Laurent Mariën 6WEWI

Onderzoekscompetentie

I. Inleiding

Mijn eindwerk gaat over enzymen. Over hoe ze gebouwd worden, hoe ze werken, en wat hun talrijke functies zijn, maar ook over hoe we ze met moderne technologieën zelf kunnen produceren om van hun unieke eigenschappen gebruik te maken.

Ik heb dit onderwerp gekozen omdat ik een algemene interesse heb in de biochemie en de biotechnologie, en omdat kennis van enzymen in deze domeinen een basisbehoefte is.

Mijn onderzoeksvragen bij het ingaan van dit werk waren de volgende:

Wat zijn Enzymen, hoe worden ze gebouwd en hoe functioneren ze? Welke rol spelen enzymen in de cel en in het lichaam? Hoe worden ze op grote schaal geproduceerd en wat zijn de belangrijkste

toepassingen?

Inhoudsopgave

I. Inleiding

2

Bereidwillige assistenten

2. Motivatie3. Onderzoeksvragen4. Inhoudsopgave

II. Wat zijn enzymen1. Definitie 2. Aminozuren 3. Codering en productie 4. Peptidenbinding 5. Functionele groepen 6. Ruimtelijke Structuur 7. Denaturatie 8. Indeling en Naamgeving9. Ribozymen

III. Werking van enzymen1. Actieve site en Specificiteit 2. Activiteit 3. Regulatie 4. Cofactoren

IV. Functies in het menselijk lichaam1. Metabolische enzymen 2. Spijsvertering 3. Andere functies in het lichaam

V. Toepassingen1. Geïmmobiliseerde enzymen 2. Industriële productie 3. Restrictieënzymen 4. Wasproducten 5. Andere toepassingen

VI. Praktische Proef

VII. Bijlagen1. Bronvermelding2. Logboek

II. Wat zijn enzymen?

Definitie

3

Enzymen zijn biologische katalysators. Ze komen voor in alle levende organismen, en dienen om chemische reacties te activeren of te versnellen. Ze zijn essentieel voor het leven, en de afwezigheid van één van de naar schatting 75,000 enzymen in het menselijk lichaam kan tot ernstige ziektes of de dood leiden.

Bijna alle enzymen bestaan uit eiwitten, proteïnen. Tot zo’n 20 jaar geleden werd gedacht dat alle enzymen uit proteïnen bestonden, tot de ontdekking van ribozymen (zie Ribozymen). Eiwitten worden door het lichaam aangemaakt als bouwstof om het lichaam mee op te bouwen, of in het geval van enzymen, reacties te laten doorgaan.

Enzymen hebben drie belangrijke karakteristieken. Ten eerste is hun basisfunctie om reacties te versnellen. De meeste cellulaire reacties gekatalyseerd door enzymen vinden ongeveer een miljoen keer sneller plaats dan in hun afwezigheid. Een enzym kan tot tienduizend reacties per seconde katalyseren. Ten tweede reageren de verschillende enzymen slechts met specifieke substraten. De derde en meest merkwaardige eigenschap is dat enzymen gereguleerd kunnen worden van een staat van lage activiteit naar één van hoge activiteit, en omgekeerd. Een groot deel van de individualiteit van een cel is te wijten aan de unieke set enzymen die ze genetisch geprogrammeerd is om aan te maken.

In het algemeen kunnen enzymen inwerken op substraten op drie manieren: substraat oriëntatie, fysische spanning, of veranderingen in de reactiviteit van het substraat. Substraat oriëntatie vind plaats wanneer een enzym ervoor zorgt dat twee substraatmoleculen in de juiste positie komen om een binding te vormen. Wanneer een enzym fysische spanning uitoefent op een substraat, grijpt het het substraat in feite vast en dwingt het om op te breken. Een enzym dat een verandering van substraatreactiviteit teweegbrengt wijzigt de positie van een molecule’s elektronen, wat de mogelijkheid van de molecule om te binden met andere moleculen beïnvloed.

Aminozuren

Alle proteïnen zijn opgebouwd uit aminozuren. Bij de mens zijn er 21 verschillende, en de combinatie van deze onderling leidt tot verschillende eiwitten. Een aminozuur bestaat uit een koolstof-atoom, waar vier dingen aan gebonden zijn: een zuurgroep (COOH), een aminogroep (NH2), een waterstofatoom en een zijketen (aangeduid als R). De zijketen is wat de aminozuren van elkaar onderscheidt.

De zijketens bepalen grotendeels de eigenschappen van het aminozuur. Ze bestaan meestal uit een koolstofketen en kunnen verschillende chemische groepen bevatten:

Glycine heeft geen zijketen, enkel een waterstofatoom.

4

Aminozuren met restgroepen die enkel een koolstofketen bevatten: Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine

Aminozuren met een aromatische zijketen (ringstructuur): Fenylalanine, Tyrosine, Tryptofaan

Aminozuren met een alcoholgroep in de zijketen: Serine, Threonine

Aminozuren met een zuurgroep in de zijketen: Asparaginezuur, Glutaminezuur

Aminozuren met een basische groep in de zijketen: Lysine, Arginine, Histidine

Aminozuren met een amidegroep in de zijketen: Asparagine, Glutamine

Aminozuren met een zwavelatoom in de zijketen: Cysteïne, Methionine

Proline heeft een afwijkende structuur, doordat de aminogroep verbonden is met de zijketen, waardoor een ringstructuur ontstaat.

Selenocysteïne is erkend als het 21ste genetisch gecodeerd aminozuur, en komt voor bij de mens en is gevonden in alle soorten levensvormen. De structuur is dezelfde als die van Cysteïne, alleen is een zwavelatoom vervangen door een seleenatoom.

Pyrrolysine is het 22e natuurlijk voorkomend, genetisch gecodeerd aminozuur. Het is enkel gevonden bij enkele archaea, en niet bij bacteriën of eukaryoten.

Er bestaan nog natuurlijk voorkomende aminozuren, zoals Ornithine, maar deze zijn niet genetisch gecodeerd.

De aminozuren kunnen ook ingedeeld worden volgens polariteit en lading bij fysiologische pH (dit is de pH van een levend systeem, bij de mens ligt dit tussen 7,35 en 7,45 voor een gezond individu). In onderstaande tabel zijn ze als volgt verdeeld:

Aminozuren met apolaire zijketens zijn aangeduid in oranje. Deze zijketens zijn dus hydrofoob.

Aminozuren met polaire zijketens zonder lading, en die met zijketens die waterstofbruggen kunnen vormen met O- of N-atomen, zijn aangeduid in groen. Deze zijketens zijn hydrofiel.

Aminozuren die in het paars zijn aangeduid hebben een negatief geladen COO- groep in de zijketen.

Aminozuren die in het blauw zijn aangeduid hebben een positief geladen NH3+ groep in de zijketen.

5

In water zijn de aminozuren altijd geïoniseerd, door zuur-base reacties met de aminogroep en de zuurgroep. Bij het iso-elektrisch punt zijn het dubbel geladen ionen (bij lagere pH meer positief geladen en bij hogere pH meer negatief geladen). De lading van een eiwit wordt dus bepaald door de pH van de omgeving.

Het iso-elektrisch punt is een belangrijke grootheid voor aminozuren en eiwitten. Het is de pH-waarde waarbij de stof geen netto elektrische lading draagt. Deze pI-waarde kan berekend worden uit de gemiddelde pK-waarden van alle ioniseerbare groepen, zolang deze groepen slechts één proton-uitwisseling verwijderd zijn van de neutrale vorm.

6

Codering en productie

De genetische informatie die de cel nodig heeft om eiwitten aan te maken, is opgeslagen in het DNA. In elke streng van de dubbele helixstructuur van het DNA komen afwisselend vier nucleotiden voor, meestal aangeduid met één hoofdletter: A staat voor Adenine, T voor Thymine, C voor Cytosine en G voor Guanine. Deze vormen per twee basenparen, Adenine altijd met Thymine en Cytosine altijd met Guanine. Deze opeenvolging van basenparen is de genetische code, en hieruit kan de cel eiwitten aanmaken.

Elk groepje van drie basenparen is een codon. Elk codon komt overeen met één of meer specifieke aminozuren. De code voor een bepaald eiwit bestaat uit een opeenvolging van codons, die overeenkomen met de aminozuren waaruit dat eiwit bestaat. Vóór deze code bevindt zich steeds een promotor, een stuk DNA dat er voor zorgt dat de transcriptie-enzymen op die plaats beginnen met de transcriptie, en een stopcodon of terminator, dat ervoor zorgt dat de transcriptie beëindigt wordt.

Het hiernaast weergegeven schema toont welke codons coderen voor welke aminozuren. De codons UAA, UGA en UAG zijn stopcodons. Het UAG codon is onrechtstreeks ook het codon voor Selenocysteïne: in de aanwezigheid van het zogenaamde SECIS-element codeert UAG de aanmaak van Selenocysteïne.

