Obes

Stage WMedisch

StagebeOverige

Auteur

sitas-geïnd

Wetenschaphe Biologie

egeleider e begeleider

duceerde ontwikk

p Geneeskue & Reumato

: Prof. Drs : Dr. B.P

: Davith S18081

laaggradkelen van

unde, Rijksologie | Uni

Dr. P. HeerinP.C. Hazenb

h de Vries, B109

dige inflamn systemis

suniversiteiiversitair M

nga berg, R.H. v

BSc

mmatie: esche amyl

it GroningeMedisch Cen

van der Heij

een risicofloïdose?

en (RuG) / ntrum Groni

jden, PhD,

factor voo

UMCG ingen

Drs. J. Bijz

or het

zet

1

2

Inhoudsopgave Samenvatting / ABSTRACT 3

Inhoudelijk deel verslag 4

Inleiding 4

Materiaal en methode 10

Resultaten 15

Discussie 22

Literatuurlijst 29

Bijlagen (Overzicht) 37

Tabellen 38

Figuren 40

Protocollen 44

Belangrijk Verwijzingen die beginnen met ‘B’ (bijv. Tabel B1) zijn terug te vinden in de bijlagen. De andere verwijzingen staan altijd in de buurt van de begeleidende tekst afgedrukt.

3

Samenvatting / ABSTRACT Inleiding: De gevolgen van overgewicht, een van de grootste wereldwijze gezondheidsproblemen, leiden tot belangrijke orgaanfunctiestoornissen. De oorsprong hiervan ligt in ziektes die door chronische laaggradige inflammatie gedreven worden zoals atherosclerose en type 2 diabetes. Wij hypothetiseren dat ook systemische AA amyloïdose door dit proces veroorzaakt kan worden en bijdraagt aan obesitas-gerelateerd orgaanfalen. Methodiek: 99 CB57B6/J muizen werden gedurende 6, 9 en 12 maanden gevoed op laag (LVD) of hoog-vet dieet (HVD). Seriële bloedplasma’s werden geanalyseerd op SAA. De mate van amyloïdose werd objectief gekwantificeerd in hart en nieren met spectraalcamera-microscopie en digitale beeldanalyse. Determinatie van amyloïdeiwitten vond plaats met diverse methoden waaronder immunohistochemie. Orgaanschade en -functieverlies werden gemeten met echocardiografie, Col-1/3, Gal-3, ANP en BNP-expressie (hart), alsmede door NGAL-expressie, serum ureum (BUN), albuminurie en autofagie (LC3) (nieren). Resultaten: Vanaf t=40wk toonden de harten en nieren progressieve amyloïdose. Plasma SAA en lichaamsgewicht correleerde goed aan de mate van amyloïdose in linkerventrikel (resp. r=0.38;p<0.05, r=0.43;p<0.01) en nieren (resp. r=0.48-0.63,p<0.001-0.05, r=0.64-0.74,p<0.001). De amyloïdose gaat gepaard met verhoogde vroege biomarkers van orgaanschade in hart (ANP, BNP, Col-1, Col-3, Gal-3) en nieren (NGAL, albuminurie) nog zonder klinisch functieverlies (BUN, echocardiografie, hemodynamische parameters). Pilotanalyse toonde aan dat (i) de amyloïdose immunohistochemisch wordt gekarakteriseerd door AA amyloïddeposities in HVD groep met in beide groepen leeftijdsafhankelijke sporen van ApoA2 en (ii) LC-3, een marker voor autofagie, versneld achteruit gaat in beide dieetgroepen. Discussie: Obesitas geïnduceerde laaggradige inflammatie lijkt systemische AA amyloïdose te kunnen induceren. Mogelijk ontstaan in dit muismodel meerdere amyloïdsoorten door versnelde veroudering van anti-amyloïdogene protectieve mechanismen, zoals autofagie. Deze mechanismen spelen een belangrijke rol in het risico voor mensen om amyloïdose te ontwikkelen. Obesitaspatiënten met genetisch versnelde veroudering van deze mechanismen ontwikkelen mogelijk AA amyloïdose als onderdeel van obesitas-gerelateerd orgaanfalen (ageing-inflammatie hypothese). Verder onderzoek is nodig om deze hypothese te bevestigen.

(295 woorden)

4

Inleiding Obesitas is een van de grootste endemische gezondheidsproblemen van de 21ste eeuw. Circa 1,4 miljard volwassenen en 250 miljoen kinderen hebben overgewicht of obesitas.1 Het probleem treft zowel rijke als minder ontwikkelde landen; naast Noord-Amerika en Europa zien ook opkomende industrieën in Zuid-Amerika en Azië een verontrustend snelle groei in mensen met overgewicht.2 Dit is niet zonder gevolgen; obesitas is een belangrijke veroorzaker van hart- en vaatziekten (HVZ) (inclusief cerebrovasculaire accidenten), type 2 diabetes mellitus (T2DM) en enkele vormen van kanker.2,3 Alleen al in Nederland, Groot-Brittannië en de Verenigde Staten zorgt dit voor respectievelijk 7000, 30.000 en 300.000 obesitas-gerelateerde doden per jaar, meestal door orgaanfalen als gevolg van voorgenoemde aandoeningen.4–6 De mechanismen waarmee obesitas ziekte en orgaandisfunctie veroorzaakt zijn van grote interesse voor de medische wetenschap. Er zijn opmerkelijke verschillen in de snelheid en mate waarin mensen met overgewicht obesitas-gerelateerde aandoeningen ontwikkelen. Enkele voorspellende klinische parameters die een risico vormen voor obesitas-gerelateerde aandoeningen zijn samengebracht in de term metabool syndroom. Hierbij zijn naast centrale obesitas (middelomtrek) tenminste 2 van de volgende 4 symptomen aanwezig: hoog nuchter glucose (≥5,6mmol/mL), hoge serum triglyceriden (≥1,7mmol/L) en verlaagd protectief high-density lipoproteïne (HDL) (♂:<1,03 en ♀:<1,29mmol/L).7 Het metabool syndroom is sterk geassocieerd met onder meer HVZ en T2DM.8 Deze classificatie is echter slechts een verzameling van klinische parameters die voorspellend zijn voor het ontwikkelen van obesitas-gerelateerde ziekte. Wat het mechanisme is achter deze obesitas gerelateerde aandoeningen is nog onvolledig belicht. Hoewel de onderliggende processen nog niet volledig begrepen zijn, is er in de afgelopen jaren steeds meer aandacht en bewijs gekomen dat metabole overbelasting kan leiden tot ontstekingsreacties, de zogenaamde metabole inflammatie hypothese. Laaggradige inflammatieprocessen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van insulineresistentie en atherosclerose.9–12 De oorsprong van deze ontsteking vinden we mogelijk in het nutriënten- en vetweefselmetabolisme. Na een vetrijke maaltijd treden een aantal mechanismen in werking die zorgen voor een fysiologische, systemisch inflammatoire respons: (i) een afwijkende microbiële flora in de darmen wordt geactiveerd door het grote aanbod aan nutriënten, wat resulteert in endotoxineproductie en systemische endotoxemie, (ii) opgenomen (metabolieten van) nutriënten worden herkend door de pattern-recognition receptors (zoals TLRs en NLRsa) op macrofagen en adipocyten en (iii) hyperglycemie en hyperlipidemie leiden tot directe endotheelactivatie.11,13–15 Deze reactie bereikt zo’n 2 uur na de maaltijd zijn maximum en is gewoonlijk na circa 4 uur uitgedoofd. Men kan zich indenken dat hierdoor bij te grote en/of te frequente maaltijden een niet meer uitdovend ontstekingssignaal onstaat.16 De vetweefselhypertrofie en -hyperplasie die het gevolg zijn van het overeten ondersteunen dit ontstekingsproces. Ze leiden tot apoptose en inflammatie door onder meer (i) weefselischemie vanwege relatief tekortschietende vaatstructuur, (ii) fysieke cellysis door overschrijding van vetopslagcapaciteit en (iii) metabole overbelasting van de celorganellen (ER, mitochondriën) en eiwitcontrolemechanismen (chaperones, lyso- en proteosomen). Bij deze afstervingsprocessen komen veel vrije zuurstofradicalen en intermediaire celmetabolieten vrij, waaronder misvouwen of gedeeltelijk gevouwen eiwitten.12,16,17

Het gemeenschappelijk resultaat van deze processen is, naast een directe inflammatie van het vaatendotheel, een lokale inflammatie van het vetweefsel, gedreven door cytokinen die ten dele door de weefselmacrofagen, maar voornamelijk door adipocyten worden gesecreteerd

5

(adipokinen). Op termijn treedt er door de inflammatoire signalen, via endotheelactivatie, een grote instroom van immuuncellen naar het vetweefsel op, waarna macrofagen daar de rol van adipocyten als belangrijkste bron van pro-inflammatoire cytokinen overnemen.18 Het vetweefsel raakt in staat van chronische ontsteking, in afwezigheid van cardinale tekenen van inflammatie (rubor, calor, dolor, tumor).11 Dit proces is progressief zolang het ongezonde levenspatroon, en daarmee de metabole overbelasting, aanwezig blijft. De effecten blijven niet beperkt tot het vetweefsel; de chonische lokale productie van pro-inflammatoire cytokines en adipokines leidt tot een systemische laaggradige inflammatie, deze wordt voornamelijk gekenmerkt door verhoogde circulerende inflammatoire parameters zoals cytokinen (TNF-alfa en IL-6), acute fase eiwitten (CRP, Serum Amyloid A) en oplosbare adhesiemoleculen (VCAM, ICAM); voor al deze parameters geldt dat zij gecorreleerd zijn aan gewicht of BMI.16–19 De systemische blootstelling van organen aan deze factoren vormt de basis in de pathogenese van diverse cardiovasculaire en metabole aandoeningen, zoals atherosclerose en insulineresistentie.16,20–23 Naar onze huidige inzichten zoeken we de oorzaak van obesitas-gerelateerde orgaandisfunctie dan ook in een combinatie van deze, door laaggradige inflammatie-gedreven ziekteprocessen: zo kan atherosclerose, vaak via hypertensie, in ischemisch hartlijden, perifeer vaatlijden en hypertensieve glomerulosclerose resulteren.24,25 Type-2-diabetes kan het proces van atherosclerose versnellen (macro-angiopathie) en via hyperglycemie tevens tot de ontwikkeling van diabetische nefropathie (micro-angiopathie) leiden.26–28 Daarbij zullen het resulterende nier- en hartfalen elkaar, door hun nauwe fysiologische relatie, versterken (het cardiorenale syndroom).29,30 De samenhang tussen deze verschillende pathologische processen illustreert hoe complex het ontstaan van obesitas-gerelateerde orgaandisfunctie is. De rol van inflammatie in de met obesitas geassocieerde pathologieën heeft geleid tot een wetenschappelijke zoektocht naar specifieke biomarkers voor obesitas-gerelateerde inflammatie, die een voorspellende waarde zouden hebben voor het ontstaan van orgaandisfunctie in de toekomst, en naar manieren om (op medicamenteus en niet-medicamenteuze wijze) te interfereren in deze inflammatiecascade.31,32 In een nog ongepubliceerde studie van Van der Heijden et al. werden in een C57BL6/J muismodel de effecten van een hoog en laag vet dieet op het ontstaan en de progressie van orgaanfunctie onderzocht, alsmede de mogelijk positieve protectieve (anti-inflammatoire) effecten van polyfenolen als voedings-supplement. Hoewel middels dit model werd verwacht hoog-vet geïnduceerde glomerulosclerose te initiëren bleek bij pathologische analyse van de nieren een amyloïde nefropathie in plaats van hypertensieve glomerulosclerose of diabetische nefropathie te ontstaan. Ook in de harten werd deze amyloïde pathologie aangetroffen. Dit riep de vraag op of amyloïdose mogelijk betrokken was bij obesitas-geïnduceerd orgaanfalen, en/of het hoog-vet dieet en het daaropvolgende overgewicht een risicofactor zou kunnen vormen voor het ontstaan of verergeren van amyloïdose. Voor veel medische wetenschappers is amyloïdose een mysterieuze aandoening; om de potentiële relatie met obesitas te onderbouwen en voor beter inhoudelijk begrip van de rest van het verslag is meer achtergrondkennis vereist aangaande deze pathologie. Amyloïdose: een ziekte van de eiwitstructuur Amyloïdose is een complex en onvolledig begrepen pathologisch proces waarin eiwit misvouwing een belangrijke rol speelt. Het is betrokken bij een breed scala van aandoeningen, die ondanks de grote variatie in de klinische presentatie, een gelijk onderliggend moleculair mechanisme en histopathologie hebben/kennen: eiwitten die van nature of door een aangeboren mutatie instabiel zijn misvouwen, waarna ze de neiging hebben te aggregeren tot

oligo- euiteindetoxische Elk amyzijn opggenoemsyndromverworvwaarbij plaatsvislaan inamyloïdbijlage)amyloïd(CML) begrip vorgaantralgemeeamyloïdgemidde(cardialwat we geassoc PathogeAllereeropgebouzijn opgtertiairede eiwit(Fig. 2)bezit deSerum AgebruikSAP sciaangrijphun enoVoor heverkenneiwitstru Eiwittenalleen ahogere sdoor de ondergafunctionEiwitvolaagste hongevou

en polymereelijk neer ale effecten v

yloïde syndrgebouwd; di

md. Er zijn tomen bekendven variantede producti

indt, en (ii) n meerdere ode syndrome. Hoewel de

dose 1:100.0en zorgt he

van deze coransplantatien slecht.33,3

dose die gedeld 10-15 jae AL amyloal wel wete

cieerde orga

enese van arst is het gouwd. Onafhgebouwd vee/quaternairetpolymeren .38 Naast po

e amyloïdfibAmyloid P (

kt voor diagnintigrafie) eppunt.37,41 Juorme stabilitet begrijpennen hoe en wuctuur gevo

n zijn compafhangt van secundaire vouwingpr

aat. Deze strneel zijn. ouwprocessehoeveelheiduwen eiwitt

en. Onder ins onoplosba

van het amyl

room kent zit eiwit worot op heden

d.33 Deze zijen) en het pie en aggregsystemische

organen, somen en deze be meeste sp000 per jaart voor een amplexe ziekie en antilic37 De progndiagnosticeeaar te leven oïdose) een en over het oaandisfuncti

amyloïdoseoed om te whankelijk vaerkrijgen de e structuur: in zigzag-v

olymeren vabril ook enk(SAP).39,40 nostische doen vormt eenuist dit SAPteit wat ther

n van de amywaarom de ormd wordt

plexe molecude aminozuen tertiaire rocessen dieructuur moe

en zijn groted vrije energten hebben v

nvloed van lare fibrillen loïd leiden t

zijn eigen amrdt in de oorn 30 verschil

n verder in atroon van gatie van hee vormen wms volgens bijbehorendecifieke varr, vergelijkbaanzienlijkekte; de behahaamtherap

nose na klacerd wordt, zhebben (famlevensduurontstaan vane in de mui

e: de eiwitsteten hoe am

an het eiwitmfibrillen deeen β-sheet

vorm om elkan het (bewekele vaste coSAP kan daoeleinden (hn potentieelP geeft de amrapeutische yloïdogenesspecifieke a.

ulen waarvauurvolgordestructuur; d

e het eiwit net niet alleen

endeels gedgie (weinig veel vrije en

lokale facton in weefselstot (chronis

myloïdogenrspronkelijkllende precute delen opaangedane et amyloïdo

waarbij circueen variant

de kenmerkerianten zeerbaar met bije ziektelast.3

andeling is vpie) en de prchtenpresentzo kunnen pmiliaire TTr van 4-6 man amyloïdos een rol zo

tructuur ismyloïdvezelmonomeer wezelfde t configuratkaar heen geerkte) precuomponentenaardoor worhet wordt gel therapeutismyloïdvezemethoden b

se is het vanamyloidoge

an de functie, maar ook deze wordt vna RNA trann energetisc

dreven door enthalpie).4

nergie: ze b

ren slaan des, alwaar desch progress

ne eiwitmonke, onschadeursoreiwitte

p basis van eorganen: er

ogene eiwit iulerende pretspecifiek pen is weergr zeldzaam zv. Chronisc34–36 Helaasvaak ingrijprognose is wtatie is afha

patienten meTR amyloïdoaanden reëlse, en welk

ou kunnen sp

soms een kls zijn waaruit ze

tie, waarin edraaid zijnursoreiwit n, zoals rden ebruikt bij sch els echter bemoeilijktn belang te ne

ie niet van de

verkregen nslatie ch stabiel, m

thermodyn42 Pas aan h

bezitten mee

eze eiwitpole mechaniscsieve) orgaa

nomeer waaelijke vorm en en bijbehetiologie (err zijn (i) lokin hetzelfdeecursoreiwitatroon. Eenegeven in Tzijn, is de toche Myeloïd hebben we

pend en/of ewisselend, mankelijk vanet sommige ose) maar iser.33,37–39 Die variant bijpelen.

kwetsbaar

n

.

maar ook fy

namiek; het het ribosoomerdere (aan o

Figuur 2

Bewerkt naa

lymeren che en mogeandisfunctie

aruit de fibrim het precurshorende amyrfelijke en

kale variantee orgaan tten neer ku

n overzicht vTabel B1 (ziotale incidende Leukemie slechts bepexperimentemaar over hn de vorm va varianten

s voor anderit roept de v

ij obesitas-

evenwicht

ysiologisch

nastreven vm gemaakteomgeving

De amyloïdfibr

ar Merlini et al.38

elijk e.

illen soreiwit yloïde

en,

unnen van de ie ntie van ie perkt eel (o.a. het an

ren vraag op

van de e,

ril

6

7

blootgestelde) hydrofobe of geladen ketens, wat ze potentieel zeer reactief maakt (aggregatie met zichzelf of andere eiwitten).43–45 De meeste eiwitten zijn evolutionair ontworpen om, begeleid door intracellulaire controlemechanismen, snel te vouwen naar een stabiele, niet aggregerende vorm.46–48 Er zijn echter grofweg drie mechanismen die kunnen interfereren met deze fysiologische vouwprocessen en daarmee het bestaan van amyloïdogene eiwitten verklaren;33,37,38

1. Sommige eiwitten zijn intrinsiek minder stabiel, zij kunnen makkelijker van conformatie veranderen omdat dit essentieel is om hun functie te vervullen (plasticiteit). Hun wisselingen tussen gevouwen en gedeeltelijk ontvouwen staat vergroot de kans op zelfaggregatie, maar alleen bij (i) langdurig verhoogde concentraties van het eiwit (o.a. AA en AL-amyloïdose) of (ii) na levenslange productie en gebruik van het eiwit (wildtype TTR in ouderdoms ATTR amyloïdose).

2. Aangeboren mutaties kunnen grote invloed hebben op de tertiaire en quaternaire structuur van een eiwit, waardoor zijn stabiliteit wordt verstoord en deze makkelijker aggregeert (o.a. familiaire ATTR en AApoA-amyloïdosen).

