Hoorcollege 14&15

7/22/2019 Hoorcollege 14&15

http://slidepdf.com/reader/full/hoorcollege-1415 1/5

Hoorcollege 14 & 15 “moleculair biologische technieken 1”

Restrictie endonucleases

(dia 2)Endo: knippen in het midden

Exo: vanaf de uiteinden

Restrictie endonucleases kunnen in DNA met een specifieke sequentie knippen. Als ze

knippen herkennen ze alleen dubbelstrengs DNA en de specificiteit duidt op herkenning

van een 5’3’ sequentie. Er zijn verschillende vormen van knippen. De enzymen

kunnen blunt ends knippen, dan knipt het enzym in het midden. Het DNA heeft dus

stompe uiteinden. Dit komt niet heel veel voor. Vaker komt ongelijk knippen voor. Dan

knipt het bijvoorbeeld na de eerste nucleotide vanaf de 5’ kant.

Vaak zijn deze sequenties palindromisch. Dit komt omdat de eerste 3 nucleotiden

gespiegeld zijn. Er zit een soort symmetrie in.

Het kan ook zo zijn dat pas na 5 basen vanaf de 5’ kant wordt geknipt (PstI).

Bij sticky ends kan dus op 2 manieren worden geknipt, met een 5’ overhang en met een

3’ overhang.

Wordt vaak enkelstrengs weergegeven, maar ze bedoelen wel dubbelstrengs knippen.

(dia 3) restrictie enzymen komen niet in humane cellen voor. Je vindt ze voornamelijk in

bacteriën. Deze hebben een genetische code voor restrictie enzymen, deze zijn

betrokken bij de afweer tegen virussen. Het DNA van die virussen wordt dan in stukken

geknipt. De sequentie specificiteit moet dus terug te vinden zijn in het virus DNA en de

bacterie zelf moet geen herkenningssequentie voor dat restrictie enzym bevatten. Deze

restrictie enzymen zijn in de loop der jaren uit bacteriën geïsoleerd, niet alleen uitbacteriën die groeien bij 37 graden.

Een restrictie enzym doet z’n werk alleen als het perfecte herkenning heeft met een,

meestal 6 baseparen, sequentie. Op dat moment is er een match van het eiwit met het

DNA, er vindt dan een conformatie plaats. Dan komt er dus een 3’ OH groep en een 5’

fosfaatgroep, er is dus geknipt. De basen komen zo vrij te liggen.

Gel electroforese

(dia 4) deze enzymen zijn handig wanneer je maar een klein stukje DNA wilt analyseren.

Dan heb je namelijk niet een heel genoom nodig en moet je dat kleine stukje uit een

groter stuk kunnen halen. Dit kan je doen door een paar identificatie punten te vinden

waar die enzymen kunnen knippen. Ook kan je een groot stuk DNA incuberen metrestrictie enzymen en als er herkenningspunten zijn, zal het enzym daar knippen. Dit

kan je weergeven in een gel-electroferese. Negatief geladen DNA loopt naar de plus pool.

Het DNA wordt dan gescheiden op grootte. Kleine stukjes DNA gaan sneller dan grote

stukken. De marker die je mee laat lopen bevat DNA waarvan de lengtes bekend zijn. Zo

kan je ook weten wat de lengten van de andere fragmenten zijn. De banden op de gel is

niet 1 DNA fragment, maar een paar miljoen DNA fragmenten met dezelfde grootte.

(dia 5) Het DNA kan je zichtbaar maken met ethidiumbromide en UV-licht. Het DNA zal

dan oplichten (paars) en daar kan je een foto van maken waardoor er een

bandenpatroon op de foto ontstaat. Ehtidiumbromide fluoresceert goed, maar dit

betekent ook dat het in het DNA gaat zitten. Dit is niet zo goed, carcinogeen. Dit kan dus

ook in je eigen DNA gaan zitten. Er moet geen direct contact zijn. Een gevolg is thymine

dimeren.



(dia 6) een andere methode is het radioactief maken van de uiteinden van DNA. Dit kan

je zichtbaar maken met een röntgenfilm, je krijgt dan een doorzichtige achtergrond met

zwarte DNA bandjes. Dit is ook niet heel gezond

(dia 7) Dit is nog een andere methode. Hier worden nucleotiden gemaakt met een

specifieke chemische groep. Deze kunnen herkend worden door een antilichaam. Aan de

base zit dan zo’n groep. Deze omvat een spacer, deze creëert ruimte. Daaraan zit eenspecifieke groep waar tegen antilichamen kunnen worden geplakt. Deze nucleotiden

moet je dus ingebouwd hebben in het DNA.

