UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

Anthelminticumresistentie bij het rund

Door

Emiel GOVAERT

Promotor: Prof. Dr. Jozef Vercruysse literatuurstudie in het kader

Copromotor: Dr. Johannes Charlier van de masterproef

© 2015 Emiel Govaert

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking

tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de

inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken

op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud

van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie

vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

Anthelminticumresistentie bij het rund

Door

Emiel GOVAERT

Promotor: Prof. Dr. Jozef Vercruysse literatuurstudie in het kader

Copromotor: Dr. Johannes Charlier van de masterproef

© 2015 Emiel Govaert

VOORWOORD

Eerst en vooral zou ik graag mijn promotor Prof. Dr. Jozef Vercuysse bedanken. Hij heeft mij

tijdens onze eerste ontmoeting heel goed op weg geholpen en duidelijk gemaakt wat hij van

mij verwachtte. Eveneens dien ik hem te bedanken voor de snelle en correcte communicatie,

iets wat niet altijd van mij gezegd kan worden.

Graag zou ik ook mijn ouders bedanken, die het mij mogelijk hebben gemaakt om de studie

diergeneeskunde te kunnen aanvatten. Uiteraard mag ik mijn broers en zus ook niet

vergeten. Zij hebben de afgelopen jaren vooral tijdens de examens heel veel geduld met mij

moeten hebben. Het vele blokken en de weinige uren slaap maakten van mij niet het meest

aangename lid van de familie.

VRIJWARINGSCLAUSULE

TITELBLAD

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING.....................................................................................................................................1

INLEIDING...............................................................................................................................................2

LITERATUURSTUDIE................................................................................................................................3

1. DE PREVALENTIE VAN ANTHELMINTICUM RESISTENTIE BIJ RUNDVEE.........................................3

2. TESTEN VOOR HET OPSPOREN VAN ANTHELMINTICUM RESISTENTIE.........................................6

2.1. IN VIVO METHODE: FECAL EGG COUNT REDUCTION TEST (FECRT)........................................6

2.2. IN VITRO METHODEN..............................................................................................................8

2.2.1. Egg Hatch Assay (EHA)…………………………………………………………………………………………………..8

2.2.2. Larval Migration Inhibition Assay (LMIA) en Micromotility Meter Test (MMT)……….…..…9

2.2.3. Larval Development Test (LDT)…………………………………………………………………………….………11

2.3 MOLECULAIRE TESTEN...........................................................................................................11

3. PREDISPONERENDE FACTOREN VOOR ONSTSTAAN VAN RESISTENTIE......................................12

3.1. DE GENETISCHE MECHANISMEN VAN RESISTENTIEONTTWIKKELING...................................12

3.2. AANTAL NEMATODEN IN REFUGIA.......................................................................................13

3.3. ONDERDOSERING.................................................................................................................15

3.4. FREQUENTIE VAN BEHANDELEN...........................................................................................15

3.5. MANAGEMENT.....................................................................................................................16

4. CONTROLE VAN RESISTENTIEONTWIKKELING.............................................................................17

4.1 CONTROLE MAATREGELEN....................................................................................................17

4.2 ALTERNATIEVE MAATREGELEN..............................................................................................18

BESPREKING..........................................................................................................................................18

REFERENTIELIJST...................................................................................................................................20

SAMENVATTING

In deze literatuurstudie wordt de problematiek aangaande de ontwikkeling van resistentie

tegen anthelmintica bij rundvee besproken.

In deze scriptie wordt eerst de prevalentie van resistentie besproken. Zowel de situatie op

wereldvlak als de situatie in Europa wordt aangekaart. Vervolgens wordt dieper ingegaan op

de verschillende testen die voor handen zijn om een verminderde efficaciteit van

anthelmintica vast te stellen. Hierna worden de voornaamste risicofactoren besproken die

aanleiding geven tot resistentieopbouw. Tenslotte worden de controlerende maatregelen

besproken die genomen kunnen worden om resistentieopbouw af te remmen of te

voorkomen.

Er is al heel wat informatie verzameld over resistentie bij kleine herkauwers. Dit komt door de

grote spreiding in o.a. Australië, Nieuw-Zeeland en andere zuidelijk gelegen landen.

Momenteel zijn de gegevens waarover men beschikt, in West-Europa bij runderen, schaars.

Om snel een duidelijker beeld te kunnen schetsen van de problematiek, is er nood aan snelle

en gevoelige testen om de efficaciteit van anthelminticum na te gaan. De test waar men

tegenwoordig het vaakst beroep op doet, de Fecal Egg Count Reduction Test (FECRT), is

immers traag en relatief duur. In deze literatuurstudie worden ook enkele alternatieve testen

naar voor geschoven zoals de Egg Hatch Test, de migratie-en motiliteitstesten, de Larval

Development Test en de moleculaire testen. Om nieuwe testen te kunnen ontwikkelen,

moeten de mechanismen en risicofactoren van resistentie verder onderzocht worden. Dit

vergt echter verder onderzoek en het laat zich al raden dat er veel geld nodig zal zijn om dit

onderzoek succesvol verder te zetten.

De steeds groter wordende kennis omtrent de risicofactoren van resistentie, geeft ons de

mogelijkheid om op velerlei wijzen in te grijpen op deze factoren. Zodoende zal de opbouw

van anthelminticumresistentie vertraagd kunnen worden en de werkzaamheid van

anthelmintica behouden blijven. Dit is enorm belangrijk omdat in de nabije toekomst geen

nieuw breed-spectrum anthelminticum op de markt wordt verwacht.

Sleutelwoorden: Anthelminticumresistentie - Prevalentie - Risicofactoren - Rund - Testen – Controle - Preventie

1

INLEIDING

Bij runderen zijn infecties met gastro-intestinale nematoden van groot economisch belang. De

belangrijkste en meest pathogene nematode die voor productieverliezen zorgt is Ostertagia

ostertagi, een bewoner van de lebmaag. Minder belangrijk zijn Cooperia oncophora,

Nematodirus spp., Trichostrongylus spp. en Haemonchus contortus (Armour, 1989). Uit

jarenlang survey-onderzoek in verschillende slachthuizen verspreid over geheel Europa bleek

dat 83-100% van de onderzochte runderen (melkvee) besmet waren met 1 of meerdere van

bovengenoemde nematoden (Burrows et al., 1980a, b; Barth et al., 1981; Brogsteede en van

der Burg, 1982; Borgsteede et al., 2000).

Momenteel zijn er 3 verschillende klassen breed-spectrum anthelmintica op de markt die ons

in staat stellen deze gastro-intestinale nematode infecties efficiënt te behandelen.

Een eerste groep omvat de benzimidazolen die hun werking danken aan een selectieve

interactie met het β-tubuline in het cytoskelet van nematoden. Hierdoor vindt er geen

aggregatie van microtubuli plaats tijdens de opbouw van het cytoskelet. Dit heeft paralyse en

de dood van de nematode tot gevolg (Borgers en de Nollin, 1975).

Een tweede groep omvat de imidathiazoles (levamisole) en de hydropyrimidines (pyrantel en

morantel). Deze anthelmintica gaan een spastische spierparalyse veroorzaken door hun

agonistische werking op de nicotine receptoren in de lichaamswand van de nematoden

(Aceves et Al., 1970; Aubrey et al., 1970).

Een derde groep van macrocyclische lactonen (avermectines en milbemycines) veroorzaakt

bij nematoden een blijvende paralyse van de de farynx (Brownlee et al., 1997) en

lichaamswand (Kass et al., 1980). Naast deze grote groep van breed-spectrum anthelmintica

is er ook nog een kleinere groep smal-spectrum anthelmintica (salicylanilides, nitrophenolen)

die enkel zijn toepassing kent in de behandeling van H. contortus bij het schaap.

De afgelopen decennia heeft de overwegend curatieve diergeneeskunde plaats gemaakt voor

een diergeneeskunde waar de klemtoon op preventie is komen te liggen. Door het intensieve

gebruik van anthelmintica de afgelopen jaren zijn klinische infecties bij rundvee zeldzaam

geworden. Momenteel zet men anthelmintica vooral in om vertraagde gewichtsaanzet en

gedaalde melkgift te voorkomen. Het intensief gebruik van anthelmintica heeft wereldwijd als

gevolg gehad dat er resistentie is ontstaan tegen de gebruikte producten. Tot voor enkele

jaren werden deze problemen vooral in de schapen- en geitenhouderij gezien, maar

anthelminticumresistentie is ook bij rundvee aan een stevige opmars bezig. Om te voorkomen

dat anthelminticumresistentie bij runderen een even groot probleem gaat vormen als bij kleine

herkauwers, is het nodig om zo snel mogelijk in te grijpen. Vooreerst is het belangrijk dat de

veehouder de resistentiestatus van zijn bedrijf kent. Coles et al (1992) publiceerde een reeks

gestandaardiseerde testen om resistentie tegen breed-spectrum anthelmintica op te sporen.

Wanneer men gebruik maakt van een gevoelige test, kan de diagnose van anthelminthicum

resistentie vaak reeds in een vroeg stadium gesteld worden. Op basis van het bekomen

2

resultaat kan men in samenspraak met de veehouder een programma opstellen om de nog

werkzame anthelmintica op een verantwoorde manier te gaan aanwenden. Hierdoor kan men

de spreiding van resistente allelen in een gegeven wormpopulatie tegenhouden of op zijn

minst vertragen (De Graaf et al., 2013).

In deze literatuurstudie zal getracht worden om een overzicht te geven over de spreiding van

resistentie bij maagdarmnematoden in rundvee op dit moment. Ook de

onstaansmechanismen en verschillende methoden om resistentie vast te stellen zullen

uitvoerig besproken worden. Als laatste komen de controlerende en preventieve maatregelen,

die boeren kunnen nemen, aan bod.

