische toepasbaarheid van

PSCDGs, waardoor vaak onvoldoende informatie beschikbaar is om de functionaliteit en

veiligheid van de PSCDGs te evalueren. Als men pre-klinische of klinische evaluatie zou

willen uitvoeren, zal een meer extensieve analyse van de PSCDGs absoluut noodzakelijk zijn.

Daarom bespreken we welke beperkingen zich stelden in de evaluatie van deze PSCDGs. Ten

slotte beschrijven we de potentiële risico’s van PSCDGs voor de patiënt zelf.

6.2.1 Morfologie en merkers

In de kliniek beoordeelt men mannelijke infertiliteit m.b.v. sperma-analyse gebaseerd op

enkele parameters zoals de morfologie. Deze analyse is echter niet indicatief voor potentiële

fertiliteit, maar identificeert slechts extreme gevallen van infertiliteit zoals azoöspermie of

- 50 -

globozoöspermie. Onder normale omstandigheden worden oöcyten die een afwijkende

morfologie vertonen niet gebruikt in klinische procedures. Als PSCDGs echter blijvend een

abnormale morfologie zullen vertonen, zullen specifieke merkers voor functionaliteit

noodzakelijk zijn, zodat men de meest levensvatbare oöcyten kan selecteren voor de klinische

toepassing. [150]

Daarnaast kan men stellen dat een cel die lijkt op een oöcyt o.b.v. morfologie, niet

noodzakelijk een ‘echte’ oöcyt is. Succesvolle gametogenese vereist zowel ‘meiose’ als ‘het

ontwikkelen’ van de gameet, deze 2 processen zijn genetisch gescheiden van elkaar. In een

studie door Dokshin et al. werden Stra8-deficiënte muizen gegenereerd die Stra8-deficiënte

OLCs produceerden (Stra8 is noodzakelijk voor de meiose). Deze OLCs waren morfologisch

niet te onderscheiden van normale oöcyten en ontwikkelden zich na fertilisatie tot 2-cellige

embryo’s. Er was echter geen bewijs voor meiose, dus deze OLCs konden niet geïdentificeerd

worden als ‘echte’ oöcyten. [156,157,99]

De meeste studies evalueren GLCs voornamelijk o.b.v. gametogenese-merkers, deze aanpak

heeft echter een aantal nadelen. Ten eerste bestaat er een grote verscheidenheid van

toegepaste merkers tussen de studies (m.a.w. iedere studie maakte gebruik van een ander

panel van merkers voor identificatie en isolatie), waardoor betrouwbare vergelijkingen

moeilijk en niet praktisch zijn. Ten tweede vormen aspecifieke merkers een probleem voor de

identificatie van GLCs (b.v. merkers die ook tot expressie komen door o.a. ESCs). Bovendien

is er discussie over de specificiteit van sommige ‘specifieke’ GLC-merkers: is de merker

100% specifiek voor een gameet (en wordt deze dus niet tot expressie gebracht door andere

celtypes)? En is de merker 100% specifiek voor een bepaald stadium van de gametogenese

(b.v. specifiek voor de meiose)? Ten derde werd de transcriptionele analyse meestal beperkt

tot een aantal merkers, hoewel in werkelijkheid een veel groter aantal genen een rol spelen in

de gametogenese. [90] Bovendien werd in de meeste studies de nadruk gelegd op vroege

PGC-merkers en niet op late meiotische- en post-meiotische merkers, waardoor evaluatie van

latere stadia moeilijk is. Ten slotte bestaat er een prangende noodzaak om te achterhalen wat

de betekenis is van de aan- of afwezigheid van deze merkers en de gevolgen op de

functionaliteit en veiligheid van de GLCs. [150]

Samengevat zouden deze problemen deels kunnen opgelost worden door een panel van

merkers te creëren die essentieel zijn voor de functie en veiligheid van gameten en cruciale

informatie bieden voor de klinische toepasbaarheid van PSCDGs. [150] Daarnaast lijkt

- 51 -

microarray analyse meer geschikt voor de vergelijking tussen het transcriptoom van GLCs en

gameten.

6.2.2 Meiose

Een correcte meiose is essentieel voor de funcionaliteit en veiligheid van de GLCs. Non-

disjunctie en aneuploïdie zijn niet verenigbaar met het leven of veroorzaken mentale

retardatie of andere ernstige afwijkingen. [152]

De meiose werd in de meeste studies die PSCDGs deriveren niet of slechts beperkt

bestudeerd. Doorgaans werden meiose-merkers geanalyseerd, deze bieden echter geen bewijs

dat de meiose ‘correct’ werd uitgevoerd. Daarnaast werd de detectie van haploïde cellen vaak

als ‘meiose-bewijs’ aangewend, maar wanneer de analyse met flow cytometrie gebeurde zijn

deze resultaten betwistbaar. [99]

Eguizabal et al. rapporteerden “volledige” in vitro meiose (bij zowel hESCs als hiPSCs) o.b.v.

post-meiose merkers en de detectie van haploïde cellen. Deze resultaten suggereren dat de

gederiveerde cellen een meiotische deling hadden ondergaan. Maar andere belangrijke

aspecten van de meiose werden niet geëvalueerd, zoals het aantonen van recombinatie,

waardoor men geen uitsluitend bewijs had dat alle cruciale aspecten van de meiose correct

verliepen. Geen enkele studie voldoet aan de ‘gouden standaard’ criteria voor een correcte

meiose voorgesteld door Handel et al. (2014). [99,100] Als PSCDGs (pre)-klinisch

geëvalueerd zouden worden, zou een grondige evaluatie van de meiose o.b.v. strenge criteria

echter noodzakelijk zijn.

6.2.3 Epigenetica

Inprenting genen reguleren de foetale en placentale groei. [158] Afwijkende expressie van

ingeprente genen kunnen een aantal syndromen en ziektes veroorzaken, zoals Angelman- en

Prader-Willi syndroom. Ze spelen tevens een rol in meerdere multifactoriële aandoeningen

(zoals diabetes, astma en psoriasis) en maligne aandoeningen zoals borst-en ovariumkanker.

[159,160]

In vitro manipulatie van cellen kan leiden tot epigenetische veranderingen die de stamcellen

of de PSCDGs kunnen beïnvloeden. [136,161] Verschillende studies suggereren dat kinderen

resulterend uit ARTs een verhoogd risico zouden hebben op bepaalde syndromen, veroorzaakt

door epigenetische afwijkingen gecreëerd tijdens manipulatie van de gameten. [150,161]

Vergeleken met de gameten bij ICSI en IVF worden PSCDGs nóg meer gemanipuleerd en

blootgesteld aan epigenetische risico’s. In 2006 werd de geboorte van muizen bereikt door de

- 52 -

fertilisatie van mESC-gederiveerde SLCs en oöcyten. Deze vertoonden echter fenotypische

afwijkingen en een korte levensduur, waarschijnlijk veroorzaakt door epigenetische

afwijkingen van de SLCs. [59] Deze observaties tonen aan dat men epigenetische afwijkingen

kan verwachten bij PSCDGs en wijzen op het belang van een grondige epigenetische

evaluatie van deze cellen.

De minderheid van de studies die PSCDGs deriveerden, onderzocht de epigenetische

herprogrammatie van de PSCDGs. Bovendien werden slechts een beperkt aantal inprenting-

genen geanalyseerd. De observatie van hESC-gederiveerde SLCs met correct paternaal

inprenting-patroon van 2 genen (H19 en Igf2r) werd reeds gerapporteerd. [73] Momenteel zijn

er echter 112 genen gekend die via inprenting gereguleerd worden: 53 bij de mens en 96 bij

de muis. [159] Als men de functionaliteit en veiligheid van de GLCs wil garanderen zal het

noodzakelijk zijn om, i.p.v. slechts 2 genen, veel meer inprenting-genen te screenen.

Daarnaast werden andere epigenetische eigenschappen van gameten nauwelijks onderzocht:

globale DNA demethylatie, histonen-modificatie en reactivatie van het X-chromosoom. [74]

6.2.4 Fertilisatie

De ultieme gouden standaard voor het bewijs van ‘functionele gameten’ is de productie van

gezonde nakomelingen met een normale ontwikkeling en normaal karyotype, transcriptoom

en epigenetisch landschap. Hayashi et al. (2011) zijn de enigen die bewezen functionele

gameten hebben kunnen creëren bij de muis. [15] De derivatie van functionele gameten

betekent echter niet dat deze ‘veilig’ waren. Want de SLCs vertoonden epigenetische

afwijkingen en de meiose werd niet bestudeerd. Bovendien heeft ‘veiligheid’ evident een

andere betekenis bij de muis dan bij de mens. Verscheidene afwijkingen kunnen moeilijk

bestudeerd worden bij de muis, zoals b.v. een verhoogd risico op de ontwikkeling van

schizofrenie. Om te bepalen of de PSCDGs effectief ‘veilig’ zijn zou bevruchting met humane

PSCDGs en lange termijn follow-up noozakelijk zijn. Omwille van ethische redenen werden

(nog) geen fertilisatie-experimenten uitgevoerd met humane PSCDGs.

