FACULTEIT GENEESKUNDE EN Co-promotor: Prof. Dr. Johan Aps … · 2013. 12. 21. · FACULTEIT...

FACULTEIT GENEESKUNDE EN

GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2012 - 2013

EEN KWANTITATIEVE BEPALING VAN DE CELLULAIRE INHOUD VAN SPEEKSEL

Renaat COOPMAN

Promotor: Prof. Dr. Joris Delanghe Co-promotor: Prof. Dr. Johan Aps

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

“De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder

de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”

Datum

(handtekening)

Renaat COOPMAN Prof. Dr. Joris Delanghe Prof. Dr. Johan Aps

(Student) (Promotor) (Co-promotor)

Een kwantitatieve bepaling van de cellulaire inhoud van speeksel.

I

Inhoudstafel.

1 Abstract. .......................................................................................................................................... 1

1.1 Inleiding................................................................................................................................... 1

1.2 Doelstellingen. ......................................................................................................................... 1

1.3 Materiaal en methoden. ........................................................................................................... 2

1.4 Resultaten. ............................................................................................................................... 2

1.5 Conclusie. ................................................................................................................................ 2

2 Inleiding. ......................................................................................................................................... 3

3 Doelstellingen. ................................................................................................................................ 9

4 Methodologie. ............................................................................................................................... 10

4.1 Vrijwilligers. .......................................................................................................................... 10

4.2 Speekselafname. .................................................................................................................... 10

4.3 Testprocedure Sysmex UF-1000i®. ....................................................................................... 10

4.4 De reproduceerbaarheid van de Sysmex UF-1000i® (within-run variatiecoëfficiënt)........... 11

4.5 Bepalen van de biologische variabiliteit gedurende één dag (between-run variatiecoëfficiënt). .

............................................................................................................................................... 11

4.6 Bepalen van de biologische variabiliteit gedurende drie weken (between-run

variatiecoëfficiënt). ................................................................................................................... 11

4.7 Effect van de bewaring van de speekselstalen....................................................................... 11

4.8 Tandenpoetsen als pre-analytische variabele. ....................................................................... 12

4.9 Het mondonderzoek tijdens het cross-sectioneel onderzoek. ................................................ 13

4.10 Statistische verwerking. ......................................................................................................... 15

5 Resultaten. .................................................................................................................................... 17

5.1 Analytische aspecten ............................................................................................................. 17

5.1.1 De reproduceerbaarheid van de Sysmex UF-1000i® (within-run variatiecoëfficiënt). .. 17

5.1.2 Between-run variatiecoëfficiënt gedurende één dag...................................................... 18

5.1.3 Between-run variatiecoëfficiënt gedurende drie weken. ............................................... 19

5.2 Pre-analytische aspecten. ....................................................................................................... 20

5.2.1 Tijd en temperatuur ....................................................................................................... 20

5.2.2 Tandenpoetsen. .............................................................................................................. 25

5.3 Diagnostische aspecten. ......................................................................................................... 28

5.3.1 Referentiewaarden en exploratieve data-analyse........................................................... 28

5.3.2 Analyse van parameters Sysmex UF-1000i®

volgens de aanwezigheid van gingivitis. 30

5.3.3 Analyse van parameters Sysmex UF-1000i® volgens de gingivitisscore. ..................... 35


volgens de aanwezigheid van cariës. ...... 43


II

6 Discussie. ...................................................................................................................................... 44

6.1 Analytische aspecten. ............................................................................................................ 44

6.2 Pre-analytische aspecten. ....................................................................................................... 45

6.3 Diagnostische aspecten. ......................................................................................................... 46

6.4 Conclusie. .............................................................................................................................. 50

7 Referentielijst. ............................................................................................................................... 51

8 Bijlage. ............................................................................................................................................ 1


1

1 Abstract.

1.1 Inleiding.

Het afnemen van een bloedstaal om de algemene gezondheid van hun patiënt te evalueren is bij artsen

een alom bekende en aanvaarde techniek. Dat een tandarts een speekselstaal zou laten analyseren om

de gezondheid van de patiënt te bepalen, is de dag van vandaag een hot topic. Verschillende

biomerkers in het speeksel zijn beschreven die aanwijzingen geven omtrent de medische status van de

patiënt. Echter is de procedure om deze biomerkers te vinden soms uitgebreid en ingewikkeld.

In 2002 verscheen een artikel van Aps et al [1] in het tijdschrift Clinica Chimica Acta. Hier werd

voor het eerst voorgesteld een flowcytometer te gebruiken om speeksel te analyseren. Dit toestel, de

Sysmex UF-100®, bepaalt zeer nauwkeurig de cellulaire inhoud van een biologische vloeistof. Het

meet het aantal rode bloedcellen, witte bloedcellen, epitheelcellen, bacteriën en ook andere cellen. De

auteurs van dit artikel vonden een verband tussen het aantal leukocyten en lokale ontsteking.

In 2007 verscheen een nieuwe generatie flowcytometers, de Sysmex UF-1000i®, die nog accurater de

cellulaire inhoud van biologische vloeistoffen kan bepalen. Dit gaf de aanzet een nieuwe studie aan te

vangen.

1.2 Doelstellingen.

Een eerste doelstelling was nagaan of de flowcytometer Sysmex UF-1000i® geschikt was voor het

analyseren van speekselstalen. Hierbij werd zowel de reproduceerbaarheid van de flowcytometer

Sysmex UF-1000i® bekeken en de biologische variabiliteit gedurende één dag en drie weken. Een

tweede aspect was het bekijken van tijd, temperatuur en het poetsen van de mond als pre-analytische

variabelen.

Een tweede doelstelling was het opstellen van referentiewaarden van de cellulaire inhoud van

speeksel. Er werd nagegaan of er verschillen konden teruggevonden worden tussen de gezonde

populatie en de populatie met dentale en/of parodontale problemen. Bij gevonden verschillen werd er

nagegaan of er gradaties konden gevonden worden tussen de ernst van de orale aandoeningen en de

cellulaire inhoud van speeksel.

In tweede instantie werd bekeken of cellulaire inhoud van een speekselstaal kon gebruikt worden als

klinisch diagnosticum om de mondgezondheid van een individu te bepalen. Hierbij ging een

bijzondere aandacht uit naar de relatie tussen het aantal witte bloedcellen en de aanwezigheid van

orale ontstekingen.


2

1.3 Materiaal en methoden.

Voor het verzamelen van speekselstalen werden 249 deelnemers (128 mannen, 121 vrouwen)

gevraagd om gedurende drie minuten te kauwen op een paraffinetablet. Het speeksel werd opgevangen

in een steriel recipiënt. De speekselstalen werden bewaard op +4°C en werden binnen 6 uur getest op

de flowcytometer Sysmex UF-1000i®.

Na de speekselafname volgde er een kort klinisch onderzoek waarbij patiënten gescreend werden op 3

parameters: cariës, gingivitis en tandplaque.

1.4 Resultaten.

De flowcytometer Sysmex UF-1000i® kan met een hoge nauwkeurigheid gebruikt worden om een

speekselstaal te analyseren. De celaantallen van de parameters gemeten door de Sysmex UF-1000i®

vertonen een grote spreiding gedurende één dag en gedurende één week voor een gezond individu.

Speekselstalen kunnen gedurende 6 uren op een temperatuur van +4°C opgeslagen worden zonder

afwijkingen van het aantal cellen te krijgen. Tandenpoetsen zonder tandpasta geeft een daling van de

cellulaire inhoud van speeksel, terwijl tandenpoetsen met een anti-cariës tandpasta een stijging geeft

van het aantal rode bloedcellen.

De gingivale en parodontale toestand van een individu kan ingeschat worden aan de hand van het

aantal witte bloedcellen in speeksel. Hierbij werd er een verband gevonden tussen het aantal witte

bloedcellen en de ernst van de parodontale ontsteking. Bij de steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar

werd bij een afkappingspunt van 1,1 x 103 witte bloedcellen per 10

-6L een sensitiviteit van 60% en een

specificiteit van 64% gevonden. Een sensitiviteit van 75% en een specificiteit van 62% werden

bekomen bij een afkappingspunt van 1,3 x 103 witte bloedcellen per 10

-6L voor een gingivitisscore 3.

1.5 Conclusie.

De flowcytometer Sysmex UF-1000i® kan veilig gebruikt worden voor het analyseren van de

cellulaire inhoud van speeksel. Er werd een verband gevonden tussen de ernst van gingivale

ontsteking en het aantal witte bloedcellen in speeksel. Het is aangewezen om de gevonden verbanden

in een vervolgstudie uit te diepen om de volledige waarde van de Sysmex UF-1000i® te kunnen

inschatten als diagnosticum in de mondgezondheid.


3

2 Inleiding.

Mondvloeistof is een samengestelde vloeistof die voor het grootste deel afkomstig is uit de

verschillende speekselklieren. Speeksel wordt voor het grootste deel geleverd door drie paar grote

speekselklieren: de glandula parotideae, de glandulae submandibulares en de glandulae sublinguales.

Verder liggen er nog zeer vele kleine, accessoire speekselklieren in de mucosa van de tong, de

wangen, de lippen en het verhemelte. Hun totale aantal wordt geschat op 450-750. Het karakter van de

speekselklieren en hun secreties wordt bepaald door hun secretoire celtypen: deze zijn sereus,

seromukeus of mukeus. Zo zijn de glandulae parotidea zuiver sereus evenals de Von Ebner

speekselkliertjes achter op de tong ter hoogte van de papillae circumvallatae. De glandulae

submandibulares zijn seromuceus, de glandulae sublinguales overheersend muceus [2-3].

Speeksel dat geproduceerd wordt in de glandula parotidea, de glandula submandibularis en de

glandula sublingualis bereiken de mond via respectievelijk de ductus parotideus, ductus

submandibularis en ductus sublingualis (die vaak uitmondt in de afvoergang van de gl.

submandibularis) [2].

Speekselafgifte wordt voor een belangrijk deel gereguleerd door prikkeling van het autonoom

zenuwstelsel. Echter, verschillende prikkels en condities kunnen de afgifte van speeksel beïnvloeden.

Afhankelijk van de persoon en van de intensiteit van de secretieprikkels kan de speekselafgifte voor

gezonde personen variëren van 0 tot 6 ml/min en van 500 tot 1500ml/dag [2].

Speeksel is meer dan het secreet van de speekselklieren. Het is een mengeling van meerdere

vloeistoffen. Het bestaat zowel uit het secreet van de kleine als de grote speekselklieren als ook uit

verschillende bestandsdelen die niet afkomstig zijn van de speekselklieren: zoals de gingivale

creviculaire vloeistof (GCF), opgehoeste secreten vanuit de nasale en bronchiale luchtwegen, serum-

en bloedderivaten van orale wonden, bacteriën en bacteriële producten, virussen en fungi,

afgeschilferde epitheelcellen, andere cellulaire componenten en voedseldebris [4].


4

Figuur 1. naar 'Figure 1. Components of whole saliva' [4].

Zeker in de context van diagnostische testen is het belangrijk dat men zich realiseert dat mondvloeistof

meer is dan speeksel, die per definitie vloeistof is gesecreteerd door speekselklieren (figuur 1). Met

andere woorden hebben serumcomponenten, epitheelcellen, tandplaque, adem en zelfs pellicle

componenten naast zuiver speeksel zekere diagnostische waarden [5]. Omdat in het algemeen de term

speeksel de mondvloeistof met al zijn componenten aanduidt, wordt ook hier de term speeksel in die

betekenis gebruikt [6].

In 2002 werd voor de eerste maal gebruik gemaakt van flowcytometrie voor de analyse van speeksel.

In deze studie werden 258 speekselstalen opgevangen in een steriel recipiënt (112 mannelijk en 146

vrouwelijk), gevortexed en vervolgens geanalyseerd met de Sysmex UF-100® flowcytometer. De

speekselstalen werden bekomen door in rechtopzittende positie te kauwen op een paraffinetablet

(CRT® test kit, Vivadent

®, Liechtenstein) gedurende minstens drie minuten [1].

Er werd onderzoek gedaan naar de reproduceerbaarheid van flowcytometrie met speeksel en er werden

referentiewaarden voor een aantal parameters opgesteld, met name het aantal rode bloedcellen, witte

bloedcellen, epitheelcellen en bacteriën per 10-6

L speeksel. De within-run variatiecoëfficiënt voor de

rode bloedcellen bedroeg 27%, 29% voor de witte bloedcellen en de epitheelcellen en 24% voor de

bacteriën. De between-run variatiecoëfficiënt gedurende 1 dag was voor rode bloedcellen 49%, 47%

voor de witte bloedcellen, 29% voor de epitheelcellen en 50% voor de bacteriën.


5

Volgende referentiewaarden werden gerapporteerd [1]:

Parameter (/10

-6L)

Over-all (n=256) Mannen (n=112) Vrouwen (n=146)

m P 2,5 P 97,5 m P 2,5 P 97,5 m P 2,5 P 97,5

RBC 716 123 3 388 918 189 4 244 580 116 3 269

WBC 1 279 257 5 142 1 239 299 5 016 1 404 237 5 158

EC 935 162 4 191 1 156 244 4 703 753 136 2 942

BACT 11 511 3 785 37 249 12 748 4 024 43 810 10 439 3 727 31 465

Tabel 1. Referentiewaarden (m = mediaan, P 2,5 = 2,5ste

percentiel, P 97,5 = 97,5ste

percentiel) voor rode

bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT) per 10-6

L [1].

Bij 213 van de 256 vrijwilligers werd er door middel van de DMF-T en DMF-S index op cariës

gescreend. Er werd gingivitis gescoord wanneer minstens één hypertrofische en hyperaemische papil

klinisch vastgesteld werd. De aanwezigheid van cariës en het risico op cariës kon niet bepaald worden

door flowcytometrie. Wel werd vastgesteld dat er een stijging was van het aantal witte bloedcellen bij

individuen met gingivitis. Aan een vastgelegde grens van 103 witte bloedcellen per 10

-6L speeksel

werd een sensitiviteit van 76% en een specificiteit van 45% gevonden. Tussen de andere parameters

werd geen significant verschil gevonden tussen individuen met of zonder gingivitis [1].

De auteurs besloten dat analyse door middel van flowcytometrie van paraffine gestimuleerd speeksel

mogelijkheden kan geven inzake diagnose en voorspelling van ziektes in de orofaryngeale loge, zoals

tonsillitis en parodontitis [1].

In 2007 kwam de opvolger van de Sysmex UF-100® op de markt: de Sysmex UF-1000i

®. Deze

flowcytometer heeft een aantal verbeteringen ten opzichte van zijn voorganger. Ten eerste gebruikt de

Sysmex UF-1000i®

een halfgeleider laser in plaats van een argonlaser. Ten tweede wordt er maar één

kleurstof (een polymethine) meer gebruikt. Ten derde zijn er twee telwegen, één voor het tellen van

microbiologische structuren en een ander voor het analyseren van het sediment. Ten vierde worden

voor elke cel zowel het voorwaarts verstrooid licht als het zijwaarts verstrooid licht simultaan

geregistreerd. Bij de Sysmex UF-100® werd enkel met het voorwaarts verstrooid licht rekening

gehouden [7-9].