7

Deze informatie wordt overgeschreven op messenger-RNA in het transcriptieproces, onder invloed van het enzym RNA-polymerase.Dit messenger-RNA gaat samen met transport-RNA dat het juiste aminozuur gebonden heeft naar de ribosomen, die de verschillende aminozuren in de juiste volgorde aaneenhechten in een polypeptidenketen.

Peptidenbinding

Chiraliteit

Het centrale koolstofatoom van een aminozuur noemt met het Calfa-atoom, en is een chiraal center. Alle aminozuren gecodeerd door DNA hebben de L-configuratie rond dit chiraal center. Een ezelsbruggetje hiervoor is de ‘CORN’-regel: als men het aminozuur bekijkt recht op de C-H as en de structuur leest in wijzerzin, spellen de letters van de aan Calfa gebonden groepen het woord CORN.

Reactie

De reactie die in de ribosomen plaatsvindt is een dehydratatie-synthese reactie of condensering. De reactie gebeurt tussen de carboxylgroep van het ene aminozuur en de aminogroep van het volgende. De resulterende molecule is een amide. De vieratomige groep -C(=O)NH- noemt men een peptidenschakel.

8

RNA-polymerase

Resonantie

De peptidenbinding heeft voor 40% de eigenschappen van een dubbele binding, dit komt doordat bij amiden resonantie plaatsvindt tussen twee vormen (zie afbeelding). Als gevolg hiervan zijn alle peptidenbindingen nagenoeg vlak van vorm. Normaal zou men verwachten dat de moleculen vrij kunnen draaien rond de peptidenbinding, maar dit wordt verhindert door de resonantie. Ook draagt het zuurstofatoom een kleine negatieve lading, en het stikstof atoom een positieve.

Cis/trans-isomerie

De sterische hindering tussen de zijketens op de Calfa atomen is het grootst in het cis-isomeer. Bijgevolg hebben peptidenbindingen bijna altijd de vorm van het trans-isomeer.

9

Functionele groepen

Vele enzymen hebben een functionele groep nodig om hun werking mogelijk te maken. Meestal worden deze na de aanmaak door de ribosomen toegevoegd als een vorm van posttranslationele modificatie (zie regulatie). Enkele reacties waarbij een functionele groep wordt toegevoegd, zijn:

glycosylatie, binding van een oligosacharide. fosforylering, binding van een fosfaatgroep. methylering, binding van een methylgroep. prenylering, binding van een hydrofobe groep. acetylering, binding van een acetylgroep. arginylering, waarbij het aminozuur arginine aan het N-terminale einde van proteïnen wordt vastgemaakt.

Ruimtelijke Structuur

Na de aanmaak door de ribosomen zijn proteïnen ver van klaar. Uit de peptidenketen als basis ontstaan grote en complexe moleculen, met meer dan alleen aminozuren als onderdelen. De structuur van een eiwit kan beschouwd worden op vier niveaus. Kort samengevat noemt men de volgorde van aminozuren de primaire structuur, plaatselijke plooiingen in de keten de secundaire structuur, de driedimensionale samenstelling van secundaire elementen de tertiaire structuur en de samenstelling van een eiwit uit zijn subeenheden de quaternaire structuur.

Primaire Structuur

De primaire structuur van een proteïne is zijn lineaire volgorde van aminozuren in de peptidenketens, zoals ze wordt aangemaakt door de ribosomen met de informatie uit het DNA. Elke peptidenketen heeft aan het ene uiteinde een zogenaamde amino-terminus of N-terminus, dit is een vrije aminogroep. Het andere uiteinde is een carboxyl-terminus of C-terminus, en bestaat uit een vrije carboxylgroep. De conventie om een peptidenketen neer te schrijven is om de N-terminus links te plaatsen en de sequentie neer te schrijven van N- naar C-terminus.

10

Secundaire Structuur

De meeste proteïnen bevatten stukken peptidenbindingen die een karakteristieke vorm (conformatie) aannemen in de driedimensionale ruimte, door de vorming van waterstofbruggen tussen de aminozuren. De meest voorkomende zijn de alfahelices en de bètavlakken.

Alfahelices

Dit is de vaakst voorkomende en meest voorspelbare conformatie. In deze structuur is de peptidenketen gespiraliseerd in een in wijzer- of tegenwijzerzin draaiende helix, in de natuur komen echter enkel de in wijzerzin draaiende helices voor. Deze komt tot stand doordat de carbonylgroep (C=O) van elke peptidenbinding parallel aan de as van de helix staat, waardoor ze gericht staat naar de NH-groep van de peptidenbinding vier aminozuren lager in de helix. Er onstaat een waterstofbrug tussen de carbonyl- en de NH-groep, en dit zorgt voor de draaiing in de helix. De helix maakt een volledige draai rond ongeveer elke 3,6 aminozuren, en de meeste alfahelices zijn ongeveer elf aminozuren lang.

Bèta-sheets

De tweede vaak voorkomende secundaire structuur is de bèta-sheet. In deze structuur ligt de peptidenketen een paar keer geplooid naast zichzelf, waardoor zogenaamde bètastrengen ontstaan van meestal 5 tot 10 aminozuren in lengte. Deze parallel of antiparallel naast elkaar liggende strengen worden aan elkaar verbonden door 5 of meer waterstofbruggen tussen een carbonylgroep van de ene streng en een NH-groep van de andere streng. Hierdoor ontstaat een gevouwen plaatstructuur.

Twee naast elkaar liggende bètastrengen worden meestal met elkaar verbonden door een peptidenketen van enkele aminozuren lang, die meestal een glycine of proline bevat omdat die aminozuren in staat zijn om een dergelijke scherpe draai te kunnen maken. Soms zit er tussen

11

de twee strengen echter grote lussen aminozuren, andere secundaire structuren of zelfs volledige delen van het proteïne.

Een bekend voorbeeld van deze structuur is zijde. Dit natuurlijk proteïne bestaat voor het grootste deel uit bètasheets.

In 3D-voorstellingen van bèta-vlakken wordt gebruik gemaakt van pijlen die elke bètastreng aanduiden, in de N- naar C-terminus richting.

12

Bètahelices

Een andere secundaire structuur is de bètahelix. In deze structuur vormen twee of drie bètasheets de zijden van een helix. Het kan gevormd worden door een peptidenketen die parallel door twee of drie bètavlakken loopt in wijzer- of tegenwijzerzin. De structuur wordt gestabiliseerd door waterstofbruggen, interacties tussen proteïnen en soms gebonden metaalionen.

13

Tertiaire Structuur

De volgende orde in de proteïnestructuur ontstaat wanneer er bindingen gevormd worden tussen de zijketens van de aminozuren. Deze bindingen bepalen de uiteindelijk geometrische structuur van het proteïne. Door deze bindingen tussen zijketens ontstaan lussen, bochten en plooiingen in de peptidenketens. Een keten kan op verschillende plaatsen aan zichzelf gebonden worden, of twee ketens kunnen aan elkaar worden gebonden.

Er zijn vier soorten interacties tussen zijketens: Waterstofbruggen Zoutbruggen Zwavelbruggen Apolaire hydrofobische interacties

Waterstofbruggen

Waterstofbruggen tussen zijketens ontstaan meestal tussen twee alcoholgroepen, tussen een alcohol- en een zuurgroep, tussen twee zuurgroepen, tussen een alcohol- en een aminegroep of tussen een alcohol- en een amidegroep.

Zoutbruggen

Een zoutbrug is een combinatie van een waterstofbrug verstevigd met een elektrostatische interactie. Ze ontstaan uit de neutralisatiereactie tussen een zuurgroep en een aminogroep in de zijketens van aminozuren. Het resultaat is een waterstofbrug tussen een zuurstof- en een waterstofatoom, en een aantrekkingskracht tussen de positief geladen ammoniumgroep en de negatief geladen zuurgroep. Een zoutbrug kan gevormd worden tussen elke combinatie van aminozuren met een zuurgroep en een aminogroep in de zijketens.

14

Zwavelbruggen

Een zwavel- of disulfidebrug is een sterke covalente binding tussen twee zwavelatomen (S-S), meestal ontstaan uit een reactie van twee thiolgroepen in de zijketens van cysteïne. Zwavel-bruggen komen veel voor bij eiwitten en vormen een belangrijk structureel element. Bij denaturalisatie door hitte worden deze bindingen niet alleen verbroken, maar kunnen er ook willekeurig nieuwe zwavelbruggen ontstaan waardoor het eiwit zijn vorm verliest.

