Onderzoeksbelang :

• studie genfunctie - genregulatie

• aanmaak recombinante eiwitten - juiste posttranslationele modificaties- vorming van correcte disulfidebruggen

protein disulfide isomerase (PDI) in endoplasmatisch reticulumvan alle eukaryoten ; vorming van S-S bruggen ; eveneens chaperone.

- aminozuurverwijdering van het oorspronkelijke polypeptide

- O-linked of N-linked glycosylaties => ongeveer 30% van de eukaryotische proteinen zijn geglycosyleerd

• manipuleren van endogeen genoom => gentherapie

Commercieel : synthese, o.a. vaccins, hormonen in zoogdier-celculturen

“Gene delivery” voor dierlijke cellen in vivo versus in vitro : gentherapie

Vectoren en klonering in hogere organismen : dierlijke cellen (Primrose & Twyman : hoofdstuk 12)

• 4 hoofdstrategiën voor horizontale gentransfer• chemische - fysische “transfectie”/transformatie• DNA-”delivery” met bacteriële vectoren• virussen als gentranfervectoren

• Plasmidevectoren : dierlijke + bacteriële componenten• Selectiemerkers

Gentransfer (DNA- transfer) naar dierlijke cellen

(DNA opname : Primrose & Twyman, pp. 218-227)

4 hoofdstrategiën van transformatie

- Transformatie - fysisch - Transformatie - chemisch – endocytose

- ‘Bactofection’ – bacterie-gemediëerd- Transductie – virus-gemedieerd

“biologisch”

“niet-biologisch”

*

• Chemische methoden – transformatie (transfectie) complex zodanig dat interactie met celmembraan bevorderd wordt vb. Positieve lading opname door endocytose Lipofiel complex membraanfusie DNA in cytoplasma

• Fysische methoden – transformatie (transfectie) door fysische kracht introductie van ‘naakt’ DNA vb. micro-injectie – “particle bombardment” – electroporatie – ultrasone behandeling

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

DNA transfer via chemische of fysische weg

N

Chemische methoden – transformatie (transfectie)

Calciumfosfaat co-precipitaat methode

- DNA/calciumfosfaat co-precipitaat afzetting op de

membraan en daarna internalisatie door endocytose

- migreert naar de nucleus voor expressie

- “coating” van cellen door het co-precipitaat is nodig ; werkt daarom

best voor cellen in monolayer- of suspensie-cultuur, maar niet erg

geschikt voor cellen in “clumps” (klompjes)

- 1-2% van de cellen nemen DNA op - slechts beperkte stabiele transformatie

- optimalisatie via specifieke buffersystemen voor trage precipitatie en

optimale balans tussen DNA, calciumfosfaat, buffer/pH

N

Diethylaminoethyl dextraan dextraan

DEAE

Gebruik van polyplexen

- DEAE-dextraan (diethylaminoethyldextraan) – een polykationisch polymeer koolhydraat in complex met DNA - polykationische componenten die spontaan oplosbare complexen

vormen (“polyplexen”) - elektrostatische interactie met DNA - initiëel ontwikkeld voor “probleem”cellen die moeilijk te transformeren

waren met de calciumfosfaat methode - nieuwe generatie polykationische componenten (zie Tabel 12.1 : Primrose & Twyman)

bvb. poly-L-lysine, spermine, polyethylenimine, dendrimeren synthetische polyaminen (veel aminogroepen - positieve ladingen)

- ook voor in vivo gentransfer : controle over genexpressie en ‘gene delivery’via specifieke polymeren met veranderende eigenschappen bvb. onder invloed van temperatuursregulatie

N

Liposomen en lipoplexen

- verpakking in liposoom (artificiële, ‘fusogene’ fosfolipidevesikels) => membraanfusie

(eerste voorbeeld : Schaffner in 1980 : fusie van bacteriële protoplasten met dierlijke cellen om DNA binnen te brengen)

- kationische/neutrale lipidemengsels vormen stabiele complexen met DNA

=> lipoplexen

- mogelijkheid tot transformatie van grote DNA’s = “zachte” weg - hoge efficiëntie van transformatie (tot 90% van de cellen) – zowel transiënt

als stabiel - transformatie m.b.v. liposomen = lipofectie

- mogelijkheid van transformatie van cellen inlevende organismen na injectie in doelwit-cellen (‘gene delivery’) : optimalisatie door

insertie van virale eiwitten die celfusie promoten of targeting naar specifieke cellen.