3. Proteolytische nabewerking van eiwitten: door de ingekorte aminozuurvolgorde kan het de structuur en stabiliteit van het eiwit veranderen. Hoewel in veel typen amyloïdfibrillen ingekorte varianten van het precursoreiwit worden gevonden, is van slechts één variant bewezen dat de proteolytische bewerking ook daadwerkelijk de oorzaak is van de instabiliteit, nm. bij AβPP amyloïd, dat een centrale rol speelt in de ziekte van Alzheimer.49 De pathogenetische rol van proteolyse in andere vormen van amyloïdose moet nader onderzocht worden.

Aggregatie van instabiele eiwitten: alles draait om energie Deze ‘instabiliteitsmechanismen’ staan aan de basis van de fibrillogenese, een ingewikkeld proces dat net als de fysiologische eiwitvouwing gebaseerd is op het principe van de thermodynamica: het nastreven van de laagste hoeveelheid vrije energie in het systeem (enthalpie). In een geconcentreerde groep instabiele eiwitten kan de vrije energie verlaagd worden wanneer de molecuulgroepen zich onderling zouden binden. Dat gaat echter niet zonder eerst energie te investeren in het ontvouwen en wellicht bewerken van deze eiwitten (entropie). Deze baten worden tegen elkaar afgewogen; de energiedrempel tussen de baten en de lasten kan worden beïnvloed door de eiwitconcentratie, zuurgraad, temperatuur, oxidatie, metaalionen en lokale weefselcomponenten.38,50,51 Proteo- en glycosaminoglycanen: de haringen voor de amyloïde tent Een van de belangrijkste beïnvloedende weefselcomponenten zijn de proteo- en glycosaminoglycanen, zoals heparinesulfaat.52,53 Hun negatief geladen molecuulgroepen kunnen waterstofbruggen vormen, wat op twee manieren de fibrilvorming ondersteunt: (i) door het onttrekken van vrij water aan de lokale omgeving, waardoor de lokale eiwitconcentraties verhoogd raken en (ii) door bindingen aan te gaan met aminozuren van gedeeltelijk ontvouwen eiwitten, die zo gestabiliseerd worden aan de extracellulaire matrix (Fig. B1c, zie bijlage).54,55 Hiermee wordt voorkomen dat ze terugschieten in hun natuurlijke staat (figuur B1a,b). In hun gedeeltelijk ontvouwen staat liggen de reactieve, hydrofobe molecuulgroepen vrij; bij voldoende hoge lokale eiwitconcentratie ligt de weg open naar zelfaggregatie tot oligomeren (B1d). Door verdere aggregatie van oligomeren wordt uiteindelijk langzaam een nucleus gevormd, een ‘amyloïdkern’ (B1e). Deze vormt een raamwerk waarop monomeren van het amyloïdogene eiwit makkelijk kunnen aanhechten, waardoor zich snel een amyloïdfibril vormt (B1f).56 Als zo’n rigide amyloïdfibril breekt kunnen beide stukken zich aan hun beide uiteinden verlengen waardoor het proces steeds sneller en effectiever gaat verlopen.

8

De amyloïdnucleus: daar valt op te bouwen De beperkende, zeer langzaam verlopende stap in de fibrillogenese is de vorming van oligomeren en de nucleus.57–59 Deze fase staat bekend als de lag phase; klinisch kan het bij mensen jaren duren voordat een amyloïdogeen eiwit ook daadwerkelijk amyloïdafzettingen veroorzaakt. De nucleus-vorming is afhankelijk van een kritieke (minimale) lokale concentratie van het amyloïdogene eiwit. Kleine concentratieverschillen hebben een enorme invloed op de benodigde tijd voor nucleus-vorming, en daarmee op de duur van de lag phase.60 Na vorming van de nucleus breidt de aggregatie zich juist snel uit, wat overeenkomt met het progressieve klinische beeld. Het concept hierachter is de segregation-and-seeding hypothese; fragmenten van de amyloïdfibril breken af en zaaien zich elders in het orgaan uit (Fig. B1g).61 Op deze nucleï worden snel nieuwe fibrillen gevormd. Dit principe kan ook kunstmatig uitgevoerd worden; na het inspuiten van geïsoleerde amyloïdfragmenten (‘Amyloid Enhancing Factor’, AEF) in gezonde dieren met een daarnaast geïnduceerde ontsteking ontstonden binnen enkele dagen forse amyloïddeposities.62 In extremen: elk eiwit kan zich tot amyloïd vormen Alle amyloïdfibrillen hebben, ongeacht het monomeer waaruit ze zijn opgebouwd, dezelfde morfologische structuur (Fig. 2). Of een eiwit kan aggregeren tot amyloid lijkt dus niet afhankelijk van zijn eigen structuur, maar van de mate waarin deze misvormd moet worden. Het concept dat elk eiwit, gegeven de juiste (extreme) denaturerende omstandigheden, amyloid kan vormen, werd in vitro aangetoond.63–66 De conformatie van in vivo bestaande amyloïdogene eiwitten is echter dusdanig dat ook in het lichaam voorkomende omstandigheden thermodynamisch voldoende zijn om de eiwitontvouwing- en aggregatie te bewerkstelligen. Mechanismen van orgaandisfunctie: amyloïd is als gewapend beton De manier waarop amyloïdose orgaandisfunctie veroorzaakt is onbegrepen en onderwerp van debat. Eenmaal gevormde afzettingen zijn sterk als beton: specifieke componenten die in elke amyloïdvezel zijn terug te vinden (m.n. SAP) beschermen de vezel tegen inwerking van proteasen en opsonisatie: hoewel amyloïdfibrillen lichaamsvreemd zijn worden ze hiermee grotendeels resistent tegen herkenning en vernietiging door het immuunsysteem.67,68 Er zijn waarschijnlijk twee manieren waarop amyloïd orgaandisfunctie kan veroorzaken; (i) De mechanische, fysieke schade die amyloïdvezels toebrengen aan de organen. Zo leiden de aggregaten in het hart tot restrictieve cardiomyopathie met diastolische disfunctie, zorgt de massawerking in het mesangium voor het vernietigen van de glomerulaire filtreerfunctie en leiden fibrillen in het corpus vitreum tot glasvochttroebelingen met blindheid van het oog tot gevolg.37 De mate van amyloïdafzettingen blijken echter niet altijd perfect te correleren met de klinische ziekte-ernst: wanneer bij AL-amyloïdose de amyloïdogene monoklonale vrije lichte ketens van immunoglobulines met chemotherapie worden teruggedrongen, wordt snel klinische vooruitgang geobserveerd, nog vóórdat er veranderingen in de mate van amyloïdafzetting zichtbaar zijn. (ii) Directe cellulaire toxiciteit van de oligomeren. Van de diverse potentiële cytotoxische mechanismen is er slecht één breed gedragen: de kanaal-hypothese (channel-hypothesis);69

oligomeren van bijna elke amyloïdvorm blijken in staat permanente, voltage en ATP-onafhankelijke kanalen te vormen in cel- en mitochondriale membranen. Vergelijkbaar met de werking van perforines van cytotoxische T-lymfocyten leidt dit snel tot apoptose van de cel en, op grotere schaal, tot orgaandisfunctie.70

9

Obesitas als veroorzaker van amyloïdose Terugkerend naar de studie van Van der Heijden et al. waar het geobserveerde obese fenotype gepaard ging met een verergering van de mate van amyloïdose: waar kan een mogelijke link tussen deze beide observaties gevonden worden? Zoals eerder beschreven is er bij obesitas sprake van een chronische, laaggradige ontsteking die gepaard gaat met verhoogde concentraties van acute fase eiwitten, waaronder serum amyloïd A eiwit ofwel kortweg SAA. Langdurig verhoogde concentraties van SAA bij chronische ontstekingsziekten als reuma en de ziekte van Crohn kunnen leiden tot AA amyloïdose (zie: amyloïdogeen mechanisme 1). Dat obesitas ook AA amyloïdose zou kunnen veroorzaken is een logisch, maar vrijwel niet onderzocht mechanisme. Er zijn enkele aanwijzingen in de literatuur te vinden voor deze gedachte: De fysiologie van Serum Amyloid A: redder van het cholesterol SAA is een door de lever geproduceerd acute-fase eiwit en is een apolipoproteïne van HDL. Haar rol is breed onderzocht sinds de ontdekking van AA amyloïd, waar het eiwit naar vernoemd is lang voordat men de precieze herkomst en rol wist.71 Er is sinds kort een redelijk begrip van de fysiologische functie van SAA; SAA is onderdeel van een systemische reactie op weefselschade of ontsteking en waarborgt het hergebruik van cholesterol van vernietigde en beschadigde cellen.72 Tijdens een acute fase reactie kan de plasma SAA concentratie 500 tot 1000-voud toenemen en vervangt het de ApoA-klasse als belangrijkste lipoproteïne. HDL-SAA complexen binden met hoge affiniteit aan weefselmacrofagen; het SAA koppelt los van HDL en induceert intracellulair een efflux van het gefagocyteerde cholesterol. Dit koppelt aan het nu ‘lege’ HDL, wordt zo teruggebracht naar de circulatie en bereikt uiteindelijk weer de lever. Het SAA blijft waarschijnlijk achter in het ontstoken of beschadigde weefsel waardoor mogelijk de ideale uitgangssituatie ontstaat voor de AA amyloïdogenese. De pathologie van Serum Amyloïd A: biomarker bij ontsteking en obesitas? Naast de cholesterol recycle-functie heeft vrij circulerend SAA sterk pro-inflammatoire eigenschappen die passen binnen de ontstekings-hypothese van atherosclerose en insulineresistentie;73 beide pathologieën correleren dan ook goed met de plasma SAA spiegel.74–76 Zoals eerder benoemd leidt overgewicht tot een verhoging van de SAA spiegel en daalt deze indien gewichtsverlies plaatsvindt.77–79 Nader onderzoek wees uit dat bij obesitas niet de lever, maar het vetweefsel de belangrijkste producent is van SAA,80 waar het als adipokine bijdraagt aan de eerder beschreven chronische inflammatie die in het vetweefsel van obesitaspatiënten ontstaat.81,82 Deze rol van de SAA in vetmetabolisme, de associatie met obesitas en de twee belangrijkste pathologieën die hiervan het gevolg zijn, maakt het de meest aannemelijke amyloïdose-variant waar obesitas, of een vetrijk dieet, invloed op zou kunnen hebben. De rol van AA amyloïd bij obesitas-geassocieerd orgaanfalen in de praktijk Het langdurig verhoogd aanwezig zijn van het precursoreiwit SAA bij obesitas schept een voorwaarde voor het ontstaan van AA amyloïdose.54,83 Maar is dat ook waargenomen? Er zijn vooralsnog slechts twee bewezen gevallen van AA amyloïdose secundair aan obesitas bij mensen gepubliceerd.82,84 Ook bij een derde patiënt is het aangetoond; die patiënte is echter nog niet beschreven (persoonlijke mededeling B.P. Hazenberg). In alle 3 gevallen waren andere secundaire oorzaken voor AA amyloïdose zorgvuldig uitgesloten. De gevallen presenteerden zich met een nefrotisch syndroom ten gevolge van een amyloïde

10

nefropathie; het belangrijkste presenterende kenmerk van AA amyloïdose.83 Hoewel obesitas sterk geassocieerd is met chronische nierziekte,85–89 is het onderzoek naar mogelijke oorzaken beperkt gebleven tot kleinschalige autopsie- en operatieve onderzoeken vanwege de moeilijkheid om bij obese patiënten nierbiopsiën te verkrijgen.82,90 Studies geven dan ook aan dat onduidelijk is wat specifieke pathologische kenmerken zijn van obesitas-gerelateerde nierziekte; diabetische nefropathie en (hypertensieve) glomerulosclerose worden gevonden, maar deze zijn zonder specifieke kleuring niet altijd goed te onderscheiden van andere pathologieën, zoals amyloïdose. Er lijkt daarom verder onderzoek nodig te zijn om te bepalen welke andere pathologische processen hier een rol spelen.82,84,90,91

Met dit onderzoek willen we een beter begrip krijgen van (i) de rol van (AA) amyloïdose in obesitas-gerelateerde orgaandisfunctie en (ii) de oorsprong van het gevonden amyloïd in deze muizenstam. Zo is in enkele oude studies bij verschillende muizenstammen ouderdoms-amyloïd beschreven van zowel de AA als de ApoA2-variant, maar over de invloed van dieet en overgewicht bij deze C57BL6/J stam is niets bekend.92–94 In deze studie vergelijken we de leeftijdsgebonden amyloïd ontwikkeling tussen de laag- en hoog-vet-dieetgroep waarbij we gebruik maken van geavanceerde technieken om een accurate kwantificatiemethode voor amyloïd te ontwikkelen. Tevens zullen we de relatie tussen SAA spiegels, mate van amyloïdose en orgaanfunctie analyseren: is SAA een geschikte biomarker voor orgaandisfunctie en in hoeverre is de amyloïdose in ons geval verklarend voor het functieverlies? Om de inflammatie-hypothese te ondersteunen zullen we de mate van ontsteking in het vetweefsel onderzoeken. Tot slot trachten we het amyloïde eiwit te identificeren; is het inderdaad SAA dat hierbij betrokken is, of spelen andere eiwitten een rol?

Uiteindelijk hopen we antwoord te vinden op de vraag of de chronische ontsteking die gepaard gaat met obesitas inderdaad in staat is amyloïde pathologieën te induceren. Dit schept mogelijkheden voor vervolgonderzoeken naar de rol van amyloïdose bij obesitas-geassocieerd orgaan falen in mensen en de rol van obesitas in de verergering van reeds aanwezige amyloïdose. Materiaal en methode Oorspronkelijk dierproefonderzoek en leefomstandigheden 99 C57BL6/J muizen (Charles River laboratories, Chatillon-sur-Chalaronne, Frankrijk) werden gedurende 6, 9 en 12 maanden in het Dierproefcentrum van het UMCG gehuisd. De muizen waren 6 weken oud bij aankomst. Alle muizen ontvingen vervolgens 6 weken lang een laag vet dieet (LVD, 10% w/v varkensvet). Gedurende deze inloopperiode werden basaal metingen uitgevoerd en werden bloed en urine monsters afgenomen. Vervolgens werden de muizen individueel gehuisvest met kooiverrijking en werden ze willekeurig verdeeld over twee dieet groepen: de ene groep bleef op eerder genoemde 10% vet dieet, de andere groep werd op een dieet met 45% vet gezet, het hoog vet dieet (HVD). Binnen de twee groepen werden de dieren onderverdeeld in drie tijd-cohorten van 24, 40 of 52 weken (gemeten vanaf start experimenteel dieet). Voor de LVD groep waren de groepsgroottes 14, 15 en 16, voor het HVD was dit 16, 18 en 20 dieren respectievelijk. Zowel voeding als water waren ad libitum beschikbaar. Tijdens het onderzoek werd in het 52 weken cohort op 9 meetpunten bloed afgenomen via de vena saphena voor analyse van bloedmarkers in de tijd in individuele dieren (zgn. seriële plasma kinetiek). Voor alle drie de cohorten werd 2 weken voor offering 20 uurs urine

11

verzameld middels metabole kooien bij alle muizen over een gestandaardiseerde tijdseenheid 12.00-8.00. In een subgroep van 16 muizen uit zowel de t=24 als t=52wk groep (totaal n=32)

werd door de afdeling experimentiele cardiologie twee weken voorafgaand aan de offering echocardiografie verricht onder anesthesie (isofluraan met zuurstof). Voorafgaand aan de daadwerkelijke offering werd bij dezelfde groep dieren onder anesthesie tevens de arteriële bloeddruk en aanverwante parameters gemeten (vanaf nu: hemodynamische parameters). Een overzicht van de totale groepsindeling van de studie is weergegeven in Tabel 1. De dieren werden geofferd onder anesthesie (isofluraan met zuurstof) gevolgd door cervicale dislocatie. Volbloed werd afgenomen middels cardiale punctie, opgevangen in een met EDTA gecoate 300ul buis (Microvette 300, Sarstedt) en direct op ijs gehouden. Het onderste deel van de aorta werd doorgeknipt en de circulatie werd gespoeld door het cardiaal inspuiten van PBS. In het laboratorium werden de bloedmonsters afgedraaid bij 3000rpm, 4°C, werd het supernatant van het pellet gepipetteerd en vervolgens ingevroren bij -80°C voor verdere analyse. Verschillende organen waaronder de nieren, hart (gecompartimentaliseerd) en vetweefsel werden gewogen en deels ingevroren bij -80°C, deels gefixeerd in 10% formaline. In het laatste geval werden de weefsels na 24 uur fixatie doorgevoerd voor uiteindelijke inbedding in paraffine. Exclusiecriteria

Omdat de vraagstelling zich richt op de effecten van obesitas op amyloïdose, dienden de dieren tot aan het eind van de studie obees te zijn. Gewichtsverlies kent een geheel ander metabolisme dan overgewicht; zo is het bijvoorbeeld vaak geassocieerd met acute ziekte, wat onze observaties ten aanzien van de effecten van laaggradige inflammatie (via SAA) op amyloïdose zou verstoren. Daarom werden, na offering, op basis van

individuele groeicurves alle dieren uitgesloten die meer dan 15% afvielen ten opzichte van hun hoogste punt op de curve. Een overzicht van de groepsaantallen voor en na exclusie is weergegeven in Tabel 2.

Tabel 1 Groepsindeling bij aanvang muizenstudie

Tijd-cohorta Leeftijd bij offering LVD (wv. +HFB) HVD (wv. +HFB) Cohorttotaal

24 weken 36 weken 14 (8) 16 (8) 30 (16)

40 weken 52 weken 15 18 33

52 weken 64 weken 16 (8) 20 (8) 36 (16)

Totaal 45 (16) 54 (16) 99 (32)

Groepsindeling in absolute aantallen. a: Tijd op experimenteel dieet, de muizen waren bij aanvang dit onderzoeksgedeelte al 12 weken oud. wv. HFB: waarvan met hartfunctiebepalingen; bij deze dieren is bij leven echocardiografie verricht alsmede bepaling van hemodynamische parameters voor offering.

Tabel 2 Groepsindeling na exclusie

Tijd-cohort LVD (wv. +HFB) HVD (wv. +HFB) Cohorttotaal

24 weken start 14 (8) 16 (8) 30 (16)

Na exclusie 14 (8) 15 (7) 29 (15)

40 weken start 15 18 33

Na exclusie 14 15 29

52 weken start 16 (8) 20 (8) 36 (16)

Na exclusie 10 (4) 10 (5) 20 (9)

Totaal voor exclusie 45 (16) 54 (16) 99 (32)

Totaal na exclusie 38 (12) 40 (12) 78 (24)

Groepsindeling in absolute aantallen. wv. HFB: waarvan met hartfunctiebepalingen; bij deze dieren is bij leven echocardiografie verricht alsmede bepaling van hemodynamische parameters voor offering.