Apolaire hydrofobische interacties

De hydrofobische interacties tussen apolaire zijketens dragen veel bij tot de stabiliteit van de tertiaire structuur. Deze interacties zijn het gevolg van de oplossingsregel: polair lost op in polair en apolair in apolair. Al de apolaire groepen stoten gezamenlijk water en polaire groepen af, wat resulteert in een netto aantrekkingskracht tussen de apolaire groepen. Ook aromatische benzeenringen in zijgroepen trekken elkaar op dergelijke manier aan.In veel gevallen zitten bijgevolg de apolaire zijketens aan de binnenkant van een globulair eiwit, terwijl de buitenkant voornamelijk polaire groepen bevat.Quaternaire Structuur

De quaternaire structuur van een proteïne beschrijft hoe verschillende peptiden- of proteïneketens samenclusteren tot één geheel. Dit gebeurt onder andere door waterstof-, zout- en zwavelbruggen die de verschillende ketens in een bepaalde geometrie samenbinden. Er zijn twee grote categorieën van quaternaire structuren: globulaire proteïnen en scleroproteïnen of fibreuze proteïnen.

Globulaire Proteïnen

Deze eiwitten hebben de vorm van een holle bal of kogel. Zoals reeds vermeld worden ze vaak gevormd door apolaire hydrofobische interacties in de zijketens. Belangrijk is dat de meeste enzymen globulair zijn, maar ook bijvoorbeeld insuline en hemoglobine, dat dankzij deze structuur zuurstof kan transporteren.

Fibreuze Proteïnen

Dit zijn eiwitten die in spoelvormen met elkaar gebonden zijn, vergelijkbaar met een touw. Ze zijn meestal onoplosbaar en hebben een belangrijke structurele rol in organismen ter versteviging en bescherming. Er zijn drie groepen fibreuze eiwitten:

Keratine: komt voor in haar, vinger- en teennagels en de veren van vogels.

Collagenen: dit zijn de meest voorkomende proteïnen in gewervelde organismen. Het komt vooral voor in verbindingsweefsels zoals kraakbeen. Het heeft als structuur een driedubbele helix. (Zie praktische proef)

Elastine: dit zijn elastische eiwitten die ervoor zorgen dat verschillende weefsels in het lichaam opnieuw hun oorspronkelijke vorm kunnen aannnemen na uitrekken of samentrekken. Elastine helpt de huid terugkeren naar zijn positie nadat het gepord of geknepen is.

15

Denaturatie

Wanneer de natuurlijke omgeving van een eiwit sterk verandert, b.v. door een pH-verandering, een temperatuursverandering, of het toevoegen van andere stoffen, kan de tertiaire structuur ( en soms ook de secundaire structuur ) afgebroken worden, waardoor het eiwit zijn vorm en daardoor ook zijn functie verliest. Dit is een onomkeerbaar proces. Dit komt omdat deze structuren fragiel zijn en snel uit elkaar vallen onder niet-optimale omstandigheden, waarbij ionbindingen en waterstofbruggen verbroken worden. Zoute (teveel Na+ -en Cl--ionen), zure (teveel H+-ionen) en basische (te weinig H+-ionen) omgevingen breken ionbindingen en waterstofbroggen die interfereren met hun elektrische ladingen. Hitte zorgt voor een toenemende beweging binnenin de moleculen, waardoor de relatief zwakke bindingen verstoort worden (zie ruimtelijke structuur: zwavelbruggen). Eens gedenatureerd, nemen de meeste proteïnen hun oorspronkelijke structuur niet meer terug aan.

Indeling en naamgeving

Over het algemeen wordt een enzym benoemd door de uitgang –ase toe te voegen aan de stam van de stof waarop het werkt. Bijvoorbeeld, ‘lipase’ is een enzym dat vetten (lipiden) afbreekt. Uitzonderingen hierop zijn meestal enzymen die ontdekt zijn voor dat deze regel werd toegepast, bijvoorbeeld pepsine, trypsine en chymotrypsine (zie spijsvertering).

Het Enzym-Commissienummer of EC-nummer is een numeriek classificatiesysteem voor enzymen, gebaseerd op de reacties die ze katalyseren. Als nomenclatuursysteem voor enzymen wordt aan elk EC nummer een voorgestelde naam toegekend voor het betreffende enzym. Deze namen zijn iets gedetailleerder, bijvoorbeeld ‘urease’ wordt ‘urea amidohydrolase’. Aangezien de EC nummers niet duiden op enzymen maar op de reacties die ze katalyseren, krijgen twee verschillende enzymen die dezelfde reactie katalyseren (bijvoorbeeld uit verschillende organismen) hetzelfde EC nummer. Daarom hebben veel enzymen ook een triviale naam.

Een EC nummer bestaat uit vier getallen gescheiden door punten. Het eerste getal geeft weer tot welke hoofdgroep het behoort, de andere getallen geven telkens specifiekere informatie. Volgens de Internationale Enzym Commissie worden de reacties die door enzymen gekatalyseerd worden opgedeeld in zes grote groepen:

1. Oxidoreductasen 2. Transferasen

3. Hydrolasen

4. Lyasen

5. Isomerasen

6. Ligasen

Oxidoreductasen

16

Dit zijn enzymen die redoxreacties katalyseren, waarbij door elektronenoverdracht één atoom wordt gereduceerd en één geoxideerd. Ze hebben NAD+- of NADP+-ionen nodig als cofactor. Ze werken in op de CH-OH groep van het substraat (=reductor) met NAD+ of NADP+ als elektronenacceptor (=oxidator).

Transferasen

Een transferase is een enzym dat de overdracht van een functionele groep van de ene molecule (de donor) naar de andere (de acceptor) katalyseert. De donor is vaak een co-enzym.

EC 2.1 Overdracht van een koolstof-groep EC 2.2 Overdracht van een aldehyd- of keto-groep EC 2.3 Omvatten acyltransferasen EC 2.4 Omvatten glycosyltransferasen EC 2.5 Overdracht van een alkyl- of aryl-groep EC 2.6 Overdracht van stikstofbevattende groepen EC 2.7 Overdracht van fosfaatbevattende groepen (kinasen) EC 2.8 Overdracht van zwavelbevattende groepen EC 2.9 Overdracht van seleenbevattende groepen

Hydrolasen

Hydrolasen zijn enzymen die hydrolysereacties katalyseren. Ze breken enkelvoudige bindingen door er watermoleculen aan toe te voegen.

EC 3.1: esterbindingen (esterasen: nucleasen, fosfodiësterasen, lipase, fosfatase) EC 3.2: koolhydraten EC 3.3: etherbindingen

17

EC 3.4: peptidebindingen (proteasen/peptidasen) EC 3.5: koolstof-stikstofbindingen, andere dan peptidebindingen EC 3.6: zure anhydriden EC 3.7: koolstof-koolstofbindingen EC 3.8: halogenidebindingen EC 3.9: fosfor-stikstofbindingen EC 3.10: zwavel-stikstofbindingen EC 3.11: koolstof-fosforbindingen EC 3.12: zwavel-zwavelbindingen EC 3.13: koolstof-zwavelbindingen

Lyasen

Dit zijn enzymen die een dubbele binding vormen of verbreken. Ze doen dit door bepaalde functionele groepen over te zetten zoals water en aminogroepen.

EC 4.1 Omvat lyasen die koolstof-koolstof bindingen knippen, zoals de o decarboxylasen (EC 4.1.1),o aldehyde-lyasen (EC 4.1.2),o oxo-zuur-lyasen (EC 4.1.3) eno andere (EC 4.1.99)

EC 4.2 Omvat lyasen die koolstof-zuurstof bindingen knippen, zoals dehydratasen EC 4.3 Omvat lyasen die koolstof-stikstof bindingen knippen EC 4.4 Omvat lyasen die koolstof-zwavel bindingen knippen EC 4.5 Omvat lyasen die koolstof-halogenide bindingen knippen EC 4.6 Omvat lyasen die fosfaat-zuurstof bindingen knippen EC 4.99 Omvat andere lyasen

Isomerasen

Dit zijn enzymen die reacties katalyseren waardoor moleculen met functionele groepen, die in verschillende isomeren kunnen voorkomen, overgaan van het ene isomeer naar het andere.

18

EC 5.1 omvat isomerasen die racemisatie (razemasen) en epimerisatie (epimerasen) katalyseren

EC 5.2 omvat isomerasen die geometrische isomeren (cis-trans isomerasen) katalyseren

EC 5.3 omvat isomerasen die intramoleculaire oxidoreductasen katalyseren EC 5.4 omvat isomerasen die intramoleculaire transferasen (mutasen) katalyseren EC 5.5 omvat isomerasen die intramoleculaire lyasen katalyseren EC 5.99 omvat andere isomerasen

Ligasen

Ligasen zijn enzymen die twee moleculen aan elkaar hechten door een nieuwe chemische binding te vormen. Hierbij wordt een watergroep vrijgemaakt, het is dus de omgekeerde reactie als die gekatalyseerd door de hydrolasen. Meestal worden er eerst door hydrolyse kleinere groepen afgescheiden van de grote moleculen voordat deze aan elkaar gebonden worden. Ze halen hiervoor energie uit een ATP-molecule (of een ander nucleotide trifosfaat) en hebben NAD+ nodig als cofactor.

