STUDIE VAN DE INFLAMMATIE EN

MORFOLOGISCHE VERANDERINGEN

GEASSOCIEERD MET INTRADUCTALE

BORSTTUMORPROGRESSIE IN NF-ΚB

REPORTER MUIZEN

Aantal woorden: ±16 500

NIELS VANDER ELST

Studentennummer: 01203388

Promotor: Prof. dr. Evelyne Meyer

Promotor: Jonas Steenbrugge

Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde

Academiejaar: 2017 – 2018

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid

of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen

inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid

voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef

VOORWOORD

Via deze weg wil ik graag mijn dank betuigen aan iedereen die op één of andere manier betrokken is

geweest bij mijn Masterproef II van het academiejaar 2017-2018. Dit is in de eerste plaats Jonas

Steenbrugge, een PhD-student van de vakgroep Farmacologie, Toxicologie en Biochemie (Faculteit

Diergeneeskunde, Universiteit Gent), die mij dagelijks begeleidde bij het uitvoeren van de experimenten en

het schrijven van dit werk. Zijn overtuiging en enthousiasme om een goed en betrouwbaar muismodel voor

borstkankeronderzoek te ontwikkelen hebben mij steeds opnieuw weten te motiveren. Daarnaast wil ik

graag Prof. dr. Evelyne Meyer bedanken, omdat zij steeds heeft gezorgd voor de nodige begeleiding en

ondersteuning. Zonder haar geduld en expertise zou het niet mogelijk geweest zijn om deze Masterproef II

tot een goed einde te brengen. Ten slotte wil ik ook graag Kristel Demeyere bedanken, omdat ook zij altijd

voor mij klaar stond indien ik prangende vragen had. Haar kennis en expertise aangaande flowcytometrie,

alsook de hulp die zij bood tijdens verschillende experimenten, hebben een grote meerwaarde betekend in

deze Masterproef II.

Daarnaast wil ook nog graag alle partners bedanken die op één of andere manier hebben bijgedragen tot

mijn onderzoek en het ontstaan van deze Masterproef II. Het intraductaal Py230 muismodel kadert in een

groter project waarin wordt gezocht naar een betrouwbaar diermodel voor borstkankeronderzoek. In dit

project zijn naast de Faculteit Diergeneeskunde van de Universiteit Gent, ook Kom Op Tegen Kanker en de

Universiteit Antwerpen betrokken. Daarnaast wil ik ook het Laboratorium voor Experimenteel

Kankeronderzoek van het UZ Gent bedanken, omdat zij zo vrij waren om mij gebruik te laten maken van de

nodige apparatuur voor het immunohistochemisch aankleuren van verschillende coupes.

INHOUDSOPGAVE

DEEL A : LITERATUURSTUDIE

1. INLEIDING ................................................................................................................................................ 8

1.1. Kanker in België ..................................................................................................................................... 8

1.1.1. Incidentie ...................................................................................................................................... 8

1.1.2. Borstkanker in cijfers .................................................................................................................... 8

1.2. De tumorgenese .................................................................................................................................... 9

1.3. De verschillende types borsttumoren ................................................................................................... 9

1.3.1. Het ductaal carcinoom in situ (DCIS) en het invasief ductaal carcinoom (IDC) .......................... 10

1.3.2. Het lobulair carcinoom in situ (LCIS) en het invasief lobulair carcinoom (ILC) ........................... 10

1.4. Tripel negatieve borsttumoren ........................................................................................................... 10

1.5. De genen BRCA-1 en BRCA-2............................................................................................................... 10

1.6. De voornaamste risicofactoren van borstkanker ................................................................................ 11

1.7. Mammatumoren bij de teef ................................................................................................................ 12

2. HET TUMORALE MICROMILIEU .............................................................................................................. 13

2.1. Drie stromale componenten met samen acht sleutelfuncties ............................................................ 13

2.1.1. Stimuleren van celdeling en -groei (tumorpromotie) ................................................................ 14

2.1.2. Ongevoeligheid voor antigroeifactoren ..................................................................................... 14

2.1.3. Resistentie aan celdood ............................................................................................................. 14

2.1.4. Replicative immortaliteit ............................................................................................................ 14

2.1.5. Angiogenese ............................................................................................................................... 15

2.1.6. Invasie en metastase .................................................................................................................. 15

2.1.7. Destructie door immuuncellen vermijden (immuno-evasie) ..................................................... 15

2.1.8. Modificatie van het cellulair metabolisme ................................................................................. 15

2.2. Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma ....................................................................... 16

2.2.1. TNF-α .......................................................................................................................................... 16

2.2.2. IL-6 .............................................................................................................................................. 16

2.2.3. IL-10 ............................................................................................................................................ 16

2.2.4. TGF-β .......................................................................................................................................... 16

2.2.5. CCL2 (MCP-1) .............................................................................................................................. 17

2.2.6. BAFF ............................................................................................................................................ 17

2.2.7. IL-1β ............................................................................................................................................ 17

2.2.8. MIP-2 (CXCL2) ............................................................................................................................. 18

2.3. Conclusie ............................................................................................................................................. 18

3. DE LINK TUSSEN NF-κB, INFLAMMATIE EN KANKER ............................................................................... 19

3.1. Van DNA tot homo- of heterodimeer ................................................................................................. 19

3.2. De verschillende pathways voor activatie van NF-κB ......................................................................... 21

3.3. De relatie van NF-κB met inflammatie en kanker ............................................................................... 22

3.3.1. Direct effect van NF-κB op tumorvorming ................................................................................. 23

3.3.2. Indirect effect van NF-κB op tumorvorming ............................................................................... 23

3.3.3. De mogelijkheden van NF-κB in antitumorale therapieën ......................................................... 23

4. HET BORSTKANKER MUISMODEL ........................................................................................................... 24

4.1. De Py230 tumorcellijn ......................................................................................................................... 24

4.2. Het intraductaal muismodel ............................................................................................................... 25

4.3. Conclusie en toekomstvisie ................................................................................................................. 26

5. METEN VAN INFLAMMATIE VIA BIOLUMINESCENTIE ............................................................................. 27

5.1. Bioluminescentie in muismodellen ..................................................................................................... 27

5.2. Meting van bioluminescentie .............................................................................................................. 28

5.3. Factoren die de bioluminescente beeldvorming beïnvloeden ............................................................ 28

6. DE ROL VAN MMP-9, VEGF, CHI3L1 EN LCN2 OP DE TUMORGENESE ...................................................... 29

6.1. Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9) ................................................................................................... 29

6.2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) ......................................................................................... 29

6.3. Chitinase 3-like 1 (CH3L1) ................................................................................................................... 30

6.4. Lipocaline 2 (LCN-2) ............................................................................................................................ 30

DEEL B : EXPERIMENTEN

1. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................................................. 31

1.2. Cultuur van Py230 mammatumorcellen ............................................................................................. 31

1.3. Selectie van NF-κB Luc+ transgene muizen ......................................................................................... 31

1.4. Intraductale injectie van Py230 mammatumorcellen in de melkklier ................................................ 31

1.5. Analyse van primaire tumorgroei en geassocieerde lokale en systemische veranderingen .............. 32

1.6. Histologische evaluatie van primaire mammatumor, milt en metastasen ......................................... 32

1.7. Immunohistochemie ........................................................................................................................... 32

1.8. Flowcytometrie ................................................................................................................................... 33

1.9. Expressie van MMP-9, VEGF, CHI3L1 en LCN2 .................................................................................... 35

1.10. Statistische analyse ............................................................................................................................. 35

1.11. Tijdlijn van het Py230 intraductale tumor experiment ....................................................................... 36

2. RESULTATEN .......................................................................................................................................... 37

2.1. Primair mammatumorvolume en gewicht van primaire mammatumoren, milt en axillaire

lymfeknopen ..................................................................................................................................................... 37

2.2. H&E lichtmicroscopie en Ki67 IHC van de primaire mammatumoren ................................................ 38

2.3. Evolutie van NF-κB-activiteit tijdens de primaire tumorgroei ............................................................ 41

2.3.1. In vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren ......................... 41

2.3.2. Ex vivo bioluminescentie NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren en de axillaire

lymfeknopen ................................................................................................................................................. 41

2.4. CD45, CD163, Ly6G en CD8a IHC evaluatie in de primaire mammatumoren ..................................... 43

2.5. Flowcytometrische evaluatie van de lokale immuuncelinflux in de primaire mammatumoren ........ 45

2.5.1. Methodiek .................................................................................................................................. 45

2.5.2. Resultaten .................................................................................................................................. 49

2.6. Matrixdegradatie en vaatvorming in het tumoraal milieu (lokaal) en serum (systemisch) ................ 50

2.6.1. Evolutie van MMP-9 in de primaire mammatumor en serum ................................................... 50

2.6.2. Evolutie van VEGF in de primaire mammatumor en serum ....................................................... 51

2.6.3. CD31 IHC evaluatie van de tumorale vaatvorming..................................................................... 51

2.7. Evolutie van CHI3L1 en LCN2 in de primaire mammatumor, milt, axillaire lymfeknopen en serum .. 52

2.7.1. CHI3L1 ........................................................................................................................................ 52

2.7.2. LCN2 ........................................................................................................................................... 52

3. DISCUSSIE ............................................................................................................................................... 54

3.1. Bespreking van de primaire tumorgroei en -progressie ..................................................................... 54

3.2. Bespreking van de lokale inflammatoire respons ............................................................................... 54

3.3. Bespreking van de tumor-geassocieerde veranderingen in de milt en lymfeknopen ........................ 55

3.4. Vergelijking van het Py230 en 4T1 intraductale muismodel ............................................................... 56

4. CONCLUSIE ......................................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.7

LITERATUURLIJST .................................................................................................................................... 58

BIJLAGEN

Bijlage I : Scorerooster muizen ....................................................................................................................... 64

7

SAMENVATTING

Borstkanker is de meest voorkomende vorm van kanker in België en treft jaarlijks ongeveer 10 500

Belgische vrouwen, waarvan 1 op de 10 uiteindelijk sterft. In de strijd tegen deze ziekte is er nood aan

goede en betrouwbare diermodellen die het preklinische testen van nieuwe therapeutica mogelijk

maken. In deze masterproef werden tripel negatieve Py230 mammatumorcellen intraductaal

geïnoculeerd in het derde paar melkklieren van lacterende C57Bl/6 Tyr-/- NF-κB-luc+ muizen. Deze

reportermuizen werden op voorhand gescreend en geselecteerd op de aanwezigheid van het

luciferase-gen dat gekoppeld is aan de genexpressie van NF-κB om in vivo opvolging van de tumor-

geassocieerde inflammatoire respons mogelijk te maken. Onze resultaten tonen aan dat het

intraductale Py230 model tot 3 weken post-inoculatie representatief is voor het ductaal carcinoma in

situ stadium, waarbij de tumorcellen in de melkkliergangen aanwezig zijn. Vervolgens evolueert dit

verder tot het invasief ductaal carcinoma stadium, waarbij de tumorcellen het vetweefsel rondom de

melkkliergangen invaderen. Een lokale en systemische inflammatoire respons volgen op de

exponentiële tumorgroei, waarbij het absolute aantal immuuncellen tijdens de tumorprogressie sterk

stijgt en hun percentuele samenstelling onderling verandert. Er vinden ook systemische

veranderingen plaats, waaronder een vergroting van de milt en axillaire lymfeknopen, en een stijging

van de prognostische biomerkers chitinase 3-like 1 en lipocaline 2. De geïnoculeerde Py230

mammatumorcellen zijn weinig agressief en vertonen geen metastasen vooraleer het humaan

eindpunt van 2,0 cm³ op 6 weken post-inoculatie wordt bereikt. Deze studie kon daarmee aantonen

dat ons Py230 muismodel een beter klinisch en meer ethisch alternatief biedt voor het intraductale

4T1-model en de klassieke 'fat pad'-injectie.

ABSTRACT

Breast cancer is the most common form of cancer in Belgium and affects about 10 500 Belgian women

each year, of which 1 in 10 eventually die. In the fight against this disease, there is a need for good

and reliable animal models that enable preclinical testing of new therapeutics. In this master thesis,

triple negative Py230 mammary tumor cells were inoculated intraductally in the third gland pair of

lactating C57Bl/6 Tyr -/- NF-κB-luc+ mice. These reporter mice were screened and selected for the

presence of the luciferase gene that is linked to the expression of NF-κB, allowing to follow-up the

tumor-associated inflammatory response in vivo. Our results show that the intraductal Py230 model

is up to 3 weeks post-inoculation representative for the ductal carcinoma in situ stage, in which the

tumor cells are located in the milk gland ducts. Thereafter, an evolution to the invasive ductal

carcinoma stage was observed, characterized by tumor cell invasion into the adipose tissue of the

mammary gland. A local and systemic inflammation were detected as a response to the exponential

tumor growth and further investigation showed that whereas the absolute number of immune cells

increases strongly, their percental ratio changes over time. In addition, systemic changes including

enlargement of the spleen and axillary lymph nodes, as well as an increase in the recently discovered

immune-associated biomarkers chitinase 3-like protein 1 and lipocalin 2 were also observed.

Moreover, the inoculated Py230 mammary tumor cells are not very aggressive and do not develop

metastases prior to the human end point of 2,0 cm³ at 6 weeks post-inoculation. This study therefore

proved that our Py230 mouse model offers a better clinical and more ethical alternative to the

intraductal 4T1 model and the classic 'fat pad' injection.

8

DEEL A: LITERATUURSTUDIE

1. INLEIDING

1.1. Kanker in België

1.1.1. Incidentie

In België worden er jaarlijks ongeveer 65 000 nieuwe gevallen van kanker geregistreerd (Stichting

tegen kanker, 2017). Kanker komt meer voor bij mannen dan vrouwen. Momenteel maakt 1 man op

3 en 1 vrouw op 4 een vorm van kanker door voor de leeftijd van 75 jaar. De ziekte doet zich vooral

voor in de populatie ouderen: ongeveer 75% van de mannen en 64% van de vrouwen zijn minstens 60

jaar op het ogenblik van de diagnose. De meest voorkomende vorm van kanker bij mannen is

prostaatkanker (23%), gevolgd door longkanker (16%) en dikke darmkanker (7,5%). Bij vrouwen valt

op dat borstkanker (36%) veruit het meest voorkomende kankertype is. Op de tweede en derde plaats

volgen respectievelijk dikke darmkanker (14%) en longkanker (8,5%). Als het onderscheid tussen de

geslachten niet in rekening wordt gebracht, zijn de meest voorkomende kankers: borstkanker (16%),

dikke darmkanker (13%), longkanker (13%) en prostaatkanker (12%). Deze cijfers worden grafisch

weergegeven in Fig. 1.

1.1.2. Borstkanker in cijfers

Per jaar worden er ongeveer 10 500 nieuwe gevallen van borstkanker vastgesteld bij Belgische

mannen en vrouwen (Stichting tegen kanker, 2017). De ziekte heeft een mortaliteit van ongeveer 10%

bij vrouwen en 15% bij mannen, wanneer een periode van vijf jaar na de diagnose in rekening wordt

gebracht. Er overlijden ongeveer 2300 mensen per jaar aan de gevolgen van deze ziekte. Borstkanker

is de meest voorkomende vorm van kanker bij de Belgische bevolking. Ongeveer één vrouw op negen

Fig. 1: Incidentie van de meest frequente kankertypes bij mannen (links), mannen en vrouwen (midden) en

vrouwen (rechts). (Bron: http://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker, laatst

bijgewerkt op 16 november 2017).

9

zal de ziekte voor haar 75ste levensjaar doormaken. Hoewel borstkanker niet frequent voorkomt bij

mannen, wordt de diagnose toch jaarlijks 80 keer gesteld in dit geslacht. Opnieuw valt op dat

borstkanker zich vooral voordoet in de oudere populatie: 75% van alle borstkankers wordt

gediagnosticeerd bij vrouwen ouder dan 50 jaar. Bovenstaande cijfers worden voorgesteld in Fig. 2.

1.2. De tumorgenese

De ontstaanswijze van een tumor kan opgedeeld worden in meerdere fasen: (1) initiatie, (2) promotie

en (3) progressie (Chiers, 2015). Tijdens de eerste fase, de initiatie, zal er schade zijn aan het erfelijk

materiaal in een cel, zonder dat deze schade hersteld wordt. Dit type cel wordt een kanker stamcel

genoemd. De DNA-schade leidt vervolgens tot (a) het overmatig aflezen van proto-oncogenen of (b)

het onderdrukken van tumor suppressie genen. In de daaropvolgende fase, de promotie, is een

stimulus nodig die deze kanker stamcel aanzet tot deling en groei. Tijdens deze fase ontstaan

bijkomende mutaties waardoor de tumorcellen hun immortaliteit verwerven. Een voorbeeld hiervan

is het verlengen van de chromosomale telomeren. Vervolgens is er groei en expansie van de tumor.

Deze fase wordt de tumorprogressie genoemd. Als de tumor gescheiden blijft van het omgevende

weefsel en enkel lokaal groeit, wordt dit een goedaardige of benigne tumor genoemd. Een tumor kan

daarnaast ook kwaadaardig of maligne zijn, doordat ze een invasieve groei in het omgevende weefsel

vertoont. Wanneer een tumor in staat is om in de bloed- of lymfevaten door te breken, kunnen

tumorcellen uitzaaien. Dit proces wordt metastasering genoemd. Een maligne tumor heeft typisch

een slechtere prognose dan een benigne tumor.