12

Voor analyse van amyloïdose in de nieren werden alle dieren gebruikt die na exclusie resteerden (n=78). De analyse van amyloïdose in de harten werd alleen verricht in de dieren waar bij leven ook functionele hartbepalingen van zijn verricht, aangevuld met 16 willekeurig gekozen dieren uit de t=40 weken groep, waarvan geen functionele metingen beschikbaar zijn. Het totale cohort voor de hartanalyse komt daarmee op n=48 vóór en n=38 ná exclusie. Kwantificatie amyloid Het doel van de kwantificatie is het inzichtelijk maken van de ernst van de amyloïdafzettingen in hart en nieren. In de nieren maken we onderscheid tussen glomerulair en interstitieel amyloïd, waarbij de laatste vaak pas in gevorderd stadium van het ziektebeeld ontstaat. Bij de harten richten we ons op totale amyloïdfractie het linkerventrikel. Congo rood kleuring De gouden standaard voor het aantonen van amyloïd is een kleuring met Congo-rood, deze kleurstof bindt irreversibel aan de amyloïdfibrillen en geeft naast de contrasterende rode kleur een appelgroene dubbelbreking (birefringence) onder gepolariseerd licht, een bevinding die pathognomonisch is voor amyloïdose.33,37,38 Van de verkregen muizenharten en -nieren werden resp. 10μm en 5μm parrafinecoupes gesneden, waarna ze na drogen en deparaffinatie gekleurd werden met Congo rood (Sigma C6277) en een hematoxiline-tegenkleuring (Merck 9249) voor herkenning van het omliggende weefsel, zoals eerder beschreven.95 Met een lichtmicroscoop werd de kwaliteit van de coupes geverifieerd, alsmede de aanwezigheid van amyloïd door te kijken naar de appelgroene dubbelbreking onder gepolariseerd licht. Kwantificatieprincipe Het (kwantitatief) analyseren van pathologische anatomie is een geavanceerde menselijke vaardigheid. Het bepalen van celvorm, groote, weefselstructuur, kleur en organisatie zijn taken die niet makkelijk door een computer kunnen worden overgenomen. Kwantificatie in histologische onderzoek geschiedt daardoor nog voornamelijk semi-kwantitatief, waarbij samples door twee of meer onafhankelijke onderzoekers worden beoordeeld en ordinaal gescoord. Deze methode beperkt echter de mogelijkheden en power van de statistische analyse en bevat altijd enige subjectiviteit.96,97 Eigenlijk is een meer objectief verkregen, continue variabele gewenst als uitkomstmaat. Daarnaast ligt het belangrijkste onderscheidende kenmerk van amyloïd niet in de morfologie, maar in de rode kleur van de afzettingen in het weefsel. De door het menselijk oog waargenomen kleur kan echter verschillen door overlap met hematoxiline aangekleurde weefselelementen (cross-talk) en door de interactie van de Congo-roodkleuring met aanliggende structuren (metachromasie).98 Recent ontwikkelde multispectrale opnametechnieken maken het echter mogelijk om de verschillende histologische chromogenen van elkaar te scheiden en vervolgens nauwkeurig hun respectievelijke oppervlakten te analyseren, zelfs wanneer de chromagenen overlappen of een vergelijkbare kleur hebben.97–99 Hierbij wordt van het achtergrondlicht en van de weefselcoupe bij meerdere lichtgolflengtes een opname gemaakt, waarmee van elke pixel het absorptiespectrum wordt bepaald. Door deze informatie te combineren met de spectra van de verschillende gebruikte histologische kleuringen, kan de opname worden ‘ontmengt’; bij onze studie in een Congo-rood en een hematoxiline laag. De relatieve omvang van de Congo-rood aankleurende gebieden kan vervolgens nauwkeurig met software worden bepaald. Voor ons onderzoek gebruikten we het Nuance™ FX spectraalsysteem (CRi, Woburn, VS), dat bewezen effectief is in het onderscheiden van celtypen en kwantificeren van weefsel

13

biomarkers.100–103 Hoewel deze multispectraalanalyse goed toepasbaar zou zijn voor het kwantificeren van amyloïd vanwege het karakteristieke absorptiespectrum van Congo-rood, is dit voor zover bekend niet eerder gedaan. Voor de analyse van de nieren verzamelden we op een vergroting van 200x 50 glomeruli per muis, hiervoor waren tussen de 3 en 14 (mediaan: 9) opnames nodig. Voor de analyse van de harten brachten we op een vergroting van 40x in 4 tot 8 (mediaan: 6) opnames het hele linker ventrikel in beeld. Na ontmenging werd aan het hemotoxiline spectrum grijs toegewezen en aan Congo-roodspectrum zwart. Deze contrastrijke grijswaardenafbeeldingen werd met lossless† compressie opgeslagen voor verdere analyse. De afbeeldingen van de harten werden samengevoegd tot een compleet ventrikel in Photoshop CS6 (Adobe Systems, San Jose, VS), met eliminatie van de overlappende gebieden. ImageScope analyse Voor de analyse van afbeeldingen gebruikten we Aperio ImageScope 11.2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Duitsland). Dit programma is in staat om met van het FDA-gecertificeerde Pixel Count-algoritme pixels te scheiden op basis van kleurbereik en intensiteit. Deze relatief nieuwe software is al in enkele recente studies met succes gebruikt om immunohistochemische kleuringen te kwantificeren.104–107 Binnen het programma kunnen interessegebieden worden getekend (positieve pen) en artefacten worden uitgesloten (negatieve pen). De berekening van pixelintensiteit vindt plaats met behulp van 4 instelbare drempelwaarden; negatief, zwak positief, positief en sterk positief, waarbij 255 maximaal wit is (achtergrond) en 0 maximaal zwart. Voor deze studie lag de interesse in het berekenen van de amyloïdfractie in droog weefsel, geëxcludeerd voor lumina. De drempelwaarden van het algoritme werden bijgesteld totdat er, visueel beoordeeld, een goede scheiding werd gemaakt tussen sterk aankleurend amyloïd (zwart, sterk positief: SP), overganggebied met lichter aankleurend amyloid (donkergrijs, positief: P), overig/amyloidvrij weefsel (lichtgrijs, zwak positief: ZP) en lumina (wit, negatief: N). Deze drempelwaarden en voorbeelden van de analyse-afbeeldingen zijn terug te vinden in Protocol B1 (zie bijlage). Voor de nieranalyse werden morfologisch representatieve glomeruli met de hand omcirkeld, artefacten en morfologisch slechte glomeruli werden geëxcludeerd met de negatieve pen, waarna de pixelpositiviteit binnen en buiten de glomeruli werd berekend. Bij de analyse van de linker ventrikels werden artefacten en het rechterventrikelrestant uitgesloten. In beide gevallen werd er gecorrigeerd voor achtergrondruis zoals weergegeven in Protocol B1. De gegevens werden in een macro geëxporteerd naar Excel alwaar de onderstaande formule werd gebruikt voor het berekenen van de amyloïdfractie. We kozen ervoor de hoeveelheid amyloïd uit te drukken in een arbitraire eenheid waarin de positieve gebieden half zo zwaar meewogen als de sterk positieve. De negatieve pixels (lumina) werden niet meegenomen in de oppervlakteberekening.

Totalrelativeamyloidload TRAL ‡ sterkpositieftotaaloppervlak

∙ positief

totaaloppervlakSP

SP P ZP ∙

PSP P ZP

De TRAL werd zowel berekend voor glomerulaire als interstitiële gebieden.

†: lossless; compressie zonder verlies van (beeld)informatie, zoals LZW in TIFF-bestand. ‡: In deze formule zijn de individuele parameters al gecorrigeerd voor achtergrondruis.

14

Kwalitatieve analyse amyloïd Amyloid isoleren (SDS extractie) Voor het isoleren van het amyloïd werden van ingevroren organen blokjes gesneden van gemiddeld 34 mg. De weefsels werden 24 uur geïncubeerd in 1mL 0,1M TE-oplossing (0,1M TrisHCl met 10mM EDTA), na extractie van de vloeistof gevolgd door 24 uur incubatie in 1mL SDS-extractiebuffer (3% sodium dodecyl sulfate in TE-buffer) zoals eerder beschreven.108,109 De aldus verkregen supernatanten werd ingevroren bij -21oC voorafgaand aan verdere behandeling. Western Blot en software-analyse De verkregen supernatanten werden opgekookt met SDS-loadingbuffer en in 20μl per slot opgebracht in een precast gel (Bio-Rad, Hercules, CA, VS). Voor de specifieke herkenning van SAA, en APO AII amyloïd werden respectievelijk Goat anti-Mouse SAA (R&D Systems, Minneapolis, VS) en Rabbit anti-Mouse APO AII (Novex Biotech, Salt Lake City, VS) primaire antilichamen gebruikt. Ter positieve controle werd bij blots ook muizenserum opgebracht. Het volledige protocol is bijgesloten in Protocol B2 (zie bijlage). Na incubatie met het fluorescent gelabeld secundair antilichaam (Gt anti-Rabbit IRDye680 en Dn anti-Goat IRDye680 van LI-COR Biosciences, Lincoln, VS) werden de blots ingescand met Odyssey CLx (LI-COR) en geanalyseerd in ImageView voor het vaststellen van de signaalintesiteit van de banden. Deze data werd geëxporteerd naar Excel en gecorrigeerd voor het weefselgewicht waaruit het isolaat verkregen was. Lasermicrodissectie en Proteomics We verrichtten een uitgebreidere kwalitatieve analyse van het amyloïdtype met massaspectrometrie proteomics na laser microdissectie van amyloïd uit niercoupes. Deze gouden standaard voor karakterisatie van amyloïd is recentelijk ontwikkeld en met succes toegepast voor karakterisatie van amyloïdafzettingen in nier, hart en zenuwvezels. 110–114 De preparatie van coupes en lasermicrodissectie werd uitgevoerd zoals beschreven door Vrana et al.,110 de hierop volgende massaspectrometrie analyse werd verricht door het Interfacultair Massaspectometrie Centrum RuG/UMCG (ERIBA, Groningen, Nederland) en geanalyseerd met de MASCOT proteomics database (Matrix Sience Ltd., Londen, VK). Immunohistochemie Voor immunohistochemische kleuringen werden longitudinale vriescoupes gesneden van in TissueTek ingebedde nieren op 5μm. De immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd zoals eerder werd beschreven voor de diagnostiek van systemische en lokale amyloïdose,115,116 met uitzondering van deparafinisatie-stappen, die hier niet van toepassing zijn. Als primair antilichaam werden anti-SAA en anti-APO A2 (herkomst gelijk aan Western Blot, tevens geschikt voor IHC) gebruikt, gevolgd door respectievelijk anti-Goat-HRP en anti-Rabbit-HRP secundaire antilichamen (Dako, Glostrup, Denemarken). Bepaling van orgaanfunctie en ontstekingsparameters met RT-PCR en ELISA De mate van orgaandisfunctie en –schade werd geëvalueerd in hart en nieren van de geofferde dieren. Ook werden de plasmabepalingen verricht van het acute fase reactant en amyloïde precursoreiwit SAA. Voor alle PCR analyses werd RNA geïsoleerd uit weefsel met RNeasy Mini plus Kit (Qiagen, Westburg, Leusden, Nederland) volgens instructies van de fabrikant. RNA kwantiteit (OD-260) en kwaliteit (OD-260/280) werden bepaald met een ND-1,000 UV-Vis spectrofotometer (NanoDrop Technologies, Rockland, VS). De PCR analyses werden uitgevoerd met SuperScript III reserve PCR (Invitrogen, Breda, Nederland). Voor de ELISA bepalingen werden de instructies van de fabrikant van de kits gevolgd (Alpco, Tilburg, Nederland).

15

In het linkerventrikelweefsel werden de expressie van atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), collageen type I en III (Col-1/3) en galactine-3 (Gal-3) bepaald met SuperScript reverse transcriptase PCR (Invitrogen, Breda, Nederland). Dit zijn belangrijke, vroege biomarkers voor hartfalen.117–121 Voor de nier werd de renale expressie van neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) bepaald (RT-PCR), een moderne, zeer sensitieve marker voor zowel acute als chronische nierschade,122–127 en tevens werden albuminurie in 20-uurs urine en serum ureum in offerbloed (ELISA) gemeten. Inflammatie van het vetweefsel werd onderzocht met expressiebepalingen van F4/80, IL-1β, MCP-1 en TNF-α. Ook werd de expressie van SAA onderzocht om te kijken of het vetweefsel tijdens de acute fase ook producent was van dit apolipoproteïne. Concentratie van SAA werden in seriële bloedplasma’s (t=52 weken cohort) en in het offerbloed (alle dieren) werden bepaald met ELISA. Microscoopfotografie Ter visualisatie van het ontstaan van de renale en cardiale amyloidose in de tijd werden representatieve foto’s gemaakt van de histopathologie per tijdspunt en dieetgroep (de mediane waarde in de kwantitatieve analyse vormde hierbij het uitgangspunt). De digitale opnames werden verricht met Olympus BX50/DP72 systeem en CellSens versie 1.4 (beide Olympus Corp., Tokyo, Japan). Statistische analyse Alle bovenbeschreven data werd geanalyseerd met SPSS (versie 21, IBM Systems, Armonk, VS) en GraphPad Prism (versie 5, GraphPad Software Inc., La Jolla, VS). Normaliteit en variantie van parameters werd onderzocht met Q-Q plot, Shapiro-Wilk test voor normaliteit en Levine’s test voor gelijkheid van variantie. Hierop werden de geschikte parametrische danwel non-parametrische tests gekozen voor het uitvoeren van de analyses (zie resultaten), deze werden significant bevonden bij p < 0,05 (significatieniveau α). Resultaten 1 Hoog-vet dieet leidt tot obesitas en ontsteking in vetweefsel

De muizen op hoog-vet dieet ontwikkelden ten op zichte van de laag-vet dieetgroep een significant hoger lichaamsgewicht en vetmassa, alsmede hogere spiegels van de obesitas parameters leptine, adiponectine en fibronectine (data niet weergegeven). Het hoog-vet dieet was daarmee een effectief model voor obesitasinductie.

Om het proces van vetweefselinflammatie bij obesitas in onze muizen te verifiëren bepaalden we de expressie van diverse immunologische merkers in het vetweefsel (Fig. 2). Expressie van F4/80, MCP-1 en TNF-alfa was in HVD-groep op alle tijdspunten significant en tenminste met een 3 voud verhoogd ten opzichte van LVD-groep. F4/80 bevindt zich als transmembraaneiwit op volwassen macrofagen, MCP-1 en TNF-α zijn belangrijke pro-inflammatoire cytokinen die geproduceerd worden bij een acute fase reactie van voornamelijk de aangeboren afweer (macrofagen). Dit bevestigt de met macrofaaginfiltratie gepaard gaande chronische ontsteking van het vetweefsel bij obesitas. expressie van IL-1β, een cytokine dat ook voornamelijk door macrofagen geproduceerd wordt, is alleen op 40 weken significant verhoogd in het vetweefsel en lijkt daardoor een beperktere, en meer tijdelijke rol te hebben in het vetweefselontstekingsproces.

Figuur

F4/80: traRelatieve**: p<0,01

3 H

geval sthoger zi

Ten aanmeasurein de segeanalyBonferr

Onderzoexpressiafkomst

2 Ontstekingsp

ansmembraaneiwit genexpressie t.o.v

1; ***: p<0,001 (ver

Figuur 3

Seriële plasmWeergegeve**: p<0,01 (t-

Hoog-vet d

tijgt de concijn dan de g

nzien van deements ANOriële meting

yseerd, waarroni-Holms

oek met RTie aantoonbtig uit de lev

parameters in e

universeel aanwezv. t=24wk LFD. Werschil t.o.v. LFD op

SAA plasmasp

mabepaling mSAA en zijn gemiddelden-test na Bonferroni-

dieet leidt to

centratie vangemiddelde

e statistischeOVA niet mgen. Daaromrbij de p-wamethode.

128

T-PCR naar baar was in hver.

epidydimaal vet

zig op volwassen mergegeven zijn gem hetzelfde tijdspunt

iegels (t=52 we

in perifeer bloed van ± standaardfout. -Holms correctie).

ot duurzaa

n het acute waarde ond

e analyse mmogelijk wam zijn de veaarde gecorr8

de herkomshet vetweef

tweefsel

macrofagen, IL-1β: Imiddelden ± standa, Bonferroni post-h

eken cohort)

an de muizen uit t=

am verhoog

fase eiwit nder een hoog

moet wordenas; bij veel merschillen perigeerd wer

st van het Sfsel van de m

Interleukine 1-betaaardfout. oc test na ANOVA)

=52 weken cohort.

gde plasma Sepeheaa32hocotreeebijzijtwlawvewhiplin

naar waardeg-vet dieet.

n opgemerktmuizen ontber tijdspunt d voor mult

AA liet zienmuizen; het

, MCP-1: monocyte

).

SAA spiegeriële bepalierifere bloedet 52 wekenan dat een h2 weken leidogere plasmoncentratiesend lijkt zicerder in te zej de dieren jn vanaf een

weemaal zo ag-vet groeeken wordt erschil gevoaarschijnlijkervoor is coasma SAA

nfectie in enkn die tenmi

t dat in dit gbrak een (wimet losse t-

tiple vergeli

n dat er naut SAA blijkt

e chemotactic prote

gels ingen in hetd van muize

n cohort toohoog-vet diedt tot signif

ma SAA s (Fig. 3). Dch overigensetten. De spmet hoog-vn half jaar choog als bij

ep. Alleen ot geen signifonden; de mke verklarinonfounding door een ac

nkele diereninste een 10

geval een reillekeurige)t-toetsen ijkingen me

uwelijks SAt vrijwel vo

eïn 1 ;TNF-α: Tumo

t en uit nden

eet vanaf ficant

Deze s al piegels vet dieet circa j de p t=42 ficant

meest ng van het

cute . In zo’n

0-voud

epeated ) waarde

et de

AA olledig

or Necrosis Factor

16

alfa.

4 K 4.1 MIn de mbeide diafzettingmicroscvinden whet laatsafzettingstudie vBij de hendomyafzettingvoorkeutoenamehoog-vedieren ude kwanmeegen 4.2 K

b

Computonder dwe een interstithoogvetde glomverschilvan inte

Figuur 4a

Mate van nieWeergegeve**: p<0,01 (D

Kwantitati

Microscopimet Congo ro

ieetgroepengen groene

coopfoto’s vwe bij een lste tijdspuntgen gevorm

vooraf ging, harten conceyocard (dezegen fors toeur voor de lue in amyloïdet dieetgroepuit het 24 wntitatieve an

nomen.