Kationisch liposoom in interactie met DNA = lipoplex

N

Fysische methoden – transformatie (transfectie)

Elektroporatie- transiënte vorming van poriën (nm-grootte)- blootstelling aan elektrische puls - intensiteit/tijd - empirische optimalisatie- eenvoudig - reproduceerbaar- mogelijkheid in vivo gentransfer - op oppervlak met elektroden/naaldelektroden

Ultrasone transfectie- snel oscillerende probe (tip sonicator)- ‘inklappen’ van membranen - ‘cavities’ – transiënte doorgang van DNA door

membranen- zowel in vitro als in vivo ‘gene delivery’Micro-injectie- directe transfer tot in de cel- enkel toepasbaar voor beperkt aantal cellen- meestal toegepast op grote celtypes, bvb. oöcyten- in vivo en in vitro

“Particle bombardment”- directe transfer tot in de cel- initieel ontwikkeld voor transformatie van planten- kleine metalen (gouden) partikels worden gecoat met DNA en m.b.v. kracht geïntroduceerdN

Bacteriële gentransfer – bacteriële vectoren

• Transfer naar planten, m.b.v. Agrobacterium tumefaciens (zie hoofdstuk 16 Plant)

• A. tumefaciens kan ook DNA introduceren in dierlijke cellen (2001)

• A. tumefaciens :

- transfer zonder invasie (blijft in de extracellulaire ruimte)

- aanhechting en vorming pilus : DNA transfer via een conjugatief mechanisme

• Bactofection van dierlijke cellen door invasie met de bacteriën :

- o.a. Salmonella spp., Listeria monocytogenese, Shigella flexneri(mogen niet pathogeen zijn, kunnen desondanks storende neveneffecten veroorzaken bij lyse ; of reacties bij gentherapeutische toepassingen)

- invasief in cytoplasma (Listeria, Shigella) of in vacuole (Salmonella, Yersinia) opname in de cel, vervolgens lyse + vrijstelling van plasmide migreert naar de nucleus ; expressie naargelang de expressiesignalen

- verzwakking (‘attenuation’) nodig - zoniet vernietiging van de gastheercellen auxotrofe mutanten of stammen met induceerbare autolysis

DNA transfer via biologische weg : bactofection

N

• Toepassingen : o.a. gentransfer in vitro en in vivo : vb. afleveren van

recombinante DNA

vaccins

nb. Bij ‘alternatieve gentherapie’ worden de bacteriën

actief behouden en wordt het eiwit in situ (in vivo)

tot expressie gebracht door de bacterie.

Vergelijking van de voornaamste vectortypes in functie van diverse parameters

Virale vectoren Niet-virale vectors Bacteriële vectoren

Veiligheid + +++ +

Efficiëntie +++ + +

Lage productiekost + ++ +++

Eenvoud van productie + ++ +++

Eenvoudige ‘delivery’ ++ + +++

Hoeveelheid toegeleverd DNA ++ + +++

N

DNA transfer via biologische weg :

De eerste experimenten (met fysische en chemische transformatiemethoden) werden initiëel

toegepast met complexe mengsels van DNA of afzonderlijke gensequenties, bij gebrek aan vectorsystemen. Met de karakterisatie van het SV40 genoom kwam de eerste mogelijkheid om virale en nadien plasmidevectoren te ontwikkelen

Gebruik van plasmidevectoren :

Voordelen :- gemak van in vitro manipulaties- introductie van modulaire elementen (e.g. promotersequenties) die onafhankelijk van het transgen bruikbaar zijn- selectiemerker op het construct omzeilt de noodzaak van co-transformatie (transgen en selectiemerker zijn gekoppeld : zie verder)- mogelijkheid tot constructie van pendelvectoren - vereisen geen integratie in het genoom - episomaal stabiel

Runaway replicon : een replicon zonder, of induceerbaar tot verlies van, ’copy number’ controle :

deze afwezigheid of verlies leidt tot ongecontroleerde replicatie en extreme toename van het aantal kopijen van het DNA waarin dit replicon ingebouwd is. Celdood kan een gevolg zijn zodat toepassing vooral op DNA en eiwitproductie gericht is. Zie voorbeelden verderop.

Virus- (of plasmide-)gemedieerd : transductie

Hier, gezien de historische context, behandeld samen met het exploreren van fysische of chemische transformatiemethoden, aangezien dit samenging met de opbouw van de eerste dierlijke virusvectoren ; transformatie met “vrij” DNA of met een replicon.

Transformatie gebeurt in twee ‘stadia’ :

introductie van DNA in de cel (transfectie = algemene term voor onderscheid met infectie)

incorporatie in de nucleus (veelal door integratie in het gastheerchromosoom)

Resultaat van transformatie :

indien tijdelijke toestand = transiënte transformatie/transfectie - effect kortstondig

onderscheid dus tussen transiënte versus permanente (‘stabiele’) transformatie=> ‘amplificatie’ mogelijk met methotrexaat

integratie in het genoom - is overerfbaar - kan leiden tot stabiele transgene cellijn integratie = inefficiënt selectie is vereist

"Klonering”

=> het betreft hier transformatie van somatische cellen in cultuur (voor wijziging van ‘germline’ cellen en eventuele aanmaak van transgene dieren zijn er andere vereisten) ; slechts een kleine fractie van het inkomende DNA zal integreren in het cellulair genoom maar kan aanleiding geven tot een nieuwe cellijn met nieuwe karakteristiek.

=> principe van ‘co-transformatie’ : het binnenkomende DNA concatemeriseert tot grote moleculen vooraleer het integreert in het genoom. Twee verschillende DNA’s hoeven dus niet gekoppeld te worden (mag uiteraard wel) : dit gebeurt in de cel. Een gen samen met een selecteerbare merker bleken samen (in elkaars buurt) geïntegreerd te zijn.