LITERATUURSTUDIE

1. DE PREVALENTIE VAN ANTHELMINTICUM RESISTENTIE BIJ RUNDVEE

Allereerst dient een duidelijk onderscheid gemaakt te worden tussen resistentie en tolerantie

van een maagdarmnematode voor een bepaald anthelminticum. Prichard et al (1980) stelde

dat er resistentie aanwezig is in een populatie, wanneer er meer individuen in die populatie

een bepaalde dosis geneesmiddel tolereren, èn wanneer dit overerfbaar is naar de volgende

generaties wormen. Met andere woorden, de resistentie zal zich ontwikkelen wanneer het

aantal wormen die een behandeling overleven, een groot deel gaat uitmaken van de

populatie behandelde wormen. Als men echter van tolerantie spreekt wil dit zeggen dat overal

ter wereld de behandelde nematoden van in het begin nooit gereageerd hebben op het

aangewende product (G. C. Coles, 2002).

Anthelminticumresistentie schijnt, met uitzondering van Nieuw-Zeeland, nog niet zo’n groot

probleem te vormen bij rundvee. Een van de redenen waarom men nog maar zo weinig weet

over de resistentieproblematiek onder rundvee, ligt vooral aan de specifieke biologie van

Ostertagia ostartagi. Deze nematode is slechts een korte periode van haar totale

levenscyclus aanwezig in het rund. Dat deel van de nematoden die een behandeling

overleven hebben hierdoor een relatief klein voordeel ten opzichte van de nematoden die wel

gevoelig zijn. Dit in tegenstelling tot Haemonchus contortus nematoden bij schapen, die

verschillende maanden in hun gastheer verblijven en dus een groot voordeel hebben na

behandeling. Hierdoor zal het aanwenden van anthelmintica in het geval van Haemonchus

contortus sneller leiden tot resistentieontwikkeling dan bij Ostertagia ostertagi. Omdat

resistentie reeds een reëel probleem vormde bij schapen was de nood aan gegrond

onderzoek in het verleden veel hoger dan het geval was bij rundvee. Om die reden kan men

besluiten dat men bij rundvee momenteel een onderschatting maakt van het heersende

resistentieprobleem tegen anthelmintica (De Graef et al., 2013). De problemen waarmee men

geconfronteerd wordt in de schapenhouderij zijn reeds van die aard dat er drastische

3

maatregelen genomen worden. In navolging van Autralië en Nieuw-Zeeland heeft ook in

Europa (Schotland) reeds het eerste bedrijf met schapen zijn activivteiten moeten stopzetten

als gevolg van resistentie tegen moxidectine (Sargison et al., 2005).

De Graef et al. (2013) maakte een overzicht (tabel 1) van enkele recent (2006-2009)

uitgevoerde onderzoeken naar anthelminticumresistentie bij runderen verspreid over geheel

de wereld. Uit de opgelijste gegevens kan men afleiden dat resistentie ook bij rundvee wel

degelijk een wereldwijd probleem is. De meest verontrustende resultaten die men kan

terugvinden in tabel 1 zijn deze die melding maken van multipele resistentie tegen zowel

macrocyclische lactonen als benzimidazoles in Nieuw-Zeeland en Zuid-Amerika (Waghorn,

2006; Soutello et al., 2007; Suarez and Cristel, 2007).

In gematigde streken zoals België en Duitsland zijn de voornaamste nematode species die

rundvee infecteren Ostertagia ostertagi en Cooperia oncophora, met een prevalentie van

nagenoeg 100%. Cooperia spp. zijn de dosis limiterende species voor macrocyclische

lactonen. Laat nu net de macrocyclische lactones de meest gebruikte klasse van

ontwormingsmiddelen zijn in België om parasitaire infecties onder controle te houden. Dit

betekent dus dat men op basis van de efficaciteit tegen Cooperia spp. de aanbevolen dosis

voor de dieren gaat bepalen (Vermunt et al., 1995). Zoals weergegeven in tabel 1 voerden

zowel Demeler et al. (2009) en later El Abdellati et al. (2010) onderzoek naar de resistentie

tegen ivermectine in België. Demeler et al. (2009) toonde als eerste, in 2006, een

verminderde efficaciteit van ivermectine aan. In zijn studie volgde men 7 bedrijven op. Op elk

bedrijf werd na 21dagen een verminderde werking vastgesteld na de behandeling met

ivermectine voor Cooperia oncophora (FEC tussen 58 en 95%). Na een terugbezoek op alle

bedrijven kon men enkel op 1 bedrijf een verminderde efficaciteit van ivermectine vaststellen

(FEC van 54%). Dit bedrijf werd in de daaropvolgende 4jaar verder opgevolgd. Men stelde in

deze periode een versnelde toename van resistentie tegen Cooperia oncophora vast. Op dit

bedrijf werd later in 2009 ook resistentie vastgesteld tegen moxidectine ook al werd dit

product nooit eerder aangewend in een behandeling. El Abdellati et al. (2010) deed hetzelfde

onderzoek nog eens over, maar dan op grotere schaal, en bezocht 88 bedrijven in zowel

België als Duitsland. Er werden maar op 84 van de 88 bezochte bedrijven macrocyclische

lactones gebruikt voor de behandeling van eersteweideseizoens kalveren. De 4 overige

bedrijven, die gebruikmaakten van andere producten, werden niet opgenomen in de test. Een

FECR < 95 % werd op 33 van de 84 bedrijven gedetecteerd. Na het gebruik van een

gevoeligere test, namelijk de Markov Chain Monte Carlo simulatie analyse (MCMC), op de

bedrijven met een FECR <95%, werd er in 21 van de 33 bedrijven een verminderde

efficaciteit aangetoond. Zodus bleek ook de gevoeligheid van de test een belangrijke invloed

te hebben op de bekomen testresultaten. In beide proefopzetten werd, na het uitvoeren van

bijkomend cultuuronderzoek, de Cooperia spp. steeds als de meest voorkomende parasiet

gevonden na behandeling. De overige gevonden species (O. ostertagi, Nematodirus spp en

Trichostrongylus axei) zijn met een prevalentie tussen 0,5-2,5% te verwaarlozen.

4

Tot op heden is er enkel resistentie aangetoond tegenover macrocyclische lactones bij het

weinig pathogene Cooperia oncophora en nog niet bij Ostertagia ostertagi (Vercruysse en

Claerebout, 1997; Sutherland en Leathwick, 2011). Door de lage pathogeniciteit van Cooperia

oncophora wordt resistentie vaak niet of pas laattijdig opgemerkt door de veehouder

(Demeler et al., 2009). Het is op zijn minst merkwaardig te noemen dat er weinig ivermectine

resistentie is tegen Ostertagia ostertagi bij runderen. Zoals eerder vermeld worden de

macrocyclische lactonen veelvuldig gebruikt, is er een hoog niveau van ivermectine

resistentie tegen Cooperia en reeds een hoog niveau van ivermectine resistentie bij

Ostertagia in schapen aangetoond.

Het mag dus duidelijk zijn dat wanneer veehouders op deze wijze ontwormingsmiddelen

blijven gebruiken, de bekomen problemen in de toekomst niet te overzien zullen zijn. Vaak

nemen boeren het probleem van resistentie ook niet altijd even ernstig omdat bij gebruik van

een ander anthelminticum het probleem in hun ogen van de baan is. Het zal dus in de

toekomst ook de taak zijn van de dierenarts er op toe te zien dat de nog werkzame producten

op correcte wijze worden gebruikt door de veehouders.

Tabel 1. Prevalentie van anthelminticum resistentie bij runder nematoden. Resistentie werd vastgesteld wanneer de reductie van de eitelling <90% (Brazilië) of <95%, bij lagere betrouwbaarheidsintervallen <90%(alle andere onderzoeken) (De Graef et al., 2013).

Regio/land en referentie

Aantal onderzochte

bedrijven

% albendazole resistentie

% I/T resistentie

% ML resistentie

% multipele resistentie

Betrokken nematode species

Nieuw-Zeeland(Waghorn et al., 2006)

62 76% ALB 6% LEV 92% IVM 74% ALB+IVM Cooperia spp. and Ostertagia

spp.

Brazilië(Soutello et al., 2007)

25 25% ALB 8% LEV 92 %IVM24% MOX

12%ALB+IVM8%ALB+ICM+

LEV

Cooperia spp., Haemonchus

spp. and Oesophagostom

um spp.

Argentië(Suarez en Cristel, 2007)

25 32% FEN Niet gedetecteerd

60% IVM 28% FEN+IVM Cooperia spp. En Ostertagia spp.

België, Duitsland en Zweden(Demeler et al., 2009)

22 Niet gedetecteerd

Niet gedetecteerd

74% IVM Niet gedtecteerd

Cooperia spp. en Ostertagia spp.

België en Duitsland(El-Abdellati et al., 2010a)

88 Niet gedetecteerd

Niet gedetecteerd

39% IVM Niet gedtecteerd

Cooperia spp., Ostertagia spp.,

Nematodirus spp. en

Trichostrongylus axei

Afkortingen: % BZ, % I/T or % ML resistentie: het percentage van bedrijven met een gereduceerde werking van anthelminticum tegen benzimidazoles, imidothiazoles en tetrahydropyrimidines of macrocyclic lactones. ALB: albendazole; FEN: fenbendazole; LEV: levamisole; IVM: ivermectine; MOX: moxidectine.

5

2. TESTEN VOOR HET OPSPOREN VAN ANTHELMINTICUM RESISTENTIE

Momenteel bestaan er verschillende technieken die courant gebruikt worden om

athelminticumresistentie op te sporen in een populatie dieren. Men kan ze onderverdelen in 3

groepen.

