UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015 – 2016
INVLOED VAN ROOD VLEES EN VLEESPRODUCTEN OP HET GASTRO-INTESTINAAL CELLULAIR
METABOLISME IN HET KADER VAN COLONKANKERONDERZOEK
door
Ellen DE PAEPE
Promotor: Prof. Dr. Lynn Vanhaecke
Medepromotor: Drs. Caroline Rombouts
Onderzoek uitgevoerd in het kader
van de Masterproef
© 2016, Ellen De Paepe
VRIJWARINGSCLAUSULE
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de
juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze
masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van
derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of
verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de
masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de
masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015 – 2016
INVLOED VAN ROOD VLEES EN VLEESPRODUCTEN OP HET GASTRO-INTESTINAAL CELLULAIR
METABOLISME IN HET KADER VAN COLONKANKERONDERZOEK
door
Ellen DE PAEPE
Promotor: Prof. Dr. Lynn Vanhaecke
Medepromotor: Drs. Caroline Rombouts
Onderzoek uitgevoerd in het kader
van de Masterproef
© 2016, Ellen De Paepe
VOORWOORD
Na enkele intensieve maanden leg hierbij ik de laatste hand aan mijn masterproef. Gedurende deze maanden
heb ik veel geleerd, zowel op wetenschappelijk, als op persoonlijk vlak. Ik maak dan ook graag van deze
gelegenheid gebruik om enkele mensen te bedanken, want deze masterproef kon enkel worden gerealiseerd
dankzij hun hulp, medewerking en begrip.
Eerst en vooral betuig ik graag mijn dankbaarheid aan de mensen die bereid waren een staal te geven en zo
deel te nemen aan dit onderzoek.
Daarnaast wens ik mijn promotor, Prof. Dr. Vanhaecke, te bedanken voor de ondersteuning. Niet alleen heeft
zij mij de mogelijkheid gegeven een zeer interessant onderwerp uit te werken, ze heeft mij ook bij de invulling
van het onderwerp de kans geboden om ‘out of the box’ te denken.
Verder bedank ik graag Drs. Caroline Rombouts, mijn dagelijkse begeleider, die steeds met raad en daad voor
mij klaarstond. Ze heeft mij keer op keer geholpen met interessante en originele ideeën, nieuwe inzichten en
snelle feedback, en maakte mij geduldig wegwijs in de wereld van wetenschappelijke artikels, empirisch
onderzoek en statistiek.
Al deze mensen hebben er mee voor gezorgd dat ik deze masterproef vandaag in deze vorm kan presenteren,
waarvoor zeer veel dank. Bovendien hebben zij de interesse voor de onderzoekswereld bij mij aangewakkerd
en mij goed voorbereid om volgend jaar mijn eerste stappen te zetten in een doctoraat.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .............................................................................................................................................. 1
INLEIDING ......................................................................................................................................................... 2
1. LITERATUURSTUDIE ................................................................................................................................... 3
1.1 De relatie tussen rood vlees en colonkanker .......................................................................................... 3
1.1.1 Epidemiologie .................................................................................................................................. 3
1.1.2 Hypotheses ...................................................................................................................................... 9
1.1.3 Mechanismen ................................................................................................................................. 15
1.2 Metabolomics ........................................................................................................................................ 23
1.2.1 Het metaboloom ............................................................................................................................. 23
1.2.2 Metabolomics ................................................................................................................................. 24
1.2.3 Het gebruik van metabolomics voor de relatie dieet-gezondheid .................................................. 26
1.3 Rol van de gastro-intestinale microbiota ............................................................................................... 27
1.3.1 Verteringssimulaties ....................................................................................................................... 27
1.3.2 Verband tussen microbiota en het risico op CRC .......................................................................... 31
2. DOEL VAN DE STUDIE .............................................................................................................................. 33
2.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ............................................................................... 33
2.2 Experiment vertering carnitine versus lysine......................................................................................... 33
2.3 Metabolomics ........................................................................................................................................ 34
3. MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................................................... 35
3.1 In vitro digestie ...................................................................................................................................... 35
3.1.1 Fecesstalen .................................................................................................................................... 35
3.1.2 Vleesbereidingen ........................................................................................................................... 35
3.1.3 Verteringssappen ........................................................................................................................... 35
3.1.4 In vitro digestie ............................................................................................................................... 37
3.2 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS .................................................................................................................... 39
3.2.1 Staalvoorbereiding ......................................................................................................................... 39
3.2.2 UHPLC-Q-Orbitrap ......................................................................................................................... 39
3.3 Statistische analyse ............................................................................................................................... 40
3.3.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ........................................................................ 40
3.3.2 Experiment vertering carnitine versus lysine ................................................................................. 40
3.3.3 SAS Enterprise guide 7 .................................................................................................................. 40
4. RESULTATEN ............................................................................................................................................. 43
4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte ............................................................................... 43
4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine......................................................................................... 45
4.2.1 Inleiding .......................................................................................................................................... 45
4.2.2 Targeted metabolomics ................................................................................................................. 45
4.2.3 Untargeted metabolomics .............................................................................................................. 46
5. DISCUSSIE ................................................................................................................................................. 52
5.1 De vertering van rood vlees versus gevogelte ...................................................................................... 52
5.2 De vertering van carnitine versus lysine ............................................................................................... 52
5.2.1 Targeted metabolomics ................................................................................................................. 52
5.2.2 Untargeted metabolomics .............................................................................................................. 54
5.2.3 Het effect van carnitine op het risico op CRC ................................................................................ 55
7. BIBLIOGRAFIE ............................................................................................................................................ 57
1
SAMENVATTING
Epidemiologisch onderzoek heeft aangetoond dat er een associatie bestaat tussen het risico op het
ontwikkelen van colorectale kanker en de langetermijn consumptie van rood en verwerkt rood vlees. Hierbij
zou onder andere haemijzer een schadelijke werking uitoefenen, door zijn katalytisch effect op de vorming van
N-nitroso componenten en zijn rol in de vetperoxidatie.
Dit onderzoek diende als validatie voor eerder onderzoek, verricht door Rombouts et al. (2016). Hierbij werden
10 metabolieten gevonden, die significant geassocieerd waren met de digestie van rood vlees. Deze
metabolieten werden niet of in beduidend lagere abundantie teruggevonden na de digestie van gevogelte.
Twee van deze metabolieten bleken acylcarnitines te zijn, waaronder 3-dehydroxycarnitine. In dit onderzoek
werd nagegaan of dezelfde resultaten konden waargenomen worden bij een groter aantal proefpersonen,
gebruik makend van ‘targeted metabolomics’. In een tweede experiment werd onderzocht welke specifieke
metabolieten gevormd werden tijdens de digestie, na supplementatie met L-carnitine versus supplementatie
met lysine. Dit experiment gebeurde met behulp van ‘untargeted metabolomics’. Ook werd met behulp van
‘targeted metabolomics’ de aanwezigheid van 3-dehydroxycarnitine na supplementatie met L-carnitine
nagegaan. Dit onderzoek diende als verificatie of het katabolisme van L-carnitine kan bijdragen aan de vorming
van 3-dehydroxycarnitine. Om deze experimenten uit te voeren werden gastrointestinale digesties in vitro
nagebootst.
Twee van de acylcarnitines die in eerder onderzoek significant konden worden geassocieerd met de digestie
van rundvlees konden ook in dit onderzoek worden geïdentificeerd, namelijk 3-dehydroxycarnitine en
vermoedelijk methylmalonylcarnitine. Specifiek kon worden waargenomen dat er reeds voor de colondigestie
een grotere abundantie was van 3-dehydroxycarnitine bij de vertering van rundvlees dan bij gevogelte. Na
colondigestie werden deze verschillen tussen rundvlees en gevogelte alleen maar groter.
Methylmalonylcarnitine was enkel significant aanwezig na de colondigestie van rundvlees. Na supplementatie
met L-carnitine werd telkens meer 3-dehydroxycarnitine gevormd dan na supplementatie met lysine. Waarbij
de abundantie telkens het hoogst bleek te zijn na colondigestie. Deze resultaten doen vermoeden dat L-
carnitine, vooral aanwezig in rood vlees, door microbieel katabolisme ter hoogte van het colon aanleiding kan
geven tot de vorming 3-dehydroxycarnitine, een molecule die reeds eerder in verband werd gebracht met
andere aandoeningen (zoals atherosclerose).
Sleutelwoorden: Carnitine - Colorectale kanker – 3-Dehydroxycarnitine – Haemijzer - Metabolieten
2
INLEIDING
Het voorkomen van colorectale kanker (CRC) is sinds 1970 in geïndustrialiseerde langden verdubbeld in
aantal. In landen met toenemende industrialisatie en verstedelijking neemt de frequentie snel toe, maar ook
in landen met een lager inkomen, zoals Japan, Singapore en Oost-Europa, lijkt de prevalentie toe te nemen.
Het voorkomen van CRC is nog steeds relatief ongewoon in Afrika en een groot deel van Azië. De ziekte lijkt
iets meer voor te komen bij mannen en kent in net iets minder dan de helft van de gevallen een fatale afloop
(WCRF, 2011).
