UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2015 – 2016

INVLOED VAN ROOD VLEES EN VLEESPRODUCTEN OP HET GASTRO-INTESTINAAL CELLULAIR

METABOLISME IN HET KADER VAN COLONKANKERONDERZOEK

door

Ellen DE PAEPE

Promotor: Prof. Dr. Lynn Vanhaecke

Medepromotor: Drs. Caroline Rombouts

Onderzoek uitgevoerd in het kader

van de Masterproef

© 2016, Ellen De Paepe

VRIJWARINGSCLAUSULE

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de

juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze

masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van

derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de

masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de

masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2015 – 2016

INVLOED VAN ROOD VLEES EN VLEESPRODUCTEN OP HET GASTRO-INTESTINAAL CELLULAIR

METABOLISME IN HET KADER VAN COLONKANKERONDERZOEK

door

Ellen DE PAEPE

Promotor: Prof. Dr. Lynn Vanhaecke

Medepromotor: Drs. Caroline Rombouts

Onderzoek uitgevoerd in het kader

van de Masterproef

© 2016, Ellen De Paepe

VOORWOORD

Na enkele intensieve maanden leg hierbij ik de laatste hand aan mijn masterproef. Gedurende deze maanden

heb ik veel geleerd, zowel op wetenschappelijk, als op persoonlijk vlak. Ik maak dan ook graag van deze

gelegenheid gebruik om enkele mensen te bedanken, want deze masterproef kon enkel worden gerealiseerd

dankzij hun hulp, medewerking en begrip.

Eerst en vooral betuig ik graag mijn dankbaarheid aan de mensen die bereid waren een staal te geven en zo

deel te nemen aan dit onderzoek.

Daarnaast wens ik mijn promotor, Prof. Dr. Vanhaecke, te bedanken voor de ondersteuning. Niet alleen heeft

zij mij de mogelijkheid gegeven een zeer interessant onderwerp uit te werken, ze heeft mij ook bij de invulling

van het onderwerp de kans geboden om ‘out of the box’ te denken.

Verder bedank ik graag Drs. Caroline Rombouts, mijn dagelijkse begeleider, die steeds met raad en daad voor

mij klaarstond. Ze heeft mij keer op keer geholpen met interessante en originele ideeën, nieuwe inzichten en

snelle feedback, en maakte mij geduldig wegwijs in de wereld van wetenschappelijke artikels, empirisch

onderzoek en statistiek.

Al deze mensen hebben er mee voor gezorgd dat ik deze masterproef vandaag in deze vorm kan presenteren,

waarvoor zeer veel dank. Bovendien hebben zij de interesse voor de onderzoekswereld bij mij aangewakkerd

en mij goed voorbereid om volgend jaar mijn eerste stappen te zetten in een doctoraat.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING .............................................................................................................................................. 1

INLEIDING ......................................................................................................................................................... 2

1. LITERATUURSTUDIE ................................................................................................................................... 3

1.1 De relatie tussen rood vlees en colonkanker .......................................................................................... 3

1.1.1 Epidemiologie .................................................................................................................................. 3

1.1.2 Hypotheses ...................................................................................................................................... 9

1.1.3 Mechanismen ................................................................................................................................. 15

1.2 Metabolomics ........................................................................................................................................ 23

1.2.1 Het metaboloom ............................................................................................................................. 23

1.2.2 Metabolomics ................................................................................................................................. 24

1.2.3 Het gebruik van metabolomics voor de relatie dieet-gezondheid .................................................. 26

1.3 Rol van de gastro-intestinale microbiota ............................................................................................... 27

1.3.1 Verteringssimulaties ....................................................................................................................... 27

1.3.2 Verband tussen microbiota en het risico op CRC .......................................................................... 31

2. DOEL VAN DE STUDIE .............................................................................................................................. 33

2.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ............................................................................... 33

2.2 Experiment vertering carnitine versus lysine......................................................................................... 33

2.3 Metabolomics ........................................................................................................................................ 34

3. MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................................................... 35

3.1 In vitro digestie ...................................................................................................................................... 35

3.1.1 Fecesstalen .................................................................................................................................... 35

3.1.2 Vleesbereidingen ........................................................................................................................... 35

3.1.3 Verteringssappen ........................................................................................................................... 35

3.1.4 In vitro digestie ............................................................................................................................... 37

3.2 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS .................................................................................................................... 39

3.2.1 Staalvoorbereiding ......................................................................................................................... 39

3.2.2 UHPLC-Q-Orbitrap ......................................................................................................................... 39

3.3 Statistische analyse ............................................................................................................................... 40

3.3.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ........................................................................ 40

3.3.2 Experiment vertering carnitine versus lysine ................................................................................. 40

3.3.3 SAS Enterprise guide 7 .................................................................................................................. 40

4. RESULTATEN ............................................................................................................................................. 43

4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ............................................................................... 43

4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine......................................................................................... 45

4.2.1 Inleiding .......................................................................................................................................... 45

4.2.2 Targeted metabolomics ................................................................................................................. 45

4.2.3 Untargeted metabolomics .............................................................................................................. 46

5. DISCUSSIE ................................................................................................................................................. 52

5.1 De vertering van rood vlees versus gevogelte ...................................................................................... 52

5.2 De vertering van carnitine versus lysine ............................................................................................... 52

5.2.1 Targeted metabolomics ................................................................................................................. 52

5.2.2 Untargeted metabolomics .............................................................................................................. 54

5.2.3 Het effect van carnitine op het risico op CRC ................................................................................ 55

7. BIBLIOGRAFIE ............................................................................................................................................ 57

1

SAMENVATTING

Epidemiologisch onderzoek heeft aangetoond dat er een associatie bestaat tussen het risico op het

ontwikkelen van colorectale kanker en de langetermijn consumptie van rood en verwerkt rood vlees. Hierbij

zou onder andere haemijzer een schadelijke werking uitoefenen, door zijn katalytisch effect op de vorming van

N-nitroso componenten en zijn rol in de vetperoxidatie.

Dit onderzoek diende als validatie voor eerder onderzoek, verricht door Rombouts et al. (2016). Hierbij werden

10 metabolieten gevonden, die significant geassocieerd waren met de digestie van rood vlees. Deze

metabolieten werden niet of in beduidend lagere abundantie teruggevonden na de digestie van gevogelte.

Twee van deze metabolieten bleken acylcarnitines te zijn, waaronder 3-dehydroxycarnitine. In dit onderzoek

werd nagegaan of dezelfde resultaten konden waargenomen worden bij een groter aantal proefpersonen,

gebruik makend van ‘targeted metabolomics’. In een tweede experiment werd onderzocht welke specifieke

metabolieten gevormd werden tijdens de digestie, na supplementatie met L-carnitine versus supplementatie

met lysine. Dit experiment gebeurde met behulp van ‘untargeted metabolomics’. Ook werd met behulp van

‘targeted metabolomics’ de aanwezigheid van 3-dehydroxycarnitine na supplementatie met L-carnitine

nagegaan. Dit onderzoek diende als verificatie of het katabolisme van L-carnitine kan bijdragen aan de vorming

van 3-dehydroxycarnitine. Om deze experimenten uit te voeren werden gastrointestinale digesties in vitro

nagebootst.

Twee van de acylcarnitines die in eerder onderzoek significant konden worden geassocieerd met de digestie

van rundvlees konden ook in dit onderzoek worden geïdentificeerd, namelijk 3-dehydroxycarnitine en

vermoedelijk methylmalonylcarnitine. Specifiek kon worden waargenomen dat er reeds voor de colondigestie

een grotere abundantie was van 3-dehydroxycarnitine bij de vertering van rundvlees dan bij gevogelte. Na

colondigestie werden deze verschillen tussen rundvlees en gevogelte alleen maar groter.

Methylmalonylcarnitine was enkel significant aanwezig na de colondigestie van rundvlees. Na supplementatie

met L-carnitine werd telkens meer 3-dehydroxycarnitine gevormd dan na supplementatie met lysine. Waarbij

de abundantie telkens het hoogst bleek te zijn na colondigestie. Deze resultaten doen vermoeden dat L-

carnitine, vooral aanwezig in rood vlees, door microbieel katabolisme ter hoogte van het colon aanleiding kan

geven tot de vorming 3-dehydroxycarnitine, een molecule die reeds eerder in verband werd gebracht met

andere aandoeningen (zoals atherosclerose).

Sleutelwoorden: Carnitine - Colorectale kanker – 3-Dehydroxycarnitine – Haemijzer - Metabolieten

2

INLEIDING

Het voorkomen van colorectale kanker (CRC) is sinds 1970 in geïndustrialiseerde langden verdubbeld in

aantal. In landen met toenemende industrialisatie en verstedelijking neemt de frequentie snel toe, maar ook

in landen met een lager inkomen, zoals Japan, Singapore en Oost-Europa, lijkt de prevalentie toe te nemen.

Het voorkomen van CRC is nog steeds relatief ongewoon in Afrika en een groot deel van Azië. De ziekte lijkt

iets meer voor te komen bij mannen en kent in net iets minder dan de helft van de gevallen een fatale afloop

(WCRF, 2011).

Het “World Cancer Research Fund” (WCRF) volgt de ontwikkelingen op het gebied van kanker nauwgezet en

publiceert regelmatig een rapport met nieuwe inzichten. Zo identificeerden ze al een groot aantal risicofactoren

voor de ontwikkeling van CRC. Eén van deze risicofactoren, met overtuigend bewijs, is de consumptie van

rood vlees en verwerkt rood vlees. Ook het “International Agency for Research on Cancer” (IARC)

identificeerde rood vlees en zeker verwerkt rood vlees als mogelijke carcinogenen (WCRF, 2011; IARC, 2015).

Epidemiologisch onderzoek toonde aan dat de consumptie van rood vlees op lange termijn een verhoogd

risico op de ontwikkeling van CRC met zich meebrengt. Langetermijn consumptie van kip en vis zijn

omgekeerd geassocieerd met dit risico (Hogg, 2007; Pan et al., 2012; Oostindjer et al., 2014).

Uit epidemiologisch onderzoek bleek dat mensen die zich in de klasse met de hoogste opname rood vlees

bevonden een hoger risico hadden op het ontwikkelen van CRC dan mensen in de laagste klasse, dit vooral

bij vrouwelijke individuen. Bovendien bleek consumptie van pluimvee en vis omgekeerd geassocieerd te zijn

met het risico op zowel proximale als distale colonkanker, opnieuw voornamelijk bij vrouwelijke individuen

(Chao et al., 2005).

Het WCRF vermeld in het rapport van 2010 een samengevat relatief risico van 1,21 gegeven voor elke stijging

in consumptie van 100 gram rood vlees/dag (WCRF, 2011). IARC stelt dat elke dagelijkse toename van 50

gram verwerkt vlees het risico op CRC met 18 % verhoogt (IARC, 2015).

In deze masterproef werd de aandacht voornamelijk gevestigd op de verschillende metabolieten die gevormd

worden bij de digestie van rundvlees, versus de vertering van gevogelte. Ook werd onderzocht welke

metabolieten gevormd worden bij supplementatie met carnitine, versus supplementatie met lysine, aangezien

carnitine in hogere concentratie voorkomt in rood vlees dan in gevogelte. Om dit te bewerkstelligen werd

gebruik gemaakt van ‘metabolomics’. Hierbij wordt er specifiek gekeken naar een aantal vooraf bepaalde

metabolieten, aangeduid als ‘targeted metabolomics’, of wordt er eerder een algemeen metabolietenprofiel

opgesteld, ook ‘untargeted metabolomics’ genoemd. Bij de techniek ‘metabolomics’ worden verschillende

analytische technieken gebruikt om het metaboloom in kaart te brengen. Het metaboloom bestaat uit een

collectie van duizenden kleine moleculen, die deelnemen aan metabole reacties.

Metabolieten van verschillende schijnbaar niet verwante biochemische processen kunnen elkaar beïnvloeden

door middel van pleiotropie. Om deze effecten te kunnen begrijpen is een analyse noodzakelijk waarbij alle

metabolieten in een biologisch systeem geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. Zo een aanpak onthult het

volledige metaboloom van het biologisch systeem en wordt ook wel ‘metabolomics’ genoemd (Fiehn, 2002;

Weckwerth & Morgenthal, 2005; Dunn et al., 2005; Hounoum et al., 2016).

3

1. LITERATUURSTUDIE

1.1 De relatie tussen rood vlees en colonkanker

1.1.1 Epidemiologie

1.1.1.1 Inleiding

In ontwikkelde landen, met hoofdzakelijk een Westers dieet, is colorectale kanker (CRC) een veel

voorkomende aandoening. In deze landen is de incidentie van CRC een viertal keer hoger dan in minder

ontwikkelde regio’s, en blijft bovendien snel stijgen (tabel 1).

Tabel 1: verschil in incidentie van de drie meest voorkomende kankers tussen ontwikkelde regio’s en minder

ontwikkelde regio’s (WCRF, 2012).

Aantal kankers per 100.000 inwoners (in de verschillende regio’s wereldwijd)

Kanker Wereldwijd Meest ontwikkeld Minder ontwikkeld

Longkanker 23,1 30,8 20

Colorectale kanker 17,2 29,2 11,7

Maagkanker 12,1 10,6 12,7

Het is de derde meest voorkomende kanker bij mannen, volgend op long -en prostaatkanker (tabel 2) en bij

vrouwen de tweede, volgend op borstkanker (tabel 3). Deze kanker kent een fatale afloop in iets minder dan

de helft van de gevallen en is de vierde meest voorkomende doodsoorzaak ten gevolge van kanker (Kamangar

et al., 2006; Bastide et al., 2011; WCRF, 2011; Kim et al., 2013; Bastide et al., 2015).

Tabel 2: Top 5 meest voorkomende kankers bij mannen wereldwijd, in 2012 (WCRF, 2012).

Kanker Nieuwe gevallen gediagnosticeerd

in 2012 (1000s)

Procent van alle kankers (exclusief

huidkanker zonder melanomen

Longkanker 1.242 16,7

Prostaatkanker 1.112 15

Colorectale kanker 746 10

Maagkanker 631 8,5

Leverkanker 554 7,5

Tabel 3: Top 5 meest voorkomende kankers bij vrouwen wereldwijd, in 2012 (WCRF, 2012).

Kanker Nieuwe gevallen gediagnosticeerd

in 2012 (1000s)

Procent van alle kankers (exclusief

huidkanker zonder melanomen

Borstkanker 1.677 25,2

Colorectale kanker 614 9,2

Longkanker 583 8,8

Baarmoederhalskanker 528 7,9

Maagkanker 320 4,8

4

Het “World Cancer Research Fund” beschouwt de associatie tussen de opname van rood en verwerkt vlees

en het ontwikkelen van CRC als aanwezig en raadt aan de consumptie van rood vlees tot het minimum te

beperken (Bastide et al., 2015). Het “International Agency for Research on Cancer” (IARC) classificeerde rood

vlees als “vermoedelijk carcinogeen voor de mens (Groep 2A), gebaseerd op gelimiteerd bewijs dat de

consumptie van rood vlees kanker veroorzaakt en sterk mechanistisch bewijs dat de carcinogene werking

ondersteunt”. Deze associatie werd voornamelijk gezien bij CRC, maar ook met pancreaskanker en

prostaatkanker werd een verband gezien. Verwerkt rood vlees werd geclassificeerd als “carcinogeen voor

mensen (groep 1), gebaseerd op voldoende bewijs dat de consumptie hiervan CRC induceert”. Elke toename

van 50 gram verwerkt vlees dagelijks verhoogt het risico op CRC met 18 % (IARC, 2015).

Ongeveer 95% van de gediagnosticeerde colorectale kankers zijn adenocarcinomen, de kanker lijkt bovendien

iets meer voor te komen bij vrouwelijke individuen (WCRF, 2011).

Het colon is het distale deel van het intestinaal stelsel en strekt zich uit van het cecum tot aan het rectum. Op

deze plaats worden water en zouten uit onverteerde voeding geabsorbeerd (WCRF, 2011). Colorectale kanker

ontwikkelt zich voornamelijk in de recto-sigmoïde overgang van de darm, het distale deel van de dikke darm.

Chao et al. (2005) vermoedden dat de concentratie aan feces in dit deel van de darm een rol speelt bij het

ontstaan van CRC. Op deze plaats in de darm is er namelijk een resorptie van water, wat leidt een concentratie

van de carcinogenen, waardoor deze regio in de darm een hogere blootstelling ondergaat (Chao et al., 2005).

1.1.1.2 Epidemiologie

Op lange termijn stelden Oostindjer et al. (2014) vast dat een hoge consumptie van rood en verwerkt vlees

geassocieerd is met een hoger risico op distale colonkanker. Langetermijn consumptie van kip en vis is

omgekeerd geassocieerd met dit risico, en werkt dus als beschermende factor (Hogg, 2007; Pan et al., 2012).

Een logische gevolgtrekking hiervan is dat vegetariërs minder kans hebben op het ontwikkelen van CRC, maar

hier bestaat echter nog geen eenduidig bewijs over (Oostindjer et al., 2014).

Dit leidt tot de assumptie dat de relatie tussen rood vlees en colonkanker complex is en vermoedelijk niet

alleen afhankelijk van de opname van rood vlees. Zo kan onder andere de totale samenstelling van het dieet

een rol spelen, en kunnen er genetische -en milieueffecten zijn (Oostindjer et al., 2014). De ontwikkeling van

CRC is een meerstappenproces, waarbij er op verschillende niveaus een interferentie kan zijn met

componenten aanwezig in rood en verwerkt rood vlees (Demeyer et al., 2015).

In epidemiologisch onderzoek verricht door Chao et al. (2005) werd het langetermijnrisico van de consumptie

van rood vlees tegenover vis en pluimvee nagegaan. Hieruit bleek dat mensen die zich in de klasse met de

hoogste opname rood vlees bevonden een hoger risico hadden op het ontwikkelen van CRC dan mensen in

de laagste klasse, dit vooral bij vrouwelijke individuen. Bovendien bleek consumptie van pluimvee en vis

omgekeerd geassocieerd te zijn met het risico op zowel proximale als distale colonkanker, opnieuw

voornamelijk bij vrouwelijke individuen (Chao et al., 2005).

Deze resultaten doen vermoeden dat vis en pluimvee factoren bevatten die bescherming bieden tegen CRC.

In pluimveevlees zijn kleine hoeveelheden nutriënten zoals selenium en calcium aanwezig, die afwezig zijn in

rood vlees, wat geassocieerd kan worden met een lager risico op CRC (Chao et al., 2005). Vis is een primaire

bron van omega-3 vetzuren, die de tumorgroei zouden inhiberen en de expressie van pro-inflammatoire genen

moduleren.

5

Op die manier zou een hoge inname van vis of visolie omgekeerd geassocieerd zijn met het risico op CRC

(Chao et al., 2005; Corpet, 2011; Baena & Salinas, 2015). Andere studies tonen echter geen duidelijk

antitumoraal effect van vis aan (WCRF, 2011).

Door middel van aanpassingen in de levensstijl kan het voorkomen van deze kanker dalen tot 50% (WCRF,

2011; Baena & Salinas, 2015).

1.1.1.3 Risicofactoren en beschermende factoren

De incidentie van CRC wordt beïnvloed door verschillende factoren (figuur 1), waarbij de individuele

vatbaarheid een ondergeschikte rol speelt. 5 tot 10 % van de CRC’s zijn een gevolg van herkende genetische

afwijkingen, zoals “Familiale Adenomateuze Polyposis” (FAP) en “Hereditary non-polyposis colorectal cancer”

(HNPCC) (WCRF, 2011). Bij de overige gevallen is ongeveer 20% te wijten aan een genetische aanleg, met

gekende gevallen van CRC in de familie (Al-Sohaily et al., 2012; Grivennikov, 2013). Hiernaast speelt vooral

de blootstelling aan etiologische factoren een belangrijke rol. Deze etiologische factoren zijn voornamelijk

geassocieerd met de voeding, aangezien carcinogenen kunnen opgenomen worden als een onderdeel van,

of met, de voeding. Wanneer deze carcinogenen niet gemetaboliseerd of geabsorbeerd worden in de dunne

darm, kunnen ze interageren met de cellen die het colon en het rectum aflijnen (Lipkin, 1974; Bastide et al.,

2011; WCRF, 2011; Kim et al., 2013).

Tabel 4: Risicofactoren en beschermende factoren in de ontwikkeling van CRC (WCRF, 2011).

Beschermende factor Risicofactor

Overtuigend Lichamelijke activiteit

Voeding met veel voedingsvezels

Rood vlees

Verwerkt vlees

Alcohol (voornamelijk bij mannen)

Lichaamsvet

Abdominaal vet

Volwassen hoogte

Vermoedelijk Look

Melk

Calcium

Alcohol (voornamelijk bij vrouwen)

Kamangar et al. (2006) brachten bepaalde aspecten van de voeding, zoals een lage hoeveelheid vezels en

de inname van rood vlees in verband met CRC. Ook te weinig lichaamsactiviteit en overgewicht zouden een

rol kunnen spelen in deze carcinogenese (tabel 4). Bij een recent ontdekte risicogroep is volgens Kim et al.

(2013) de carcinogenese gelinkt met colitis (WCRF, 2011; Oostindjer et al., 2014). Deze individuen

ontwikkelen vooral colitis geassocieerde kanker (CAC), waarbij de chronische inflammatie drie verschillende

stadia in de carcinogenese kan beïnvloeden, meer bepaald zijn dit de tumor initiatie, promotie en progressie.

Tumor initiatie is het proces waarbij een normale cel kwaadaardige eigenschappen ontwikkelt en is

geassocieerd met een accumulatie van genetische veranderingen. Men vermoedt dat geactiveerde

immuuncellen cytokines en andere factoren vrijstellen, die op hun beurt de vorming van reactieve zuurstof

species (ROS) binnenin epitheelcellen kunnen activeren. Deze ROS kunnen zowel enkelvoudige als dubbele

DNA bindingen verbreken (Demeyer et al., 2015).

6

Bepaalde medicatie, zoals niet steroïdale anti-inflammatoire drugs (NSAID’s) (aspirine en

hormoonvervangende therapie bij postmenopauze vrouwen) kunnen het risico op CRC verlagen, terwijl het

gebruik van tabak dit risico dan net weer kan verhogen (tabel 5) (Paskett et al., 2007; Botteri et al., 2008; Wei

et al., 2009; WCRF, 2011; Johnson et al., 2013).

1.1.1.3.1 Beschermende factoren

Het “World Cancer Research Fund” (WCRF) haalt verschillende factoren aan die een beschermende werking

kunnen uitoefenen op het ontstaan van CRC. Deze factoren zijn onder andere een vezelrijke voeding (figuur

2), voldoende lichamelijke activiteit, calcium en look.

In het gastrointestinaal stelsel brengt vezelrijke voeding een aantal verschillende effecten teweeg, zo zal het

onder meer zorgen voor een verdunning van de fecale inhoud in de darm, een verminderde transittijd en een

toegenomen massa van de stoelgang. Wanneer diëtaire carbohydraten en mucines het colon bereiken worden

deze gefermenteerd door de darmflora in voornamelijk korte keten vetzuren, zoals butyraat, deze spelen een

rol in de apoptose en differentiatie, en het stopzetten van de celcyclus. Deze effecten lijken dosisgerelateerd

en komen in gelijke mate voor bij mannen en vrouwen (Larsson et al., 2005; WCRF, 2011; Johnson et al.,

2013).