Enerzijds zijn er de in vivo testen, namelijk de FECRT (fecal egg count reduction test) en de

CET (controlled efficacy test). Anderzijds zijn er nog de in vitro testen. Dit zijn de LDT (larval

development test), de EHA (egg hatch assay), de LMIA (larval migration inhibition assay), de

MMT (micromotility meter test) en de LFA (larval feeding assay). De in vivo testen hebben als

voordeel dat ze snel, eenvoudig en goedkoop uit te voeren zijn (Le Jambre et al., 1995). In

vitro testen daarentegen hebben als voordeel dat ze niet onderhevig zijn aan de invloeden

van cofounding factoren en dat ze anthelminticumresistentie aantonen. Als derde groep zijn

er ook de moleculaire testen waaronder de real-time PCR-test (polymerase chain reaction

test) de meest gebruikte is. Sinds de ‘World Association for the advancement of veterinary

Parasitology’ (WAAVP) de gestandaardiseerde methoden voor het opsporen van resistentie

heeft gepubliceerd in 1992 (Coles et al., 1992), is het belang van resistentie in de 3 groepen

van breed-spectrum anthelminticum drastisch toegenomen.

Iedere test op zich heeft zijn eigen objectief waarvoor hij aangewend wordt. De FECRT is de

meest gebruikte en kan gebruikt worden voor het opsporen van resistentie tegen alle klasse

van breedspectrum athelminticum. Ook is het samen met de CET de enige test die

voorhanden is die het bepalen van resistentie tegen macrocylische lactonen mogelijk maakt.

De CET (controlled efficacy test) echter is de gouden standaard voor het testen van

anthelminticum efficaciteit, maar door de hoge arbeidskosten en het moeten euthanaseren

van de dieren voor de test wordt hij momenteel nagenoeg nooit gebruikt (Taylor et al., 2002).

Nochtans is er hoge nood aan goede testen voor het opsporen van resistentie tegen

macrocyclische lactones. De EHT en de PCR-test dienen voor het bepalen van bezimidazole

resistentie. De MALDT test op zijn beurt gebruikt men om benzimidazole en levamisole

resistentie op te sporen.

Hieronder worden de meest gebruikte testen uitgebreid besproken.

2.1. IN VIVO METHODE: FECAL EGG COUNT REDUCTION TEST (FECRT)

Deze in vivo test is in de praktijk de meest gebruikte test om resistentie op te sporen tegen

breed-spectrum anthelmintica. Het principe achter deze test steunt op de microscopische

detectie van nematoden eieren in een meststaal voor en na een behandeling. Op basis

6

hiervan wordt de reductie in het aantallen uitgescheiden eieren in de faeces (FEC=Fecal Egg

Count) berekend. Op dit moment is de test enkel gestandardiseerd bij het schaap. Dit omdat

het bepalen van anthelminticum resistentie moeilijker is bij rundvee dan het geval is bij de

kleine herkauwers. Het feit dat de FEC bij rundvee lager zijn en dat er geen echte correlatie

kan vastgesteld worden tussen de FEC en het aantal wormen in de gastheer liggen hiervan

aan de basis (Taylor et al., 2002).

Methode (geformuleerd door Coles et al., 2006). Kies 10 dieren per groep tussen 3 en 6

maanden oud en gaat na of die een eitelling hebben die hoger ligt dan 150epg. Neem

vervolgens rectaal mest (3-5g) en bewaar deze individueel. Hierna dient men zo snel mogelijk

na staalname een telling uit te voeren met de McMaster techniek. Hierna dienen de dieren

allen individueel gewogen te worden en behandeld volgens hun gewicht. De tweede

staalname dient te gebeuren na 3-7dagen voor levamisole, na 8-10 dagen voor

benzimidazoles of na 17 dagen wanneer men behandelde met macrocyclische lactonen.

Indien men alle breedspectrum anthelminticums in dezelfde kudde test, dient de tweede

staalname na 14dagen te gebeuren. Het is raadzaam om gebruik te maken van

controlegroepen om natuurlijke fluctuaties in de eitellingen niet als afwijkend te aanzien. Op

de stalen kan ook cultuuronderzoek uitgevoerd worden om de desbetreffende wormspecies te

identificeren. In dat geval mogen de stalen niet langer dan 24u bewaard worden bij 4°C.

Wanneer men deze test toch zou aanwenden bij rundvee is het aan te raden om enkel dieren

te gebruiken met een minimum uitscheiding van 100epg. Dit is lager als aanbevolen bij

schapen, maar bij rundvee zijn de eitellingen normaal gezien ook lager. Indien mogelijk is het

beter om 15 dieren per groep te bemonsteren en de dieren die geen eieren in de faeces

hebben niet op te nemen in de testresultaten. De betrouwbaarste resultaten worden bekomen

wanneer men orale anthelmintica preparaten gebruikt. De tijd tussen de eerste staalname en

behandeling en de tweede staalname is dezelfde als bij schapen. Wanneer men

macrocyclisch lactones met remanente werking aanwendt, dient het tweede staal 28dagen na

de behandeling genomen te worden. Dit moet ook gecombineerd worden met

cultuuronderzoek om de nematode species te indentificeren. Wanneer de eerste eitellingen

lager liggen dan 150epg (egg per gram) maakt men best gebruik van gevoeligere methoden

dan de McMaster techniek die men bij schapen gebruikt (Coles et al., 2006). Deze McMaster

techniek heeft een gevoeligheid van 50epg. Recent werd een commerciële kit op de markt

gebracht met een gevoeligheid van 10epg (FECPAK). De Cornell-Wisconsin techniek heeft

zelfs een gevoeligheid van 1epg.

De interpretatie van de FECRT wordt beïnvloed door enkele factoren. Dit zijn de mate van

uitscheiding en aggregatie van de gebuikte FEC, de detectielimiet van de gebruikte techniek

voor de eitelling en het aantal dieren die opgenomen worden in de test (Levecke et al., 2012).

Een anthelminticum wordt aanzien als volledig effectief (FECR=100%) wanneer er geen

enkele worm de behandeling overleeft. Wanneer er toch enkele eieren worden aangetroffen

7

in het tweede meststaal kan dit wijzen op de aanwezigheid van resistentie. AR wordt

verwacht bij een gemiddelde FECR < 95 % voor ivermectine (Coles et al., 2006) en een

FECR < 90 % wat betreft benzimidazoles (El-Abdellati et al., 2010a).

Aan het gebruik van de FECRT zijn verschillende nadelen verbonden. De grootste beperking

voor deze test is zijn gebrek aan analytische gevoeligheid. Martin et al. (1989) toonde in

onderzoek bij schapen aan dat er enkel benzimidazole-resistentie kon vastgesteld worden

wanneer de frequentie van resistente allelen groter is dan 25% in de wormpopulatie. Toch

kan de FECRT resistentie detecteren voordat de klinische behandeling faalt. Dit is het

moment waarop de meeste veehouders zelf resistentie beginnen op te merken (De Graef et

al., 2013). De test is ook zeer arbeidsintensief omdat er tweemaal meststalen dienen

genomen te worden bij minimaal 15 runderen (Taylor et al., 2002). Een ander nadeel ligt hem

in het feit dat de test niet species-specifiek is. Bij menginfecties is het onmogelijk om onder de

microscoop de verschillende eieren van elkaar te differentiëren. Hierdoor is het onmogelijk

om de species-specifieke anthelminticum efficaciteit te berekenen. Daarom dient

cultuuronderzoek uitgevoerd te worden (De Graef et al., 2013). Doordat men de ei-

uitscheiding in rekening brengt, geeft de FECRT ons enkel een beeld van het aantal adulte

vrouwelijke nematoden in de gastheer. Uit onderzoek blijkt dat er bij rundvee niet altijd een

correlatie is vast te stellen tussen de eitelling en het wormaantal in de gastheer (Eysker en

Ploeger, 2000; Coles et al., 2006).

2.2. IN VITRO METHODEN

2.2.1. Egg Hatch Assay (EHA)

Deze test wordt uitsluitend aangewend voor de detectie van benzimidazole-resistentie. Dit

omdat de macrocyclische lactones, imidazothiazoles en tetrahydopyrimidines niet ovocied zijn

(Coles et al., 2006). De test werd oorspronkelijk beschreven door Le Jambre (1976) en in de

loop der tijd licht aangepast door Taylor et al. (2002). Men maakt in deze test steeds gebruik

van thiabendazole. De gevoeligheid voor thiabendazole neemt af naarmate de eieren ouder

worden, daarom moeten de verzamelde eieren binnen de 3 uur gebruikt worden of onder

anaerobe omstandigheden bewaard worden (Hunt en Taylor, 1989).

Methode (geformuleerd door Coles et al., 2006): Neem een 24well plaat en breng 1,89ml

water aan in elke well. Voeg vervolgens 10 µl thiabendazole toe die opgelost en verdund

werd in DMSO. Voeg ook DMSO toe aan de controle wells. Om de graad van resistentie te

bepalen gebruikt men 0.05, 0.1, 0.2 of 0.5 µg/ml verdunningen van thiabendazole. Breng

vervolgens 100 µl verse eieren (<3u oud of anaeroob bewaard) in elke well aan. De eieren

dienen zo proper mogelijk te zijn, dit omdat thiabendazole de eigenschap heeft om debris te

binden. Dan laat men de plaat 48u incuberen aan 25°C. Voeg vervolgens 2 druppels lugol-

iodine toe aan iedere well. Tel dan op zijn minst 100 van de overblijvende eieren of

8

uitgekomen larven. Dit kan men onmiddellijk, zonder tussenstap, doen met een

inversiemicroscoop of door de eieren en larven voorzichtig uit de well plaat te wassen en aan

te brengen op een draagglaasje of petri-schaaltje en vervolgens te bekijken met een

lichtmicroscoop.