Het “World Cancer Research Fund” (WCRF) volgt de ontwikkelingen op het gebied van kanker nauwgezet en
publiceert regelmatig een rapport met nieuwe inzichten. Zo identificeerden ze al een groot aantal risicofactoren
voor de ontwikkeling van CRC. Eén van deze risicofactoren, met overtuigend bewijs, is de consumptie van
rood vlees en verwerkt rood vlees. Ook het “International Agency for Research on Cancer” (IARC)
identificeerde rood vlees en zeker verwerkt rood vlees als mogelijke carcinogenen (WCRF, 2011; IARC, 2015).
Epidemiologisch onderzoek toonde aan dat de consumptie van rood vlees op lange termijn een verhoogd
risico op de ontwikkeling van CRC met zich meebrengt. Langetermijn consumptie van kip en vis zijn
omgekeerd geassocieerd met dit risico (Hogg, 2007; Pan et al., 2012; Oostindjer et al., 2014).
Uit epidemiologisch onderzoek bleek dat mensen die zich in de klasse met de hoogste opname rood vlees
bevonden een hoger risico hadden op het ontwikkelen van CRC dan mensen in de laagste klasse, dit vooral
bij vrouwelijke individuen. Bovendien bleek consumptie van pluimvee en vis omgekeerd geassocieerd te zijn
met het risico op zowel proximale als distale colonkanker, opnieuw voornamelijk bij vrouwelijke individuen
(Chao et al., 2005).
Het WCRF vermeld in het rapport van 2010 een samengevat relatief risico van 1,21 gegeven voor elke stijging
in consumptie van 100 gram rood vlees/dag (WCRF, 2011). IARC stelt dat elke dagelijkse toename van 50
gram verwerkt vlees het risico op CRC met 18 % verhoogt (IARC, 2015).
In deze masterproef werd de aandacht voornamelijk gevestigd op de verschillende metabolieten die gevormd
worden bij de digestie van rundvlees, versus de vertering van gevogelte. Ook werd onderzocht welke
metabolieten gevormd worden bij supplementatie met carnitine, versus supplementatie met lysine, aangezien
carnitine in hogere concentratie voorkomt in rood vlees dan in gevogelte. Om dit te bewerkstelligen werd
gebruik gemaakt van ‘metabolomics’. Hierbij wordt er specifiek gekeken naar een aantal vooraf bepaalde
metabolieten, aangeduid als ‘targeted metabolomics’, of wordt er eerder een algemeen metabolietenprofiel
opgesteld, ook ‘untargeted metabolomics’ genoemd. Bij de techniek ‘metabolomics’ worden verschillende
analytische technieken gebruikt om het metaboloom in kaart te brengen. Het metaboloom bestaat uit een
collectie van duizenden kleine moleculen, die deelnemen aan metabole reacties.
Metabolieten van verschillende schijnbaar niet verwante biochemische processen kunnen elkaar beïnvloeden
door middel van pleiotropie. Om deze effecten te kunnen begrijpen is een analyse noodzakelijk waarbij alle
metabolieten in een biologisch systeem geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. Zo een aanpak onthult het
volledige metaboloom van het biologisch systeem en wordt ook wel ‘metabolomics’ genoemd (Fiehn, 2002;
Weckwerth & Morgenthal, 2005; Dunn et al., 2005; Hounoum et al., 2016).
3
1. LITERATUURSTUDIE
1.1 De relatie tussen rood vlees en colonkanker
1.1.1 Epidemiologie
1.1.1.1 Inleiding
In ontwikkelde landen, met hoofdzakelijk een Westers dieet, is colorectale kanker (CRC) een veel
voorkomende aandoening. In deze landen is de incidentie van CRC een viertal keer hoger dan in minder
ontwikkelde regio’s, en blijft bovendien snel stijgen (tabel 1).
Tabel 1: verschil in incidentie van de drie meest voorkomende kankers tussen ontwikkelde regio’s en minder
ontwikkelde regio’s (WCRF, 2012).
Aantal kankers per 100.000 inwoners (in de verschillende regio’s wereldwijd)
Kanker Wereldwijd Meest ontwikkeld Minder ontwikkeld
Longkanker 23,1 30,8 20
Colorectale kanker 17,2 29,2 11,7
Maagkanker 12,1 10,6 12,7
Het is de derde meest voorkomende kanker bij mannen, volgend op long -en prostaatkanker (tabel 2) en bij
vrouwen de tweede, volgend op borstkanker (tabel 3). Deze kanker kent een fatale afloop in iets minder dan
de helft van de gevallen en is de vierde meest voorkomende doodsoorzaak ten gevolge van kanker (Kamangar
et al., 2006; Bastide et al., 2011; WCRF, 2011; Kim et al., 2013; Bastide et al., 2015).
Tabel 2: Top 5 meest voorkomende kankers bij mannen wereldwijd, in 2012 (WCRF, 2012).
Kanker Nieuwe gevallen gediagnosticeerd
in 2012 (1000s)
Procent van alle kankers (exclusief
huidkanker zonder melanomen
Longkanker 1.242 16,7
Prostaatkanker 1.112 15
Colorectale kanker 746 10
Maagkanker 631 8,5
Leverkanker 554 7,5
Tabel 3: Top 5 meest voorkomende kankers bij vrouwen wereldwijd, in 2012 (WCRF, 2012).
Kanker Nieuwe gevallen gediagnosticeerd
in 2012 (1000s)
Procent van alle kankers (exclusief
huidkanker zonder melanomen
Borstkanker 1.677 25,2
Colorectale kanker 614 9,2
Longkanker 583 8,8
Baarmoederhalskanker 528 7,9
Maagkanker 320 4,8
4
Het “World Cancer Research Fund” beschouwt de associatie tussen de opname van rood en verwerkt vlees
en het ontwikkelen van CRC als aanwezig en raadt aan de consumptie van rood vlees tot het minimum te
beperken (Bastide et al., 2015). Het “International Agency for Research on Cancer” (IARC) classificeerde rood
vlees als “vermoedelijk carcinogeen voor de mens (Groep 2A), gebaseerd op gelimiteerd bewijs dat de
consumptie van rood vlees kanker veroorzaakt en sterk mechanistisch bewijs dat de carcinogene werking
ondersteunt”. Deze associatie werd voornamelijk gezien bij CRC, maar ook met pancreaskanker en
prostaatkanker werd een verband gezien. Verwerkt rood vlees werd geclassificeerd als “carcinogeen voor
mensen (groep 1), gebaseerd op voldoende bewijs dat de consumptie hiervan CRC induceert”. Elke toename
van 50 gram verwerkt vlees dagelijks verhoogt het risico op CRC met 18 % (IARC, 2015).
Ongeveer 95% van de gediagnosticeerde colorectale kankers zijn adenocarcinomen, de kanker lijkt bovendien
iets meer voor te komen bij vrouwelijke individuen (WCRF, 2011).
Het colon is het distale deel van het intestinaal stelsel en strekt zich uit van het cecum tot aan het rectum. Op
deze plaats worden water en zouten uit onverteerde voeding geabsorbeerd (WCRF, 2011). Colorectale kanker
ontwikkelt zich voornamelijk in de recto-sigmoïde overgang van de darm, het distale deel van de dikke darm.
Chao et al. (2005) vermoedden dat de concentratie aan feces in dit deel van de darm een rol speelt bij het
ontstaan van CRC. Op deze plaats in de darm is er namelijk een resorptie van water, wat leidt een concentratie
van de carcinogenen, waardoor deze regio in de darm een hogere blootstelling ondergaat (Chao et al., 2005).
1.1.1.2 Epidemiologie
Op lange termijn stelden Oostindjer et al. (2014) vast dat een hoge consumptie van rood en verwerkt vlees
geassocieerd is met een hoger risico op distale colonkanker. Langetermijn consumptie van kip en vis is
omgekeerd geassocieerd met dit risico, en werkt dus als beschermende factor (Hogg, 2007; Pan et al., 2012).
Een logische gevolgtrekking hiervan is dat vegetariërs minder kans hebben op het ontwikkelen van CRC, maar
hier bestaat echter nog geen eenduidig bewijs over (Oostindjer et al., 2014).
Dit leidt tot de assumptie dat de relatie tussen rood vlees en colonkanker complex is en vermoedelijk niet
alleen afhankelijk van de opname van rood vlees. Zo kan onder andere de totale samenstelling van het dieet
een rol spelen, en kunnen er genetische -en milieueffecten zijn (Oostindjer et al., 2014). De ontwikkeling van
CRC is een meerstappenproces, waarbij er op verschillende niveaus een interferentie kan zijn met
componenten aanwezig in rood en verwerkt rood vlees (Demeyer et al., 2015).
In epidemiologisch onderzoek verricht door Chao et al. (2005) werd het langetermijnrisico van de consumptie
van rood vlees tegenover vis en pluimvee nagegaan. Hieruit bleek dat mensen die zich in de klasse met de
hoogste opname rood vlees bevonden een hoger risico hadden op het ontwikkelen van CRC dan mensen in
de laagste klasse, dit vooral bij vrouwelijke individuen. Bovendien bleek consumptie van pluimvee en vis
omgekeerd geassocieerd te zijn met het risico op zowel proximale als distale colonkanker, opnieuw
voornamelijk bij vrouwelijke individuen (Chao et al., 2005).
Deze resultaten doen vermoeden dat vis en pluimvee factoren bevatten die bescherming bieden tegen CRC.