(dia 8) Een stuk DNA wat uit het midden is geknipt, moet dus aan beide kanten een

herkenningssequentie hebben voor het restrictie enzym.

Kloneren

(dia 9) wanneer je zo’n stukje DNA hebt, moet je er heel veel van hebben om het te

kunnen analyseren. Dit kan je verkrijgen door kloneren.

DNA kan, in een lab, met allerlei soorten DNA baseparen. Fragmenten met een 5’

overhang, kunnen dus baseparen met een fragment dat een complementaire 5’ overhangheeft. Deze overhang moet een perfecte match zijn, anders zal het niet met elkaar

binden.

(dia 10) Er worden dus opnieuw stukjes DNA met elkaar gecombineerd recombinant

DNA. Recombinant DNA kan bestaan uit humaan gecombineerd met bacterieel DNA.

(dia 11) Als het DNA geknipt is, worden de uiteinden, de suikerfosfaat backbone,

hersteld door het enzym DNA ligase.

(dia 12) Voor het verkrijgen van veel van een stukje DNA, wordt de E.coli bacterie

gebruikt. Deze bacterie heeft zijn eigen genoom, daarop ligt een ori. Sommige bacterien

hebben plasmiden. Dit is een klein circulair DNA, wat zelfstandig kan vermenigvuldigenin een bacterie. Deze moet ook een ori hebben, anders is er geen replicatie. Vaak wordt

bij deling van een bacterie de plasmide verwijderd.

(dia 13) Deze moet voor kloneren echter wel binnen worden gehouden. Dit wordt

gedaan door een aantal dingen in te bouwen in het plasmide. Een daarvan is een stukje

DNA wat codeert voor resistentie tegen een antibioticum. Als een bacterie dan in

aanraking komt met dit antibioticum, kan de bacterie hier tegen. Je kan dan

onderscheidt maken tussen bacterien met een plasmide en zonder plasmide.

Het derde wat er op een plasmide moet komen is een reporter gen. Hiermee kan je zien

of je gekloneerd hebt (-galactosidase: blauwkleuring). Je kan hiermee zien of de

bacterie het plasmide nog bezit. Het gen voor -galactosidas is het LacZ gen. Als dit eiwit

wordt gemaakt en in het groeimedium is x-gal aanwezig, dan kan het x-gal het -

galactosidase knippen. Wanneer dit gebeurd is een van de stofje blauw. Je krijgt dan

blauwe bacterien. Je kan dan concluderen dat het resistent is tegen een antibioticum, dat

de bacterie het plasmide bevat en dat LacZ expressie actief is.

(dia 15/16) Bij een kloneringsvector is in het LacZ gen nog een stuk DNA er in geplakt.

Dit is allemaal synthetisch gemaakt in een lab. Aan het begin van het open lees frame

van het LacZ gen is DNA toegevoegd. Dit zit vol met restrictie enzym

herkenningsplaatsen. Het moet een veelvoud van 3 zijn, anders wordt het open

leesframe van het LacZ gen verstoord en kan -galactosidase dus niet meer gevormd

worden. Ook moet er geen stopcodon in zitten. Ook moet er getest worden of het eiwit



wat gevormd wordt nog steeds geknipt kan worden door x-gal. Het stukje wat in het

open leesframe van LacZ wordt gezet is een multiple clonings site of polylinker.

(dia 17) In een MCS kunnen weer andere stukje DNA worden gezet. Het plasmide kan

worden opengeknipt op een van de restrictie enzym herkenningsplaatsen en dan kan je

een stukje DNA daarin zetten. Je kunt dan echt gaan kloneren.(dia 18) Dit stukje wordt dan ook vermeerderd tijdens het amplificeren (vermeerderen).

Deze vermeerdering gaat exponentieel. De plasmide kan je ook isoleren uit de bacterie.

Na het amplificeren heb je dan dus alleen een heleboel DNA van de plasmide.

(dia 19) Als je een stukje DNA hebt toegevoegd aan de plasmide, is het open leesframe

van het LacZ gen verstoord, dus is er ook geen blauwkleuring meer. Je ziet dan witte

kolonies.

(dia 20) Het stukje DNA wordt dus toegevoegd in de polylinker.

(dia 21) Als je heel veel DNA uit een kloneringsvector hebt, kan je porties hier van

gebruiken voor verschillende experimenten. Als je een kloneringsvector hebt met

verschillende restrictie herkenningsplaatsen, kan je dat plasmide dus steeds voor her

kloneren van verschillende stukken DNA gebruiken.