De discriminerende dosis is een dosis waarbij 99% van de gevoelige eieren verhinderd

worden van uit te komen. Per definitie worden de eieren die zich toch ontwikkelen en

uitkomen als resistent beschouwd. Deze dosissen worden gebruikt om de gevoeligheid van

de test te verhogen. Recente data suggereren dat een dosis van 0.1 µg/ml thiabendazole het

ontwikkelen van H. contortus, T. circumcincta en Trichostrongylus colubriformis in 99% van

de gevallen zal voorkomen en aldus de discriminerende dosis is. Coles et al. (2006) toonde in

veldproeven aan dat bij deze concentratie ook de eieren van andere gevoelige nematoden

(Cooperia, Oesophagostomum) niet kunnen uitkomen. Het percentage van eieren dat zich

toch kan ontwikkelen omvat normaal alleen de homozygoten en enkel in geval van dominante

resistentie genen ook de heterzoygoten. Dit is slechts een vermoeden en verder onderzoek

zal nodig zijn om dit te kunnen bevestigen of weerleggen. Discriminerende dosissen zijn

echter nog niet vastgelegd voor nematoden bij rundvee. Door de toenemende bezimidazole

resistentie zal de waarde van deze test toenemen in het opsporen van resistentie bij rundvee

(Coles et al., 2006).

2.2.2. Larval Migration Inhibition Assay (LMIA) en Micromotility Meter Test (MMT)

De werking van migratie-en motiliteitstesten is gebaseerd op de verlammende werking van

anthelmintica op de lichaamsspieren van trichostrongylide nematoden. LMIA wordt gebruikt

om de effecten van ivermectine op de larvale migratie via in vitro technieken te beschrijven.

Met de MMT werden de effecten van verschillende benzimidazoles en levamisole op de

motiliteit van Haemonchus contortus reeds bepaald (Folz et al., 1987a).

Wagland et al. (1992) beschreef de methode om een LMIA test uit te voeren. Ontschede L3-

larven worden geïncubeerd in seriële verdunningen van anthelminticum gedurende 24uur.

Vervolgens worden deze L3-larven op een zeef (nylon filter) aangebracht gedurende 24uur.

Resistente L3-larven kunnen blijven bewegen en door deze zeef migreren, terwijl gevoelige

L3-larven op de zeef blijven liggen. De fractie van L3-larven dat kan migreren door de zeef

wordt bepaald, dit is het deel van de larven die hun beweeglijkheid behouden hebben. Het

deel van de parasieten populatie die minder gevoelig is aan de paralyserende effecten van

ivermectine zullen blijven migreren wanneer ze blootgesteld worden aan een hogere dosis

ivermectine, dit in tegenstelling tot de gevoelige parasieten. Aan de hand van deze gegevens

kan het percentage larven bepaald worden die een behandeling zal overleven. Net zoals

bovenstaande FECRT, detecteert deze test enkel resistentie wanneer meer dan 25 % van de

wormen in de populatie resistent zijn (Coles et al., 1992)

9

Folz et al. (1987) op zijn beurt beschreef de MMT in detail. Ontschede L3-larven worden

gebruikt voor de test. Nadat een zuiver en homogeen staal word bekomen, gaat men dit

verdunnen tot wanneer men een concentratie heeft van 20 larven per 10 µl. Hieraan wordt

dan het te testen anthelminticum toegevoegd in verschillende verdunningen. Om bacteriële

groei te voorkomen wordt penicilline en streptomycine toegevoegd aan het verdunde staal

van larven. Dit wordt vervolgens 24u bewaard bij 4°C. Om op kwantitatieve wijze de

bewegingen van behandelde wormen te bepalen na een behandeling maakt men gebruik van

een micromotiliteitsmeter (fig 1). Het is mogelijk om met dit toestel de motiliteit in 1 staal

accuraat te meten binnen de minuut. Na het verstrijken van een dag worden de buisjes met

de stalen in de kanalen van de meter geplaatst. Aan de basis van deze kanalen is een

lichtbron geplaatst die door het buisje schijnt. De stralen zullen door het bewegen van de

larven horizontaal verstrooid worden. Afhankelijk van de sterkte van bewegen zullen meer of

minder stralen verstrooid worden en aldus op de fotodetector vallen. Door de fotodetector

zullen de verstrooide lichtstralen vertaald worden in een elektrisch signaal. De sterkte van het

signaal vertaalt zich dan weer in de motiliteits index. Actieve wormen geven sterkere signalen

dan deze die niet meer bewegen doordat ze verlamd zijn na de behandeling.

Figuur 1: Doorsnede door 1 kanaal van de multikanaals motiliteitsmeter (Folz et al., 1987).

a = photodiode; b = pin lamp; c = knob to adjust position of test tubes; d = plastic light pipe; e

= aluminum housing for test tube; f = connector to computer; g = test tube; h = meniscus.

2.2.3 Larval Development Test (LDT)

10

Momenteel zijn er 2 larval development testen die van belang zijn. Deze beschreven door

Hubert en Kerbouf (1992) zijn gebaseerd op vloeistof. Gill et al. (1995) beschreef echter een

op agar gebaseerde test (MALDT, microagar larval development test). Beide testen berusten

op de ontwikkeling van infectieus ei tot L3 larve. De leeftijd van de gebruikte eieren bij de

MALDT is van weinig belang om de test betrouwbaar uit te kunnen voeren (Gill et al., 1995;

Demeler et al., 2010).

Deze methode is enkel betrouwbaar voor gebruik bij benzimidazoles en levamisole. De test is

echter nog niet bruikbaar bij rundvee omdat enkel voor oviene en equine nematoden de

discriminerende dosis bepaald werd. Op het einde van de test kan bepaald worden welke

species de behandeling overleefd hebben en welke niet. Dit door de L3-larven te identificeren

in de controle wells en de wells die behandeld werden (Coles et al., 2006)

Methode (Gill et al., 1995): Isoleer nematode eieren uit faeces zoals beschreven in de EHT.

Vul de buitenste rijen van een 96-well plaat met gedistilleerd water om het uitdrogen van

test wells te verhinderen. Voeg vervolgens 10 µl water of 10 µl anthelminticumoplossing aan

de wells. Gebruik routinematig 6wells per anthelminticum. Voeg vervolgens 150 µl 2% Bacto-

agar aan 45°C toe in elke well. Laat dit afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg nu 10 µl eieren

toe vanuit een 1:1 oplossing met amphotericine B. Het is belangrijk de variatie in aantal

eieren tussen de wells zo klein mogelijk te houden( 50-80 eieren per well). Voeg dan 10 µl

gist-extract toe, zoals beschreven is door Hubert en Kerbouf (1984), en sluit de plaat af met

plakband. Hierna laat men de plaat 7dagen incuberen aan 25°C. Na de incubatieperiode telt

men het aantal levende L3 larven in elke well.

De resultaten van de in vitro testen worden uitgedrukt in functie van de half maximal effective

concentration (EC50), hiermee bedoelt men de concentratie om 50% van de wormen af te

doden. Uit deze gegevens wordt de resistent ratio (RR) berekend, dit is de verhouding van de

EC50 van resistente isolaten en EC50 van gevoelige isolaten (Demeler et al., 2010). Hoe

groter de RR is, des te groter zal de aanwezigheid van resistentie zijn.

De grootste uitdaging van de in vitro methodes is het bepalen van EC50 referentiewaarden bij

runderen zowel voor de verschillende species als voor menginfecties. Daarom moet de

accuraatheid, sensitiviteit, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid voor de verschillende

isolaten en species in verschillende labo geoptimaliseerd worden (Sangster en Gill, 1999).

2.3 MOLECULAIRE TESTEN

Deze testen kunnen enkel gehanteerd worden voor het opsporen van bezimidazole-

resistentie omdat de moleculaire mehanismen voor resistentie tegen levamisole, pyrantel en

de macrocyclische lactones nog niet gekend zijn. Om deze testen routinematig te kunnen

gebruiken in de praktijk, moeten ze verder als real-time PCR ontwikkeld worden. Moleculaire

11

testen zijn geschikt om resistente allelen op sporen, zelfs wanneer de frequentie ervan nog

zeer laag is in de onderzochte populatie wormen.

Het moleculaire mechanisme achter benzimidazole resistentie in trichostrongyliden bij

schapen is momenteel al gekend. Het zou gaan om een phenylalanine naar tyrosine mutatie

op plaats 200 van het beta-tubuline gen (Elard et al., 1996, 1999). Bij runderen wordt een

gelijkaardig mechanisme beschreven bij Cooperia oncophora (Pape et al., 1999, 2003; von

Samson-Himmelstjerna et al., 2001; Njue and Prichard 2003; Winterrowed et al., 2003)

Methode (Coles et al., 2006): Allereerst maakt men een lysaat van een suspensie van

ontschede larven met een concentratie lager dan 1000 larven per ml. Vervolgens plaatst men

individuele larven in microtubes en laat deze overnachten bij een temperatuur van 41°C. Geef

de microtubes dan een hittebehandeling van 20 minuten bij 95°C. Bewaar dit dan bij -20°C tot

men de analyse uitvoert. Men plaatst dan de verteerde larven in een reactief mengsel dat

onder andere primers en Taq polymerase bevat. Dan laat men verschillende

amplificatieronden plaatsvinden bij wisselend temperaturen. Als laatste stap voert men een

agar-gel elektroforese uit. De banden die verschijnen kan men aflezen en zijn species-

specifiek.

Men moet wel extra aandacht besteden aan enkele zaken zodat de test op een correcte

manier kan verlopen. Zo is het noodzakelijk dat men verse larven gebruikt die maximum

1maand bij 4°C bewaard zijn. Om vals positieve resultaten te vermijden dient men er zeker

van te zijn dat de primerconcentratie correct is (Coles et al., 2006). Elard et al. (1999)

bepaalde de gevoeligheid van de test. Het aantal wormen dat nodig is om op zijn minst 1

resistent individu te vinden is 100, 50, 35, en 20 of respectievelijk 4, 8, 10 en 12% resistente

wormen aanwezig in de populatie.