Reporters : (verdere informatie in Primrose & Twyman : pp.229-230 en 310-311)

- CAT : radiochemisch, chromatografie, ELISA (intracellulair)

- Alkalische fosfatase : kleur, fluorografie (secretie)

- LacZ : kleurvorming, ...

- GusA : kleurvorming, ... (gusA gen = uidA gen : glucuronidase-gen)

- luciferase (luciferine, ATP, Mg2+) : flash

- GFP (UV/blauw => groen fluorescent) en varianten(vereist geen substraat ; vooral nuttig voor localisatie-experimenten)

Merkers :

- uit het nucleotidemetabolisme (TK, HPRT, APRT, ...)

- exogene, dominante (neo, nptII (aphII) : geneticine; ...)

- "amplificatie" : methotrexaat : competitieve inhibitie van DHFR

resistentie door - mutaties in DHFR- verhindering opname

- verhoogde doelwitdosis

Merkers en selectie, en reporters

*

Endogene selectiemerkers (Primrose & Twyman, voor een korte lijst in Tabel 12.2en beschrijving in Fig 12.3)

Voorbeeld: Tk = thymidinekinasegen

historisch : experiment met muiscellen deficiënt in TK - te transformeren metHerpes Simplex Virus (HSV) Tk gen => resultaat : activiteit herwonnen

transformanten te selecteren op HAT-medium (hypoxanthine - aminopterine -

thymidine) : aminopterine blokkeert de de novo synthese van dTMP (en

dus van dTTP) voor achtergrond : zie figuur op volgende slide - ‘de novo’ en ‘salvage pathway’ toepassing : bij co-transformatie met andere transgenen die men wou overbrengen :

transfectie met 2 ongekoppelde DNA’s resulteerde in 90% co-

transformanten ;

m.a.w. TK+ cellen waren ook positief voor het niet-selecteerbare gen (uit

analyse van deze regio bleek dat concatemeren tot 2 Mbp waren gevormd voor integratie

optrad)

Merkers Drie types selectiemerkers in zoogdiercellen

• Endogene selectiemerkers - bruikbaar bij mutante cellijnen• Dominante selectiemerkers• ‘Kwantitatieve’ selectiemerkers

Endogene selectiemerkers : voorbeelden

Uridine

DHFR

Dominante selectiemerkers (uitgebreide lijst in Primrose & Twyman, Tabel 12.3)

bruikbaar voor alle gevoelige cellijnen – nieuw fenotype meestal antibioticumresistentiemerkers van bacteriële oorsprong neomycinefosfotransferase – resistentie aan aminoglycosideantibiotica

(kanamycine, neomycine, G418) – proteïnesynthese-inhibitoren selectiemerker wel onder transcriptieregulatie van eukaryotische elementen

te plaatsen (bvb. HSV Tk promoter, SV40 ‘vroege’ promoter)

‘Kwantitatieve’ selectiemerkers (uitgebreide lijst in Primrose & Twyman, Tabel 12.4)

stapsgewijze (random) amplificatie van de merker waardoor de cel ongevoelig wordt voor lage dosissen van de inhibitor/’drug’ toelaatbare concentratie – indicatie voor ‘kopijaantal’ transgen vb. dhfr-locus - dihydrofolaatreductase - methotrexaat is competitieve inhibitor voor

deze enzymatische activiteit : schakelt de novo synthese van dUMP en dIMP uittoepassing: co-amplificatie van transgenen die gelijktijdig met DHFR geïntroduceerd

werden - expressieniveau tot zeer hoog op te drijven Vb. methotrexaat-selectie voor grootschalige expressie : gradueel opdrijven van de concentratie methotrexaat ; kan tot 10.000 maal de basis toxische concentratie tolereerbaarmaken (o.a. toegepast voor productie van weefselplasminogeenactivator).

Simian virus 40 (SV40) : eerste dierlijke virus dat onderzocht werd als mogelijke

vector

sequentie van het DNA genoom (5224 bp) bekend in 1978

Geïsoleerd uit de Rhesus aap : in 1960 uit culturen van niercellen, die werden gebruikt voor de

aanmaak van het poliovaccin : controversieel toen bleek dat miljoenen mensen het hadden

gekregen via het gecontamineerde vaccin.

Papovaviridae (Papilloma, polyoma, vacuolating agent) (SV40 is een polyoma virus)

SV40 is “slapend” en asymptomatisch in Rhesus apen. Bij de mens kan het een nierziekte

veroorzaken. In andere species, vooral hamsters, veroorzaakt het tumoren. (Ook in de rat

werd een tumormodel ontwikkeld.) Een formeel bewijs van een rol van SV40 bij tumor-

vorming bij de mens ontbreekt (hoewel SV40-sequenties in heel wat tumoren gevonden werden).