Hieronder wordt het werkingsprincipe van de Sysmex UF-1000i® kort toegelicht:

Net zoals de vorige modellen Sysmex UF-100®/UF-50

®/UF-100i

®, is de Sysmex UF-1000i

® ook een

fluorescentie flowcytometer, maar gebaseerd op de geavanceerde halfgeleider laser technologie [8].

Bij de manuele procedure zuigt de Sysmex UF-1000i® 0,8 ml vloeistof op. Binnenin het toestel, wordt

het te testen staal gemengd met speciale reagentia in een vaste oplossingsverhouding. Deze reagentia

geven een specifieke pH aan het staal. Op deze manier wordt het staal klaargemaakt voor analyse.

Direct hierna worden er kleurstoffen op basis van polymethines toegevoegd (één voor het tellen van de


6

bacteriën, een ander voor het aantonen van de additionele partikels in het te testen staal). De specifieke

pH verzekert een optimale kleuring. Dit gebeurt allemaal op een welbepaalde specifieke temperatuur

in een incubatiekamer [8].

De kleurstoffen zijn aangepast aan de golflengte van de laser in de Sysmex UF-1000i®. Deze bedraagt

635 nm en ligt dus in de buurt van rood licht. Wanneer het opgeloste en gekleurde staal de laserstraal

passeert in de flow cell, absorberen de elektronen van de kleurstoffen de hoog-energetische stralen

en emitteren vervolgens een fluorescentiegolf (golflengte > 660 nm, in de buurt van het spectrum van

infrarood licht) [8].

Figuur 2. Optische unit van de Sysmex UF-1000i® analyser Sysmex Ultra Online [8].

Hydrodynamisch focussen verlaagt de diameter van het opgeloste en gekleurde staal vooraleer het de

ingang van de flow cell bereikt. De partikels passeren de laserstraal individueel, gealigneerd in

lengterichting en aan hoge snelheid. Voor elke cel wordt zowel het voorwaarts verstrooid licht als het

zijwaarts verstrooid licht simultaan geregistreerd. De fluorescentie geïnduceerd door de laser, wordt

ook gemeten. Deze optische signalen worden geanalyseerd en worden gebruikt voor de classificatie

van de gepasseerde partikels en voor additionele informatie [8].

De Sysmex UF-1000i® analyseert het aantal rode bloedcellen, witte bloedcellen, epitheelcellen,

bacteriën, en andere. Het lijkt dus opportuun om op een aantal parameters waarop de Sysmex UF-

1000i®

metingen uitvoert, iets dieper te kijken in verband met orale vloeistof.

Zo worden epitheelcellen, afkomstig van desquamatie van de binnenzijde van de mond, in het speeksel

teruggevonden. De contributie van creviculair of pocketepitheel is niet gekend [4-10].


7

Bloed en bloedderivaten kunnen afkomstig zijn van intra-orale bloedingen (serum en cellen) en van

gingivocreviculaire vloeistof [4,11].

De meerderheid van de witte bloedcellen komt de orale caviteit binnen via de gingivocreviculaire

vloeistof. Het aantal witte bloedcellen in speeksel varieert van persoon tot persoon en het celaantal

varieert voor een individu doorheen de dag [12-13]. In een gezonde mond is het aandeel van de

gingivocreviculaire vloeistof gering, terwijl bij gingivale en parodontale ontstekingen de

vloeistofstroom vanuit de sulcus niet meer te verwaarlozen is [14]. Het apicale deel van de

subgingivale plaque is omgeven met uitgetreden meerkernige witte bloedcellen [15]. Ook opgehoeste

bronchiale en nasale secreten kunnen voorkomen in speeksel [4]. Deze secreten kunnen in geval van

ziekte ook leukocyten bevatten [16-18].

De mond is gekoloniseerd door de lichaamseigen orale microflora. Deze bestaat uit protozoa,

schimmels, virussen en vooral bacteriën. Bij een gezonde volwassen persoon is de samenstelling van

de microflora vrij constant. Deze omvat ongeveer 20 bacteriefamilies, die allen weer verschillende

species kennen. In totaal komen ongeveer 300 verschillende bacteriën in de mond [15]. Sommige

auteurs spreken zelfs van meer dan 600 verschillende bacteriënspecies [11]. De mond bestaat uit een

aantal milieus (habitats), zoals tandoppervlak, gingivale weefsels, etc.. Elke habitat ondersteunt de

groei van bepaalde bacteriënpopulaties en heeft een specifieke ‘microbial community’ [19]. Deze

microbiële gemeenschap kan door een aantal factoren verstoord worden zoals mondhygiëne,

eetgewoonten, chemotherapie [20]. Microbiële kolonisatie start bij de geboorte.

Figuur 3. Naar figuur 5-3. Ongunstige eigenschappen van tandplaque [21].

Tandplaque is een biofilm dat op alle oppervlakken in de mond, in het bijzonder op harde

oppervlakken, voorkomt. Het zit vast op de het tandoppervlak en kan er niet van worden afgespoeld.

Het bestaat voor meer dan 70% uit bacteriën. In één milligram plaque komen er meer dan 108

bacteriecellen voor [21]. De vorming van tandplaque is een complex dynamisch proces. De eerste stap

in de ontwikkeling van de plaque is de vorming van een ‘pellicle’ laag. Pellicle zijn speekseleiwitten

die geabsorbeerd worden aan het tandoppervlak. Hieraan kunnen bacteriën zich hechten. Na twee


8

dagen is een groot deel van het tandoppervlak bedekt met bacteriën. De eerste bacteriesoorten die

worden waargenomen zijn voornamelijk Streptococcen. Vervolgens zien we andere Gram-positieve

bacteriën. Deze maken het mogelijk dat de Gram-negatieve bacteriën zich aan het tandoppervlak

kunnen hechten. Na enkele dagen wordt de samenstelling van de plaque steeds complexer. Naarmate

de plaque toeneemt en ouder wordt, neemt het aantal bacteriënsoorten toe, wordt de plaque steeds

Gram-negatiever en wordt de samenstelling steeds meer anaëroob [15,21]. Tandplaque speelt een zeer

belangrijke rol in het ontstaan en evolutie van orale ziektebeelden (figuur 3).

Cariës is het resultaat van een verstoring van het evenwicht tussen demineralisatie en remineralisatie

van tandmateriaal. Demineralisatie treedt op wanneer tandplaquebacteriën fermenteerbare suikers

afbreken tot zuren. Bij de pH-waarden waarbij glazuur in oplossing gaat (pH 5,5-4,0) zijn de

Lactobacilli en Streptococci mutans belangrijke zuurvormers [21]. Men ziet dat de proporties

Streptococci mutans en Lactobacilli verhoogd zijn in carieuze laesies [20,21].

Parodontitis is een groep van inflammatoire ziektebeelden waarbij het aanhechtingsweefsel en het

ondersteunende bot rondom de tand zijn beschadigd. De initiatie en de progressie van parodontitis zijn

afhankelijk van de aanwezigheid van parodontaal virulente micro-organismen. Alhoewel bacteriën de

initiërende agentia zijn, is ook de immuunrespons van de gastheer op de infectie van belang bij de

ziekteprogressie [11]. De relatie tussen plaque en gingivitis is aangetoond in een experimenteel

gingivitisonderzoek [22]. De flora van parodontale pockets bestaat voornamelijk uit aërobe en

anaërobe Gram-positieve kokken en eventueel aërobe en anaërobe Gram-negatieve staafjes [15].


9

3 Doelstellingen.

De doelstellingen van deze masterproef waren zowel analytisch als klinisch van aard.

Een eerste doelstelling was om de analytische aspecten van de flowcytometer Sysmex UF-1000i® in

verband met speeksel in kaart te brengen. Er werd gekeken hoe nauwkeurig (within-run

variatiecoëfficiënt) de flowcytometer Sysmex UF-1000i® was bij het meten van de cellulaire inhoud

van speeksel. Een tweede aspect was inzicht verwerven in de biologische variabiliteit, zowel op korte

termijn als middellange termijn. Er werd geopteerd om deze variabiliteit te bekijken gedurende één

dag en gedurende drie weken.

Een tweede doelstelling was om na te gaan wat de invloed was van tijd, temperatuur en het poetsen

van de mond als pre-analytische variabelen. Uit deze gegevens kon dan bekeken worden wat de beste

manier was om speekselstalen af te nemen en te bewaren.

Een derde doelstelling was het opstellen van referentiewaarden voor speeksel. De bekomen gegevens

werden vervolgens in functie van de mondgezondheid beschouwd. Zo werd er gekeken of er

significante verschillen konden teruggevonden worden tussen de gezonde populatie en de populatie

met dentale en/of parodontale problemen. Er werd nagegaan of er naast die verschillen ook gradaties

konden gevonden worden tussen de cellulaire inhoud van speeksel en de ernst van de dentale en/of

parodontale problematiek. Vervolgens werden er statistische modellen opgesteld.

Een vierde doelstelling was het bekijken of deze bekomen resultaten konden gebruikt worden als

klinisch instrument bij het analyseren van de mondgezondheid. Er werd bijzondere aandacht gevestigd

op het aantal witte bloedcellen en de aanwezigheid van parodontale ontstekingen.


10

4 Methodologie.

4.1 Vrijwilligers.

De speekselafname gebeurde bij gezonde personen die op het moment van afname geen medicatie

namen en minimum 18 jaar oud waren. Hun toestemming werd schriftelijk vastgelegd via een

informed consent formulier (bijlage 1). De recruitering van de patiënt gebeurde bij de intakekliniek en

recall kliniek van polikliniek 8, Universitair Ziekenhuis (UZ) Gent.

4.2 Speekselafname.

De vrijwilligers bevonden zich bij afname in een staande of zittende houding, telkens met het hoofd in

een rechte positie. Het speeksel werd gestimuleerd afgenomen door middel van het kauwen op een

paraffinetablet. Deze zijn commercieel verkrijgbaar in een CRT test set® (Ivoclar Vivadent,

Liechtenstein). Elk staal werd opgevangen in een steriel recipiënt van 50 ml.

Er werd gedurende exact drie minuten gecollecteerd. Op het moment dat de paraffinetablet in de mond

werd geplaatst, werd de timer gestart. Bij het verstrijken van de drie minuten werd het resterende

speeksel nog een laatste maal in het recipiënt gedeponeerd.

Het recipiënt werd vervolgens afgesloten en bewaard in een koelkast op +4°C. Er werd na een

maaltijd, na mondhygiëne of na gebruik van kauwgom minstens één uur gewacht op collectie. De

speekselstalen werden binnen de 6 uur geanalyseerd [23].

4.3 Testprocedure Sysmex UF-1000i®.

Het speekselstaal werd eerst manueel geschud gedurende 3 seconden en werd vervolgens via een pipet

met gele tip (yellow tip for automatic pipette Eppendorf-Gilson-Brand-Socorex type. Vol. 0:200 l)

overgebracht in een kegelproefbuis. Deze pipet werd tegen de bodem gehouden van het steriel

recipiënt. De proefbuis werd afgesloten met een afsluitdop en vervolgens gedurende twintig seconden

gevortexed met het Scientific Industries Vortex-Genie 2®

toestel.

Het speekselstaal werd vervolgens manueel getest op de flowcytometer Sysmex UF-1000i®. Elk

speekselstaal werd zo hoog mogelijk naar boven gebracht totdat de opzuignaald van de Sysmex UF-

1000i® contact maakte met de bodem van de kegelproefbuis. Na elk staal werd de flowcytometer

Sysmex UF-1000i® gespoeld met fysiologisch water (NaCl 0,9% van B. Braun

®). Na analyse van het

laatste speekselstaal werd de flowcytometer door middel van een ‘auto rinse’ spoelprocedure proper

gemaakt.


11

4.4 De reproduceerbaarheid van de Sysmex UF-1000i® (within-run

variatiecoëfficiënt).

Er moest voldoende speeksel (meer dan 6,4 ml) in het steriel recipiënt aanwezig zijn om de

testprocedure acht maal te kunnen vervolledigen. Tussen elke test werd het staal gedurende twintig

seconden gevortexed met het Scientific Industries Vortex-Genie 2®

toestel. Het speekselstaal werd

acht maal na elkaar getest zoals bovenstaand beschreven in paragraaf 4.3. In totaal werden tien

speekselstalen van tien verschillende gezonde personen op bovenstaande manier getest.

4.5 Bepalen van de biologische variabiliteit gedurende één dag (between-run


Er werden speekselstalen genomen om 9 uur, 12 uur, 15 uur en 17 uur. Gedurende exact drie minuten

werd speeksel afgenomen onder stimulatie van een paraffinetablet. Deze stalen werden bewaard op

kamertemperatuur en binnen het uur geanalyseerd op de flowcytometer Sysmex UF-1000i® zoals

beschreven in paragraaf 4.3. De steekproef bestond uit tien verschillende personen waarvan 5 vrouwen

en 5 mannen waren. De gemiddelde leeftijd van de vrouwen bedroeg 23,7 jaar (standaarddeviatie 5,4

jaar), die van de mannen was 25,4 jaar (standaarddeviatie 11,8 jaar). Deze personen waren zowel

dentaal als parodontaal gezond.

4.6 Bepalen van de biologische variabiliteit gedurende drie weken (between-run


Voor dit deelonderzoek werd er aan tien personen gevraagd die zowel dentaal als parodontaal gezond

waren om twee maal per week gedurende drie weken een speekselstaal te produceren op de wijze

beschreven in paragraaf 4.2. De speekselstalen werden elke maandag- en donderdagavond afgenomen.

Deze werden bewaard op kamertemperatuur en binnen het uur getest op de flowcytometer Sysmex

UF-1000i®. De populatie bestond uit tien verschillende personen waarvan zeven mannen en drie

vrouwen. De gemiddelde leeftijd was bij de vrouwen 34 jaar (standaarddeviatie 14,3 jaar) en bij de

mannen 40 jaar (standaarddeviatie 15,5 jaar).

4.7 Effect van de bewaring van de speekselstalen.

Er werd willekeurig aan tien verschillende gezonde patiënten gevraagd om een speekselstaal te

produceren. De steekproef bestond uit vijf vrouwen en vijf mannen. De gemiddelde leeftijd was bij de

mannen 25,4 jaar (standaarddeviatie 2,4 jaar) en bij de vrouwen 23,6 jaar (standaarddeviatie 2,1 jaar).

De speekselstalen werden afgenomen om 12 uur in de middag. Er moest een minimum van tien ml

speeksel aanwezig zijn in het recipiënt. De speekselafname vond plaats om 12u ’s middags.


12

Het speeksel werd gelijkmatig verdeeld over twee proefbuizen. Eén proefbuis werd bewaard op

kamertemperatuur (+20 graden Celsius, (°C)) en één proefbuis werd bewaard in de koelkast (+4

graden Celsius, (°C)). De verdeling van het speekselstaal gebeurde op de volgende manier: het

volledige recipiënt werd eerst gedurende twintig seconden gevortexed met het Scientific Industries

Vortex-Genie 2 toestel, vervolgens werd een hoeveelheid van twee milliliter opgezogen en per halve

milliliter gelijkmatig verdeeld over de twee proefbuizen. Dit werd gedaan tot het volledig staal

gelijkmatig werd verdeeld.