Kwantitatiebepaald doo

teranalyse ve microscoozich door d

tium van de tgroep op h

meruli en linllen zijn echerstitiële am

a Mate van nier

eramyloïdose uitgeden is Whiskers boxpDunn’s post-hoc tes

ieve analyse

isch beeld toood gekleurn vanaf 40 w

dubbelbrekvan represenleeftijd van t is dit toeg

md. Deze nienegatief vo

entreren hete laatste woegenomen euminale zijddose te zijn p erger te zeken cohortnalyse buite

eve amyloïdor een som

van de met dop verkrege

de tijd progrnier zien w

et 52-wekennkerventrikehter niet sign

myloïdose op

ramyloïdose

drukt in total relativplot: mediaan, interst na Kruskal-Wallis

e amyloïd

oont progrerde coupes tweken. Naasking onder gntatieve mu40 weken denomen en eren kleurdeoor diabetisct amyloïd ziordt afgebeeen diffuus vede. Over hetussen het 2

ijn aangedat bleek dat n

en beschouw

d-analyse lijvan veroud

de spectraalen indrukkenessief ontw

we tevens een tijdspunt (els de hoog-nificant. Vp 40 weken

ve amyloïd load (aarkwartierafstand, ras ANOVA). Het met

essieve amytoonden we st de karaktegepolariseeruizen is weede beginnenzijn er daaren in het ooche nefropaich aanvankeld in Fig. Berspreid ove

et geheel lijk24, 40 en 52

aan. Omdat nergens amywing gelaten

jkt uit te wijderings- en

lcamera vern (Fig. 4a e

wikkelende aen significan(dieeteffect)-vet dieetgro

Verder zien wgroter is da

angedane oppervlakange. Het 24-wekent grijze balk aangeg

yloïdose in hin nier- en

eristiek rodrd licht; eenrgegeven F

nde amyloïdrnaast omvaorspronkelijkathie (PAS kkelijk rond dB2), op het ler het myockt er in beid2 weken tijdna analyse vyloïd aantoon. Bij de har

jzen dat de dieeteffecte

rkregen opnen 4b). In zoamyloïdose nt verschil t). Met nameoep erger tewe het merkan bij 52 we

k) van respectieveln cohort bevatte gegeven verschil is on

hart en nierharten amye kleur vert

n overzicht mig. B2 (bijla

dose vooral angrijke inteke onderzoekleuring, dade coronairvaatste tijdsp

card. Er blijfde organen edspunt en ovan de nierconbaar was,rten is deze

ernst van aen

names leverdowel de nier(verouderin

tussen de laae op dit tijdse zijn aangedkwaardige veken (grijze

ijk de glomeruli en en amyloïd en is danterecht significant

ren yloïdose aantoonden de met age). In de nin de glomeerstitiële ek, dat aan data niet weevaten en hetpunt zijn deft echter eeneen duidelijoogt daarnaacoupes van , is deze groe groep wel

amyloïdose

de bewijs vren als hartengseffect). Iag- en spunt lijkt odaan, deze

verschil dat e balk) en is

het interstitium. aarom niet geanaly

t vanwege achtergr

n in

nieren eruli, op

deze rgeven). t

e n k ast de alle

oep in

wordt

oor de en zien In het

ook bij

de mate er, in

yseerd (zie 4.1). rondruis, zie tekst.

17

tegensteamyloïdtussen dDit is hekwantifredenent=40 wepositief coupes vtoegepana-effecoppervleffect opamyloïdook geeDe hartcachtergrdan ookbeperkinbeschikbmaar weniet gev 5 C 5.1 P

oFiguren(veroudeffect lijdieetgrogecontrohet amyhypothekunnen diëten alichaam(Tabel 3 In navollaten wegerelateVerder tin de glomet de mverbandTezameons ideelaaggrad

elling tot dedose, geen vde 40 en 52 et resultaat ficatiemethon vertoondeneken meer af geteld weevan t=52 w

aste correctict zichtbaarakte-effect p de data va

dose. Aan den conclusiecoupes vertrondruis en

k niet. Hier sng; omdat a

kbaar waren einig datapu

vonden sign

Correlaties

Positieve coondersteun

n 1, 2 en B1 deringseffecijkt te veroooepen is echoleerde fact

yloïdogene eese is immerbeïnvloede

aan de mate msgewicht st3).

lging van de zien dat oeerd is aan htoonden weomeruli (p=mate van amd bestaat tusen met de poe dat er hierdige inflam

e glomerulaiverschil aanweken hoovan een bep

ode. Om ondn de niercouachtergrondrfsel) bij anaeken. Ondae blijft hierv; vanwege hheeft dit mean de interstit verschil m

es verbondetoonden zeekennen dit

speelt wel ealleen de hazijn gekwa

unten over (nificantie tus

s

orrelaties tuen het conctoonden eet), waarbij e

orzaken. De hter groot (dtor (het hooeffect van drs dat obesi

en. Daarom van amyloï

terk positief

e aangetoonok lichaams

het plasma Se aan dat de =<0,05; r=0myloïdose inssen amyloïositieve corrr sprake is vmatie bij ob

ire ntoonbaar is g-vet groepperking in dduidelijke upes van ruis (vals-alyse dan deanks de van nog eenhet et name eentitiële moeten dan n worden.

er weinig probleem

een andere arten van de antificeerd b(zie Fig. 1).ssen de 40 e

ussen lichaacept van eenen leeftijdsgeen hoog-vespreiding v

data niet weog-vet dieet)de resultantetas, en niet correleerdeïdose in harf gecorrelee

nde invloedsgewicht vaSAA (respeSAA spieg,48) en niern het hart (pdose in de nrelaties tuss

van een systbesitas.

p. de

e

n

n

muizen wableven er in . Dit heeft men 52 weken

amsgewichtn door obes

gebonden onet dieet slecvan de lichaeergegeven)) te onderzoe van het diespecifiek ee

en we het licrt en nieren.erd is aan de

d van het hoan zowel hectievelijk p

gels goed corinterstitiump<0,05; r=0nierglomerusen amyloïdtemische AA

Figuur 4

Mate van oppervlak)Weergege**: p<0,01

aarvan ook fsommige su

mogelijk eenn groep.

t, plasma SAsitas beïnvlontwikkelingchts een trenaamsgewich; in plaats v

oeken, is heteet, namelijen hoog-vetchaamsgewi. Hiermee lie mate van a

og-vet dieett 52-weken<0,01; r=0,

orreleren mem (p<0,001; 0,38). Tot slulus en het hdose en lichA amyloïdo

4b Mate van ha

hartamyloïdose uitg).

even is Whiskers bo (Dunn’s post-hoc t

functionele ubgroepen nn nadelig ef

AA en amyoede AA amvan amyloï

ndmatige vehten binnen van het effect interessantk het overgt dieet, amyicht van de ieten we zieamyloïdose

t op de SAAals het geh

62 en p<0,0et de ernst vr=0,63) en ot laten wehart (p<0,05haamsgewicse als reacti

artamyloïdose

gedrukt in total rela

oxplot: mediaan, inttest na Kruskal-Wa

hartparamena exclusie

ffect gehad

yloïdose myloïdose ïdose aan

ersterking vde twee ct van de ter te kijken

gewicht. Onyloïdose zoumuizen van

en dat het in nier en h

A spiegel (Fhele cohort 001; r=0,71van de amylmatig corre

e zien dat er5; r=0,53). cht bekrachtie op chron

ative amyloïd load (

terkwartierafstand,allis ANOVA).

eters nog

op de

an dit

n naar nze u n beiden

hart

Fig. 3)

). loïdose eleren r een

tigt dit isch

(aangedane

range.

18

19

Tabel 3 Correlatie tussen obesitas, systemische ontsteking gekenmerkt door verhoogd plasma SAA en ernst van amyloïdose in nier en hart (Spearman r correlatiecoëfficiënten).

Mate van amyloidose

SAAplasma Nierglomerulair Nierinterstieel Hart

LG 0,71*** 0,50*** ns 0,43**

LG, t=52wka 0,62** 0,74*** 0,64*** ns

SAAplasma - ns 0,33* 0,38*

SAAplasma, t=52wka - 0,48* 0,63*** ns

Mate van amyloïdose

Nierglomerulair - ns 0,53*

Nierinterstitieel - ns

LG: Lichaamsgewicht bij offering. Nieren: 40, 52 weken (n=49), Harten 24, 40, 52 weken (n=37). a. Alleen verricht cohort van het laatste tijdspunt (t=52wk): vanwege lag phase van amyloïdose is dit een betere maat voor effecten van LG en SAA, zie kader op pagina 16. De overige correlaties zijn verricht over het gehele beschikbare cohort. b. Onbetrouwbare analyse, klein groepsaantal voor correlatie (n=9 , zie Tabel 2) *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001 (significantie Spearman rank correlatie)

5.2 Amyloïdose en obesitas correleren aan orgaandisfunctie in hart en nieren, maar het

plasma SAA niet. Om te zien welke klinische gevolgen de pathologisch geobserveerde amyloïdose had, onderzochten we de relatie met enkele orgaanfunctieparameters. Voor de nier correleerde de mate van amyloïdose aan albuminurie en renale NGAL expressie (respectievelijk p<0,001; r=0,44 en p<0,001; r=0,43), maar niet aan serum ureum waardes (p=0,57; r=0,08, BUN; blood urea nitrogen) (Tabel 4). In het hart waren er, met uitzondering van de systolische intra-ventriculaire septum dikte (IVSs), geen observeerbare correlaties tussen de bij leven echografisch bepaalde hart-functie en post-mortem geanalyseerde amyloïdose (Tabel 5). Ook waren er geen significante relaties met hemodynamische parameters als bloeddruk, polsdruk en hartslag (niet weergegeven). Echter, bij analyse van bekende biomarkers voor hartschade117–121 (genexpressie van hartfalenmarkers ANP, BNP, alsmede collageenproductie (Col-1, Col-3) en fibroblastactiviteit (Gal-3) in het hart) konden we sterke correlaties met de mate van hartamyloïdose aantonen. Ook de massa van de hartcompartimenten nam toe door het ziekteproces en kon gerelateerd worden aan de ernst van de amyloïdose.

Waarom onderscheid tussen 52-weken en het gehele cohort? Amyloïdose wordt gekenmerkt door een lag phase tussen de verhoogde aanwezigheid van het precursorproteïne en het ontstaan van amyloïdafzettingen; terwijl het gewicht van de muizen na 40 weken nauwelijks meer toeneemt (data niet weergeven), hebben de hieruit resulterende verhoogde SAA spiegels (zie Fig. 3) dus minstens enkele maanden nodig om amyloïdose te kunnen veroorzaken. Daarom hebben we in de correlaties tussen lichaamsgewicht, SAA en ernst van amyloïdose onderscheid gemaakt tussen (a) het gehele beschikbare cohort (24, 40 en 52 wk voor harten en 40 en 52wk voor de nieren) en (b) alleen de 52 weken groep. Deze laatste groep doet naar onze mening meer recht aan de hypothese binnen ons model: overgewicht veroorzaakt niet direct, maar op lange termijn amyloïdose. De correlaties met de 52 weken-groep zijn over het algemeen dan ook sterker. Alleen de correlaties met de hartamyloïdose zijn bij deze parameter niet significant; hier ondervinden we waarschijnlijk opnieuw nadeel van het kleine aantal muizen in de hoog-vet 52 weken groep na exclusie.

20

Daarnaast analyseerden we het concept van obesitas-geïnduceerde orgaandisfunctie door naar de directe correlatie tussen lichaamsgewicht en orgaanfunctie(parameters) te kijken. Deze bleken onder meer te bestaan voor albuminurie in de nier en voor Col1, Col3, Gal3-expressie in het hart, alsmede voor de gewichten van de hartcompartimenten. Voor het bepalen van de rol van SAA als biomarker voor (obesitas-geïnduceerde) orgaanschade keken we tot slot naar de directe relatie tussen plasma SAA spiegels en orgaanfunctie; de SAA spiegel

was gerelateerd aan albuminurie, cardiale Gal-3 expressie en de gewichten van de hartcompartimenten. Ook waren er correlaties met diverse echografische parameters van hartfunctie (Tabel B2). Over het geheel correleert het plasma SAA echter minder goed dan amyloïdose aan orgaandisfunctie. Tabel 5 Correlatie tussen obesitas, plasma SAA, ernst van amyloïdose het hart en bijbehorende orgaanfunctieparameters. (weergeven zijn de Spearman r correlatiecoëfficiënten)

Echoparameters Hartschade genexpressie Gewichten hartcompartimenten

IVSs Overige ANP BNP Col-1 Col-3 Gal-3 Geheel LV RV Atria

LG 0,58** † ns ns 0,49** 0,43** 0,45** 0,71*** 0,71*** 0,50*** 0,49**

SAAplasma 0,69** † ns ns ns ns 0,52* 0,60* 0,60* 0,59* ns

Mate van amyloïdose

Hart 0,51* ns 0,58*** 0,44** 0,50** 0,35* 0,60*** 0,56*** 0,55*** 0,42* 0,48**

LG: lichaamsgewicht bij offering, IVSs: intraventriculaire septumdikte tijdens systole; ANP: atrial natriuretic peptide; BNP; brain natriuretic peptide; Col-1/3; Collageen type 1/3; Gal-3: Galactine-3; LV: linkerventrikel; RV: rechterventrikel. De correlaties zijn verricht op het gehele cohort dieren waarbij hartfunctiebepalingen zijn gedaan (t=24 en 52wk, n=24). Vanwege het kleine groepsaantal in de 52 weken groep zijn hier geen losse correlaties van LG en SAA verricht die zich beperken tot dit cohort, zie

verklarende tekst. † Meerdere andere significante correlaties, deze worden voor de doelstelling van het onderzoek minder belangrijk geacht, zie Tabel B2 *: p<0,05; ** : p<0,01; ***: p<0,001

6 Kwalitatieve analyse 6.1 Western Blot Om de aanwezigheid van SAA en ApoA2 in de nieramyloïdafzettingen aan te tonen hebben we met verschillende amyloïdextractie- en isolatiemethoden geëxperimenteerd. Het einddoel hierbij was het isoleren van de amyloid fibrillen in een zo zuiver mogelijke waterige (fibrillen geïsoleerd in water) dan wel sereuze (fibrillen opgelost met andere weefseleiwitten) oplossing. Deze methodes werden eerder met succes toegepast voor amyloïd isolatie bij mens en dier, maar niet eerder ter uitvoering van een Western Blot op muizen. Hierdoor liepen we tegen enkele problemen aan. Een korte beschrijving hiervan kan behulpzaam zijn voor

Tabel 4 Correlatie tussen obesitas, plasma SAA, ernst van amyloïdose in de nier en nierfunctieparameters (Spearman r correlatiecoëff.).

Nierfunctieparameters

Albuminurie NGAL BUN

LG 0,53*** ns ns

LG, t=52wka 0,64** ns ns

SAAplasma 0,48** ns ns

SAAplasma, t=52wka ns ns ns

Mate van amyloïdose

Nierglomerulair 0,55*** 0,43*** ns

Nierinterstitieel ns ns ns

LG: lichaamsgewicht bij offering. Nieren: 40, 52 wk (n=49), Harten 24, 40, 52 wk (n=37). a. Alleen verricht cohort van het laatste tijdspunt (t=52wk, n=20): vanwege lag phase van amyloïdose is dit een betere maat voor effecten van LG en SAA, zie de verklarende tekst. De overige correlaties zijn verricht op het gehele beschikbare cohort. *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001

21

vervolgonderzoeken. Een wassing zoals beschreven door Pras et al.129 is zeer bewerkelijk en gaf op de blot incomplete resultaten, maar was achteraf gezien waarschijnlijk de beste methode geweest om door te ontwikkelen. De voor ELISA veel gebruikte guanidine-extractie130,131 werkte vlot en leverde bewezen eiwit op in het eindproduct. De lading van guanidine interfereerde echter met de elektroforese, waardoor de banden morfologisch vertekenden en doorliepen in naburige slots. Het tegen water dialyseren van het extract in een poging het guanidine te verwijderen bleek onsuccesvol. Uiteindelijk gebruikten we SDS-extractie om de fibrillen te isoleren, welke technisch een mooi resultaat opleverde, de blots zijn weergegeven in Figuur B3. Het gevonden patroon in de nierweefsel extracten komt echter niet overeen met de verwachte molecuulgewichthoogtes van SAA (12,5kD, AA: 8kD) en ApoA2 (monomeer 7,8kD). Aangezien amyloïd per definitie bestaat uit polymeren van het (bewerkte) precursoreiwit zou het mogelijk zijn oligomeren te vinden, al is dat door de denaturatiestap (koken van supernatanten) wel onwaarschijnlijk. Het is echter wel mogelijk eiwitten van verschillende lengtes te vinden door verschillen in proteolytische nabewerking van de fibrillen.132,133 Een kwantificatie van de meest in het oog springende banden in de SAA blots (ter hoogte van 25kD, zie Fig. B3) correleerde echter niet met de mate van amyloïdose noch de SAA spiegels (resultaten niet weergeven). Er lijkt dus sprake te zijn van aspecifieke binding van de gebruikte antilichamen. De secundaire, fluorescent gelabelde antilichamen zijn gecontroleerd op aspecifieke binding; deze bleek minimaal. Dit maakt aspecificiteit van de primaire antilichamen het meest waarschijnlijk. De correcte werking van de primaire antilichamen werd in de blots bevestigd door de controle samples. Deze antilichamen zijn gecertificeerd voor gebruik op Western Blot en zouden geschikt moeten zijn om de amyloïdeiwitten na de extractie en denaturatiestappen te herkennen. Dit lijkt echter niet het geval te zijn. Concluderend zijn we met Western Blot er niet in geslaagd de aanwezigheid van SAA of ApoA2 in nieren met bewezen amyloïddeposities aan te tonen. 6.2 Massaspectometrie Ondanks het zorgvuldig volgen van het protocol zoals beschreven door Vrana et al. hebben de analyses van het nieramyloid geisoleerd met behulp van lasermicrodissectie en gevolgd door massaspectrometrie meermaals geen resultaat opgeleverd. Niet alleen werden er geen amyloïde eiwitten gevonden, er werd geen enkel bekend (muis)proteïne gevonden. Dat is uiteraard onlogisch, aangezien er zichtbaar nierweefsel in de samples aanwezig was. Het maakte hierbij niet uit of we zelf de voorbereidingsstappen voor de massaspectrometrie uitvoerden op de verkregen samples, of deze lieten uitvoeren. Dit maakt het waarschijnlijk dat het probleem ligt in de massaspectometrie-methodiek van het ERIBA instituut. In de discussie wordt hier verder op in gegaan. 6.3 Immunohistochemie Immunohistochemische kleuring van de nieren van representatieve dieren toonde een interessant patroon van SAA en APO A2 afzettingen (Fig. B4). Op een leeftijd van 40 weken zijn in de hoog-vet dieet groep beginnende SAA deposities zichtbaar, terwijl de nieren van de laag-vet dieetgroep geheel vrij van AA amyloïd zijn. Wel tonen beiden groepen sporen van APO A2 amyloïdafzettingen. Bij een leeftijd van 52 weken zijn de beginnende SAA deposities in de hoog-vet dieetgroep uitgegroeid tot een weefseloverheersende AA amyloïdose. De laag-vet dieetgroep toont nog steeds praktisch geen aankleuring voor SAA. De APO A2 amyloïdafzettingen zijn in beide groepen in gelijke mate toegenomen. Voor de HVD groep is de APO depositie slechts een kleine fractie van het totale amyloïd, maar bij de

