DANKWOORD - Universiteit Gent
Transcript of DANKWOORD - Universiteit Gent
I
DANKWOORD
Nu het einde van deze thesis en mijn studententijd nadert, wil ik even de tijd nemen om een
paar mensen te bedanken.
Allereerst wil ik Prof. dr. Peter Vandamme bedanken. Dankzij uw lessen heb ik ervoor
gekozen om mij verder te verdiepen in de microbiologie. Het is ook dankzij uw contact met het
ILVO dat het mogelijk was om deze thesis tot stand te laten komen.
Ook wil ik Dr. Marc Hendrickx bedanken, die het mogelijk maakte om mee te werken aan het
onderzoek naar MRSA in varkensbedrijven in het groot labo van de kelder van ILVO
T&V370, alsook voor het vakkundig nalezen van deze thesis.
Verder wil ik graag Dr. Geertrui Rasschaert bedanken voor de tijd en inspanning die ze
gestoken heeft in het lezen en verbeteren van mijn eerste schrijfpogingen tot de uiteindelijke
thesis.
Veel dank ben ik verschuldigd aan mijn begeleidster lic. Marijke Verhegghe. Zonder je
onuitputtelijke steun, je wijsheden, het vele herlezen en alle andere hulp had deze thesis niet
tot stand kunnen komen. Dankzij jouw is deze thesis een werk geworden waar ik trots op kan
zijn.
Bedankingen ook voor de mensen van het groot labo in de kelder van het ILVO T&V 370. Dit
gaat van Rik, die voor dit project met de biggen worstelde, over Karen, voor een
ontspannende babbel, via Dorien en Pieter, voor de sportieve ontspanning, tot Ann en haar
niet zo uitgebreide liedjeskennis, die het labo altijd opfleurden. Maar ook alle anderen
waarmee ik over de middag of tijdens de koffie al eens een babbeltje heb gedaan.
Ook veel dank aan m’n Maandagse Saxvrienden. Gezellig samen in de Sax ééntje drinken, zit
er niet meer in maar we vinden wel een nieuw stamcafé om stoom af te laten na een lange dag
werken.
Natuurlijk moet ik ook nog mijn dank richten aan mijn ouders en m’n Frère.
Frère, je zorgde er altijd voor dat mijn problemen zo nietig leken. Alles werd veel relatiever
dankzij een dikke knuffel van jou.
Mamie en papie, zonder jullie zou niets van dit alles mogelijk geweest zijn. Jullie steunden me
in alles wat ik wou doen en hebben me altijd alle mogelijke kansen gegeven. Jullie waren er
voor me gedurende alle ups en downs tijdens deze thesis, maar ook doorheen mijn hele
universiteitscarrière. Zonder jullie was ik nooit geworden wie ik nu ben! Veel dank vanuit de
grond van mijn hart!
Tot slot wil ik mij ook richten tot mijn vriend en allerbeste maatje, Steven. Dank je wel om er
te zijn voor me toen ik het even niet meer zag zitten, om me te helpen met nuttige adviezen en
tips, om naar me te luisteren als ik aan het zagen was, … maar natuurlijk ook voor de leuke
en ontspannende momenten. Jij gelooft in me zelfs als ik het zelf niet meer doe!
Aan iedereen hier vermeld en aan diegenen die ik misschien vergeten ben:
Veel dank voor al jullie hulp en steun!
INHOUDSTAFEL
II
INHOUDSTAFEL
DANKWOORD............................................................................................................................................................ I
INHOUDSTAFEL ...................................................................................................................................................... II
AFKORTINGENLIJST ........................................................................................................................................... IV
SAMENVATTING ................................................................................................................................................... VI
SUMMARY ...............................................................................................................................................................VII
I. Inleiding ............................................................................................................................................................. 1
1. Inleiding methicilline resistente Staphylococcus aureus ....................................................... 1
1.1. Staphylococcus aureus ................................................................................................................... 1
1.2. Penicilline resistente Staphylococcus aureus ..................................................................... 1
1.3. Methicilline resistente Staphylococcus aureus .................................................................. 3
2. Overzicht van de verschillende MRSA types ............................................................................... 4
2.1. Ziekenhuisgebonden MRSA ........................................................................................................ 4
2.2. Gemeenschapsgebonden MRSA ............................................................................................... 4
2.3. Diergebonden MRSA ...................................................................................................................... 5
3. Typeringsmethoden van MRSA ST398 .......................................................................................... 6
3.1. Multilocus sequentietypering .................................................................................................... 6
3.2. spa typering ........................................................................................................................................ 7
3.3. Multi locus variable number tandem repeat analyse .................................................... 7
3.4. Pulsed Field Gel Elektroforese .................................................................................................. 8
3.5. SCCmec typering .............................................................................................................................. 9
3.6. Antibioticaresistentie ................................................................................................................. 11
3.7. Toxines .............................................................................................................................................. 12
4. Impact op de volksgezondheid ....................................................................................................... 12
II. Doelstelling ................................................................................................................................................... 14
III. Resultaten ................................................................................................................................................. 15
1. Staalname Bedrijf C .............................................................................................................................. 15
2. Screening van de isolaten .................................................................................................................. 17
2.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse ................................................. 17
3. Typering van de geselecteerde isolaten ..................................................................................... 17
3.1. Multi locus sequentie typering .............................................................................................. 17
3.2. spa typering ..................................................................................................................................... 17
3.2. SCCmec typering ........................................................................................................................... 19
3.3. Pulsed Field Gel Elektroforese ............................................................................................... 19
3.4. Antibiogrammen ........................................................................................................................... 20
INHOUDSTAFEL
III
3.5. Overzicht van de typeringen ................................................................................................... 22
IV. Discussie .................................................................................................................................................... 24
4.1. Prevalentie in varkens .................................................................................................................... 24
4.2. Typering van de isolaten ............................................................................................................... 25
4.3. Conclusie ............................................................................................................................................... 28
V. Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 29
1. Staalname bedrijf C ............................................................................................................................... 29
1.1. Beschrijving bedrijf C ................................................................................................................. 29
1.2. Beschrijving staalname.............................................................................................................. 30
1.3. Verwerking staalname ............................................................................................................... 31
2. Verwerking verdachte kolonies ..................................................................................................... 31
2.1. DNA extractie ................................................................................................................................. 31
2.2. Triplex PCR ...................................................................................................................................... 31
3. Screening van de isolaten .................................................................................................................. 32
3.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse ................................................. 32
4. Typering van de isolaten .................................................................................................................... 33
4.1. Multi locus sequentie typering .............................................................................................. 33
4.2. spa typering ..................................................................................................................................... 33
4.3. SCCmec typering ........................................................................................................................... 33
4.4. Pulsed Field Gel Elektroforese ............................................................................................... 34
4.5. Antibiogrammen ........................................................................................................................... 35
VI. Referenties ................................................................................................................................................ 36
BIJLAGEN ..................................................................................................................................................................... i
1. Bandenpatronen SCCmec typering op geselecteerde stalen ............................................... ii
2. Afleesresultaten van de antibiogrammen.................................................................................... iv
3. DNA extractie en triplex PCR mecA/ nuc/ 16S rRNA ............................................................vii
4. MLVA ............................................................................................................................................................. ix
5. SCCmec typering ....................................................................................................................................... x
6. PFGE Staphylococcus aureus for 10 plugs ................................................................................... xii
7. PFGE protocol voor Salmonella ....................................................................................................... xv
8. Antibiogram MRSA ............................................................................................................................ xviii
AFKORTINGEN
IV
AFKORTINGENLIJST
AA-MRSA Diergebonden MRSA
Animal associated MRSA
BURP Based upon repeat pattern
CA-MRSA Gemeenschapsgebonden MRSA
Community-acquired MRSA
ccr Cassette chromosome recombinase
CIP Ciprofloxacine
CLR Chloramphenicol
CODA Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie
CSB Cel suspensie buffer
DNA Desoxyribonucleïnezuur
dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
EET EDTA/EGTA/Tris-HCl
EGTA Ethyleen glycol tetra-azijnzuur
ERYTR Erythromycine
EtBr Ethidiumbromide
FUCID Fucidine
GEN Gentamicine
HA-MRSA Ziekenhuisgebonden MRSA
Hospital-acquired MRSA
HPLC High performance/pressure liquid chromatography
ILVO Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek
ISS Integratie site sequentie
KAN Kanamycine
LINCO Lincomycine
LINEZ Linezolid
MgCl2 Magnesiumdichloride
MHB Muller-Hinton broth
MLST Multi locus sequentie typering
Multi locus sequence typing
MLVA Multi locus variable number tandem repeat analysis
MRSA Methicilline resistente S. aureus
MSSA Methicilline sensitieve S. aureus
MUPIR Mupirocine
NaCl Natriumchloride
OD Optical density
ORSAB Oxacylin resistance screening agar base
PBP (2a) Penicilline bindend proteïne (2a)
Penicillin binding protein (2a)
PCR Polymerase chain reaction
PFGE Pulsed field gel electrophoresis
PSM Phenol-soluble moduline
PVL Panton-Valentine leukocidine
RAPD Random amplification of polymorphic DNA
AFKORTINGEN
V
RIFAM Rifampicine
Rpm Rotation per minute
rRNA Ribosomaal ribonucleïnezuur
SCCmec Staphylococcal cassette chromosome mec
SDS Natriumdodecylsulfaat
SEB Staphylococcal enterotoxin B
SKG Seakem Gold
ST Sequentie type
SSR Short sequence repeat
SSSS Staphylococcal scalded-skin syndrome
SULFA Sulfonamide
SYN Quinupristine/dalfopristine
TBE Tris/Boraat/EDTA
TE Tris-HCl/EDTA
TET Tetracycline
TOBRA Tobramycine
TRIME Trimethoprim
TSA Tryptic soy agar
TSS Toxic shock syndrome
TSST-1 TSS toxin-1
TYLOS Tylosine
UPGMA Unweighted pair Group method with arithmic mea
VNTR Variable number tandem repeat
VRE Vancomycine resistente enterococcen
Wwb Warmwaterbad
SAMENVATTING
VI
SAMENVATTING
MRSA vormt reeds lange tijd een probleem in de gezondheidszorg en de gemeenschap.
Recent werd een derde vorm van deze bacterie gevonden bij dieren. Dit diergebonden MRSA
of MRSA ST398 komt voor bij verschillende dieren, zoals varkens, kippen, runderen, paarden
en huisdieren. Gekoloniseerde dieren vertonen geen ziektesymptomen maar kunnen als vector
dienen voor de overdracht naar de mens, wat sporadisch leidt tot ernstige infecties.
Studies in varkens hebben aangetoond dat MRSA ST398 wijdverspreid is op
varkensbedrijven. Zowel de varkens, als de mensen die op het bedrijf wonen of werken
kunnen MRSA ST398 dragers zijn. Daarnaast zijn dierenartsen en slachthuispersoneel die
frequent in contact komen met gecontamineerde, levende varkens frequent drager van MRSA
ST398. Als één van deze mensen opgenomen wordt in het ziekenhuis, kan de MRSA ST398
in het ziekenhuis verspreid worden als een zogenaamde ‘ziekenhuisbacterie’, die zieke
patiënten kan infecteren. Daarnaast kan door middel van horizontale gentransfer
antibioticumresistentiegenen doorgegeven worden tussen ziekenhuis- en diergebonden
MRSA. Hierdoor kan een nieuw type MRSA ontstaan, dat nog meer verschillende
antibioticum resistentiegenen bevat dan ziekenhuis- of diergebonden MRSA, waardoor de
behandeling nog moeilijker zou worden.
Aangezien gekoloniseerde varkens het slachthuis en het slachthuispersoneel kunnen
contamineren, is kolonisatie van het varkensvlees ook mogelijk. Gecontamineerd vlees zou de
verspreiding van MRSA ST398 in de gemeenschap in de hand kunnen werken. Uit
literatuurgegevens bleek echter dat er een zeer laag kiemgetal van MRSA in varkensvlees te
vinden is, waardoor er geen gevaar zou zijn voor overdracht naar de gemeenschap/mens.
In deze scriptie werd onderzoek uitgevoerd naar de epidemiologie van diergebonden MRSA
in varkens door het bemonsteren van een gesloten kip-varkensbedrijf om het tijdstip van
kolonisatie van de biggen en de bron ervan na te gaan. Op verschillende tijdstippen werden er
stalen genomen van de biggen vanaf het werpen tot in de voormest. Om na te gaan of de
zeugen en hun biggen hetzelfde MRSA type dragen, werden er stalen genomen van de zeugen
in de kraamstal. Om contaminatie uit de omgeving te onderzoeken werden er stalen van de
wand, de vloer en de lucht genomen in de verschillende stallen. Op alle isolaten werd een
screening uitgevoerd door middel van MLVA. Geselecteerde isolaten werden verder
getypeerd aan de hand van MLST, spa typering, SCCmec typering en PFGE. Tot slot werd
het antibioticaresistentieprofiel van de isolaten bepaald.
De resultaten toonden een kolonisatiegraad aan van 97% in de biggen van drie à vier dagen
oud. De biggen waren gekoloniseerd met MRSA isolaten die, op basis van MLVA, een hoge
verwantschap vertoonden. De bron van contaminatie kon echter niet gespecifieerd worden,
aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal en van de omgeving een hoge
verwantschap vertonen met de isolaten gevonden in de bigstalen. Dit betekent dat de biggen
zowel door de zeugen als de omgeving kunnen gecontamineerd worden. De isolaten
behoorden tot sequentie type 398 en spa type t011, beide veel voorkomend in Belgische
varkens. De MRSA isolaten droegen de SCCmec type V cassette en werden op basis van
pulsed field gel elektroforese samen geclusterd met 92% of meer verwantschap. Aangezien de
meerderheid van de isolaten ook hetzelfde antibioticaresistentieprofiel vertoonden, kan
verwacht worden dat alle gevonden isolaten tot hetzelfde MRSA type behoren.
Als besluit kan gesteld worden dat het onderzochte kip-varkensbedrijf een hoge prevalentie
vertoonde voor MRSA in biggen, zeugen en de omgeving. De onderzochte isolaten waren
sterk verwant en behoren hoogstwaarschijnlijk tot hetzelfde type.
SUMMARY
VII
SUMMARY
Since the 60’s, MRSA has been a major problem in hospitals and later in the community. A
new type of MRSA, the animal associated MRSA, has recently been found in different
animals like pigs, chickens, cattle, horses, cats and dogs. Animal associated MRSA or MRSA
ST398 belongs to the clonal complex CC398, which has sequence type 398 (ST398) as a
basis. Although pigs do not show any sign of infection when they are colonized with MRSA
ST398, they can act as a reservoir. Transmission to humans can occur, which leads
sporadically to severe infections.
Multiple studies showed that this type of MRSA is frequently found on pig farms. Besides the
pigs, people who live and work on the farm can be carriers of MRSA ST398. Veterinarians
and slaughterhouse workers, who have frequently contact with living and contaminated pigs,
can also get an infection with MRSA ST398. When admitted to a hospital, humans can
introduce MRSA ST398 into the hospital and infect patients. On top of this, the possibility
exists that a new type of MRSA arises through horizontal gen transfer of antibiotic resistance
genes between hospital-acquired and animal associated MRSA. This multi resistant MRSA
would be harder to treat than other MRSA.
Since slaughterhouses and slaughterhouse workers can be colonized with MRSA,
contamination of pork can occur while handling the meat. Colonized pork could accelerate the
spread of MRSA ST398 in the community. In literature, studies on the quantity of MRSA
ST398 in pork showed that the colony forming units per kilogram are insufficient to be a
threat for the transmission of MRSA ST398 in the community.
In order to study the epidemiology of animal associated MRSA, a closed pig-poultry farm was
examined for the time and source of colonization of the piglets. During this study samples
were taken of piglets from farrowing until arrival in the finishing stable. Since the aim was to
find the source of contamination, samples were taken of the sows and the environment (the
floor, the wall at the piglets level, the air surrounding the piglets and the air leaving the
stable). All samples were checked for the presence of MRSA and screening by MLVA
occurred. Subsequently, a selection of isolates were typed by MLST, SCCmec typing and
PFGE. The antimicrobial susceptibility of the isolates was also determined.
Three to four days after farrowing, 97% of the piglets were infected with MRSA. Based on
MLVA, a high similarity between the isolates can be found. The source of contamination
cannot be determined since the isolates from sows in the farrowing stables and from the
environment were highly related to the isolates found in the samples of the piglets. So, the
piglets could be contaminated by both the sows and the environment. All isolates belonged to
sequence type 398 and had spa type t011, which are both highly present on Belgian pig farms.
Furthermore, the isolates carried the SCCmec type V cassette and showed a similarity of 92%
based on PFGE. Since the majority of the isolates also had the same antibiotic profile, one can
anticipate that the MRSA isolates all belong to the same MRSA type.
In conclusion, the pig-poultry farm showed a high prevalence for the presence of MRSA. All
the isolates, typed in this study, were most likely related to each other.
INLEIDING
1
I. INLEIDING
1. INLEIDING METHICILLINE RESISTENTE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1.1. Staphylococcus aureus
Het genus Staphylococcus behoort tot de familie van de Micrococcaceae. Het genus omvat
ongeveer 20 species waarvan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis en
Staphylococcus saprophyticus het meest geïsoleerd worden bij de mens als ziekteverwekker.
Deze bacteriën hebben een Gram-positieve celwand en vormen geen sporen. Het zijn
facultatief anaëroben die resistent zijn aan een verminderde wateractiviteit en bijgevolg
tolerant zijn aan uitdroging en hoge zoutconcentraties. Staphylococci kunnen deze droogte- en
halotolerantie een paar uur overleven op oppervlakten in de omgeving. Deling van de cellen
leidt tot vorming van celclusters. Staphylococcen zijn commensalen en parasieten van zowel
mens als dier en komen voor in de normale microbiële flora van de huid en de bovenste
luchtwegen. Infectie resulteert voornamelijk uit de overdracht van een gezond individu, die de
bacterie draagt, naar een vatbaar individu (Brock et al, 2006).
Staphylococcus aureus (S. aureus) werd voor het eerst beschreven in 1880 in het vocht van
een chirurgisch abces (Bowersox, 1999). Infectie met de bacterie kan zeer uiteenlopende
ziektebeelden veroorzaken van milde huidinfecties tot levensbedreigende bacteraemia.
S. aureus is een commensaal van de huid maar komt ook frequent voor in de neus. Preventief
behandelen bij aanwezigheid op het lichaam hoeft niet, aangezien aanwezigheid niet altijd
aanleiding geeft tot infectie en rekolonisatie met de bacterie kan voorkomen. Dieren, zoals
honden, katten en paarden, kunnen als vector dienen bij de overdracht van de bacterie.
Wanneer de huid of het mucosa onderbroken is, kan S. aureus andere weefsels infecteren met
als mogelijke gevolgen zweren, puisten, longontstekingen of artritis. S. aureus stammen
kunnen ook verantwoordelijk zijn voor voedselvergiftigingen door de productie van een
enterotoxine, namelijk het Staphylococcal enterotoxine B (SEB). S. aureus kan op
verschillende manieren verspreid worden door contact met o.a. geïnfecteerd wondvocht, een
geïnfecteerd persoon of objecten die aangeraakt zijn door een geïnfecteerd persoon.
S. aureus stammen, die frequent aandoeningen veroorzaken in mensen, produceren
extracellulaire enzymen en toxines. Een belangrijk gen voor de pathogeniciteit van S. aureus,
het coa gen, codeert voor een coagulase, dat de vorming van fibrineklonters bevordert. Deze
frbirneklonters geven bescherming aan de bacterie wanneer de immuunrespons wordt
opgeroepen. Andere species van het Staphylococcus genus zijn coagulase-negatief.
Een ander belangrijk enzym om staphylococci te onderscheiden van enterococci en
streptococci, is catalase. Dit enzym zet waterstofperoxide om in water en zuurstof (Brock et
al, 2006). Bovendien kan de aanwezigheid van fagen in de bacteriële cel leiden tot een
verhoogde virulentie door de aanwezigheid van het Panton-Valentine leukocidine (PVL) gen
op het genoom van de residerende faag (Voyich et al, 2006).
1.2. Penicilline resistente Staphylococcus aureus
In 1928 ontdekte Alexander Fleming per toeval penicilline. Een vergeten plaat geënt met
S. aureus bleek geïnfecteerd met een schimmel, die de groei van S. aureus inhibeerde. Die
schimmel staat nu bekend als Penicillium notatum en na onderzoek werd het inhiberende
product, geproduceerd door de schimmel, penicilline genoemd (Haven, 1994).