In pluimveevlees zijn kleine hoeveelheden nutriënten zoals selenium en calcium aanwezig, die afwezig zijn in
rood vlees, wat geassocieerd kan worden met een lager risico op CRC (Chao et al., 2005). Vis is een primaire
bron van omega-3 vetzuren, die de tumorgroei zouden inhiberen en de expressie van pro-inflammatoire genen
moduleren.
5
Op die manier zou een hoge inname van vis of visolie omgekeerd geassocieerd zijn met het risico op CRC
(Chao et al., 2005; Corpet, 2011; Baena & Salinas, 2015). Andere studies tonen echter geen duidelijk
antitumoraal effect van vis aan (WCRF, 2011).
Door middel van aanpassingen in de levensstijl kan het voorkomen van deze kanker dalen tot 50% (WCRF,
2011; Baena & Salinas, 2015).
1.1.1.3 Risicofactoren en beschermende factoren
De incidentie van CRC wordt beïnvloed door verschillende factoren (figuur 1), waarbij de individuele
vatbaarheid een ondergeschikte rol speelt. 5 tot 10 % van de CRC’s zijn een gevolg van herkende genetische
afwijkingen, zoals “Familiale Adenomateuze Polyposis” (FAP) en “Hereditary non-polyposis colorectal cancer”
(HNPCC) (WCRF, 2011). Bij de overige gevallen is ongeveer 20% te wijten aan een genetische aanleg, met
gekende gevallen van CRC in de familie (Al-Sohaily et al., 2012; Grivennikov, 2013). Hiernaast speelt vooral
de blootstelling aan etiologische factoren een belangrijke rol. Deze etiologische factoren zijn voornamelijk
geassocieerd met de voeding, aangezien carcinogenen kunnen opgenomen worden als een onderdeel van,
of met, de voeding. Wanneer deze carcinogenen niet gemetaboliseerd of geabsorbeerd worden in de dunne
darm, kunnen ze interageren met de cellen die het colon en het rectum aflijnen (Lipkin, 1974; Bastide et al.,
2011; WCRF, 2011; Kim et al., 2013).
Tabel 4: Risicofactoren en beschermende factoren in de ontwikkeling van CRC (WCRF, 2011).
Beschermende factor Risicofactor
Overtuigend Lichamelijke activiteit
Voeding met veel voedingsvezels
Rood vlees
Verwerkt vlees
Alcohol (voornamelijk bij mannen)
Lichaamsvet
Abdominaal vet
Volwassen hoogte
Vermoedelijk Look
Melk
Calcium
Alcohol (voornamelijk bij vrouwen)
Kamangar et al. (2006) brachten bepaalde aspecten van de voeding, zoals een lage hoeveelheid vezels en
de inname van rood vlees in verband met CRC. Ook te weinig lichaamsactiviteit en overgewicht zouden een
rol kunnen spelen in deze carcinogenese (tabel 4). Bij een recent ontdekte risicogroep is volgens Kim et al.
(2013) de carcinogenese gelinkt met colitis (WCRF, 2011; Oostindjer et al., 2014). Deze individuen
ontwikkelen vooral colitis geassocieerde kanker (CAC), waarbij de chronische inflammatie drie verschillende
stadia in de carcinogenese kan beïnvloeden, meer bepaald zijn dit de tumor initiatie, promotie en progressie.
Tumor initiatie is het proces waarbij een normale cel kwaadaardige eigenschappen ontwikkelt en is
geassocieerd met een accumulatie van genetische veranderingen. Men vermoedt dat geactiveerde
immuuncellen cytokines en andere factoren vrijstellen, die op hun beurt de vorming van reactieve zuurstof
species (ROS) binnenin epitheelcellen kunnen activeren. Deze ROS kunnen zowel enkelvoudige als dubbele
DNA bindingen verbreken (Demeyer et al., 2015).
6
Bepaalde medicatie, zoals niet steroïdale anti-inflammatoire drugs (NSAID’s) (aspirine en
hormoonvervangende therapie bij postmenopauze vrouwen) kunnen het risico op CRC verlagen, terwijl het
gebruik van tabak dit risico dan net weer kan verhogen (tabel 5) (Paskett et al., 2007; Botteri et al., 2008; Wei
et al., 2009; WCRF, 2011; Johnson et al., 2013).
1.1.1.3.1 Beschermende factoren
Het “World Cancer Research Fund” (WCRF) haalt verschillende factoren aan die een beschermende werking
kunnen uitoefenen op het ontstaan van CRC. Deze factoren zijn onder andere een vezelrijke voeding (figuur
2), voldoende lichamelijke activiteit, calcium en look.
In het gastrointestinaal stelsel brengt vezelrijke voeding een aantal verschillende effecten teweeg, zo zal het
onder meer zorgen voor een verdunning van de fecale inhoud in de darm, een verminderde transittijd en een
toegenomen massa van de stoelgang. Wanneer diëtaire carbohydraten en mucines het colon bereiken worden
deze gefermenteerd door de darmflora in voornamelijk korte keten vetzuren, zoals butyraat, deze spelen een
rol in de apoptose en differentiatie, en het stopzetten van de celcyclus. Deze effecten lijken dosisgerelateerd
en komen in gelijke mate voor bij mannen en vrouwen (Larsson et al., 2005; WCRF, 2011; Johnson et al.,
2013).
Dagelijks 30 minuten gematigde lichaamsactiviteit resulteert in een daling van CRC met 11 % (tabel 5) (Baena
& Salinas, 2015). Op lange termijn verhogen deze periodes de metabole efficiëntie en capaciteit van het
Fig 1: Schematische voorstelling van diëtaire factoren en levensstijl, met een invloed op het ontstaan van
CRC. De combinatie van verschillende factoren speelt een grotere rol dan elke factor afzonderlijk (Windey
et al., 2012).
7
lichaam. Dit kan op zijn beurt
zorgen voor een reductie van
inflammatie, insulinelevels –en
resistentie. Het effect van
lichaamsactiviteit lijkt het
duidelijkst te zijn bij mannelijke
individuen (WCRF, 2011; Johnson
et al., 2013; Patel & De, 2016).
Intracellulair calcium heeft een
belangrijke invloed op
verschillende cellulaire functies,
waaronder ook de celgroei. Het
begrenst namelijk de cellulaire
proliferatie en promoot
differentiatie en apoptose in
normale, alsook in tumorale cellen.
Door de aanwezigheid van calcium
in melk, kan ook hierbij een antitumoraal effect waargenomen worden (WCRF, 2011; Johnson et al., 2013).
Een studie van Sesink et al. (2001) toonde het chemoprotectief effect van calcium aan, waarbij calcium de
cytotoxische en hyperproliferatieve effecten van haem tegengaat (Corpet, 2011). Ook Bastide et al. (2015)
vermeldden bij ratten op een laag calcium dieet een bevordering van precancereuze laesies door rood en
verwerkt vlees.
Look zou een antitumoraal effect hebben, voornamelijk door zijn allyl-zwavel componenten. Deze kunnen
zowel de celgroei als tumorvorming inhiberen, op een dosis-afhankelijke manier (WCRF, 2011; Johnson et al.,
2013).
1.1.1.3.2 Risicofactoren
Verschillende factoren kunnen het risico op het ontstaan van CRC doen toenemen, deze zijn onder andere
alcohol, overtollig lichaamsvet (tabel 5) en abdominaal vet, volwassen hoogte en de consumptie van rood en
verwerkt vlees.
Bij mannen lijkt alcohol een groter effect te hebben op het ontstaan van CRC dan bij vrouwen. Een mogelijke
verklaring hiervoor is de gemiddeld hogere alcoholconsumptie bij mannen, die bovendien een andere voorkeur
voor bepaalde biersoorten hebben. Reactieve metabolieten van alcohol, zoals acetaldehyde kunnen
carcinogeen zijn. Bovendien is er een interactie met roken, waarbij tabak specifieke mutaties in het DNA
induceert die minder efficiënt kunnen worden hersteld in aanwezigheid van alcohol. Alcohol kan ook fungeren
als solvent en zo de penetratie van carcinogene moleculen in mucosale cellen faciliteren (Ferrari et al., 2007;
WCRF, 2011; Baena & Salinas, 2015; Patel & De, 2016).
Lichaamsvet beïnvloedt rechtstreeks de hoeveelheid circulerende hormonen, zoals insuline, ‘insuline like
growth factor’ en oestrogenen. Op die manier wordt een omgeving gecreëerd die carcinogenese bevordert en
apoptose tegengaat. Het stimuleert bovendien de inflammatoire respons van het lichaam, wat kan bijdragen
in het ontstaan en de progressie van verschillende kankers (WCRF, 2011; Baena & Salinas, 2015).
.
Fig. 2: Relatief risico en 95% betrouwbaarheidsinterval voor het
verband tussen colonkanker en de opname van vezelrijke voeding.
Hoe meer vezelrijke voeding, hoe lager het relatief risico op het
ontwikkelen van CRC (Larsson et al., 2005).
8
Ook abdominaal vet induceert een toegenomen aantal circulerende oestrogenen en een verminderde insuline
gevoeligheid, deze effecten zijn onafhankelijk van het algemene lichaamsvet (WCRF, 2011).
De volwassen hoogte wordt bepaald door
voeding in het vroege leven, gewijzigde
hormoonprofielen en de snelheid van
seksuele maturatie, wat mogelijks een rol
kan spelen in het verhogen van
kankerrisico (WCRF, 2011).