Een synoniem voor ligase is synthetase, maar een syntase is eender welk enzym dat een synthese katalyseert, ongeacht of ze nucleotide trifosfaten gebruiken of niet.

EC 6.1: Binding tussen koolstof en zuurstof EC 6.2: Binding tussen koolstof en zwavel EC 6.3: Binding tussen koolstof en stikstof EC 6.4: Binding tussen twee koolstofatomen EC 6.5: Vorming van een fosfaatester EC 6.6 : Vorming van een stikstof-metaalatoom-binding

19

DNA-ligase

Ribozymen

Niet alle enzymen bestaan uit proteïnen. Sommige RNA moleculen kunnen functioneren als enzymen, en dus veranderingen in de structuur van substraten (meestal ook RNA moleculen) katalyseren. Deze katalytische RNA moleculen worden ribozymen genoemd.

Ondanks dat de meeste ribozymen erg zeldzaam zijn in de cel, zijn hun rollen soms essentieel. Het belangrijkste ribozym is het ribosomaal RNA, het functionele deel van de ribosomen, de organellen die de translatie van RNA naar proteïne uitvoeren. Omdat r-RNA zowel de eigenschappen heeft van DNA (replicatie en de mogelijkheid om informatie te coderen), als van enzymen (katalysatie), wordt het beschouwd als een belangrijke stap in de evolutie van het DNA.

De meeste soorten van RNA, namelijk transport RNA (t-RNA), ribosomaal RNA (r-RNA) en messenger RNA (m-RNA), worden eerst aangemaakt als ‘voorlopers’ die groter zijn dan het eindproduct. Ze bevatten vaak “hoofd” (5’) en “staart” (3’) sequenties, en intronen. Deze moeten verwijderd worden om het eindproduct te bekomen.

Alle levende organismen synthetiseren bijvoorbeeld een enzym genaamd Ribonuclease P, dat het 5’-deeltje van de voorloper van de t-RNA molecule afsplitst. In bacteriën is Ribonuclease P een heterodimeer (molecule gevormd door binding van twee verschillende monomeren), bestaande uit een RNA en een proteïne deel. Als de twee gescheiden worden, behoudt het RNA-deeltje zijn werking om de splitsingsstap te katalyseren (hoewel minder effectief dan bij het intacte dimeer), het proteïne deeltje kan dit niet.

20

Een ‘hammerhead’-ribozym

III. Werking van enzymen

Actieve Site en Specificiteit

Het basismechanisme waarmee enzymen chemische reacties katalyseren begint bij het binden van het substraat met de actieve site op het enzym. De actieve plaats is de regio op het enzym die in contact komt met het substraat en hiermee reageert. Het binden van het substraat aan het enzym zorgt voor veranderingen in de elektronenverdeling in de chemische bindingen van het substraat, en zet zodanig de reacties in gang die leiden tot de vorming van de reactie-producten. De reactieproducten worden vervolgens losgemaakt van het enzymoppervlak, waardoor het enzym de volgende reactie kan katalyseren.

De actieve site heeft, door de complexiteit van de primaire, secundaire en tertiaire structuren van het enzym, een unieke geometrische vorm. De actieve site is meestal een holte of kloof, omgeven door aminozuur of andere zijketens die functionele groepen bevatten die verantwoordelijk zijn voor eigenschappen zoals lading, hydrofobie of –filie en sterische hindering. Deze vorm, tezamen met de aanwezige functionele groepen is complementair met de geometrische vorm van een bepaald substraat, waardoor de specificiteit van enzymen ontstaat. Enzymen zijn heel specifiek, en katalyseren slechts één of enkele reacties.

Er wordt een onderscheid gemaakt tussen vier soorten specificiteit:

Absolute specificiteit: het enzym katalyseert slechts één reactie. Groepsspecificiteit: het enzym zal enkel inwerken op moleculen die een specifieke

functionele groep hebben, zoals amino-, fosfaat-, of methylgroepen. Bindingsspecificiteit: het enzym zal enkel inwerken op een bepaalde soort van

chemische binding, ongeacht de rest van de moleculaire structuur. Stereochemische specificiteit: het enzym zal enkel inwerken op een bepaald sterisch of

chiraal isomeer.

Vroeger werd het Lock and Key-model gebruikt om dit voor te stellen. Het stelt dat een bepaald substr aat geometrisch perfect past in de actieve site van het enzym en er verder geen aanpassing nodig is, maar dit is simplistisch voorgesteld. Een uitbreiding van het Lock and Key-model is het Induced Fit-model, dat stelt dat de actieve site flexibeler is en door middel van de residuen zorgt dat het juiste substraat gelokaliseerd wordt, waarna bij de binding veranderingen in de structuur kunnen voorkomen.

21

Substraten binden aan de actieve site van het enzym door middel van waterstofbruggen, hydrofobische interacties, vanderwaalskrachten, of een combinatie van al deze, en vormen zo het enzym-substraatcomplex. De functionele groepen rond de actieve site fungeren als donors en acceptors van protonen of andere groepen op het substraat om de reactie te vergemakkelijken, door het verlagen van de activatie energie van de reactie. De ontstane reactieproducten zijn meestal onstabiel in de actieve site door sterische hindering, die ervoor zorgt dat de reactieproducten vrijgemaakt worden van het enzym waardoor het terugkeert naar zijn oorspronkelijke, ongebonden vorm.

De actieve site maakt slechts een klein deel uit van het volume van het enzym, en daardoor komt slechts een fractie van de residuen op de peptidenketen in contact met het substraat. De onderdelen waaruit de actieve site bestaat liggen vaak niet dicht bij elkaar in de primaire structuur van het enzym, maar de tertiaire plooiingen brengen hen bij elkaar in de driedimensionale ruimte. Vaak zijn bij de actieve site ook onderdelen betrokken die voorkomen op de verbindende structuren tussen de secundaire helices en vlakken in plaats van op deze structuren zelf, en in veel gevallen komt de actieve site voor op de verbinding tussen twee domeinen die tertiair contact maken.

Activiteit

De efficiëntie van de werking van een enzym varieert met de omstandigheden. Deze hangen af van het milieu binnen en buiten de cel, waarin factoren als temperatuur, pH, en de concentraties van verscheidene stoffen verschillend kunnen zijn van plaats tot plaats en kunnen veranderen. Op deze manier kunnen de enzymen die werkzaam zijn in een cel hoogst gereguleerd functioneren. De volgende factoren hebben invloed op de activiteit van een enzym:

Temperatuur

De snelheid van een reactie die gekatalyseerd wordt door enzymen neemt toe met de temperatuur. Dit gaat door tot het enzym zijn optimale temperatuur bereikt heeft, nadien gaat de activiteit omlaag door denaturatie. Een temperatuursstijging van 10 graden kan leiden tot een toename in activiteit van een enzym van 50 tot 100%. Dit

22

Een actieve site bestaande uit verschillende onderdelen

komt omdat een temperatuursstijging in een systeem het gevolg is van een toename aan kinetische energie in dat systeem. Dit heeft verschillende effecten op de snelheid van een reactie:

- Meer energetische botsingen- Meer botsingen per tijdseenheid

- Stijging van de enthalpie

pH

Ook veranderingen in de pH van de omgeving hebben een invloed op de werking van enzymen. Elk enzym heeft een optimum-pH, die veel kan verschillen van enzym tot enzym (zie tabel). Een extreem hoge of lage pH zorgt meestal voor een compleet verlies aan activiteit. De pH speelt ook een rol in de stabiliteit van enzymen, net zoals bij de activiteit heeft elk enzym een pH waarbij het een optimale stabiliteit heeft.

Enzym- en substraatconcentratie

Hoe meer enzymen er aanwezig zijn, hoe meer substraatmoleculen er tegelijk verwerkt kunnen worden, en hoe sneller de reactie dus gaat. Hoe meer substraatmoleculen er aanwezig zijn, hoe sneller er complexen gevormd kunnen worden tussen enzym en substraat. Op een bepaald moment, als alle enzymen in een complex zitten, heeft het toevoegen van substraatmoleculen geen verhoging van activiteit meer tot gevolg. Ook de concentratie van de cofactoren van een enzym heeft een invloed. De eerste figuur toont dat de reactiesnelheid toeneemt met de concentratie van het enzym, en de tweede figuuur toont dat de reactiesnelheid toeneemt met de concentratie van het substraat, tot een maximum.

23

Regulatie

Om de goede werking van enzymen te verzekeren worden ze door het lichaam gecontroleerd, en kan hun werking soms verhoogd of verlaagd worden en zelfs compleet uitgeschakeld. Er zijn enkele belangrijke manieren waarop dit gebeurd.

