Optimalisatie van gepegyleerde kationische …...Zij katalyseren chemische reacties (enzymen),...

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie

Academiejaar 2008-2009

OPTIMALISATIE VAN GEPEGYLEERDE

KATIONISCHE LIPOSOMEN ALS

FARMACEUTISCHE DRAGER VOOR

INTRAVENEUZE TOEDIENING VAN siRNA

Experimenteel Onderzoek

Saskia ROBBRECHT

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. dr. apr. S. De Smedt

Begeleider

Apr. K. Buyens

Commissarissen

Prof. dr. K. Braeckmans

Dr. apr. C. Stove

Auteursrecht

‘De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopieren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder

de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.’

2 juni 2009

Promotor

Prof. dr. apr. S. De Smedt

Auteur

Saskia Robbrecht

Dankwoord

Hierbij wens ik mijn promotor, Prof. dr. apr. S. De Smedt, te bedanken voor de algemene

inleiding van de masterproef en voor de kans die ik gekregen heb om van dichtbij kennis te

maken met het wetenschappelijk onderzoek.

In het bijzonder wil ik Apr. K. Buyens bedanken voor zijn toegewijde en correcte

begeleiding. Ik wil hem speciaal bedanken voor het geduld en begrip dat hij de eerste weken

wist op te brengen en de gedrevenheid waarmee hij trachtte elk probleem dat zich voordeed

tot een goed einde te brengen. Verder wens ik hem nog heel veel succes met het behalen van

zijn doctoraat.

Het overige personeel van het laboratorium dank ik voor hun vriendelijkheid, bereidheid

om me waar mogelijk te helpen, de gezellige momenten tussendoor en de aangename werksfeer

die ik steeds weer ervaren mocht.

Mijn ouders wil ik bedanken voor de kans die ze me gegeven hebben om verder te

studeren en hun onvoorwaardelijke steun dag in, dag uit.

Tot slot wil ik mijn vrienden en de mensen van de scouts bedanken voor de ontspannende

momenten tijdens deze drukke periode. In het bijzonder wil ik Raf bedanken voor alle begrip,

steun en liefde die ik gekregen heb, vooral tijdens de iets moeilijkere momenten.

Saskia Robbrecht

2 juni 2009

Inhoudsopgave

Lijst met gebruikte afkortingen ix

1 Inleiding 1

1.1 GENEXPRESSIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Algemeen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.2 Nucleınezuren als therapeutica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 RNA INTERFERENCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.1 Werkingsmechanisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.2 Endogene short RNAs: miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.3 Onderdrukking van de genexpressie op lange termijn: shRNA . . . . . . 6

1.2.4 SiRNA: design en chemische modificaties . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.2.5 Toepassingen van RNAi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.5.1 Functioneel genoomonderzoek . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.5.2 Therapeutische applicaties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3 SiRNA FORMULATIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3.1 Barrieres bij therapeutische toepassingen van siRNA . . . . . . . . . . . 8

1.3.1.1 De bloedbaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3.1.2 Extravasatie doorheen de bloedvatwand en de extracellulaire

matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3.1.3 Opname in de doelwitcel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.3.1.4 Endosomale escape . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.3.2 Toxiciteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3.2.1 Off-target effecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3.2.2 Immuunrespons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3.3 Vectorsystemen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3.3.1 Virale vector versus niet-virale vector . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3.3.2 Niet-virale vectoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3.4 Kationische liposomen als vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2 Objectieven 19

vi

Inhoudsopgave

3 Materiaal en Methoden 20

3.1 SiRNA DUPLEXEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.2 BEREIDEN VAN LIPOPLEXEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.2.1 Materiaal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.2.2 Aanmaak van hydra-lipoplexen (hLPX) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.2.3 Aanmaak van lipoplexen via ethanoldilutiemethode (eLPX) . . . . . . . 24

3.3 BEPALING VAN DE DEELTJESGROOTTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.3.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.3.2 Praktische uitvoering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.4 CELEXPERIMENTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.4.1 Celkweek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.4.2 Aanmaak platen voor transfectie en cytotoxiciteitstesten . . . . . . . . . 26

3.4.3 Bepaling van transfectie-efficientie: flow cytometrie . . . . . . . . . . . . 27

3.4.3.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.4.3.2 Praktische uitvoering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.4.4 Cytotoxiciteitstesten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.4.4.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.4.4.2 Praktische uitvoering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4 Resultaten en Discussie 29

4.1 OPTIMALISATIE EXPERIMENTELE SETTING . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.1.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.1.2 Praktische aspecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.1.3 Resultaten en interpretatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.2 HYDRATATIE VERSUS ETHANOLDILUTIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4.2.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32



4.3 INVLOED VAN DE N/P RATIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.3.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34



4.4 VERGELIJKING VAN ZES VERSCHILLENDE KATIONISCHE LIPIDEN . . 36

4.4.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36



4.5 VERGELIJKING DOTAP-DOSPA-LIPID 2-IVF . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.5.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40


vii

Inhoudsopgave


4.6 VERKLEINEN VAN DE siPLEXEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.6.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45



4.6.3.1 Dotap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.6.3.2 Dospa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.6.3.3 Lipid 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5 Besluit 51

Literatuurlijst 53

viii

Lijst met gebruikte afkortingen

Ago2 Argonaute 2

AMP adenosinemonofosfaat

AS-ON antisense oligo(deoxy)nucleotide

ATP adenosinetrifosfaat

bp basenparen

BSA Bovine Serum Albumin

dH hydrodynamische diameter

DisRNA Dicer substraat siRNA

DLS Dynamic Light Scattering

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMMAn dimethylmaleınezuur-anhydride

DMMAn-Mel dimethylmaleınezuur-anhydride-mellitine

DNA deoxyribonucleic acid

DOPE dioleoylfosfatidylethanolamine

DOSPA 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)-ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium

DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan

DSPE-Hz-PEG distearoylfosfatidylethanolamine-hydrazone-polyethyleenglycol

DSPE-PEG distearoylfosfatidylethanolamine-polyethyleenglycol

dsRNA dubbelstrengig RNA

EDTA ethyleen diamine tetra-acetaat

ix


eGFP enhanced Green Fluorescence Protein

eLPX lipoplexen via ethanoldilutie

FBS Fetal Bovine Serum

HB Hepes Buffer

Hepes 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur

hLPX hydra-lipoplexen

Huh-7-eGFP humane hepatomacellen die het eGFP-gen tot expressie brengen

Hz hydrazonebinding

IVF Invivofectamine

kDa kilo Dalton

L2000 Lipofectamine2000

LAF Laminar Air Flow

LPX lipoplexen

miRISC micro RNA Induced Silencing Complex

miRNA micro RNA

mRNA messenger RNA

Mw moleculair gewicht

nm nanometer

NNP nucleınezuur nanopartikel

nt nucleotide

OptiMEM Optimized-Minimal Essential Medium

PBS Phosphate Buffered Saline

pdI polydispersiteitsindex

PEG polyethyleenglycol

PEI polyethyleenimine

x


pmol picomol

PPi pyrofosfaat

pre-miRNA precursor micro RNA

pre-mRNA precursor messenger RNA

P/S penicilline en streptomycine

RISC RNA Induced Silencing Complex

RNA ribonucleic acid

RNAi RNA interference

Rnase ribonuclease

rpm rotaties per minuut

shRNA short hairpin RNA

siPLexen siRNA-PEGylated Liposome complexen

siRNA short interfering RNA

SNALP Stabilized Nucleic Acid-Lipid Particle

SPT Single Particle Tracking

UTR untranslated region

xi

1Inleiding

1.1 GENEXPRESSIE

1.1.1 Algemeen

Eiwitten of proteınen zijn een klasse macromoleculen welke een diversiteit aan functies uit-

oefenen in het menselijk lichaam. Zij katalyseren chemische reacties (enzymen), houden de

celstructuur in stand (structurele eiwitten), zorgen voor het transport van stoffen in en uit

de cel (transporteiwitten) en doorheen de bloedbaan (serumproteınen), verzorgen de com-

municatie tussen cellen (hormonen, signaaleiwitten) en zijn betrokken in de regulatie van

cellulaire processen (regulatie-eiwitten). Het genomisch DNA, aanwezig in de nucleus van

elke lichaamscel, bezit de informatie voor de aanmaak van deze eiwitten onder de vorm van

genen. Hierbij codeert elk gen voor een specifiek proteıne. Tijdens de transcriptie wordt het

gen overgeschreven naar precursor messenger RNA (pre-mRNA), welke vervolgens wordt om-

gezet tot functioneel mRNA (splicing). Het mRNA verlaat de kern en wordt in het cytoplasma

vertaald tot een proteıne met behulp van ribosomen (translatie) (Figuur 1.1).

1.1.2 Nucleınezuren als therapeutica

Een defect gen heeft tot gevolg dat de productie van het overeenkomstige proteıne verstoord

wordt of dat het proteıne zelfs volledig ontbreekt. Dit komt vaak voor bij erfelijke aandoe-

ningen. Gentherapie heeft als doel genetisch materiaal in menselijke doelwitcellen te brengen

1

1 Inleiding

Figuur 1.1: AANMAAK VAN PROTEINEN. DNA wordt in de celkern overgeschrevennaar messenger RNA (mRNA). Het mRNA wordt getransporteerd naar hetcytoplasma waar het wordt omgezet in een functioneel proteıne (translatie)(www.vcbio.science.ru.nl).

in de hoop dat hierbij het niet of onvoldoende functionerende gen vervangen wordt door een

intact therapeutisch gen (Opalinska & Gewirtz , 2002).

Het verkeerd of in te hoge mate tot expressie komen van een proteıne kan eveneens

pathologische gevolgen hebben. Zo zou de overproductie van bepaalde eiwitten een rol spe-

len in de pathogenese van tumoren (Pai et al., 2006). Het doelgericht onderdrukken van

het expressiepatroon van het pathologische gen is hierbij het aangrijpingspunt. Daar waar

conventionele farmaca vaak aangrijpen op het proteıneniveau, doen nucleınezuren dit reeds

tijdens het proces van de genexpressie.

Drie types van antisense moleculen, welke aangrijpen op het niveau van het mRNA

en zo translatie verhinderen, kunnen onderscheiden worden (Kurreck , 2002). Antisense-

oligonucleotiden (AS-ONs) zijn korte enkelstrengige (gemodificeerde) DNA moleculen, meestal

bestaande uit 15-20 nucleotiden. Zij hybridiseren op een sequentie-specifieke manier met het

complementaire mRNA via Watson-Crick basenparing. De DNA-RNA heteroduplex induceert

de activiteit van het RNase H endonuclease waarbij het target mRNA wordt afgebroken, ter-

wijl het AS-ON ongemoeid blijft (Wu et al., 2004). Anderzijds kunnen AS-ONs de translatie

verhinderen door sterische hinder bij het samenkomen van de twee ribosomale subeenheden

2

1 Inleiding

en de mRNA streng of tijdens de translocatie van het ribosoom (Kurreck , 2002).

Ribozymen zijn ribonucleınezuur (RNA) moleculen welke een katalytische activiteit be-

zitten. Zij zorgen voor hydrolyse van specifieke fosfodiesterbindingen tussen opeenvolgende

nucleotiden in het target mRNA na basenparing hiermee (James & Gibson, 1998). Recent

is een nieuw en meer efficient mechanisme ontdekt voor knockdown van de proteınesynthese,

namelijk RNA interference (RNAi) (Fire et al., 1998).

1.2 RNA INTERFERENCE

1.2.1 Werkingsmechanisme

Fire en Mello ontdekten in 1998 dat dubbelstrengig RNA (dsRNA) in staat is de expressie van

het homologe gen te onderdrukken in de nematode Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998).

Drie jaar later werd RNA interference (RNAi) aangetoond in zoogdiercellen door Tuschl en

collega’s (Elbashir et al., 2001). Zij leverden tevens baanbrekend werk door het gebruik van

chemisch gesynthetiseerde short interfering RNAs (siRNAs) voor de onderdrukking van de

genexpressie.

In een eerste stap klieft het endoribonuclease Dicer lang dsRNA in korte siRNAs. SiRNA

staat voor small of short interfering RNA en bestaat uit twee strengen van elk 21 nucleotiden

lang. Negentien nucleotiden van elke streng vormen samen een helix met 2 nucleotiden (nt)

overhang aan elk van de 3'uiteinden zoals weergegeven in Figuur 1.2. SiRNAs kunnen ook

synthetisch aangemaakt worden en rechtstreeks in de cel gebracht worden.

Figuur 1.2: STRUCTUUR VAN siRNA (21-mer siRNA duplex met 2 nt overhang aan de3'uiteinden van elke streng) (Kurreck , 2009).

SiRNAs worden in het cytoplasma geıncorporeerd in een proteınecomplex, genaamd

RNA induced silencing complex (RISC). Deze bezit het endonuclease Argonaute 2 (Ago2)

(Tolia & Joshua-Tor , 2007), een multifunctioneel proteıne dat vooreerst zorgt voor het ont-

winden van de RNA duplex waarna de sense of passenger streng wordt gekliefd. Zo blijft enkel

de antisense of guide streng weerhouden en wordt het geactiveerde RISC (RISC*) bekomen.

3

1 Inleiding

RISC* gebruikt de antisense streng om te binden op de complementaire sequentie van het

target mRNA. Na hybridisatie wordt het mRNA gekliefd (slicing) door het Ago2 op de plaats

recht tegenover de fosfaatbinding tussen basen 10 en 11 vanaf het 5'uiteinde van de antisense

streng (Liu et al., 2004). Door deze klieving kunnen intracellulaire exonucleasen aanvallen ter

hoogte van de uiteinden waar geen bescherming meer geboden wordt door een 5'cap structuur

(gemethyleerd G-nucleotide) of een polyA staart. Een geactiveerd RISC complex is in staat

verschillende mRNA transcripten te splitsen. Deze katalytische werking maakt dat RNAi een

efficient mechanisme is om knockdown van een bepaald proteıne te bekomen (Haley & Zamore,

2004) (Figuur 1.3).

Figuur 1.3: RNAi PATHWAY GEMEDIEERD DOOR siRNAs. Transfectie van een doelwit-cel met siRNA leidt tot sequentie-specifieke onderdrukking van de genexpressieop het post-transcriptioneel niveau (Raemdonck et al., 2008).

1.2.2 Endogene short RNAs: miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van kleine RNA moleculen die ook kunnen zorgen voor

posttranscriptionele onderdrukking van de genexpressie. De miRNA pathway staat weerge-

geven in Figuur 1.4. De eerste stap in de productie van miRNAs vindt plaats in de celkern.

Lange primaire transcripten worden overgeschreven door RNA polymerase II waarna ze ver-

werkt worden door het enzym Drosha tot hairpins met een (vaak) imperfecte complementa-

4

1 Inleiding

riteit, genaamd precursor miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA wordt via de transportmolecule

Exportine-5 naar het cytoplasma gebracht waar het een substraat is voor Dicer. Uiteindelijk

wordt zo het mature ∼22 nt miRNA duplex bekomen welke op zijn beurt interageert met RISC

(Kim, 2005). Slechts een van beide strengen wordt weerhouden in het proteınecomplex via de-

welke het complementaire target mRNA wordt herkend. Binding vindt plaats ter hoogte van

de 3'-untranslated region (3'-UTR) van het mRNA, vaak met onvolledige basenparing, doch

perfecte basenparing is vereist in de seed region (posities 2-8 van het miRNA). De binding

van het geactiveerde miRISC* complex resulteert in de onderdrukking van de translatie.

Figuur 1.4: ENDOGENE miRNA PATHWAY. Lange primaire transcripten worden in dekern overgeschreven en verwerkt tot pre-miRNA, dat wordt getransporteerd naarhet cytoplasma. Na verwerking door Dicer tot mature ∼22 nt miRNA duplexen,reageren deze met RISC. Het geactiveerde miRISC* complex interageert methet target mRNA waardoor de translatie sterisch wordt verhinderd (Raemdoncket al., 2008).

5

1 Inleiding

1.2.3 Onderdrukking van de genexpressie op lange termijn: shRNA

21-mer siRNAs kunnen naast chemische synthese en introductie in de doelwitcel ook intracellu-

lair gevormd worden. Dit door gebruik te maken van short hairpin RNA (shRNA) precursoren

welke worden overgeschreven in de celkern na introductie van expressiecassettes met behulp

van plasmiden of virale vectoren (Brummelkamp et al., 2002) . ShRNAs zijn structureel en

functioneel gelinkt aan pre-miRNAs. Net zoals bij de miRNA pathway is Exportine-5 verant-

woordelijk voor het transport naar het cytoplasma waar Dicer deze shRNAs klieft tot actieve

21-mer siRNAs welke deelnemen aan de RNAi pathway (Yi et al., 2003).

SiRNAs hebben een genonderdrukkend effect dat slechts transient is ten gevolge van in-

tracellulaire degradatie en verdunning door celdeling, dit laatste echter is vooral geldig tijdens

in vitro experimenten en niet bij primaire cellen in vivo. Integratie van de expressiecassette,

welke codeert voor het shRNA, in het genoom van de doelwitcel leidt tot een blijvende pro-

ductie van shRNA, met een langdurige onderdrukking van de genexpressie tot gevolg. Deze

integratie kan bekomen worden met behulp van lentivirale vectoren.

1.2.4 SiRNA: design en chemische modificaties

Om tot een succesvolle toepassing van RNAi te komen, zijn een aantal factoren van belang.