Verschillende bronnen halen de opname
van rood en verwerkt rood vlees aan als
een belangrijke risicofactor voor het
ontstaan van CRC, waarbij de inname van
verwerkt rood vlees een nog schadelijkere
invloed zou hebben dan vers vlees (Chao
et al., 2005; van den Brandt & Goldbohm,
2006; Boyle et al., 2008; Bastide et al.,
2011; Baena & Salinas, 2015). Onder
verwerkt vlees wordt vlees verstaan dat
gezouten of gerookt wordt, of waaraan
nitraten of nitrieten worden toegevoegd, dit
alles om de bewaring te verbeteren.
Verwerkt vlees bevat nitrosamines en hun
precursoren, componenten die bij een hoge consumptie schadelijke effecten kunnen teweegbrengen (Chao
et al., 2005). In een review van prospectieve onderzoeken toonden Chao et al. (2005) aan dat een toename
van 100 g rood vlees per dag een risicostijging van 12 tot 17 % met zich mee brengt. Daarenboven kwam er
in deze studie ook aan het licht dat een toename van 25 g verwerkt vlees per dag geassocieerd is met een
toegenomen risico op CRC van 49%. Bij sommige van deze prospectieve onderzoeken werd er echter geen
rekening gehouden met mogelijke ‘confounders’ (Chao et al., 2005). Daniel et al. (2011) vonden dat het risico
op CRC lineair verhoogt met een stijgende opname van rood of verwerkt vlees tot 140 g/dag. Bovendien bleek
de frequentie van opname van rood vlees sterker geassocieerd te zijn met het risico op carcinogenese dan de
totale opgenomen hoeveelheid (Smolinska et al., 2012).
In onderzoek van Chao et al. (2005) naar mogelijke ‘confounders’ bleek dat mensen met een hogere inname
van rood vlees vaak ook een lagere scholing hadden, minder aan lichamelijke activiteit deden en een hoger
BMI hadden. Bovendien gaven deze mensen ook aan meer sigaretten te roken, meer bier en sterke dranken
te nuttigen en bleken ze een hogere totale dagelijkse energie-opname te hebben. Ook aten deze mensen
minder fruit, weinig of bijna geen groenten en hadden ze een voedingspatroon met een laag vezelgehalte.
Wanneer er verder rekening gehouden werd met al deze ‘confounders’ kon er nog steeds een verband
aangetoond worden tussen een hogere opname van rood vlees en de ontwikkeling van CRC (Chao et al.,
2005; Aune et al., 2013).
Tabel 5: Overgewicht, roken en alcoholgebruik hebben een
hoger relatief risico op het ontwikkelen van CRC,
lichaamsactiviteit kan gezien worden als een beschermende
factor (Johnson et al., 2013).
9
1.1.2 Hypotheses
Sinds het onderzoek naar de risicofactoren van CRC gestart is, zijn er reeds verscheidene hypotheses naar
voor gebracht. Aanvankelijk dacht men dat de verzadigde vetten een belangrijke rol speelden, deze hypothese
werd echter door verscheidene onderzoeken ontkracht, aangezien diëtair vet uit andere voedingswaren dan
vlees geen verhoogd risico met zich meebracht. In epidemiologisch onderzoek werd vastgesteld dat mensen
met een voorkeur voor sterk doorbakken vlees een groter risico leken te hebben op CRC (Giovannucci &
Goldin, 1997; Gunter et al., 2005). Hierdoor vermoedde men dat er afhankelijk van de bereidingsmethode
wisselende hoeveelheden heterocyclische amines en polyaromatische koolwaterstoffen werden gevormd, dit
zijn stoffen met carcinogene werking (Butler, 2003). Deze stoffen worden echter ook gevormd bij de bereiding
van pluimvee, maar deze vleessoort is desondanks niet geassocieerd met CRC (Bastide et al., 2011). Een
belangrijk verschil in eigenschappen tussen rood vlees en pluimvee is de hoeveelheid myoglobine in de
spieren, deze is in beduidend hogere concentraties aanwezig in rood vlees. Dit myoglobine is een
hemoproteïne, wat inhoudt dat het een haemmolecule bevat (Chao et al., 2005; Bastide et al., 2011).
1.1.2.1 Verzadigde vetten
Een eerste hypothese stelt
dat er een verband bestaat
tussen de hoeveelheid
verzadigde vetten in de
voeding en het risico op
CRC. Een hoge hoeveelheid
diëtair vet induceert een
toegenomen vrijstelling van
galzouten in de dunne darm
(figuur 3). Vervolgens
kunnen deze door bacteriën
in het colon worden omgezet
in secundaire en tertiaire
galzouten. Deze oefenen
niet-specifiek irriterende
effecten uit op de
epitheelcellen, zoals
oxidatieve stress, wat
aanleiding kan geven tot
DNA schade. Deze mutaties
kunnen leiden tot aberrante
expressie van oncogenen of
tumorsuppressiegenen.
Op die manier kunnen
galzouten fungeren als
tumorpromotor (Giovannucci
Fig 3: Schematische voorstelling van het effect van galzouten op het
ontstaan van CRC. Galzouten zorgen voor een activatie van oppervlakte
enzymen, dit zorgt voor een vrijstelling van reactieve zuurstofradicalen,
met als gevolg onder meer DNA schade en celdood, wat een
inflammatoire respons kan teweegbrengen (Payne et al., 2008).
10
& Goldin, 1997; Ajouz et al., 2014). Bovendien kan een continue blootstelling aan hoge hoeveelheden
galzouten een selectieve groei van resistente celpopulaties veroorzaken (Payne et al., 2008; Barrasa et al.,
2013). Ten laatste wordt het DNA herstel mechanisme geïnhibeerd door deze galzouten (Payne et al., 2008).
De secretie van deze componenten wordt echter zowel door vet van dierlijke als plantaardige oorsprong
gestimuleerd, en bovendien bleek het niet mogelijk aan de hand van epidemiologisch onderzoek deze
hypothese te bevestigen. Wel werd duidelijk dat vooral de consumptie van rood vlees een verhoogde incidentie
van CRC met zich mee bracht, waarbij de invloed van de totale vetinhoud minder relevant leek te zijn
(Giovannucci & Goldin, 1997; Alexander et al., 2009; Demeyer et al., 2015). Verschillende onderzoeken
hebben aangetoond dat de associatie tussen vetzuren en CRC complex is en gerelateerd is met andere
factoren dan de verzadigde vetten (Giovannucci & Goldin, 1997; Alexander et al., 2009; Demeyer et al., 2015).
1.1.2.2 Verbrandingsproducten
Epidemiologisch onderzoek wees aan dat de incidentie van CRC verhoogd was bij vleeseters met voorkeur
voor goed doorbakken vlees, terwijl er geen verhoogd risico werd vastgesteld bij personen die hun vlees
minder doorbakken consumeerden. Dit deed vermoeden dat CRC geassocieerd is met verbrandingsproducten
van vlees, waarbij vooral de kookmethodes een grote invloed hebben (Giovannucci & Goldin, 1997; Gunter et
al., 2005).
Deze verbrandingsproducten worden gevormd tijdens het opwarmen van voedingswaren met hoge proteïne-
inhoud, zoals vlees, en staan gekend als mogelijke humane carcinogenen. De eerste groep
verbrandingsproducten zijn de heterocyclische amines (HCA’s) en de tweede groep zijn de polyaromatische
koolwaterstoffen (PAK’s).
Fig 4: Het verband tussen de voorkeur in gebakken vlees en het verhoogd risico op CRC. ● Licht
gebruind / rauw; ■ Medium bruin / Roze; ▲ Fel gebruind / aangebrand. De ods ratio op het ontwikkelen
van CRC is duidelijk hoger bij consumptie van goed doorbakken vlees, voornamelijk bij rundvlees
(Helmus et al., 2013).
11
1.1.2.2.1 Heterocyclische amines
Heterocyclische aromatische amines (HCA’s) zijn in hoogste concentratie aanwezig in vleessap (Butler, 2003;
Bastide et al., 2011). HCA’s worden gevormd in verhitte vleeswaren en vis, tijdens de Maillard reactie, met
creati(ni)ne, aminozuren en suikers. De uiteindelijk gevormde hoeveelheid HCA’s is afhankelijk van de
bereidingsmethode, de tijd, de temperatuur, de beginconcentratie van precursoren en de aanwezigheid van
water en vet in het rauw product (Alaejos & Afonso, 2011). Zo kan de vorming van deze HCA’s optimaal
doorgaan bij een langere kooktijd en bij bereiken van een kerntemperatuur van 150 °C tot 200 °C. Ook een
grotere externe verkoling kan de vorming van deze HCA’s in de hand werken (Butler, 2003; Bastide et al.,
2011). Essentieel in de carcinogene werking van deze HCA’s is een metabole activatie, aldus kan het
carcinogeen potentieel afhangen van de mate van metabolisatie (Cross & Sinha, 2004). Dit is afhankelijk van
genetische verschillen in bepaalde enzymen (Le Marchand et al., 2002) en kan ook variëren met verschillen
in intestinale microflora (Kassie et al., 2004; Vanhaecke et al., 2008). Tijdens de metabolisatie in het lichaam
wordt er een nitriet ion gevormd, wat de ultieme genotoxische component zou zijn. Deze kan binden aan het
DNA, meer bepaald door middel van N-C bindingen aan de guanine basen en induceert aldus DNA-adducten
(Demeyer et al., 2015).
