Faculteit bio-ingenieurswetenschappen

1ste bachelor bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2008-2009

Practicum BIOCHEMIE

Portfolio

Julie Merzougui, Lien Moreels, Heleen Olaerts, Louis PeeneReeks E - groep 3

Module 1: Enzymen en enzymkinetiek

Deze module handelt rond reacties onder invloed van enzymen. Enzymen zijn proteïnen die een waaier van chemische reacties katalyseren, ze versnellen een reactie zonder dat ze erdoor veranderd worden. Enzymen zijn substraat-specifiek, ze versnellen slechts één reactie. De reden hiervoor vinden we in de ruimtelijke bouw van het enzyme. Enzymen bevatten een ‘holte’, die we het actieve centrum noemen, waarin het substraat zal binden. In het actieve centrum past maar 1 substraat. In de reactie van het substraat met het enzym wordt het substraat omgevormd tot product.

De naam van enzymen wordt bepaald naargelang het substraat, gevolgd door de uitgang –ase. In module 1 werken we met een fosfatase, een enzym dat een fosfaatgroep van hun substraat afsplitst. Aan de hand van een viertal experimenten bestuderen we de kinetiek van het fosfatase. Als substraat gebruiken we het kleurloze p-nitrofenylfosfaat, dat door een fosfatase wordt omgezet tot het gele p-nitrofenol. Door de kleuromzetting kunnen we de reactie spectrofotometrisch volgen.

Achtereenvolgens bepalen we het pH-optimum, het temperatuursoptimum en de Michaelis-constante van een onbekend fosfatase. Eveneens analyseren we het effect van een inhibitor op een zuur fosfatase.

DOEL

We stellen een ijklijn op voor p-nitrofenol zodat we die kunnen gebruiken bij de volgende experimenten.

METHODE

Er wordt een verdunningsreeks van p-nitrofenol in NaOH opgesteld. Deze verdunningsreeks wordt gepipetteerd in een microtiterplaat om de absorptie bij 415nm van elke concentratie te meten. Met de bekomen resultaten kan een ijkcurve worden opgesteld van de absorptie in functie van de concentratie p-nitrofenol. De bekomen ijkcurve kunnen we in verdere experimenten gebruiken om de reactiesnelheid te berekenen.

VERWACHTINGEN

De ijkcurve gaat de vorm van een rechte aannemen, met voorschrift y= ax+b. Hoe groter de concentratie p-nitrofenol, hoe groter de absorptiewaarde, zodat de richtingscoëfficiënt, of a, een positieve waarde heeft.

1. Inleiding

2. Experiment 1.1: Opstellen van een ijkcurve voor p-nitrofenol

Module 2: Nucleïnezuren

Deze module behandelt het onderwerp van de nucleïnezuren. Nucleïnezuren zijn opgebouwd uit covalent gebonden nucleotiden. Nucleotiden zijn op hun beurt dan weer opgebouwd uit een purine- of pyrimidinedase, een pentose en een fosfaatgroep.

Het doel van deze module is DNA isoleren en vervolgens de concentratie en zuiverheid hiervan schatten. We zullen eveneens nieuw DNA amplificeren, via de PCR-methode, van het geïsoleerde DNA. Als laatste isoleren we DNA uit 2 bacteriën en onderzoeken hen op de aanwezigheid van een ampicillineresistentiegen. Hiervoor gebruiken we de PCR-methode en agarosegelelektoforese.

DOEL

Tijdens dit experiment gaan we het plasmide DNA uit bacteriecellen isoleren. Aangezien het chromosomaal DNA veel moeilijker te isoleren is, houden we ons enkel bezig met plasmide DNA.

METHODE

Om te beginnen zonderen we de bacteriecellen af door centrifugatie en verwijderen we het overbodige bovenlaag. We voegen aan de cellen buffer 1 (die EDTA bevat) toe. Deze zorgt voor een destabilisatie van het celmembraan door het binden met metaalionen. Vervolgens wordt de 2e Buffer toegevoegd. Deze lysis-buffer bevat SDS die de fosfolipidelaag zal afbreken zodat het DNA vrij komt en zal denatureren in het basisch milieu. Door een derde buffer toe te voegen wordt het basisch milieu geneutraliseerd waardoor de plasmiden renatureren en er een neerslagvorming plaatsvindt van het gedenatureerd DNA.De oplossing wordt opnieuw gecentrifugeerd, zodat we alleen het plasmide DNA kunnen opvangen.

Vervolgens voegen we isopropanol toe, dit zal het DNA doen neerslaan. Door nogmaals te centrifugeren, verkrijgen we een extra zuivering van het DNA. Bovendien wordt het pellet gewassen met 70% ethanol om hiermee de zouten uit de oplossing te verwijderen.Door de DNA-pellet aan de lucht te drogen zal hij het best oplossing in TE-buffer.

VERWACHTINGEN

De hoeveelheid geïsoleerde DNA uit de pellet is moeilijk te schatten. We veronderstellen dat de grootte-orde van het DNA microgram zal zijn.

1. Inleiding

2. Experiment 2.1: Isolatie van DNA uit bacteriën

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Om na te gaan of de isolatie goed gebeurd is, verwijzen we naar experiment 2.2, waarin we de zuiverheid van het geïsoleerde DNA meten.

DOEL

Het bepalen van zowel de concentratie als de zuiverheid van het totale DNA (afgezonderd in experiment 2.1) m.b.v een NanoDrop spectrofotometer

METHODE

We gebruiken de NanoDrop spectrofotometer om de absorptie te meten bij 260 en 280 nm. Hierna berekenen we de concentratie van de DNA-oplossing en de massa van het geïsoleerde DNA. Zo kunnen we dan de zuiverheid hiervan bepalen. De meting is gebaseerd op de verhouding in optische dichtheid bij golflengtes van 260 en 280 nm. De optische dichtheid wordt bepaald door de absorptie. Bij onzuiverheden stijgt de OD280, waardoor de verhouding OD260/OD280 zal dalen. Deze verhouding is dus een maat voor de onzuiverheid van de oplossing.

VERWACHTINGEN

Aangezien de methode om DNA te zuiveren zeer precies is, is het altijd mogelijk om fouten (o.a. contaminatie, onnauwkeurig pippeteren …) te maken tijdens het practicum. Hierdoor zal het DNA niet heel zuiver zijn.