1.3. De verschillende types borsttumoren

Borstkanker wordt ingedeeld aan de hand van het weefsel van oorsprong en het type groei (Stichting

tegen kanker, 2017). Een borsttumor kan ontstaan uit het epitheel van de melkafvoergangen (ductaal)

of het epitheel van de melkklieren (lobulair). In enkele zeldzame gevallen kan een borsttumor ook

ontstaan uit het stromaal weefsel, zoals het vetweefsel. Het type groei kan, zoals eerder aangehaald,

lokaal of invasief zijn. Wanneer een borsttumor lokaal groeit, wordt dit in situ groei genoemd. Er wordt

Fig. 2: Incidentiecijfers, geslachtsverdeling, mortaliteit en leeftijdsdistributie van borstkanker in de

Belgische bevolking. (Bron: http://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker, laatst

bijgewerkt op 16 november 2017).

10

een onderscheid gemaakt in: (1) het ductaal carcinoom in situ (DCIS), (2) het lobulair carcinoom in situ

(LCIS), (3) het invasief ductaal carcinoom (IDC) en (4) het invasief lobulair carcinoom (ILC).

1.3.1. Het ductaal carcinoom in situ (DCIS) en

het invasief ductaal carcinoom (IDC)

Bij een DCIS ontstaat de tumor uit het

epitheel van de melkklierafvoergangen. In dit

vroege stadium van borstkanker groeien de

cellen lokaal in de melkkanalen. Frequent

zullen de tumorcellen een invasief karakter verwerven en zich verspreiden in het onderliggende

mesenchymale weefsel. Deze situatie wordt een IDC genoemd. Dit type borstkanker

vertegenwoordigt 70 à 80 % van de vastgestelde borstkankers en is dus het meest voorkomende type.

1.3.2. Het lobulair carcinoom in situ (LCIS) en het invasief lobulair carcinoom (ILC)

De ontstaanswijze van een LCIS en ILC is analoog aan deze van een DCIS en IDC, behalve dat deze

tumor ontstaat uit de epitheelcellen van de melkklieren. ILC’s vertegenwoordigen ongeveer 10 à 15%

van de vastgestelde borstkankers.

1.4. Tripel negatieve borsttumoren

Wanneer een borsttumor gecategoriseerd wordt als tripel negatief, zijn er op de tumorcellen geen

oestrogeen- (ER), progesteron- (PR) en humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren (HER2) aanwezig

(Stichting tegen kanker, 2017). Deze diagnose volgt meestal na immunohistochemisch onderzoek van

een biopt. Doordat de tumorcellen geen receptoren voor deze hormonen dragen, zijn de

therapeutische mogelijkheden beperkt. ER, PR en HER2 receptorblokkers kunnen de tumorgroei dan

niet afremmen. Schmadeka et al. (2014) beschreven dat ongeveer 12 tot 24% van alle

borstcarcinomen tripel negatief zijn. Eveneens beschreven zij dat vrouwen met een tripel negatieve

borsttumor, sneller hervallen na therapie en bovendien een grotere kans hebben om metastasen te

ontwikkelen. Dent et al. (2007) onderzochten 1601 vrouwen met borstkanker, waarvan 180 vrouwen

een tripel negatieve borstkanker hadden. 33,9% van deze vrouwen hervielen na therapie, dit was

slechts 20,4% in de groep zonder tripel negatieve borsttumor.

1.5. De genen BRCA-1 en BRCA-2

“Breast cancer gene 1 and 2 (BRCA-1 en -2)” zijn twee genen die coderen voor verschillende tumor

supressor eiwitten. Hoewel beide genen verschillende proteïnen aanmaken, behoren ze toch tot

dezelfde pathway. Mutaties in deze genen leiden tot defecten in de DNA-herstelmechanismen,

waardoor fouten in het genoom van de cel onvolledig worden hersteld. Mutaties in BRCA-1 en 2

bevorderen hierdoor de tumorinitiatie. Volgens Murphy C.G. et al. (2010) verhogen mutaties in deze

genen de kans op borstkanker met een factor 20 tot 30. Morris J. L. et al. (2010) toonden aan dat 50

– 65% van de vrouwen met een deletiemutatie in BRCA-1, borstkanker ontwikkelen voor de leeftijd

van 70 jaar. Voor BRCA-2 zou dit 13 – 23% bedragen. Hierbij moet vermeld worden dat BRCA-1 en -2

ook het risico op ovariumkanker aanzienlijk verhogen. Mutaties in de BRCA-1 en -2 genen zijn erfelijk

en kunnen zowel langs vaders- als moederszijde aan de nakomelingen worden doorgegeven.

Fig. 3: Illustratie van de melkklieren en -

kanalen van de borst (Bron:

http://www.kanker.be/alles-over-

kanker/alle-types-kanker/borstkanker).

11

Tegenwoordig zijn testen beschikbaar om mutaties in de BRCA-1 en -2 genen op te sporen, zodat er

preventieve maatregelen kunnen genomen worden bij personen met een verhoogd risico.

Regelmatige screening aan de hand van een mammografie of het preventief afzetten van de borsten

zijn hier enkele voorbeelden van.

1.6. De voornaamste risicofactoren van borstkanker

Desreux J. et al. (2011) beschreven de belangrijkste risicofactoren voor borstkanker waaraan Belgische

vrouwen worden blootgesteld. De toename van het relatief risico van elk van deze factoren wordt

weergegeven in Grafiek 1.

Een eerste belangrijke risicofactor is de veroudering van de Belgische bevolking. De DNA-

herstelmechanismen worden minder efficiënt naarmate de leeftijd van een individu stijgt. Hierdoor

stapelen mutaties zich op en stijgt de kans op tumorinitiatie. Bovendien daalt de werking van het

immuunsysteem, waardoor een tumor gemakkelijker kan groeien en metastaseren. Een tweede

risicofactor is het nemen van de anticonceptiepil. De literatuur hieromtrent is echter niet éénduidig.

Een rechtstreeks verband aantonen tussen het gebruik van de anticonceptiepil en borstkanker is

moeilijk, omdat de meeste borstkankers voorkomen bij oudere vrouwen die niet meer aan

anticonceptie doen. Over het algemeen wordt aangenomen dat de anticonceptiepil het risico op

borstkanker licht verhoogt. Dit risico daalt echter weer na het stopzetten van de

anticonceptietherapie. Er werd wel een duidelijk verband aangetoond tussen borstkanker en het

nemen van hormoonpreparaten tijdens de menopauze. Oestrogeenpreparaten, en in het bijzonder

progesteronderivaten, zijn sterke promotoren van kanker stamcellen met oestrogeen- en/of

progesteronreceptoren. Aangezien oudere vrouwen een hoger risico hebben op de aanwezigheid van

dergelijke tumor-geïnitieerde cellen in de borst, versnelt deze hormoontherapie hun tumorpromotie

en -progressie. Het effect is wel proportioneel afhankelijk van de ingenomen dosis en de duur van de

behandeling.

Andere risicofactoren die Desreux J. et al. (2011) aanhalen zijn obesitas, lichaamsbeweging, voeding,

en vitamine D. Bij obese vrouwen worden er meer androgenen omgezet tot oestrogenen in de perifere

vetcellen en is er meer productie van insuline-like growth factor 1 (IGF-1). Dit bevordert de

ontwikkeling van borstkanker. Een tekort aan lichaamsbeweging zorgt eveneens voor een toename

Grafiek 1: De toename van het relatief risico van enkele borstkanker-geassocieerde risicofactoren. (Bron:

DESREUX J. et al. (2011), Le cancer du sein en Belgique: pourquoi sommes-nous les premiers en Europe?,

Revue medical de Liège, 66 : 5-6, p. 231 – 237.)

12

van perifeer geproduceerd oestrogeen en daarnaast wordt er ook een verminderde werking van het

immuunsysteem en de menstruele cyclus waargenomen. Een voeding rijk aan dierlijk vet, vlees,

zuivelproducten en gesuikerde dranken verhogen aanzienlijk het risico op borstkanker. Vrouwen met

een Mediterraans of Aziatisch dieet hebben respectievelijk tot 15% en 30% minder kans om

borstkanker te ontwikkelen. Bovendien zou een tekort aan vitamine D het risico op borstkanker

verhogen, omdat de actieve vorm ervan een rol speelt bij apoptose van mammaire cellen. Ten slotte

verhogen ook alcoholgebruik, een lage socio-economische status, stress, nachtwerk en tabaksgebruik

het risico op borstkanker.

1.7. Mammatumoren bij de teef

Hadzijusufovic et al. (2017) publiceerden een uitgebreide studie waarbij mammatumoren van de mens

vergeleken werden met deze van de teef. Net zoals bij de vrouw zijn mammatumoren het meest

voorkomende tumortype bij de teef. Ongeveer 50% van de mammatumoren bij de hond is benigne,

terwijl de overige 50% reeds metastasen vertonen in de regionale lymfeknopen en/of de longen

(Sleeckx et al., 2011). Tumoren zijn beschreven in alle vijf klierparen van de teef, hoewel het laatste

klierpaar frequenter is aangetast. Op het moment van aanbieden zijn er echter in 70% van de gevallen

meerdere klieren aangetast, waarbij de tumoren vaak verschillen in grootte en ontwikkelingsstadia.

Dit proces wordt ‘multistep carcinogenesis’ geheten (Fig. 4) en is het gevolg van mutaties in

verschillende oncogenen en/of tumor suppressie genen in de mammaire cellen van hetzelfde dier.

De manier waarop mammatumoren bij de hond worden geclassificeerd, is identiek aan de indeling die

wordt gehanteerd bij de mens. Analoog aan de vrouw zijn de meeste maligne tumoren ductaal

invasieve carcinomen van epitheliale oorsprong (Sorenmo et al., 2003). Ook bij de teef zijn er erfelijke

mutaties gekend in de BRCA-1 en -2 genen, die sterk gelijken op de gekende deletiemutaties van de

mens. De diagnostische methoden voor borstkanker bij de mens kunnen eveneens aangewend

worden bij de hond. In de praktijk wordt hier echter weinig

gebruik van gemaakt, omdat dierenartsen rekening moeten

houden met de financiële mogelijkheden van de eigenaar.

Er kan dus geconcludeerd worden dat mammatumoren bij de

teef goed gelijken op deze van de mens (Uva et al., 2009). De

belangrijkste redenen hiervoor zijn: de gelijkaardige

pathofysiologie, éénzelfde classificatie en het gebruik van

dezelfde diagnostiek. Het muismodel dat in deze masterproef

wordt beschreven voor humane borstkanker, kan dus ook

gebruikt worden als model voor de teef.

Fig. 4: Multistep carcinogenesis bij een teef. (Bron: HADZIJUSUFOVI

E. et al. (2017), Comparing Human Breast Cancer with Canine

Mammary Cancer, Jensen-Jarolim E. (eds) Comparative Medicine,

Springer).

13

2. HET TUMORALE MICROMILIEU

Er wordt in de literatuur steeds meer belang gehecht aan het stromaal milieu rondom een tumor. Dit

milieu speelt immers een belangrijke rol in het ontwikkelingsproces van een tumor. Daarom wordt nu

besproken waaruit dit stromale milieu bestaat en op welke manier deze componenten een invloed

hebben op de tumorinitiatie, -promotie en -progressie.

2.1. Drie stromale componenten met samen acht sleutelfuncties

Het stromaal milieu waarin de tumorcellen zich bevinden wordt typisch ingedeeld in drie cellulaire

componenten: (1) de angiogene vasculaire cellen (AVC), (2) de infiltrerende immuuncellen (IIC) en

(3) de kanker geassocieerde (“cancer associated”) fibroblasten (CAF). Deze drie celtypes kunnen

volgens Douglas H. et al. (2012) in totaal op acht manieren inwerken op tumorcellen, namelijk door:

- cytokines te secreteren die hun celdeling en -groei stimuleren (tumorpromotie),

- ze ongevoelig te maken voor antigroeifactoren,

- ze ongevoelig te maken voor celdood,

- hun vermogen tot celdeling oneindig te maken (replicatieve immortaliteit),

- angiogenese te stimuleren,

- hun invasie en metastasering te stimuleren,

- hun destructie door immuuncellen te vermijden (immuno-evasie),

- hun cellulair metabolisme te beïnvloeden.

In Fig. 5 worden deze drie celtypes met bovenstaande inwerkingsmechanismen afgebeeld.

Fig. 5 (Douglas et al., 2012): Angiogene vasculaire cellen (AVC), infiltrerende immuuncellen (IIC) en kanker

geassocieerde fibroblasten (CAF) vormen de drie types stromale cellen rond een tumor die op acht

verschillende manieren kunnen inwerken op een tumor.

14

2.1.1. Stimuleren van celdeling en -groei (tumorpromotie)

Het stimuleren van celdeling en -groei kan zowel door AVC, ICC en CAF gebeuren. De relatie van AVC

met tumorgroei is vanzelfsprekend. Als er meer ingroei is van bloedvaten (neovascularisatie) worden

er meer voedingsstoffen (o.a. zuurstof) aangevoerd naar de tumor. Neovascularisatie is een

belangrijke voorwaarde opdat de tumor kan blijven groeien. De IIC spelen eveneens een belangrijke

rol in de tumorgroei door hun cytokineproductie. Voorbeelden van gesecreteerde signaalmoleculen

zijn epidermale groeifactoren (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), tumor necrosis factor-α

(TNF-α), fibroblast growth factor (FGF), interleukines (IL), chemokines, histamine en heparine. Net

zoals de IIC, zijn ook de CAF in staat om cytokines te produceren. De best gekende is insuline like

growth factor 1 (IGF-1). Daarnaast kunnen CAF ook epitheliale-mesenchymale transitie (EMT)

stimuleren door secretie van TGF-β. Dit dedifferentiatie mechanisme zorgt ervoor dat epitheliale

cellen van hun basaalmembraan loskomen en zich verder verspreiden in het onderliggende

mesenchymale weefsel. EMT is van groot belang bij de metastasering van epitheliale tumoren zoals

borstcarcinomen.

2.1.2. Ongevoeligheid voor antigroeifactoren

Ongevoeligheid voor antigroeifactoren is aangetoond bij zowel ICC als CAF. Normaal worden deze

factoren geproduceerd door cellen wanneer ze bij contact met naburige cellen of extracellulaire

matrix. Door dit para- of juxtacrien signaal wordt de celcyclus geremd. De IIC secreteren echter

verschillende proteolytische enzymen die in staat zijn om cel-cel en cel-matrix verbindingen te

verbreken. Hierdoor valt het inhiberend signaal van de naburige cel of extracellulaire matrix weg en

worden cellen gestimuleerd om zich te vermeerderen. Daarnaast is in verschillende studies

aangetoond dat de groei van kankercellen in een niet-tumoraal stroma geremd wordt. Normale

fibroblasten zijn dus in staat zijn om de groei van tumorcellen te remmen. Dit is niet meer het geval

voor de CAF, omdat er in het tumoraal milieu een soort van “herprogrammering” van de fibroblasten

plaatsvindt, waarvan het mechanisme nog niet is opgehelderd.

2.1.3. Resistentie aan celdood

Resistentie tegenover celdood is een belangrijke stap in de tumorgenese. Enerzijds bestaat deze uit

een intrinsieke resistentie tegenover de cel-eigen apoptose, maar anderzijds ook uit een extrinsieke

resistentie tegenover afdoding door cytotoxische cellen (CD8+ T-cellen, NK-cellen). Zowel AVC, IIC als

CAF werken dit in de hand. AVC kan door vascularisatie de tumorcellen laten ontsnappen aan

apoptose, een geprogrammeerde celdood die normaal zou optreden als gevolg van hypoxie en een

tekort aan voedingsstoffen. De rol van IIC is als volgt: epitheelcellen bezitten een homeostatisch

mechanisme dat apoptose veroorzaakt wanneer ze het contact verliezen met hun basaalmembraan

en hun omgevende cellen. IIC zijn in staat om deze bindingen na te bootsen, waardoor epitheelcellen

toch kunnen loskomen uit hun lamina epithelialis. Daarnaast is ook aangetoond dat tumor

geassocieerde monocyten en macrofagen cytokines produceren, die de overleving van kankercellen

promoot. CAF produceren IGF-1 en 2, die via paracriene weg de resistentie tegen celdood stimuleren.

Daarnaast produceren ze ook moleculen die een positieve invloed hebben op de vorming van een

neoplastische extracellulaire matrix.

2.1.4. Replicative immortaliteit

Tumorcellen bezitten de eigenschap dat ze oneindig lang kunnen blijven delen. Normaliter verliezen

de chromosomale uiteinden, de zogeheten telomeren, na elke replicatie een stukje DNA. Als deze

telomeren na een aantal delingen te kort zijn geworden, stopt de celcyclus. Dit proces van veroudering

noemt men celsenescentie. Tumorcellen bezitten echter de typische eigenschap dat ze deze

15

telomeren kunnen verlengen waardoor oneindig lang kunnen blijven delen. Tot op heden blijft de rol

van AVC, IIC en CAF in dit proces onduidelijk. Er wordt wel aangenomen dat deze van ondergeschikt

belang is, daar replicatieve immortaliteit voornamelijk ontstaat tijdens tumorinitiatie en -promotie.

2.1.5. Angiogenese

Angiogenese is onmisbaar tijdens tumorprogressie. Zonder de ingroei van nieuwe bloedvaten kan een

tumor niet expanderen. Historisch gezien achtte men de tumor terecht verantwoordelijk voor de

productie van angiogene groeifactoren. Daarnaast spelen echter ICC en CAF ook een belangrijke rol

bij tumorale angiogenese. De IIC en CAF produceren verschillende moleculen die angiogenese

stimuleren. Dit zijn o.a. vascular endothelial growth factor (VEGF), TNF-α, TGF-β, IL-8 en verschillende

matrix metalloproteinasen (MMP). Tumor geassocieerde macrofagen (TAM) spelen hierin een

belangrijke rol door de productie van VEGF. Stockmann et al. (2008) toonden aan dat tumorgroei

geremd kon worden door een deletie van het VEGF-gen in deze macrofagen. Ook mastcellen zouden

een belangrijke rol spelen via de productie van eveneens VEGF, naast angiopoietine-1, IL-8, histamine

en heparine (Bergers et al., 2000).