Vooreerst is er het siRNA zelf. Afhankelijk van de relatieve thermodynamische stabiliteit van

de twee uiteinden van het siRNA, wordt een van beide strengen preferentieel geıncorporeerd in

het RISC (Schwartz et al., 2003). Als de streng met de juiste complementariteit ten opzichte

van het target mRNA weerhouden wordt, is hybridisatie mogelijk. Daarnaast is er ook het

target mRNA zelf. De bereikbaarheid van de bindingssite voor het siRNA bepaalt mede hoe

sterk de onderdrukking van de genexpressie is (Shao et al., 2007). Daarbij is het 3'uiteinde

van het mRNA van belang aangezien de interactie plaats vindt beginnende in de seed region

van het siRNA (Westerhout & Berkhout , 2007).

Conventionele siRNAs bestaan uit een 19 basenparen (bp) duplex met 2 nucleotiden (nt)

overhang aan het 3'uiteinde van beide strengen. Dit stemt overeen met de afbraakproducten

van Dicer na degradatie van lang dsRNA. Onderzoek heeft echter aangetoond dat siRNAs

met langere sequenties (25/27-mers) tevens succesvol toegepast kunnen worden (Kim et al.,

2005). Reden hiervoor is dat langere siRNAs herkend kunnen worden door Dicer en in het

cytoplasma alsnog worden omgezet tot 21-mers, vandaar de benaming Dicer substraat siRNAs

of DisRNAs. Daar Dicer een rol zou spelen tijdens de eerste stappen van RISC assemblage,

houdt deze tussenstap in dat de siRNAs efficienter in RISC geıncorporeerd zouden worden

(Lee et al., 2004). Dit heeft tot gevolg dat lagere concentraties gebruikt kunnen worden.

Tot slot kan het siRNA ook chemisch gemodificeerd worden. Het inbouwen van che-

misch gemodificeerde nucleotiden verhoogt de weerstand tegen nuclease-gemedieerde degra-

6

1 Inleiding

datie. Daarnaast worden chemische modificaties ook aangewend om off-target effecten (Snove

& Rossi , 2006) en immuunrespons tegen te gaan (Marques & Williams, 2005).

1.2.5 Toepassingen van RNAi

1.2.5.1 Functioneel genoomonderzoek

Een belangrijke ontwikkeling in de wetenschap was de opheldering van de nucleotidensequentie

van het menselijke genoom. Nochtans is een van de belangrijkste doelstellingen van functioneel

genoomonderzoek, het achterhalen van de biologische functie van de genen in het genoom. Met

de ontdekking van RNAi en het feit dat in theorie elk gen als doelwit voor RNAi beschouwd

kan worden, is een heel nieuwe wereld opengegaan. Door in het organisme een welbepaald gen

te onderdrukken, wordt een zogenaamd ’knock out model’ gecreeerd waarbij de functie van

dat gen nagegaan kan worden. Dit is tot op heden de meest gebruikte toepassing van RNAi.

De studie van kankergeassocieerde genen levert informatie over eiwitten die betrokken

zijn in pathways die leiden tot ongecontroleerde proliferatie en celdeling, angiogenese in tu-

moren, metastase, resistentie tegen chemotherapeutica, enz. Genen die coderen voor deze

eiwitten zijn dan ook een mogelijk doelwit voor de therapeutische applicatie van RNAi (Kitt-

ler & Buchholz , 2003).

1.2.5.2 Therapeutische applicaties

Wanneer een ziekte veroorzaakt wordt door de overexpressie van een gen, kan RNAi aange-

wend worden voor knockdown van dat specifieke gen. Zo kan RNAi aangewend worden in de

behandeling van virale infecties, kanker en genetische ziekten.

Virale infecties vormen een toenemend probleem in de medische wereld aangezien het

aantal chronische infecties geassocieerd met HIV-1, hepatitis B en hepatitis C virus steeds

toeneemt. Voorts ontstaan ook nieuwe varianten van virussen, zoals het influenza virus H5N1,

of nieuwe virussen, zoals het SARS coronavirus. Ondanks de nood aan antivirale middelen,

is het huidig aanbod beperkt. RNAi zou hier verandering in kunnen brengen. Hierbij is

de keuze van het target RNA belangrijk, teneinde virale escape door mutatie te voorkomen.

Combinatietherapie van siRNAs tegen verschillende targets gericht of siRNA gecombineerd

met conventionele antivirale farmaca kan hier ook toe bijdragen. Tot slot kan ook gekozen

worden voor siRNAs gericht tegen cellulaire factoren dewelke het virus nodig heeft om de

gastheercel binnen te dringen en zich te vermenigvuldigen, maar die niet essentieel zijn voor

het overleven van de cel (Kurreck , 2009).

De eerste klinische studies lieten niet lang op zich wachten. Lokale toediening door

intravitreale injectie van siRNA gericht tegen de endotheliale groeifactor VEGF of zijn receptor

7

1 Inleiding

zou neovascularisatie tegengaan bij patienten met maculadegeneratie. Systemische toediening

is doorgaans een stuk moeilijker door de talrijke barrieres welke in vivo overwonnen moeten

worden.

1.3 SiRNA FORMULATIE

SiRNA kan pas werkzaam zijn wanneer het de RNAi machinerie, welke in het cytoplasma

van de cel gelokaliseerd is, bereikt. Naakte siRNA moleculen zullen de cellen niet spontaan

binnendringen, daar ze sterk negatief geladen macromoleculen zijn. De doorbraak van siRNA

als therapeuticum is sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van vectorsystemen die intact

siRNA in het cytoplasma van de doelwitcel afleveren, na toediening aan de patient. De

toedieningsweg is afhankelijk van de lokalisatie van het doelwitorgaan. Vaak zal intraveneuze

injectie nodig zijn teneinde het doelwit te kunnen bereiken. Dit brengt een aantal extra

barrieres met zich mee die overwonnen dienen te worden om tot een farmaceutische formulatie

te komen welke een geschikte aflevering van het siRNA garandeert. Deze barrieres bevinden

zich zowel op het intracellulaire als het extracellulaire niveau en worden samengevat in Figuur

1.5.

1.3.1 Barrieres bij therapeutische toepassingen van siRNA

1.3.1.1 De bloedbaan

Na intraveneuze toediening dient het siRNA intact het cytoplasma van de doelwitcellen te

bereiken. Vrij siRNA heeft een korte in vivo halfwaardetijd omwille van zijn gevoeligheid voor

serumnucleasen en zijn snelle renale klaring. Slechts enkele minuten zijn nodig om het grootste

gedeelte van het siRNA af te breken, voornamelijk ter hoogte van de 3'overhangs (Haupenthal

et al., 2006). Een mogelijkheid om de stabiliteit van het siRNA te verhogen, is chemische

modificatie. Mogelijke modificaties zijn ‘backbone’modificaties zoals fosforothioaatbinding

(PS RNA) en boranofosfaatbinding (BO RNA). Voorts kan de 2'-OH vervangen worden door

2'-O-metyl, 2'-F of 2'-H. Een methyleenbrug kan aangebracht worden tussen 2'-O en 4'-C

van de ribosering om deze rigider te maken (Locked nucleic acid of LNA) of een S-atoom op

plaats 4 in de ribosering (4'-thio RNA) (Figuur 1.6) (Corey , 2007). De efficientie van het door

modificatie bekomen siRNA is afhankelijk van het aantal gemodificeerde basen en hun positie

in de duplex. Het contact met de nucleasen kan ook fysisch verhinderd worden door gebruik

van een drager (zie sectie 1.3.3).

Voorts is de halfwaardetijd ook afhankelijk van de renale klaring daar siRNAs sterk

hydrofiel zijn en een moleculair gewicht bezitten (∼14 kDa) dat ver onder de grens voor

glomulaire filtratie ligt. Mogelijke oplossingen zijn chemische modificaties (PS RNA of 4'-thio

RNA) welke de interactie met serumproteınen bevorderen (Corey , 2007), vorming van siRNA

8

1 Inleiding

Figuur 1.5: IN VIVO BARRIERES VOOR siRNA EN NUCLEINEZUUR NANOPARTI-KELS (NNP’S). Barrieres die achtereenvolgens overwonnen dienen te wordenzijn: klontervorming, enzymatische afbraak en klaring door macrofagen in debloedbaan, klaring door Kupffercellen in de lever, extravasatie doorheen debloedvatwand, migratie doorheen de extracellulaire matrix, opname in de celvia endocytose, endosomale escape en vrijstelling van het siRNA in het cyto-plasma (Raemdonck et al., 2008).

conjugaten of incorporatie in nanopartikels. Conjugatie van siRNA kan met moleculen zoals

cholesterol, galzuren en lange keten vetzuren. Deze lipofiele siRNAs worden geıncorporeerd

in lipoproteınepartikels (High Density Lipoprotein of HDL, Low Density Lipoprotein of LDL)

waardoor renale klaring vermeden wordt en cellulaire opname verbeterd door interactie met

de HDL en LDL lipoproteınereceptoren, die zich vooral ter hoogte van de lever en het jejenum

bevinden (Wolfrum et al., 2007).

1.3.1.2 Extravasatie doorheen de bloedvatwand en de extracellulaire matrix

De nucleınezuur nanopartikels (NNPs) moeten ter hoogte van het doelwitorgaan vanuit de

bloedbaan naar de extracellulaire matrix die de weefselcellen omgeeft, geraken. De mogelijk-

heid om uit de bloedbaan te treden is afhankelijk van de grootte van de NNPs en de permea-

9

1 Inleiding

Figuur 1.6: RNA EN ANALOGEN BEKOMEN DOOR CHEMISCHE MODIFICATIE (Co-rey , 2007).

biliteit van de capillaire wand (Takakura et al., 1998). Transport doorheen de endotheellaag

vindt plaats door diffusie en osmose. Er zijn verschillende soorten bloedcapillairen:

• Continue capillairen bezitten een dicht opeengepakte endotheellaag die enkel permeabel

is voor moleculen kleiner dan 2 nm. Deze bevinden zich ter hoogte van de spieren, de

longen, de huid, het hart en het subcutaan weefsel. De bloedhersenbarriere is enkel

permeabel voor zeer kleine hydrofobe moleculen.

• Er zijn ook capillairen met fenestrae, dit zijn openingen tussen de endotheelcellen welke

diffusie van grotere partikels toelaten. Deze bevinden zich ter hoogte van de lever, de

milt en het beenmerg. Bij tumoren kan de grootte sterk verschillen afhankelijk van

de soort tumor (100 - 400 nm) (Braet & Wisse, 2002). Recent werd aangetoond dat de

10

1 Inleiding

grootte van de fenestrae in de lever tevens species afhankelijk is. Zo zijn de fenestrae bij

de mens en het konijn gemiddeld 100 nm, bij de muis 140 nm en bij de rat 160 nm groot

(Wisse et al., 2008). Het is belangrijk hiermee rekening te houden daar het onderzoek

waar deze masterproef in kadert, de lever als doelorgaan voor ogen heeft.

Eens de bloedvatwand gepasseerd, volgt diffusie doorheen de extracellulaire matrix. Dit is een

dens netwerk van polysacchariden en fibreuze eiwitten welke het transport van macromoleculen

en nanopartikels kan vertragen (Zamecnık et al., 2004). Om deze twee genoemde barrieres

met succes te overwinnen, dienen de NNPs voldoende klein te zijn. Er wordt gestreefd naar

partikels die niet groter zijn dan 100 nm.

1.3.1.3 Opname in de doelwitcel

SiRNA is een sterk negatief geladen hydrofiele macromolecule (∼40 negatieve ladingen per mo-

lecule). Spontane diffusie doorheen het plasmamembraan van de doelwitcel is niet mogelijk.

Enerzijds is er de elektrostatische repulsie tussen het negatief geladen siRNA en het negatief

geladen membraanoppervlak. Anderzijds is er de moeilijke passage van een hydrofiele molecule

doorheen het lipofiele milieu van de fosfolipiden dubbellaag welke de cel omgeeft. Een moge-

lijke oplossing is het verpakken van siRNA in kationische NNPs. Deze NNPs worden in de cel

opgenomen via endocytose. Dit proces bestaat uit de invaginatie van het plasmamembraan

met vorming van een vesikel welke het NNP insluit, zijnde een endosoom. De kationische NNPs

interageren op een elektrostatische manier met het negatief geladen membraanoppervlak. Dit

is niet receptor gemedieerde endocytose.

Deze stelling gaat echter niet op wanneer de NNPs eerst in contact komen met serum

(zoals het geval is na intraveneuze injectie). Zo toonden Buyens et al. (2008) aan dat de

interactie van kationische NNPs met negatief geladen serumproteınen aanleiding geeft tot

neutralisatie en zelfs reversie van de oppervlaktelading van de NNPs.

Door incorporatie van specifieke liganden kan receptor gemedieerde endocytose bekomen

worden, daar deze liganden kunnen interageren met hun specifieke receptor aanwezig in de

celmembraan van de doelwitcel (Hongjiang et al., 2004). Conjugatie van het siRNA met

lipofiele moleculen kan tevens de opname verbeteren door een toename van de passieve diffusie

over de plasmamembraan (Lorenz et al., 2004).

1.3.1.4 Endosomale escape

De NNPs bevinden zich na endocytose in endosomen. Initieel is de pH neutraal, maar door

de aanwezigheid van een H+/Cl− synporter worden protonen naar binnen gepompt waardoor

de pH daalt tot ∼5.5. Deze endosomen versmelten met lysosomen. Lysosomen zijn rijk aan

enzymen welke actief zijn bij deze lagere pH en zo de inhoud van de endosomen gaan afbreken

11

1 Inleiding

zoals samengevat door Remaut et al. (2007). De siRNA moleculen moeten dus tijdig vrijkomen

uit de endosomen, zoniet worden ze afgebroken.

1.3.2 Toxiciteit

Niet alleen de effectiviteit, maar ook de veiligheid waarmee een siRNA formulatie in vivo

toegepast kan worden, speelt een belangrijke rol gedurende zijn ontwikkeling. Neveneffecten

kunnen veroorzaakt worden door het siRNA zelf, maar ook door zijn farmaceutische drager.

1.3.2.1 Off-target effecten

Het is belangrijk dat enkel het beoogde mRNA wordt afgebroken, zonder dat de expressie van

andere proteınen op een of andere manier beınvloed wordt. Ondanks de verwachte selectiviteit

van siRNAs, is gebleken dat er soms ook andere genen dan het beoogde gen onderdrukt of

juist gestimuleerd worden, de zogenaamde off-target effecten of niet-specifieke effecten. Up- of

downregulatie van ongerelateerde genen resulteert soms, maar niet altijd, in een biologisch sig-

nificant neveneffect zoals toxiciteit (Fedorov et al., 2006). Het bestaan van off-target effecten

dient gezocht te worden in de overlap tussen de RNAi pathway en de miRNA pathway. Som-

mige siRNAs kunnen functioneren als miRNA, daar de miRNA pathway geen perfecte comple-

mentariteit vereist met het mRNA voor de knockdown van een proteıne (Doench et al., 2003).

Een doordachte keuze van de siRNA sequentie is dan ook aangeraden. Off-target effecten

kunnen verder gereduceerd worden door chemische modificatie. Een 2'-O-methyl substitutie

in het tweede nucleotide van de antisense streng reduceert off-target effecten met behoud van

de genonderdrukkende activiteit (Jackson et al., 2006).

1.3.2.2 Immuunrespons

Het ontstaan van een immunologische respons tegen het vreemd siRNA en/of zijn drager

zijn een tweede categorie van ongewenste effecten. Het werkingsmechanisme staat uitgebreid

beschreven in de review van Marques & Williams (2005). Deze respons is vergelijkbaar met

deze tegen RNA virussen, wat ook zijn reden van bestaan verklaart. Een familie van Toll-like

receptoren zijn betrokken bij de herkenning van siRNAs op een sequentiespecifieke manier.

Deze bevinden zich in de wand van de endosomen of in het cytosol. Stimulatie van deze

receptoren geeft aanleiding tot de productie van interferon en pro-inflammatoire cytokines.

Tevens kan de stimulatie van bepaalde andere receptoren leiden tot een synthese-inhibitie van

alle proteınen in die cel, met celdood tot gevolg.

Het is dus van groot belang dat men tijdens de ontwikkeling van geschikte siRNAs niet

alleen kijkt naar de expressie van het target proteıne, maar naar het volledige expressiepatroon

van de cel. Ongewenste effecten kunnen niet op voorhand voorspeld worden en moeten dus

bepaald worden bij elk specifiek siRNA.

12

1 Inleiding

1.3.3 Vectorsystemen

De adequate aflevering van siRNA in de doelcellen is een van de grootste uitdagingen in de

ontwikkeling van RNAi voor therapeutische applicatie. Het ontbreken van een gepaste for-

mulatie die in staat is het siRNA af te leveren aan het cytosol na intraveneuze toediening,

is het grote probleem. Verschillende mogelijkheden teneinde dit probleem op te lossen, wor-

den onderzocht. De ideale vector dient aan een aantal voorwaarden te voldoen. Het systeem

moet voldoende effectief zijn met een hoge transfectie-efficientie, bij RNAi is dit de mate

waarin de genexpressie van het doelproteıne onderdrukt wordt. Een andere vereiste is dat

deze onderdrukking enkel gebeurt ter hoogte van de doelcellen. De vector mag niet toxisch

of immunogeen zijn. Dit betekent dat hij na verloop van tijd afgebroken moet worden in het

lichaam, met vorming van niet-toxische metabolieten. Er moet een voldoende hoge draagca-

paciteit voor het siRNA aanwezig zijn. Hij moet voldoende stabiel zijn voor tijdelijke opslag,

op grote schaal geproduceerd kunnen worden en dit liefst aan een beperkte kostprijs.