6.2.5 Veiligheid voor de patiënt

Indien men de efficiëntie van humane PSCDG-derivatie zou willen verhogen zou men kunnen

experimenteren met een in vivo-transplantatie-stap naar humane testes of ovaria. Dit zou

echter een potentieel risico kunnen inhouden voor de patiënt m.b.t. de vorming van tumoren,

zowel bij hESCs als hiPSCs. [136,162] Bovendien bestaat er een risico op immunologische

rejectie, zelfs bij autologe therapie zou dit mogelijks een probleem kunnen vormen. [136,163]

- 53 -

6.3 Conclusie

Is de derivatie van PSCDGs efficiënt? Ondanks intensief onderzoek naar stamcel-

gederiveerde gameten sinds 2003 blijft dit een relatief inefficiënt en slecht reproduceerbaar

proces. Dit is misschien niet verrassend aangezien de gametogenese in vivo eveneens een

uniek en complex proces is. [89] De derivatie van functionele FLSs vormt momenteel de

grootste uitdaging. Verder onderzoek naar de optimalisering van de derivatie-cultuur en

ontwikkeling van nieuwe methodes zullen bijdragen aan het verhogen van de efficiëntie van

PSCDG-derivatie. [164] Als de efficiëntie laag zou blijven, kan de bedenking gemaakt

worden dat men slechts één functionele spermatozoïde en één oöcyt nodig heeft voor een

fertilisatie. Bovendien zou men o.b.v. screening de ‘beste’ PSCDGs kunnen selecteren.

Zijn humane PSCDGs veilig? Veiligheid is de grootste bezorgdheid rond PSCDGs. De

meeste studies besteden echter relatief weinig aandacht aan de moleculaire evaluatie van

PSCDGs. Bovendien zijn de resultaten heterogeen. Er zijn aanwijzingen dat er een

mogelijkheid bestaat dat PSCDGs (tot op een bepaald niveau) veilig zouden kunnen zijn in de

toekomst. Maar waakzaamheid is geboden, want mogelijks zullen PSCDGs nooit ‘volledig’

veilig zijn. Een meer extensieve evaluatie van PSCDGs zou noodzakelijk zijn om een

antwoord te kunnen bieden op deze vraagstelling.

Is de toepassing van PSCDGs voor de behandeling van onvruchtbare patiënten efficiënt,

veilig en ethisch verantwoord? Momenteel is het antwoord op deze vraag: nee. Maar er

bestaat een mogelijkheid dat dit wel zo zal zijn in de toekomst. In 2008 werd door de Hinxton

Group geschat dat de derivatie van PSCDGs mogelijk zal zijn binnen 5-15 jaar. [16] Dit lijkt

een optimistische schatting als men PSCDGs zou willen deriveren die volledig veilig zijn. De

complexiteit van de nieuwe techniek van PSCDGs is in de eerste plaats een wetenschappelijk-

technische uitdaging, maar er zijn tevens ethische en sociale problemen m.b.t. de veiligheid

van de resulterende kinderen en de potentiële hoge kosten van deze techniek. Als

maatschappij zullen we moeten beoordelen hoever we willen gaan om de wens voor genetisch

ouderschap te vervullen.

- 54 -

7. REFERENTIES

1. Chachamovich JR, Chachamovich E, Ezer H, Fleck MP, Knauth D, Passos EP. Investigating quality of

life and health-related quality of life in infertility: a systematic review. J Psychosom Obstet Gynaecol

2010, 31:101–110.

2. Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG. International estimates of infertility prevalence and

treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Hum Reprod. 2007

Jun;22(6):1506-12.

3. Petraglia F, Serour GI, Chapron C. The changing prevalence of infertility. Int J Gynaecol Obstet. 2013

Dec;123 Suppl 2:S4-8.

4. Steptoe PC, Edwards RG. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, 2 (1978), p. 366.

5. Schlegel PN. Evaluation of male infertility. Minerva Ginecol. 2009 Aug;61(4):261-83.

6. Yassini SM, Taghavi Shavazi M, Taghavi Shavazi N. Factors associated with adoption acceptance rate

from the view point of infertile couples. Iran J Reprod Med. 2012 Sep;10(5):413-8.

7. Kind&Gezin. Hoe lang duurt het om een kind te adopteren? Beschikbaar via:

http://www.kindengezin.be/contact-en-help/veelgestelde-vragen/adoptie/hoe-lang-duurt-het-om-een-

kind-te-adopteren.jsp. Geraadpleegd op juli 2015.

8. Ferraretti AP1, Goossens V, Kupka M, Bhattacharya S, de Mouzon J, Castilla JA, et al. Assisted

reproductive technology in Europe, 2009: results generated from European registers by ESHRE. Hum

Reprod. 2013 Sep;28(9):2318-31.

9. Hoge gezondheidsraad. Publicatie nr. 8639 van 7 juli 2010. Eiceldonatie: Medische en psychologische

evaluatie van eiceldonor en gevolgen voor haar gezondheid.2007

10. Bodri D, Guillén JJ, Polo A, Trullenque M, Esteve C, Coll O. Complications related to ovarian

stimulation and oocyte retrieval in 4052 oocyte donor cycles. Reprod Biomed Online. 2008

Aug;17(2):237-43.

11. Dickenson D. Commodification of human tissue: implications for feminist and development ethics. Dev

World Bioeth. 2002 May;2(1):55-63.

12. Gong D, Liu YL, Zheng Z, Tian YF, Li Z. An overview on ethical issues about sperm donation. Asian J

Androl. 2009 Nov;11(6):645-52.

13. Jadva V, Freeman T, Kramer W, Golombok S. The experiences of adolescents and adults conceived by

sperm donation: comparisons by age of disclosure and family type. Hum Reprod. 2009

Aug;24(8):1909-19.

14. Hübner K, Fuhrmann G, Christenson LK, et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem

cells. Science. 2003;300(5623):1251-1256.

15. Hinxton Group. Consensus Statement: Science, Ethics and Policy Challenges of Pluripotent Stem Cell

Derived Gametes. (2008). Beschikbaar via: http://www.hinxtongroup.org/au_pscdg_cs.html

(geraadpleegd op april 2016).

16. Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, SaitouM. Reconstitution of the mouse germ cell

specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 2011;146 519-532.

17. Shanthly N, Aruva MR, Zhang K, Mathew B, Thakur ML. Stem cells: a regenerative pharmaceutical. Q

J Nucl Med Mol Imaging. 2006 Sep;50(3):205-16. Review.

18. Evans MJ, Kaufman MH. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.

Nature. Jul;292:154–156.

19. Martin GR. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium

conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. Dec;78:7634–7638.

20. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. 1998.

Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. Nov;282:1145–1147.

21. Puri MC, Nagy A. Concise review: Embryonic stem cells versus induced pluripotent stem cells: the

game is on. Stem Cells. 2012 Jan;30(1):10-4.

22. Briggs R, King TJ. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs.

Proc Natl Acad Sci U S A. 1952 May;38(5):455-63.

23. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and

adult mammalian cells. Nature. 1997 Feb 27;385(6619):810-3.

24. National Academy of Sciences (US), National Academy of Engineering (US), Institute of Medicine

(US) and National Research Council (US) Committee on Science, Engineering, and Public Policy.

Scientific and Medical Aspects of Human Reproductive Cloning. Washington (DC): National

Academies Press (US); 2002.

25. Yamanaka S, Blau HM. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature.

2010 Jun 10;465(7299):704-12.

- 55 -

26. Munsie, M.J. et al. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse

somatic cell nuclei. Curr. Biol. 2000; 10, 989–992.

27. Tachibana M, Amato P, Sparman M, Gutierrez NM, Tippner-Hedges R, Ma H, et al. Human embryonic

stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell. 2013 Jun 6;153(6):1228-38.