Deze hypothese leek echter niet zo waarschijnlijk aangezien de gevormde concentratie HCA’s gelijk is na
bereiden van zowel rund en varken, als kip en vis (Bastide et al., 2011; Demeyer et al., 2015). Ook is de
hoeveelheid HCA’s die toxische effecten uitoefent bij knaagdieren 1000 keer hoger dan de concentratie die
kan gevonden worden in de voeding (Stavric, 1994; Schwab et al., 2000; Bastide et al., 2011). Aldus worden
HCA’s niet als belangrijke carcinogenen gezien voor de ontwikkeling van CRC (Corpet, 2011).
1.1.2.2.2 Polyaromatische koolwaterstoffen
De tweede groep van verbrandingsproducten zijn
de polyaromatische koolwaterstoffen (PAK’s).
Deze zijn wijdverspreid in het milieu aanwezig en
worden geproduceerd door onvolledige
verbranding van organische componenten. Ze
kunnen aanwezig zijn in de omgeving en
gevormd worden in de voeding tijdens de
bereiding (Demeyer et al., 2015). De hoogste
levels aan deze PAK’s kunnen teruggevonden
worden in vlees dat boven een warmtebron
bereid werd, zoals na grillen of barbecue.
Wanneer dit vlees verhit wordt, druppen er
vetsappen op de warmtebron en door pyrolyse
kunnen er vervolgens schadelijke stoffen in de rook terechtkomen (Butler, 2003; Bastide et al., 2011; Demeyer
et al., 2015). De meest bestudeerde PAK is benzo[a]pyreen, dit carcinogeen werd in 2012 door IARC
geclassificeerd als groep 1, op basis van mechanistisch bewijs en andere relevante data (figuur 5).
PAK’s op zichzelf zijn niet toxisch, maar tijdens metabolisatie kunnen reactieve metabolieten gevormd worden
die covalent kunnen binden met DNA en op die manier schade veroorzaken. PAK’s zijn aanwezig in alle
Fig 5: de chemische formule van benzo[a]pyrene
(IARC).
12
soorten voeding en worden dus niet gezien als causaal agens in de carcinogenese. Het is eerder de manier
van vleesbereiding die bijdraagt in de ontwikkeling van CRC (Cirillo et al., 2010; Demeyer et al., 2015).
1.1.2.3 Proteïne
Kim et al. (2013) stelden dat de overmatige opname van proteïnen kan leiden tot het ontstaan van CRC. De
meeste diëtaire proteïnen worden geabsorbeerd in de dunne darm. Er zijn echter substantiële hoeveelheden
endogene en exogene nitrogene componenten die de dikke darm bereiken, waar de microbiota instaat voor
de proteolyse. Dit zorgt voor het ontstaan van peptiden en aminozuren, die worden vrijgesteld in de darmen.
De darmmicrobiota verwerken deze peptiden en aminozuren, met de productie van bacteriële metabolieten
als gevolg. Hierdoor kunnen potentieel toxische bacteriële metabolieten in overmaat geproduceerd worden,
wat kan leiden tot DNA schade bij de colonepitheelcellen, dit brengt metabole veranderingen teweeg. Deze
potentieel toxische producten van de proteïnefermentatie zijn: ammoniak, fenolen, indolen, ‘Branched Chain
Fatty Acids’ (BCFA’s) en H2S. Daarnaast kunnen ook endogene N-nitroso-componenten (NOC’s) gevormd
worden. De concrete werkingsmechanismen van deze opgesomde producten werden echter nog niet uitvoerig
onderzocht (Corpet et al., 1995; Hughes et al., 2000; Kim et al., 2013; Oostindjer et al., 2014).
Verschillende epidemiologische studies ondersteunen de associatie tussen overmatige proteïne opname en
CRC niet, aangezien er geen significant verband kon worden aangetoond (Windey et al., 2012).
1.1.2.4 Haem
De laatste hypothese, betreffende de toxiciteit van haem wordt ondersteund door epidemiologisch en
experimenteel onderzoek. Haem is ingebed in een hemoproteïne en bevindt zich met zijn ijzeratoom in het
centrum van een grote heterocyclische organische ring, genaamd porfyrine (figuur 7). Er bestaan drie soorten
hemoproteïnes, twee daarvan zijn betrokken bij de zuurstofvoorziening van de cel, dit zijn de hemoglobines
en myoglobines. Het overblijvende hemoproteïne is het cytochroom en kan de elektronentransferreacties
Fig 6: Schematische voorstelling van de metabolisatie van overmatige proteïne-opname, deze proteïnen
worden verwerkt door de microbiota, wat leidt tot de productie van onder meer schadelijke metabolieten
(Kim et al., 2013).
13
katalyseren. In rood vlees is haem tot 10 keer meer aanwezig dan in wit vlees (Bastide et al., 2011, Demeyer
et al., 2015).
Dit haemijzer is verantwoordelijk voor de
rode kleur van vlees en is hoofdzakelijk
aanwezig in het myoglobine van rood vlees,
wat kan verklaren waarom rood vlees
geassocieerd wordt met een hogere
incidentie van CRC (Chao et al., 2005). Men
heeft aangetoond dat een hoge inname van
haemijzer geassocieerd is met een hoger
risico op colonkanker. Het relatieve risico
(RR) van colonkanker ligt 1,18 keer hoger
voor mensen in de hoogste categorie van
haemijzer opname (meer dan 2,05 mg/dag)
in vergelijking met die in de laagste
categorie (minder dan 0,76 mg/dag) (Lee & Lee, 2004; Bastide et al., 2011). Kim et al. (2013) stelden dat de
consumptie van rood vlees het risico op CRC verhoogt op een dosis-afhankelijke manier. Zowel de opname
van rood vlees als supplementatie met haemijzer geven een verhoogde fecale concentratie van N-nitroso
componenten (NOC’s) en meer DNA-adducten in humane colonocyten (Chao et al., 2005). In een studie van
Kuhnle et al. (2007) werd aangetoond dat rundvlees meer haem bevat dan varkensvlees.
Bij vlees dat bewerkt is met pekelzout dat nitraat of nitriet bevat, zal dit nitriet zorgen voor een nitrosylatie van
het haemijzer, wat verondersteld is toxischer te zijn dan niet genitroslyeerd haemijzer (Bastide et al., 2011).
De haemmolecule heeft een katalytisch effect op de vorming van zowel NOC’s, als eindproducten van de
vetperoxidatie (Demeyer et al., 2015).
1.1.2.4.1 N-Nitrosocomponenten
Alle stoffen met N-nitroso-groepen worden geclassificeerd als N-nitrosocomponenten (NOC), waaronder ook
de N-nitrosamines en N-nitrosamides. Dit zijn alkylerende agentia die kunnen interageren met DNA van het
targetweefsel, waardoor zij mutaties kunnen induceren, en zo potentieel carcinogeen zijn (Saffhill et al., 1985).
Een veel voorkomende mutatie bij CRC is de alkylatie van de O6-positie van guanine, wat kan leiden tot een
transitie van guanine (G) naar adenine (A) (Bastide et al., 2011; Kim et al., 2013).
N-nitrosamides zijn direct alkylerende agentia en oefenen hun effect voornamelijk uit op de plaats van
blootstelling. N-nitrosamines daarentegen vereisen een metabole activatie om hun mutagene activiteit uit te
oefenen en zullen voornamelijk schade veroorzaken op hun activatieplaats. Tijdens voedselconsumptie
kunnen mensen blootgesteld worden aan NOC’s van zowel exogene als endogene origine (Cross & Sinha,
2004; Jagerstad & Skog, 2005).
Exogene N-Nitroso componenten (NOC’s) ontstaan wanneer organische componenten in de voeding door
nitriet genitrosyleerd worden. Behandeling van de voeding met nitriet is een methode om de houdbaarheid
van voeding te verlengen en een goede kleur te behouden.
De endogene N-nitrosylering van amines vindt plaats in het gastro-intestinaal stelsel en is een reactie tussen
nitrogene oxides en secundaire amines in de maag. Als eindproduct worden nitrosamines gevormd, de
Fig. 7: Chemische formule van haem (Wishart et al., 2013).
14
vorming van deze nitrosamines kan in de hand gewerkt worden door het katalytisch effect van haem, alsook
door een hoge temperatuur, zoals bijvoorbeeld kan gezien worden bij frituren (Bastide et al., 2011; Kim et al.,
2013; Oostindjer et al., 2014).
Het “International Agency for Research in Cancer” (IARC) klasseerde in 2010 de inname van nitraat of nitriet,
waardoor endogene nitrosylering kan plaatsvinden als “mogelijk carcinogeen voor mensen (Groep 2A)”. De
opname van nitraat gebeurt echter niet alleen door nitraat-bevattende behandeling van vlees. Er zijn namelijk
bepaalde groenten zoals selder, radijzen, bieten en spinazie die hoge levels van nitraat bevatten. Dit nitraat
wordt door orale bacteriën gemetaboliseerd naar nitriet, wat kan leiden tot een veel hogere opname van nitriet
per portie dan die door de opname van rood vlees (Oostindjer et al., 2014).
1.1.2.4.2 Vetperoxidatie
In vitro is haem zowel genotoxisch als cytotoxisch voor colonocyten, aangezien het DNA- en membraan
schade induceert. Heem zelf veroorzaakt een ‘downregulatie’ van pentraxine, een proteïne dat betrokken is in
het verwijderen van oude colonepitheelcellen. Dit zorgt voor een inhibitie van de apoptose en het afschilferen
van de colonocyten. Ook treedt er door haem een downregulatie van de inhibitoren van de celproliferatie op
(Kim et al., 2013).