2.1.6. Invasie en metastase

Er werd aangetoond dat alle celtypes (AVC, IIC en CAF) een rol spelen tijdens invasie en metastasering.

Door de sterke expressie van VEGF in tumoren, verliest het endotheel haar tight junctions. Bijgevolg

is de barrière tussen de verschillende AVC eerder zwak, zodat tumorcellen gemakkelijker in de

bloedbaan komen. Dit proces wordt zeker bevorderd wanneer in de tumor ook een hoge interstitiële

druk heerst na expansie. Daarbij zorgt een onvoldoende ingroei van bloedvaten voor de expressie van

hypoxie geïnduceerde transcriptiefactoren (HIF). Deze HIF brengen op hun beurt VEGF en NO-

synthase tot expressie, die beiden metastasering bevorderen. De IIC produceren verschillende MMP,

die de cel-cel en cel-matrix verbindingen afbreken. Hierdoor kunnen tumorcellen loskomen van hun

omgeving en naar de bloed- of lymfevaten migreren. De CAF produceren cytokines die metastase en

invasie stimuleren, het belangrijkste cytokine hierbij is TGF-β.

2.1.7. Destructie door immuuncellen vermijden (immuno-evasie)

De AVC spelen een belangrijke rol in immuno-evasie. Dit komt omdat het tumoraal endotheel geen

massale T-cel inflammatie ondersteunt. Zo kunnen er bijvoorbeeld in tumoren geen hoog endotheliale

venules (HEV) waargenomen worden. Dit zijn vasculaire structuren die van belang zijn voor een

massale instroom van lymfocyten in lymfeknopen of zwaar ontstoken weefsels. Daarnaast worden

ook moleculen waargenomen die inflammatie van het endotheel tegengaan, met een lager aantal

receptoren op het endotheel tot gevolg. De IIC, in het bijzonder macrofagen, spelen eveneens een rol

in immuno-evasie via de productie van immunosuppressieve cytokines. Deze cytokines inhiberen CD8+

T-cel proliferatie en infiltratie. Een andere manier waarop deze TAM-immuunreacties stil leggen, is

door de productie van chemokine (C-C motief) ligand 22 (CCL22). Dit zorgt voor een influx van

regulatorische T-cellen (Treg), waardoor inflammatie afneemt. De Treg worden eveneens aangetrokken

door chemokine ligand 2 (CCL2) en TGF-β die geproduceerd worden door CAF in het tumoraal stroma.

2.1.8. Modificatie van het cellulair metabolisme

Momenteel is enkel de rol van CAF in het cellulair metabolisme beschreven. Volgens Rattigan et al.

(2012) zouden CAF een atypische vorm van aerobe glycolyse stimuleren via zuurstofradicalen

geproduceerd door tumorcellen. De CAF produceren in ruil de glycolyse metaboliet pyruvaat, die

vervolgens door de tumorcellen gebruikt wordt als brandstof voor celproliferatie.

16

2.2. Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma

Cytokines vormen een belangrijk communicatiemiddel tussen tumorcellen en het stroma. Bovendien

hebben ze meerdere functies en kan één cytokine verschillend inwerken op een tumor.

2.2.1. TNF-α

TNF-α speelt een belangrijke rol tijdens de tumorprogressie omdat het een transcriptiefactor is van

NF-κB. Door NF-κB produceert de cel anti-apoptotische moleculen, waardoor de cel langer kan

overleven. Daarnaast kan NF-κB ook op andere manieren tumorgenese stimuleren (o.a. via

inflammatie), dit wordt besproken in het onderdeel 3. De link tussen NF-κB, inflammatie en kanker

(zie verder). TNF-α zou ook de productie van genotoxische moleculen zoals NO en ROS stimuleren.

Deze radicalen kunnen het DNA beschadigen en op deze manier bijdragen aan tumorinitiatie. Andere

manieren waarop TNF-α kan bijdragen aan tumorgenese zijn angiogenese, metastasering en T-cel

suppressie.

2.2.2. IL-6

IL-6 draagt bij aan de tumorgenese door inflammatie en anti-apoptotische factoren. Bovendien

stimuleert IL-6 tumorale groei, via expressie van genen die de celcyclus stimuleren. Berger et al. (2004)

toonden aan dat er een polymorfisme bestaat in de promotorregio van het IL-6 gen tussen

verschillende etnische groepen. Er werd in deze studie een verband aangetoond tussen expressie van

IL-6, prevalentie van borstkanker en een slechte prognose na metastasering.

2.2.3. IL-10

IL-10 is een cytokine met een anti-inflammatoire werking, omdat het de expressie van NF-κB inhibeert.

Daardoor daalt de afdoding door cytotoxische T-cellen (CD8+ T-cellen en NK-cellen). De tumor kan

bijgevolg ongehinderd blijven groeien. Er is eveneens beschreven dat tumorcellen IL-10 produceren

om immuno-evasie te veroorzaken (Mannino M.H. et al, 2015). Daarnaast wordt IL-10 geproduceerd

door TAM en bevordert het bovendien invasie en metastasering. Hoewel het overwegend

protumoraal werkt, is de rol ervan paradoxaal. IL-10 gaat namelijk de secretie van TNF-α en IL-6 tegen.

Op deze manier wordt tumorigenese afgeremd.

2.2.4. TGF-β

TGF-β vertoont enerzijds veel gelijkenissen met IL-10 door zijn identieke, anti-inflammatoire werking.

Een bijkomende functie van TGF-β is anderzijds Treg proliferatie, die tumorgroei bevordert door

afremming van de CD8+ T-cel responsen. Hoewel TGF-β dus antitumoraal kan werken, is dit niet

éénduidig. TGF-β werkt ook EMT in de hand. Daarnaast is beschreven dat TGF-β een rol speelt bij

invasie, angiogenese en metastasering. De rol van TGF-β in tumorprogressie is dus opvallend complex.

17

2.2.5. CCL2 (MCP-1)

CCL2, of nog monocyt chemotactisch proteïne-1 (MCP-1), is een molecule die monocyten aantrekt

tijdens ontstekingsprocessen. Omdat CCL2 ook tot expressie gebracht wordt in het tumoraal

micromilieu, zorgt het voor een accumulatie van macrofagen. Soria et al. (2008) toonden aan dat CCL2

in borstcarcinomen een belangrijke rol speelt tijdens tumorprogressie en metastasering. Een

recentere studie beschrijft eveneens de rol van CCL2 op de groei van borstkankercellen (Tsuyada et

al., 2012). De TAM worden momenteel beschouwd als één van de belangrijkste cellen die

tumorprogressie stimuleren, dus CCL2 is een protumoraal cytokine.

2.2.6. BAFF

B-cell activating factor (BAFF) is een cytokine dat fysiologisch tot expressie gebracht wordt door CD4+

T-cellen. Het helpt B-cellen om te zetten in plasmacellen. Pelekanou V. et al. (2008) ontdekten voor

het eerst dat BAFF continu tot expressie gebracht werd in borstcarcinomen. De rol van BAFF in

borstkanker was toen nog onduidelijk. Het waren uiteindelijk Walters S. et al. (2009) die beschreven

dat BAFF een belangrijke protumorale functie vervult. Meer specifiek veroorzaakt BAFF expansie van

Treg cellen, waardoor T-cel responsen worden afgeremd.

2.2.7. IL-1β

IL-1β wordt tot expressie gebracht in verschillende types kankercellen, ook in borstkanker. Bij knock-

out muizen voor IL-1β werd een vermindering van de tumorgenese en angiogenese waargenomen.

Daarom wordt aangenomen dat IL-1β een belangrijke rol speelt tijdens tumorpromotie en -progressie.

Veruit de belangrijkste functie van IL-1β is het bevorderen van metastase. Dit komt omdat IL-1β

structurele veranderingen kan veroorzaken bij tumorcellen, waardoor cel-cel verbindingen (E-

cadherine) worden verbroken. De tumorcellen krijgen daarnaast ook een fibroblastoïd karakter. Door

Fig. 6: De rol van TNF-α, IL-6 en IL-10 op tumorgenese en het inflammatoir micromilieu.

18

deze twee aanpassingen verwerven ze gemakkelijker een maligne karakter (De Marco et al., 2016).

Ten slotte stimuleert IL-1β ook het inflammatoir micromilieu.

2.2.8. MIP-2 (CXCL2)

Macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) is een cytokine dat geproduceerd wordt door

macrofagen en chemotactisch inwerkt op polymorfonucleaire neutrofiele leukocyten. Soms wordt

MIP-2 ook chemokine ligand 2 (CXCL2) genoemd. MIP-2 is een cytokine dat angiogenese en

metastasering van borstcarcinomen bevordert (Nuray et al., 2015).

2.3. Conclusie

De interactie tussen een tumor en de tumor omgeving is uitermate complex. De tumor en de

verschillende cellen van het stroma beïnvloeden elkaar door de productie van cytokines. Merk op dat

de rol van ieder cytokine niet éénduidig is en vaak onvolledig werd opgehelderd. Dit illustreert de

noodzaak aan een in vivo preklinisch model voor onderzoek naar borstkanker. Het is immers

onmogelijk om de complexe interacties tussen het stroma en de tumor in vitro na te bootsen.

Fig. 7: De rol van IL-1β, BAFF, MIP-2, TGF-β en CCL2 op tumorgenese en het inflammatoir micromilieu.

19

3. DE LINK TUSSEN NF-κB, INFLAMMATIE EN KANKER

NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) is een transcriptiefactor die tot

expressie gebracht kan worden in bijna alle celtypes onder invloed van bepaalde stimuli. Deze stimuli

kunnen bestaan uit: cytokines, vrije radicalen, zware metalen, UV-straling en bacteriële of virale

antigenen (Hoesel et al., 2013). In deze rubriek wordt in eerste instantie de moleculaire structuur van

de proteïnen behorende tot de NF-κB familie besproken. Vervolgens komen de drie pathways aan bod

die NF-κB kunnen activeren. Daarna wordt het verband gelegd van NF-κB met kanker en inflammatie.

Ten slotte wordt kort besproken wat de mogelijkheden zijn om NF-κB te gebruiken in antitumorale

therapieën.

3.1. Van DNA tot homo- of heterodimeer

De verschillende proteïnen van de NF-κB pathway en het geassocieerde IκB kinase-complex worden

voorgesteld in Fig. 8. Er wordt een opdeling in drie families gemaakt: de NF-κB familie (A), de IκB

familie, dit zijn endogene inhibitoren van NF- κB (B) en het IκB kinase complex of IKK (C).

Fig. 8: De verschillende proteïnen van de NF-κB pathway en het geassocieerde IκB kinase-complex volgens

Hoesel et al. (2013). (A) De vijf leden van de NF-κB familie, (B) De verschillende IκB familieleden (inhibitoren

van NF-κB) en (C) het IKK-complex.

20

Uit Fig. 8A volgt dat, de NF-κB familie uit vijf proteïnen bestaat: RelA (p65), RelB, C-Rel, p105 en p100.

Deze laatste twee worden proteolytisch verder verwerkt tot respectievelijk p50 en p52. Wat opvalt is

dat al deze proteïnen een zogeheten Rel homoloog domein (RHD) bevatten. Dit domein is nodig om

de NF-κB proteïnen onderling homo- of heterodimeren te laten vormen en bovendien is RHD ook

verantwoordelijk voor de binding aan promotoren in het DNA (May et al., 1997). Bijkomend kunnen

in de structuur van p105 en p100 zogeheten “ankyrine repeats” (ANK) waargenomen worden. Deze

komen ook voor bij IκBα van de IκB familie, dit zijn inhibitoren van NF- κB (Fig. 8B). De verschillende

IκB familieleden binden typisch met de dimeren van de NF-κB familie, waardoor ze inactief worden.

Deze situatie komt voor in een cel die zich in een niet-ontstoken en niet-tumoraal milieu bevindt

(Hayden et al., 2012). Bovendien zorgt deze binding ervoor dat er een shift optreedt van de NF-κB

dimeren van de kern naar het cytosol (Birbach et al., 2002).

Wanneer p105 en p100 echter proteolytisch verwerkt worden tot respectievelijk p50 en p52, komen

daarnaast ook nog kleine segmenten met ANK vrij. De plaats waar p105 en p100 worden geknipt is

weergegeven met zwarte pijlen in Fig. 9A. Deze kleine segmenten kunnen binden met het DNA dat

codeert voor de verschillende proteïnen van NF-κB, waardoor transcriptie hiervan onmogelijk wordt.

Op deze manier wordt een systeem van negatieve feedback bekomen (Hayden et al., 2008). Wat

bovendien ook nog opvalt, is dat dimeren van p50 en p52 kunnen binden aan het transactivatie

domein (TA) van RelA, RelB en c-Rel. Hierdoor worden ze translationeel actief. Wat opvalt is dat BCL-

3 uit de IκB familie deze TA-domeinen ook bevat. Hierbij moet de opmerking gemaakt worden dat

deze p50 en p52 dimeren daarnaast ook hun functie als transcriptiefactor behouden. Ze binden dus

ook nog aan promotoren van andere genen. Dit alles wordt schematisch weergegeven in Fig. 9.

Fig. 9: De complexe functies van p105 en p100 na proteolyse tot p50, p52 en ANK-segmenten.

21

Er kan dus aangenomen worden dat activatie van NF-κB op twee manieren kan ontstaan (Hayden et

al., 2008). De eerste is het loslaten van de IκB proteïnen van de NF-κB dimeren, waardoor er een shift

zal plaatsvinden van de dimeren van het cytosol naar de kern. De tweede manier is partiële degradatie

van p105 en p100 tot p52, p50 en de ANK-segmenten zoals hierboven besproken. Deze proteolyse is

slechts mogelijk na ubiquitinisatie van p105 en p100, die op zijn beurt slechts kan doorgaan na dubbele

fosforylatie van deze eiwitten door het IKK-complex. Dit IKK-complex werkt enzymatisch en bestaat

uit drie proteïnen weergegeven in Fig. 8C. Dit zijn 2 enzymen met een kinase activiteit nl. IKKα en IKKβ

en een structureel proteïne IKKγ, of nog NEMO.

Ten slotte moeten hier nog enkele randopmerkingen gemaakt worden (Oeckinghaus et al., 2009). Ten

eerste hebben de verschillende dimeren van de NF-κB familie een verschillende affiniteit voor

verschillende promotoren in het DNA. Met andere woorden kan dus gezegd worden dat iedere dimeer

een voorkeur heeft voor binding met een welbepaalde promotor. De verschillende NF-κB monomeren

hebben bovendien ook nog verschillende plaatsen waar fosforylatie en andere post-translationele

modificaties, zoals “folding” van het proteïne, mogelijk zijn. Hieruit wordt bijgevolg besloten dat de

NF-κB pathway heel complex in elkaar zit en moeilijk op te helderen is.

3.2. De verschillende pathways voor activatie van NF-κB

Volgens Hoesel et al. (2013) zijn er drie verschillende pathways om NF-κB te activeren. (1) De

gebruikelijke, (2) de minder gebruikelijke en (3) de atypische activatie. Deze drie manieren van

activatie zijn weergegeven in Fig. 10.

De gebruikelijke manier, weergegeven in Fig. 10A, kan starten door binding van lipopolysacchariden

(LPS), interleukine 1β (IL-1β) en tumor necrosis factor α (TNFα) aan respectievelijk toll-like receptoren

(TLR), interleukine-1 receptoren (IL-1β) en tumor necrosis factor receptoren (TNFR). Binding van zo

een ligand aan dit type receptoren leidt tot activatie van het IKK-complex, dat op zijn beurt NF-κB zal

fosforyleren. Vervolgens ontstaat er een ubiquitinisatie van het IκB proteïne dat aan het NF-κB dimeer

is gebonden, waardoor het wordt afgebroken door proteasomen. Daardoor komt dan het NF-κB

dimeer vrij, vindt er een shift plaats naar de kern en kan het binden op zijn promotor.

Fig. 10: De gebruikelijke (A), de minder gebruikelijke (B) en de atypische activatiewegen van NF-κB volgens

Hoesel et al. (2013).

22

De minder gebruikelijke weg voor activatie kan starten door binding van B cell activatie factor (BAFFR),

lymfotoxine β-receptor ligand (LTβR), CD40 en receptor activator voor nucleaire factor kappa B (RANK)

aan zijn overéénstemmende receptor. Binding van ligand aan receptor zal het NF-κB induceerbaar

kinase (NIK) activeren, dat opgebouwd is uit tweemaal IKKα (Fig. 10C). Dit NIK kan dan op zijn beurt

p100 fosforyleren. Vervolgens zal deze, eveneens na ubiquitinisatie, uitéénvallen in p52 en een ANK-

segment door proteolyse. Dit dimeer p52/RelB dimeer ondergaat dan een shift van cytosol naar kern,

waar het op zijn promotor zal binden. Deze manier van activatie wordt weergegeven in Fig. 10B.

Ten slotte is er nog een atypische manier om NF-κB te activeren, voorgesteld in Fig. 10C. Deze manier

van activeren wordt onder andere gebruikt indien de cel aan hevige genotoxische stress wordt

onderworpen. Dit soort stress zorgt ervoor dat NF-kappa-B essential modulator (NEMO) zich naar de

kern kan begeven, waar het zal binden met ataxia telangiectasia mutated checkpoint kinase (ATM).