De verdeling van het speeksel en de eerste analyse vonden plaats binnen het uur na afname. De

speekselstalen werden nogmaals getest om 15 uur, 18 uur en 21 uur en nogmaals om 12 uur 's middags

de volgende dag, 24 uur later dan de eerste analyse.

Bij de analyses om 15 uur, 18 uur, 21 uur en 12 uur ’s middags de volgende dag moesten er telkens

per persoon twee speekselstalen getest worden: één bewaard in de koelkast (+4°C) en één bewaard op

kamertemperatuur (+20°C). Per persoon werden de twee kegelproefbuizen verzameld. Ze werden

beide apart voor testen gedurende twintig seconden gevortexed met het Scientific Industries Vortex-

Genie 2®

toestel. Vervolgens werd eerst de proefbuis uit de koelkast (+4°C) getest en direct erna

teruggeplaatst. Ten slotte werd de proefbuis op kamertemperatuur (+20°C) getest. Deze procedure

werd herhaald per persoon voor alle speekselstalen.

4.8 Tandenpoetsen als pre-analytische variabele.

Voor dit onderzoek werden aan achttien studenten tandheelkunde gevraagd om in totaal zes

speekselstalen te produceren. De achttien studenten werden verdeeld in drie groepen: groep A, groep

B en groep C. Er werden tijdens het verloop van één dag drie momenten van speekselafname

georganiseerd: moment 1, 2 en 3. Tussen elke moment zat een tijdspanne van negentig minuten.

Tijdens elk moment werden er twee speekselstalen geproduceerd zoals beschreven in paragraaf 4.2.

Tussen de twee stalen werd een pauze van tien minuten ingelast waarin de tanden al dan niet werden

gepoetst. In totaal waren er in dit studieonderdeel 108 speekselstalen.

Periode 1 Periode 2 Periode 3

Groep A Niet gepoetst Zonder Tandpasta

gepoetst Met Tandpasta gepoetst

Groep B Zonder Tandpasta

gepoetst Met Tandpasta gepoetst Niet gepoetst

Groep C Met Tandpasta gepoetst Niet gepoetst Zonder Tandpasta

gepoetst

Tabel 2. Studieprotocol tandpoetsen


13

Afhankelijk van de periode werd aan de studenten gevraagd om gedurende twee minuten de tanden te

poetsen met of zonder tandpasta. Dit werd exact getimed. Er werd geen onderscheid gemaakt tussen

verschillende poetstechnieken. De gebruikte tandpasta was Elmex anti-cariës met aminofluoride (1400

ppm) [24]. De speekselstalen werden bewaard in de koelkast (+4°C) en diezelfde dag nog

geanalyseerd.

4.9 Het mondonderzoek tijdens het cross-sectioneel onderzoek.

De speekselafname gebeurde zoals beschreven in paragraaf 4.2 en vond telkens plaats voor het

mondonderzoek. Bij het mondonderzoek werden drie zaken bekeken: cariës, gingivitis en tandplaque.

Het onderzoek gebeurde met een spiegel, wattenrollen en een parodontaal sonde.

Er werd gescreend op het aantal actieve cariëslaesies. Dat aantal werd genoteerd. Er werd niet gekeken

naar de grootte van de laesies. De Decayed, Missing, Filled (DMF-) index werd niet actief gescreend.

Het scoren van tandplaque gebeurde met behulp van de plaque index volgens Silness en Löe [25].

Deze index is gebaseerd op het meten van zowel zacht debris en gemineraliseerde afzettingen op de

volgende tanden (Ontbrekende tanden worden niet gesubstitueerd):

Figuur 4. Te meten tanden [25].

Aan elk vlak van de tanden (buccaal, linguaal, mesiaal en distaal) werd een score gegeven van 0-3.

Van deze scores werd per tand het gemiddelde berekend om zo een plaque-index te geven aan die

tand. Van al deze plaque-indices werd een globaal gemiddelde berekend. De tandplaquescore was het

cijfer voor de komma van dit gemiddelde.

Volgende scores en criteria werden gehanteerd om de tandoppervlakken te scoren:


14

Score Criteria

0 Geen tandplaque

1

Een laagje plaque dat vasthangt aan de vrije marginale gingiva en aan de aangrenzende

tandzone. De tandplaque mag in situ enkel te zien zijn na applicatie van plaqueverklikker of

na het gebruik van een sonde op het tandoppervlak.

2 Milde accumulatie van een zacht laagje in de gingivale pocket, of aan de tand en marginale

gingiva die te zien is met het blote oog.

3 Overvloed aan zacht materiaal in de gingivale pocket en/of op de tand en aan de marginale

gingiva.

Tabel 3. Scores en criteria van de Silness en Löe plaque index [25].

Voor gingivitis werd de Dutch Periodontal Screening Index (DPSI) gebruikt. Dit is een screening

index die een schatting maakt van de gingivale/parodontale toestand. Het deelt een populatie patiënten

in categorieën volgens hun parodontale conditie [26].

Er zijn zes sextanten:

Sextant 1 gebitselementen 1.8 t.e.m. 1.4






Tabel 4. Verdeling gebitselementen over de sextanten.

Er wordt per sextant gescoord volgens onderstaande criteria:

DPSI score Bloeding / Tandsteen Pockets

0 geen bloeding of tandsteen EN < 4 mm

1 bloeding EN < 4 mm

2 bloeding + tandsteen EN < 4 mm

3- bloeding EN ≥ 4 mm, < 6 mm

3+ bloeding + recessie op meetplaats EN ≥ 4 mm, < 6 mm

4 bloeding EN ≥ 6 mm

Tabel 5. scores Dutch Periodontal Screening Index [26].


15

SEXT. 1 (score 0-4) SEXT. 2 (score 0-4) SEXT. 3 (score 0-4)

SEXT. 4 (score 0-4) SEXT. 5 (score 0-4) SEXT. 6 (score 0-4)

Tabel 6. Bepalen van DPSI – index.

De hoogste score is gelijk aan de DPSI - index.

De DPSI-index werd voor dit onderzoek aangepast tot een “Graad van Gingivitis” of gingivitisscore.

Hierbij werd van elke sextant de hoogste score genomen. Achteraf werd van alle sextanten samen het

gemiddelde berekend. Afhankelijk van de waarde van dit gemiddelde werd volgens tabel 7 een

gingivitisscore toegekend.

Gingivitisscore Gemiddelde sextanten DPSI-index

0 Gemiddelde is element van [0;1[



3 Gemiddelde is element van [3;4]

Tabel 7. Classificatie Gingivitisscore

4.10 Statistische verwerking.

Alle data werden direct bewaard in een databank (Microsoft Excel, versie 2007) en werden verwerkt

met behulp van het programma ‘Statistical Product and Service Solutions (SPSS, versie 21)’. Een p-

waarde kleiner dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Een p-waarde groter dan 0,05

wordt beschouwd als niet-significant en staat aangeduid met de afkorting NS.

De reproduceerbaarheid van de flowcytometer Sysmex UF-1000i® en de biologische variabiliteit

werden uitgedrukt als variatiecoëfficiënten. Voor elk speekselstaal en voor elk individu werden de

gemiddelden en de standaarddeviaties berekend. Hieruit werden de variatiecoëfficiënten afgeleid. De

gemiddelden van deze variatiecoëfficiënten werden beschouwd als de within-run variatiecoëfficiënten

en de between-run variatiecoëfficiënten voor de parameters gemeten door de Sysmex UF-1000i®.

De vergelijking van de gegevens bekomen uit de speekselstalen bewaard in de koelkast (+4°C) met

deze bewaard op kamertemperatuur (+20°C), gebeurde met een gepaarde Wilcoxon signed rank test.

De gegevens zijn visueel voorgesteld met behulp van Box-and-Whisker plots (figuur 5-8).

Om de invloed van de tijd en temperatuur in te schatten op de bewaarde speekselstalen, werden

intervallen berekend voor alle baselinewaarden van de tien speekselstalen voor elke parameter. Deze


16

intervallen hadden als onder- en bovengrenzen de baselinewaarden die respectievelijk werden

verminderd of vermeerderd met tweemaal de within-run variatiecoëfficiënt voor de desbetreffende

parameter. Een op een later tijdstip gevonden waarde die geen element was van het baseline-interval,

werd als afwijkend beschouwd.

Aan de hand van een gepaarde Wilcoxon signed rank test werden de gegevens van de verschillende

poetsmethoden vergeleken. Deze gegevens werden visueel voorgesteld met behulp van Box-and-

Whisker plots (figuur 9-12). Hier werden op de x-as de zes speekselstalen geplaatst met telkens de

vermelding welke periode van het experiment werd vervuld. Voor de rode bloedcellen werd eerst een

logaritmische omzetting uitgevoerd. Deze omzetting gaf grafisch een beter interpreteerbaar beeld. De

baselinewaarden werden voor elke parameter vergelijken met een Kruskal-Wallis test.

In het cross-sectioneel onderzoek werden referentiewaarden opgesteld. Deze waarden werden

voorgesteld met behulp van de mediaan, het 2,5ste

percentiel en het 97,5ste

percentiel, uitgedrukt per 10-

6L. De verdeling van het aantal gegevens volgens geslacht en volgens parodontale gezondheid werden

weergegeven door histogrammen. Met behulp van een Mann-Whitney U test en Chi kwadraat testen

werd nagegaan of er statistisch significante verschillen konden gevonden worden tussen de

verschillende parameters bij een verdeling van de steekproefpopulatie volgens geslacht en parodontale

gezondheid.

Een binaire logistisch regressiemodel werd opgesteld om de gegevens volgens parodontale gezondheid

te bekijken, zijnde een gezonde populatie en een populatie met gingivitis.

Een multinomiaal logistisch regressiemodel werd opgesteld om de significantie van het gevonden

verband na te gaan tussen de parodontale toestand en het aantal witte bloedcellen, de leeftijd en de

hoeveelheid tandplaque. Het verband werd kwantitatief door Cox & Snell, Nagelkerke en McFadden

determinatiecoëfficiënten weergegeven en werd visueel door een Box-and-Whisker plot voorgesteld

[27].

Een receiver operating characteristic (ROC) curve werd gebruikt om de diagnostische waarde van

gevonden verbanden visueel voor te stellen. Het afkappingspunt is met een zwarte pijl weergegeven op

de figuur en stelt de waarde voor die het dichtst bij het punt ligt dat een sensitiviteit en een specificiteit

van honderd percent heeft.


17

5 Resultaten.

5.1 Analytische aspecten

5.1.1 De reproduceerbaarheid van de Sysmex UF-1000i®

(within-run variatiecoëfficiënt).

Voor elk speekselstaal werden volgende gemiddelden, standaarddeviaties en within-run

variatiecoëfficiënten gevonden:

RBC WBC EC BACT

M SD CV M SD CV M SD CV M SD CV

STAAL (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %)

1 65 24 37 328 17 5 281 14 5 11 800 1 140 10

2 69 9 13 1 860 111 6 645 32 5 46 400 3 070 7

3 1 096 109 10 974 102 11 615 24 4 29 500 664 2

4 90 9 10 458 26 6 392 10 3 29 600 871 3

5 168 283 22 1 720 223 13 1230 44 4 38 200 3 940 10

6 29 4 14 361 37 10 459 25 6 14100 641 5

7 167 10 6 700 31 4 818 102 13 4 410 835 19

8 18 2 11 352 14 4 349 16 5 14 600 625 4

9 15 2 11 197 6 3 235 10 4 4 980 219 4

10 17 1 8 330 35 11 671 51 8 10 900 374 3

Tabel 8. Gemiddelden (M), standaarddeviaties (SD) en within-run variatiecoëfficiënten (CV) van het aantal rode

bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT) van elk speekselstaal.

De gemiddelden van de variatiecoëfficiënten uit tabel 8 werden beschouwd als de within-run

variatiecoëfficiënten van de Sysmex UF-1000i®

voor de gemeten parameters. Deze staan vermeld in

tabel 9 met respectievelijk hun standaarddeviatie en 95% betrouwbaarheidsinterval.

Within-run CV SD 95% BI

(in %) (in %) (in %)

RBC 14,0 9,0 8,5 - 19,6

WBC 7,3 3,5 5,1 - 9,4

EC 5,5 2,8 3,7 - 7,2

BACT 6,7 5,1 3,6 - 9,9

Tabel 9. Within-run variatiecoëfficiënten (CV), standaarddeviaties (SD) en 95%-betrouwbaarheidsinterval (95%

BI) voor de Sysmex UF-1000i® voor rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en

bacteriën (BACT).


18

5.1.2 Between-run variatiecoëfficiënt gedurende één dag.

Voor alle individuen werden volgende gemiddelden, standaarddeviaties en within-run


RBC WBC EC BACT


n (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %)

1 324 413 128 1 200 598 50 673 99 15 40 700 18 900 47

2 479 609 127 1 770 919 52 1 300 744 57 36 700 12 500 34

3 229 188 82 2 830 1 770 63 1 270 252 20 15 000 13 000 87

4 128 41 32 2 610 474 18 2 130 1 140 54 33 100 15 200 46

5 149 111 74 1 700 167 10 563 62 11 12 500 950 8

6 110 75 68 525 89 17 428 116 27 12 500 1 840 15

7 127 85 67 538 191 36 607 209 35 20 300 5 520 27

8 584 935 160 2 445 255 10 2 190 449 21 41 200 16 300 40

9 30 19 62 495 258 52 421 123 29 2 100 1 220 58

10 46 38 83 821 318 39 1 250 270 22 10 200 5 910 58

Tabel 10. Gemiddelden (M), standaarddeviaties (SD) en between-run variatiecoëfficiënten (CV) gedurende één

dag van het aantal rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT)

voor elk individu (n).

De gemiddelden van de variatiecoëfficiënten uit tabel 10 werden beschouwd als de between-run


gedurende één dag voor de gemeten parameters. Deze

staan vermeld in tabel 11 met respectievelijk hun standaarddeviatie en 95% betrouwbaarheidsinterval.

Between-run CV SD 95% BI

(in %) (in %) (in %)

RBC 88,3 38,3 64,6 - 112,0

WBC 34,6 19,5 22,5 - 46,7

EC 29 15,6 19,3 - 38,6

BACT 41,8 23,1 27,5 - 56,1

Tabel 11. Between-run variatiecoëfficiënten (CV), standaarddeviaties (SD) en 95%-betrouwbaarheidsinterval

(95% BI) voor rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT)

gedurende één dag.


19

5.1.3 Between-run variatiecoëfficiënt gedurende drie weken.

Voor alle individuen werden volgende gemiddelden, standaarddeviaties en within-run


RBC WBC EC BACT


n (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %) (/ 10-6L) (/ 10-6L) (in %)

1 32 39 123 699 324 46 378 142 38 6 270 3 850 61

2 20 4 19 440 202 46 384 106 28 6 050 1 700 28

3 62 63 101 478 75 16 505 206 41 11 400 4 030 35

4 378 517 137 793 373 47 1 250 639 51 12 600 7 700 61

5 82 64 79 804 332 41 699 267 38 13 400 11 200 83

6 448 564 126 511 112 22 481 221 46 10 700 4 090 38

7 180 173 96 676 236 35 382 69 18 4 960 1 410 28

8 110 107 97 516 306 59 415 188 45 13 000 6 670 52

9 38 29 76 392 142 36 340 111 33 15 300 8 090 53

10 115 72 62 1 280 519 41 641 205 32 11 400 1 890 17

Tabel 12. Gemiddelden (M), standaarddeviaties (SD) en between-run variatiecoëfficiënten (CV) gedurende drie

weken van het aantal rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën

(BACT) voor elk individu (n).