INLEIDING
2
Penicilline behoort tot de β-lactam
antibiotica (Figuur 1). Deze bevatten een
β-lactamring en zijn inhibitoren van de
celwandsynthese. Aangezien het
synthesemechanisme van de celwand en de
celwand zelf uniek zijn voor het koninkrijk
Bacteria, hebben de β-lactam antibiotica
een hoge selectiviteit en zijn ze niet toxisch
voor eukaryote gastheercellen (Brock et al,
2006).
β-lactam antibiotica zijn structurele
analogen van D-alanyl-alanine, die binden
aan transpeptidasen, ook wel penicilline
bindende proteïnen (PBP) genoemd. Het transpeptidase verbindt peptidoglycaanmonomeren
in de bacteriële celwand aan elkaar. Binding van penicilline of een ander β-lactam
antibioticum inhibeert deze werking waardoor de celwand verzwakt. Hierdoor verhoogt de
osmotische druk in het cytoplasma, wat leidt tot cytolyse of celdood. Bovendien stijgt de
concentratie van peptidoglycaan precursoren waardoor de hydrolasen en autolysines van de
bacteriële celwand geactiveerd worden en het aanwezige peptidoglycaan verwijderen. Dit
betekent dat penicilline een betere inhiberende werking heeft tegen Gram-positieve bacteriën
dan tegen Gram-negatieven, aangezien de eersten een meer uitgebreide peptidoglycaanlaag
hebben (Figuur 2) (Brock et al, 2006).
In 1944 werden voor het eerst penicillinase producerende S. aureus stammen beschreven
(Kirby, 1944). Penicillinase is een β-lactamase, dat de β-lactamring van penicilline
openbreekt waardoor het penicilline geïnactiveerd wordt. De stammen, die penicillinase
Figuur 1: Structuurformule van penicilline. R
geeft de variabele groep weer die verschillende
specificiteit geeft aan het antibioticum. De β-
lactamring is aangduid.
Figuur 2: Overzicht van de Gram-positieve en Gram-negatieve celwandstructuur. Naast het verschil in de peptidoglycaanlaag, heeft de Gram-negatieve celwand een extra laag, die bestaat uit o.a. fosfolipiden, lipopolysacchariden en lipoprotëinen.
INLEIDING
3
produceren, waren toen nog weinig voorkomend en werden enkel geïsoleerd uit
ziekenhuispatiënten.
Na de tweede wereldoorlog was penicilline makkelijker te verkrijgen en steeg de prevalentie
van penicillinase producerende S. aureus. Slechts enkele jaren later waren de meeste
S. aureus ziekenhuisstammen resistent tegen penicilline, terwijl gemeenschapsgebonden
S. aureus stammen penicilline sensitief waren (Barber & Rozwadowska-Dowzenko, 1948).
Hieruit werd afgeleid dat behandeling met penicilline de kans verhoogde op het isoleren van
een penicilline resistente stam. Immers, hoe meer S. aureus in contact kwam met penicilline,
hoe meer penicilline sensitieve stammen er afstierven, waardoor een niche gecreëerd werd
voor de penicilline resistente bacteriën, waarin ze konden vermeerderen. In deze eerste studies
werd ook de kolonisatie van het ziekenhuispersoneel en hun rol in de transmissie van de
penicilline resistente S. aureus onderzocht. Men zag dat het ziekenhuispersoneel de vector
kon zijn in de transmissie van de bacteriën tussen patiënten. Deze studies beperkten zich
echter tot ziekenhuisstammen (Chambers, 2001).
1.3. Methicilline resistente Staphylococcus aureus
Door het ontstaan van penicilline resistente
S. aureus konden infecties niet meer
behandeld worden met penicilline.
Daardoor ging men op zoek naar een
alternatieve behandelingsmethode. In 1959
werd, een nieuw semi-synthethisch
antibioticum, namelijk methicilline,
gevonden. Dit is een β-lactam antibioticum,
afgeleid van penicilline (Figuur 3). In
tegenstelling tot penicilline, was
methicilline resistent tegen de werking van
β-lactamasen, waardoor het gebruikt kon
worden als behandeling tegen penicilline
resistente S. aureus (Unan & Young, 2007).
Twee jaar na het eerste therapeutisch gebruik
van methicilline werden de eerste
methicilline resistente S. aureus (MRSA)
stammen geïsoleerd in het Verenigd Koninkrijk (Enright et al, 2002). Gedurende de jaren ’60
werden over heel Europa MRSA stammen geïsoleerd en in het volgende decenium ook in
andere delen van de wereld. In de jaren ’90 werd er een sterke stijging van het aantal infecties
met MRSA gezien. Deze stijging werd voornamelijk veroorzaakt door misbruik van
antibiotica, wat voorschrijven van antibiotica bij virale infectie maar ook het niet opnemen
van voorgeschreven antibiotica omvat. Dit leidt immers tot versnelde resistentie.
Resistentie van S. aureus tegen methicilline wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van het
mecA gen, dat codeert voor het penicilline bindend proteïne 2a (PBP2a). Dit type van PBP
heeft een lagere affiniteit voor β-lactam antibiotica, waardoor deze moeilijk tot niet kunnen
binden. Het mecA gen is gelegen op een mobiel element, het Staphylococcal Cassette
Chromosome mec (SCCmec) element (Ito et al, 2003). Hiervan bestaan verschillende types
die verschillende regio’s bevatten (zie paragraaf 3.5).
Figuur 3: Structuurformule van methicilline .
Methicilline heeft dezelfde algemene structuur
als penicilline, aangevuld met de typische
variabele groep van methicilline. De
β-lactamring is aangduid.
INLEIDING
4
2. OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE MRSA TYPES
2.1. Ziekenhuisgebonden MRSA
Tot een decenium terug vond men MRSA enkel in ziekenhuizen, lange termijn opvang
tehuizen of bij mensen die met één van beide in contact waren geweest. Deze
ziekenhuisgebonden MRSA (hospital-acquired MRSA; HA-MRSA) betekende een groot
probleem in de behandeling van patiënten. Aangezien de β-lactam antibiotica het meest
verspreid en het meest gebruikt zijn in de humane geneeskunde, verkleinen de opties op een
succesvolle behandeling van HA-MRSA met deze antibiotica. Tegenwoordig beschikken
dokters nog over andere antibiotica in de behandeling van MRSA, hoewel sommige MRSA
stammen met de tijd ook hiertegen resistent zijn geworden. Vandaar dat MRSA ook wel
multiresistente S. aureus genoemd wordt. De andere antibiotica hebben echter nadelen: ze
kunnen niet oraal opgenomen worden en zijn minder efficiënt dan de β-lactam klasse
waardoor een succesvolle behandeling langer duurt. Verder veroorzaken ze bijwerkingen die
in sommige gevallen kunnen leiden tot complicaties (Unan & Young, 2007).
Vancomycine krijgt tegenwoordig de voorkeur als behandelingsmiddel tegen HA-MRSA
infecties. Het is nauw verwant aan avoparcine, een antibioticum dat veel gebruikt werd als
groeipromotor in de veeteelt. In 1997 kwam op dit gebruik echter op Europees niveau een
verbod door richtlijn 97/6/EC. Het gebruik van avoparcine was immers de aanleiding voor de
opkomst van vancomycine resistente enterococcen (VRE) in boerderijdieren. Men vreesde dat
het vanA gen, dat zorgt voor resistentie tegen vancomycine, overgebracht zou worden naar
MRSA, wat deze onbehandelbaar zou maken. Ondertussen zijn er meldingen geweest in de
Verenigde Staten waarbij dit het geval was (MMWR, 2002a; MMWR, 2002b; Witte, 2004).
Het vanA gen is gelegen op de ‘van cluster’ en wordt regelmatig gevonden in bacteriën
geïsoleerd uit voeder voor boerderijdieren waaraan vancomycine wordt toegevoegd. Dit
betekent dat het gebruik van avoparcine de opkomst van vancomycine resistente S. aureus
stammen als gevolg zou kunnen hebben (Lu et al, 2004). In Europa werden nog geen
vacomycine resistente MRSA gevonden.
2.2. Gemeenschapsgebonden MRSA
De voorbije twee decennia werd MRSA voornamelijk gevonden in grote ziekenhuizen in de
stad in vergelijking met kleinere medische centra, die een lagere prevalentie vertoonden.
Tijdens de jaren ’90 merkte men een sterke stijging in beide prevalenties (Chambers, 2001).
Bovendien veroorzaakte MRSA ook infecties bij personen buiten ziekenhuizen en andere
verzorgingstehuizen. MRSA infecties in mensen die niet recent een medische ingreep
ondergingen of in contact geweest zijn met ziekenhuizen, worden veroorzaakt door
gemeenschapsgebonden MRSA (community-acquired; CA-MRSA).
Gedurende de laatste 10 jaar is CA-MRSA wereldwijd verspreid geraakt. Dit type ontstond
onafhankelijk van HA-MRSA en is meer virulent dan HA-MRSA, dankzij de aanwezigheid
van verschillende virulentiefactoren (Etienne, 2005), zoals o.a. het PVL toxine en het Phenol-
soluble moduline (PSM) toxine. De aanwezigheid van deze toxines kan aanleiding geven tot
ziekten die vitale organen aantasten, wat vervolgens kan leiden tot infecties over het hele
lichaam, toxic-shock syndroom of necrotiserende longontstekingen (Miller et al, 2005). De
eerste beschrijving van CA-MRSA dateert van 1993 en beschrijft de observatie van
CA-MRSA in Aboriginals uit verschillende gemeenschappen (Udo et al, 1993).
INLEIDING
5
Ongeveer 75% van de CA-MRSA infecties komen voor op de huid en zacht weefsel en zijn
behandelbaar. Naast het feit dat ze meer virulent zijn, kunnen ze zich makkelijker verspreiden
in vergelijking met de traditionele stammen.
De behandeling van CA-MRSA is eenvoudiger dan de behandeling van HA-MRSA infectie
doordat CA-MRSA (tot op heden) minder resistentie vertoont voor bepaalde soorten
antibiotica, waaronder sulfonamiden, tetracyclines en clindamycine (Deurenberg &
Stobberingh, 2008).
2.3. Diergebonden MRSA
De eerste melding van een nieuw type MRSA in varkens kwam uit Nederland in december
2004. Eerst dacht men dat dit een interessante maar eenmalige gebeurtenis was, aangezien er
al eerder rapporten gepubliceerd waren over HA- en CA-MRSA in dieren (Manian, 2003;
Scott et al, 1988).
In juli 2004 voerden artsen in het ziekenhuis van Nijmegen een pre-operatief onderzoek uit op
een meisje van zes maanden dat drager bleek van MRSA. Ondanks verschillende pogingen
om het meisje MRSA vrij te maken, bleef ze gekoloniseerd met de bacterie. Verschillende
testen toonden aan dat de ouders van het meisje eveneens gekoloniseerd waren met MRSA.
Het gezin runde en woonde op een varkensbedrijf. Na onderzoek op enkele van de varkens
van het varkensbedrijf waar het meisje van zes maanden woonde en varkens van andere
varkensbedrijven in diezelfde omgeving, werd bij één van de 30 geteste varkens MRSA
gevonden die identiek was aan het type geïsoleerd op het bedrijf van de familie van het meisje
In oktober 2004 werd een jonge moeder opgenomen in het ziekenhuis met mastitis
veroorzaakt door MRSA. Testen toonden aan dat zowel de man als hun dochter MRSA
dragers waren. Doordat de vader een varkensboer was, werden er stalen genomen bij tien van
zijn varkens en bij drie van zijn werknemers. Alle werknemers en acht van de tien varkens
bleken drager van een MRSA stam met spa type t108.
Begin 2005 werden nog twee gevallen beschreven van MRSA gelinkt aan varkens: het ene
handelde over een varkensboer en het andere over de zoon van een veearts, die veel met
varkens in contact kwam. Hierdoor vermoedde men dat de varkens de bron van de
antibioticum resistente bacteriën zouden kunnen zijn.
Onderzoekers probeerden de MRSA stammen te classificeren door middel van Pulsed Field
Gel Elektroforese (PFGE) met behulp van het SmaI restrictie-enzym, aangezien deze techniek
toen gekend was als de beste methode voor karakterisatie van MRSA stammen. De
geïsoleerde stammen konden hiermee echter niet getypeerd worden. Door middel van random
amplification of polymorphic DNA (RAPD) onderscheidde men ten slotte drie verschillende
stammen. De isolaten van de met MRSA gekoloniseerde familie en de varkens van hun
bedrijf behoorden tot dezelfde stam (spa-type t108) (Voss et al, 2005). Een derde
typeringsmethode, namelijk multi locus sequentie typering (MLST) classificeerde tot slot alle
stammen in het sequentie type ST398. MRSA ST398 wordt ook wel diergebonden MRSA
(animal associated MRSA of AA-MRSA) genoemd. Uit al deze resultaten werd
geconcludeerd dat MRSA overgedragen kon worden tussen mensen en varkens, maar de
richting van transmissie was niet gekend (Huijsdens et al, 2006).
Tegenwoordig is MRSA ST398 wereldwijd verspreid geraakt bij industrieel gekweekte
varkens met onder andere rapporten uit België (Denis et al, 2007), Nederland (Huijsdens et al,
INLEIDING
6
2006), Denemarken (Guardabassi et al, 2007), Duitsland (Meemken et al, 2008), Portugal
(Pomba et al, 2009), Canada (Khanna et al, 2008) en de Verenigde Staten (Smith et al, 2008).
3. TYPERINGSMETHODEN VAN MRSA ST398
3.1. Multilocus sequentietypering
MLST is een uitstekende methode om de moleculaire evolutie van S. aureus te bestuderen.
Deze methode meet de DNA sequentievariatie in een set van huishoudgenen en karakteriseert
stammen op basis van hun unieke allelische profielen. De zeven huishoudgenen die
onderzocht worden voor de karakterisatie van MRSA zijn: arcC, aroE, glopF, gmk, pta, tpi
en yqiL. Er wordt gebruik gemaakt van huishoudgenen omdat de frequentie van mutaties in
deze genen relatief laag is. Een hoge mutatiegraad in huishoudgenen zou kunnen leiden tot
een defect in een genproduct dat essentieel is voor de celwerking.
De techniek omvat PCR amplificatie gevolgd door DNA sequenering. Op basis van de
gevonden allelen wordt een allelisch profiel opgesteld, ook wel een sequentietype (ST)
genoemd. Het sequentietype is een identificatiemerker voor de stam die onderzocht werd.
(Cuny et al, 2010). Het profiel van MRSA ST398 is 3-35-19-2-20-26-39 (www.mlst.net).
Door middel van bio-informatica methoden kan de verwantschap tussen verschillende
sequentietypes en de verschillen tussen de sequentietypes weergegeven worden (Figuur 4).
MLST is een zeer reproduceerbare methode. Materiaal voor ST determinatie kan eenvoudig
uitgewisseld worden tussen laboratoria in verschillende landen en de nodige primersequenties
en protocollen zijn makkelijk elektronisch te vinden. Andere voordelen van MLST zijn de
automatisering ervan en de combinatie van high throughput sequenering en bioinformatica
met populatiegenetica. Verder heeft de methode ook een goed discriminerend vermogen om
isolaten te differentiëren. Nadelig is dat deze methode duur, arbeidsintensief en tijdrovend is
(Deurenberg & Stobberingh, 2008; Leonard & Markey, 2008).
Figuur 4: Genetische verwantschap van MRSA van patiënten en controles, weergegeven als een minimum spanning tree gebaseerd op MLST profielen. Elke cirkel stelt een sequentie type voor.
De getallen onder en rechts naast de lijnen die de types verbinden verwijzen naar het aantal
verschillen in de MLST profielen. De schaduwen rond de cirkels omvatten de complexen van
sequentie types die met minder dan 3 loci verschillen (van Loo et al, 2007).
INLEIDING
7
3.2. spa typering
spa typering karakteriseert bacteriën op basis van variable number tandem repeats (VNTR’s),
het aantal herhalingen die gevonden worden in een bepaalde regio van het genoom. Voor spa
typering wordt er gekeken naar het variabel aantal repeats in de polymorfe X regio van het
proteïne A gen (Figuur 5). Diversiteit van de X regio ontstaat door deleties en duplicaties van
de repetitieve eenheden en door puntmutaties. De functie van het domein gecodeerd door de
X regio is niet gekend maar zou kunnen dienen als verlenging van het N-terminale
immunoglobulin G bindend deel van het proteïne (Shopsin et al, 1999).
Bij spa typering wordt eerst de sequentie van de X regio achterhaald door middel van
sequenering. Vervolgens kan er gebruik gemaakt worden van verschillende soorten software
om de resultaten van de sequenering te verwerken. Wereldwijd worden er twee
nomenclatuursystemen gebruikt, beschreven door Koreen et al (2004) en Harmsen et al
(2003). Dit geeft dikwijls moeilijkheden om vergelijkingen te maken met gepubliceerde spa
types. In Europa wordt voornamelijk gebruik gemaakt van het StaphType software pakket
(Ridom GmbH, Würzburg, Germany), dat ook gebruikt kan worden om een clusteranalyse uit
te voeren op basis van een algoritme gebaseerd op repeat patronen (based upon repeat pattern,
BURP). De data worden gesynchroniseerd op het internet en op de centrale spa server gezet
(http://www.spaserver.ridom.de) (Deurenberg & Stobberingh, 2008).
Gebruik van een single-locus merker, zoals bij spa typering, is minder duur, minder
tijdsrovend en vertoont minder variatie dan multilocus sequeneringstechnieken. De methode
is gestandaardiseerd waardoor vergelijking tussen verschillende labo’s mogelijk is. Verder
heeft spa typering een hoger discriminerend vermogen dan MLST en is minder
arbeidsintensief (Koreen et al, 2004).
MRSA ST398 isolaten vertonen weinig variatie wat betreft spa type. De meeste hebben spa-
type t011, t108 of t034 (Huijsdens et al, 2009).
3.3. Multi locus variable number tandem repeat analyse
Net als spa typering is multi locus variable number tandem repeat analysis (MLVA)
gebaseerd op de aanwezigheid van VNTR’s in het bacterieel genoom. In tegenstelling tot spa
typering, wordt er gekeken naar verschillende loci in het genoom. De VNTR’s in het genoom
kunnen geamplificeerd worden door middel van PCR en worden vervolgens gescheiden.
Doordat verschillende loci een verschillende grootte hebben, zullen ze ook tot op een
verschillende hoogte op het scheidingsgel lopen. Elke primerset is gelabeld met een ander
fluorescent label, waardoor meerdere PCR reacties gelijktijdig gelopen kunnen worden en de
Figuur 5: Overzicht van het proteïne A gen. De blokken geven de segmenten aan van het gen die
coderen voor de signaalsequentie (S), de immunoglobuline G bindende regio’s (A-D), een regio
homoloog aan A-D (E) en de COOH terminus (X), die de short sequence repeats (SSR’s) (X f) en de
celwand aanhechtingssequenties (Xc) bevat. 1095F en 1517R zijn mogelijke primers voor de
amplificatie van de X regio van proteïne A gen.
INLEIDING
8
amplicons kunnen onderscheiden worden na detectie in verschillende kanalen op een
sequencer. Eens de lengte van het amplicon gekend is, kan het aantal repeats berekend
worden door de lengte van het fragment te verminderen met de lengte van de primers en dit te
delen door de lengte van de repeat in het amplicon. Een MLVA profiel kan vervolgens
opgesteld worden op basis van het aantal repeats per amplicon (Lindstedt, 2005).
De MLVA methode is goed reproduceerbaar en heeft een goed discriminerend vermogen.
Bovendien is deze techniek ook goedkoper dan bovenstaande technieken, eenvoudig en
makkelijk te interpreteren. Daarom is MLVA heel bruikbaar als typeringsmethode voor
grootschalige epidemiologische studies (Rasschaert et al, 2009).
MLVA wordt in het kader van deze thesis echter gebruikt als screeningsmethode, waardoor
niet gekeken wordt naar het aantal repeats per amplicon maar naar het bekomen
bandenpatroon. Dit betekent dat de verschillende amplicons hetzelfde fluorescente label
kunnen dragen wanneer de scheiding gebeurt door middel van een sequencer of geen
fluorescent label hoeven te dragen wanneer de fragmenten gescheiden worden op gel.
Rasschaert et al (2009) testten verschillende primersets op hun discriminerend vermogen en
een selectie van deze primerssets wordt gebruikt om een eerste screening uit te voeren op de
lysaten van alle verdachte kolonies bekomen uit de staalnames. Door middel van
BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België) wordt op basis van
de bandenpatronen een clustering gemaakt. Hieruit wordt een selectie gemaakt van de
stammen die verder getypeerd zullen worden door middel van verschillende
typeringsmethoden.
3.4. Pulsed Field Gel Elektroforese
Pulsed field gel elektroforese (PFGE) is de gouden standaard voor de typering van MRSA.