1. De enzymproductie (de transcriptie en translatie van de genen) kan door de cel verhoogd of verlaagd worden als reactie op veranderingen in de omgeving van de cel. Dit is een vorm van genregulatie, en gebeurd dus op het niveau van het DNA.

2. Enzymen kunnen gecompartimentaliseerd zijn in een bepaald deel van de cel, zodat op verschillende plaatsen verschillende reacties kunnen doorgaan. Bijvoorbeeld, vetzuren worden door één set van enzymen aangemaakt in het cytosol, endoplasmatisch reticulum en golgi apparaat, en worden door een andere set enzymen afgebroken in de mitochondriën als energiebron.

3. Enzymen kunnen gereguleerd worden door inhibitors en activators. Inhibitors verlagen of stoppen de activiteit van enzym door zich eraan te binden. Inhibitors die aan de actieve site binden om zo de binding van substraatmoleculen te verhinderen noemt men competitieve inhibitors, de rest zijn niet-competitieve inhibitors. Een activator is een stof die bij binding met een enzym zijn activiteit verhoogt. Niet-competitieve inhibitors worden, samen met activators, effectors genoemd. Deze beïnvloeden de werking van het enzym door middel van allosterische regulatie. Dit betekent dat de effectors binden op een plaats die niet de actieve site is, een allosterische site.

24

De eindproducten van een reactiepad of metabole pathway (een reeks van reacties gekatalyseerd door enzymen) zijn vaak inhibitors voor de enzymen die de eerste reactie van de pathway katalyseren. Dit noemt men een negatieve feedback, omdat de hoeveelheid van een eindproduct dat aangemaakt wordt gereguleerd wordt door zijn eigen concentratie. Hierdoor kunnen producten aangemaakt worden op behoefte van de cel, en worden er geen overtollige stoffen aangemaakt, wat zorgt voor een stabiele interne omgeving in de cel.

4. Enzymen kunnen ook gereguleerd worden door posttranslationele modificatie. Dit betekend dat er na de synthese van het enzym een verandering wordt aangebracht. Vaak is dit de laatste stap die nodig is om het enzym actief te maken, en gebeurt enkel wanneer het enzym nodig is. Dit kan door toevoeging van een functionele groep die onontbeerlijk is voor de werking van het enzym, of door afsplitsing van een overbodig stuk peptidenketen die ervoor zorgt dat het enzym nog niet actief is. Een voorbeeld van dit laatste is de activatie van trypsinogeen (zie spijsvertering).

5. Sommige enzymen worden geactiveerd als ze in een ander milieu terechtkomen, bijvoorbeeld van hoge naar lage pH, of van een reducerende naar een oxiderende omgeving. Hierdoor verandert hun structuur. Een voorbeeld hiervan is de activatie van pepsinogeen (zie spijsvertering).

Cofactoren

Veel enzymen hebben de aanwezigheid van andere stoffen - cofactoren - nodig om te kunnen functioneren. Wanneer de cofactor een organische stof is, wordt het een co-enzym genoemd. Het inactieve enzym zonder de cofactor noemt men het apo-enzym, en het actieve complex van apo-enzym en cofactor is het holo-enzym.

25

Co-enzymen zijn relatief kleine moleculen in vergelijking met het apo-enzym. Veel van deze co-enzymen zijn afkomstig van vitaminen, en ze maken altijd een deel uit van de actieve site. Wanneer het co-enzym sterk gebonden is aan het apo-enzym noemt men het eerder een prothetische groep*

Niet-organische cofactoren zijn meestal metaalionen. Deze zijn bijvoorbeeld: K+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, en Mo3+. Enzymen met metaalionen als cofactor noemt men metallo-enzymen. Vaak is de cofactor samengesteld uit een organisch en een inorganisch deel.

*Noot: de bronnen spreken elkaar tegen over het verschil in betekenis tussen cofactoren, co-enzymen en prothetische groepen.

IV. Functies in het menselijk lichaam

Spijsverteringsenzymen

De belangrijkste enzymen in het menselijk lichaam zijn de enzymen die deel uitmaken van de spijsvertering. Zij zorgen voor de afbraak van de voedingsstoffen zodat deze kunnen opgenomen worden door het lichaam.

Speeksel

Het speeksel, afgescheiden door de speekselklieren in de mond, bevat een α-amylase. Amylases zijn enzymen die koolhydraten afbreken, het specifieke enzym dat voorkomt in het speeksel is ptyaline. Het is verantwoordelijk voor de afbraak van grote zetmeelketens tot maltose en dextrines, kortere en oplosbare zetmeelketens. (amylodextrine, erythrodextrine en achrodextrine) . Hierdoor krijgt voedsel dat weinig suiker bevat maar veel zetmeel, zoals rijst en aardappelen, een lichte zoete smaak tijdens de afbraak in de mond. Ptyaline wordt in de maag gedeactiveerd door het maagzuur. Het heeft calciumionen nodig als co-factoren, zonder deze is het compleet inactief.

26

Ptyaline

Amylase was onder de naam diastase het eerste enzym dat ooit ontdekt is, en werd gevonden in mout.

Maag

De sappen afgescheiden door de maag bevatten pepsinogeen, de inactieve vorm van het enzym pepsine. Pepsine is één van de drie enzymen verantwoordelijk voor de afbraak van eiwitten in de spijsvertering, samen met trypsine en chymotrypsine. Pepsinogeen wordt geactiveerd in zure milieus. Dit gebeurt wanneer de maag de aanwezigheid van peptiden waarneemt en maagsap afscheidt, dat naast pepsinogeen ook waterstofchloride bevat, dat pepsinogeen activeert. Pepsine was het eerste ontdekte dierlijk enzym.

Pancreas

Enzymen die door de pancreas worden aangemaakt zorgen voor de vertering van suikers (door amylase), vetten (door lipase) en eiwitten (door trypsine en chymotrypsine). Ze worden door de pancreas afgescheiden en komen via een afvoerbuis bij de zogenaamde Papil van Vater in de twaalfvingerige darm terecht. Trypsine en chymotrypsine worden, net zoals pepsine, aangemaakt in een inactieve vorm (trypsinogeen en chymotrypsinogeen). Trypsinogeen wordt geactiveerd door enteropeptidase, dat wordt geproduceerd in de wanden van de twaalfvingerige darm. Trypsine activeert op zijn beurt chymotrypsinogeen tot chymotrypsine.

Dunne darm

De dunne darm scheidt naast enteropeptidase ook maltase, lactase, sacharase en peptidase af. De eerste drie breken respectievelijk maltose, lactose en sacharose af, peptidasen breken de di- en tripeptiden, die door trypsine zijn gemaakt, af tot aminozuren.

Voedingsenzymen

Een belangrijk deel van de vertering wordt gedaan door enzymen afkomstig uit het voedsel zelf. Zowel plantaardig als dierlijk voedsel bevat deze enzymen. De plantaardige enzymen zijn stabiel zelfs in de zure omgeving van de maag, en helpen daar bij de afbraak samen met de enzymen aangemaakt door de maag en de mechanische contractie van de maag. Vanaf het moment dat het voedsel in de darmen terecht komt, beginnen ook opgenomen dierlijke enzymen te werken.

Bij gekookt voedsel daarentegen zijn alle enzymen gedenatureerd. Dit heeft tot gevolg dat ze niet kunnen helpen bij de afbraak, waardoor de lichaamseigen enzymen meer werk moeten

27

Trypsine

Pepsine

Maltase

verrichten. Daarom wordt beweerd dat het eten van rauw voedsel vaak gezonder is dan het eten van gekookt voedsel.

Metabolische enzymen

Dit is de tweede grote groep van enzymen die belangrijk zijn in het menselijk lichaam. Metabolische enzymen hebben een verscheidenheid aan functies in het lichaam. In het algemeen spelen ze een belangrijke rol in de reproductie en de vernieuwing van cellen in onze vitale organen, maar ze ondersteunen ook andere lichaamsfuncties.

De pancreas is het belangrijkste orgaan dat metabolische enzymen aanmaakt en ze verspreidt in het lichaam. Deze enzymen zorgen (samen met die van de lever) voor de verwijdering van toxische stoffen uit het lichaam, helpen met het produceren van energie en verzekeren de correcte werking van alle organen. Een van hun belangrijkste functies vindt plaats in het bloed. De enzymen in het bloed verwerken de vijfenveertig nutriënten afkomstig van de voeding, waarna het lichaam hieruit nieuwe cellen opbouwt die nodig zijn voor de productie van spier-, zenuw-, bot-, bloed- en longcellen. Zo zorgen ze ervoor dat cellen vernieuwd worden. Dit doen ze ook door het lichaam te helpen zuurstof naar de cellen te transporteren. Er is geen enkele cel in het menselijk lichaam dat niet afhankelijk is van metabolische enzymen.