LVD dibleek de Concludeen hoovan diee 7 ADe bijzoleeftijdssoorten mogelijmechanbeter geanti-amyis een bvan het dit systeafval, zokunnen ook eenamyloïdpilotexpLC3 expautofagileeftijds Discus Met dit circulerbereikt continueobesitasconceptwe aannalbuminhart. Er orgaandgeassocnefropawaarschde muis De relaindividuDe achtsystemihet hierutussen dlichaam

ieren is het de apart gete

derend ontsog-vet dieet et of gewich

Autofagie ondere bevisgebonden oamyloïd dek een algem

nisme in de mezegd, een d

myloïdogeen elangrijk onlichaam; ve

eem leidt eroals eiwitagophopen.13

n bewezen bdplaque formperiment (n=pressie, eenie,139 in de nsgebonden a

ssie

onderzoek rend SAA endoor met sue schaal kws via laaggrat dat dit een nemelijk gemnurie, NGALbestonden

disfunctie incieerde oorzathie of andehijnlijk de ms.

tie tussen duele variatieterliggende sche laaggruit resultere

de hoog- en msgewicht en

de belangrijste aspecifi

taat er (i) eeen (ii) een l

ht.

inding van hontstaan vaneed vermoedmeen pro-ammuizenstam

disfunctionemechanism

nderhouds-merminderde rtoe dat intraggregaten, z4,135 Autofa

beschermendmatie.136–138

=28) toonden belangrijkenieren van dachteruit ga

hebben we n ernst van ucces een m

wantificeerbaadige inflam verklarendmaakt doorL expressietevens enke

n ons modelzaken van caere vormen meest verkla

dieet, obesitae factoren va

radige inflamende verhoolaag-vet gr

n plasma SA

jkste vorm veke binding

en progressileeftijdsafha

het n meerdere den dat er myloïdogeenm speelde, oeren van eeme. Autofagmechanismewerking va

acellulair zich zou agie heeft dade rol in 8 In een en we aan de merker vodeze muizen

aat (Fig. 5).

aangetoondamyloïdose

methode te oaar is. De b

mmatie zou de factor is i

het aantone in de nier eele directe rl ontstaat in ardiovasculavan glomer

arende patho

as, ontstekin

n dit lichaammmatie, weogde plasmaroep vanaf t=AA. Daarna

van de tweeg van de sec

ieve AA amankelijke A

n of en gie e an

an

dat oor n

d dat er een e bij muizenontwikkelenevindingen kunnen leid

in obesitas-gnen van posen ANP, BNrelaties tusse afwezigheiaire patholoruloscleroseologie van d

ng en amylo

msgewicht-lke in onze a SAA. Dez=32 weken

aast zou de h

Figuu

LC3 ext=24=1***: p<0

e onderzochcundaire ant

myloïdose bAPO A2 amy

relatie bestn. De causal waarmee aondersteun

den tot systegeassocieeritieve correNP, Col-1, Cen obesitas id van klassogie zoals he. Ofwel, dede obesitas-

oïdose is co

-gebonden zstudie aang

ze verhogingals met een

hoog-vet gr

ur 5 Autofagie i

pressie als maat vo,0. Weergegeven z0,001 (Bonferroni p

hte eiwitten.tilichamen n

ij dieren meyloïdose die

taat tussen (liteit Dit heb

amyloïd objenen onze hypemische AAde orgaandilaties tussenCol-3 en Gaen deze fun

sieke met obypertensie,

e amyloïdos-geassocieer

mplex en ke

ziekteprocesgetoond is ing bevestigenn goede corrroep meer am

n de nieren

oor autofagie in de zijn gemiddelden ±ost-hoc test na AN

. Op alle conihil.

et overgewie onafhanke

(over)gewicbben we meectief en oppothese dat

A amyloïdoisfunctie hen amyloïdoal-3 expressnctieparamebesitas diabetische

se is hier rd orgaansc

ent brede

s liggen in dn het vetwen wij zowelrelatie tusse

amyloïd kun

nieren. Relatieve g± standaardfout. NOVA)

upes

icht door elijk lijkt

cht, ede p een t se. Het

ebben se en sie in het eters. De

e

chade bij

de eefsel, en l direct en nnen

genexpressie:

22

23

ontwikkelen door de aanwezigheid van AEF in het ingenomen vet. Enkele recente studies hebben laten zien dat de initiatie van amyloïdose mogelijk is via voedsel dat AEF bevat, zoals foie gras.140,141 Onze hoofdgedachte blijft echter dat SAA door obesitas-geïnduceerde inflammatie AA amyloïdose veroorzaakt. Analoog aan het onderzoek van Yang et al. blijkt dit SAA bij muizen in onze studie uitsluitend geproduceerd te worden in de lever (mSAA1 RNA expressie data, hier niet getoond). Dat bekent dat bij obese mensen de geobserveerde SAA stijgingsreactie mogelijk zelfs sterker is; het vetweefsel neemt dan de rol van de lever over als belangrijkste producent van SAA.80,82 De totale productiecapaciteit zou hiermee groter zijn dan wanneer het SAA alleen in de lever aangemaakt wordt; de vraag is uiteraard of dit ook tot daadwerkelijk hogere serumspiegels zou leiden. Hoewel we met dit onderzoek slechts een associatief verband tussen SAA en de ernst van amyloïdose kunnen aantonen, is dit verband aannemelijk causaal: Het plasma SAA correleert bij mensen goed aan de ernst van AA amyloïdose en het risico hieraan te overlijden, zo ging bij 7-jaars follow-up een beperkt verhoogde spiegel (4-9mg/L, net boven de normaalwaarde) al gepaard met een relatief overlijdensrisico van 3,9 ten opzichte van individuen met normale SAA spiegels (<4mg/L).71,83,142 Of dit ook geldt voor de door obesitas-geïnduceerde verhoogde SAA spiegels (bij mensen) is nog onduidelijk. Het vormt naar aanleiding van de huidige muizenstudie in ieder geval een interessant onderzoeksthema. Wanneer we het ziekteproces in het muismodel nader bestuderen zien we dat de amyloïdose duidelijk tijdsgebonden verergerde, maar waren er, met uitzondering van de interstitiële amyloïdose op t=52wk, geen significante verschillen tussen de hoog- en laag-vet dieetgroep. Ook veel muizen in de laag-vet groep ontwikkelden een mildere, maar toch duidelijk aanwezige amyloïdose. Deze bevindingen kunnen op drie manieren verhelderd worden; i. Het laag-vet dieet bestond in deze studie uit 10% varkensvet; dit blijkt nog relatief hoog te

zijn voor een laag-vet controlegroep; in de internationale literatuur is 5% lard (‘chow’) in zo’n geval gebruikelijker. Het is dan ook niet merkwaardig dat sommige muizen uit onze laag-vet groep toch nog relatief zwaar werden, en daarmee ook getroffen werden door obesitas-gerelateerde pathologie. Dit vermoeden werd bevestigd in een pilotexperiment van een andere onderzoeker binnen onze groep, waar in chow dieren van dezelfde muizenstam en leeftijd wel enig amyloïd, maar geen SAA (AA amyloïd) werd aangetroffen bij immunohistochemisch kleuring.

ii. Daarnaast bestaat er binnen beide dieetgroepen een grote spreiding in lichaamsgewicht en mate van amyloïdose. In tegenstelling tot mensen kan er bij ingeteelde muizen stammen weinig genetisch verschil bestaan in de gevoeligheid voor het ontwikkelen van overgewicht. Onder meer verschillen in fysieke activiteit en totale intake (voedsel was ad libitum) zouden wel verklarend kunnen zijn voor de spreiding. Dat maakte het voor ons nog belangrijker om te kijken naar de directe relatie tussen gewicht en amyloïdose; de sterke correlatie hiertussen bevestigde dat de biologische gevolgen van overgewicht, en niet perse een vetrijk dieet, amyloïdose kunnen induceren dan wel verergeren. Dit maakt tevens de hypothese dat de resultaten voornamelijk verklaarbaar zijn door in het vet aanwezig AEF onwaarschijnlijk.

iii. Tot slot zorgen de beperkingen in studieopzet in combinatie met de statistische analyse ervoor dat het lastiger was om groepsverschillen aan te tonen. Een goede studieopzet begint met een power analyse: deze is bij dierproefstudies vaak al lastig omdat er vaak weinig normaalwaardes beschikbaar zijn in experimentele vakgebieden. In dit geval was er zelfs sprake van het achteraf testen op verschillen in datasoorten waar bij aanvang van de studie niet op gerekend was; de amyloïdose was een onverwachte bevinding. Vervolgens bleven er, na exclusie van acuut ziek geworden dieren, in sommige subgroepen relatief weinig datapunten over (zie fig. 1). De data bleek non-parametrisch verdeeld, waardoor gekozen werd voor een Kruskal Wallis ANOVA met een Dunn’s host hoc analyse. Deze

24

test is overmatig conservatief op een type I fout (ten onrechte verwerpen h0, in ons geval: het vinden van een verschil) en heeft daardoor een matige power.143 Dit maakt de gevonden verschillen in ernst van amyloïdose op basis van verouderingseffecten sterk, maar mist mogelijk verschillen tussen de hoog- en laag-vet dieetgroep.

Amyloidose en orgaanschade We hebben aannemelijk gemaakt dat amyloïdose bij deze dieren leidt tot orgaanschade door sterke correlaties met diverse belangrijke merkers voor weefselschade in hart- en nieren aan te tonen. Echografische en hemodynamische hartparameters en serumureum (BUN) correleerden echter niet met de mate van amyloïdose. Tevens was het plasma SAA maar in een beperkte mate een voorspellende merker voor de orgaandisfunctie die de amyloïdose, blijkens de correlaties, zou veroorzaken. Deze bevindingen zijn niet direct verwonderlijk: ook in de kliniek is er niet een volledige overeenkomst tussen de pathologische ernst van amyloïdose en orgaandisfunctie.37,142 Wellicht heeft dit te maken met effecten van toxische oligomeren; verschillen in concentratie van deze intermediaire amyloïdeiwitten zijn echter zeer moeilijk aan te tonen. Ten tweede kijken we hier waarschijnlijk naar een relatief beginstadium van orgaandisfunctie; de dieren waren nog grotendeels gezond. De nieren en het hart hebben grote fysiologische reservecapaciteit, pas wanneer de schade dit punt overtreft worden klinische gevolgen snel zichtbaar. Een voorbeeld is het serum ureum (BUN), dat pas bij aanzienlijk afgenomen nierfunctie significant zal stijgen en pas bij nog hogere waarden het leven bedreigd door uremische encefalopathie; het nierfalen bevindt zich dan echter al in een eindstadium. De twee andere bepaalde nierfunctiewaarden, albuminurie en NGAL expressie, zijn juist vroege markers van nierschade en correleerden sterk aan de mate van amyloïdose. Zo impliceert het verlies van eiwit de destructie van de glomerulaire filtratiefunctie, voornamelijk door verlies van negatieve lading van het endotheel, nog voordat de filtratiesnelheid beïnvloed wordt. NGAL is een meer recent ontdekte biomarker voor vroege nierschade. Haar voorspellende rol is bij zowel acuut als chronisch nierfalen bewezen en het is goed mogelijk dat deze marker binnen afzienbare tijd breder klinisch wordt toepast.122–127 In het eveneens door amyloïdose getroffen hart zien we een vergelijkbaar beeld; we vinden nog geen veranderde fysieke functie (echocardiografie, hemodyanamische parameters) maar wel sterk positieve correlaties met diverse belangrijke biomarkers van vroege hartschade, zoals BNP en Gal-3, welke voorspellend zijn voor het ontwikkelen van hartfalen.117–121 Samenvattend ondersteunen bovenstaande bevindingen onze theorie dat we na één jaar in ons muismodel naar een nog relatief vroege fase van orgaanschade kijken: het topje van een snel naderende amyloïdberg. Spectrale beeldvorming is een goede techniek voor objectieve amyloïdkwantificatie Tijdens het onderzoek ontwikkelden we met succes een nieuwe/betere methode om amyloïd te kwantificeren met behulp van spectral imaging en elektronische beeldanalyse. De bereikte voordelen van deze methode, ten opzichte van semi-kwantitatieve analyse door 2 onderzoekers, zijn onder meer objectiviteit en het kunnen uitdrukken van de ernst in een continue variabele. We ondervonden echter ook beperkingen aan de methode; het inscannen en aftekenen van glomeruli in niercoupes met spectraalcamera software is tijdrovend. De analysesoftware heeft, meer dan mensen, last van verschillen in coupekleuring en –kwaliteit, wat zich uit in een wisselende mate van achtergrondruis. Hiervoor is grotendeels te compenseren, maar er blijven na-effecten bestaan die, vooral bij kleine groepsaantallen, nadelige effecten kunnen hebben voor de analyse. De verslechterde signaal-tot-ruis verhouding zal eerderen leiden tot het ten onrechte niet vinden van een verschil dan het

25

omgekeerde; de methode is dus conservatief. Het soort weefsel en het preparatie- en kleuringsprotocol kunnen hier invloed op hebben: in ons onderzoek was de achtergrondruis bijvoorbeeld aanzienlijk lager in de hartcoupes. Voor toekomstige analyses concluderen we dat deze methode belangrijke voordelen biedt boven menselijke kwantificatie. Hoewel protocolverschillen mogelijk tot andere absolute waardes leiden, blijven kwantificatieresultaten goed onderling vergelijkbaar zijn zolang de coupes binnen het onderzoek op dezelfde manier behandeld zijn.

Kwalitatieve determinatie van het amyloïde eiwit Hoewel we er niet in zijn geslaagd alle kwalitatieve determinatiemethoden met succes af te ronden, hebben we immunohistochemisch aangetoond dat de amyloïddeposities in onze muizen ten minste bestaan uit een aanzienlijke hoeveelheid SAA, gecombineerd met enige sporen van ApoA2. Tevens suggereren de voorlopige resultaten dat het SAA amyloïd veel sneller toeneemt dan de ApoA2 afzettingen. Buiten de tijdspanne van deze onderzoeksstage zullen deze resultaten in de rest van het muizencohort bevestigd moeten worden. We hadden onze aandacht namelijk aanvankelijk gericht op meer sensitieve methode om amyloïdeiwitten aan te tonen; Western Blot en massaspectometrie. Uit de opgedane ervaring met Western Blot concluderen we dat het best gekozen kan worden voor een isolatiemethode volgens Pras et al.129; deze techniek is bewerkelijker dan de tegenwoordig voor ELISA veelgebruikte guanidine of SDS-extractie, maar geeft een zuiverder product. De fibrillen zijn opgelost in water in plaats van onderdeel van een eiwitconcentraat, wat de kans op aspecifieke binding verkleint. Indien de blot niet-conclusieve resultaten oplevert kan een aminozuurvolgordebepaling van de band in de elektroforesegel worden verricht. Hiermee kan zekerheid over de aanwezigheid van het eiwit verkregen worden, ook als deze zich niet op de verwachte hoogte bevindt door bijv. polymerisatie. Deze bewerkelijke kwalificatiemethode is in het verleden, voor de opkomst van modernere analysetechnieken, al veelvuldig met succes toegepast.130,144 Alternatief is het verrichten van ELISA op het weefsel-isolaat. Deze methode is voor routinematige diagnostiek op mensen goed doorontwikkeld, maar is bij dieren tot noch toe beperkt gebleven tot serumanalyses, zoals ook in onze studie.116,145 Onze voorkeur ligt echter bij massaspectrometrische bepaling van met lasermicrodissectie uitgesneden amyloïddeposities. Deze moderne gouden standaard kan de samenstelling van het amyloïd in kaart brengen zonder dat er naar een specifiek eiwit hoeft te worden gezocht.110–114 Helaas keerden de analyses van de LMD monsters blanco terug. Het Interfacultair Massaspectometrie Centrum RuG/UMCG (ERIBA) heeft geen ervaring met dergelijke bepaling. De onmogelijkheid om volledig inzicht te krijgen in hun methodiek heeft ons ertoe gebracht om voor toekomstige analyses samen te werken met de Amerikaanse ontwikkelaars van deze amyloïddeterminatiemethode (Vrana et al.110). Zij zullen nieuwe LMD monsters analyseren met hun eigen apparatuur. Wij kijken uit naar hun resultaten, welke onomstotelijk uitsluitsel zullen geven over de samenstelling van het gevonden amyloïd. Protectieve mechanismen / autofagie daalt door ageing De voorlopige resultaten van de kwalitatieve eiwitbepaling suggereren dat er in deze muizen meerdere soorten amyloïd naast elkaar bestaan, zoals al eerder in 1991 door Higuchi beschreven is.92 Er is in het wetenschappelijk veld debat of dit een meer dan theoretische mogelijkheid betreft. Op basis van het seeding concept kan men beredeneren dat een muizenstam die genetisch gevoelig is voor ApoA2 amyloïdose, daarna ook sneller andere vormen, zoals AA, zou afzetten. Het blijkt echter dat seeding in veruit de meeste gevallen eiwitspecifiek is.59,146,147 Ondanks de gelijke structuur van de amyloïdfibrillen zijn de

26

specifieke zijketens van het eiwitmonomeer waarschijnlijk toch belangrijk voor het laten aanhechten van nieuwe precursoreiwitten. Omdat het hier zou kunnen gaan om een uitzonderingsgeval zou het toch interessant zijn te onderzoeken of een obese CB57 B6/J muis die kunstmatig geseed wordt met ApoA2 sneller AA amyloïd ontwikkelt dan zijn niet-geseede tegenhanger. We gaan er echter vanuit dat er hier geen sprake van is; immers, het ApoA2 amyloïd lijkt zich zowel in onze als in Highuchi’s studie later te ontwikkelen dan AA.