3. PREDISPONERENDE FACTOREN VOOR ONSTSTAAN VAN RESISTENTIE

De belangrijkste factoren die instaan voor het ontstaan van resistentie zijn:

- de genetische mechanismen van resistentieontwikkeling

- het aantal nematoden in refugia

- de onderdosering

- de frequentie van behandelen

- het management

12

3.1. DE GENETISCHE MECHANISMEN VAN RESISTENTIEONTTWIKKELING

Ondanks het feit dat bepaalde species van helminthen er morfologisch hetzelfde uitzien,

kunnen ze toch sterk verschillend zijn wat betreft hun genetische bagage (genoom). De

ontwikkeling van resistentie kan veroorzaakt worden door mutaties op één of meerdere genen

van het genoom van de parasiet. Door het bestaan van genetische variatie kunnen er zich

mutaties voordoen ter hoogte van de aangrijpingspunten van de verschillende klasses

anthelmintica. Dit kunnen variaties zijn ter hoogte van de receptorplaatsen van het

anthelminticum. Ook kunnen er verschillen zijn in de enzymes of mechanismen die de

metabolisatie of transport van het anthelminticum beïnvloeden.

Momenteel is er echter weinig geweten over de frequentie van resistentiegenen in een

onbehandelde populatie. Dit kan toegeschreven worden aan het gebrek van sluitende

resistentietesten en het geringe aantal populaties die nog niet bloodgesteld werden aan een

selectie door een eerder toegepaste behandeling. Algemeen wordt aangenomen dat deze

frequentie zeer laag is. Doch toonde Beech et al. (1994) aan dat de frequenties van allelen

verantwoordelijk voor resistentie tegen bezimidazoles, in een onbehandelde populatie van

haemonchus contortus nematoden verrassend hoog waren. In de vroege zestiger jaren

werden reeds genen aangetoond voor resistentie tegen benzimidazoles nog voor het product

op de markt was (Roos et al., 1990).

In de literatuur wordt zowel melding gemaakt van dominante als recessieve allelen die aan de

basis liggen van resistentieontwikkeling. Uit onderzoek van Herlich et al. (1981) bleek het allel

verantwoordelijk voor resistentie van H. contortus tegen benzimidazoles (cambendazole)

recessief te zijn. Le Jambre (1979) daarentegen maakte gewag van een semi-dominant allel

verantwoordelijk voor thiabendazole-resistentie van H. contortus en een dominant allel in het

geval van T. colubriformis. Een individueel gen of een groep van enkele genen met een

autosomaal recessief oververvingspatroon zijn verantwoordelijk voor levamisole resistentie

(Martin en Mackenzie, 1990).

Ivermectine-resistentie daarentegen vindt zijn oorsprong in een autosomaal dominante loci

waarop de resistentiegenen zitten (Sangster 1996). Momenteel weet men nog niet zoveel van

de genetische basis achter de ontwikkeling van resistentie. Wel weet men dat wanneer een

enkel gen betrokken is in het ontstaan van resistentie, het verloop sneller zal zijn dan

wanneer meerdere genen betrokken zijn in dit proces. Ook weet men dat resistentie zich

sneller zal ontwikkelen wanneer de specifieke genen gelegen zijn op dominante allelen dan

op recessieve. Zowel de heterozygote als de homozygote wormen zullen dan een

behandeling overleven en zo hun resistentiegenen kunnen doorgeven aan de volgende

generatie nematoden ( Sangster et al., 1998; Le Jambre et al., 2000; Coles., 2004). Dit is

geen goed nieuws voor de melkvee- en vleesveesector waar ivermectines, zoals eerder

vermeld, vaak worden aangewend bij de controle van maagdarmnematoden.

13

3.2. AANTAL NEMATODEN IN REFUGIA

De term refugia werd bedacht om die nematoden aan te duiden die niet bloodgesteld worden

aan een behandeling en dus ontsnappen aan de selectie van resistentie. Men bedoelt dus de

nematoden die zich op de weide bevinden (suprapopulatie) en in onbehandelde dieren

(infrapopulatie). Ook de stadia die aanwezig zijn in de gastheer en niet gevoelig zijn aan een

behandeling, beïnvloeden het refugium. Elke behandeling waarbij men een anthelminticum

gebruikt, dat geen efficaciteit heeft van 100%, zal een selectie op resistente wormen met zich

meebrengen. De nematoden waarover we spreken zijn dus als het ware ‘ontsnapt’ aan deze

selectie voor resistentie. In de gematigde streken zal de suprapopulatie het grootste deel van

het refugium uitmaken (Kenyon et al., 2009).

Er zijn 2 factoren die de grootte van het refugium beïnvloeden, namelijk het klimaat en de

biologische karakteristieken van de parasiet. De nematoden die een behandeling overleefd

hebben zijn minder gevoelig of resistent aan het gebruikte product. Het wordt aangenomen

dat resistente wormen een verhoogde fitness hebben of dat resistentie gekoppeld is aan

andere fitness genen, waardoor de snelheid van resistentie-spreiding ook zal toenemen

(Coles, 2005). Elard et al. (1998) deden onderzoek naar de fitness bij bezimidazole-resistente

en gevoelige T. circumcincta nematoden. Ze stelden geen significante verschillen vast tussen

de resistente en gevoelige wormen wat betreft eiproductie, de ontwikkeling van ei tot

infectieuze larve en het overleven van zowel de larve als de adult in de gastheer.

Benzimidazole-resistentie wordt daarentegen wel geassocieerd met verhoogde

pathogeniciteit van de overgebleven nematode populaties (Kelly et al., 1978). Coles et al

(2001) stelde ook vast dat H. contortus nematoden, die resistent waren aan ivermectine,

pathogener waren ten opzichte van de gevoelige isolaten. Geïnfecteerde dieren vertoonden

duidelijk tekenen van klinische gastro-enteritis.

De andere factor die het refugium beïnvloed is het klimaat. In Europa en andere gematigde

streken bevinden het grootste deel van de parasieten zich op de weides. Dit in tegenstelling

tot tropische streken waar de hitte en droogte deze suprapopulatie binnen een termijn van 4

weken zal afdoden (Barger 1994). Zodoende zal in de tropische streken het grootste deel van

de nematodenpopulatie zich in de gastheer bevinden. In Australie werden dieren ontwormt

tijdens droge periodes, dit bleek een zeer effectieve manier van behandelen te zijn. Dit had

echter wel tot gevolg dat het ontstaan van atnthelminticum resistentie danig werd versneld.

Dit omdat enkel de wormen resistent aan droogte en het gebruikte middel, overleefden.

Hierdoor is de resistentieproblematiek ook stukken groter in het Zuiden dan bij ons in het

Westen (Kenyon et al., 2009).

Omwille van de verschillende papers (Martin et al., 1981; Smith et al., 1999; Michel, 1985;

Barger, 1999; Kenyon et al, 2009) die eraan gewijd zijn, wordt refugia algemeen aanvaard als

een belangrijke factor in de selectie voor resistentie na het behandelen met anthelminticum.

14

Ondanks het groot belang dat men hecht aan refugia bij onderzoek naar het ontstaan van

resistentie, wordt het vaak over het hoofd gezien wanneer maatregelen opgesteld worden om

de problemen van resistentieopbouw in te perken.

Praktijken zoals het behandelen van de gehele kudde dieren en deze daarna verplaatsen

naar een veilige of nematode vrije weide zouden eigenlijk niet meer als controlemaatregel

mogen gebruikt worden. Er zouden in dat geval altijd enkele onbehandelde dieren moeten

achterblijven die gevoelige wormen blijven uitscheiden op de weide (van wyk, 2001).

3.3. ONDERDOSERING

Het toedienen van te lage dosissen heeft als gevolg dat meer nematoden de behandeling

gaan overleven. De impact die onderdosering zal hebben hangt vooral af van de frequentie

aan resistente allelen aanwezig in de nematode populatie voor en na de behandeling.

Afhankelijk van de mogelijkheid van het anthelminticum om geheel of gedeeltelijk de

gevoelige homozygote, heterozygote en/of homozygote resistente wormen te doden, zijn er

dosisniveaus waar onderdosering resistentie opbouw bevordert en andere die

resistentieopbouw verhinderen (Smith et al., 1999). De meest gemaakte fouten zijn: het

onderschatten van het gewicht, de verdunning van het geneesmiddelen om economische

redenen, het gebruiken van minderwaardige producten en de onjuiste administratie van het

product ( bv. Houdbaarheidsdatum overschreiden, mixen met andere producten)

(Lalchhandama, 2010).

Bij het gebruik van remanente (langwerkende) of ‘slow-release’ drugs zullen de

geneesmiddelconcentraties langzaam afzwakken naar het einde van hun eliminatiefase als

gevolg van een langere halfwaardetijd. Het beschreven effect zou dezelfde invloed hebben

als onderdosering bij dieren. Daarom worden bij voorkeur kortwerkende middelen gebruikt.

(Wolstenholme et al., 2004; Sutherland et al., 2011)

3.4. FREQUENTIE VAN BEHANDELEN

Martin et al. (1982) toonde als eerste een verband aan tussen de behandelingsfrequentie en

anthelminticumresistentie. Waarschijnlijk is het de combinatie van, ten eerste een gegeven

worm populatie in refugia en ten tweede de frequentie van behandelen die de graad van

selectie voor resistentie zal bepalen. Elke behandeling met een anthelminticum zal gevoelige

wormen elimineren. Bij het verhogen van de frequentie van behandelen zal het aantal

mogelijkheden om gevoelige wormen te elimineren toenemen. Hierdoor zullen de resistente

bevoordeeld zijn en een steeds groter deel van de achterblijvende populatie gaan uitmaken

(van Wyk, 2001). Algemeen gezien is er weinig informatie voor handen over hoe een

veehouder zijn dieren behandelt. Vaak stopt de taak van de dierenarts,in het kader van

anthelmintische behandelingen, wanneer hij de producten aflevert op de boerderij. De

15

informatie waarover men momenteel beschikt doet ons vermoeden dat de frequentie van

behandelen té hoog ligt. (Stafford et al.,1999; Vercruysse et al. 2001).