28. Wakayama S, Jakt ML, Suzuki M, Araki R, Hikichi T, Kishigami S, et al. Equivalency of nuclear

transfer-derived embryonic stem cells to those derived from fertilized mouse blastocysts. Stem cells.

2006; 24:2023–2033.

29. Wakayama, T. et al. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by

nuclear transfer. Science. 2001; 292, 740–743.

30. Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL, Nelson M, Sanger WG, Gokhale S, et al. Producing primate

embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 2007 Nov 22;450(7169):497-502.

31. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult

fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663–676.

32. Park I-H, Zhao R, West JA et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined

factors. Nature 2007; 451: 141–146.

33. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human

fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861–872.

34. Bar-Nur O, Russ HA, Efrat S et al. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation

in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell 2011; 9:

17–23.

35. Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T. Generation of induced

pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008

Jan;26(1):101-6.

36. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, Gao Q, Bell GW, Cook EG. Parkinson's disease patient-derived

induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 2009 Mar 6;136(5):964-77.

37. Botman O, Wyns C. Induced pluripotent stem cell potential in medicine, specifically focused on

reproductive medicine. Front Surg. 2014 Mar 24;1:5.

38. Lawson KA, Hage WJ. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found.

1994; Symp. 182, 68–84, discussion 84-91.

39. Lawson KA, Dunn NR, Roelen BA, Zeinstra LM, Davis AM, Wright CV, et al. Bmp4 is required for

the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev.1999; 13, 424–436.

40. Saitou M, Yamaji M. Germ cell specification in mice: signaling, transcription regulation, and epigenetic

consequences. Reproduction. 2010 Jun;139(6):931-42.

41. Arnold SJ1, Robertson EJ. Making a commitment: cell lineage allocation and axis patterning in the

early mouse embryo. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Feb;10(2):91-103.

42. Magnúsdóttir E, Surani MA. How to make a primordial germ cell. Development. 2014 Jan;141(2):245-

52.

43. Magnúsdóttir E, Dietmann S, Murakami K, Günesdogan U, Tang F, Bao S, et al. A tripartite

transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nat. Cell Biol. 2013;

15, 905–915.

44. Phillips BT, Gassei K, Orwig KE. Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis. Philos

Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2010 May 27;365(1546):1663-78.

45. Abban G, Johnson J. Stem cell support of oogenesis in the human. Hum Reprod. 2009

Dec;24(12):2974-8.

46. Page SL, Hawley RS. The genetics and molecular biology of the synaptonemal complex. Annu Rev

Cell Dev Biol, 2004.

47. Urani MA, Barton SC, Norris ML. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the

genome during gametogenesis. Nature. 1984; 308, 548-550.

48. Reik W, Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat. Rev. Genet. 2001; 2, 21-

32.

49. Yao L, Yu X, Hui N, Liu S. Application of iPS in assisted reproductive technology: sperm from somatic

cells? Stem Cell Rev. 2011 Sep;7(3):714-21.

50. Imamura M, Hikabe O, Lin ZY, Okano H. Generation of germ cells in vitro in the era of induced

pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 2014 Jan;81(1):2-19.

51. Bratt-Leal AM, Carpenedo RL, McDevitt TC. Engineering the embryoid body microenvironment to

direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 2009 Jan-Feb;25(1):43-51.

52. Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.

PNAS. 2003;100 11457-11462.

53. Payer B, Chuva de Sousa Lopes SM, Barton SC, Lee C, Saitou M & Surani MA 2006 Generation of

stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis 44 75–83.

- 56 -

54. Chuang CY, Lin KI, Hsiao M, Stone L, Chen HF, Huang YH. Meiotic competent human germ cell-like

cells derived from human embryonic stem cells induced by BMP4/WNT3A signaling and

OCT4/EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) selection. J Biol Chem. 2012 Apr 27;287(18):14389-

401.

55. Bucay N, Yebra M, Cirulli V, Afrikanova I, Kaido T, Hayek A, Montgomery AM. A novel approach

for the derivation of putative primordial germ cells and sertoli cells from human embryonic stem cells.

Stem Cells. 2009 Jan;27(1):68-77.

56. Zwaka TP, Thomson JA. A germ cell origin of embryonic stem cells?

Development. 2005 Jan;132(2):227-33.

57. Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A.Testicular cell conditioned medium supports differentiation of

embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells. 2006 Feb;24(2):266-73.

Epub 2005 Aug 18.

58. Qing T, Shi Y, Qin H, Ye X, Wei W, et al. Induction of oocyte-like cells from mouse embryonic stem

cells by co-culture with ovarian granulosa cells. Differentiation. 2007;75:902–911.

59. Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW, et al. In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to

male gametes that can generate offspring mice. Developmental Cell. 2006;11(1):125-132.

60. Nicholas CR, Haston KM, Grewall AK, Longacre TA, Reijo Pera RA. Transplantation directs oocyte

maturation from embryonic stem cells and provides a therapeutic strategy for female infertility. Hum

Mol Genet. 2009 Nov 15;18(22):4376-89.

61. Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, et al. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ

cell-like cells in mice. Science. 2012;338(6109):971-975.

62. Miryounesi M, Nayernia K, Dianatpour M, Mansouri F, Modarressi MH. Co-culture of Mouse

Embryonic Stem Cells with Sertoli Cells Promote in vitro Generation of Germ Cells. Iran J Basic Med

Sci. 2013 Jun;16(6):779-83.

63. Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A.Testicular cell conditioned medium supports differentiation of

embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells. 2006 Feb;24(2):266-73.

Epub 2005 Aug 18.

64. Lawson KA, Dunn NR, Roelen BA, Zeinstra LM, Davis AM, Wright CV, et al. Bmp4 is required for

the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev.1999; 13, 424–436.

65. Silva C, Wood JR, Salvador L, Zhang Z, Kostetskii I, Williams CJ, Strauss JF 3rd. Expression profile

of male germ cell-associated genes in mouse embryonic stem cell cultures treated with all-trans retinoic

acid and testosterone. Mol Reprod Dev. 2009 Jan;76(1):11-21. doi: 10.1002/mrd.20925.

66. Geijsen N, Horoschak M, Kim K, Gribnau J, Eggan K, et al. Derivation of embryonic germ cells and

male gametes from embryonic stem cells. Nature. 2004;427:148–154.

67. Hu Y, Sun J, Wang J, Wang L, Bai Y, Yu M, Lian Z, Zhang S, Hua J. Characterization of female germ-

like cells derived from mouse embryonic stem cells through expression of GFP under the control of

Figla promoter. J Cell Biochem. 2012 Apr;113(4):1111-21. doi: 10.1002/jcb.24044.

68. Nitta M, Imamura M, Inoue Y, Kunitomo Y, Lin ZY, Ogawa T, et al. Aberrant gene expression and

sexually incompatible genomic imprinting in oocytes derived from XY mouse embryonic stem cells in

vitro. PLoS One. 2013;8(3):e58555. doi: 10.1371/journal.pone.0058555. Epub 2013 Mar 5.

69. Novak I, Lightfoot DA, Wang H, Eriksson A, Mahdy E, Höög C. Mouse embryonic stem cells form

follicle-like ovarian structures but do not progress through meiosis. Stem Cells. 2006 Aug;24(8):1931-

6.

70. Young JC, Dias VL, Loveland KL. Defining the window of germline genesis in vitro from murine

embryonic stem cells. Biol Reprod. 2010 Feb;82(2):390-401. doi: 10.1095/biolreprod.109.078493.

Epub 2009 Oct 21.

71. Clark AT, Bodnar MS, Fox M, Rodriquez RT, Abeyta MJ, Firpo MT, Pera RA. Spontaneous

differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro. Hum Mol Genet. 2004 Apr

1;13(7):727-39.

72. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.

2001 Apr;2(4):280-91. Review.

73. Easley CA 4th, Phillips BT, McGuire MM, Barringer JM, Valli H, Hermann BP, et al. Direct

differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2012 Sep

27;2(3):440-6.

74. Hajkova P, Erhardt S, Lane N, Haaf T, El-Maarri O, Reik W, Walter J, Surani MA. Epigenetic

reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 2002; 117: 15 23.

75. Wei W, Qing T, Ye X, Liu H, Zhang D, Yang W, Deng H. Primordial germ cell specification from

embryonic stem cells. PLoS One. 2008;3(12):e4013. doi: 10.1371/journal.pone.0004013. Epub 2008

Dec 24.

- 57 -

76. Kato Y, Kaneda M, Hata K, Kumaki K, Hisano M, et al. (2007) Role of the Dnmt3 family in de novo

methylation of imprinted and repetitive sequences during male germ cell development in the mouse.

