HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole...3 5 LES 6 HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole 5.1 Binaire...

1

1

LES 6

HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole

5.1 Binaire fissie, knopvorming en biofilms

7.3 Celdeling en Fts eiwitten

7.4 MreB en celmorfologie

7.5 Peptidoglycaanbiosynthese

5.2 Kwantitatieve aspecten van groei

5.3 De microbiële groeicyclus

5.4 Continucultuur

5.6 Microscopische telling

5.7 Leefbare celtellingen

5.8 Turbiditeitsmetingen

2

Prokaryoten bevatten een dynamisch cytoskelet uit meerdere

componenten

MreB: belangrijke vorm-bepalende factor in prokaryoten, actine-

analoog

– Vormt een eenvoudig cytoskelet in cellen van Bacteria en sommigeArchaea

– Vormt kleine lap-vormige filamenten die bewegen loodrecht op de lengte as aan de binnenkant van de cel, onder de membraan

– Komt niet voor in cocci (bolvormige bacteria)

– Zorgt voor de precieze localisatie van peptidoglycaansynthese enandere celwandonderdelen bij de groei van staafvormige cellen

– MreB structuur roteert >> peptidoglycaan synthese langs lengte-as


Figure 7.10

2

3

Bacillus subtillis

Fasencontrast

Zelfde cellen, MreB

fluorescent gemerkt


Uitschakeling van MreB gen >> coccoide cellen

Figure 7.10

4

Crescentine vorm-bepalend eiwit in komma-vormigecellen van Caulobacter crescentus

Vormt filamenten 10 nm breed in holle zijde van de cellen

Crescentine = rood gekleurd

DAPI kleuring: DNA – blauw

Gelijkaardige eiwitten in anderegebogen cellen, vb. Helicobacter

Archaea: genomen bevatten ook MreB en FtsZ genen >> zelfde

celvormen

Eukaryoten: MreB ~ actine, FtsZ ~ tubuline, crescentine ~ keratine

>> veel parallellen tussen prokaryoot en eukaryoot:

Evolutieve verwantschap


Figure 7.10

3

5

LES 6








5.4 Continucultuur




6


Figures 2.10,11,12

Structuur peptidoglycaan

4

7

In cocci groeien celwanden in tegenovergestelde

richting vanuit de centrale FtsZ ring


Figure 7.12

Bij knopvormers is er gelokaliseerde wandsynthese

8

In FtsZ ring bij

staafjes zoals E.

coli: FtsI

Waar MreB actief is gebeurt ook

peptidoglycaan-synthese

In staafjes gebeurt groei op verschillende punten over de hele cellengte


5

9

Productie van nieuw celwandmateriaal is een belangrijk

process bij celdeling

- Bestaande peptidoglycaanketens moeten geopend worden om nieuw materiaal tussen te schuiven

Autolysinen: maken kleine openingen ter hoogte

van de FtsZ ring of MreB

Hierin worden nieuwe bouwstenen geschoven

- Celwand is lokaal zwakker >> proces moet snel en

gecontroleerd verlopen want celwand zorgt voor

stevigheid van de cel en beheerst de turgordruk

- Bouwstenen worden binnen in de cel aangemaakt en

naar buiten getransporteerd


10

Bouwstenen peptidoglycaan: N-acetylglucosamine/N-acetylmuramine zuur/pentapeptide

Van binnen de cel naar buiten gebracht over het membraan

door bactoprenol: • C-55 alcohol, hydrofoob, groot

• Bindt de precursor

• Brengt hem over de membraan


Figure 7.13

6

11


12

1.Autolysinen breken β1-4 glycosidische binding tussenN-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur

2.Glycosylasen werken met bactoprenol om de precursoren in de groeipunten te stoppen en katalyseren

de β1-4 glycosidische binding

Figure 7.14


7

13


Figure 7.14

3. Transpeptidasen vormen de peptide cross-links om

naburige suikerketens te verbinden

• In G-: tussen D-ala en DAP van naburige peptideketen

• Extra D-ala splitst af en zorgt zo voor energie

• In E. coli is FtsI een transpeptidase

• geremd door penicilline, autolysinen niet >> cel barst open

14

LES 6








5.4 Continucultuur




8

15


Groeicurve

16

Bacteria groeien sneller dan de meeste eukaryote micro-organismen

Generatietijd afhankelijk van medium en incubatie condities

Exponentiële groei: groei waarbij de populatie verdubbelt ineen constant tijdsinterval. Aanvankelijk stijgt het aantal cellen

niet sterk, maar dit gaat steeds sneller (exponentieel)

Relatie tussen aantal cellen bij start van exponentiële groeien aantal na een tijd van exponentiële groei

N= N02n

N = # cellen na tijd van exponentiële groei

N0 = # cellen bij start van exponentiële groei

n = # generaties van exponentiële groei


9

17

GroeisnelheidExponentiële groei

N= N02n

Generatietijd bij

exponentiële groei

g= t / nt = duur van

exponentiële groei

n = # generaties met

exponentiële groei


Figure 5.5

18

Generatietijd g(methode 1 - visueel)

Bij exponentiële groei is g afte leiden uit de groei curve (semi-log Y-as) (rechte!)

Hoe lang voor verdubbeling

# cellen?


10

19

Relatie tussen het aantal cellen bij de start en het aantal

na een periode van exponentiële groei:N = No2

n

Met N = aantal cellen bij einde van de meting na tijd t van

exponentiële groei

No = aantal cellen bij de start en n = aantal generaties na

tijd t van exponentiële groei

Dit levert een tweede methode om de generatietijd te

berekenen want g=t/n

Generatietijd (methode 2 – obv cel aantallen)


20

g = t/n

Vb. men meet N0= 5.107 t=2 N=108

>> men kan n en dus ook g berekenen


Generatietijd (methode 2 – obv cel aantallen)

11

21

Uit de helling van de semilog groeicurve

Helling = Δcellen = logN-logN0 = 0.301 • n = 0.301

Δtijd t t g

Generatietijd (methode 3 – obv helling groeicurve)

Helling = 0.05

0.05 = 0.301 • n/t

0.05 = 0.301 • 1/g

g = 0.301/0.05 = 6

Voorwaarde om g teberekenen is exponentiële groei


22


Bij exponentiële groei is de celtoename eerst traag, maar ze stijgt tot

ze enorm groot is.

Daarom worden voedingsmiddelen vaak schijnbaar plots slecht

(vb zure melk)

Figure 5.5

12

23

LES 6








5.4 Continucultuur




24

Exponentiële groei is slechts een onderdeel van de groeicyclus. In een gesloten systeem kunnen

MO niet oneindig groeienBatch cultuur: gesloten systeem, vast volume


Figure 5.7

13

25

Groeicyclus

• Lag fase– Tijdsinterval tussen inoculatie van de cultuur en start

van de exponentiële groei

• Exponentiële fase/Log fase– Cellen in meest optimale conditie, groeisnelheid

constant

• Stationaire fase– Groei snelheid van de populatie is nul

– Metabolisme zeer traag

– Ofwel is een essentieel voedingsmiddel op of is een

remmend afvalproduct te geconcentreerd aanwezig

– Soms kryptische groei

• Afstervingsfase– Cellen sterven af met constante snelheid


26

LES 6








5.4 Continucultuur




14

27

Continucultuur – vb. chemostaat

Open systeem, vast volume (vers medium wordt toegevoegd

en verbruikt medium wordt afgevoerd met eenzelfde snelheid)

5.4 Continucultuur

Figure 5.8

Bij evenwicht blijft volume,

aantal cellen, concentratie

aan voedsel en afvalstoffen

constant = steady state

28

5.4 Continucultuur

Figure 5.8

15

29

Celopbrengst van cultuur afhankelijk van groeisnelheid & populatie

densiteit. De manier om deze te beïnvloeden verschilt in de

verschillende types culturen:

Batch:

- concentratie limiterende

voedingsbron bepaalt cel

opbrengst

- omdat de condities

voortdurend veranderen kan

men de cel opbrengst en

groeisnelheid niet afzonderlijk

manipuleren

Chemostaat:

- concentratie limiterende

voedingsbron bepaalt cel

opbrengst (cellen/ml)

- dilutiesnelheid (snelheid

waarmee vers medium wordt

toegevoegd) bepaalt

groeisnelheid

- cel opbrengst en groeisnelheid

onafhankelijk te manipuleren

5.4 Continucultuur

30

“Batch” cultuur Continue cultuur

Te hoge dilutie >> wash out

Te lage dilutie >> honger, dood

Hogere conc. van de limiterende

voedselbron>> meer cellen,

zelfde groei snelheid

5.4 Continucultuur

Figure 5.10

Figure 5.9

16

31

Chemostat toepassingen:

- langdurige experimenten

- enzymologie

- ecologie: lage nutriënt concentraties, gemengde populaties

- aanrijkingsculturen

32

Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME) – LabMET, UGent

Reactor Volume (ml) Residence time (h) pH

R1: stomach 200 4

R2: small intestine 200 4

R3: ascending colon 500 20 5.6–5.9

R4: transverse colon 800 32 6.1–6.4

R5: descending colon 600 24 6.6–6.9

17

33

LES 6








5.4 Continucultuur




34

Hoe bacteriële groei meten en opvolgen?

Rechtstreeks:

• Microscopische observeren en cellen tellen in

een staal• Staal uitplaten, incuberen en kolonies tellen

Indirect:• Turbiditeit van een groeiende cultuur meten

• Concentratiebepaling celcomponenten

18

35

Microscopische tellingen – Eenvoudig

Petroff-Hausser meetraster

Alternatief voor het tellen van vloeibare culturen:

flow cytometrie


Figure 5.13

36

Microscopische tellingen:

minder betrouwbaar maar wegens eenvoud veel gebruikt

Nadelen:

- Kleine cellen worden gemakkelijk gemist

- Precisie is moeilijk

- Cellen moeten liefst stil liggen

- Indien men kleurt is alles dood

- Indien men niet kleurt, is fasencontrast nodig

- Onderscheid levende – dode cellen vereist speciale

kleuring

- Moeilijk bij lage concentratie (< 106 cellen/ml)

- Rommel in het staal lijkt soms op cellen


19

37

Microscopische tellingen:

minder betrouwbaar maar wegens eenvoud veel gebruikt

Verschillende kleuringen laten toe:

• Fylogenetische groepen te onderscheiden

• DNA kleuring met DAPI

• Kleuringen om levende en dode cellen te onderscheiden

• Kleuring voor Archaea of Bacteria

• Specifieke kleuringen voor bepaalde

functionele/metabolische groepen


38

Alternatieve methode: flow cytometrieCeltelling in vloeibareculturen of stalen via flow cytometer

(laserlicht, fluorescentekleuring, elektronica)


Figure 19.36

20

39

LES 6








5.4 Continucultuur




40

Meting gebeurt door groei na te gaan: “viable cellcounts” of “plate counts”, kolonietellingen op Petri-

platen

Gebruikt medium en condities zullen bepalen wat men telt:

- Algemeen medium: veel groei (maar zelden alles)

- Selectief medium: enkel bepaalde groepen- Men telt enkel wat kan groeien


21

41

Twee methoden voor viable count: in allebei cellen individueel

uitspreiden op/in medium, groeien en kolonies tellen


Figure 5.14

42

Best tellen op platenmet 30-300 kolonies

Verdunningsreeks

Seriële verdunningen

CFU

Om goede tellingen tekunnen doen, moet een

staal verdund worden enmoeten meerdere

verdunningen uitgeplaatworden


Figure 5.15

22

43

Spiraal plater

Mogelijke foutenbronnen voor berekening van celaantallen:

• Verschillende groeisnelheden >> kleine en grote kolonies

• Homogeniseren van stalen >> niet-homogene suspensie

of celklonters• Pipetteerfoutjes

• Te warme temperatuur medium (bij gietplating)


44

Totale tellingen op platen zijn vaak onbetrouwbaar voor natuurlijke stalen (o.a. grond en water)

“The Great Plate Count Anomaly”: Microscopische

tellingen van stalen geven meestal veel meer MO dan kolonietelligen op platen met eender welk medium

Verklaring:

- Dode cellen tellen mee - De groeicondities van diverse organismen kunnen enorm

verschillen (niet alles groeit)- Cellen in rust (VBNC)


23

45

Gerichte tellingen van bepaalde groepen:

Beter betrouwbaar

Zeer selectief cultuur medium.

Bv. complex medium + 10% NaCl: selecteert Staphylococcus

van de huidflora.

Bv. EMB voor coliformen in water.


Kolonietellingen veel gebruikt

in voedsel- water- en klinische

microbiologie waar men

bepaalde groepen selectief wil

tellen

46

LES 6








5.4 Continucultuur




24

47

Meten van de groeiTurbiditeitsmeting

Onrechtstreekse meting van groei ~ vertroebeling van

vloeibare cultuur

Spectrofotometer meet OD

(optische densiteit bij bepaalde

golflengte vb 540 nm OD540)

OD ~ celaantal (bij eencelligen)

Verschilt per soort MO,

medium

Gebruik van standaardcurve


Figure 5.16

48

Groeicurve voor 2 organismen

Meten van de groei – Turbiditeitsmeting

E. coli cultuur


Figure 5.16

25

49

Om het aantal cellen af te leiden,

heeft men een standaardcurvenodig (Relatie tsn. celaantal en OD units)

Kan variëren tussen soorten en

media

Turbiditeitsmeting

Voordelen:- Snel

- Gemakkelijk

- Niet-destructief of verstorend

Nadelen:- Moeilijk bij biofilmvorming of bij samenklittende cellen


Figure 5.16

50

Laboratorium ≠ Buitenwereld

26

51


5.9 Microbiële temperatuurklassen

5.10 Microbieel leven in de kou

5.11 Microbiële groei bij hoge temperaturen

5.12 pH effect op microbiële groei

5.13 Osmolariteit en microbiële groei

5.14 Zuurstof en microbiële groei

5.15 Groeibeperking algemeen en door hitte

5.16 Andere fysische methoden: Straling & filtratie

5.197 Chemische beperking van microbiële groei

LES 6

52

Effect van de temperatuur op de groeisnelheidMinumum, optimum, maximum: kardinale temperaturenRange meestal minder dan 40°C

5.9 Microbiële temperatuuklassen

Figure 5.17

27

53

Verschillende categoriën MO volgens temperatuuroptima

Mesofielen: in warmbloedige dieren, in terrestrische enaquatische habitats, in gematigde en tropische streken

5.9 Microbiële temperatuuklassen

54


5.9 Microbiële temperatuurklassen


5.11 Microbiële groei bij hoge temperaturen

5.12 pH effect op microbiële groei

5.13 Osmolariteit en microbiële groei

5.14 Zuurstof en microbiële groei

5.15 Groeibeperking algemeen en door hitte

5.16 Andere fysische methoden: Straling & filtratie

5.197 Chemische beperking van microbiële groei

LES 6

28

55

Extremofielen

– Organismen die best groeien bij extreem warme of

extreem koude omstandigheden

Psychrofielen

– Organismen met koude groei-optima (<15°C); de

meest extreme bewonen permanent koude habitats

(max. 20°C)