Een gebrek aan metabolische enzymen is een belangrijke factor in het verouderingsproces. In de pancreas van oudere personen kunnen minder enzymen worden aangemaakt. Aangezien spijsverteringsenzymen de hoogste prioriteit hebben voor het lichaam en in grote hoeveelheden nodig zijn, zal de pancreas die enzymen in dezelfde hoeveelheden blijven aanmaken ten nadele van de metabolische enzymen. Dit geldt niet enkel voor de pancreas, maar voor het hele lichaam en leidt tot een slechtere gezondheid. Het veroorzaakt de rimpels, botverlies en andere aandoeningen die komen met ouderdom. Veel mensen keren zich daarom tot voedingssuplementen die deze enzymen bevatten, maar dit gebeurd best enkel op advies van een arts.Andere functies in het lichaam

Spiercontractie

Om de spieren te laten werken is een enorme hoeveelheid ATP nodig. Deze wordt op het moment dat er nood aan is vrijgemaakt door enzymen in drie fasen.

In eerste instantie wordt creatine fosfaat, een hoog energetische molecule, omgezet in ATP door het enzym creatine kinase. De reserves aan creatine fosfaat in de spieren zijn opgebruikt in enkele seconden.

CP + ADP ATP + Creatine

Daarna worden fosforylasen gebruikt om glycogeen af te breken tot glucose, die omgezet wordt in ATP. Als de reserves aan glycogeen op zijn wordt overgeschakeld op de afbraak van vetzuren en aminozuren.

28

Signaaltransductie

Signaaltransductie is het doorgeven van signalen binnen een cel. Deze signalen kunnen worden doorgegeven via eiwitten. Er bestaan lange ‘paden’ van eiwitten tussen plaatsen in de cel, waarlangs een signaal kan worden doorgegeven. Dit gebeurd door een eiwit te activeren door bijvoorbeeld een fosfaat-groep op een bepaalde positie aan te hechten (fosforylering door een kinase), waarna een volgende reactie plaatsvindt en er uiteindelijk een keten van reacties ontstaat, allen gekatalyseerd door enzymen. Op die manier kan een signaal door de cel geleid worden naar de plek waar dat nodig is, waarna de cel een actie kan ondernemen, bijvoorbeeld beweging, afsterven, starten met deling, enz.

Veel ziektes zijn het gevolg van een fout bij de signaaltransductie, bijvoorbeeld diabetes, hartziekten, autoimmuniteit en kanker.

Actief transport

Veel stoffen moeten getransporteerd worden naar binnen of buiten de cel. Soms moet de concentratie van een bepaalde stof in een cel anders zijn dan die in zijn omgeving, wat tegengewerkt wordt door diffusie. Daarom voert de cel actief transport uit.

In het cytosol van dierlijke cellen is de concentratie aan kaliumionen (K+) tot twintig keer hoger dan die in de vloeistof die de cel omgeeft. Omgekeerd bevat deze extracellulaire vloeistof een concentratie aan natriumionen (Na+) tot tien keer groter dan dan die binnen de cel. Deze verhoudingen worden in stand gehouden door actief transport van beide ionen. Beide ionen worden getransporteerd door één enzym, de Na+/K+ ATPase. Het hydroliseert ATP om energie te verkrijgen, waarmee het drie Na+ ionen uit de cel kan transporteren voor elke twee K+ ionen die de cel binnen worden gepompt.

Het belang van dit enzym wordt aangetoond door het feit dat bijna een derde van alle energie die in dierlijke cellen in de mitochondriën wordt vastgelegd onder de vorm van ATP, gebruikt wordt om deze pomp te laten functioneren.

29

V. Toepassingen

Geïmmobiliseerde enzymen

Enzymen worden op veel manieren commercieel gebruikt, bijvoorbeeld in de wasmiddelen-, voedings- en brouwindustrie. Het probleem is dat deze enzymen na gebruik vaak moeilijk te recupereren zijn, omdat ze oplosbaar zijn in water of ze geïnhibiteerd worden door de reactieproducten. Daarom worden enzymen vaak geïmmobiliseerd door ze vast te hechten aan een andere stof. Dit heeft enkele commerciële voordelen:

het enzym wordt gemakkelijker verwijdert uit het reactiemengsel een snelle verwijdering van het enzym uit het reactiemengsel vermindert inhibitie

de stabiliteit van het enzym wordt vergroot, waardoor het minder rap denatureert en er dus hogere temperaturen kunnen gebruikt worden

30

hogere temperaturen verhogen de reactiesnelheid

het enzym kan gefixeerd worden op kolommen in het reactiemengsel, waardoor het lange tijd bruikbaar is

Enkele methoden om enzymen te immobiliseren zijn:

covalente binding aan een vaste structuur adsorptie in een onoplosbare stof

opsluiting binnen een gel

incapsulatie achter een selectief permeabel membraan

Industriële productie

Vroeger werden enzymen die nodig waren in de industrie afgezonderd uit het organisme dat ze van nature aanmaakt. Voor de productie van kaas bijvoorbeeld, gebruikt men chymosine, een enzym dat door veel jonge dieren wordt aangemaakt om van de moedermelk een vaste stof te maken. Hierdoor blijft de melk (kaas) langer in het spijsverteringsstelsel van het dier, waardoor het meer voedingsstoffen kan opnemen. Men gebruikte het op grote schaal om kaas te produceren, maar de enzymen moesten afgezonderd worden uit de magen van jonge (geslachte) kalven.

Tegenwoordig kan men enzymen op grote schaal produceren door ze te laten aanmaken door micro-organismen. Gisten, schimmels en bacteriën maken enzymen aan, en kunnen makkelijk gekweekt worden. Dit gebeurt in fermentoren, grote gesloten tanks die alle voedingsstoffen nodig voor de groei van de micro-organismen bevatten onder optimale groeiomstandigheden. Na enkele dagen isoleert men de enzymen en doodt men de resterende micro-organismen.

Om een enzym door micro-organismen te laten aanmaken wordt er gebruik gemaakt van genetische manipulatie. De genen nodig om het juiste enzym aan te maken worden aan de genetische informatie van het micro-organisme toegevoegd door recombinant DNA-technologie. Zo kan men elk gewenst enzym op industriële schaal aanmaken.

Restrictie-enzymen

Restrictie-enzymen of nucleasen zijn enzymen die DNA-strengen splitsen op specifieke herkenningsplaatsen. Ze komen voor in bacteriën en archaea, en zijn vermoedelijk ontstaan als verdedigingsmechanisme tegen binnendringende virussen. In de bacteriële cel knippen deze enzymen selectief het vreemd DNA in een proces genaamd restrictie. Het eigen DNA van het organisme wordt hiertegen beschermd door methylering, een wijziging die aangebracht wordt door een methylase enzym. De methylgroepen blokkeren de binding van

31

de resctrictie-enzymen, maar hebben geen invloed op de normale replicatie en transscriptie van het DNA. Op deze manier maken restrictie-enzymen een onderscheid tussen eigen en vreemd DNA.

De naam restrictie-enzym is afkomstig van het feit dat enkel de bacteriofagen (virussen die bacteriën als doelwit hebben) afkomstig van enzymen van dezelfde stam zich kunnen reproduceren binnen een bacterie. Elke bacteriestam heeft één of meerdere restrictie-enzymen die een specifieke herkenningsplaats gebruiken, en een methylase die juist die plaats beschermd. De enzymen zorgen dus voor een restrictie op infecties van bacteriofagen.

Elk restrictie-enzym herkent een specifieke sequentie DNA. Er zijn drie types:

Type I knipt het DNA op een willekeurige plaats ver van de herkenningsplaats. Type II knipt het DNA binnen de herkenningsplaats. Type III knipt het DNA ongeveer 20 tot 25 baseparen van de herkenningsplaats

verwijderd.

Sommige nucleasen knippen aan beide zijden van de keten tussen de twee nucleotiden van overeenkomstige baseparen en laten zogenaamde ‘blunt ends’ achter, andere knippen tussen twee paar nucleotiden die een paar baseparen van elkaar verwijderd zijn en laten ‘sticky ends’ achter. Sticky ends kunnen nadien gemakkelijker terug aan elkaar verbonden worden.

Restrictie-enzymen die knippen midden in de DNA-keten worden endonucleasen genoemd, degene die knippen aan de uiteinden van de ketens worden exonucleasen genoemd. Enkel de endonucleasen zijn echter interessant voor de moleculaire biologie.

Toepassingen in de moleculaire biologie

Restrictie-endonucleasen zijn enorm belangrijk voor de wetenschap, omdat ze toelaten om te knippen en te plakken in het DNA, waardoor men allelen kan afzonderen, de expressie van eiwitten kan onderzoeken, slechte stukken kan verwijderen uit het DNA en nieuwe genen kan toevoegen. Het enzym dat men gebruikt om twee DNA-strengen opnieuw met elkaar te verbinden is DNA-ligase. Na de ontdekking van deze enzymen lag de weg naar de genetische modificatie open.