Hum Mol Genet 16: 2272–2280

77. McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev. 2000; 21: 200–

214.

78. Lee MM1, Donahoe PK. Mullerian inhibiting substance: a gonadal hormone with multiple functions.

Endocr Rev. 1993 Apr;14(2):152-64.

79. Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.

Nature. 2007 Jul 19;448(7151):313-7.

80. Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. Generation of

pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 2008 Aug 1;321(5889):699-

702.

81. Imamura M, Aoi T, Tokumasu A, Mise N, Abe K, Yamanaka S, Noce T. Induction of primordial germ

cells from mouse induced pluripotent stem cells derived from adult hepatocytes. Mol Reprod Dev. 2010

Sep;77(9):802-11.

82. Li Y, Wang X, Feng X, Liao S, Zhang D, Cui X, Gao F, Han C. Generation of male germ cells from

mouse induced pluripotent stem cells in vitro. Stem Cell Res. 2014 Mar;12(2):517-30.

83. Li P, Hu H, Yang S, Tian R, Zhang Z, Zhang W, Ma M, Zhu Y, Guo X, Huang Y, He Z, Li Z.

Differentiation of induced pluripotent stem cells into male germ cells in vitro through embryoid body

formation and retinoic acid or testosterone induction. Biomed Res Int. 2013;2013:608728.

84. Yang S, Bo J, Hu H, Guo X, Tian R, Sun C, Zhu Y, Li P, Liu P, Zou S, Huang Y, Li Z. Derivation of

male germ cells from induced pluripotent stem cells in vitro and in reconstituted seminiferous tubules.

Cell Prolif. 2012 Apr;45(2):91-100.

85. Swanson W.J., Vacquier V.D. The rapid evolution of reproductive proteins. Nat. Rev., Genet.

2002;3:137–144.

86. Nichols J, Smith A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):487-92.

87. West FD, Roche-Rios MI, Abraham S, Rao RR, Natrajan MS, Bacanamwo M, Stice SL. KIT ligand and

bone morphogenetic protein signaling enhances human embryonic stem cell to germ-like cell

differentiation. Hum Reprod. 2010 Jan;25(1):168-78.

88. Medrano JV, Ramathal C, Nguyen HN, Simon C, Reijo Pera RA. Divergent RNA-binding proteins,

DAZL and VASA, induce meiotic progression in human germ cells derived in vitro. Stem Cells. 2012

Mar;30(3):441-51.

89. Aflatoonian B, Ruban L, Jones M, Aflatoonian R, Fazeli A, Moore HD. In vitro post-meiotic germ cell

development from human embryonic stem cells. Hum Reprod. 2009 Dec;24(12):3150-9.

90. Lim JJ, Shim MS, Lee JE, Lee DR. Three-step method for proliferation and differentiation of human

embryonic stem cell (hESC)-derived male germ cells. PLoS One. 2014 Apr 1;9(4):e90454.

91. Chen HF, Jan PS, Kuo HC, Wu FC, Lan CW, Huang MC, Chien CL, Ho HN. Granulosa cells and

retinoic acid co-treatment enrich potential germ cells from manually selected Oct4-EGFP expressing

human embryonic stem cells. Reprod Biomed Online. 2014 Sep;29(3):319-32.

92. Tilgner K, Atkinson SP, Golebiewska A, Stojkovic M, Lako M, Armstrong L. Isolation of primordial

germ cells from differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 2008 Dec;26(12):3075-85.

93. Xuemei L, Jing Y, Bei X, Juan H, Xinling R, Qun L, Guijin Z. Retinoic acid improve germ cell

differentiation from human embryonic stem cells. Iran J Reprod Med. 2013 Nov;11(11):905-12.

94. Panula S, Medrano JV, Kee K, Bergström R, Nguyen HN, Byers B, et al. Human germ cell

differentiation from fetal- and adult-derived induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 2011 Feb

15;20(4):752-62.

95. Alton M, Lau MP, Villemure M, Taketo T (2008) The behavior of the X- and Y-chromosomes in the

oocyte during meiotic prophase in the B6. Y(TIR)sexreversed mouse ovary. Reproduction 135: 241–

252.

96. Park TS, Galic Z, Conway AE, Lindgren A, van Handel BJ, Magnusson M, et al. Derivation of

primordial germ cells from human embryonic and induced pluripotent stem cells is significantly

improved by coculture with human fetal gonadal cells. Stem Cells. 2009 Apr;27(4):783-95.

97. Duggal G, Heindryckx B, Warrier S, Taelman J, Van der Jeught M, Deforce D, et al. Exogenous

supplementation of Activin A enhances germ cell differentiation of human embryonic stem cells. Mol

Hum Reprod. 2015 May;21(5):410-23.

98. Kee K, Angeles VT, Flores M, Nguyen HN, Reijo Pera RA. Human DAZL, DAZ and BOULE genes

modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation. Nature. 2009 Nov 12;462(7270):222-5.

99. Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell.

2014 Jun 5;157(6):1257-61.

- 58 -

100. Eguizabal C, Montserrat N, Vassena R, Barragan M, Garreta E, Garcia-Quevedo L, et al. Complete

meiosis from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2011 Aug;29(8):1186-95.

101. Song N, Liu J, An S, Nishino T, Hishikawa Y, Koji T (Aug 2011). "Immunohistochemical Analysis of

Histone H3 Modifications in Germ Cells during Mouse Spermatogenesis". Acta Histochemica et

Cytochemica 44 (4): 183–90.

102. Seki Y, Yamaji M, Yabuta Y et al. Cellular dynamics associated with the genome-wide epigenetic

reprogramming in migrating primordial germ cells in mice. Development 2007; 134: 2627–2638.

103. Griswold MD. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell and Developmental

Biology. 1998;9(4):411–416.

104. Sharpe RM. The regulation of spermatogenesis. In: Knobil E, Neil JD, editors. The Physiology of

Reproduction. 2nd edn. New York: Raven Press; 1993. p. 1363-1434.

105. Jarrow J, Zirkin B. The androgen microenvironment of the human testis and hormonal control of

spermatogenesis. Ann N Y Acad Sci 2005;1061:208-220.

106. Yamanaka S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.

2008;363:2079–2087.

107. Bilic J, Izpisua Belmonte JC. Concise review: Induced pluripotent stem cells versus embryonic stem

cells: close enough or yet too far apart? Stem Cells. 2012 Jan;30(1):33-41.

108. Mathews DJ, Donovan PJ, Harris J, Lovell-Badge R, Savulescu J, Faden R. Pluripotent stem cell-

derived gametes: truth and (potential) consequences. Cell Stem Cell. 2009 Jul 2;5(1):11-4.

109. Cutas D, Dondorp W, Swierstra T, Repping S, de Wert G. Artificial gametes: perspectives of

geneticists, ethicists and representatives of potential users. Med Health Care Philos. 2014

Aug;17(3):339-45.

110. Human Fertilisation and Embryology Authority, Ethics and Law Committee. (2006). In vitro derived

gametes. Report of the Meeting of 16th January 2006.

111. Testa G, Harris J. Ethics and synthetic gametes. Bioethics. 2005 Apr;19(2):146-66.

112. Hendriks S, Dondorp W, de Wert G, Hamer G, Repping S, Dancet EA. Potential consequences of

clinical application of artificial gametes: a systematic review of stakeholder views. Hum Reprod

Update. 2015 May-Jun;21(3):297-309.

113. Mertes H, Pennings G. Ethical aspects of the use of stem cell derived gametes for reproduction. Health

Care Anal. 2010 Sep;18(3):267-78.

114. Baetens P, Devroey P, Camus M, van Steirteghem AC, Ponjaert-Kristoffersen I. Counseling couples

and donors for oocyte donation: the decision to use either known or anonymous oocytes. Hum Reprod

2000;15:476–484.

115. Nuffield Council of Bioethics. Donor Conception: Ethical Aspects of Information Sharing. London:

Nuffield Council, 2013.

116. Pennings, G. (2000). Multiple pregnancies: A test case for the moral status of medically assisted

reproduction. Human Reproduction, 15, 2466–2469.

117. Pennings, G. (1999). Measuring the welfare of the child: In search of the appropriate evaluation

criterion. Human Reproduction, 14, 146–150.

118. Robertson, J. (1994). Children of choice. Princeton, New Jersey: Princeton University Press.

119. Palacios-González C, Harris J, Testa G. Multiplex parenting: IVG and the generations to come. J Med

Ethics. 2014 Nov;40(11):752-8.