Dit enzym zal NEMO ook weer ubiquitiniseren en vervolgens verhuist dit complex opnieuw naar het

cytosol. Daar kan deze het IKK complex activeren en vervolgens aansluiten bij de gebruikelijke weg.

3.3. De relatie van NF-κB met inflammatie en kanker

NF-κB maakt integraal onderdeel uit van de inflammatoire respons (Ben-Neriah et al., 2011). Deze

transcriptiefactor komt voor in alle celtypes van multicellulaire organismen en kan dus overal in het

lichaam tot expressie gebracht worden. NF-κB induceert cytokines die de inflammatie verder in de

hand helpen. Dit zijn o.a. TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8, die reeds hoger werden besproken onder 2.2.

Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma. De verschillende antigenen die deze

ontstekingsreactie kunnen induceren werden ook eerder besproken onder de rubriek 3.2. De

verschillende pathways voor activatie van NF-κB.

De rol van NF-κB in tumoren is dubbel. In eerste instantie helpt NF-κB voor het ontstaan van een

inflammatoire respons die cytotoxische (CD8+) T-cellen naar de tumorale omgeving aantrekken. Deze

cytotoxische cellen helpen vervolgens de getransformeerde cellen af te doden. Deze situatie gaat

echter maar op bij een acute inflammatoire respons. Bij een chronische inflammatoire respons werd

beschreven dat NF-κB net de tumorprogressie in de hand werkt. Meer nog, als de cytotoxische cellen

er niet in slagen de tumorcellen af te doden, ontstaat een soort van evenwicht tussen deze twee

celtypes. In de meerderheid van de gevallen kan de tumor uiteindelijk ontsnappen aan het

immuunsysteem. In deze situatie van chronische inflammatie worden typisch lagere concentraties van

NF-κB aangetroffen. Die concentraties werken net pro-oncogeen in plaats van pro-inflammatoir.

Hiervoor zijn volgens Hoesel et al. (2013) verschillende verklaringen:

(1) NF-κB resulteert in een verhoging van anti-apoptotische factoren waardoor cellen langer leven.

Inderdaad kunnen cellen die potentieel oncogeen zijn na bijvoorbeeld DNA-mutaties, hierdoor langer

overleven.

(2) In het feit dat de inflammatoire respons die gepaard gaat met NF-κB ook neutrofielen aantrekt.

Deze aangeboren afweer granulocyten zouden mogelijks reactieve zuurstofradicalen vrijstellen, die

genotoxisch zijn voor DNA en op deze manier kunnen zorgen voor tumor-initiatie.

(3) In het feit dat NF-κB zorgt voor een verhoging van vascular endothelial growth factor (VEGF) en

zijn receptoren. Dit zorgt voor angiogenese in de tumor waardoor deze gemakkelijker kan groeien en

metastaseren.

23

3.3.1. Direct effect van NF-κB op tumorvorming

In principe kan een tumor ontstaan doordat er mutaties zijn in de genen van NF-κB. Andere

mogelijkheden voor het ontstaan van een tumor, door toedoen van NF-κB, zijn: mutaties in de genen

van de verschillende expressiewegen of een verhoging van NF-κB in het micromilieu van de cel. In

2012 ontdekten Jiao et al. mutaties in de genen van IKKβ, IκBα, IκBε en de verschillende genen van de

NF-κB familie bij humane borstkankers. Ondertussen zijn tal van andere mutaties in deze genen

bekend bij verschillende types tumoren van verschillende organen.

3.3.2. Indirect effect van NF-κB op tumorvorming

In principe kunnen tumoren ook ontstaan door interactie van NF-κB met andere transcriptiefactoren.

Dit is bijvoorbeeld het geval voor STAT3 en p53 (Didonato et al., 2012). Er werd bewezen dat STAT3

indirect de structuur van RelA kan beïnvloeden door acetylatie, waardoor NF-κB langer in de kern

aanwezig zou zijn. Bovendien is ook bewezen dat RelA, p53 afhankelijke transactivatie kan

verminderen. Hierdoor wordt p53-afhankelijke apoptose onderdrukt.

Naast interactie tussen NF-κB en transcriptiefactoren, werden ook andere interacties gevonden met

feedbackmechanismen, kinases en microRNA (Hoesel et al., 2013). Dit type van interacties is echter

te complex en de bespreking valt buiten de scope van deze masterproef.

3.3.3. De mogelijkheden van NF-κB in antitumorale therapieën

Aangezien NF-κB een belangrijke rol speelt in tumorinitiatie en -progressie, zou deze transcriptiefactor

mogelijks een aanknopingspunt kunnen betekenen voor nieuwe antitumorale therapieën. Er kan

bijvoorbeeld gesteld worden dat NF-κB zou kunnen toegediend worden aan kankerpatiënten, om de

tumorale inflammatie op te drijven. Hierdoor worden er meer cytotoxische (CD8+) cellen naar de

tumorhaard aangetrokken en zou het immuunsysteem de tumorcellen mogelijks kunnen afdoden.

Deze behandeling zou een goede aanvulling zijn op de huidige immuuntherapie, die steeds meer aan

belang wint. Toch kan het ook tegenaangewezen zijn om NF-κB aan kankerpatiënten te gaan

toedienen. Dit is bijvoorbeeld het geval wanneer patiënten behandeld worden met een

chemotherapeuticum of na radiotherapie. Chemotherapeutica zorgen voor het afdoden van snel

delende cellen. Radiotherapie heeft als doel de tumorcellen af te doden na bestraling. Doordat NF-κB

zorgt voor het verhogen van anti-apoptotische factoren, zou resistentie tegenover het

chemotherapeuticum of de radiotherapie kunnen optreden, met therapiefalen tot gevolg.

Naast NF-κB zelf zouden ook NF-κB inhibitoren gebruikt kunnen worden (Didonato et al., 2012).

Belangrijk is dat er rekening wordt gehouden met het stadium van de tumor waarin deze potentiële

geneesmiddelen worden toegediend. Het is wenselijk deze toe te dienen tijdens de chronisch

inflammatoire fase die zorgt voor tumor-initiatie en overleving van de tumor-geïnitieerde cellen. Het

is echter tegenaangewezen deze de patiënt te verschaffen tijdens eliminatie van de tumor door het

immuunsysteem, omdat ze inflammatie onderdrukken. Daardoor worden er minder cytotoxische T-

cellen naar de tumor aangetrokken en worden de tumorcellen minder gemakkelijk afgedood.

24

4. HET BORSTKANKER MUISMODEL

In het experimentele deel van deze masterproef wordt gebruik gemaakt van C57Bl/6 Tyr-/- NF-κB-luc+

reportermuizen als model voor borstkanker bij de mens. Meer nog, er zullen via de tepelopening

Py230 tumorcellen geïnoculeerd worden in de melkklierafvoergangen van lacterende muizen. Dit

wordt een intraductale injectie genoemd. De karakteristieken van de gebruikte tumorcellijn en het

intraductaal muismodel worden in deze rubriek beschreven.

4.1. De Py230 tumorcellijn

Py230 tumorcellen werden geïsoleerd uit C57Bl/6 muizen door deze intraductaal in te spuiten met

een oplossing van oncogene virussen, nl. polyomaviridae (Bao et al., 2015). Oncogene virussen zijn in

staat om geïnfecteerde cellen tumoraal te ontaarden. In de C57Bl/6 muizen vormden zich na de

infectie spontane tumoren, die vervolgens werden geïsoleerd. Daarna werden deze geïsoleerde

tumoren enzymatisch behandeld (met o.a. trypsine en EDTA) tot een homogene suspensie van

individuele cellen werd bekomen. Vervolgens werd een monoklonale celpopulatie bekomen uit de

polyklonale celmassa, door gebruik te maken van een reeks toenemende verdunningen. De graad van

deze verdunningen is afhankelijk van het aantal cellen in de startpopulatie en hun levensvatbaarheid.

Daarnaast kan er eventueel nog op bijkomende kenmerken geselecteerd worden. Zo werd voor de

Py230 tumorcellen geselecteerd voor tripel negativiteit (zie ook verder) en epitheliaal origine. Nadat

de verdunningen waren aangemaakt, werden aliquots van de suspensie in welletjes gebracht en

geïncubeerd. Voor het experimentele deel van deze masterproef werden de Py230 tumorcellen niet

zelf aangemaakt, maar aangekocht van een commerciële verdeler.

Het waren Bao et al. (2015) die als eerste de

karakteristieken van de Py230 tumorcellijn beschreven.

Na isolatie, inoculeerden zij opnieuw C57Bl/6 muizen met

Py230 tumorcellen en zagen dat de gevormde mammaire

tumoren histologisch identiek waren aan de tumoren

geïnduceerd door het polyomavirus (Fig. 11). Er moet

echter rekening worden gehouden met de receptoren die

voorkomen op deze tumorcellijn. Polyomavirus-

geïnduceerde mammatumoren kunnen drager zijn van

één of meerdere types hormoonreceptoren, nl.

oestrogeenreceptoren (ER) en progesteronreceptoren

(PR). Deze receptoren en hun belang werden reeds eerder besproken in 1.4. tripel negatieve

borsttumoren. De Py230 tumorcellijn werd echter geselecteerd op tripel negativiteit, wat dus wil

zeggen dat ze geen ER, PR en humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren (HER2) draagt. Bao et al.

(2015) beschreven echter dat in vitro tripel negatieve Py230 tumorcellen, ER en/of PR positieve

tumoren kunnen vormen in vivo, wanneer deze in lage aantallen (104 cellen of minder) worden

geïnoculeerd (Fig. 12). Hiermee moet dus rekening gehouden worden in het experimentele deel van

de masterproef, aangezien we een muismodel beogen voor tripel negatieve borsttumoren bij de

mens.

Fig. 11 (Bao et al., 2015): Een ductaal

carcinoma in situ ontstaan na intraductale

injectie van Py230 tumorcellen (1) versus

deze geïnduceerd door polyomavirus (2).

25

4.2. Het intraductaal muismodel

Anatomisch is de borstklier ruwweg samengesteld uit twee compartimenten: het stromale en

luminale compartiment, gescheiden door de basaalmembraan van het melkklierepitheel (Fig. 13). De

tumorprogressie van borstkanker wordt echter klassiek bestudeerd door tumorcellen te injecteren in

het stromale compartiment van de borstklier, het zogeheten vetkussen. Deze laatste dankt zijn naam

aan het feit dat dit compartiment voor het grootste deel is opgebouwd uit vetcellen. Het luminale

compartiment bestaat echter uit melkproducerend epitheel en klierafvoergangen. Deze epitheliale

kanalen winnen steeds meer aan terrein als inoculatieplaats voor tumorcellen. De micro-omgeving in

dit compartiment beïnvloedt evenzeer de tumorcelprogressie. Meer nog, zoals eerder aangehaald in

1.3. De verschillende types borsttumoren, ontstaan bijna alle borstkankers bij de mens uit het epitheel

van de melkklieren en de melkklierafvoergangen. Er is eerst een ‘in situ’ situatie vooraleer de

tumorcellen de basaalmembraan doorbreken en zich in het onderliggende stromale compartiment

verder verspreiden. Het is dus wel degelijk van belang om deze stap in rekening te brengen indien we

een representatief muismodel willen ontwikkelen voor humane borstkanker. Steenbrugge et al.

(2016) vergeleek de intraductale injectie van BALB/c muizen met 4T1 tumorcellen ten opzichte van

een injectie in het vetkussen. Zij kwamen tot de conclusie dat primaire mammatumoren zich op

vergelijkbare wijze ontwikkelen, maar een initieel, langzamere groei vertonen. Deze onderzoekers

vonden daarboven ook sterke aanwijzingen dat de epitheliale micro-omgeving wel degelijk een

invloed heeft op de primaire tumorgroei in een immunocompetent muismodel.

Fig. 12 (Bao et al., 2015): Immunohistochemische coupes van polyomavirus-geïnduceerde

mammatumoren en mammatumoren ontstaan na intraductale injectie van 104 Py230 tumorcellen. De

coupes tonen een kleuring voor respectievelijk oestrogeenreceptoren, progesteronreceptoren en

humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren.

26

4.3. Conclusie en toekomstvisie

Het gebruik van Py230 tumorcellen in C57Bl/6 muizen werd reeds beschreven in de literatuur (Biswas

et al., 2014). Daarentegen werd de intraductale injectie ervan in deze muizenstam nog nooit eerder

uitgevoerd. Deze masterproef heeft dan ook tot doel om de intraductale injectie van deze tumorcellijn

in immunocompetente, C57Bl/6 reportermuizen voor NF-κB te bestuderen en beschrijven, zodat op

termijn de werking van nieuwe, potentiële antitumorale geneesmiddelen in vivo kan worden

geëvalueerd, voorafgaand aan klinische studies op borstkankerpatiënten.

Fig. 13 (Steenbrugge et al., 2016): Een schematische weergave van de melkklier. Het stromale compartiment

bestaat hoofdzakelijk uit vetcellen, terwijl het luminale compartiment vooral uit (myo)epitheelcellen

bestaat. Beide compartimenten worden gescheiden door de basaalmembraan van het melkklierepitheel.

27

5. METEN VAN INFLAMMATIE VIA BIOLUMINESCENTIE

In de vorige rubriek werd het verband tussen NF-κB, inflammatie en tumorgroei besproken. In de

experimenten van deze masterproef willen we dit type inflammatie indirect meten aan de hand van

bioluminescentie in Py230 intraductaal geïnoculeerde NF-κB reportermuizen. Dit wordt in deze

rubriek besproken.

5.1. Bioluminescentie in muismodellen

Bioluminescentie is een reactie die in de natuur frequent voorkomt. In dit type van reacties vindt er

steeds een oxidatie van een substraat plaats, waardoor fotonen worden uitgezonden wat wordt

waargenomen als een lichtsignaal. Voorbeelden van organismen die aan bioluminescentie doen, zijn:

sommige algen, sommige diepzeevissen en vuurvliegjes. Bij deze laatstgenoemde diersoort is de

wetenschap erin geslaagd om het verantwoordelijke gen te identificeren en aan te wenden voor

experimentele doeleinden (Carlsen et al., 2002). Het meest gebruikte gen is het luc-gen van de Noord-

Amerikaanse Photonius pyralis. Een ander en minder gebruikt gen, is het ruc-gen van Renilla

reniformis. Beiden zenden licht uit van een welbepaalde golflengte. Voor luciferase (van het luc-gen)

is dit groen licht met een golflengte van 562 nm, voor het renilla luciferase (van het ruc-gen) is dit

blauw licht met een golflengte van 482 nm. Een ander belangrijk verschilpunt is het substraat van

beide enzymen. Luciferase zet het D-luciferine om tot oxyluciferine met behulp van zuurstof, ATP en

magnesium. Deze reactie wordt weergegeven in Fig. 14. Het renilla luciferase heeft geen cofactoren

nodig. Een nadeel van deze reactie is echter de instabiliteit van het substraat coelenterazine (Akiko et

al., 2004). In de experimenten van deze masterproef wordt daarom gebruik gemaakt van luciferase

en D-luciferine.

Concreet zal bij de in vivo experimenten gebruik gemaakt worden van C57BL/6 muizen, waarbij via

“knock-in” strategieën het luc-gen gekoppeld werd aan het NF-κB gen. Het principe is ook

weergegeven in Fig. 14. Na inoculatie van de tumorcellen ontstaat inflammatie. Tijdens deze

inflammatie wordt het NF-κB gen afgelezen en is er transcriptie van het luc-gen. Daardoor ontstaat

luciferase op de plaats van inflammatie. Als dan het substraat D-luciferine toegediend wordt aan de

muizen, zal deze in aanwezigheid van het lokaal vrijgestelde luciferase, zuurstof, ATP en magnesium,

Fig. 14: De expressie van het luc-gen, gekoppeld aan het NF-κB gen. Na toedienen van het substraat D-

luciferine treedt een lichtreactie op. Deze vrijgestelde bioluminescentie is dus indirect een maat voor NF-κB

activatie.

28

omgezet worden in oxyluciferine. Tijdens deze reactie is er een emissie van fotonen en dit lichtsignaal

kan dan gemeten worden. Een bijkomend voordeel van deze techniek is de opvolging van de

tumorgroei in functie van de tijd, zonder dieren op te offeren.

5.2. Meting van bioluminescentie

De fotonen die ontstaan tijdens de bioluminescente reactie, zijn in staat om weefsels te penetreren

van enkele mm tot cm dik. Een toestel dat uitgezonden fotonen kan waarnemen bestaat uit twee

hoofdcomponenten: een donkere kamer en een lichtgevoelige camera (Akiko et al., 2004). In de

donkere kamer worden de muizen onder gasanesthesie geplaatst. Het is belangrijk dat deze kamer

lichtdicht is, zodat de lichtgevoelige camera geen fotonen meet van buitenaf. Het toestel neemt eerst

een anatomische foto van de verdoofde muis. Daarna worden de uitgezonden fotonen in de weefsels

gemeten door de lichtgevoelige camera. De detectoren in deze camera meten de hoeveelheid fotonen

uitgezonden per lichaamsoppervlakte. Voor de meting van het luciferase signaal is een lichtfilter van

562 nm ideaal. Dit signaal wordt dan omgezet in een tweedimensionaal beeld en vervolgens op de

anatomische foto van de muis gesuperponeerd. Door middel van een kleurschaal wordt de intensiteit

van de lichtreactie weergegeven. Op deze manier wordt dan de mate van inflammatie (NF-κB

activatie) zichtbaar, samen met de anatomische lokalisatie ervan.