Groei op niercellen van de aap (AGMK, CV1, …)

Structuur : 5243 bp (2 zeer kleine restrictiefragmentjes werden pas later ontdekt), circulair DNA chromatinestructuur (nucleosomen) ; rol van histon H1 (zie foto volgende slide)

viruspartikel : icosahedraal, VP1, VP2, VP3

Genetische opbouw : "early" & "late" gebied, OR (replicatiefunctie)

Lytische ontwikkeling versus cellulaire transformatie

Replicons Repliconvectoren (viraal) - plasmidevectoren

*

Vectoren voor dierlijke cellen, gebaseerd op SV40 *

SV40 ori-gebied (details op volgende slide)

*

De origin voor SV40 DNA replicatie wordt voorgesteld door de ellips met erin een ruit(tussen posities 5207 en 31). De belangrijkste elementen zijn een 27 bp palindroom en de aansluitende 17 AT-bp sequentie ("AT-block"). Als nulpunt (G) is de centrale positie genomen van het 27 bp palindroom (positie 1 ligt dus bij het volgende bp.)

Het ligt aan de rechterzijde van een unieke BglI herkenningsplaats.

cagaggccgaggcGgcctcggcctctg

BglI GCCnnnnnGGC

........0123456789 nummering

Transcriptie van zowel het vroeg als laat gebied wordt geregeld door een (schijnbaar) bidirectionele promoter die de AT-block, 21 bp herhalingen, en de sequentie van de identische 72 bp gebieden omvat. (“schijnbaar” omdat deletie van sommige repeats een verschillend effect heeft op vroege versus late transcriptie.)

Het kleinste ‘vroeg mRNA’ codeert voor groot-T antigen. Het grootste ‘vroeg mRNA’ voorklein-T antigen, hoewel het gehele vertaalde gebied (dus ook het stoptriplet) voor de positievan het intron ligt. Er is een (gemeenschappelijk) polyadenylatiesignaal, maar er is geen specifieke afstand vereist (m.a.w. bij deletiemutanten verschuift de positie naar links of rechts).

Een groot intron zorgt voor het VP1 ‘laat mRNA’. De andere VP-eiwitten worden op grotere mRNAs gecodeerd (kleinere introns, diverse groottes).

Transcriptiekaart van SV40.

ORI ligt op positie 5243/0

Vroege transcriptie in tegenwijzerzin. 2 mRNAs door verschillende splicing (large-T + small-t)

Late transcriptie in wijzerzin.2 mRNAs, één voor VP1, andere voor VP2 + VP3

Gestippelde zones zijn de introns.

*N

‘Runaway’ polyoma replicons – replicerend, maar celdood

SV40 DNA

• 2 transcriptie-eenheden : vroeg en laat• meerdere producten door alternatieve splicing• Vroeg : regulatorische eiwitten• Laat : capside-eiwitten• Regulatie: regulatorische sequenties tussen

vroege-late regio• In regulatorische regio :

vroege + late promoter, enhancer, ori

• Vroege eiwitten : t en T tumor antigenen• T-antigen is vereist voor replicatie en de

oncoproteïne-eigenschappen

(Bemerk, en hou rekening met, de omgekeerde orientatie van de cirkel t.o.v. vorige figuur.)

*

Verloop van een SV40 infectie in permissieve en in niet-permissieve cellen.

Tot ongeveer 14 uur na infectie (vroege fase) is de de ontwikkeling gelijklopend. - In permissieve cellen volgt dan DNA replicatie, late eiwitsynthese, virusvorming en celdood. - In niet-permissieve cellen integreert het virale DNA in het cellulair DNA en kan “celtransformatie”optreden als expressie van groot-T antigen aanhoudt.

N

Infectieprocesontmanteling : 8 uvroege fase: vroege mRNA's, vroege eiwitten : 4 ustart replicatie + late fase : late mRNA's en eiwitten : vanaf +/- 24 umaturatie : inpakking en cellyse

Aanmaak COS cellen : SV40 DNA gelineariseerd met BglI (3 bp uitstekende uiteinden)

afsplitsing van de uitstekende uiteinden en ligeren=> enkele bp in ORI verloren = ORI is inactief

transformatie cellen : detectie T-antigen (op basis van fluorescentie)

COS cellen : constitutieve expressie van T-antigen door het celgenoom=> T-antigen wordt in trans voorzien.

Naam COS : CV-1 van oorsprong (Origin), met SV40

CV-1 : een cellijn afgeleid van niercellen van de African green monkey aap. Immortalisatie door transformatie met het replicatie-deficiente SV40 DNA (COS cellen).Brengt wel nog het T-antigen tot expressie.

Twee vormen van COS cellijnen : COS-1 (nog permissief voor lytische groei van SV40) en COS-7 (bevat defectieve genomen maar zet geen infectieve viruspartikels vrij).

niet N

N

niet N

Belangrijkste karakteristieken

Basisgegevens :

replicatie : ORI : minimaal 70 bp

bi-directionele replicatie

bij elke replicatieronde is opnieuw T-antigen nodig

ORI : sluit promotoractiviteit in op beide strengen (tegengestelde richtingen)

- vroege mRNA’s : 19S (T en t)

- late mRNA’s : 16S (VP1) en 19S (VP2 en VP3)

Beperkte inpakmogelijkheid : tot 110% van het genoom

(30% deleties mogelijk)

=> dit limiteert vectorconstructie

Bij pendelvectoren ( zie verder) moet rekening gehouden worden met zogenaamde

“toxische” sequenties van pBR322 : dit zijn sequenties die de efficientie van

transformatie van dierlijke cellen verminderen. Zij zijn gesitueerd in het gebied

rond de nic/bom plaats van het plasmide.