In de afbeelding is het restrictie-enzym EcoRV, afkomstig uit de bacterie Escherichia coli, weergegeven rond een kort stukje DNA-helix. Het bovenste deel toont de molecule voor de splitsing, met de fosfaatgroep waar geknipt zal worden, het onderste deel toont de molecule na de splitsing, waar een extra zuurstofatoom is toegevoegd afkomstig van H2O, dicht bij de fosfaatgroep maar er niet aan gebonden.

32

Wasproducten

Het gebruik van enzymen in wasmiddelen is weid verspreid in ontwikkelde landen, en men schat dat meer dan de helft van alle beschikbare producten enzymen bevatten. Hierdoor is de Wasmiddelenindustrie de grootste afzetmarkt ter wereld voor enzymen, en maakt tot 30% uit van de totale verkoop.

Vuil komt voor onder vele vormen, en bevat onder andere eiwitten, zetmeel en vetten. Het meeste vuil kan verwijdert worden door de kleren te wassen op hoge temperaturen en met krachtige bewegingen in de machine, maar de kosten om het water op te warmen zijn hoog en door lang mixen of slaan van de kleren

33

zal de kwaliteit rapper achteruitgaan. Door enzymen te gebruiken kan er gewassen worden op lagere temperaturen en kortere periodes van agitatie.

Proteasen en amylasen zijn de enzymen die het meest gebruikt worden, maar er zijn tegenwoordig ook lipasen bekend die geschikt zijn voor het gebruik in wasmiddelen.

Wasmiddelen met proteasen kunnen vlekken bestaande uit bloed, melk, zweet, gras, enz. gemakkelijk verwijderen, terwijl wasmiddelen zonder proteasen vaak permanente vlekken achterlaten door de proteïnen te denatureren en te oxideren. Met moderne bleekmiddelen is het verschil tussen schoon zijn en schoon lijken niet altijd zichtbaar. De proteasen breken de eiwitten af tot kortere, beter oplosbare ketens die door de andere wasproducten gemakkelijker verwijderd kunnen worden.

Amylasen worden gebruikt om restanten van zetmeel bevattende voeding te verwijderen, en wordt ook vaak gebruikt in afwasmiddelen voor vaatwas. Lipasen breken vetten af, de stoffen die altijd al het moeilijkst te verwijderen waren uit kleding, zeker op lage temperaturen. Wasproducten zonder enzymen hebben vooral moeite met het verwijderen van vetten van kleding bestaande uit een mengeling van katoen en polyester.

De ontwikkeling van enzymen voor wasproducten focust vooral op het verwijderen van vlekken, maar ook cellulasen hebben handige eigenschappen voor het onderhouden van kleren. Een cellulase enzym kan de structuur van cellulosedraden, in kleren uit katoen of een mengeling met katoen, veranderen. Kleren uit katoen kunnen na enkele wasbeurten schijnbaar hun kleur verliezen, en ze zien er pluizig uit. Dit komt omdat er microfibrillen ontstaan die zich gedeeltelijk afsplitsen van de katoendraden. Hierdoor wordt het licht dat op de kleren valt meer teruggekaatst, wat de indruk geeft dat de kleuren doffer zijn. Deze kleine draadjes kunnen echter door cellulasen afgebroken worden, waardoor de kleding zijn oorspronkelijke kleur terugkrijgt. De kleren worden ook zachter door de verwijdering van de microfibrillen, en vuil dat opgesloten zat tussen deze draadjes kan terug verwijdert worden.

Om hypergevoeligheid bij de gebruikers te voorkomen, worden de enzymen tegenwoordig bevat in kleine granulen van ongeveer een halve millimeter in diameter die geen stof kunnen vrijgeven en die oplossen in water, waardoor de enzymen ook beschermd worden tegen beschadiging van andere stoffen in het wasmiddel tijdens de opslag. De gebruikte enzymen moeten bestemd zijn tegen een grote verscheidenheid van negatieve omstandigheden in de wasmachine zoals schommelende pH niveaus, de aanwezigheid van andere afbraakproducten en bestanddelen van waspoeder en temperaturen tot 60°C.

Overige toepassingen

Papierindustrie

In de papierindustrie maakt men gebruik van laccases, enzymen die van nature voorkomen in houtzwammen. Laccases breken lignine af, een stof die voorkomt in de houtpulp waaruit papier gemaakt worden. Lignine geeft een bruine kleur aan het papier, maar door het gebruik van laccases verkrijgt men het gewenste wit papier, zonder nood aan chloorbevattende bleekmiddelen.

34

Brood

Brood rijst door de omzetting van suikers tot CO2 door gist. Bloem bevat echter weinig korte suikerketens, maar voornamelijk lange zetmeelketens. Daarom wordt amylase toegevoegd die het zetmeel omzet in suikers, die de gisten kunnen omzetten.

Ook wordt vaak xylanase toegevoegd om andere lange suikerketens, afkomstig uit de buitenhuid van graankorrels, af te breken waardoor het brood makkelijker rijst.

Bier brouwen

Net zoals bij de gisting van brood gebruikt men bij de gisting van bier amylasen, om zetmeel uit graan om te zetten tot suikers. Ook voegt men proteasen toe die overblijvende eiwitten uit gist afbreken, waardoor het bier helderder wordt en makkelijker gefilterd kan worden.

Fruitsap

Bij het persen van fruit verkrijgt men meer sap wanneer er pectinase wordt toegevoegd om pectine, een kleefstof tussen de celwanden van plantaardige cellen, af te breken. Een ander pectinase en amylase breken daarna de restanten van pectine en zetmeel af.

Bio-brandstof

Uit gewassen met veel suiker of zetmeel wordt bio-ethanol gewonnen, een van de meest geproduceerde biobrandstoffen. Amylasen zetten het zetmeel om tot suikers, die kunnen worden gefermenteerd tot ethanol. Na een paar verwerkingsstappen kan de ethanol als brandstof worden gebuikt.

Voeding

Veel voedsel wordt in kleine mate voorverteerd door enzymen. Dit geeft het een betere smaak en kan de houdbaarheid vergroten. Enzymen die gebruikt worden zijn bijvoorbeeld trypsine, papaïne en cellulase.

Lensvloeistof

Onderhoudsvloeistof voor lenzen bevat vaak een van de enzymen papaïne, pancreatine of subtiline, die het vuil afbreken waardoor de lens opnieuw schoon is voor gebruik.

VI. Praktische Proef: Afbraak van Gelatine door Proteasen

Doel:

Onderzoeken welke fruitsoorten de enzymgroep proteasen bevatten, en de invloed van denaturatie op deze enzymen bestuderen.

35

Principe:

Gelatine is een eiwit dat bereidt wordt door middel van gedeeltelijke hydrolyse van collageen, een eiwit dat voorkomt in de bindweefsels van zoogdieren, bijvoorbeeld de huid, de botten en het kraakbeen. Door hydrolyse wordt de lange ketenstructuur van collageen afgebroken tot kortere peptidenketens.

Door zijn specifieke aminozuursamenstelling (elk derde aminozuur is glycine, de rest bestaat voornamelijk uit hydroxyproline en proline) komt collageen voor als driedubbele helix. Deze structuur wordt in stand gehouden door waterstofbruggen tussen de aminozuren aan de binnenkant van de helix.

Als aan de gelatine heet water wordt toegevoegd, zullen de waterstofbruggen verbroken worden en bevinden de peptidenketens zich los van elkaar in de gelatineoplossing. Wanneer de oplossing afkoelt worden de waterstofbruggen opnieuw gevormd, maar de drievoudige helix structuur kan zich niet meer perfect vormen. Er ontstaat een groot netwerk van aan elkaar gebonden peptidenketens, met daartussen holten waarin water wordt vastgehouden. Hierdoor ontstaat een vaste gel.

Sommige fruitsoorten bevatten van nature proteasen, enzymen die proteïnen splitsen door middel van hydrolyse. Wanneer deze inwerken op de peptidenketens van gelatine, worden deze verder afgebroken tot aminozuren of zeer korte peptidenketens, die minder of niet meer in staat zijn om een gel te vormen.

Door het sap van enkele vruchtensoorten toe te voegen aan gelatineoplossing, onderzoeken we welke van deze vruchten proteasen bevatten. Als het sap proteasen bevat, zal het ervoor zorgen dat de gelatineoplossing trager of helemaal niet stolt.

We onderzoeken ook het effect van denaturatie op de werking van de proteasen, door de vruchten te verhitten en de gelatineproef te herhalen met het sap van de gekookte vrucht. We bekijken ook geconserveerde vruchten om na te gaan of er denaturatie heeft plaatsgevonden.