Door zijn sterk katalytische werking draagt heem bij in de vetperoxidatie, met vorming van reactieve
zuurstofradicalen met cytotoxische en genotoxische werking (Bastide et al., 2011; Kim et al., 2013; Oostindjer
et al., 2014). Dit proces gaat vooral door in aanwezigheid van polyonverzadigde vetten zoals in celmembranen
onder de mucuslaag, of in aanwezigheid van galzuren (Oostindjer et al., 2014). In muizen is reeds aangetoond
dat haemijzer de carcinogenese promoot door vetperoxidatie. Dit zorgt voor een verhoogde celproliferatie ter
hoogte van de colonmucosa. Onder normale omstandigheden wordt haem volledig geabsorbeerd in het
gastrointestinaal stelsel, maar bij een overaanbod kan het niet volledig opgenomen worden en blijft het
aanwezig in de darmen, op die manier kan er beschadiging zijn van het colonepitheel. Als de schade niet kan
hersteld worden, resulteert dit in een verhoogd risico op kanker. Deze schade kan beperkt worden door
opname van voldoende antioxidanten, die van nature aanwezig zijn in groenten en fruit (Oostindjer et al.,
2014).
1.2.4.3 White meat controversy
Volgens Oostindjer et al. (2014) is de haemmolecule niet de oorzaak van het verhoogde risico op colonkanker,
gezien de kleine verschillen in haemconcentratie tussen rood vlees enerzijds, en kip en vis anderzijds. Ook
Lombardi-Boccia et al. (2002) vermelden dat er een gelijkaardige haemconcentratie aanwezig is in kip- en
varkensvlees, die beduidend lager is dan in rundvlees. Dit wordt ook aangeduid als de ‘white meat
controversy’.
In dit opzicht is het mogelijk dat het risico op CRC, afgezien van de haemmolecule, geassocieerd is met een
specifieke component van rood vlees, zoals bijvoorbeeld een oppervlakkig siaalzuur, meer bepaald het N-
glycolneuraminezuur (Neu5Gc) (Oostindjer et al., 2014). Deze molecule wordt niet geproduceerd door
bacteriën of planten en is zo goed als afwezig in gevogelte en vis. Het is daarentegen rijkelijk aanwezig in
koemelk en rood vlees (Byres et al., 2008).
Mensen kunnen dit siaalzuur niet verwerken en gaan het bijgevolg accumuleren uit de voeding. Dit resulteert
in de productie van circulerende anti-Neu5Gc antilichamen, wat leidt tot een lokale chronische inflammatie
15
(Hedlund et al., 2008). In (verwerkt) rood vlees kan de gecombineerde aanwezigheid van Neu5Gc met haem
en genotoxische componenten de mogelijkheid tot het ontwikkelen van dieetgerelateerde carcinomen doen
toenemen (Demeyer et al., 2015).
1.1.3 Mechanismen
Om de verschillende processen in de carcinogenese te begrijpen is het belangrijk inzicht te hebben in de
werking van de normale darm (figuur 8). Het colon heeft een plat oppervlakte-epitheel, bestaande uit
colonocyten, enteroendocriene cellen en Goblet cellen, dit epitheel zal invagineren om crypten te vormen. Op
de bodem van deze crypten blijven er steeds een aantal stamcellen aanwezig, rest van de cellen gaan snel
delen en proliferen. Vanuit deze proliferatieve zone migreren de cellen via een transitiezone naar het oppervlak
van de mucosa, waar ze gaan afschilferen (Degirolamo et al., 2011).
Terwijl ze door de transitiezone bewegen, stopt de DNA synthese. Aldus stopt de proliferatieve celcyclus en
de cellen worden volwassen, dit is de maturatiefase.
Fig 8: (a) Schematische voorstelling van het colonepitheel, onderaan bevinden zich een aantal
stamcellen, deze gaan traag delen en generen op die manier progenitorcellen, deze bevinden zich in het
onderste derde van de crypten en kunnen differentieren naar alle cellijnen in het colon. (b) Normale
stamcellen produceren progenitorcellen die zich kunnen differentieren in een aantal verschillende
cellijnen. In tumorale cellen is er een ontregeling van de normale dynamiek, waardoor er een clonale
expansie is van gemuteerde cellen (Degirolamo et al., 2011).
16
Bij gezonde individuen wordt het oppervlak van de colonmucosa op die manier door nieuwe cellen vervangen
om de 4-8 dagen. In deze proliferatiesnelheden zit echter vrij veel variatie. Zo zijn er regio’s die dagen niet-
proliferatief zijn versus regio’s waarbij de cellen onmiddellijk opnieuw delen. Deze traag proliferatieve
epitheelcellen worden voornamelijk gevonden in het sigmoïde colon. De cellen op deze plaats van de darm
zijn dus langer in contact met potentiële carcinogenen (Lipkin, 1974).
1.1.3.1 Pathogenese
De ontwikkeling van kanker is een langdurig proces, en bestaat uit de accumulatie van verschillende mutaties.
Dit verklaart het lineaire leeftijdsspecifieke incidentiepatroon van CRC (Vogelstein & Kinzler, 1993; Kamangar
et al., 2006). Het risico op ontwikkelen van CRC neemt toe met de leeftijd, en meer dan 90 % van de
sporadische CRC ontstaat bij individuen, ouder dan 50 jaar (Al-Sohaily et al., 2012). CRC ontstaat meestal als
een goedaardige adenomateuze poliep, die zich verder kan ontwikkelen in een gevorderd adenoom, met
dysplastische cellen en uiteindelijk kan een invasieve kanker (figuur 9) (Fearon & Vogelstein, 1990; Demeyer
et al., 2015).
Drie categorieën van genen spelen een belangrijke rol in de carcinogenese, namelijk de oncogenen, de
tumorsuppressiegenen en stabiliteitsgenen. Veranderingen in deze genen zijn belangrijke gebeurtenissen in
de tumor initiatie.
De belangrijkste groep zijn de tumorsuppressiegenen, welke zorgen voor een inhibitie van de celproliferatie.
Genetische veranderingen die aanleiding geven tot een inactivatie van deze genen leiden tot een verlies van
Fig. 9: De verschillende stappen in het ontstaan van een coloncarcinoom. (A) toont de normale opbouw
van een crypte. (B) toont de ontwikkeling van een fase 1 proliferatieve laesie, het aantal nieuwgevormde
cellen is nog evenredig met het aantal afschilferende cellen. (C) is de ontwikkeling van een fase 2
proliferatieve laesie, waarbij er een accumulatie is van cellen in de mucosa. (D) toont de verdere
differentiatie van abnormale cellen, met de progressie naar carcinoom (Lipkin, 1974).
17
controle en dus een ongeremde celgroei (Vogelstein & Kinzler, 1993; Vogelstein & Kinzler, 2004; Boland &
Goel, 2010).
Een andere belangrijke groep is deze van de oncogenen, die kunnen coderen voor groeifactoren of hun
receptoren, voor signaalmoleculen en andere factoren die een rol kunnen spelen in de celproliferatie en
overleving. De oncogene eigenschappen worden geactiveerd bij veranderingen in deze genen, wat kan leiden
tot overactieve genproducten en een toegenomen aantal kopijen (Boland & Goel, 2010).
1.1.3.1.1 Model van Fearon en Vogelstein
Dit model stelt dat de carcinogenese begint met mutaties die de activatie van oncogenen en inactivatie van
tumorsuppressiegenen veroorzaken. Deze stap wordt gevolgd door mutaties in minstens 4 tot 5 verschillende
genen, noodzakelijk voor het ontwikkelen van de tumor. Ten laatste is er een accumulatie van mutaties die de
tumor zijn kwaadaardige eigenschappen bezorgen (Fearon & Vogelstein, 1990).
De initiële stap in de ontwikkeling van de tumor is een mutatie ter hoogte van het APC tumor suppressie gen,
wat een inkorting veroorzaakt van het geproduceerde proteïne, waardoor dit niet meer functioneel is
(Vogelstein & Kinzler, 1993). Deze mutaties reduceren de hoeveelheid caspase 3, 7 en 9 in colonocyten van
muizen, wat leidt tot een resistentie aan apoptose (Bastide et al., 2011).
Mutaties ter hoogte van het APC gen leiden tot de vorming van gradueel groeiende goedaardige tumoren,
doordat de normale inhibitie van de DNA-synthese tijdens de maturatie niet gebeurt, met als gevolg een
toegenomen cellulaire proliferatie (Lipkin, 1974). De volgende stap is een mutatie van het RAS gen, wat leidt
Fig. 10: Schematische voorstelling van het model van Fearon en Vogelstein (naar Fearon & Vogelstein,
1990).
18
tot een verdere clonale expansie van de tumor. Dit RAS gen is een oncogen en wanneer gemuteerd, promoot
dit de hyperplastische groei van het colonepitheel, aberrante morfologie in de crypten, tumorgroei en de
vorming van metastasen (Cabrera-Mendoza et al., 2014).
De progressie van adenoom naar carcinoom wordt gemedieerd door genetische veranderingen in de
tumorsuppressiegenen DCC, gelegen op chromosoom 18q, en p53. Dit geeft aanleiding tot een clonale
expansie die finaal resulteert in de progressie naar een maligne tumor (figuur 10) (Fearon & Vogelstein, 1990;
Vogelstein & Kinzler, 1993).