*deels N

Types SV40 vectoren : hoe, en welke, vectoren ontwikkeld op basis van SV40 elementen?

- transducerende vectoren (met helper virus) : inpakbaar, replicerendlate replacement vectors : 2 soorten virions

early replacement vectors : 2 soorten virions

in COS cellen : zuivere virions

- plasmide vectoren : niet-inpakbaar, replicerendgevolg van de vaststelling dat in COS cellen het viraal DNA repliceert, ook als

het late gebied verwijderd is. Er worden dan uiteraard geen virions meer

gevormd, dus geen plaques : er is bijgevolg een selectiemerker nodig. Er bleek

ook geen grootte-beperking qua inserties te zijn.

- passieve vectoren : niet-inpakbaar, niet-replicerendhet DNA kan niet repliceren (niet-permissieve cellen), maar is alleen behoudbaar

door integratie in het celgenoom. Dit werd mogelijk zodra selectiemerkers voor

dierlijke cellen beschikbaar waren (en is dus bruikbaar in een groot aantal

verschillende celtypes, ongeacht hun permissiviteit voor SV40).

- pendelvectoren met E.coli plasmide : "toxisch" gebied (uit pBR322) te vermijden een SV40 replicon samengevoegd met een E. coli replicon.

ook twee selectiemerkers vereist, één voor elk van beide waardcellen.

N

Belangrijkste karakteristiekenWerken met :

(complementatie)

N

nb. in deze en volgende figuur : vroegere nummering van het SV40 DNA vanaf de EcoRI knipplaats (in het VP1 gen) met het late gebied in wijzerzin.

Complementatie van SV40

transducerende vectoren met

defectieve helpers (ts-mutanten).

Hetzij het "laat-DNA" (bovenaan)

hetzij het "vroeg-DNA" (onderaan)

is vervangen.

Een temperatuur-gevoelige

tsA mutatie geeft een mutant T,

een tsB mutatie een mutant VP1.

N

Complementatie door COS cellen,

van een SV40 tranducerende

vector zonder groot-T gen.

Het "laat-DNA" is vervangen door

nieuwe insertsequenties. Na

transfectie zijn alle eiwitten voor

replicatie en verpakking aanwezig :

T-antigen vanuit de COS cellen,

VP1, 2 en 3 vanop de vector.

niet N

Belangrijkste karakteristieken

Werken met :

N

niet N

SV40 plasmidevectoren.

Meestal pendelvectoren : bevatten ongeveer2,3 kb pBR322 sequenties met de ori en hetbla gen, voor klonering in E. coli. Het SV40 segment in de vector is het gebiedvan 5171 tot 270 (in wijzerzin) waarin de ORI ligt en ook de promoter-activiteit voor vroege transcriptie. Hierachter is een selectiemerker voorzien,waarachter de SV40 sequenties voor polyadenylering (rond positie 2500) liggen, zodat een actief mRNA gevormd wordt.

pSV2 repliceert in COS cellen, maar niet in gewone apencellen waarin geen groot-T antigen aanwezig is. pSV3 repliceert wel ingewone apencellen, aangezien het groot-T groot-T gen ingebouwd is in de BamHI plaats van pSV2.

pSV2 en pSV3 kunnen ook insereren in het celgenoom en permanente transformatie veroorzaken. Aldus groeit 1 cel op 104-105 tot een kolonie in aanwezigheid van mycofenolzuur (een immunosuppressief agens).

-gpt

-gpt

N

Plasmidevector met expressie-eenheid op basis van het oncovirus RSV (Rous sarcoma virus) (RNA genoom) met LTR die specifieke integratie in het gastgenoom mogelijk maakt, evenals hoge genexpressie.

Plasmidevectoren

N

Samenvattend : SV40 – virale vectoren • eerste vectoren, virale vectoren gentransfer via transductie ; lytische infectie virions • verplaatsing van vroege of late regio ; voorzie de ontbrekende regio in trans door co-introductie

van een helpervirus• vereenvoudiging door COS-cellijn : gen van T antigen genomisch in trans voorzien bij vectoren

met uitgewisselde vroege regio• nadeel : capaciteit viraal capside : max. ~ 2.5 kb te incorporeren ;

SV40 ori op plasmiden• voordeel : geen grootterestrictie• enkel ori nodig replicatie in COS cellijn ; ori + gen T-antigen in permissieve cellen• transiënt hoge expressie - aanmaak van grote hoeveelheden recombinant eiwit : bvb. in pcDNA3.1• ‘runaway’-karakter (groot aantal kopijen => grote hoeveelheden DNA) veroorzaakt celdood• !! ontwikkeling van stabiele episomale vectoren mogelijk door regulatie van T antigen expressie

(met conditionele promoter - temperatuursensitieve mutanten - e.d.)