VERWERKING

Door de absorptie te meten bij 260 en 280 nm met behulp van een NanoDrop spectrofotometer verkrijgen we informatie over de concentratie en zuiverheid van ons DNA (tabel 2.2.1).

Tabel 2.2.1: de gemeten absorptie bij 260 en 280 nm en de verhouding voor beide stalen.

Het geïsoleerde DNA is zuiver wanneer de verhouding A260/280 ligt tussen 1,8 en 2,0. Hieruit kunnen we afleiden dat de zuiverheid van beide stalen niet zo perfect is, maar dat staal 1 toch zuiverder is dan staal 2.

3. Experiment 2.2: Concentratie- en zuiverheidsbepaling van DNA door OD-meting

absorptie A260 A 280A260/280

staal 1 94,614 54,242 1,74

staal 2 29,177 13,613 2,14

De meting gaf ons ook de concentratie van het DNA (tabel 2.2.2). Deze kunnen we ook via de wet van Lambert-Beer berekenen:

A= b*c*ε

met A de gemeten absorptie, b de doorsnede van het cuvetje, c de gezochte concentratie van ons DNA en ε de extinctiecoëfficiënt.

Voor we de concentratie kunnen bereken met deze wet, zoeken we eerst de extinctiecoëfficiënt. We passen de wet toe bij een oplossing met een concentratie van 50µg dsDNA en een absorptie van 1,0. We krijgen 0,02 als waarde voor ε. Vervolgens berekenen we de concentratie van onze 2 stalen (tabel 2.2.2).

Gemeten concentratie (in ng/µl) Berekende concentratie (in ng/µl)

Staal 1 4730,7 4730,7

Staal 2 1458,9 1458,85

Tabel 2.2.2: gemeten en berekende concentratie van beide stalen

INTERPRETATIE EN BESLUIT

We merkten dat in onze staal wel veel onzuiverheden aanwezig waren. Voornamelijk in staal 2 is de concentratie DNA zeer laag. Dit kwam doordat we het tijdens experiment 2.1 moeilijk hadden om na toevoeging van isopropanol de neerslag van het DNA op de bodem van het epje te zien, zelfs na een extra keer centrifugeren. Hierdoor hebben we waarschijnlijk een deel van de DNA-pellet mee met het supernatans verwijderd.

DOEL

Het vermeerderen van DNA uit bacteriën aan de hand van de PCR-methode.

METHODE

We gebruiken het principe van de polyemerasekettingreactie. Het proces bevat drie belangrijke stappen, namelijk denaturatie van het dubbelstrengig DNA (temperatuur = 94°C), aanhechting van de primers (temperatuur = 60°C) en extensie vanaf de primers (temperatuur = 72°C).De cyclus van deze drie stappen gebeurt in het PCR-toestel en wordt automatisch een aantal keren herhaald totdat we de gewenste hoeveelheid DNA hebben. Alvorens we dit doen maken we een oplossing die een kleine hoeveelheid DNA bevat om van te vertrekken. Het DNA dat we zullen amplificeren is afkomstig uit bacteriecellen. Eerst nemen we een bacteriekolonie op van de agarplaat en suspenderen we deze cellen in milliQ-water. Dit is het

4. Experiment 2.3: Amplificatie van bacterieel DNA: polymerasekettingreactie(PCR)

matrijs-DNA. Vervolgens maken we de ‘mastermix’ die we toevoegen aan het templaat. Dit reactiemengsel bevat:

1. PCR-reactiebuffer: deze buffer zorgt voor een optimale pH en zoutconcentratie van het reactiemengsel. De buffer bevat ook MgCl2, wat een katalysator is voor de binding tussen DNA-polymerase, DNA en dNTP.

2. dNTP’s dit zijn de bouwstenen die nodig zijn voor de extensie vanaf de primers. Zonder deze oligonucleotiden kan er geen nieuw DNA gesynthetiseerd worden.

3. Primer: de synthese van nieuw DNA begint met de aanhechting van de primers. Deze korte nucleotidesequenties hechten vast aan het enkelstrengig (gedenatureerd) DNA en initiëren zo verdere extensie. We voegen twee verschillende primers toe, namelijk Forward en Reverse.

4. Taq-polymerase. Dit is een thermostabiel enzym, dat de primers zal verlengen met een snelheid van 2 tot 4 kb per minuut.

Het PCR-buisje met de negatieve controle bevat geen bacteriekolonies, maar enkel steriel milli-Q-water en een paar µl van de matermix. Hier zullen we dan ook geen vermeerdering van DNA verkrijgen aangezien het geen cellen van de bacteriecolonie bevat.

VERWACHTINGEN

Aangezien het aantal DNA-stengen per cyclus verdubbeld, zou het aantal exponentieel moeten stijgen. Het PCR-apparaat is ingesteld op 30 cycli, we verwachten dus 302 strengen (900 DNA strengen).

DOEL

We vergelijken de twee stalen met een positieve en negatieve controle door middel van agarosegelelektroforese. Ook de lengte van het PCR-fragment wordt bepaald door het te vergelijken met een ladder, waarvan de grootte van alle fragmenten gekend is.

METHODE

We analyseren de stalen met agarosegelelektroforese. Allereerst maken we een mengsel van agarose en TBE-buffer en warmen dit op in de microgolfoven. Na afkoeling gieten we de gel in een bakje en laten het stollen.

We bereiden verschillende stalen klaar. Enerzijds maken we λ-DNA stalen met verschillende concentraties, deze kunnen we gebruiken om de concentratie van onze geamplificeerde stalen af te schatten. Anderzijds hebben we de stalen die geamplificeerd werden in experiment 2.3. Aan ieder epje werd een laadbuffer toegevoegd, deze bestaat uit bromofenolblauw, xyleencyanol en sucrose. De laadbuffer zorgt ervoor de densiteit van het staal verhoogd wordt, zodat het DNA niet wegdrijft uit het slotje in de gel. De kleurstoffen in de laadbuffer staan ons toe de migratie van het DNA doorheen de gel te volgen. We laden de stalen in de gel zoals aangegeven in het laadschema in tabel.