Genomische DNA bank

(dia 22) De plasmides zijn handig wanneer je het totale genoom bij elkaar wilt hebben in

kleine stukjes. Je kan een genomische DNA bank maken. Een totaal genomisch DNA

wordt aan flarden geknipt door restrictie enzymen. Er zijn dan een heleboel kleine

stukjes DNA en deze meng je met plasmiden die door hetzelfde restrictie enzym zijn

geknipt als het DNA. Ze hebben dan dezelfde sticky uiteinden en zo’n DNA stukje kan

dan recombineren met een plasmide. Deze plasmiden moeten dan weer de bacterien in,

dit doe je met calcium. Een bacterie neemt meestal maar 1 plasmide op. Deze plasmidenzijn allemaal verschillend omdat ze allemaal verschillende stukjes DNA hebben.

(dia 23) Deze methode is eigenlijk alleen handig wanneer je geinteresseerd bent in

exon-intron overgangen. Wanneer je eiwitcoderende delen wilt bestuderen, is vooral

RNA handig.

Hybridiseren

(dia 24) Met hybridiseren kan je het RNA bestuderen. Hybridiseren betekend op elkaar

plakken. Je hebt een mengsel van enkelstrengs DNA moleculen. Ook wordt er een stukje

enkelstrengs DNA gemaakt, dit gebeurd als je op zoek bent naar een bepaald stuk DNA.

Als dit wordt geincubeerd met het DNA moleculen mengsel, zal het synthetische DNA na

verhitting een complementaire streng vinden.Vaak wordt bij die mechanisme een primer of probe gebruikt, deze is uniek als het 20

nucleotiden lang is. Hiermee kan je een heel lang RNA uit een mengsel RNA’s isoleren. In

het lab past alles op elkaar, qua RNA en DNA. De probe of primer wordt vaak radioactief

gemaakt, zodat het makkelijk is terug te vinden waar het aan bindt.

cDNA bank

(dia 25) Deze bank is gebasseerd op hybridiseren. Hierin neem je een weefsel, daarin

zitten bepaalde RNA’s. De expressie van RNA hangt af van het weefsel. Wanneer het een

mRNA betreft, bevat dit een poly-A staart. Je kan dan een primer maken die oligo-DT is,

dus veel T’tjes aan elkaar. Dit wordt gehybridiseerd tegen het mRNA aan. Bij het

mengsel wordt dan reverse transcriptase gevoegd en nucleotiden gevoegd en dit zal eencomplementaire DNA streng maken. Vervolgens wordt er een RNase toegevoegd, dit



breekt RNA af. Er blijft een stukje RNA zitten, dit dient vervolgens als primer. DNA

polymerase zal deze primer verlengen. Er is dus een kopie van het mRNA gemaakt, maar

dan in dubbelstrengs.

(dia 26) Deze cDNA’s kan je ook weer gaan kloneren en inbrengen in plasmiden. Je kan

dan zien welke RNA’s voorkomen in welke weefsels. Hoe vaker het RNA voorkomt, hoe

groter de kans is dat het terug te vinden is in het plasmide.

Hoorcollege 15

DNA sequentie analyse

(dia 1) Wanneer je een stuk onbekend stuk DNA in een plasmide hebt, kan je er achter

komen wat deze sequentie is. Je weet welke uit einden het heeft, anders kon het

restrictie enzym niet knippen.

(dia 2) Wanneer het DNA geisoleerd is, wordt het verhit. Als het DNA verhit wordt, krijg

je twee enkele strengen.

(dia 3) Dan maak je 1 of 2 primers en die laat je binden aan het enkelstrengs DNA. Voor

die primer moet je de sequentie weten, want hij moet complementair zijn aan een stukje

DNA. Je weet niet de sequentie van het stuk DNA waarin je geinteresseerd bent, maar

wel die van de kloneringsvector en de MCS. Je moet dus een primer hebben die

complementair is aan eens stukje voor of na het onbekende DNA. Welke kant de

template verlengt wordt, ligt aan welke kant de primer op beweegt.

(dia 4/5) Met een primer die bindt aan de template, kan je met een DNA polymerase en

alle nucleotiden heel de plasmide weer dubbelstrengs maken. Als je dit doet wordt er

ook weer een stuk DNA gemaakt waarvan de sequentie onbekend is.

(dia 6/7) Wanneer je heel de template weer repliceerd, krijg je weer dezelfde plasmide.Door een speciale base toe te voegen gebeurd er iets anders. Er wordt dan een dideoxy

toegevoegd in plaats van een deoxy. Een deoxy heeft een 3’ OH groep, deze is nodig bij

het verlengen van de keten. Een dideoxy mist deze OH groep, dus deze kan de keten niet

meer verlengen. In een mengsel doe je dan een overmaat van de gewone deoxy

nucleotiden en af en toe doe je een dideoxy erbij. Alle 4 de basen kunnen gebruikt

worden voor een dideoxy.