Niet-replicerende plasmiden• niet-replicerende plasmiden blijven korte tijd extrachromosomaal in de cel aanwezig (lineair

DNA wordt te snel afgebroken in zoogdiercellen, dus bij voorkeur cccDNA of covalent gesloten

ocDNA).• goed bruikbaar om snel met transiënte transformatie constructen uit te testen (regulatorische

gebieden aangekoppeld aan een reportergen, aanmaak van een beperkte hoeveelheid van een

nieuw recombinant eiwit (ter test, vooraleer een nieuwe stabiele cellijn te maken voor

grootschalige

productie).• integratie in niet-permissieve cellen onder selectiedruk vanop het plasmide (geen co-transformatie

nodig). Diverse vectoren zijn ontwikkeld (inclusief van SV40) vooral voor expressiedoeleinden.

deels *deels N

Transcriptie/translatie-vereisten

uitgebreidere beschrijving in Primrose & Twyman, Tabel 12.2)

maximalisatie transgenexpressie gebruik van een sterke promoter

- Vb. adenovirale of vaccinia virus promoters

- SV40 vroege promoter + enhancer

- CMV (cytomegalovirus) vroege promoter

!!! Activiteit is afhankelijk van celtype

aanwezigheid van een intronsequentie : bevorderlijk voor expressie polyadenylatiesignaal (terminatoren) - voor correct 3’ uiteinde van het mRNA

- toevoeging van > 100 adenylaat-residu’s

- vaak poly(A) van SV40 vroege transcriptie-eenheid of muis -globine mRNA

- verhoogde stabiliteit

3’UTR en 5’ UTR regio’s van mRNA worden best (grotendeels) weggelaten in cDNA optimalisatie van transgen voor expressie :

- consensus rond translatie-initiatieplaats

- codonkeuze : potentieel tekort aan preferentiële codons : codonoptimalisatie voor de

betrokken gastheer

signaalsequentie voor secretorische pathways, bvb. Ig lichte keten

Aantal voorbeelden enkele slides verder

*N

Voorbeeld van expressieconstruct in een ‘runaway’ polyoma replicon

• PCMV = humane CMV (cytomegalovirus) promoter

• EK = enterokinase knipplaats voor verwijdering tags

BGH : “bovine growth hormone” sequentie

pA : polyadenyleringssignaal

Hoog expressieniveau in COS cellen(ORI tot 105 kopijen/cel).

celdood ; beperkt aantal cellen zijn getranfecteerd

neo als selectiemerker, tussen SV40-promoter en poly(A)-signaal

Zie ook hoofdstuk Expressievectoren en eiwitproductie voor nadere beschrijving van de diverse elementen

*N

Ter illustratie van verdere ontwikkelingen met andere virussen

Algemene basisaspecten en overwegingen voor en bij gebruik van (andere) virussen voor gentransfer en expressie.

Papillomavirussen (mens, rund, …) (wratten, …)

Adenovirussen

Herpesvirussen (EBV, e.a.)

Baculovirus (bij insecten)

Retrovirussen

e.a.

Verder ook : C. elegans (Caenorhabditis elegans - nematode) als modelorganisme)

Zeer veel virussen en hun genomen werden onderzocht als mogelijkheid tot vectorontwikkeling en klonering, in functie van hun typische karakteristieken, gastcelspectrum, specifieke toepassingen, enz…

N+ verder

Virussen als gentransfervectoren - transducerende vectoren

• Transductie : horizontale DNA-transfer via mechanisme van virusinfectie• Gentransfer in vitro (celculturen) en in vivo (gentherapie toepassingen)• Insertie van een transgen of omwisseling van virale sequenties voor een transgen• Insertie door ligatie of homologe recombinatie• Helper-onafhankelijk : kan zich autonoom repliceren + propageren• Helper-afhankelijk : virale elementen moeten in trans voorzien worden

co-infectie met helpervirus ; helperplasmide voorzien of een

‘complementaire cellijn’ (ook ‘packaging’ cellijn)

• Vaak gewenst : afwezigheid van virale coderende sequenties enkel amplicons

overhouden (cis-elementen)

voordelen : niet-cytotoxisch en grotere inserten mogelijk• Keuze virale vector :

afhankelijk van de te transformeren gastheer

type expressie (stabiel - transiënt)

hoeveelheid te verpakken DNA

adenovirus - retrovirus - beperkte verpakkingscapaciteit

(icosaëdrale hoofdjes)

baculovirus - staafvormig - minder strikt

Expressie :

BPV – Bovine papillomavirus

• Historisch - de eerste episomale vectoren

(verre verwantschap met polyomavirussen)

• Kan muiscellen infecteren, zonder virus

te produceren

• Kopijenaantal ~100 (geen integratie)

• Ook T antigen (replicatie + oncogene

transformatie gastheercel)

(vroegste deel van infectie similair aan SV40 infectie, latere meer complex)

• Vroege functies op 69% fragment - BPV69T

• selectiemerker neo - selectie op geneticine

• Vb. expressie humaan –globine

• Nadeel : recombinatie - deleties - zekere vorm van instabiliteit

Papilloma virussen : episomaal - structureel onstabiel

Papilloma virussen : human BK replicon ; episomaal - structureel onstabiel

BK virus (mens polyomavirus) JC (of JCV) is een ander voorbeeld ;beide hebben ongeveer 70% homologie met SV40 DNA)