De gemiddelden van de variatiecoëfficiënten uit tabel 12 werden beschouwd als de between-run


gedurende drie weken voor de gemeten parameters.

Deze staan vermeld in tabel 13 met respectievelijk hun standaarddeviatie en 95%

betrouwbaarheidsinterval.

Between-run CV SD 95% BI

(in %) (in %) (in %)

RBC 91,6 34,7 70,1 - 113,1

WBC 38,9 12,7 31,1 - 46,8

EC 36,9 9,7 30,9 - 42,9

BACT 45,7 20,0 33,3 - 58,1

Tabel 13. Between-run variatiecoëfficiënten (CV), standaarddeviaties (SD) en 95%-betrouwbaarheidsinterval

(95% BI) voor rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT)

gedurende drie weken.


20

5.2 Pre-analytische aspecten.

5.2.1 Tijd en temperatuur

Voor alle parameters werden onderstaande Box-and-Whisker plots gevonden met daarbij telkens een

tabel met de resultaten van de Wilcoxon signed rank test.

Figuur 5. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal rode bloedcellen (per 10

-6L) uit elke periode tijdens

bewaring in de koelkast (+4°C) en bewaring op kamertemperatuur (+20°C). RECHTS: Tabel met p-waarden

(Wilcoxon signed rank test) bij vergelijking van het aantal rode bloedcellen (RBC) (per 10-6

L) bewaard in de

koelkast (+4°C) en op kamertemperatuur (+20°C).

Figuur 6. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal witte bloedcellen (per 10



(Wilcoxon signed rank test) na vergelijking aantal witte bloedcellen (WBC) (per 10-6

L) bewaard in de koelkast

(+4°C) en op kamertemperatuur (+20°C).

RBC p-waarden

Baseline NS

na 3 uur NS

na 6 uur NS

na 9 uur NS

na 24 uur NS

WBC p-waarden

Baseline NS

na 3 uur NS (0,06)

na 6 uur NS (0,06)

na 9 uur < 0,02

na 24 uur < 0,01


21

Figuur 7. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal epitheelcellen (per 10



(Wilcoxon signed rank test) na vergelijking aantal epitheelcellen (EC) (per 10-6

L) bewaard in de koelkast (+4°C)

en op kamertemperatuur (+20°C).

Figuur 8. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal bacteriën (per 10

-6L) uit elke periode tijdens bewaring

in de koelkast (+4°C) en bewaring op kamertemperatuur (+20°C). RECHTS: Tabel met p-waarden (Wilcoxon

signed rank test) na vergelijking aantal bacteriën (BACT) (per 10-6

L) bewaard in de koelkast (+4°C) en op

kamertemperatuur (+20°C).

EC p-waarden

Baseline NS

na 3 uur NS

na 6 uur NS

na 9 uur NS

na 24 uur < 0,02

BACT p-waarden

Baseline NS

na 3 uur < 0,02

na 6 uur < 0,01

na 9 uur < 0,01

na 24 uur < 0,01


22

Bij de vergelijking van de methode van bewaring voor het aantal rode bloedcellen was er na 24 uren

geen statistisch significant verschil. Voor het aantal epitheelcellen was er bij de meting na 24 uren wel

een significant verschil. Voor het aantal bacteriën en het aantal witte bloedcellen was er een statistisch

significant verschil op te merken respectievelijk na drie en negen uren. Bij de bewaring van de witte

bloedcellen viel de randsignificantie na drie en zes uren op (p-waarde = 0,06) tussen bewaring op

+4°C en +20°C.

Op de Box-and-Whisker plots van de rode bloedcellen en epitheelcellen werd quasi een status quo

gezien van het aantal cellen bij zowel + 4°C als + 20°C. Dit stond in contrast met de stijging van het

aantal bacteriën bij bewaring op +4°C en +20°C. Bij bewaring op +4°C was deze stijging van het

aantal bacteriën minder fel uitgesproken dan bij bewaring op +20°C. Op de Box-and-Whisker plot van

het aantal witte bloedcellen was te zien dat de waarden bij bewaring op + 20°C stegen t.o.v. de

baselinewaarden. Deze stijging kan ook opgemerkt worden bij het aantal epitheelcellen maar ze is

kleiner.

In tabel 14 en 15 werd gezien dat de speekselstalen bewaard op een temperatuur van +4°C de eerste

zes uren geen significant verschil vertoonden met de baselinewaarden. Bij bewaring van de

speekselstalen op een temperatuur van +20°C waren er reeds na drie uren grote veranderingen

aanwezig in de waarden van het aantal cellen.


23

Resultaten bewaring speekselstalen in de koelkast (+4°C).

De baselinewaarden (baseline) en het berekend interval werden hieronder weergegeven. Het kruis (x) gaf aan in welke periode een waarde (verschil) werd

teruggevonden die geen element was van het baseline-interval. De grijze schaduw gaf de tijdsduur weer waarin bewaring zonder afwijkende resultaten

mogelijk is.

RBC WBC EC BACT

STAAL waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

1 baseline 27 19 - 34

580 493 - 667

840 748 - 933

27 400 23 900 - 31 000

verschil 23

x 605

x 837

x 27 500

x

2 baseline 40 29 - 52

970 825 - 1 120

536 477 - 595

20 200 17 600 - 22 900

verschil 29

x

1 110

x 525

x 25 400

x

3 baseline 16 11 - 20

639 543 - 734

440 391 - 488

9 970 8 700 - 11 300

verschil 15

x 527

x

393

x

10 500

x

4 baseline 22 16 - 28

420 357 - 483

559 497 - 620

2 540 2 210 - 2 870

verschil 23

x 347

x

486

x

2 890

x

5 baseline 25 18 - 32

1 550 1 320 - 1 790

1 130 1 000 - 1 250

21 600 18 800 - 24 400

verschil 17

x

1 310

x

1 170

x 24 000

x

6 baseline 20 14 - 25

797 678 - 917

584 519 - 648

22 200 19 300 - 25 100

verschil 15

x

686

x 563

x 25 300

x

7 baseline 57 41 - 73

1 780 1 520 - 2 050

1 460 1 300 - 1 620

37 900 33 000 - 42 800

verschil 48

x 1 610

x 1 560

x 42 900

x

8 baseline 140 100 - 179

270 230 - 311

193 172 - 214

3 400 2 960 - 3 840

verschil 152

x 192

x

182

x 3 970

x

9 baseline 117 85 - 150

991 843 - 1 140

757 674 - 840

7 580 6 590 - 8 560

verschil 122

x 937

x 767

x 7 840

x

10 baseline 25 18 - 32

834 709 - 959

1 010 897-1 120

31 500 27 400 - 35 600

verschil 20

x 776

x 1 080

x 31 400

x

Tabel 14. Resultaten bewaring speekselstalen in de koelkast (+4°C) (baseline = baselinewaarde, verschil = waarde die geen element is van het baseline-interval, GV = geen

verschil, RBC = rode bloedcellen, WBC = witte bloedcellen, EC = epitheelcellen, BACT = bacteriën).


24

Resultaten bewaring speekselstalen op kamertemperatuur (+20°C).

De baselinewaarden (baseline) en het berekend interval werden hieronder weergegeven. Het kruis (x) gaf aan in welke periode een waarde (verschil) werd

teruggevonden die geen element was van het baseline-interval. De grijze schaduw gaf de tijdsduur weer waarin bewaring zonder afwijkende resultaten

mogelijk is.

RBC WBC EC BACT

STAAL waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

waarde

(/10-6L)

interval

(/10-6L) 3u 6u 9u 24u GV

1 baseline 22 16 - 28 572 486 - 658 810 721 - 899 28 500 24 800 - 32 200

verschil 30

x 662

x

910

x 33 400

x

2 baseline 37 27 - 47 1 110 946 - 1 280 556 495 - 618 20 800 18 100 - 23 500

verschil 30

x 1 290

x 714

x 33 100

x

3 baseline 16 12 - 21 607 516 - 698 424 377 - 471 9 830 8 560 - 11 100

verschil 13

x 650

x 489

x 14 520

x

4 baseline 19 13 - 24 417 355 - 480 487 433 - 540 2 170 1 890 - 2 450

verschil 24

x

343

x 414

x 3 090

x

5 baseline 26 19 - 33 1 420 1 210 - 1 640 1 060 940 - 1 170 20 500 17 800 - 23 200

verschil 24

x 1 580

x 1 270

x 25 700

x

6 baseline 19 14 - 25 751 638 - 864 556 495 - 617 20 300 17 600 - 22 900

verschil 22

x 783

x 629

x 27 400

x

7 baseline 58 41 - 74 1 760 1 500 - 2 030 1 450 1 290 - 1 610 35 900 31 200 - 40 500

verschil 53

x 1 830

x 1 680

x 45 300

x

8 baseline 136 98 - 175 280 238 - 322 189 168 - 210 3 280 2 850 - 3 710

verschil 100

x 192

x 187

x 6 660

x

9 baseline 106 76 - 136 1 020 868 - 1 170 763 679 - 846 7 760 6 750 - 8 760

verschil 146

x 1 190

x 809

x 10 800

x

10 baseline 21 15 - 27 824 701 - 948 1 050 932 - 1 160 27 900 24 300 - 31 600

verschil 28

x

998

x 1 160

x 38 600

x

Tabel 15. Resultaten bewaring speekselstalen op kamertemperatuur (+20°C) (baseline = baselinewaarde, verschil = waarde die geen element is van het baseline-interval, GV

= geen verschil, RBC = rode bloedcellen, WBC = witte bloedcellen, EC = epitheelcellen, BACT = bacteriën).


25

5.2.2 Tandenpoetsen.

Figuur 9. LINKS: Box-and-Whisker plot: de

10log-waarden van het aantal rode bloedcellen (per 10

-6L) tijdens

het experiment tandenpoetsen. RECHTS: Tabel BOVEN: resultaten Wilcoxon signed ranks test na vergelijking

van het aantal rode bloedcellen (RBC) (per 10-6

L) van elk baseline staal met het staal na 10 min voor elke

testprocedure. Tabel ONDER: resultaten Kruskal-Wallis test na vergelijking baseline waarden van rode

bloedcellen (per 10-6

L) (Niet = zonder tandenpoetsen, ZTP= zonder tandpasta gepoetst, MTP= met tandpasta

gepoetst).

Figuur 10. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) tijdens het experiment

tandenpoetsen. RECHTS: Tabel BOVEN: resultaten van Wilcoxon signed ranks test na vergelijking van het

aantal witte bloedcellen (WBC) (per 10-6

L) van elk baseline staal met het staal na 10 min voor elke

testprocedure. Tabel ONDER: resultaten Kruskal-Wallis test na vergelijking baseline waarden van witte

bloedcellen (per 10-6

L) (Niet = zonder tandenpoetsen, ZTP= zonder tandpasta gepoetst, MTP= met tandpasta

gepoetst).

RBC Wilcoxon

p-waarden

Niet < 0,01

ZTP 0,001

MTP < 0,001

RBC Kruskal Wallis

p-waarde

< 0,02

WBC Wilcoxon

p-waarden

Niet < 0,04

ZTP 0,001

MTP NS

WBC Kruskal Wallis

p-waarde

< 0,03


26

Figuur 11. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal epitheelcellen (per 10



aantal epitheelcellen (EC) (per 10-6

L) van elk baseline staal met het staal na 10 min voor elke testprocedure.

Tabel ONDER: resultaten Kruskal-Wallis test na vergelijking baseline waarden van epitheelcellen (per 10-6

L)

(Niet = zonder tandenpoetsen, ZTP = zonder tandpasta gepoetst, MTP = met tandpasta gepoetst).

Figuur 12. LINKS: Box-and-Whisker plot van het aantal bacteriën (per 10



aantal bacteriën (BACT) (per 10-6

L) van elk baseline staal met het staal na 10 min voor elke testprocedure. Tabel

ONDER: resultaten Kruskal-Wallis test na vergelijking baseline waarden van bacteriën (per 10-6

L) (Niet =

zonder tandenpoetsen, ZTP = zonder tandpasta gepoetst, MTP = met tandpasta gepoetst).

EC Wilcoxon

p-waarden

Niet NS

ZTP < 0,001

MTP NS

EC Kruskal Wallis

p-waarde

NS

BACT Wilcoxon

p-waarden

Niet NS

ZTP < 0,01

MTP < 0,001

BACT Kruskal Wallis

p-waarde

NS


27

Tijdens de periode dat er niet werd gepoetst, werd een statistisch significant verschil gevonden bij het

aantal rode bloedcellen en het aantal witte bloedcellen. In de periode dat er gepoetst werd zonder

tandpasta, werden voor het aantal cellen van alle parameters de grootste statistisch significante

verschillen gevonden. Bij het poetsen met tandpasta werd enkel voor het aantal rode bloedcellen en het

aantal bacteriën een statistisch significant verschil gevonden.

Uit de Box-and-Whisker plots zijn een aantal zaken af te leiden.

Ten eerste varieerden de baseline waarden bij het aantal epitheelcellen en het aantal bacteriën niet

veel. De resultaten van de Kruskal-Wallis test onderbouwden dit. Bij het aantal rode bloedcellen en het

aantal witte bloedcellen was deze stelling niet van toepassing (figuur 9-12).

Ten tweede lag het aantal cellen van alle parameters na het poetsen zonder tandpasta betrekkelijk lager

in vergelijking met de baselinewaarden. Dit was statistisch merkbaar aan de hand van de significante

p-waarden van de Wilcoxon signed ranks test.

Ten derde waren de waarden van het aantal rode bloedcellen na het poetsen met tandpasta sterk

gestegen, het aantal bacteriën was sterker gedaald. Merk hierbij op dat de spreiding van het aantal

bacteriën bij het poetsen met tandpasta kleiner is in vergelijking met de waarden van het aantal

bacteriën tijdens de andere poetsprocedures. Het aantal witte bloedcellen steeg na het poetsen met

tandpasta en het aantal epitheelcellen daalde, maar deze verschillen waren niet statistisch significant.


28

5.3 Diagnostische aspecten.

5.3.1 Referentiewaarden en exploratieve data-analyse.

Parameter

(/10-6

L)

Over-all (n=249) Mannen (n=128) Vrouwen (n=121)

m P 2,5 P 97,5 m P 2,5 P 97,5 m P 2,5 P 97,5

RBC 61 9 1 290 66 10 1 630 57 8 940

WBC 1 171 167 4 610 1 160 227 4 920 1 190 82 4 610

EC 762 160 2 510 783 160 2 630 736 152 2 310

BACT 20 500 451 83 900 24 000 120 92 400 17 700 451 70 300

Tabel 16. Referentiewaarden (m = mediaan, P 2,5 = 2,5ste

percentiel, P 97,5 = 97,5ste

percentiel) voor het aantal

rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), epitheelcellen (EC) en bacteriën (BACT) (per 10-6

L).