Op dit principe is de sequentie bepaling gebaseerd.

(dia 9) Het DNA verhit je en je gebruikt 1 streng als template. Er is een primer gemaakt

die op het DNA past, dit is dus een bekende sequentie. Deze primer is ongeveer 20

nucleotiden lang. Dan kan de primer actief worden gemaakt, maar je kan ook maar 1nucleotide radioactief maken. Vervolgens worden daar alle vier de deoxy’s toegevoegd.

Dat wordt verdeeld in 4 buisjes. In ieder buisje zitten dan een paar miljoen DNA

moleculen. Als bij die buisjes DNA polymerase werd toegevoegd werd de primer

verlengt en krijg je dus een tweede cirkel. Maar eerst worden de dideoxy’s in de buisjes

toegevoegd. In buisje 1 ddATP, buisje 2 ddTTP enz. Het polymerase zal dan zijn werk

doen, maar zal op een onwillekeurig moment een keer een dideoxy inbouwen. Het buisje

waar het DNA dus in zat heeft als laatste die base ingebouwd die bij dat buisje gevoegd

was als dideoxy. Vervolgens maak je een gel en hoe kleiner het fragment is, hoe lager het

onderin de gel terecht komt. Omdat er zoveel moleculen in 1 buisje zitten, is er van elke

lengte wel een fragment. In die gel ontstaat dan een bandenpatroon en je weet in welke



banden de buisjes zijn gevoegd en je weet dus wat de laatste letter was, hierdoor kan je

een hele sequentie lezen.

(dia 11/12) Bij deze techniek is gebruik gemaakt van de radioactiviteit van de primer.

Tegenwoordig kunnen de dideoxy’s fluorescent gemaakt worden en die krijgen dan hun

eigen kleur. Dan kunnen alle buisjes bij elkaar in 1 laantje. Het is een geautomatiseerd

systeem, dus dan krijg je allemaal gekleurde pieken.(dia 14/15) Wanneer je de sequentie van het DNA weet, kan je ook kijken of het codeert

voor een eiwit. Je moet dan kijken naar de open leesframes, dit kan in 6 frames. Elke

streng heeft 3 frames en je weet niet of je een primer voor de template of de coderende

streng hebt gebruikt.

In zo’n reactie zal je ongeveer 300 nieuwe basen kunnen lezen. Wanneer je meer basen

hebt op een onbekend stuk DNA, kan je van 2 kanten de sequentie in lezen. Dus een

primer begint net ervoor met polymeriseren en de ander begint net erna en gaat terug

polymeriseren.

PCR

(dia 16) Het bitter gen heeft een mutatie als je wel of niet proeft. Dit hangt af van of eenrestrictie enzym kan knippen.

(dia 17/18) Je neemt van een totaal genomisch DNA een stukje DNA, bijvoorbeeld een

gen en dit ga je amplificeren. Dit kan je doen door weer een primer te nemen die een van

de twee strengen verlengt. In totaal heb je 2 primers, de een verlengt de ene streng, de

ander verlengt de andere streng. Bij deze reactie worden geen dideoxy’s gevoegd,

waardoor de streng dus helemaal verlengt wordt. Vervolgens kan de op de gevormde

streng ook weer een primer binden en die primer wordt dan weer verlengt. Na een

aantal cycli heb je dus miljoenen kopieen van dat stukje DNA. Ook dit kan je weer

zichtbaar maken en op een gel zetten. Ook kan je, als je een heleboel hebt, het incuberen

met een restrictie enzym (practicum bitter gen).

Toepassingen PCR methoden

(dia 20) Je kan dus kijken naar DNA van een bepaald persoon. Dit kan je ook kloneren,

dit kan ook met RNA waar je vervolgens cDNA van maakt. Na PCR amplificatie kan je

deze miljoenen kopieen weer onderzoeken en kijken of iemand een dader is of niet.

(dia 21) PCR wordt heel veel gebruikt voor analyse van DNA. En wat het meest verschilt

tussen personen zijn de niet coderende delen. Alles wat codeert voor eiwitten zijn

vrijwel gelijk. De niet coderende delen worden dus gebruikt bij DNA analyse. Je neemt

dan een primer die op een specifiek stukje DNA past. Daarna komt meestal weer een

repeterend deel. Aan beide kanten zet je een primer en daar tussen amplificeer je het

dan. Dat repeterende deel verschilt in lengte per persoon.

Hoorcollege 14&15

Documents

Transcript of Hoorcollege 14&15