• Virus dat latente infectie veroorzaakt (infecteert meerdere celtypes)

• Behoud als episomaal replicon (geen verpakking in virions)

• Geen integratie => geen ‘positie-effect’ (zoals bij geïntegreerde transgenen)

• Relatief laag kopijenaantal = replicon interfereert niet met gastheercelgroei

• Plasmiden met ‘latente’ ori (geen inpakking in capsiden)

• Voordeel t.o.v. integratieve vectoren: geen integratiespecifieke beïnvloeding

van expressie (m.a.w. geen ‘positie’-effect)

• Humaan BK polyomavirus –– kopijenaantal ~500

kan opgedreven orden tot ~ 9000 (door toenemende concentratie ‘antibiotica’

waartegen een resistentiegen aanwezig is, bvb. neoR)

• BK T-antigen kan voorzien worden in trans

Voorbeeld van een BKV vector (replicon)

BKV ori

T antigen - functies

Epstein-Barr virus gebaseerde plasmiden – stabiele expressie

• EBV : zeer stabiele replicatie in mens-cellen (+ mammalia in het algemeen)

• EBV - herpesvirus - dsDNA ~170 kb

• oorzaak van mononucleosis (‘klierkoorts’)

• episomaal replicon, ~ 1000 kopijen

• onder natuurlijke omstandigheden : alleen infectie van lymfocyten, maar na

transfectie ook in tal van andere primaatcellen te behouden

• vereist voor episomale replicatie: latente oriP en trans-werkende regulator (EBNA1)

• EBV-gebaseerde expressievectoren – 2 tot 50 kopijen per cel

• selectie : ‘neomycine’ of ‘hygromycine’ selectiemerkers - stabiele aanwezigheid

• gebruik : episomale cDNA banken

• introductie van oriP in YACs

in vitro circularisatie introductie in humane

cellen

Epstein-Barr virus gebaseerde plasmiden – stabiele expressie

Adenovirale vectoren voor ‘kortstondige’ transiënte expressie

Adenovirus en adenovirus-afgeleide vectoren

• lineair, dsDNA genoom (~37 kb)

• 6 vroege transcriptie-eenheden (E) : virale replicatie

• 1 majeure late transcriptie-eenheid (MLT) : capside-eiwitten

• veel gebruikt als gentransfer- & genexpressievector & attractief voor

faagtherapie (efficiënte opname – neg./inflammatoire respons – immuunsysteem)

• voordelen: stabiliteit, hoge capaciteit vreemd DNA, hoge titer (1011 pfu/ml),breed gastheerspectrum

• transiënte expressie in delende cellen – geen efficiënte integratie

Adenovirus genoom

Adenovirale vectoren:

- eerste generatie : replicatiedeficiënt : ‘E1 replacement vectors’

- kloneercapaciteit cfr. ‘uitgewisseld’ gedeelte ~7 kb

- productie in de humane embryonale niercellijn 293 die de linker 11% van het adenovirus DNA bevat complementatie van functies in trans

- ook andere ‘E’-regio’s verwijderd eventueel grotere inserties (~10 kb capaciteit)

- nadelen : virale expressie – cytotoxiciteit eventueel recombinatie met geïntegreerde complementerende sequenties

- enkel amplicon overhouden

- grote capaciteit (~ 37 kb)

- minimaal cytotoxisch langere expressie

- nadeel : geen cellijn die alle functies in trans voorziet verpakking vereist helpervirus risico van contaminatie

Vectorafgeleiden van het adeno-geassocieerd virus - integratief

Adeno-associated virus (AAV)

• AAV : ontdekt als contaminant in een adenoviraal preparaat

• ssDNA virus - Parvoviridae

• AAV-genoom : ~5 kb

• rep (replicatie) en cap (capside) genen geflankeerd door 145 nt omgekeerde herhalingen

• van nature replicatiedeficiënt - vereist ander virus (bvb. adenovirus, herpesvirus) voor lytische infectiecyclus

• zonder ‘helper’ : integratie in het genoom (constante locus - chromosoom 19) latent provirus ‘rescue’ door o.a. een adenovirus-infectie

• noodzaak van helperinfectie = controle over virusreplicatie – veiligheid bij gentherapietoepassing (samen met specifieke integratie)

Vectorontwikkeling :

• Rep proteïnen interfereren met endogene promoters cytotoxisch effect

• deletie rep en cap genen LTR enige noodzakelijke elementen voor

replicatie, transcriptie, provirale integratie (eventueel niet plaatsspecifiek in

afwezigheid van Rep-eiwitten) en ‘rescue’.