Voor PFGE wordt eerst een restrictie uitgevoerd op het volledige chromosomaal DNA
ingebed in agaroseblokjes, die vervolgens geladen worden op een agarosegel. Deze gel wordt
gelopen in een elektrisch veld met een voltage dat periodiek veranderd van richting en tijd.
Wanneer het voltage van richting verandert, moeten de fragmenten hun lading heroriënteren
alvorens ze kunnen migreren in de nieuwe richting. Grotere fragmenten zullen hiervoor meer
tijd nodig hebben, waardoor ze zullen achterblijven ten opzichte van de kleinere fragmenten.
Op deze manier kunnen grote fragmenten tot 2 Mb gescheiden worden. Dit resulteert in een
DNA vingerafdruk van het bacterieel genoom. Een clustering wordt uitgevoerd met
bijvoorbeeld de BioNumerics software van Applied Maths door middel van een Dice
vergelijking met de Unweighted Pair Group Method with Arithmic Mean (UPGMA)
clusteringsmethode. De clustering toont de verwantschap tussen de verschillende onderzochte
stammen (Deurenberg & Stobberingh, 2008).
Voordeel aan PFGE is dat deze methode zeer discriminerend is. Nadelen zijn de tijdsrovende
protocols en de beperkte reproduceerbaarheid tussen verschillende labo’s. Dit laatste wordt
echter opgelost door gebruik te maken van gestandaardiseerde protocols (Struelens et al,
1992), die ook voor MRSA beschikbaar zijn. Het probleem is echter dat MRSA ST398 niet
met deze protocols typeerbaar is. Het enzym SmaI dat gebruikt wordt voor S. aureus is niet
bruikbaar voor MRSA ST398, omdat de knipplaatsen van het enzym gemethyleerd zijn. Er
zijn echter alternatieve restrictie enzymen zoals BstZI, SacII en ApaI (Rasschaert et al, 2009).
INLEIDING
9
3.5. SCCmec typering
Het SCCmec mobiel element is een genetisch element dat codeert voor methicillineresistentie
en dat unieke site-specifieke recombinasen draagt. Er bestaan meerdere structureel
verschillende SCCmec elementen die een aantal karakteristieken delen. Ze dragen allemaal
het mecA gen in een mec gencomplex en cassette chromosome recombinase (ccr) genen in
een ccr gencomplex. Verder kunnen ze integreren op specifieke sites in het Staphylococcus
chromosoom. Deze site wordt de integratie site sequentie (ISS) voor SCC genoemd en is het
target voor ccr-gemedieerde recombinatie. Tot slot bevat het SCCmec mobiel element ook de
flankerende gebieden van het ISS, die nodig zijn voor recombinatie van het element in het
Staphylococcus chromosoom (Katayama et al, 2000).
De herkomst van het SCCmec mobiel element is niet bekend. Een mogelijke afkomst zou
Staphylococcus sciuri kunnen zijn. In deze bacterie werd een PBP gevonden, die 87%
aminozuursequentiegelijkenis vertoont met het PBP2a. De S. sciuri stammen waren
methicillinesensitief, maar in aanwezigheid van methicilline werden ze hier resistent aan door
de verhoogde snelheid van transcriptie van de mecA gen homoloog. Wanneer de onderzoekers
dit mecA gen homoloog introduceerden in methicilinesensitieve S. aureus (MSSA) werden
deze methicilline resistent (Wu et al, 2001).
Tot op heden kunnen acht verschillende SCCmec types onderscheiden worden (zie Figuur 6).
De types worden benoemd met een romeins cijfer of een arabisch cijfer en een letter, die
respectievelijk verwijzen naar het ccr gencomplex en het mec gencomplex (zie Tabel 1). Er
zijn vijf verschillende ccr gencomplexen, type 1 tot 5, en vier verschillende mec
gencomplexen, klasse A tot D. Zo bevat SCCmec type I of 1B het type 1 ccr en het klasse B
mec gencomplex. De andere types die voorkomen zijn: type II of 2A, type III of 3A, type IV
of 2B, type V of 5C2, type VI of 4B, type VII of 5C1 en type VIII of 4A (Ito, 2009). Deze
Figuur 6: Een schematisch overzicht van een aantal SCCmec cassettess die gevonden worden in
MRSA (Ito et al., 2001, 2004; Daum et al., 2002; Oliveira et al., 2006a; Takano et al., 2008). De
belangrijkste elementen van de SCCmec cassette (ccr genes, IS431, IS1272, mecA, mecI/R1, orfX,
pI258, pT181, pUB101 and Tn554) zijn weergegeven (Overgenomen uit Deurenberg et al. (2007).
INLEIDING
10
types kunnen nog onderverdeeld worden in subtypes op basis van de polymorfismen en
variaties in de J regio. Deze regio omvat de niet-essentiële delen van de cassette die niet
behoren tot de ccr of mec gen complexen.
Tabel 1: SCCmec types geïdentificeerd in S. aureus. Elk SCCmec type wordt weergegeven met het
aanwezige ccr en mec gencomplex.
SCCmec type ccr gen complex mec gen complex
I 1 B
II 2 A
III 3 A
IV 2 B
V 5 C2
VI 4 B
VII 5 C1 VIII 4 A
Over het algemeen vindt men de SCCmec types I, II en III in HA-MRSA bacteriën en de
SCCmec types IV en V in CA-MRSA (Baba et al, 2002; Daum et al, 2002). In AA-MRSA
stammen vond men tot nu toe de SCCmec types IVa en V. De SCCmec types IV en V zijn
kleiner dan SCCmec types I, II en III en dragen veelal minder antibiotica resistentiegenen
naast het mecA gen dat nodig is voor de resistentie tegen methicilline (Grundmann et al,
2006; Ito et al, 2004). Hierdoor zijn CA- en AA-MRSA minder resistent tegen andere
antibiotica dan veel HA-MRSA. Uit verschillende studies werd besloten dat SCCmec types IV
en V dragende bacteriën beter aangepast zijn om te overleven in de gemeenschap, waar het
gebruik van antibiotica relatief laag is (Grundmann et al, 2006; Lee et al, 2007; Okuma et al,
2002). De bacteriën kunnen zich sneller vermenigvuldigen en hebben een lager
energieverbruik in vergelijking met SCCmec types I, II en III dragende bacteriën, wat kan
verklaard worden door de kleinere cassettes. Voor de bacterie is een kleinere cassette tevens
een voordeel omdat deze makkelijker doorgegeven kan worden door middel van horizontale
gentransfer. Aangezien CA- en AA-MRSA gelijkaardige cassettes bevatten, betekent dit
echter dat CA- en AA-MRSA eenvoudiger methicillineresistentie kunnen doorgeven aan
andere S. aureus dan HA-MRSA. (Unan & Young, 2007).
Door de snelle evolutie van de MRSA types en subtypes moet de typering van het SCCmec
element continu aangepast worden. Momenteel worden in het labo waar deze thesis doorging
hiervoor drie PCR reacties gelopen. De eerste PCR, ontwikkeld en beschreven door Oliveira
et al (2002), is geschikt voor de identificatie van SCCmec types I tot IV. SCCmec type V,
veel voorkomend in AA-MRSA, kan met deze methode niet geïdentificeerd worden. Ook de
subtypering van SCCmec type IV, van belang in het onderzoek naar AA-MRSA, kan niet
onderscheiden worden. De subtypering van type IV wordt behandeld in de tweede PCR, met
primers beschreven door Milheiriço et al (2007). De derde PCR wordt gelopen met primers
beschreven door Zhang et al (2005) en is bedoeld om SCCmec type V te identificeren maar
dient ook als controle voor de SCCmec types IVb en IVc. Deze drie PCRs worden gelopen en
de geamplificeerde fragmenten worden op gel gescheiden. Van de drie bekomen
bandenpatronen kan afgeleid worden tot welk SCCmec type het isolaat behoort.
INLEIDING
11
Het aflezen van de patronen gebeurt op basis van standaardstammen die verschillend zijn per
primerset (Figuur 7). Wanneer het resultaat van primerset 1 wijst op aanwezigheid van
SCCmec type IV of V, wordt gekeken naar de resultaten van de ander primersets om na te
gaan welk subtype aanwezig is of ter bevestiging van de aanwezigheid van SCCmec type V.
3.6. Antibioticaresistentie
MRSA stammen worden ook getest op hun gevoeligheid voor antimicrobiële agentia.
Volgende antibiotica worden meestal getest: cipofloxacine, erythromycine, fucidine,
gentamicine, linezolid, mupirocine, sulphametoxazole, trimethoprim, tetracycline,
chloramphenicol, vancomycine en quinupristine/dalfopristine (EFSA, 2007). Dit is een
verzameling van antibiotica, die behoren tot verschillende antibioticumklassen. Sommige
worden in de humane geneeskunde gebruikt en andere in de diergeneeskunde. Doordat MRSA
stammen onderling verschillen vertonen in hun antibioticasensitiviteit, kan deze techniek
gebruikt worden als typeringstechniek.
De studie naar de gevoeligheid van MRSA ten opzichte van antibiotica kan op verschillende
manieren gebeuren. Vooreerst kan men enkel kijken naar de resistentie of sensitiviteit van de
bacterie voor een vastgestelde concentratie antibioticum. Dit wordt gedaan door middel van
een agar disk diffusie test. Hiervoor wordt de bacterie geënt op een medium, waarop
vervolgens schijfjes geplaatst worden met een bepaalde concentratie aan antibiotica. Wanneer
de bacterie sensitief is voor het onderzochte antibioticum, zal na incubatie rond het schijfje
een inhibitiezone verschijnen.
Een tweede methode bestaat uit een titerbepaling. Voor deze methode wordt gebruik gemaakt
van strips die een oplopende concentratie van het onderzochte antibioticum bevatten. De
strips worden op een plaat gelegd waar de bacteriën op geënt zijn. Sensitieve bacteriën zullen
kunnen groeien op de plaat tot op de hoogte van de concentratie van het antibioticum die de
groei inhibeert. Uit deze methode kan men dus afleiden voor welke concentratie van het
antibioticum de bacterie resistent is.
Een vermoedelijke resistentie kan ook onderzocht worden door na te gaan of het
resistentiegen aanwezig is in het genoom van de bacterie door middel van een PCR reactie
100 100
L I II III IV V L L III IVa IVb IVc IVd V L L III IVa IVb IVc V L
100
200
500
1000
200
500
1000
0
200
500
1000
Figuur 7: Voorbeeld van een resultaat van SCCmec typering met primerset 1 (links), 2
(midden) en 3 (rechts) uitgevoerd op de standaardstammen. L: 100 bp ladder.
INLEIDING
12
met primers specifiek voor het onderzochte antibioticumresistentiegen (Hakanen et al, 2003;
Lehtopolku et al, 2010).
3.7. Toxines
Het genoom van MRSA codeert voor verschillende virulentiefactoren waaronder toxines.
Deze kunnen onderverdeeld worden in drie groepen volgens hun biologische eigenschappen.
Een eerste groep zijn toxines met exfoliatieve effecten. Deze splitsen de desmosomen die de
huidcellen van de gastheer samenhouden. Verlies van de cel-cel adhesie kan leiden tot
staphylococcal scalded-skin syndrome (SSSS) (Amagai et al, 2000).
De suppuratieve toxines vormen een tweede groep. Een belangrijk lid van deze groep is het
Panton Valentine leukocidin, dat poriën vormt in het buitenste membraan van
polymorphonucleaire leukocyten, waardoor deze apoptose ondergaan. Secretie van PVL leidt
tot de vorming van necrotiserende, etterende letsels. De genen van dit toxine zijn
gelocaliseerd op het genoom van een bacteriofaag.
Tot slot zijn er nog superantigenische toxines die het toxische shock syndroom (TSS)
induceren. Een belangrijk superantigenisch toxine is het TSS toxin-1 (TSST-1). Dit toxine
activeert een grote hoeveelheid T-cellen, die op hun beurt een teveel aan cytokine vrijstellen.
Een ander voorbeeld zijn de enterotoxines van Staphylococcus, die voedselvergiftiging
veroorzaken (Raulin et al, 2010).
De vermoedelijke productie van toxines wordt nagegaan door middel van PCR reacties. Dit
betekent dat het gen dat codeert voor een bepaald toxine geamplificeerd wordt door middel
van specifieke primers. Meestal kunnen meerdere primersets in één reactie gelopen worden
aangezien de lengte van de genen gekend is. Na scheiding van de fragmenten op gel, kan er
gekeken worden naar de aan- of afwezigheid van de toxinegenen (Jarraud et al, 2002).
4. IMPACT OP DE VOLKSGEZONDHEID
Hoe groot het gevaar van MRSA ST398 is voor de volksgezondheid is nog niet geweten. Vast
staat dat mensen die op een bedrijf werken waar de dieren MRSA ST398 dragen, een groter
risico lopen om gekoloniseerd te raken met MRSA ST398. Dit geldt ook voor de mensen die
werken op het varkensbedrijf en voor de dierenartsen die met de varkens in contact komen.
Kolonisatie kan rechtstreeks van het varken naar de mens maar ook onrechtstreeks via de
omgeving. Verder werd er reeds onderzoek gedaan naar de mogelijke overdracht van MRSA
ST398 tussen mensen, die tot nu toe beperkt lijkt (van Loo et al, 2006).
De gemeenschap zou in theorie ook gekoloniseerd kunnen worden met AA-MRSA aanwezig
op gecontamineerd varkensvlees. De contaminatiestatus van de transportwagens waarin de
varkens vervoerd worden van het bedrijf naar het slachthuis werd reeds onderzocht (Broens,
2009). Deze studie toonde aan dat de transportwagens gecontamineerd kunnen worden met
MRSA ST398 gedurende de korte periode waarin de varkens in de transportwagen verblijven.
De studie onderzocht ook de wachtruimtes van het slachthuis. De wachtruimtes waren reeds
na één dag gekoloniseerd, ondanks het feit dat de varkens er twee tot elf uur doorbrengen.
Van Cleef et al (2009) toonde aan dat de werknemers van het slachthuis die in contact komen
met de levende varkens, meer kans hebben op kolonisatie met MRSA ST398. Verschillende
studies concludeerden dat MRSA voornamelijk aanwezig is op de oppervlakten in het
slachthuis waar levende varkens verblijven, maar dat de bacterie verspreid wordt doorheen het
slachthuis tijdens het verwerkingsproces (Mulders et al, 2009; van Cleef et al, 2009). Deze
INLEIDING
13
studies werden uitgevoerd in Nederland, maar ook in België is MRSA ST398 wijdverspreid
op varkensbedrijven en gemengde bedrijven (van Cleef et al, 2009; Verhegghe et al, 2009).
Hoewel de primaire kolonisatiesite bij varkens voornamelijk de neusholte is, zijn de darmen
ook frequent gekoloniseerd met MRSA. Tijdens het slachten kan dus contaminatie gebeuren
van het vlees maar ook van de omgeving (de Boer et al, 2009). De Boer et al. (2009)
onderzocht de prevalentie van MRSA in verschillende types vlees en vond dat 10,7% van de
varkensvleesstalen positief was. Aanwezigheid van MRSA in vlees zou kunnen leiden tot
versnelde verspreiding van MRSA ST398 in de gemeenschap. Dit is echter niet het geval
doordat het lage aantal kolonievormende eenheden per kg aanwezig in het vlees. Men
concludeert hier voorlopig uit dat de contaminatie van vlees zo laag is dat er geen gevaar zou
zijn voor de consument/volksgezondheid (Morgan, 2008).
Contaminatie van mensen, die nauw contact hebben met gekoloniseerde varkens, zoals
varkensboeren, dierenartsen en werknemers van slachthuizen, zorgen voor een verhoogde
aanwezigheid van MRSA ST398 in de gemeenschap, wat op zichzelf reeds een risico voor de
volksgezondheid kan betekenen. Wanneer deze geïnfecteerde mensen bijkomende in contact
komen met HA- of CA-MRSA, zou horizontale gentransfer kunnen voorkomen. Tot nu toe
vertoont AA-MRSA minder resistentie tegen verschillende antibiotica dan HA-MRSA. Dit
wordt verklaard door een verschillend antibioticagebruik in de menselijke gezondheidszorg en
de veeteelt. Gentransfer tussen HA- en AA-MRSA kan er echter voor zorgen dat HA-MRSA
zeer snel resistent wordt aan een nog groter aantal antibiotica waardoor bestrijding van de
bacterie zeer moeilijk wordt (Unan & Young, 2007).
DOELSTELLING
14
II. DOELSTELLING MRSA vormt reeds lange tijd een probleem in de gezondheidszorg en de gemeenschap. In
2004 is een derde vorm van deze bacterie gevonden bij dieren, AA-MRSA genaamd.
Sindsdien werd dit type uitvoerig onderzocht en gekarakteriseerd als MRSA ST398. Varkens
zijn een veel voorkomende drager van MRSA ST398 zonder vertoon van infectie. Deze
bacterie wordt eenvoudig doorgegeven aan de omgeving en aan mensen die in contact komen
met gekoloniseerde varkens, zoals boeren, dierenartsen en slachthuispersoneel. Kolonisatie
van mensen kan sporadisch tot infecties leiden. Het gevaar is bovendien dat MRSA ST398
DNA zou kunnen uitwisselen met HA-MRSA door middel van horizontale gentransfer met de
vorming van een zeer infectueuze en zeer resistente bacterie als gevolg. Aangezien de bacterie
kan overleven op oppervlakten, is het mogelijk dat karkassen en vers varkensvlees
gecontamineerd raken met MRSA ST398. Dit kan leiden tot verspreiding van MRSA ST398
in de gemeenschap. Na onderzoek vond men echter een zeer laag kiemgetal van MRSA in
varkensvlees, waardoor het gevaar voor overdracht via varkensvlees naar de
gemeenschap/mens, eerder klein is.
Het project waarin deze thesis kadert, onderzoekt onder andere de epidemiologie van MRSA
ST398 bij vleesvarkens op twee gesloten varkensbedrijven, twee gesloten kip-
varkensbedrijven en twee gesloten rund-varkensbedrijven. Op deze bedrijven wordt de
kolonisatiestatus van de vleesvarkens onderzocht vanaf het werpen tot het einde van de
afmest. Om de contaminatiebron van de biggen te achterhalen, worden stalen genomen van de
omgeving en van de zeugen in de kraamstal en voor en na het wassen van de zeugen.
Deze thesis onderzocht de kolonisatieleeftijd van biggen met MRSA ST398 op een gesloten
kip-varkensbedrijf. Stalen worden genomen van de biggen op drie à vier dagen en drie weken
na het werpen in de kraamstal, iedere week van het verblijf in de biggenbatterij en gedurende
de eerste week in de voormest. Op drie à vier dagen na het werpen en voor het spenen (drie
weken na het werpen) van de biggen worden ook stalen genomen van de zeugen. Voor het
werpen worden de zeugen gewassen. Om de efficiëntie hiervan na te gaan, worden er
neusstalen en huidstalen genomen voor en na het wassen. Om de contaminatie van de
omgeving na te gaan worden er stalen genomen van de vloer in de stal, de wand ter hoogte
van het varken, de lucht ter hoogte van het staand varken en de lucht die de stal verlaat via het
ventilatiesysteem.
Na uitplaten en uitzuiveren worden er van elk MRSA isolaat een glycerolstock en lysaat
gemaakt voor verder onderzoek. Vervolgens wordt op alle isolaten een screening uitgevoerd
door middel van MLVA typering. Uit deze resultaten wordt vervolgens een selectie van de
isolaten gemaakt die gekarakteriseerd zullen worden door middel van MLST, spa typering,
SCCmec typering en PFGE. Tevens zal het antibioticaprofiel bepaald worden. Aangezien
MLST en spa typering tijdsrovende en arbeidsintensieve technieken zijn, wordt slechts een
beperkt aantal stalen getypeerd door middel van deze methoden. Wegens tijdsgebrek wordt
tevens slechts een deel van de selectie getypeerd door middel van PFGE. De overige
technieken worden toegepast op alle door middel van MLVA geselecteerde isolaten. Een
clustering zal vervolgens worden uitgevoerd om de verschillende isolaten met elkaar te
vergelijken.
RESULTATEN
15
III. RESULTATEN
1. STAALNAME BEDRIJF C
Om na te gaan op welke leeftijd biggen gekoloniseerd worden met MRSA, werden op een
gesloten kip-varkensbedrijf stalen genomen van de biggen/vleesvarkens, de zeugen en de
omgeving op verschillende tijdstippen na werpen. De biggen waren verdeeld over twee
kraamstallen die later biggenbatterij werden. Door het groot aantal positieve stalen werd
besloten om voor deze thesis verder te werken met de helft van de staalnames, namelijk de
staalnames drie à vier dagen na werpen, de weken voor en na het spenen van de biggen en de
weken voor en na het overbrengen van de vleesvarkens naar de voormestafdeling.