1) Verse vruchten

Werkwijze:

We onderzoeken het sap van de volgende vruchtensoorten: kiwi, mango, vijg, ananas, appel en sinaasappel, en ook van gemberwortel.

36

We persen het sap uit de vruchten, filteren het zo dun mogelijk en vangen het op in een reageerbuis. Ondertussen maken we een gelatineoplossing door gelatinepoeder toe te voegen aan heet water.

We brengen in elke reageerbuis 5 milliliter gelatineoplossing, en voegen hierbij 0,5 milliliter vruchtensap. We maken ook een reageerbuis waar we niets aan toevoegen, en één waar we 0,5 milliliter water aan toevoegen. We brengen de reageerbuizen vervolgens in een warmwaterbad van ongeveer 37°C. We laten de enzymen inwerken gedurende 15 minuten, en plaatsen de reageerbuizen vervolgens in de koelkast. Nu meten we hoe lang het duurt tot de gelatineoplossing eventueel stolt.

37

Metingen:

Waarneming:

Na de blanco oplossing stollen eerst appel en sinaasappel, even later stollen ook de mango en het water. Enkele minuten later stolt ook de reageerbuis met vijgensap. De reageerbuizen met kiwi, gemberwortel en ananas stollen niet.

Besluiten:

Appels en sinaasappels bevatten geen proteasen. Mango’s bevatten misschien proteasen, vijgen bevatten een kleine hoeveelheid proteasen, en kiwi’s, gemberwortels en ananassen bevatten grote hoeveelheden proteasen. Het feit dat de controlebuis waar we water aan toevoegden later stolt dan die met vruchtensap zonder proteasen, kan verklaart worden

Naam Vrucht Tijd tot stollingBlanco 15,17 sSinaasappel 16,08 sAppel 16,23 sMango 17,18 sWater 18,03 sVijg 24,22 sKiwi Geen stollingGember Geen stollingAnanas Geen stolling

38

doordat de aanwezigheid van andere grote moleculen in het vruchtensap de coagulatie vergemakkelijkt. De blanco controlebuis stolt het snelst omdat de concentratie aan gelatine daar het hoogst is.

Extra meting:

Om te controleren of mango’s wel degelijk een kleine hoeveelheid proteasen bevatten herhalen we de proef, maar nu met een veel grotere hoeveelheid sap, en een langere inwerktijd in het warmwaterbad. Als ze proteasen bevatten, zou dat nu duidelijker tot uiting moeten komen.

Vorige meting Nieuwe meting17,18 s 26,40 s

Besluit:

Mango’s bevatten inderdaad een kleine hoeveelheid proteasen.

2) Gekookte vruchten

We herhalen de vorige proef, maar nu enkel met de vruchten die de stolling tegengingen of vertraagden: vijg, kiwi, gemberwortel en ananas. We koken deze vruchten, met uitzondering van ananas, waarvoor we geconserveerde ananas gebruiken.

Metingen:

Naam Vrucht Tijd tot stollingBlanco 13,51 sKiwi 14,47 sGember 14,51 sAnanas 14,53 sVijg 14,56 sWater 18,17 s

Waarnemingen:

Alle reageerbuizen met vruchtensap stollen op hetzelfde moment, tussen de blanco controlebuis en die met water.

39

Besluiten:

Bij het koken van de kiwi, gember en vijg zijn alle proteasen volledig gedenaturaliseerd, waardoor er geen stolling meer plaatsvindt. Ook de proteasen in ananas zijn tijdens het conserveringsproces volledig gedenaturaliseerd.

VI. Bronvermelding

Cursussen:

Biologie, K. GoubertChemie, Y. Buelens

40

Boeken:

Het ABC van het DNA: Mens en erfelijkheid. Peter Marynen en Siska Waelkens, Davidsfonds, Leuven

Sites:

http://www.bioplek.org/inhoudpracticum.htmlhttp://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/http://www.ebi.ac.uk/intenz/index.jsphttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/MACiE/http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer.htmlhttp://ull.chemistry.uakron.edu/genobc/Chapter_20/http://ull.chemistry.uakron.edu/genobc/periodic/http://www.kintek-corp.com/index.shtmlhttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2004/http://www.mapsenzymes.com/History_of_Enzymes.asphttp://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/E/Enzymes.htmlhttp://www.worthington-biochem.com/IntroBiochem/default.htmlhttp://www.rsc.org/education/teachers/learnnet/cfb/enzymes.htmhttp://www.chem4kids.com/files/bio_enzymes.htmlhttp://www.brenda-enzymes.org/http://www.wisegeek.com/what-are-enzymes.htmhttp://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/570enzymes.html http://www.biologyinmotion.com/minilec/wrench.htmlhttp://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/animation__how_enzymes_work.htmlhttp://www.bioplek.org/kaarten/kaartenenzymen.htmlhttp://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Ribozymes.htmlhttp://www.rsc.org/Publishing/eBooks/2007/9780854042531.asphttp://www.hhmi.org/news/ribozyme.htmlhttp://home.scarlet.be/~eb024464/Voeding/Eiwitten/aminozuren1.htmhttp://www.gymnasium-apeldoorn.nl/content/bestanden/eiwittendna_en_rna.pps?AdminoSessieId=762fad405f3776ba3128fe240be2d7behttp://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/course/index.htmlhttp://202.114.65.51/fzjx/wsw/website/mit/lm/proteins/aa/aminoacids.htmlhttp://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.htmlhttp://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Codons.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8811175#http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2978458 http://pubs.acs.org/cen/topstory/8021/8021notw1.htmlhttp://en.wikipedia.org/wiki/Ornithinehttp://www.statemaster.com/encyclopedia/Pyrrolysinehttp://www.worthington-biochem.com/IntroBiochem/factors.htmlhttp://www.lpscience.fatcow.com/jwanamaker/animations/Enzyme%20activity.htmlhttp://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/enz_and.htmhttp://www.chemeddl.org/collections/tsts/gellman/Gellmanpg9-12/Primary9to12.htmlhttp://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/571lockkey.htmlhttp://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/PrimaryStructure.htmlhttp://wiz2.pharm.wayne.edu/biochem/prot.htmlhttp://www.hcc.mnscu.edu/chem/V.27/index.html !!!!!http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS95/course/7_tertiary/glob_enz.htmlhttp://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section3/sheet.html !!!http://www.daviddarling.info/encyclopedia/F/fibprot.htmlhttp://www.peptideguide.com/solid-phase-peptide-synthesis.html !!!!http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS95/course/3_geometry/index.html http://www.articlealley.com/article_31524_23.html

41

http://www.anyvitamins.com/enzymes-info.htmhttp://hubpages.com/hub/Importance_of_Enzyme_in_the_Bodyhttp://www.healthynewage.com/eorder.htmlhttp://www.enzymestuff.com/digestion.htm#2http://www.wisegeek.com/what-are-metabolic-enzymes.htmhttp://www.housepetmagazine.com/four/Enzymes.htmhttp://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/restriction.phphttp://heartdisease.about.com/lw/Health-Medicine/Conditions-and-diseases/Cardiac-Enzymes-and-Heart-Attacks.htmhttp://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb8_1.htmlhttp://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RestrictionEnzymes.htmlhttp://www.restoreunity.org/enzymes_aging.htm http://beta.essortment.com/37124-health-topics-metabolic-enzymes-body.htmlhttp://findarticles.com/p/articles/mi_m0ISW/is_275/ai_n16675814/ !!!http://www.fasebj.org/cgi/content/full/16/7/653http://mcb.asm.org/cgi/content/abstract/9/8/3393http://uhaweb.hartford.edu/BUGL/immune.htmhttp://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/michael.gregory/files/bio%20102/bio%20102%20lectures/digestive%20system/digestive%20system.htmhttp://www.cliffsnotes.com/study_guide/Six-Types-of-Enzyme-Catalysts.topicArticleId-24998,articleId-24970.html http://www.biology-online.org/biology-forum/about472.htmlhttp://class.fst.ohio-state.edu/FST822/lectures/Denat.htmhttp://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/generalbiology/biochemistry/Enzymes/Classification/Classification.htm http://www.gezondheid.be/index.cfm?fuseaction=art&art_id=400http://www1.lsbu.ac.uk/biology/enztech/detergent.htmlhttp://enzymes.me.uk/enzyme/enzymes-in-industryhttp://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/http://www.chemieforum.nl/forumwww.kennislink.nl www.wikipedia.com

Tijdschriften:

www.exploremagazine.nlwww.nature.com

Andere publicaties:

Enzymen: In je lijf en in je leven, Vlaams Instituut voor Biotechnologie, inforeeks een kijk op biotechnologie, nr. 8

Assistenten:

Julie Florkin en Nicholas Kuppens

Software:

http://pymol.org/http://mcdermott.chem.columbia.edu/biophys/Lab_PDB_Visualization.html 4242424242424242

42