1.3.3.1 Virale vector versus niet-virale vector

Zoals eerder aangegeven (sectie 1.2.3) vereist het therapeutisch gebruik van shRNA de in-

troductie van expressiecassettes in de doelcellen. Hiervoor worden vaak virale vectoren ge-

bruikt, daar zij een hogere transfectie-efficientie bezitten. De meest gebruikte virussen zijn

lentivirussen, adenovirussen en adeno-geassocieerde virussen (AAV). Lentivirale vectoren ge-

ven aanleiding tot een stabiele expressie van het shRNA daar het DNA dat ervoor codeert,

geıntegreerd wordt in het genoom van de gastheercel (Kurreck , 2009). Adenovirale en AAV

afgeleide vectoren daarentegen zorgen voor een transiente expressie door het vormen van een

episoom.

Ondanks de hogere transfectie-efficientie, gaat de voorkeur vaak uit naar niet-virale vec-

toren daar deze doorgaans een stuk veiliger zijn. Zij bezitten een lagere immunogeniciteit en

geven minder aanleiding tot oncogeniciteit. Bovendien kunnen er chemische wijzigingen in

aangebracht worden, zijn ze goedkoper in aanmaak en kunnen ze gemakkelijker aan kwali-

teitscontroles onderworpen worden (Kostarelos & Miller , 2005).

1.3.3.2 Niet-virale vectoren

Polyplexen zijn NNPs opgebouwd uit een kationisch polymeer die via elektrostatische inter-

acties het negatief geladen nucleınezuur binden. Een van de meest onderzochte polymeren is

polyethyleenimine (PEI). De belangrijkste reden hiervoor is de efficiente intracellulaire afle-

vering van het siRNA via het ‘proton-spons’effect. Hierbij zijn protoneerbare aminogroepen

verantwoordelijk voor het bufferend effect waardoor de endosomale pH neutraal blijft. Dit

resulteert in een voortdurende captatie van protonen en een accumulatie van Cl− ionen met

13

1 Inleiding

een stijging van de osmotische druk tot gevolg. Door de stijgende druk kan een tijdelijke rup-

tuur ontstaan in het endosoom waarbij een deel van de inhoud vrijgesteld kan worden (Boussif

et al., 1995).

Lipoplexen daarentegen maken gebruik van een kationisch lipide om een complex te

vormen met het nucleınezuur. Het probleem echter hierbij is de stabiliteit bij hun gebruik in

vivo daar het siRNA niet afgeschermd wordt van zijn omgeving. Het gebruik van liposomen

of stabilized nucleic acid-lipid particles (SNALPs) waarbij het siRNA geencapsuleerd wordt,

is daardoor meer aangeraden (zie sectie 1.3.4).

Voorts worden in de literatuur vaak manieren beschreven die ervoor zouden moeten

zorgen dat het siRNA aan een specifiek celtype afgeleverd wordt, de zogenaamde actieve

targeting. Zo is er de conjugatie van het nucleınezuur met een Fab fragment welk een specifiek

antigen herkent op het oppervlak van de doelcel. Hierbij is het Fab fragment gekoppeld aan

het positief geladen protamine dat op zijn beurt via elektrostatische interacties het siRNA

bindt (Song et al., 2005). Tevens is er ook de mogelijkheid voorgaand besproken NNPs te

coaten met celspecifieke liganden. Nu kan deze actieve targeting in vraag gesteld worden.

Het is niet omdat een Fab fragment of celspecifiek ligand aanwezig is, dat het conjugaat of

NNP plots aangezogen zal worden naar het doelweefsel. Het is eerder door de verpakking

van siRNA in NNPs, dat een zekere mate van selectiviteit bekomen wordt daar de partikels

enkel uit de bloedbaan kunnen treden op plaatsen waar de fenestrae groot genoeg zijn. Dit in

tegenstelling tot conjugaten die een heel stuk kleiner zijn en daardoor meer weefsels kunnen

bereiken. Actieve targeting moet dus eerder gezien worden als een mogelijkheid tot verbeterde

opname, eens het conjugaat of NNP ter plaatse is, door interactie met de geschikte receptoren.

1.3.4 Kationische liposomen als vector

Deze masterproef is gericht op het verdere onderzoek naar de optimale samenstelling van ka-

tionische liposomen als drager voor siRNA. Hierbij is de uiteindelijke doelstelling de in vivo

toepassing van deze liposomen waarbij de lever het doelwitorgaan is. Aan een aantal te-

genstrijdige voorwaarden moet voldaan zijn opdat deze kationische liposomen in aanmerking

zouden komen als vectorsysteem. De partikels moeten enerzijds het siRNA beschermen en

voldoende stabiel zijn in de bloedbaan en bij tijdelijke opslag. Tevens moet opname door

weefsels welke niet het doelwit zijn, vermeden worden. Anderzijds moeten ze even snel weer

kunnen destabiliseren eens opgenomen in de doelcellen opdat het siRNA het cytosol zou be-

reiken. Om deze voorwaarden allemaal in een partikel te kunnen verenigen, zijn verschillende

componenten nodig. Een aantal formulatieparameters mogen daarbij niet uit het oog verloren

worden zoals welke componenten aangewend worden, hun onderlinge verhouding en de la-

dingsratio (N/P of +/- ratio). Deze laatste wordt bekomen door het aantal positieve ladingen

op de kationische lipiden te delen door het aantal negatieve ladingen op de siRNA moleculen

14

1 Inleiding

(waarbij 1 siRNA molecule 40 negatief geladen fosfaatgroepen bezit).

Liposomen zijn sferische vesikels bestaande uit een dubbellaag van (fosfo)lipiden. Hier-

bij zijn de hydrofiele gedeelten naar de interne waterige fase en de buitenzijde gericht terwijl

de hydrofobe koolwaterstofketens naar elkaar toe zijn gericht. Figuur 1.7 toont de klassieke

voorstelling van een liposoom. De bolletjes zijn de hydrofiele regio’s, de staartjes de hydro-

fobe. Liposomen kunnen ook bestaan uit meerdere dubbellagen rond elkaar gerangschikt, de

zogenaamde multilamellaire liposomen.

(A) (B)

Figuur 1.7: 3D VOORSTELLING VAN (A) EEN UNILAMELLAIR EN (B) EEN MULTI-LAMELLAIR LIPOSOOM (Remaut et al., 2007); www.encapsula.com.

Een eerste component is het kationisch lipide. Deze is verantwoordelijk voor de elek-

trostatische interactie met het negatief geladen siRNA. Een belangrijk aspect is de manier

waarop de siRNA-liposoom complexen aangemaakt worden. Zo toonden Buyens et al. (2009)

eerder al aan dat het klassiek mengen van siRNA met reeds gevormde, gepegyleerde katio-

nische liposomen resulteert in het verlies van quasi al het siRNA bij contact met serum. De

reden hiervoor is als volgt: de incorporatie van een PEG-lipide (zie ook verder) stabiliseert

de unilamellaire structuur van de liposomen. Op deze manier wordt de vorming van multila-

mellaire structuren waartussen het siRNA gepakt en beschermd zit, voorkomen. Aangezien

het siRNA niet in staat is binnen te dringen in de gevormde liposomen, zit het gebonden op

het liposoomoppervlak (Figuur 1.8). Daar elektrostatische interacties de drijvende kracht zijn

voor de binding van het siRNA, zal het siRNA gebonden aan de buitenzijde van de liposomen

in serum vrijgesteld worden door competitie met negatief geladen serumcomponenten zoals

albumine. SiRNA dat is losgekomen van de liposomen kan dan verder afgebroken worden door

serumnucleasen.

Het is dus van belang encapsulatie van het siRNA binnenin de gepegyleerde liposomen te

15

1 Inleiding

Figuur 1.8: AANMAAK VAN siRNA-LIPOSOOM COMPLEXEN VOLGENS HET KLAS-SIEKE PROTOCOL (BOVEN) EN HET HYDRA PROTOCOL (ONDER). Hetklassieke protocol: een siRNA-oplossing wordt gemengd met reeds gevormde, ge-pegyleerde kationische liposomen. Het HYDRA protocol: directe hydratatie vande lipidenfilm met een geconcentreerde siRNA-oplossing.

bekomen voor de optimale bescherming ervan. Een alternatieve methode waarbij een lipiden-

film gerehydrateerd wordt met een geconcentreerde siRNA-oplossing (directe HYDRAtatie)

geeft het siRNA de kans in contact te komen met al de positieve ladingen, dus ook deze die

aan de binnenzijde van het liposoom komen te zitten, daar de liposomen nog niet gevormd

zijn (Figuur 1.8). Er wordt verondersteld dat op deze manier 50% van het siRNA gebonden

kan worden aan de binnenwand van de liposomen en 50% aan de buitenkant. Daartoe moet

aan een aantal voorwaarden voldaan zijn:

• alle kationische ladingen zijn homogeen verdeeld over de lipidenfilm

• alle kationische ladingen zijn bereikbaar voor het siRNA

• de lipide dubbellagen sluiten zich op een willekeurige manier tot liposomen

• er worden geen multilamellaire structuren gevormd

Theoretisch gezien is de maximale encapsulatie-efficientie dus gelijk aan 50%. Het aantal

methoden welke een efficiente encapsulatie van het siRNA binnenin liposomen (die een grote

hoeveelheid PEG-lipide bezitten) toelaat, is beperkt. Naast deze HYDRA methode zijn er nog

de zogenaamde stabilized nucleic acid-lipid particles of SNALPs welke later aan bod zullen

komen in het kader van deze masterproef.

Een tweede component is het helperlipide. De twee meest voorkomende helperlipiden

zijn het neutrale dioleoylfosfatidylethanolamine (DOPE) en cholesterol. DOPE bezit een

16

1 Inleiding

eerder conische structuur door zijn smalle kopgroep en licht uiteenwijkende hydrofobe staarten.

DOPE zou de endosomale escape bevorderen, het precieze werkingsmechanisme is echter nog

niet gekend. Cholesterol zorgt voor een betere stabiliteit van de liposomen in biologische

vloeistoffen en zou vorming van kleinere liposomen toelaten daar zij de ruimte tussen de

hydrofobe staarten kan opvullen.

Een derde component is het polyethyleenglycol(PEG)-lipide. Dit lipide heeft verschil-

lende functies. Albumine, een sterk negatief geladen serumproteıne, kan interageren met de

positief geladen partikels en veroorzaakt zo neutralisatie of reversie van de oppervlaktela-

ding. Door neutralisatie van de nanopartikels verlaagt de elektrostatische repulsie waardoor

ze dichter tot elkaar kunnen naderen. Wanneer de partikels voldoende tot elkaar naderen,

kunnen Van der Waalse aantrekkingskrachten zorgen voor aggregaatvorming (Verbaan et al.,

2003). Dit is nadelig daar deze aggregaten capillairen kunnen verstoppen met een verstoorde

doorbloeding van het bijhorende orgaan tot gevolg. Anderzijds kunnen de partikels geklaard

worden door de macrofagen van het reticulo-endotheliaal systeem, gemedieerd door opsonisa-

tie en activatie van het complement. Voorgaande problemen kunnen voorkomen worden met

behulp van PEG-polymeren welke het oppervlak van de partikels afschermen. De incorporatie

van een PEG-lipide stabiliseert tevens de vorming van unilamellaire liposomen zoals reeds

vroeger aangehaald werd.

Figuur 1.9: ZIJDELINGSE DOORSNEDE VAN DE BLOEDVATWAND VAN EEN SI-NUSOIDE IN DE LEVER. Partikels treden uit de bloedbaan ter hoogte vande fenestrae van het endotheel en komen zo in de ruimte van Disse. Hierbijdienen eerst de Kupffercellen gepasseerd te worden vooraleer de hepatocytenbereikt kunnen worden (www.mdconsult.com).

17

1 Inleiding

De belangrijkste reden waarom de deeltjes voldoende klein moeten zijn, ligt in de pas-

sieve targeting. Als de nanopartikels kleiner dan 100 nm zijn, kunnen deze passeren doorheen

de fenestrae van het endotheel (extravasatie) ter hoogte van de lever, het doelorgaan in dit

onderzoek. Ze komen hierbij terecht in de ruimte van Disse en moeten eerst de Kupffercel-

len passeren vooraleer ze de hepatocyten kunnen bereiken zoals weergegeven in Figuur 1.9.

Pegylatie speelt ook hier een belangrijke rol in de bescherming tegen de klaring door de Kupf-

fercellen (Kostarelos & Miller , 2005).

De aanwezigheid van de PEG-ketens heeft ook zijn nadelen. Zo is er een verminderde

cellulaire opname van de partikels. Tevens wordt de endosomale escape verhinderd daar PEG-

ketens het nauwe contact tussen de lipiden van de gepegyleerde lipoplexen en de endosomale

membraan voorkomen (Shi et al., 2002). Om dit probleem te voorkomen, kan gebruik gemaakt

worden van ingenieuze PEG-lipiden zoals PEG-ceramides (welke uit het liposoom kunnen

diffunderen na verloop van tijd) (Hu et al., 2001) of zuurgevoelige PEG- lipiden (welke de

PEG-ketens verliezen na daling van de pH in het endosoom) (Sawant et al., 2006).

Tot slot kunnen ook specifieke liganden geıncorporeerd worden teneinde de opname in de

doelcellen te bevorderen en de opname door andere weefsels te verminderen. In dit onderzoek

wordt tevens ook gebruik gemaakt van een lipide gekoppeld aan een endosomolytisch peptide

welke de vrijstelling van de partikels uit de endosomen verder bevordert.

18

2Objectieven

Deze masterproef kadert binnen de zoektocht naar een geschikte farmaceutische formulatie

voor de aflevering van siRNA aan menselijke cellen na intraveneuze injectie bij de in vivo

toepassing ervan. Er wordt gezocht naar de optimale samenstelling van kationische liposomen

als drager voor het nucleınezuur. De hoofddoelstelling van dit onderzoek is dan ook het

vergelijken van zes verschillende kationische lipiden op het vlak van transfectie-efficientie en

toxiciteit.

Vooraleer deze vergelijking uitgevoerd kan worden, dient de experimentele proefopzet

geoptimaliseerd te worden. Zo zal onderzocht worden welk commercieel beschikbaar transfec-

tiereagens dienst kan doen als referentie en op welke manier de aanwezigheid van de lipoplexen

in de bloedbaan nagebootst kan worden.

Verder zal een nieuwe methode voor de aanmaak van de partikels getest worden waarbij

gestreefd wordt naar een meer reproduceerbare siRNA encapsulatie. Hierbij zal de werking

vergeleken worden van siRNA-liposoom complexen aangemaakt volgens het HYDRA protocol

met deze bekomen via ethanoldilutie. Een andere formulatieparameter die onderzocht kan

worden is de ladings- of N/P ratio.

Uiteindelijk zullen we de transfectie-efficientie (met behulp van flowcytometrie) en de

toxiciteit (met behulp van een bioluminescentie assay) nagaan van zes verschillende kationische

lipiden en deze met elkaar vergelijken. We proberen tot een optimale samenstelling te komen

die dan verder verkleind zal moeten worden.

19

3Materiaal en Methoden

3.1 SiRNA DUPLEXEN

Het short interfering RNA (siRNA) aangewend tijdens de eerste experimenten werd aange-

kocht onder gelyofiliseerde vorm bij Eurogentec (Seraing, Belgium). Er is gebruik gemaakt

van siRNA gericht tegen het enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) om de transfectie-

efficientie van de te testen liposoomformulaties na te gaan. Een geoptimaliseerde sequentie die

niet overeenstemt met eender welke sequentie in het genoom van de doelwitcel, deed dienst als

negatieve controle siRNA (Eurogentec). Deze gelyofiliseerde siRNAs werden telkens verdund

met Hepes Buffer (HB) (20 mM Hepes buffer pH 7,4) tot een concentratie van 10 of 100 µM

(afhankelijk van de aanmaakmethode, zie sectie 3.2). Latere experimenten zijn uitgevoerd

met het chemisch gemodificeerde 25/27-mer Dicer substraat siRNA (DisRNA) afkomstig uit

het Europees project Meditrans (IDT DNA, Leuven, Belgie). Als negatieve controle werd hier

gebruik gemaakt van het DisRNA gericht tegen het pGL3 luciferase gen.

3.2 BEREIDEN VAN LIPOPLEXEN

In deze masterproef zijn de complexen van het siRNA met de kationische liposomen welke een

bepaalde hoeveelheid PEG-lipide bevatten (ook wel siRNA-PEGylated Liposome complexes

of siPLexes genoemd) op twee verschillende manieren aangemaakt. Een eerste methode is

gebaseerd op het HYDRA protocol (hydra-lipoplexen of hLPX) en een tweede methode maakt

gebruik van ethanoldilutie (lipoplexen via ethanoldilutie of eLPX).

20

3 Materiaal en Methoden

3.2.1 Materiaal

Een eerste kationisch lipide, DOTAP genaamd, werd aangekocht bij Avanti Polar Lipids (Ala-

baster, AL, USA) (Figuur 3.1). Het is een kwaternair ammoniumderivaat met permanente,

pH-onafhankelijke eenmaal positieve lading. DOSPA werd bekomen via Invitrogen (Carls-

bad, CA, USA) (Figuur 3.2). Deze molecule bezit een kwaternaire, twee secundaire en twee

primaire aminofuncties en draagt daardoor, afhankelijk van de pH, maximaal vijf positieve

ladingen.

N⊕

⊖Cl

bb""

H O""

O

bb"

"bb"

"bb"

"bb"

" bb"

"bb"

"bb"

"bb"

"

bb""

Obb

O

""b

b""b

b""b

b""b

b ""b

b""b

b""b

b""b

b

Figuur 3.1: DOTAP+Cl− (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan (chloride zout)),Mw: 698.55 g/mol.

Figuur 3.2: DOSPA (2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)-ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium), Mw: 972 g/mol.