5. Experiment 2.4: Analyse van PCR-producten door agarosegelelektroforese

DNA-ladder

Bact A Bact B NC PC λ25 λ50 λ100 λ200Extra staal 1

Extra staal 2

Tabel 2.4.1: Laadschema gel

Eens alle stalen geladen zijn, sluiten we het bakje aan op stroom en laten we de elektroforese gedurende 45 minuten lopen op 165V. Na de looptijd visualiseren we de verschillende bandjes DNA onder UV-licht.

VERWACHTINGEN

We verwachten dat verschillende patronen zichtbaar zullen zijn. De positieve controle zal een bandje vertonen ter hoogte van het resistentie gen, de negatieve controle mag dit niet hebben. We vergelijken de 2 bacteriën met de positieve en negatieve controle, slechts 1 van de bacteriën zal het gen hebben, bij de andere mag er dus geen bandje zichtbaar zijn.

GEGEVENS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1. DNA-ladder2. Bacterie A3. Bacterie B4. Negatieve controle5. Positieve controle6. λ 257. λ 508. λ 1009. λ 20010. Staal 111. Staal 2

VERWERKING

Hat ampicillineresistentiegen is aanwezig in het uitstrijkje van bacterie B. De gemigreerde DNA fragmenten van bacterie B hebben eenzelfde afstand afgelegd als de DNA fragmenten van de positieve controle. Dit wijst op de aanwezigheid van het gen in bacterie B. In het uitstrijkje van bacterie A zijn er geen migrerende DNA fragmentente vinden, net zoals in de negatieve controle. Dit wijst op de afwezigheid van het gen in bacterie A.

De DNA-ladder is opgebouwd uit 15 stompeindige fragmenten met een lengte tussen 100 en 1500 basenparen, per veelvouden van 100 basenparen met een extra fragment van 2072bp. Korte fragmenten migreren sneller door de gelmatrix en dus is de onderste trede op de ladder gelijk aan een fragment van 100 basenparen. De rode lijn op de foto van de agarosegel stelt de afstand voor dat het DNA fragment van bacterie B heeft afgelegd. De lijn kruist de ladder ongeveer op de 6de trede, de grootte van het PCR-amplificatieproduct is dus ongeveer gelijk aan 600 basenparen. De verwachte grootte die we bepaald hebben aan de hand van de gekregen DNA-sequentie en gebruikte primers is 563 basenparen. Dit komt goed overeen met de grootte die we bepaald hebben aan de hand van de DNA-ladder.

De intensiteit van het DNA fragment van bacterie B komt ongeveer overeen met de intensiteit van λ 100, hierin zit 100 ng / 18 µl=5,556 ng / µl λ-DNA. In het staal van PCR-bacterie B zit 15 µl bacterie B uit de PCR-reactie. De totale hoeveelheid amplificatieproduct is dus gelijk aan 5,556 ng / µl * 15 µl = 83,333 ng.

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Het resultaat komt sterk overeen met de schets, enkel de λ-standaard is niet helemaal correct, dit is waarschijnlijk te wijten aan een pipeteerfout.

Module 3: Proteïnen

Een eiwit of proteïne is een biopolymeer bestaande uit 1 of meerdere ketens van aminozuren. Deze aminozuren zijn via een amidebinding covalent verbonden. De uiteinden van de eiwitketen krijgen verschillende namen naargelang de functionele groep die erop staat, het begin van de keten wordt de N-terminus genoemd en het einde van de keten is de C-terminus.

In deze module gebruiken we affiniteitschromatografie om het ‘Green Fluorescent Protein’ (GFP) uit een recombinantie Escherichia Coli bacterie op te zuiveren. De drie varianten waarmee gewerkt wordt zijn; EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) en ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein). We bepalen het excitatie- en emissiespectrum van het opgezuiverde proteïne met een spectrofotometer. Aan de hand hiervan kunnen we opmaken welke GFP-variant we geïsoleerd hebben. Ten slotte gebruiken we SDS-PAGE om de efficiëntie van de zuivering en het molecuulgewicht van de gezuiverde GFP-variant te bepalen.

DOEL

De opzuivering van de GFP-variant door middel van metaalaffiniteits-chromatografie.

METHODE

De opzuiveringsprocedure verloopt in vier grote stappen, eerst worden de bacteriecellen die de gewenste proteïnen met een His-staart bevatten gelyseerd. De His-staart werd eerder door middel van genmanipulatie aan het te zuiveren proteïne gebonden. Deze proteïnen binden vervolgens met de Ni-partikels die aan het lysaat werden toegevoegd. De histidine-residu’s vertonen immers een hoge affiniteit voor Ni+ . Na het wegwassen van de niet-gebonden proteïnen wordt het gewenste proteïne geëlueerd met imidazol.

Cellen Lysate Bind Wash Elute

VERWACHTINGEN

Tijdens dit experiment worden 3 fracties afgezonderd, de lysaat-, doorloop- en eluaatfractie. In de lysaatfractie komen verschillende eiwitten voor, onder andere ook de GFP-variant. Deze variant moet echter nog opgezuiverd worden. In de eluaatfractie is deze opgezuiverde variant terug te vinden. In de doorloopfractie bevindt zich geen GFP-variant, deze is namelijk gebonden aan de Ni-NTA-agarose in de kolom.

1. Inleiding

2. Experiment 3.1: Purificatie van een GFP-variant uit E. Coli

DOEL

Aan de hand van het absorptiespectrum van het gezuiverde proteïne wordt het type GFP-variant bepaald.

METHODE

Elke variant heeft een specifiek excitatie- en emissiespectrum. Door het absorptiespectrum van ons proteïne te vergelijken met de gekende spectra van de varianten, kunnen we het juiste type GFP-variant bepalen.

VERWACHTINGEN

We verwachten een grafiek dat ons het absorptiespectrum toont. Hierin zal een duidelijke piek zichtbaar zijn bij de golflengte die specifiek is voor de GFP-variant. Uit de kleur van de celpellet die we kregen bij experiment 3.1, veronderstellen we dat we te maken hebben met EGFP. Hiervoor hebben we de kleur van de celpellet vergeleken met die van de drie varianten die beschikbaar waren in het labo.