Figuur 13. LINKS: Histogram met de verdeling van leeftijd (in jaren) van steekproefpopulatie (n=249) volgens

geslacht (128 mannen en 121 vrouwen). RECHTS: Tabel met resultaten na vergelijking verschillende

parameters van Sysmex UF-1000i®, aanwezigheid van gingivitis, hoeveelheid tandplaque, aanwezigheid van

cariës en aantal gebitselementen tussen beide geslachten voor de volledige steekproefpopulatie.

Het aantal bacteriën lag statistisch significant hoger bij de mannen dan bij de vrouwen. Voor de andere

variabelen werden geen significante verschillen opgemerkt tussen beide geslachten.

De gemiddelde leeftijd van de steekproefpopulatie bedroeg 35,1 jaar met een standaarddeviatie van

14,5 jaar. Een gemiddelde leeftijd van 36,2 jaar (standaarddeviatie = 14,7) werd genoteerd voor de

vrouwen en 34,2 jaar (standaarddeviatie = 14,4) voor de mannen.

Parameter p-waarden

Rode bloedcellen NS

Witte bloedcellen NS

Epitheelcellen NS

Bacteriën < 0,05

Parameter p-waarden

Gingivitis NS

Tandplaque NS

Cariës NS

Gebitselementen NS


29

Figuur 14. Scatterplot met het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) als afhankelijke variabele en het aantal

epitheelcellen (per 10-6

L) als onafhankelijke variabele voor de volledige steekproefpopulatie (R = Pearson

correlatiecoëfficiënt, R2 = determinatiecoëfficiënt).

Lineaire regressie

p-waarde < 0,001

Coëfficiënten

R 0,61

R2 0,37


30


volgens de aanwezigheid van gingivitis.

a. Volledige steekproef.

Figuur 15. LINKS: Histogram met verdeling van leeftijd (in jaren) van de volledige steekproefpopulatie (n=249)

volgens parodontaal ziektebeeld (159 gezond en 90 met gingivitis). RECHTS: Tabel met resultaten na

vergelijking verschillende parameters van Sysmex UF-1000i®, hoeveelheid tandplaque, aanwezigheid van cariës

en aantal gebitselementen tussen parodontaal gezonde en ongezonde individuen bij de volledige steekproef.

Het aantal bacteriën en gebitselementen lagen bij de populatie met gingivitis significant lager dan bij

de gezonde populatie. De hoeveelheid tandplaque en cariës lag significant hoger. Er werd geen

significant verschil opgemerkt tussen het aantal rode bloedcellen, witte bloedcellen en het aantal

epitheelcellen. Het gemiddelde aantal witte bloedcellen bij de gezonde populatie bedroeg 1330 cellen

per 10-6

L (standaarddeviatie = 1000/10-6

L) en 1800 cellen per 10-6


L)

bij de populatie met gingivitis.

b. Binair logistische regressie gezonde populatie versus populatie met gingivitis.

Voorspeld Percentage correct

Geobserveerd Gezond Met gingivitis

Gezond 144 13 91,7

Met gingivitis 17 70 80,5

Totale percentage 87,7

Tabel 17. Classificatietabel binair logistisch regressiemodel gezonde populatie versus populatie met gingivitis.

Tabel 17 geeft de kracht van het regressiemodel weer. Uit deze tabel blijkt dat 87,7 % van de gegevens

kan voorspeld worden aan de hand van onderstaand model. Uit dit model is gebleken dat de

aanwezigheid van gingivitis kan voorspeld worden aan de hand van leeftijd, de hoeveelheid

tandplaque, het aantal witte bloedcellen en het aantal bacteriën.

Parameter p-waarden

Rode bloedcellen NS

Witte bloedcellen NS

Epitheelcellen NS

Bacteriën < 0,001

Parameter p-waarden

Tandplaque < 0,001

Cariës < 0,001

Gebitselementen < 0,001


31

Codering categorische variabelen

Aantal Parameter codering

Plaque(1) Plaque(2) Plaque(3)

Graad Tandplaque

0 142 0 0 0

1 45 1 0 0

2 26 0 1 0

3 31 0 0 1

Tabel 18. Codering categorische variabele tandplaque voor gebruik in binair logistisch regressiemodel.

B S.E. Wald df p-waarde Exp(B)

Leeftijd 0,09 0,02 31,0 1 < 0,001 1,1

Tandplaque 33,0 3 < 0,001

Plaque(1) 1,60 0,54 8,77 1 0,003 5,0

Plaque(2) 3,47 0,77 20,4 1 < 0,001 32,0

Plaque(3) 2,68 0,63 18,4 1 < 0,001 14,6

WBC 0,001 < 0,001 9,60 1 < 0,002 1,0

BACT < 0,001 < 0,001 5,5 1 < 0,02 1,0

Constant -5,33 0,85 39,8 1 < 0,001 0,005

Tabel 19. Variabelen opgenomen in het binair logistisch regressiemodel. (Plaque(x) = zie tabel 18, WBC = witte

bloedcellen, BACT = bacteriën, B = regressiecoëfficiënt, S.E. = standard error, Wald = Wald Chi kwadraat test,

df = degrees of freedom en Exp(B) = Odds ratio).

c. Nader onderzoek van de significante variabelen uit het binair logistisch regressiemodel.

LEEFTIJD:

Figuur 16. LINKS: Histogram met verdeling van leeftijd (in jaren) van de steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar

(n=120) volgens parodontaal ziektebeeld (44 gezond en 76 met gingivitis). RECHTS. Tabel met resultaten na

vergelijking verschillende parameters van Sysmex UF-1000i®, hoeveelheid tandplaque, aanwezigheid van cariës

en aantal gebitselementen tussen parodontaal gezonde en ongezonde individuen bij de steekproef ouder dan 30

jaar.

Parameter p-waarden

Rode bloedcellen NS

Witte bloedcellen < 0,01

Epitheelcellen 0,001

Bacteriën < 0,02

Parameter p-waarden

Tandplaque < 0,001

Cariës < 0,001

Gebitselementen < 0,001


32

Bij de populatie ouder dan 30 jaar lag bij de populatie met gingivitis het aantal witte bloedcellen, het

aantal epitheelcellen, de hoeveelheid tandplaque en het aantal cariëslaesies significant hoger in

vergelijking met de gezonde populatie. Het aantal gebitselementen en het aantal bacteriën lagen

significant lager dan bij de gezonde populatie. Voor het aantal rode bloedcellen werd geen significant

verschil gevonden.

De gemiddelde leeftijd van de steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar bedroeg 48,2 jaar met een

standaarddeviatie van 10,4 jaar. Een gemiddelde leeftijd van 47,6 jaar (standaarddeviatie = 10,7 jaar)

werd genoteerd voor de vrouwen en 48,8 jaar (standaarddeviatie = 10,1 jaar) voor de mannen. Het

steekproefaantal (n) ouder dan 30 jaar bedroeg in totaal 120 individuen. De gemiddelde leeftijd van de

gezonde populatiegroep ouder dan 30 jaar (n = 44) was 29,0 jaar (standaarddeviatie = 11,5 jaar). Voor

de populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar (n= 76) was de gemiddelde leeftijd 46,0 jaar

(standaarddeviatie = 13,2 jaar).

De populatie ouder dan 30 jaar gaf de kleinste p-waarden. Bij de populaties ouder dan 25 jaar, 35 jaar,

40 jaar en 50 jaar namen de p-waarden opnieuw af (maar ze bleven wel statistisch significant).

Hetzelfde binair logistisch regressiemodel werd ook opgesteld voor de volledige populatie ouder dan

30 jaar. Een p-waarde voor de variabele leeftijd kleiner dan 0,02 werd gerapporteerd.

Figuur 17. Vergelijking aantal witte bloedcellen (per 10-6

L) na logaritmische omzetting tussen gezonde

populatie en populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar

Het gemiddeld aantal witte bloedcellen bedroeg bij de gezonde populatie 1000 cellen per 10-6

L

(standaarddeviatie = 660/10-6

L) en het gemiddelde voor de populatie met gingivitis bedroeg 1780

cellen per 10-6


L).


33

Figuur 18. Vergelijking aantal epitheelcellen (per 10-6

L) na logaritmische omzetting tussen gezonde populatie en

populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar.

Figuur 19. Vergelijking aantal bacteriën (per 10-6

L) na logaritmische omzetting tussen gezonde populatie en

populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar.

Het aantal bacteriën werd in het binair logistisch regressiemodel als statistisch significant bestempeld.

Bij de populatie met gingivitis lag het aantal bacteriën lager dan het aantal bacteriën van de gezonde

controlegroep. Merk op dat het aantal bacteriën bij de populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar

statistisch significant lager lag en dat de hoeveelheid tandplaque statistisch significant hoger lag dan

bij de gezonde populatie.


34

WITTE BLOEDCELLEN:

De receiver operating charateristic curve (ROC) curven voor het aantal witte bloedcellen in geval van

gingivitis staan hieronder vermeld. De curve met de grootste ‘area under the curve’ was de curve

berekend voor de populatie met gingivitis die ouder dan 50 jaar was.

Figuur 20. Receiver operating characteristic (ROC) curven voor het aantal witte bloedcellen (per 10-6

L) in geval

van gingivitis. LINKS: voor de populatie ouder dan 30 jaar. RECHTS: voor de populatie ouder dan 50 jaar.

Bij de populatie ouder dan 30 jaar werd bij een afkappingspunt van 1,1 x 103 witte bloedcellen per

10-6

L een sensitiviteit van 60% en een specificiteit van 64% gevonden. Voor de populatie ouder dan

50 jaar werd bij een afkappingspunt van 6,5 x 103 witte bloedcellen per 10

-6L een sensitiviteit van 75%

en een specificiteit van 58% gevonden.

ROC curve voor witte bloedcellen

bij populatie met gingivitis

Volledige populatie

AUC p-waarde 95% BI

0,55 NS 0,47-0,63

Populatie ouder dan 30 jaar

AUC p-waarde 95% BI

0,65 < 0,01 0,55 – 0,75


AUC p-waarde 95% BI

0,67 < 0,01 0,55 – 0,78


AUC p-waarde 95% BI

0,72 < 0,05 0,55 - 0,89

Tabel 20. Gegevens receiver operating characteristic (ROC) curven voor witte bloedcellen bij een populatie met

gingivitis ingedeeld volgens leeftijd (AUC = area under the curve; 95% BI = 95% betrouwbaarheidsinterval).


35

BACTERIËN:

Voor het aantal bacteriën werd onderstaande ROC-curve gerapporteerd in geval van gingivitis. Deze

curve verbeterde niet bij verschillende leeftijdscategorieën zoals bij het aantal witte bloedcellen.

Figuur 21. Receiver operating characteristic (ROC) curve voor het aantal bacteriën (per 10-6

L) in geval van

gingivitis bij de volledige steekproefpopulatie met rechts een tabel met de gegevens van de ROC-curve.


volgens de gingivitisscore.

a. Multinomiaal logistisch regressiemodel.

Model Fitting Information

Model Model Fitting Criteria Likelihood Ratio Tests

-2 Log Likelihood Chi-Square df p-waarde

Intercept Only 511,7

Final 321,4 190,3 15 0,001

Tabel 21. Model fitting informatie van het multinomiaal logistisch regressiemodel met gingivitisscore als

afhankelijke variabele, het aantal witte bloedcellen (WBC) en leeftijd als covarianten, en de hoeveelheid

tandplaque (PLAQUE) als factor.

Pseudo R

2

Cox and Snell 0,54

Nagelkerke 0,62

McFadden 0,37

Tabel 22. Determinatiecoëfficiënten (Pseudo R2) van het multinomiaal logistisch regressiemodel met

gingivitisscore als afhankelijke variabele, het aantal witte bloedcellen (WBC) en leeftijd als covarianten, en de

hoeveelheid tandplaque (PLAQUE) als factor.

Volledige populatie

AUC p-waarde 95% BI

0,321 < 0,001 0,25 - 0,39


36

Likelihood Ratio Tests

Effect Model Fitting Criteria Likelihood Ratio Tests

-2 Log Likelihood of Reduced Model Chi-Square df p-waarde

Intercept 321,4a < 0,001 0 .

WBC 341,7 20,3 3 < 0,001

LEEFTIJD 369,3 47,9 3 < 0,001

PLAQUE 391,9 70,6 9 < 0,001

De chi-square test is het verschil in -2 log-likelihoods tussen het finale model en een gereduceerd

model. Het gereduceerde model wordt gevormd door een effect uit het finale model uit te sluiten. De

nulhypothese is dat alle parameters van dat effect gelijk zijn aan 0.

a. Dit gereduceerde model is equivalent aan het finale model omdat de uitsluiting van het effect geen

verhoging geeft van het aantal vrijheidsgraden.

Tabel 23. Likelihood ratio tests van het multinomiaal logistisch regressiemodel met gingivitisscore als

afhankelijke variabele, het aantal witte bloedcellen (WBC) en leeftijd als covarianten, en de hoeveelheid

tandplaque (PLAQUE) als factor.

Schattingen van regressiecoëfficiënten

Graad Gingivitisa B S.E. Wald df p-waarde Exp(B)

95% BI voor Exp(B)

Ondergrens Bovengrens

1

Intercept -3,42 1,22 7,92 1 0,005

WBC < 0,001 < 0,001 0,92 1 NS 1,00 1,000 1,001

LEEFTIJD 0,07 0,02 12,07 1 0,001 1,07 1,03 1,11

[PLAQUE=0] -1,87 0,84 4,90 1 < 0,03 0,15 0,03 0,81

[PLAQUE=1] -0,11 0,90 0,02 1 NS 0,89 0,15 5,24

[PLAQUE=2] 1,24 1,10 1,29 1 NS 3,46 0,41 29,54

[PLAQUE=3] 0b 0

b 0

b 0 0

b 0

b 0

b 0

b

2

Intercept -3,55 1,15 9,56 1 0,002

WBC < 0,001 < 0,001 1,86 1 NS 1,00 1,000 1,001

LEEFTIJD 0,09 0,02 21,53 1 < 0,001 1,10 1,05 1,14

[PLAQUE=0] -3,69 0,80 21,26 1 < 0,001 0,03 0,005 0,12

[PLAQUE=1] -0,86 0,76 1,28 1 NS 0,42 0,01 1,89

[PLAQUE=2] 0,91 0,95 0,92 1 NS 2,49 0,39 16,00

[PLAQUE=3] 0b 0

b 0

b 0 0

b 0

b 0

b 0

b

3

Intercept -7,09 1,53 21,44 1 < 0,001

WBC 0,001 < 0,001 14,61 1 < 0,001 1,00 1,001 1,002

LEEFTIJD 0,14 0,03 28,46 1 < 0,001 1,15 1,089 1,20

[PLAQUE=0] -3,68 0,89 17,13 1 < 0,001 0,03 0,004 0,14

[PLAQUE=1] -1,53 0,98 2,43 1 NS 0,22 0,032 1,48

[PLAQUE=2] 0,81 1,06 0,59 1 NS 2,25 0,28 17,82

[PLAQUE=3] 0b 0

b 0

b 0 0

b 0

b 0

b 0

b

a. De referentie categorie is: 0

b. Deze parameter is op nul gezet omdat deze overbodig is..