3.5. MANAGEMENT

Runderen bouwen normaal een relatief goede natuurlijke immuniteit op na het eerste

weideseizoen tegen maagdarmnematoden. Cooperia en Nematodrus induceren in hun

gastheer een snelle immuniteitsopbouw (Armour 1989). Bij de Ostertagia ostertagi echter

gebeurt de opbouw van immuniteit veel trager en zal deze na het eerste weideseizoen slechts

partieel zijn (Klesius, 1988). Wanneer de blootstelling in het eerste weideseizoen

onvoldoende is of de frequentie van anthelmintische behandelingen te hoog ligt, dan kan dit

in de daarop volgende weideseizoenen leiden tot parasitaire gastro-enteritis en de daarmee

gepaard gaande productieverliezen. Dit komt doordat de dieren onvoldoende

antigeenstimulatie hebben ondergaan met als gevolg dat ze geen goed immuunrespons

hebben kunnen opbouwen. Daarom is het beter om dieren in het eerste weideseizoen later te

behandelen zodat er al enige immuunstimulatie heeft plaatsgevonden en er een normale

ontwikkeling van immuniteit kan plaatsvinden (Wiliams, 1997).

Gastro-intestinale nematoden zijn normaal enkel van belang bij kalveren in het eerste weide

seizoen. Toch werd er fundamenteel bewijs geleverd dat er een negatieve invloed kan zijn op

de productiviteit van adult melkvee wanneer men de adulte dieren niet behandelt. Nodtvedt et

al. (2002) toonde aan dat een behandeling met eprinomectine pour-on na het kalven bij

melkvee, die toegang hadden tot grasland, een verhoging van de melkgift van 0,94 kg per

dag werd bekomen. Sanchez et al. (2002) stelde ook vast dat bij een behandeling met

eprinomectine pour-on bij melkvee, die de mogelijkheid hadden om te grazen, na de partus

een positief effect werd gezien wat betreft de tussenkalftijd en het aantal inseminaties per

dracht. De opfok van melkveekalveren gebeurt steeds volledig gescheiden van het

moederdier. Deze kalveren komen in de zomer meestal op een weide terecht die elk jaar

opnieuw gebruikt wordt voor de opfok van kalveren. Ze komen dus enkel in contact met

nematoden die uitgescheiden werden door het behandelde jongvee van het voorgaande jaar.

Dit zal een sterke selectie op resistentie teweegbrengen.

Pichard et al. (1980) suggereerde in eerder onderzoek reeds dat het gebruiken van

anthelminticum in een preventieve behandeling van een populatie, zelfs met minder

behandelingen, sterker zal selecteren op resistentie dan op een curatieve behandeling van

een populatie. Dobson et al. (1996) heeft dit vermoeden via onderzoek kunnen bevestigen en

stelde volgende algemene regel op: ‘Een chemoprofylactische strategie zal altijd het ontstaan

van resistentie bevorderen tegenover een chemotherapeutische strategie’. In Zweden

bijvoorbeeld wordt veel meer preventief behandeld dan in België of Duitsland. Meestal gaat

16

men daar ook geheel de groep behandelen, waar dit in België en Duitsland maar in 5-10%

van de bedrijven gedaan wordt (Charlier et al., 2010).

4. CONTROLE VAN RESISTENTIEONTWIKKELING

Tot op heden vertrouwden veehouders vooral op anthelmintica om gastro-intestinale

nematodeninfecties onder controle te houden in hun vee. Meestal gebruiken ze elk jaar

hetzelfde product en wanneer de werking afneemt schakelen ze gewoonlijk over op een

ander product. Wanneer ook hierbij de efficaciteit na verloop van tijd vermindert, is men

genoodzaakt om combinatiepreparaten te gebruiken. Dit bleek vooral in den beginne een

goede oplossing te zijn en daarenboven verminderde dit ook de kans op

resistentieontwikkeling, omdat de efficaciteit richting de 100% ging. Wanneer recent het

probleem van multipele resistentie de kop op stak, dienden andere maatregelen genomen te

worden. Hierbij dient men de selectiedruk tegen anthelminticum-resistentie te beperken.

4.1 CONTROLE MAATREGELEN

Vooreerst is het belangrijk om de dieren de dosis toe te dienen zoals voorgeschreven door de

fabrikant. Men kan het zwaarste dier wegen en op basis van dat gewicht geheel de kudde

behandelen. Op die manier kan men ook onderscheid maken tussen het falen van de

behandeling door onderdosering en anthelminticum-resistentie (De Graef et al, 2013). Best

behandelt men enkel de eerste weideseizoens kalveren en dit op zulke wijze dat ze nog

voldoende in aanraking komen met nematoden. Ploeger et al. (1990) toonde aan dat het

beter is om in het eerste weideseizoen een verminderde groei te hebben dan in het tweede.

Door voldoende blootstelling aan helminth-antigenen wordt immuniteit opgebouwd die hen zal

beschermen in de volgende weideseizoenen. Best vermijdt men ook elk jaar hetzelfde

anthelminticum te gebruiken.

Recent is het belang van een groot refugia toegenomen als preventieve maatregel in de strijd

tegen resistentieontwikkeling. De aanwezigheid van een groep nematoden die gevoelig zijn

aan anthelmintica zullen het deel resistente nematoden, die ontstaan na een behandeling,

verdunnen. Om een voldoende groot refugia te bekomen is het toepassen van een Targeted

Treatment (TT) of een Targeted Selective Treatment (TST) een goede methode gebleken.

Deze principes reduceren het aantal behandelingen en doen het interval tussen 2

behandelingen toenemen.

Bij TT gaat men geheel de kudde in een keer behandelen. Door het vergrootte

behandelingsinterval krijgen de gevoelige genotypes de kans om een groter onderdeel van de

weidecontaminatie uit te gaan maken. Hierdoor daalt het risico dat 2 heterozygoten met

elkaar paren en homozygote resistente nakomelingen gaan vormen. Bijgevolg zal het aantal

resistente genotypes op de weide gestaag dalen (Kenyon, 2009). TST op zijn beurt is een

doorontwikkelede vorm van TT. Deze strategie baseert zich op het feit dat het grootste deel

17

van de wormpopulatie, aanwezig is in een klein deel van de dieren in een kudde (Stafford et

al., 2009). Bij deze methode zal men enkel de zwaarste geïnfecteerde dieren uit de kudde

gaan behandelen (Charlier et al., 2014). Enkel de behandelde dieren kunnen dus instaan

voor de aanwezigheid van resistente genotypes. De wormpopulatie in het onbehandelde deel

van de kudde , zullen overleven en zorgen voor het onderhoud van het grootste deel van het

refugium. Aldus zal het refugium gevoelig blijven aan behandeling en kunnen behandelde

dieren zich terug infecteren met gevoelige nematoden. Bijgevolg zullen ook de resistente

genotypes in de behandelde dieren verdund worden en zal de selectiedruk afnemen

(Prichard, 1990). Momenteel bestaan er voor rundvee nog geen geschikte technieken om,

dieren die een behandeling kunnen gebruiken, te onderscheiden van de overige dieren. Men

kan wel de FEC bepalen, 2 maanden na het uitweiden of de gewichtsaanzet volgen, maar

deze benaderingen zijn te arbeidsintensief om routinematig te gaan gebruiken in de praktijk

(höglund et al., 2009).

Nieuw aangekochte dieren plaatst men best in quarantaine alvorens ze bij de kudde te laten.

Wanneer de resistentiestatus van het bedrijf van afkomst ongekend is of zou verschillen van

het eigen bedrijf dienen de dieren een behandeling te krijgen. Men gaat best behandelen met

een combinatie van macrocyclische lactonen en levamisole. In het Verenigd Koninkrijk

gebruikt men best de combinatie van benzimidazoles en levamisole omdat er resistentie

tegen macrocyclische lactones voorkomt. Na 48u worden de dieren buiten geplaatst op een

besmette weide, zodat je een dilutie krijgt van de eventueel resistente wormen die

uitgescheiden worden (Dobson et al., 2001).

4.2 ALTERNATIEVE MAATREGELEN

Momenteel voert men veel onderzoek naar mogelijkheden om ons in de toekomst minder

afhankelijk te maken van anthelminticumgebruik. Het ontwikkelen van een vaccin zou zeker

een antwoord kunnen bieden op anthelminticum resistentie. Ondanks de identificatie van

verschillende bruikbare antigenen is er tot op heden nog steeds geen bruikbaar vaccin op de

markt verschenen (Vercruysse et al., 2007).

Een andere methode maakt gebruik van per oraal toegediende microfungi. Na de passage

door de gastro-intestinale tractus van het rund zullen de microfungi zich voeden met larven op

de weide (Waller et al., 1994; Assis et al., 2012).

BESPREKING

In deze literatuurstudie komt steeds hetzelfde punt terug naar voren, namelijk dat er bij de

kleine harkauwers reeds veel meer onderzoek is verricht naar de problematiek rond

anthelminticum resistentie. Hierdoor zijn de risicofactoren en de prevalentie van

anthelminticumresistentie op wereldvlak goed gekend bij de kleine herkauwers. Dit staat in

18

schril contrast met de stand van zaken bij rundvee. De afgelopen decennia werd er amper

aandacht aan besteed omdat er simpelweg geen nood aan was.