VERWERKING

Grafiek 3.2.1: Absorptiespectrum van het opgezuiverde proteïne

Er verschijnt een duidelijke piek bij een golflengte van 486 nm.

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Op pagina 55 in de handleiding staan de specifieke absorptie-maxima voor de verschillende GFP-varianten. We vergelijken de absolute maximale absorptie hiermee. Bijgevolg besluiten we dat onze hypothese klopte, we hebben te maken met het EGFP.

3. Experiment 3.2: Bepaling van het absorptiespectrum van GFP.

DOEL

We willen nagaan hoe efficiënt we GFP gezuiverd hadden, en bepalen het molecuulgewicht van de gezuiverde GFP-variant.

METHODE

We zullen de efficiëntie nagaan door gebruik te maken van de SDS-PAGE techniek. De stalen die op de gel geladen worden zullen door deze techniek gescheiden worden op basis van hun molecuulgewicht. Over de gel wordt een elektrisch veld aangelegd. Door de proteïnen te behandelen met SDS hebben de proteïnen met een groter molecuulgewicht een grotere negatieve lading. Wanneer ze zich gaan rangschikken op basis van hun lading in het elektrisch veld, zal dit automatisch ook een rangschikking zijn op basis van hun molecuulgewicht. Na de elektroforese worden de stalen op de gel vergeleken met een molecuulladder en kan bepaald worden welk molecuulgewicht onder andere de GFP-variant heeft.

De stalen bereiden we voor door er een staalbuffer aan toe te voegen. Deze bevat de volgende componenten: Trisbase SDS: dit is een anionisch detergent. SDS bindt op de proteïnen en denatureert hen zo.

Bovendien geeft het hen een negatieve lading. Deze negatieve lading is in verhouding tot de lengte van het proteïne. Aangezien het molecuulgewicht mede bepaald wordt door de lengte van het proteïne, staat de negatieve lading ook in verhouding tot het molecuulgewicht.

Dithiotrheitol (DTT) : deze stof breekt de disulfidebruggen binnen het proteïne en tussen verschillend proteïnen onderling. Het zorgt er dus voor dat het proteïne helemaal afgebroken wordt tot zijn lineaire structuur.

Glycerol Bromofenolblauw

De pH van de staalbuffer heeft een waarde van 6.8.

VERWACHTINGENWe verwachten dat in de staal ‘lysaat' zich nog zeer veel en ook grote proteïnen zullen bevinden. Er zullen dus veel ‘streepjes’ op de gel te zien zijn (figuur 3.3.1). In de staal ‘doorloop’ zullen minder proteïnen aanwezig zijn, en zeker het GFP zal hier niet meer op terug te vinden zijn. Er zijn dus minder streepjes. Tot slot zou het staal ‘eluaat’ theoretisch gezien maar 1 proteïne mogen bevatten, namelijk het GFP. Er zou dus maar 1 streepje op de foto mogen staan. Op de plek waar bij ‘eluaat’ een streepje staat, mag zeker geen streepje staan bij ‘doorloop’.

4. Experiment 3.3: SDS-polyacrylamidegelelektroforese.

Figuur 3.3.1: schets verwachte resultaat gelelektroforese

VERWERKING

Figuur 3.3.2: Foto van proteinegel na SDS-page

Zoals we kunnen zien in bovenstaande tekening zijn de resultaten bekomen in het practicum anders dan de verwachtte resultaten. We hebben namelijk geen duidelijk streepje bij het Eluaat.

De gel wordt geladen volgens het schema in tabel 3.3.1.

Tabel 3.3.1: Laadschema proteïnegel

Laan 1 Laan 2 Laan 3 Laan 4 Laan 5

Eiwitstandaard (‘ladder’) Lysaat Doorloop Eluaat -

INTERPRETATIE EN BESLUIT

De eiwitstandaard kunnen we gebruiken als referentiepunt voor de andere stalen. Die andere stalen geven de proteïnen weer na een bepaalde behandeling. In het lysaat zitten alle proteïnen afkomstig van de celsuspensie. Bij de doorloop die afkomstig is van de eerste filtratie zitten al heel wat minder proteïnen. Het Eluaat zou zoals verwacht in de tekening een duidelijk bandje moeten geven omdat het het meest gezuiverde staal is. Dat bandje zou GFP moeten zijn. Bij de doorloop zou het normaal niet zichtbaar mogen zijn. Bij ons is het bandje niet echt zichtbaar bij het Eluaat.

Om de grootte van het GFP te bepalen kunnen we gebruikmaken van tekening 2 en van de foto van de proteïnegel van groepje 4 van reeks E (waar het GFP bandje wel duidelijk is).

Dan komen we uit op ongeveer 21,5kDa. Die grootte kunnen we vinden door de plaats van het GFP in het eluaat te vergelijken met de plaats op de ladder.

Figuur 3.3.3: Eiwitstandaard

Module 4: Polysachariden

Polysachariden zijn condensatiepolymeren van monosachariden. Monosachariden worden gekenmerkt door hun algemene brutoformule Cx(H2O)x.

In deze module bestuderen we twee zetmeelafbrekende enzymen, α-amylase en β-amylase. Ze werken beiden in op α-1,4-glycosidebindingen in zetmeel en glycogeen. Toch leiden ze tot de vorming van verschillende afbraakproducten. α-amylase, of ook endo-amylase, knipt min of meer willekeurig in het midden van de keten. Hierdoor ontstaan glucose, α-maltose, isomaltose en dextrines. β-amylase, ook wel exo-amylase, daarentegen breekt zetmeel af van de niet-reducerende uiteinden. Dit zorgt ervoor dat de zetmeel keten langer intact blijft. β-amylase geeft het ontstaan aan β-maltose.

DOELZowel voor α- als voor β-amylase willen we de werking nagaan op 2 manieren: de DNS- en de I2-methode.

METHODE

Eerst worden de twee methoden voor α-amylase uitgevoerd. Pas als deze gedaan zijn, worden de experimenten uitgevoerd voor β-amylase. Een student neemt de jodiummethode voor zijn rekening, een andere student voert de DNS-methode uit.

A. Jodiummethode

Allereerst bereiden we een 1x verdunning uit 25x stockoplossing van jodiumreagens. Er zijn 48 putjes waaraan we 200µl jodiumoplossing moeten toevoegen. We hebben dus exact 9600µl nodig, om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten maken we 10000µl 1x oplossing:

We verdunnen 400µl 25x stockoplossing met 9600µl gedestilleerd water.