Een alternatieve verklaring voor het vinden van meerdere amyloïden in dezelfde muis is dat er een defect bestaat in een van de gemeenschappelijk pathofysiologische stappen waarin amyloïd ontstaat dan wel voorkomen wordt. Hiervoor zijn diverse mogelijkheden, bijvoorbeeld: (i) een mutatie van eiwitcontrolemechanismen (chaperones, lysosomen, proteosomen, autofagosomen etc.) waardoor deze niet meer goed functioneren of sneller verouderen. Deze mechanismen begeleiden het vouwproces van de zeer reactieve, pas aan het ribosoom gemaakte eiwitten en ruimen verkeerd gevouwen varianten op.45–48 Het controlesysteem is waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom amyloïdose zo zeldzaam is bij mensen (en wild type dieren). Een defect verhoogt de kans op het vrijkomen van misvouwen, instabiele eiwitten van elke soort. Andere mogelijkheden zijn (ii) afwijkende samenstelling van de extracellulaire matrix waarmee het aanhechten van instabiele monomeren bevorderd wordt of (iii) defecten in systemen die kleine eiwitaggregaten opruimen buiten de cel, zoals weefselresidente macrofagen. Daarmee wordt de kans dat de depositie zich kan uitbreiden tot amyloïde nucleus vergroot. Het verslechterd functioneren van deze mechanismen kan een direct gevolg zijn van een genetische afwijking, maar ook resulteren uit versnelde veroudering. In ons onderzoek toonden we aan dat microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A (LC-3), een marker voor autofagie, leeftijdsgebonden achteruit gaat. Als belangrijk onderdeel van de eiwitcontrolemechanismen kan verminderd functionerende autofagie leiden tot versnelde ontwikkeling van (meerdere soorten) amyloïdose.136–138 En mogelijk speelt ook (versnelde) verouderingsgebonden achteruitgang van andere protectieve mechanismen hier een rol. De ageing-inflammatie hypothese Wanneer we het concept van door obesitas geïnduceerde AA amyloïdose combineren met door veroudering aangetaste protectieve mechanismen, in een muis die genetisch gevoelig is voor ApoA2 amyloïdose, ontstaat een interessant model (Fig. 6). Wij hypothetiseren dat zich een leeftijdsgebonden basishoeveelheid amyloïd vormt in deze muizenstam, als gevolg van afnemende werking van protectieve mechanismen (groene kruising). De verhoogde SAA spiegel bij individuen met obesitas (of andere bron van ontsteking, al dan niet tezamen met een vorm van AEF in het dietaïre vet) zorgt hierbij voor een omvangrijk toegevoegd pathologisch effect: de amyloïdose ontwikkelt zich eerder en sneller (rode kruising). Dit concept zou ook gelden voor andere precursoreiwitten met verhoogde concentratie en daardoor verkorte lag phase. Vanwege de beperkte omvang van de pilotstudie is het nog onvoldoende duidelijk wat de effecten van dieet en lichaamsgewicht op autofagie in de nier zijn. Zo is er gerapporteerd dat autofagie in vetweefsel kan toenemen bij jonge obese muizen.148,149 Het is echter niet onderzocht of deze reactie ook behouden blijft bij veroudering. Daarnaast vindt in vetweefsel bij obesitas een ontstekingsproces plaats, terwijl amyloïdose zich, na de opstartfase, kenmerkt door afwezigheid van inflammatie. Dat maakt het aannemelijk dat de autofagiereactie in door amyloïd getroffen organen zoals nieren en hart anders is dan in vetweefsel.

De veroen naar grote indaadwevraag wcontroledaarop iproteaseverschilmechanspeelt beiwitconinstabievetweef Concludobesitasamyloïdinflammdoor eenaan diabamyloïdZo zullestudie nhand vaorgaanfamyloïd

Figuur 6 D

Weergegeveobesitas en vis tevens de inflammatie lsneller ontwiverouderendbuiten de nor

ouderings-inobesitas-ge

ndividuele verkelijk ontswaarom slecheerbare chrois niet eenven en samenllen.150 Een

nismen passebovendien nntrolemecha

elere, misgevfsel geprodu

derend heefs, namelijk ddose kan onmatie en metn recente stubetische nefdose aangetren in de VSnaar de relatan onze studfalen verder dose bij mor

De ageing-inflamm

en is de cumulatieveversneld verouderenormale verouderinoopt de totale SAAkkelt. Later volgt eee protectieve mechrmale levensspan v

nflammatie eïnduceerdevariatie in destaan van amhts een kleionische ontsoudig; ondenstelling vandefect in ofen goed in dog een extraanismen in vouwen eiwuceerd word

ft ons onderdegenen me

ntwikkelen atabole overbudie van Difropathie weroffen in de binnenkorttie tussen obdie duidelijkr reikt dan drbide obesit

matiehypothese i

e belasting van de ende protectieve anng van deze mecha

A belasting harder oen beperkte mate vhanismen en cumuvan het organisme

hypothese i amyloïdosee aanwezighmyloïdose. On deel van pstekingszieker andere afn proteoglyf versnelde deze verklara factor meehet vetweef

witten, zoalsdt.80

rzoek aannemet genotypisals gevolg vbelasting vaiez et al.; inerd in circa e nieren.151A

t vroege resbesitas en Ak geworden de eerder gentas.82,84 Amy

n beeld

amyloïdogene eiwinti-amyloïdogene manismen geschetstop, waardoor AA amvan APO amyloïd. Dlatieve amyloïdoge bevinden: dan onts

is goed verte in het bijzheid van amOnderzoekepatiënten mkte een AA fwijkingen iycanen zoud

verouderingring(en). Bie: de metabfsel.12,16,17 Ds SAA, dat b

melijk gemsch zwakkervan obesitasan het vetwn hun autops

eentiende vA Dergelijke

sultaten geprAA amyloïd

dat de rol vnoemde casyloïdose he

itten in een individumechanismen. Ter rt. Onder obesitas-gmyloïd zich eerder De kruising tussen

ene eiwitbelasting kstaat er dus geen a

Ddahosndiwmgrvowzijmkwvovabebebedeoode Dam

taalbaar naazonder. Juis

myloïdogeneers hebben z

met, bijvoorbamyloïdose

in SAA genden verantwg van autofaij de relatie

bole overbelDit vergrootbij obese pa

maakt dat eenre protectie-geïnduceereefsel. Dezesieonderzoevan de gevae resultatenresenteerd wose.152A In i

van amyloïdse reports vaeeft mogelijk

u met referentie gedreven en normale

kan zich amyloïd.

e trend die wat autofagie oog-vet dieenel afneemt eet groep (reergegeven

moeten echterotere schaaoor ze statisorden. Ook jn de amylo

model afzondwantificerenoorgestelde an ApoA2 eevestigen. Deantwoordenevindingen aeel van de vorsprong vaeze muizen.

e relatie tusmyloïdose bar AA amylot bij mensen

e precursorezich altijd gbeeld, een oe ontwikkel

notype, macrwoordelijk kufagie en and

tussen amylasting van dt de kans opatiënten voo

n deel van pve mechanirde, laaggrae theorie wo

ek op 330 paallen ook, of

nodigen uiworden vanieder geval dose bij obean acuut orgk een signif

wij observe in de niereet muizen nals in de la

resultaten nn). Deze resuer nog op eeal bevestigdstisch getestk zou het weoïde eiwittenderlijk te n om het progressiep

en AA-amylDesalniettemn deze eerstal een belan

vraag wat dean het amylo.

ssen obesitabij mensen oïdose bij mn bestaat ereiwitten en hgeïnteresseeonvoldoendelt. Het antwrofaagfunctunnen zijn v

dere protectiyloïdose en de protectie

p het vrijkomornamelijk i

patiënten mismen, AA adige, systemordt onderstatiënten dief voornamelit tot bevestn een klinisc

is mede aanesitas-geassogaanfalen dficant aande

eren is n van

net zo ag-vet

niet ultaten en

worden t kunnen enselijk n uit het

patroon loïd te

min te ngrijk e oïd is in

as en

mensen r een het

erd in de e oord tie, voor de ieve obesitas

eve men van in het

et

mische teund

e leden lijk, AA iging.

che n de ocieerd

door AA eel in de

27

28

orgaandisfuncties die met obesitas gepaard gaan, zoals hart- en nierfalen. Een inventarisatie van de aanknopingspunten voor vervolgonderzoek leert ons dat er nog veel werk te doen is om dat onomstotelijk aan te tonen (Tabel 6). Het zou de medische visie op deze relatief obscure ziekte voorgoed veranderen en een belangrijke vooruitgang kunnen brengen in onderzoek naar amyloïde ziektes in het algemeen.

Tabel 6 Samenvatting van aanknopingspunten voor vervolgonderzoek naar relatie tussen amyloïdose en obesitas

- Uitvoeren van dieronderzoek met voor aanvang als doel de amyloïdontwikkeling te analyseren, met hierop aangepaste powerberekening en grotere groepsgrootte, waarbij:

o Ook een met chow dieet / bewezen AEF vrij dieet gevoedde dierengroep meegenomen worden o Dieren langer leven (>52 wk) of oudere dieren gebruikt worden: ontwikkelen deze dieren dan

inderdaad gevorderde orgaanfunctiestoornissen, zoals de vroege biomarkers voorspellen? o Een interventionele studieopzet wordt gekozen, waarmee de relatie tussen overgewicht, plasma

SAA en amyloïdose causaal gemaakt kan worden. - Determinatie van betrokken amyloïdeiwit(ten) bij obesitas-geïnduceerde amyloïdose met massaspectometrie

en/of amminozuurvolgorde analyse (gouden standaarden). o Kwantificering van deze eiwitten (wrs. APO en SAA), bijvoorbeeld met immunohistochemie.

- In grotere studie testen van leeftijdsgebonden achteruitgang van anti-amyloïdogene protectieve mechanismen, zoals autofagie.

- Onderzoek naar amyloïde pathologieën (specifiek AA amyloïdose) bij mensen met obesitas en orgaandysfunctie (in populatie met en zonder T2DM).

o Is de (licht) verhoogde SAA spiegel bij obesitas net zo sterk geassocieerd met (i) amyloïdose, (ii) orgaanschade en (iii) mortaliteit als nu al is aangetoond bij de bestaande patiëntpopulatie met AA amyloïdose?

29

Literatuurlijst 1. WHO. WHO Global Infobase: data on overweight and obesity, mean BMI, healthy diets and

physical inactivity. WHO Global InfoBase. 2008. [Internet] via https://apps.who.int/infobase/Index.aspx, retrieved 3-2-2014.

2. Haslam DW, James WPT. Obesity. Lancet. 2005;366(9492):1197–209.

3. Low S, Chin MC, Deurenberg-Yap M. Review on epidemic of obesity. Ann Acad Med Singapore. 2009 Jan;38(1):57–9.

4. WHO. Obesity: preventing and managing the global epidemic. WHO Technical Report Series number 894. Geneva; 2000.

5. National Audit Office. National Audit Office. Tackling obesity in England: a report by the Comptroller and Auditor General. London; 2001.

6. Allison DB, Fontaine KR, Manson JE, Stevens J, VanItallie TB. Annual deaths attributable to obesity in the United States. JAMA. 1999 Oct;282(16):1530–8.

7. International Diabetes Federation. The IDF consensus worldwide definition of the Metabolic Syndrome. Brussels; 2006.

8. Isomaa B, Almgren P, Tuomi T. Cardiovascular morbidity and mortality associated with the metabolic syndrome. Diabetes Care. 2001;24(4).

9. Romeo GR, Lee J, Shoelson SE. Metabolic syndrome, insulin resistance, and roles of inflammation--mechanisms and therapeutic targets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012 Aug;32(8):1771–6.

10. Schmidt MI, Duncan BB. Diabesity: an inflammatory metabolic condition. Clin Chem Lab Med. 2003 Sep;41(9):1120–30.

11. Lumeng CN, Saltiel AR. Inflammatory links between obesity and metabolic disease. J Clin Invest. 2011;121(6):2111–7.

12. Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 2006 Dec;444(7121):860–7.

13. Ceriello A, Taboga C, Tonutti L, Quagliaro L, Piconi L, Bais B, et al. Evidence for an independent and cumulative effect of postprandial hypertriglyceridemia and hyperglycemia on endothelial dysfunction and oxidative stress generation: effects of short- and long-term simvastatin treatment. Circulation. 2002 Sep;106(10):1211–8.

14. Erridge C, Attina T, Spickett CM, Webb DJ. A high-fat meal induces low-grade endotoxemia: evidence of a novel mechanism of postprandial inflammation. Am J Clin Nutr. 2007 Nov;86(5):1286–92.

15. Anderson RA, Evans ML, Ellis GR, Graham J, Morris K, Jackson SK, et al. The relationships between post-prandial lipaemia, endothelial function and oxidative stress in healthy individuals and patients with type 2 diabetes. Atherosclerosis. 2001 Feb;154(2):475–83.

16. Emanuela F, Grazia M, Marco DR, Maria Paola L, Giorgio F, Marco B. Inflammation as a Link between Obesity and Metabolic Syndrome. J Nutr Metab. 2012 Jan;2012:476380.

17. Monteiro R, Azevedo I. Chronic inflammation in obesity and the metabolic syndrome. Mediators Inflamm. 2010;2010.

18. Rodríguez-Hernández H, Simental-Mendía LE, Rodríguez-Ramírez G, Reyes-Romero MA. Obesity and inflammation: epidemiology, risk factors, and markers of inflammation. Int J Endocrinol. 2013 Jan;2013:678159.

19. Jin C, Flavell RA. Innate sensors of pathogen and stress: linking inflammation to obesity. J Allergy Clin Immunol. Elsevier Ltd; 2013 Aug;132(2):287–94.

20. Epstein F, Ross R. Atherosclerosis—an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999;340(2):115–26.

21. Hansson GK, Robertson A-KL, Söderberg-Nauclér C. Inflammation and atherosclerosis. Annu Rev Pathol. 2006 Jan;1:297–329.

30

22. Pickup J. Inflammation and Activated Innate Immunity in the Pathogenesis of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 2004;27(3).

23. Ziegler D. Type 2 diabetes as an inflammatory cardiovascular disorder. Curr Mol Med. 2005 May;5(3):309–22.

24. Libby P, Ridker P, Hansson G. Inflammation in Atherosclerosis: From Pathophysiology to Practice. J Am Coll Cardiol. 2009;54(23):2129–38.

25. Libby P, Theroux P. Pathophysiology of coronary artery disease. Circulation. 2005 Jun;111(25):3481–8.

26. Dronavalli S, Duka I, Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropathy. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2008 Aug;4(8):444–52.

27. Aso Y. Cardiovascular disease in patients with diabetic nephropathy. Curr Mol Med. 2008 Sep;8(6):533–43.

28. Ray A, Huisman M V, Tamsma JT, van Asten J, Bingen BO, Broeders E a BJ, et al. The role of inflammation on atherosclerosis, intermediate and clinical cardiovascular endpoints in type 2 diabetes mellitus. Eur J Intern Med. European Federation of Internal Medicine.; 2009 May;20(3):253–60.

29. Bongartz LG, Cramer MJ, Doevendans P a, Joles J a, Braam B. The severe cardiorenal syndrome: “Guyton revisited”. Eur Heart J. 2005 Jan;26(1):11–7.

30. Ronco C, Haapio M, House A a, Anavekar N, Bellomo R. Cardiorenal syndrome. J Am Coll Cardiol. 2008 Nov;52(19):1527–39.

31. Baur J a, Pearson KJ, Price NL, Jamieson H a, Lerin C, Kalra A, et al. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature. 2006 Nov;444(7117):337–42.

32. Morrison M, van der Heijden R, Heeringa P, Kaijzel E, Verschuren L, Blomhoff R, et al. Epicatechin attenuates atherosclerosis and exerts anti-inflammatory effects on diet-induced human-CRP and NFκB in vivo. Atherosclerosis. 2014 Mar;233(1):149–56.

33. Hazenberg BPC. Amyloidosis: a clinical overview. Rheum Dis Clin North Am. 2013 May;39(2):323–45.

34. Gertz MA, Lacy MQ, Dispenzieri A. Amyloidosis. Hematol Oncol Clin North Am. 1999 Dec;13(6):1211–33, ix.

35. Hemminki K, Li X, Försti A, Sundquist J, Sundquist K. Incidence and survival in non-hereditary amyloidosis in Sweden. BMC Public Health. 2012 Jan;12:974.

36. Pinney JH, Smith CJ, Taube JB, Lachmann HJ, Venner CP, Gibbs SDJ, et al. Systemic amyloidosis in England: an epidemiological study. Br J Haematol. 2013 May;161(4):525–32.

37. Pepys MB. Amyloidosis. Annu Rev Med. 2006 Jan;57:223–41.

38. Merlini G, Bellotti V. Molecular mechanisms of amyloidosis. N Engl J Med. 2003 Aug;349(6):583–96.

39. Bellotti V, Nuvolone M, Giorgetti S, Obici L, Palladini G, Russo P, et al. The workings of the amyloid diseases. Ann Med. 2007 Jan;39(3):200–7.

40. Pepys MB, Booth DR, Hutchinson WL, Gallimore JR, Collins IM, Hohenester E. Amyloid P component. A critical review. Amyloid. Informa UK Ltd UK; 1997 Jul;4(4):274–95.

41. Hawkins P, Lavender J, Myers M, Pepys M. Diagnostic radionuclide imaging of amyloid: biological targeting by circulating human serum amyloid P component. Lancet. 1988;331(8600):1413–8.

42. Bryngelson JD, Onuchic JN, Socci ND, Wolynes PG. Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. Proteins. 1995 Mar;21(3):167–95.

43. Van den Berg B, Ellis RJ, Dobson CM. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation. EMBO J. 1999 Dec;18(24):6927–33.

44. Minton A. Protein folding: Thickening the broth. Curr Biol. 2000 Feb;10(3):R97–9.

45. Kinjo AR, Takada S. Competition between protein folding and aggregation with molecular chaperones in crowded solutions: insight from mesoscopic simulations. Biophys J. Elsevier; 2003 Dec;85(6):3521–31.

31

46. Ranson NA, Dunster NJ, Burston SG, Clarke AR. Chaperonins can catalyse the reversal of early aggregation steps when a protein misfolds. J Mol Biol. 1995 Jul;250(5):581–6.

47. Ellis RJ, Hartl FU. Principles of protein folding in the cellular environment. Curr Opin Struct Biol. 1999 Feb;9(1):102–10.

48. Kopito RR. Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol. 2000;10(12):524–30.

49. Zhou Z, Chan CH, Ma Q, Xu X, Xiao Z, Tan E-K. The roles of amyloid precursor protein (APP) in neurogenesis: Implications to pathogenesis and therapy of Alzheimer disease. Cell Adh Migr. 2011 Jul;5(4):280–92.

50. Moriarty D, Colón W. Factors that Favor the Formation of Amyloidogenic Intermediates. In: Sipe JD, editor. Amyloid Proteins: the Beta Sheet Conformation and Disease. Weinheim: Wiley-VCH; 2005. p. 282–5.

51. Ohnishi S, Takano K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cell Mol Life Sci. 2004 Mar;61(5):511–24.

52. Sipe JD. Amyloidosis. Annu Rev Biochem. 1992;61:947–75.

53. Kisilevsky R, Snow A. The potential significance of sulphated glycosaminoglycans as a common constituent of all amyloids: or, perhaps amyloid is not a misnomer. Med Hypotheses. 1988 Aug;26(4):231–6.

54. Kisilevsky R, Young ID. Pathogenesis of amyloidosis. Baillieres Clin Rheumatol. 1994 Aug;8(3):613–26.

55. Neame P, Gallagher J. Extracellular Matrix Heparan Sulfate Proteoglycans. In: Sipe JD, editor. Amyloid Proteins: the Beta Sheet Conformation and Disease. Weinheim: Wiley-VCH; 2005. p. 131–67.