Tabel 24. Variabelen opgenomen in het multinomiaal logistisch regressiemodel. ([PLAQUE=x] = hoeveelheid

tandplaque, WBC = witte bloedcellen, B = regressiecoëfficiënt, S.E. = standard error, Wald = Wald Chi

kwadraat test, df = degrees of freedom en Exp(B) = Odds ratio, 95% BI = 95% betrouwbaarheidsinterval).


37

b. Nader onderzoek van het aantal witte bloedcellen.

WITTE BLOEDCELLEN:

Figuur 22. LINKS: Box-and-Whisker plot. y-as: aantal witte bloedcellen (per 10

-6L), x-as: gingivitisscore.

RECHTS: Tabel BOVEN&MIDDEN: Resultaten multinomiaal logistisch regressiemodel met gingivitisscore als

afhankelijke variabele en met het aantal witte bloedcellen (per 10-6

L) als covariante. Tabel ONDER: resultaten

Mann-Whitney U test na vergelijking gingivitisscore 1-2-3 met gezonde populatie.

AANTAL WITTE BLOEDCELLEN PER TAND VERSUS DE GINGIVITISSCORE.

Figuur 23. LINKS: Box-and-Whiskerplot. y-as: aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) per tand, x-as:

gingivitisscore. RECHTS: Tabel met resultaten van het multinomiaal logistisch regressiemodel met

gingivitisscore als afhankelijke variabele en met het aantal witte bloedcellen (per 10-6

L) per gebitselement als

covariante.

Multinomiaal logistische regressie

p-waarde < 0,001

Determinatiecoëfficiënt R2

Cox and Snell 0,100

Nagelkerke 0,113

McFadden 0,050

Mann-Whitney U test

Gingivitisscore p-waarden

Score 0 -1 NS

Score 0 - 2 NS

Score 0 - 3 < 0,001

Multinomiale logistische regressie

p-waarde = 0,003


Cox and Snell 0,061

Nagelkerke 0,074

McFadden 0,035


38

AANTAL WITTE BLOEDCELLEN PER TAND VERSUS DE SOM VAN DE GINGIVITISSCORE MET

DE TANDPLAQUESCORE:

Figuur 24. LINKS: Box-and-Whiskerplot: y-as: aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) per tand, x-as:

gingivitisscore plus tandplaquescore. RECHTS: Tabel met resultaten van het multinomiaal logistisch

regressiemodel met de som van gingivitisscore en tandplaquescore als afhankelijke variabele en met het aantal

witte bloedcellen (per 10-6

L) per gebitselement als covariante.

AANTAL WITTE BLOEDCELLEN VERSUS HET PRODUCT VAN DE GINGIVITISSCORE MET DE

TANDPLAQUESCORE EN HET AANTAL GEBITSELEMENTEN:

1. BIJ EEN POPULATIE OUDER DAN 40 JAAR:

Figuur 25. Lineair regressiemodel met het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) als afhankelijke variabele en het

product van gingivitisscore+1, hoeveelheid tandplaque+1 en aantal gebitselementen als onafhankelijke variabele

bij een populatie ouder dan 40 jaar (R = Pearson correlatiecoëfficiënt, R2 = determinatiecoëfficiënt).

Multinomiale logistische regressie

p-waarde < 0,001


Cox and Snell 0,130

Nagelkerke 0,138

McFadden 0,050

Lineaire regressie

p-waarde < 0,001

Coëfficiënten

R 0,50

R2 0,25


39

2. BIJ EEN POPULATIE OUDER DAN 50 JAAR:

Figuur 26. Lineair regressiemodel met het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) als afhankelijke variabele en het

product van gingivitisscore+1, hoeveelheid tandplaque+1 en aantal gebitselementen als onafhankelijke variabele

bij een populatie ouder dan 50 jaar (R = Pearson correlatiecoëfficiënt, R2 = determinatiecoëfficiënt).

c. ROC curven voor het aantal witte bloedcellen in geval van gingivitisscore.

GINGIVITISSCORE 1:

Figuur 27. Receiver operating characteristic (ROC) curve voor het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) in geval

van gingivitisscore 1 bij de volledige steekproefpopulatie met rechts een tabel met de gegevens van de ROC-

curve.

Lineaire regressie

p-waarde < 0,001

Coëfficiënten

R 0,55

R2 0,30

Gingivitisscore 1 bij volledige populatie

AUC p-waarde 95% BI

0,47 NS 0,35 - 0,58


40

GINGIVITISSCORE 2:

Figuur 28. Receiver operating characteristic (ROC) curve voor het aantal witte bloedcellen (per 10-6

L) in geval


curve.

GINGIVITISSCORE 3:


L) in geval


curve.

Voor een gingivitisscore 3 werd de mooiste ROC-curve bekomen. Een sensitiviteit van 75% en een

specificiteit van 62% werden bekomen bij een afkappingspunt (zwarte pijl) van 1,3 x 103 witte

bloedcellen per 10-6

L.


AUC p-waarde 95% BI

0,44 NS 0,34 - 0,54


AUC p-waarde 95% BI

0,73 < 0,001 0,62 – 0,84


41

d. Nader onderzoek van gingivitisscore 3 als diagnosticum.

BIJ HOGER LEEFTIJD:

Figuur 30. Receiver operating characteristic (ROC) curve voor het aantal witte bloedcellen (per 10

-6L) in geval

van gingivitisscore 3 bij de volledige steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar met rechts een tabel met de gegevens

van de ROC-curve.

Bij een afkappingspunt (zwarte pijl) van 1,3 x 10

3 witte bloedcellen per 10

-6L werd een sensitiviteit

van 76% en een specificiteit van 74% gevonden voor een gingivitisscore 3 bij de volledige

steekproefpopulatie ouder dan 35 jaar.

BIJ VROUWEN:


L) in geval

van gingivitisscore 3 bij vrouwen ouder dan 30 jaar met rechts een tabel met de gegevens van de ROC-curve.




van 85% en een specificiteit van 70% gevonden voor een gingivitisscore 3 bij vrouwen ouder dan 30

jaar.

Gingivitisscore 3 bij volledige

populatie ouder dan 35 jaar.

AUC p-waarde 95% BI

0,80 < 0,001 0,70 – 0,90

Gingivitisscore 3 bij vrouwen ouder

dan 30 jaar.

AUC p-waarde 95% BI

0,83 < 0,001 0,69 – 0,97


42


L) in geval


Bij een afkappingspunt (zwarte pijl) van 1,3 x 103 witte bloedcellen per 10


van 85% en een specificiteit van 77% gevonden voor een gingivitisscore 3 bij vrouwen ouder dan 40

jaar.

BIJ MANNEN:


L) in geval





van 77% en een specificiteit van 67% gevonden voor gingivitisscore 3 bij mannen ouder dan 30 jaar.

Gingivitisscore 3 bij vrouwen ouder

dan 40 jaar.

AUC p-waarde 95% BI

0,84 < 0,001 0,71 – 0,97

Gingivitisscore 3 bij mannen ouder

dan 30 jaar.

AUC p-waarde 95% BI

0,79 0,002 0,64 – 0,93


43


volgens de aanwezigheid van cariës.

Figuur 34. LINKS: Histogram met verdeling van leeftijd (in jaren) van de steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar

(n=112) volgens carieus ziektebeeld (75 gezond en 37 met cariës). RECHTS: Tabel met resultaten na

vergelijking verschillende parameters van Sysmex UF-1000i®, hoeveelheid tandplaque, gingivitisscore en aantal

gebitselementen tussen dentaal gezonde en ongezonde individuen bij de steekproefpopulatie ouder dan 30 jaar.

Het aantal witte bloedcellen, de hoeveelheid tandplaque en de gingivitisscore lagen statistisch

significant hoger bij de populatie met cariëslaesies dan bij de gezonde populatie. Het aantal

gebitselementen lag in vergelijking met de gezonde populatie statistisch significant lager bij de

populatie met cariëslaesies. Tussen het aantal rode bloedcellen, het aantal epitheelcellen en het aantal

bacteriën waren er geen statistisch significante verschillen terug te vinden.

Kruistabel

Gezond versus Cariës Totaal

Gezond Met cariës

Gingivitisscore

0 37 4 41

1 17 7 24

2 13 10 23

3 8 16 24

Totaal 75 37 112

Tabel 25. Kruistabel aanwezigheid cariës met gingivitisscore.

Merk de stijging op van het aantal individuen met cariëslaesies bij toenemende gingivitisscore.

Parameter p-waarden

Rode bloedcellen NS

Witte bloedcellen < 0,01

Epitheelcellen NS

Bacteriën NS

Parameter p-waarden

Tandplaque < 0,001

Gingivitisscore < 0,001

Gebitselementen 0,001


44

6 Discussie.

6.1 Analytische aspecten.

Naast prikkeling van het autonoom zenuwstelsel is speekselafgifte ook onderworpen aan andere

prikkels. Afhankelijk van de persoon en de intensiteit van de secretieprikkels varieert de

speekselafgifte voor gezonde personen [2]. Daarbij komt dat de geanalyseerde cellen niet rechtstreeks

afkomstig uit de speekselklieren. Met andere woorden hoe meer speeksel er werd geproduceerd, hoe

groter de verdunning was. Hierdoor konden sommige waarden onderschat of overschat worden.

De mogelijkheid bestaat dat, in geval van ziekte, witte bloedcellen via nasale of bronchiale secreten

de orale caviteit kunnen binnenkomen. Alle vrijwilligers die deelnamen aan deze studie waren in

goede gezondheid. Theoretisch bestaat wel de mogelijkheid dat sommige van de deelnemers

subklinisch ziek waren met nasale en bronchiale witte bloedcellen in de mond als gevolg [16-18].

De within-run variatiecoëfficiënten van de Sysmex UF-1000i® lagen voor de witte bloedcellen,

epitheelcellen en bacteriën in dezelfde grootteorde. De within-run variatiecoëfficiënt van de rode

bloedcellen lag hoger in vergelijking met de andere parameters. Een reden was dat het aantal rode

bloedcellen in de speekselstalen een stuk lager lagen in vergelijking met die van de andere parameters

(tabel 16). Dit gaf als resultaat dat een paar rode bloedcellen extra of een kleine bloedklonter in het

speeksel tijdens de analyse een stijging kon geven in de standaarddeviaties met een grotere spreiding

van de variatiecoëfficiënten als gevolg. Deze bevindingen liggen in dezelfde lijn als diegene gevonden

voor de analyse van urine [28].

De within-run variatiecoëfficiënten van de Sysmex UF-1000i® lagen markant lager dan de waarden

gevonden bij de Sysmex UF-100®

[1]. Hieronder zijn een aantal mogelijke redenen opgesomd.

Ten eerste is er het verschil tussen de toestellen. Zo blijkt de Sysmex UF-1000i® in staat meer

informatie te verzamelen (zie inleiding) en kan zo een preciezere analyse van het speekselstaal geven.

Ten tweede werden er in deze studie meer stalen (tien speekselstalen achtmaal geanalyseerd) getest

zodat een betere weergave werd bekomen van de spreiding van de within-run variatiecoëfficiënt in

vergelijking met de Sysmex UF-100® (drie speekselstalen tienmaal geanalyseerd).

Ten derde is de huidige testprocedure verschillend van deze gebruikt in 2002 [1]. Waar de

opzuigcanule bij de Sysmex UF-100® op een willekeurige plaats werd gehouden, wordt heden de

opzuigcanule van de Sysmex UF-1000i® helemaal tot de bodem van de kegelproefbuis gebracht. Er

was een vermoeden dat de procedure van vortexen kon leiden tot centrifugeren van het speekselstaal.

Hiermee wordt bedoeld dat de cellulaire inhoud van het speekselstaal onderaan de kegelproefbuis

hoger is dan de cellulaire inhoud aan de bovenkant. Bij het plaatsen van de opzuigcanule op


45

willekeurige plaatsen leidt dit onvermijdelijk tot verschillende waarden van de parameters. Door

standaardisatie van de analyseprocedure werd dit fenomeen vermeden.

De between-run variatiecoëfficiënten gedurende drie weken waren niet significant verschillend van de

between-run variatiecoëfficiënten van een gezond persoon gedurende één dag. Het viel op dat deze

waarden een grote spreiding vertonen. Hiermee moet rekening gehouden worden. Het nemen van een

staal voor het ontbijt (nuchter) kan mogelijks een oplossing bieden om deze spreiding te verkleinen.

De cellulaire inhoud in de mond is dan gedurende de nacht onaangeroerd gebleven.

De between-run variatiecoëfficiënten voor de epitheelcellen en de bacteriën gemeten door de Sysmex

UF-1000i® waren gelijklopend met de waarden van de Sysmex UF-100

®. De gerapporteerde waarden

bij de Sysmex UF-1000i® van de rode bloedcellen en de witte bloedcellen lagen respectievelijk hoger

en lager [1].

Een verklaring voor de verhoging van de between-run variatiecoëfficiënt bij de rode bloedcellen kon

gezocht worden bij het lager aantal rode bloedcellen in speeksel (tabel 16). Een verklaring voor

between-run variatiecoëfficiënt van de witte bloedcellen lag mogelijks bij een verbetering voor de

within-run variatiecoëfficiënt. Een tweede reden voor deze discrepanties waren mogelijks verschillen

in de testpopulaties tussen beide studies.

6.2 Pre-analytische aspecten.

De stijging van het aantal bacteriën op zowel +20°C als op +4°C kon verklaard worden doordat de

bacteriën voedselresten, epitheelcellen en polysacchariden ketens afkomstig van speekseleiwitten als

voedingsbron gebruiken. De kleinere stijging van het aantal bacteriën bij bewaring in de koelkast

(+4°C) kan worden verklaard door het effect van de temperatuur op de groei van bacteriën. Deze

bevindingen en verklaringen werden reeds vroeger gemeld [1].

De stijgingen van het aantal witte bloedcellen en epitheelcellen op kamertemperatuur (+ 20°C) kunnen

te wijten zijn aan het uiteenvallen van clusters van cellen in het speekselstaal. Deze clusters werden

initieel niet opgemerkt door de Sysmex UF-1000i® als aparte cellen. Deze clusters bleven bij een

lagere temperatuur (+4°C) beter samen. Ook dit fenomeen werd reeds vroeger gerapporteerd [1].

Uit de resultaten van het tandpoetsen konden een aantal stellingen worden afgeleid.

Ten eerste deed het poetsen zonder tandpasta de waarden van alle parameters dalen. Grafisch bleek dit

het geval te zijn, zeker in vergelijking met het testprotocol waar er niks was gebeurd. M.a.w. borstelen

in de mond gedurende twee minuten verwijderde de cellulaire inhoud in de mond significant.