We pipetteren telkens 100µl HCl oplossing in alle putjes van rijen A, B, C en D van een microtiterplaat. Aan putjes 1A en 1B voegen we 50µl buffer met pH 6,0 toe en aan putjes 1C en 1D voegen we 50µl buffer met pH 4,8 toe. Dit zijn de blanco-stalen van respectievelijk α-amylase en β-amylase. We voegen 100µl α-amylase toe aan 5,0 ml zetmeeloplossing met pH 6,0 en mengen dit. Onmiddellijk brengen we 50µl van dit mengsel over in putjes 2A en 2B. Om de 2 minuten herhalen we deze staalname 10 maal. We voegen 100µl β-amylase toe aan 5,0 ml zetmeeloplossing met pH 4,8 en mengen dit. Onmiddellijk brengen we 50µl van dit mengsel over in putjes 2C en 2D. Om de 2 minuten herhalen we deze staalname 10 maal.

1. Inleiding

2. Experiment 4.1: Werking van en -amylase

Vervolgens pipetteren we 200µl van het verdunde jodiumreagens in alle putjes van rijen E, F, G en H. Aan de putjes van rijen E, F, G en H voegen we telkens 10µl van de overeenkomstige kolom in respectievelijk rijen A, B, C en D. Ten slotte bepalen we hiervan de absorptie bij 595nm.

B. DNS-methode

We merken 14 epjes met A bl, A0, A4, A8, A12, A16, A20, B bl, B0, B4, B8, B12, B16 en B20, en voegen aan alle epjes 250µl DNS. De epjes met letter A zijn voor de proeven met α-amylase, die met B zijn voor β-amylase. We voegen 100µl α-amylase toe aan 5,0 ml zetmeeloplossing met pH 6,0 en mengen dit. Onmiddellijk brengen we 250µl van dit mengsel over in epje A0. We herhalen deze staalname 5 maal, telkens om de 4 minuten. We voegen 100µl β-amylase toe aan 5,0 ml zetmeeloplossing met pH 4,8 en mengen dit. Onmiddellijk brengen we 250µl van dit mengsel over in epje B0. Ook deze staalname herhalen we 5 maal om de 4 minuten. Als alle stalen genomen zijn, plaatsen we de 14 epjes gedurende 5 minuten in een kokend waterbad en laten ze nadien afkoelen op ijs. Vervolgens pipetteren we 200µl vanuit de epjes met α-amylase telkens in rijen A en B. We doen dit ook voor de epjes met β-amylase maar dan wel in rijen C en D. Van het verkregen resultaat bepalen we de absorptie bij 595nm.

VERWACHTINGEN

Amylasen breken α-1,4-glycosidebindingen in zetmeel. Het verschil tussen α- en β-amylase manifesteert zich in de plaats waar er gesplitst wordt. α-amylase doet dit eerder willekeurig in de keten en β-amylase breekt zetmeel progressief af vertrekkende van de niet-reducerende uiteinden. β-amylase is bijgevolg specifieker en laat de zetmeelketen langer intact.

A. Jodiummethode

Na verloop van tijd wordt zetmeel afgebroken en zal bijgevolg de donkere kleur (bruin, blauw of paars) stilaan afnemen en uiteindelijk verdwijnen. De specificiteit van α- en β-amylase verschilt, bijgevolg verschilt ook hun kleuring. β-amylase houdt zetmeel langer intact dus verwachten we dat de donkere kleur langer zal blijven dan bij α-amylase.

B. DNS-methode

Ook hier zal een kleurverandering optreden, dan wel met een andere betekenis. Door de inwerking van amylasen wordt zetmeel afgebroken en worden er reducerende suikers gevormd. Als deze reducerende suikers reageren met 3,5-dinitrosalicylzuur (DNS), wordt hun aldehydegroep geoxideerd tot een carboxylgroep. DNS daarentegen wordt gereduceerd tot 3-amino-5-nitrosalicylzuur, dit kleurt roodbruin. We verwachten dat de rode/oranje kleur zal toenemen met de tijd, naarmate er meer zetmeel afgebroken en meer reducerende suikers gevormd worden. α-amylase breekt zetmeel vlugger af, dus verwachten we dat er bij α-amylase een tragere omslag naar de rode kleur zal zijn. Ook dit proces kunnen we spectrofotometrisch volgen.

RESULTATEN

A. Jodiummethode

In tabel 4.1.1 geven we de gecorrigeerde absorptie weer van α- en β-amylase als we de jodiummethode hebben toegepast. In figuur 4.1.1 geven we deze resultaten weer in functie van de tijd in een grafiek. De gecorrigeerde absorptie berekenen we als volgt, aan de hand van een blanco staal, een staal met HCl, buffer en jodiumreagens maar zonder enzyme.

Tabel 4.1.1: Gecorrigeerde absorptie van α- en β-amylase

Tijd Gecorrigeerde absorptie van α-amylase

Gecorrigeerde absorptie van β-amylase

0 0,599 0,493

2 0,381 0,474

4 0,483 0,461

6 0,382 0,453

8 0,274 0,420

10 0,243 0,406

12 0,214 0,390

14 0,197 0,382

16 0,167 0,376

18 0,180 0,376

20 0,118 0,346

Figuur 4.1.1: Gecorrigeerde absorptie van α- en β-amylase in functie van de tijd

B. DNS-methode

In tabel 4.1.2 geven we de gecorrigeerde absorptie weer van α- en β-amylase als we de DNS-methode hebben toegepast. In figuur 4.1.2 geven we deze resultaten weer in functie van de tijd in een grafiek. Ook hier berekenen we de gecorrigeerde absorptie op basis van een blanco staal, dat ditmaal bestaat uit DNS en buffer.