Het is echter ongewoon dat combinaties van mutaties in verschillende genen voorkomen in één en dezelfde
kanker. De genetische achtergrond van de ontwikkeling van een CRC lijkt meer heterogeen te zijn.
Tegenwoordig wordt vooral de hypothese van genomische instabiliteit gevolgd, dit is een integraal deel van
de transformatie van naar carcinoom. Er zijn drie moleculaire principes geïdentificeerd, waarbij er genetische
veranderingen kunnen optreden in belangrijke regulatorische genen: chromosomale instabiliteit, microsatelliet
instabiliteit en “CpG eiland methylator fenotype pathway”. Deze moleculaire principes zijn niet strikt, wat wil
zeggen dat sommige tumoren kenmerken van meerdere principes kunnen vertonen (Al-Sohaily et al., 2012).
Omgevings -en voedingsgebonden mutagenen bevatten componenten die aanwezig zijn in rood en verwerkt
vlees, die kunnen bijdragen tot genomische instabiliteit en uiteindelijk CRC door het induceren van DNA
schade (Demeyer et al., 2015).
1.1.3.1.2 Chromosomale instabiliteit
De meest voorkomende oorzaak, 65 – 70 % van de sporadische CRC, van genomische instabiliteit is de
chromosomale instabiliteit. Dit wordt gekenmerkt door een afwijkend karyogram, tengevolge van winst of
verlies van volledige chromosomen of chromosomale regio’s. Het gevolg hiervan is een imbalans in het
chromosoom aantal en een verlies aan heterogeniteit. Wanneer dit plaatsvindt in belangrijke oncogenen of
tumorsuppressiegenen wordt de tumor initiatie gestart (Al-Sohaily et al., 2012).
1.1.3.1.3 Microsatelliet instabiliteit
Microsatellieten zijn kleine herhalingen van nucleotide sequenties en zijn verspreid over het gehele genoom.
Door hun repetitieve sequentie zijn ze gevoelig voor fouten gedurende de replicatie (Al-Sohaily et al., 2012).
Microsatellieten zijn polymorf tussen individuen, maar zijn voor elk individu uniek en uniform in lengte (Boland
& Goel, 2010).
Fouten tijdens de replicatie worden herkend door het ‘DNA mismatch repair’ (MMR) systeem, dit zal fouten in
basepaarcombinaties herstellen. Een instabiliteit van de microsatellieten is het gevolg van de onmogelijkheid
van het MMR systeem om deze fouten te corrigeren. Overerfbare fouten in MMR genen resulteren in HNPCC
(Al-Sohaily et al., 2012). Deletiemutaties in deze sequenties vinden vaak plaats in genen die een rol spelen
als regulatoren van de celproliferatie (Boland & Goel, 2010) en kunnen een inactief genproduct veroorzaken
(Markowitz et al., 1995).
1.1.3.1.4 ‘CpG Eiland methylator phenotype pathway’
Bij dit moleculair principe treden er geen mutaties op, maar epigenetische veranderingen die de genexpressie
of functie kunnen veranderen zonder de DNA sequentie van een gen te wijzigen. Bij mensen worden deze
19
veranderingen hoofdzakelijk veroorzaakt door DNA-methylatie of histonenmodificatie. Methylatie van een
promotorgen kan resulteren in ‘silencing’ van dit gen en biedt zo een alternatief mechanisme voor het verlies
van functie van een tumorsuppressiegen (Al-Sohaily et al., 2012). Het fenomeen van methylatie neemt toe bij
ouder worden, en ook als adaptieve respons op chronische inflammatie (Boland & Goel, 2010).
1.1.3.1.5 Erfelijke vormen
De ontwikkeling van CRC vereist op zijn minst zeven genetische gebeurtenissen voordat een invasieve tumor
ontstaat. Wanneer mutaties in genen worden overgeërfd, maakt dit het individu gevoeliger voor het
ontwikkelen van kanker. Dit wordt gezien bij twee verschillende syndromen, het eerste is het “Familiale
Adenomateuze Polyposis” (FAP) met een mutatie in het adenomateuze polyposis coli gen APC, gelegen op
chromosoom 5 (Vogelstein & Kinzler, 1993). Het tweede syndroom is het “Hereditary Nonpolyposis Colorectal
Cancer” (HNPCC), waarbij door een erfelijk defect in het ‘DNA mismatch repair’ mechanisme de controle op
mutaties niet meer correct kan doorgaan (Kinzler & Vogelstein, 1996).
1.1.3.1.6 Invasie en metastasen
Kwaadaardige tumoren worden gekenmerkt door hun mogelijkheid invasief en metastatisch te groeien. Hierbij
slagen de tumorale cellen erin zich los te maken van hun primaire plaats, binnen te dringen in bloed –of
lymfevaten en zich te verspreiden en te vestigen op andere plaatsen in het lichaam. Om dit te kunnen doen
zullen tumorcellen dedifferentiëren naar een mesenchymaal-achtig fenotype, dit proces wordt ook ‘epitheliale
mesenchymale transitie’ (EMT) genoemd. Metastatische tumoren vertonen echter nog steeds morfologische
kenmerken van de primaire tumor, dit impliceert dat ze na vestiging op een andere plaats in het lichaam
opnieuw zullen differentiëren, dit is de ‘mesenchymale epitheliale transitie’ (MET) (Al-Sohaily et al., 2012).
1.1.3.2 Effecten van haem
Zoals reeds eerder aangehaald is de hypothese van haem-geïnduceerde schade de meest waarschijnlijke.
Deze baseert zich op het katalytisch effect van de haemmolecule op de vorming van zowel NOC’s, als
eindproducten van de vetperoxidatie. Diëtair haem wordt slecht geabsorbeerd in de dunne darmen, hierdoor
komt ongeveer 90 % in het colon terecht, waar het fungeert als groeifactor voor bacteriën (Ijssennagger et al.,
2012).
Er zijn drie mechanistische hypotheses die de promotie van CRC door haem ondersteunen (figuur 11):
- Katalystisch effect van het haemijzer op de endogene vorming van NOC’s,
- Katalystisch effect van haemijzer op de vetperoxidatie (Bastide et al., 2011),
- Metabolisatie van haem in de darm naar een cytotoxische factor (Sesink et al., 1999).
20
1.1.3.2.1 N-nitrosocomponenten
Tijdens de voedselconsumptie kunnen mensen blootgesteld worden aan NOC’s van zowel exogene als
endogene origine (Cross & Sinha, 2004; Jagerstad & Skog, 2005).
1.1.3.2.1.1 Exogene blootstelling
Met hitte behandelde vleesproducten bevatten vaak NOC’s, waarvan de belangrijkste groep de volatiele N-
nitrosamines zijn. Twee van deze volatiele N-nitrosamines zijn door IARC geclassificeerd als potentieel
carcinogeen voor de mens (Demeyer et al., 2015). Voedingsbronnen, en dan voornamelijk verwerkt en verhit
vlees, zijn verantwoordelijk voor ongeveer 70 % van de humane exogene blootstelling (Tricker & Preussmann,
1991; Tricker, 1997; Jakszyn et al., 2004).
Fig. 11: Schematische voorstelling van de mechanismen van de ontwikkeling van CRC. Nitraat en nitriet in
vlees worden gemetaboliseerd naar NO (dit proces kan zowel in het vlees als in de mond plaatsvinden), die
op hun beurt kunnen interageren met amines tot de vorming van NOC’s. Haemijzer kan ook interageren met
polyonverzadigde vetten in de darm, resulterend in ROS, die DNA kunnen beschadigen (Oostindjer et al.,
2014).
21
1.1.3.2.1.2 Endogene productie
Endogene productie maakt 45 – 75 % van de totale blootstelling aan NOC’s uit (Tricker, 1997). Belangrijk
hierbij zijn de secundaire amines en andere nitroseerbare precursoren, zoals een aantal essentiële proteïnen
en sporenelementen, in de voeding (De Kok & van Maanen, 2000). Deze endogene productie kan verlopen
via verschillende mechanismen, zo kan ze gekatalyseerd worden door een zuur milieu of doorgaan in het
colon onder invloed van bacteriën (Cross & Sinha, 2004).
De katalysatie door zuur milieu vindt voornamelijk plaats in de maag, het proces begint reeds bij de opname
van de voeding in de mond. Ongeveer 5 % van het exogeen nitraat wordt ter hoogte van de dunne darmen
opgenomen, zal recirculeren naar het speeksel en wordt door orale bacteriën gereduceerd tot nitriet.
Vervolgens wordt het in het speeksel gevormde nitriet omgezet naar het nitroserend agens: ‘nitrous acid’
(Spiegelhalder et al., 1976; De Kok & van Maanen, 2000). Dit proces van endogene vorming van NOC wordt
echter als minimaal beschouwd en is dus van ondergeschikt belang (Pignatelli et al., 1993).
In de dunne en dikke darm is de pH te hoog en kan voorgaand proces niet doorgaan. Onder deze
omstandigheden zal er een biologische katalyse optreden door bacteriële groei (Demeyer et al., 2015).