Ten tweede veroorzaakte het poetsen met tandpasta microtraumata omwille van het abrasivum dat zich

in tandpasta bevindt [24]. Deze microtraumata konden na het poetsen nog even nabloeden. De sterke

stijging van de rode bloedcellen kon zo verklaard worden. Het uitblijven van een significant verschil


46

tussen het aantal witte bloedcellen en het aantal epitheelcellen kon verklaard worden doordat poetsen

zonder tandpasta een daling geeft, terwijl de microtraumata (in de minuten na het poetsen) een stijging

geven van het aantal cellen. Het nettoresultaat was het vinden van een niet statistisch significant

verschil. Mogelijke verklaringen voor de iets sterkere daling van het aantal bacteriën waren de

destructie ervan door de combinatie van het abrasivum met de fluoride in de tandpasta [24,29], en een

intensere mondspoeling na het poetsen met tandpasta. Hiernaast moest de kleinere spreiding van het

aantal bacteriën in rekening gebracht worden. Ook deze kan een verklaring geven van de kleinere p-

waarde. Er is dus voorzichtigheid geboden bij het interpreteren van de daling van het aantal bacteriën

na het poetsen met tandpasta. In dit experiment is er niet met zekerheid te zeggen of er na het poetsen

met tandpasta een grotere daling is van het aantal bacteriën in vergelijking met het poetsen zonder

tandpasta.

6.3 Diagnostische aspecten.

Tijdens dit onderzoek werden voor de cellulaire inhoud van speeksel referentiewaarden opgesteld. De

referentiewaarden gemeten met de Sysmex UF-1000i® (tabel 16) werden vergeleken met de

referentiewaarden gemeten met de Sysmex UF-100® (tabel 1). Het viel op dat de waarden (mediaan,

2,5ste

percentiel en 97,5ste

percentiel) gevonden voor het aantal witte bloedcellen en het aantal

epitheelcellen in dezelfde grootteorde lagen. Dit was niet het geval voor de medianen van de rode

bloedcellen en van de bacteriën. Bij de Sysmex UF-1000i® lagen deze waarden respectievelijk lager en

hoger dan de gerapporteerde waarden in tabel 1. Dit gold ook voor het 97,5ste

percentiel. De twee

studiepopulaties waren qua leeftijd en aantal vergelijkbaar. De gevonden verschillen waren

vermoedelijk te wijten aan het verschil tussen de beide flowcytometers. De Sysmex UF-1000i®

gebruikt namelijk een aparte telkamer voor bacteriën. Deze extra telkamer verhindert interferentie

tussen bacteriën en rode bloedcellen, met een preciezere detectie als gevolg van zowel het aantal

bacteriën als van het aantal rode bloedcellen [30,31].

Er werd gezien dat het enige statistisch significant verschil tussen de gezonde populatie en de

populatie met gingivitis het aantal bacteriën was. Dit aantal lag lager bij de populatie met gingivitis

dan bij de gezonde populatie. Dit was niet het resultaat dat initieel verwacht werd. Het aantal bacteriën

zou bij de parodontaal ongezonde populatie juist hoger moeten liggen, aangezien er meer tandplaque

aanwezig was bij de parodontaal ongezonde populatie (figuur 15 en 16).

Een reden voor het vinden van minder bacteriën bij de populatie met gingivitis was de constitutie van

de tandplaque zelf. De tandplaque bij de gezonde populatie was niet dezelfde als bij de populatie met

gingivitis. Bij de populatie met gingivitis was de tandplaque ouder, Gram-negatiever, bestond uit een

groter aantal bacteriën en was meer pathogeen [22]. Omdat deze tandplaque ouder was, waren er meer

verbindingen tussen de bacteriën [15,21]. Dit betekende dat de flowcytometer Sysmex UF-1000i® bij


47

deze oudere, pathogene tandplaque het aantal bacteriën foutief kon interpreteren omdat er minder

individuele bacteriën waren in het speekselstaal.

Hiernaast is het ook van belang te vermelden dat het niet alleen het aantal bacteriën zijn die instaat

voor de parodontale ontsteking maar dat ook de virulentie van een aantal micro-organismen en de

immuunrespons van de gastheer een rol spelen [11].

Dit was de reden voor de vorm van de ROC-curve (figuur 21) voor het aantal bacteriën in geval van

gingivitis. Het aantal bacteriën zijn daarom als diagnosticum moeilijk te gebruiken.

In de voorgaande studie met de Sysmex UF-100® bleek er een correlatie te bestaan tussen het aantal

witte bloedcellen en de aanwezigheid van gingivitis [1]. Hoewel in deze masterproef het aantal witte

bloedcellen bij de populatie met gingivitis hoger lag, was er geen statistisch verschil terug te vinden

tussen de volledige gezonde populatie en de populatie met gingivitis. Bij de populatie ouder dan 25

jaar werd dit verschil opnieuw teruggevonden. De grootste verschillen werden teruggevonden bij een

populatie ouder dan 30 jaar.

Een verklaring voor het verdwijnen van het statistisch verschil bij de volledige populatie tussen het

aantal witte bloedcellen bij de gezonde populatie en bij de populatie met gingivitis was het verschil in

meetcriteria tussen beide studies. Individuen die in de vorige studie met de Sysmex UF-100®

als

parodontaal ongezond werden beschouwd, kunnen in deze studie als gezond bestempeld worden [1].

Het was immers zo dat in deze studie één ontstoken papil moest gevonden worden pér sextant om aan

de criteria van een gingivitisscore 1 of hoger te voldoen. In de gingivitisscore classificatie werd dus

één ontstoken wijsheidstand per definitie als gezond geclassificeerd. In de voorgaande studie met de

Sysmex UF-100® werd een individu geclassificeerd met gingivitis bij het vinden van één

hyperaemisch en ontstoken papil [1]. Dit betekent dus dat het parodontale ziektebeeld in deze

masterproef onderschat werd, in vergelijking met de voorgaande studie met de Sysmex UF-100®:

sommigen uit de gezonde populatie in deze studie konden met andere woorden in de voorgaande

studie met de Sysmex UF-100® als een individu met gingivitis beschouwd worden.

Het terugvinden van het statistisch significant verschil tussen beide populaties bij oudere

leeftijdscategorieën kan epidemiologisch verklaard worden. Naarmate de populatie ouder wordt, wordt

gingivitis (die vaak al langer bestaat), veralgemeend in de mond teruggevonden [32]. Hierdoor vallen

de oudere individuen met (meer veralgemeende) gingivitis ook sneller in een hogere gingivitisscore

dan jongere individuen die op minder plaatsen gingivitis hebben.

Deze situatie legt een serieuze tekortkoming van de gingivitisscore classificatie bloot. Door het

gemiddelde te nemen van alle sextanten bij de gingivitisscore classificatie werd verwacht een gradatie

volgens parodontale mondgezondheid te bekomen. Dit was een grove classificatie voor de parodontale

gezondheid. Het nemen van een volledige parodontale status blijft de gouden standaard maar is wel

een zeer arbeidsintensief gebeuren.


48

Het aantal epitheelcellen lag bij de populatie met gingivitis ouder dan 30 jaar statistisch significant

hoger dan bij de gezonde populatie ouder dan 30 jaar. Een reden voor deze vaststelling is de correlatie

die werd gevonden tussen het aantal witte bloedcellen en het aantal epitheelcellen (figuur 14). Deze

correlatie kan worden verklaard doordat de witte bloedcellen enzymen en cytokines produceren die de

epitheliale structuur in de mondholte aantasten met een stijging van het aantal epitheelcellen als

gevolg [11].

Nergens werd een verband gevonden tussen het aantal rode bloedcellen en de aanwezigheid van

gingivale problemen. De criteria van gingivitis uit de klinische praktijk, zijnde tandplaque en bloeding,

konden niet in verband gebracht worden met de cellulaire inhoud van speeksel, zijnde een stijging van

het aantal rode bloedcellen en het aantal bacteriën.

Een zuivere lineaire stijging, zoals gehoopt, van het aantal witte bloedcellen bij stijging van de

gingivitisscore werd niet teruggevonden. Door extra klinische gegevens toe te voegen aan het model

zoals de hoeveelheid tandplaque en het aantal tanden verbeterden de correlaties tussen het aantal witte

bloedcellen en de gingivitisscore.

De plaque-index van Silness en Löe geeft meer weer dan alleen de aan- of afwezigheid van

tandplaque. Hij geeft ook de hoeveelheid tandplaque weer supra- als subgingivaal. Witte bloedcellen

zijn voornamelijk afkomstig uit de gingivocreviculaire vloeistof [13-14]. Indien een patiënt met

parodontitis een goede mondhygiëne heeft, kan het gebeuren dat de oppervlakkige ontsteking en de

bloeding door regelmatige reiniging verdwijnt, terwijl de subgingivale ontsteking blijft bestaan [15].

Het is dus mogelijk dat een goede mondhygiëne een verlaging geeft van het aantal witte bloedcellen

en dus ook een onderschatting geeft van de werkelijke onderliggende pathologie. De witte bloedcellen

kunnen moeilijker uit de sulcus ontsnappen omdat de oppervlakkige ontsteking verdwijnt en de

gingivale vezels terug strakker rond de tand gaan liggen [15]. De aanwezigheid van tandplaque kan

dan zo misschien onrechtstreeks worden bekeken als een parameter die het openstaan van de sulcus

rond de tand weergeeft. Een open sulcus kan het ontsnappen van witte bloedcellen vereenvoudigen.

Hoe meer tanden er aanwezig zijn, hoe groter de oppervlakte waaruit witte bloedcellen kunnen

diffunderen.

Bij het bekijken van de ROC-curven werd gezien dat het aantal witte bloedcellen als mogelijks

diagnosticum in geval van een gingivitisscore 1 en een gingivitisscore 2 geen resultaten gaven. Dit

was reeds te vermoeden uit de p-waarden van tabel 24 voor een gingivitisscore 1 en voor een

gingivitisscore 2. Voor zowel een gingivitisscore 1 als voor een gingivitisscore 2 verbeterden de ROC

curven niet bij stijgende leeftijdscategorieën. Ook het maken van een onderscheid tussen beide

geslachten bracht geen soelaas.


49

Tussen een gingivitisscore van 0 en 3 werden de grootste significante verschillen gevonden. Een

gingivitisscore van 3 komt overeen met een veralgemeende parodontale ontsteking. Bij individuen met

zware tandvleesontstekingen kan de flowcytometer Sysmex UF-1000i® duidelijk aangewend worden

als extra diagnosticum.

Er werd een statistisch significant verschil gevonden tussen het aantal witte bloedcellen bij de gezonde

populatie ouder dan 30 jaar en de populatie met cariëslaesies ouder dan 30 jaar. In tabel 25 werd

opgemerkt dat het aantal individuen met cariëslaesies steeg bij toenemende gingivitisscore.

Gingivitisscore trad hier op als een confouding factor.

Door het samenbrengen van meerdere gegevens werden er betere verbanden gevonden. Een

vervolgstudie waarbij er rekening gehouden wordt met het de hoeveelheid speeksel, de totale

pocketdiepte, het aantal tanden, de hoeveelheid plaque en tandsteen, is aangewezen.

Het product van de gemiddelde pocketdiepte met het aantal tanden geeft het totale oppervlak weer van

waaruit witte bloedcellen kunnen diffunderen. Samen met de plaque-index geeft dit een beeld van de

totale mondhygiëne. Het gebruik van een volledige parodontale status is hierbij een must. Door het

aantal witte bloedcellen per 10-6

L speeksel te vermenigvuldigen met de hoeveelheid speeksel, kan er

een correcter beeld van het exacte aantal witte bloedcellen gevormd worden die uit de

gingivocreviculaire sulcus diffunderen. Deze bewering werd reeds deels aangetoond in figuur 25 en

26.

Ideaal zou zijn om deze stelling longitudinaal te bestuderen aan de hand van een populatie met

gingivale en/of parodontale problemen die ondertussen klinisch behandeld wordt. Op deze wijze kan

bovenstaande bewering gestaafd worden en kan de causaliteit tussen het aantal witte bloedcellen en de

aanwezigheid van gingivale ontstekingen beter onderzocht worden.


50

6.4 Conclusie.

De flowcytometer Sysmex UF-1000i® kan met grote nauwkeurigheid gebruikt worden om een

speekselstaal te analyseren. De celaantallen van de parameters gemeten door de Sysmex UF-1000i®

vertonen gedurende één dag en gedurende één week voor een gezond individu een grote spreiding.

Speekselstalen kunnen gedurende 6 uren op een temperatuur van +4°C bewaard worden zonder

afwijkingen van het aantal cellen te krijgen. Tandenpoetsen zonder tandpasta geeft een daling van de

cellulaire inhoud van speeksel terwijl tandenpoetsen met een anticariës tandpasta een stijging geeft van

het aantal rode bloedcellen.

Er zijn statistisch significante verschillen in de cellulaire inhoud tussen de gezonde populatie en de

populatie met gingivitis. Er is een verband tussen het aantal witte bloedcellen en de gradatie van orale

ontstekingen. Uit de gegevens van deze masterproef komt het aantal witte bloedcellen in speeksel het

beste naar voor als klinisch diagnosticum om de mondgezondheid te beoordelen.

Een vervolgstudie met alle noodzakelijke gegevens en informatie in detail is wenselijk om het

volledige potentieel van de flowcytometer Sysmex UF-1000i® als aanvullend diagnostisch middel

voor de mondgezondheid in kaart te brengen.


51

7 Referentielijst.

[1] Aps J, Van Den Maagdenberg K, Delanghe J, Martens L. Flow cytometry as a new method to

quantify the cellular content of human saliva and its relation to gingivitis. CLINICA CHIMICA

ACTA 2002; 321:35-41.

[2] Van Nieuw Amerongen AV, Veerman ECI, Vissink A. Vorming en secretie van speeksel. In :

SPEEKSEL, SPEEKSELKLIEREN EN MONDGEZONDHEID. Bohn Stafleu Van Loghum,

Houten 2004; 23-36.

[3]

Young B, Heath JW. Oral Tissues. In : WHEATER’S FUNCTIONAL HISTOLOGY, Churchill

Livingstone, Oxford, Uk 2000; 4:237-248.

[4]

Kaufman E, Lamster IB. The diagnostic applications of saliva – a review. CRITICAL

REVIEWS IN ORAL BIOLOGY AND MEDICINE 2002; 13(2):197-212.

[5] Ligtenberg AJM, De Soet JJ, Veerman ECI, Van Nieuw Amerongen A. Oral diseases – from

detection to diagnostics. ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 2007;

1098:200-203.

[6] Van Nieuw Amerongen AV, Ligtenberg AJM, Veerman ECI. Implications for diagnostics in the

biochemistry and physiology of saliva. ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF

SCIENCES 2007; 1098:1-6.

[7] Sysmex UF-100® operator’s manual. Fully automated urine cell analyzer. Toa Medical

Electronics, Kobe, Japan 1995: 17-52.

[8] UF-1000i : a new face – a new phase in urinalysis. SYSMEX XTRA ONLINE 2007;1:1-4.

Opgehaald op 21 februari 2013 van

http://www.docstoc.com/docs/74181744/SYSMEX-UF-new-face-new-phase-in-urinalysis

[9] Nanos EN, Delanghe J. Evaluation of Sysmex UF-1000i for use in cerebrospinal fluid analysis.

CLINICA CHIMICA ACTA 2008; 392: 30-33.

[10] Wilton JMA, Curtis MA, Gillett IR, Griffiths GS, Maiden MFJ, Sterne JAC, Wilson DT,

Hohnson NW. Detection of high-risk groups and individuals for periodontal diseases.

JOURNAL OF CLINICAL PERIODONTOLOGY 1989; 16:475-483.