5.3. Factoren die de bioluminescente beeldvorming beïnvloeden

Volgens Akiko S. et al. (2004) zijn er een aantal belangrijke factoren waar rekening mee moet

gehouden worden bij bioluminescente beeldvormingstechnieken. Dit zijn (a) het aantal cellen die het

luciferase gen tot expressie brengen, (b) de promotor van het gen, (c) de beschikbaarheid van

cofactoren (ATP, O2 en Mg2+), (d) de tijd tussen toediening van D-luciferine en de meting, (e) de aard

en diepte van de weefsels die overwonnen moeten worden door de fotonen en (f) de aanwezigheid

van pigment in de huid of haren.

In ons experiment zullen we werken met C57BL/6 Tyr-/- albino muizen die het gen voor tyrosinase niet

dragen en bijgevolg niet in staat om pigment aan te maken. Op deze manier wordt de interferentie

van pigment uitgeschakeld (Kocher et al., 2013).

Een andere factor waar rekening mee gehouden moet worden is de aanwezigheid van een

achtergrondsignaal (Carlson et al., 2002). De onderzoeksgroep kon eerder reeds een verhoogde

luminescentie waarnemen in de lymfeknopen van de hals, de thymus en de Peyerse platen van de

Fig. 15A & B: Het imaging toestel (Bron: https://www.ugent.be/di/di07/nl/dienstverlening/gentherapie) en

een foto genomen door dit toestel na injectie subcutaan (linker muis) en intrarenaal (rechter muis) van

luciferase-positieve tumorcellen (Bron: Akiko S. et al., 2004).

29

darm. Ook werd vastgesteld dat bioluminescentie in bepaalde organen (lever, milt, nieren en hart)

minder gemakkelijk te meten was. De verklaring van Carlson et al. (2002) hiervoor, was dat het

hemoglobine in deze goed doorbloedde organen zorgt voor een absorptie van het uitgezonden licht.

Dit is een illustratie dat bioluminescentie afhankelijk is van de aard en de diepte van het weefsel dat

overwonnen moet worden, zoals eerder aangehaald.

6. DE ROL VAN MMP-9, VEGF, CHI3L1 EN LCN2 OP DE TUMORGENESE

In het experimentele deel van deze masterproef zullen we vier glycoproteïnen meten die met

tumorgroei en metastase worden geassocieerd. Dit zijn matrix metalloproteïnase 9 (MMP-9), vascular

endothelial growth factor (VEGF), chitinase 3-like 1 (CH3L1) en lipocaline 2 (LCN2). Deze tumor

geassocieerde glycoproteïnen winnen steeds meer aan belang omdat ze een potentieel

aangrijpingspunt vormen voor antitumorale therapieën. In deze rubriek wordt hun rol tijdens de

tumorgenese beschreven.

6.1. Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9)

Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9), soms ook gelatinase B geheten, is een proteolytisch enzym dat

typisch geassocieerd wordt met tumorprogressie en metastasering (Daniele et al., 2016). Dit

glycoproteïne kan geproduceerd worden door tumorcellen, maar ook door cellen van het omgevende

stroma. Doordat MMP-9 een proteolytische activiteit heeft, kan ze de extracellulaire matrix afbreken

in de directe omgeving van de tumor, waardoor tumorale groei gemakkelijker kan doorgaan.

Bovendien is MMP-9 in staat om onder andere collageen type IV en laminine-5 af te breken, twee

structurele eiwitten die voorkomen in de basaalmembraan van epithelia. Daardoor kunnen

tumorcellen gemakkelijker de basaalmembraan doorbreken, waardoor ze een meer invasief karakter

krijgen. Het is bovendien al langer geweten dat MMP-9 ook angiogenese stimuleert via de productie

van VEGF (Toi et al., 1996). In conclusie geschiedt de rol van MMP-9 op de tumorale groei door:

(1) het bevorderen van tumorprogressie door afbraak van de ECM,

(2) het stimuleren van maligne transformatie door een verhoogde invasiviteit, en

(3) de inductie van VEGF-expressie met tumorale angiogenese tot gevolg.

6.2. Vascular endothelial growth factor (VEGF)

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is een glycoproteïne dat een sleutelrol speelt in de tumorale

groei door de inductie van tumorale angiogenese (Carmeliet, 2005). Zonder de productie van VEGF

kan een tumor niet groter worden dan 1 à 2 millimeter, omdat er dan onvoldoende nutriënten en

zuurstof worden aangevoerd. Men spreekt van een ‘angiogene switch’ wanneer een tumor onder

invloed van hypoxie en andere factoren (bv. MMP-9, zie voor) VEGF begint te produceren, waardoor

een ingroei van bloedvaten in en rond de tumor ontstaat en ze haar exponentiële groei ongehinderd

kan voortzetten. De bloedvaten die ontstaan ten gevolge van tumorale VEGF-expressie zijn structureel

en functioneel abnormaal. Ze vormen geen typische arteriolen, venulen en capillairen, waardoor ze

lekken op meerdere plaatsen en een hoge interstitiële druk veroorzaken. Daardoor is de tumorale

bloedvoorziening suboptimaal, ontstaat hypoxie en wordt de productie van VEGF verder

gestimuleerd. Een vicieuze cirkel wordt zo in stand gehouden. VEGF heeft dus één relevante functie,

nl. de inductie van:

(1) tumorale angiogenese

30

6.3. Chitinase 3-like 1 (CH3L1)

Chitinase 3-like 1 (CH3L1) is een glycoproteïne dat zijn naam heeft gekregen omdat het structureel

sterk verwant is met chitinase. Chitine komt voor in de celwanden van schimmels en in het exoskelet

van sommige insecten. Chitinase wordt daarom door dieren gebruikt om chitine van schimmels te

verteren of het exoskelet van vorm te laten veranderen. Doorheen de evolutie is dit chitinase gen zijn

enzymatische activiteit verloren en kreeg het nieuwe functies. Recent werd beschreven dat CH3L1 een

rol zou spelen bij chronische inflammatie, idiopathische longfibrose en verschillende tumoren. Het

waren uiteindelijk Cohen N. et al. (2017), die aantoonden dat CH3L1 verhoogd tot expressie wordt

gebracht door borstkanker-geassocieerde fibroblasten. Zij konden eveneens een verhoogde expressie

van deze merker aantonen in muriene longmetastasen. Cohen N. et al. (2017) besloten daarom dat

CH3L1 een belangrijke rol speelt in de tumorgenese, omdat dit glycoproteïne:

(1) angiogenese induceert,

(2) chemotactisch inwerkt op macrofagen,

(3) tumorgroei versnelt, en

(4) zorgt voor een verminderde influx van CD8+ T-cellen.

6.4. Lipocaline 2 (LCN-2)

Lipocaline 2 (LCN2) is een proteïne dat behoort tot de familie van de lipocalines. Lipocalines zijn

beschreven als regulatoren van imuunresponsen en het celmetabolisme. Bovendien zouden ze van

belang zijn in het ijzertransport en de synthese van prostaglandines (Shi H. et al., 2008). Lipocalines

zijn eveneens van belang bij het ontstaan van sommige pathologiën, waarbij de rol van LCN2 op de

tumorgenese het best is beschreven. Yang J. et al. (2009) toonden aan dat LCN2 verhoogd tot expressie

gebracht wordt in humane borstcarcinomen. Zij beschreven eveneens dat er minder E-cadherine op

de tumorcellen kon worden aangetroffen na blootstelling aan LCN2. Er werd daarom geconcludeerd

dat LCN2, epitheliaal-mesenchymale transitie (EMT) bevordert. Dezelfde onderzoeksgroep

publiceerde in 2013 dat een verhoging van LCN2 gepaard gaat met een verhoging van vascular

endothelial growth factor (VEGF). De auteurs besloten daarom dat LCN2 eveneens van belang is bij

tumorale angiogenese. Andere onderzoeksgroepen (Leng X. et al., 2009; Shi H. et al., 2008) kwamen

tot dezelfde conclusie als Yang J. et al. (2009). LCN2 wordt als pro-oncogeen beschouwd omdat het

zorgt voor de stimulatie van:

(1) tumorprogressie,

(2) tumorale angiogenese, en

(3) metastasering via EMT.

Fig. 16: De ‘angiogene switch’ onder invloed van VEGF. (Bron:

https://www.nemokennislink.nl/publicaties/stik-er-toch-in/ ,

geraadpleegd op 18 februari 2018).

31

DEEL B: EXPERIMENTEN

1. MATERIALEN EN METHODEN

1.2. Cultuur van Py230 mammatumorcellen

Muriene Py230 mammatumorcellen werden aangekocht bij een erkende verdeler voor cellijnen

(ATCC) en vermeerdert in celcultuurflessen, waarbij het medium (F-12K Medium met 1%

penicilline/streptomycine, 5% foetaal kalfsserum en 0.1% MITO+ Serum Extender) twee maal per

week werd ververst. Na één week werd een sub-celcultuur aangelegd. De tumorcellen werden

geoogst na toevoeging van trypsine-EDTA (0.25%). Het wassen van de celsuspensie geschiedde door

centrifugatie (250 g, 5 minuten, 37°C) en resuspensie van de pellet in PBS. De geoogste Py230

mammatumorcellen werden geteld met een Bürker telkamer.

1.3. Selectie van NF-κB Luc+ transgene muizen

Vrouwelijke C57Bl/6 albinomuizen uit ons eigen kweekprogramma werden gescreend op de

aanwezigheid van het NF-κB-gekoppelde luciferase gen. Dit gebeurde door intraperitoneale injectie

van 200 μl D-luciferine in PBS (2mg/100μl), isofluraan anesthesie en bioluminescente beeldvorming

aan de hand van het ‘In Vivo Imaging System’ (IVIS Lumina II®) (Fig. 15A&B en 17A&B). De muizen

werden conventioneel gehuisvest in een faciliteit met gecontroleerde temperatuur- en relatieve

vochtigheid onder een 12 uur licht / donker cyclus. Voedsel en water waren ad libitum beschikbaar.

Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Commissie ethiek van dierproeven van de

Universiteit Gent (erkenningsnummer: EC2017_80).

1.4. Intraductale injectie van Py230 mammatumorcellen in de melkklier

De gescreende NF-κB luc+ C57Bl/6 muizen werden geanestheseerd aan de hand van een

intraperitoneale injectie van 10 μg/kg buprenorfine en isofluraan-gasanesthesie (2-3% voor inductie,

1-1,5% voor onderhoud en steeds aangevuld met zuurstof). Intraductale injectie van tumorcellen kan

enkel uitgevoerd worden bij lacterende muizen. Paring vond daarom 5 weken voor de start van het

experiment plaats. Wanneer de pups 12 tot 14 dagen oud waren, werden ze gespeend. Eén uur hierna

werden de muizen intraductaal geïnoculeerd met 105 Py230 mammatumorcellen, gesuspendeerd in

Fig. 17A & B: Screening van vrouwelijke C57Bl/6 albinomuizen uit ons eigen kweekprogramma. De muizen

werden na intraperitoneale injectie van D-luciferine in het IVIS Lumina II® toestel geplaatst onder isofluraan

gasanesthesie (linker foto). Bij de middelste muis werd geen bioluminescente lichtreactie waargenomen

(rechter foto), deze muis is dus geen drager van het luciferase gen.

32

een 100 μl koud mengsel van PBS en Matrigel® in een verhouding 1:10 v/v. Injectie gebeurde door

gebruik te maken van een stomp gemaakte 32G naald, na minimale excisie van de tepeltop.

1.5. Analyse van primaire tumorgroei en geassocieerde lokale en systemische

veranderingen

De groei van de primaire mammatumoren werd wekelijks opgevolgd aan de hand van een digitale

schuifpasser. Het tumorvolume werd dan berekend door lengte, breedte en hoogte met elkaar te

vermenigvuldigen. Het humaan eindpunt werd op een tumorvolume van 2 cm³ vastgelegd. Gewichts-

en lichaamstemperatuurveranderingen werden eveneens wekelijks bijgehouden. Daarnaast werden

ook andere parameters beoordeeld om het welzijn van de muizen in te schatten, dit waren

bijvoorbeeld gedrag en vachtkwaliteit. Een scorerooster is toegevoegd als Bijlage I.

Bioluminescentie beeldvorming werd uitgevoerd op zowel de primaire mammatumoren in vivo als de

verschillende organen ex vivo. Deze metingen gebeurden met het IVIS Lumina II-systeem, dat reeds

werd besproken in ‘Deel A: 5. Meten van inflammatie via bioluminescentie’. De muizen kregen eerst

een intraperitoneale injectie van 200 μl D-luciferine in PBS (2 mg/100 μl). Bioluminescentie werd 10

minuten na deze injectie gemeten en uitgedrukt in de logaritmische eenheid flux, een eenheid die het

aantal fotonen weergeeft dat per seconde op de detector inslaat. Om de flux densiteit te berekenen

werd er vervolgens gedeeld door gemeten oppervlakte, in dit geval de regio van het derde klierpaar.

De totale flux densiteit laat toe om de luminescente reactie van de primaire mammatumoren op

verschillende tijdstippen te vergelijken, omdat deze waarden onafhankelijk zijn van de absolute

oppervlakte waarover werd gemeten (normalisatie per cm2).

Op drie tijdstippen, nl. 11 dagen, 3 en 6 weken vond er opoffering plaats van telkens enkele muizen.

Deze werden eerst verdoofd door intraperitoneale injectie van 1 ml ketamine (100 mg/kg) en xylazine

(10 mg/kg). Na enkele minuten werden deze dan geëuthanaseerd via cervicale dislocatie. Primaire

mammatumoren, milt, lymfeknopen, longen en lever werden gedissecteerd en in het IVIS Lumina II-

toestel geplaatst om de bioluminescentie ex vivo te bepalen. Alle gedissecteerde organen werden

daarna gewogen. Vlak voor de cervicale dislocatie werd er eveneens een intracardiale punctie

uitgevoerd om bloed te bekomen, dat vervolgens werd gecentrifugeerd (19000 g, 1 uur, 4°C). Het

bekomen serum werd daarna gepipetteerd naar een nieuw epje.

1.6. Histologische evaluatie van primaire mammatumor, milt en metastasen

(lymfeknoop, long en lever)

Alle organen en weefsels werden gefixeerd in een 4% gebufferde formaldehyde-oplossing gedurende

24 uur. Deze werden daarna bewaard in 70% ethanol om vervolgens ingebed te worden in paraffine.

Aan de hand van een microtoom werden coupes van 5 μm gesneden en vervolgens

gedeparaffiniseerd, gehydrateerd en gekleurd met Hematoxyline & Eosine (H&E). De coupes werden

opnieuw gedehydrateerd en gemonteerd op een draagglas om ze onder de lichtmicroscoop te

beoordelen.

1.7. Immunohistochemie

Voor immunohistochemische kleuringen (IHC) werden coupes van 2-3 μm gedeparaffiniseerd en

behandeld onder druk bij 95°C met een citraatbuffer (10 mM tri-natriumcitraat aangevuld met 0,05%

Tween-20, pH 6) gedurende 30 minuten voor antigeenretrieval. De draagglaasjes werden vervolgens

afgekoeld tot kamertemperatuur (KT) gedurende 30 minuten, waarna endogene peroxidase-activiteit

werd geblokkeerd met 3% H2O2 in methanol (voor Ki67, CD45, Ly6G, CD163 en CD31) of 0,6% H2O2 in

methanol (voor CD8a) gedurende 10 minuten bij KT. Serumvrije proteïneblokker werd gedurende 10

33

minuten bij KT aangebracht om aspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren. De draagglaasjes werden

vervolgens geïncubeerd met verdund primair antilichaam gedurende 1 uur bij KT. Na de nodige

wasstappen werden de draagglaasjes met het secundaire antilichaam geïncubeerd gedurende 15

minuten indien anti-muis of 30 minuten indien anti-rat, eveneens bij KT. Daarna werd een di-amino-

benzidine (DAB) buffer aangebracht gedurende 10 minuten, waarna werd gewassen met gedestilleerd

water. Ten slotte werden de preparaten gekleurd met hematoxyline en opnieuw gedehydrateerd. De

wasstappen werden uitgevoerd met een tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 2 minuten bij

KT en telkens drie maal herhaald. Alle incubatie- en wasstappen vanaf de blokkering van de

peroxidase-activiteit tot de stap waar DAB op de preparaten wordt gebracht, werden uitgevoerd op

een schudder aan 20 rpm in een gesloten preparaathouder voor microscoopglaasjes (vochtige kamer

door papier gedrenkt in TBS).

De gebruikte primaire antilichamen zijn samen met hun verdunning en doelwitcel weergegeven in

Tabel 1. De secundaire antilichamen waren anti-muis antistoffen voor CD45, Ly6G, CD8a en anti-konijn

antistoffen voor Ki67, CD163 en CD31.

1.8. Flowcytometrie

Op de drie tijdstippen van opoffering (11 dagen, 3 en 6 weken) werden drie primaire mammatumoren

willekeurig geselecteerd en onderworpen aan een flowcytometrische analyse. Eerst werd een

‘gentleMACS’-digestie (Miltenyi®) uitgevoerd. De primaire mammatumoren werden in kleine stukjes

van 2-4 millimeter gesneden en samen met 2,5 ml van een commercieel bereid enzymmengsel (tumor

dissociatie kit; Miltenyi®) overgebracht in een gentleMACS C-tube, waarna het programma

m_impTumor_02 werd uitgevoerd door het gentleMACS toestel. Na beëindiging van dit programma

werd de gentleMACS C-tube ontkoppeld van de dissociator en gedurende 40 minuten geïncubeerd bij

37°C aan 40 rpm. Daarna werd de C-tube terug aangekoppeld en werd het m_impTumor_02

programma twee maal achter elkaar uitgevoerd. Ten slotte werd de suspensie dan overgeheveld naar

een MACS SmartStrainer (70 μm).