De vier overige kationische lipiden zijn tevens afkomstig van Invitrogen. Daar de struc-

turen niet publiek bekend zijn, kunnen deze niet weergegeven worden. De benamingen zijn

dan ook als volgt: lipid 2, lipid 3, lipid 4 en lipid 5. Wel is het aantal mogelijk protoneerbare of

kwaternaire stikstoffen geweten. Ze bezitten respectievelijk vier, drie, een en een kwaternaire

aminofunctie(s), welke pH-onafhankelijke positieve ladingen vertegenwoordigen.

Andere componenten die voorkomen in de verschillende samenstellingen zijn de helper-

lipiden DOPE (Avanti Polar Lipids) (Figuur 3.3) en cholesterol (Sigma, St Louis, MO, USA)

(Figuur 3.4), het zuurgevoelig PEG-lipide DSPE-Hz-PEG (Kale & Torchilin, 2007) (Figuur

3.5), het niet-zuurgevoelig PEG-lipide DSPE-PEG (Avanti Polar Lipids) (Figuur 3.6) en het

endosomolytisch peptide-bevattende DOPE-DMMAn-NMA3 (wat commercieel niet beschik-

baar is). Hierbij is DOPE gelinkt aan een endosomolytisch peptide, NMA3 genaamd, welke

21


een afgeleide is van mellitine, het hoofdbestanddeel van bijengif. Bovendien zijn de amines

gemodificeerd met dimethylmaleınezuur-anhydride (DMMAn) waardoor de lytische activiteit

en toxiciteit van het peptide minimaal zijn bij extracellulaire neutrale pH. Bij daling van

de pH worden de beschermende groepen verwijderd waardoor het peptide zijn werking kan

uitoefenen tijdens de endosomale escape (Meyer et al., 2008) (Figuur 3.7).

NHHH

⊕""b

b""O��P

O

O⊖

PPObb"

"

H O""

O

bb"

"bb"

"bb"

"bb"

" bb"

"bb"

"bb"

"bb"

"

bb""

Obb

O

""b

b""b

b""b

b""b

b ""b

b""b

b""b

b""b

b

Figuur 3.3: DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), Mw: 744,05 g/mol. BijpH 7,4 is de fosfaatgroep negatief en de primaire aminegroep positief geladen envormt zo een neutrale molecule (zwitterion).

HObb

""b

b

""

""b

b

""b

bbb

bb

H

bb

""b

b

""

H��

H

PP

Figuur 3.4: CHOLESTEROL, Mw: 386,66 g/mol (www.wikipedia.org).

Tot slot dienen nog twee transfectiereagentia vermeld te worden in het licht van deze

masterproef, beiden werden bekomen via Invitrogen. Het betreft Lipofectamine2000 (L2000)

welke het meest geschikte in vitro transfectiereagens is en Invivofectamine (IVF), wat sinds

kort verkocht wordt als zijnde bruikbaar voor in vivo experimenten. L2000 en IVF vormen in

dit onderzoek een vergelijkingspunt bij het nagaan van de transfectie-efficientie van de geteste

siPLexen.

22


O

O

S((bb

O

""N

O

Nhh

O

PPNH

��N bb

bb"

"""

""b

bbb

bbN

""

O

bb

O

S O P

O

OH

O""

""O

bb

O

""C17H37

bb

O""

O

C17H35

()n

Figuur 3.5: PEG-Hz-DSPE (polyethyleenglycol-hydrazone-distearoylfosfatidylethanol-amine), Mw: 3280 g/mol. PEG is gekoppeld aan een DSPE-residu met behulpvan een zuurgevoelige hydrazonebinding (Hz). Het DSPE-residu zorgt voorde incorporatie in de liposomen. Een daling van de endosomale pH tot ∼5.5induceert hydrolyse van de Hz-binding waardoor de PEG-ketens verloren gaanen endosomale escape mogelijk wordt (Kale & Torchilin, 2007).

""b

b""b

b""

O

bbO

""bb

HO""

O

bb"

"bb"

"bb

""bb

O��P

O

O−

NH+4

PPObb"

"bbNH

""

O

bb(OCH2CH2)45OCH3

( )7

( )7

Figuur 3.6: DSPE-PEG (distearoylfosfatidylethanolamine-polyethyleenglycol (ammoniumzout)), Mw: 2805,54 g/mol. Bemerk de repetitieve polyethyleenglycol (PEG)eenheden.

Figuur 3.7: DMMAn-Mel (dimethylmaleınezuur-anhydride-mellitine), voorloper van het ge-bruikte peptide DMMAn-NMA3 (Meyer et al., 2008). Voor onze toepassingis hieraan DOPE gekoppeld opdat incorporatie in de liposomen mogelijk zouworden.

23


3.2.2 Aanmaak van hydra-lipoplexen (hLPX)

De lipiden worden opgelost in het gepaste organische solvent, zijnde chloroform voor alle

gebruikte lipiden in deze masterproef, behalve voor lipid 2. Lipid 2 wordt opgelost in een

mengsel methanol/chloroform 2:1. De benodigde hoeveelheden van de samenstellende compo-

nenten worden bij elkaar gevoegd in een kolfje. Dit kolfje wordt vervolgens aangesloten op een

rotavapor waarbij het chloroform wordt afgedampt bij kamertemperatuur. De bekomen lipi-

denfilm wordt gerehydrateerd met de gewenste siRNA-oplossing (250 µl 10 µM; in HB) waarbij

de lipoplexen gevormd worden. Na toevoegen van 750 µl extra buffer (eindconcentratie siRNA

2.5 µM) wordt het geheel 11 maal geextrudeerd door een polycarbonaat membraanfilter met

100 nm poriengrootte (Whatman, Brentfort, UK) en daarna bewaard bij 4℃.

3.2.3 Aanmaak van lipoplexen via ethanoldilutiemethode (eLPX)

De benodigde hoeveelheden van de samenstellende componenten worden bij elkaar gevoegd in

een 1.5 ml epje. Het chloroform wordt afgedampt met behulp van een stikstofstroom teneinde

de dubbele bindingen in het oliezuur te beschermen tegen oxidatie door zuurstof uit de lucht.

De lipiden worden heropgelost in 20 µl zuivere ethanol, gevortext en kort gecentrifugeerd. De

gewenste siRNA-oplossing (25 µl 100 µM; in HB) wordt toegevoegd. Vorming van lipoplexen is

mogelijk dankzij de aanwezigheid van een kritische ethanolconcentratie die ∼40 vol% bedraagt.

Na gedurende 30 minuten om de 5 minuten zacht te vortexen, wordt 955 µl extra buffer

(eindconcentratie siRNA 2.5 µM) toegevoegd, het geheel geextrudeerd en daarna bewaard bij

4℃.

3.3 BEPALING VAN DE DEELTJESGROOTTE

3.3.1 Principe

Dynamic Light Scattering (DLS) of dynamische lichtverstrooiing is een techniek waarmee de

grootte van partikels in een dispersie gemeten kan worden. Enerzijds kan dit aangewend

worden als kwaliteitscontrole op de aangemaakte siPLexen, anderzijds kan de stabiliteit met

het oog op aggregaatvorming bestudeerd worden.

Het principe van DLS gaat als volgt: een laserstraal wordt ingestuurd op een dispersie

van nanopartikels die zich in de daartoe bestemde cuvet bevindt. Hierbij verstrooien de na-

nopartikels het licht in alle richtingen waarbij de brekingsindex afhankelijk is van het soort

partikel en het dispersiemedium. De intensiteit van het verstrooide licht wordt gemeten door

een detector geplaatst onder een hoek van 173° (back scatter). Daar de partikels onderhe-

vig zijn aan de Brownse beweging, veroorzaken zij op elk tijdstip een ander scatterpatroon

waardoor fluctuaties ontstaan in de gemeten intensiteit van het verstrooide licht. De snelheid

waarmee de intensiteit fluctueert is afhankelijk van de grootte van de partikels. Hoe groter

24


een partikel, hoe trager zijn Brownse beweging en dus hoe lager de snelheid waarmee de in-

tensiteit fluctueert. Uit de fluctuatiesnelheid van de lichtintensiteit kan de diffusiecoefficient

D bepaald worden welke een maat is voor de snelheid van de Brownse beweging. Met behulp

van de Stokes-Einstein vergelijking kan dan de hydrodynamische diameter van de partikels

bepaald worden:

d (H) =kT

3πηD

waarin:

d (H): hydrodynamische diameter (m)

k: constante van Boltzmann (J/K)

T : temperatuur (K)

η: viscositeit (Pa.s)

D: diffusiecoefficient (m2/s)

Merk hierbij op dat de diameter van de partikels gemeten met DLS de hydrodynamische

diameter is, gedefinieerd als de diameter van een sfeer met dezelfde diffusiecoefficient als het

partikel. Tevens zijn ook de viscositeit van het dispersiemedium en de temperatuur van belang.

De temperatuur dient constant gehouden te worden gedurende de meting, zijnde 37℃ in deze

masterproef.

3.3.2 Praktische uitvoering

De partikelgrootte van de siPLexen wordt gemeten gebruik makende van de Zetasizer Nano

ZS (Malvern, Worcestershire, UK). Daar stofdeeltjes aanwezig in het staal een vertekening

kunnen geven van de deeltjesgrootte, worden de stalen voorbereid in een kast met laminaire

luchtstroom teneinde stofvrij te kunnen werken. Telkens wordt 20 µl van de te meten lipoplex-

oplossing aangelengd met 50 µl HB (20 mM, pH 7.4) in de daartoe bestemde cuvet.

3.4 CELEXPERIMENTEN

De uiteindelijke doelstelling bij de ontwikkeling van een geschikte siRNA formulatie is de

toepassing ervan in vivo. Proeven op levende organismen worden echter zo lang mogelijk

uitgesteld tot voldoende bewijs geleverd werd dat de siRNA formulatie effectief werkzaam is en

geen of minimale toxiciteit vertoont. Celexperimenten zijn hiervoor uiterst geschikt daar zij de

in vivo situatie kunnen nabootsen en eenvoudig uitvoerbaar zijn. De gebruikte cellen moeten

ex vivo (dus in een vloeibaar cultuurmedium) in leven kunnen gehouden worden en blijven

vermenigvuldigen. Daartoe worden vaak tumorcellijnen aangewend. In deze masterproef is

25


gebruik gemaakt van een Huh-7-eGFP cellijn. Dit zijn humane hepatomacellen die op een

stabiele wijze het eGFP gen tot expressie brengen.

3.4.1 Celkweek

De Huh-7-eGFP cellen worden gekweekt in plastieken cultuurflessen van 75 cm2. Zij groeien

in een medium bestaande uit 435 ml DMEM:F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) ge-

supplementeerd met 5ml 2 mM L-glutamine, 50 ml FBS (Fetal Bovine Serum) en 10 ml P/S

(100 IU/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine) (allen bekomen via Gibco/Invitrogen) bij

37℃ en 5% CO2. Het medium wordt op een steriele wijze aangemaakt in een LAF-kast en on-

derworpen aan membraanfiltratie. Alle hierna volgende handelingen dienen tevens uitgevoerd

te worden in een steriele omgeving en met steriele materialen teneinde contaminatie van de

cellen te vermijden.

Om de delende cellen in cultuur te houden, dienen deze uitgesplitst te worden wanneer

ze confluent (quasi continue monolaag van cellen in de cultuurfles) zijn. Zoniet gaan de cellen

in meerdere lagen boven elkaar groeien wat een negatieve invloed heeft op de kwaliteit van

de cellen. Eerst wordt het oude cultuurmedium verwijderd, waarna de cellen worden gewas-

sen met het steriele Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco/Invitrogen). Vervolgens worden

de cellen losgemaakt van de bodem door toevoeging van 3 ml 0.25% trypsine/EDTA (Sigma).

Trypsine is een enzym dat peptidebindingen kan splitsen en zo de eiwitmatrix afbreekt die ver-

antwoordelijk is voor de bindingen tussen de cellen. Na vijf minuten incuberen bij 37℃ wordt

7 ml cultuurmedium toegevoegd teneinde het trypsine te inactiveren. Doorgaans wordt 1 ml

van de bekomen 10 ml celsuspensie (1:10 verdunning) overgebracht naar een nieuwe cultuur-

fles en aangelengd met 10 ml cultuurmedium. De cellen zijn opnieuw confluent na drie a vier

dagen.

3.4.2 Aanmaak platen voor transfectie en cytotoxiciteitstesten

Vooraleer een transfectie-experiment uitgevoerd kan worden, dienen Huh-7-eGFP cellen uit-

gezaaid te worden in een 12-wellplaat. Daartoe moet het aantal cellen aanwezig in de oor-

spronkelijke celsuspensie gekend zijn opdat een reproduceerbare celdensiteit in de wells bereikt

zou worden. Het tellen van de cellen is hierbij noodzakelijk. 50 µl van de celsuspensie wordt

gemengd met 100 µl tryptaanblauw (dit kleurt selectief de dode cellen blauw, opdat deze de

telling niet zouden verstoren). Een kleine hoeveelheid van dit mengsel wordt onder het draag-

glaasje van een telkamer van Burker gebracht, waarvan gekend is welk volume zich boven

de verschillende onderverdelingen bevindt. Hieruit kan het aantal cellen per ml celsuspensie

bepaald worden. Vervolgens kan berekend worden hoeveel ml cultuurmedium aan de celsus-

pensie toegevoegd moet worden opdat het gewenste aantal cellen per well uitgezaaid wordt.

In deze masterproef worden telkens 50000 cellen/well in een 12-wellplaat uitgezaaid. Na 24u

26


incubatie (37℃, 5% CO2) zijn de cellen adherent en klaar voor transfectie. Deze procedure

verloopt volledig analoog voor de aanmaak van de platen voor de cytotoxiciteitstesten. Hierbij

worden de cellen uitgeplaat tegen een densiteit van 4000 cellen/well in een 96-wellplaat. Er

dient opgemerkt te worden dat het aantal cellen/cm2 op deze manier overeenstemt met het

aantal cellen/cm2 bij de platen voor transfectie.

3.4.3 Bepaling van transfectie-efficientie: flow cytometrie

3.4.3.1 Principe

Aangezien we werken met siRNA/DisRNA dat in staat is het eGFP-mRNA af te breken, is

de gemeten fluorescentie-intensiteit omgekeerd evenredig met de transfectie-efficientie. Hoe

lager de fluorescentie, hoe meer de expressie van het eGFP-gen onderdrukt wordt en hoe beter

de transfectie-efficientie. Ter controle wordt de fluorescentie gemeten van Huh-7-eGFP cellen

welke op een identieke manier getransfecteerd werden met siPLexen welke een controlesequen-

tie bevatten.

Flow cytometrie is een techniek waarbij de cellen individueel in een vloeistofstroom be-

studeerd kunnen worden. Ze worden geevalueerd op basis van hun morfologie en fluorescentie.

Een laserstraal (met een golflengte van 488 nm) wordt ingestuurd op een zeer fijn capillair

buisje waar de cellen een voor een passeren. Een aantal detectoren zijn verantwoordelijk voor

het waarnemen van de lichtverstrooiing van de laser en de fluorescentie veroorzaakt door het

deeltje dat passeert. Een detector staat in het verlengde van de ingestuurde lichtbundel (For-

ward Scatter, FSC), de andere loodrecht erop (Side Scatter, SSC). Deze twee detectoren meten

de lichtverstrooiing veroorzaakt door de cellen en geven zo specifieke informatie over respec-

tievelijk de grootte en de inwendige structuur van de cel (vorm van de celkern, aanwezigheid

van cytoplasmatische granules). Fluorescente stoffen aanwezig in de cellen (hier eGFP) kun-

nen geexciteerd worden door het laserlicht. De cellen zenden daarbij licht uit met een langere

golflengte (fluorescentielicht) welke gedetecteerd kan worden met de fluorescentie detector. De

gemeten fluorescentie-intensiteit is een maat voor de hoeveelheid eGFP aanwezig in de cel.

Hoe hoger de intensiteit, hoe meer eGFP aanwezig is. Deze techniek stelt ons dus in staat de

mate van onderdrukking van het eGFP te evalueren na toedienen van siRNA/DisRNA gericht

tegen het eGFP-mRNA.

3.4.3.2 Praktische uitvoering

Wanneer de resultaten uitgelezen moeten worden, wordt het medium van de cellen verwijderd

gevolgd door een wasstap met 1ml PBS. Vervolgens worden de cellen getrypsiniseerd met

400 µl 0.25% trypsine/EDTA per well gedurende 5 a 10 minuten bij 37℃. Een ml cultuur-

medium per well wordt toegevoegd om het trypsine te inactiveren en de celsuspensie wordt

27


overgebracht in 1.5 ml epjes. Na 7 minuten centrifugeren (bij 1200 rpm, 4℃) wordt de celpel-

let geresuspendeerd in 200 µl flow buffer (PBS, 0.1% Natrium azide, 1% BSA (Bovine Serum

Albumin, Sigma) gefiltreerd door een 0.2 µm filter en steriel bewaard) en worden de stalen

meteen op ijs gezet. Net voor de meting wordt 2.5 µl propidium jodide toegevoegd teneinde

het onderscheid te maken tussen de dode en levende cellen aanwezig in het staal. De metingen

worden uitgevoerd met een Beckman Coulter CytomicsTM FC500 en Beckman Coulter CXP

analysis software wordt gehanteerd voor de dataverwerking.