120. Smajdor A, Cutas D. Artificial gametes and the ethics of unwitting parenthood. J Med Ethics. 2014

Nov;40(11):748-51.

121. ESHRE Task Force on Ethics and Law, Pennings G, de Wert G, Shenfield F, Cohen J, Tarlatzis B,

Devroey P. ESHRE Task Force on Ethics and Law 13: the welfare of the child in medically assisted

reproduction. Hum Reprod. 2007 Oct; 22(10):2585-8.

122. Golombok, S. 2005. Unusual families. Reproductive BioMedicine Online. 10(Supplemental 1):9-12.

123. Master, Z. 2006. Embryonic stem cell gametes: the new frontier in human reproduction. Human

Reproduction. 21(4):857-863.

124. Mertes H. Gamete derivation from stem cells: revisiting the concept of genetic parenthood. J Med

Ethics. 2014 Nov;40(11):744-7.

125. Kang L, Wang J, Zhang Y, Kou Z, Gao S. iPS cells can support full-term development of tetraploid

blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell. 2009 Aug 7;5(2):135-8.

126. Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T, Hao J, Guo CL, Ma QW, Wang L, Zeng F, Zhou Q. iPS

cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature. 2009 Sep 3;461(7260):86-90.

127. Devolder K. To be, or not to be? Are induced pluripotent stem cells potential babies, and does it matter?

EMBO Rep. 2009 Dec;10(12):1285-7. doi: 10.1038/embor.2009.244. Epub 2009 Nov 20.

128. Ishii T, Pera RA, Greely HT. Ethical and legal issues arising in research on inducing human germ cells

from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2013 Aug 1;13(2):145-8.

- 59 -

129. McLaren A. IVF: regulation or prohibition? Nature 1989;342:469-470.

130. Leese, H. J., & Whittall, H. (2001). Regulation of the transition from research to clinical practice in

human assisted conception. Human Fertility, 4, 172–176.

131. Smajdor A. Artificial gametes. Background paper. December 2015. Beschikbaar via:

http://nuffieldbioethics.org/wp-content/uploads/Background-paper-2016-Artificial-gametes.pdf.

Geraadpleegd maart 2015.

132. Hayden EC. Technology: The $1,000 genome. Nature. 2014 Mar 20;507(7492):294-5.

133. Boseley S. End of infertility within a decade, say doctors. Beschikbaar via:

http://www.theguardian.com/uk/2003/jul/25/science.research1. Geraadpleegd maart 2015.

134. Irie N, Weinberger L, Tang WW, Kobayashi T, Viukov S, Manor YS, et al. SOX17 is a critical

specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 2015;160:253–268.

135. Sugawa F, Arauzo-Bravo MJ, Yoon J, Kim KP, Aramaki S, Wu G, et al. Human primordial germ cell

commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. EMBO J. 2015;34:1009–

1024.

136. Moreno I, Míguez-Forjan JM, Simón C. Artificial gametes from stem cells. Clin Exp Reprod Med.

2015 Jun;42(2):33-44.

137. Dominguez AA, Chiang HR, Sukhwani M, Orwig KE, Reijo Pera RA. Human germ cell formation in

xenotransplants of induced pluripotent stem cells carrying X chromosome aneuploidies. Sci

Rep.2014;4:6432.

138. Tremellen K, Savulescu J. A discussion supporting presumed consent for posthumous sperm

procurement and conception. Reprod Biomed Online. 2015 Jan;30(1):6-13.

139. Ethics Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Posthumous collection and use

of reproductive tissue: a committee opinion. Fertil Steril. 2013 Jun;99(7):1842-5.

140. Newson AJ, Smajdor AC. Artificial gametes: new paths to parenthood? J Med Ethics. 2005

Mar;31(3):184-6.

141. Murphy TF. The meaning of synthetic gametes for gay and lesbian people and bioethics too. J Med

Ethics. 2014 Nov;40(11):762-5.

142. Golombok S, Blake L, Casey P, Roman G, Jadva V. Children born through reproductive donation: a

longitudinal study of psychological adjustment. J Child Psychol Psychiatry 2013;54:653–660.

143. Sparrow R. In vitro eugenics. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):725-31.

144. Douglas T. Stem cell-derived gametes, iterated in vitro reproduction, and genetic parenthood. J Med

Ethics. 2014 Nov;40(11):723-4.

145. Ishii T. Germ line genome editing in clinics: the approaches, objectives and global society. Brief Funct

Genomics. 2015 Nov 27.

146. Pennings G. New Belgian law on research on human embryos: trust in progress through medical

science. J Assist Reprod Genet. 2003 Aug;20(8):343-6.

147. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, Lv J, Xie X, Chen Y, Li Y, et al. CRISPR/Cas9-

mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015;6:363–372.

148. Colvin JS, Green RP, Schmahl J, Capel B, Ornitz DM. Male-to-female sex reversal in mice lacking

fibroblast growth factor 9. Cell. 2001 Mar 23;104(6):875-89

149. Zvetkova I, Apedaile A, Ramsahoye B, Mermoud JE, Crompton LA, et al. Global hypomethylation of

the genome in XX embryonic stem cells. Nat Genet. 2005;37: 1274–1279.

150. Kashir J, Jones C, Child T, Williams SA, Coward K. Viability assessment for artificial gametes: the

need for biomarkers of functional competency. Biol Reprod. 2012 Nov 8;87(5):114.

151. Daley GQ. Gametes from embryonic stem cells: a cup half empty or half full? Science 2007; 316:409

410.

152. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.

2001 Apr;2(4):280-91. Review.

153. Hunt PA, Hassold TJ. Sex matters in meiosis. Science. 2002 Jun 21;296(5576):2181-3. Review.

154. Osafune K, Caron L, Borowiak M, Martinez RJ, Fitz-Gerald CS, Sato Y, et al. Marked differences in

differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat Biotechnol 2008;26:313–315.

155. Bock C, Kiskinis E, Verstappen G, Gu H, Boulting G, Smith ZD, et al. Reference Maps of human ES

and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 2011 Feb

4;144(3):439-52.

156. Dokshin GA, Baltus AE, Eppig JJ, Page DC. Oocyte differentiation is genetically dissociable from

meiosis in mice. Nat Genet. 2013;45:877–883.

157. Morgan CT, Noble D, Kimble J. Mitosis-meiosis and sperm-oocyte fate decisions are separable

regulatory events. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:3411–3416.

158. Coan PM, Burton GJ, Ferguson-Smith AC. Imprinted genes in the placenta—A review. Placenta.

2005;26:S10–S20.

- 60 -

159. Morison IM, Ramsay JP, Spencer HG. A census of mammalian imprinting. Trends Genet. 2005

Aug;21(8):457-65.

160. Yinhua Yu, Fengji Xu, Hongqi Peng, Xianjun Fang, Shulei Zhao, Yang Li, et al. (1999) NOEY2

(ARHI), an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas. Proc Natl Acad

Sci U S A.; 96(1): 214–219.

161. Hiura H, Okae H, Miyauchi N, Sato F, Sato A, Van De Pette M, et al. Characterization of DNA

methylation errors in patients with imprinting disorders conceived by assisted reproduction

technologies.Hum Reprod. 2012;27:2541–2548.

162. Ben-David U, Benvenisty N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem

cells. Nat Rev Cancer. 2011;11:268–27.

163. Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem

cells. Nature.2011;474:212–215.

164. Esfandiari F1, Mashinchian O2, Ashtiani MK3, Ghanian MH3, Hayashi K4, Saei AA5, et al.

Possibilities in Germ Cell Research: An Engineering Insight. Trends Biotechnol. 2015 Dec;33(12):735-

46.

- 61 -

BIJLAGEN

- 62 -

BIJLAGE 1

Afkortingenlijst

Afkorting Verklaring

AMH anti-mullerian hormone (anti-mulleriaans hormoon) CM conditioned medium (geconditioneerd medium)

EpiLCs epiblast-like cells (epiblast-achtige cellen)

ES- embryonal stem cell- (embryonale stam-)

ESCs embryonal stem cells (embryonale stamcellen)

FAC factor cocktail: BMP4, RA, cytochroom P450, CYP26 inhibitor R115866, SDF1,

SCF, bFGF, n-acetyl-cysteïne en forskoline.