Tabel 4.1.2: Gecorrigeerde absorptie van α- en β-amylase

Tijd Gecorrigeerde absorptie van α-amylase

Gecorrigeerde absorptie van β-amylase

0 0,047 0,021

4 0,159 0,084

8 0,220 0,164

12 0,303 0,336

16 0,390 0,247

20 0,464 0,428

Figuur 4.1.2: Gecorrigeerde absorptie van α- en β-amylase in functie van de tijd

INTERPRETATIE EN BESLUIT

A. Jodiummethode

Zoals verwacht verdwijnt de donkere kleur na verloop van tijd. We konden dit met het blote oog zien, maar het is ook te merken aan het dalende absorptiespectrum. Hoe lager de absorptie, hoe minder zetmeel er in het reactiemengsel aanwezig is. We merken op dat de absorptie van α-amylase sneller daalt dan die van β-amylase. Dit hangt samen met het feit dat β-amylase het zetmeel langer intact laat. Na 2 minuten merken we een uitschieter op bij α-amylase. Dit kunnen we verklaren doordat er tijdens het pipetteren wat fout is gegaan, waardoor zowel α- als β-amylase werd toegevoegd aan dat epje.

B. DNS-methode

In tegenstelling tot de jodiummethode neemt de absorptie van het reactiemengsel hier toe met de tijd, ook dit hadden we voorspeld. We stelden dat de rode/oranje kleur zou toenemen. Het toenemen in absorptie wordt veroorzaakt door het afbreken van zetmeel en de vorming van reducerende suikers. Op tijdstip 16 merken we een dal in de absorptie van β-amylase. We kunnen hiervoor niet meteen een oorzaak geven, het ligt hoogstwaarschijnlijk aan een pipetteerfout.

In het algemeen kunnen we besluiten dat α- en β-amylase daadwerkelijk verteringsenzymen zijn die zetmeel afbreken. Zowel de jodium- als de DNS-methode toont dit aan.

DOEL

Tijdens dit experiment bepalen we de activiteit van amylase en de invloed van temperatuur op het enzyme amylase doorheen de tijd.

METHODE

We tonen de aanwezigheid van zetmeel aan door een I2-kleuring. Door de grote polariseerbaarheid van I2 zal het zich schikken in de holte van de zetmeelkorrels. De elektronen kunnen zich vrij bewegen over de lange ketens van deze jodiummoleculen in de zetmeelspiraal. Dit geconjugeerd systeem zal licht van een hogere golflengte absorberen, waardoor we een kleuromslag zien van geel naar blauw.

We gebruiken slechts speeksel van één persoon aangezien de hoeveelheid verteringsenzymen verschilt van tijdstip tot tijdstip naargelang de betreffende persoon pas heeft gegeten of niet.

VERWACHTINGEN

Door toevoeging van het speeksel bij de zetmeeloplossing zal het geleidelijk aan de glycosidebindingen breken. Hoe langer amylase inwerkt, hoe minder zetmeel zichtbaar gemaakt kan worden door de dijoodkleuring. Door het speeksel met de zetmeeloplossing in een kookbad van 100°C te plaatsen, zullen de enzymen denatureren. Bijgevolg wordt er geen zetmeel verteerd en zullen we een blauwe kleur te zien krijgen.

RESULTATEN

In tabel 4.2.1 geven we weer welke kleur we waarnemen na toevoeging van jodium. We vergelijken hierbij speeksel dat op kamertemperatuur bewaard wordt (proefbuis A) en speeksel dat op tijdstip 0 gedurende 5 minuten in een kokend waterbad werd geplaatst (proefbuis B).

Tabel 4.2.1: waargenomen kleur in functie van de tijd

waargenomen kleur

A(t=0 min) donkerbruin

A(t=8 min) lichtbruin

A(t=20 min) geel

B(t=0 min) donkerbruin

B(t=8 min) donkerbruin

B(t=20 min) donkerbruin

3. Experiment 4.2 : Activiteit van speekselamylase

VERWERKING

Proefbuis A

- Direct na toevoeging van speeksel bij de zetmeeloplossing wordt er aan een deel I2

toegevoegd. We zien dat we een kleuromslag krijgen naar donkerbruin, bijna zwart. Dit komt omdat de amylase nog geen tijd heeft gekregen zetmeel af te breken.

- Na 8 minuten voegen we aan een ander deel van de oplossing ook I2 toe. We zien meteen dat de oplossing al minder bruin kleurt als in begin. In deze 8 minuten is er al een deel van zetmeel afgebroken door de verteringsenzymen.

- Na 20 minuten voegen we opnieuw enkele druppels jodiumoplossing toe aan een deel. De kleur is geel tot lichtjes bruin. Dit betekent dat het grootste deel van de zetmeeloplossing is afgebroken door speekselamylase.

Proefbuis B

- Direct na toevoeging van speeksel bij de zetmeeloplossing wordt er aan een deel enkele druppels jodiumoplossing toegevoegd. We zien dat we een kleuromslag krijgen naar donkerbruin, bijna zwart. Dit komt omdat de amylase nog geen tijd heeft gekregen zetmeel af te breken. Hierna wordt de proefbuis in een kokend waterbad gezet gedurende 5 minuten.

- Na 3 minuten de proefbuis op kamertemperatuur gestaan te hebben, voegen we aan een deel enkele druppels jodiumoplossing toe. De waargenomen kleur is dezelfde donkerbruine kleur. Dit betekent dat door het koken de verteringsenzymen gedenatureerd zijn en zo zijn afbrekende werking verloren heeft.

- Ook na 20 minuten zien we dat we een donker bruine kleur verkrijgen. De werking van amylase blijft uit, waardoor zetmeel nog steeds aanwezig is.

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Speelselamylasen zijn afkomstig uit het menselijk lichaam dat een temperatuur heeft van ongeveer 37°C. De amylasen zullen met andere woorden optimaal werken bij deze temperatuur. Aangezier kamertemperatuur het dichtst aanleunt bij deze temperatuur zullen de amylasen goed werken en het zetmeel goed afbreken. Echter bij een temperatuur van 100°C zal het speekselamylase niet optimaal optimaal werken. We zien dus dat de resultaten overeenkomen met de verwachtingen.

Module 5: Lipiden

In module 5 worden vetten uit een voedingsmiddel geisoleerd door middel van extractie met chloroform/methanol. In de eerste plaats wordt het totale vetgehalte van het voedingsmiddel bepaald. Dit doen we aan de hand van een eierdooier. Daarna zal het cholesterolgehalte bepaalt worden op twee manieren: de enzymatische cholesteroloxidase methode en de chemische Lieberman-Buchard methode.

DOEL

Het doel van dit experiment is vetten uit voedingsmiddelen isoleren door middel van extractie met chloroform:methanol. Alcoholen zijn goede solventen voor de meeste lipiden, doordat ze de waterstofbruggen en elektrostatische krachten verbreken

METHODE

Eerst wegen we 1 g voedingsmiddel af in een kleine falcontube (tot op 0,0001 g nauwkeurig). Dan voegen we 10 ml chloroform:methanol toe en gaan we de suspensie krachtig vortexen. Eerst wordt een chloroform/methanol mengsel toegevoegd omdat methanol een polaire vloeistof is en chloroform is apolair. De vetten zullen dus oplossen in chloroform terwijl alle polaire bestanddelen oplossen in de methanollaag. Daarna gaan we de suspensie filteren met Whatman 1PS filter en filtraat opvangen in nieuwe falcontube. Bij de volgende stap gaan we het volume van het filtraat bepalen en 0,2 maal volume CaCl2 oplossing toevoegen. CaCl2

wordt toegevoegd omdat het de extractie vergemakkelijkt van niet-lipiden naar de waterige fase en het verhindert de dissociatie van zure lipiden, zodat deze in de niet-polaire fase blijven. Dan gaan we de oplossing weer vortexen en vervolgens 5min afcentrifugeren. Wanneer de oplossing gecentrifugeerd is gaan we de bovenste fase verwijderen met een pasteurpipet. Dan gaan we het resterende volume verdubbelen door chloroform : methanol : water toe te voegen en dan terug homogeniseren door te vortexen. Door het toevoegen van een chloroform:methanol:water oplossing gaan alle polaire bestanddelen die zich eventueel nog in de apolaire laag zouden bevinden naar de polaire laag. Dan lezen we het onderste volume af en verwijderen we weer de bovenste laag met een pasteurpipet.

GEGEVENS

Massa dooier = 0,9944gvolume van filtraat bekomen na stap3 = 6,5mlvolume van toegevoegde CaCl2 = 1,3mlhoe lang wordt er afgecentrifugeerd? 5minutenVolume na verwijdering van bovenste fase na stap 6 = 3ml

1. Inleiding

2. Experiment 5.1: extractie van lipiden uit een ei

Volume van toegevoegde chloroform:methanol:water) = 3mlVolume onderste fase (= ei-extract) = 4ml

VERWERKING

Er werd 4 ml eiextract bekomen per 0,9944 g eierdooier. Dat is dus 4,02 ml per gram eierdooier.

DOEL

Er worden 2 technieken gebruikt om de cholesterolgehalte te bepalen: De chemische Lieberman-Buchard methode en de enzymatische cholesteroloxidasemethode. De Lieberman-buchardtechniek bepaalt het totale cholesterolgehalte. Cholesteroloxidase daarentegen kan enkel vrij cholesterol bepalen.

METHODE

Om te beginnen moeten we een onderscheid maken tussen de Lieberman-buchard techniek en de cholesteroloxidase techniek.

De Lieberman-buchardtechniek is een chemische techniek waarmee het totale cholesterol-gehalte bepaald wordt. Cholesterol reageert met het LB-cholesterolreagens dat uit een mengsel van ijsazijn, azijnzuuranhydride en geconcentreerd zwavelzuur bestaat. Bij deze reactie wordt er een product gevormd met een blauw-groene kleur die spectrofotometrisch gemeten kan worden. Des te meer cholesterol aanwezig, des te meer er kan reageren en des te meer gekleurd product ontstaat. Hoe hoger de absorptie hoe donkerder de kleur en hoe meer cholesterol er dus aanwezig was.

Cholesteroloxidase daarentegen is een enzym dat enkel vrij cholesterol kan oxideren. We meten dus enkel de concentratie vrij cholesterol. Door een reeks opeenvolgende reacties wordt lutidine verkregen. Die eveneens fotospectrometrisch bepaald kan worden.

VERWACHTINGEN

We verwachten dus dat de hoeveelheid cholesterol die gemeten wordt met de Lieberman-buchard methode hoger zal zijn dan die gemeten met de cholesteroloxidase methode.

CHOLESTEROLOXIDASEMETHODE

(1) De onbekende cholesteroloplossing wordt 10 keer verdund in isopropanol (we nemen 100 µl ei-cholesteroloplossing en voegen 900 µl isopropanol toe)

(2) In een klein proefbuisje wordt 2000 µl Ch0x-cholesterolreagens gebracht(3) 160 µl verdunde lipidenextract toevoegen en goed mengen(4) Telkens 1 ml van dit mengsel overbrengen in twee epjes(5) Aan epje B 8 µl cholesteroloxidase toevoegen

3. Experiment 5.2: bepaling van cholesterol in het ei-extract

(6) De epjes worden 1 uur in een warmwaterbad van 37-40 °C geplaatst en terug afgekoeld.(7) De absorptie wordt bepaald bij 405 nm van staal B ten opzichte van A als blanco (8) Aan de hand van een formule (zie handleiding) wordt het cholesterolgehalte berekend.

GEGEVENS

De gemeten absorptie bij 405 nm was 0,110.

VERWERKING

Formule:

[cholesterol] (mg/ml) = 0.711 x (*E)

[cholesterol] (mg/ml) = 0.711 x 0.110

[cholesterol] (mg/ml) = 0,07821

Wanneer we dit vermenigvuldigen met het volume van onze staal nl. 4,0 ml bekomen we het aantal mg cholesterol dat in het lipidenextract zat.

0 .07821 mg /ml4,0 ml

=0,0195525mg=19 ,55 *10^(-3) g

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Het Cholesteroloxidase meet enkel het vrij cholesterol.In 1 g eierdooier is (19,55*10^(-3)/ 0,9944g)=19,66*10^(-3)g cholesterol aanwezigAls je weet dat een kippenei gemiddeld 65 g weegt en voor 30% bestaat uit dooier, dan is er in dit ei 383,37 mg cholesterol aanwezig.

LIEBERMAN-BUCHARD METHODE

(1) In een epje met 100 µl standaardoplossing nog 100 µl lipidenextract en 1000 µl LB-cholesterolreagens toevoegen en mengen.