3.4.4 Cytotoxiciteitstesten

3.4.4.1 Principe

Het is niet alleen belangrijk dat de geteste siPLexen een hoge transfectie-efficientie bezitten,

ze mogen tevens geen (of minimale) toxiciteit vertonen. De celviabiliteit wordt bepaald met

behulp van de CellTiter-Glor luminescentie assay (Promega, Madison, WI, USA). Deze assay

is gebaseerd op de reactie waarbij het firefly luciferase het substraat luciferine, in aanwezigheid

van ATP en O2, omzet tot oxyluciferine, AMP, PPi, CO2 en licht. De hoeveelheid uitgezon-

den licht kan gemeten worden met de Glomaxr 96 Microplate Luminometer (Promega). In

tegenstelling tot andere toepassingen waarbij de enzymactiviteit van het luciferase bepaald

wordt, gaat het hier om een ATP bepaling welke een maat is voor de metabool actieve en

dus gezonde cellen. Het CellTiter-Glor reagens bezit zowel het substraat als het firefly luci-

ferase in overmaat waardoor het ATP afkomstig van de gelyseerde cellen de limiterende factor

is voor de chemische omzetting. Het luminescentie signaal is daarbij recht evenredig met de

hoeveelheid ATP. Bij deze assay is het van belang een controle in te bouwen onder de vorm van

niet-getransfecteerde cellen (blanco) waarbij het gemeten signaal overeenstemt met 100% via-

biliteit. Tevens moet ook het achtergrondsignaal (afkomstig van OptiMEM) bepaald worden,

dit is het signaal waarbij geen enkele metabool actieve cel aanwezig is en dus correspondeert

met 0% viabiliteit. Tijdens het verwerken van de resultaten wordt het signaal bekomen bij de

getransfecteerde cellen relatief ten opzichte van de niet-getransfecteerde cellen uitgedrukt.

3.4.4.2 Praktische uitvoering

Vlak voor de analyse wordt het medium van de cellen verwijderd en vervangen door 50 µl

OptiMEM. Daaraan wordt 50 µl van het CellTiter-Glor reagens toegevoegd. Na enkele mi-

nuten schudden wordt de inhoud van de wells overgebracht naar een witte 96-wellplaat en de

luminescentie gemeten.

28

4Resultaten en Discussie

4.1 OPTIMALISATIE EXPERIMENTELE SETTING

4.1.1 Doel

Transfectie-experimenten worden in deze masterproef aangewend om na te gaan in welke mate

het siRNA/DisRNA, onder de vorm van een siPLex, in staat is de productie van het eGFP in

de cellen te onderdrukken. Op deze manier kan nagegaan worden welke siPLexen wel degelijk

in staat zijn het siRNA/DisRNA op een efficiente manier af te leveren in het cytosol van de

cel. De werking van de siPLexen met de verschillende kationische lipiden dient niet enkel

vergeleken te worden ten opzichte van elkaar, maar ook met een commercieel beschikbaar

transfectiereagens. Daarom wordt in dit experiment een bepaalde siPLex samenstelling verge-

leken met Lipofectamine2000 (L2000) en Invivofectamine (IVF) teneinde na te gaan welke van

de twee de beste referentie is. Daar de uiteindelijke doelstelling de in vivo toepassing van de

siPLexen betreft, wordt tevens onderzocht op welke manier de aanwezigheid van de siPLexen

in de bloedbaan, na intraveneuze injectie, het best wordt nagebootst. Enerzijds kunnen de

siPLexen gedurende een uur bij 37℃ gepreıncubeerd worden in een welbepaalde hoeveelheid

serum (FBS). Een andere benadering van de bloedbaan is deze waarbij de siPLexen op cellen

worden gebracht waar een bepaald percentage serum (FBS) aan het medium toegevoegd werd.

29

4 Resultaten en Discussie

4.1.2 Praktische aspecten

De samenstelling van de siPLexen (hLPX) is als volgt: 0.2 µmol DOSPA (N/P 10) + 1 µmol

DOPE + 0.105 µmol DSPE-Hz-PEG + 0.008 µmol DOPE-DMMAn-NMA3 + 2.5 nmol eGFP

of controle siRNA (Eurogentec). Het cultuurmedium wordt 24u na aanmaak van de transfec-

tieplaatjes vervangen door vier verschillende media (hoeveelheden per well):

• 100 µl PBS +890 µl OptiMEM

• 100 µl PBS +800 µl OptiMEM(*)

• 100 µl PBS +800 µl OptiMEM + 90 µl FBS

• 100 µl PBS +890 µl FBS

(*)10 µl staal 1 uur preıncuberen met 90 µl FBS (37℃, 5% CO2), dan kwantitatief overbrengen

naar well.

Transfectie vindt plaats met de aangemaakte siPLexen, L2000 en IVF. Er wordt telkens

0.5 pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen per well aangebracht (concreet is dit 10 µl 2.5 µM

staal bij 50000 uitgezaaide cellen/well).

4.1.3 Resultaten en interpretatie

In Figuur 4.1 wordt de transfectie-efficientie van de siPLexen vergeleken met deze van IVF

en L2000. Bovendien verschilt de werking van de partikels afhankelijk van het gebruikte

transfectie medium. Zowel de siPLexen als het IVF werken goed in OptiMEM, minder goed

na preıncubatie en in aanwezigheid van 10% FBS. Bij 90% FBS werken ze helemaal niet.

Tevens gedijen de cellen niet zo goed in aanwezigheid van 90% serum (zoals opgemerkt in het

FSC/SSC plot en het aantal dode cellen tijdens analyse). Dit zou een mogelijke reden kunnen

zijn waarom partikels minder of helemaal niet werden opgenomen door de cellen. De precieze

reden waarom de partikels minder goed werken na preıncubatie of in aanwezigheid van 10%

serum is niet gekend. Normaal kunnen positief geladen partikels goed interageren met de

negatief geladen celmembraan, wat noodzakelijk is voor endocytose. Daar in serum negatief

geladen eiwitten zitten die de partikels negatief geladen maken (zie sectie 1.3.1.3), zou dit een

mogelijkheid kunnen zijn waarom de partikels minder goed opgenomen werden. Bovendien

zorgen deze eiwitten voor een zekere afscherming van het partikeloppervlak waardoor het

contact van de siPLexen met de binnenwand van het endosoom en dus de vrijstelling van het

siRNA mogelijk bemoeilijkt wordt.

L2000 daarentegen geeft nog een zeker percentage knockdown in 90% FBS (dit werd

ook opgemerkt in een voorgaand experiment waarvan de resultaten niet weergegeven zijn).

Een mogelijke verklaring hiervoor zou zijn dat L2000 in serum heel grote aggregaten vormt

30


��

�� ! �"#$

%&'�(�� )�**+,�� -�� '�+,�� -��

Figuur 4.1: VERGELIJKING VAN HET EXPRESSIE NIVEAU (%) TUSSEN DE si-PLEXEN, IVF- EN L2000-STALEN IN VIER VERSCHILLENDE TRANS-FECTIE MEDIA. Een expressie niveau beneden de 100% betekent dat er knock-down veroorzaakt wordt.

(zoals waargenomen bij het bekijken van de cellen onder de lichtmicroscoop na transfectie).

Deze aggregaten zakken uit en komen bovenop de cellen te liggen waardoor een bepaalde

hoeveelheid van de partikels toch nog opgenomen wordt.

Daar IVF een commercieel beschikbaar transfectiereagens is dat aangewend wordt voor

gelijkaardige toepassingen als deze van onze siPLexen, wordt IVF (in plaats van L2000) in

de volgende experimenten aangewend ter vergelijking voor de werkzaamheid van de partikels.

Een tweede argument is het feit dat IVF spontaan kleine partikels vormt die in de grootteorde

van de siPLexen na extrusie liggen.

Tot slot hebben we beslist om in de volgende experimenten verder te werken met het

principe van preıncubatie van de stalen teneinde de in vivo situatie zo goed mogelijk na te

bootsen. De reden hiervoor is dat de partikels na intraveneuze injectie doorheen de bloedbaan

reizen tot het doelorgaan bereikt is. Vervolgens treden ze uit de bloedbaan en worden ze, na

migratie doorheen de extracellulaire matrix, opgenomen door de cellen. Aangezien de cellen

in de weefsels ook niet in serum baden, leek het ons weinig zinvol verder te werken met het

transfectie medium dat 90% serum bevat.

31


4.2 HYDRATATIE VERSUS ETHANOLDILUTIE

4.2.1 Doel

Bij de aanmaak van de siPLexen, via directe hydratie (HYDRA protocol) van een lipiden-

film met een geconcentreerde siRNA-oplossing, bekwamen we vaak vrij harde films die met

glasparels losgemaakt moesten worden. We vermoeden dat hierdoor niet alle kationische la-

dingen homogeen verdeeld zitten over de film en zo niet alle ladingen toegankelijk zijn voor

het siRNA. Dit zijn echter twee vereisten waar aan voldaan moet zijn opdat een maximale

encapsulatie-efficientie van 50% bekomen zou worden.

Een alternatieve methode die gebruik maakt van ethanoldilutie wordt door ons uitge-

probeerd. De idee hierbij is voornamelijk afkomstig vanuit de aanmaak van de zogenaamde

‘stabilized nucleic acid-lipid particles’ (SNALPs) (Morrissey et al., 2005). Kort gezegd is de

aanmaak van onze siPLexen via ethanoldilutie gebaseerd op het mengen van de in ethanol

heropgeloste lipiden met een waterige siRNA-oplossing (waarbij een kritische ethanolconcen-

tratie van ∼40 vol% noodzakelijk is opdat vesikels spontaan gevormd zouden worden). Dit

experiment heeft dan ook als doel na te gaan of de transfectie-efficientie van partikels (met

eenzelfde samenstelling) op de twee verschillende manieren aangemaakt, verschillend is.


De samenstelling van de siPLexen is als volgt: 0.2 µmol DOSPA (N/P 10) + 1µmol DOPE +

0.105 µmol DSPE-Hz-PEG + 2.5 nmol eGFP of controle siRNA (Eurogentec). De siPLexen

worden op de twee verschillende manieren aangemaakt (hydra-lipoplexen of hLPX; lipoplexen

via ethanoldilutie of eLPX). Het cultuurmedium wordt 24u na aanmaak van de transfectie-

plaatjes vervangen door een mengsel PBS/OptiMEM (100 µl PBS +900 µl OptiMEM per well).

Een gepaste hoeveelheid van de aangemaakte siPLexen wordt gedurende een uur bij 37℃ in

50% serum (FBS) gepreıncubeerd. Vervolgens worden de oorspronkelijke en gepreıncubeerde

siPlexen op de cellen gebracht in zes verschillende hoeveelheden (gaande van 4 tot 0.125 pmol

siRNA per 1000 uitgezaaide cellen per well).


Zoals in Figuur 4.2 gezien kan worden, heeft de aanmaakmethode geen uitgesproken invloed

op de transfectie-efficientie van de partikels met eenzelfde samenstelling. Opmerkelijk in dit

experiment is de vaststelling dat preıncubatie van de stalen dit keer geen negatief effect heeft

op de onderdrukking van de genexpressie. Een duidelijke verklaring kan hiervoor niet aange-

haald worden. Verder kan er besloten worden dat blijkbaar niet meer dan 0.5 pmol siRNA per

1000 uitgezaaide cellen per well nodig is om efficiente knockdown te bekomen. Bij de hogere

concentraties zien we zelfs iets minder sterke knockdown, wat niet strookt met onze verwach-

32


tingen. Een mogelijke verklaring is de volgende: hoe groter de hoeveelheid partikels dat op

de cellen wordt gebracht, hoe meer kans op toxiciteit. De cellen die veel partikels opgenomen

hebben, hebben meer kans om te sterven dan degene die minder partikels opgenomen hebben.

Daar het deze cellen met weinig opgenomen partikels zijn die overleven, is een veel minder

efficiente knockdown mogelijk.

��

� � � ��

!"!#!$!%!&!!

# " & !'( !' "( !'&"() *+,- ./012345674889 4:;<

=>?@ A>?@(A) (B)

Figuur 4.2: VERGELIJKING VAN HET EXPRESSIE NIVEAU (%) TUSSEN hLPX ENeLPX. De toegevoegde hoeveelheid siRNA per well wordt uitgedrukt als hetaantal pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen. De resultaten zijn deze van dehLPX en eLPX (A) zonder preıncubatie en (B) na preıncubatie in 50% serum.

We besluiten in de volgende experimenten verder te werken met de aanmaak van si-

PLexen via ethanoldilutie op basis van volgend vermoeden: bij de kritische ethanolconcentra-

tie van ∼40 vol% zou een betere verdeling van het siRNA over alle positieve ladingen mogelijk

zijn (en zo een meer reproduceerbare siRNA encapsulatie bekomen kunnen worden) aangezien

de gevormde liposomen zich op de grens van stabiliteit bevinden. Door regelmatig te vortexen,

worden de liposomen als het ware voortdurend opgebroken en hervormd waarbij het siRNA

zich steeds beter kan verdelen over alle ladingen. Stabiele liposomen worden pas gevormd

wanneer het mengsel verder wordt aangelengd met HB. Bij het HYDRA protocol daarentegen

hebben de siRNA moleculen slechts een kans. Eens de liposomen hier sluiten, is hervorming

niet meer mogelijk. Als er dan toevallig een minder homogene verdeling is, dan kan daar niets

meer aan veranderd worden.

Er dient vermeld te worden dat een aantal fundamentele verschillen bestaan tussen onze

ethanoldilutie-methode en de aanmaak van SNALPs (Buyens et al., 2009). Zo gebeurt de

aanmaak van SNALPs bij een lagere pH (∼pH 5) en is het gebruik van een titreerbaar katio-

nisch lipide vereist. De reden hiervoor is dat bij een lage pH de titreerbare kationische lipiden

positief geladen zijn. De opzuivering die volgt, is eenvoudigweg te bereiken door de pH te

verhogen waardoor de positieve lading verdwijnt, met het vrijstellen van het oppervlaktege-

33


bonden siRNA als gevolg. Daar in deze masterproef gebruik gemaakt wordt van zuurgevoelige

PEG-lipiden, wordt er gewerkt bij neutrale pH. Tevens zijn niet alle gebruikte kationische li-

piden titreerbaar.

4.3 INVLOED VAN DE N/P RATIO

4.3.1 Doel

Zoals eerder vermeld is de ladingsratio (N/P of +/- ratio) een belangrijke formulatieparameter.

Deze wordt bekomen door het aantal positieve ladingen op de kationische lipiden te delen

door het aantal negatieve ladingen op de siRNA moleculen (waarbij 1 siRNA molecule 40 en 1

DisRNA molecule 51 negatief geladen fosfaatgroepen bezit). Gewoonlijk hanteren we een N/P

ratio gelijk aan 10, dit betekent dat er 10 keer meer positieve dan negatieve ladingen aanwezig

zijn waardoor de netto oppervlaktelading van de siPLexen positief is. Bovendien zal al het

siRNA gebonden kunnen worden door de overmaat aan positieve ladingen. De bedoeling van

dit experiment is dan ook na te gaan wat er gebeurt met de werkzaamheid van de partikels

als de N/P ratio verlaagd wordt. Concreet vergelijken we N/P ratio’s 10, 5, 2 en 1.


De samenstelling van de siPLexen (eLPX) is als volgt:

• N/P 10: 0.2 µmol DOSPA + 1 µmol DOPE + 0.105 µmol DSPE-Hz-PEG + 2.5 nmol

eGFP of controle siRNA

• N/P 5: 0.1 µmol DOSPA + 0.5 µmol DOPE + 0.105 µmol DSPE-Hz-PEG + 2.5 nmol


• N/P 2: 0.04 µmol DOSPA + 0.2 µmol DOPE + 0.105 µmol DSPE-Hz-PEG +2.5 nmol


• N/P 1: 0.02 µmol DOSPA + 0.1 µmol DOPE + 0.105 µmol DSPE-Hz-PEG +2.5 nmol


Het cultuurmedium wordt 24u na aanmaak van de transfectieplaatjes vervangen door een

mengsel PBS/OptiMEM (100 µl PBS + 900 µl OptiMEM per well). Een gepaste hoeveelheid

van de aangemaakte siPLexen wordt gedurende een uur bij 37℃ in 50% serum (FBS) ge-

preıncubeerd. Vervolgens worden de oorspronkelijke en gepreıncubeerde siPlexen op de cellen

gebracht in drie verschillende hoeveelheden (4, 1 of 0.125 pmol siRNA per 1000 uitgezaaide

cellen per well).

34



De siPLexen met N/P ratio 10 en 5 blijken het meest efficient te zijn zoals te zien in Figuur 4.3.

Het is opmerkelijk dat ook hier weer geen negatieve invloed gezien wordt na preıncubatie (B)

van de stalen. Partikels met een ladingsratio van 2 werken minder goed in OptiMEM en hele-

maal niet na preıncubatie. Deze met een ratio van 1 geven in beide situaties geen knockdown.

Dit valt als volgt te verklaren: hoe lager de ladingsratio, hoe minder positieve ladingen er zijn

om dezelfde hoeveelheid siRNA moleculen te binden. Bij een ratio van 1 zou het siRNA nog

net gebonden moeten kunnen worden (de helft van de positieve ladingen zit aan de binnen-

kant, de andere helft aan de buitenkant) op voorwaarde dat alle positieve ladingen homogeen

verdeeld en goed bereikbaar zijn. Een vereiste waar in de praktijk hoogstwaarschijnlijk niet

volledig aan voldaan is. Bovendien is de encapsulatie slechts een deel van het probleem. De

samenstelling op zich speelt ook een belangrijke rol, deze is mogelijk minder gunstig voor de

endosomale escape bij een N/P ratio van 1. Tot slot valt te verwachten dat bij een N/P ratio

van 1 de partikels, zelfs in OptiMEM, negatief geladen zijn door de volledige bedekking met

siRNA. Dit kan het gebrek aan knockdown zelfs in OptiMEM en bij hoge concentraties mee

verklaren. Uit de resultaten kunnen we besluiten best verder te werken met een ladingsratio

van 10 zoals in voorgaande experimenten reeds het geval was. .