FISH fluorescence-in situ hybridization (fluorescentie-in-situhybridisatie)

FLSs follicle-like structures (follikel-achtige structuren)

FSH-R follicle stimulating hormone-receptor (follikel stimulerend hormoon-receptor)

GC germ cell (kiemcel)

GCLCs germ cell-like cells (kiemcel-achtige cellen)

GDNF glial-derived neurotrophic factor (gliale cel- gederiveerde neurotrofische factor)

GLCs gamete-like cells (gameet-achtige cellen)

hESCs human embryonal stem cells (humane embryonale stamcellen)

hFGS humane foetale gonadale stromale cellen

hiPSCs human induced pluripotent stem cells (humane geïnduceerde pluripotente stamcellen)

ICSI intracytoplasmic sperm-injection (intracytoplasmatische sperma-injectie)

Igfr2 insulin-like growth factor 2 receptor gene

iPS- induced pluripotent stem- (geïnduceerde pluripotente stam-)

iPSCs induced pluripotent stem cells (geïnduceerde pluripotente stamcellen)

LH-R luteinizing hormone-receptor (luteïniserend hormoon-receptor)

LIF leukemia inhibitory factor MEFs mouse embryonic fibroblasts

mESCs mouse embryonal stem cells (muis embryonale stamcellen)

miPSCs mouse induced pluripotent stem cells (muis geïnduceerde pluripotente stamcellen)

mSLCs mouse spermatogonial like cells (muis spermatozoön-achtige cellen)

OLCs oocyte-like cells (oöcyt-achtige cel)

PGCs primordial germ cells (primordiale kiemcellen)

PGCLCs primordial germ cell-like cell (primordiale kiemcel-achtige cel)

PSCDGs pluripotent stem cell-derived gametes (pluripotente stamcel-gederiveerde gameten

RA retinoic acid (retinoïnezuur)

RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction

SCP3 synaptonemal complex protein

SLCs spermatozoon-like cell (spermatozoïde-achtige cel)

Snrpn small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N

SSC spermatogonial stem cell (spermatogoniale stamcel)

- 63 -

BIJLAGE 2

Tabel 1: mESC-gederiveerde gameten. Overzicht van gebruikte methodes bij de derivatie van

PGCLCs, SLCs, OLCs of FLSs uit mESCs. Opmerking 1.: deze cellen werden enkel geëvalueerd o.b.v. merkers.

mESC-gederiveerde gameten

Referentie Bron van cellen (geslacht)

Derivatie van

Cultuur Methode

Hübner et al., 2003 mESCs (XY,XX) FLSs N/A N/A

Toyooka et al., 2003 mESCs (XY) SLCs BMP4, BMP8b Transplantatie van testes-aggregaten naar testes

Geijsen et al., 2004 mESCs (XY) SLCs RA N/A

Lacham-Kaplan et al., 2006

mESCs (XY) FLSs Testiculair celcultuur-CM

Nayernia et al., 2006

mESCs (XY) SLCs RA Transplantatie naar testes

Novak et al., 2006 mESCs (XY) FLSs BMP4 N/A

Qing et al., 2007 mESCs (XY) OLCs RA co-cultuur met ovariële granulosacellen

Wei et al., 2008 mESCs (N/A) PGCLCs1 BMP4, BMP8b, BMP2, Wnt3a, ActivineA

N/A

Nicholas et al., 2009 mESCs (XX) FLSs FAC Transplantatie van ovarium-aggregaten onder nierkapsel

Silva et al., 2009 mESCs (XY) SLCs1 RA, testoseron N/A

Young et al., 2010 mESCs (XY) PGCLCs1 BMP4, BMP8b, BMP2

N/A

Hayashi et al., 2011 mESCs (XY) miPSCs (XY)

SLCs *EpiLCs inductie:

Activine A, bFGF en

KSR

*PGCLC-inductie:

BMP4, BMP8b, LIF,

SCF, EGF, WNT3

Co-cultuur + transplantatie naar testes

Hayashi et al., 2012 mESCs (XX) miPSCs (XX)

FLSs N/A Co-cultuur + transplantatie van ovarium-aggregaten naar ovaria

Hu et al., 2012 mESCs (XY) OLCs1 RA Transplantatie van ovarium-aggregaten onder nierkapsel

Miryounesi et al., 2013

mESCs (N/A) SLCs1 RA co-cultuur met sertoli-cellen

Nitta et al., 2013 mESC (XX) FLSs BMP4 Transplantatie onder nierkapsel

Talaei-Khozani et al., 2014

mESC (N/A) PGCLCs1 BMP4 N/A

- 64 -

BIJLAGE 3

Tabel 2: Effecten van inducerende factoren bij mESC-gederiveerde gameten.

mESC- en miPSC- gederiveerde gameten

Inducerende factor Effect Referentie

BMP4 resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLC-

inductie

Toyooka et al., 2003

Wei et al., 2008

onduidelijk of een continue stimulatie met BMP4

noodzakelijk is


Wei et al., 2008

Young et al., 2010

Toyooka

de inductie is concentratie-afhankelijk: optimale

concentratie is 100ng/ml

Young et al., 2010

Wei et al., 2008

de inductie is tijdsafhankelijk Talaei-Khozani et al., 2014

geen stimulatie van de meiose Novak et al., 2006

stimulatie van folliculogenese Nitta et al., 2013

Combinatie van BMP4, LIF, SCF, BMP8b en

EGF is krachtiger

Hayashi et al., 2011

RA resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLC-

inductie

Silva et al., 2009

stimulatie van folliculogenese en spermatogenese Hu et al, 2012

Silva et al., 2009

stimulatie van de meiose Silva et al., 2009


de inductie is concentratie-afhankelijk: optimale

concentratie is 2 μM

Qing et al., 2007; Silva et

al., 2009

de inductie is tijdsafhankelijk Silva et al., 2009

BMP8b geen inducerend effect Young et al., 2010

Wei et al., 2008

BMP2 een even sterk inducerend effect als BMP4 Young et al., 2010

geen synergistisch effect bij combinatie met

BMP4

Young et al., 2010

Wnt3 onduidelijk effect Wei et al., 2008


Activine A geen inducerend effect Wei et al., 2008

Testosteron resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLC-

inductie

Silva et al., 2009

synergistisch effect bij combinatie met RA

de inductie is tijdsafhankelijk

FAC resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLC-

inductie en OLC-differentiatie

Nicholas et al., 2009

65

BIJLAGE 4

Tabel 3: mESC-gederiveerde gameten: RNA- en proteïne merkers. Opmerking: vetgedrukte termen zijn merkers die niet detecteerbaar waren. Merkers met

kleine letters zijn mRNA-merkers, deze met hoofdletters zijn proteïne-merkers.