Het aantal MRSA positieve en MRSA niet detecteerbare stalen wordt weergegeven in
Tabel 2. Drie à vier dagen na werpen was reeds 97,5% van de biggen drager van MRSA. Dit
percentage daalde niet in de kraamstal of biggenbatterij maar wel bij het overbrengen van de
vleesvarkens naar de voormestafdeling. Op dat moment was slechts 76,4% van de
vleesvarkens MRSA drager. Bij het vergelijken van de aanwezigheid van MRSA bij de
biggen in de kraamstal/biggenbatterij (98%) en bij de vleesvarkens in de voormestafdeling
(76,4%), wass er een verschil van 20% merkbaar. Drie à vier dagen na werpen was 91,7% van
de zeugen MRSA positief. Dit percentage steeg tot 100% drie weken na werpen, wat betekent
gemiddeld 95,2% van de stalen van de zeugen drie à vier dagen en drie weken na werpen
MRSA positief was.
Tabel 2: Aantal vleesvarkens in kraamstal, biggenbatterij en voormest en aantal zeugen in de
kraamstal op verschillende tijdstippen na werpen die MRSA positief waren of waar MRSA niet
gedetecteerd werd. (ND: niet detecteerbaar)
3-4 dagen 3 weken 4 weken 10 weken 11 weken
BIGGEN VLEESVARKENS
Aantal Positief (%) 116 (97,5) 85 (100) 111 (97,4) 107 (98,2) 81 (76,4)
Aantal ND (%) 3 (2,5) 0 (0) 3 (2,6) 2 (1,8) 25 (23,6)
ZEUGEN
Aantal Positief (%) 11 (91,7) 9 (100) - - -
Aantal ND (%) 1 (8,3) 0 (0) - - -
Om na te gaan of de omgeving de contaminatiebron is van de biggen en later van de
vleesvarkens werden per stal omgevingstalen genomen op verschillende tijdstippen na het
werpen van de zeugen. Verdunningsreeksen werden aangelegd van de vloer- en wandstalen en
per luchtstrip werden vier kolonies uitgeplaat. Een omgevingsstaal werd als MRSA positief
beschouwt als één van de verdunningen of één van de vier geënte kolonies MRSA positief
was. Tabel 3 toont de resultaten van de vloer-, wand- en luchtstalen uit
kraamstal/biggenbatterij 7 en 10 en voormestafdeling 7 en 8. Bij de vloer- en wandstalen werd
op alle plaatsen MRSA gedetecteerd. De luchtstalen gaven een verschillend beeld in
kraamstal/biggenbatterij en voormestafdeling. Zeven van de 16 luchtstalen van de
kraamstal/biggenbatterij testten positief voor MRSA aanwezigheid. Bij de luchtstalen in de
voormestafdelingen werd slechts bij één staal MRSA gevonden.
Tot slot werden ook stalen genomen van zeugen voor en na het wassen, om na te gaan of het
wassen van de zeugen verandering geeft in de aanwezigheid van MRSA. Dit gebeurde met
RESULTATEN
16
behulp van neus- en huidstalen genomen voor en na het wassen (Tabel 4). Voor het wassen
werd bij 66,7% van de huidstalen MRSA gedetecteerd. Na het wassen werd er geen verschil
gevonden. Wel was er een lichte daling in de aanwezigheid van MRSA in de neus. Voor het
wassen vond men bij 91,7% van de neusstalen MRSA, terwijl dit na het wassen daalde naar
66.7%.
Bij negen van de 12 zeugen veranderde de contaminatiestatus van de neus niet, in
tegenstelling tot drie zeugen waarvan de neusstalen voor het wassen MRSA positief waren en
na het wassen er geen MRSA gedetecteerd kon worden (Tabel 4). Bij de huidstalen was een
gelijkaardige trend te zien. Bij acht van de 12 zeugen was er MRSA aanwezig op de huid voor
en na wassen. De huid van twee zeugen was voor het wassen MRSA positief, terwijl na het
wassen geen MRSA geïsoleerd werd. De overige twee zeugen hadden een negatief huidstaal
voor het wassen en een MRSA positief huidstaal na het wassen.
Tabel 3: Resultaten van de omgevingstalen op verschillende tijdstippen na de geboorte. MRSA
detectie wordt weergegeven met 1, geen detectie met 0.
OMGEVING 3-4 dagen 3 weken 4 weken 10 weken 11 weken
KRAAMSTAL/BIGGENBATTERIJ 10 VOORMESTAFDELING 7
Vloer 1 1 1 1 1
Wand 1 1 1 1 1
Lucht staand varken 1 1 0 0 0
Uitgaande lucht 0 0 1 0 0
KRAAMSTAL/BIGGENBATTERIJ 7 VOORMESTAFDELING 8
Vloer 1 1 1 1 1
Wand 1 1 1 1 1
Lucht staand varken 0 1 1 0 0
Uitgaande lucht 0 1 1 0 1
Tabel 4: Resultaten van de neus- en huidstalen van de zeugen voor en na het wassen en het
totaal aantal stalen waarin MRSA werd gedetecteerd. Detectie van MRSA wordt weergegeven
met 1, geen detectie met 0.
ZEUG Neus voor Neus na Huid voor Huid na
569 1 1 1 1
563 1 1 1 0
510 1 1 1 1
106 1 1 1 0
560 1 0 1 1
526 1 1 1 1
142 08 1 1 0 1
088 07 1 1 1 1
565 1 0 0 0
149 09 1 1 1 1
519 0 0 0 1
567 1 0 0 0
Totaal Aantal Positief (%) 11 (91,7) 8 (66,7) 8 (66,7) 8 (66,7)
RESULTATEN
17
2. SCREENING VAN DE ISOLATEN
2.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse
Zoals eerder vermeld werd eerst op alle (588) isolaten een screening uitgevoerd door middel
van MLVA. Er werden zes verschillende profielen verkregen. Op basis van deze profielen
werd in BioNumerics een clustering gevormd met de UPGMA clusteringmethode met Dice
coëfficiënt (Figuur 8). De profielen waarvan isolaat 2631 en 2082 voorbeelden zijn
vertoonden een lagere verwantschap met de andere stammen.
Uit de 588 isolaten werden op basis van deze resultaten 54 isolaten geselecteerd die verder
getypeerd werden. Hierbij werd rekening gehouden met de mogelijkheid om te vergelijken
tussen MRSA isolaten van verschillende vleesvarkens komende van dezelfde zeug en van
verschillende zeugen onderling, tussen MRSA isolaten van vleesvarkens en de omgeving en
tussen MRSA isolaten geïsoleerd voor en na het wassen van de zeugen. Een nieuw
dendrogram werd gevormd met de geselecteerde isolaten in BioNumerics met de UPGMA
clusteringmethode met Dice coëfficiënt (Figuur 9). Zoals hierboven vermeld, vertoonde de
clustering zes profielen. Profielen I en II omvatten 44 isolaten die 95% of meer verwantschap
vertoonden. Profiel III bevatte vijf isolaten en vertoonde 85% similariteit met profielen I en II,
terwijl dit slechts 74% was voor profiel IV, dat twee isolaten omvatte. Profiel V en VI
bevatten respectievelijk twee en één isola(a)t(en) en waren 84% verwant met elkaar, maar
minder dan 70% met de overige profielen.
3. TYPERING VAN DE GESELECTEERDE ISOLATEN
3.1. Multi locus sequentie typering
Door middel van MLST kan nagegaan worden tot welk sequentie type de 54 geselecteerde
MRSA isolaten behoren. Door de arbeidsintensiviteit en hoge kostprijs van de methode
worden slechts twee isolaten (1480 en 1984) door middel van deze techniek onderzocht. Het
resulterende profiel van de onderzochte isolaten was 3-35-19-2-20-26-39, wat overeenkomt
met sequentie type ST398.
3.2. spa typering
spa typering typeert stammen op basis van het aantal VNTR’s aanwezig in de X regio van het
proteïne A gen van MRSA. Opnieuw werd er slechts een beperkt aantal van de geselecteerde
isolaten aan deze techniek onderworpen. Alle isolaten vertoonden allemaal spa type t011.
MLVA-Marijke100
90
80
70
MLVA-Marijke
.
.
.
.
.
.
1875
1958
3057
2839
2631
2082
big 3, 3w
big 80, 3w
Big 3, 11w
big 2, 10w
Zeug 8807, neus na
Lucht U, 3w
Figuur 8: Dendrogram van de verschillende profielen, gevonden na de MLVA screening. Via
Bionumerics werd een clustering gevormd door middel van de UPGMA methode via Dice
vergelijking.
RESULTATEN
18
Figuur 9: Dendrogram van de MLVA profielen van de geselecteerde stalen. De cluster werd
gevormd in BioNumerics door middel van UPGMA via Dice vergelijking. Profielen worden
aangegeven met romeinse cijfers.
MLVA-Marijke
100
90
80
70
MLVA-Marijke
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1551
1975
1733
2839
2910
2674
2612
3193
1567
2066
3330
2961
2078
1971
1979
1480
1481
1482
1546
1725
1873
1874
1875
1939
1943
1948
1984
1985
2840
3056
1556
1959
2690
2659
2677
2663
2624
2626
2614
2619
3181
3169
2045
3057
2898
2949
1570
2965
1958
2057
2631
2678
2082
big 65, 3-4d
Lucht SV, 3w
big 80, 3-4d
big 2, 10w
Big 80, 10w
Zeug 8807, huid voor
Zeug 569, neus voor
Big 80, 11w
Wand, 3-4d
Vloer, 4w
Wand, 11w
Wand, 10w
Wand, 4w
Wand, 3w
Lucht U, 3-4d
zeug 1, 3-4d
big 2, 3-4d
big 3, 3-4d
zeug 7, 3-4d
zeug 8, 3-4d
zeug 1, 3w
big 2, 3w
big 3, 3w
zeug 7, 3w
big 65, 3w
zeug 8, 3w
big 2, 4w
big 3, 4w
big 3, 10w
Big 2, 11w
Vloer, 3-4d
Vloer, 3w
Zeug 8807, huid na
Zeug 569, huid voor
Zeug 569, huid na
Zeug 510, huid voor
Zeug 569, neus na
Zeug 510, neus na
Zeug 510, neus voor
Zeug 8807, neus voor
Big 65, 11w
Vloer, 11w
Big 65, 4w
Big 3, 11w
Big 65, 10w
Vloer, 10w
Lucht SV, 3-4d
Lucht U, 4w
big 80, 3w
big 80, 4w
Zeug 8807, neus na
Zeug 510, huid na
Lucht U, 3w
I
II
III
IV
V
VI
RESULTATEN
19
3.2. SCCmec typering
Door middel van SCCmec typering wordt nagegaan welke SCCmec cassette aanwezig is in
het genoom van het MRSA isolaat. Het resultaat van de SCCmec typering zijn drie
bandenpatronen waaruit het SCCmec type afgeleid kan worden. De 54 geselecteerde isolaten
vertoonden allemaal het SCCmec type V, behalve isolaat 2631 en 3336 (zie bijlage 1). De
combinatie van bandenpatronen voor isolaten 2631 en 3336 gaven geen uitkomst die
vergelijkbaar was met de standaardstammen weergegeven in Figuur 7. Figuur 10 toont de
resultaten van SCCmec typering van een positieve controle voor type IVa en V, een negatieve
controle, isolaat 1481, dat SCCmec type V bevat en isolaten 2631 en 3336 die niet typeerbaar
zijn.
3.3. Pulsed Field Gel Elektroforese
PFGE is de gouden standaard voor de typering van MRSA. Aangezien er reeds aangetoond
werd door middel van MLST en spa typering dat de isolaten behoorden tot MRSA ST398 en
dit sequentietype niet geknipt kan worden door SmaI, werd de restrictie uitgevoerd met BstZI
als restrictie-enzym. Wegens tijdsgebrek werden slechts tien isolaten onderzocht via PFGE.
Vijf isolaten kwamen van big 2 en 3 en hun zeug (zeug 1) en big 65 en de bijhorende zeug
(zeug 7), allemaal bekomen drie à vier dagen na werpen. De overige vijf waren ook afkomstig
van big 2 maar deze zijn bekomen drie, vier, negen, tien en elf weken na werpen. De bekomen
pulsotypes werden verwerkt in BioNumerics en geclusterd door middel van de UPGMA
clusteringsmethode met Dice coëfficiënt (Figuur 11).
Figuur 10: SCCmec profielen bekomen met behulp van drie
PCR mixen van isolaten 2631, 3336 en 1481 met positieve
controles voor SCCmec types IVa en V en een negatieve
controle. (L: 100 bp ladder; 1: controle SCCmec type V; 2:
controle SCCmec type IVa; 3: negatieve controle; 4: isolaat 2631;
5: isolaat 3336; 6: isolaat 1481)
L MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX 1 MIX 2 MIX 3
1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6
5
6
5
6
5
500
300
200
100
400
1000
RESULTATEN
20
De clustering toonde dat zeven van de tien isolaten 100% verwant waren op basis van PFGE
met het BstZI restrictie-enzym. De overige drie isolaten waren minder verwant. Isolaat 3056
had slechts 92% verwantschap met de overige isolaten.
3.4. Antibiogrammen
Antibiogrammen worden uitgevoerd om na te gaan tegen welke antibiotica resistentie
aanwezig is bij het onderzochte isolaat. Zestien verschillende antibiotica werden getest
(originele data bijlage 2). Bij de test werden zes verschillende antibioticumresistentieprofielen
gevonden (Tabel 5). Alle profielen vertoonden resistentie tegen tetracycline en trimethoprim
en sensitiviteit tegen chloramphenicol, fucidine, gentamicine, kanamycine, linezolid,
rifampicine, sulfonamide en tobramycine. Voor de overige zes antibiotica vertoonden de
profielen een verschillende resistentie/sensitiviteit. Profiel zes vertoonde een groot verschil
met de overige profielen door de resistentie tegen erythromycine, lincomycine en mupirocine,
de sensitiviteit voor ciprofloxacine en de intermediaire reactie tegen
quinupristine/dalfopristine. Profiel 1, 3, 4 en 5 waren gelijkaardig. Wanneer profiel 1 als basis
genomen werd, verschilden profiel 3, 4 en 5 met profiel 1 in een intermediaire reactie in
plaats van resistentie voor respectievelijk lincomycine, erythromycine en tylosine. Bij
profiel 2 viel de intermediaire reactie tegen lincomycine en sensitiviteit voor ciprofloxacine
op.
Tabel 6 toont het voorkomen van de verschillende antibioticumresistentieprofielen. Het
dominante profiel was profiel 1, dat bij 87% van de isolaten voorkwam. Profiel 3 kwam drie
keer voor (isolaten 1979, 3330 en 2674). Profielen 2, 4, 5 en 6 werden maar één keer
gevonden in respectievelijk isolaat 2631, isolaat 2949, isolaat 2082 en isolaat 3336.
De reactie van de isolaten ten opzicht van de verschillende antibiotica wordt weergegeven in
Tabel 7. Alle isolaten waren resistent aan tetracycline en trimethoprim en sensitief aan
chloramphenicol, fucidine, gentamicine, kanamycine, linezolid, rifampicine en sulfonamides.
De meeste isolaten (96,2%) waren resistent voor ciprofloxacine, terwijl 92,7% gevoelig was
aan lincomycine. Tot slot vertoonde meer dan 95% van de isolaten een sensitiviteit voor
erythromycine, mupirocine, quinupristine/dalfopristine en tylosine.
PFGE - EagI - 2
100
98
96
94
92
PFGE - EagI - 2
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1480
1481
1482
1546
1873
1984
2839
1551
1874
3056
zeug 1, 3-4d
big 2, 3-4d
big 3, 3-4d
zeug 7, 3-4d
zeug 1, 3w
big 2, 4w
big 2, 10w
big 65, 3-4d
big 2, 3w
Big 2, 11w
Figuur 11: Dendrogram van de profielen bekomen door middel van PFGE. De cluster werd
gegenereerd in Bionumerics door middel van UPGMA clustering via de Dice vergelijking.
RESULTATEN
21
Tabel 5: Overzicht van de antibioticaresistetieprofielen gevonden in de 54 onderzochte
stammen. De isolaten die behoren tot een bepaald profiel waren sensitief (S), intermediair (I) of
resistent (R) voor een bepaald antibioticum.
Profiel 1 Profiel 2 Profiel 3 Profiel 4 Profiel 5 Profiel 6
Chloramphenicol S S S S S S
Ciprofloxacine R S R R R S
Erythromycine S S S I S R
Fucidine S S S S S S
Gentamicine S S S S S S
Kanamycine S S S S S S
Lincomycine S I I S S R
Linezolid S S S S S S
Mupirocine S S S S S R
Quinupristine/dalfopristine S S S S S I
Rifampicine S S S S S S
Sulfonamide S S S S S S
Tetracycline R R R R R R
Tobramycine S S S S S S
Trimethoprim R R R R R R
Tylosine S S S S I S
Tabel 6:Aantal en percentage van de isolaten per antibioticaresistentieprofiel.
Profiel 1 2 3 4 5 6
Aantal 47 1 3 1 1 1
Percentage (%) 87,0 1,9 5,6 1,9 1,9 1,9
Tabel 7: Overzicht van het percentage isolaten die resistent, intermediair of sensitief zijn voor
een bepaald antibioticum.
Resistent (%) Intermediair (%) Sensitief (%)
Chloramphenicol - - 100
Ciprofloxacine 96,2 - 3,8
Erythromycine 1,9 1,9 96,4
Fucidine - - 100
Gentamicine - - 100
Kanamycine - - 100
Lincomycine 1,9 7,5 92,7
Linezolid - - 100
Mupirocine 1,9 - 98,1
Quinupristin/dalfopristin - 1,9 98,1
Rifampicine - - 100
Sulphonamide - - 100
Tetracycline 100 - -
Tobramycine - - -
Trimethoprim 100 - -
Tylosine 1,9 1,9 96,2
RESULTATEN
22
3.5. Overzicht van de typeringen
Op basis van de MLVA profielen werd een dendrogram gemaakt van de 54 geselecteerde
isolaten door middel van de UPGMA clusteringsmethode met Dice coëfficiënt, die de
resultaten van spa typering, SCCmec typering, PFGE en antibioticumresistentieprofilering
bevat (Figuur 12).
Meest opvallend in dit dendrogram was isolaat 3336, dat geen MLVA bandenpatroon
vertoonde, een antibioticumresistentieprofiel had dat sterk verschilt van de overige isolaten en
niet typeerbaar was door middel van SCCmec typering.
In MLVA profiel I vielen isolaten 2674, 3330 en 1979 op door een intermediaire resistentie
voor lincomycine die niet terug werd gevonden bij de overige isolaten in deze cluster. MLVA
profiel II vertoonde geen variatie in SCCmec type, antibioticumresistentieprofiel of spa type.
Enkel op basis van de PFGE was er een verschil op te merken bij isolaten 1874 en 3056. Alle
typeringsmethoden gaven dezelfde resultaten voor de isolaten van MLVA profiel IV. Deze
resultaten werden ook meestal teruggevonden bij de isolaten van MLVA profiel III, met
uitzondering van isolaat 2949, dat een intermediaire resistentie vertoonde voor erythromycine
die niet te zien was bij de andere isolaten.
RESULTATEN
23
MLVA-Marijke
100
80
60
40
20
0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1551
1975
1733
2839
2910
2674
2612
3193
1567
2066
3330
2078
1971
1979
1480
1481
1482
1546
1725
1873
1874
1875
1939
1943
1948
1984
1985
2840
3056
1556
1959
2690
2659
2677
2663
2624
2626
2614
2619
3181
3169
2045
3057
2898
2949
1570
2965
1958
2057
2631
2678
2082
3336
big 65, 3-4d
Lucht SV, 3w
big 80, 3-4d
big 2, 10w
Big 80, 10w
Zeug 8807, huid .
Zeug 569, neus v.
Big 80, 11w
Wand, 3-4d
Vloer, 4w
Wand, 11w
Wand, 4w
Wand, 3w
Lucht U, 3-4d
zeug 1, 3-4d
big 2, 3-4d
big 3, 3-4d
zeug 7, 3-4d
zeug 8, 3-4d
zeug 1, 3w
big 2, 3w
big 3, 3w
zeug 7, 3w
big 65, 3w
zeug 8, 3w
big 2, 4w
big 3, 4w
big 3, 10w
Big 2, 11w
Vloer, 3-4d
Vloer, 3w
Zeug 8807, huid .
Zeug 569, huid v.
Zeug 569, huid na
Zeug 510, huid v.
Zeug 569, neus na
Zeug 510, neus na
Zeug 510, neus v.