��

� � ��

�� !�"��

� " �#�$% &'() *+,-./01230445 0678(9 "� (9 $ (9 � (9 "(A) (B)

Figuur 4.3: VERGELIJKING VAN HET EXPRESSIE NIVEAU (%) TUSSEN siPLEXENMET VERSCHILLENDE N/P RATIO. De toegevoegde hoeveelheid siRNA perwell wordt uitgedrukt als het aantal pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen. Deresultaten zijn deze van siPLexen (A) zonder preıncubatie en (B) na preıncubatiein 50% serum.

35


4.4 VERGELIJKING VAN ZES VERSCHILLENDE KATIONISCHE

LIPIDEN

4.4.1 Doel

In dit gedeelte komt de uiteindelijke doelstelling van deze masterproef aan bod, namelijk de

vergelijking van zes verschillende kationische lipiden op het vlak van transfectie-efficientie en

toxiciteit. De bedoeling is te komen tot een of enkele lipiden waarmee verdere experimenten

uitgevoerd zullen worden. De structuur van de zes lipiden werd reeds besproken in sectie 3.2.1.

Het belangrijkste om hieruit te onthouden, is dat de lipiden verschillen in het aantal positieve

ladingen dat ze dragen per molecule en dat bij DOSPA dat aantal bovendien ook nog eens

pH-afhankelijk is.


De samenstelling van de siPLexen (eLPX) is als volgt: 1 µmol mogelijk protoneerbare of

kwaternaire stikstoffen (N/P 10) + 1 µmol DOPE + 0.021 µmol DSPE-Hz-PEG + 2.5 nmol

eGFP of controle siRNA (Eurogentec). De hoeveelheid zuurgevoelig PEG-lipide is verlaagd,

in vergelijking met de vorige experimenten, omdat de voorraad hiervan beperkt is en dit

tenslotte nog maar screeningsexperimenten zijn. Onze verwachting is dat de partikels beter

zouden opgenomen moeten worden aangezien er minder afscherming is door het PEG.

Het cultuurmedium wordt 24u na aanmaak van de plaatjes verwijderd en vervangen

door een mengsel PBS/OptiMEM. Een gepaste hoeveelheid van de aangemaakte siPLexen

wordt gedurende een uur bij 37℃ in 50% serum (FBS) gepreıncubeerd. Vervolgens worden

de oorspronkelijke en gepreıncubeerde siPlexen op de cellen gebracht in zes verschillende hoe-

veelheden (gaande van 4 tot 0.125 pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen per well).


Uit Figuur 4.4 (A en B) kunnen we besluiten dat DOTAP als kationisch lipide goed werkzaam

is en slechts weinig toxiciteit vertoont. De partikels werken minder goed na preıncubatie. In

OptiMEM wordt het volgende waargenomen: hoe hoger de hoeveelheid toegevoegd siRNA per

well, hoe sterker de knockdown.

De siPLexen met DOSPA (Figuur 4.4 (C en D)) als kationisch lipide vertonen zeer weinig

toxiciteit. De partikels werken goed in OptiMEM, ook hier vinden we een logisch verloop qua

werkzaamheid naarmate de concentratie aan siRNA afneemt. Vrij bizar zijn de resultaten

na preıncubatie. De partikels blijken hier niet te werken na contact met serum, nochtans

in voorgaande experimenten werden goede resultaten bekomen met DOSPA. Een mogelijke

verklaring zou volgende kunnen zijn: we hanteren theoretisch gezien een N/P ratio van 10.

36


Deze ratio is gebaseerd op het aantal stikstoffen dat aanwezig is per molecule kationisch lipide.

In tegenstelling tot de andere lipiden is bij DOSPA deze N/P ratio niet gelijk aan de +/-

ratio. De reden hiervoor is dat DOSPA verschillende soorten aminofuncties (1 kwaternaire, 2

secundaire en 2 primaire) bezit die niet allen positief geladen zijn bij neutrale pH. De primaire

aminofuncties (pKa 10) zijn allen geprotoneerd en dus positief geladen bij neutrale pH, de

secundaire (pKa 7) daarentegen slechts gedeeltelijk. Daardoor is de +/- ratio bij DOSPA

ongeveer twee keer lager in vergelijking met de andere lipiden (welke wel een +/- ratio van

10 bezitten bij N/P ratio 10 daar alle stikstoffen kwaternair zijn). Het is daarom aangeraden

in de toekomst een experiment uit te voeren waarbij de hoeveelheid kationisch lipide constant

gehouden wordt in plaats van de N/P ratio.

Zoals weergegeven in Figuur 4.4 (E en F) werkt Lipid 2 zeer goed, zelfs na preıncubatie

blijft vrij sterke knockdown zichtbaar. Het toxiciteitsprofiel is wel iets minder gunstig. Vooral

in OptiMEM blijken de partikels vrij toxisch te zijn. Deze toxiciteit kan misschien in toekom-

stige experimenten wat verlaagd worden door te werken met een hoger percentage PEG-lipide

(5 of 10 mol%) daar de PEG-ketens normaal zorgen voor het afschermen van het partikel en

dus ook van het kationisch lipide.

In vergelijking met de drie voorgaande lipiden kennen we slechts een matige transfectie-

efficientie bij de siPLexen met lipid 3 als kationisch lipide (Figuur 4.5 (A en B)). De partikels

zijn matig tot vrij toxisch, voornamelijk in OptiMEM. Het komt wel vaker voor dat de siPLexen

minder toxisch zijn na preıncubatie in serum, een precieze verklaring hiervoor kan niet meteen

gegeven worden. We vermoeden echter dat door de interactie van de positief geladen partikels

met de negatief geladen componenten van het serum, het partikeloppervlak en dus ook de

kationische lipiden afgeschermd worden van hun omgeving waardoor de toxiciteit verlaagd

wordt.

Lipid 4 blijkt het meest toxische kationisch lipide uit de reeks te zijn, zoals te zien in

Figuur 4.5 (C en D). De wells waaraan de drie grootste hoeveelheden aan partikels werden

toegevoegd, vertoonden tijdens de analyse met flow cytometrie nauwelijks nog levende cellen,

wat bevestigd wordt in het toxiciteitsprofiel. Dit heeft tot gevolg dat de resultaten bij de

grootste hoeveelheden aan siRNA/partikels niet betrouwbaar zijn. Zoals eerder aangehaald

geldt volgende redenering: hoe toxischer de partikels, hoe meer kans dat enkel de cellen over-

leven die nauwelijks partikels opgenomen hebben. Als er geen of weinig partikels opgenomen

worden, dan kan er onmogelijk efficiente knockdown bekomen worden.

Lipid 5 tot slot vertoont een matige tot hoge toxiciteit. Na preıncubatie zijn de partikels

minder toxisch. Tevens is er geen onderdrukking van de genexpressie, zelfs niet in OptiMEM,

zoals weergegeven in Figuur 4.5 (E en F).

37


��

� � � ��

�� !"# � �" �� !"# �$%$&$'$($)$$)%$)&$

& % ) $*+ $* %+ $*)%+, -./0 1234567 89 :; <=;9; >8; >?@ABCCD 2ECF DGHIJK -C /J 2ECFDGHIJK -C(A) (B)

LMLNLOLPLQLL

N M Q LRS LR MS LRQMST UVWX YZ[\]^_`ab_ccd _efg

hiij Zkil jmnopq Ui Wp Zkil jmnopq Uirsrtrurvrwrrwsrwtr

t s w rxy rx sy rx wsyz {|}~ �� {� }� �� {�(C) (D)

��

� � � � ¡ � �¡ � ��¡¢ £¤¥¦ §¨©ª«¬®¯°±±² ³´µ¶··¸ ¨¹·º ¸»¼½¾¿ £· ¥¾ ¨¹·º ¸»¼½¾¿ £·

ÀÁÀÂÀÃÀÄÀÅÀÀÅÁÀÅÂÀ

Â Á Å ÀÆÇ ÀÆ ÁÇ ÀÆÅÁÇÈ ÉÊËÌ ÍÎÏÐÑÒÓ ÔÕ Ö× ØÙ×Õ× ÚÔ× ÚÛÜÝÞßßà Îáßâ àãäåæç Éß Ëæ Îáßâ àãäåæç Éß(E) (F)

Figuur 4.4: EXPRESSIE NIVEAU (%) (LINKS) EN TOXICITEITSPROFIEL (RECHTS)VAN siPLEXEN MET DOTAP (A EN B), DOSPA (C EN D) EN LIPID 2(E EN F) ALS KATIONISCH LIPIDE. De toegevoegde hoeveelheid siRNA perwell wordt uitgedrukt als het aantal pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen.De resultaten zijn deze van siPLexen met en zonder preıncubatie in 50% serum.Een expressie niveau beneden de 100% betekent dat er knockdown veroorzaaktwordt en een celviabiliteit (relatief t.o.v. niet-getransfecteerde cellen) benedende 100% betekent dat er toxiciteit veroorzaakt wordt door de siPLexen.

38


��

�� !"#$% � �$ �� !"#$% �

&'&(&)&*&+&&+'&+(&( ' + &, - &, '- &, +'-. /012 3456789 :; <= >?=;= @:= @ABC

DEEF 4GEH FIJKLM /E 1L 4GEH FIJKLM /E(A) (B)

NONPNQNRNSNNP O S NT U NT OU NT SOUV WXYZ [\]^_`

abcdaeef aghijkkl \mkn lopqrs Wk Yr \mkn lopqrs Wk

tutvtwtxtyttyutyvtv u y tz { tz u{ tz yu{| }~��

�� }� �� }�(C) (D)

�� ¡�� ¡ �¢ £ �¢ �£ �¢ ¡�£¤ ¥¦§ ©ª«¬®¯°±²¯³³´ ¯µ¶·

¸¹¹º ª»¹¼ º½¾¿ÀÁ ¥¹ §À ª»¹¼ º½¾¿ÀÁ ¥¹ÂÃÂÄÂÅÂÆÂÇÂÂÇÃÂÇÄÂ

Ä Ã Ç ÂÈ É ÂÈ ÃÉ ÂÈ ÇÃÉÊ ËÌÍÎ ÏÐÑÒÓÔÕ Ö× ØÙ ÚÛÙ×Ù ÜÖÙ ÜÝÞßàááâ Ðãáä âåæçèé Ëá Íè Ðãáä âåæçèé Ëá(E) (F)

Figuur 4.5: EXPRESSIE NIVEAU (%) (LINKS) EN TOXICITEITSPROFIEL (RECHTS)VAN siPLEXEN MET LIPID 3 (A EN B), LIPID 4 (C EN D) EN LIPID 5(E EN F) ALS KATIONISCH LIPIDE. De toegevoegde hoeveelheid siRNA perwell wordt uitgedrukt als het aantal pmol siRNA per 1000 uitgezaaide cellen.De resultaten zijn deze van siPLexen met en zonder preıncubatie in 50% serum.Een expressie niveau beneden de 100% betekent dat er knockdown veroorzaaktwordt en een celviabiliteit (relatief t.o.v. niet-getransfecteerde cellen) benedende 100% betekent dat er toxiciteit veroorzaakt wordt door de siPLexen.

39


Op basis van de voorgaande resultaten kunnen reeds drie kationische lipiden uitgesloten

worden voor verdere experimenten. We werken verder met DOTAP, DOSPA en Lipid 2.

DOTAP vertoont goede knockdown en beperkte toxiciteit (enkel bij hogere concentraties).

Een voordeel is dat DOTAP commercieel beschikbaar is. DOSPA bezit een uiterst geringe

toxiciteit, werkt vrij goed in OptiMEM en weinig of niet na preıncubatie. De reden dat

we DOSPA blijven meenemen (ondanks het oog op in vivo toepassing en het ontbreken van

activiteit na preıncubatie), is dat DOSPA reeds beschreven werd als goed werkend lipide en

dat we in voorgaande experimenten wel goede resultaten gezien hebben na preıncubatie. Lipid

2 werkt het best van alle zes de lipiden, zijn enige nadeel is dat het toxischer is dan DOTAP

en DOSPA. De kationische lipiden Lipid 3, 4 en 5 worden uitgesloten omwille van te hoge

toxiciteit of beperkte werkzaamheid. In Tabel 4.1 staat alles nog eens kort samengevat.

Tabel 4.1: VERGELIJKING VAN siPLEXEN MET EEN VERSCHILLEND KATIONISCH LIPIDEOP HET VLAK VAN WERKZAAMHEID EN TOXICITEIT.

Kationisch

lipide

N/P ratio Transfectie-efficientie a Toxiciteit b

Geen preıncubatie Na preıncubatie Geen preıncubatie Na preıncubatie

DOTAP 10 Goed Matig Weinig toxisch Niet toxisch

DOSPA 10 Goed Slecht Niet toxisch Niet toxisch

Lipid 2 10 Zeer Goed Goed Matig toxisch Niet toxisch

Lipid 3 10 Goed Matig Toxisch Niet toxisch

Lipid 4 10 Slecht Slecht Zeer toxisch Zeer toxisch

Lipid 5 10 Slecht Slecht Matig toxisch Weinig toxisch

a Zeer goed > Goed > Matig > Slechtb Niet toxisch > Weinig toxisch > Matig toxisch > Toxisch > Zeer toxisch en ‘>’= beter dan

4.5 VERGELIJKING DOTAP-DOSPA-LIPID 2-IVF

4.5.1 Doel

In dit experiment worden de drie overgebleven lipiden niet enkel met elkaar, maar ook met

Invivofectamine (IVF) vergeleken op het vlak van werkzaamheid en toxiciteit. Hierbij zal

enerzijds de N/P ratio constant gehouden worden (N/P 10), anderzijds zal de hoeveelheid

kationisch lipide dezelfde blijven. We willen zo nagaan wat het effect is van de verhoogde N/P

ratio bij DOSPA (N/P 50) en Lipid 2 (N/P 40).

40




• DOTAP (N/P 10): 1.275 µmol DOTAP + 1.275 µmol DOPE + 0.026 µmol DSPE-PEG

+ 2.5 nmol eGFP of pGL3 DisRNA (Meditrans, 51 i.p.v. 40 negatieve ladingen)

• DOSPA (N/P 10): 0.255 µmol DOSPA + 1.275 µmol DOPE + 0.015 µmol DSPE-PEG

+ 2.5 nmol eGFP of pGL3 DisRNA

• Lipid 2 (N/P 10): 0.319 µmol Lipid 2 + 1.275 µmol DOPE + 0.016 µmol DSPE-PEG +

2.5 nmol eGFP of pGL3 DisRNA

• DOSPA (N/P 50): 1.275 µmol DOSPA + 1.275 µmol DOPE + 0.026 µmol DSPE-PEG

+ 2.5 nmol eGFP of pGL3 DisRNA

• Lipid 2 (N/P 40): 1.275 µmol Lipid 2 + 1.275 µmol DOPE + 0.026 µmol DSPE-PEG +

2.5 nmol eGFP of pGL3 DisRNA

Er dient opgemerkt te worden dat vanaf dit experiment is overgeschakeld op DisRNA afkomstig

van Meditrans (zie sectie 3.1). Dit is chemisch gemodificeerd siRNA waarvan is aangetoond

dat het beter werkzaam is dan het conventionele siRNA (Eurogentec), als controle wordt

gebruik gemaakt van DisRNA gericht tegen het luciferase gen (pGL3). Verder bezitten de

siPLexen DSPE-PEG in plaats van het zuurgevoelig PEG-lipide daar dit laatste niet tijdig in

voorraad was. Er wordt met 1 mol% PEG-lipide gewerkt aangezien DSPE-PEG de opname

en endosomale escape van de siPLexen verhindert. De rest verloopt analoog zoals aangegeven

in sectie 4.4.2.


De siPLexen met DOTAP (Figuur 4.6 (A en B)) als kationisch lipide werken heel goed in

OptiMEM, minder goed na preıncubatie en zijn weinig toxisch. Deze resultaten zijn perfect

vergelijkbaar met deze bekomen in voorgaand experiment (Figuur 4.4 (A en B)). Het enige

verschil is dat de siPLexen nu net iets beter werken, maar dat is te verklaren door het gebruik

van het DisRNA i.p.v. het conventionele 21-mer siRNA.

Ook bij DOSPA met een N/P ratio 10 (Figuur 4.6 (C en D)) worden gelijkaardige

resultaten teruggevonden als voordien in Figuur 4.4 (C en D). Het enige verschilpunt echter is

dat de siPLexen nu ook na preıncubatie een zekere mate van knockdown vertonen zoals gezien

in de allereerste experimenten.

Dat Lipid 2 het meest belovende kationisch lipide is om mee verder te werken, wordt

nogmaals bewezen in Figuur 4.6 (E en F). In vergelijking met Figuur 4.4 (E en F) werken de

41


siPLexen nu nog net iets beter (waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van DisRNA) en zijn

ze in OptiMEM minder toxisch. Dat deze partikels een knockdown van 60% blijven geven na

preıncubatie is zeer gunstig.

Uit Figuur 4.7 (A en B) blijkt dat de partikels met Invivofectamine (IVF) matig tot zeer

toxisch zijn bij hogere concentraties. Opmerkelijk is dat er nu geen verschil in toxiciteit wordt

gezien tussen de stalen met en zonder preıncubatie in serum. Tevens zien we ook dat IVF zeer

efficiente knockdown veroorzaakt, zelfs bij de laagste concentraties en na preıncubatie. De

toxiciteit kan omzeild worden door te werken met een voldoende lage concentratie aangezien

de partikels voldoende werkzaam zijn. Men moet toch in gedachten houden dat de hoogst

geteste concentratie een factor 32 groter is dan de laagste, wat niet min is.