De laatste jaren werd er een kleine inhaalbeweging gemaakt omdat steeds vaker melding

gemaakt werd van resistentie bij rundvee. Een andere reden is wellicht dat men een situatie

zoals die nu aanwezig is in de schapenhouderij, ten allen tijde wil vermijden. Uit onderzoek

van Demeler et al. (2009) en El-Abdellati et al. (2010a) bleek dat ook in België, Duitsland en

Zweden reeds resistentie aanwezig is tegen de macrocyclische lactones. Bij rundvee bleek

dus al resistentie aanwezig te zijn, zonder dat we het goed en wel besseften. Via

sensibiliseringscampagnes kan men aan veehouders en veeartsen vragen waakzaam te zijn

en indien ze een vermoeden van resistentie hebben dit steeds te melden. Hierdoor zal men

resistentie in veel gevallen sneller kunnen opsporen. Zo kan men de problemen kordaat

aanpakken voor ze zich verder verspreiden onder de kuddes.

De testen die momenteel voor handen zijn, werden in het verleden allemaal ontwikkeld voor

hun gebruik bij schapen. Vaak blijkt dat het gebruik van dezelfde testen bij rundvee niet altijd

als even betrouwbaar mag aanzien worden. Momenteel is er dus hoge nood aan testen die

specifiek voor rundvee ontwikkeld zijn. Dit omdat rundvee een lagere eiproductie heeft en

deze niet steeds gekoppeld kan worden aan de hoeveelheid wormen aanwezig in een rund.

Ideaal zou het zijn wanneer een gevoelige test ontwikkeld kan worden, die zowel zwaar

besmette dieren kan identificeren in een kudde en tegelijk de resistentiestatus van de

parasieten kan bepalen. Het zou dan ook zeer interessant zijn omdat op basis daarvan een

TST aanpak uit te werken en zo resistentieopbouw te vertragen (De Graef et al., 2013).

De kennis die vergaard wordt over de risicofactoren kan men gebruiken om preventieve

maatregelen op te stellen. Kort geschetst, moeten we onderdosering vermijden, het refugium

zo hoog mogelijk houden en zo min mogelijk behandelen. Ook dient er aandacht besteed te

worden aan alternatieve maatregelen om ons anthelminticum gebruik terug te dringen. Toch

moeten we steeds in ons achterhoofd houden dat we nooit zonder doeltreffende anthelmintica

zullen kunnen in de intensieve veehouderij. Daarom is het belangrijk dat men de

werkzaamheid van de ontwormingsmiddelen kan blijven garanderen.

Uit deze scriptie blijkt dus dat er hoge nood is aan meer doortastend onderzoek bij rundvee.

Alleen zo zullen we de ontstaansmechanismen van anthelminticum resistentie beter kunnen

begrijpen. Hierdoor zou het makkelijker moeten worden om maatregelen te treffen en

behandelingsstrategiën uit te werken om op die manier een halt toe te roepen aan

anthelminticum resistentie.

19

REFERENTIELIJST

-Aceves J., Erlij D., Martinez-Maranon R. (1970). The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle. British Journal Pharmacology 38, 602–607.

-Armour J. (1989). The influence of host immuntity on the epimeiology of trichostrongylus

infections in cattle. Veterinary Parasitology 32, 5-19

-Assis R.C., Luns F.D., Araujo J.V., Braga F.R. (2012). Biological control of trichostrongyles in

beef cattle by the nematophagous fungus Duddingtonia flagrans in tropical southeastern

Brazil. Experimental Parasitology 132, 373-377.

-Aubry M.L., Cowell P., Davey M.J., Shevde S. (1970). Aspects of the pharmacology of a new

anthelmintic: pyrantel. British Journal Pharmacology 38, 332–344.

-Barger I.A. (1994). Rotational grazing for control of gastrointestinal nematodes of goats in a

wet tropical environment. Veterinary Parasitology 53, 109-116.

-Barger I.A. (1999). The role of epidemiological knowledge and grazing management for

helminth control in small ruminants. International Journal for Parasitology 29, 41-4

-Beech R.N., Prichard R.K., Scott M.E. (1994). Genetic variability of the β-tubulin genes in

benzimidazole susceptible and resistant strains of Haemonchus contortus. Genetics 138,

103-110.

-Bennett J. L., Pax R.A. (1986). Micromotility meter: an instrument designed to evaluate the

action of drugs on motility of larvae and adult nematodes. Parasitology 93, 341-346.

-Borgers M., De Nollin S. (1975). Ultrastructural changes in Ascaris suum intestine after

mebendazole treatment in vivo. Journal Parasitology 61, 110–122.

-Brownlee D.J., Holden-Dye L., Walker R.J. (1997). Action of the anthelmintic ivermectin on

the pharyngeal muscle of the parasitic nematode, Ascaris suum. Parasitology 115, 553–561.

-Charlier J., Demeler J., Höglund J., von Samson-Himmelstjerna G. (2010). Ostertagia

ostertagi in first-season grazing cattle in Belgium Germany and Sweden: General levels of

infection and related management practices. Veterinary Parasitology 171, 91-98.

20

-Charlier J., Morgan E. R., Rinaldi L., van Dijk J., Demeler J., Höglund J., Hertzberg H., Van

Ranst B., Hendrickx G., Vercruysse J., Kenyon F. (2014). Practices to optimise

gastrointestinal nematode control on sheep, goat and cattle farms in Europe using targeted

(selective) treatments. Veterinary Record 175, 250-255

-Coles G.C. (2004). Resistance in cattle worms. Veterinary Record 155, 312.

-Coles G.C. (2005). Anthelmintic resistance-looking to the future: a UK perspective. Research

in Veterinary Science 78, 99-108.

-Coles G.C., Bauer C., Borgsteede F.H.M., Geerts S., Klei T.R., Taylor M.A., Waller P.J.

(1992). World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.)

methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance.

Veterinary Parasitology 44 , 35–44

-Coles G.C., Jackson F., Pomroy W.E., Prichard R.K., von Samson - Himmelstjerna G.,

Silvestre A., Taylor M.A., Vercruysse J. (2006). The detection of anthelmintic resistance in

nematodes of veterinary im- portance. Veterinary Parasitology 136, 167–185.

-Coles G.C., Stafford K.A. (2001). Activity of oxycolzanide, nitroxynil, clorsulon and

albendazole against adult triclabendazole-resistant fasciola hepatica. Veterinary Record 148,

723-724.

-Coles, G.C. (2002). Cattle nematodes resistant to anthelmintics: why so few cases?

Veterinary Research 33, 481-489

-Conway D.P. (1964). Variance in the effectiveness of thiabendazole against Haemonchus

contortus in sheep. American Journal Veterinary Research 25, 106-107.

-De Graef J., Claerebout E., Geldhof P. (2013). Anthelmintic resistance of gastrointestinal

cattle nema- todes. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 82, 113-123.

-Demeler J., Van Zeveren A.M., Kleinschmidt N., Vercruysse J., Hoglund J., Koopmann R.,

Cabaret J., Claere- bout E., Areskog M., von Samson-Himmelstjerna G. (2009). Monitoring

the efficacy of ivermectin and albendazole against gastro intestinal nematodes of cattle in

Northern Europe. Veterinary Parasitology 160, 109-115.

-Dobson R.J., Besier R.B., Barnes E.H., Love S.C., Vizard A., Bell K., Le Jambre L.F. (2001).

Principles for the use of macrocyclic lactones to minimise selection for resis- tance. Australian

Veterinary Journal 79, 756-761.

21

-Dobson R.J., LeJambre L.F., Gill J.F. (1996). Management of anthelmintic resistance:

inheritance of resistance and selection with persistent drugs. International Journal of

Parasitology 26, 993–1000

-El-Abdellati A., Charlier J., Geldhof P., Levecke B., De- meler J., von Samson-

Himmelstjerna, G., Claerebout E., Vercruysse J. (2010a). The use of a simplified faecal egg

count reduction test for assessing anthelmintic efficacy on Belgian and German cattle farms.

Veterinary Parasitology 169, 352-357.

-Elard L., Cabaret J., Humbert J.F. (1991) PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibility or

resistance in natural populations of the small ruminant parasite, Teladorsagia circumcincta.

Veterinary Parasitology 80, 231–237

-Elard L., Comes A.M., Humbert J.F., (1996). Sequences of betatubulin cDNA from

benzimidazole-susceptible and -resistant strains of Teladorsagia circumcincta, a nematode

parasite of small ruminants. Molecular Biochemy Parasitology 79, 249–253.

-Elard L., Sauve C., Humbert J.F. (1998). Fitness of bezimidazole-resistant and susceptible

worms of Teladorsagia circumcincta, a nematode parasite of small ruminants. Parasitology

117, 571-578

-Eysker M., Ploeger H.W. (2000). Value of present diagnostic methods for gastrointestinal

nematode infections in ruminants. Parasitology 120, 109-119.

-Folz S.D., Pax R.A., Thomas E.M., Bennett J.L., Lee B.L., Conder G.A. (1987). Detecting in

vitro anthelmintic effects with a micromotility meter. Veterinary Parasitology 24, 241-250.

-Gill, J.H., Redwin, J.M., van Wyk, J.A., Lacey, E., (1995). Avermectin inhibition of larval

development in Haemonchus contortus effects of ivermectin resistance. International Journal

Parasitology 25, 463–470.

-Höglund J., Morrison D. A., Charlier J., Dimander S. O. & Larsson A. (2009) Assessing the

feasibility of targeted selective treatments for gastrointestinal nematodes in first-season

grazing cattle based on mid-season daily weight gains. Veterinary Parasitology 164, 80–88

-Hubert J., Kerbouf D. (1984). A new method for culture of larvae used in diagnosis of

ruminant gastrointestinal strongylosis: comparison with faecal cultures. Canadian Journal of

Comparative Medicine 48, 63–71.