56. Eva Ž. Amyloid-fibril formation. Eur J Biochem. 2002 Jul;269(14):3362–71.

57. Lomakin A, Teplow DB, Kirschner DA, Benedek GB. Kinetic theory of fibrillogenesis of amyloid beta-protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul;94(15):7942–7.

58. Harper JD, Lansbury PT. Models of amyloid seeding in Alzheimer’s disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Annu Rev Biochem. 1997 Jan;66:385–407.

59. Jerrett JT, Lansbury PT. Seeding “One-Dimensional Crystallization ” of Amyloid: A Pathogenic Mechanism in Alzheimer’s Disease and Scrapie? Cell. 1993;73:1055–8.

60. Moriarty D, Colón W. Mechanism of Amyloid Formation. In: Sipe JD, editor. Amyloid Proteins: the Beta Sheet Conformation and Disease. Weinheim: Wiley-VCH; 2005. p. 285–8.

61. Xing Y, Higuchi K. Amyloid fibril proteins. Mech Ageing Dev. 2002 Nov;123(12):1625–36.

62. Lise H. Amyloid-Enhancing Factor : Production and Response in and -Resistant Mouse Strains. 1988;316:311–6.

63. Dobson CM. Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem Sci. 1999 Sep;24(9):329–32.

64. Dobson CM. The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001 Feb;356(1406):133–45.

65. Fändrich M, Fletcher M a, Dobson CM. Amyloid fibrils from muscle myoglobin. Nature. 2001 Mar;410(6825):165–6.

66. Pertinhez T, Bouchard M, Tomlinson E. Amyloid fibril formation by a helical cytochrome. FEBS Lett. 2001;495:184–6.

67. Noursadeghi M, Bickerstaff MC, Gallimore JR, Herbert J, Cohen J, Pepys MB. Role of serum amyloid P component in bacterial infection: protection of the host or protection of the pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Dec;97(26):14584–9.

68. Pepys MB, Rademacher TW, Amatayakul-Chantler S, Williams P, Noble GE, Hutchinson WL, et al. Human serum amyloid P component is an invariant constituent of amyloid deposits and has a uniquely homogeneous glycostructure. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jun;91(12):5602–6.

32

69. Kagan B. Oligomers and Cellular Toxicity. In: Sipe JD, editor. Amyloid Proteins: the Beta Sheet Conformation and Disease. Weinheim: Wiley-VCH; 2005. p. 319–42.

70. Ottenhoff T. Cellulaire immuniteit. In: Rijkers G, editor. Immunologie. Houten: Bohn Stafleu van Loghum; 2009. p. 123–48.

71. Husby G, Marhaug G, Dowtor B, Sletten K, Sipe JD. Serum amyloid A (SAA): Biochemistry, genetics and the pathogenesis of AA amyloidosis. Amyloid. Informa UK Ltd UK; 1994 Jul;1(2):119–37.

72. Kisilevsky R, Manley PN. Acute-phase serum amyloid A: perspectives on its physiological and pathological roles. Amyloid. 2012 Mar;19(1):5–14.

73. Uhlar CM, Whitehead AS. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. Eur J Biochem. 1999 Oct;265(2):501–23.

74. Scheja L, Heese B, Zitzer H, Michael MD, Siesky AM, Pospisil H, et al. Acute-phase serum amyloid A as a marker of insulin resistance in mice. Exp Diabetes Res. 2008 Jan;2008:230837.

75. Whicher J, Rifai N, Biasucci LM. Markers of the acute phase response in cardiovascular disease: an update. Clin Chem Lab Med. 2001 Nov;39(11):1054–64.

76. Johnson BD, Kip KE, Marroquin OC, Ridker PM, Kelsey SF, Shaw LJ, et al. Serum amyloid A as a predictor of coronary artery disease and cardiovascular outcome in women: the National Heart, Lung, and Blood Institute-Sponsored Women’s Ischemia Syndrome Evaluation (WISE). Circulation. 2004 Feb;109(6):726–32.

77. Gómez-Ambrosi J, Salvador J, Rotellar F, Silva C, Catalán V, Rodríguez A, et al. Increased serum amyloid A concentrations in morbid obesity decrease after gastric bypass. Obes Surg. 2006;16(3):262–9.

78. O’Brien KD, Brehm BJ, Seeley RJ, Bean J, Wener MH, Daniels S, et al. Diet-induced weight loss is associated with decreases in plasma serum amyloid a and C-reactive protein independent of dietary macronutrient composition in obese subjects. J Clin Endocrinol Metab. 2005 Apr;90(4):2244–9.

79. Zhao Y, He X, Shi X, Huang C, Liu J, Zhou S, et al. Association between serum amyloid A and obesity: a meta-analysis and systematic review. Inflamm Res. 2010 May;59(5):323–34.

80. Yang R-Z, Lee M-J, Hu H, Pollin TI, Ryan AS, Nicklas BJ, et al. Acute-phase serum amyloid A: an inflammatory adipokine and potential link between obesity and its metabolic complications. PLoS Med. 2006 Jun;3(6):e287.

81. Lee Y-H, Tharp WG, Maple RL, Nair S, Permana P a, Pratley RE. Amyloid precursor protein expression is upregulated in adipocytes in obesity. Obesity (Silver Spring). 2008 Jul;16(7):1493–500.

82. Poitou C, Viguerie N, Cancello R, De Matteis R, Cinti S, Stich V, et al. Serum amyloid A: production by human white adipocyte and regulation by obesity and nutrition. Diabetologia. 2005 Mar;48(3):519–28.

83. Lachmann HJ, Goodman HJB, Gilbertson J a, Gallimore JR, Sabin C a, Gillmore JD, et al. Natural history and outcome in systemic AA amyloidosis. N Engl J Med. 2007 Jun;356(23):2361–71.

84. Alsina E, Martin M, Panadés M, Fernández E. Renal AA amyloidosis secondary to morbid obesity? Clin Nephrol. 2009;72(4):312–4.

85. Wang Y, Chen X, Song Y, Caballero B, Cheskin LJ. Association between obesity and kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Kidney Int. 2008 Jan;73(1):19–33.

86. Corpeleijn E, Bakker SJL, Stolk RP. Obesity and impaired renal function: potential for lifestyle intervention? Eur J Epidemiol. 2009 Jan;24(6):275–80.

87. Chen J, Muntner P, Hamm LL, Jones DW, Batuman V, Fonseca V, et al. The metabolic syndrome and chronic kidney disease in U.S. adults. Ann Intern Med. 2004 Feb;140(3):167–74.

33

88. Ninomiya T, Kiyohara Y, Kubo M, Yonemoto K, Tanizaki Y, Doi Y, et al. Metabolic syndrome and CKD in a general Japanese population: the Hisayama Study. Am J Kidney Dis. 2006 Sep;48(3):383–91.

89. Ninomiya T, Kiyohara Y, Kubo M, Tanizaki Y, Doi Y, Okubo K, et al. Chronic kidney disease and cardiovascular disease in a general Japanese population: the Hisayama Study. Kidney Int. 2005 Jul;68(1):228–36.

90. Deji N, Kume S, Araki S, Soumura M, Sugimoto T, Isshiki K, et al. Structural and functional changes in the kidneys of high-fat diet-induced obese mice. 2009;118–26.

91. Kambham N, Markowitz GS, Valeri a M, Lin J, D’Agati VD. Obesity-related glomerulopathy: an emerging epidemic. Kidney Int. 2001 Apr;59(4):1498–509.

92. Higuchi K, Naiki H, Kitagawa K, Hosokawa M, Takeda T. Mouse senile amyloidosis. ASSAM amyloidosis in mice presents universally as a systemic age-associated amyloidosis. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol. 1991 Jan;60(4):231–8.

93. Naeser P, Westermark P. Amyloidosis in ageing obese-hyperglycemic mice and their lean litter-mates. Acta Pathol Microbiol Scand. 1977;(85):761–7.

94. Westermark P, Sletten K. Characterization of Amyloid of Ageing Obese–Hyperglycaemic Mice and their Lean Littermates. Scand J Immunol. 1979;(9):193–6.

95. Puchtler H. On the binding of amyloid by Congo red. J Histochem Cytochem. 1962;10:355–63.

96. Cross SS. Observer accuracy in estimating proportions in images: implications for the semiquantitative assessment of staining reactions and a proposal for a new system. J Clin Pathol. 2001 May;54(5):385–90.

97. Taylor CR, Levenson RM. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 2006 Oct;49(4):411–24.

98. Levenson RM. Spectral imaging perspective on cytomics. Cytometry A. 2006 Jul;69(7):592–600.

99. Barber PR, Vojnovic B, Atkin G, Daley FM, Everett SA, Wilson GD, et al. Applications of cost-effective spectral imaging microscopy in cancer research. J Phys D Appl Phys. IOP Publishing; 2003 Jul;36(14):1729–38.

100. Fiore C, Bailey D, Conlon N, Wu X, Martin N, Fiorentino M, et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 2012 Jun;65(6):496–502.

101. Xu X, Gimotty PA, Guerry D, Karakousis G, Van Belle P, Liang H, et al. Lymphatic invasion revealed by multispectral imaging is common in primary melanomas and associates with prognosis. Hum Pathol. 2008 Jun;39(6):901–9.

102. O’Donnell RK, Feldman M, Mick R, Muschel RJ. Immunohistochemical method identifies lymphovascular invasion in a majority of oral squamous cell carcinomas and discriminates between blood and lymphatic vessel invasion. J Histochem Cytochem. 2008 Sep;56(9):803–10.

103. Mansoor I, Zalles C, Zahid F, Gossage K, Levenson RM, Rimm DL. Fine-needle aspiration of follicular adenoma versus parathyroid adenoma: the utility of multispectral imaging in differentiating lesions with subtle cytomorphologic differences. Cancer. 2008 Feb;114(1):22–6.

104. Chabot-Richards D, Martin D. Quantitative image analysis in the assessment of diffuse large B-cell lymphoma. Mod …. 2011;24(12):1598–605.

105. Gorgun J, Portyanko A, Marakhouski Y, Cherstvoy E. Tissue transglutaminase expression in celiac mucosa: an immunohistochemical study. Virchows Arch. 2009 Oct;455(4):363–73.

106. Krishnamurthy S, Mathews K, McClure S, Murray M, Gilcrease M, Albarracin C, et al. Multi-institutional comparison of whole slide digital imaging and optical microscopy for interpretation of hematoxylin-eosin-stained breast tissue sections. Arch Pathol Lab Med. 2013 Dec;137(12):1733–9.

107. Moore SA, Oglesbee MJ. Involvement of the choroid plexus in the inflammatory response after acute spinal cord injury in dogs: an immunohistochemical study. Vet Immunol Immunopathol. Elsevier B.V.; 2012 Aug;148(3-4):348–52.

34

108. Westermark P, Davey E, Lindbom K, Enqvist S. Subcutaneous fat tissue for diagnosis and studies of systemic amyloidosis. Acta Histochem. 2006 Jan;108(3):209–13.

109. Ikeda K, Monden T, Kanoh T, Tsujie M, Izawa H, Haba A, et al. Extraction and analysis of diagnostically useful proteins from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. J Histochem Cytochem. 1998 Mar;46(3):397–403.

110. Vrana J a, Gamez JD, Madden BJ, Theis JD, Bergen HR, Dogan A. Classification of amyloidosis by laser microdissection and mass spectrometry-based proteomic analysis in clinical biopsy specimens. Blood. 2009 Dec;114(24):4957–9.

111. Sethi S, Vrana J a, Theis JD, Leung N, Sethi A, Nasr SH, et al. Laser microdissection and mass spectrometry-based proteomics aids the diagnosis and typing of renal amyloidosis. Kidney Int. Nature Publishing Group; 2012 Jul;82(2):226–34.

112. Nasr SH, Said SM, Valeri AM, Sethi S, Fidler ME, Cornell LD, et al. The diagnosis and characteristics of renal heavy-chain and heavy/light-chain amyloidosis and their comparison with renal light-chain amyloidosis. Kidney Int. Nature Publishing Group; 2013 Mar;83(3):463–70.

113. Klein C, Vrana J, Theis J. Amyloid neuropathy type is distinguished by mass spectrometric based proteomic analysis of nerve tissue. Arch Neurol. 2011;68(2):195–9.

114. Maleszewski JJ, Murray DL, Dispenzieri A, Grogan M, Pereira NL, Jenkins SM, et al. Relationship between monoclonal gammopathy and cardiac amyloid type. Cardiovasc Pathol. Elsevier Inc.; 2013;22(3):189–94.

115. Schönland SO, Hegenbart U, Bochtler T, Mangatter A, Hansberg M, Ho AD, et al. Immunohistochemistry in the classification of systemic forms of amyloidosis: a systematic investigation of 117 patients. Blood. 2012 Jan;119(2):488–93.

116. Linke RP. On typing amyloidosis using immunohistochemistry. Detailled illustrations, review and a note on mass spectrometry. Prog Histochem Cytochem. 2012 Aug;47(2):61–132.

117. De Boer RA, van Veldhuisen DJ, Gansevoort RT, Muller Kobold AC, van Gilst WH, Hillege HL, et al. The fibrosis marker galectin-3 and outcome in the general population. J Intern Med. 2012 Jul;272(1):55–64.

118. De Boer RA, Voors AA, Muntendam P, van Gilst WH, van Veldhuisen DJ. Galectin-3: a novel mediator of heart failure development and progression. Eur J Heart Fail. 2009 Sep;11(9):811–7.

119. Yu CM, Sanderson JE, Shum IO, Chan S, Yeung LY, Hung YT, et al. Diastolic dysfunction and natriuretic peptides in systolic heart failure. Higher ANP and BNP levels are associated with the restrictive filling pattern. Eur Heart J. 1996 Nov;17(11):1694–702.

120. Wei CM, Heublein DM, Perrella MA, Lerman A, Rodeheffer RJ, McGregor CG, et al. Natriuretic peptide system in human heart failure. Circulation. 1993 Sep;88(3):1004–9.

121. Clerico A, Iervasi G, Del Chicca MG, Emdin M, Maffei S, Nannipieri M, et al. Circulating levels of cardiac natriuretic peptides (ANP and BNP) measured by highly sensitive and specific immunoradiometric assays in normal subjects and in patients with different degrees of heart failure. J Endocrinol Invest. 1998 Mar;21(3):170–9.

122. Soni SS, Cruz D, Bobek I, Chionh CY, Nalesso F, Lentini P, et al. NGAL: a biomarker of acute kidney injury and other systemic conditions. Int Urol Nephrol. 2010 Mar;42(1):141–50.

123. Bolignano D, Lacquaniti A, Coppolino G, Donato V, Campo S, Fazio MR, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and progression of chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 2009 Feb;4(2):337–44.

124. Bolignano D, Lacquaniti A, Coppolino G, Campo S, Arena A, Buemi M. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin reflects the severity of renal impairment in subjects affected by chronic kidney disease. Kidney Blood Press Res. 2008 Jan;31(4):255–8.

125. Devarajan P. Biomarkers for the early detection of acute kidney injury. Curr Opin Pediatr. 2011 Apr;23(2):194–200.

35

126. Clerico A, Galli C, Fortunato A, Ronco C. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as biomarker of acute kidney injury: a review of the laboratory characteristics and clinical evidences. Clin Chem Lab Med. 2012 Jan;50(9):1505–17.

127. Haase M, Bellomo R, Devarajan P, Schlattmann P, Haase-Fielitz A. Accuracy of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in diagnosis and prognosis in acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. Am J Kidney Dis. 2009 Dec;54(6):1012–24.

128. Aickin M, Gensler H. Adjusting for multiple testing when reporting research results: the Bonferroni vs Holm methods. Am J Public Health. 1996 May;86(5):726–8.

129. Pras M, Schubert M, Zucker-Franklin D, Rimon A, Franklin EC. The characterization of soluble amyloid prepared in water. J Clin Invest. 1968 Apr;47(4):924–33.

130. DiBartola SP, Benson MD, Dwulet FE, Cornacoff JB. Isolation and characterization of amyloid protein AA in the Abyssinian cat. Lab Invest. 1985 May;52(5):485–9.

131. Glenner GG, Bladen HA. Purification and reconstitution of the periodic fibril and unit structure of human amyloid. Science. 1966 Oct;154(3746):271–2.

132. Westermark GT, Westermark P, Sletten K. Amyloid fibril protein AA. Characterization of uncommon subspecies from a patient with rheumatoid arthritis. Lab Invest. 1987 Jul;57(1):57–64.

133. Johnson KH, O’Brien TD, Betsholtz C, Westermark P. Islet amyloid, islet-amyloid polypeptide, and diabetes mellitus. N Engl J Med. 1989 Aug;321(8):513–8.

134. Tanida I. Autophagy basics. Microbiol Immunol. 2011 Jan;55(1):1–11.

135. Komatsu M, Ichimura Y. Selective autophagy regulates various cellular functions. Genes Cells. 2010 Sep;15(9):923–33.

136. Tillement J-P, Lecanu L, Papadopoulos V. Amyloidosis and neurodegenerative diseases: current treatments and new pharmacological options. Pharmacology. 2010 Jan;85(1):1–17.

137. Nilsson P, Loganathan K, Sekiguchi M, Matsuba Y, Hui K, Tsubuki S, et al. Aβ secretion and plaque formation depend on autophagy. Cell Rep. 2013 Oct;5(1):61–9.

138. Naiki H, Nagai Y. Molecular pathogenesis of protein misfolding diseases: pathological molecular environments versus quality control systems against misfolded proteins. J Biochem. 2009 Dec;146(6):751–6.

139. Tanida I, Ueno T, Kominami E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 2008 Jan;445:77–88.

140. Westermark GT, Westermark P. Serum amyloid A and protein AA: molecular mechanisms of a transmissible amyloidosis. FEBS Lett. Federation of European Biochemical Societies; 2009 Aug;583(16):2685–90.

141. Solomon A, Richey T, Murphy CL, Weiss DT, Wall JS, Westermark GT, et al. Amyloidogenic potential of foie gras. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jun;104(26):10998–1001.

142. Gillmore JD, Lovat LB, Persey MR, Pepys MB, Hawkins PN. Amyloid load and clinical outcome in AA amyloidosis in relation to circulating concentration of serum amyloid A protein. Lancet. 2001;358:24–9.

143. Elliott AC, Hynan LS. A SAS(®) macro implementation of a multiple comparison post hoc test for a Kruskal-Wallis analysis. Comput Methods Programs Biomed. 2011 Apr;102(1):75–80.

144. Eckerskorn C, Lottspeich F. Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by gel electrophoresis after tryptic digestion in polyacrylamide matrix. Chromatographia. 1989 Jul;28(1-2):92–4.

145. Olsen KE, Sletten K, Westermark P. The use of subcutaneous fat tissue for amyloid typing by enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Clin Pathol. 1999 Mar;111(3):355–62.