De MACS SmartStrainer werd daarna met 10 ml RPMI 1640 gewassen en overgebracht naar een

nieuwe Falcontube, die vervolgens werd gecentrifugeerd (7 min., 450G). Na afgieten van het

supernatans werd de pellet geresuspendeerd in 1 ml RPMI 1640 waarvan 100 μl werd overgebracht

in een welletje van een 96-well plaat (met V-bodem). De suspensie werd dan een eerste keer geteld

aan de hand van de flowcytometer (Analis®, Cytoflex). Daarna werd er opnieuw gecentrifugeerd (7

min., 450G) en werd de cel pellet opgelost in Fc-Blok (BD®), dat 1/10 werd verdund in Facsbuffer (voor

Primair antilichaam Verdunning Merker voor

Anti-Ki67 1:50 Tumorcellen

Anti-CD45 1:1000 Immuuncellen

Anti-Ly6G 1:1000 Neutrofielen

Anti-CD163 1:500 Protumorigene macrofagen

Anti-CD31 1:2000 Endotheelcellen

Anti-CD8a 1:50 Cytotoxische T-cellen

Tabel 1: Weergave van de aangewende primaire antilichamen met respectievelijk hun gebruikte verdunning

en doelwitcel voor de immunohistochemische evaluatie van de primaire mammatumoren.

34

500 ml Facsbuffer werd 5 g BSA en 365 mg EDTA-dinatriumzout opgelost in PBS met 500 μL 10%

natriumazide).

Vervolgens werd 100 μL van elke celsuspensie in de 96-well plaat gebracht en 10 minuten lang

geïncubeerd bij 4°C. De 96-well plaat werd dan opnieuw gecentrifugeerd (5 min., 450G) en na afgieten

van het supernatans werd dan 100 μL van de drie verschillende primaire antilichaamcombinaties

toegevoegd aan elke celsuspensie (Tabel 2). Een deksel werd op de plaat gebracht en deze werd dan

gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 4°C. Daarna werd gecentrifugeerd (5 min., 450G) en gewassen

(200 μl Facsbuffer). Ten slotte werd, enkel indien het primair antilichaam niet direct geconjugeerd

was, 100 μL secundair toegevoegd aan de welletjes (Tabel 2) en 15 minuten geïncubeerd bij 4°C.

Opnieuw werd daarna gecentrifugeerd aan 450G gedurende 5 minuten. Na het uitvoeren van een

nieuwe wasstap werd 100 µl Facsbuffer toegevoegd aan elke well en 2 µl propidiumiodide (PI) voor

elke celsuspensie toegevoegd aan een welletje zonder antilichamen.

Antilichaam

(Primair)

Label Verdunning

Primair

Antilichaam

(Secundair)

Verdunning

Secundair

Merker voor

Anti-CD45 Biotine 1:200 Streptavidine PE 1:333 Immuuncellen

Anti-CD45 Biotine 1:200 Streptavidine eFluor 1:80 Immuuncellen

Anti-F4/80 APC 1:20 / / Macrofagen

Anti-Ly6G APC 1:10 / / Neutrofielen

Anti-CD3 FITC 1:50 / / T-cellen

Anti-CD4 PE 1:80 / / Helper T-cellen

Anti-CD8a APC 1:80 / / Cytotoxische T-cellen

Antilichaamcombinaties

Combinatie 1 Anti-CD45 + Anti-F4/80

Combinatie 2 Anti-CD45 + Anti Ly6G

Combinatie 3 Anti-CD45 + Anti-CD3 + Anti-CD4 + Anti-8a

Tabel 2: Weergave van de primaire antilichamen met hun doelwitcel en aangewende verdunning voor

flowcytometrische detectie van verschillende types immuuncellen in de primaire mammatumoren.

Fluorescentie van CD45-positieve immuuncellen geschiedde door toevoeging van een secundair met

streptavidine-gemerkte fluorochromen. De verschillende antilichaamcombinaties zijn eveneens

weergegeven.

35

1.9. Expressie van MMP-9, VEGF, CHI3L1 en LCN2

Een deel van de geïsoleerde primaire mammatumoren, milten en axillaire lymfeknopen werden met

een mixer gehomogeniseerd. Cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd door dit homogenaat te

mengen met 300 μl lysebuffer (1% Nonidet P40, 10 mM Tris-HCl met pH 7,4, 200 mM NaCl, 5 mM

EDTA en 10% glycerol), aangevuld met proteaseremmers (100 μM fenylmethylsulfonylfluoride); 0,15

μM aprotinine; 2,1 μM leupeptine en 1 mM geoxideerd L-glutathion). De mengsels werden overnacht

bewaard bij -20°C en de volgende dag gecentrifugeerd (19000 g, 1 uur, 4°C). Het supernatans werd

overgebracht in een nieuw epje en hierop werden vervolgens de eiwitconcentraties bepaald aan de

hand van coomassie blauw kleuring en spectrofotometrie. Lysaten en sera werden bewaard bij -80°C

en ontdooid bij KT voor verdere analyse via ELISA. De lichtabsorptie werd gemeten bij een golflengte

van 450 en 550 nm (optische densiteit, OD). Een correctie voor optische imperfecties werd uitgevoerd

door de OD-waarden bekomen bij 550 nm af te trekken van deze bij 450 nm. De concentraties van

MMP-9, VEGF, CHI3L1 of LCN2 werden in de stalen bepaald door de gemeten optische densiteit af te

lezen op de corresponderende standaardcurve.

1.10. Statistische analyse

Analyse van de variantie (ANOVA) met Tukey HSD als post-hoc test werd gebruikt voor de analyse van

de gegevens bekomen na meting van meer dan twee tijdspunten. Eénzijdige T-testen werden gebruikt

om de P-waarden van de gegevens tussen 2 tijdspunten of parameters te berekenen.

Normaalverdeling van de gegevens werd steeds gecontroleerd. Indien nodig, werd een log10-

transformatie uitgevoerd om een normaalverdeling te kunnen bekomen. P-waarden onder 0,05

werden als statistisch significant beschouwd. Alle statistische analyses werden uitgevoerd in

Graphpad®.

36

1.11. Tijdlijn van het Py230 intraductale tumor experiment

37

2. RESULTATEN

2.1. Primair mammatumorvolume en gewicht van primaire mammatumoren, milt en

axillaire lymfeknopen

Onderstaande grafieken (Fig. 18A-D) tonen volume- en gewichtsverandering van de primaire

mammatumoren en de gewichtsveranderingen van de milt en de axillaire lymfeknopen. Het

tumorvolume werd niet-invasief bepaald via een schuifpasser, waardoor er voor die parameter meer

tijdspunten zijn dan voor de overige drie parameters. Deze laatsten werden bepaald na opoffering van

telkens 5 muizen per tijdstip, nl. op 11 dagen, 3 weken en 6 weken post-intraductale injectie van de

Py230 mammatumorcellen.

Het gemiddelde tumorvolume was op 6 weken significant groter (P < 0.001; n = 5) dan dat van de vijf

vroegere tijdspunten (Fig. 18A). Het gemiddelde tumorgewicht was op 6 weken ook significant (P <

0.01; n = 5) groter dan dat van beide vroegere tijdspunten (Fig. 18B). Het humaan eindpunt dat was

Fig. 18A tot D: Evolutie van primair tumorvolume (A) en gewicht van de primaire mammatumor (B), de milt (C)

en de axillaire lymfeknopen (D). ). ** staat voor P < 0.01 en *** staat voor P < 0.001.

A B

v

C D

38

vastgelegd op een tumorvolume van 2,0 cm³ of indien ulceratie van de primaire mammatumoren zou

plaatsvinden, werd bereikt bij 3 van de 8 muizen op 6 weken post-inoculatie (p.i.). Het langer

aanhouden van de muizen was daarom ethisch onaanvaardbaar. Daarnaast werd eveneens een sterke

miltvergroting vastgesteld tussen 3 en 6 weken p.i. (Fig. 18C). Op 6 weken p.i. was er ook een

vergroting van de axillaire lymfeknopen zichtbaar, maar de vergroting tussen 11 dagen en 3 weken

ging niet in stijgende lijn (Fig. 18D). Er kon voor deze beide, laatste fenomenen geen significantie

worden aangetoond.

2.2. H&E lichtmicroscopie en Ki67 IHC van de primaire mammatumoren

Om de primaire mammatumorgroei microscopisch te bestuderen, werd naast H&E ook een IHC

uitgevoerd voor het nucleair proteïne Ki67, als merker voor cellulaire proliferatie. De onderstaande

representatieve beelden illustreren dat op 11 dagen p.i. de Py230 mammatumorcellen volledig

gelokaliseerd waren in de melkkliergangen (Fig. 19A-D). Op 3 weken p.i. was dit aantal in de

melkkliergangen duidelijk toegenomen (Fig. 19E-H). Vanaf 6 weken p.i. was er een duidelijke

doorbraak van de tumorcellen in het onderliggende mammair vetweefsel zichtbaar (Fig. 19I-J).

A B

39

C D

E F

G H

40

Fig. 19A tot J: Hematoxyline & Eosine (H&E) lichtmicroscopie en Ki67 IHC op paraffinecoupes van de primaire tumoren op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i.. Ki67 is een

proliferatiemerker en kleurt de kernen van delende cellen (o.a. tumorcellen) aan.

I J

41

2.3. Evolutie van NF-κB-activiteit tijdens de primaire tumorgroei

2.3.1. In vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren

De in vivo bioluminescentie op 6 weken p.i. was significant (P < 0.05; n = 5) hoger dan deze gemeten

op de 6 vroegere tijdspunten (Fig. 20).

2.3.2. Ex vivo bioluminescentie NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren en de axillaire

lymfeknopen

Op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i. werden telkens enkele muizen opgeofferd en van zowel de primaire

mammatumoren als de axillaire lymfeknopen werd de ex vivo bioluminescentie gemeten. Voor de

primaire mammatumoren was er een duidelijke trend tot stijging van de NF-κB activiteit in functie van

de tijd (Fig. 21A). Echter, voor de axillaire lymfeknopen was dit enkel het geval voor de verandering

tussen 3 en 6 weken p.i. (Fig. 21B). Er kon voor beide ex vivo metingen geen significantie worden

aangetoond.

A

Fig. 20: Evolutie van de in vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren. * staat

voor P < 0.05.

42

Fig. 21A en B: Evolutie van de ex vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren

(A) en de axillaire lymfeknopen (B).

B

43

2.4. CD45, CD163, Ly6G en CD8a IHC evaluatie in de primaire mammatumoren

IHC merker (I), evolutie (E) en lokalisatie (L)

11 Dagen p.i.

3 Weken p.i.

6 Weken p.i.

I: CD45 (immuuncellen) E: Toename op 6 weken L: Tumoraal Stroma

I: CD163 (M2-macrofagen) E: Toename op 6 weken L: Tumoraal Stroma

44

IHC merker, evolutie en lokalisatie

11 Dagen p.i.

3 Weken p.i.

6 Weken p.i.

I: Ly6G (neutrofielen) E: Toename op 6 weken L: Primaire tumor

I: CD8a (Cytotoxische T-cellen) E: Toename op 6 weken L: Primaire tumor

45

2.5. Flowcytometrische evaluatie van de lokale immuuncelinflux in de primaire

mammatumoren

Om de immunologische samenstelling van de primaire tumoren beter te bestuderen, werd naast IHC

ook een flowcytometrische analyse uitgevoerd. De manier waarop de bekomen data werden

geanalyseerd is relatief complex, en wordt daarom eerst toegelicht.

2.5.1. Methodiek

2.5.1.1. “Gating strategy”

Onderstaand is de ‘gating strategy’’ zoals werd toegepast voor een representatieve muis weergegeven

(Fig. 22A-I). Deze werd voor alle muizen en alle tijdspunten steeds aangehouden.

Eerst wordt celdebris geëxcludeerd op basis van forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC). Onder

celdebris worden alle partikels uit het tumorweefsel verstaan die geen cellen zijn, maar wel door de

flowcytometer werden gedetecteerd. Dit zijn bijvoorbeeld de collageen- en elastinevezels van de

extracellulaire matrix. Debris heeft typisch een lage FSC, waardoor deze populatie gemakkelijk

uitgesloten kan worden door te ‘gaten’ op een dotplot waarin FSC werd uitgezet tegenover SSC (Fig.

22A).

Vervolgens worden celaggregaten uitgesloten aan de hand van de hoogte (Height, H) versus

oppervlakte (Area, A). Wanneer een enkelvoudige cel doorheen de laser in de flowcytometer passeert,

is de gemeten verhouding tussen H van die cel en haar A min of meer constant. Met andere woorden:

hoe hoger de cel, hoe groter haar oppervlak. Wanneer A dan wordt uitgezet tegenover H in een dot

plot, zullen alle enkelvoudige cellen op een rechte vallen. Celaggregaten hebben typisch een hogere

A gemeten voor een bepaalde H, waardoor deze kunnen worden uitgesloten op een dotplot (Fig. 22B).

In de volgende stap (Fig. 22C) worden enkel de cellen geselecteerd die positief zijn voor het

fluorochroom waarmee het primair of eventueel secundair antilichaam gelabeld is (Tabel 2). De grens

voor een positief signaal werd ingesteld aan de hand van twee negatieve controles nl. de

autofluorescentie en het isotype. De autofluorescentie is de fluorescentie gemeten op dezelfde

celsuspensie, maar zonder toevoeging van antistoffen. Het isotype is de fluorescentie gemeten op de

celsuspensie met toevoeging van isotype-controle antistoffen om aspecifieke binding na te gaan. De

fluorescentie intensiteit die hoger is dan deze beide negatieve controles wordt beschouwd als een

(A) (B)

46

positief signaal. Hierbij werd steeds een maximale overlapping van 5% tussen de negatieve controles

en het staal toegelaten.

2.5.1.2. Afbakening van de populatie macrofagen

Het aandeel macrofagen binnen de populatie immuuncellen wordt bepaald zoals weergegeven in

onderstaand histogram (Fig. 22D). Binnen de CD45+ populatie werd gekeken naar bijkomende APC

fluorescentie. APC is immers het fluorochroom dat werd gekoppeld aan antistoffen tegenover F4/80,

een moleculaire merker op de celmembraan van macrofagen (Tabel 2). Voor de afbakening werd

opnieuw een overlap van maximaal 5% tussen het isotype en het staal toegelaten.

2.5.1.3. Afbakening van de populatie neutrofielen

Analoog aan de afbakening van macrofagen, werd ook het aandeel neutrofielen in de primaire tumor

bepaald zoals weergegeven in onderstaand histogram (Fig. 22E). Het belangrijkste verschil hier is dat

het APC-fluorochroom nu werd gekoppeld aan antistoffen gericht tegenover Ly6G, een moleculaire

merker voor neutrofielen (Tabel 2).

(C)

(D)

47

2.5.1.4. Afbakening van de CD3+, CD4+ en CD8+ T-cellen

Aan de celsuspensie van de primaire tumoren werden fluorochroom-gemerkte antistoffen

toegevoegd voor CD45, CD3, CD4 en CD8. In deze combinatie aan antilichamen, werd gewerkt met

CD45 antistoffen gekoppeld aan eFluor in plaats van PE (Tabel 2). De afbakening van CD45+ cellen is

opnieuw weergegeven in onderstaand histogram (Fig. 22F). De overige antistoffen tegenover CD3,

CD4 en CD8 werden fluorescent gemerkt met respectievelijk FITC, PE en APC (Tabel 2).

Vervolgens werd binnen deze CD45+ populatie, de CD3+ lymfocyten bepaald. De afbakening tussen

het isotype en de CD3+ celpopulatie was echter niet éénduidig (Fig. 22G). De grens werd daarom

geverifieerd via ‘backgating’ vanuit de CD4+ en CD8+ celpopulatie, aangeduid met een rode kleur (Fig.

22H). Opnieuw werd een maximale overlapping tussen isotype en staal van 5% gerespecteerd.

(F)

(E)

48

In de laatste stap wordt dan de APC fluorescentie uitgezet tegenover die van PE (Fig. 22I). T-

helpercellen zijn PE positief en APC negatief, terwijl dit omgekeerd is voor de cytotoxische T-cellen.

(G) (H)

(I)

Fig. 22A tot I: “Gating strategy” van de flowcytometrische evaluatie voor de lokale immuuncelinflux in de

primaire mammatumoren.

49

% Dode cellen

(PI+ / All Single Cells) x 100

27,46

17,92

22,97

13,63

21,63

PI+ niet gemeten

12,22

31,64

18,26

2.5.2. Resultaten

2.5.2.1. Het percentage immuuncellen, macrofagen en neutrofielen in de primaire

mammatumoren

Het percentage CD45+ cellen (immuuncellen) werd berekend op het totaal aantal enkelvoudige cellen,

na exclusie van debris en celaggregaten. Binnen deze populatie immuuncellen werd dan gekeken naar

het aandeel (percentage) viabele (PI-) macrofagen en neutrofielen.

2.5.2.2. Het percentage CD3+, CD4+ en CD8+ cellen in de primaire mammatumoren

Het percentage CD3+ cellen (T-cellen) werd berekend binnen de populatie CD45+ cellen

(immuuncellen). Binnenin deze populatie immuuncellen werd dan gekeken naar het percentage CD4+

en CD8+ T-cellen, dit zijn respectievelijk de T-helpercellen en cytotoxische T-cellen. Er vond geen

flowcytometrische analyse plaats van T-cellen op 11 dagen p.i., omdat deze aan de hand van de IHC

coupes weinig belangrijk werden geacht op dit vroege tijdspunt.