22

-Hubert J., Kerbouf D. (1992). A microlarval development assay for the detection of

anthelmintic resistance in sheep nematodes. Veterinary Record 130, 442–446.

-Hunt K.R., Taylor M.A. (1995). Use of the egg hatch assay on sheep faecal samples for the

detection of benzimidazole resistant nematodes. Veterinary Record 125, 153–154

-Kass I.S., Wang C.C., Walrond J.P., Stretton A.O. (1980). Avermectin B1a, a paralyzing

anthelmintic that affects interneurons and inhibitory motoneurons in Ascaris. Proceeding

Naional Academy Science U.S.A. 77, 6211–6215.

-Kelly I.D., Whitlock H.V., Thompson H.G., Hall C.A., Martin I.C.A., Le Jambre L.F., (1978).

Physiological characteristics of free-living and parasitic stages of strains of Haemon- chus

contortus, susceptible or resistant to benzimidazole anthelmintics. Research veterinary

Science 25, 376-385.

-Kenyon F., Greer A.W., Coles G.C., Cringoli G., Papadopoulos E., Cabaret J., Berrag B.,

Varady M., Van Wyk J.A., Thomas E., Vercruysse J., Jackson F. (2009). The role of targeted

selective treatments in the development of refugia-based approaches to the control of

gastrointestinal nematodes of small ruminants. Veterinary Parasitology 164, 3-11.

-Klesius P.H., (1988). Immunity against Ostertagia ostertagi. Veterinary Parasitology. 27, 159-

167

-Lalchhandama K. (2010). Anthelmintic resistance: the song remains the same. Science

vision 10, 11-122

-Le Jambre L.F., Gill J.H., Lenane I.J., Baker P. (2000). Inheritance of avermectin resistance

in Haemonchus con- tortus. International Journal for Parasitology 30, 105- 111.

-Le Jambre L.F., Gill J.H., Lenane I.J., Lacey E. (1995). Characterisation of an avermectin

resistant strain of Australian Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology 25,

691–698.

-Le Jambre L.F., Martin P.J., Webb R.F. (1997). Thiabendazole resistance in field populations

of Haemonchus contortus. Australian Veterinary Journal 55, 163-166

-Levecke B., Dobson R.J., Speybroeck N., Vercruysse J., Charlier J. (2012). Novel insights in

the faecal egg count reduction test for monitoring drug efficacy against gastrointestinal

nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology 188, 391-396.

23

-Martin P.J., Le Jambre L.F., Claxton J.H. (1981). The impact of refugia on the development

of thiabendazole resist- ance in Haemonchus contortus. International Journal for Parasitolog

11, 35-4

-Martin P.J., McKenzie J.A., (1990). Levamisole resistance in Trichostrongylus colubriformis:

A sex-linked recessive character. International Journal for Parasitology 20, 867-872.

-Michel J.F. (1985). Strategies for the use of anthelmintics in live- stock and their implications

for the development of drug resistance. Parasitology 90, 621-62

-Njue, A.I., Prichard, R.K. (2003). Cloning two full beta-tubulin cDNAs from Cooperia

oncophora, and screening for benzimidazole-associated mutations in two isolates.

Parasitology 127, 579-588

-Nødtvedt A., Dohoo I., Sanchez J., Conboy G., DesCoteaux L., Keefe G. (2002). Increase in

milk yield following eprinomectin treatment at calving in pastured dairy cattle. Veterinary

Parasitology 105, 191–206.

-Pape M., Posedi J., Failing K., Schnieder T., von Samson-Him- melstjerna G. (2003).

Analysis of the beta-tubulin codon 200 genotype distribution in a benzimidazole-susceptible

and -resistant cyathostome population. Parasitology 127, 53–59.

-Pape M., von Samson-Himmelstjerna G., Schnieder T. (1999). Characterisation of the beta-

tubulin gene of Cylicocyclus nas- satus. International Journal Parasitoly 29, 1941–1947.

-Ploeger H.J., Kloosterman A., Bargeman G., Wuijckhuise L.V., van den Brink R. (1990). Milk

yield increase after anthelmintic treatment of dairy cattle related to some

parametersestimating helminth infection. Veterinary Parasitology 35, 103–116

-Prichard R.K., Hall C.A., Kelly J.D., Martin I.C.A., Donald A.D. (1980). The problem of

anthelmintic resistance in nematodes. Australie Veterinary Journal 56, 239-250

-Prichard R.K. (1990). Anthelmintic resistance in nematodes: extent, recent understanding

and future di- rections for control and research. International Journal for Parasitology 20, 515-

523.

-Roos, M.H., Boersema, J.H., Borgsteede, F.H.M., Cornelissen, J., Taylor, M. and

Ruitenberg, E.J., (1990). Molecular analysis of selection for benzimidazole resistance in the

sheep parasite Haemonchus contortus. Molecular Biochemy Parasitology 43, 77-88.

24

-Sanchez J., Nødtvedt A., Dohoo I., DesCoteaux L. (2002c). The effect of eprinomectin

treatment at calving on reproduction parameters in adult dairy cows in Canada. Preventive

Veterinary Medicine 56, 165–177.

-Sangster N. (1996). Pharmacology of anthelmintic resistance. Parasitology 113, 201–216

-Sangster N.C., Gill J. (1999). Pharmacology of anthelmintic resistance. Parasitology Today

15, 141-146.

-Sangster N.C., Redwin J.M., Bjorn H. (1998). Inheritance of levamisole and benzimidazole

resistance in an isolate of Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology 28,

503-510.

-Sargison N.D., Jackson F., Bartley Moir, A.C.P. (2005) . Failure of moxidectin to control

benzimidazole-, levamisole- and ivermectin resistant Teladorsagia circumcincta in a sheep

flock. Veterinary Record 156, 109–156.

-Smith G. (1990). A mathematical model for the evolution of an- thelmintic resistance in a

direct life cycle nematode parasite. International Journal for Parasitology 20, 913-9

-Smith G., Grenfell B.T., Isham V., Cornell S. (1999). Anthelmintic resistance revisited:

underdosing, chemo and prophylactic strategies, and mating probabilities. International

Journal for Parasitology 29, 77-91.

-Soutello R.G., Seno M.C., Amarante A.F. (2007). Anthel- mintic resistance in cattle

nematodes in northwestern Sao Paulo State, Brazil. Veterinary Parasitology 148, 360- 364.

-Stafford K., Coles G.C., (1999). Nematode control practices and anthelmintic resistance in

dairy calves in the south west of England. Veterinary Record 144, 659-661.

-Stafford K.A., Morgan E.R., Coles G.C. (2009). Weight- based targeted selective treatment of gastrointestinal nem- atodes in a commercial sheep flock. Veterinary Parasitology 164, 59-65.

-Suarez V.H., Cristel S.L. (2007). Anthelmintic resistance in cattle nematode in the western

Pampeana Region of Argentina. Veterinary Parasitology 144, 111-117.

-Sutherland I.A., Leathwick D.M. (2011). Anthelmintic resistance in nematode parasites of

cattle: a global issue? Trends in Parasitology 27, 176-181.

-Taylor M.A., Hunt K.R., Goodyear K.L. (2002). Anthelmintic resistance detection methods.

Veterinary Parasitology 103, 183-194.

25

-Van Wyck J.A. (2001). Refugia overlooked as perhaps the most potent factor concerning the

development of anthelmintic resistance. Journal Veterinary Research 68, 55-67.

-Vercruysse J., Claerebout E. (1997). Immunity development against Ostertagia ostertagi and

other gastrointestinal nematodes in cattle. Veterinary Parasitology 72, 309–326.

-Vercruysse J., Claerebout E. (2001). Treatment vs. non-treatment of helminth infections in

cattle: defining the treshold. Veterinary Parasitology 98, 194-214.

-Vercruysse J., Schetters T.P., Knox D.P., Willadsen P., Claerebout E. (2007). Control of

parasitic disease using vaccines: an answer to drug resistance? Revue Scientifique et

Technique 26, 105-115.

-Vermunt J.J., West D.M., Pomroy W.E. (1995). Multiple resistance to ivermectin and

oxfendazole in Cooperia species of cattle in New Zealand. Veterinary Record 137, 43-45.

-von Samson-Himmelstjerna, G., Harder, A., Pape, M., Schnieder, T., (2001). Novel small

strongyle (cyathostominae) beta-tubulin sequences. Parasitology Research 87, 122–125.

-Waghorn T.S., Leathwick D.M., Rhodes A.P., Jackson R., Pomroy W.E., West D.M., Moffat

J.R. (2006). Prevalence of anthelmintic resistance on 62 beef cattle farms in the North Island

of New Zealand. New Zealand Veterinary Journal 54, 278-282.

-Wagland B.M., Jones W.O., Hribar L., Bendixsen T., Emery D.L. (1992). A new simplified

assay for larval migration inhibition. International Journal for Parasitology 22, 1183-1185.

-Waller P.J., Larsen M., Faedo M., Hennessy D.R. (1994). The potential of nematophagous

fungi to control the free- living stages of nematode parasites of sheep: in vitro and in vivo

studies. Veterinary Parasitology 51, 289-299.

-Williams J.C. (1997). Anthelmintic treatment strategies: current status and future. Veterinary

Parasitology 72, 461-477.

-Winterrowd C.A., Pomroy W.E., Sangster, N.C., Johnson, S.S., Geary, T.G., (2003).

Benzimidazole-resistant b-tubulin alleles in a population of parasitic nematodes (Cooperia

oncophora) of cattle. Veterinary Parasitoly 117, 161–172.

-Wolstenholme A.J., Fairweather I., Prichard R., von Samson-Himmelstjerna G., Sangster

N.C. (2004). Drug resistance in veterinary helminths. Trends in Parasitology 20, 469-476.

of New Zealand. New Zealand Veterinary Journal 54, 278-282.

26