• transfectie van AAV-afgeleid construct : LTR + transgen (in plasmidevector)

+ AAV-functies (helperplasmide)

- transfectie-gebaseerd adenoviraal helperplasmide (virusvorming)- affiniteitschromatografie voor opzuivering AAV-partikels – zoniet contaminatie

met adenoviruspartikels

• in principe beperkte capaciteit verpakking vreemd DNA - aflevering van beperkte

beperkte hoeveelheid DNA omzeilen via co-introductie van 2 segmenten

op 2 vectoren vectorconcatemerisatie in doelwitcel

Baculovirus-afgeleide vectoren: hoog expressieniveau in insectcellijnen

• staafvormig capside

• groot dsDNA genoom

• gastheer: insekten

• bepaalde baculovirussen : polyhedrosis virussen – productie van

‘nuclear occlusion bodies’

virions omgeven door eiwitlaag (polyhedrine) – extra bescherming

polyhedrine productie - hoog - sterke promoter

polyhedrine is niet essentieel (voor geslaagde infectie van cellijnen)

polyhedrine-gen uit te wisselen voor een transgen

= polyhedrine ‘replacement’ vectoren

(hoog expressieniveau - 1 mg/106 cellen)

• Meest toegepast :

‘Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus’ (AcMNPV)

eiwitexpressie in cellijnen (bvb. Sf9, Sf21)

‘Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus’ (BmNPV)

infectie zijderups - recombinante eiwitexpressie in organisme

Endocytosis van baculovirusBaculovirus

• ‘replacement vectors’ uitwisseling van polyhedrine-gen : screening van recombinanten :

* Wild-type virus productie occlusion bodies opaque plaques

=> recombinanten geen occlusion bodies heldere plaques

* E. coli lacZ gen in leesraam blauw-wit onderscheid

* ‘Green fluorescent eiwit’ (GFP) in leesraam

‘polyhedrine replacement vectors’

Opmerking bij deze illustratiemeer succesvolle systemenwerden ontwikkeld met een grotere deletie dan enkel het polyhedrine-gen

• Klonering door homologe recombinatie tussen polyhedrine-gedeleteerd viraalDNA en vector met transgen en homologe regio’s

* nadeel bij beperkte deletie : lage frequentie recombinanten (0,5-5 %)

* oplossing met gelineariseerd DNA door homologe recombinatie in een wild-type baculovirus met grote deleties (defectief); circulariteit

enkel te herstellen door homologe recombinatie met een vector waarin het target transgen + replicon : wordt replicatie competent.

leefbaar, recombinant genoom tot 90% recombinanten* bacmid : gebaseerd op elementen uit een fusie van een BAC vector

met een baculovirus (gebaseerd op plaats-specifieke transpositie) (figuur

volgende slide)• Glycosylatie : - is mogelijk : echter : glycosylatiereactieweg verschillend tussen insecten

en zoogdieren => mogelijk onjuiste glycosylatie immunogeen recombinant

eiwit - oplossing : cellijnen die zoogdiereigen glycosylatie uitvoeren

of co-expressie van geschikte glycosylatie-enzymen

- vb. expressie van plasminogeenactivator (gegalactosyleerd) => de Sf9-cellijn brengt het 1,4-galactosyltransferase tot expressie

(onder controle van een vroege baculoviruspromoter, dus induceerbaar door baculovirus infectie). Een baculovirus vector die een plasminogeenactivator transgen tot expressie brengt wordt hierdoor correct

geglycosyleerd.

Herpesvirus vectoren – latent – mogelijk lange termijn transgenexpressie

Herpesvirussen - groot dsDNA - o.a. EBV, HSV, Varicella zoster

• HSV-1 gebaseerde transducerende vectoren

• na transfer door transfectie – compatibel met vele cellijnen

• evenwel : via transductie - voor gentherapie - neurotopisch =

gericht naar zenuwcellen

• groot virus - transgenklonering via homologe recombinatie in getransfecteerde cellen

• alternatief : plasmide-gebaseerde ampliconvectoren - enkel cis-elementen (replicatie & verpakking) + verpakkingssystemen voorzien in trans

• gentransfer in vivo naar neuronen

Retrovirale vectoren – efficiënte genomische integratie

• Retrovirussen : RNA-virussen die repliceren via DNA-intermediair

• Integratie in genoom gastheercel

• Vectorontwikkeling - belangrijke kenmerken:

- sommige acuut oncogeen - replicatie-deficiënt

- geen gastheerafdoding - continue productie

- vaak sterke promoters - hoge eiwitexpressie (mogelijk induceerbaar)

- sommige breed celspectrum

- geschikt voor vectorontwikkeling door beperkte genoomgrootte

(in vitro-manipulaties eenvoudig) - hoge titers - efficiënte

infectie• Nadelen: velen – enkel efficiënte infectie van delende cellen

beperkt qua gentherapie-toepassingen

• Lentiviridae (o.a. HIV) wel mogelijkheid van infectie van niet-delende cellen

Oncoretrovirussen - genoom

• Boven: geïntegreerd provirus – LTR PB = primer binding sites - virale replicatie

• Onder : verpakt RNA

Geïntegreerd genoom bevat gag, pol, env genen : gag structurele eiwitten pol reverse transcriptase env enveloppe-eiwitten

Viraal RNA afgeschreven van promoter in linker LTR en stopt napolyadenyleringssignaal in rechter LTR. Ook capping.

Gag-pol fusieproteïne processing tot meerdere polypeptiden

Deel RNA splicing gag-pol en translatie env

Twee kopijen RNA genoom verpakt + reverse transcriptase & integrase