[11] Taba M, Kinney J, Kim AS, Giannobile WV. Diagnostic biomarkers for oral and periodontal

diseases. DENTAL CLINICS OF NORTH AMERICA 2005; 49:551-571.

[12] Schiott RC, Loë H. The origin and variation in number of leukocytes in human saliva.

JOURNAL OF PERIODONTAL RESEARCH 1970; 5:36-41.

[13] Walker DM. Oral Mucosal Immunology – An Overview. ANNALS ACADEMY OF

MEDICINE SINGAPORE 2004; 33: 27-30.

http://www.docstoc.com/docs/74181744/SYSMEX-UF-new-face-new-phase-in-urinalysis


52

[14] Van Nieuw Amerongen AV, Veerman ECI, Vissink A. Samenstelling en eigenschappen van

speeksel – van dun-vloeibare tot viskeuze mondvloeistof. In : SPEEKSEL,

SPEEKSELKLIEREN EN MONDGEZONDHEID. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten 2004;

37-50.

[15] Van Dijk J. Parodontaal onderzoek. In : ATLAS VAN DE PARODONTALE DIAGNOSTIEK.

Bohn Stafleu van Loghum, Houten 2001; 25-41.

[16] Kirstila V, Tenovuo J, Ruuskanen O, Suonpaa J, Meurman O, Vilja P. Longitudinal analysis of

human salivary immunoglobulins, nonimmune antimicrobial agents and microflora after

tonsillectomy. CLINICAL IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY 1996; 80: 110-

115.

[17] Brook I, Foote PA, Slots J. Immune response to Fusobacterium nucleatum, Prevotella

intermedia and other anaerobes in children with acute tonsillitis. JOURNAL OF

ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY 1997; 39:763-769.

[18] Editorials : Eosinophil progenitors in sputum. Throwing out the baby with the bath water?.

AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE 2004;

169:549-556.

[19] Marsh PD. Host defenses and microbial homeostasis: Role of microbial interactions.

JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, 1989; 68:1567-1575.

[20] Baehni PC, Guggenheim B. Potential of diagnostic microbiology for treatment and prognosis of

dental caries and periodontal diseases. CRITICAL REVIEWS IN ORAL BIOLOGY AND

MEDICINE 1996; 7(3):259-277.

[21] Van Loveren C, Van Der Weijden. Tandplaque. In : PREVENTIEVE TANDHEELKUNDE.

Bohn Stafleu Van Loghum, Houten 2000; 2:45-67.

[22] Theilande E, Wright WH, Jensen SB, Löe H. Experimental gingivitis in man. A longitudinal

clinical and bacteriological investigation. JOURNAL OF PERIODONTAL RESEARCH 1966;

1:1-3.

[23] Chiappin S, Antonelli G, Gatti R, De Palo EF. Saliva specimen - a new laboratory tool for

diagnostic and basic investigation. CLINICAL CHEMISTRY 2007; 383:30-40.

[24] Elmex® caries protection toothpaste with amine fluoride. Online 2013. Opgehaald op 22

maart 2013, van http://www.gaba.com/htm/568/en/elmex-CARIES-PROTECTION-

toothpaste.htm?Brand=elmex&Subnav=&Product=17865

[25] Löe H. The Gingival Index, the Plaque Index and the Retention Index. JOURNAL OF

PERIODONTOLOGY 1967; 38:610-616.

[26] Thevissen E. Parodontale screening met behulp van de DPSIndex. CONTACTPUNT 2005;

editie maart: 10-16.


53

[27] Nagelkerke NJD. A note on a general definition of the coefficient of

determination. BIOMETRIKA 1991;78(3): 691–692.

[28] Tang J, Peisong Ch, Juan O, Shihong Zh, Dan C. Urine particles analysis – performance

evaluation of Sysmex UF-1000i and comparison among urine flow cytometer, dipstick and

visual microscopic examination. SCANDINAVIAN JOURNAL OF CLINICAL AND

LABORATORY INVESTIGATION 2011; 71: 30-37.

[29] Van der Mei HC, Engels E,de Vries J, Busscher HJ. Effects of amine fluoride on biofilm

growth and salivary pellicles. CARIES RESEARCH 2008;42:19–27.

[30] 1. Wang J, Zhang Y, Xu D, Shao W, Lu Y. Evaluation of the Sysmex UF-1000i for the diagnosis

of urinary tract infection. AMERICAN JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY 2010;

133:577–582.

[31] Broeren MAC, Bahçeci S, Vader HL, Arents NLA. Screening for Urinary Tract Infection with

the Sysmex UF-1000i Urine Flow Cytometer. JOURNAL OF. CLINICAL. MICROBIOLOGY

2011; 49(3):1025-1029.

[32] Academic Report. Epidemiology of periodontal diseases. JOURNAL OF

PERIODONTOLOGY 2005;76:1406-1419.

.

A

8 Bijlage.

Informatiebrief voor de deelnemers aan experimenten

1. Titel van de studie: Een kwantitatieve bepaling van de cellulaire inhoud van speeksel

2. Doel van de studie: Men heeft u gevraagd om deel te nemen aan een studie. Het doel van deze studie is om een verband te zoeken tussen de cellen die zich in het speeksel bevinden en de mondgezondheid van de patiënt.

3. Beschrijving van de studie: Om de verschillende aspecten van de mondgezondheid te bepalen, zullen een aantal zaken betreffende het aantal tanden, de toestand ervan, de hoeveelheid tandsteen, de hoeveelheid tandplaque en de toestand van het tandvlees worden genoteerd. Deze registratie gebeurt tijdens de routine tandheelkundige controle die U periodiek ondergaat. Daarnaast zal U gevraagd worden om een beetje speeksel te spuwen in een steriel plastieken bekertje. De onderzoeker zal eveneens een aantal vragen stellen in verband met eet-en mondhygiënegewoonten en het gebruik van medicatie. De analyse van het speeksel gebeurt nadien in het laboratorium. De resultaten hiervan zullen gekoppeld worden aan de in de mond vastgestelde toestand en de eet-en mondhygiënegewoonten en het eventuele medicatiegebruik. De verwachte totale duur van de studie is een eenmalige registratie, die plaatsvindt tijdens de reguliere tandartscontrole. Er zullen in totaal een 30-tal personen aan deze studie deelnemen.

4. Wat wordt verwacht van de deelnemer? Voor het welslagen van de studie, is het uitermate belangrijk dat u volledig meewerkt met de onderzoeker en dat u zijn instructies nauwlettend opvolgt. Bovendien moet u onderstaande items respecteren: - zo accuraat mogelijk de gegevens proberen te verstrekken betreffende uw eetgewoonten - zo accuraat mogelijk de gegevens proberen te verstrekken betreffende uw mondhygiëne gewoonten - zo accuraat mogelijk de gegevens proberen te verstrekken betreffende uw medicatiegebruik

B

5. Deelname en beëindiging: De deelname aan deze studie vindt plaats op vrijwillige basis. U kan weigeren om deel te nemen aan de studie, en u kunt zich op elk ogenblik terugtrekken uit de studie zonder dat u hiervoor een reden moet opgeven en zonder dat dit op enigerlei wijze een invloed zal hebben op uw verdere relatie en/of behandeling met de onderzoeker of de behandelende arts. Uw deelname aan deze studie zal worden beëindigd als de onderzoeker meent dat dit in uw belang is. U kunt ook voortijdig uit de studie worden teruggetrokken als u de in deze informatiebrief beschreven procedures niet goed opvolgt of u de beschreven items niet respecteert. Als u deelneemt, wordt u gevraagd het toestemmingsformulier te tekenen.

6. Procedures:

6.1 Procedures:

- tellen van het aantal tanden aanwezig in uw mond - tellen van het aantal tanden met tandsteen en tandplaque - het meten van de gezondheidstoestand van uw tandvlees - speeksel verzamelen door te spuwen in een bekertje - vragenlijst overlopen met de onderzoeker betreffende eetgewoonten,

mondhygiëngewoonten en medicatiegebruik

6.2 Studieverloop: Zie hierboven 6.1

7. Risico’s en voordelen: Aan dit onderzoek zijn geen risico’s verbonden. Het grote voordeel is dat Uw mondgezondheid grondig wordt nagekeken en gemeten. Tijdens de verdere routine tandartscontrole zal vervolgens Uw gebit weer gereinigd worden en zal de onderzoeker U van goede raad voorzien, indien nodig, om Uw mondgezondheid te verbeteren of op peil te houden. U hebt het recht op elk ogenblik vragen te stellen over de mogelijke en/of gekende risico’s, nadelen van deze studie. Als er in het verloop van de studie gegevens aan het licht komen die een invloed zouden kunnen hebben op uw bereidheid om te blijven deelnemen aan deze studie, zult u daarvan op de hoogte worden gebracht. Mocht u door uw deelname toch enig nadeel ondervinden, zal u een gepaste behandeling krijgen. Deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek verbonden aan het UZ Gent en wordt uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de verklaring van Helsinki opgesteld ter bescherming van mensen deelnemend aan klinische studies. In geen geval dient u de goedkeuring door de Commissie voor Medische Ethiek te beschouwen als een aanzet tot deelname aan deze studie.

C

8. Kosten: Uw deelname aan deze studie brengt geen extra kosten mee voor U.

9. Vergoeding: Voor uw deelname aan deze studie is geen vergoeding voorzien.

10. Vertrouwelijkheid: In overeenstemming met de Belgische wet van 8 december 1992 en de Belgische wet van 22 augustus 2002, zal u persoonlijke levenssfeer worden gerespecteerd en zal u toegang krijgen tot de verzamelde gegevens. Elk onjuist gegeven kan op uw verzoek verbeterd worden. Vertegenwoordigers van de opdrachtgever, auditoren, de Commissie voor Medische Ethiek en de bevoegde overheden hebben rechtstreeks toegang tot Uw medische dossiers om de procedures van de studie en/of de gegevens te controleren, zonder de vertrouwelijkheid te schenden. Dit kan enkel binnen de grenzen die door de betreffende wetten zijn toegestaan. Door het toestemmingsformulier, na voorafgaande uitleg, te ondertekenen stemt U in met deze toegang. Als u akkoord gaat om aan deze studie deel te nemen, zullen uw persoonlijke en klinische gegevens tijdens deze studie worden verzameld en gecodeerd (hierbij kan men uw gegevens nog terug koppelen naar uw persoonlijk dossier). Verslagen waarin U wordt geïdentificeerd, zullen niet openlijk beschikbaar zijn. Als de resultaten van de studie worden gepubliceerd, zal uw identiteit vertrouwelijke informatie blijven.

11. Letsels ten gevolge van deelname aan de studie: Hoewel het helemaal niet te verwachten valt dat u schade zou kunnen oplopen door aan dit onderzoek mee te werken, is er toch een foutloze aansprakelijkheidsverzekering afgesloten ; dit is namelijk verplicht volgens de Belgische experimentenwet van 7 mei 2004.

12. Contactpersoon: Als er letsel optreedt tengevolge van de studie, of als U aanvullende informatie wenst over de studie of over uw rechten en plichten, kunt U in de loop van de studie op elk ogenblik contact opnemen met: Prof. Dr. Joris Delanghe, Professor Klinische Biochemie, ; UZG, P8 Laboratorium Klinische Biologie, De Pintelaan 185, 9000 Gent. – tel: 09 332 29 56 – e-mail; [email protected]

mailto:[email protected]

D

Toestemmingsformulier Ik, _________________________________________ heb het document “Informatiebrief voor de deelnemers aan experimenten” met als voettekst “Informed Consent dd. 9 augustus 2012 pagina 1 tot en met 4 gelezen en er een kopij van gekregen. Ik stem in met de inhoud van het document en stem ook in deel te nemen aan de studie. Ik heb een kopij gekregen van dit ondertekende en gedateerde formulier voor “Toestemmingsformulier”. Ik heb uitleg gekregen over de aard, het doel, de duur, en de te voorziene effecten van de studie en over wat men van mij verwacht. Ik heb uitleg gekregen over de mogelijke risico’s en voordelen van de studie. Men heeft me de gelegenheid en voldoende tijd gegeven om vragen te stellen over de studie, en ik heb op al mijn vragen een bevredigend antwoord gekregen. Ik stem ermee in om volledig samen te werken met de toeziende onderzoeker/tandarts in opleiding. Ik zal hem op de hoogte brengen als ik onverwachte of ongebruikelijke symptomen ervaar. Men heeft mij ingelicht over het bestaan van een verzekeringspolis in geval er letsel zou ontstaan dat aan de studieprocedures is toe te schrijven. Ik ben me ervan bewust dat deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek verbonden aan het UZ Gent en dat deze studie zal uitgevoerd worden volgens de richtlijnen voor de goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de verklaring van Helsinki, opgesteld ter bescherming van mensen deelnemend aan experimenten. Deze goedkeuring was in geen geval de aanzet om te beslissen om deel te nemen aan deze studie. Ik mag me op elk ogenblik uit de studie terugtrekken zonder een reden voor deze beslissing op te geven en zonder dat dit op enigerlei wijze een invloed zal hebben op mijn verdere relatie met de onderzoeker/tandartsarts in opleiding. Men heeft mij ingelicht dat zowel persoonlijke gegevens als gegevens aangaande mijn gezondheid worden verwerkt en bewaard gedurende minstens 20 jaar. Ik stem hiermee in en ben op de hoogte dat ik recht heb op toegang en verbetering van deze gegevens. Aangezien deze gegevens verwerkt worden in het kader van medisch-wetenschappelijke doeleinden, begrijp ik dat de toegang tot mijn gegevens kan uitgesteld worden tot na beëindiging van het onderzoek. Indien ik toegang wil tot mijn gegevens, zal ik mij richten tot de toeziende tandarts, die verantwoordelijk is voor de verwerking. Ik begrijp dat auditors, vertegenwoordigers van de opdrachtgever, de Commissie voor Medische Ethiek of bevoegde overheden, mijn gegevens mogelijk willen inspecteren om de verzamelde informatie te controleren. Door dit document te ondertekenen, geef ik toestemming voor deze controle. Bovendien ben ik op de hoogte dat bepaalde gegevens doorgegeven worden aan de opdrachtgever. Ik geef hiervoor mijn toestemming, zelfs indien dit betekent dat mijn gegevens doorgegeven worden aan een land buiten de Europese Unie. Ten alle tijden zal mijn privacy gerespecteerd worden.

E

Ik ben bereid op vrijwillige basis deel te nemen aan deze studie. Naam van de vrijwilliger: _________________________________________ Datum: _________________________________________ Handtekening:

Ik bevestig dat ik de aard, het doel, en de te voorziene effecten van de studie heb

uitgelegd aan de bovenvermelde vrijwilliger.

De vrijwilliger stemde toe om deel te nemen door zijn/haar persoonlijk gedateerde

handtekening te plaatsen.

Naam van de persoon

die voorafgaande uitleg

heeft gegeven: _ __

Datum: _________________________________________

Handtekening:

FACULTEIT GENEESKUNDE EN Co-promotor: Prof. Dr. Johan Aps … · 2013. 12. 21. · FACULTEIT...

Documents

Transcript of FACULTEIT GENEESKUNDE EN Co-promotor: Prof. Dr. Johan Aps … · 2013. 12. 21. · FACULTEIT...