146. Morozova-Roche LA, Zurdo J, Spencer A, Noppe W, Receveur V, Archer DB, et al. Amyloid fibril formation and seeding by wild-type human lysozyme and its disease-related mutational variants. J Struct Biol. 2000 Jun;130(2-3):339–51.

147. O’Nuallain B, Williams AD, Westermark P, Wetzel R. Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils. J Biol Chem. 2004 Apr;279(17):17490–9.

36

148. Jansen HJ, van Essen P, Koenen T, Joosten LAB, Netea MG, Tack CJ, et al. Autophagy activity is up-regulated in adipose tissue of obese individuals and modulates proinflammatory cytokine expression. Endocrinology. 2012 Dec;153(12):5866–74.

149. Kosacka J, Koch K, Gericke M, Nowicki M, Heiker JT, Klöting I, et al. The polygenetically inherited metabolic syndrome of male WOKW rats is associated with enhanced autophagy in adipose tissue. Diabetol Metab Syndr. 2013 May;5(1):23.

150. Obici L, Raimondi S, Lavatelli F, Bellotti V, Merlini G. Susceptibility to AA amyloidosis in rheumatic diseases: a critical overview. Arthritis Rheum. 2009 Oct;61(10):1435–40.

151A. Studie in afwachting van publicatie, ABSTRACT:

Renal Amyloidosis in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus Ramón A. Díez,1 Gerardo Gamba,3 Virgilia Soto,1,2 Juan Soriano,2 Magdalena Madero.1 1National Heart Institute Mexico; 2Hospital General de Mexico;3INCMNS. Background: Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is the leading cause of chronic kidney disease (CKD) and a major cause of cardiovascular disease (CVD) mortality. Infl ammation is closely involved in the pathogenesis of T2DM and in the development of chronic vascular complications. Reactive amyloidosis (AAA) is a condition that occurs in the presence of chronic infl ammation. We hypothesized that patients with T2DM may have a higher prevalence of Renal Amyloidosis (RAAA) and that this could contribute to worse kidney and vascular disease. Methods: This was an observational cross-sectional study that included autopsy kidneys from patients with previous diagnosis of T2DM. Vascular tissue damage (chronic ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, aortic, coronary and intrarenal atherosclerosis) and RAAA were the variable outcomes of interest. The kidney tissue was evaluated by two different pathologists in order to determine the presence of diabetic nephropathy, RAAA (defined as the positivity of immunohystochemistry through indirect immunoperoxidase with the primary AA antibody) and the severity of vascular tissue damage. Results: 330 autopsy cases of T2DM were included in the study. The mean age of the population was 61± 13 years and 47% were female. Eighty percent of the population had diabetic nephropathy. RAAA was detected in 9% of our population and was associated with an increased risk [OR (95% CI)], [11 (2.04 to 59.16)] for nodular sclerosis, [4.59 (2.02 to 10.42)] for chronic ischemic cardiomyopathy, [3.41 (1.52 to 7.64)] for myocardial infarction and [4.75 (1.09 to 20.69)], [3.22 (1.47 to 7.04)] and [3.84 (1.46 to 10.09)] for aortic, coronary and intrarenal atherosclerosis, respectively. The presence of RAAA was confi rmed by electronic microscopy in some randomly selected cases. Conclusions: RAAA is prevalent amongst T2DM and is associated with worse cardiovascular, aortic and renal disease. RAAA is a marker of severe chronic infl ammation and this likely explains our results. Studies replicating our fi ndings in other populations are warranted in order to confi rm these associations. Funding: Government Support - Non-U.S.

152A. Obesity as a determinant in the development and progression of AA amyloidosis. B. Kluve-Beckerman (Indianapolis, IN, USA), [Internet] via http://www.amyloidosis.nl/indpls/indpls_program.htm retrieved on 6-4-2014

HalloHallo ......................................................................................................................................... 36 

37

Bijlagen

Tabellen

Tabel B1: Amyloïde pathologieën en hun precursoreiwitten bij mensen 38

Tabel B2: Overige correlaties cardiale parameters 39

Figuren

Figuur B1: De fibrillogenese 40

Figuur B2: Amyloïdkleuring van hart en niercoupes met Congo-rood 41

Figuur B3: Western Blot van nierweefselextracten op APO A2 en SAA 42

Figuur B4: Immunohistochemische kleuring van niercoupes op SAA en APO A2 43

Protocollen

Protocol B1: Kwantificatie van amyloïdose met ImageScope 44

Protocol B2: Western Blot 45

38

Tabel B1 Amyloïde pathologieën en hun precursoreiwitten bij mensen

Fibril eiwit Precursor eiwit Systemisch of Lokaal

Verworven of Erfelijk

Aangedane organen en onderliggende pathologie (bij verworven, indien bekend)

AL Immunoglobuline lichte keten S, L V Alle organen behalve CZS Secundair bij MGUS en multiple myeloom

AH Immunoglobuline zware keten S, L V Alle organen behalve CZS Secundair bij MGUS en multiple myeloom

Ab2M

b2-microglobuline, wild type b2-microglobuline, variant

S S

V E

Spier- en skelet systeem AZS

ATTR

Transthyretine, wild type Transthyretine, varianten

S, L S

V E

Hart (vn. bij mannen), tenosynovium. Bij ouderdom. PZS, AZS, hart, oog, leptomeningen

AA (Apo) serum amyloid A S V Alle organen behalve CZS Secundair bij chronische ontstekingsziekten

AApoAI Apolipoproteïne AI, variant S E Hart, lever, nier, PZS, testis, larynx, huid

AApoAII Apolipoproteïne AII, variant S E Nieren

AApoAIV Apolipoproteïne AIV, wild type S V Niermedulla en systemisch. Bij ouderdom.

AGel Gelsoline, variant S E PZS, cornea

ALys Lysozyme, variant S E Nieren

ALect2 Leucocyt chemotactic factor-2 S V Nieren (voornamelijk)

AFib Fibrogeen a, variant S E Nieren (voornamelijk)

ACys Cystatin C, variant S E PZS, huid

Abri ABriPP, variant S E CZS (voornamelijk)

ADana ADanPP, variant L E CZS

Aβ

Aβ protein precursor, wildtype Aβ protein precursor, variant

L L

V E

CZS. Ziekte van Alzheimer. CZS. Ziekte van Alzheimer (vroegtijdig).

APrP

Prion proteine, wild type Prion proteine, variant

L L

V E

CZS. Creutzfeld-Jacob, fatale insomnie CZS. Creutzfeld-Jacob, GSS syndroom, fatale insomnie

ACal (Pro)calcitonine L V Schildklier. C-cel thyroïd tumoren.

AIAPP Islet amyloïd polypeptideb L V Islet-cellen van Langerhans. T2DM en insulinomen.

AANF Atrial natriuretic factor L V Hartatria

APro Prolactine L V Hypofyse. Hypofyse prolactinomen en door ouderdom.

AIns Insuline L V Subcutaan. Iatrogeen, lokale injecties.

ASPC Long surfactant proteïne L V Longen

AGal7 Galactine 7 L V Huid

ACor Corneodesmine L V Verhoornd epitheel, haarfollikels

AMed Lactadherine L V Tunica media aorta. Bij ouderdom.

Aker Kerato-epitheline L E Cornea

ALac Lactoferrine L V Cornea

AOaap Odontogeen ameloblast-geassocieerd proteïne

L A Kaak. Odontogene tumoren

ASEm1 Semogeline 1 L V Veciscula seminalis

De belangrijkste, meest voorkomende amyloïde pathologieën zijn vetgedrukt. Belangrijke, maar afzonderlijk zeldzame erfelijke varianten zijn cursief gedrukt. Afkortingen: AZS: autonoom zenuwstelsel, CZS: centraal zenuwstelsel, PZS: perifeer zenuwstelsel, GSS: Gerstmann-Straussler-Scheinker syndroom. a. ADan is een eiwit dat afstamt van hetzelfde gen als Abri.

Bewerkt door D. de Vries naar Hazenberg, 2013.33

39

Tabel B2 Overige correlaties tussen lichaamsgewicht, plasma SAA en diverse functionele cardiale parameters (Spearman r coerrelatiecoëfficiënten)

Echoparameters Hemodynamisch

IVSs IVSd MV E Vel MV A Vel LVPWs LVPWd Overigea HR SBP DBP

LG 0,58** 0,73*** 0,49* 0,58* 0,46* ns ns -0,45* ns ns

SAAplasma 0,69** 0,76** ns 0,62* 0,58* 0,53* ns ns 0,52* ns

LG: lichaamsgewicht bij offering, IVSs/d: intraventriculaire septumdikte tijdens systole/diastole; MV E Vel: mitral valve E-wave dominant inflow (passieve vullingsfase); MV A Vel: mitral valve A-wave inflow (actieve vullingsfase/contractie atria); LVPWs/d: left ventricle posterior wall thickness tijdens systole/diastole; HR: heart rate; SBP: systolische/diastolische systemische bloeddruk; DBP: diastolische systemische bloeddruk.

De correlaties zijn verricht op het gehele cohort dieren waarbij hartfunctiebepalingen zijn gedaan (t=24 en 52wk, n=24). Vanwege het kleine groepsaantal in de 52 weken groep zijn hier geen losse correlaties van LG en SAA verricht die zich beperken tot dit cohort, zie verklarende tekst.

a. Alle overige gangbare echografische parameters zoals MV E/A ratio, dikte van andere wanden, diameter en drukgradiënt over de outflow tracts (pulmonalis/aorta), ejectiefractie en snelheid van ventrikeldrukstijging/daling bij resp. systole en diastole.

*: p<0,05; ** : p<0,01; ***: p<0,001

Figuur

Bewerkt d

B1 De fibrillog

door D. de Vries na

genese

aar Xing, 2002.61

40

Figuur

Congoroolicht (biref

B2 Amyloïdkle

od-hematoxiline klefringence) van de 5

euring van hart

euring van de nieren52 weken groep we

en niercoupes

n en harten van repeergeven. De beeld

met Congo-roo

presentatieve muizden tonen een leefti

od

zen (mediaan aangtijds- en dieetgebon

edaan in ernst amynden toename van

yloïdose), in de ond amyloïdose in zow

derste rij is dubbelbwel hart als nieren.

breking onder gepo

41

olariseerd

Figuur

Western Bgerandomgecompeartefacten

B3 Western B

Blot resultaten op Smiseerd en niet geranseerd is: om dezen) niet opnieuw uitg

Blot van nierwee

SDS-extracten van angschikt op tijdscoe reden is de sleutegevoerd.

efselextracten o

nierweefsel van 54ohort of vetdieet. Del niet weergegeven

op APO A2 en S

4 muizen, afkomstigDe bandpatronen pen. Omdat de resulta

SAA

ig uit het 40 en 52 wer blot zijn vrijwel idaten niet bruikbaar

weken cohort, plus dentiek, er zijn alleer bleken werden de

enkele controles uen intensiteitsversc technisch minder g

uit een andere studichillen tussen de blgeslaagde blots (lu

ie. De muizen zijn ots, waar bij analys

ucht- en fluorescent

42

se voor tie-

Figuur

Immunohdieren me

B4 Immunohi

istochemische-hemet overgewicht doo

stochemische k

matoxiline kleuring vr een hoog-vet diee

kleuring van nie

van nierweefsel vaet en een leeftijdsa

ercoupes op SA

n representatieve mfhankelijke APO A2

AA en APO A2

muizen (mediaan a2 amyloïdose die o

aangedaan in ernstonafhankelijk lijkt va

amyloïdose) toont an dieet of gewicht.

t een beeld van pro.

ogressieve AA amy

43

loïdose bij

Protoc

col B1 Kwantificatie van amylooïdose met ImaageScope In de nkwantif A | Hetzichtba B | De Nuancehet oveafbeeld C | De hand oworden D | De weergaalle ge De pixepositiefintensitvindenwe verUiteindgebied(vals-p *** AlgoAlgorithVersionView WView HeOverlapImage ZClassifieClass LClassifiePixel ArHue VaHue WiColor SIntensityIntensityIntensityIntensityIntensityIntensityIntensity

In afbeRoodbOranje Geel Wit E | Hetdie ookgroen ogeïnterverder per catgebiedpercen

nevenstaande fificatieproces in

t normale lichtmare glomeruli, w

gemixte cube zce software is hierige weefsel licding is ingelade

voor analyse gomcirkeld in Iman altijd 50 glom

pixelanalyse voave zien van de

eïncludeerde (gr

els worden in 4f, zwak en negateit. De drempe van de meest

rgeleken met hedelijk vonden weden te scheidenpositieve pixels)

orithm Inputs *** hm n

Width eight p Size Zoom er

List er Neighborhood rea (millimeter-squ

alue (Center) idth

Saturation Thresholty Threshold WEAKty Threshold WEAKty Threshold MEDIUty Threshold MEDIUty Threshold STROty Threshold STROty Threshold Negat

eelding D en E gbruin : sterk poe : positief deze uit : zwak po : negatief

t interstitium vak niet wordt meomcirkelde glomresseerd in de verwerkt in Exctegorie in stap D

d resteert. De abntages van het w

iguur is in 5 sta zijn werk gaat.

microscopische waarvan 1 van d

zoals geproducier het Congorochtgrijs (gebruiken in ImageSco

geïncludeerde gageScope, de geruli omcirkeld.

oor de glomerue geselecteerderoen omcirkelde

4 klassen geschatief. De amyloïelwaardes voor correcte drempet lichtmicroscoe de onderstaa van het omring

):

ared)

d K (Upper Limit) K (Lower Limit) UM (Upper Limit) UM (Lower Limit)

ONG (Upper Limit) ONG (Lower Limit)

ive Pixels

geldt de volgenositief (amyloïd)(overgangsgebtgezoomde afbeositief (overig wf, geen weefsel

an de nier wordteegenomen in dmeruli ten onreclosse waarde vcel: het resultaaD) worden van bsolute waardeweefseloppervl

appen weergeg.

plaatje van eendubieuze kwalite

ceerd door de Node spectrum zwkersinstellingenpe.

glomeruli (morfogeëxcludeerde g.

li wordt uitgevoe glomerulus, me) gebieden tez

heiden op basis ïddeposities zij scheiding zijn ipelwaarden toetopische plaatje onde instellingengende weefsel

*** AlgPositiv9,1 1000 1000 0 1, None 0 -1, 0, 0, 0, 235 (G140 (G140 (O115 (O115 (R0 (ROO-1 (WI

de kleurcoderin

bied amyloïd/weeelding) eefsel zonder a

t geanalyseerd.e interstitiumbechte wel betrokoor het interstitat van de glomedeze analyse a

es (aantal geteldak.

geven hoe het a

n stuk niercoupteit is voor analy

Nuance FX specwart gekleurd, n, andere kleure

ologisch represglomerulus is g

oerd; de softwamaar de berekenzamen.

s van kleurintenn zwart en hebinstelbaar in hetsten we verschonder normaal n als meest idemet zo min mo

gorithm Inputs ***ve Pixel Count v9

GEEL) GEEL) ORANJE) ORANJE) ROOD)

OOD) IT)

ng:

eefsel, slechts b

amyloïd)

. Let op de geëxerekening. Zoalkken in de analytium. Daarom weruli-analyse (hafgetrokken, allde pixels) word

amyloïd

pe, met daarin 4yse.

ctraalcamera. Dde kernen donken zijn ook mog

entatief) zijn megeel omcirkeld.

re laat alleen dening vindt plaat

siteit: sterk posben dus de hoo

et programma. Vhillende instellin en gepolarisee

eaal om de amygelijk achtergro

*

beperkt zichtba

xcludeerde glomls te zien wordeyse; wij zijn worden de resulhet aantal geteldeen het omliggeen omgezet na

44

4

Door de kergrijs en gelijk). De

et de Per muis

e visuele ts over

sitief, ogste Voor het ngen die erd licht. yloïde ondruis

ar op

merulus, en de

ltaten nog de pixels ende

aar

45

Protocol B2 Western Blot

Protocol SDS PAGE en Western Immunoblot Prepareren monsters:

- (voorverdunde) monsters 1:1 verdunnen met 2x denaturatiebuffer 2x db: 0.125M Tris.HCl, pH 6.8, 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) Glycerol, 0.03% (w/v) Broomfenolblauw, met 10% (v/v) ß-ME

- “Kook” monsters 15 minuten (95 °C) Elektroforese:

- 30 μl monster opbrengen in 4-20% precast SDS-PAGE gel (BioRad, Veenendaal, The Netherlands; 345-0033) in 1x elektroforesebuffer:

o 4x elektroforesebuffer: 0.1M Tris.HCl, pH 8.7, 0.77M Glycine, 0.4% SDS; los 60.5 g Tris en 289 g Glycine (Merck, Darmstadt, Germany; 1.04201) op en voeg hieraan 200 ml 10% SDS toe. Vul met water aan tot 5000 ml en controleer pH (8.4)

- 5 μl Precision plus protein Kaleidoscope standard (BioRad 161-0375) - Voltage:

o Stackinggel 70V, 50 mA o Runninggel 120V, 50mA

Blotten (Criterion Blotter):

- Gekoelde transferbuffer: o 6.06 g Tris en 28.8 g Glycine (Merck 1.04201) oplossen in 1200 ml demiwater, vul aan tot

1600 ml met demiwater en vul aan met 400 ml methanol tot 2000 ml o Prewet Immobilon-FL (PVDF) membraan (Millipore, Amsterdam, NL; IPFL-00010)

30 seconden Methanol 2 minuten demi-water 15 minuten transferbuffer

- Maak elektroforese sandwich van onder naar boven: zwart > matje > filtreerpapier > gel > membraan > filtreerpapier > matje > rood

- Blotcondities: 100V, limit 2.00, timer 0.6 (30 minuten) en koel met ijsblok Kleuren membraan:

- Markeer de plek waar de gel lag - Kleur membraan eventueel met Ponceau S (Sigma, Zwijndrecht, NL; P7170, check op eiwit

overdracht) - Incubeer 1 uur in 50 ml blokbuffer/ incubatiebuffer:

o Odyssey blockingbuffer (Li-Cor Westburg, Leusden, NL; 927-40000) 1: 1 verdund met PBS + 0.1% Tween-20

- Incubatie overnacht bij 4°C, licht schudden met primair antilichaam in incubatiebuffer door antilichaam aan incubatiezakje toe te voegen:

Gt anti-Mouse SAA (R&D Systems) 0.2 mg/ ml; MW 12 kD; 1: 2500 Rb anti-Mouse Apo-AII (online Ab) 1 mg/ ml; MW 11 kD; 1: 1250

- Was 2 keer kort en 1 keer 15 minuten in 50 ml wasbuffer (TBS/T) - Incubatie 1 uur met secundair antilichaam 1:10000 in incubatiebuffer

Odyssey Gt anti-Rabbit IRDye680 (Westburg 926-32221) Odyssey Dn anti-Goat IRDye680 (Westburg 926-68074)

- Was 2 keer kort en 1 keer 15 minuten in 50 ml wasbuffer (TBS/T) - Bewaar membraan in PBS om later te scannen (Odyssey CLx)