Eiwitten in het nieuws

Adenosine-receptoro http://www.c2w.nl/terug-naar-de-tekent

afel.51851.lynkxo http://esciencenews.com/articles/2008/1

0/02/many.receptor.models.used.drug.design.may.not.be.useful.after.all

o Nu 3D-structuur van drie receptoren van de 800 die we hebben…

o Belangrijk voor medicijnonderzoek (Parkinson, ….)

Green Fluorescent Proteino Nobelprijs Scheikunde 2008o http://www.c2w.nl/nobelprijs-voor-

groen-eiwit.56537.lynkxo http://nobelprize.org/nobel_prizes/c

hemistry/laureates/2008/o http://www.ecosci.jp/chem10/gfp.h

tml

Studietaak 3

Post-translationele modificaties

Signals in sequences

Signals in sequences o Eiwitten: meer dan alleen

aminozureno Post-translationele modificaties

o ‘Signaal’ hiervoor in az-volgorde!

o Voorspellingen over de structuur en/of functie van eiwitteno Op basis van die signalen

Post-translationele modificaties

Post-translationele modificaties

o Aanpassingen na afloop van (= ‘post’) translatieo Extra ‘groepen’ die aan eiwitten worden

gezeto Invloed op o.m. vorm en functie van het eiwito Ken je zelf voorbeelden?

o Proteolytische klievingo Protein sorting / protein targeting (pre-

sequenties)o Van inactief pro-eiwit naar actief eiwit (pro-

sequenties)

Signaaltransductie

EPO: geglycosileerd eiwit

Afsplitsing van aminozuren of peptiden

Afsplitsing van aminozuren of peptiden

o Gebeurt door proteolytische enzymen

o Specifiek (herkenningssequentie)

Trypsine activeert andere zymogenen

o Trypsine is de algemene activator van alle pancreatische zymogenen (pro-enzymen)

o Elk organisme bezit proteolytische enzymen

o Er zijn verschillende klasses proteolytische enzymen (ter info, niet kennen!)

o Allerlei functies

o Elk protease/proteïnase/peptidase heeft zijn eigen substraatspecificiteit = herkenningsplaats & klievingsplaats: alleen bepaalde aminozuurvolgordes! (straks meer)

Activatie van proteaseso Een aantal proteases is betrokken bij het

activeren van pro-eiwitten (zoals pro-insuline)

o Maar proteases worden zelf ook meestal gesynthetiseerd als pro-eiwitten

o Op de plaats van bestemming (bv. buiten de cel bij een bacterie of in het darmlumen bij de prancreatische proteases) wordt het pro-gedeelte afgesplitst (meestal door weer een ander protease) en wordt het protease actief

Proteolytische enzymen in het biochemisch

onderzoek

1: Bepaling van de aminozuursequentie van een

eiwit

o Bepaling van aminozuursequentie gebeurt tegenwoordig in 99,9% van de gevallen via DNA-technologie (HOE?), maar vroeger kon dat niet….

o Pehr Edman ontwikkelde een methode voor het labelen van de N-terminus van een peptide, gevolgd door klieving ervan van het peptide

o Deze methode heet Edman-degradatieo Door dit achter elkaar te doen en elke keer het

gelabelde en vervolgens afgekliefde aminozuur te identificeren (mbv HPLC) kan de aminozuursequentie van peptiden tot ca. 50 az worden bepaald

Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

o Een tweede manier is om vanaf de C-terminus steeds een aminozuur af te klieven m.b.v. carboxypeptidase en dit steeds te identificeren

Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

o Langere polypeptides moeten eerst in kleinere stukjes worden ´gehakt´ m.b.v. proteases of cyanogeenbromide (CNBr)

o Bijvoorbeeld:

Enzym Klievingsplaats

Trypsine Lys of Arg (C)

Chymotrypsine Phe, Trp, Tyr (C)

Pepsine Phe, Trp, Tyr (N)

Cyanogenbromide Met (C)

Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

o Behandeling van een polypeptide met trypsine

Sub-peptides

Polypeptide

N C

Trypsine (lys, arg)

Chymotrypsine (trp, tyr, phe)

De az-volgorde van de sub-peptides is onbekend!De sequentie wordt gereconstrueerd d.m.b. de overlap tussen op verschillende manieren geproduceerde sub-peptides

(1)

(2)

Az-volgordes bepalen van de geproduceerde peptides

Oefeneno Ik heb een klein peptide van negen azo Na incubatie van dit peptide met trypsine (R K) vind

ik twee peptides met de volgende az-volgordes: o AAWGK o TYVK

o Na incubatie van hetzelfde peptide met chymotrypsine (Y W F) vind ik een peptide met de volgende az-volgorde: o VKAAW

o De overige brokstukken cq losse az van de incubatie met chymotrypsine zijn te klein om te isoleren en deze zijn dus niet bepaald!

o Wat is de az-volgorde van dit peptide?