Referentie RNA-merkers Proteïne merkers

PGC Meiose Oögenese Spermatogenese PGC Meiose Oögenese Spermatogenese

Hübner et al., 2003

c-Kit, Mvh

Gdf9, Fig-alfa,

StAR, P450

aromatase,

CYP17, Zp2, Zp3,

Zp1

SCP1, SCP3, COR1,

SYN1

GDF9, ZP2,

ZP3, ZP1


alkaline

phosphatase, c-

KIT, E-cadherin,

MVH OCT3-4,

SSEA1

GCNA1, SCP3

Geijsen et al., 2004

Dazl, Gcnf, Rnf17,

Tdrd1

acrosin, haprin, Piwil2,

Rnh2, Sry, Tex14

Lacham-Kaplan et al., 2006

C-KIT, MVH,

OCT3-4


Mvh, Fragilis, Oct4,

stella, Rnf17

Sycp3 acrosin, Prm1, Tp2 DAZL, RBMY,

STRA8

HSP-90alfa, PIWIL2

Novak et al., 2006

Sycp3

Sycp1,

Sycp2, Stag3,

Rec8, Smc1

Qing et al., 2007 c-Kit, Fragilis, Mvh,

Oct4, Stella

Figa, Gdf-9, Zp1,

Zp2, Zp3, Nobox acrosin, haprin, Rfp,

Sry

MVH , OCT3-4

Wei et al., 2008 Blimp1, Fgf8, Oct4,

Sox2, Stella, T

C-KIT, MVH,

OCT3-4, SSEA1

66

Vervolg tabel 3

Referentie RNA-merkers Proteïne merkers

PGC Meiose Oögenese Spermatogenese PGC Meiose Oögenese Spermatogenese

Nicholas et al., 2009

Mvh, Nanos,

Oct4, Stella, Stra8

Gdf9

Silva et al., 2009 Akap3, Dazl, Odf2,

Stella, Stra8

Sycp1,

Sycp3,

Msy2

Piwil2, Prm1, Tex14,

Prm2, Act

DAZL MSY2, SCP1, SCP3 PRM1, ACT

Young et al., 2010

Acvr1, Blimp1, Dazl,

Fragilis, Mvh, Nanog,

Oct4, Smad1, Smad5,

Stella

NANOG,

OCT4,

STELLA

Hayashi et al.¸ 2011

Blimp1, Prdm14,

Tcfap2c, Nanos3, stella,

Tdrd5, Dnd1, Mvh

(Ddx4) and Dazl


Pou5f1, Sox2, Nanog,

Prdm1, Prdm14,

Tcfap2c, Dppa3,

Nanos3, Uhrf1, Dnmt3a,

Dnmt3b, Ddx4, Dazl

Stra8,

Smc1b

DDX4 SCP3

Nitta et al., 2013 Stella, Fragilis, Dazl,

Oct4, ERas, c-Kit,

Boule, Dmc1, Foxo3a

Sycp3 Zp1, Zp3, Gdf9,

Figlα, Fgf8,

Nobox, BMP15,

Fshr, Lhcgr,

StAR, Cyp11a1,

Cyp19a1, Ptgs2

Amh GDF9,

ZP3

67

BIJLAGE 5

Tabel 4 Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde oöcyten: meiose, hormonen, epigenetica en fertilisatie.

mESC-gederiveerde OLCs

Referentie Meiose Hormonen Epigenetica Fertilisatie

Abnormaal Normaal Abnormaal Normaal Abnormaal

Hübner et

al., 2003

*expressie meiose-merkers

SCP3, SCP1

*vorming van poollichaampjes-

achtige cellen

*oestradiol detectie

*stijging mRNA

steroidogenese-enzymen

(StAR, P450 aromatase,

CYP17)

*reactie bij toevoegen van

gonadotrofines

*blastocyst-achtige

structuren, vermoedelijk door

parthenogenetische activatie

Novak et

al., 2006

*geen expressie van meiose-

merkers SCP1, SCP2,

STAG3, REC8 en SMC1

*SCP3 niet chromosomaal

gelokaliseerd

*geen synaps-vorming

*expressie meiose-merker SCP3

*oestradiol detectie

Qing et al.,

2007

*cytoplasmatische lokalisatie

van SCP3

*expressie meiose-merker SCP3

Nicholas et

al., 2009

*abnormale chromosomale

alignatie van SCP3

(gedeeltelijk) en SCP1

*onvolledige synaps-vorming

* expressie meiose-merkers

SCP3, SCP1 en γ-H2AX

*nucleaire lokalisatie van SCP3,

γ-H2AX en SCP1

68

Vervolg tabel 4

mESC-gederiveerde oöcyten

Referentie Meiose Epigenetica Hormonen Fertilisatie

Abnormaal Normaal Abnormaal Normaal

Hu et al.,

2012

* expressie meiose-merker

SCP3

Hayashi et

al., 2012

*nucleair gelokaliseerd SCP3

*geëlongeerd SCP3-patroon

*normale inprenting-

verwijdering van H19,

Igf2r, Kcnq1ot1

*initiatie X-inactivatie bij EpiLCs

*reactivatie X-

chromosoom bij PGCLCs:

2 actieve X-chromosomen

*Na IVM en IVF: 2-

cellige embryo’s

*40% ontwikkeling tot

blastocyst

*Na transfer: 5

nakomelingen geboren

*Normale inprenting

*ontwikkeling tot

volwassen, vruchtbare

muizen

*efficiëntie was laag,

mogelijks door

triploïdie (3 pronuclei)

Nitta et

al., 2013

*abnormale paternale

inprenting van Snrpn

en H19

*geen expressie van

steroidogenese-

geassocieerde

genen

*geen expressie van

FSH-R en LH-R

*abnormale

expressie van AMH

69

BIJLAGE 6

Tabel 5: Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde spermatozoa: meiose, hormonen, epigenetica en fertilisatie.

mESC-gederiveerde spermatozoa

Referentie Meiose Hormonen Epigenetica Fertilisatie

Abnormaal Normaal Normaal Abnormaal Normaal

Geijsen et al., 2004

*lage

efficiëntie

*klein aantal haploïde

cellen (nadeel flow

cytometrie)

*expressie van LH-R

en AMH

*50% onderging 1 celdeling

tot het 2-cellig stadium (n-125)

*20% ontwikkelde zich tot

blastocyst-achtige structuren

*geen transfer naar uterus

Nayernia et al., 2006 (SSC7)

*haploïde cellen

(nadeel flow

cytometrie)

*synaps-vorming

*expressie meiose-

merkers SCP3 en

acrosin

*geen inprenting-verwijdering

Snrpn

* onvolledig instellen paternaal

inprenting-patroon H19 en Igf2r

*initiatie inprenting-

verwijdering H19 en Igf2r

*gedeeltelijk correct instellen

paternaal inprenting-patroon

Snrpn

*vorming poollichaampjes en

pronucleaire formatie

*ontwikkeling zygotes tot pre-

implantatie embryo’s met

normale kenmerken

*65 embryo’s transfer naar

uterus

*12 nakomelingen geboren:

abnormaal gestalte en

premature mortaliteit

Nayernia et al., 2006 (SSC12)


Snrpn

*onvolledig instellen paternaal

inprenting-patroon H19

*verwijdering inprenting H19

en Igf2r

*gedeeltelijk correct instellen

paternaal inprenting-patroon

Igf2r en Snrpn

Wei et al., 2006 *initiatie inprenting-

verwijdering Peg3 en Igf2r

Silva et al., 2009

*expressie meiose-

merker SCP3

Young et al., 2010


H19

70


*geen inprenting-verwijdering Igf2r en Snrpn

*initiatie inprenting-

verwijdering Kcnq1ot1 en H19

*globale hypomethylatie

*normale placenta’s en

inprenting patronen

*detectie van transgenen (BV

en SC) bij de nakomelingen

*gezonde en vruchtbare

mannelijke en vrouwelijke

muizen

71

BIJLAGE 7

Tabel 6: Overzicht miPSC-gederiveerde GLCs.

miPSC-gederiveerde GLCs

Referentie Bron (geslacht;

bron iPSCs)

Derivatie

van

Inductie-

factoren Methode

Meiose Epigenetica

Abnormaal Normaal

Imamura

et al., 2010

miPSCs (XY,

hepatocyten)

OLCs BMP4, GDNF,

EGF

N/A *geen detectie van late

meiose merkers (Miwi,

Crem, Tp1, Tp2,

Prm1)

*expressie meiose-

merkers Sycp1, Sycp3,

Hox4A, Haprin

*slechts gedeeltelijke

demethylatie van Mvh

*demethylatie van Nanog

Hayashi et

al., 2011

miPSCs

(XY,MEFs) en

mESCs (XY)

SLCs BMP4, BMP8b,

LIF, SCF, EGF,

WNT3

transplantatie

rechtstreeks in

tubuli seminiferi

testes

Yang et

al., 2012

miPSCs (XY,

neurale

progenitorcellen)

mannelijke

kiemcellen

RA injectie samen met

testiculaire cellen in

de dorsale huid van

muizen

*geen detectie van late

meiose merkers (Tp1,

Prm1)

*expressie meiose-

merkers Sycp3, Haprin

Zhu et al.,

2012

miPSCs (XY,

neurale

progenitorcellen)

SLCs RA transplantatie

rechtstreeks in

tubuli seminiferi

testes

*expressie van meiose-

merker sycp3

Hayashi et

al., 2012

miPSCs (XX,

MEFs) en

mESCs (XX)

FLSs BMP4, BMP8b,

LIF, SCF, EGF,

WNT3

Transplantatie van

ovarium-aggregaten

naar ovarium

Li et al.,

2013

miPSCs (MEFs) mannelijke

kiemcellen

RA en testosteron N/A * detectie van meiose-

merkers (sycp1, sycp3) en

late meiose-merkers

(Msy2, Akap3)

*2-8% haploïde cellen

Li et al.,

2014

miPSCs (MEFs

en TTFs)

SLCs BMP4, BMP8b,

SCF

Transplantatie

rechtstreeks in

tubuli seminiferi

testes

72

BIJLAGE 8

Tabel 7: Merkers van hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. Een overzicht van verscheidene mRNA- en proteïne-merkers tijdens GLC-

derivatie. Vetgedrukte termen zijn merkers die niet detecteerbaar waren in de cultuur.

hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten

Referentie mRNA-merkers Proteïne merkers

PGC / pre-meiose Meiose Oögenese Spermatogenese PGC Meiose Oögenese Spermatogenese

Clark et al., 2004 Nanos1, Dazl, Vasa Scp1 Gdf9 Tekt1 DAZL, VASA SCP3, MLH1

Kee et al., 2006 Vasa Scp3

Tilgner et al.¸2008 Vasa, Stella, Oct4 Scp1, Scp3 c-KIT, SSEA4, VASA SCP3

Bucay et al., 2009 Prdm1, Stella, Dazl, c-kit, Vasa Zp1, Zp2, Zp3 Acrosin, Mis, Fshr,

Sox-9

FSHR, HS14

Park et al., 2009 Vasa, Prdm1, Stella, Dazl VASA, SSEA1, c-KIT,

PLAP

Aflatoonian et al.,

2009

Oct4, Vasa, Dazl Scp3 Gdf9, ZP1 Prm1, Prm2, Tnp1,

Tnp2, H1t

C-KIT, DAZL, VASA,

SSEA1 ZP PRM1, 1.97

West et al., 2010 Oct4, Vasa, Dazl, Fragilis, Stella,

c-kit, Nanog, Cxcr4, Nanos1

Mlh1, Scp1, Scp3 Pum2, Piwil2

Panula et al., 2011 Vasa, Ifitm1, Pelota, Prdm1a,

Stellar, Gcnf

Dmc1 VASA, DAZL ACROSIN

Eguizabal et al.,

2011

Scp3, γH2ax Zp1, Zp3, FIG1α CD9, CD49f, CD90,

SSEA

Easley et al.¸ 2012 Vasa, Dazl Plzf, Cxcr4, Acrosin,

Piwil1, Utf1, Cdh1,

Ret, Gfr α1

HILI SCP3 PIWIL1, ACROSIN,

PROTAMINE 1,

TRANSITION

PROTEIN 1

Medrano et al.,

2012

Vasa, Dazl, Ifitm1, Prdm1a, Gcnf,

Gdf3, cKit, Pelota

Scp3, Mlh1,

Dmc1

Gdf9, Zp4 SCP3, CENPA ACROSIN

Xuemei et al., 2013 Vasa Scp3 Gdf9 Tekt1

Lim et al., 20141 c-Kit Tp-1, Iap, integrine

α6, Th2b

VASA, GFR-α1

Chen et al., 2014 Vasa, c-Kit Scp3 Gdf9, Zp3 SSEA1, OCT4, VASA

Duggal et al., 2015 c-Kit, Vasa, Dazl, Stella, Oct4 Scp3 VASA, OCT4 SCP3

73

BIJLAGE 9

Tabel 8: Overzicht hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. Een samenvatting van verscheidene studies die humane GLCs genereerden. De

functionele parameters van de GLCs, meiose en epigenetica, worden ingedeeld in ‘onvolledig’ en ‘volledig’.

hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten

Referentie Bron (geslacht;

bron iPSCs)

Derivatie

van Methode

Meiose Epigenetica

Onvolledig ‘Volledig’ Onvolledig ‘Volledig’

Clark et al.,

2004

hESCs (XX en

XY)

mannelijke en

vrouwelijke

gonocyt-

achtige cellen

spontaan *expressie meiose-

merker SCP3

*geen expressie meiose-

merker MLH1

*vooral

cytoplasmatische

lokalisatie van SCP3

*subgroep nucleaire

lokalisatie SCP3:

punctiforme SCP3

kleuring

*geen haploïde cellen

Kee et al.¸

2006

hESCs (XX) PGCLCs BMP4, BMP7,

BMP8b

*expressie meiose-

merker SCP3

Tilgner et

al., 2008

hESCs (XX) PGCLCs spontaan, (BMP4)1

*expressie meiose-

merkers SCP1 en SCP3

*cytoplasmatische

lokalisatie van SCP3

*geen synaps-vorming

*vermoedelijk klein aantal

haploïde cellen (nadeel: flow

cytometrie)

*initiatie

inprenting-

verwijdering H19

en Igf2r

*histon modificatie

PGCLCs equivalent

aan PGCs

Bucay et

al.¸ 2009

hESCs PGCLCs cultuur hESCs: kleine

clusters en minder

‘feeding cycles’

N/A

74

Park et al.,

2009

hESCs (XX, XY),

hiPSCs (XY,

dermale

fibroblasten)

PGCLCs 3 methodes:

-co-cultuur met

hFGS2

-CM hFGS

-monolayer zonder

hFGS

*geen expressie meiose-

merkers

* initiatie

inprenting-

verwijdering H19

en Igf2r

*geen inprenting-

verwijdering Peg1

Aflatoonian

et al.¸ 2009

hESCs (XX, XY) FLSs, SLCs RA *expressie meiose-

merker SCP3 *vermoedelijk ∼0.5%

haploïde cellen (nadeel: flow

cytometrie)

West et al.,

2010

hESCs (XY) PGCLCs BMP4 *expressie van meiose

merkers SCP1, SCP3,

MLH1

* geen inprenting-

verwijdering H19,

Igf2, Snrpn,

Snurf

*geen globale

demethylatie

Panula et

al., 2011

hESCs (XY, XX),

hiPSCs (XY,

adulte fibroblasten;

XX, foetale

fibroblasten)

SLCs BMP4, BMP7,

BMP8b

+ overexpressie van

DAZL, BOULE en

DAZ

*meerderheid geen SCP3

kleuring

*subgroep met ‘slechts’

initiatie meiose

(punctiforme SCP3

kleuring)

*max ~0.4% haploïde cellen

(FISH)

* klein aantal cellen met

geëlongeerd SCP3 patroon

*co-lokalisatie van SCP3

met chromosomen

Eguizabal

et al., 2011

hESCs (XX, XY),

hiPSCs (XX, XY;

keratinocyten en

navelstrengbloed)

SLCs 3 stappen:

1. monolayer

2. +RA

3. +LIF, bFGF,

FRSK, CYP26

inhibitor

* tussen de 0.4% en 2.3%

haploïde cellen (FISH)

*expressie van meiose

merkers (mRNA): Scp3,

γH2ax

*fout instellen

paternaal

inprenting-

patroon H19 bij 2

hiPS-cellijnen

*correct instellen

paternaal inprenting-

patroon H19 bij 4

van de 6 cellijnen

*expressie

gelijkaardig aan

spermatozoa van

paternaal (Phlda en

Cdkn1c) en

maternaal (Mest,

Igf2, Nnat, Snrpn)

inprenting-genen

75

Easley et

al., 2012

hESCs (XX3, XY)

en hiPSCs (XY;

fibroblasten)

SLCs muis-SSC cultuur

(GDNF+)4

*~4% haploïde cellen

(FISH) die acrosine-

expressie vertonen

*expressie meiose-merker

SCP3

*correct instellen

paternaal inprenting-

patroon H19 en Igf2r

Medrano et

al., 2012

hESCs (XX, XY),

hiPSCs (XX)

SLCs *spontane

differentiatie

*overexpressie van

Vasa

*meerderheid geen SCP3

kleuring

*subgroep met ‘slechts’

initiatie meiose

(punctiforme SCP3

kleuring)

*max ~0.7% haploïde cellen

(FISH) die acrosine-

expressie vertonen

*klein aantal cellen met

geëlongeerd SCP3 patroon

*expressie meiose-merkers

Scp3, Mlh1, Dmc1, Cenpa

* geen inprenting-

verwijdering H19

(zonder

overexpressie of

met DAZL

overexpressie)

*initiatie

inprenting

verwijdering H19

bij VASA-

overexpressie

Xuemei et

al., 2013

hESCs (XX, XY) FLSs, SLCs RA *enkel detectie Scp3-

mRNA

Lim et al.,

2014

hESCs (XY) SLCs 3 stappen:

1. BMP4 + RA

2. GC-proliferatie

medium met EGF,

bFGF, GDNF en LIF

3. 3D-co-cultuur

o.b.v. alginaat met

testiculaire cellen

*~3% haploïde cellen

(FISH)

Chen et

al.¸2014

hESCs (XX) OLCs *RA

* SCF, BMP4,

BMP7, BMP8b

*co-cultuur met

granulosacellen

*CM o.b.v.

granulosacellen

*enkel detectie Scp3-

mRNA

Duggal et

al., 2015

hESCs (XX, XY) PGCLCs *BMP4 + ActivineA

*IVM

*enkel detectie Scp3-mRNA,

niet van het proteïne SCP3

Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis...

Documents

Transcript of Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis...