UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

VALIDATIE VAN BOTDENSITEITSMETING OP BASIS VAN COMPUTED TOMOGRAPHY-OSTEOABSORPTIOMETRIE BIJ DE HOND

door

Marie-Laure KERSCHOT

Promotoren: Dierenarts Walter Dingemanse Onderzoek in het kader

Dr. Ingrid Gielen van de Masterproef

© 2015 Marie-Laure Kerschot

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de

juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze

masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van

derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de

masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de

masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 - 2015

VALIDATIE VAN BOTDENSITEITSMETING OP BASIS VAN COMPUTED TOMOGRAPHY-OSTEOABSORPTIOMETRIE BIJ DE HOND

door

Marie-Laure KERSCHOT

Promotoren: Dierenarts Walter Dingemanse Onderzoek in het kader

Dr. Ingrid Gielen van de Masterproef

© 2015 Marie-Laure Kerschot

1

1. WOORD VOORAF Het uitwerken van een masterproef behoort tot de laatste stappen voor het behalen van het

langbegeerd diploma. Dit was uiteraard niet mogelijk zonder de hulp van een aantal mensen.

Om te beginnen waren er de mensen met de nodige vakkennis en ervaring die mij als ‘jonkie’ wilden

begeleiden bij het uitwerken van een masterproef in hun vakgebied. Hiervoor een erg welgemeende

dank-u-wel aan mijn promotoren, Walter Dingemanse en dr. I. Gielen, en aan ons vakgroephoofd,

prof. dr. H. van bree, voor hun zeer gedreven begeleiding, hulp, steun en het kritisch nalezen van mijn

werk. Tevens vergeet ik de medewerkers van het labo diervoeding niet, die voor mij alle

biochemische analyses nauwgezet hebben uitgevoerd en hieromtrent ook de nodige adviezen

hebben uitgedeeld. Bedankt Herman en prof. dr. ir. G. Janssens.

Daarnaast wil ik ook zeer zeker mijn naaste omgeving bedanken voor de steun en vooral het

onmetelijke geduld dat zij met mij gehad hebben. Allereerst zijn er mijn ouders die mij tijdens al die

studiejaren zowel financiële als vooral morele steun gegeven hebben en in mij zijn blijven geloven:

bedankt mama, papa, Ronny! Daarnaast wil ik ook mijn vrienden, en in het bijzonder mijn vriend Joris,

bedanken voor alle hulp en steun wanneer ik het nodig had, alsook voor het geduld dat zij

tentoonspreidden wanneer ik te druk bezig was met mijn werk om tijd vrij te maken voor andere leuke

dingen.

Tenslotte wil ik nog een laatste klein dankwoordje richten aan al mijn medestudenten en ex-

kotgenoten van de voorbije studiejaren. Zij hebben mijn studententijd net dat ietsje meer gegeven: de

kersjes op de taart.

2

2. INHOUDSOPGAVE

1. WOORD VOORAF ..................................................................................................................................... 1

2. INHOUDSOPGAVE .................................................................................................................................... 2

3. SAMENVATTING ....................................................................................................................................... 4

4. INLEIDING ................................................................................................................................................ 5

5. LITERATUURSTUDIE .................................................................................................................................. 6

5.1. HET KNIEGEWRICHT ................................................................................................................................ 6

5.1.1. Anatomie................................................................................................................................... 6

5.1.2. Histologie en fysiologie .............................................................................................................. 9

5.2. IN VIVO DENSITEITSBEPALING VAN (SUBCHONDRAAL) BEENWEEFSEL .................................................................. 11

5.2.1. Inleiding .................................................................................................................................. 11

5.2.2. Botanalyse............................................................................................................................... 11

5.2.3. Röntgentechnologie ................................................................................................................. 12

a. Basisprincipes .............................................................................................................................................12

b. Hardware ....................................................................................................................................................12

c. Stralen-weefsel-interactie en attenuatie ......................................................................................................15

d. Beeldvorming en densiteitsbeoordeling .......................................................................................................15

5.2.4. Dual Energy X-ray Absorption (DEXA of DXA) ............................................................................ 16

5.2.5. Computed Tomography (CT) technologie.................................................................................. 18

a. Basisprincipes .............................................................................................................................................18

b. Hardware ....................................................................................................................................................19

c. Procedure ...................................................................................................................................................20

d. Densiteitsbepaling door Kwantitatieve Computed Tomography (Quantitative computed tomography, QCT) .21

e. Densiteitsbepaling door CT-osteoabsorptiometrie (CT-OAM) .......................................................................22

6. ONDERZOEK ........................................................................................................................................... 24

6.1. MATERIAAL EN METHODEN .................................................................................................................... 24

6.1.1. Algemeen ................................................................................................................................ 24

6.1.2. Selectie van kadavers ............................................................................................................... 26

6.1.3. Mechanisch vrijprepareren van femur en tibia .......................................................................... 26

6.1.4. Indeling in groepen .................................................................................................................. 26

6.1.5. Voorbereidende processen en bewaring ................................................................................... 26

6.1.6. Staalname ............................................................................................................................... 27

6.1.7. CT onderzoek ........................................................................................................................... 27

6.1.8. Biochemische analyse .............................................................................................................. 28

6.1.9. CT-OAM ................................................................................................................................... 29

6.1.10. Statistische analyse.................................................................................................................. 31

3

6.2. RESULTATEN ....................................................................................................................................... 32

7. DISCUSSIE ............................................................................................................................................... 34

8. REFERENTIELIJST .................................................................................................................................... 36

4

3. SAMENVATTING Doel: Validatie van CT-osteoabsorptiometrie (CT-OAM) als methode om densiteit en

densiteitsdistributie te bepalen in subchondraal bot bij honden.

Materiaal & Methoden: Van 15 honden werden de achterpoten verzameld, de kniegewrichten

werden manueel vrijgeprepareerd en ingedeeld in 6 groepen die op een specifieke manier werden

bewaard: op formol, op 70% alcohol, diepgevroren na afkoken, diepgevroren na maceratie en twee

controlegroepen voor respectievelijk formol en alcohol die eveneens diepgevroren werden bewaard.

Na een variabele bewaartermijn werden er van ieder gewricht verschillende stalen genomen:

femurcondyl mediaal, femurcondyl lateraal, tibiaal plateau mediaal en tibiaal plateau lateraal. Alle

stalen werden gescand en via CT-OAM werd de densiteit ter hoogte van het subchondraal bot

bepaald. Vervolgens werd via biochemische analyse een asbepaling uitgevoerd van dezelfde biopten.

De twee meetmethoden voor densiteitbepaling (CT-OAM en biochemische asbepaling) werden met

elkaar vergeleken per groep. Voor iedere meetmethode apart werd de densiteit van verschillende

groepen eveneens met elkaar vergeleken.

Resultaten: Bij vergelijking van de twee meetmethoden per groep was er bij 5 van de 6 groepen een

significante positieve tot sterk positieve correlatie te vinden. Bij de groep stalen van afgekookte

beenderen werd slechts een zwakke correlatie gevonden (niet significant). De oorzaak voor deze

afwijkende groep werd niet achterhaald. Bij vergelijking van verschillende groepen waren er geen

verschillen te vinden tussen alcohol 70% en alcohol controle (diepvries) en tussen formol en formol

controle (diepvries) wanneer de metingen plaatsvonden met CT-OAM. Er werden wel verschillen

teruggevonden bij vergelijking tussen groepen alcohol 70% en alcohol controle (diepvries) en tussen

maceratie en afkoken wanneer de mineralendensiteit werd bepaald door biochemische asbepaling.

Conclusie: CT-OAM is een betrouwbare methode om de mineralendensiteit en densiteitsdistributie

van subchondraal bot bij honden te bepalen. Bij klinisch onderzoek van een individueel dier wordt het

evenwel geadviseerd om meerdere metingen per gewricht uit te voeren. Er is verder onderzoek nodig

om de effecten van verschillende bewaringsmethoden op de mineralendensiteit van beenderen vast

te stellen.

5

4. INLEIDING Densiteitsbepaling van (bot)weefsels krijgt reeds lange tijd de aandacht van artsen, dierenartsen,

tandartsen, kinesisten, fysiotherapeuten en biomedisch ingenieurs. Gedurende de volledige

levensduur zijn de beenderen van zoogdieren onderhevig aan veranderingen ten gevolge van

inwerkende krachten (Sjaastad, et al., 2007). Daarnaast kunnen diverse pathologiën een invloed

hebben op de samenstelling of vorm van de beenderen. Gegeneraliseerde veranderingen kunnen

een indicatie vormen voor metabole of nutritionele aandoeningen die potentieel dienen opgevolgd of

behandeld te worden. Lokale veranderingen echter kunnen informatie verschaffen over eerder lokale

functionele, pathologische of traumatische problemen. Zowel de gegeneraliseerde als lokale

veranderingen hebben een voorspellende waarde voor bijvoorbeeld fragiliteitsfracturen of

pathologische fracturen. Hierdoor zou implementatie van informatie uit densiteitsbepalingen in het

behandelplan van de patiënt toekomstige problemen kunnen helpen voorkomen.

Er zijn talrijke methoden op punt gesteld om deze densiteitsbepalingen uit te voeren. De meeste van

deze methodes, doch niet allemaal, berusten op beeldvormingstechnieken. Zo zijn er technieken

uitgewerkt vanuit klassieke of computed (CR) radiografie, computed tomography (CT), magnetic

resonance imaging (MRI) en ultrasonografie of echografie. Al deze technieken hebben hun specifieke

voor- en nadelen. Op dit ogenblik zijn Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA of DXA) en

Quantitative Computed Tomography (QCT) de meestgebruikte technieken (Ralston, 2005). Computed

Tomography Osteoabsorptiometry (CT-OAM) blijkt bepaalde nadelen van de QCT te kunnen

counteren, wat verder onderzoek naar deze techniek zeer interessant maakt. In de diergeneeskunde

wordt deze techniek recent toegepast, en dit vooral in onderzoeksstudies. Om het gebruik ervan bij

honden te rechtvaardigen werd deze validatiestudie uitgevoerd waarbij de resultaten uit CT-OAM

werden uitgezet tegen de directe densiteitsmeting via verassing.

6

5. LITERATUURSTUDIE

5.1. HET KNIEGEWRICHT

5.1.1. Anatomie Een gewricht is een plaats waar twee of meer beenderen met elkaar verbonden zijn. Ieder gewricht

omvat, naast de beenuiteinden, een gewrichtskapsel, een gewrichtsholte en gewrichtskraakbeen

(König & Liebich, 2007). Ligamenten zijn aanwezig om het gewricht te verstevigen en vrije beweging

te beperken (Evans & de Lahunta, 2013).

Het gewrichtskapsel omgeeft de gewrichten en is samengesteld uit een binnenste membrana

synovialis, die verantwoordelijk is voor de productie van synoviaalvocht en een fagocytosefunctie

heeft, en een buitenste membrana fibrosis, die zorgt voor stevigheid van het kapsel en overgaat in het

periost van de aangrenzende beenderen (König & Liebich, 2007). De membrana fibrosis tussen de

patella en de tibia bevat een grote hoeveelheid vetweefsel en vormt het infrapatellaire vetkussen

(Evans & de Lahunta, 2013).

In de membrana fibrosis van het femorotibiale gewrichtskapsel ontwikkelen zich twee

halvemaanvormige, fibrocartilageneuze menisci tussen de femurcondylen en het tibiaal plateau

(Evans & de Lahunta, 2013; Eleftherios, et al., 2011). De laterale meniscus komt, in tegenstelling tot

de mediale, verder in de ontwikkeling los van het gewrichtskapsel (Evans & de Lahunta, 2013). De

menisci vullen de incongruentie tussen de femurcondylen en het tibiaal plateau op en zijn zo van

belang voor stabilisatie van het gewricht, verdelen van compressiekrachten op de beenderen,

schokabsorptie, vermindering van de wrijving binnen het gewricht en nutritionele ondersteuning van

het gewrichtskraakbeen (Eleftherios, et al., 2011; Evans & de Lahunta, 2013).

De gewrichtsholte zelf is gevuld met synoviaalvocht dat de wrijving binnen het gewricht vermindert en

instaat voor de nutritionele ondersteuning van het gewrichtskraakbeen (König & Liebich, 2007). Het

hyaliene gewrichtskraakbeen is van belang voor de schokdemping in het gewricht (König & Liebich,

2007).

7

Figuur 1: Het kniegewricht, Bron: Budras, K. et al, 2007

Beenderelementen worden grofweg ingedeeld in lange, korte, platte, luchthoudende en

onregelmatige beenderen (König & Liebich, 2007). Het kniegewricht bevindt zich tussen drie lange

beenderen - de femur, tibia en fibula – en vier korte (sesams)beenderen – de fabellae ter hoogte van

de musculus gastrocnemius, het popliteusbeentje ter hoogte van de musculus popliteï en de patella

ter hoogte van de eindpees van de musculus quadriceps (König & Liebich, 2007; Sjaastad, et al.,

2007).

Beenweefsel zelf kan worden ingedeeld in compact (dens) bot en spongieus (trabeculair) bot (Aughey

& Frye, 2001). Bij lange beenderen bestaat de buitenzijde uit compact bot (König & Liebich, 2007). Dit

compact, corticaal bot vormt een aaneengesloten geheel van beenweefsel zonder macroscopisch

zichtbare tussenliggende ruimtes (Aughey & Frye, 2001). Ter hoogte van de epifysen is er slechts

een dun laagje compact bot dat een grote hoeveelheid spongieus bot omgeeft (König & Liebich,

2007; Sjaastad, et al., 2007). Dit laagje compact bot wordt ter hoogte van het gewrichtskraakbeen het

subchondrale bot genoemd. Het vormt een overgangszone tussen het kraakbeen en het spongieus

bot, die zorgt voor krachtoverdracht tussen deze twee weefselzones (Leumann, et al., 2015). Het

spongieus bot is opgebouwd uit kleine botbalkjes, trabeculae. Deze trabeculae vormen samen een

netwerk, waartussen zich beenmerg bevindt (Aughey & Frye, 2001). In de diafyse bevindt zich

centraal een mergholte waarin beenmerg aanwezig is met daarrond een laag compact bot, dikker dan

ter hoogte van de epifysen (König & Liebich, 2007; Sjaastad, et al., 2007).

Aan de buitenzijde zijn lange beenderen bedekt met een laagje periost, dat ter hoogte van de

gewrichten over gaat in het gewrichtskapsel en verder loopt overheen het naastgelegen bot (König &

Liebich, 2007). Aan de binnenzijde is het bot van het beenmerg gescheiden door een laagje endost

(König & Liebich, 2007). Dit laagje heeft eveneens een botvormende capaciteit en het bevat

osteoprogenitorcellen, voorlopers van osteoblasten en osteoclasten (König & Liebich, 2007). Bij

sesamsbeenderen is er geen periost aanwezig (Van de Velde, 2013).

8

Net als alle lange beenderen kan de femur onderverdeeld worden in de twee uiteinden (de epifysen),

een middenstuk of schacht (de diafyse) en de overgangszones tussen de diafyse en de epifyse waar

zich tijdens de ontwikkeling de kraakbenige groeischijf bevindt (de metafyse) (Sjaastad, et al., 2007).

De distale epifyse van de femur bestaat uit twee gewrichtsoppervlakken, namelijk de mediale en

laterale condylen aan caudale zijde, en de trochlea aan craniale zijde (König & Liebich, 2007). De

patella en femurtrochlea vormen het femuropatellaire sledegewricht (König & Liebich, 2007). De

condylen vormen het femurotibiale gewricht met het tibiaal plateau proximaal op de tibia. Tussen

deze condylen bevindt zich de fossa intercondylaris die craniaal doorloopt tot in de trochlea en waar

de voorste en achterste kruisband zich aanhechten aan respectievelijk de laterale en mediale zijde

(König & Liebich, 2007).

De tibia en fibula vormen samen het skeleton cruris, waarbij enkel de tibia ter hoogte van de

proximale epifyse met de femur verbonden is en zo een gewichtsdragende functie heeft (König &

Liebich, 2007). Onder de articulerende gewrichtsoppervlakken van de proximale tibia bevinden zich

twee condylen: de laterale en de mediale condyl (König & Liebich, 2007). Het tibiaal plateau wordt in

twee gesplitst door de eminentia intercondylaris, die kan ingedeeld worden in een tuberculum mediale

en laterale met daartussen de area intercondylaris centralis (König & Liebich, 2007). Ter hoogte van

deze area intercondylaris centralis bevindt zich het aanhechtingspunt voor de klinisch belangrijke

voorste kruisband (König & Liebich, 2007). Op de laterale condyl bevindt zich het proximale

tibiofibulaire gewricht, een syndesmose die weinig tot geen beweging toelaat (Budras, 2007; König &

Liebich, 2007). Ondanks dat de fibula dus geen rechtstreekse articulatie met de femur heeft, is er toch

een verbinding aanwezig via de laterale collateraalband die vertrekt op de laterale femurcondyl en

eindigt distaal op de epifyse van de fibula (Evans & de Lahunta, 2013). Craniaal op de proximale tibia

bevindt zich de tuberositas tibiae (König & Liebich, 2007; Budras, 2007).

Skeletelementen kunnen met elkaar verbonden zijn via synartrosen (niet beweeglijke verbinding),

amfiartrosen (weinig beweeglijke verbindingen) of diartrosen (vrij beweeglijke verbindingen) (König &

Liebich, 2007). Deze gewrichten kunnen verder ingedeeld worden volgens verschillende kenmerken

(König & Liebich, 2007). Wanneer het aantal opbouwende beenderen in acht wordt genomen dan

wordt er van enkelvoudige gewrichten gesproken met twee samenstellende beenderen, of van

complexe gewrichten die opgebouwd zijn uit meer dan twee interagerende beenderen (König &

Liebich, 2007).

Diartrosen of beweeglijke gewrichten kunnen ook ingedeeld worden volgens het type beweging die

mogelijk is (König & Liebich, 2007). Hierbij worden uniaxiale, biaxiale en multiaxiale gewrichten

onderscheiden (Eurell & Frappier, 2006). Uniaxiale gewrichten kunnen slechts in één richting

bewegen en worden onderverdeeld in rol- en scharniergewrichten (König & Liebich, 2007).

Rolgewrichten zijn gewrichten waarbij de beenderen als het ware over elkaar rollen en alzo een

rotatiebeweging mogelijk maken waarvan de as parallel is aan de lengteas van de samenstellende

beenderen (König & Liebich, 2007). Scharniergewrichten daarentegen laten een beweging loodrecht

9

op de lengteas van de samenstellende beenderen toe (König & Liebich, 2007). Het femurotibiale

kniegewricht wordt beschouwd als een enkelvoudig, diarthrotisch scharniergewricht (König & Liebich,

2007).

5.1.2. Histologie en fysiologie Beenweefsel heeft een drieledige functie in het lichaam: ondersteuning, bescherming en een

metabole functie (Eurell & Frappier, 2006) (Sjaastad, et al., 2007). Daarnaast is er ter hoogte van het

beenmerg sprake van vetopslag en productie van bloedcellen (Sjaastad, et al., 2007). Beenweefsel

wordt beschouwd als een bindweefsel, dat per definitie bestaat uit bindweefselcellen en een

extracellulaire matrix, waarbij de onderlinge verhouding van deze componenten bepalend is voor de

functionele eigenschappen van het weefsel (Aughey & Frye, 2001). Bindweefsel ontwikkelt uit

embryonaal bindweefsel, mesenchym, dat ontstaat uit de mesodermlaag (Aughey & Frye, 2001). De

bindweefselcellen in beenweefsel zijn osteocyten, osteoblasten en osteoclasten (Aughey & Frye,

2001). De extracellulaire matrix bestaat uit collageenvezels, een amorfe grondsubstantie en

hydroxyapatiet (Aughey & Frye, 2001) (König & Liebich, 2007) (Bacha & Bacha, 2012).

Het zijn de osteoblasten, de botvormende cellen, die de collageenvezels en amorfe grondsubstantie

afzetten, wat samen het osteoid genoemd wordt (Bacha & Bacha, 2012). Het osteoid wordt

vervolgens gemineraliseerd door afzetting van hydroxyapatietkristallen (Bacha & Bacha, 2012;

Sjaastad, et al., 2007). Dit mineralisatieproces wordt geïnduceerd door de proteïnen en

proteoglycanen en de grondsubstantie (Sjaastad, et al., 2007). Tevens produceren de osteoblasten

alkalische fosfatase, een enzym dat de concentratie aan vrije fosfor ionen verhoogt, en stellen ze

Ca2+ vrij in het extracellulaire vocht (Sjaastad, et al., 2007). Osteocyten zijn voormalige osteoblasten

die ingesloten zijn geraakt tijdens dit mineralisatieproces en waarvan de botvormende capaciteit

verloren gegaan is (Aughey & Frye, 2001; Sjaastad, et al., 2007). De osteocyten blijven achter in

kleine holtes in het botweefsel, de lacunae (Bacha & Bacha, 2012). Ze zijn via diverse uitlopers met

elkaar verbonden via tight junctions (Bacha & Bacha, 2012; Sjaastad, et al., 2007). De verbindingen

tussen de lacunae, waardoor de uitlopers van verschillende osteocyten met elkaar in verbinding

staan, worden canaliculi genoemd (Bacha & Bacha, 2012). Via deze canaliculi is er uitwisseling van

hormonen, nutriënten en afvalstoffen tussen beenweefsel, de ingesloten osteocyten en de bloedvaten

mogelijk (Bacha & Bacha, 2012; Sjaastad, et al., 2007). Osteoclasten, de botafbrekende cellen,

ontstaan, net als osteoblasten, rechtstreeks uit de osteoprogenitorcellen (Bacha & Bacha, 2012). In

samenwerking met osteoblasten zorgen osteoclasten ervoor dat beenweefsel een dynamisch geheel

vormt dat ook na ontwikkeling en groei onderhevig is aan processen als remodellering en herstel

(Bacha & Bacha, 2012; Sjaastad, et al., 2007). Ze binden aan het beenoppervlak via

adhesiemolecules in hun membraan (Sjaastad, et al., 2007). Onder deze binding vormt er zich een

reactiekamer waarin protonen (H+) en proteasen afgezet worden met botafbraak tot gevolg (Sjaastad,

et al., 2007). De afbraakstoffen worden door de osteoblasten opgenomen en vrijgesteld in de

bloedbaan, van waaruit ze gerecycleerd of geëxcreteerd kunnen worden (Sjaastad, et al., 2007).

10

De anorganische fractie van beenweefsel bestaat voor een groot deel uit hydroxyapatiet, naast een

kleine fractie aan andere mineralen zoals natrium, magnesium en kalium (Sjaastad, et al., 2007).

Daarnaast is het mogelijk dat toxische of radioactieve stoffen ingebed raken in het beenweefsel

tijdens het mineralisatieproces (Sjaastad, et al., 2007). Respectievelijk 99% en 85-90% van het

aanwezige calcium en fosfor in het lichaam bevindt zich als hydroxyapatiet in het beenweefsel

(Sjaastad, et al., 2007). Dit beenweefsel kan bijgevolg als bron voor deze mineralen aangewend

worden wanneer nodig, zoals bijvoorbeeld bij dracht en lactatie (Sjaastad, et al., 2007). Deze

processen staan voornamelijk onder endocriende controle (Sjaastad, et al., 2007).

Biomechanische botadaptatie en remodellering op basis van compressie- en trekkrachten op het

beenweefsel is reeds lang bekend, bestudeerd en aangewend bij diagnose en behandeling van

diverse aandoeningen. Het proces vormt een evenwicht tussen osteoblastactiviteit, verantwoordelijk

voor aanmaak van beenmatrix, en osteoclastactiviteit, verantwoordelijk voor botafbraak, met als

eindresultaat een variabele botdensiteit en morfologie (Tat, et al., 2010). Het feit dat deze effecten

ook plaatsvinden ter hoogte van het subchondraal bot, kreeg lang weinig aandacht vanuit de

wetenschap of kliniek (Eckstein, et al., 1997). Er is echter sprake van een rechtstreeks verband

tussen krachten inwerkend op dit botweefsel en deze inwerkend op de gewrichtsoppervlakken

(Eckstein, et al., 1997). Chronische verandering in belasting van gewrichten, resulteert in een

afwijkend densiteitspatroon van het subchondraal bot ter hoogte van de betreffende gewrichtsvlakken

(Eckstein, et al., 1997). Verhoogde densiteit wordt gerelateerd aan regio’s onderhevig aan herhaalde

hoge belasting (Müller-Gerbl, et al., 1990). Ook op volwassen leeftijd kunnen veranderingen in

belasting nog leiden tot biomechanische botadaptatie (Eckstein, et al., 1997).

Onderzoek heeft uitgewezen dat wijzigingen in het densiteitspatroon vaak voorafgaan aan de

veruiterlijking van klinische aandoeningen, zoals bijvoorbeeld osteoarthritis (Bruyere, et al., 2003).

Vroeger werd vermoed dat deze wijzigingen vooral van secundaire aard waren, waardoor

densiteitsbepalingen vooral informatie konden verschaffen over een reeds verder geëvolueerd

probleem (Tat, et al., 2010). Vandaag de dag zijn er echter indicaties die erop wijzen dat

veranderingen in het metabolisme en het densiteitspatroon van subchondraal bot eerder een actieve

component is van osteoarthitis (Tat, et al., 2010). Verdere uitwerking en toepassing van deze kennis

zou alzo kunnen leiden tot een verbeterde preventie van orthopedische aandoeningen.

Bij mensen werd aangetoond dat gewrichten niet steeds perfect congruent zijn en dat de

subchondrale botdensiteit onder meer ook een weerspiegeling is van deze incongruentie (Eckstein, et

al., 1997). Incongruenties kunnen aangeboren zijn of ontwikkelen tijdens het verdere leven, zowel op

jonge als op volwassen leeftijd (Eckstein, et al., 1997). Zowel aangeboren als tijdens het verdere

leven verworven incongruenties dragen alzo, samen met de belasting van het gewricht, bij tot de

uiteindelijke densiteitsdistributie van het subchondraal bot (Eckstein, et al., 1997). Zo kan men

concluderen dat de subchondrale densiteitspatronen informatie verschaffen over de individuele

biomechanische situatie van een mens of dier (Zumstein, et al., 2012).

11

Onderzoek van Zumstein et al. heeft aangetoond dat er een significant verband is tussen

mechanische sterkte van verschillende plaatsen in een gewricht en de geassocieerde botdensiteit

(Zumstein, et al., 2012). Dit impliceert dat CT-OAM, een methode om de densiteit(sverdeling) te

bepalen, geïmplementeerd zou kunnen worden in het pre-operatief onderzoek bij orthopedische

ingrepen (Zumstein, et al., 2012) of bij bijvoorbeeld vergevorderde keuringen van sportdieren.

5.2. IN VIVO DENSITEITSBEPALING VAN (SUBCHONDRAAL)

BEENWEEFSEL

5.2.1. Inleiding Er zijn verschillende methoden om de mineralendensiteit van subchondraal bot (BMD of bone mineral

density) te bepalen. Vele van deze methodes, zoals histologie, biochemische analyse en micro-

computed tomography, zijn enkel bruikbaar ex-vivo of na invasieve staalname (Müller-Gerbl, et al.,

1990). Hierdoor gaan de voorspellende waarde met het oog op preventie en de

toepassingsmogelijkheden in praktijkomstandigheden deels verloren of worden ze sterk invasief

(Müller-Gerbl, et al., 1990). Methodes als kwantitatieve CT (QCT) en CT-osteoabsorptiometrie

(CT-OAM) kunnen wel in vivo gebruikt worden en openen perspectieven in klinische omstandigheden

(Müller-Gerbl, et al., 1990). Deze methodes zorgen voor een verbeterd dierenwelzijn bij onderzoek

aangezien de subjecten niet geëuthanaseerd moeten worden voor analyse, vooral wanneer er sprake

is van een strenge selectie van de proefdieren. Subchondrale mineralendensiteit kan via kwantitatieve

CT en CT-osteoabsorptiometrie gedurende een langere periode bij dezelfde dieren opgevolgd worden

(Müller-Gerbl, et al., 1990; Eckstein, et al., 1997). Bij QCT worden absolute densiteitsbepalingen

uitgevoerd terwijl osteoabsorptiometrie zich richt op bepaling van de relatieve densiteit of

densiteitsverhoudingen binnen een gewricht (Müller-Gerbl, et al., 1990).

De keuze van de te scannen botregio is afhankelijk van de aandoening waarvoor gescreend wordt, en

van de technische eigenschappen van de metingstechniek (Stepan, 2002).

Hieronder volgt een overzicht van de meest gebruikte methodes om de mineralendensiteit van

beenweefsel in vivo te bepalen op basis van röntgenstraling, en een korte vermelding van de

botanalyse.

5.2.2. Botanalyse In humane geneeskunde wordt bioptname ter hoogte van de crista iliaca en vervolgens analyse soms

gebruikt om de botkwaliteit van de patiënt te beoordelen (International Atomic Energy Agency (IAEA),

2010). Omdat deze methode zeer invasief is, wordt ze vandaag de dag veelal vervangen door minder

invasieve methodes (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Deze methodes zijn vaak

gebaseerd op röntgenstraling, maar ook technieken gebaseerd op echografie en magnetische

resonantie (MR) hebben hun intrede gedaan (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).

12

5.2.3. Röntgentechnologie

a. Basisprincipes Het basisidee van waaruit röntgen- of X-stralentechnologie vertrekt is de attenuatie van straling door

biologisch materiaal. De reststraling wordt geregistreerd op een gevoelige plaat en weergegeven

onder de vorm van verschillende grijstinten op de locatie waar de geattenueerde stralenbundel invalt.

Röntgenstralen bevinden zich in het spectrum van de electromagnetische straling en worden

gekarakteriseerd door een frequentie (f) en een golflengte (λ) (Thrall, 2013). De combinatie van

frequentie en golflengte kenmerken de snelheid van deze electromagnetische straling (Thrall, 2013).

Elektromagnetische straling heeft een snelheid gelijk aan deze van het licht, die een constante is

(Thrall, 2013). Hieruit kunnen we concluderen dat frequentie en golflengte omgekeerd evenredig zijn

aan elkaar (Thrall, 2013). De stralingsenergie is omgekeerd evenredig met de golflengte, en dus recht

evenredig met de frequentie (Thrall, 2013).

b. Hardware Voor het maken van röntgenfoto's zijn een regelbare röntgenstralenbron en -generator, en een

detector noodzakelijk. Daarnaast vormen een statief en een tafel de ondersteunende hardware. Een

ontwikkelaar of digitale verwerking is dan weer noodzakelijk om uit de techniek ook daadwerkelijk een

beeld te vormen.

De stralenbron wordt gevormd door een röntgenbuis die grofweg bestaat uit een anode en een

kathode in een vacuüm met een glazen omhulsel (Thrall, 2013) (Verhoye, 2011). Onder invloed van

een elektrische lading die doorheen het kathodefilament stroomt, worden elektronen vrijgesteld die

aangetrokken worden door de positief geladen anode, het doelwit (Thrall, 2013). Röntgenstralling

worden opgewekt door zowel collusie tussen de elektronen en de anode, als door radioactieve

interacties tussen de elektronen en atomen van de anode (Thrall, 2013).

De röntgen(stralen)generator zorgt ervoor dat, na opdrijven van de spanning door een transformator,

er elektrische stroom doorheen de kathode stroomt (Thrall, 2013) (Verhoye, 2011). Deze stroom is

recht evenredig met de hoeveelheid elektronen die vrijgesteld worden en bijgevolg met de

hoeveelheid röntgenstraling die opgewekt wordt. Dit kan geregeld worden door de milliampere (mA)

instellingen op het toestel (Thrall, 2013). De hoeveelheid opgewekte röntgenstraling neemt ook toe

met de tijdsduur van de elektrische stroom doorheen het filament (Thrall, 2013). Met de instelling mAs

(milliampere seconde) wordt de totale hoeveelheid straling gekwantificeerd op basis van de mA en de

duur van doorstroming van het filament (Thrall, 2013).

De versnelling van de elektronen tussen de kathode en de anode wordt bepaald door het voltverschil

tussen beide, en kan eveneens aangepast worden op het toestel als kiloVoltagepiek (kVp) (Thrall,

2013). Hoe groter deze versnelling, hoe hoger de energie van de opgewekte röntgenstralen (Thrall,

2013). Iedere mA-vKp-combinatie resulteert voor een röntgenbuis in een specifieke hoeveelheid

energie van de opgewekte straling (Thrall, 2013).

Er zijn twee types interacties tussen de elektronen en de atomen van de anode die resulteren in het

ontstaan van röntgenstraling (Thrall, 2013) (Verhoye, 2011).

13

Bij collusie botsen de inkomende elektronen tegen orbitaalelektronen van de anodeatomen (Thrall,

2013). Hierbij worden de orbitaalelektronen weggekaatst en komt er karakteristieke röntgenstraling

vrij (Thrall, 2013). Deze straling wordt karakteristiek genoemd omdat ze typerend is voor de

bindingsenergie die nodig is om het orbitaalelektron weg te kaatsen (Thrall, 2013). Deze

bindingsenergie is afhankelijk van het atoom, de schil waarvan het elektron weggekaatst werd en van

de bron van de inkomende elektronen (Thrall, 2013).

Bij radioactieve interactie daarentegen wordt er geen elektron weggekaatst, maar passeert het

inkomend elektron zeer dicht langs de (positieve aantrekkende) wolfraam-atomen waardoor het

afgeremd wordt (Thrall, 2013). Deze remming veroorzaakt vrijkomende energie onder de vorm van

röntgenstralen (Thrall, 2013). Deze straling wordt alzo toepasselijk 'bremsstraling' genoemd (brems is

het Duitse woord voor rem) (Thrall, 2013). Deze straling heeft, in tegenstelling tot de karakteristieke

röntgenstralen, een breed spectrum waarbij de frequentie toeneemt naarmate de inkomende

elektronen dichter bij de atoomkern passeren en bijgevolg sterker afgeremd worden (Thrall, 2013). De

energie van de röntgenstralen wordt uitgedrukt in kiloelektron volt (keV) (Thrall, 2013). Binnen een

stralenbundel zijn er stralen met een variabele energie aanwezig, waarbij de bremsstralen een

continu spectrum vormen terwijl de karakteristieke straling ten gevolge van collusie resulteert in

pieken van een specifieke (karakteristieke) energiewaarde (Thrall, 2013). De maximale energie van

een röntgenstralenbundel komt overeen met de ingestelde kVp, al is het percentage straling dat dit

niveau haalt eerder klein (Thrall, 2013). Deze maximale straling wordt opgewekt wanneer het

potentiaalverschil tussen de kathode en de anode maximaal is, wat men gedurende een zo groot

mogelijk deel van de tijd tracht te bekomen (zie verder) (Thrall, 2013).

Bremsstraling vormt een groot deel van de opgewekte röntgenstralen (Verhoye, 2011). Deze

stralenbundel bestaat uit straling van sterk variërende frequenties, waarvan slechts bepaalde

frequenties bruikbaar zijn voor de beeldvorming (Verhoye, 2011). De onbruikbare frequenties zouden,

wanneer de volledige stralenbundel gebruikt wordt bij beeldvorming, een onnodige verhoging van de

stralingsdosis veroorzaken en het beeldcontrast verlagen (Verhoye, 2011). Om dit tegen te gaan

worden er aluminium filters geplaatst die zachte stralen, dit zijn röntgenstralen met een lage

frequentie, absorberen (Verhoye, 2011).

Om de stralingsdosis voor de patiënt zo laag mogelijk te houden worden de röntgenstralen zorgvuldig

gericht zodat enkel het interessegebied belicht wordt (Verhoye, 2011). Dit gebeurt met behulp van

een collimator op het toestel (Verhoye, 2011).

Röntgenstralen ondergaan in het lichaam van de patiënt naast absorptie ook verstrooiing (zie verder)

die de scherpte van het beeld kan verlagen (Thrall, 2013) (Verhoye, 2011). Om deze effecten zo veel

mogelijk te beperken wordt een loden rooster of bucky diafragma geplaatst tussen de patiënt en de

detectoren (Verhoye, 2011). Deze roosters blokkeren stralen die niet loodrecht op de detector invallen

en die dus vermoedelijk het gevolg zijn van verstrooiing (Verhoye, 2011).

De inkomende elektronen veroorzaken een sterke verhitting ter hoogte van de anode (Thrall, 2013).

Daarom is het van belang dat het smeltpunt van deze anode zeer hoog is (Thrall, 2013). Veelal wordt

er gekozen voor wolfraam, met een smeltpunt van 3422°C (Thrall, 2013). Een bijkomend voordeel

14

van wolfraam is dat het een hoog atoomnummer (74) heeft, waardoor de elektronen zeer sterk

aangetrokken worden door de wolfraam atomen (Thrall, 2013). Dit verhoogt de efficiëntie van de

röntgenbuis, meerbepaald bij het ontstaan van bremstraling (Thrall, 2013).

Omdat er gebruik gemaakt wordt van wisselstroom, zou het voltverschil tussen anode en kathode

continu variëren tussen +kVp en -kVp, waarbij deze slechts een fractie van de tijd maximaal of

minimaal is naast alle (suboptimale) tussenfasen tussen +kVp en -kVp (Thrall, 2013). Omwille van de

opgewekte hitte ter hoogte van de anode zijn er ook hier vrije elektronen aanwezig (Thrall, 2013). De

wisselstroom zorgt er normaal gezien voor dat er momenten plaatsvinden waarop het filament positief

is ten opzichte van de doelwitanode, waardoor de vrije elektronen die hier aanwezig zijn

aangetrokken zouden worden door het filament en daar schade zouden kunnen veroorzaken (Thrall,

2013). Om dit te voorkomen wordt er gebruik gemaakt van rectificatie, waardoor het filament steeds

negatief blijft ten opzichte van het doelwit en schade door tegengestelde elektronenstroming

voorkomen wordt (Thrall, 2013).

De efficiëntie bij het opwekken van röntgenstralen verlaagt tijdens de suboptimale fasen tussen de -

kVp pieken (Thrall, 2013). Vandaag de dag wordt deze efficiëntieverlaging zoveel mogelijk

tegengegaan door hoogfrequentie röntgen(straling)generatoren (Thrall, 2013). Bij deze generatoren is

er sprake van een bijna continu maximaal voltverschil tussen het kathodefilament en de anode

(Thrall, 2013).

Invallende elektronen kunnen eveneens schade veroorzaken ter hoogte van de anode, vooral

wanneer deze continu op hetzelfde (focale) punt binnenkomen (Thrall, 2013). Dit wordt ingeperkt door

het doelwit te laten roteren waardoor de elektronen steeds op een ander punt binnenkomen (Thrall,

2013). Tevens wordt gebruik gemaakt van een

schuin geslepen anodedoelwit, waardoor het

voordeel van een brede invallende elektronenbundel

(minder hitteconcentratie) gecombineerd wordt met

het voordeel van een smalle uitgaande

röntgenstralenbundel (zie figuur 2) (Thrall, 2013). De

smalle uitgaande röntgenstralenbundel zorgt voor

een verhoging van de detailweergave op het

eindbeeld (Thrall, 2013). De uitgaande

röntgenstralenbundel kan eveneens versmald

worden door een versmalling van de invallende

elektronenbundel (Thrall, 2013). Sommige toestellen

laten toe de breedte van de elektronenbundel te

regelen via selectie van een breder of dunner kathodefilament (Thrall, 2013). Hoe dunner het filament

echter, hoe lager de maximale milliampere die gebruikt kan worden (Thrall, 2013). Bij de combinatie

van een dun filament en een hoge mA instelling bestaat namelijk het risico van oververhitting en

doorbranden van het kathodefilament (Thrall, 2013).

Figuur 2: Anode, Bron: Thrall, 2013

15

c. Stralen-weefsel-interactie en attenuatie Er zijn vijf verschillende manieren waarop röntgenstralen interactie aangaan met (organisch)

materiaal, waaronder paarvorming en fotodesintegratie die minder van belang zijn voor medische

beeldvorming (Thrall, 2013). De drie interacties die wel van groot belang zijn bij beeldvorming zijn de

compton verstrooiing, coherente verstrooiing en foto-elektrische effecten (Thrall, 2013).

Coherente verstrooiing is een interactie tussen een foton en het materiaal, waarbij het foton van

richting verandert maar er geen energieverandering plaatsvindt bij het foton en het object het foton

niet absorbeert (Thrall, 2013). Deze vorm van verstrooiing is ongewenst aangezien de fotonen niet

bijdragen tot het beeld, maar net de beeldkwaliteit verminderen en een risico vormen voor

radioveiligheid (Thrall, 2013). Slechts vijf procent van de straling die de patiënt in aanraking komt

resulteert in coherente verstrooiing (Thrall, 2013).

Compton verstrooiing ontstaat bij botsing tussen een foton en een elektron uit een perifere schil van

een atoom uit het weefsel, waarbij de elektron wordt weg geprojecteerd en het foton in een andere

richting en met een verlaagde energie verstrooid wordt (Thrall, 2013). In tegenstelling tot interacties

die afhankelijk zijn van het atoomgetal van de weefselatomen, is het ontstaan van compton

verstrooiing hier onafhankelijk van (Thrall, 2013). Hierdoor heeft dit type interactie eveneens een

negatief effect op de beeldkwaliteit en op de radioveiligheid zonder bij te dragen aan de beeldvorming

van inwendige structuren (Thrall, 2013). De mate waarin compton verstrooiing voorkomt is afhankelijk

van het energieniveau van de straling (Thrall, 2013).

Foto-elektrische effecten zijn het resultaat van de belangrijkste (gewenste) interacties als het aankomt

op beeldvorming (Thrall, 2013). Hierbij komt een foton in collusie met een elektron uit de binnenste

schil(len) van een weefselatoom (Thrall, 2013). Het foton wordt geabsorbeerd en het elektron wordt,

als fotoelektron, weggekaatst (Thrall, 2013). Dit fotoelektron wordt opnieuw geabsorbeerd in

organisch weefsel binnen het lichaam en heeft dus bijgevolg geen effect op het beeld (Thrall, 2013).

Het is de absorptie van deze fotonen, die afhankelijk is van het atoomgetal van het weefsel waar de

absorptie optreedt, die ervoor zorgt dat grijswaarden in het gevormde beeld variëren op basis van

verschillen tussen weefsels waar de stralen op invallen (Thrall, 2013).

De absorptie van röntgenstralen door weefsel is afhankelijk van de intensiteit van de invallende

röntgenstralen (Iin), de massa-absorptiecoëficiënt (σ, in m²/kg) en de dichtheid van het weefsel (ρ, in

kg/m³) (Verhoye, 2011). De massa-absorptiecoëfficiënt is afhankelijk van de energie van de

invallende röntgenstralen (Verhoye, 2011). De radioloog kan bijgevolg de mate van absorptie

beïnvloeden door het energieniveau van de röntgenstralen aan te passen (Verhoye, 2011).

d. Beeldvorming en densiteitsbeoordeling Zoals eerder vermeld wordt het uiteindelijke beeld bij röntgenfoto's gevormd door registratie van

invallende straling op een gevoelige detector. De zwarting die hierbij bekomen wordt op film of op een

monitor, is afhankelijk van de intensiteit van de X-stralen die hierop invallen (Verhoye, 2011). Hoe

hoger de filamentspanning en dus hoe groter de elektronenbundel tussen het kathodefilament en het

anodedoelwit, hoe sterker de zwarting (Verhoye, 2011).

16

Densiteitsbepalingen voor detectie van gegeneraliseerde veranderingen gebeurde, voor het

beschikbaar worden van nieuwere technieken als DEXA en CT, op basis van klassieke

röntgenbeelden (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Hiervoor werden opnames van

de heup en de ruggenwervels gebruikt om, via diverse rekenmethoden, eventuele osteoporose aan te

tonen (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Eén van die methoden was de Singh-index

waarbij radioöpaciteit van de trochanter visueel werd beoordeeld (International Atomic Energy Agency

(IAEA), 2010). Dit werd veelal tesamen met de beoordeling van de femorale calcar breedte

(International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Bij de Singh index wordt concreet het trabeculair

patroon ter hoogte van de proximale femur vergeleken met een referentieschaal (Cooper, et al.,

1986). De zichtbaarheid van deze trabekels wordt onderverdeeld in 6 graden, die sterk gecorreleerd

zijn aan de botdensiteit die toeneemt van graad 1 naar graad 6 (Cooper, et al., 1986). Nadelen zijn

dat er een verandering van ongeveer 30% moet optreden alvorens dit waarneembaar is, en dat een

hoge resolutie vereist is bij de beeldvorming, wat gepaard gaat met een hogere blootstelling aan

ioniserende straling (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). De femorale calcar is een

dense botbalk die zich bevindt onder de trochanter minor van de proximale femur (Griffin, 1982). De

breedte van deze calcar is eveneens gerelateerd aan botdensiteit (International Atomic Energy

Agency (IAEA), 2010) (Cooper, et al., 1986). Deze methode werd ontwikkeld door Horsman et al.

(Cooper, et al., 1986).

Een andere methode om botdensiteit te bepalen die gebruik maakt van klassieke röntgenbeelden is

de metacarpaalindex (MCI), waarbij de cortex van de metacarpus wordt uitgezet tegen de gehele

dikte van deze metacarpus (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).Een nadeel van deze

techniek is dat veranderingen trager optreden in de cortex en dus minder snel gedetecteerd kunnen

worden als deze bij de Singh index (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).

Recentere methodes zijn ontwikkeld uit de digitale radiografie (computed radiography of CR) en

stellen ons in staat om de densiteit daadwerkelijk te kwantificeren door absorpties uit te zetten tegen

deze van een fantoom (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Omdat er bij radiografie

schaduwvorming is van alle superponerende weefsels, is het interessant om hiervoor beenderen te

selecteren waarbij er in verhouding weinig weke delen aanwezig zijn (International Atomic Energy

Agency (IAEA), 2010).

5.2.4. Dual Energy X-ray Absorption (DEXA of DXA) Dual energy X-ray absorption (DEXA of DXA) is een meettechniek die uitgaat van hetzelfde principe

als klassieke radiografie: specifieke attenuatie van röntgenstralen door organische weefsels op basis

van dikte, densiteit en samenstelling (Ralston, 2005) (International Atomic Energy Agency (IAEA),

2010). Bij DEXA wordt de minderalendensiteit gekwantificeerd door gebruik te maken van absorptie

bij twee verschillende stralingsenergieniveaus (Ralston, 2005) (International Atomic Energy Agency

(IAEA), 2010). Hierbij wordt het lichaam beschouwd als driecompartimenteel met als compartimenten

beenweefsel, vet en vetvrije zachte weefsels (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). De

17

attenuatiecoëfficiënten van deze compartimenten (weefsels) zijn gekend voor de verschillende

energieniveaus (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Bij een lage stralingsenergie

(lage KeV instelling) is de attenuatie door beenweefsel veel hoger dan deze door weke delen of lucht

(Ralston, 2005). Bij een hoge stralingsenergie is dit verschil bijna afwezig (zie tabel 1) (Ralston,

2005). Wanneer de attenuatie door een specimen bij verschillende energieën wordt vergelegen is het

mogelijk om mathematisch te corrigeren voor de weke delen en lucht, en zo uitsluitend de

attenuatiewaarden voor beenweefsel mee te nemen in verdere berekeningen (Ralston, 2005). De

attenuatiewaarden voor beenweefsel worden dan vergeleken met de attenuatiewaarden van het

gebruikte fantoom (Ralston, 2005). Dit systeem heeft tot gevolg dat de densiteitsmeting bij DEXA

gebeurt in massa per oppervlakte (pixel), in tegenstelling tot QCT of CT-OAM, waarbij metingen

gebeuren per volume-eenheid (voxel) (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).

Materiaal

lucht been spier vet

Stralings-

energie (KeV)

10 4,91 19,790 5,154 3,081

50 0,205 0,347 0,224 0,201

100 0,154 0,180 0,170 0,168

Tabel 1: massa attenuatiecoëfficiënt van röntgenstralen voor verschillende weefsels en materialen, Bron: adaptatie van Ralston, 2005

Na eliminatie van de attenuatie voor niet-beenweefsel worden er drie waarden berekend: bone

mineral content (BMC), bone area (BA) en areal bone mineral density (aBMD) (International Atomic

Energy Agency (IAEA), 2010). De BMC geeft de hoeveelheid hydroxyapatiet, als de voornaamste

component van beenweefsel, weer in gram (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).

Niet-minerale componenten van beenweefsel worden hierbij niet in rekening gebracht (International

Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Het BA geeft weer hoe groot het oppervlak is dat wordt bedekt

met beenweefsel (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). De aBMD is het eindcijfer

waarin we geïnteresseerd zijn, namelijk de mineralendensiteit in gram per vierkante centimeter

(g/cm²) (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Dit wordt berekend door de BMC te delen

door de BA (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010).

Voordelen van DEXA zijn een korte scantijd, een lage dosis ioniserende straling in vergelijking met

CT technieken en goedkoop in vergelijking met MRI technieken (International Atomic Energy Agency

(IAEA), 2010). Een nadeel is dat de resultaten uitsluitend weergegeven worden in densiteit per pixel

(Nazarian, et al., 2008).

Gebruikte referentiewaarden in de humane geneeskunde zijn afhankelijk zijn van geslacht, leeftijd en

etnische afkomst (International Atomic Energy Agency (IAEA), 2010). Mogelijk spelen er in

diergeneeskunde ook dergelijke verschillen.

18

5.2.5. Computed Tomography (CT) technologie

a. Basisprincipes Computed tomography is een beeldvormingstechniek waarbij een beeld wordt opgesteld op basis van

de attenuatie van röntgenstralen in ieder punt van een driedimensionaal lichaam. Omdat de

attenuatie van röntgenstralen in iedere richting van het x-y vlak doorheen het lichaam bepaald wordt,

en deze registratie herhaald wordt in het z-vlak, is het mogelijk om de attenuatiecoëfficiënt van ieder

individueel punt of voxel te berekenen waardoor een volledig driedimensionaal beeld bekomen kan

worden door het scannen van achtereenvolgende transversale vlakken. De berekeningen die hiervoor

nodig zijn, zijn echter zodanig uitgebreid en complex dat integratie van een computer noodzakelijk is

(Verhoye, 2011). CT beeldvorming bestaat dus uit twee stadia, waarbij het eerste stadium bestaat uit

de scantijd zelf, en het tweede uit het computergestuurd samenstellen van de beelden op basis van

de scans (Adams, 2009).

De attenuatie wordt uitgedrukt in hounsfield units (HU), waarbij de attenuatiecoëfficiënt van het

weefsel in kwestie wordt vergeleken met deze van water met waarde nul (Vandenberghe, 2014).

Lucht heeft hierbij een waarde van -1000 HU, wat resulteert in een donkere grijstint, en beenweefsel

heeft een waarde van 400 tot 1000 HU waardoor hier sprake is van een lichtere grijstint

(Vandenberghe, 2014) (Vandenberghe, 2014).

Figuur 3: Hounsfield units voor diverse weefsels, Bron: Vandenberghe, S., 2014; Verhoye, M., 2011

De HU waarde wordt bepaald door de atoomnummers van de absorberende stof aanwezig in de

weefsels (Adams, 2009). Er is een hogere mate van absorptie in gebieden met hogere

atoomnummers, wat resulteert in hogere HU waarden (Adams, 2009). Om uit deze HU waarden

(weergegeven als grijstinten) een kwantitatieve waarde met betrekking tot de densiteit te kunnen

onttrekken, wordt er een fantoom in het scanveld gebracht (Adams, 2009). Dit fantoom bevat

verschillende compartimenten met een bekende densiteit, uitgedrukt in mg/cm³ (Adams, 2009).

Grijstinten uit de patiëntmetingen kunnen vergeleken worden met grijstinten uit het fantoom om zo de

densiteit van het weefsel van de patiënt te bepalen (Adams, 2009). Door attenuatiewaarden van de

verschillende fantoomcompartimenten te gebruiken, kunnen HU-waarden van voxels uit de

patiëntbeelden omgezet worden in densiteitswaarden (Adams, 2009). De verschillende organen

19

hebben een HU-waarde die kan overlappen met de HU-waarde van andere organen (zie figuur 4)

(Verhoye, 2011). Identificatie van organen kan dus niet gebeuren uitsluitend op basis van grijswaarde

van het weefsel op een CT-beeld (Verhoye, 2011).

Figuur 4: HU-waarde van verschillende organen, bron: Verhoye, M., 2011

b. Hardware De CT-unit (3e generatie) bestaat uit de beeldvormingshardware, een bedieningsmodule/software en

eventuele uitbreidingen (Saunders & Ohlerth, 2011). De beeldvormingshardware wordt gevormd door

vergelijkbare basisapparatuur als deze nodig voor het nemen van gewone röntgenfoto's: een

röntgengenerator en röntgenbuis, filters, een collimator, een bucky-diafragma en detectoren. Deze

hardware is geïnstalleerd op een cirkelvormig statief, waarbij de stralingsbron en de detectoren zich

tegenover elkaar bevinden. Beide elementen draaien gelijktijdig en synchroon rond binnen dit statief.

De patiënt bevindt zich in de centrale opening op een beweegbare tafel die doorheen de opening

beweegt in z-richting.

Doorheen de evolutie van de CT-technologie zijn er verschillende types van CT-scanners ontwikkeld.

Vandaag de dag wordt er voornamelijk gewerkt met derde generatie scanners omdat de

beeldkwaliteit goed is, er minder detectoren nodig zijn dan bij de vierde generatie (goedkoper) en er

septa geplaatst kunnen worden tussen de detectoren waardoor strooistraling beter geblokkeerd kan

worden in vergelijking met vierde generatie scanners (Vandenberghe, 2014). Derde

generatiescanners maken gebruik van een brede fan beam en een combinatie van verschillende,

lineair geplaatste detectoren (Vandenberghe, 2014). Hierdoor wordt de patiënt in eenmaal omvat en

moeten de stralingsbron en -detectoren, in tegenstelling tot eerdere generatie scanners, geen extra

beweging maken per beeld (Vandenberghe, 2014). Dit reduceert de scantijd en bijgevolg ook de

dosis zeer sterk en het zorgt er tevens voor dat de techniek minder gevoelig is voor

bewegingsartefacten (Vandenberghe, 2014).

20

In de loop van de evolutie werd er steeds meer overgeschakeld van een seriële techniek naar een

spirale techniek (Verhoye, 2011). Bij de seriële techniek wordt er herhaald een scan uitgevoerd in een

volledige rotatie, waarna de tafel met patiënt voortbewogen wordt in de scanner en er een nieuwe

scanfase start (Verhoye, 2011). In de spirale techniek wordt de patiënt aan een continue snelheid

voortbewogen doorheen de scanner terwijl deze blijft roteren en scannen (Verhoye, 2011). Hierbij

ontstaat een spiraalvormige beweging van de scanner over de patiënt, die de continuïteit van de

beelden doorheen het gescande volume verbetert (Verhoye, 2011). Dit was uiteraard pas mogelijk

sinds de invoering van de derde generatie scanners. Een andere evolutie is deze van de fan beam

naar de cone beam, waarbij de stralenbundel ook in z-richting wordt verbreed en multislice scans

mogelijk worden (Verhoye, 2011). Voordeel van deze techniek is een verdere toename van de

scansnelheid, maar als nadeel moet er rekening gehouden worden met een toename van de

strooistraling die de beeldkwaliteit doen dalen (Vandenberghe, 2014). Uiteraard resulteert dit in een

nog complexere beeldreconstructie (Vandenberghe, 2014).

c. Procedure Een CT scan procedure is opgebouwd uit verschillende stappen. Om te beginnen wordt de patiënt op

de tafel gebracht en wordt de positie (dorsaal, rechtslateraal, linkslateraal of ventraal) van de patiënt

ingegeven in de computer. De tafel wordt zodanig gepositioneerd dat de patiënt horizontaal door het

nulpunt van het x-y-assenstelsel van de ct-scanner beweegt. Vervolgens worden er twee

tomogrammen of scouts gemaakt (Nöller, 2007). Dit zijn klassieke radiografische opnames in

dorsoventrale en latero-laterale richting. Op basis van deze opnames wordt het bereik van de CT

scan ingesteld als driedimensionaal volume. Met deze instellingen wordt het scannen gestart en de

geattenueerde straling wordt opgevangen door de detectoren (Nöller, 2007). Informatie van

detectoren uit verschillende slices of uit de helix wordt via computerverwerking omgezet in een beeld,

waarbij de verschillende slices (in volgorde) of helix achter elkaar geplaatst worden om een volledig

driedimensionaal beeld te krijgen van het gescande lichaam(sdeel). Beoordeling van deze beelden is,

door middel van gereformatteerde beelden, mogelijk in drie ruimtelijke oriëntaties: transversaal,

sagittaal en dorsaal (Nöller, 2007). Sagittale beelden verlopen parallel met de lengteas van het

lichaam in dorsoventrale doorsnede waar dorsale beelden eveneens parallel verlopen met de

lengteas van het lichaam maar dan in links-rechtsdoorsnede (Nöller, 2007). De transverse beelden

vormen een dwarsdoorsnede loodrecht op de lengteas van het lichaam. Wanneer humane beelden

vergeleken worden met diergeneeskundige beelden, is het van belang om de oriëntatie in

beschouwing te houden (Nöller, 2007). Vooral bij beoordeling van structuren ter hoogte van het hoofd

is dit belangrijk, waarbij dorsale/coronale beelden uit de humane geneeskunde overeen komen met

transversale beelden in diergeneeskunde en dorsale beelden in diergeneeskunde corresponderen

met axiale/transversale beelden in de humane geneeskunde (zie figuur 5) (Nöller, 2007).

21

Figuur 5: Oriëntaties, vergelijking tussen diergeneeskunde en humane geneeskunde, bron: Nöller, 2007

d. Densiteitsbepaling door Kwantitatieve Computed Tomography (Quantitative computed

tomography, QCT) De basis van QCT is de klassieke computed tomography waarbij de attenuatie voor een ingestelde

region of interest (ROI) vergeleken wordt met het fantoom dat tegelijkertijd gescand wordt (Ralston,

2005). Dit laatste is nodig omdat de attenuatie afhankelijk is van de weefselsamenstelling en de

scanparameters: kVp, mA, ms en de afstand tussen de röntgenbuis en het specimen of de patiënt.

(Ralston, 2005). Bij kwantitatieve computed tomography (QCT) wordt de attenuatiewaarde berekend

als gemiddelde voor ROI (Adams, 2009). Dit heeft tot gevolg dat, als er verschillende weefselsoorten

dit ROI opmaken, de HU waarde voor die ROI niet representatief is voor de individuele weefsels in

kwestie maar eerder een gemiddelde van de samenstellende weefsels (Adams, 2009). Door de

gelimiteerde resolutie in combinatie met het toepassen van deze gemiddelde waarden per ROI,

kunnen densiteitsvariaties niet bepaald worden voor kleine zones (Adams, 2009) (Nazarian, et al.,

2008). Bij onderzoek van trabeculair been is het bijvoorbeeld mogelijk dat binnen een bepaalde ROI

zowel beenweefsel als lucht aanwezig is (Adams, 2009). De HU waarde zal in dit geval lager zijn dan

de HU waarde die overeenstemt met de densiteit van het bot, en hoger dan deze die overeenstemt

met de densiteit van lucht. Dit kan ook een probleem vormen bij metingen ter hoogte van de dunne

subchondrale eindplaat van een bot (Adams, 2009). Of een meting accuraat uitgevoerd kan worden is

dus afhankelijk van de afmetingen van het weefsel en de samenstelling van de ROI in relatie tot de

gebruikte ROI- en voxelgrootte (Adams, 2009). Om het probleem van weefselcombinaties binnen een

ROI te counteren kan er gebruik gemaakt van een techniek die DEXA en QCT combineert: de Dual

Energy CT (Ralston, 2005). In de praktijk wordt dit echter niet uitgevoerd omwille van de nadelen: een

hogere stralingsdosis en een lagere precisie (Ralston, 2005).

22

Micro-CT (µCT) en kwantitatieve µCT (QµCT) zouden hiervoor theoretisch een oplossing kunnen

bieden omdat deze artefacten een minder grote invloed hebben bij deze schaalvergroting. Er zijn

echter een aantal beperkingen voor in vivo metingen op deze schaal (Gregor, et al., 2012). De eerste

µCT opstellingen zijn uitsluitend bruikbaar voor ex-vivo metingen gezien het monster op een draaiend

plateau geplaatst wordt, er een sterke beperkingen is qua afmetingen van het monster en de scantijd

langer is dan bij een klassieke CT-scan (Gregor, et al., 2012). In dit systeem bevindt het draaiend

sample zich tussen een stationaire röntgenstralenbron en een detector (Gregor, et al., 2012). De

afmetingen van het monster bedraagt bij voorkeur maximaal 500 à 1000 maal de gewenste resolutie

(Gregor, et al., 2012). Afhankelijk van de gewenste resolutie bedraagt de scantijd één (detail tot

10 µm) tot 24u (detail tot 1 µm) en de (bijbehorende) stralingsdosis, wat eveneens een probleem zou

kunnen opleveren voor in-vivo scans (Gregor, et al., 2012). Nieuwere systemen, gericht op in vivo

scans hebben een opstelling met een bewegende röntgenstralenbron en -detector (Gregor, et al.,

2012). Bij in vivo µCT bedraagt de beste resolutie die bereikt kan worden 30 tot 100 µm (Gregor, et

al., 2012). De afstand tussen het sample en de detector, die bij de ex vivo µCT systemen aangewend

wordt om de resolutie te optimaliseren, kan hier bijgevolg moeilijker aangepast worden (Gregor, et al.,

2012). Daarnaast speelt er ook een beperking in scantijd en stralingsdosis (Gregor, et al., 2012). De

toegestane afmeting van het staal blijft echter zeer klein, wat het systeem nog steeds buiten bereik

houdt voor gebruik bij honden (Gregor, et al., 2012).

In vergelijking met DEXA, dat densiteiten meet binnen een bepaald vlak (BMDa, bone minderal

density area), gebeurt de meting bij QCT binnen een bepaald volume (Adams, 2009). Dit biedt de

mogelijkheid om een onderscheid te maken tussen verschillende weefsels, op voorwaarde dat de

afmetingen van de individuele voxels voldoende klein zijn (Ralston, 2005) (Adams, 2009).

Daarenboven krijgt de onderzoeker bij QCT meer geometrische informatie dan bij DEXA (Ralston,

2005).

Er zijn echter ook nadelen aan QCT verbonden. De blootstelling aan ioniserende straling ligt bij QCT

hoger dan bij DEXA (Adams, 2009). Wanneer we QCT vergelijken met andere diagnostische

methodes, zoals bijvoorbeeld radiografieën, is de dosis nog beperkt (Adams, 2009). Concreet gaat

het bij een meting ter hoogte van de lumbaalwervels om een blootstelling aan ongeveer 90 µSv

(Adams, 2009). Er zijn specifieke QCT-scanners op de markt, al is het in principe mogelijk om met

elke CT-scanner densiteitsmetingen uit te voeren (Ralston, 2005).

e. Densiteitsbepaling door CT-osteoabsorptiometrie (CT-OAM) CT-OAM werd in 1989 voor de eerste keer voorgesteld door Müller-Gerbl et al. als alternatieve

methode om de densiteitsdistributie ter hoogte van een gewricht te bepalen (Müller-Gerbl, et al.,

1990; Leumann, et al., 2015). De basis is hier een klassieke CT-scan die via specifieke CT-OAM

software wordt verwerkt tot een densiteitsdistributiemap (Leumann, et al., 2015). Hierbij wordt de

X-stralenabsorptie per voxel berekend over een vooraf bepaalde afstand (aantal voxels) loodrecht op

het gewrichtsoppervlak (Müller-Gerbl, et al., 1990). De som of hoogste waarde van deze

absorptiewaarden, afhankelijk van de instellingen, wordt vervolgens weergegeven op het

gewrichtsoppervlak als een tweedimensionale map in grijswaarden op een kleurenmap (Müller-Gerbl,

23

et al., 1990; Norimasa, et al., 2000). Zo ontstaan er op deze oppervlaktemap lijnen die (kleur)zones

met een gelijke densiteit met elkaar verbinden: de equidensiteitslijnen (Müller-Gerbl, et al., 1990). In

tegenstelling tot de (CT-)densitometrie methodes wordt er bij CT-OAM dus geen absolute

densiteitswaarde weergegeven, maar een relatieve densiteitswaarde ten opzichte van omgevende

gebieden (Müller-Gerbl, et al., 2008). Het beeld dat zo bekomen wordt is een densitogram (Müller-

Gerbl, et al., 2008). Het is wel mogelijk om de resultaten te ijken via een ijklijn opgesteld op basis van

CT-OAM beelden van een fantoom, gemaakt tijdens dezelfde scan. Op deze manier kan een

densiteitswaarde of densiteitsrange berekend worden.

In de humane geneeskunde, en recent ook steeds meer in de diergeneeskunde, zijn per gewricht

mappen opgesteld die corresponderen met fysiologische en pathologische situaties van het

subchondraal bot (Leumann, et al., 2015).

24

6. ONDERZOEK

6.1. MATERIAAL EN METHODEN

6.1.1. Algemeen Binnen deze studie werd de validiteit van het gebruik van CT-OAM voor densiteitsbepaling van

beenweefsel bij honden onderzocht. Tevens werd er een initiërend onderzoek gedaan naar het effect

van verschillende bewaarmethoden op de mineralendensiteit van beenweefsel.

Op pagina 25 is een flowchart van het onderzoeksproces weergegeven. Meer gedetailleerde

informatie per stap is uitgewerkt op pagina 26 en volgende.

25

6.1.2 Selectie van kadavers van 15 grote honden

6.1.3 Mechanisch vrij prepareren van femur en tibia

6.1.4

Indelen van de poten in 6 verschillende groepen

Alcohol 70% Controle alcohol

(diepvries) Formol

Controle formol

(Diepvries) Maceratie Afkoken

6.1.5

Maceratieproces

Afkoken

+ verwijderen

restspieren

Bewaartijd:

4 maanden

Bewaarmethode:

Alcohol 70%

Bewaartijd:

4 maanden

Bewaarmethode:

Diepvries

Bewaartijd:

4 maanden

Bewaarmethode:

Formol

Bewaartijd:

4 maanden

Bewaarmethode:

Diepvries

Bewaartijd: 3 dagen

Bewaarmethode:

Diepvries

Bewaartijd: 3 weken

Bewaarmethode:

Diepvries

6.1.6 Staalname

6.1.7 CT onderzoek van de genomen stalen

6.1.8 Biochemische analyse

6.1.9 CT-OAM

6.1.10 Statistiek

Tabel 2: Flowchart van het onderzoeksproces

26

6.1.2. Selectie van kadavers Kadavers van vijftien honden, geselecteerd op basis van grootte, werden in deze studie opgenomen.

Er werd geen selectie uitgevoerd op basis van ras of eventuele orthopedische aandoeningen. In

onderstaande tabel 3 is een overzicht van de aanwezige rassen terug te vinden.

Alcohol 70% + controlegroep Formol + controlegroep Maceratie + afkoken

Duitse herder Mechelse herder Labrador retriever

Herder kruising Bouvier Boxer

Labrador retriever Labrador retriever Rottweiler

Labrador retriever Amerikaanse bulldog Labrador retriever

Labrador retriever Berder sennenhond Labrador retriever Tabel 3: Rassen gebruikt in de studie

6.1.3. Mechanisch vrijprepareren van femur en tibia De achterpoten werden verwijderd en de kniegewrichten werden vrijgeprepareerd door het manueel

verwijderen van omgevende weke delen. Van ieder gewricht werden femur en tibia behouden voor

verder onderzoek.

6.1.4. Indeling in groepen De gewrichten (combinatie femur-tibia per poot) werden ingedeeld in zes verschillende groepen zoals

weergegeven in tabel 4. Hierbij werden de verschillende knieën per hond ingedeeld in een

onderzoeksgroep en controlegroep voor het onderzoek naar de verschillende bewaringsmethoden.

Honden Rechterknie Linkerknie

1 t.e.m. 5 Alcohol 70% Controle alcohol (Diepvries)

6 t.e.m. 10 Formol Controle formol (Diepvries)

11 t.e.m. 15 Afkoken Maceratie Tabel 4: Indeling van de gewrichten volgens groep.

Bij de groep Controle formol (Diepvries) werden er slechts vier gewrichten gebruikt. De knie van de

Berner sennenhond is hierbij verloren gegaan.

6.1.5. Voorbereidende processen en bewaring De beenderen van de verschillende groepen werden op verschillende manieren verwerkt en bewaard

om het effect van deze bewaringsmethodes op de mineralendensiteit van het bot te kunnen

evalueren.

De beenderen in de groepen alcohol 70% en formol werden in bokalen gebracht waarin zich

respectievelijk een 70% alcohol oplossing en een 37% formaldehyde oplossing in water (formol)

bevond. Deze bokalen werden gedurende 4 maanden bij kamertemperatuur in een donkere ruimte

bewaard.

De beenderen in de twee controlegroepen, controle alcohol (Diepvries) en controle formol (Diepvries),

werden na het vrijprepareren gedurende 4 maanden diepgevroren bewaard bij -20°C.

27

De beenderen uit de groep maceratie werden in een warmwaterbad met biotex® geplaatst. Dit proces

werd beëindigd vlak voor de staalname waardoor de bewaartijd voor deze beenderen beperkt was tot

3 dagen. Omdat er na maceratie geen degradatieprocessen meer verwacht worden, was een

bewaartijd hier niet noodzakelijk.

De beenderen in de groep afkoken werden in netzakjes gebracht en gezamenlijk afgekookt.

Vervolgens werden de laatste resten van het weke delen materiaal zo goed mogelijk manueel

verwijderd en werden de beenderen gedurende 3 weken diepgevroren bewaard bij -20°C.

6.1.6. Staalname Voor de biochemische analyse werden er per gewricht vier

interessegebieden geselecteerd waar cilindervormige stalen genomen

werden. De interessegebieden waren: femurcondyl lateraal, femurcondyl

mediaal, tibiaal plateau lateraal en tibiaal plateau mediaal. Initieel werd er

gebruik gemaakt van een trepan (6 mm). Het gebruik van dit trepan werd

tijdens het proces van staalname echter vervangen door het gebruik van

een elektrische holle boor (6 mm binnendiameter) omwille van fysieke

redenen en omdat gebruik van de elektrische holle boor resulteerde in

homogenere staalname (zie figuur 6). Om technische redenen werd de

elektrische holle boor van 6 mm binnendiameter bij staalname bij de

gemacereerde beenderen vervangen door een elektrische holle boor van

10 mm.

De cilindervormige stalen reikten doorheen het

gewrichtskraakbeen en het subchondraal bot tot

voorbij de overgang naar het trabeculair

botweefsel. Het gewrichtskraakbeen, het

subchondraal bot en het aangrenzende trabeculair

bot werden intact gelaten en zo gescand om

herkenning van het gewrichtsoppervlak op de CT

beelden te vergemakkelijken. De stalen werden in genummerde plastic epjes

gebracht en zo bewaard tot aan de biochemische analyse, maximaal 48u na

staalname. Na het uitvoeren van de CT scans werden het gewrichtskraakbeen en het trabeculair bot

zo goed mogelijk manueel verwijderd van het gewrichtskraakbeen.

6.1.7. CT onderzoek De scans werden uitgevoerd met een GE Lightspeed 4-slice CT toestel. Aan de hand van twee

scoutsviews werd de positionering gecontroleerd en het te scannen volume ingesteld. De snededikte

was 1,25mm met 0,6mm interval. De beelden werden gemaakt met 120 kVp en 300 mAs. Alle scans werden uitgevoerd in aanwezigheid van een aangepast densiteitsfantoom. De stalen werden in plastic

epjes gescand in groepen van 8 tot 12 stalen.

Figuur 6: Holle boor, 6mm binnendiameter

Figuur 8: Femurcondylen na staalname

Figuur 7: Tibiaal plateau na staalname

28

6.1.8. Biochemische analyse De biochemische analyse van de stalen gebeurde zoals weergegeven in tabel 5.

Bepaling Methode Formule

Verse stof Gewicht

(VS)

Wegen. Resultaat van weging

%VS %VS = 100% weegresultaat

Droge stof Gewicht

(DS)

Stalen drogen in een droogstoof

vij 70°C tot een constant gewicht

bereikt is en vervolgens opnieuw

wegen.

DS = VS - gewicht na drogen

%DS %DS = DS x 100

VS

Ruw vet Gewicht

(RV)

Etherextractie volgens de soxhlet-

methode gedurende 6 uur,

opnieuw drogen tot constant

gewicht en vervolgens opnieuw

wegen.

RV = DS - gewicht na etherextractie

%DS %RV = RV x 100

VS

Ruwe as Gewicht

(As)

Verassing van restmateriaal bij

550°C na etherextractie en

vervolgens opnieuw wegen

As = Gewicht na - gewicht na

etherextractie verassing

%As %As = As x 100

VS

Organische

fractie

Gewicht

(org)

Org = VS - DS - As

%Org %Org = Org x 100

VS

Niet-vet

organische

fractie

Gewicht

(NVO)

NVO = Org - RV

%NVO % NVO = NVO x 100

VS Tabel 5: Biochemische analyse

Binnen deze studie is vooral het As en %As van belang.

29

6.1.9. CT-OAM De bekomen beelden werden vervolgens verwerkt met Analyze versie 11.0, een softwarepakket

ontwikkeld door Mayo Clinic (ANALYZE, versie 11.0, Biomedical Imaging Resource (BIR), Mayo-

Foundation, Rochester, USA).

De bekomen monsters werden gescand met de CT-scanner en de densiteit werd bepaald met behulp

van de Analyze beeldverwerkingssoftware. Voor iedere scan werd eerst op basis van de

tweedimensionale transversale beelden een selectie gemaakt van het stuk been waar verdere

metingen op zullen plaatsvinden. Vervolgens werd een driedimensionaal beenmodel gecreëerd in een

8 bit grijsschaal. Het driedimensionale beeld werd vervolgens geroteerd zodat het gewrichtsoppervlak

loodrecht in beeld kwam voor verdere bewerking. Om exclusief beenweefsel in beeld te brengen

werden de densiteitsparameters ingesteld op een range van 105 tot 255 in de 8 bit grijsschaal. Van

dit driedimensionale beeld werd een tweedimensionaal beeld opgeslagen dat later zal dienen ter

oriëntatie van de gewrichtsoppervlakken. Het gewrichtsoppervlak, dat bij de stalen het volledige

oppervlak omvat, werd geselecteerd en de densiteit van het subchondraal bot werd geëvalueerd tot

een diepte van 3 mm.

Hieronder is een lijst print screen beelden ondergebracht die het proces illustreren (Figuren 9 t.e.m.

14). Er is specifiek gekozen voor beelden die gemaakt zijn bij analyse op een volledige epifyse omdat

dit de figuren sterk verduidelijkt.

Figuur 9: Selectie van het botdeel waar verdere metingen op zullen gebeuren

Figuur 10: Opmaak van een 3D beeld en rotatie over de verschillende assen om het gewrichtsoppervlak perfect in beeld te positioneren. Het perfect gepositioneerd beeld werd bewaard om later de kleurenmap van de gewrichtsoppervlakken op te kunnen superpositioneren.

30

Figuur 11: Selectie van de gewrichtsoppervlakken

Figuur 12: Resultaat na selectie van de gewrichtsoppervlakken

Figuur 13: Aanpassing van de instellingen (hier werd tot een diepte van 9 voxels geëvalueerd)

Figuur 14: Kleurenmap gesuperponeerd op het gepositioneerde 3D beeld van het beenuiteinde

31

Bij CT-OAM wordt de densiteit van de achtereenvolgende voxels in een kolom van één voxel breed

en één voxel lang, loodrecht op het oppervlak bepaald. Het aantal voxels op rij dat geëvalueerd

wordt, en dus de diepte van de metingen, kan manueel ingesteld worden. Via mathematische

verrekening wordt de grijswaarde, corresponderend met de voxel met de hoogste densiteit, aan het

oppervlak van het gewrichtsoppervlak weergegeven in een tweedimensionaal beeld (MIP of maximal

intensity projection). Deze grijswaarden worden vervolgens omgezet in een kleurenmap. Tenslotte

wordt het gewrichtsoppervlak automatisch over het eerder gemaakte tweedimensionale beeld van het

been gesuperpositioneerd.

Binnen dit onderzoek zijn we op zoek gegaan naar exacte waarden voor de densiteit die vergeleken

konden worden met de resultaten uit biochemische analyse. Daarom werd van de volledige zone een

overzicht gemaakt van de attenuatiewaarden voor de verschillende voxels en werd de gemiddelde

attenuatie automatisch berekend en weergegeven als HU-waarde binnen de geselecteerde 8 bit

grijsschaal. Voor kwantitatieve densiteitsbepaling werden de HU-waarden ter hoogte van het staal

vergeleken met de HU-waarden van het gelijktijdig gescand fantoom met drie gekende densiteiten.

Op basis van de gekende densiteiten van de drie densiteitsmodules in het fantoom werd een ijklijn

opgesteld voor de corresponerende HU-waarde van de densiteitsmodules. De geregistreerde HU-

waarden ter hoogte van het gewrichtsoppervlak worden uitgebracht in deze ijklijn waardoor de

corresponderende densiteitswaarden berekend kunnen worden. Dit proces werd geautomatiseerd

door gebruik te maken van een Microsoft Excel werkblad. Aangezien de absorptiewaarden voor

dezelfde weefsels per scan licht kunnen variëren, zelfs bij gebruik van hetzelfde toestel en fantoom,

wordt het proces van deze kwantitatieve densiteitsbepaling bij iedere scan volledig doorlopen. De

resultaten, verkregen via CT-OAM, zijn weergegeven in mg hydroxyapatiet per cm³.

6.1.10. Statistische analyse Voor de studie naar de validiteit van CT-OAM als methode voor densiteitsbepaling van beenweefsel

werden de gemiddelde densiteiten zoals berekend volgens CT-OAM gecorreleerd aan de %As zoals

gemeten via biochemische analyse. De correlatie tussen beide methoden werd bepaald met een

Pearson Correlation test in een commercieel beschikbaar softwareprogramma voor statistiek (SPSS).

Dit gebeurde eerst voor iedere groep afzonderlijk, en vervolgens voor de gehele groep zonder

onderverdeling in aparte groepen. De grenswaarde voor significantie werd vastgelegd op 0,05.

Voor de initiërende studie naar het effect van verschillende bewaarmethoden op de

mineralendensiteit van beenweefsel werden volgende groepen onderling gecorreleerd met de Student

T-Test. Dit gebeurde met dezelfde SPSS software.

32

6.2. RESULTATEN De resultaten van de correlatietesten zijn weergegeven in tabel 6. Hierbij werd de mean density

volgens CT-OAM gecorreleerd aan de %As uit biochemische analyse.

Groep Pearson

Correlation

Significantie

(2 tailed)

Aantal

stalen (N)

Conclusie

Alcohol 70% 0,869 0,000 20 Sterke positieve correlatie

Significant

Controle alcohol

(Diepvries)

0,889 0,000 20 Sterke positieve correlatie

Significant

Formol 0,799 0,000 20 Sterke positieve correlatie

Significant

Controle formol

(Diepvries)

0,750 0,001 16 Positieve correlatie

Significant

Maceratie 0,664 0,001 20 Positieve correlatie

Significant

Afkoken 0,115 0,631 20 Zwakke positieve correlatie

Niet significant Tabel 6: correlaties tussen CT-OAM (mean density) en biochemische analyse (%As) per groep

De resultaten van de correlaties tussen de verschillende groepen zijn weergegeven in tabel 7. Hierbij

werden per meetmethode (CT-OAM en biochemische asbepaling) vergeleken of er een verschil was

voor de berekende gemiddelden.

De aangenomen nulhypothese was: er is geen verschil tussen de gemiddelden van beide groepen

voor die bepaalde parameter (CT-OAM of biochemische asbepaling).

De grenswaarde voor significantie werd vastgelegd op 0,05.

33

Groepen Student T-Test Conclusie

Sig. Betekenis

Alcohol 70% -

Controle Alcohol (Diepvries)

CT-OAM

0,335 Nulhypothese mag

niet verworpen

worden

Er is geen verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Alcohol 70% -

Controle Alcohol (Diepvries)

BIOCHEMISCHE ANALYSE

%As

0,000 Nulhypothese mag

verworpen worden

Er is wel een verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Formol -

Controle formol (Diepvries)

CT-OAM

0,860 Nulhypothese mag

niet verworpen

worden

Er is geen verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Formol -

Controle formol (Diepvries)

BIOCHEMISCHE ANALYSE

%As

0,757 Nulhypothese mag

niet verworpen

worden

Er is geen verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Afkoken - Maceratie

CT-OAM

0,352 Nulhypothese mag

niet verworpen

worden

Er is geen verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Afkoken - Maceratie

BIOCHEMISCHE ANALYSE

%As

0,000 Nulhypothese mag

verworpen worden

Er is wel een verschil tussen de

gemiddelden van beide groepen.

Tabel 7: Vergelijking van de densiteiten per meetmethode voor verschillende bewaarmethoden

34

7. DISCUSSIE Een belangrijke uitkomst in deze studie is de significante (sterk) positieve correlatie tussen de

gemiddelde densiteiten gemeten met CT-OAM en biochemische analyse voor de vergelijking binnen

vijf van de zes groepen en over alle groepen heen. Een positief tot sterk positieve correlatie werd

gevonden voor de groepen Alcohol 70%, Controle Alcohol (Diepvries), Formol, Controle formol

(Diepvries) en Maceratie. Voor de groep Afkoken werd een zwakke positieve correlatie gevonden die

niet significant was. De oorzaak voor deze afwijking werd jammer genoeg niet achterhaald.

Hieruit kunnen we concluderen dat CT-OAM volgens dit onderzoek kan beschouwd worden als een

betrouwbare methode om inzicht te krijgen in de densiteit en densiteitsdistributie van het

subchondraal bot bij de hond.

CT-OAM kent verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden om de densiteit van

beenweefsel te bepalen. CT-OAM wordt uitgevoerd op basis van een softwarepakket dat klassieke

CT-beelden verwerkt. Dit heeft tot gevolg dat deze metingen kunnen uitgevoerd worden op reeds

bestaande beelden of op CT-beelden die standaard gemaakt zouden worden in een klinische setting

en dat er dus veelal geen extra scans moeten uitgevoerd worden.

In tegenstelling tot bioptname en biochemische analyse, kunnen proefdieren of patiënten met

CT-OAM gedurende langere tijd periodiek opgevolgd worden, zodat longitudinale studies mogelijk

zijn. Daarenboven geeft biochemische analyse weinig tot geen informatie over densiteitsdistributie in

een gewricht of been. CT-OAM is tevens niet invasief en kan in vivo gebeuren waardoor het

proefdier- of patiëntenwelzijn toeneemt.

Wanneer CT-OAM vergeleken wordt met QCT, zien we een voordeel voor CT-OAM wanneer het

aankomt om de (gedetailleerde) distributie van densiteiten in een gewrichtsoppervlak te beoordelen.

Dit is het geval omdat er bij QCT gewerkt wordt met standaard grotere ROI’s waarvan de gemiddelde

densiteit gemeten wordt. QCT kan echter wel eveneens gebruikt worden om periodieke studies

gedurende een langere periode uit te voeren.

DEXA is een goede methode om de gegeneraliseerde mineralendensiteit of de densiteit in een groter

oppervlak te meten, maar de spatiële resolutie is hier beperkt. Tevens wordt de densiteit bij DEXA

weergegeven in gram per vierkante centimeter, terwijl dit bij CT-OAM weergegeven wordt in gram per

kubieke centimeter waardoor distributies voor alle oppervlakken weergegeven kunnen worden. Een

voordeel van DEXA in vergelijking met CT-OAM is echter de lagere stralingsdosis bij DEXA, hoewel

dit momenteel in de diergeneeskunde minder belang heeft dan in de humane geneeskunde.

Belangrijk was ook om te bestuderen of CT-OAM eveneens bruikbaar is bij een klein aantal metingen,

zoals in klinische omstandigheden zou gebeuren bij een individueel dier. Hiertoe werd er per groep

een grafiek opgesteld met op de X-as de densiteit gemeten volgens biochemische analyse, en op de

Y-as de densiteitsbepaling volgens CT-OAM. De spreiding die hierbij gezien werd (lineair gespreid,

diagonaal stijgend) leert ons dat de methode ook voor individuele dieren gebruikt kan worden. Er was

echter wel sprake van zeldzame afwijkingen uit de lineaire spreiding, die