Nog meer oefeneno www.bioplein.nl

Protein Targeting

Protein Targeting

Bij prokaryoten zijn er niet zoveel verschillende locaties om een eiwit naar toe te sturen

Welke?

Eukaryote cellen hebben organellen en dus veel meer locaties om eiwitten naar toe te sturen

Prokaryoten: bekendste systeem: Sec-systeem

Twee ‘soorten’ ribosomen:Vrije ribosomen: maken eiwitten die in het cytosol zittenAan ER gebonden ribosomen (‘ruw ER’) maken eiwitten voor endomembraansysteem ( organellen) en eiwitten die uitgescheiden worden

Aan kernmembraan gebonden ribosomen maken eiwitten die in celkern terecht moeten komen

Eiwitten voor endomembraansysteem of buitenkant: na synthese van N-terminaal signaalpeptide binding aan SRP (= signal-recognition particle)SRP met peptide en ribosoom aan SRP receptor op het ER; verwijdering van signaalpeptide

Protein Targeting bij eukaryoten

Na koppeling ribosoom aan ER gaat synthese verder en eiwit komt in lumen ER terecht

Daar blijft het of het wordt verder getransporteerd

Zo zijn er ook signaalsequenties (‘postcodes’) voor mito’s, chloro’s, kern en andere organellen die geen deel uit maken van het endomembraan-systeem

Hierbij wordt het eiwit eerst helemaal gemaakt in het cytosol en vervolgens naar het organel geïmporteerd

Protein Targeting bij eukaryoten

http://www.steve.gb.com/science/protein_targeting.html

Signaalsequentieso De ‘postcodes’ van de celo Meer op www.bioplein.nl

Extra groepen aan eiwitten

Extra groepen aan eiwitten

GlycosyleringAcyleringMyristoyleringMethyleringFosforyleringSulferingPrenyleringHydroxyleringAmideringCarboxylering…..

Glycosylering

.

Een glycoproteïne is een eiwit met daaraan covalent gebonden een of meer koolhydraat-moleculen (ook wel glycanen genoemd). Het kan hierbij gaan om monosacharide(s), disacharide(s), oligosacharide(s), polysacharide(s) of afgeleiden hiervan (bv. sulfo- of fosfo-gesubstitueerd). Het kan gaan om één, enkele of veel koolhydraten per eiwit.

De meeste modificaties bij glycoproteïnen vinden plaats via N- of O-glycosidische bindingen

O-linkage: Ser, Thr (GalNAc) N-linkage: Asn (GlcNAc)

o ~ 50% van alle eukaryote eiwitten is geglycosyleerd o Hiervan is 90% N-linked glycanen

o Het vaakst worden de volgende monomere suikers aangetroffen: glucose, galactose, mannose, fucose, GalNAc en GlcNAc

o Eiwit-glycosylering vindt plaats tijdens het transport in ER en Golgi

o Dus alleen eiwitten die via deze route gaan worden geglycosyleerd! (waar kun je dus geglycosyleerde eiwitten verwachten en waar niet??)

o De glycosylering is belangrijk voor de vouwing en de functie van het eiwit

Cutis laxa:Een van de aandoeningen die het gevolg zijn van een glycosyleringsdefect

Hoe toon je aan of er bij een patiënt sprake is van een glycosyleringsdefect?

o N-glycosylering: Isoëlektrische Focusering (IEF) van transferrineo Transferrine in bloedo Geglycosyleerd eiwito Afwezigheid of verstoring glycosylering a.g.v.

algemeen glycsoyleringsdefect leidt tot afwijkend Isoëlektrisch Punt (IEP) van transferrine

o Sinds kort ook een klinische test voor O-glycosyleringsdefecten dankzij oud-studente Suzan Wopereis

Voorspellingen

Meer in de computerles

VoorspellingenoVoorspellingen over de

structuur en/of functie van eiwitten gebaseerd op:oVergelijken van eiwittenoDe aminozuurvolgorde van het eiwit zelfo Signalen in aminozuursequenties

Voorspellende methodeso Van isoëlektrisch punt, via

secundaire structuur en glycosyleringssites tot sorteersignalen

o Veel van deze methodes zijn te vinden bij het Expert Protein Analyis System

o Demo´s in computerles

Pas op! Voorspelling!!! Bijvoorbeeld N-glycosylering (N-X-(S,T)):

Programma ziet alle mogelijke N-glycosyleringssitesDit betekent NIET dat deze ook daadwerkelijk allemaal geglycosyleerd zijnDat laatste kun je alleen in het lab aantonen