Zeug 8807, neus .
Big 65, 11w
Vloer, 11w
Big 65, 4w
Big 3, 11w
Big 65, 10w
Vloer, 10w
Lucht SV, 3-4d
Lucht U, 4w
big 80, 3w
big 80, 4w
Zeug 8807, neus .
Zeug 510, huid na
Lucht U, 3w
Lucht U, 10w
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cipR, ery I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R, tylo R
ery R, lico R, mup R, syn I, tet R, trim R
II
I
I
I
I
I
I
III
I
IV
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
NT
V
V
NT
MLVA-Marijke
100
80
60
40
20
0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1551
1975
1733
2839
2910
2674
2612
3193
1567
2066
3330
2078
1971
1979
1480
1481
1482
1546
1725
1873
1874
1875
1939
1943
1948
1984
1985
2840
3056
1556
1959
2690
2659
2677
2663
2624
2626
2614
2619
3181
3169
2045
3057
2898
2949
1570
2965
1958
2057
2631
2678
2082
3336
big 65, 3-4d
Lucht SV, 3w
big 80, 3-4d
big 2, 10w
Big 80, 10w
Zeug 8807, huid voor
Zeug 569, neus voor
Big 80, 11w
Wand, 3-4d
Vloer, 4w
Wand, 11w
Wand, 4w
Wand, 3w
Lucht U, 3-4d
zeug 1, 3-4d
big 2, 3-4d
big 3, 3-4d
zeug 7, 3-4d
zeug 8, 3-4d
zeug 1, 3w
big 2, 3w
big 3, 3w
zeug 7, 3w
big 65, 3w
zeug 8, 3w
big 2, 4w
big 3, 4w
big 3, 10w
Big 2, 11w
Vloer, 3-4d
Vloer, 3w
Zeug 8807, huid na
Zeug 569, huid voor
Zeug 569, huid na
Zeug 510, huid voor
Zeug 569, neus na
Zeug 510, neus na
Zeug 510, neus voor
Zeug 8807, neus voor
Big 65, 11w
Vloer, 11w
Big 65, 4w
Big 3, 11w
Big 65, 10w
Vloer, 10w
Lucht SV, 3-4d
Lucht U, 4w
big 80, 3w
big 80, 4w
Zeug 8807, neus na
Zeug 510, huid na
Lucht U, 3w
Lucht U, 10w
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cipR, ery I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
linco I, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R
cip R, tet R, trim R, tylo R
ery R, lico R, mup R, syn I, tet R, trim R
2
1
1
1
1
1
1
3
1
4
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
t011
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
NT
V
V
NT
Figuur 12: Cluster gebaseerd op de MLVA profielen met de resultaten van de spa typering,
SCCmec typering en antibiogrammen. (NT: niet typeerbaar)
Nr. Herkomst Antibioticumresistentieprofiel PFGE spa SCCmec
I
II
III
IV
V
VI
DISCUSSIE
24
IV. DISCUSSIE MRSA ST398 werd voor het eerst beschreven in Nederland in 2005. Sindsdien zijn
verschillende studies uitgevoerd naar de prevalentie van deze bacterie op varkensbedrijven
en naar de typering van de gevonden stammen. Tijdens deze thesis werd de prevalentie van
MRSA in een gesloten kip-varkensbedrijf onderzocht en werden de isolaten door middel van
MLST, spa typering, SCCmec typering en PFGE getypeerd. Tevens werd het
antibioticumresistentieprofiel bepaald.
4.1. PREVALENTIE IN VARKENS
Onderzoek naar de epidemiologie van MRSA binnen één bedrijf is in België nog niet eerder
gebeurd. In de literatuur werd tot op heden niets gepubliceerd over de contaminatieleeftijd
van biggen. Studies naar de prevalentie van MRSA in varkensbedrijven werden wel
uitgevoerd. Van Duijkeren et al (2008) rapporteerden in Nederland een prevalentie van 11%
in de 310 varkens waarvan stalen genomen werden. De prevalentie van MRSA in gesloten
bedrijven in België is 56% (Denis et al, 2007; Willems et al, niet gepubliceerde data).
Drie à vier dagen na werpen was 97,5% van de stalen afgenomen bij de biggen MRSA
positief, net zoals een groot deel van de omgevingsstalen. In de kraamstal en biggenbatterij
bleven deze observaties terugkeren. Wanneer de vleesvarkens overgebracht waren naar de
voormestafdeling, werd slechts bij 76,4% van de vleesvarkens MRSA dragerschap gevonden
terwijl er geen daling was in het aantal omgevingsstalen die MRSA positief waren. Dit
verschil kan mogelijks verklaard worden door het verhuizen van de vleesvarkens. De MRSA
bacterie kan nog steeds aanwezig zijn op de huid van de vleesvarkens, waardoor de
vleesvarkens de omgeving contamineren maar er geen detecteerbare hoeveelheid MRSA
meer aanwezig is in de neus. Een verlaagde prevalentie in oudere varkens werd reeds
beschreven door Denis et al (2007), Dewaele et al (2007) en Willems et al (niet
gepubliceerde data).
De zeugen in de kraamstal vertoonden een hoge aanwezigheid van MRSA. Drie à vier dagen
na de worp waren 91,7% van de zeugen MRSA positief. Deze contaminatiestatus is niet
consistent met eerdere studies (Denis et al, 2007; Dewaele et al, 2007; Willems et al, niet
gepubliceerde data), waarin gevonden werd dat oudere varkens een lagere prevalentie
vertonen dan biggen. Zeugen zijn minimum zeven maanden oud en behoren dus tot de
oudere varkens, waardoor een verlaagde prevalentie zou kunnen verwacht worden, wat hier
niet het geval is. Het is echter niet geweten of de zeugen reeds voor het werpen
gekoloniseerd waren met MRSA of hiermee gecontamineerd werden in de kraamstal. De
omgevingsstalen waren meestal positief, waardoor de contaminatie van de zeugen
veroorzaakt kan zijn door contact met de omgeving. De zeugen kunnen ook de omgeving
gecontamineerd hebben. Verder onderzoek is nodig naar de prevalentie van MRSA in
oudere varkens en de contaminatiestatus van de zeugen voor ze naar de kraamstal
overgebracht worden.
Bij het verhuizen van de zeugen van de drachtstal naar de kraamstal, worden de zeugen
gewassen om bacteriën, mest, en dergelijke te verwijderen. Op bedrijf C worden de zeugen
gewassen in de kraamhokken waarin ze ook zullen werpen. Bij het wassen worden
tegelijkertijd de kraamhokken schoongemaakt. Men verwacht dat dit leidt tot een
vermindering in prevalentie van MRSA in de stalen van de gewassen zeugen. Bij de
DISCUSSIE
25
neusstalen werd er een daling van 91,7% naar 66,7% opgemerkt maar dit was niet het geval
bij de huidstalen, waar zowel voor als na het wassen een prevalentie gezien werd van 66,7%.
Het wassen van de zeugen leidde dus tot een vermindering van 25% in het voorkomen van
MRSA in de neus. Hoewel het aantal huidstalen, die MRSA positief waren, gemiddeld
gelijk blijft voor en na het wassen, kon opgemerkt worden dat twee zeugen overgegaan zijn
van een positieve naar een niet detecteerbare status terwijl twee andere zeugen MRSA
positief waren geworden na het wassen. Dit onderzoek testte slechts 12 zeugen voor en na
het wassen en zou herhaald moeten worden op een statistisch verantwoord aantal zeugen
voor er echte conclusies kunnen getrokken worden. De daling in prevalentie in de neus kan
te maken hebben met de manier van wassen en het gebruikte reinigingsmiddel. Op bedrijf C
werden de zeugen zorgvuldig ingeschuimd en nadien afgespoten met een hogedrukreiniger.
Inzepen door middel van een borstel zou een beter manier kunnen zijn om MRSA bacteriën
van de huid te verwijderen. Gebruik van een desinfectans in plaats van zeep zou ook een
betere verwijdering van de bacterie kunnen veroorzaken. Onderzoek naar verschillende
reinigingsmethoden, om na te gaan welke methode het meest efficiënt is, is dus nodig.
4.2. TYPERING VAN DE ISOLATEN
Door het groot aantal MRSA positieve stalen werd een screening uitgevoerd met behulp van
MLVA. Zes verschillende profielen werden gevonden en geclusterd (Figuur 8). Aangezien
sommige profielen niet alle banden vertoonden, kan dit aanleiding geven tot een
similariteitsberekening die niet correct is. Dit was waarschijnlijk het geval voor stam 2631
en 2082, waarvan het profiel respectievelijk twee en drie banden vertoont. Een tekort aan
banden kan verklaard worden door een onvolledige PCR reactie of door een te lage DNA
concentratie in de gebruikte lysaten.
Uit de 588 positieve isolaten werd een selectie van 54 isolaten gemaakt waarmee een nieuwe
MLVA clustering gevormd werd (Figuur 9). Profiel I en II omvatten 85% van de
geselecteerde isolaten en vertoonden 95% verwantschap. In profiel III werd gezien dat de
bandenpatronen onvolledig zijn. Slechts vier van de vijf geamplificeerde fragmenten waren
aanwezig. Dit is ook het geval in profiel V en VI die respectievelijk drie en twee fragmenten
tekort hadden in hun bandenpatroon. Er moet nog verder nagegaan worden of dit werkelijk
een genetisch verschil is of een fout in de MLVA-analyse. Het bandenpatroon van profiel IV
vertoonde alle geamplificeerde fragmenten maar was slechts 74% verwant met profiel I en
II. Deze isolaten waren afkomstig van dezelfde big en zijn mogelijks een andere MRSA
stam dan de isolaten in profielen I en II. Aangezien het bandenpatroon zeer gelijkaardig was
aan de bandenpatronen gevonden in profielen I en II maar enkel de banden hoger liggen, is
een tweede verklaring mogelijks dat het verschil in hoogte veroorzaakt is door de sequencer.
Alle stalen worden afzonderlijk gelopen, waardoor een verschil kan optreden tussen
verschillende stalen, ondanks het gebruik van een referentiemerker en normalisatie in
BioNumerics. Ook dit verschil in bandenpatroon moet nog verder onderzocht en eventueel
bevestigd worden.
Van de 54 geselecteerde isolaten werden tien van de elf isolaten, bekomen tijdens de
staalname drie à vier dagen na werpen, geclusterd in de profielen I en II, net zoals negen van
de elf isolaten van drie weken na werpen, vijf van de zeven isolaten van vier weken na
werpen, vier van de zes isolaten van 10 weken na werpen en vijf van de zes isolaten van
11 weken na werpen. Dit betekent dat al deze isolaten een similariteit vertoonden van 95%
of meer waardoor dit waarschijnlijk isolaten zijn van dezelfde MRSA stam. Verdere
DISCUSSIE
26
typering door middel van PFGE bevestigde dit resultaat aangezien negen van de tien
isolaten, die PFGE analyse ondergingen, 98% verwant waren Typering van meer isolaten is
echter nodig om verdere conclusies te kunnen vormen.
De overige isolaten van de verschillende staalnames behoren tot MLVA profielen waar één
of meer fragmenten niet werden geamplificeerd en moeten ook verder onderzocht worden.
Op basis van de MLVA clustering kunnen isolaten geïsoleerd bij verschillende staalnames
van dezelfde big met elkaar vergeleken worden. Per big in de kraamstal/biggenbatterij kon
gezien worden dat over het algemeen de isolaten een verwantschap vertoonden van 95% en
meer. Dit betekent dat de biggen kort na werpen gekoloniseerd werden met een MRSA stam
en deze stam behouden gedurende hun verblijf in de kraamstal en de biggenbatterij. De
isolaten geïsoleerd in de voormest vertoonden onderling een lagere similariteit. Een
verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat sommige biggen bij het transport van de
biggenbatterij naar de voormestafdeling de aanwezige MRSA stam verliezen en in de
voormest gekoloniseerd worden met een nieuwe stam, terwijl andere gekoloniseerd blijven
met de MRSA stam die ze in de kraamstal en biggenbatterij hebben. Dit is consistent met de
verschillende soorten dragerschap die voorkomen. Varkens kunnen permanent drager zijn
van MRSA, waardoor alle isolaten van dit varken tot dezelfde stam behoren. Een tweede
mogelijkheid is intermediair dragerschap, waarbij het varken op verschillende tijdstippen
gekoloniseerd is met verschillende MRSA stammen maar die na een bepaalde periode ook
weer verliest. Varkens kunnen ook geen dragerschap vertonen, wat betekent dat er geen
kolonisatie met MRSA optreedt.
Wanneer gekeken werd naar de isolaten afgenomen bij de zeugen en de bijhorende biggen in
de kraamstal, waren 11 van de 14 isolaten 100% verwant. De isolaten vertoonden hetzelfde
SCCmec type en werden ook samen geclusterd op basis van de pulsotypes bekomen door
middel van PFGE. Aangezien dezelfde isolaten ook hetzelfde antibioticumresistentieprofiel
vertoonden, kan besloten worden dat ze behoren tot dezelfde MRSA stam. Een algemene
conclusie kan nog niet getrokken worden door het beperkt aantal isolaten.
Op basis van de MLVA profielen werd ook 100% similariteit gevonden wanneer gekeken
werd naar alle isolaten gevonden in big-, zeug- en omgevingsstalen afgenomen in de
kraamstal. Negentien van de 22 stammen geïsoleerd drie à vier dagen en drie weken na
werpen vertoonden een similariteit van 95% of meer.
Tussen de isolaten van biggen van verschillende zeugen was een verwantschap van 95%,
wat een eerder vreemde observatie was, aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal
100% verwant waren. Dit kan verklaard worden door eventuele variatie in de analyse of
door een verschillend MRSA type. Verdere typering met meerdere methoden kan eventueel
aantonen dat de isolaten toch afkomstig zijn van dezelfde MRSA stam.
Op basis van de MLVA profielen was te zien dat de isolaten bekomen van de zeugen in de
kraamstal en de omgeving drie à vier dagen en 3 weken na het werpen 95% verwantschap
toonden. Hieruit kan echter niet afgeleid worden of de zeugen de omgeving gecontamineerd
hebben of vice versa. Om dit te kunnen nagaan moeten een studie uitgevoerd worden naar
het moment van contaminatie van de zeugen. Een mogelijke opzet is om een MRSA
negatieve zeug over te brengen naar een MRSA positief bedrijf en vervolgens de
contaminatiestatus op te volgen.
De isolaten, afkomstig van het wassen van de zeugen, vertoonden op basis van de MLVA
profielen een verwantschap van 95% of meer, behalve twee isolaten, die maar twee van de
DISCUSSIE
27
vijf banden vertoonden en dus een twijfelachtig resultaat gaven. Hieruit kan er afgeleid
worden dat de zeugen of gekoloniseerd blijven gedurende het wassen, of geen MRSA meer
dragen maar deze snel weer oppikken door contact met de omgeving. Snelle rekolonisatie is
eerder onwaarschijnlijk aangezien de stalen afgenomen werden 20 min na het wassen.
De onderzochte isolaten behoren tot sequentietype ST398, dat geassocieerd wordt met
AA-MRSA. De isolaten die spa typering ondergingen, hadden spa type t011. Dit is een veel
voorkomend type bij MRSA ST398, naast spa type t108 en t034. Dit werd ook gevonden in
Nederland door Van Duijkeren et al. (2008) en de Neeling et al (2007) en in België door
Denis et al (2007), Rasschaert et al (2009) en Willems et al (niet gepubliceerde data). In alle
geselecteerde isolaten, op twee na, werd SCCmec type V teruggevonden, wat frequent
teruggevonden wordt in MRSA ST398 (de Neeling et al, 2007; Denis et al, 2007; Huijsdens
et al, 2006; Rasschaert et al, 2009; van Duijkeren et al, 2008; Willems et al, niet
gepubliceerde data). De overige twee isolaten vertoonden een niet typeerbaar SCCmec
profiel en worden verder onderzocht.
Tien isolaten werden onderzocht door middel van PFGE met het BstZI restrictie-enzym en
de bekomen pulsotypes werden geclusterd (Figuur 11). Zeven van de tien isolaten waren
100% verwant. Isolaten 1551 en 1874 vertoonden een verwantschap van ongeveer 98% met
de eerste zeven isolaten. Wanneer er naar de bandenpatronen gekeken werd, kon er gezien
worden dat deze zeer gelijkaardig waren aan deze van de isolaten die 100% verwant waren.
Er was echter wel een smeer te zien bij de hoger gelegen banden die de lagere verwantschap
zouden kunnen verklaren. Door de smeer kunnen deze banden op een andere hoogte
gepositioneerd zijn en dus aanleiding geven tot een verlaagde verwantschap. Er kan dus
verwacht worden dat de isolaten 1551 en 1874 ook 100% verwant zullen zijn met de andere
zeven isolaten. Meer isolaten moeten onderzocht worden om te kunnen besluiten of deze
stammen tot hetzelfde MRSA type behoren. Het tiende isolaat (3056) valt op. Dit isolaat
werd geïsoleerd bij een big in de voormest en vertoonde in vergelijking met de andere
isolaten een licht verschillend pulsotype. Dit zou kunnen betekenen dat sommige MRSA
isolaten in de voormestafdelingen een ander pulsotype hebben dan de isolaten in de
kraamstal/biggenbatterij. Aangezien er maar één isolaat uit de voormest onderzocht werd
met PFGE, kan er geen definitief besluit getrokken worden.
Alle antibioticumprofielen vertoonden resistentie tegen tetracycline en trimethoprim. Ook in
andere studies (Denis et al, 2007; Dewaele et al, 2007; Willems et al, niet gepubliceerde
data) is 100% resistentie gevonden van MRSA ST398 tegen deze antibiotica. Tetracycline is
het meest gebruikte antibioticum in de veeteelt, waardoor er een verhoogde blootstelling is
voor bacteriën, die zo resistentie kunnen ontwikkelen. Ciprofloxacineresistentie werd in
96,4% van de stammen gevonden. Dit is merkbaar hoger dan de 33% gevonden door Denis
et al (2007) en Willems et al (niet gepubliceerde data) na onderzoek van 663 MRSA
positieve stalen. In Denis et al (2007) werd ook sensitiviteit aan chloramphenicol, fusidine,
gentamicine, kanamycine, linezolide, rifampicine, sulphonamide en tobramycine gevonden.
Deze resultaten werden ook hier gezien.
Profiel zes vertoonde een sterk verschillend resistentieprofiel. Dit profiel kwam enkel in
stam 3336 voor. Dit luchtstaal uit de voormestafdeling toont tevens een atypisch SCCmec
type, waardoor vermoed kan worden dat het om een ander MRSA type gaat. Verder
onderzoek zal dit moeten bevestigen.
DISCUSSIE
28
In Figuur 12 kon gezien worden dat 42 van de 54 geselecteerde isolaten zeer gelijkaardig
waren op basis van de MLVA profielen, antibioticumresistentieprofielen, PFGE profielen,
spa type en SCCmec type. Om te besluiten dat deze isolaten tot dezelfde MRSA stam
behoren, moeten meer isolaten onderzocht worden met PFGE en eventuele andere
typeringsmethoden. De overige isolaten moeten opnieuw onderzocht worden door middel
van MLVA om na te gaan of deze bij aanwezigheid van de vijf geamplificeerde reactie een
hogere similarteit vertonen met MLVA profielen I en II. Verder onderzoek op isolaat 3336,
dat verschillende karakteristieken vertoont ten opzichte van de andere 54 isolaten, moet
aantonen of isolaat 3336 werkelijk een MRSA isolaat is.
4.3. CONCLUSIE
In het onderzoek naar de epidemiologie van AA-MRSA in varkens, werd in een gesloten
kip-varkensbedrijf een studie gedaan naar het tijdstip van kolonisatie van de biggen en de
bron van contaminatie. De resultaten toonden een hoge kolonisatiegraad in biggen van drie à
vier dagen oud. De biggen waren gekoloniseerd met MRSA isolaten die, op basis van
MLVA, een hoge verwantschap vertoonden. De bron van contaminatie kan echter niet
gespecifieerd worden, aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal en de omgeving
een hoge verwantschap tonen met de isolaten gevonden in de stalen van de biggen. Dit
betekent dat de biggen zowel door de zeugen als de omgeving gekoloniseerd kunnen zijn
met MRSA. Een selectie van isolaten werd verder getypeerd door middel van MLST, spa
typering, SCCmec typering, PFGE en antibioticaresistentieprofilering. De isolaten
behoorden tot sequentie type ST398 en hadden spa type t011, beide veel voorkomend in
varkens in België en typisch voor het diergebonden MRSA. De isolaten hadden SCCmec
type V en werden op basis van PFGE samen geclusterd met 92% of meer verwantschap.