Dagelijks 30 minuten gematigde lichaamsactiviteit resulteert in een daling van CRC met 11 % (tabel 5) (Baena

& Salinas, 2015). Op lange termijn verhogen deze periodes de metabole efficiëntie en capaciteit van het

Fig 1: Schematische voorstelling van diëtaire factoren en levensstijl, met een invloed op het ontstaan van

CRC. De combinatie van verschillende factoren speelt een grotere rol dan elke factor afzonderlijk (Windey

et al., 2012).

7

lichaam. Dit kan op zijn beurt

zorgen voor een reductie van

inflammatie, insulinelevels –en

resistentie. Het effect van

lichaamsactiviteit lijkt het

duidelijkst te zijn bij mannelijke

individuen (WCRF, 2011; Johnson

et al., 2013; Patel & De, 2016).

Intracellulair calcium heeft een

belangrijke invloed op

verschillende cellulaire functies,

waaronder ook de celgroei. Het

begrenst namelijk de cellulaire

proliferatie en promoot

differentiatie en apoptose in

normale, alsook in tumorale cellen.

Door de aanwezigheid van calcium

in melk, kan ook hierbij een antitumoraal effect waargenomen worden (WCRF, 2011; Johnson et al., 2013).

Een studie van Sesink et al. (2001) toonde het chemoprotectief effect van calcium aan, waarbij calcium de

cytotoxische en hyperproliferatieve effecten van haem tegengaat (Corpet, 2011). Ook Bastide et al. (2015)

vermeldden bij ratten op een laag calcium dieet een bevordering van precancereuze laesies door rood en

verwerkt vlees.

Look zou een antitumoraal effect hebben, voornamelijk door zijn allyl-zwavel componenten. Deze kunnen

zowel de celgroei als tumorvorming inhiberen, op een dosis-afhankelijke manier (WCRF, 2011; Johnson et al.,

2013).

1.1.1.3.2 Risicofactoren

Verschillende factoren kunnen het risico op het ontstaan van CRC doen toenemen, deze zijn onder andere

alcohol, overtollig lichaamsvet (tabel 5) en abdominaal vet, volwassen hoogte en de consumptie van rood en

verwerkt vlees.

Bij mannen lijkt alcohol een groter effect te hebben op het ontstaan van CRC dan bij vrouwen. Een mogelijke

verklaring hiervoor is de gemiddeld hogere alcoholconsumptie bij mannen, die bovendien een andere voorkeur

voor bepaalde biersoorten hebben. Reactieve metabolieten van alcohol, zoals acetaldehyde kunnen

carcinogeen zijn. Bovendien is er een interactie met roken, waarbij tabak specifieke mutaties in het DNA

induceert die minder efficiënt kunnen worden hersteld in aanwezigheid van alcohol. Alcohol kan ook fungeren

als solvent en zo de penetratie van carcinogene moleculen in mucosale cellen faciliteren (Ferrari et al., 2007;

WCRF, 2011; Baena & Salinas, 2015; Patel & De, 2016).

Lichaamsvet beïnvloedt rechtstreeks de hoeveelheid circulerende hormonen, zoals insuline, ‘insuline like

growth factor’ en oestrogenen. Op die manier wordt een omgeving gecreëerd die carcinogenese bevordert en

apoptose tegengaat. Het stimuleert bovendien de inflammatoire respons van het lichaam, wat kan bijdragen

in het ontstaan en de progressie van verschillende kankers (WCRF, 2011; Baena & Salinas, 2015).

.

Fig. 2: Relatief risico en 95% betrouwbaarheidsinterval voor het

verband tussen colonkanker en de opname van vezelrijke voeding.

Hoe meer vezelrijke voeding, hoe lager het relatief risico op het

ontwikkelen van CRC (Larsson et al., 2005).

8

Ook abdominaal vet induceert een toegenomen aantal circulerende oestrogenen en een verminderde insuline

gevoeligheid, deze effecten zijn onafhankelijk van het algemene lichaamsvet (WCRF, 2011).

De volwassen hoogte wordt bepaald door

voeding in het vroege leven, gewijzigde

hormoonprofielen en de snelheid van

seksuele maturatie, wat mogelijks een rol

kan spelen in het verhogen van

kankerrisico (WCRF, 2011).

Verschillende bronnen halen de opname

van rood en verwerkt rood vlees aan als

een belangrijke risicofactor voor het

ontstaan van CRC, waarbij de inname van

verwerkt rood vlees een nog schadelijkere

invloed zou hebben dan vers vlees (Chao

et al., 2005; van den Brandt & Goldbohm,

2006; Boyle et al., 2008; Bastide et al.,

2011; Baena & Salinas, 2015). Onder

verwerkt vlees wordt vlees verstaan dat

gezouten of gerookt wordt, of waaraan

nitraten of nitrieten worden toegevoegd, dit

alles om de bewaring te verbeteren.

Verwerkt vlees bevat nitrosamines en hun

precursoren, componenten die bij een hoge consumptie schadelijke effecten kunnen teweegbrengen (Chao

et al., 2005). In een review van prospectieve onderzoeken toonden Chao et al. (2005) aan dat een toename

van 100 g rood vlees per dag een risicostijging van 12 tot 17 % met zich mee brengt. Daarenboven kwam er

in deze studie ook aan het licht dat een toename van 25 g verwerkt vlees per dag geassocieerd is met een

toegenomen risico op CRC van 49%. Bij sommige van deze prospectieve onderzoeken werd er echter geen

rekening gehouden met mogelijke ‘confounders’ (Chao et al., 2005). Daniel et al. (2011) vonden dat het risico

op CRC lineair verhoogt met een stijgende opname van rood of verwerkt vlees tot 140 g/dag. Bovendien bleek

de frequentie van opname van rood vlees sterker geassocieerd te zijn met het risico op carcinogenese dan de

totale opgenomen hoeveelheid (Smolinska et al., 2012).

In onderzoek van Chao et al. (2005) naar mogelijke ‘confounders’ bleek dat mensen met een hogere inname

van rood vlees vaak ook een lagere scholing hadden, minder aan lichamelijke activiteit deden en een hoger

BMI hadden. Bovendien gaven deze mensen ook aan meer sigaretten te roken, meer bier en sterke dranken

te nuttigen en bleken ze een hogere totale dagelijkse energie-opname te hebben. Ook aten deze mensen

minder fruit, weinig of bijna geen groenten en hadden ze een voedingspatroon met een laag vezelgehalte.

Wanneer er verder rekening gehouden werd met al deze ‘confounders’ kon er nog steeds een verband

aangetoond worden tussen een hogere opname van rood vlees en de ontwikkeling van CRC (Chao et al.,

2005; Aune et al., 2013).

Tabel 5: Overgewicht, roken en alcoholgebruik hebben een

hoger relatief risico op het ontwikkelen van CRC,

lichaamsactiviteit kan gezien worden als een beschermende

factor (Johnson et al., 2013).

9

1.1.2 Hypotheses

Sinds het onderzoek naar de risicofactoren van CRC gestart is, zijn er reeds verscheidene hypotheses naar

voor gebracht. Aanvankelijk dacht men dat de verzadigde vetten een belangrijke rol speelden, deze hypothese

werd echter door verscheidene onderzoeken ontkracht, aangezien diëtair vet uit andere voedingswaren dan

vlees geen verhoogd risico met zich meebracht. In epidemiologisch onderzoek werd vastgesteld dat mensen

met een voorkeur voor sterk doorbakken vlees een groter risico leken te hebben op CRC (Giovannucci &

Goldin, 1997; Gunter et al., 2005). Hierdoor vermoedde men dat er afhankelijk van de bereidingsmethode

wisselende hoeveelheden heterocyclische amines en polyaromatische koolwaterstoffen werden gevormd, dit

zijn stoffen met carcinogene werking (Butler, 2003). Deze stoffen worden echter ook gevormd bij de bereiding

van pluimvee, maar deze vleessoort is desondanks niet geassocieerd met CRC (Bastide et al., 2011). Een

belangrijk verschil in eigenschappen tussen rood vlees en pluimvee is de hoeveelheid myoglobine in de

spieren, deze is in beduidend hogere concentraties aanwezig in rood vlees. Dit myoglobine is een

hemoproteïne, wat inhoudt dat het een haemmolecule bevat (Chao et al., 2005; Bastide et al., 2011).

1.1.2.1 Verzadigde vetten

Een eerste hypothese stelt

dat er een verband bestaat

tussen de hoeveelheid

verzadigde vetten in de

voeding en het risico op

CRC. Een hoge hoeveelheid

diëtair vet induceert een

toegenomen vrijstelling van

galzouten in de dunne darm

(figuur 3). Vervolgens

kunnen deze door bacteriën

in het colon worden omgezet

in secundaire en tertiaire

galzouten. Deze oefenen

niet-specifiek irriterende

effecten uit op de

epitheelcellen, zoals

oxidatieve stress, wat

aanleiding kan geven tot

DNA schade. Deze mutaties

kunnen leiden tot aberrante

expressie van oncogenen of

tumorsuppressiegenen.

Op die manier kunnen

galzouten fungeren als

tumorpromotor (Giovannucci

Fig 3: Schematische voorstelling van het effect van galzouten op het

ontstaan van CRC. Galzouten zorgen voor een activatie van oppervlakte

enzymen, dit zorgt voor een vrijstelling van reactieve zuurstofradicalen,

met als gevolg onder meer DNA schade en celdood, wat een

inflammatoire respons kan teweegbrengen (Payne et al., 2008).

10

& Goldin, 1997; Ajouz et al., 2014). Bovendien kan een continue blootstelling aan hoge hoeveelheden

galzouten een selectieve groei van resistente celpopulaties veroorzaken (Payne et al., 2008; Barrasa et al.,

2013). Ten laatste wordt het DNA herstel mechanisme geïnhibeerd door deze galzouten (Payne et al., 2008).

De secretie van deze componenten wordt echter zowel door vet van dierlijke als plantaardige oorsprong

gestimuleerd, en bovendien bleek het niet mogelijk aan de hand van epidemiologisch onderzoek deze

hypothese te bevestigen. Wel werd duidelijk dat vooral de consumptie van rood vlees een verhoogde incidentie

van CRC met zich mee bracht, waarbij de invloed van de totale vetinhoud minder relevant leek te zijn

(Giovannucci & Goldin, 1997; Alexander et al., 2009; Demeyer et al., 2015). Verschillende onderzoeken

hebben aangetoond dat de associatie tussen vetzuren en CRC complex is en gerelateerd is met andere

factoren dan de verzadigde vetten (Giovannucci & Goldin, 1997; Alexander et al., 2009; Demeyer et al., 2015).

1.1.2.2 Verbrandingsproducten

Epidemiologisch onderzoek wees aan dat de incidentie van CRC verhoogd was bij vleeseters met voorkeur

voor goed doorbakken vlees, terwijl er geen verhoogd risico werd vastgesteld bij personen die hun vlees

minder doorbakken consumeerden. Dit deed vermoeden dat CRC geassocieerd is met verbrandingsproducten

van vlees, waarbij vooral de kookmethodes een grote invloed hebben (Giovannucci & Goldin, 1997; Gunter et

al., 2005).

Deze verbrandingsproducten worden gevormd tijdens het opwarmen van voedingswaren met hoge proteïne-

inhoud, zoals vlees, en staan gekend als mogelijke humane carcinogenen. De eerste groep

verbrandingsproducten zijn de heterocyclische amines (HCA’s) en de tweede groep zijn de polyaromatische

koolwaterstoffen (PAK’s).

Fig 4: Het verband tussen de voorkeur in gebakken vlees en het verhoogd risico op CRC. ● Licht

gebruind / rauw; ■ Medium bruin / Roze; ▲ Fel gebruind / aangebrand. De ods ratio op het ontwikkelen

van CRC is duidelijk hoger bij consumptie van goed doorbakken vlees, voornamelijk bij rundvlees

(Helmus et al., 2013).

11

1.1.2.2.1 Heterocyclische amines

Heterocyclische aromatische amines (HCA’s) zijn in hoogste concentratie aanwezig in vleessap (Butler, 2003;

Bastide et al., 2011). HCA’s worden gevormd in verhitte vleeswaren en vis, tijdens de Maillard reactie, met

creati(ni)ne, aminozuren en suikers. De uiteindelijk gevormde hoeveelheid HCA’s is afhankelijk van de

bereidingsmethode, de tijd, de temperatuur, de beginconcentratie van precursoren en de aanwezigheid van

water en vet in het rauw product (Alaejos & Afonso, 2011). Zo kan de vorming van deze HCA’s optimaal

doorgaan bij een langere kooktijd en bij bereiken van een kerntemperatuur van 150 °C tot 200 °C. Ook een

grotere externe verkoling kan de vorming van deze HCA’s in de hand werken (Butler, 2003; Bastide et al.,

2011). Essentieel in de carcinogene werking van deze HCA’s is een metabole activatie, aldus kan het

carcinogeen potentieel afhangen van de mate van metabolisatie (Cross & Sinha, 2004). Dit is afhankelijk van

genetische verschillen in bepaalde enzymen (Le Marchand et al., 2002) en kan ook variëren met verschillen

in intestinale microflora (Kassie et al., 2004; Vanhaecke et al., 2008). Tijdens de metabolisatie in het lichaam

wordt er een nitriet ion gevormd, wat de ultieme genotoxische component zou zijn. Deze kan binden aan het

DNA, meer bepaald door middel van N-C bindingen aan de guanine basen en induceert aldus DNA-adducten

(Demeyer et al., 2015).

Deze hypothese leek echter niet zo waarschijnlijk aangezien de gevormde concentratie HCA’s gelijk is na

bereiden van zowel rund en varken, als kip en vis (Bastide et al., 2011; Demeyer et al., 2015). Ook is de

hoeveelheid HCA’s die toxische effecten uitoefent bij knaagdieren 1000 keer hoger dan de concentratie die

kan gevonden worden in de voeding (Stavric, 1994; Schwab et al., 2000; Bastide et al., 2011). Aldus worden

HCA’s niet als belangrijke carcinogenen gezien voor de ontwikkeling van CRC (Corpet, 2011).

1.1.2.2.2 Polyaromatische koolwaterstoffen

De tweede groep van verbrandingsproducten zijn

de polyaromatische koolwaterstoffen (PAK’s).

Deze zijn wijdverspreid in het milieu aanwezig en

worden geproduceerd door onvolledige

verbranding van organische componenten. Ze

kunnen aanwezig zijn in de omgeving en

gevormd worden in de voeding tijdens de

bereiding (Demeyer et al., 2015). De hoogste

levels aan deze PAK’s kunnen teruggevonden

worden in vlees dat boven een warmtebron

bereid werd, zoals na grillen of barbecue.

Wanneer dit vlees verhit wordt, druppen er

vetsappen op de warmtebron en door pyrolyse

kunnen er vervolgens schadelijke stoffen in de rook terechtkomen (Butler, 2003; Bastide et al., 2011; Demeyer

et al., 2015). De meest bestudeerde PAK is benzo[a]pyreen, dit carcinogeen werd in 2012 door IARC

geclassificeerd als groep 1, op basis van mechanistisch bewijs en andere relevante data (figuur 5).

PAK’s op zichzelf zijn niet toxisch, maar tijdens metabolisatie kunnen reactieve metabolieten gevormd worden

die covalent kunnen binden met DNA en op die manier schade veroorzaken. PAK’s zijn aanwezig in alle

Fig 5: de chemische formule van benzo[a]pyrene

(IARC).

12

soorten voeding en worden dus niet gezien als causaal agens in de carcinogenese. Het is eerder de manier

van vleesbereiding die bijdraagt in de ontwikkeling van CRC (Cirillo et al., 2010; Demeyer et al., 2015).

1.1.2.3 Proteïne

Kim et al. (2013) stelden dat de overmatige opname van proteïnen kan leiden tot het ontstaan van CRC. De

meeste diëtaire proteïnen worden geabsorbeerd in de dunne darm. Er zijn echter substantiële hoeveelheden

endogene en exogene nitrogene componenten die de dikke darm bereiken, waar de microbiota instaat voor

de proteolyse. Dit zorgt voor het ontstaan van peptiden en aminozuren, die worden vrijgesteld in de darmen.

De darmmicrobiota verwerken deze peptiden en aminozuren, met de productie van bacteriële metabolieten

als gevolg. Hierdoor kunnen potentieel toxische bacteriële metabolieten in overmaat geproduceerd worden,

wat kan leiden tot DNA schade bij de colonepitheelcellen, dit brengt metabole veranderingen teweeg. Deze

potentieel toxische producten van de proteïnefermentatie zijn: ammoniak, fenolen, indolen, ‘Branched Chain

Fatty Acids’ (BCFA’s) en H2S. Daarnaast kunnen ook endogene N-nitroso-componenten (NOC’s) gevormd

worden. De concrete werkingsmechanismen van deze opgesomde producten werden echter nog niet uitvoerig

onderzocht (Corpet et al., 1995; Hughes et al., 2000; Kim et al., 2013; Oostindjer et al., 2014).

Verschillende epidemiologische studies ondersteunen de associatie tussen overmatige proteïne opname en

CRC niet, aangezien er geen significant verband kon worden aangetoond (Windey et al., 2012).

1.1.2.4 Haem

De laatste hypothese, betreffende de toxiciteit van haem wordt ondersteund door epidemiologisch en

experimenteel onderzoek. Haem is ingebed in een hemoproteïne en bevindt zich met zijn ijzeratoom in het

centrum van een grote heterocyclische organische ring, genaamd porfyrine (figuur 7). Er bestaan drie soorten

hemoproteïnes, twee daarvan zijn betrokken bij de zuurstofvoorziening van de cel, dit zijn de hemoglobines

en myoglobines. Het overblijvende hemoproteïne is het cytochroom en kan de elektronentransferreacties

Fig 6: Schematische voorstelling van de metabolisatie van overmatige proteïne-opname, deze proteïnen

worden verwerkt door de microbiota, wat leidt tot de productie van onder meer schadelijke metabolieten

(Kim et al., 2013).

13

katalyseren. In rood vlees is haem tot 10 keer meer aanwezig dan in wit vlees (Bastide et al., 2011, Demeyer

et al., 2015).

Dit haemijzer is verantwoordelijk voor de

rode kleur van vlees en is hoofdzakelijk

aanwezig in het myoglobine van rood vlees,

wat kan verklaren waarom rood vlees

geassocieerd wordt met een hogere

incidentie van CRC (Chao et al., 2005). Men

heeft aangetoond dat een hoge inname van

haemijzer geassocieerd is met een hoger

risico op colonkanker. Het relatieve risico

(RR) van colonkanker ligt 1,18 keer hoger

voor mensen in de hoogste categorie van

haemijzer opname (meer dan 2,05 mg/dag)

in vergelijking met die in de laagste

categorie (minder dan 0,76 mg/dag) (Lee & Lee, 2004; Bastide et al., 2011). Kim et al. (2013) stelden dat de

consumptie van rood vlees het risico op CRC verhoogt op een dosis-afhankelijke manier. Zowel de opname

van rood vlees als supplementatie met haemijzer geven een verhoogde fecale concentratie van N-nitroso

componenten (NOC’s) en meer DNA-adducten in humane colonocyten (Chao et al., 2005). In een studie van

Kuhnle et al. (2007) werd aangetoond dat rundvlees meer haem bevat dan varkensvlees.

Bij vlees dat bewerkt is met pekelzout dat nitraat of nitriet bevat, zal dit nitriet zorgen voor een nitrosylatie van

het haemijzer, wat verondersteld is toxischer te zijn dan niet genitroslyeerd haemijzer (Bastide et al., 2011).

De haemmolecule heeft een katalytisch effect op de vorming van zowel NOC’s, als eindproducten van de

vetperoxidatie (Demeyer et al., 2015).

1.1.2.4.1 N-Nitrosocomponenten

Alle stoffen met N-nitroso-groepen worden geclassificeerd als N-nitrosocomponenten (NOC), waaronder ook

de N-nitrosamines en N-nitrosamides. Dit zijn alkylerende agentia die kunnen interageren met DNA van het

targetweefsel, waardoor zij mutaties kunnen induceren, en zo potentieel carcinogeen zijn (Saffhill et al., 1985).

Een veel voorkomende mutatie bij CRC is de alkylatie van de O6-positie van guanine, wat kan leiden tot een

transitie van guanine (G) naar adenine (A) (Bastide et al., 2011; Kim et al., 2013).

N-nitrosamides zijn direct alkylerende agentia en oefenen hun effect voornamelijk uit op de plaats van

blootstelling. N-nitrosamines daarentegen vereisen een metabole activatie om hun mutagene activiteit uit te

oefenen en zullen voornamelijk schade veroorzaken op hun activatieplaats. Tijdens voedselconsumptie

kunnen mensen blootgesteld worden aan NOC’s van zowel exogene als endogene origine (Cross & Sinha,

2004; Jagerstad & Skog, 2005).

Exogene N-Nitroso componenten (NOC’s) ontstaan wanneer organische componenten in de voeding door

nitriet genitrosyleerd worden. Behandeling van de voeding met nitriet is een methode om de houdbaarheid

van voeding te verlengen en een goede kleur te behouden.

De endogene N-nitrosylering van amines vindt plaats in het gastro-intestinaal stelsel en is een reactie tussen

nitrogene oxides en secundaire amines in de maag. Als eindproduct worden nitrosamines gevormd, de

Fig. 7: Chemische formule van haem (Wishart et al., 2013).

14

vorming van deze nitrosamines kan in de hand gewerkt worden door het katalytisch effect van haem, alsook

door een hoge temperatuur, zoals bijvoorbeeld kan gezien worden bij frituren (Bastide et al., 2011; Kim et al.,

2013; Oostindjer et al., 2014).

Het “International Agency for Research in Cancer” (IARC) klasseerde in 2010 de inname van nitraat of nitriet,

waardoor endogene nitrosylering kan plaatsvinden als “mogelijk carcinogeen voor mensen (Groep 2A)”. De

opname van nitraat gebeurt echter niet alleen door nitraat-bevattende behandeling van vlees. Er zijn namelijk

bepaalde groenten zoals selder, radijzen, bieten en spinazie die hoge levels van nitraat bevatten. Dit nitraat

wordt door orale bacteriën gemetaboliseerd naar nitriet, wat kan leiden tot een veel hogere opname van nitriet

per portie dan die door de opname van rood vlees (Oostindjer et al., 2014).

1.1.2.4.2 Vetperoxidatie

In vitro is haem zowel genotoxisch als cytotoxisch voor colonocyten, aangezien het DNA- en membraan

schade induceert. Heem zelf veroorzaakt een ‘downregulatie’ van pentraxine, een proteïne dat betrokken is in

het verwijderen van oude colonepitheelcellen. Dit zorgt voor een inhibitie van de apoptose en het afschilferen

van de colonocyten. Ook treedt er door haem een downregulatie van de inhibitoren van de celproliferatie op

(Kim et al., 2013).

Door zijn sterk katalytische werking draagt heem bij in de vetperoxidatie, met vorming van reactieve

zuurstofradicalen met cytotoxische en genotoxische werking (Bastide et al., 2011; Kim et al., 2013; Oostindjer

et al., 2014). Dit proces gaat vooral door in aanwezigheid van polyonverzadigde vetten zoals in celmembranen

onder de mucuslaag, of in aanwezigheid van galzuren (Oostindjer et al., 2014). In muizen is reeds aangetoond

dat haemijzer de carcinogenese promoot door vetperoxidatie. Dit zorgt voor een verhoogde celproliferatie ter

hoogte van de colonmucosa. Onder normale omstandigheden wordt haem volledig geabsorbeerd in het

gastrointestinaal stelsel, maar bij een overaanbod kan het niet volledig opgenomen worden en blijft het

aanwezig in de darmen, op die manier kan er beschadiging zijn van het colonepitheel. Als de schade niet kan

hersteld worden, resulteert dit in een verhoogd risico op kanker. Deze schade kan beperkt worden door

opname van voldoende antioxidanten, die van nature aanwezig zijn in groenten en fruit (Oostindjer et al.,

2014).

1.2.4.3 White meat controversy

Volgens Oostindjer et al. (2014) is de haemmolecule niet de oorzaak van het verhoogde risico op colonkanker,

gezien de kleine verschillen in haemconcentratie tussen rood vlees enerzijds, en kip en vis anderzijds. Ook

Lombardi-Boccia et al. (2002) vermelden dat er een gelijkaardige haemconcentratie aanwezig is in kip- en

varkensvlees, die beduidend lager is dan in rundvlees. Dit wordt ook aangeduid als de ‘white meat

controversy’.

In dit opzicht is het mogelijk dat het risico op CRC, afgezien van de haemmolecule, geassocieerd is met een

specifieke component van rood vlees, zoals bijvoorbeeld een oppervlakkig siaalzuur, meer bepaald het N-

glycolneuraminezuur (Neu5Gc) (Oostindjer et al., 2014). Deze molecule wordt niet geproduceerd door

bacteriën of planten en is zo goed als afwezig in gevogelte en vis. Het is daarentegen rijkelijk aanwezig in

koemelk en rood vlees (Byres et al., 2008).

Mensen kunnen dit siaalzuur niet verwerken en gaan het bijgevolg accumuleren uit de voeding. Dit resulteert

in de productie van circulerende anti-Neu5Gc antilichamen, wat leidt tot een lokale chronische inflammatie

15

(Hedlund et al., 2008). In (verwerkt) rood vlees kan de gecombineerde aanwezigheid van Neu5Gc met haem

en genotoxische componenten de mogelijkheid tot het ontwikkelen van dieetgerelateerde carcinomen doen

toenemen (Demeyer et al., 2015).

1.1.3 Mechanismen

Om de verschillende processen in de carcinogenese te begrijpen is het belangrijk inzicht te hebben in de

werking van de normale darm (figuur 8). Het colon heeft een plat oppervlakte-epitheel, bestaande uit

colonocyten, enteroendocriene cellen en Goblet cellen, dit epitheel zal invagineren om crypten te vormen. Op

de bodem van deze crypten blijven er steeds een aantal stamcellen aanwezig, rest van de cellen gaan snel

delen en proliferen. Vanuit deze proliferatieve zone migreren de cellen via een transitiezone naar het oppervlak

van de mucosa, waar ze gaan afschilferen (Degirolamo et al., 2011).

Terwijl ze door de transitiezone bewegen, stopt de DNA synthese. Aldus stopt de proliferatieve celcyclus en

de cellen worden volwassen, dit is de maturatiefase.

Fig 8: (a) Schematische voorstelling van het colonepitheel, onderaan bevinden zich een aantal

stamcellen, deze gaan traag delen en generen op die manier progenitorcellen, deze bevinden zich in het

onderste derde van de crypten en kunnen differentieren naar alle cellijnen in het colon. (b) Normale

stamcellen produceren progenitorcellen die zich kunnen differentieren in een aantal verschillende

cellijnen. In tumorale cellen is er een ontregeling van de normale dynamiek, waardoor er een clonale

expansie is van gemuteerde cellen (Degirolamo et al., 2011).

16

Bij gezonde individuen wordt het oppervlak van de colonmucosa op die manier door nieuwe cellen vervangen

om de 4-8 dagen. In deze proliferatiesnelheden zit echter vrij veel variatie. Zo zijn er regio’s die dagen niet-

proliferatief zijn versus regio’s waarbij de cellen onmiddellijk opnieuw delen. Deze traag proliferatieve

epitheelcellen worden voornamelijk gevonden in het sigmoïde colon. De cellen op deze plaats van de darm

zijn dus langer in contact met potentiële carcinogenen (Lipkin, 1974).

1.1.3.1 Pathogenese

De ontwikkeling van kanker is een langdurig proces, en bestaat uit de accumulatie van verschillende mutaties.

Dit verklaart het lineaire leeftijdsspecifieke incidentiepatroon van CRC (Vogelstein & Kinzler, 1993; Kamangar

et al., 2006). Het risico op ontwikkelen van CRC neemt toe met de leeftijd, en meer dan 90 % van de

sporadische CRC ontstaat bij individuen, ouder dan 50 jaar (Al-Sohaily et al., 2012). CRC ontstaat meestal als

een goedaardige adenomateuze poliep, die zich verder kan ontwikkelen in een gevorderd adenoom, met

dysplastische cellen en uiteindelijk kan een invasieve kanker (figuur 9) (Fearon & Vogelstein, 1990; Demeyer

et al., 2015).

Drie categorieën van genen spelen een belangrijke rol in de carcinogenese, namelijk de oncogenen, de

tumorsuppressiegenen en stabiliteitsgenen. Veranderingen in deze genen zijn belangrijke gebeurtenissen in

de tumor initiatie.

De belangrijkste groep zijn de tumorsuppressiegenen, welke zorgen voor een inhibitie van de celproliferatie.

Genetische veranderingen die aanleiding geven tot een inactivatie van deze genen leiden tot een verlies van

Fig. 9: De verschillende stappen in het ontstaan van een coloncarcinoom. (A) toont de normale opbouw

van een crypte. (B) toont de ontwikkeling van een fase 1 proliferatieve laesie, het aantal nieuwgevormde

cellen is nog evenredig met het aantal afschilferende cellen. (C) is de ontwikkeling van een fase 2

proliferatieve laesie, waarbij er een accumulatie is van cellen in de mucosa. (D) toont de verdere

differentiatie van abnormale cellen, met de progressie naar carcinoom (Lipkin, 1974).

17

controle en dus een ongeremde celgroei (Vogelstein & Kinzler, 1993; Vogelstein & Kinzler, 2004; Boland &

Goel, 2010).

Een andere belangrijke groep is deze van de oncogenen, die kunnen coderen voor groeifactoren of hun

receptoren, voor signaalmoleculen en andere factoren die een rol kunnen spelen in de celproliferatie en

overleving. De oncogene eigenschappen worden geactiveerd bij veranderingen in deze genen, wat kan leiden

tot overactieve genproducten en een toegenomen aantal kopijen (Boland & Goel, 2010).

1.1.3.1.1 Model van Fearon en Vogelstein

Dit model stelt dat de carcinogenese begint met mutaties die de activatie van oncogenen en inactivatie van

tumorsuppressiegenen veroorzaken. Deze stap wordt gevolgd door mutaties in minstens 4 tot 5 verschillende

genen, noodzakelijk voor het ontwikkelen van de tumor. Ten laatste is er een accumulatie van mutaties die de

tumor zijn kwaadaardige eigenschappen bezorgen (Fearon & Vogelstein, 1990).

De initiële stap in de ontwikkeling van de tumor is een mutatie ter hoogte van het APC tumor suppressie gen,

wat een inkorting veroorzaakt van het geproduceerde proteïne, waardoor dit niet meer functioneel is

(Vogelstein & Kinzler, 1993). Deze mutaties reduceren de hoeveelheid caspase 3, 7 en 9 in colonocyten van

muizen, wat leidt tot een resistentie aan apoptose (Bastide et al., 2011).

Mutaties ter hoogte van het APC gen leiden tot de vorming van gradueel groeiende goedaardige tumoren,

doordat de normale inhibitie van de DNA-synthese tijdens de maturatie niet gebeurt, met als gevolg een

toegenomen cellulaire proliferatie (Lipkin, 1974). De volgende stap is een mutatie van het RAS gen, wat leidt

Fig. 10: Schematische voorstelling van het model van Fearon en Vogelstein (naar Fearon & Vogelstein,

1990).

18

tot een verdere clonale expansie van de tumor. Dit RAS gen is een oncogen en wanneer gemuteerd, promoot

dit de hyperplastische groei van het colonepitheel, aberrante morfologie in de crypten, tumorgroei en de

vorming van metastasen (Cabrera-Mendoza et al., 2014).

De progressie van adenoom naar carcinoom wordt gemedieerd door genetische veranderingen in de

tumorsuppressiegenen DCC, gelegen op chromosoom 18q, en p53. Dit geeft aanleiding tot een clonale

expansie die finaal resulteert in de progressie naar een maligne tumor (figuur 10) (Fearon & Vogelstein, 1990;

Vogelstein & Kinzler, 1993).

Het is echter ongewoon dat combinaties van mutaties in verschillende genen voorkomen in één en dezelfde

kanker. De genetische achtergrond van de ontwikkeling van een CRC lijkt meer heterogeen te zijn.

Tegenwoordig wordt vooral de hypothese van genomische instabiliteit gevolgd, dit is een integraal deel van

de transformatie van naar carcinoom. Er zijn drie moleculaire principes geïdentificeerd, waarbij er genetische

veranderingen kunnen optreden in belangrijke regulatorische genen: chromosomale instabiliteit, microsatelliet

instabiliteit en “CpG eiland methylator fenotype pathway”. Deze moleculaire principes zijn niet strikt, wat wil

zeggen dat sommige tumoren kenmerken van meerdere principes kunnen vertonen (Al-Sohaily et al., 2012).

Omgevings -en voedingsgebonden mutagenen bevatten componenten die aanwezig zijn in rood en verwerkt

vlees, die kunnen bijdragen tot genomische instabiliteit en uiteindelijk CRC door het induceren van DNA

schade (Demeyer et al., 2015).

1.1.3.1.2 Chromosomale instabiliteit

De meest voorkomende oorzaak, 65 – 70 % van de sporadische CRC, van genomische instabiliteit is de

chromosomale instabiliteit. Dit wordt gekenmerkt door een afwijkend karyogram, tengevolge van winst of

verlies van volledige chromosomen of chromosomale regio’s. Het gevolg hiervan is een imbalans in het

chromosoom aantal en een verlies aan heterogeniteit. Wanneer dit plaatsvindt in belangrijke oncogenen of

tumorsuppressiegenen wordt de tumor initiatie gestart (Al-Sohaily et al., 2012).

1.1.3.1.3 Microsatelliet instabiliteit

Microsatellieten zijn kleine herhalingen van nucleotide sequenties en zijn verspreid over het gehele genoom.

Door hun repetitieve sequentie zijn ze gevoelig voor fouten gedurende de replicatie (Al-Sohaily et al., 2012).

Microsatellieten zijn polymorf tussen individuen, maar zijn voor elk individu uniek en uniform in lengte (Boland

& Goel, 2010).

Fouten tijdens de replicatie worden herkend door het ‘DNA mismatch repair’ (MMR) systeem, dit zal fouten in

basepaarcombinaties herstellen. Een instabiliteit van de microsatellieten is het gevolg van de onmogelijkheid

van het MMR systeem om deze fouten te corrigeren. Overerfbare fouten in MMR genen resulteren in HNPCC

(Al-Sohaily et al., 2012). Deletiemutaties in deze sequenties vinden vaak plaats in genen die een rol spelen

als regulatoren van de celproliferatie (Boland & Goel, 2010) en kunnen een inactief genproduct veroorzaken

(Markowitz et al., 1995).

1.1.3.1.4 ‘CpG Eiland methylator phenotype pathway’

Bij dit moleculair principe treden er geen mutaties op, maar epigenetische veranderingen die de genexpressie

of functie kunnen veranderen zonder de DNA sequentie van een gen te wijzigen. Bij mensen worden deze

19

veranderingen hoofdzakelijk veroorzaakt door DNA-methylatie of histonenmodificatie. Methylatie van een

promotorgen kan resulteren in ‘silencing’ van dit gen en biedt zo een alternatief mechanisme voor het verlies

van functie van een tumorsuppressiegen (Al-Sohaily et al., 2012). Het fenomeen van methylatie neemt toe bij

ouder worden, en ook als adaptieve respons op chronische inflammatie (Boland & Goel, 2010).

1.1.3.1.5 Erfelijke vormen

De ontwikkeling van CRC vereist op zijn minst zeven genetische gebeurtenissen voordat een invasieve tumor

ontstaat. Wanneer mutaties in genen worden overgeërfd, maakt dit het individu gevoeliger voor het

ontwikkelen van kanker. Dit wordt gezien bij twee verschillende syndromen, het eerste is het “Familiale

Adenomateuze Polyposis” (FAP) met een mutatie in het adenomateuze polyposis coli gen APC, gelegen op

chromosoom 5 (Vogelstein & Kinzler, 1993). Het tweede syndroom is het “Hereditary Nonpolyposis Colorectal

Cancer” (HNPCC), waarbij door een erfelijk defect in het ‘DNA mismatch repair’ mechanisme de controle op

mutaties niet meer correct kan doorgaan (Kinzler & Vogelstein, 1996).

1.1.3.1.6 Invasie en metastasen

Kwaadaardige tumoren worden gekenmerkt door hun mogelijkheid invasief en metastatisch te groeien. Hierbij

slagen de tumorale cellen erin zich los te maken van hun primaire plaats, binnen te dringen in bloed –of

lymfevaten en zich te verspreiden en te vestigen op andere plaatsen in het lichaam. Om dit te kunnen doen

zullen tumorcellen dedifferentiëren naar een mesenchymaal-achtig fenotype, dit proces wordt ook ‘epitheliale

mesenchymale transitie’ (EMT) genoemd. Metastatische tumoren vertonen echter nog steeds morfologische

kenmerken van de primaire tumor, dit impliceert dat ze na vestiging op een andere plaats in het lichaam

opnieuw zullen differentiëren, dit is de ‘mesenchymale epitheliale transitie’ (MET) (Al-Sohaily et al., 2012).

1.1.3.2 Effecten van haem

Zoals reeds eerder aangehaald is de hypothese van haem-geïnduceerde schade de meest waarschijnlijke.

Deze baseert zich op het katalytisch effect van de haemmolecule op de vorming van zowel NOC’s, als

eindproducten van de vetperoxidatie. Diëtair haem wordt slecht geabsorbeerd in de dunne darmen, hierdoor

komt ongeveer 90 % in het colon terecht, waar het fungeert als groeifactor voor bacteriën (Ijssennagger et al.,

2012).

Er zijn drie mechanistische hypotheses die de promotie van CRC door haem ondersteunen (figuur 11):

- Katalystisch effect van het haemijzer op de endogene vorming van NOC’s,

- Katalystisch effect van haemijzer op de vetperoxidatie (Bastide et al., 2011),

- Metabolisatie van haem in de darm naar een cytotoxische factor (Sesink et al., 1999).

20

1.1.3.2.1 N-nitrosocomponenten

Tijdens de voedselconsumptie kunnen mensen blootgesteld worden aan NOC’s van zowel exogene als

endogene origine (Cross & Sinha, 2004; Jagerstad & Skog, 2005).

1.1.3.2.1.1 Exogene blootstelling

Met hitte behandelde vleesproducten bevatten vaak NOC’s, waarvan de belangrijkste groep de volatiele N-

nitrosamines zijn. Twee van deze volatiele N-nitrosamines zijn door IARC geclassificeerd als potentieel

carcinogeen voor de mens (Demeyer et al., 2015). Voedingsbronnen, en dan voornamelijk verwerkt en verhit

vlees, zijn verantwoordelijk voor ongeveer 70 % van de humane exogene blootstelling (Tricker & Preussmann,

1991; Tricker, 1997; Jakszyn et al., 2004).

Fig. 11: Schematische voorstelling van de mechanismen van de ontwikkeling van CRC. Nitraat en nitriet in

vlees worden gemetaboliseerd naar NO (dit proces kan zowel in het vlees als in de mond plaatsvinden), die

op hun beurt kunnen interageren met amines tot de vorming van NOC’s. Haemijzer kan ook interageren met

polyonverzadigde vetten in de darm, resulterend in ROS, die DNA kunnen beschadigen (Oostindjer et al.,

2014).

21

1.1.3.2.1.2 Endogene productie

Endogene productie maakt 45 – 75 % van de totale blootstelling aan NOC’s uit (Tricker, 1997). Belangrijk

hierbij zijn de secundaire amines en andere nitroseerbare precursoren, zoals een aantal essentiële proteïnen

en sporenelementen, in de voeding (De Kok & van Maanen, 2000). Deze endogene productie kan verlopen

via verschillende mechanismen, zo kan ze gekatalyseerd worden door een zuur milieu of doorgaan in het

colon onder invloed van bacteriën (Cross & Sinha, 2004).

De katalysatie door zuur milieu vindt voornamelijk plaats in de maag, het proces begint reeds bij de opname

van de voeding in de mond. Ongeveer 5 % van het exogeen nitraat wordt ter hoogte van de dunne darmen

opgenomen, zal recirculeren naar het speeksel en wordt door orale bacteriën gereduceerd tot nitriet.

Vervolgens wordt het in het speeksel gevormde nitriet omgezet naar het nitroserend agens: ‘nitrous acid’

(Spiegelhalder et al., 1976; De Kok & van Maanen, 2000). Dit proces van endogene vorming van NOC wordt

echter als minimaal beschouwd en is dus van ondergeschikt belang (Pignatelli et al., 1993).

In de dunne en dikke darm is de pH te hoog en kan voorgaand proces niet doorgaan. Onder deze

omstandigheden zal er een biologische katalyse optreden door bacteriële groei (Demeyer et al., 2015).

Onderzoek van Massey et al. (1988) ondersteunt deze hypothese, doordat er bij kiemvrije ratten geen

omvorming gebeurde van nitraat naar NOC. Ook onderzoek van Vanden Bussche et al. (2014) toonde aan

dat de aanwezigheid van een actieve microbiota essentieel is voor de endogene alkylatie, aangezien er bij

geautoclaveerde fecale inocula geen DNA-adducten konden gevormd worden. Intestinale vorming van NOCs

is afhankelijk van de opname van nitraat en de capaciteit van de microbiota om nitraat te reduceren tot nitriet

(Engemann et al., 2013).

Verwerkt rood vlees bevat residueel nitriet dat kan bijdragen tot de vorming van NOC’s. Bovendien kan haem

aanwezig in rood en verwerkt vlees ook bijdragen bij deze endogene productie van NOC’s (Demeyer et al.,

2015).

Eenmaal blootgesteld aan de reducerende omstandigheden in de dunne en dikke darm wordt de

haemmolecule wordt snel genitrosyleerd en vanaf dan heeft het de mogelijkheid zelf te functioneren als een

nitrosylerend agens. Op die manier wordt de vorming van N-nitrosocomponenten gepromoot. Deze worden

ook wel “Apparant Total N-nitroso Compounds” (ATNC) genoemd en een aantal hiervan zijn gekende of

verdachte carcinogenen, omdat ze het DNA kunnen alkyleren (Kuhnle & Bingham, 2007; Bastide et al., 2011).

Vermoedelijk is deze DNA-alkylatie voornamelijk het effect van N-alkyl-N-nitroso componenten, die zorgen

voor de transitie van guanine-cytosine (GC), naar adenine-thymine (AT). Deze transities worden vaak

aangetroffen in genen die gemuteerd zijn bij CRC, waaronder het RAS gen (Kuhnle et al., 2007).

Bovendien kan de nitrosylering van aminozuren, zoals glycine, leiden tot het ontstaan van onmiddellijk actieve

componenten, zoals diazoacetaat, die kunnen reageren met DNA in vivo. Dit resulteert in de vorming van een

N-nitroso-component specifiek adduct, namelijk O6-carboxymethyl-2’-deoxy-guanosine (O6-CMeG). Dit adduct

wordt niet hersteld door O6-alkylguanine-transferase en kan zich dus opstapelen in het cellulair DNA van het

gastrointestinaal stelsel. Dit kan worden gezien als een promutagene laesie en is verhoogd aanwezig in

coloncellen die geïsoleerd werden bij humane vrijwilligers die rood vlees gegeten hadden. Er kan een correlatie

gezien worden tussen het aantal gevonden adducten en het fecaal gehalte aan ATNC (Lewin et al., 2006;

Kuhnle et al., 2007; Bastide et al., 2011; Vanden Bussche et al., 2014).

22

1.1.3.2.2 Oxidatieve schade aan DNA

Haem kan de oxidatie van polyonverzadigde vetzuren in de celmembranen veroorzaken. De residuen van

deze vetzuren in fosfolipiden zijn heel gevoelig aan oxidatie. Dit proces wordt geïnitieerd door vrije radicalen

die de membraanlipiden gaan aanvallen, waarbij de heemmolecule fungeert als katalysator.

LOOH (lipide hydroperoxide) + Fe-ligand (heem) LOOFe liganden LO° (lipide alkoxy radicaal) + °OFe

liganden (heem oxiradicaal)

Initieel worden er lipidenperoxiden gevormd, deze zijn echter maar vrij kortlevend en worden ofwel

gereduceerd door glutathion peroxidase tot niet-reactieve vetzuuralcoholen, ofwel reageren ze met metalen

wat aanleiding geeft tot het ontstaan van reactieve aldehyden, die ofwel direct met DNA en proteïnen reageren,

ofwel verdere oxidatie ondergaan tot meer reactieve epoxiden. In de groep van deze reactieve aldehyden zijn

malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenal de belangrijkste. Deze diëtaire vetperoxidatieproducten zijn

risicofactoren voor verschillende humane ziekten, waaronder ook het ontstaan van colonkanker (Marnett,

2000; Bartsch & Nair, 2004; Bastide et al., 2011). De hoogste waarden van deze aldehyden worden

aangetroffen voor de colondigestie (Vanden Bussche et al., 2014).

• Malondialdehyde (figuur 12)

Deze molecule ontstaat na oxidatie van polyonverzadigde vetzuren met twee of meerdere dubbele bindingen.

Malondialdehyde (MDA) induceert DNA-schade en is aldus mutageen voor bacteriële, zoogdier -en humane

cellen. De schade ontstaat doordat MDA reageert met DNA en zo adducten vormt met deoxyguanosine,

deoxyadenosine en deoxycytidine.

Het belangrijkste DNA adduct dat gevormd wordt is het 1,N²-malondialdehyde-deoxyguanosine (M1dG). Dit

werd gedetecteerd in colorectale biopten van personen met normale mucosae. Het aantal van deze adducten

wordt beïnvloed door het voedingspatroon en de levensstijl. Bovendien hebben mensen met adenomen een

hoger M1dG gehalte vergeleken met mensen zonder. Belangrijk bij de productie van MDA is de totale

vetinhoud van het vlees, aangezien dit een peroxidatieproduct van polyonverzadigde vetzuren is (Bastide et

al., 2011; Vanden Bussche et al., 2014).

Fig. 12: Structuurformule van malondialdehyde (IARC, 2015).

23

• 4-hydroxynonenal (figuur 13)

In tegenstelling tot MDA is 4-hydroxynonenal (4-HNE) slechts zwak mutageen, maar toch blijkt het het

belangrijkste toxische product van de vetperoxidatie te zijn. Het oefent zijn belangrijkste effecten uit op de

signaaltransductie, maar lijkt onafhankelijk te zijn van DNA-schade (Baradat et al., 2011; Bastide et al., 2011).

1.1.3.2.3 Metabolisatie van haem in de darm tot een cytotoxische factor

Een laatste hypothese is het direct effect van haem (of 1 van zijn metabolieten) op coloncellen, waarbij dit

zorgt voor een toegenomen epitheliale proliferatie in de colonmucosa, ook het resulterende fecaal water lijkt

toxisch te zijn. Hyperproliferatie van colonepitheel wordt gezien als een compensatie voor cytotoxicteit (Sesink

et al., 1999). Bovendien toonden ratten, gevoederd met hemine, minder afgeschilferd DNA in de feces dan de

controledieren, dit wijst erop dat hemine de celdifferentiatie en exfoliatie van colonocyten in het darmlumen

vermindert (Demeyer et al., 2015).

1.2 Metabolomics

1.2.1 Het metaboloom

Het metaboloom, het finale product van het genoom, wordt gedefinieerd als de totale kwantitatieve

verzameling van moleculen met een laag moleculair gewicht, meer bepaald metabolieten, aanwezig in een cel

of organisme, dat deelneemt in de metabole reacties die vereist zijn voor groei, onderhoud en normale functie

van het lichaam (Dunn et al., 2005). Het metaboloom bestaat dus uit een collectie van duizenden kleine

moleculen, die chemische transformaties ondergaan tijdens de stofwisseling en worden beïnvloed door elk

aspect van de celfunctie (Hounoum et al., 2016).

Het humaan metaboloom bestaat uit twee delen en wordt beïnvloed door het dieet. Het voedingsmetaboloom

wordt rechtstreeks afgeleid van de digestie en biotransformatie van voeding en zijn componenten, dit zijn meer

dan 25 000 metabolieten. Dit voedingsmetaboloom is extreem complex en de compositie ervan kan variëren

naargelang het dieet. Een andere component van het humane metaboloom is het endogeen metaboloom, dit

omvat alle metabolieten die afkomstig zijn van de gastheer (Scalbert et al., 2014). De metabolieten zijn dus

heel nauw verwant met het fenotype van de onderzochte persoon (Ellis et al., 2007; Hounoum et al., 2016).

Fig. 13: Structuurformule 4-hydroxynonenal (Wishart et al., 2013).

24

Dit metaboloom biedt een grote bron van mogelijke diëtaire biomerkers die kunnen gebruikt worden om de

diëtaire blootstelling in detail weer te geven. Zo kan een gedetailleerde karakterisatie van het

voedingsmetaboloom zorgen voor een accurate monitoring van diëtaire blootstelling en ook voor de

identificatie van voeding die het ziekterisico beïnvloedt in klinische en epidemiologische studies (Scalbert et

al., 2014). De metabolieten kunnen met behulp van verschillende analytische platforms met uitstekende

nauwkeurigheid en precisie uit complexe biologische systemen gehaald worden (Ellis et al., 2007; Hounoum

et al., 2016).

1.2.2 Metabolomics

‘Metabolomics’ is het geheel van technieken die gebruikt worden om metabolieten in kaart te brengen. Op die

manier kan men essentiële informatie verkrijgen over de cellulaire biochemie. Zo kunnen metabolieten van

verschillende schijnbaar niet verwante biochemische processen elkaar beïnvloeden door middel van

pleiotropie. Om deze effecten te kunnen begrijpen is een analyse noodzakelijk waarbij alle metabolieten in

een biologisch systeem geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. Zo een aanpak onthult het volledige

metaboloom van het biologisch systeem en wordt ook wel ‘metabolomics’ genoemd (Fiehn, 2002; Weckwerth

& Morgenthal, 2005; Dunn et al., 2005).

‘Metabolomics’ kan verder worden opgesplitst in meerdere takken, waarvan de eerste de ‘target analysis’ is,

dit is een kwantitatieve benadering van één of enkele metabolieten, die specifiek gerelateerd zijn aan een

bepaald metabolisch principe (Fiehn, 2002; Dunn et al., 2005).

Wanneer metabolieten geïdentificeerd en gekwantificeerd worden op basis van hun gelijkende chemische

eigenschappen of metabole principes, dan spreekt men van ‘metabolite profiling’ (Dunn et al., 2005). Meestal

maakt men hierbij gebruik van een aantal vooraf bepaalde metabolieten in een biologisch staal (Fiehn, 2002).

Een laatste categorie is de ‘metabolic fingerprinting’, hierbij worden de stalen geclassificeerd op basis van hun

origine of biologische relevantie (Fiehn, 2002), er treedt geen identificatie en kwalificatie op (Dunn et al., 2005).

1.2.2.2 Gebruikte technieken

1.2.2.2.1 Nucleaire magnetische resonantie

Eén van de eerste technieken gebruikt voor ‘metabolomics’ is de “Nucleaire Magnetische Resonantie” (NMR)

spectroscopie. Deze techniek kan voor veel stalen gebruikt worden, aangezien de meeste elementen minstens

één isotoop bezitten met een magnetisch spin nummer groter dan nul, dit is immers essentieel voor de werking

van NMR (Ellis et al., 2007). Kernen met een oneven aantal protonen of neutronen bezitten intrinsieke

magnetische eigenschappen (Nixon et al). De meest gevoelige NMR-techniek, welke nog steeds een vrij lage

gevoeligheid heeft, maakt gebruik van de 1H-kern, dit zijn enkelvoudige protonen en komen bij praktisch alle

chemische moleculen voor (Ellis et al., 2007).

Deze elektrisch geladen atomische kernen hebben kleine energieverschillen, die bepalen of ze parallel of

antiparallel bewegen bij aanleggen van een magnetisch veld (Sherry, 1984). Wanneer het staal in een

magnetisch veld met een radiofrequentie van het elektromagnetisch spectrum wordt geplaatst, dan zorgt de

straling voor een NMR transitie. Hierdoor zullen de kernen zich gaan alligneren en roteren zodat ze parallel

met dit magnetisch veld komen te liggen (Nixon et al., 1986, Ellis et al., 2007). Tijdens deze verandering van

spinstatus zullen de protonen een deel van de radiofrequentie energie absorberen.

25

Nuclei binnen dezelfde molecule, maar met een lichtjes verschillende omgeving vereisen een verschillende

energie voor de NMR transitie. Wanneer de magnetische puls verwijderd wordt, vallen te protonen terug naar

hun originele positie, waarbij ze een radiofrequentie signaal uitsturen. Op die manier worden karakteristieke

absorpties of resonanties geproduceerd en kan de moleculaire structuur bepaald worden (Sherry, 1984; Nixon

et al., 1986).

De betreffende straling beweegt snel door materiaal, waaronder zacht biologisch weefsel. Meestal brengt deze

straling een minimale opwarming van het staal teweeg, waardoor het kan gezien worden als een non-invasieve

analytische techniek (Dunn et al., 2005; Ellis et al., 2007). Bovendien is deze techniek heel gevoelig aan de

chemische omgeving waarin een component zich bevindt. Hierdoor wordt er in een mengsel met een grote

variëteit aan chemische componenten makkelijk een onderscheid gemaakt tussen de verschillende

componenten (Ellis et al., 2007).

1.2.2.2.2 Vloeistofchromatografie gekoppeld met massaspectrometrie

Een andere veelgebruikte techniek voor het uitvoeren van ‘metabolomics’ is de koppeling van

vloeistofchromatografie aan massaspectrometrie (LC-MS). Deze koppeling heeft meerdere voordelen, zoals

het grote aantal beschikbare instrumenten, gekoppeld aan ruime databases, net als het grote aantal

metabolieten die met deze techniek kunnen worden herkend. Dit zorgt ervoor dat men een vrij volledig beeld

krijgt van het effectieve metaboloom. Als laatste is deze techniek ook heel erg veelzijdig, zo kan een enkele

LC-MS combinatie gebruikt worden voor een groot aantal verschillende functies, met een minimum aan

modificaties (Gika et al., 2014).

1.2.2.2.2.1 “Ultra hoge prestatie vloeistofchromatografie”

“High Performance Liquid” Chromatografie (HPLC) is een methode die in staat is gecompliceerde mengsels

met componenten van verschillend moleculair gewicht te scheiden. Bovendien kan het ook moleculen met

verschillende polariteiten en zuur-base eigenschappen scheiden in verschillende matrices. Een groot nadeel

van deze techniek is dat er ofwel tijd ofwel resolutie moet opgeofferd worden. Biologische stalen zijn echter

vaak vrij complex en aanwezig in grote aantallen, waardoor deze scheiding met een hoge resolutie en

sensitiviteit, aan een hoge snelheid, moeten kunnen geanalyseerd worden. Daarom werden methodes

ontwikkeld die een snelle analyse konden uitvoeren, zonder dat dit gepaard gaat met een verlies aan efficiëntie

van de scheiding (Novakova & Vlckova, 2009).

Aan deze eisen wordt voldaan door de “Ultra High Performance Liquid” Chromatografie (UHPLC), waarbij

gebruik wordt gemaakt van sub-2-micron partikels in ultra hoge druksystemen. Daarom wordt ook wel eens

“Ultra High Pressure Liquid” Chromatografie als synoniem gebruikt. Het gebruik van kleine partikels is de beste

oplossing om de chromatografische prestaties te verbeteren (Novakova & Vlckova, 2009; Rainville et al.,

2014).

Het gebruik van deze techniek resulteert in een accurater metabolisch profiel, gecombineerd met een

toegenomen resolutie (meer discrete pieken per scheiding), betere sensitiviteit en verminderde

ionensuppressie. Deze voordelen maken het mogelijk om in eenzelfde analysetijd significant meer analyten in

een staal te detecteren (Rainville et al., 2014).

26

De laatste tijd is UHPLC een veel gebruikte analytische techniek, bruikbaar voor heel veel verschillende

doeleinden. De techniek kan toegepast worden voor farmaceutische analyses, proteomics, metabolomics en

analyses van voeding, omgeving en planten (Novakova & Vlckova, 2009).

1.2.2.2.2.2 Hoge resolutie massaspectrometrie

Een belangrijke techniek bij metabolomics is massaspectrometrie (MS), deze biedt een uitstekende

gevoeligheid en heeft bovendien de mogelijkheid verschillende honderden metabolieten te detecteren in één

enkele analyse (Ellis et al., 2007). Het is een complexe techniek die gebruikt wordt voor de identificatie en

kwantificatie van biologische en chemische entiteiten en is gebaseerd op het meten van massa.

Het moleculair gewicht van intacte metabolieten is gecorreleerd aan de elementaire samenstelling en wordt

experimenteel bepaald. De werking van een MS toestel volgt steeds een vast patroon. Het begint met de

introductie van een staal, gevolgd door de vorming van ionen in een ionenbron. Daarna gebeurt de scheiding

van de ionen op basis van hun massa/lading-verhouding (m/z), deze stap vindt plaats in een massa analysator.

Tenslotte worden de ionen gedetecteerd. Door de hoge sensitiviteit van deze techniek kunnen metabolieten

aan fysiologische concentraties gedetecteerd worden. Bovendien kunnen door de hoge selectiviteit

metabolieten in complexe biologische systemen specifiek gedetecteerd worden en kan er zowel een

confirmatie als identificatie van deze metabolieten gebeuren. Dit is allemaal mogelijk zonder een dure

voorbehandeling van de stalen, de voorbehandeling is echter wel complexer dan bij NMR. De selectiviteit kan

nog verhoogd worden door gebruik van een tandem MS, dit zijn twee massaspectrometers die met elkaar

gekoppeld zijn (Ellis et al., 2007; Römpp & Spengler, 2013; Hounoum et al., 2016).

Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) heeft een hogere accuraatheid dan de gewone

massaspectrometrie. Dit komt doordat de HRMS efficiënter kan centreren en zorgen voor deconvolutie van

piekprofielen (Hounoum et al., 2016).

HRMS maakt een accurate massa meting mogelijk met een hoog oplossend vermogen. De belangrijkste

HRMS technieken zijn “time-of-light” massa spectrometrie en “Orbitrap Fourier-transform”

massaspectrometrie. Beide technieken kunnen een component of een fragment vrij nauwkeurig bepalen zodat

de elementaire samenstelling onmiddellijk kan bepaald worden. Accurate massa en isotooppatronen werken

als filter voor confirmatie van de identiteit van een component of zelfs identificatie van een ongekende

component (Ojanpera et al., 2012; Junot et al., 2014). Het voordeel van een Orbitrap is dat het bij een lage

ratio reeds een hoge resolutie biedt. Het nadeel is echter dat het langer duurt voor de dataverzameling

compleet is (Hounoum et al., 2016). Deze techniek biedt een accurate massameting, met fouten van sub-ppm

grootte. Door discriminatie tussen isobare componenten verbetert HRMS de detectie van metabolieten, maar

ook de identificatie of structurele karakterisatie van de metabolieten is mogelijk (Junot et al., 2014).

1.2.3 Het gebruik van metabolomics voor de relatie dieet-gezondheid

Het gebruik van metabolomics is een techniek om de positieve en negatieve gevolgen van bepaalde voeding

of een bepaald dieet te evalueren. Ook kan deze techniek gebruikt worden om bepaalde voedingspatronen te

analyseren, bijvoorbeeld het Westers voedingspatroon, dat vrij veel vlees bevat (Kim et al., 2015).

27

Metabolomics kan helpen de interactie tussen nutriënten en het humaan metabolisme op te helderen.

Bovendien wordt het effect van het genoom en het darmmicrobioom op de algemene gezondheid van de mens

nagegaan (McNiven et al., 2011).

Verschillende studies zijn erin geslaagd biomerkers te identificeren die geassocieerd zijn met de opname van

bepaalde voedingselementen. Deze studies hebben ook aangetoond dat bepaalde voedingselementen of

patronen een significant effect hebben op bepaalde aspecten van de stofwisseling, zoals het aminozuur –en

lipidenmetabolisme, met invloed op de gezondheid van de mens.

Zo werd er aangetoond dat het dieet gepaard gaat met bepaalde ziektes, waarbij metabolomics kan gebruikt

worden om de metabolische verandering, geassocieerd met deze voedingsgerelateerde aandoening aan te

tonen. Metabolomics kan gebruikt worden om te controleren of een dieetinterventie het beoogde effect heeft

(Kim et al., 2015). Er kan ook nagegaan worden of een patiënt lijdt aan een deficiëntie.

Het metaboloom geeft een accurate weergave van de inwendige processen, waardoor heel snel

veranderingen kunnen opgemerkt worden. Op die manier kunnen overgangen van anabolisme naar

katabolisme of reacties op bepaalde stimuli snel gedetecteerd worden. Sommige elementen van het

metaboloom zullen echter meer gradueel veranderen, wat het begin van een ziekte kan reflecteren. Als laatste

zijn er ook bepaalde elementen in het profiel van de gastheer die gedurende het verloop van weken of soms

zelfs jaren constant blijven. Deze constante is te wijten aan de genetische samenstelling, levensstijl en

omgeving. De invloed van de omgeving kan zelfs aanleiding geven tot regionale metabolische fenotypes

(McNiven et al., 2011).

1.3 Rol van de gastro-intestinale microbiota

1.3.1 Verteringssimulaties

Onderzoek naar de in vivo digestie bij mensen bestaat uit een voedingsstudie en de verzameling van een

reeks stalen.

Fig. 14: Schematische voorstelling van de volledige digestietractus (Guerra et al., 2012).

28

Deze digestiestalen worden via nasogastrische of nasoduodenale aspiratie gepreleveerd uit de maag of dunne

darm. Het meer distale deel van de dunne darm is ontoegankelijk voor staalname, de eerstvolgende plaats

waar opnieuw stalen verzameld kunnen worden is het terminale ileum, in geval van ileostomie, of via de feces

(Wickham et al., 2009). Via in vivo interventiestudies, bij mensen of dieren, kunnen de meest accurate

gegevens verzameld worden, maar deze zijn tijdrovend en duur. Daarom werden in vitro procedures

ontwikkeld, een handig alternatief om voedingsmiddelen te screenen. Hierbij test men structurele en

chemische veranderingen van de voeding onder gesimuleerde gastrointestinale (GI) condities (Hur et al.,

2011).

1.3.1.1 Statische verteringssimulaties

Bij de statische of biochemische modellen blijven de finale digestieproducten gedurende het volledige

digestieproces aanwezig in hetzelfde recipiënt en worden geen andere fysische bewegingen zoals verkleinen,

mixen, daling van de maag pH en absorptieprocessen toegepast (Wickham et al., 2009; Guerra et al., 2012;

Minekus et al., 2014).

Deze statische modellen zijn niet in staat de dynamische veranderingen die optreden tijdens de digestie na te

bootsen (Nguyen et al., 2015). Ze worden voornamelijk gebruikt bij gelimiteerde digesties, om bijvoorbeeld

enkel de maagdigestie na te bootsen. Ze zijn minder bruikbaar voor volledige digestiestudies (Wickham et al.,

2009). Veel van deze modellen zijn vrij eenvoudig en bestaan uit de homogenisatie van voeding, verzuring

met HCl en toevoegen van de maagenzymen. Dit wordt gevolgd door een variabele incubatieperiode, wat

overeenkomt met het verblijf in de maag, vervolgens gebeurt er een neutralisatie met bicarbonaat en hydroxide

gecombineerd met de toevoeging van pancreasenzymen en galzouten. Gedurende het volledige proces wordt

er steeds gemengd en een temperatuur van 37 °C nagestreefd (Wickham et al., 2009).

Het grootste nadeel van deze statische modellen is dat de dynamische digestieprocessen zoals maaglediging,

peristaltische bewegingen, pH veranderingen in de maag, de secretie van enzymen en vocht tijdens de

digestie niet kunnen nabootsen. Wanneer de volledige digestietractus moet bestudeerd worden, maakt men

bijgevolg meestal gebruik van dynamische digestieprocessen (figuur 14) (Guerra et al., 2012).

Een statische benadering van de dikke darmfermentatie wordt gegeven door de ‘batch fermentatie’. Hierbij is

er groei van een bacteriële suspensie in een zorgvuldig geselecteerd medium, zonder verdere toediening van

nutriënten. Vaak wordt hier gebruik gemaakt van gesloten systemen die de suspensies van fecaal materiaal

bevatten en dit onder anaërobe condities houden. ‘Batch fermentaties’ worden voornamelijk gebruikt voor het

onderzoek naar metabole profielen van korte keten vetzuren, die ontstaan door actieve metabolisatie van

diëtaire componenten door de darmmicrobiota. Deze systemen zijn makkelijk in gebruik en goedkoop, zo

kunnen een grote hoeveelheid stalen snel getest worden (Payne et al., 2008).

1.3.1.2 Dynamische verteringssimulaties

Verschillende in vitro modellen worden gebruikt om de vertering na te bootsen, onder andere TIM-1, TIM-2 en

“Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem” (SHIME)

TIM-1 (TNA gastrointestinaal model 1) stelt het gastrointestinaal stelsel voor met 1 component die dienst doet

als maag, 3 componenten als dunne darm, meer bepaald duodenum, jejunum en ileum, en tot slot nog 1

component die de dikke darm voorstelt. Het hele systeem wordt gecontroleerd door een computer en houdt

rekening met de belangrijkste parameters tijdens de digestie, zoals humane temperatuur, pH-veranderingen

29

in de maag, de automatische secretie van maag –en pancreassap, transittijd (figuur 14), peristaltische

beweging en de absorptie van nutriënten ter hoogte van de darm (Guerra et al., 2012). Een nadeel van dit

systeem is dat het niet in staat is de microbiota te imiteren, om dit gebrek weg te werken werd TIM-2 ontwikkeld

uit TIM-1. Deze bevat nog andere belangrijke functies zoals de absorptie van water en metabolieten in de

dikke darm (Payne et al., 2012; Nguyen et al., 2015). TIM-2 bestaat uit vier glazen eenheden met een flexibele

binnenwand die peristaltische beweging mogelijk maakt. Aldus simuleert dit systeem het proximaal colon.

Er wordt een temperatuur van 37 °C en anaeroob milieu gehandhaafd, dit laatste gebeurt door te spoelen met

N2. Er wordt gebruik gemaakt van een spoelvloeistof die in de reactor gepompt wordt doorheen holle vezels.

Fecesstalen van 10 gezonde volwassenen worden gemengd en dienen als inoculum, dit wordt snel ingevroren

in vloeibare N2 en bewaard aan een temperatuur van -80 °C. Aan de start van het experiment wordt 30 mL

van dit fecaal inoculum samengevoegd met 80 mL van een dubbel verdund “standard ileal efflux” medium

(SIEM). Er wordt steeds volgens een vast patroon gewerkt, beginnend met een stabilisatieperiode, zodat de

microbiota zich kan aanpassen aan de in vitro cultuur, dit duurt 16 uur. Vervolgens wordt de microbiota 2 uur

gevast, waarna er een behandelingsperiode van 3 dagen plaatsvindt (figuur 15) (Van den Abbeele et al.,

2013).

Fig. 15: Schematische voorstelling van TIM-2 (Van den Abbeele et al., 2013).

30

Een tweede veel gebruikt systeem is SHIME en bestaat uit vijf dubbelwandige vaten die de maag, dunne

darmen en drie colonregio’s voorstellen. Dit is één van de enige modellen die het gehele gastrointestinaal

stelsel nabootst (Van den Abbeele et al., 2013; Van de Wiele et al., 2015). Ook hier wordt een temperatuur

van 37 °C gehandhaafd en wordt er een anaeroob milieu gecreëerd door de bovenstaande ruimte te spoelen

met N2. De colonregio’s worden geïnoculeerd met een fecaal staal van een gezonde vrijwilliger (Van den

Abbeele et al., 2013). De nadruk ligt hier op simulatie van de microbiële samenstelling van het colon, daarom

wordt wegens interindividuele variatie geen gebruik gemaakt van mengstalen. Het systeem kan worden

aangepast naargelang de doelgroep (volwassenen, kinderen, verschillende diersoorten) (Van de Wiele et al.,

2015). Drie keer per dag wordt er 140 mL nutritioneel medium toegediend aan de maag en 60 mL pancreassap

aan de dunne darm. Een voordeel van dit systeem is dat de microbiota gedurende een langere periode

geobserveerd kan worden, dit in tegenstelling tot TIM-2. Analoog met TIM-2 wordt ook hier gebruik gemaakt

van verschillende stadia, beginnend met een stabilisatieperiode (2 weken), waarin de microbiota kan wennen

aan de omgevingsomstandigheden. Vervolgens komt de basale periode (2 weken), waarbij het systeem getest

wordt onder normale omstandigheden en de basis parameters gemeten worden. Daarna wordt het effect van

een specifieke behandeling op de microbiota van het gastrointestinaal stelsel nagegaan tijdens de

behandelingsperiode (2-4 weken). Als laatste volgt de “wash-out” periode (2 weken) waarin wordt onderzocht

hoe lang de geïnduceerde veranderingen blijven bestaan na stopzetten van de behandeling (figuur 16) (Van

de Wiele et al., 2015).

Aangezien de activiteit van een voorbereid enzymmengsel afneemt, is het belangrijk dit bij de aanvang van

een nieuwe studie telkens opnieuw te bereiden. Belangrijk bij een in vitro digestie zijn de karakteristieken van

het gebruikte enzym, welke worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals concentratie, temperatuur,

pH, stabiliteit, eventuele activatoren en inhibitoren.

De temperatuur tijdens de digestie bedraagt steeds 37°C en de digestietijd is afhankelijk van het onderzochte

staal. De digestietijd bij in vivo vertering is afhankelijk van zowel de individuele karakteristieken zoals leeftijd,

geslacht, gezondheidstoestand, mentale gezondheid en tijdstip, als van de karakteristieken van de voeding,

Fig. 16: Schematische voorstelling van SHIME (Van den Abbeele et al., 2013).

31

zoals de totale hoeveelheid, samenstelling en partikelgrootte. Deze digestietijd kan heel erg variëren, het is

bijgevolg belangrijk dat de in vitro digestie hierop afgesteld worden (Hur et al., 2011).

1.3.2 Verband tussen microbiota en het risico op CRC

De microbiota die de mucus net boven het epitheel van het colon koloniseert wordt het mucosaal microbioom

genoemd. Dit is een belangrijke component van het microbieel ecosysteem aangezien ze door hun nabijheid

bij het colonepitheel een rol kunnen spelen in de darmgezondheid, en bij uitbreiding ook de gezondheid van

het individu (Van de Wiele et al., 2015).

Door zijn gunstige eigenschappen, zoals een trage darmtransit, nutriëntenbeschikbaarheid en een optimale

pH is het colon de anatomische locatie met het hoogste aantal micro-organismen (figuur 17) (Payne et al.,

2012).

De aanwezige microbiota van het colon bevat een complexe mengeling van bacteriën, deze vertonen zowel

inter –als intra-individuele verschillen, bovendien kunnen ze zelfs in het colon van anatomische positie en

lokalisatie in het lumen verschillen (Vanden Bussche et al., 2014).

De microbiota van de dikke darm wordt gezien als een belangrijk metabolisch orgaan, met impact op zowel

ziekte als gezondheid. Hierbij vormen de enterische bacteriën een natuurlijke barrière, met tal van protectieve,

structurele en metabolische effecten op het epitheel (figuur 18).

Fig. 17: De bacteriële densiteit neemt toe in het jejunum en ileum en is maximaal in het colon. De meest

voorkomende genera worden opgesomd (O'Hara & Shanahan, 2006).

Fig. 18: Commensale bacteriën oefenen een heel gamma van beschermende, structurele en metabole

effecten uit op de intestinale mucosa (O'Hara & Shanahan, 2006).

32

De intestinale epitheliale celdifferentiatie –en proliferatie wordt beïnvloed door de vorming van korte keten

vetzuren door bacteriën (O'Hara & Shanahan, 2006). De microflora van het colon is voornamelijk

samengesteld uit bacteriën, maar bevat ook fungi en protozoa. Sommige bacteriën zijn schadelijk voor de

gastheer, terwijl andere dan net weer voordelig zijn. Wanneer het evenwicht tussen beide groepen verstoord

is, kan dit de bioactivatie van carcinogenen beïnvloeden, en op die manier ook het risico op kanker (Kim et al.,

2013).

De samenstelling van dit microbioom kan worden beïnvloed door het dieet, zo zal er bij muizen gevoederd

met een hoofdzakelijk Westers dieet, ook hoog in vetpercentage, en supplementatie met haemijzer, een

verschuiving zijn naar hogere aantallen Bacteroides en lagere aantallen Firmicutes. Deze verschuiving zou

voornamelijk veroorzaakt worden door een selectieve gevoeligheid van gram+ bacteriën aan de haemijzer

geïnduceerde cytotoxiciteit van fecaal water. Hierdoor kan er een selectieve groei van gram- kiemen

plaatsvinden. De veranderde samenstelling van de microbiota oefent echter geen invloed uit op de

hyperproliferatie en hyperplasie (Ijssennagger et al., 2012). Ook Maier et al. (1974) observeerden bij omnivore

fecale stalen een toename van Bacteroides, Bifidobacterium, E. coli en Enterobactericeae. In een onderzoek

van Sobhani et al. (2011) werd een duidelijke stijging gezien van de bacteriën Bacteroïdes en Prevotella bij

patiënten met CRC tegenover de gezonde controlegroep. Enkele van deze colonbacteriën, meer bepaald de

Lactobacilli en de Bifidobacteria spp. zijn in staat NO te produceren uit nitriet (Vanden Bussche et al., 2014).

De microbiota spelen een belangrijke rol in het ontstaan van de hyperproliferatie en hyperplasie, aangezien

dit proces niet meer doorgaat na toediening van antibiotica. Een verklaring hiervoor is dat antibiotica zorgen

voor een versterking van de mucus barrière, door de eliminatie van een subgroep bacteriën die

verantwoordelijk zijn voor de productie van sulfiden en de degradatie van mucine (Ijssennagger et al., 2015).

Zowel supplementatie met haemijzer als een dieet met hoog vetgehalte resulteren in een toename van

reactieve zuurstof species, gepaard met hogere MDA concentraties in de feces, indicatoren voor oxidatieve

stress. Deze bevindingen zijn sterk positief geassocieerd met E. coli en Enterococcus species en negatief

geassocieerd met Lactobacillus. Bij controlediëten werden net de omgekeerde fenomenen gezien (Qiao et al.,

2013; Ijssennagger et al., 2015). Diëten hoog in vet geven een daling in Bifidobacteria, deze zijn betrokken in

de productie van butyraat, een belangrijke antitumorale molecule (Vanden Bussche et al., 2014).

Deze verschuivingen in microbiota, geassocieerd met oxidatieve stress, zijn belangrijk aangezien Ijssennagger

et al. (2012), bij haem gesupplementeerde muizen, een toegenomen capaciteit tot nitraatreductie vaststelden

in de colonmicrobiota. Dit leunt aan bij bevindingen van Engemann et al. (2013) en Vanden Bussche et al.

(2014), waarbij haemijzer de vorming van NOC afgeleide DNA-adducten bevordert. Aldus is het mogelijk dat

de microbiële samenstelling een determinerende factor is in de productie van toxische NOC’s, door zijn nitraat

reducerende eigenschappen (Ijssennagger et al., 2015).

Veranderingen in deze microbiële samenstelling kunnen leiden tot veranderingen in de immuunrespons en zo

evolueren tot de ontwikkeling van pathologische toestanden (Belkaid & Hand, 2014). Zo is bewezen dat de

manipulatie van de intestinale microbiota de ontwikkeling van colitis geassocieerde CRC bij muizen in de hand

werkt (Uronis et al., 2009), terwijl de depletie van luminaal ijzer aanpassingen in de microbiota genereert,

waardoor de ontwikkeling van chronische ileïtis bij muizen kan worden tegengegaan (Werner et al., 2010).

33

2. DOEL VAN DE STUDIE

2.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte

Eerder onderzoek, verricht door Rombouts et al. (2016), toonde aan dat er verschillende metabolieten worden

gevormd bij de colondigestie van rood vlees, die bij de digestie van kip in significant lagere concentratie tot

afwezig zijn. In dit onderzoek werd bij twee proefpersonen met behulp van een “untargeted metabolomics”

methode gezocht naar metabolieten die specifiek geassocieerd zijn met de colondigestie van rood vlees in

vergelijking met kip. Als resultaat van deze studie werden 10 metabolieten weerhouden die significant hoger

waren bij de vertering van rund versus gevogelte. Twee van deze 10 metabolieten zijn hoogstwaarschijnlijk

acylcarnitines (metaboliet 1 en 7), waaronder 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) (tabel 6). Deze laatste kan

door transformatie in de lever worden omgevormd naar trimethylamine-N-oxide (TMAO), wat geassocieerd is

met atherosclerose (Koeth et al., 2013). Volgens Bae et al. (2014) kan deze stof ook betrokken zijn bij de

carcinogenese van colonkanker.

Tabel 6: De metabolieten met hun specifieke m/z ratio en retentietijden (Rombouts et al., 2016).

Ionisatiemodus m/z ratio (Da) Retentietijd (min)

1: 3-dehydroxycarnitine + 146.11738 1,58

2: Niet gekend + 160.13284 1,64

3: Niet gekend - 180.07907 1,02

4: Niet gekend + 239.13870 7,05

5: Niet gekend + 241.15411 2,08

6: Isoleucyl-hydroxyproline + 245.14875 1,59

7: Methylmalonylcarnitine + 262.12789 1,73

8: Niet gekend + 264.13223 1,55

9: Niet gekend + 344.24240 0,71

10: Niet gekend + 373.24396 0,96

Het eerste deel van deze studie diende ter validatie van de reeds behaalde resultaten van bovenvermeld

onderzoek door na te gaan of er bij meerdere proefpersonen (n = 6) van verschillende leeftijd en geslacht

vergelijkbare resultaten bekomen worden. Om dit te bewerkstelligen werd gebruik gemaakt van ‘targeted

metabolomics’, waarbij specifiek werd gezocht naar deze tien rood vlees geassocieerde metabolieten. De

vertering van kippenvlees werd gezien als een controlegroep voor de vertering van rundvlees.

2.2 Experiment vertering carnitine versus lysine

In voorgaand onderzoek werd met behulp van ‘untargeted metabolomics aangetoond dat er bij de vertering

van rood vlees hoogstwaarschijnlijk 2 acylcarnitines gevormd werden, namelijk 3-dehydroxycarnitine en

methylmalonylcarnitine. Deze werden significant minder gevormd bij de vertering van gevogelte.

In het tweede deel van deze studie werd nagegaan of deze acylcarnitines tijdens de vertering gevormd werden

vanuit de precursormolecule carnitine.

Voor zoogdiercellen is carnitine een essentiële component omdat het een sleutelrol speelt in de β-oxidatie.

Zijn primaire functie is namelijk het transporteren van lange keten vetzuren naar het cytosol van mitochondriën.

34

Carnitine komt vooral voor in vlees en melkproducten. Zo kan de hoogste concentratie carnitine gevonden

worden in het vlees van de kangaroo (6370 mg/kg DM), gevolgd door paardenvlees (4230 mg/kg DM),

rundvlees (1950 mg/kg DM) en varkensvlees (613 mg/kg DM). In het weefsel van gevogelte is er niet veel

carnitine aanwezig, namelijk een concentratie van 344 mg/kg DM. In vivo productie van carnitine kan gebeuren

uit de precursoren, lysine en methionine, dit zijn essentiële aminozuren (Seline & Johein, 2007). Gezien de

hoge concentratie carnitine in rood vlees is het waarschijnlijk dat er bij de vertering van rood vlees meer

acylcarnitines worden gevormd dan bij de digestie van gevogelte.

Lysine is een essentieel aminozuur en kan dus niet gesynthetiseerd worden in het lichaam, bijgevolg moet het

opgenomen worden met de voeding of voedingssupplementen. Vleesproducten zijn vaak rijk aan lysine, terwijl

granen vaak weinig lysine bevatten (Tomé & Bos, 2007; Rutherfurd & Moughan, 2007; Bertinato et al., 2016).

In dit experiment werd lysine gebruikt als controlegroep.

2.3 Metabolomics

Metabolomics kan ingedeeld worden in twee groepen naargelang men wel of geen voorkennis heeft van de

metabolieten die men wenst te bepalen, namelijk de ‘targeted metabolomics’ en de ‘untargeted metabolomics’.

Bij eerder onderzoek door Rombouts et al. (2016), alsook in dit onderzoek, werd gebruik gemaakt van

‘untargeted metabolomics’. Hierbij werd een globale benadering gebruikt waarbij zo veel mogelijk polaire tot

matig apolaire metabolieten gemeten worden binnen een bepaald bereik, die dan ondergebracht werden in

statistische modellen. Op die manier kunnen routinematig biologische stalen geanalyseerd worden, die

duizenden pieken genereren. Elk van deze pieken komt overeen met een gedetecteerd ion (afkomstig van

een metaboliet), met unieke massa-lading verhouding (m/z) en retentietijd. Op basis van deze eigenschappen

en de 12C/13C-isotoop kan de gevonden metaboliet geïdentificeerd worden.

Wanneer gebruik wordt gemaakt van een gedefinieerde set metabolieten spreekt met van ‘targeted

metabolomics’. Bij de keuze van de metabolieten wordt voornamelijk gefocust op één of meerdere pathways

van interesse (Patti et al., 2012). Deze methode werd gebruikt in het rood vlees-gevogelte onderzoek,

aangezien alleen op zoek werd gegaan naar de rood vlees geassocieerde metabolieten.

35

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1 In vitro digestie

3.1.1 Fecesstalen

In het eerste experiment (zie 1.1) werd de in vitro gastro-intestinale digestie van rundvlees en kip gesimuleerd.

Hiervoor werden verse fecesstalen verzameld bij 6 verschillende proefpersonen met een Westers dieet. Deze

mensen hadden bovendien geen antibioticagebruik gedurende de laatste 6 maanden. Proefpersoon 1 was

een man van 50 jaar, proefpersoon 2 een man van 25 jaar, proefpersoon 3 een vrouw van 52 jaar,

proefpersoon 4 een man van 53 jaar, proefpersoon 5 een man van 75 jaar en proefpersoon 6 een vrouw van

23 jaar. In totaal werden 6 digesties (kip in triplicaat en rund in triplicaat) per proefpersoon uitgevoerd. De

fecesstalen werden afgewogen en 60 g hiervan werd telkens verdund met 300 mL geautoclaveerd fecaal

inoculum buffer, bestaande uit K2HPO4 (4,4 g/ 500 mL), KH2PO4 (3,4 g/ 500 mL) en natriumthioglycolaat (0,5

g/ 500 mL). Nadien werd dit mengsel gedurende 10 minuten aan hoge intensiteit gehomogeniseerd met behulp

van een stomacher. Vervolgens werden de stalen gecentrifugeerd (500 g, 2 min), hiervan werd het

supernatans verzameld en 1 minuut gemengd (vortexen) met 20% glycerol, waarna de stalen werden

ingevroren bij -80°C.

Voor het uitvoeren van de digesties in het tweede experiment (zie 1.2) werd slechts het ingevroren fecaal

inoculum van proefpersoon 1 gebruikt, dit werd volgens dezelfde methode verkregen.

3.1.2 Vleesbereidingen

Voor de start van de incubatie werden er ook vleesbereidingen gemaakt. Voor het rundvlees werd gebruik

gemaakt van 3 kg diafragmaspier en bij kip 1 kg borstspier. Bij beide vleessoorten werd het vet verwijderd en

het vlees in kleine stukken van 1 à 2 cm3 gesneden. Vervolgens werd er 20% subcutaan varkensvet door

gemengd. De vleesbereidingen werden fijngemalen met behulp van een Omega T12, waarbij de eerste keer

een 10 mm plaat gebruikt werd, gevolgd door een 3,5 mm plaat. Daaropvolgend werd het vlees gelijkmatig

over 500 mL maatbekers verdeeld en, na het bereiken van een kerntemperatuur van 90 °C, 30 minuten verhit

in een warmwaterbad. Tenslotte werden de vleesbereidingen fijngemalen met een keukenrobot (Moulinex),

gealiquoteerd (70 g) en vacuüm verpakt.

3.1.3 Verteringssappen

De verteringssappen (speeksel, maagsap, duodenaalsap en galsap) bestaan uit een anorganische fractie

(tabel 7) en een organische fractie (tabel 8). De anorganische oplossingen kunnen ruim op voorhand

aangemaakt worden en dienen bewaard te worden in een koelkast. Een dag voor de incubatie werden de

organische oplossingen voorbereid en vermengd met de anorganische fractie. Deze finale verteringssappen

werden, met uitzondering van het duodenaalsap, geautoclaveerd. Pepsine (500 µL, aan een concentratie van

32 mg/100 mL) werd pas toegevoegd op de dag van de incubatie, dit simultaan met de toediening van

maagsap (figuur 19).

36

Tabel 7: Anorganische oplossing van de verschillende verteringssappen (op voorhand).

Speeksel Maagsap Duodenaalsap Galsap

20 mL KCl 31,4 mL NaCl 80 mL NaCl 60 mL NaCl

20 mL KSCN 6 mL NaH2PO4 80 mL NaHCO3 136,6 mL NaHCO3

20 mL NaH2PO4 18,4 mL KCl 20 mL KH2PO4 8,4 mL KCl

20 mL NaSO4 36 mL CaCl2.2H2O 12,6 mL KCl 1,3 mL HCl 37%

3,4 mL NaCl 20 mL NH4Cl 20 mL MgCl2

40 mL NaHCO3 13 mL HCl 37% 0,36 mL HCl 37%

Aanlengen met H2O tot 1000 mL

De dag voor de incubatie werd ook het fecaal inoculum gefinaliseerd, waarbij de eerder verwerkte fecale stalen

1/10de werden verdund met geautoclaveerd Brain Heart Infusion medium, bestaande uit Brain Heart Infusion

(37 g/L) en L-cysteïne (0,5 g/L). Deze fecale inocula werden nadien gedurende 1u gespoeld met N2 gas om

een anaeroob milieu te creëren, nodig voor de activiteit van de dikke darmflora. Uiteindelijk werden de fecale

inocula geïncubeerd gedurende 24u (37°C, 150 RPM) voor de verdere opkweek van de microbiota.

Tabel 8: Organische fractie van de verschillende verteringssappen (dag voor de incubatie).

Speeksel Maagsap Duodenaalsap Galsap

2 mL ureum (1,25 g in

50 mL H2O)

1,7 mL ureum (1,25 g in

50 mL H2O)

2 mL ureum (1,25 g in

50 mL H2O)

2,5 mL ureum (1,25 g in

50 mL H2O)

0,25 mL

lactoperoxidase (0,0016

g in 50 mL H2O)

0,3250 g glucose 0,0999 g CaCl2.2H2O 0,0555 g CaCl2.2H2O

0,0017 g NaNO2 0,0100 g glucuronzuur 0,5000 g BSA 0,4500 g BSA

0,0029 g urinezuur 0,1650 g glucosamine-

HCl

4,5000 g pancreatine 7,5000 g gal

0,0063 g mucine 0,0056 g FeSO4 0,7500 g lipase

0,0088 g ascorbinezuur

0,5000 g Bovine Serum

Albumin (BSA)

1,5000 g mucine

Aanlengen met H2O tot

125 mL

Aanlengen met H2O tot

250 mL

Aanlengen met H2O tot

250 mL

Aanlengen met H2O tot

125 mL

125 mL anorganische

oplossing toedienen

250 mL anorganische

oplossing toedienen

250 mL anorganische

oplossing toedienen

125 mL anorganische

oplossing toedienen

37

3.1.4 In vitro digestie

3.1.4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte

Bij het eerste experiment, betreffende de digestie van rood vlees en gevogelte, werd op de dag van de

incubatie 4,5 g vlees afgewogen. Vervolgens werd 6 mL speeksel, 12 mL maagsap, 10 µL H2O2 en 500 µL

pepsine (32 mg/100 mL) toegediend. Dit geheel werd gemixt (Ultraturax) en gedurende 2 uur geïncubeerd bij

37°C en stelt de passage door de maag voor. Hierna werd er 2 mL bicarbonaatoplossing (8,4 g/100 mL), 12

mL duodenaalsap en 6 mL galsap toegevoegd, gevolgd door opnieuw een 2 uur durende incubatie (37°C),

analoog met de passage doorheen de dunne darm. Tenslotte werd er 22 mL Simulator of the Human Intestinal

Microbial Ecosystem (SHIME) medium (tabel 9) en 22 mL fecaal inoculum toegevoegd waarna de eerste

staalnames (1 mL Eppendorf) gebeurden, representatief voor de dunne darmdigestie. De vaste fractie van het

SHIME-medium werd op voorhand aangemaakt en de dag voor de incubatie gemengd met 0,1 M fosfaatbuffer,

bestaande uit KH2PO4 (6,8 g/L) en K2HPO4 (8,8 g/L), waarna dit geheel geautoclaveerd en bewaard werd in

de koelkast. Na staalname werden de stalen gespoeld met N2 gedurende een half uur. Dit werd gevolgd door

een 48 uur durende incubatie (37°C, 150 RPM). Na deze incubatieperiode werden opnieuw stalen verzameld,

deze stellen de dikke darmdigestie voor (figuur 19). Drie replica’s per vleessoort werden geïnclineerd in de

studie. De stalen werden geanalyseerd met de UHPLC-Q-Orbitrap.

Figuur 19: Flowchart van de in vitro digestie.

38

Tabel 9: Vaste fractie SHIME medium.

Component g/L

Arabinogalactan 1

Gist extract 3

Glucose 0,4

L-cysteïne 0,5

Mucine 4

Pectine 2

Pepton 1

Xylaan 1

Aardappel zetmeel 4

3.1.4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine

Bij het tweede experiment, dit met carnitine, werden verschillende concentraties carnitine (aangekocht bij

Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA; C0158-1G; zuiverheid > 98%) en lysine toegevoegd aan 900 mg

varkensvet (20 % varkensvet voor 4,5 g vlees), dit varkensvet werd toegevoegd om te normaliseren voor

vetpercentage en komt overeen met het percentage dat ook in het eerste experiment gebruikt werd. Er werd

een verdunningsreeks gebruikt in de studie, met 3 verdunningen in triplicaat, van zowel carnitine als lysine.

Als referentie werd het vlees van de schouder van het rund gebruikt. Dit vlees bevat 1390 mg carnitine per kg

droog gewicht (Seline & Johein, 2007), dit correspondeert met 5 mg carnitine voor 3,6 g rood vlees. Als

alternatief voor gevogelte werd gebruik gemaakt van 0,5 mg carnitine voor 3,6 g vlees. Telkens werd dezelfde

concentratie lysine toegevoegd aan de controlegroepen van carnitine.

Een stockoplossing van carnitine en van lysine werden gemaakt, elk aan een concentratie van 5 mg aminozuur

per mL. Deze stockoplossingen werden gebruikt voor het aanmaken van de verdunningsreeksen, waarvan

telkens 1 mL werd toegediend aan de corresponderende potjes (tabel 10). Aan groep 1 en 2 werden

respectievelijk 100 % lysine-stockoplossing en 100 % carnitine-stockoplossing toegevoegd, dit komt neer op

5 mg aminozuur per potje. Voor groep 3 en 4 werd de stockoplossing verdund, waardoor er respectievelijk 0,5

mg lysine en carnitine aanwezig was per potje. Hiervoor moest de stockoplossing 10 x verdund worden. Aldus

werd 400 µL onverdunde stockoplossing samengevoegd met 3600 µL gedestilleerd water. Aan groep 5, die

kan gezien worden als de algemene controlegroep, werd uiteindelijk 100 % gedestilleerd water toegediend

(tabel 10).

Tabel 10: Verdunningsreeks carnitine-lysine.

Groep Verdunningsreeks Concentratie

Groep 1 5 mg lysine 1 mL van 100 % stockoplossing (5 mg/mL lysine)

Groep 2 5 mg carnitine 1 mL van 100 % stockoplossing (5 mg/mL carnitine)

Groep 3 0,5 mg lysine 1 mL van verdunde stockoplossing (400 uL onverdund lysine

+ 3600 uL gedestilleerd water)

Groep 4 0,5 mg carnitine 1 mL van verdunde stockoplossing (400 uL onverdund

carnitine + 3600 uL gedestilleerd water)

Groep 5 Geen aminozuren 1 mL gedestilleerd water

39

3.2 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS

3.2.1 Staalvoorbereiding

Voorafgaand aan de extractie werd aan de stalen 20 µL interne standaard (25ng/µL D-valine-d8, Sigma

Aldrich) toegevoegd, waarna ze gecentrifugeerd werden (13300 RPM, 5 min). Het supernatans werd

vervolgens gefilterd doorheen een Polyvinylideen Fluoride Membraan (PVDF filter (0,22 µL)) en in een nieuwe

eppendorf gebracht. Het filtraat werd vervolgens 1/5de verdund met ultrapuur (UP) water en overgebracht

naar een LC-MS vial.

Er werd ook gebruik gemaakt van kwaliteitscontrole door het supernatans van alle stalen te poolen en deze

1/5de te verdunnen met UP water (= QC stalen). Ook deze stalen werden overgebracht in een LC-MS vial en

meegenomen in de analyse. De methode die werd gebruikt op de UHPLC-Q-Orbitrap werd reeds ontwikkeld

door Vanden Bussche et al. (2015).

3.2.2 UHPLC-Q-Orbitrap

Deze methode maakt voor het UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) deel gebruik van een

Acquity HSS T3 C18 kolom (1,8 μm, 150 mm x 2,1 mm, Waters), aan een temperatuur van 45 °C, voor de

scheiding van de gastrointestinale metabolieten.

Er werd gebruik gemaakt van een binair solvent systeem met ultrapuur water (A) en acetonitrile (B), beide

geacidifieerd met 0,1 % mierenzuur, aan een constante snelheid van 0,4 mL/min. Voor elke analyse werd er

10 μL van elk staal geïnjecteerd. Zie tabel 11 voor de flowgradiënten van de solventen.

Tabel 11: Gradiënten van de solventen UHPLC.

Tijd (min) 0,1 % mierenzuur (%) 0,1 % ACN (%) μL/min

0 - 1,5 98 2 400

1,5 - 7,0 75 25 400

7,0 - 8,0 40 60 400

8,0 - 12,0 5 95 400

12,0 - 14,0 5 95 400

14,0 -14,1 98 2 400

4,0 min re-equilibratie

De HRMS analyse werd uitgevoerd met een Exactive benchtop Orbitrap massa spectrometer (Thermo Fisher

Scientific San José, CA, USA), uitgerust met een verwarmde elektrospray ionisatie bron (HESI), die kan

werken met een wisselende polariteit. Verder werden volgende instellingen gebruikt: voltage bron van 5 kV,

temperatuur van de bron bedroeg 350 °C, de scanrange bevond zich tussen 53,4-800 m/z, temperatuur van

de capillair was 250°C, voltage van de capillair: 90 kV (+/-), voltage tubelens 60 kV (+/-), ‘skimmer’ voltage 20

kV (+/-). Er was een ‘auxillary flow rate’ van 25 arbitraire eenheden, ‘sweep gas flow rate’ van 5 arbitraire

eenheden, ‘sheat gas flow rate’ van 50 arbitraire eenheden en ‘heather’ temperatuur van 350°C. Het ‘AGC

target’ was gebalanceerd (1 x 106 ionen) met een maximum injectietijd van 50 ms.

40

Er werd gewerkt in full scan modus, waardoor er geen fragmentatie optrad van moleculen. Deze methode

maakte gebruik van zeer hoge resolutie (100 000 full width half maximum) aan 1 Hz, waardoor telkens de

massa van de moleculen tot 10 ppm nauwkeurig kon worden bepaald. Het verschil tussen de theoretische

massa en de berekende massa werd daardoor begrensd tot maximaal 10 ppm (Vanden Bussche et al.,

2015).

3.3 Statistische analyse

3.3.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte

Zoals reeds eerder aangehaald werd er bij het experiment met rood vlees en gevogelte gewerkt met een

‘targeted’ methode, dit houdt in dat er specifiek gezocht werd naar de tien eerder bepaalde metabolieten. Deze

metabolieten kunnen herkend worden op basis van hun specifieke retentietijden en massa-lading ratio.

De resultaten werden manueel geprocessed met Xcalibur 2.1. Vervolgens werd voor elke metaboliet de

piekintensiteit bepaald, waarna voor elke proefpersoon per metaboliet in excel de gemiddelde waarde en

standaarddeviatie werden berekend van de drie herhalingen. Deze waarden werden uitgezet in een grafiek.

3.3.2 Experiment vertering carnitine versus lysine

Bij het lysine-carnitine experiment werd er zowel met ‘targeted’ als ‘untargeted metabolomics’ gewerkt. Bij de

‘untargeted metabolomics’ werd het volledige metabool patroon dat gegenereerd wordt door de digestie van

lysine vergeleken met dit van carnitine, de referentiegroep. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de statistische

programma’s SIEVETM en SIMCATM. De ‘targeted metabolomics’ gebeurde analoog aan het experiment van

de vertering van rood vlees versus gevogelte, waarbij er specifiek naar de 10 rood vlees geassocieerde

metabolieten werd gezocht, meer specifiek naar de acylcarnitines.

3.3.3 SAS Enterprise guide 7

De verdere statistische analyse van beide ‘untargeted metabolomic’ experimenten werd uitgevoerd met SAS

Enterprise guide 7. Er werd een ANOVA-tabel (Analysis of variance) gemaakt om na te gaan of de gemiddelde

waarden significant verschillend waren. Het doel van een Two-way ANOVA is om na te gaan of er significante

verschillen bestaan tussen de verschillende niveau’s van twee categorische variabelen (vlees en tijdstip

staalname), wat betreft de waarde van een bepaalde continue afhankelijke variabele (piekintensiteit). Door de

instelling “Differences of Least Squares Means” werden alle mogelijke combinaties tussen voor en na

colondigestie, en rund en kip met elkaar vergeleken. Er werd gebruik gemaakt van een Tukey’s test, hierbij

worden in één enkele stap multipele vergelijkingen berekend en worden een reeks

betrouwbaarheidsintervallen berekend voor alle paarsgewijze verschillen tussen de gemiddelden. Deze

intervallen zijn gebaseerd op Tukey’s “Honest Significant Difference”-methode. Bij de vergelijkingen werd

gebruik gemaakt van een “default” term, hierbij wordt een vooraf ingestelde waarde gegeven aan een variabele

als de gebruiker zelf geen waarde invoert (Seo et al., 1994).

Uiteindelijk werden de bekomen resultaten geïnterpreteerd, indien er een P-waarde bekomen werd die kleiner

is dan 0,05 betekent dit dat er een significant verschil was tussen de gemiddelden.

41

3.3.3.1 SIEVETM

Gebruikmakend van het statistisch programma SIEVETM 2.2 (ThermoFisher Scientific, San José, USA)

gebeurde er een eerste analyse van de stalen. Hierbij werden de lysine (5 mg) stalen vergeleken met de

carnitine (5 mg) stalen. Er werd een onderscheid gemaakt tussen de stalen met positieve ionisatie en die met

negatieve ionisatie, beide werden in een apart proces geanalyseerd, dit werd geregeld door de instelling ‘Filter

selection’.

De “intensity threshold” bedroeg 500.000, om achtergrondinformatie zoveel mogelijk te elimineren. De

identificatie van de statistisch weerhouden metabolieten gebeurde aan de hand van de “Human Metabolome

Database” (Wishart et al., 2013).

Als eerste werden de pieken gealligneerd, om de variabiliteit tussen de chromatogrammen te corrigeren,

waarna het programma kon gestart worden en de analyse begon. Voor de analyse werd carnitine gekozen als

ratio-groep, waartegenover lysine werd vergeleken. Vervolgens werd er gefilterd om enkel metabolieten die

significant tussen de carnitine- en lysinegroep verschilden te weerhouden. Deze filtering gebeurde als volgt:

‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine < 0,66 OR Ratio_lysine > 1,5)’, op deze manier trad er een sterke

reductie van het aantal componenten op.

De metabolieten werden geëxporteerd naar een excelfile, waarbij de metaboliet gekenmerkt werd door:

component ID, component moleculair gewicht, m/z-ratio, retentietijd, oppervlakten onder de piek, ratio,

standaardafwijking, p-waarde en de chemische formule.

Vervolgens werden deze component ID’s en hun corresponderend signaal (oppervlakte onder de piek) vanuit

excel overgebracht naar het statistisch programma SIMCATM 13.0.2 (Umetrics, Malmö, Zweden).

3.3.3.2 SIMCATM

Dit programma onderzocht welke metabolieten significant gerelateerd zijn met de digestie van carnitine, in

vergelijking met lysine aan de hand van verschillende statistische modellen (PCA-X, PLS-DA, OPLS-DA).

Allereerst werd een PCA-X (Principal Component Analysis) model opgesteld. In dit model werden de y-

variabelen (lysine en carnitine) uitgesloten. De clustering van de stalen werd nagegaan en er werd beoordeeld

of er uitbijters aanwezig waren aan de hand van een score-plot.

Hierna werd een PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) model opgesteld, dit model wordt

gebruikt om een permutatietest uit te voeren voor een eerste validatie van het statistisch model.

Tenslotte werd een OPLS-DA (orthogonal partial least squares) model opgesteld, waarin de systemische

variatie van de X-variabelen (metabolieten) opgesplitst wordt in twee elementen. Het ene element stelt de

variatie voor die lineair (voorspellend) gerelateerd is aan een Y-variabele en de andere de variatie die niet

gerelateerd (orthogonaal) is aan een Y-variabele. Deze onderverdeling van variatie vergemakkelijkt de

interpretatie van het model. Dit model werd finaal gebruikt om een selectie te maken van metabolieten die

specifiek geassocieerd zijn met carnitine. Bijkomende validatie werd uitgevoerd met behulp van CV-ANOVA.

Vervolgens werd een S-plot gemaakt, voor de selectie van de metabolieten specifiek voor de digestie van

carnitine, alsook werd een VIP-plot (Variable Importance in Projection) gemaakt. In het S-plot stelt elke cirkel

een metaboliet voor. De waarden op de X-as stellen de bijdrage van de metabolieten aan de variatie van de

observaties voor, terwijl de waarden op de Y-as de correlatie weergeven van een specifieke metaboliet met

een Y-variabele (carnitine of lysine). Hoe verder weg van 0 op de X-as en Y-as, hoe meer een metaboliet

geassocieerd kan worden met carnitine (positieve grenswaarde). Tenslotte werd aan de hand van het VIP plot

42

nagegaan in hoeverre de geselecteerde metabolieten belangrijk zijn (>1: zeer belangrijk, 1< middelmatig >0,8,

<0,8: weinig belangrijk). Alleen de metabolieten met een VIP-waarde boven 0,8 werden weerhouden.

Voor de identificatie van de finaal geselecteerde metabolieten, dewelke een sterke associatie vertoonden met

de digestie van carnitine, werd gebruik gemaakt van de online “Human Metabolome Database”. Hierbij was

de identificatie gebaseerd op de accurate massa (<10 ppm). Belangrijk om op te merken is dat men niet

volledig zeker kan zijn of de teruggevonden metaboliet in de “Human Metabolome Database” wel degelijk

overeenkomt met de metaboliet in het staal (vaak ook meerdere suggesties mogelijk per metaboliet). Om

volledig zeker te zijn zou men een analytische standaard van dit metaboliet moeten aankopen om de identiteit

te bevestigen. Indien een standaard niet beschikbaar is kunnen MS/MS spectra en/of nucleaire magnetische

resonantie (NMR) verdere verheldering geven van de structuur van een metaboliet.

43

4. RESULTATEN

4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte

In dit experiment werd bij zes proefpersonen nagegaan welke metabolieten significant verschillend waren

tussen de vertering van rood vlees en die van gevogelte. Hiervoor werd gebruik gemaakt van ‘targeted’

metabolomics, aldus werd er specifiek gezocht naar 10 metabolieten die significant meer voorkomen bij de

vertering van rood vlees ten opzichte van gevogelte (tabel 6). Van elke categorie (kip en rund voor

colondigestie, en kip en rund na colondigestie) werden de concentraties, bekomen na manuele processing

met X-calibur, ingevoerd in het statistisch programma SAS Enterprise guide 7. Op basis hiervan werd een

ANOVA tabel samengesteld, die de vergelijking van alle categorieën met elkaar mogelijk maakte. Er werd per

metaboliet gezocht naar significante verschillen tussen de categorieën, gekenmerkt door een P-waarde kleiner

dan 0,05.

Onderstaande tabel (tabel 12) geeft de algemene trends weer, waarbij voor elke paarsgewijze vergelijking

wordt vermeld welke categorieën significant verschillen. Deze algemene trends konden worden waargenomen

bij de meeste proefpersonen, er zijn echter wel uitzonderingen, wegens de interindividuele variatie tussen de

proefpersonen. Mogelijke verklaringen hiervoor worden beschreven in de discussie.

Tabel 12: Significante verschillen tussen de verschillende categorieën, vermeld met P-waarde, tussen

haakjes staat steeds de categorie met de hoogste concentratie. (R) rund, (K) Kip, (T0) voor colondigestie,

(T48) na colondigestie.

Nr Kip vs. rund Voor vs. na Kip:

voor vs. na

Rund:

voor vs. na

Kip vs. rund:

voor

Kip vs. rund:

na

1 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (T48) 0,0241 (R) < 0,0001 (R)

2 < 0,0001 (R) 0,0037 (T0) 0,7931 0,0002 (T0) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)

3 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,2280 < 0,0001 (T48) 1,0000 < 0,0001 (R)

4 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,0448 (T48) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)

5 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,8736 < 0,0001 (T48) 0,0003 (R) < 0,0001 (R)

6 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,9085 < 0,0001 (T48) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)

7 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,8782 < 0,0001 (T48) 1,0000 < 0,0001 (R)

8 0,0214 0,0002 < 0,0001 0,4382 0,0005 0,7222

9 0,1027 0,0792 0,2137 0,2100 0,2442 0,2484

10 < 0,0001 (R) 0,7634 0,9630 0,6371 < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)

Figuur 20 stelt de abundanties van 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) voor. Hierbij is er een stijging te zien

na de colondigestie van zowel rund als kip. Deze trend kan bij de meeste metabolieten worden waargenomen,

namelijk metaboliet 3, 4, 5, 6 en 7.

Tussen de vertering van rundvlees en gevogelte kunnen significante verschillen waargenomen worden bij

metabolieten 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 10. Het gaat hier over de combinatie van dunne darm digestie en

colondigestie. De abundantie van de metabolieten is telkens het hoogst bij de digestie van rundvlees.

Voor en na de colondigestie zijn er significante verschillen bij metabolieten 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7. Hierbij is de

abundantie steeds het hoogst na colondigestie, uitgezonderd metaboliet 2, waar de abundantie lijkt af te

nemen tijdens colondigestie.

44

Slechts bij twee metabolieten (metaboliet 1 of 3-dehydroxycarnitine, en metaboliet 4) neemt de abundantie

tijdens colondigestie van gevogelte significant toe.

Bij de colondigestie van rood vlees zijn er meerdere metabolieten die een significante verandering vertonen.

Zo is er bij metabolieten 1, 3, 4, 5, 6 en 7 een significant toegenomen abundantie na vertering ter hoogte van

het colon. Bij metabolieten 5 en 6 is er een afwijkend resultaat bij proefpersoon 3, waarbij de abundantie hoger

is ter hoogte van de dunne darm. Bij metaboliet 2 neemt de abundantie af tijdens de passage doorheen het

colon.

Reeds voor de passage doorheen het colon is er een significant verschil tussen rood vlees en gevogelte bij

metabolieten 1, 2, 4, 5, 6 en 10. Waarbij de metaboliet steeds in hoogste abundantie aanwezig is bij de

vertering van rundvlees.

Tot slot is er ook na de colondigestie een significant verschil tussen rood vlees en gevogelte bij de metabolieten

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 10. Ook hier ligt de abundantie van de metabolieten steeds het hoogst bij de digestie van

rood vlees.

Afwijkend van deze algemene trends zijn metabolieten 8 en 9. Deze metabolieten vertoonden veel variatie,

waardoor er geen significante verschillen aangetoond konden worden.

Fig. 20: De abundantie van 3-dehydroxycarnitine, voor (T0) en na (T48) colondigestie van rundvlees en

gevogelte. (A) significant verschil voor versus na colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie

van rund en kip, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Er is een significante stijging in abundantie,

na de colondigestie van zowel kip als rund. Ook zijn er significante verschillen tussen de digestie van

rund en kip, zowel voor (P-waarde < 0,05) als na (P-waarde < 0,001) de colondigestie, waarbij rund

steeds in hoogste abundantie voorkomt.

A**B**

A**B*

A**B* A**B**

45

4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine

4.2.1 Inleiding

Voorgaand onderzoek wees aan dat er na colondigestie van rundvlees significant hogere hoeveelheden 3-

dehydroxycarnitine gevormd werden. Dit doet vermoeden dat het aanwezige L-carnitine in rundvlees tijdens

colondigestie een bacterieel katabolisme ondergaat, met de vorming van 3-dehydroxycarnitine.

Om dit te bevestigen werd een experiment opgestart waarbij zowel supplementatie met L-carnitine als

supplementatie met lysine geschiedde. Vervolgens werd per categorie gecontroleerd hoeveel 3-

dehydroxycarnitine gevormd werd.

4.2.2 Targeted metabolomics

Tijdens dit experiment werd de abundantie aan L-carnitine, 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) en een

waarschijnlijk ongekend acylcarnitine (metaboliet 7) vergeleken en dit bij de verschillende categorieën

(supplementatie met carnitine en lysine, zowel 0,5 mg als 5 mg en zowel voor als na colondigestie). Hiervoor

werden de stalen manueel verwerkt met het programma X-calibur. De bekomen abundanties werden ook

ingevoerd in het statistisch programma SAS Enterprise guide 7, waar een ANOVA tabel werd samengesteld.

In deze ANOVA tabel werden alle categoriën met elkaar vergeleken, waarbij er gezocht werd naar significante

verschillen, gekenmerkt door een P-waarde kleiner dan 0,05. Eerst werden de abundanties van L-carnitine in

de stalen nagegaan, vervolgens de abundanties van 3-dehydroxycarnitine en als laatste deze van het

ongekende acylcarnitine (waarschijnlijk metaboliet 7 of methylmalonylcarnitine), deze werd echter in geen van

de stalen aangetroffen.

Na statistische verwerking van de stalen door SAS Enterprise guide 7 werden volgende significante verschillen

aangetroffen (figuur 21):

Fig. 21: De abundantie van L-carnitine, voor en na colondigestie van carnitine en lysine. (A) significant

verschil voor (T0) versus na (T48) colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie van carnitine

en lysine, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Er is een significante hogere abundantie voor

colondigestie, na supplementatie met L-carnitine. Na passage doorheen het colon lijkt alle L-carnitine te

zijn verdwenen, en is er geen significant verschil meer met supplementatie met lysine.

A**B**

A**B**

46

Voor colondigestie was er steeds een hogere abundantie carnitine aanwezig bij supplementatie met carnitine

(5 mg of 0,5 mg), dan bij supplementatie met lysine (5 mg of 0,5 mg) of zonder supplementatie met

aminozuren. De abundantie L-carnitine voor colondigestie is hoger na supplementatie met 5 mg dan na

supplementatie met 0,5 mg carnitine.

Bij supplementatie met carnitine was er bovendien steeds een significante daling van de abundantie L-

carnitine na colondigestie. Na colondigestie kon er geen significant verschil opgemerkt worden tussen

supplementatie met carnitine (5 mg of 0,5 mg) en supplementatie met lysine (5 mg of 0,5 mg) of zonder

supplementatie.

Na statistische verwerking met SAS Enterprise guide 7 kon worden opgemerkt dat er steeds een significante

stijging was van 3-dehydroxycarnitine na colondigestie, bij supplementatie met carnitine. Deze stijging kon niet

worden opgemerkt bij supplementatie met lysine. Ook was er een significant hogere concentratie 3-

dehydroxycarnitine aanwezig na colondigestie van 5 mg carnitine dan 0,5 mg carnitine (figuur 22).

Voor colondigestie kon er geen verschil worden opgemerkt tussen de verschillende categorieën.

4.2.3 Untargeted metabolomics

Met behulp van het statistisch programma SIEVE 2.2 werd geselecteerd naar metabolieten, die verschillend

zijn tussen de digestie van carnitine en lysine. Er werden afzonderlijke analyses uitgevoerd naar de stalen met

positieve ionisatie en deze met negatieve ionisatie, waarbij de intensity threshold telkens 500.000 bedroeg.

De “Human Metabolome Database” werd gebruikt voor de identificatie van de componenten (Wishart et al.,

2013). Om de variabiliteit tussen de chromatogrammen te corrigeren werden deze eerst gealligneerd. Na de

Fig. 22: De abundantie van 3-dehydroxycarnitine, voor (T0) en na (T48) colondigestie van carnitine en

lysine. (A) significant verschil voor versus na colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie van

carnitine en lysine, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Na supplementatie met L-carnitine is er

een significant hogere abundantie van 3-dehydroxycarnitine na colondigestie. Na colondigestie is er ook

een significant verschil op te merken tussen supplementatie met carnitine versus lysine.

A**B**

B** A**

47

analyse werd er een eerste selectie gemaakt naar significante verschillen, op basis van de P-waarde en de

ratio: ‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine < 0,66 OR Ratio_lysine > 1,5) (tabel 15).

Vervolgens werden met

SIMCA 13.0.2 enkele

metabolieten geselecteerd

die specifiek geassocieerd

zijn met de vertering van

carnitine. Deze metabolieten

worden significant minder of

niet teruggevonden bij de

vertering van lysine. Als

eerste werd de clustering

van de stalen nagegaan aan

de hand van een PCA-X

model (figuur 23).

Tabel 15: aantal weerhouden metabolieten voor en na filtering (‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine <

0,66 OR Ratio_lysine > 1,5)), met intensity threshold 500.000.

Ionisatiemodus Voor filtering Na filtering

5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie + 3706 6

5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie - 1304 4

5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie + 3039 20

5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie - 1139 8

5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie + 5194 6

5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie - 1162 5

Vervolgens werd een PLS-DA model opgesteld om een permutatietest uit te voeren als eerste validatie van

het statistisch model, deze test was steeds correct (snijpunt met Y-as van R2 en Q2 moet respectievelijk <0,5

en <0 zijn).

Tenslotte werd ook een OPLS-DA model opgesteld, hierbij werd geselecteerd naar volgende

validiteitsparameters: een R2X-waarde die de waarde 1 zo dicht mogelijk benaderde (in dit geval was de

kleinste R2X-waarde 0,86 en de kleinste R2Y-waarde 0,993) en een Q2-waarde groter dan 0,5 (in dit geval

was de kleinste Q2 waarde 0,969). Wanneer deze waarden gerespecteerd worden kan het model gevalideerd

worden.

Om deze validiteit na te gaan werd ook een CV-ANOVA bepaald, hier werd geselecteerd naar een P-waarde

kleiner dan 0,05, bij elk model werd dit gerespecteerd. Hierna werd een S-plot opgesteld om specifiek de

metabolieten die geassocieerd zijn met de digestie van carnitine te kunnen selecteren (figuur 24). Elke cirkel

in het S-plot stelt een metaboliet voor, waarbij de metabolieten in het onderste linkse kwadrant specifiek

Fig. 23: PCA-X model, met score-plot, hierbij is groep 1 de supplementatie

met lysine en groep 2 de supplementatie met carnitine. Dit model wordt

gebruikt om de aanwezigheid van uitbijters na te gaan. In dit geval zijn

beide categorieën mooi geclusterd.

48

geassocieerd zijn met

de vertering van

carnitine en deze in het

rechter boven kwadrant

met de digestie van

lysine, deze eerste zijn

de metabolieten van

interesse. Om de meest

specifieke metabolieten

te selecteren werd

gebruik gemaakt van

een cut off waarde,

waarbij enkel de

metabolieten met een

VIP-waarde hoger dan

0,8 weerhouden werden

(blauwe cirkels).

Er werd een vergelijking gemaakt tussen de groep met 5 mg carnitine en die van 5 mg lysine, zowel voor als

na colondigestie. Tenslotte werd ook het verschil tussen 5 mg carnitine en 0,5 mg carnitine onderzocht, waarbij

de eerste telkens fungeerde als ratiogroep.

Aan de hand van de theoretische massa, de retentietijd en de 13C/12C relatieve isotoop-ratio van de

weerhouden metabolieten werd in de online “Human Metabolome Database” (Wishart et al., 2013) gezocht

naar mogelijke identificaties.

4.2.3.1 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie

Bij de vergelijking van de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine voor colondigestie, met positieve

ionisatiemodus werden twee componenten weerhouden die specifiek geassocieerd werden met de vertering

van 5 mg carnitine. Deze componenten hadden een VIP-waarde groter dan 0,8.

Deze twee componenten hadden component ID’s 882 en 883, hierbij is component ID 882 een L-carnitine,

component ID 883 is vermoedelijk D-carnitine (tabel 16).

Tabel 16: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie,

positieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

882 1,89 162,11221 1,73 0,95 L-carnitine

883 0,96 162,11204 2,77 2,33 D-carnitine

Bij de stalen met negatieve ionisatiemodus werden opnieuw twee componenten weerhouden, namelijk

component ID 534 en 986, maar deze konden niet geïdentificeerd worden (tabel 17).

Fig. 24: S-plot (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie, positieve

ionisatiemodus) Rechts onderaan worden de waarden weergegeven die

significant geassocieerd zijn met de supplementatie van carnitine. De blauwe

bollen hebben een VIP-waarde groter dan 0,8.

49

Tabel 17: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie,

negatieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

534 1,21 198,07094 0,94 Niet geïdentificeerd

986 1,40 357,05921 0,94 Niet geïdentificeerd

4.2.3.2 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie

In de positieve ionisatiemodus werden vier component ID’s weerhouden, specifiek geassocieerd met de

digestie van carnitine, meer bepaald 529, 543, 680 en 833 (tabel 18, figuur 23 en 24).

Tabel 18: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie,

positieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

529 1,23 131,03383 0,61 1,56 4-5-dioxovaleraan-

zuur (DOVA)

543 0,87 132,06549 0,38 0,99 4-hydroxyproline

680 1,61 146,11741 1,16 1,01 3-dehydroxy-

carnitine

833 0,87 162,11227 1,73 0,95 L-carnitine

Component ID 529 kon mogelijks ook nog geïdentificeerd worden als:

- Itaconaat,

- Glutaconaat,

- 2,5-dioxo-pentanoaat,

- 5-Oxotetrahydrofuraan-2-carboxylaanzuur,

- Citraconaat,

- Trans-glutaconaat,

- (2Z)-4-Methoxy-4-oxo-2-butenoaat,

- Mesaconaat.

De tweede component ID 543 kon mogelijks ook nog geïdentificeerd worden als:

- 5-aminolevulinezuur

- Acetylalaninehydroxide,

- Ethylformylglycine,

- l-Glutamic-gamma-semialdehyde,

- 2-Oxo-5-aminopentanoaat,

- cis-4-Hydroxyproline,

- (3S)-3-Hydroxy-L-proline,

- (3S)-3-Hydroxy-D-proline.

50

De derde component ID 680 is waarschijnlijk ‘4-trimethylammoniobutanoic acid’ of ‘gamma-butyrobetaine’ of

3-dehydroxycarnitine, deze heeft namelijk dezelfde retentietijd als de molecule die in het eerste experiment

geïdentificeerd werd als 3-dehydroxycarnitine. De laatste component ID is 833 en komt overeen met L-

carnitine.

In de negatieve

ionisatiemodus werden

drie component ID’s

weerhouden, geen van

deze kon worden

geïdentificeerd (tabel

19). Bij deze

metabolieten valt op

dat er in het PCA-X

model een uitbijter in

de lysinegroep lijkt te

zijn. Ditzelfde

fenomeen werd ook

gezien bij de negatieve

ionisatie voor

colondigestie (figuur 25).

Tabel 19: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie,

negatieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

438 1,15 278,05664 1,00 Niet geïdentificeerd

589 1,92 216,05591 1,00 Niet geïdentificeerd

899 1,17 332,07543 1,01 Niet geïdentificeerd

3.2.3.3 De vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie

Bij de stalen met positieve ionisatie werden twee component ID’s, geassocieerd met de digestie van 5 mg

carnitine, weerhouden, meer bepaald 710, met retentietijd 1,01 welke gelinkt wordt aan gamma-butyrobetaine

(zie eerder) en 858, met retentietijd 0,95 welke gelinkt wordt aan L-carnitine (tabel 20).

Fig. 25: Score-plot, groep 1 is de supplementatie met lysine, groep 2 de

supplementatie met carnitine. In de groep van lysine lijkt er een uitbijter te zijn.

51

Tabel 20: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na

colondigestie, positieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

710 1,41 146,11742 1,16 1,01 Gamma-

butyrobetaine

858 1,26 162,11227 1,73 0,95 L-carnitine

Uit de stalen met negatieve ionisatie werden drie component ID’s weerhouden, maar deze konden niet

geïdentificeerd worden (tabel 21).

Tabel 21: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na

colondigestie, negatieve ionisatie).

Component

ID

VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm

(Da)

Retentietijd

(min)

Metaboliet volgens

HMDB

450 1,18 278,05664 1,00 Niet geïdentificeerd

605 1,21 216,05591 1,00 Niet geïdentificeerd

916 1,07 332,07544 1,01 Niet geïdentificeerd

52

5. DISCUSSIE

5.1 De vertering van rood vlees versus gevogelte

Van de twee acylcarnitines die in onderzoek van Rombouts et al. (2016) geïdentificeerd werden kon de eerste,

namelijk 3-dehydroxycarnitine, ook steeds worden teruggevonden bij de digestie van rundvlees. Ook lijkt de

concentratie van deze metaboliet steeds toe te nemen na colondigestie. Dit kan worden verklaard door het feit

dat 3-dehydroxycarnitine een intermediaire metaboliet is in het bacteriële katabolisme van L-carnitine (Koeth

et al., 2013). Het tweede acylcarnitine, mogelijks methylmalonylcarnitine (metaboliet 7) wordt vooral gevormd

na de colondigestie van rundvlees, aldus kan er vermoed worden dat deze metaboliet door bacteriële

omzetting in het colon wordt gevormd.

Een mogelijke verklaring voor de individuele verschillen in gevormde metabolieten komt van Dethlefsen et al.

(2006). Zij stellen dat de microbiota voornamelijk bestaat uit Firmicutes en Bacteroides, maar dat binnenin

deze twee predominante phyla er nog verschillende stammen bestaan en dat dit leidt tot het ontstaan van een

darmflora die even uniek is als een vingerafdruk. Zij stellen dat er verschillende factoren zijn die een invloed

hebben op de samenstelling van de microbiota, waaronder voeding, gastheer genotype en interacties tussen

de microbiota (Oostindjer et al., 2014).

De darmmicrobiota kan gewijzigd worden door aanpassingen aan de levensstijl, waarbij vooral het dieet een

cruciale rol speelt. Eetgewoontes bepalen namelijk welke voedingsstoffen er beschikbaar komen voor de

darmflora. Het genoom en het epigenoom van een bacterie bepalen zijn metabole activiteit en zo ook welke

voedingsstoffen deze het best kan verwerken. Zo zijn saccharolytische bacteriën in staat carbohydraten te

metaboliseren. In deze groep zitten volgende bacteriën: Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus,

Eubacterium, Propionibacterium, Escherichia, Enterococcus, Peptostreptococcus, Fusobacteria, en anderen.

De proteolytische bacteriën halen hun energie dan weer uit de fermentatie van proteïnen. Hieronder vallen:

Streptococcus, Staphylococcus, Proteus, Escherichia, en sommige soorten van Clostridium, Fusobacteria,

Bacillus, Propionibacterium, en anderen.

Er zijn drie enterotypes beschreven, met predominantie van Bacteroides, Prevotella of Ruminococcus. Het

enterotype Bacteroides komt meest voor bij mensen met een Westers dieet, namelijk een voedingspatroon

rijk in vet en proteïnen. Het Prevotella enterotype komt veel voor bij mensen met een dieet rijk aan vezels

(Kashtanova et al., 2015). Deze genera impliceren dat de enterotypes op verschillende manieren hun energie

generen uit voedingsstoffen die het colon bereiken. Deze fylogenetische verschillen leiden tot functionele

verschillen tussen de enterotypes (Arumugam et al., 2011).

5.2 De vertering van carnitine versus lysine

5.2.1 Targeted metabolomics

5.2.1.1 L-carnitine

Bij de targeted metabolomics aanpak van dit experiment (tabel 13) kan worden opgemerkt dat L- carnitine

steeds in de hoogste concentratie aanwezig is voor colondigestie. Na colondigestie is er steeds significant

minder L-carnitine aanwezig. De hoogste waarden kunnen worden gezien voor de colondigestie van 5 mg L-

carnitine en iets minder hoge waarden voor de colondigestie van 0,5 mg L-carnitine. Deze resultaten

suggereren een afbraak van L-carnitine gedurende de colondigestie. Bovendien is er na colondigestie geen

53

verschil meer op te merken tussen de verschillende categorieën, dit wijst op een significant hogere afbraak

van L-carnitine tijdens de colondigestie.

Ook in de groepen zonder supplementatie met L-carnitine, zowel de groep met supplementatie van lysine als

de controlegroep, is er steeds L-carnitine aanwezig en ook hier treedt er een daling van de concentratie op na

colondigestie. De aanwezigheid van L-carnitine in deze groepen kan worden verklaard worden door de

aanwezigheid in vetweefsel, wat aan elke recipiënt werd toegevoegd. Dit toont aan dat er voor het bereiken

van het colon geen verschil is tussen de metabolisatie van carnitine versus die van lysine. De afbraak van

carnitine in het colon werd reeds aangetoond door Steiber et al. (2004) en Koeth et al. (2013).

L-carnitine kan zowel endogeen gevormd worden als uit de voeding opgenomen worden. Onder normale

omstandigheden wordt de totale hoeveelheid L-carnitine uit de voeding opgenomen ter hoogte van de dunne

darm. L-carnitine is in vrij hoge concentraties aanwezig in vrijwel elke vleessoort, verwerkt vlees is hiermee

vergeleken veel armer aan carnitine (Demarquoy et al., 2004).

L-carnitine is een antioxidant en kan aldus het lichaam beschermen tegen vrije radicalen en reactieve

zuurstofmoleculen. Deze schadelijke moleculen worden tijdens normale fysiologische processen continu

gevormd en kunnen bij overmaat gelinkt worden aan een risico op CRC (Gulcin, 2006; Jegasothy et al., 2014).

Carnitine is essentieel in de mitochondriale β-oxidatie, waar het instaat voor het transport van geactiveerde

vetzuren doorheen de mitochondriale membraan (Demarquoy et al., 2004). Door bacterieel katabolisme kan

er in het colon echter wel een omzetting gebeuren naar 3-dehydroxycarnitine. Deze molecule werd in de

literatuur reeds geassocieerd met verscheidene aandoeningen, zoals atherosclerose (Koeth et al., 2013).

5.1.2.2 3-Dehydroxycarnitine

De abundantie aan 3-dehydroxycarnitine neemt telkens significant toe na colondigestie (tabel 14). Dit

suggereert een vorming tijdens de passage doorheen het colon. De toename is vooral duidelijk na

supplementatie van carnitine (zowel bij toediening van 5 mg, als in mindere mate na toediening van 0,5 mg)

en in veel mindere mate na supplementatie van lysine. Dit doet vermoeden dat er tijdens de colondigestie een

omzetting is van L-carnitine naar 3-dehydroxycarnitine.

3-Dehydroxycarnitine is een intermediaire molecule in de intestinale bacteriële degradatie van L-carnitine naar

trimethylamine (Steiber et al., 2004). Deze afbraak is aanwezig bij alle proefpersonen en afhankelijk van de

aanwezige microbiota in het colon. Sommige enterotypes kunnen deze L-carnitine beter afbreken dan andere

enterotypes (Koeth et al., 2013).

5.1.2.3 Ongekend acylcarnitine

Het waarschijnlijk ongekende acylcarnitine werd in geen enkele van de stalen aangetroffen. Er wordt vermoed

dat deze molecule een acylcarnitine is, aangezien er in eerder onderzoek van Rombouts et al. (2016) een

fragment 85.280 werd teruggevonden, typisch voor de acylcarnitinegroep, waarbij fragmentatie gekenmerkt

wordt door een gemeenschappelijk ion bij acylcarnitines met een m/z [85]+ (Costa et al., 1997). De urinaire

concentratie aan acylcarnitines is gelinkt met de consumptie van rood vlees. Zo is de concentratie in de urine

veel hoger bij mensen die een dieet rijk aan rood vlees nuttigen (O'Sullivan et al., 2011).

54

5.2.2 Untargeted metabolomics

5.2.2.1 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie

Bij de untargeted metabolomics van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine werden er voor de colondigestie bij

positieve ionisatiemodus 2 component ID’s gevonden, geassocieerd met de vertering van carnitine, namelijk

882 en 883 (tabel 16). In de Human Metabolome Database wordt Component ID 882 aangeduid als L-carnitine.

Deze bevinding sluit aan bij de resultaten van de targeted metabolomics, aangezien ook hier een hogere

concentratie L-carnitine kon gevonden worden voor de colondigestie, bij de groep met de hoogste

supplementatie. Aangezien de moleculaire massa van component ID 883 exact gelijk is aan deze van

component 882, is deze vermoedelijk een isomeer van L-carnitine, namelijk D-carnitine. De aangekochte

standaard L-carnitine (Sigma-Aldrich; St. Louis, Missouri, USA; C0158-1G) had een zuiverheid van > 98%,

het is dus mogelijk dat er ook een kleine hoeveelheid D-carnitine aanwezig was in dit mengsel. Om dit na te

gaan werd ook de standaard geanalyseerd, waaruit bleek dat hier een kleinere hoeveelheid molecule

aanwezig was met dezelfde massa, maar verschillende retentietijd. Deze retentietijd kwam overeen met de

geobserveerde waarde bij het experiment van de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor

colondigestie.

Bij negatieve ionisatiemodus werden opnieuw 2 component ID’s weerhouden, deze zijn geassocieerd met

carnitine maar konden beide niet worden geïdentificeerd door de Human Metabolome Database (tabel 17).

5.2.2.2 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie

Vervolgens werd gekeken naar de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na de colondigestie.

Onder de positieve ionisatiemodus werden hier 4 metabolieten gevonden, geassocieerd met carnitine, met

volgende component ID’s: 529, 543, 680 en 833 (tabel 18).

De metaboliet met component ID 529 komt op basis van de literatuur vermoedelijk overeen met 4-5-

dioxovaleraanzuur (DOVA), dit is het finale oxidatieproduct van 5-aminolevulinezuur, een precursor van

porfyrine in de biosynthese van haem (Kikuchi et al., 1958; Wishart et al., 2013). De aanwezigheid van deze

component ID kan op een degradatie van het aanwezige haem wijzen tijdens colondigestie. Aangezien deze

intermediairen van de haemsynthese significant minder voorkomen bij de controlegroep (supplementatie

lysine), kan er vermoed worden dat er een interactie plaatsvindt tussen carnitine en de haemmolecule.

Component 543 is vermoedelijk 4-hydroxyproline is. 4-hydroxyproline is een belangrijke component van

collageen, en bevindt zich voornamelijk in spierweefsel (Ogle et al., 1962; Lepetit, 2008). Een studie van Ross

et al. (2015) toonde aan dat 4-hydroxyproline een mogelijke biomerker is voor de digestie van rundvlees.

Hierbij was er een gelijke concentratie van vrij 4-hydroxyproline aanwezig in zowel haring als rood vlees, maar

na digestie bleek de hoeveelheid 4-hydroxyproline veel hoger te liggen in het plasma na de vertering van

rundvlees. Dit doet vermoeden dat er meer factoren een rol spelen dan alleen de hoeveelheid collageen in de

spieren. Een mogelijkheid bestaat dat L-carnitine een rol speelt in de vorming van 4-hydroxyproline. Zo

toonden Akkus et al. (2009) aan dat de toediening van carnitine aan wonden zorgt voor een toegenomen

aanwezigheid van hydroxyproline.

De derde component ID 680 is vermoedelijk ‘4-trimethylammoniobutanoic acid’ of ‘gamma-butyrobetaine’ of

3-dehydroxycarnitine. Deze molecule is een bouwsteen van carnitine. Deze observatie komt overeen met de

resultaten van de ‘targeted metabolomics’, waar ook een toename gezien werd in concentratie 3-

dehydroxycarnitine. Deze toename was het hoogst bij hoge supplementatie carnitine, wat opnieuw doet

55

vermoeden dat er ter hoogte van het colon een degradatie is van L-carnitine naar zijn bouwstenen, waaronder

3-dehydroxycarnitine. De laatste component ID is 833 en kon nog niet geïdentificeerd worden.

Bij de negatieve ionisatiemodus kon geen enkele component ID geïdentificeerd worden (tabel 19). Hier werd

bij de score-plot (net als bij de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie, maar ook

bij negatieve ionisatie) een mooie clustering gezien van de carnitine-groep. Bij de lysine-groep lijkt er echter

een uitbijter aanwezig te zijn, deze mag toch worden opgenomen in de statistische verwerking aangezien het

model kon gevalideerd worden (figuur 25).

5.2.2.3 De vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie

Bij de vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie, werden er bij de positieve ionisatie

twee component ID’s weerhouden, deze konden geassocieerd worden met 5 mg carnitine. Deze component

ID’s zijn 710 en 858.

Component ID 710 komt overeen met gamma-butyrobetaine, of meer bepaald 3-dehydroxycarnitine. Deze

molecule werd ook geassocieerd met supplementatie met carnitine, na colondigestie. Het is dan ook logisch

dat deze significant meer aanwezig is bij hogere supplementatie met carnitine. De tweede component ID is

858 en kon nog niet geïdentificeerd worden. Bij de negatieve ionisatiemodus kon er geen enkele component

geïdentificeerd worden.

Zoals reeds eerder aangehaald is het onmogelijk met zekerheid te bepalen welke metabolieten teruggevonden

zijn, louter op basis van het gebruik van de Human Metabolome Database.

5.2.2.4 Verder onderzoek

Om met zekerheid te kunnen beslissen welke metabolieten werden teruggevonden, kan er bij reeds

gekarakteriseerde moleculen gebruik gemaakt worden van een standaard, die kan aangekocht worden. Hierbij

is het belangrijk dat er minimum twee onafhankelijke en orthogonale data, die eigen zijn aan deze authentieke

component worden mee geanalyseerd, onder identieke experimentele omstandigheden als de stalen. Het

gebruik van waarden, vermeld voor deze authentieke stalen, uit de literatuur wordt als onvoldoende

beschouwd om een betrouwbare identificatie toe te laten.

Dankzij de accurate massameting van HRMS, kunnen de authentieke spectra gebruikt worden, waarmee

spectrale matching kan worden gedaan, hiervoor moeten deze spectra wel beschikbaar zijn in databases

(Sumner et al., 2007; Brown et al., 2009; Roux et al., 2012).

5.2.3 Het effect van carnitine op het risico op CRC

Uit de literatuur is gebleken dat er effectief een afbraak is van carnitine tijdens de colondigestie. L-carnitine

heeft een trimethylamine (TMA) structuur en wordt tijdens colondigestie dan ook omgezet naar trimethylamine-

derivaat, vermoedelijk 3-dehydroxycarnitine (4-trimethylammoniobutanoic acid) (Steiber et al., 2004). TMA

wordt opgenomen in het bloed en naar de lever getransporteerd, hier bevinden zich de hepatische flavine

monooxygenasen, die TMA zullen omvormen naar trimethylamine-N-oxide (TMAO). Dit is een proatherogene

molecule en bovendien geassocieerd met cardiovasculair risico. De afbraak van L-carnitine door de darmflora

werd aangetoond door Koeth et al. (2013), waarbij de darmmicrobiota een essentiële rol bleek te spelen. Bij

dit onderzoek werd aan proefpersonen gedurende één week breed spectrum antibiotica toegediend, om de

intestinale microbiota te onderdrukken. Na supplementatie met L-carnitine bleek er een complete

56

onderdrukking te zijn van de vorming van TMAO. Zonder toediening van antibiotica bleek de omvorming van

L-carnitine naar TMA en TMAO ongestoord door te gaan. Dit toont aan dat de productie van TMAO vanuit L-

carnitine afhankelijk is van de intestinale microbiota.