Zoals eerder aangegeven bestaat het vermoeden dat bij de siPLexen met DOSPA, de

ladingsratio (bij neutrale pH) verschilt van de N/P ratio en dat deze ongeveer twee keer lager is

dan bij de andere lipiden met dezelfde N/P ratio. Daarom dat we in dit experiment nagaan wat

het effect is als we niet de N/P ratio maar de hoeveelheid kationisch lipide constant houden.

Concreet wordt er evenveel kationisch lipide aan de siPLexen toegevoegd als bij DOTAP.

Figuur 4.7 (C en D) maakt duidelijk dat de siPLexen met DOSPA en N/P ratio 50 uiterst

toxisch zijn. Enkel de twee laagste concentraties vertonen nog een beduidende fractie levende

cellen. De resultaten over de werkzaamheid bij hogere concentraties zijn dus niet betrouwbaar

omwille van reeds vroeger vermelde reden. Wat opvalt is dat bij de laagste concentraties de

siPLexen in staat zijn efficiente knockdown te veroorzaken, zelfs na preıncubatie.

Figuur 4.7 (E en F) toont ons dat de siPLexen met Lipid 2 en N/P ratio 40 tevens zeer

toxisch zijn. Enkel de wells met de kleinste hoeveelheden siRNA vertonen nog iets meer dan

de helft levende cellen. Opmerkelijk is dat bij de twee laagste concentraties 80% knockdown

wordt bekomen, zelfs na preıncubatie. Ondanks het feit dat de hogere N/P ratio toxischer is,

zijn de partikels wel beter werkzaam bij lage concentraties in vergelijking met N/P 10 (Figuur

4.6 (E en F)).

42


��

�� ! �" #$%&'� (% � �! �"#$%&'�)*)+),)-).)).*).+)

+ * . )/ 0 )/ *0 )/ .*01 2345 6789:;< => ?@ AB@>@ C=@ CDEFGHHI 7JHK ILMNOP 2H 4O 7JHK ILMNOP 2H(A) (B)

QRQSQTQUQVQQS R V QW X QW RX QW VRXY Z[\] ^_`abcdefgdhhi djkl

mnno _pnqorstuv Zn \u _pnqorstuv Znwxwywzw{w|ww|xw|yw

y x | w} ~ w} x~ w} |x~� �� (C) (D)

� �¡�¢�£�¤��¡ ¤ �¥ ¦ �¥ ¦ �¥ ¤ ¦§ ¨©ª« ¬®¯°±²³´µ²¶¶· ²¸¹º

»¼¼½ ¾¼¿ ½ÀÁÂÃÄ ¨¼ ªÃ ¾¼¿ ½ÀÁÂÃÄ ¨¼ÅÆÅÇÅÈÅÉÅÊÅÅÊÆÅÊÇÅ

Ç Æ Ê ÅË Ì ÅË ÆÌ ÅË ÊÆÌÍ ÎÏÐÑ ÒÓÔÕÖ×Ø ÙÚ ÛÜ ÝÞÜÚÜ ßÙÜ ßàáâãääå Óæäç åèéêëì Îä Ðë Óæäç åèéêëì Îä(E) (F)

Figuur 4.6: EXPRESSIE NIVEAU (%) (LINKS) EN TOXICITEITSPROFIEL (RECHTS)VAN siPLEXEN MET DOTAP N/P 10 (A EN B), DOSPA N/P 10 (C EN D)EN LIPID 2 N/P 10 (E EN F) ALS KATIONISCH LIPIDE. De toegevoegdehoeveelheid siRNA per well wordt uitgedrukt als het aantal pmol siRNA per1000 uitgezaaide cellen. De resultaten zijn deze van siPLexen met en zonderpreıncubatie in 50% serum. Een expressie niveau beneden de 100% betekentdat er knockdown veroorzaakt wordt en een celviabiliteit (relatief t.o.v. niet-getransfecteerde cellen) beneden de 100% betekent dat er toxiciteit veroorzaaktwordt door de siPLexen.

43


��

�� !"#$% � �$ �� !"#$% �&'&(&)&*&+&&+'&+(&

( ' + &, - &, '- &, +'-. /012 3456789 :; <= >?=;= @:= @ABCDEEF 4GEH FIJKLM /E 1L 4GEH FIJKLM /E(A) (B)

NONPNQNRNSNNP O S NT U NT OU NT SOUV WXYZ [\]^_`abcdaeef aghi

jkkl \mkn lopqrs Wk Yr \mkn lopqrs Wktutvtwtxtyttyutyvt

v u y tz { tz u{ tz yu{| }~�� }� �� }�(C) (D)

�� ¡�� ¡ �¢ £ �¢ �£ �¢ ¡�£¤ ¥¦§ ©ª«¬®¯°±²¯³³´ ¯µ¶·

¸¹¹º ª»¹¼ º½¾¿ÀÁ ¥¹ §À ª»¹¼ º½¾¿ÀÁ ¥¹ÂÃÂÄÂÅÂÆÂÇÂÂÇÃÂÇÄÂ

Ä Ã Ç ÂÈ É ÂÈ ÃÉ ÂÈ ÇÃÉÊ ËÌÍÎ ÏÐÑÒÓÔÕ Ö× ØÙ ÚÛÙ×Ù ÜÖÙ ÜÝÞßàááâ Ðãáä âåæçèé Ëá Íè Ðãáä âåæçèé Ëá(E) (F)

Figuur 4.7: EXPRESSIE NIVEAU (%) (LINKS) EN TOXICITEITSPROFIEL (RECHTS)VAN IVF-STALEN (A EN B) EN siPLEXEN MET DOSPA N/P 50 (C EN D)EN LIPID 2 N/P 40 (E EN F) ALS KATIONISCH LIPIDE. De toegevoegdehoeveelheid siRNA per well wordt uitgedrukt als het aantal pmol siRNA per1000 uitgezaaide cellen. De resultaten zijn deze van siPLexen met en zonderpreıncubatie in 50% serum. Een expressie niveau beneden de 100% betekentdat er knockdown veroorzaakt wordt en een celviabiliteit (relatief t.o.v. niet-getransfecteerde cellen) beneden de 100% betekent dat er toxiciteit veroorzaaktwordt door de siPLexen.

44


Tabel 4.2 geeft nog eens een kort overzicht van de te vergelijken formulaties. Op basis

van deze en voorgaande resultaten zijn we geneigd te kiezen voor Lipid 2 als kationisch lipide

voor de optimale samenstelling van liposomen als drager voor het siRNA.

Tabel 4.2: VERGELIJKING VAN siPLEXEN MET DOTAP OF DOSPA OF LIPID 2 EN IVF-STALEN OP HET VLAK VAN WERKZAAMHEID EN TOXICITEIT.

Kationisch

lipide

N/P ratio Transfectie-efficientie a Toxiciteit b

Geen preıncubatie Na preıncubatie Geen preıncubatie Na preıncubatie

DOTAP 10 Zeer Goed Goed Weinig toxisch Niet toxisch

DOSPA 10 Goed Matig Niet toxisch Niet toxisch

Lipid 2 10 Zeer Goed Zeer Goed Matig toxisch Niet toxisch

IVF / Zeer Goed Zeer Goed Toxisch Toxisch

DOSPA 50 Zeer Goed Zeer Goed Zeer toxisch Zeer toxisch

Lipid 5 40 Zeer Goed Zeer Goed Zeer toxisch Zeer toxisch

a Zeer goed > Goed > Matig > Slechtb Niet toxisch > Weinig toxisch > Matig toxisch > Toxisch > Zeer toxisch en ‘>’= beter dan

4.6 VERKLEINEN VAN DE siPLEXEN

4.6.1 Doel

In een laatste experiment gaan we na of de siPLexen (met DOTAP, DOSPA of Lipid 2 als

kationisch lipide) verder verkleind kunnen worden. We nemen alle formulaties uit het voor-

gaande experiment mee. Immers, wat ben je met het best werkend en/of minst toxisch lipide

als je de siPLexen niet voldoende kan verkleinen voor de in vivo toepassing ervan? We ver-

vangen het helperlipide DOPE door cholesterol en extruderen doorheen een filter met 50

i.p.v. 100 nm poriengrootte. Cholesterol zou kleinere partikels beter stabiliseren dan DOPE

aangezien DOPE een eerder conische structuur vertoont en daardoor minder geneigd is een

lamellaire vorm aan te nemen. Dit experiment is vooral bestemd als screening waarin we op

zoek gaan naar bepaalde trends.



• DOTAP (N/P 10): 1.275 µmol DOTAP + 1.275 µmol DOPE of cholesterol + 0.283 µmol

DSPE-PEG + 2.5 nmol eGFP DisRNA (Meditrans)

45


• DOSPA (N/P 10): 0.255 µmol DOSPA + 1.275 µmol DOPE of cholesterol + 0.170 µmol

DSPE-PEG + 2.5 nmol eGFP DisRNA

• Lipid 2 (N/P 10): 0.319 µmol Lipid 2 + 1.275 µmol DOPE of cholesterol + 0.177 µmol


• DOSPA (N/P 50): 1.275 µmol DOSPA + 1.275 µmol DOPE of cholesterol + 0.283 µmol


• Lipid 2 (N/P 40): 1.275 µmol Lipid 2 + 1.275 µmol DOPE of cholesterol + 0.283 µmol


Er wordt gewerkt met DisRNA van Meditrans. De siPLexen bezitten telkens 10 mol% DSPE-

PEG. Voor extrusie wordt 20 µl van de siPLex-oplossing verdund in 50 µl HB (20 mM, pH 7.4)

in de daartoe bestemde cuvet en wordt de grootte gemeten. Er wordt 31 maal geextrudeerd

door een polycarbonaat membraanfilter met 50 nm poriengrootte (Whatman). Opnieuw 20 µl

siPLex-oplossing wordt gebruikt voor bepaling van de grootte na extrusie.


De resultaten van dit experiment staan samengevat in Tabel 4.3. De grootte van de partikels,

uitgedrukt als de hydrodynamische diameter dH , is een gemiddelde van 3 metingen. Het

zou correcter geweest zijn een gemiddelde te nemen van 3 verschillende extrusies, dit was

echter in de praktijk niet haalbaar. De polydispersiteitsindex pdI is een maat voor het aantal

verschillende groottes van partikels die zich in het staal bevinden. Een pdI < 0.2 is daarbij

aanvaardbaar.

Niet onbelangrijk om weten in verband met DLS-metingen is het volgende: deze resulta-

ten zijn niet voor 100% betrouwbaar aangezien deze gebaseerd zijn op een algoritme, gebruikt

in de berekeningen, dat aanleiding geeft tot een ruime distributie. Bovendien zijn verschillende

weergaven van de grootte-distributie mogelijk. Standaard wordt de intensiteitsdistributie ge-

bruikt. Daarnaast zijn er ook de volume- en numberdistributie. Zoals aangegeven in Figuur

4.8 moet opgelet worden met de interpretatie van zo een grootte-distributie.

Concreet bedoelen we het volgende: de dH van de gemeten partikels (of z-average) in

Figuur 4.8 bedraagt 87.41 nm en stemt ongeveer overeen met het maximum van de curve die

de intensiteitsdistributie weergeeft. Wordt deze distributie echter omgezet naar de volume-

of numberdistributie, dan blijkt dat de curve opschuift naar links. Dit heeft tot gevolg dat

een groot aantal partikels eigenlijk een grootte heeft die kleiner is dan de aangegeven dH ,

met een maximum in de numberdistributie rond 50 nm. Dit fenomeen kan verklaard worden

aan de hand van een voorbeeld (Figuur 4.9). Stel dat een mengsel van sferische partikels

van 5 en 50 nm (in gelijke delen aanwezig) gemeten wordt, dan vertoont de numberdistributie

46


Tabel 4.3: DLS-METINGEN VAN siPLEXEN NA EXTRUSIE DOOR50 NM PORIEN.

Kationisch Lipide N/P ratio Helperlipide dH (nm) pdIb

DOTAP 10 DOPE 87.85± 1.0a 0.100

DOTAP 10 Cholesterol 55.34± 0.7a 0.271

DOSPA 10 DOPE 78.26± 0.6a 0.128

DOSPA 10 Cholesterol 183.63± 39.3a 0.252

Lipid 2 10 DOPE 90.02± 0.9a 0.123

Lipid 2 10 Cholesterol 97.89± 1.5a 0.232

DOSPA 50 DOPE 86.55± 0.8a 0.239

DOSPA 50 Cholesterol 273.87± 151.7a 0.352

Lipid 2 40 DOPE 92.86± 1.3a 0.170

Lipid 2 40 Cholesterol 105.93± 0.4a 0.137

a± standaarddeviatie, dH staat voor hydrodynamische diameter

b pdI : polydispersiteitsindex

2 evenredige pieken. Converteren we deze naar een volumedistributie, dan zien we dat de

deeltjes van 50 nm een grotere bijdrage leveren aan het totaal volume dan de kleinere. Dit

komt omdat het volume van een sfeer ∼ d3. Gaan we nog een stap verder en kijken we naar

de intensiteitsdistributie, dan neemt het verschil nogmaals met een factor 1000 toe aangezien

de intensiteit van het verstrooide licht ∼ d6. Wat we met dit voorbeeld willen aantonen is dat

de resultaten uit dit experiment ons enkel een idee geven over de trends die teruggevonden

kunnen worden. Willen we de precieze grootte van de partikels weten, dan moeten we ons

richten tot technieken zoals Single Particle Tracking (SPT). Hiermee kan niet alleen de grootte

nauwkeurig bepaald worden, maar tevens ook de stabiliteit van de partikels in bloed.

4.6.3.1 Dotap

Als we het resultaat (Tabel 4.3) van de siPLexen (met DOTAP als kationisch lipide) met

DOPE versus cholesterol als helperlipide vergelijken, dan zien we een significant verschil tus-

sen de grootte van de partikels. De partikels met cholesterol zijn beduidend kleiner (±50

nm) dan deze met DOPE (±90 nm). Dit is volgens onze verwachtingen: enerzijds wordt van

cholesterol gezegd dat het aanleiding kan geven tot kleinere partikels daar het de vorming

van een dubbellaag bevordert. Akinc en collega’s toonden reeds aan dat, voor hun specifieke

samenstelling, het gebruik van cholesterol leidt tot kleine partikels (Akinc et al., 2009). An-

derzijds verhindert DOPE de vorming van zeer kleine liposomen door zijn conische structuur

(welke tevens de reden is voor zijn werking als fusogeen lipide tijdens de endosomale escape).

47


��

�� !�� "�

Figuur 4.8: VERGELIJKING VAN INTENSITEITS-, VOLUME- EN NUMBERDISTRI-BUTIE (%) VOOR siPLEXEN MET DOTAP EN DOPE (N/P 10). De verticalelijn geeft de waarde (z-average) aan die gehanteerd wordt voor de berekeningenin de tabel.

Er dient wel opgemerkt te worden dat de grootte-distributie bij cholesterol groter is dan bij

DOPE (Figuur 4.10). Een mogelijke verklaring hiervoor is het gebruik van 10 mol% DSPE-

PEG zowel bij de formulatie met DOPE als cholesterol ondanks het feit dat cholesterol een

kleinere molecule is. Daar het totale volume aan lipiden kleiner is bij de cholesterol-formulatie,

is er als het ware DSPE-PEG teveel. De overmaat aan PEG-lipide kan kleine micellen vormen

welke zorgen voor een bredere distributiecurve. Bij een SPT-experiment zouden deze micellen

de meting niet kunnen verstoren.

Daar de uiteindelijke doelstelling de in vivo toediening van de siPLexen is, is het belang-

rijk de partikels zo klein mogelijk (liefst ± 70 nm voor onze toepassing, de lever) te krijgen.

Daarbij zou cholesterol een grote hulp kunnen zijn zoals gebleken uit voorgaande resulta-

ten. Echter, we mogen ook de werkzaamheid van de partikels niet uit het oog verliezen. We

hebben geen concrete gegevens over de effectiviteit van deze verkleinde siPLexen, maar onze

verwachting is dat DOPE beter zal werken dan cholesterol aangezien we dit reeds vastgesteld

hebben in eerdere experimenten (waarvan de resultaten niet gepubliceerd werden). Belangrijk

is wel te benadrukken dat je hierbij samenstelling per samenstelling moet testen. Als na een

bevestigend experiment zou blijken dat dit ook hier het geval is, dan is de volgende stap de

werkelijke grootte te bepalen van de partikels met DOPE. Wie weet zijn de partikels toch

voldoende klein en blijven ze dit ook in bloed en zijn extra inspanningen teneinde de partikels

nog te verkleinen overbodig. Indien ze nog niet klein genoeg zouden zijn, kan getracht worden

ze te extruderen door een filter met 30 nm poriengrootte.

48


Figuur 4.9: NUMBER-, VOLUME- EN INTENSITEITSDISTRIBUTIE VAN EEN DIS-PERSIE DIE PARTIKELS VAN 5 EN 50 NM BEZIT IN GELIJKE DELEN(www.malvern.co.uk).

��

� �� !"#�

Figuur 4.10: INTENSITEITSDISTRIBUTIE VAN siPLEXEN (MET DOTAP ALS KAT-IONISCH LIPIDE, N/P 10) MET DOPE VERSUS CHOLESTEROL.

49


4.6.3.2 Dospa

Uit Tabel 4.3 blijkt dat het gebruik van cholesterol geen verkleining van de siPLexen (met

DOSPA als kationisch lipide) oplevert in vergelijking met DOPE. Integendeel, we zien zelfs

dat de siPLexen met DOPE vrij klein zijn wat positief is daar we het gebruik van cholesterol

trachten te vermijden om zo de werking van de partikels te behouden. Deze trend wordt

voor beide N/P ratio’s waargenomen. De siPLexen met cholesterol vertonen een gemiddelde

diameter die hoger ligt dan verwacht met een grote standaarddeviatie. Tevens bezitten ze een

vrij hoge pdI. We vermoeden hieruit dat er geen echte liposoomstructuren gevormd zijn. Welke

structuur de partikels dan wel aannemen, zou onderzocht kunnen worden met cryoTEM.