Zevenentachtig procent van de onderzochte isolaten vertoonden hetzelfde
antibioticumresistentieprofiel, waardoor kan verwacht worden dat al de meeste van de
gevonden isolaten tot dezelfde MRSA stam behoren. Verder onderzoek van meer isolaten en
van meerdere bedrijven moet hiervoor echter uitgevoerd worden. Onderzoek moet ook
gevoerd worden naar de contaminatiestatus van de zeugen bij het binnenbrengen in een
nieuw bedrijf om na te gaan op welk moment de zeugen gecontamineerd worden.
Onderzoek naar de overdracht van MRSA tussen de varkens en de kippen op het bedrijf
wordt momenteel gevoerd in het groter project waarin deze thesis kadert.
MATERIAAL EN METHODEN
29
V. MATERIAAL EN METHODEN
1. STAALNAME BEDRIJF C
1.1. Beschrijving bedrijf C
Bedrijf C is een gemengd veeteeltbedrijf waar zowel varkens als kippen aanwezig zijn. Dit
bedrijf telt ongeveer 180 zeugen, 500 biggen (0-10 weken oud) en 1000 vleesvarkens (ouder
dan 10 weken).
Dit bedrijf is een gesloten varkensbedrijf dat werkt met een één wekensysteem. Een gesloten
bedrijf produceert zelf biggen in tegenstelling tot een open bedrijf dat biggen aankoopt om af
te mesten. Eén of meer wekensystemen zijn gebaseerd op de cyclus van de zeug, die 21
weken duurt. Eén week na het begin van de cyclus wordt de zeug in de meeste gevallen
kunstmatig geïnsemineerd. Na een dracht van ongeveer 16 weken werpen de zeugen.
Afhankelijk van het wekensysteem, worden de biggen drie à vier weken gezoogd en nadien
gespeend. Bij het spenen worden de zeugen gescheiden van hun biggen, waarna de cyclus
opnieuw kan starten (Figuur 13).
Bij een één-wekensysteem wordt er iedere week één groep zeugen geïnsemineerd, wat
betekent dat er op bedrijf C ongeveer 21 groepen van acht zeugen aanwezig zijn. Dit systeem
heeft als voordeel dat er met kleinere groepen gewerkt kan worden, maar het is wel
arbeidsintensiever en vereist vrij veel afdelingen.
Het bedrijf heeft één stal met de kraamafdelingen, de biggenbatterijen en de zeugenstal (=
dekafdeling + drachtstal) en één stal met vleesvarkens in voor- en afmestafdelingen. Eén
week voor het werpen worden de acht zeugen van de drachtstal overgebracht naar de
kraamafdeling, waar ze gewassen worden. Na het werpen verblijven ze in de kraamhokken tot
het spenen, waarna de zeugen verplaatst worden naar de dekafdeling. De biggen blijven in de
kraamstal die op dat moment de biggenbatterij wordt. Ongeveer 10 weken na het werpen
worden de biggen verplaatst naar de voormestafdeling achteraan in de andere stal. Eens ze
circa 40 kg wegen, worden de varkens verhuisd naar de afmestafdeling vooraan in de stal. Na
Figuur 13:Voorstelling van de cyclus van de zeug en het effect
van de cyclus op het één wekensysteem.
MATERIAAL EN METHODEN
30
een zestal maanden bereiken de varkens een gewicht van ongeveer 120 kg en worden ze
afgevoerd naar het slachthuis.
Naast varkens bezit dit bedrijf ongeveer 50.000 braadkippen, die gehuisvest zijn in twee
stallen. Hierin worden de kippen vetgemest tot een leeftijd van zes weken, waarna ze geslacht
worden.
1.2. Beschrijving staalname
Om het moment van MRSA kolonisatie na te gaan, worden de biggen vanaf het werpen
bemonsterd op verschillende tijdstippen (Tabel 8). Tevens worden de zeugen bemonsterd om
na te gaan of hun biggen hetzelfde MRSA type dragen. Van de biggen en de zeugen worden
neusswabs afgenomen aangezien dit een op Europees niveau gestandaardiseerde methode is
(EFSA, 2007). Bovendien is de neus de enige plaats in het lichaam waar er een natuurlijke
spoeling optreedt. Aanwezigheid van MRSA in de neus wijst dus op kolonisatie van de
bacterie en in mindere mate op contaminatie door stof of door de omgeving. Stalen genomen
op andere plaatsen (bijvoorbeeld de huid of het perineum), die in contact zijn met stof en de
omgeving, kunnen door dit contact gecontamineerd zijn met MRSA.
Swabs worden genomen door middel van wattenstaafje, die zich bevinden in een tube met
Mueller-Hinton Broth medium (Oxoid ltd., CM0405, Hampshire, Engeland) aangerijkt met
6,5% NaCl (MHB + 6,5% NaCl). Door de aanwezigheid van het zout gebeurt reeds een eerste
selectie voor MRSA, daar MRSA halofiel is en makkelijker in dit medium zal groeien dan
andere omgevingsbacteriën.
Tabel 8: Overzicht van de staalnames.
STAL TIJDSTIP/LEEFTIJD DIER SOORT STAAL
Kraamstal Voor wassen Zeug Neusswab/Envirospons
Na wassen Zeug Neusswab/Envirospons
3 dagen na werpen Zeug + Big Neusswab
7 dagen na werpen Zeug + Big Neusswab
3 weken na werpen (voor spenen) Zeug + big Neusswab
Biggenbatterij 4 weken na werpen (na spenen) Big Neusswab
5 weken na werpen Big Neusswab
6 weken na werpen Big Neusswab
7 weken na werpen Big Neusswab
8 weken na werpen Big Neusswab
9 weken na werpen Big Neusswab
10 weken na werpen Big Neusswab
Voormest 11 weken na werpen Varken Neusswab
Voor en na het wassen van de zeugen wordt er naast een neusswab ook een huidstaal
afgenomen. Dit gebeurt door middel van een Envirospons (Biotrace International, Bridgend,
Verenigd Koninkrijk), die vooraf bevochtigd werd met 7 ml MHB + 6,5% NaCl om de
opname van bacteriën door de spons te bevorderen.
Om contaminatie uit de omgeving na te gaan worden er stalen van de wand, de vloer en de
lucht genomen in de verschillende stallen. Op die manier kan men ook nagaan of het MRSA
type overeenstemt met de types gevonden in de varkensstalen.
MATERIAAL EN METHODEN
31
De vloer- en wandstalen worden afgenomen met behulp van een Envirosponge en een metalen
rooster. Hierbij wordt er 10 cm² van de vloer en van de wand ter hoogte van de varkens in de
stal afgeveegd.
Per stal worden twee luchtstalen genomen, één van de lucht ter hoogte van het staand varken
en één van de lucht die de stallen verlaat. Luchtstalen worden afgenomen door middel van een
luchtbemonsteringstoestel (Biotest, Hessen, Duitsland), waarin een luchtstrip gebracht wordt.
De luchtstrip wordt vooraf gevuld met Oxacylin Resistance Screening Agar Base (ORSAB)
medium (Oxoid ltd., CM1008, Hampshire, Engeland) dat een supplement bevat dat selectie
geeft voor MRSA (zie Materiaal en methoden paragraaf 1.3). Per staal wordt er gedurende 2
min lucht aangezogen op de luchtstrip, wat overeenkomt met 100 l lucht.
1.3. Verwerking staalname
Na transport naar het labo worden de sponsjes overgebracht in een stomacherzakje en
gewogen. Per gram spons wordt vervolgens 10 g MHB + 6,5% NaCl toegevoegd. Na mengen
wordt per staal een verdunningsreeks aangelegd van 1 g/ml, 0.1 g/ml en 0.01 g/ml in een
falcontube. Deze verdunningsreeks niet gebruikt als semi-kwantificatie maar om zeker te zijn
dat MRSA in de minder verdunde oplossingen niet gemist wordt door aanwezigheid van
andere bacteriën. Samen met de stomacherzakjes met sponsjes en de verdunningsreeks
worden de neusswabs en luchtstrips geïncubeerd bij 37°C gedurende 18 tot 20u.
Van elk staal wordt er na incubatie 1 µl met een entoog uitgeënt op MRSA-ID platen
(bioMérieux, La Balma et Craponne, Frankrijk). Deze platen bevatten een chromogeen
medium dat bij aanwezigheid van MRSA een groene kleur vertoont, wat resulteert in groene
kolonies. Atypische bacteriën kunnen onderscheiden worden door een andere kolonievorm of
–kleur. Het ORSAB medium in de luchtstrips is tevens een chromogeen medium dat blauwe
kolonies geeft. Per luchtstrip worden vier blauwe kolonies opgepikt en uitgeplaat op MRSA-
ID platen.
Alle MRSA-ID platen worden 18 tot 20u geïncubeerd bij 37°C. Na aflezen wordt er per
verdacht staal één kolonie opgepikt en uitgezuiverd op MRSA-ID platen voor verdere
verwerking.
2. VERWERKING VERDACHTE KOLONIES
2.1. DNA extractie
Voor de DNA extractie wordt één verdachte kolonie van de uitzuiveringsplaten overgezet op
Tryptic Soy Agar (TSA) medium (Oxoid ltd., CM0131, Hampshire, Engeland), een universele
bodem. Na 18 tot 20u incubatie bij 37°C wordt één kolonie geresuspendeerd in 45 µl
gedestilleerd water waaraan 5 µl lysostaphine (1 mM) toegevoegd werd. Vervolgens wordt
deze suspensie gedurende 10 min geïncubeerd bij 37°C. Nadien voegt men 5 µl proteïnase K
(2.5 mM) en 150 µl Tris-HCl (0.1 mM) toe. Na incubatie gedurende 10 min bij 60°C wordt
het lysaat 5 min bij 100°C geïncubeerd. Het lysaat wordt vervolgens ingevroren en kan tot één
maand bewaard worden. (Volledig protocol: zie bijlage3)
2.2. Triplex PCR
Om na te gaan of een verdachte kolonie een MRSA isolaat is, wordt er op het lysaat een
triplex PCR uitgevoerd. Bij deze PCR wordt gebruik gemaakt van drie primersets (Tabel 9),
waardoor er detectie gebeurt van drie genen, namelijk het 16S rRNA gen dat specifiek is voor
MATERIAAL EN METHODEN
32
het genus Staphylococcus, het nuc gen dat codeert voor een S. aureus specifiek nuclease en
het mecA gen dat verantwoordelijk is voor de methicillineresistentie.
Tabel 9: Overzicht van de verschillende genen onderzocht in de triplex PCR, de grootte van het
geamplificeerde fragment en de gebruikte primers met hun sequentie.
De PCR mix bevat 2.5 µl 10x PCR buffer, 2 µl MgCl2 (25 mM), 0.25 µl dNTP mix (10 mM),
0.2 µl Goldstar polymerase (5 U/µl), 9.05 µl steriel HPLC water, 1 µl van de mecA primers
en 1.5 µl van de nuc en 16S rRNA primers. Aan deze mix wordt dan 3 µl lysaat toegevoegd.
De gebruikte thermocyclus bestaat uit een initiële denaturatie van 10 min bij 94°C gevolgd
door 30 cycli met 1 min denaturatie bij 94°C, 1 min annealing bij 55°C en 2 min extensie bij
72°C. Tot slot is er een finale extensie van 5 min bij 72°C.
Na PCR wordt 8 µl PCR product gemengd met 2 µl Loading Dye en aangebracht op een 1,5%
Seakem LE agarose gel. Per gel wordt ook één laan geladen met een 1 Kb ladder. Vervolgens
wordt de elektroforese gelopen gedurende 30 min bij 100 V. De bekomen banden op de gel
worden gevisualiseerd met EtBr (25 ml in 250 ml demi water). (Volledig protocol: zie
bijlage 3)
3. SCREENING VAN DE ISOLATEN
3.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse
De screening wordt uitgevoerd door middel van MLVA, waarbij er vier genen, namelijk
SIRU21, ClfA, ClfB en sdrCDE geamplificeerd worden in twee PCR mixen (Tabel 10).
De eerste PCR mix bevat 2.5 µl 10x PCR buffer, 1.3 µl MgCl2 (25 mM), 2.5 µl dNTP mix (10
mM), 0.5 µl Taq polymerase (5 U/µl), 14.16 µl steriel HPLC water, 0.12 µl van de SIRU21
primers, 0.18 µl van de ClfA primers en 0.22 µl van de ClfB primers.
De tweede PCR mix bevat dezelfde volumes voor de 10x PCR buffer, MgCl2 (25 mM), dNTP
mix (10mM) en Taq polymerase (5U/µl) maar 14.96 µl steriel HPLC water en 0.22 µl van de
sdrCDE primers. Tot slot wordt aan elke mix nog 3 µl lysaat toegevoegd.
De gebruikte thermocyclus is voor beide PCR reacties dezelfde en bestaat uit een initiële
denaturatie van 5 min bij 94°C gevolgd door 25 cycli met 30 sec denaturatie bij 94°C, 30 sec
annealing bij 55°C en 1 min extensie bij 72°C. Vervolgens is er een finale extensie van 5 min
bij 72°C.
Nadien worden de reactiemixen samengevoegd en geanalyseerd op een 3130xl Genetic
analyzer van Applied Biosystems, gelokaliseerd op de site Plant 21 van het ILVO. De
resultaten worden verwerkt met behulp van BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-
Martens-Latem, België). De bandenpatronen worden gegenereerd en vervolgens wordt een
GEN GROOTTE PRIMER SEQUENTIE
mecA 533 bp Mec A F 5'-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3'
Mec A R 5'-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3'
nuc 279 bp Nuc F 5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'
Nuc R 5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3'
16S rRNA staph 750 bp 16S rRNA F staph 5'-GTTATTAGGGAAGAACATATGTG-3'
16S rRNA R staph 5'-CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC-3'
MATERIAAL EN METHODEN
33
clustering uitgevoerd door middel van UPGMA clusteringsmethode met Dice vergelijking.
(Volledig protocol: zie bijlage 4)
Tabel 10: Overzicht van de verschillende genen die geamplificeerd worden door middel van
MLVA, de grootte van het geamplificeerde fragment en de gebruikte primers met hun
sequentie.
4. TYPERING VAN DE ISOLATEN
4.1. Multi locus sequentie typering
De geselecteerde stammen werden opgestuurd naar het CODA waar de MLST werd
uitgevoerd.
4.2. spa typering
Zoals bij MLST, werden de geselecteerde stammen opgestuurd naar het CODA waar de spa
typering werd uitgevoerd.
4.3. SCCmec typering
Voor SCCmec typering worden drie PCR’s uitgevoerd. Voor de drie PCR mixen wordt er
gebruik gemaakt van een 25 µM primer concentratie. Een overzicht van de primers, die
gebruikt worden in de drie PCR reacties, wordt gegeven in bijlage 5.
De eerste PCR mix bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Qiagen, Venlo,
Nederland) en 4 µl HPLC water. Van primers Rif4 F3 en Rif4 R9 wordt 0.4 µl toegevoegd.
Het volume van primers Cif2 F2, Cif2 R2, MecA P4, MecA P7, IS431 P4, pUB110 R1, KDP
F1, KDP R1, Dcs F2, Dcs R1, R1F5 F10, R1F5 R13 en pT181 R1 is 0.8 µl. Tot slot wordt er
1.6 µl van de IS431 P4, Meci P2 en Meci P3 primers toegevoegd.
De tweede PCR mix bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Qiagen, Venlo,
Nederland) en 6.3 µl HPLC water. Van primers IVa F, IVa R, IVb F en IVb R wordt 0.4 µl en
van primers ccrB2 F, IVc F en IVc R is 0.8 µl toegevoegd. Een volume van 1.6 µl van de
ccrB2 R, IVd F en IVd R primers wordt toegevoegd, naast een volume van 1.8 µl van de IVg
F, IVg R, IVh F en IVh R primers.
PCR mix drie bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland),
10.4 µl HPLC water en 2 µl van de IVb F en IVb R primers. Daarnaast wordt er van de IVc F
en IVc R primers 1.6 µl en van de V F en V R primers 1.2 µl toegevoegd.
Tot slot wordt 5 µl lysaat aan elke mix toegevoegd.
GEN GROOTTE PRIMER SEQUENTIE
clfA 800-1000 bp clfA F 5'-GATTCTGACCCAGGTTCAGA-3'
clfA R 5'-CTGTATCTGGTAATGGTTCTTT-3'
clfB 1000-1100 bp clfB F 5'-ATGGTGATTCAGCAGTAAATCC-3'
clfB R 5'-CATTATTTGGTGGTGTAACTCTT-3'
SIRU 21 200-300 bp SIRU21 F 5'-AGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'
SIRU21 R 5'-GCTCAAGCACCAAAAGAGGA-3'
sdrCDE 100-200 bp en 800 bp sdrCDE2 F 5'-TTACGGATCATGATGATTTCA-3'
sdrCDE2 R 5'-CAYTACCTGTTTCTGGTAATGCTT-3'
MATERIAAL EN METHODEN
34
De drie PCR reacties doorlopen dezelfde thermocyclus. Deze bestaat uit een initiële
denaturatie van 4 min bij 94°C gevolgd door 35 cycli met 30 sec denaturatie bij 94°C, 30 sec
annealing bij 53°C en 1 min extensie bij 72°C. Er is een finale extensie van 4 min bij 72°C.
Na PCR wordt 8 µl PCR product gemengd met 2 µl Loading Dye en aangebracht op een 1,5%
Seakem LE agarose gel. Per gel wordt ook één laan geladen met een 100 bp ladder
(Invitrogen, Merelbeke, België). Vervolgens wordt de elektroforese gelopen gedurende
45 min bij 100 V. Na visualisatie van de banden met EtBr (25 ml EtBr in 250 ml demi water)
wordt de combinatie van de drie bandenpatronen per staal bekeken om na te gaan welk
SCCmec type aanwezig is (Volledig protocol: zie bijlage 5).
4.4. Pulsed Field Gel Elektroforese
Met de hieronder beschreven methode worden 10 stalen verwerkt. Op dag één worden de
stammen geïnoculeerd op TSA platen en overnacht geïncubeerd bij 37°C.
Op dag twee worden kolonies met behulp van een entnaald van de TSA plaat afgeschraapt en
geresuspendeerd in EET buffer (100mM EDTA, 10 mM EGTA, 10mM Tris HCl, pH 8). De
OD610 nm van deze suspensie wordt gemeten, waarbij de buffer als blanco gebruikt wordt. De
concentratie wordt vervolgens aangepast tot een OD610 nm van 0.9 in EET buffer. Deze
verdunning wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 4°C gedurende 15 min aan 4000 rpm. Het
supernatans wordt verwijderd en het pellet geresuspendeerd in 1 ml EET buffer. Tweehonderd
µl van deze bacteriële suspensie wordt gemengd met 200 µl 2% InCert agarose, waarvan
ongeveer 300 µl in de plughouder gepipeteerd wordt. Intussen wordt de lysebuffer gemaakt
bestaande uit 8.5 ml EET buffer, 0.5 ml lysostaphine (1mg/ml) en 1 ml lysozyme (10 mg/ml)
en verdeeld over kleine falcontubes, waarin de plugs worden gebracht eens ze gestold zijn. Na
incubatie van 4u bij 37°C worden de plugs overgebracht in de deproteïnatie buffer, die bestaat
uit 17 ml EET Buffer, 2 ml proteinase K oplossing (10 mg/ml) en 1 ml SDS (20%).
Vervolgens wordt er overnacht geïncubeerd bij 50°C.
Op de derde dag wordt de deproteïnatie buffer verwijderd en ondergaan de plugs zeven
wasstappen, waar de TE buffer (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) telkens na 30 min
schudden bij 37°C ververst wordt. Vervolgens wordt de restrictie van de plugs uitgevoerd.
Hiervoor wordt aan 100 µl restrictie buffer 30 U BstZI toegevoegd. In dit mengsel worden de
agarose plugs overnacht geïncubeerd bij de 50°C, optimale temperatuur van BstZI.
Salmonella Braenderup kolonies worden opgegroeid en verwerkt tot plugs (zie bijlage 7) om
te gebruiken als merker. Deze plugs worden behandeld met het restrictie-enzym XbaI, dat het
genoom van de S. Braenderup gaat knippen in fragmenten met een gekende lengte.
De volgende dag wordt 2 L 0,5X TBE buffer gemaakt, die gekoeld wordt in de ChefMapper
bij 14°C. Honderdzestig ml van deze buffer wordt gemengd met 1% Seakem Gold agarose.
Na het gieten van 150 ml gel en aanbrengen van de plugs in de slotjes, worden de slotjes
afgesloten met de overige 10 ml agarose.
