Inhoud presentatie
description
Transcript of Inhoud presentatie
Laboratorium diagnostiek van cystine
dr. Leo A.J. KluijtmansLab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten
UMC St Radboud
Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten
(Klein beetje) biochemie
Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten
Meting cystine (eigenlijk: cysteine)
Hoe kunnen we elkaar vinden
Vragen
Inhoud presentatie
Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten)
Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek
8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen)
Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar
Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten
Het UMC St Radboud, Nijmegen
LGEM laboratorium
LGEM laboratorium
De humane cel
1. Lysosoom2. Celmembraan3. Mitochondrion4. Endoplasmatisch
reticulum5. Cytoplasma6. Kernmembraan7. Kernporie8. Kern9. Kernlichaampje10.Ribosoom11.Golgi-systeem.
Ontdekt in 1949 door Christian de Duve
De stofzuigers van de cel
Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal)
Afbraakproducten gaan naar cel plasma
Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2
Het lysosoom
Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( )
NH2
Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH
( ) NH2 NH2
Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( )
COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH (
)NH2
De belangrijkste spelers
Hoe gaat het ‘normaal’?
cystine
Lysosoom
Cysteine-transporter
Lysine-transporter
De cel
Cystine-transporter
Wat gebeurt er bij Cystinosis
cystine
Lysosoom
Cysteine-transporter
Lysine-transporter
De cel
Cystine-transporter
cystine
Wat gebeurt er bij Cystinosis
Lysosoom
Cysteine-transporter
Lysine-transporter
De cel
Cystine-transporter
cystine
Werking van cysteamine
cysteamine
cysteine
Lysosoom
Cysteine-transporter
Lysine-transporter
De cel
Cystìne-transporter
Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect
Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten)
Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten
DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)
Diagnose cystinosis
Isolatie granulocyten uit bloed◦ Vermijden contaminatie met andere bloedcellen
(mn rode)
Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine◦ Oxidatie van cysteine geeft cystine◦ Rode- en witte bloedcellen bevatten veel
cysteine
Wat zijn de ‘challenges’
Granulocyt isolatie(polymorphonucleaire cellen)
Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden
Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.
Leukocyt isolatie, procedure
Dextraan incubatie, 1 uur op ijs
Leukocyten (witte cellen)
Erythrocyten (rode cellen)
Het leukocyten isolaat
Neutrofiele granulo
Eosinofiele granulo
Basofiele granulo
Lymfocyt Monocyt
35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6%
Totaal: 4.4-11.0 x 109 per liter
granulocyten
Dextraan incubatie
Leukocyten (witte cellen)
Erythrocyten (rode cellen)
Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker).
Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen)
Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm)
Scheiding op soortelijk gewicht
Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie
De Centrifuge
De Ficoll gradient
lymfocyten
granulocyten
Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij
Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving
Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten
+ 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)
Contaminatie met rode bloedcel
De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS).
Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g
Afzuigen wasbuffer en invriezen invloeibare stikstof (-196°C)
Opslag in -80°C vriezer tot analyse
Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten
Meting cystine uit de granulocyt met HPLC
Wat is de situatie ?
De cel
Lysosoom
cysteine
Andere –SH
verbindingen
cystine
HOOC HC-CH2-SH NH2
Cellen kapot maken
Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij…
Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine
Vals verhoogd cystine
N-ethylmaleimide (NEM)
Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)
De oplossing…
Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( )
+ NEM
Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook
het aanwezige cysteine weg
Het bindt NIET aan cystine
in overmaat
Complex mengsel van verbindingen
Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!
Complex mengsel van verbindingen
In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen.
De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden
Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten.
Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd
Het complexe mengsel
Complex mengsel van verbindingen
Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector
HPLC: High Performance Liquid Chromatography(hogedruk vloeistof chromatografie)
Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen
Cysteine meting met HPLC
Hoe werkt HPLC?
De ‘cystine’ HPLC in het lab.
De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden
De vloeistoffen
De monster verwisselaar van de HPLC
Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen.
Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten
Cysteine kwantificeren
Chromatogram
Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.
Van piekoppervlak naar concentratie
Hoeveelheid cysteine
Oppervlakte piek
In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald.
Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µM
Oppervlak ~ Concentratie cysteine
Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine)
Cysteine concentratie wordt gehalveerd.
Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen.
Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.
Van cysteine concentratie naar uitslag
In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s)
Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten)
Referentiewaarden / Targetwaarden
Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld:
Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.
Kinderpoli: 11-01-2011 Volwassenen: 17-01-2011 Kinderpoli: 25-01-2011 Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01)
Kinderpoli: 12-04-2011 Volwassenen: 18-04-2011 Kinderpoli: 26-04-2011 Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04) Kinderpoli: 14-06-2011 Kinderpoli: 21-06-2010 Volwassenen: 27-06-2011 Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06)
Volwassenen: 26-09-2011
Kinderpoli: 11-10-2011 Kinderpoli: 25-10-2011 Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)
Wat bieden we aan in 2011?
In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen.
Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking)
Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.
Isolatie granulocyten in Nijmegen
Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit
Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’
Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.
Ter afsluiting
Analisten:Dinny van Oppenraaij-EmmerzaalJenneke Keizer-GarritsenGwendolyn BeckmannLouk Geelen
“Het Oude Team”Addy de Graaf-HessHenk Blom
Elena Levtchenko
Marjolein Bos
Acknowledgments
Ter afsluiting nog een mooi plaatje…
ERNDIM, kwaliteitsrondzendingenEuropean Research Network Inherited Disorders of Metabolism