4.6.3.3 Lipid 2

In geval van Lipid 2 als kationisch lipide blijkt cholesterol niet in staat de siPLexen te verklei-

nen. De grootte van de partikels is vergelijkbaar met deze welke DOPE bezitten, zowel voor

N/P 10 als N/P 40. De verklaring kan misschien gezocht worden in de structuur van de lipiden

zelf. DOTAP is een eerder cilindrische molecule. Lipid 2 daarentegen is een multivalent lipide

waarbij de positief geladen kopgroep iets groter is. Dit zorgt er mogelijk voor dat DOPE met

zijn conische structuur even goed of beter past tussen de lipid 2 moleculen dan cholesterol.

Het resultaat dat we hier zien, is dat we iets kleinere liposomen bekomen met DOPE.

50

5Besluit

De belangrijkste focus in deze masterproef is de vergelijking van zes verschillende kationische

lipiden op het vlak van transfectie-efficientie en toxiciteit om zo te komen tot een lipide. Dit

lipide kan vervolgens aangewend worden voor verder onderzoek teneinde een farmaceutische

drager te ontwikkelen die het siRNA voldoende beschermt en alle barrieres weet te omzeilen

bij de in vivo toepassing ervan.

IVF bleek de beste referentie om de werking van de siPLexen mee te vergelijken daar

IVF voor gelijkaardige toepassingen aangewend wordt en spontaan kleine partikels vormt.

Voorts wordt de aanwezigheid van de lipoplexen in de bloedbaan best gesimuleerd door

preıncubatie van de partikels in 50% serum. Aanmaak van de siPLexen via ethanoldilutie

leverde geen significante verschillen op in de werkzaamheid van de partikels ten opzichte van

de hydra-lipoplexen. Het verlagen van de N/P ratio daarentegen had negatieve gevolgen voor

de transfectie-efficientie.

Een eerste vergelijking van de zes verschillende kationische lipiden resulteerde in de

uitsluiting van drie lipiden voor verdere experimenten. Lipid 3 was matig toxisch en veroor-

zaakte slechts geringe knockdown. Lipid 4 bleek uiterst toxisch te zijn en Lipid 5 kon geen

onderdrukking van de genexpressie teweegbrengen.

De overgebleven lipiden DOTAP, DOSPA en Lipid 2 werden nogmaals vergeleken. Dit

keer niet enkel met elkaar, maar ook met het IVF. Hierbij viel meteen op dat Lipid 2 best

IVF kon benaderen qua werkzaamheid, zowel met als zonder preıncubatie. Het constant

51

5 Besluit

houden van de hoeveelheid kationisch lipide bracht vooral extra toxiciteit met zich mee, zowel

voor Lipid 2 als voor DOSPA. In een poging de deeltjesgrootte van de siPLexen verder te

verkleinen, met behulp van extrusie door 50 nm en vervangen van DOPE door cholesterol,

bleek dat enkel bij de liposomen met DOTAP significant kleinere partikels bekomen konden

worden met behulp van cholesterol. De liposomen met Lipid 2 en DOPE versus cholesterol

waren vergelijkbaar in grootte, doch beiden een stuk kleiner dan de conventionele siPLexen.

Tot slot bleek dat cholesterol de liposomen met DOSPA niet kon stabiliseren.

We besluiten te kiezen voor Lipid 2 als kationisch lipide in de verdere ontwikkeling van

een optimale liposomale samenstelling als drager voor het siRNA. Lipid 2 is het enige lipide

dat in staat is efficiente knockdown te veroorzaken na preıncubatie in 50% serum, wat een

belangrijk argument is met het oog op de in vivo toepassing van de siPLexen. Het is tevens

weinig toxisch en de siPLexen kunnen voldoende verkleind worden. Een extra reden om Lipid

2 boven DOSPA te verkiezen is volgende: het zuurgevoelig PEG-lipide DSPE-Hz-PEG kent

een geringe stabiliteit en is zeer gevoelig aan protonen. Aangezien DOSPA 2 primaire en 2

secundaire aminofuncties bezit die partieel gedeprotoneerd zijn, kunnen die vrije protonen

het DSPE-Hz-PEG afbreken. Dit is niet het geval bij Lipid 2 (deze bezit enkel kwaternaire

stikstoffen), dus gaat ook hier de voorkeur uit naar Lipid 2.

Hierna volgen een aantal experimenten die in de toekomst uitgevoerd kunnen worden

als vervolg op het werk in deze masterproef. Eerst en vooral kan dezelfde formulatie als in

het experiment van sectie 4.5 (met Lipid 2 in N/P ratio 10) nogmaals getest worden, maar

met een lager percentage DOPE. Er kan nagegaan worden wat de invloed is op de toxiciteit

en de werkzaamheid van de partikels. Verder is het de bedoeling om hogere percentages van

het zuurgevoelig DSPE-Hz-PEG te incorporeren in de siPLexen teneinde de partikelgrootte

in bloed te stabiliseren. Ook valt nog te onderzoeken wat het effect is van de toevoeging van

het endosomolytisch peptide gekoppeld aan DOPE (DOPE-DMMAn-NMA3). De grootte van

de partikels moet op een precieze manier bepaald worden (m.b.v. SPT) en de stabiliteit moet

getest worden in vol bloed. Extra maatregelen moeten eventueel genomen worden teneinde

partikels te bekomen van de gewenste grootte.

Eens de optimale samenstelling van de partikels bepaald is, zal overgegaan worden tot

in vivo evaluatie. Zo zal de activiteit in vivo getest worden, zal nagegaan worden welke de

biodistributie is en zullen de grootte en de stabiliteit van de partikels hieraan gelinkt worden.

Meer specifiek zal de distributie binnenin de lever en de endotheelcellen onderzocht worden. De

verdeling tussen de hepatocyten (parenchymale cellen) en de Kuppfercellen (levermacrofagen)

en endotheelcellen (samen de niet-parenchymale cellen) zal bestudeerd worden. Dit omdat de

partikels eerst de niet-parenchymale cellen moeten passeren vooraleer ze hun werking kunnen

uitoefenen ter hoogte van de hepatocyten.

52

Literatuurlijst

Akinc, A.; Goldberg, M.; Qin, J.; Dorkin, J. R.; Gamba-Vitalo, C.; Maier, M.; Jayaprakash,

K. N.; Jayaraman, M.; Rajeev, K. G.; Manoharan, M.; Koteliansky, V.; Rohl, I.; Leshchiner,

E. S.; Langer, R.; Anderson, D. G. (2009). Development of lipidoid-siRNA formulations for

systemic delivery to the liver. Molecular Therapy, 17, 872–879

Boussif, O.; Lezoualch, F.; Zanta, M. A.; Mergny, M. D.; Scherman, D.; Demeneix, B.; Behr,

J. P. (1995). A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture

and in-vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7297–7301

Braet, F.; Wisse, E. (2002). Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial

cell fenestrae. Comp. Hepatol., 1, 1

Brummelkamp, T. R.; Bernards, R.; Agami, R. (2002). A system for stable expression of short

interfering RNAs in mammalian cells. Science, 296, 550–553

Buyens, K.; Demeester, J.; De Smedt, S.; Sanders, N. N. (2009). Elucidating the encapsulation

of siRNA in PEGylated cationic liposomes. Langmuir, 25, 4886–4891

Buyens, K.; Lucas, B.; Raemdonck, K.; Braeckmans, K.; Vercammen, J.; Hendrix, J.; En-

gelborghs, Y.; De Smedt, S. C.; Sanders, N. N. (2008). A fast and sensitive method for

measuring the integrity of siRNA-carrier complexes in full human serum. Journal of Con-

trolled Release, 126, 67–76

Corey, D. R. (2007). Chemical modification: the key to clinical application of RNA interfe-

rence? J. Clin. Invest., 117, 3615–3622

Doench, J. G.; Petersen, C. P.; Sharp, P. A. (2003). SiRNAs can function as miRNAs. Genes.

Dev., 17, 438–442

Elbashir, S. M.; Harborth, J.; Lendeckel, W.; Yalcin, A.; Weber, K.; Tuschl, T. (2001).

Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.

Nature, 411, 494–498

Fedorov, Y.; Anderson, E. M.; Birmingham, A.; Reynolds, A.; Karpilow, J.; Robinson, K.;

Leake, D.; Marshall, W. S.; Khvorova, A. (2006). Off-target effects by siRNA can induce

toxic phenotype. RNA, 12, 1188–1196

53

Literatuurlijst

Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C. (1998). Potent

and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,

391, 806–811

Haley, B.; Zamore, P. D. (2004). Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat. Struct.

Mol. Biol., 11, 599–606

Haupenthal, J.; Baehr, C.; Kiermayer, S.; Zeuzem, S.; Albrecht, P. (2006). Inhibition of

RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs in

serum. Biochemical Pharmacology, 71, 702–710

Hongjiang, W.; Lima, W. F.; Zhang, H.; Fan, A.; Sun, H.; Crooke, S. T. (2004). Determination

of the role of the human RNase H1 in the pharmacology of DNA-like antisense drugs. J.

Biol. Chem., 279, 17181–17189

http://www.encapsula.com (09/05/09)

http://www.malvern.co.uk (17/05/09)

http://www.mdconsult.com (20/05/09)

http://www.promega.com (15/05/09)

http://www.vcbio.science.ru.nl (28/04/09)

http://www.wikipedia.org (03/05/09)

Hu, Q.; Shew, C. R.; Bally, M. B.; Madden, T. D. (2001). Programmable fusogenic vesicles

for intracellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides: enhanced cellular uptake and

biological effects. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1514, 1–13

Jackson, A. L.; Burchard, J.; Leake, D.; Reynolds, A.; Schelter, J.; Guo, J.; Johnson, J. M.;

Lim, L.; Karpilow, J.; Nichols, K.; Marshall, W.; Khvorova, A.; Linsley, P. S. (2006).

Position-specific chemical modification of siRNAs reduces ‘off target’transcript silencing.

RNA, 12, 1197–1205

James, H. A.; Gibson, I. (1998). The therapeutic potential of ribozymes. Blood, 91, 371–382

Kale, A. A.; Torchilin, V. P. (2007). ‘Smart’ drug carriers: PEGylated TATp-modified pH-

sensitive liposomes. Journal of Liposome Research, 17, 197–203

Kim, D. H.; Behlke, M. A.; Rose, S. D.; Chang, M. S.; Choi, S.; Rossi, J. J. (2005). Synthetic

dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat. Biotechnol., 23, 222–226

Kim, V. N. (2005). MicroRNA-dependent localization of targeted mRNAs to mammalian

P-bodies. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, 376–385

54

Literatuurlijst

Kittler, R.; Buchholz, F. (2003). RNA interference: gene silencing in the fast lane. Seminars

in Cancer Biology, 13, 259–265

Kostarelos, K.; Miller, A. D. (2005). Synthetic, self-assembly ABCD nanoparticles; a structu-

ral paradigm for viable synthetic non-viral vectors. Chemical Society Reviews, 34, 970–994

Kurreck, J. (2002). Antisense technologies - Improvement through novel chemical modificati-

ons. Eur. J. Biochem., 270, 1628–1644

Kurreck, J. (2009). RNA Interference: From basic research to therapeutic applications. Angew.

Chem. Int. Ed., 48, 1378–1398

Lee, Y. S.; Nakahara, K.; Pham, J. W.; Kim, K.; He, Z.; Sontheimer, E. J.; Carthew, R. W.

(2004). Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing

pathways. Cell, 117, 69–81

Liu, J. D.; Carmell, M. A.; Rivas, F. V.; Marsden, C. G.; Thomson, J. M.; Song, J. J.;

Hammond, S. M.; Joshua-Tor, L.; Hannon, G. J. (2004). Argonaute 2 is the catalytic

engine of mammalian RNAi. Science, 305, 1437–1441

Lorenz, C.; Hadwiger, P.; John, M.; Vornlocher, H. P.; Unverzagt, C. (2004). Steriod and lipid

conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells. Bioorg.

Med. Chem. Lett., 14, 4975–4977

Marques, J. T.; Williams, B. R. G. (2005). Activation of the mammalian immune system by

siRNAs. Nature Biotech., 23, 1399–1405

Meyer, M.; Philipp, A.; Reza, O.; Schmidt, C.; Wagner, E. (2008). Breathing life into po-

lycations: Functionalization with pH-responsive endosomolytic peptides and polyethylene

glycol enables siRNA delivery. J. Am. Chem. Soc., 130, 3272–3279

Morrissey, D. V.; Lockridge, J. A.; Shaw, L.; Blanchard, K.; Jensen, K.; Breen, W.; Hartsough,

K.; Machemer, L.; Radka, S.; Jadhav, V.; Vaish, N.; Zinnen, S.; Vargeese, C.; Bowman,

K.; Shaffer, C. S.; Jeffs, L. B.; Judge, A.; MacLachlan, I.; Polisky, B. (2005). Potent and

persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs. Nature Biotech., 23,

1002–1007

Opalinska, J. B.; Gewirtz, A. M. (2002). Nucleic-acid therapeutics: Basic principles and recent

applications. Nature Reviews Drug Discovery, 1, 503–514

Pai, S. I.; Lin, Y. Y.; Macaes, B.; Meneshian, A.; Hung, C. F.; Wu, T. C. (2006). Prospects

of RNA interference therapy for cancer. Gene Therapy, 13, 464–477

Raemdonck, K.; Vandenbroucke, R. E.; Demeester, J.; Sanders, N. N.; De Smedt, S. C. (2008).

Maintaining the silence: reflections on long-term RNAi. Drug Discovery Today, 13, 917–931

55

Literatuurlijst

Remaut, K.; Sanders, N. N.; De Geest, B. G.; Braeckmans, K.; Demeester, J.; De Smedt, S. C.

(2007). Nucleic acid delivery: Where material sciences and bio-sciences meet. Materials

Science & Engineering Reports, 58, 117–161

Sawant, R. M.; Hurley, J. P.; Salmaso, S.; Kale, A.; Tolcheva, E.; Levchenko, T. S.; Torchilin,

V. P. (2006). ‘SMART’ drug delivery systems: Double-targeted pH-responsive pharmaceu-

tical nanocarriers. Bioconjugate Chemistry, 17, 943–949

Schwartz, D. S.; Hutvanger, G.; Du, T.; Xu, Z.; Aronin, N.; Zamore, P. D. (2003). Asymmetry

in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell, 115, 199–208

Shao, Y.; Chan, C. Y.; Maliyekkel, A.; Lawrence, C. E.; Roninson, I. B.; Ding, Y. (2007).

Effect of target secondary structure on RNAi efficiency. RNA, 13, 1631–1640

Shi, F. X.; Wasungu, L.; Nomden, A.; Stuart, M. C. A.; Polushkin, E.; Engberts, J. B. F. N.;

Hoekstra, D. (2002). Interference of poly(ethylene glycol)-lipid analogues with cationic-lipid-

mediated delivery of oligonucleotides; role of exchangeability and non-lamellar transitions.

Biochemical Journal, 366, 333–341

Snove, O.; Rossi, J. J. (2006). Chemical modifications rescue off-target effects of RNAi. ACS

Chemical Biology, 1, 274–276

Song, E. W.; Zhu, P. C.; Lee, S. K.; Chowdhury, D.; Kussman, S.; Dykxhoorn, D. M.; Feng, Y.;

Palliser, D.; Weiner, D. B.; Shankar, P.; Marasco, W. A.; Lieberman, J. (2005). Antibody

mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat. Biotech.,

23, 709–717

Takakura, Y.; Mahato, R. I.; Hashida, M. (1998). Extravasation of macromolecules. Drug

Deliver. Rev., 34, 93–108

Tolia, N. H.; Joshua-Tor, L. (2007). Slicer and the Argonauts. Nat. Chem. Biol., 3, 36–43

Verbaan, F.; Van Dam, I.; Takakura, Y.; Hashida, M.; Hennink, W.; Storm, G.; Oussoren,

C. (2003). Intravenous fate of poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate)-based polyplexes.

Eur. J. Pharm. Sci., 20, 419–427

Westerhout, E. M.; Berkhout, B. (2007). A systematic analysis of the effect of target RNA

structure on RNA interference. Nucleic Acids Res., 35, 4322–4330

Wisse, E.; Jacobs, F.; Topal, B.; Frederik, P.; De Geest, B. (2008). The size of endothelial

fenestrae in human liver sinusoids: implications for hepatocyte-directed gene transfer. Gene

Therapy, 15, 1193–1199

Wolfrum, C.; Shi, S.; Jayaprakash, K. N.; et al. (2007). Mechanisms and optimization of in

vivo delivery of lipophilic siRNAs. Nature Biotech., 25, 1149–1157

56

Literatuurlijst

Wu, H.; Lima, W. F.; Zhang, H.; Fan, A.; Sun, H.; Crooke, S. T. (2004). Determination of the

human of the RNase H1 in thepharmacology of DNA-like antisense drugs. J. Biol. Chem.,

279, 17181–17189

Yi, R.; Qin, Y.; Macara, I. G.; et al. (2003). Exportine-5 mediates the nuclear export of

pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev., 17, 3011–3016

Zamecnık, J.; Vargova, L.; Homola, A.; Kodet, R.; Sykova, E. (2004). Extracellular ma-

trix glycoproteins and diffusion barriers in human astrocytic tumours. Neuropathol. Appl.

Neurobiol., 30, 338–350

57

Optimalisatie van gepegyleerde kationische …...Zij katalyseren chemische reacties (enzymen),...

Documents

Transcript of Optimalisatie van gepegyleerde kationische …...Zij katalyseren chemische reacties (enzymen),...