Vervolgens wordt de elektroforese gestart. Deze loopt gedurende 20 u 18 min bij 14°C met
een initiële pulstijd van 0.46 sec, een finale pulstijd van 35.38 sec en een voltage van
6.0 V/cm.
Na afloop wordt de gel 30 min gekleurd in een EtBr oplossing (80 µl EtBr + 400 µl demi
water). Vervolgens wordt de gel gedurende 30 min ontkleurd in demi water. Verwerking van
de gel gebeurt via BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België),
MATERIAAL EN METHODEN
35
waarin een clustering gemaakt wordt door middel van UPGMA met Dice vergelijking.
(Volledig protocol: zie bijlage 6)
4.5. Antibiogrammen
De resistentie van de geselecteerde MRSA stammen tegen 16 verschillende antibiotica
(Tabel 11) wordt bepaald. Op dag één worden de stammen geïnoculeerd op TSA medium. De
volgende dag worden enkele kolonies gesuspendeerd in een steriele 0,9% NaCl oplossing tot
een suspensie van 0,5 McFarland bereikt wordt. Binnen 15 min wordt met behulp van een
steriel wattenstaafje een massieve uitstrijk gemaakt op een Mueller-Hinton II agar plaat. De
plaat wordt vervolgens kort gedroogd. Sensitabs (Rosco Diagnostica, Taastrup, Denemarken)
worden op de plaat aangebracht met behulp van een dispenser volgens het patroon
weergegeven in bijlage 8. Na 24u incubatie bij 37°C wordt de diameter van de inhibitiezone
rond de sensitabs gemeten.
Tabel 11: Overzicht van de neosensitabs die gebruikt worden in de antibiogrammen met de
waarden van de inhibitiezones, die de sensitiviteit en resistentie aangeven. De waarden worden
weergegeven in mm.
ANTIBIOTICUM SENSITIEF INTERMEDIAIR RESISTENT
Quinupristine/dalfopristine 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15
Trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16
Gentamicine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
Tobramycine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
Kanamycine 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20
Erythromycine 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18
Ciprofloxacine 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16
Tetracycline 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18
Rifampicine 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
Mupirocine 10µg ≥ 14 - ≤ 13
Chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20
Linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20
Fucidine 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23
Sulphonamide 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
Lincomycine 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
Tylosine 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
REFERENTIES
36
VI. REFERENTIES
Amagai M, Matsuyoshi N, Wang ZH, Andl C, Stanley JR (2000) Toxin in bullous impetigo and staphylococcal scalded-skin syndrome targets desmoglein 1. Nat Med 6: 1275-1277 Baba T, Takeuchi F, Kuroda M, Yuzawa H, Aoki K, Oguchi A, Nagai Y, Iwama N, Asano K, Naimi T, Kuroda H, Cui L, Yamamoto K, Hiramatsu K (2002) Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet 359: 1819-1827 Barber M, Rozwadowska-Dowzenko M (1948) Infection by penicillin-resistant staphylococci. Lancet 2: 641-644 Bowersox J (1999) Experimental Staph Vaccine Broadly Protective in Animal Studies. National Institute of Allergy and Infectious Diseases Brock TD, Madigan MT, Martinko JM (2006) Biology of Microorganisms, Eleventh edn. Broens EM (2009). Transmission of MRSA ST398 during transport of pigs from farm to slaughterhouse and during time spent in lairages at the slaughterhouse. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. Chambers HF (2001) The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Infect Dis 7: 178-182 Cuny C, Friedrich A, Kozytska S, Layer F, Nubel U, Ohlsen K, Strommenger B, Walther B, Wieler L, Witte W (2010) Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in different animal species. Int J Med Microbiol 300: 109-117 Daum RS, Ito T, Hiramatsu K, Hussain F, Mongkolrattanothai K, Jamklang M, Boyle-Vavra S (2002) A novel methicillin-resistance cassette in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds. J Infect Dis 186: 1344-1347 de Boer E, Zwartkruis-Nahuis JT, Wit B, Huijsdens XW, de Neeling AJ, Bosch T, van Oosterom RA, Vila A, Heuvelink AE, Food and Consumer Product Safety Authority (VWA) AZ, The Netherlands. [email protected] (2009) Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat. Int J Food Microbiol 134: 52-56 de Neeling AJ, van Den Broek MJM, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, dam-Deisz C, Boshuizen HC, van De Giessen AW, van Duijkeren E, Huijsdens X (2007) High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs. Veterinary mMicrobiology: 366-372 Denis O, Hallin M, deplano A, Struelens MJ, Suetens C, Vanoyen H, Ramboer I, Leens E, Quoilin S (2007) Prevalence survey of methicillin resistant Staphylococcus aureus in swine and pig farmers in Belgium compared to other human population. Verslag voor het Ministerie van volksgezondheid Deurenberg RH, Stobberingh EE (2008) The evolution of Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol 8: 747-763 Dewaele I, De Man I, Stael A, Delputte P, Butaye P, Vlaemynck G, Heyndrickx M, Rasschaert G (2007) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on Belgian pig farms. In Antimicrobial Resistance in Zoonotic Bacteria and Foodborne Pathogens. Tours, Frankrijk EFSA (2007) Report of the Task Force on Zoonoses Data collection on a proposal for technical specifications for a baseline survey on the prevalence of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in breeding pigs. The EFSA Journal: 1-14
REFERENTIES
37
Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci U S A 99: 7687-7692 Etienne J (2005) Panton-Valentine leukocidin: a marker of severity for Staphylococcus aureus infection? Clin Infect Dis 41: 591-593 Grundmann H, Aires-de-Sousa M, Boyce J, Tiemersma E (2006) Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet 368: 874-885 Guardabassi L, Stegger M, Skov R (2007) Retrospective detection of methicillin resistant and susceptible Staphylococcus aureus ST398 in Danish slaughter pigs. Vet Microbiol 122: 384-386 Hakanen AJ, Lehtopolku M, Siitonen A, Huovinen P, Kotilainen P (2003) Multidrug resistance in Campylobacter jejuni strains collected from Finnish patients during 1995-2000. J Antimicrob Chemother 52: 1035-1039 Haven KF (1994) Marvels of Science : 50 Fascinating 5-Minute Reads, Littleton, Colo. Huijsdens XW, Bosch T, van Santen-Verheuvel MG, Spalburg E, Pluister GN, van Luit M, Heck ME, Haenen A, de Neeling AJ (2009) Molecular Characterisation of Pfge Non-Typable Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus in the Netherlands, 2007. Eurosurveillance 14: 12-16 Huijsdens XW, van Dijke BJ, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, Heck ME, Pluister GN, Voss A, Wannet WJ, de Neeling AJ (2006) Community-acquired MRSA and pig-farming. Ann Clin Microbiol Antimicrob 5: 26 Ito T (2009) Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob Agents Chemother 53: 4961-4967 Ito T, Ma XX, Takeuchi F, Okuma K, Yuzawa H, Hiramatsu K (2004) Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC. Antimicrob Agents Chemother 48: 2637-2651 Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K (2003) Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat 6: 41-52 Jarraud S, Mougel C, Thioulouse J, Lina G, Meugnier H, Forey F, Nesme X, Etienne J, Vandenesch F (2002) Relationships between Staphylococcus aureus genetic background, virulence factors, agr groups (alleles), and human disease. Infect Immun 70: 631-641 Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K (2000) A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 44: 1549-1555 Khanna T, Friendship R, Dewey C, Weese JS (2008) Methicillin resistant Staphylococcus aureus colonization in pigs and pig farmers. Vet Microbiol 128: 298-303 Kirby WM (1944) Extraction of a Highly Potent Penicillin Inactivator from Penicillin Resistant Staphylococci. Science 99: 452-453
REFERENTIES
38
Koreen L, Ramaswamy SV, Graviss EA, Naidich S, Musser JM, Kreiswirth BN (2004) spa typing method for discriminating among Staphylococcus aureus isolates: implications for use of a single marker to detect genetic micro- and macrovariation. J Clin Microbiol 42: 792-799 Lehtopolku M, Nakari UM, Kotilainen P, Huovinen P, Siitonen A, Hakanen AJ (2010) Antimicrobial susceptibilities of multidrug-resistant Campylobacter jejuni and C. coli strains: in vitro activities of 20 antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 54: 1232-1236 Leonard FC, Markey BK (2008) Meticillin-resistant Staphylococcus aureus in animals: a review. Vet J 175: 27-36 Lindstedt BA (2005) Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria. Electrophoresis 26: 2567-2582 Lu K, Asano R, Davies J (2004) Antimicrobial resistance gene delivery in animal feeds. Emerg Infect Dis 10: 679-683 Manian FA (2003) Asymptomatic nasal carriage of mupirocin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a pet dog associated with MRSA infection in household contacts. Clin Infect Dis 36: e26-28 Meemken D, Cuny C, Witte W, Eichler U, Staudt R, Blaha T (2008) [Occurrence of MRSA in pigs and in humans involved in pig production-preliminary results of a study in the northwest of Germany]. Dtsch Tierarztl Wochenschr 115: 132-139 Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H (2007) Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 51: 3374-3377 Miller LG, Perdreau-Remington F, Rieg G, Mehdi S, Perlroth J, Bayer AS, Tang AW, Phung TO, Spellberg B (2005) Necrotizing fasciitis caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Los Angeles. N Engl J Med 352: 1445-1453 MMWR (2002a) Staphylococcus aureus resistant to vancomycin. Morbidity and Mortality Weekly Report: 565-567 MMWR (2002b) Public Health Rispatsch: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus. Morbidity and Mortality Weekly Report Morgan M (2008) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and animals: zoonosis or humanosis? J Antimicrob Chemother 62: 1181-1187 Mulders MN, Haenen A, Geenen PL, Poldervaart LE, Bosch T, Huijsdens X, Vesseur PC, Hengeveld PD, Dam-Deisz C, van De Giessen AW (2009). Prevalence of MRSA in dutch broiler slaughterhouses. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. Oliveira DC, de Lencastre H (2002) Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46: 2155-2161 Pomba C, Hasman H, Cavaco LM, da Fonseca JD, Aarestrup FM (2009) First description of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) CC30 and CC398 from swine in Portugal. Int J Antimicrob Agents 34: 193-194 Rasschaert G, Vanderhaeghen W, Dewaele I, Janez N, Huijsdens X, Butaye P, Heyndrickx M (2009) Comparison of fingerprinting methods for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus sequence type 398. J Clin Microbiol 47: 3313-3322
REFERENTIES
39
Raulin O, Durand G, Gillet Y, Bes M, Lina G, Vandenesch F, Floret D, Etienne J, Laurent F (2010) Toxin profiling of Staphylococcus aureus strains involved in varicella superinfection. J Clin Microbiol Scott GM, Thomson R, Malone-Lee J, Ridgway GL (1988) Cross-infection between animals and man: possible feline transmission of Staphylococcus aureus infection in humans? J Hosp Infect 12: 29-34 Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, Smith DH, Waddington M, Dodge DE, Bost DA, Riehman M, Naidich S, Kreiswirth BN (1999) Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 37: 3556-3563 Smith TC, Male MJ, Harper AL, Moritz-Koroloev E, Kroeger JS, Diekema DJ, Herwaldt LA (2008) Isolation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from swine in the Midwestern United States. International Conference on Emerging Infectious Diseases, Atlanta, USA abstract Struelens MJ, Deplano A, Godard C, Maes N, Serruys E (1992) Epidemiologic typing and delineation of genetic relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by macrorestriction analysis of genomic DNA by using pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 30: 2599-2605 Udo EE, Pearman JW, Grubb WB (1993) Genetic analysis of community isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Western Australia. J Hosp Infect 25: 97-108 Unan C, Young R (2007) MRSA in farm animals and meat, A new threat to human health, report 5 in the series 'The use and misuse of antibiotics in UK agriculture'. Soil Association van Cleef BAGL, Broens EM, Voss A, Huijsdens XW, Zuechner L, van Benthem BH, Kluytmans J, Mulders MN, van de giessen AW (2009). High prevalence of MRSA in slughterhouse workers in contact with live pigs. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. van Duijkeren E, Ikawaty R, Broekhuizen-Stins MJ, Jansen MD, Spalburg EC, de Neeling AJ, Allaart JG, van Nes A, Wagenaar JA, Fluit AC (2008) Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains between different kinds of pig farms. Veterinary Microbiology 126: 383-389 van Loo I, Huijsdens X, Tiemersma E, de Neeling A, van de Sande-Bruinsma N, Beaujean D, Voss A, Kluytmans J (2007) Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus of Animal Origin in Humans. Emerging Infectious Diseases 13: 1834 -1839 van Loo I, Tiemersma E, de Neeling H, Huijsdens X, Van den Broek M, van der Giessen A, Beaujean D, Voss A, Kluytmans J (2006). Emergence of a methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone from animal origin in the human population. 12th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections; Maastricht, Nederland. Verhegghe M, Pletinckx LJ, Vandersmissen T, Arijs D, Haesebrouck F, Butaye P, Heyndrickx M, Rasschaert G (2009). Prevalence of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ST398 on Belgian pig farms and pig farms with other livestock. Methicillin-resistant Staphylococci in animal: veterinary and public health implications; London, England. Voss A, Loeffen F, Bakker J, Klaassen C, Wulf M (2005) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig farming. Emerg Infect Dis 11: 1965-1966
REFERENTIES
40
Voyich JM, Otto M, Barun Mathema KRB, Adeline R. Whitney, Diane Welty, R. Daniel Long, David W. Dorward, Donald J. Gardner, Gérard Lina, Barry N. Kreiswirth, and Frank R. DeLeo (2006) Is Panton-Valentine leukocidin the major virulence determinant in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease? The Journal of Infectious Diseases 194: 1761–1770 Willems G, Dispas M, Hallin M, Denis O, Seutens C, Gordts B, Struelens MJ, Butaye P (niet gepubliceerde data) Prevalance, epidemiology and genetic characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among pigs belonging to different age groups and different types of farm management systems in Belgium. Witte W (2004) Glycopeptide resistant Staphylococcus. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 51: 370-373 Wu SW, de Lencastre H, Tomasz A (2001) Recruitment of the mecA gene homologue of Staphylococcus sciuri into a resistance determinant and expression of the resistant phenotype in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 183: 2417-2424 Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Louie T, Conly JM (2005) Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 43: 5026-5033
BIJLAGEN
i
BIJLAGEN
BIJLAGEN
ii
1. BANDENPATRONEN SCCMEC TYPERING OP GESELECTEERDE STALEN
GEL 1: GEL 2:
Primerset 1: Primerset 1:
Primerset 2: Primerset 2:
Primerset 3: Primerset 3:
BIJLAGEN
iii
GEL 3:
Primerset 1: Primerset 2: Primerset 3:
Geloverzicht:
GEL 1
100 bp 1481 1874 1984 2839 3056 1482 1875 1985
2840 3057 1551 1943 2045 2898 3181 1733 1958
2057 2910 2626 1480 1873 1546
GEL 2
100 bp 1939 1725 1948 2612 2624 2659 2677 2614
3193 2663 2678 2619 2631 2674 2690 1556 1959
2066 2949 3169 1567 1971 2078
GEL 3
100 bp 2961 3330 1870 1975 1979 2082 2965 3336
MV26 MV172 NEG
BIJLAGEN
iv
2. AFLEESRESULTATEN VAN DE ANTIBIOGRAMMEN
Stam CLR CIP ERYTR FUCID GEN KANAM LINCO LINEZ MUPIR SYN RIFAM SULFA TET TOBRA TRIME TYLOS
1481 31 0 32 35 28 30 34 30 29 24 36 29 0 28 0 28
1874 35 0 33 35 28 30 30 28 26 23 35 31 12 31 0 27
1984 33 0 33 35 28 30 32 30 26 23 34 27 0 30 0 27
2839 35 0 33 37 28 28 30 29 25 24 37 26 12 29 0 27
3056 31 0 33 35 29 30 32 28 25 24 36 26 12 30 0 28
1482 31 0 32 40 26 29 29 26 25 23 35 27 0 26 0 27
1875 35 0 35 35 31 34 35 32 28 26 37 27 12 32 0 32
1985 32 0 34 35 30 31 35 30 28 24 37 27 11 32 0 28
2840 32 0 33 33 28 30 30 30 26 24 37 25 12 28 0 30
3057 32 0 30 35 27 30 30 29 26 26 37 30 11 28 0 27
1551 31 0 30 32 27 30 30 28 28 23 35 28 11 28 0 26
1943 33 0 30 34 29 28 30 30 27 24 36 30 12 28 0 26
2045 32 0 32 32 30 31 30 27 26 25 37 27 0 30 0 28
2898 32 0 32 34 28 31 32 30 27 24 38 26 0 31 0 29
3181 32 0 34 36 31 31 30 32 27 21 40 26 13 32 0 32
1733 31 0 30 34 27 27 30 27 30 26 35 26 11 28 0 28
1958 32 0 31 36 29 29 30 30 26 27 36 26 11 30 0 29
2057 31 0 32 34 30 29 34 36 27 26 38 27 12 30 0 33
2910 32 0 36 38 30 31 36 34 30 26 38 28 13 34 0 30
3193 31 0 32 36 29 30 32 29 28 27 37 25 12 32 0 30
1480 30 0 30 30 27 30 30 28 28 27 35 30 11 28 0 26
1873 32 0 33 35 29 29 30 30 25 25 37 28 11 29 0 28
1546 33 0 31 38 29 31 30 30 27 25 37 30 11 29 0 28
1939 33 0 32 35 29 31 30 30 28 24 39 32 11 30 0 28
1725 33 0 32 36 30 30 32 32 27 26 38 28 11 30 0 29
1948 31 0 33 38 27 29 31 30 26 25 37 26 12 29 0 28
2612 30 0 31 34 29 29 32 28 27 25 36 27 11 29 0 27
BIJLAGEN
v
2624 31 0 32 36 30 31 31 28 26 25 37 28 0 30 0 27
2659 32 11 30 36 30 31 32 28 28 25 40 30 11 30 0 28
2677 29 0 32 40 27 30 30 26 28 26 36 26 0 28 0 28
2614 32 0 27 33 28 29 30 29 26 25 37 29 11 28 0 28
2626 34 12 33 35 31 33 33 32 28 25 38 26 12 32 0 30
2663 34 0 34 32 30 31 28 30 27 27 40 27 12 31 0 28
2678 28 0 30 35 28 30 29 30 26 25 36 29 11 29 0 29
2619 31 0 32 35 29 31 30 28 29 25 36 30 0 30 0 29
2631 35 30 36 30 30 32 24 31 21 21 40 33 18 32 0 32
2674 31 0 36 34 29 30 18 32 27 20 38 30 11 29 0 32
2690 33 0 35 34 31 31 32 36 29 27 40 29 11 31 0 30
1556 33 0 33 30 29 29 32 30 26 22 38 28 0 27 0 29
1959 30 0 32 34 30 31 32 28 25 25 36 24 12 29 0 28
2066 30 0 30 40 28 30 30 30 27 25 35 30 0 30 0 30
2949 30 0 25 30 27 28 30 30 27 36 35 25 0 30 0 30
3169 25 0 30 30 25 30 30 30 25 25 35 25 0 30 0 30
1567 30 0 30 35 30 30 27 30 25 25 35 30 0 30 0 30
1971 36 0 30 30 30 30 30 34 30 25 40 30 0 30 0 30
2078 30 0 30 40 30 30 30 34 30 25 40 30 0 30 0 30
2961 30 0 30 30 28 30 30 30 30 25 40 25 10 30 0 30
3330 30 0 34 34 30 28 18 30 28 21 35 25 10 30 0 30
1570 30 0 34 40 30 32 30 30 25 26 40 30 0 30 0 30
1975 30 0 30 40 30 32 26 30 30 25 40 26 0 30 0 28
1979 40 0 32 35 30 30 18 30 30 20 44 30 0 30 0 30
2082 36 0 31 34 30 30 31 30 26 25 40 28 0 30 0 24
2965 30 0 30 30 30 30 30 30 30 26 40 25 0 30 0 30 3336 40 25 0 34 34 30 0 34 0 17 50 29 18 25 0 0
BIJLAGEN
vi
Legende bij de afleesresultaten van de antibiogrammen:
Sensitief
Intermediair Resistent
CLR Chloramphenicol
CIP Cirprofloxacine
ERYTR Erythromycine
FUCID Fucidine
GEN Gentamicine
KANAM Kanamycine
LINCO Lincomycine
LINEZ Linezolid
MUPIR Mupirocine
SYN Quinupristine/dalfopristine
RIFAM Rifampicine
SULFA Sulphonamide
TET Tetracycline
TOBRA Tobramycine
TRIME Trimethoprim
TYLOS Tylosine
BIJLAGEN
vii
3. DNA EXTRACTIE EN TRIPLEX PCR MECA/ NUC/ 16S RRNA
Maes N. et al, Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from
coagulase-negative staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures,
Journal of Clinical Microbiology (2002); 40 (4) p 1514-1517.