% Immuuncellen

(CD45+ / All Single Cells) x 100

1 5,26

2 3,48

3 3,82

4 9,62

5 6,11

6 8,54

7 59,89

8 36,91

9 38,78

Tijd Post - inoculatie Muisnummer

11 dagen

3 weken

6 weken

% Macrofagen in CD45+ % Neutrofielen in CD45+

(F4/80+ / CD45+) x 100 (Ly6G+ / CD45+) x 100

40,88 4,04

43,68 2,40

41,25 0,80

15,95 0,46

35,16 0,67

34,95 1,92

25,93 2,92

21,84 28,49

25,28 6,51

Tabel 3: Het percentage immuuncellen, macrofagen en neutrofielen in de primaire mammatumoren.

50

2.6. Matrixdegradatie en vaatvorming in het tumoraal milieu (lokaal) en serum

(systemisch)

2.6.1. Evolutie van MMP-9 in de primaire mammatumor en serum

De onderstaande grafieken geven de MMP-9 concentratie weer in de primaire mammatumor en

serum. In de primaire mammatumor is er op 6 weken p.i. een significante (P < 0.001; n = 5) stijging

van de MMP-9 concentratie ten opzichte van alle andere tijdspunten (Fig. 23A). Bovendien stijgt de

MMP-9 concentratie in functie van de tijd. Op 6 weken p.i. is de concentratie van MMP-9 in serum

ook significant verschillend (P < 0.05; n = 5) van deze op 3 weken en van de concentratie gevonden in

serum van gezonde muizen, maar niet van deze op 11 dagen (Fig. 23B). De concentraties van MMP-9

zijn hoger in serum dan in de primaire mammatumor.

% T - cellen in CD45+

(CD3+ / CD45+) x 100

4 8,65

5 4,48

6 4,04

7 20,15

8 26,24

9 32,00

6 weken

Tijd Post - inoculatie Muisnummer

3 weken

% T - cellen in CD45+

(CD3+ / CD45+) x 100

4 8,65

5 4,48

6 4,04

7 35,04

8 26,24

9 32,00

6 weken

Tijd Post - inoculatie Muisnummer

3 weken

Fig. 23A & B: Evolutie van de MMP-9 concentraties in de primaire mammatumor (A) en serum (B). * staat

voor P < 0.05 en *** staat voor P < 0.001.

A B

% T - cellen in CD45+ % T - Helpercellen in CD3+ % Cytotoxische T - cellen in CD3+

(CD3+ / CD45+) x 100 (CD3+CD4+ / CD45+) x 100 (CD3+CD8+ / CD45+) x 100

8,65 65,97 7,64

4,48 48,60 4,67

4,04 44,33 7,22

35,04 36,52 45,13

26,24 23,27 51,93

32,00 31,79 51,04

Tabel 4: Het percentage CD3+, CD4+ en CD8+ cellen in de primaire mammatumoren.

51

2.6.2. Evolutie van VEGF in de primaire mammatumor en serum

Onderstaande grafieken zijn een weergave van de concentratie van VEGF in de primaire mammatumor

(Fig. 24A) en het serum (Fig. 24B). De concentraties van VEGF in de primaire mammatumor en het

serum gemeten 6 weken p.i. zijn significant (P < 0.05; n = 5) verschillend van alle andere tijdstippen,

behalve voor de concentratie gemeten in gezonde melkklieren. De concentratie van VEGF is hoger in

de primaire mammatumor dan in het serum.

2.6.3. CD31 IHC evaluatie van de tumorale vaatvorming

Om de groei van bloed- en lymfevaten (aanvullend op VEGF) als parameter te kunnen bestuderen,

werd een IHC uitgevoerd voor CD31. Dit is een moleculaire merker die voorkomt op de celmembraan

van endotheelcellen. Een toename van de CD31 kleuring is zichtbaar 6 weken p.i. en is zowel in de

primaire mammatumor als het tumoraal milieu gelokaliseerd.

11 Dagen p.i. 3 Weken p.i. 6 Weken p.i.

Fig. 24A & B: Evolutie van de VEGF concentraties in de primaire mammatumor (A) en serum (B). * staat voor

P < 0.05.

A B

Fig. 25: IHC kleuring voor CD31 op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i.

52

2.7. Evolutie van CHI3L1 en LCN2 in de primaire mammatumor, de milt, de axillaire

lymfeknopen en serum

2.7.1. CHI3L1

Onderstaande grafieken geven de evolutie van de concentratie van CHI3L1 weer in de primaire

mammatumor, het serum, de milt en de axillaire lymfeknopen. In de primaire mammatumor is er geen

enkele trend, noch enige significantie waar te nemen (Fig. 26A). Er is daarentegen een significante (P

< 0.001; n = 5) stijging van CHI3L1 te zien in serum, 6 weken p.i. (Fig. 26B). Op 11 dagen en 6 weken

p.i. is er ook in de milt een significante (P < 0.05; n = 5) stijging van CHI3L1, maar enkel ten opzichte

van de waarden die werden gemeten in gezonde muizen (Fig. 26C). Verder zijn er ook hogere waarden

gemeten in de axillaire lymfeknopen, maar dit is opnieuw zonder significantie (Fig. 26D).

Fig. 26A tot D: Evolutie van de CHI3L1 concentraties in de primaire mammatumor (A), serum (B), milt (C) en

axillaire lymfeknopen (D). * staat voor P < 0.05 en *** staat voor P < 0.001.

2.7.2. LCN2

Onderstaande grafieken geven de evolutie van de concentratie LCN2 in de primaire mammatumor,

het serum, de milt en de axillaire lymfeknopen. Deze zijn op 6 weken p.i. steeds significant (P < 0.001,

P < 0.01 of P < 0.05; n = 5) verschillend van alle andere gemeten tijdspunten en van de concentratie

gevonden in gezonde muizen (Fig. 27A-D). De gemiddelde concentratie gemeten 6 weken p.i. is

vergelijkbaar in de primaire mammatumor en het serum. Op dit tijdstip is de gemiddelde concentratie

in de milt ongeveer de helft hiervan. In de lymfeknopen is deze lager, nl. gemiddeld 0.2 x 106 pg/ml.

A B

C D

53

Fig. 27A tot D: Evolutie van de LCN2 concentraties in de primaire mammatumor (A), serum (B), milt (C) en

axillaire lymfeknopen (D). * staat voor P < 0.05; ** staat voor P < 0.01 en *** staat voor P < 0.001.

A B

C D

54

3. DISCUSSIE

3.1. Bespreking van de primaire tumorgroei en -progressie

De groei van de primaire tumoren in de tijd vertoonde een exponentieel verloop. Op 6 weken p.i.

waren de primaire tumoren sterk toegenomen, zowel in volume als in gewicht. Het langer aanhouden

van de muizen was ethisch onaanvaardbaar aangezien het tumorvolume dan de vooropgestelde grens

van 2,0 cm³ zou overschrijden. Deze toename in tumorvolume en -gewicht was in overeenstemming

met de waargenomen lokale groei via de kwalitatieve H&E histologie en Ki67 IHC. De coupes toonden

eveneens aan dat dit intraductaal muismodel tot 3 weken p.i. representatief was voor de situatie van

een ductaal carcinoma in situ (DCIS) bij de mens. Tussen 3 en 6 weken p.i. evolueerde de DCIS tot een

invasief ductaal carcinoma (IDC), zoals besproken sub 1.3.1. in de literatuurstudie van deze

masterproef. De doorbraak in het onderliggend mammair bind- en vetweefsel kon bovendien

gecorreleerd worden met de significante toename van MMP-9, een enzyme dat verantwoordelijk

wordt geacht voor extracellulaire matrixdegradatie (Bergers et al., 2000).

Bijkomend kon uit de evolutie van de VEGF concentratie in de primaire tumoren, en de bijhorende

kwalitatieve CD31 IHC detectie besloten worden dat er ook een sterke lokale angiogenese plaatsvond

op 6 weken p.i. Deze bloedvatvorming is cruciaal voor de toevoer van zuurstof en nutriënten naar de

exponentieel groeiende mammatumorcellen. Desondanks ontstaan er in veel mammatumoren

hypoxemische regio’s gekenmerkt door necrose (Steenbrugge et al., 2016). Histologie van de primaire

tumoren in dit model toonde echter geen duidelijke tekenen van hypoxie-geïnduceerde necrose. Er

kan dus aangenomen worden dat de exponentiële groei toch voldoende opgevangen wordt door

VEGF-gemedieerde angiogenese.

Een onverwachte observatie was dat er, ondanks de evolutie van DCIS naar IDC stadium met

bijhorende matrixdegradatie en angiogenese, geen macroscopisch waarneembare metastasen

aanwezig waren tot op het humaan eindpunt 6 weken p.i.

3.2. Bespreking van de lokale inflammatoire respons

Een exponentiële toename van het bioluminescent signaal voor NF-kB, gecorreleerd met de sub 3.1

beschreven tumorgroei, was zichtbaar in de primaire tumoren zowel in als ex vivo. Dit wijst op een

toename van de lokale inflammatie in functie van de tijd. In tegenstelling tot de in vivo data, was deze

toename niet significant bij de ex vivo metingen. Nochtans werd verwacht dat het bioluminescent

signaal net sterker zou zijn na dissectie van de organen. Een verklaring is de lange tijdsduur tussen de

injectie van D-luciferine (het substraat voor luciferase geproduceerd door de gastheercellen) en de ex

vivo metingen, met uitwerking van het D-luciferine en dus een verlies van bioluminescent signaal. In

vivo ‘imaging’ van de tumorale inflammatie, waarbij het bioluminescent signaal voor NF-kB

gegenereerd wordt door de gastheer (en dus niet door de mammatumor cellijn), werd nog niet

beschreven bij een intraductaal muismodel.

Uit de flowcytometrische analyse van de primaire mammatumoren kon besloten worden dat: 1) het

aantal immuuncellen in de primaire mammatumor en het micromilieu toenamen in functie van de

tumorprogressie, 2) er een percentuele daling was van het aandeel macrofagen binnen de populatie

immuuncellen, 3) neutrofielen slechts een klein percentage vormden van de totale populatie

immuuncellen, maar er wel een stijging was 6 weken p.i., 4) T-cellen het sterkst stijgend type

immuuncellen waren en 5) er binnenin deze populatie T-cellen een verschuiving plaatsvond van T-

helpercellen naar cytotoxische T-cellen. Hierbij moet er een belangrijke opmerking gemaakt worden,

nl. dat het absolute aantal macrofagen wél degelijk steeg in functie van de tijd, maar dat deze

populatie relatief daalde binnen de sterker stijgende totale populatie aan immuuncellen.

55

Deze toename aan een lokale inflammatoire respons werd kwalitatief bevestigd via IHC. Meer

specifiek was er binnenin deze stijgende populatie immuuncellen een toename zichtbaar aan M2-

macrofagen, neutrofielen en cytotoxische T-cellen (CD45 als algemene leukocytmerker; CD163, Ly6G

en CD8a, respectievelijk). Niettegenstaande dat de kwantitatieve stijging aan neutrofielen beperkt

was, mag deze daarom niet als onbelangrijk worden beschouwd. Recent werd namelijk aangetoond

dat neutrofielen samen met T-cellen de metastasering van borstkanker kunnen bevorderen (Coffelt

et al., 2015; Wculek et al., 2015). Cytotoxische T-cellen waren percentueel het sterkst stijgende

immuunceltype in de primaire mammatumoren . Deze zeer belangrijke bevinding wijst op een

uitgesproken inflammatoire en antitumorale respons vermits cytotoxische T-cellen de tumorale groei

kunnen inhiberen door inductie van apoptose (Bakshi et al., 2014). Merk op dat tumorcellen hiervoor

dan wel gevoelig moeten zijn, wat soms niet meer het geval is omdat ze het benodigde mechanisme

kunnen uitschakelen (Debatin, 2004). Bovendien staat de waargenomen absolute stijging van M2-

macrofagen in contrast met de toename aan cytotoxische T-cellen, omdat M2-macrofagen net een

anti-inflammatoire en pro-tumorigene functie hebben (Allavena et al., 2008).

3.3. Bespreking van de tumor-geassocieerde veranderingen in de milt en lymfeknopen

Het gewicht van de milt en de axillaire lymfeknopen was toegenomen 6 weken p.i., alhoewel niet-

significant. Een mogelijke verklaring hiervoor is de beperkte steekproefgrootte in deze “proof-of-

concept” studie. Er was wel een trend zichtbaar in de toename van het tumorvolume en -gewicht

enerzijds en het gewicht van de milt en axillaire lymfeknopen anderzijds. Hoe groter de primaire

tumoren werden, hoe groter de milt en axillaire lymfeknopen. Dit fenomeen kan verklaard worden

door het op gang komen van een systemische inflammatie geassocieerd met progressie van de

primaire tumoren (Steenbrugge et al., 2016). De toegenomen serumconcentraties van CHI3L1 en LCN2

waren een bevestiging voor deze hypothese. Beide laatst vermeldde biomerkers werden relatief

recent ontdekt en worden momenteel als prognostische ‘tool’ voor menselijke borstkankerpatiënten

voorgesteld (Johansen et al., 2006; Bauer et al., 2008; Wan G. et al., 2017). Om na te gaan of dit ook

toepasbaar was in ons muismodel, werden CHI3L1 en LCN2 concentraties bepaald in lysaten van zowel

de primaire tumoren, axillaire lymfeknopen en milt en vergeleken met deze in serum. CHI3L1 bleek

daarbij een goede systemische merker voor tumorprogressie, indien gemeten in lysaten van de milt

of in serum. Echter, deze biomerker was niet geschikt voor de beoordeling van de lokale

tumorprogressie, aangezien de concentraties in de primaire tumor niet-significant verschilden van de

concentraties op de vroegere tijdspunten noch van gezonde muizen. In de axillaire lymfeknopen was

wel een stijging in functie van de tijd, maar opnieuw niet significant, wat te wijten is aan de beperkte

steekproefgrootte. Daarentegen was LCN2 wel een goede systemische én lokale biomerker voor

tumorprogressie, omdat deze op 6 weken p.i. in alle gemeten weefsels significant verschillend was

van deze op de vroegere tijdspunten en van gezonde muizen. Ook hier was er een stijging in functie

van de tijd, behalve voor de concentraties in lysaten van de milt. LCN2 kon dus ook gecorreleerd

worden aan de tumorprogressie, zowel lokaal als systemisch.

56

3.4. Vergelijking van het Py230 en 4T1 intraductale muismodel

De Meyer-groep beschikt momenteel over twee intraductale, immunocompetente muismodellen:

het 4T1 model (Steenbrugge et al., 2016) en het nieuwe Py230 model beschreven in deze masterproef

(Vander Elst et al., 2018). Er zijn een aantal belangrijke gelijkenissen en verschilpunten tussen deze

muismodellen. De beide modellen worden in Tabel 5 samenvattend vergeleken.

Steenbrugge et al. (2016) Vander Elst et al. (2018)

Tripel negatieve

mammatumorlijn 4T1 (BALB/c-afgeleid) Py230 (C57BL/6-afgeleid)

Muislijn BALB/c C57BL/6 Tyr-/- NF-κB-luc+

Inoculatiedosis 4,6 x 104 mammatumorcellen,

gesuspendeerd in 100 μl PBS en

Matrigel (1:10)

105 mammatumorcellen

gesuspendeerd in 100 μl PBS en

Matrigel (1:10)

Tijdstip inoculatie 1 uur na spenen van de pups 1 uur na spenen van de pups

Luciferase expressie Ja, tumorcel Ja, transgene NF-κB muis

Tumorgroei Evolutie van DCIS tot IDC stadium

< 3 weken p.i. DCIS stadium blijft minimaal 3

weken behouden

Metastasering op 6 weken p.i. Ja Neen

Splenomegalie Relevante toename

vanaf 4-5 weken p.i.

Relevante toename

vanaf 6 weken p.i.

CHI3L1 in primaire tumor en

serum Relevante toename

vanaf 4-5 weken p.i.

Geen toename lokaal, wel

relevante toename in serum

vanaf 6 weken p.i.

LCN2 in primaire tumor en serum Relevante toename

vanaf 4-5 weken p.i.

Relevante toename

vanaf 6 weken p.i.

Zoals volgt uit Tabel 5, is een belangrijk voordeel van het Py230 intraductale muismodel dat het DCIS

stadium langer (nl. tot 3 weken p.i.) behouden blijft dan bij het 4T1-model. Dit doet zich ook voor bij

de humane patiënt met triple negatieve borstkanker (TNBC) en vormt dus een belangrijk aspect van

dit preklinische model met het oog op screening van succesvolle, vroegtijdige therapieën (Virnig et al.,

2009; Schmadeka et al., 2014). Het Py230 muismodel kan op basis van de preliminaire data uit deze

masterproef reeds voorzichtig worden aanbevolen als potentiële screeningstool voor de werking van

kandidaat antitumorale geneesmiddelen. Meer specifiek voor geneesmiddelen die ingrijpen op de

evolutie van het DCIS naar het IDC stadium door deze hetzij te verhinderen, hetzij te verlaten.

Bovendien biedt het Py230-muismodel ook een ethisch voordeel ten opzichte van het agressievere

4T1 model, omdat het uitblijven van metastasen ervoor zorgt dat de dieren minder ziek zijn. Dit

resulteert daardoor in minder vroegtijdige euthanasie, waardoor de uitval van proefdieren lager is.

Bovendien moeten er ook minder analgetica worden toegediend.

Tabel 5: Vergelijking tussen het 4T1-model (Steenbrugge et al., 2016) en het Py230-model dat wordt

beschreven in deze masterproef (Vander Elst et al., 2018). Beiden zijn intraductale, immunocompetente

muismodellen ontwikkeld door de Meyer-groep.

57

Een huidige tekortkoming van het Py230-muismodel is de nog onvolledige karakterisatie van de

antitumorale inflammatie en de beperkte steekproefgrootte. Met het oog op het onderzoeken van de

aanwezige immuunresponsen in dit immunocompetente muismodel, zouden bepalingen van de

cytokineprofielen zowel lokaal (in de primaire mammatumoren) als systemisch (in serum) een sterke

meerwaarde bieden. Op deze manier kan een beter inzicht verkregen worden in de antitumorale

inflammatie van het Py230-muismodel, complementair aan de H&E en IHC evaluaties (kwalitatief) en

de flowcytometrische data (kwantitatief). Ook moet het tijdstip waarop de overgang van een DCIS

naar een IDC plaatsvindt, nog beter gekarakteriseerd worden. Daarvoor zouden nog bijkomende

experimenten moeten worden uitgevoerd met opoffering op 4 en 5 weken p.i. om ook op deze

tussentijdstippen een histologische evaluatie van de DCIS-IDC transitie mogelijk te maken. Bovendien

werd er geen flowcytometrische analyse uitgevoerd van de primaire mammatumoren in het

intraductale 4T1 muismodel (Steenbrugge et al., 2016), waardoor de vergelijking van de lokale en

systemische inflammatoire respons met het Py230-muismodel momenteel onvolledig kan worden

gemaakt.

Tot slot werd er vanuit gegaan dat de mammatumorcellen tripel negatief blijven. Nochtans is geweten

dat in vitro tripel negatieve Py230 tumorcellen, ER en/of PR positieve tumoren kunnen vormen in vivo,

wanneer deze in lage aantallen (104 cellen of minder) worden geïnoculeerd (Bao et al., 2015). Hoewel

er in deze ‘proof-of-concept’ studie nooit minder dan 104 cellen werden geïnoculeerd, is de

afwezigheid van ER en/of PR nooit geverifieerd via IHC.

4. CONCLUSIE

Op basis van de data gegenereerd in het kader van deze masterproef is dit nieuwe

immunocompetente, intraductale Py230-muismodel tot 3 weken p.i. representatief voor de situatie

van een DCIS van tripel negatieve borsttumoren bij de mens. Na 3 weken p.i. gaat deze situatie over

naar het IDC stadium, maar zonder het ontstaan van duidelijke metastasen 6 weken p.i.. Op dat tijdstip

werd eveneens het humaan eindpunt bereikt. Het DCIS stadium blijft dus relatief lang behouden,

waardoor dit innovatieve, preklinische model potentieel gebruikt kan worden voor het uittesten van

nieuwe antitumorale therapieën die o.a. een effect beogen op de DCIS-IDC transitie. Naast de

exponentiële tumorgroei en -progressie, werd ook een sterke lokale en systemische inflammatie

waargenomen. Het absolute aantal immuuncellen in de primaire tumoren nam sterk toe in functie van

de tijd, waarbij ook de lokale relatieve verhouding tussen de verschillende types immuuncellen

veranderde. Ook systemisch trad er een primaire tumor-geassocieerde inflammatie op, gekenmerkt

door o.a. splenomegalie, evenals een stijging in de concentratie van de recent ontdekte tumorale

biomerkers CHI3L1 en LCN2 in serum.

58

LITERATUURLIJST

- AKIKO S., KLAUNBERG B., TOLWANI R. (2004), Overview: in vivo bioluminescence imaging,

comperative medicine, vol. 54, N°6, pp. 631-634.

- ALLAVENA P., SICA A., SOLINAS G., PORTA C., MANTOVANI A. (2008), The inflammatory micro-

environment in tumor progression: The role of tumor-associated macrophages, Critical Reviews in

Oncology/Hematology, Vol. 66, Issue 1, pp 1-9.

- BAKSHI R.K., COX M.A., ZAJAC A.J. (2014), Cytotoxic T Lymphocytes. Encyclopedia of Medical

Immunology. Springer, New York, NY.

- BAO L. et al. (2015), Multipotent luminal mammary cancer stem cells model tumor heterogeneity,

Breast Cancer Research, 17 : 137.

- BAUER M. et al. (2008), Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is a predictor of poor

prognosis in human primary breast cancer, Breast Cancer Res Treat., vol. 108(3), pp. 389 - 397.

- BEN-NERIAH Y., KARIN M. (2011), Inflammation meets cancer with NF-κB as the matchmaker,

Nature Immunology, vol. 12, pp. 715-723.

- BERGERS et al. (2000), Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during

carcinogenesis, Nat. Cell Biol., Vol. 2, pp. 737-744.

- BERGERS F.G. et al. (2004), The interleukin-6 gene: a susceptibility factor that may contribute to

racial and ethnic disparities in breast cancer mortality, Breast Cancer Res. Treat., Vol. 88, pp. 281–

285.

- BERGERS G. et al. (2000), Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during

carcinogenesis, Nature cell biology, vol. 2, pp. 737-744.

- BIRBACH A. et al. (2002), Signalling molecules of the NF-kappa B pathway shuttle constitutively

between cytoplasm and nucleus, Journal of Biological Chemistry, vol. 277, pp. 10842-10851.

- BISWAS T. et al. (2014), Attenuation of TGF-β signalling supports tumor progression of a

mesenchymal-like mammary tumor cell line in a syngeneic murine model, Cancer Letters, vol. 346,

p. 129-138.

59

- CARLSON H. et al. (2002), In vivo imaging of NF-κB activity, The Journal of Immunology, vol. 168,

pp. 1441-1446.

- CARMELIET P. (2005), VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer, Oncology, vol. 69, Suppl.

3, pp. 4-10.

- CHIERS K. (2015), Oncology [course text], Ghent University, Merelbeke.

- CHIN A.R., WANG S.E. (2014), Cytokines driving breast cancer stemness, Mol Cell Endocrinol., Vol.

382(1), pp. 598-602.

- COFFELT S.B. et al. (2015), IL-17-producing γδ T cells and neutrophils conspire to promote breast

cancer metastasis, Nature, vol. 522(7556), pp. 345-348.

- COHEN N. et al. (2017), Fibroblasts drive an immunosuppressive and growth-promoting

microenvironment in breast cancer via secretion of Chitinase 3-like 1, Oncogene, vol. 36, pp. 4457–

4468.

- DANIELE A. et al. (2016), Clinical and prognostic role of matrix metalloproteinase-2, -9 and their

inhibitors in breast cancer and liver diseases: A review, The International Journal of Biochemistry

& Cell Biology, Vol. 77, Part A, pp. 91-101.

- DEBATIN K.M. (2004), Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy, Cancer Immunol.

Immunother., vol. 53, n° 153.

- DE MARCO P. et al. (2016), GPER signalling in both cancer associated fibroblasts and breast cancer

cells mediates a feedforward IL1β/IL1R1 response, Nature, Vol. 6, Art. 24354.

- DENT R. et al. (2007), Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence,

Clin. Cancer Res., vol. 1 n°13(15 Pt. 1), pp. 4429-4434.

- DESREUX J. et al. (2011), Le cancer du sein en Belgique: pourquoi sommes-nous les premiers en

Europe?, Revue medical de Liège, vol. 66, pp. 231 – 237.

- DIDONATO A. J. et al. (2012), NF-Κb and the link between inflammation and cancer, immunological

reviews, vol. 246, pp. 379-400.

60

- DOUGLAS H., COUSSENS L. M. (2012), Accessoiries to the crime: Functions of cells recruited to the

tumor microenvironment, cancer cell, March 2012, pp. 309-319.

- DOUGLAS H., COUSSENS L.M. (2012), Accessories to the crime: functions of cells recruited to the

tumor microenvironment, Cancer Cell, Vol. 21, pp. 309-321.

- HADZIJUSUFOVI E. et al. (2017), Comparing Human Breast Cancer with Canine Mammary Cancer,

Jensen-Jarolim E. (eds) Comparative Medicine, Springer).

- HAYDEN M.S.M., GHOSH S.S. (2008), Shared principles in NF-κB signaling, cell, vol. 132, pp. 344-

362.

- HAYDEN M.S.M., GHOSH S.S. (2012), NF-κB, the first quarter-century: remarkable progress and

outstanding questions, Genes Development, vol. 26, pp. 203-234.

- HOESEL B., SCHMID J.A. (2013), The complexity of NF-κB signalling in inflammation and cancer,

Molecular cancer, vol. 12, article 86.

- JANG J. et al. (2009), Lipocalin 2 promotes breast cancer progression, PNAS, vol. 106, no. 10, pp.

3913–3918.

- JANG J. et al. (2013), Lipocalin 2 is a novel regulator of angiogenesis in human breast cancer, The

FASEB Journal, vol. 27, no.1 , pp. 45-50.

- JIAO X. et al. (2012), Somatic mutations in the Notch, NF-KB, PIK3CA, and Hedgehog pathways in

human breast cancers, Genes Chromosomes Cancer, vol. 51, pp. 480-489.

- JOHANSEN J.S. et al. (2006), Serum YKL-40, a new prognostic biomarker in cancer patients?, Cancer

Epidemiol Biomarkers, vol. 15(2), pp. 194–202.

- KATANOV C. et al. (2015), Regulation of the inflammatory profile of stromal cells in human breast

cancer: prominent roles for TNF-α and the NF-κB pathway, Stem Cell Res Ther., Vol. 6, Art. 87.

- KATSMAN A. et al. (2009), Chemosensitization and immunosensitization of resistant cancer cells

to apoptosis and inhibition of metastasis by the specific NF-kappaB inhibitor DHMEQ, Current

Pharmalogical Design, vol. 15, pp. 792-808.

61

- KOCHER B., PIWNICA-WORMS D. (2013), Illuminating cancer systems with genetically engineered

mouse models and coupled luciferase reporters in vivo, cancer discovery, June 2013, pp. 616-629.

- KOHNO T. et al. (2003), Interleukin-10–mediated inhibition of angiogenesis and tumor growth in

mice bearing VEGF-producing ovarian cancer, Cancer Res., Vol. 63, pp. 5091–5094.

- LENG X. et al. (2009), Inhibition of Lipocalin 2 Impairs Breast Tumorigenesis and Metastasis, Cancer

Research, vol. 69, pp. 8579-8584.

- LIN W.W., KARIN M. (2007), A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation,

and cancer, J. Clin. Invest., Vol. 117(5), pp. 1175-1183.

- LIOU G-Y., STORZ P. (2010), Reactive oxygen species in cancer, Free Radical Biology & Medicine

journal, vol. 44, pp. 479-496.

- MANNINO M.H. et al. (2015), The paradoxical role of IL-10 in immunity and cancer, Cancer Letters,

vol. 367, pp. 103-107.

- MAY MJ et al. (1997), Rel/NF-kappa B and I kappa B proteins: an overview, Semin Cancer Biology,

vol. 8, pp. 63-73.

- MORRIS J. L., GORDON O.K. (2010), Positive Results: Making the Best Decisions When You're at

High Risk for Breast or Ovarian Cancer, Amherst, N.Y.: Prometheus Books.

- MURPHY C.G., MOYNAHAN M.E. (2010), BRCA gene structure and function in tumor suppression:

a repair-centric perspective, Cancer J., vol. 16(1), pp. 39-47.

- OECKINGHAUS A., GHOSH S.S. (2009), The NF-κB family of transcription factors and its regulation,

Cold Spring Harbour Perspective in Biology, vol. 1, article 000034.

- PELEKANOU V. et al. (2008), Expression of TNF-superfamily members BAFF and APRIL in breast

cancer: Immunohistochemical study in 52 invasive ductal breast carcinomas, BMC Cancer, vol. 8,

N°76.

- RATTIGAN et al. (2012), Lactate is a mediator of metabolic cooperation between stromal

carcinoma associated fibroblasts and glycolytic tumor cells in the tumor microenvironment, Exp.

Cell Res., Vol. 318, pp. 326-335.

62

- RATTIGAN Y.I. et al. (2012), Lactate is a mediator of metabolic cooperation between stromal

carcinoma associated fibroblasts and glycolytic tumor cells in the tumor microenvironment,

experimental cell research, vol. 318, pp. 326-335.

- RIHACEK M. et al. (2015), B-Cell Activating Factor as a Cancer Biomarker and Its Implications in

Cancer-Related Cachexia, BioMed Research International, Article ID 792187.

- SCHMADEKA R., HARMON B.E., SINGH M. (2014), Triple-negative breast carcinoma: current and

emerging concepts, Am J Clin Pathol., Vol. 141(4), pp. 462-477.

- SHI H. et al. (2008), Lipocalin 2 promotes lung metastasis of murine breast cancer cells, Journal of

Experimental & Clinical Cancer Research 2008, vol. 27, Art. 83.

- SORIA G., BEN-BARUCH A. (2008), The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast cancer,

Cancer Lett., Vol. 267, pp. 271-285.

- STEENBRUGGE J. et al. (2016), Comparison of the adipose and luminal mammary gland

compartment as orthotopic inoculation sites in a 4T1-based immunocompetent preclinical model

for triple-negative breast cancer, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, vol. 21. p.

113-112.

- STICHTING TEGEN KANKER (2017), Borstkanker – Algemeen, Laatst bijgewerkt op 16 november

2017, van https://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker.

- STOCKMANN C. et al. (2008), Macrophage expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha

suppresses T-cell function and promotes tumor progression, Nature, vol. 456, pp. 814-818.

- STOCKMANN et al. (2008), Deletion of vascular endothelial growth factor in myeloid cells

accelerates tumorigenesis, Nature, Vol. 456, pp. 814-818.

- TOI et al. (1996), Clinical significance of the determination of angiogenic factors, European Journal

of Cancer, 32A, pp. 2513-2519.

- TSUYADA et al. (2012), CCL2 mediates cross-talk between cancer cells and stromal fibroblasts that

regulates breast cancer stem cells, Cancer Res., Vol. 72, pp. 2768-2779.

63

- VIRNIG B.A. et al. (2009), Diagnosis and management of ductal carcinoma in situ (DCIS), Evidence

Report/Technology Assessment, AHRQ Publication, No.09-E018 (185), pp. 1–549.

- WALTERS S. et al. (2009), Increased CD4+Foxp3+ T cells in BAFF-transgenic mice suppress T cell

effector responses, The Journal of Immunology, Vol. 182(2), pp. 793-801.

- WAN G. et al. (2017), Elevated YKL-40 expression is associated with a poor prognosis in breast

cancer patients, Oncotarget, vol. 8(3), pp. 5382–5391.

- WCULEK S.K., MALANCHI I. (2015), Neutrophils support lung colonization of metastasis-initiating

breast cancer cells, Nature, vol. 528(7582), pp. 413 – 417.

- WOLPE S. D. et al. (1989), Identification and characterization of macrophage inflammatory protein

2, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 86, pp. 612-616.

64

BIJLAGEN

Bijlage I : Scorerooster muizen

Scorerooster voor het opvolgen van lacterende C57BL/6 Tyr-/- NF-κB-luc+ muizen na een intraductale

injectie met 105 Py230 tumorcellen. Wanneer een score hoger dan 3 wordt vastgesteld, kregen de

muizen onmiddellijk analgetica toegediend. Een score hoger dan 5 resulteert in euthanasie.

Kooinummer:

(OK/NOK)

(OK/NOK)

(OK/NOK)

(OK/NOK)

(OK/NOK)

Variabele

score

0 dagen

(27/10)

score

4 dagen

(31/10)

score

11 dagen

(7/11)

score

2 weken

(10/11)

score

3 weken

(17/11)

score

4 weken

(24/11)

score

5 weken

(1/12)

score

6 weken

(8/12)

Lichaamsgewicht (g)

0: normaal

1: <10% gewichtsverlies

2: 10-20% gewichtsverlies

3: > 20% gewichtsverlies

Tumor L3 (L)

Tumor L3 (B)

Tumor L3 (H)

Tumor R3 (L)

Tumor R3 (B)

Tumor R3 (H)

Tumor L4 (L)

Tumor L4 (B)

Tumor L4 (H)

Tumor R4 (L)

Tumor R4 (B)

Tumor R4 (H)

0: tumor kleiner dan 2 cm3, niet geülcureerd

3: tumor groter dan 2 cm3 of geülcureerd

Lichaamstemperatuur (rectaal, °C)

Body condition score

0: >3

1: 2-3

2: 2-1

3: 1

Uitzicht

0: normaal

1: onverzorgde vacht

2: abnormaal haarkleed, oog of neusvloei

3: abnormale houding, zeer afwijkend haarkleed

Gedrag

0: normaal

1: licht afwijkend

2: verminderde activiteit, minder alert

3: zelfmutilatie, hyperactiviteit, immobiliteit

Reactie op stimulus

0: normaal

1: milde verhoogde of verlaagde reactie

2: matig abnormale respons

3: apathie of agressief

Incisieplaats

0: mooi gesloten, niet gezwollen, pijnlijk of rood

1: mooi gesloten, licht gezwollen, pijnlijk of rood

2: lichte wonddehiscentie, matig tot sterk gezwollen, pijnlijk of rood

3: totale wonddehiscentie, infectie, automutilatie, zeer pijnlijk

TOTALE SCORE

Inoculatie R3

Euthanasiedatum

Serum

Inoculatie L4

Inoculatie R4

Gebruik tumor L3

Gebruik tumor R3

Geboortedatum

Aantal pups

Inoculatie L3