Psychrotoleranten

– Organismen die kunnen groeien bij 0ºC maar optima

hebben van 20ºC tot 40ºC; wijder verspreid dan

psychrofielen


56

Micro-organismen uit

Antarctisch zeewater

Permanent bevroren

Lake Bonney, Antarctica

Polaromonas leeft in ijs

Figure 5.19


Garwood Gletsjer, Antarctica

29

57

Psychrofiele gemeenschappen in

zeeijs, sneeuwvelden, gletsjers:

Bacteriën en sneeuwalgen

Koude kampioen: Planococcus

halocryophilus groeit bij -15°C in

permafrost

Er is nog vloeibaar water bij -20°C

Limiet is mogelijk -40°C

Generatietijd maanden/jaren


Figure 5.20

Rode sporen van

Chlamydomonas nivalis

58

Moleculaire adaptaties psychrofielen:

• Enzymen meer flexibel (meer α helixen, minder βsheets; meer polaire en minder hydrofobe aminozuren, minder zwakke bindingen tussen EW domeinen)

• Membranen met veel (poly)onverzadigde en korterevetzuren (meer vloeibaar) >> vlotter transport

• Cold shock proteins

• Exopolysaccharide slijm op celoppervlak

• Synthese van cryoprotectantia: antivries proteinen, glycerol, bepaalde suikers

Cryoprotectantia voor culturen: glycerol, DMSO beletten vorming van ijskristallen


30

59

Onderzoek polaire microorganismen in Lab. Microbiologie

Polar regions:

• Low temperatures/ freezing-thawing cycli

• Varying light conditions, salinities and nutrient

concentrations

• High UV irradiation

• Desiccation

• Extensive ice cover

• Extremely strong winds

Extreme habitats impose a considerable

physiological stress on the living organisms

Doctoraat Stefanie Van Trappen, 2004

Karolien Peeters, 2011; Bjorn Tytgat 2016,

Guillaume Tahon 2017, Sam Lambrechts

Extra

60

Princess Elisabeth Station is located at Utsteinennunatak in the Dronning Maud Land (East Antarctica). The coordinates are 71°57' S-23°20' E.

http://www.antarcticstation.org/

Extra

31

61

Cultivation study: microbial mat samples

Extra

Bacterial diversity in Antarctica

62

Experimental approach:

10-1 (R2A A20) 10-2 (R2A A20) 10-3 (R2A A20)

10-4 (R2A A20) 10-5 (R2A A20) 10-6 (R2A A20)

Dilution series

Dilution series 10-1 10-7

MA R2A R2A/10 PYGV

4° C

15° C

20° C

4° C

15° C

20° C

4° C

15° C

20° C

4° C

15° C

20° C

Incubate under different conditions

Isolate, purify strains

1 g sample

Isolated strains


Extra

32

63

1379 rep-types

(GTG5-PCR)Purify bacterial isolates

Thousands of isolates

16S rRNA

gene sequencing of

representatives

Pairwise comparison and delineation

of phylotypes at 99% similarity

Comparison with public database =

Identification Comparison with public DNA databases for assessment of geographical distribution

Dereplication

Extra

Genomic fingerprintor proteomic fingerprint


Experimental approach:

64

Culturable diversity:

- many potentially new species (and genera)

- some first reports from Antarctica

- some very rare isolates

However:

Culturable diversity

is not representative of the

whole community:

cultivation

and selection bias !!

Extra


33

65

KweekTotale

gemeenschap

Actinobacteria Bacteroidetes Deinococci Proteobacteria Firmicutes

Cyanobacteria Proteobacteria Actinobacteria

OP10 Verrucomicrobia TM7

Acidobacteria Planctomycetes Firmicutes

Gemmatimonadetes Deinococcus-Thermus Bacteroidetes

BRC1 Chloroflexi

Vergelijking kweek – sequenering omgevingsDNA

BB50

Extra


HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole...3 5 LES 6 HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole 5.1 Binaire...

Documents

Transcript of HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole...3 5 LES 6 HOOFDSTUK 5 : Groei en groeicontrole 5.1 Binaire...