DNA extractie
Oplossingen:
- Lysostaphine (Sigma; cat.nr L7386): 1 mg/ml
- Proteïnase K: 2,5 mg/ml in gedestilleerd water
- 0,1 M Tris-HCl (pH 8)
Werkwijze:
- Resuspendeer een kolonie in 45 µl gedestilleerd water +
5 µl lysostaphine (werk op ijs)
- Incubeer 10 min bij 37°C
- + 5 µl proteïnase K + 150 µl Tris-HCl
- Incubeer 10 min bij 60°C
- Incubeer 5 min bij 100°C
- Invriezen (max 1 maand houdbaar)
Primer sequenties
MecA 1 5’- AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC –3’
MecA 2 5’- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC –3’
Nuc 1 5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT –3’
Nuc 2 5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC –3’
16S rRNA 1 staph 5’- GTTATTAGGGAAGAACATATGTG –3’
16S rRNA 2 staph 5’- CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC –3’
PCR mix (25 µl)
* 10x PCR buffer 2,5 µl
* mecA1 (10 µM) 1 µl
* mecA2 (10 µM) 1 µl
* nuc1 (10 µM) 1 µl
* nuc2 (10 µM) 1 µl
* 16S rRNA1 staph (10 µM) 1,5 µl
* 16S rRNA2 staph (10 µM) 1,5 µl
* dNTP mix (10 mM) 0,25 µl
* MgCl2 (25 mM) 2 µl
BIJLAGEN
viii
* Goldstar polymerase (5u/µl) 0,2 µl
* HPLC water 10,05 µl
* lysaat 3 µl
PCR programma
10 min 94°C 1x
1 min 94°C
1 min 51°C 30x
2 min 72°C
5 min 72°C 1x
15°C ∞
Analyse van de resultaten
1,5% Seakem LE agarose gel
Analyse van de resultaten
MRSA MSSA
nuc (279 bp) + +
mecA (533 bp) + -
16S rRNA staph (750 bp) + +
BIJLAGEN
ix
4. MLVA
Dit protocol wordt uitgevoerd op lysaten. Aan elke mix wordt er 3 µl lysaat toegevoegd.
(Indien er veel stalen zijn, wordt er gebruik gemaakt van PCR platen ipv epjes)
MIX 1 MIX 2
Voor 1 staal (µl) Voor 1 staal (µl)
10x PCR buffer 2.5 10x PCR buffer 2.5
MgCl2 (25mM) 1.3 MgCl2 (25mM) 1.3
dNTP mix (10mM) 2.5 dNTP mix (10mM) 2.5
Taq polymerase (5u/µl) 0.5 Taq polymerase (5u/µl) 0.5
HPLC water 14.16 HPLC water 14.96
SIRU21 F (10µM) 0.12 sdrCDE F (10µM) 0.22
SIRU21 R (10µM) 0.12 sdrCDE R (10µM) 0.22
ClfA F (10µM) 0.18
ClfA R (10µM) 0.18 Totaal: 22µl
ClfB F (10µM) 0.22
ClfB R (10µM) 0.22
Totaal: 22µl
PCR reactie: MLVA-MRSA
Hold 94°C 5:00
Cycle 94°C 00:30
58°C 00:30
72°c 1:00
For 25 cycles
Hold 72°C 5:00
Hold 15°C
Na de PCR reactie worden beide mixen met elkaar gemengd en opgestuurd naar Plant 21 voor
fragmentanalyse.
Primers:
clfA F-MV forward GATTCTGACCCAGGTTCAGA 6-FAM label op 5’
clfA R-MV reverse CTGTATCTGGTAATGGTTCTTT
clfB F-MV forward ATGGTGATTCAGCAGTAAATCC 6-FAM label op 5’
clfB R-MV reverse CATTATTTGGTGGTGTAACTCTT
SIRU21 F-MV forward AGCAGTAGTGCCGTTTGCTT 6-FAM label op 5’
SIRU21 R-MV reverse GCTCAAGCACCAAAAGAGGA
sdrCDE2 F-MV forward TTACGGATCATGATGATTTCA 6-FAM label op 5’
sdrCDE2 R-MV reverse CAYTACCTGTTTCTGGTAATGCTT
BIJLAGEN
x
5. SCCMEC TYPERING
Mix for PCR:
Onderscheid tussen types I, Ia, II, III, IIIa, IIIb en IV
25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)
4 µl HPLC water
0.4 µl van de Rif4 F3 (25 µM) en Rif4 R9 (25 µM) primers
0.8 µl van de Cif2 F2 (25 µM), Cif2 R2 (25 µM), MecA P4 (25 µM), MecA P7 (25
µM), IS431 P4 (25 µM), pUB110 R1 (25 µM), KDP F1 (25 µM), KDP R1 (25 µM),
Dcs F2 (25 µM), Dcs R1 (25 µM), R1F5 F10 (25 µM), R1F5 R13 (25 µM) en pT181
R1 (25 µM) primers
1.6 µl van de IS431 P4 (25 µM), Meci P2 (25 µM) en Meci P3 (25 µM) primers
5 µl DNA
(Oliveira & de Lencastre, 2002)
Onderscheid tussen types IVa – IVh
25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)
6.3 µl HPLC water
0,4 µl van de IVa F (25 µM), IVa R (25 µM), IVb F (25 µM) en IVb R (25 µM)
primers
0.8 µl van de ccrB2 F (25 µM), IVc F (25 µM) en IVc R (25 µM) primers
1.6 µl van de ccrB2 R (25 µM), IVd F (25 µM) en IVd R (25 µM) primers
1.8 µl van de IVg F (25 µM), IVg R (25 µM), IVh F (25 µM) en IVh R (25 µM)
primers
5 µl DNA
(Milheirico et al, 2007)
Type V & bevestiging types IVb + IVc
25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)
10,4 µl HPLC water
2 µl van de IVb F (25 µM) en IVb R (25 µM) primers
1.6 µl van de IVc F (25 µM) en IVc R (25 µM) primers
1.2 µl van de V F (25 µM) en V R (25 µM) primers
5 µl DNA
(Zhang et al, 2005)
PCR conditions
Denat.: 4 min → 94°C
30 s → 94°C
35 x 30 s → 53°C
1 min → 72°C
Final ext.: 4 min → 72°C
Hold: ∞ → 4°C
BIJLAGEN
xi
PRIMER SEQUENTIE PRIMER SEQUENTIE
Rif4-F3 5'-GTGATTGTTCGAGATATGTGG-3' J IVa F 5'-ATAAGAGATCGAACAGAAGC-3'
Rif4-R9 5'-CGCTTTATCTGTATCTATCGC-3' J IVa R 5'-TGAAGAAATCATGCCTATCG-3'
Cif2-F2 5'-TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG-3' J IVb F 5'-TTGCTCATTTCAGTCTTACC-3'
Cif2-R2 5'-ATTTACCACAAGGACTACCAGC-3' J IVb R 5'-TTACTTCAGCTGCATTAAGC-3'
MecA-P4 5'-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3' J IVc F 5'-CCATTGCAAATTTCTCTTCC-3'
MecA-P7 5'-CCACTTCATATCTTGTAACG-3' J IVc R 5'-ATAGATTCTACTGCAAGTCC-3'
IS431-P4 5'-CAGGTCTCTTCAGATCTACG-3' ccrB2 F 5'-CGAACGTAATAACATTGTCG-3'
pUB110-R1 5'-GAGCCATAAACACCAATAGCC-3' ccrB2 R 5'-TTGGCWATTTTACGATAGCC-3'
KDP-F1 5'-AATCATCTGCCATTGGTGATGC-3' J IVd F 5'-TCTCGACTGTTTGCAATAGG-3'
KDP-R1 5'-CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG-3' J IVd R 5'-CAATCATCTAGTTGGATACG-3'
Dcs-F2 5'-CATCCTATGATAGCTTGGTC-3' Type IVb F 5'-TCTGGAATTACTTCAGCTGC-3'
Dcs-R1 5'-CTAAATCATAGCCATGACCG-3' Type IVb R 5'-AAACAATATTGCTCTCCCTC-3'
R1F5-F10 5'-TTCTTAAGTACACGCTGAATCG-3' Type IVc F 5'-ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC-3'
R1F5-R13 5'-GTCACAGTAATTCCATCAATGC-3' Type IVc R 5'-TTGGTATGAGGTATTGCTGG-3'
pT181-R1 5'-GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC-3' Type V F 5'-GAACATTGTTACTTAAATGAGCG-3'
Meci-P2 5'-ATCAAGACTTGCATTCAGGC-3' Type V R 5'-TGAAAGTTGTACCCTTGACACC-3'
Meci-P3 5'-GCGGTTTCAATTCACTTGTC-3'
BIJLAGEN
xii
6. PFGE STAPHYLOCOCCUS AUREUS FOR 10 PLUGS
DAY 1
Inoculate S. aureus on TSA plates and incubate at 37°C overnight (O/N).
DAY 2
Preparations
Prepare EET Buffer (100mM EDTA, 10 mM EGTA, 10mM Tris HCl, pH 8) as follows:
a. 100 ml of 0.5 M EDTA, pH 8
b. 10 ml of 0.5 M EGTA, pH 8
c. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8
d. Dilute to 500 ml with sterile UP water
Prepare 2% InCert Agarose in EET Buffer for plugs as follows:
a. Weigh 100 mg of agarose and add 5 ml of EET Buffer
b. Melt agarose in tube in cup of water in microwave. Do not overheat.
Rem. Keep agarose in warm water 50°C until use. If not used all, you can reuse it 2-3 times (keep at room
temperature)
Making of plugs
Suspend bacterial colonies in 3 ml EET buffer
Measure OD610 nm (EET buffer is blanc)
Adjust concentration to OD610 nm 0.9 in 1 ml EET buffer
(for example: if OD is 3.6, then x= (1 x 0.9)/3.6= 0.5 ml of bacterial suspension to 0.5 ml EET buffer)
Centrifuge at 4°C for for 15 min at 4000 rpm
Discard supernatans and resuspend pellet in 1 ml EET buffer
Mix 200 µl of this bacterial Suspension with 200 µl InCert agarose.
Mix well and bring it in the wells of the plug holder (washed with javel and ethanol)
Allow plugs to solidify for 15 min. in fridge
Prepare Lysis Buffer (EET buffer, lysostaphine, lysozyme)
8.5 ml of EET buffer
0.5 ml of lysostaphine (stock 1mg/ml)
1 ml of lysozyme (stock 10 mg/ml)
Add to small tubes 1 ml of this lysis buffer
After solidification, bring the plugs in the tubes
Incubate for 4 hours at 37°C.
BIJLAGEN
xiii
During these hours prepare the Deproteinisation Buffer (EET Buffer, Proteinase K, SDS)
can be prepared as follows:
a. 17 ml of EET Buffer
b. 2 ml of Proteinase K solution (10 mg/ml)
c. 1 ml of SDS (20%)
Add 2 ml of the deproteinisation buffer to the bigger tubes
Transfer agarose plugs to these tubes
Incubate overnight in incubator at 50° C
Rem. Incubation time may vary between 2h to 3 days.
DAY 3
Washing of plugs
Prepare TE Buffer (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) as follows:
a. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8
b. 1 ml of 0.5 M EDTA, pH 8
c. Dilute to 500 ml with sterile ultrapure water
Discard carefully Deproteinisation Buffer
Add 2 ml of TE Buffer and shake the tubes at 37°C in warm water bath for minimum
30 min
Pour off TE Buffer and repeat previous step six more times
The last time, add 5 ml TE Buffer to the plugs. These plugs can be stored in the fridge
DAY 3 OR OTHER DAY
Restriction digestion
Add 30 U restriction enzyme to 100 µl Restriction Buffer
Incubate in water bath overnight at appropriate temperature
Do not forget S. Braenderup as marker (XbaI)
DAY 4
Make 2 L 0.5 x TBE
Prepare 160 ml of a 1% Seakem Gold agarose gel using 0.5 x TBE. Use 150 ml to pour
the gel. Keep the other 10 ml in a warm water bath.
Prechill the rest of the TBE buffer (1840 ml) in the ChefMapper at 4°C.
Load the gel, pour the 10 ml agarose over the gel.
Start the electrophoresis:
BIJLAGEN
xiv
o Auto-algoritm
o xK low-xK high,
o calibration 1%
o 0.5 x TBE
o 14°C
o 1% PFGE agarose
o gradient 6.0V/cm
o included angle: 120°
o run time: xx
o switch time: x to x
LOW -HIGH RUN TIME SWITCH TIME
XmaI 30K-700K 18h 2.63s-63.8s
ApaI 5K-200K 16h 0.22s-17.33s
EagI (BstZI) 10K-400K 20.18h 0.46s-35.38s
SacII 10K-500K 20.18h 0.46s-44.69s
Stain 30 min in 80 ul EtBr in 400 ul water
Destain 30 min in water
BIJLAGEN
xv
7. PFGE PROTOCOL VOOR SALMONELLA
Dag 1: Opgroeien isolaten
Zuivere stammen streepenten op TSA, overnacht incuberen bij 37°C.
Dag 2: Plugs maken en lyseren
> Voorbereiding
- spectrofotometer aan
- schudbad op 54°C
- wwb op 50°C
> Maak 1% Seakem Gold: 1% SDS
- weeg 0.25g SKG af en los op in 23.5 ml TE buffer
- voldoende opkoken en in 50°C bad plaatsen
- voor gebruik 1.25 ml 20% SDS (voorverwarmd tot 55°C) toevoegen en mengen
> Celsuspensies maken
-zuiverheid stammen controleren
-label potjes met stamnummers en breng in elk 5 ml Cel Suspensie Buffer
-zeker op ijs werken zolang je OD’s meet!
-voeg voldoende cellen toe met een steriele swab en vortex goed
-meet OD’s aan 610 nm (~800 µl in cuvet)
-voeg cellen toe indien OD < 1.35 + meet opnieuw
-bereken verdunningsfactoren om OD 1.35 (tussen 1.3-1.4) te bekomen (Excel)
-500 µl celsuspensie overbrengen in 2 ml epje en verdunnen met x µl CSB volgens
berekening
> Plugs gieten
- wanneer alle celsuspensies op correcte OD: op kamertemperatuur plaatsen
- plughouder labelen
- breng 400 µl van elke celsuspensie in een gelabeld epje
- voeg 20 µl proteinase K (20 mg/ml) toe en meng met pipet
- haal 1%SKG:1%SDS uit wwb en zet in beker met warm water
- voeg 400 µl agarose-oplossing toe, (snel) opmengen met pipetpunt en overbrengen
in plughouder
- laat de plugs 5 min stollen bij 4°C of op kamertemperatuur (15 min)
> Cellyse in plugs
- mix maken: voor elk staal 5 ml Cel Lyse Buffer en 25 µl proteinase K (20 mg/ml)
(voor 20 plugs: 105 ml CLB + 525 µl prot K)
- 5 ml CLB:prot K uitverdelen per staal in 50 ml falcons
- open plughouder en breng plugs in juiste falcon
- plaats rek met falcons in schudbad (150-175 rpm) bij 54°C en incubeer 2 uur
BIJLAGEN
xvi
> Wassen plugs
- warm voldoende steriel dH2O en TE buffer op in wwb 50°C voor de wasstappen
- verlaag de temperatuur van het schudbad naar 50°C
- verwijder CLB:prot K uit de falcons door afgieten met behulp van groene filterdoppen (zo
goed
mogelijk alles verwijderen-doekje!)
2x wassen met dH2O:
- voeg 10 ml voorverwarmd dH2O toe aan elke falcon en incubeer 10 min in schudbad
- giet dH2O af en was nogmaals 10 min in schudbad met dH2O
4x wassen met TE buffer:
- giet dH2O af, voeg 10 ml steriel TE buffer toe en incubeer 10 min in schudbad
- giet TE buffer af en voeg 10 ml verse toe
- incubeer opnieuw 10 min bij 50°C in schudbad
- was de plugs op deze manier 4x
- breng de plugs over in nieuwe 15 ml falcons met 5 ml TE buffer en bewaar ze bij 4°C
Dag x: DNA restrictie in plugs
> Voorbereiding
- wwb bij 37°C klaarzetten
> Pre-restrictiestap
- label 1.5 ml epjes voor je stammen en standaarden (MB 3389 Salmonella ser. Braenderup
H9812)
- verdun voldoende 10x H buffer 1:10 met HPLC en verdeel 200 µl uit per stam
- snij een stukje van ~ 2 mm breed van elke plug met een spatel en breng over in de epjes
met 10x verdunde restrictiebuffer
- zorg dat de rest van de plug terug in de TE buffer zit!
- incubeer 10 min bij 37°C
- verwijder voorzichtig buffer met pipet
> Restrictie DNA
- verdun 10x H buffer 1:10 met HPLC en voeg XbaI enzyme toe (50 U/plug) voor alle stalen
volgens volgende tabel:
Reagentia µl/plug
HPLC 175
H buffer 20
XbaI (10 U/µl) 5
Totaal volume 200
BIJLAGEN
xvii
- voeg 200 µl toe aan elk epje met plug
- incubeer overnacht bij 37°C
Dag x+1: PFGE gels lopen
> PFGE gels gieten
- voldoende 0.5x TBE buffer maken voor gels en electroferesebakken door 10x TBE buffer
20x te
verdunnen (2 l per gel)
- maak 160 ml 1% SeaKem Gold Agarose in 0.5x TBE (1.6 g in 160 ml) en plaats in wwb bij
50°C
om af te koelen, haal er 10 ml en plaats in 50 ml buis in wwb bij 50°C (voor vullen Wells)
- giet de gel
- laat de gel minstens 30 min stollen voor het laden
- giet ondertussen 2l 0.5x TBE in de electroforesekamer en zet koeling (14°C), CHEF mapper
en
pomp aan (bij 70)
> PFGE gels laden
- laad de plugs in de wells mbv een spatel en vul ze op met het restje 1% SKG agarose en laat
5
min stollen
- haal de gel uit de gietvorm, verwijder goed alle overtollige agarose en plaats het platform
met
de gel in de electroforesekamer
> Electroforese
- CHEF mapper instellen: Auto Algorithm
30 kb – low MW
600 kb – high MW
Initial switch time 2.16 s
Final switch time 54.17 s
Run time 19 h
- start electroforese in de namiddag en loop de gel overnacht
Dag x+2: Kleuren en opname van PFGE gels
- kleur de gel 30 min in 400 ml dH2O met 40 µl ethidium bromide (mag max. 5x hergebruikt
worden)
- ontkleur de gel in 500 ml dH2O gedurende 1 uur, ververs dH2O om de 20 min
- maak een digitale foto van de gel en print af
- bewaar zeker de originele opname!
- converteer de opname ook naar een .tif file voor latere verwerking in BioNumerics (beide
formaten met dezelfde naam opslaan en datum vermelden!)
BIJLAGEN
xviii
8. ANTIBIOGRAM MRSA
Benodigdheden:
Dispenser (ref 8577502)
Neo-sensitabs
Ref Antibioticum Sensitief Intermediair Resistent
8571379 quinupristin/dalfopristin 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15
8571710 trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16
8570665 gentamicin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
8571696 tobramycin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
8570797 kanamycin 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20
8570576 erythromycin 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18
8570420 ciprofloxacin 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16
8571637 tetracyclin 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18
8571459 rifampicin 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
8570983 mupirocin 10µg ≥ 14 - ≤ 13
8570390 chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20
8570861 linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20
8570614 fucidin 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23
8571556 sulphonamides 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19
8570843 lincomycin 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
8571726 tylosin 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22
Mueller Hinton II Agar platen
Steriele swabs
Flesjes met 5 ml 0.9% NaCl-oplossing
Methode:
Dag 1
1 MRSA kolonie (MRSA-ID) uitstrijken op TSA
Dag 2
Mueller Hinton platen eventueel laten drogen
Van TSA enkele kolonies in 0.9% NaCl opsossing suspenderen tot 0.5 McFarland
Binnen 15 min een wattenstaafje in de oplossing brengen en op de plaat strijken en de platen
minimum 3 en maximum 15 minuten laten drogen
Tabs aanbrengen met de dispenser
Overnacht incuberen bij 37°C (24u !!!)
Dag 3
Diameters meten met een lat
BIJLAGEN
xix
Locatie tabs:
! Lincomycine, erythromycine en tylosine in een driehoek naast elkaar plaatsen (synergisme)
Antibiogram 1
Antibiogram 2
Antibiogram 3
Quinu/Dalfo
Tetra
Cipro
Tobra
Kana
Genta
Trimetho
Line
Fuc
Tylo
Linco
Sulpho
Erythro
Chlor
Mupi
Rifamp