De verschillende bacteriële taxa beïnvloeden plasma TMAO concentraties, zo is het Prevotella enterotype

geassocieerd met een hogere TMAO concentratie dan Bacteroides enterotypes. Dit impliceert dat bestaande

eetgewoontes zowel de intestinale microbiële samenstelling als de mogelijkheid tot productie van TMA en

TMAO vanuit L-carnitine moduleren. Zo kan bovendien een langdurige supplementatie met L-carnitine een

verschuiving aan bacteriële taxa veroorzaken, met soorten die beter geschikt zijn voor de TMA-productie uit

L-carnitine (Koeth et al., 2013). Veranderingen in de metabolisatie van deze trimethylamine-structuren kunnen

voorkomen in het begin van de ziekteontwikkeling, dit kan geassocieerd zijn met een hoger risico op CRC. Er

is een positieve associatie tussen plasma TMAO en CRC aangetoond, dit is consistent met een betrokkenheid

van het darmmicrobioom in de pathogenese van CRC (Bae et al., 2014). Een studie van Vanden Bussche et

al. (2014) toonde aan dat er veel interindividuele variatie bestaat in de vorming van DNA-adducten. Dit leidt

tot een grote variatie in de gevoeligheid van een persoon tot het ontwikkelen van CRC, na het eten van haem-

rijke voeding, zoals rood vlees.

57

7. BIBLIOGRAFIE

-Ajouz H., et al. (2014). "Secondary bile acids: an underrecognized cause of colon cancer." World Journal of

Surgical Oncology 12(164).

-Akkus A., et al. (2009). "Effect of carnitine on cutaneous wound healing in immunosuppressed rats." J Surg

Res 155(2): 301-305.

-Al-Sohaily S., et al. (2012). "Molecular pathways in colorectal cancer." J Gastroenterol Hepatol 27(9): 1423-

1431.

-Alaejos M. S. and A. M. Afonso (2011). "Factors That Affect the Content of Heterocyclic Aromatic Amines in

Foods." Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 10(2): 52-108.

-Alexander D. D., et al. (2009). "Meta-analysis of animal fat or animal protein intake and colorectal cancer."

Am J Clin Nutr 89(5): 1402-1409.

-Arumugam M., et al. (2011). "Enterotypes of the human gut microbiome." Nature 473(7346): 174-180.

-Aune D., et al. (2013). "Red and processed meat intake and risk of colorectal adenomas: a systematic review

and meta-analysis of epidemiological studies." Cancer Causes Control 24(4): 611-627.

-Bae S., et al. (2014). "Plasma choline metabolites and colorectal cancer risk in the Women's Health Initiative

Observational Study." Cancer Res 74(24): 7442-7452.

-Baena R. and P. Salinas (2015). "Diet and colorectal cancer." Maturitas 80(3): 258-264.

-Baradat M., et al. (2011). "4-Hydroxy-2(E)-nonenal metabolism differs in Apc(+/+) cells and in Apc(Min/+)

cells: it may explain colon cancer promotion by heme iron." Chem Res Toxicol 24(11): 1984-1993.

-Barrasa J. I., et al. (2013). "Bile acids in the colon, from healthy to cytotoxic molecules." Toxicol In Vitro 27(2):

964-977.

-Bartsch H. and J. Nair (2004). "Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in inflammation

driven carcinogenesis." Cancer Detect Prev 28(6): 385-391.

-Bastide N. M., et al. (2015). "A central role for heme iron in colon carcinogenesis associated with red meat

intake." Cancer Res 75(5): 870-879.

-Bastide N. M., et al. (2011). "Heme iron from meat and risk of colorectal cancer: a meta-analysis and a review

of the mechanisms involved." Cancer Prevention Research: 1-16.

-Belkaid Y. and T. W. Hand (2014). "Role of the microbiota in immunity and inflammation." Cell 157(1): 121-

141.

-Bertinato J., et al. (2016). "l-Lysine supplementation does not affect the bioavailability of copper or iron in

rats." J Trace Elem Med Biol.

-Boland C. R. and A. Goel (2010). "Microsatellite instability in colorectal cancer." Gastroenterology 138(6):

2073-2087 e2073.

-Botteri E., et al. (2008). "Smoking and Colorectal Cancer: a meta-analysis." American Medical Association

300(23): 2765-2778.

-Boyle P., et al. (2008). "Diet, nutrition and cancer: public, media and scientific confusion." Ann Oncol 19(10):

1665-1667.

-Brown M., et al. (2009). "Mass spectrometry tools and metabolite-specific databases for molecular

identification in metabolomics." Analyst 134(7): 1322-1332.

-Butler L. M. (2003). "Heterocyclic Amines, Meat Intake, and Association with Colon Cancer in a Population-

based Study." American Journal of Epidemiology 157(5): 434-445.

58

-Byres E., et al. (2008). "Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial

toxin." Nature 456(7222): 648-652.

-Cabrera-Mendoza F., et al. (2014). "Clinical relevance of the K-ras oncogene in colorectal cancer: Experience

in a Mexican population." Revista de Gastroenterología de México (English Edition) 79(3): 166-170.

-Chao A., et al. (2005). "Meat consumption and risk of colorectal cancer." American Medical Association

293(2): 172-183.

-Cirillo T., et al. (2010). "Assessment of the dietary habits and polycyclic aromatic hydrocarbon exposure in

primary school children." Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 27(7): 1025-1039.

-Corpet D. E. (2011). "Red meat and colon cancer: should we become vegetarians, or can we make meat

safer?" Meat Sci 89(3): 310-316.

-Corpet D. E., et al. (1995). "Colonic Protein Fermentation and Promotion of Colon Carcinogenesis by

Thermolyzed Casein." Nutrition and Cancer 23(3): 271-281.

-Costa C., et al. (1997). "Quantitative analysis of plasma acylcarnitines using gas chromatography chemical

ionization mass fragmentography." Journal of Lipid Research 38: 173-182.

-Cross A. J. and R. Sinha (2004). "Meat-related mutagens/carcinogens in the etiology of colorectal cancer."

Environ Mol Mutagen 44(1): 44-55.

-Daniel C. R., et al. (2011). "Prospective investigation of poultry and fish intake in relation to cancer risk."

Cancer Prev Res (Phila) 4(11): 1903-1911.

-De Kok T. M. and J. van Maanen (2000). "Evaluation of fecal mutagenicity and colorectal cancer risk."

Mutation Research 463: 53-101.

-Degirolamo C., et al. (2011). "Bile acids and colon cancer: Solving the puzzle with nuclear receptors." Trends

Mol Med 17(10): 564-572.

-Demarquoy J., et al. (2004). "Radioisotopic determination of l-carnitine content in foods commonly eaten in

Western countries." Food Chemistry 86(1): 137-142.

-Demeyer D., et al. (2015). "Mechanisms Linking Colorectal Cancer to the Consumption of (Processed) Red

Meat: A Review." Crit Rev Food Sci Nutr: 0.

-Dethlefsen L., et al. (2006). "Assembly of the human intestinal microbiota." Trends Ecol Evol 21(9): 517-523.

-Dunn W. B., et al. (2005). "Measuring the metabolome: current analytical technologies." Analyst 130(5): 606-

625.

-Ellis D. I., et al. (2007). "Metabolic fingerprinting as a diagnostic tool." Pharmacogenomics 8(9): 1243-1268.

-Engemann A., et al. (2013). "Intestinal formation of N-nitroso compounds in the pig cecum model." J Agric

Food Chem 61(4): 998-1005.

-Fearon E. and B. Vogelstein (1990). "A Genetic Model for Colorectal Tumorigenesis." Cell 61: 759-767.

-Ferrari P., et al. (2007). "Lifetime and baseline alcohol intake and risk of colon and rectal cancers in the

European prospective investigation into cancer and nutrition (EPIC)." Int J Cancer 121(9): 2065-2072.

-Fiehn O. (2002). "Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes." Plant Molecular Biology 48:

155-171.

-Gika H. G., et al. (2014). "LC-MS-based holistic metabolic profiling. Problems, limitations, advantages, and

future perspectives." J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 966: 1-6.

-Giovannucci E. and B. Goldin (1997). "The role of fat, fatty acids, and total energy intake in the etiology of

human colon cancer." Am J Clin Nutr 66: 1564S-1571S.

59

-Grivennikov S. I. (2013). "Inflammation and colorectal cancer: colitis-associated neoplasia." Semin

Immunopathol 35(2): 229-244.

-Guerra A., et al. (2012). "Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion."

Trends Biotechnol 30(11): 591-600.

-Gulcin I. (2006). "Antioxidant and antiradical activities of L-carnitine." Life Sci 78(8): 803-811.

-Gunter M. J., et al. (2005). "Meat intake, cooking-related mutagens and risk of colorectal adenoma in a

sigmoidoscopy-based case-control study." Carcinogenesis 26(3): 637-642.

-Hedlund M., et al. (2008). "Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated

inflammation in carcinoma progression." Proc Natl Acad Sci U S A 105(48): 18936-18941.

-Helmus D. S., et al. (2013). "Red meat-derived heterocyclic amines increase risk of colon cancer: a

population-based case-control study." Nutr Cancer 65(8): 1141-1150.

-Hogg N. (2007). "Red meat and colon cancer: heme proteins and nitrite in the gut. A commentary on "diet-

induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract"." Free Radic Biol Med 43(7): 1037-1039.

-Hounoum B. M., et al. (2016). "Liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry-based cell

metabolomics: Experimental design, recommendations, and applications." TrAC Trends in Analytical

Chemistry 75: 118-128.

-Hughes R., et al. (2000). "Protein degradation in the large intestine: relevance to colorectal cancer." Curr.

Issues Intest. Microbiol. 1(2): 51-58.

-Hur S. J., et al. (2011). "In vitro human digestion models for food applications." Food Chemistry 125(1): 1-12.

-IARC (2015). "IARC Monographs evaluate consumption of red meat and processed meat."

-Ijssennagger N., et al. (2015). "Gut Microbiota Facilitates Dietary Heme-induced epithelial Hyperproliferation

by Opening the Mucus Barrier in Colon." PNAS 112(32): 10038-10043.

-Ijssennagger N., et al. (2012). "Dietary heme alters microbiota and mucosa of mouse colon without functional

changes in host-microbe cross-talk." PLoS One 7(12): e49868.

-Jagerstad M. and K. Skog (2005). "Genotoxicity of heat-processed foods." Mutat Res 574(1-2): 156-172.

-Jakszyn P., et al. (2004). "Development of a Food Database of Nitrosamines, Heterocyclic Amines, and

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons." J Nutr 134: 2011-2014.

-Jegasothy H., et al. (2014). "In vitro heme and non-heme iron capture from hemoglobin, myoglobin and ferritin

by bovine lactoferrin and implications for suppression of reactive oxygen species in vivo." Biometals 27(6):

1371-1382.

-Johnson C. M., et al. (2013). "Meta-analyses of colorectal cancer risk factors." Cancer Causes Control 24(6):

1207-1222.

-Junot C., et al. (2014). "High resolution mass spectrometry based techniques at the crossroads of metabolic

pathways." Mass Spectrom Rev 33(6): 471-500.

-Kamangar F., et al. (2006). "Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents:

defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world." J Clin Oncol 24(14):

2137-2150.

-Kashtanova D. A., et al. (2015). "Association between the gut microbiota and diet: Fetal life, early childhood,

and further life." Nutrition.

-Kassie F., et al. (2004). "Effect of intestinal microfloras from vegetarians and meat eaters on the genotoxicity

of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline, a carcinogenic heterocyclic amine." J Chromatogr B Analyt

Technol Biomed Life Sci 802(1): 211-215.

60

-Kikuchi G., et al. (1958). "The enzymatic synthesis of gamma-aminolevulinic acid." J Biol Chem 233: 1214-

1219.

-Kim E., et al. (2013). "Review of the association between meat consumption and risk of colorectal cancer."

Nutr Res 33(12): 983-994.

-Kim S., et al. (2015). "Food metabolomics: from farm to human." Curr Opin Biotechnol 37: 16-23.

-Kinzler K. and B. Vogelstein (1996). "Lessons from hereditary colorectal cancer." Cell 87: 159-170.

-Koeth R. A., et al. (2013). "Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes

atherosclerosis." Nat Med 19(5): 576-585.

-Kuhnle G. G. and S. Bingham (2007). "Dietary meat, endogenous nitrosation and colorectal cancer."

Biochemical society transactions 35(5): 1355-1357.

-Kuhnle G. G., et al. (2007). "Diet-induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract." Free

Radic Biol Med 43(7): 1040-1047.

-Larsson S. C., et al. (2005). "Whole grain consumption and risk of colorectal cancer: a population-based

cohort of 60,000 women." Br J Cancer 92(9): 1803-1807.

-Le Marchand L., et al. (2002). "Red Meat Intake, CYP2E1 Genetic Polymorphisms, and Colorectal Cancer

Risk." Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 11: 1019-1024.

-Lee W.-C. and K. H. Lee (2004). "Applications of affinity chromatography in proteomics." Analytical

Biochemistry 324(1): 1-10.

-Lepetit J. (2008). "Collagen contribution to meat toughness: Theoretical aspects." Meat Sci 80(4): 960-967.

-Lewin M. H., et al. (2006). "Red meat enhances the colonic formation of the DNA adduct O6-carboxymethyl

guanine: implications for colorectal cancer risk." Cancer Res 66(3): 1859-1865.

-Lipkin M. (1974). "Phase 1 and phase 2 proliferative lesions of colonoc epithelial cells in diseases leading to

colonic cancer." Cancer(34): 878-888.

-Lombardi-Boccia G., et al. (2002). "Total Heme and Non-heme Iron in Raw and Cooked Meats." Food

Chemistry and Toxicology 67(5): 1-4.

-Maier B., et al. (1974). "Effects of a high-beef diet on bowel flora: a preliminary report." Am J Clin Nutr 27:

1470-1474.

-Markowitz S., et al. (1995). "Inactivation of the Type II TGF-β Receptor in Colon Cancer Cells with

Microsatellite Instability." Science 268(5215): 1336-1338.

-Marnett L. (2000). "Oxyradicals and DNA damage." Carcinogenesis 21(3): 361-370.

-Massey R., et al. (1988). "An investigation of the endogenous formation of apparent total N-nitroso

compounds in conventional microflora and germ-free rats." Fd Chem. Toxic. 26(7): 595-600.

-McNiven E. M., et al. (2011). "Analytical metabolomics: nutritional opportunities for personalized health." J

Nutr Biochem 22(11): 995-1002.

-Minekus M., et al. (2014). "A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international

consensus." Food Funct 5(6): 1113-1124.

-Nguyen T. T. P., et al. (2015). "A comprehensive review on in vitro digestion of infant formula." Food Research

International 76: 373-386.

-Nixon C., et al. (1986). "Nuclear magnetic resonance." Anaesthesia 41: 131-137.

-Novakova L. and H. Vlckova (2009). "A review of current trends and advances in modern bio-analytical

methods: chromatography and sample preparation." Anal Chim Acta 656(1-2): 8-35.

-O'Hara A. M. and F. Shanahan (2006). "The gut flora as a forgotten organ." EMBO Rep 7(7): 688-693.

61

-O'Sullivan A., et al. (2011). "Dietary intake patterns are reflected in metabolomic profiles: potential role in

dietary assessment studies." Am J Clin Nutr 93(2): 314-321.

-Ogle J., et al. (1962). "3-Hydroxyproline, a new amino acid of collagen." The Journal of Biological Chemistry

237(12): 3667-3673.

-Ojanpera I., et al. (2012). "Current use of high-resolution mass spectrometry in drug screening relevant to

clinical and forensic toxicology and doping control." Anal Bioanal Chem 403(5): 1203-1220.

-Oostindjer M., et al. (2014). "The role of red and processed meat in colorectal cancer development: a

perspective." Meat Sci 97(4): 583-596.

-Pan A., et al. (2012). "Red meat consumption and mortality: results from 2 prospective cohort studies." Arch

Intern Med 172(7): 555-563.

-Paskett E. D., et al. (2007). "Association between cigarette smoking and colorectal cancer in the Women's

Health Initiative." J Natl Cancer Inst 99(22): 1729-1735.

-Patel P. and P. De (2016). "Trends in colorectal cancer incidence and related lifestyle risk factors in 15-49-

year-olds in Canada, 1969-2010." Cancer Epidemiol 42: 90-100.

-Payne A. N., et al. (2012). "Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling." Trends

Biotechnol 30(1): 17-25.

-Payne C., et al. (2008). "Hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon

carcinogenesis." Clinical and Experimental Gastroenterology 19(47): 19-47.

-Pignatelli B., et al. (1993). "Mutagens, N-nitroso compounds and their precursors in gastric juice from patients

with and without prrecancerous lesions of the stomach." European Journal of Cancer 29A(14): 2031-2039.

-Qiao Y., et al. (2013). "Alterations of the gut microbiota in high-fat diet mice is strongly linked to oxidative

stress." Appl Microbiol Biotechnol 97(4): 1689-1697.

-Rainville P. D., et al. (2014). "Advances in liquid chromatography coupled to mass spectrometry for metabolic

phenotyping." TrAC Trends in Analytical Chemistry 61: 181-191.

-Rombouts C., et al. (2016). High-resolution mass spectrometry based metabolomics reveals acylcarnitines

as key metabolites discriminating red from white meat colonic digestion. 61st International Congress of Meat

Science and Technology. Clermont-Ferrand, France.

-Römpp A. and B. Spengler (2013). "Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space."

Histochem Cell Biol 139(6): 759-783.

-Ross A. B., et al. (2015). "Herring and Beef Meals Lead to Differences in Plasma 2-Aminoadipic Acid, beta-

Alanine, 4-Hydroxyproline, Cetoleic Acid, and Docosahexaenoic Acid Concentrations in Overweight Men." J

Nutr 145(11): 2456-2463.

-Roux A., et al. (2012). "Annotation of the human adult urinary metabolome and metabolite identification using

ultra high performance liquid chromatography coupled to a linear quadrupole ion trap-Orbitrap mass

spectrometer." Anal Chem 84(15): 6429-6437.

-Rutherfurd S. M. and P. J. Moughan (2007). "Development of a novel bioassay for determining the available

lysine contents of foods and feedstuffs." Nutr Res Rev 20(1): 3-16.

-Saffhill R., et al. (1985). "Mechanisms of carcinogenesis induced by alkylating agents." Biochimica et

Biophysica Acta 823: 111-145.

-Scalbert A., et al. (2014). "The food metabolome: a window over dietary exposure." Am J Clin Nutr 99(6):

1286-1308.

62

-Schwab C., et al. (2000). "Search for Compounds That Inhibit the Genotoxic and Carcinogenic Effects of

Heterocyclic Aromatic Amines." Critical Reviews in Toxicology 30(1): 1-69.

-Seline K. and H. Johein (2007). "The determination of l-carnitine in several food samples." Food Chemistry

105(2): 793-804.

-Seo T., et al. (1994). "A generalized Tukey conjecture for multiple comparisons among mean vectors." Journal

of the American Statistical Association 89(426): 676-679.

-Sesink A., et al. (1999). "Red Meat and Colon Cancer: The Cytotoxic and Hyperproliferative Effects of Dietary

Heme." Cancer Research 59: 5704-5709.

-Sesink A., et al. (2001). "Red meat and colon cancer: dietary haem-induced colonic cytotoxicity and epithelial

hyperproliferation are inhibited by calcium." Carcinogenesis 22(10): 1653-1659.

-Sherry (1984). Gadolinium chelates as NMR contrast agents, The Board of Regents, The University of Texas

System. 4639365.

-Smolinska A., et al. (2012). "NMR and pattern recognition methods in metabolomics: from data acquisition to

biomarker discovery: a review." Anal Chim Acta 750: 82-97.

-Sobhani I., et al. (2011). "Microbial dysbiosis in colorectal cancer (CRC) patients." PLoS One 6(1): e16393.

-Spiegelhalder B., et al. (1976). "Influence of dietary nitrate on nitrite content of human saliva: possible

relevance to in vivo formation of N-nitroso compounds." Fd. Cosmet Toxicol 14: 545-548.

-Stavric B. (1994). "Biological significance of trace levels of mutagenic heterocyclic aromatic amines in human

diet: a critical review." Food Chemistry Toxicology 32(10): 977-994.

-Steiber A., et al. (2004). "Carnitine: a nutritional, biosynthetic, and functional perspective." Mol Aspects Med

25(5-6): 455-473.

-Sumner L. W., et al. (2007). "Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis

Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI)." Metabolomics 3(3): 211-221.

-Tomé D. and C. Bos (2007). "Lysine requirement through the human life cycle." The journal of nutrition 137:

1642S-1645S.

-Tricker A. (1997). "N-nitroso compounds and man: sources of exposure, endogenous formation and

occurrence in body fluids." European Journal of Cancer Preventio 6: 226-268.

-Tricker A. and R. Preussmann (1991). "Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurence, formation,

mechanismsand carcinogenic potential." Mutation Research 259: 277-289.

-Uronis J. M., et al. (2009). "Modulation of the intestinal microbiota alters colitis-associated colorectal cancer

susceptibility." PLoS One 4(6): e6026.

-Van de Wiele T., et al. (2015). "The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME®)." 305-

317.

-Van den Abbeele P., et al. (2013). "Different human gut models reveal the distinct fermentation patterns of

Arabinoxylan versus inulin." J Agric Food Chem 61(41): 9819-9827.

-van den Brandt P. A. and R. A. Goldbohm (2006). "Nutrition in the prevention of gastrointestinal cancer." Best

Pract Res Clin Gastroenterol 20(3): 589-603.

-Vanden Bussche J., et al. (2014). "O(6)-carboxymethylguanine DNA adduct formation and lipid peroxidation

upon in vitro gastrointestinal digestion of haem-rich meat." Mol Nutr Food Res 58(9): 1883-1896.

-Vanden Bussche J., et al. (2015). "Validated High Resolution Mass Spectrometry-Based Approach for

Metabolomic Fingerprinting of the Human Gut Phenotype." Anal Chem 87(21): 10927-10934.

63

-Vanhaecke L., et al. (2008). "The microbial PhIP metabolite 7-hydroxy-5-methyl-3-phenyl-6,7,8,9-

tetrahydropyrido[3',2':4,5]imidazo[1,2-a]pyri midin-5-ium chloride (PhIP-M1) induces DNA damage, apoptosis

and cell cycle arrest towards Caco-2 cells." Toxicol Lett 178(1): 61-69.

-Vogelstein B. and K. Kinzler (1993). "The mutlistep nature of cancer." Reviews 9(4): 138-141.

-Vogelstein B. and K. W. Kinzler (2004). "Cancer genes and the pathways they control." Nat Med 10(8): 789-

799.

-WCRF (2011). "Continuous Update Project Report. Food, Nutrition, Physical Activity, and the Prevention of

Colorectal Cancer."

-WCRF (2012). "World Cancer Research Fund International."

-Weckwerth W. and K. Morgenthal (2005). "Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation."

Drug Discovery Today 10(22): 1551-1558.

-Wei E. K., et al. (2009). "Cumulative risk of colon cancer up to age 70 years by risk factor status using data

from the Nurses' Health Study." Am J Epidemiol 170(7): 863-872.

-Werner T., et al. (2010). "Depletion of luminal iron alters the gut microbiota and prevents Crohn's disease-like

ileitis." Gut 60: 325-333.

-Wickham M., et al. (2009). "In vitro digestion methods for assessing the effect of food structure on allergen

breakdown." Mol Nutr Food Res 53(8): 952-958.

-Windey K., et al. (2012). "Relevance of protein fermentation to gut health." Mol Nutr Food Res 56(1): 184-

196.

-Wishart D. S., et al. (2013). "HMDB 3.0 - The Human Metabolome Database in 2013."