(2) Incubatie gedurende 20 minuten bij 37°C.(3) 3 maal 200 µl in microtiterplaat brengen(4) Meet meteen de absorptie bij 540 nm(5) Cholesterolgehalte in de oplossing bepalen

GEGEVENS

Tabel 5.2.1:Absorptie van de stalen hun bijbehorende concentratie

cholesterol-concentratie

0mM 5mM 10mM 20mM

absorptie bij 540 nm

0,176 0,434 0,588 0,722

Figuur 5.2.1:Absorptie in functie van de cholesterolconcentratie. (Lieberman-Buchardmethode)

VERWERKING

Y = 0.26 X + 0.2524

Als Y=0 dan:

0= 0.026 X + 0.2524

- 0.2524 = 0.026 X

−0 .25240 .026 = X

X = -9,708

Wanneer we hier de absolute waarde van nemen bekomen we een cholesterolconcentratie van 9,708mM of ook 9,708*10^(-3)M. We weten ook dat we een volume van 4 ml gebruikt hebben dit is 4,0*10^(-3) l. Bij vermenigvuldiging van de concentratie en het volume krijgen we 3,883*10^(-6) mol. De molecuulmassa van cholesterol is 386.64 g/mol dus bij vermenigvuldiging van beide getallen bekomen we 15,01*10^(-4) g. Er zat dus 15,01*10^(-4) g cholesterol in het lipidenextract. Bij deling met de massa van het ei (0,9944g) waar we mee begonnen zijn krijgen we 15,09*10^(-4) g cholesterol per g ei.

INTERPRETATIE EN BESLUIT

Bij deze methode wordt het gehele aantal cholesterol bepaald. In 1g eidooier zit 15,09*10^(-4)g cholesterol.

Als je weet dat een ei gemiddeld 65 g weegt en er gemiddeld 30% eierdooier aanwezig is(waar het cholesterol zich bevindt) is er dus 15,09*10^(-4)*(65*0,3)=294mg cholesterol per ei.

Als we deze 2 methoden bekijken komen we uit dat er bij de cholesterol oxidase methode meer cholesterol aanwezig is dan bij de Lieberman-buchard techniek, normaal zouden we net het tegenovergestelde moeten uitkomen. Omdat de cholesterol oxidase methode enkel het vrije cholesterol meet. Als we ons resultaat van de cholesterol oxidase methode vergelijken met de andere is het mogelijk dat er een meetfout werd gemaakt bij het opmeten.

Module 6: Genexpressie

In deze module brengen we twee reportergenen tot expressie via in vitro transcriptie en translatie in een E. coli S30-extract. Een reportergen codeert een eiwit dat makkelijk detecteerbaar of meetbaar is. In de twee volgende experimenten zullen we de reportergenen β-galactosidase en luciferase tot expressie brengen.

De activiteit van β-galactosidase kan makkelijk worden nagegaan bij de hydrolyse van o-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG). β-galactosidase splitst ONPG immers in galactose en o-nitrofenol. De concentratie van de geelgekleurde verbinding o-nitrofenol is te bepalen aan de hand van een colorimetrische test.

Luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine waarbij licht vrijkomt. We kunnen dus met een lichtmeting de activiteit bepalen van luciferase.

Aan de hand van de activiteit, de detectiegevoeligheid en de hoeveelheid aangemaakt proteïne, kunnen we bepalen welk van beide reportergenen het beste geschikt is voor onderzoek met het E. coli S30-extract.

DOEL

In dit experiment brengen we β-galactosidase in vitro tot expressie door middel van transcriptie en translatie in een E. coli S30-extract. Zo kunnen we de activiteit, de detectiegevoelig en de hoeveelheid β-galactosidase bepalen.

METHODE

Bij in vitro transcriptie en translatie wordt een gen niet tot expressie gebracht door het coderend DNA toe te voegen aan een intacte cel maar door het toe te voegen aan een cel-extract. Dit cel-extract bevat RNA-polymerase, transcriptiefactoren, ribosomen, aminoacyl-tRNA synthetasen, en initiatie-,elongatie- en terminatiefactoren, hieraan voegen we ook rNTPs, tRNAs, aminozuren, een energiebron(ATP, GTP) en cofactoren toe.

We gebruiken een E. coli S30-extract, de transcriptie en translatie verlopen hier simultaan. Dit zorgt voor een snelle eiwitsynthese en voor stabilisatie van de vroege binding tussen de ribosomen en de mRNA-strengen.

Voor de in vitro synthese van β-galactosidase voegen we 0,750 µg in 3 µl DNA(pGEM-βGal), 2 µl aminozuurmix, 8 µl S30 premix, 6 µl E. coli S30-extract en 1 µl H2O toe aan een epje. We maken ook een negatieve controle met 2 µl aminozuurmix, 8 µl S30 premix, 6 µl E.

1. Inleiding

4. Experiment 6.1: In vitro expressie en detectie van β-galactosidase

coli S30-extract en 4 µl H2O. Na de 2 stalen te mengen, af te centrifugeren en 60 minuten te incuberen op 37°C in een waterbad, stoppen we de reacties door ze 5 minuten op ijs te zetten.

Na toevoeging van 450 µl van een 3mM ONPG oplossing aan beide stalen incuberen we de stalen 5 à 10 minuten op een verwarmingsblok tot 30°C. We stoppen de reacties door 250 µl van een 1 M Na2CO3 oplossing toe te voegen en de epjes 10 minuten op ijs te zetten.

We meten naast absorbantie bij 420 nm van de in vitro aangemaakt β-galactosidase ook de absorbantie bij 420nm van een standaard β-galactosidase-oplossing. Op deze manier kunnen we de activiteit ,detectiegevoeligheid en eiwitproductie van β-galactosidase bepalen.

Deze β-galactosidase-oplossing maken we door een epje met 450 µl 3 mM ONPG, 250 µl 0,1 M kaliumfosfaatbuffet pH 7,7 te verwarmen tot 30°C. Deze oplossing pipetteren we over naar een cuvet en we voegen 5 µl 0,3 mg/ml β-galactosidase toe.

GEGEVENS

VERWERKING

INTERPRETATIE EN BESLUIT

3. Experiment 6.2: In vitro expressie en detectie van luciferase