Onderzoek van Massey et al. (1988) ondersteunt deze hypothese, doordat er bij kiemvrije ratten geen
omvorming gebeurde van nitraat naar NOC. Ook onderzoek van Vanden Bussche et al. (2014) toonde aan
dat de aanwezigheid van een actieve microbiota essentieel is voor de endogene alkylatie, aangezien er bij
geautoclaveerde fecale inocula geen DNA-adducten konden gevormd worden. Intestinale vorming van NOCs
is afhankelijk van de opname van nitraat en de capaciteit van de microbiota om nitraat te reduceren tot nitriet
(Engemann et al., 2013).
Verwerkt rood vlees bevat residueel nitriet dat kan bijdragen tot de vorming van NOC’s. Bovendien kan haem
aanwezig in rood en verwerkt vlees ook bijdragen bij deze endogene productie van NOC’s (Demeyer et al.,
2015).
Eenmaal blootgesteld aan de reducerende omstandigheden in de dunne en dikke darm wordt de
haemmolecule wordt snel genitrosyleerd en vanaf dan heeft het de mogelijkheid zelf te functioneren als een
nitrosylerend agens. Op die manier wordt de vorming van N-nitrosocomponenten gepromoot. Deze worden
ook wel “Apparant Total N-nitroso Compounds” (ATNC) genoemd en een aantal hiervan zijn gekende of
verdachte carcinogenen, omdat ze het DNA kunnen alkyleren (Kuhnle & Bingham, 2007; Bastide et al., 2011).
Vermoedelijk is deze DNA-alkylatie voornamelijk het effect van N-alkyl-N-nitroso componenten, die zorgen
voor de transitie van guanine-cytosine (GC), naar adenine-thymine (AT). Deze transities worden vaak
aangetroffen in genen die gemuteerd zijn bij CRC, waaronder het RAS gen (Kuhnle et al., 2007).
Bovendien kan de nitrosylering van aminozuren, zoals glycine, leiden tot het ontstaan van onmiddellijk actieve
componenten, zoals diazoacetaat, die kunnen reageren met DNA in vivo. Dit resulteert in de vorming van een
N-nitroso-component specifiek adduct, namelijk O6-carboxymethyl-2’-deoxy-guanosine (O6-CMeG). Dit adduct
wordt niet hersteld door O6-alkylguanine-transferase en kan zich dus opstapelen in het cellulair DNA van het
gastrointestinaal stelsel. Dit kan worden gezien als een promutagene laesie en is verhoogd aanwezig in
coloncellen die geïsoleerd werden bij humane vrijwilligers die rood vlees gegeten hadden. Er kan een correlatie
gezien worden tussen het aantal gevonden adducten en het fecaal gehalte aan ATNC (Lewin et al., 2006;
Kuhnle et al., 2007; Bastide et al., 2011; Vanden Bussche et al., 2014).
22
1.1.3.2.2 Oxidatieve schade aan DNA
Haem kan de oxidatie van polyonverzadigde vetzuren in de celmembranen veroorzaken. De residuen van
deze vetzuren in fosfolipiden zijn heel gevoelig aan oxidatie. Dit proces wordt geïnitieerd door vrije radicalen
die de membraanlipiden gaan aanvallen, waarbij de heemmolecule fungeert als katalysator.
LOOH (lipide hydroperoxide) + Fe-ligand (heem) LOOFe liganden LO° (lipide alkoxy radicaal) + °OFe
liganden (heem oxiradicaal)
Initieel worden er lipidenperoxiden gevormd, deze zijn echter maar vrij kortlevend en worden ofwel
gereduceerd door glutathion peroxidase tot niet-reactieve vetzuuralcoholen, ofwel reageren ze met metalen
wat aanleiding geeft tot het ontstaan van reactieve aldehyden, die ofwel direct met DNA en proteïnen reageren,
ofwel verdere oxidatie ondergaan tot meer reactieve epoxiden. In de groep van deze reactieve aldehyden zijn
malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenal de belangrijkste. Deze diëtaire vetperoxidatieproducten zijn
risicofactoren voor verschillende humane ziekten, waaronder ook het ontstaan van colonkanker (Marnett,
2000; Bartsch & Nair, 2004; Bastide et al., 2011). De hoogste waarden van deze aldehyden worden
aangetroffen voor de colondigestie (Vanden Bussche et al., 2014).
• Malondialdehyde (figuur 12)
Deze molecule ontstaat na oxidatie van polyonverzadigde vetzuren met twee of meerdere dubbele bindingen.
Malondialdehyde (MDA) induceert DNA-schade en is aldus mutageen voor bacteriële, zoogdier -en humane
cellen. De schade ontstaat doordat MDA reageert met DNA en zo adducten vormt met deoxyguanosine,
deoxyadenosine en deoxycytidine.
Het belangrijkste DNA adduct dat gevormd wordt is het 1,N²-malondialdehyde-deoxyguanosine (M1dG). Dit
werd gedetecteerd in colorectale biopten van personen met normale mucosae. Het aantal van deze adducten
wordt beïnvloed door het voedingspatroon en de levensstijl. Bovendien hebben mensen met adenomen een
hoger M1dG gehalte vergeleken met mensen zonder. Belangrijk bij de productie van MDA is de totale
vetinhoud van het vlees, aangezien dit een peroxidatieproduct van polyonverzadigde vetzuren is (Bastide et
al., 2011; Vanden Bussche et al., 2014).
Fig. 12: Structuurformule van malondialdehyde (IARC, 2015).
23
• 4-hydroxynonenal (figuur 13)
In tegenstelling tot MDA is 4-hydroxynonenal (4-HNE) slechts zwak mutageen, maar toch blijkt het het
belangrijkste toxische product van de vetperoxidatie te zijn. Het oefent zijn belangrijkste effecten uit op de
signaaltransductie, maar lijkt onafhankelijk te zijn van DNA-schade (Baradat et al., 2011; Bastide et al., 2011).
1.1.3.2.3 Metabolisatie van haem in de darm tot een cytotoxische factor
Een laatste hypothese is het direct effect van haem (of 1 van zijn metabolieten) op coloncellen, waarbij dit
zorgt voor een toegenomen epitheliale proliferatie in de colonmucosa, ook het resulterende fecaal water lijkt
toxisch te zijn. Hyperproliferatie van colonepitheel wordt gezien als een compensatie voor cytotoxicteit (Sesink
et al., 1999). Bovendien toonden ratten, gevoederd met hemine, minder afgeschilferd DNA in de feces dan de
controledieren, dit wijst erop dat hemine de celdifferentiatie en exfoliatie van colonocyten in het darmlumen
vermindert (Demeyer et al., 2015).
1.2 Metabolomics
1.2.1 Het metaboloom
Het metaboloom, het finale product van het genoom, wordt gedefinieerd als de totale kwantitatieve
verzameling van moleculen met een laag moleculair gewicht, meer bepaald metabolieten, aanwezig in een cel
of organisme, dat deelneemt in de metabole reacties die vereist zijn voor groei, onderhoud en normale functie
van het lichaam (Dunn et al., 2005). Het metaboloom bestaat dus uit een collectie van duizenden kleine
moleculen, die chemische transformaties ondergaan tijdens de stofwisseling en worden beïnvloed door elk
aspect van de celfunctie (Hounoum et al., 2016).
Het humaan metaboloom bestaat uit twee delen en wordt beïnvloed door het dieet. Het voedingsmetaboloom
wordt rechtstreeks afgeleid van de digestie en biotransformatie van voeding en zijn componenten, dit zijn meer
dan 25 000 metabolieten. Dit voedingsmetaboloom is extreem complex en de compositie ervan kan variëren
naargelang het dieet. Een andere component van het humane metaboloom is het endogeen metaboloom, dit
omvat alle metabolieten die afkomstig zijn van de gastheer (Scalbert et al., 2014). De metabolieten zijn dus
heel nauw verwant met het fenotype van de onderzochte persoon (Ellis et al., 2007; Hounoum et al., 2016).
Fig. 13: Structuurformule 4-hydroxynonenal (Wishart et al., 2013).
24
Dit metaboloom biedt een grote bron van mogelijke diëtaire biomerkers die kunnen gebruikt worden om de
diëtaire blootstelling in detail weer te geven. Zo kan een gedetailleerde karakterisatie van het
voedingsmetaboloom zorgen voor een accurate monitoring van diëtaire blootstelling en ook voor de
identificatie van voeding die het ziekterisico beïnvloedt in klinische en epidemiologische studies (Scalbert et
al., 2014). De metabolieten kunnen met behulp van verschillende analytische platforms met uitstekende
nauwkeurigheid en precisie uit complexe biologische systemen gehaald worden (Ellis et al., 2007; Hounoum
et al., 2016).
1.2.2 Metabolomics
‘Metabolomics’ is het geheel van technieken die gebruikt worden om metabolieten in kaart te brengen. Op die
manier kan men essentiële informatie verkrijgen over de cellulaire biochemie. Zo kunnen metabolieten van
verschillende schijnbaar niet verwante biochemische processen elkaar beïnvloeden door middel van
pleiotropie. Om deze effecten te kunnen begrijpen is een analyse noodzakelijk waarbij alle metabolieten in
een biologisch systeem geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. Zo een aanpak onthult het volledige
metaboloom van het biologisch systeem en wordt ook wel ‘metabolomics’ genoemd (Fiehn, 2002; Weckwerth
& Morgenthal, 2005; Dunn et al., 2005).
‘Metabolomics’ kan verder worden opgesplitst in meerdere takken, waarvan de eerste de ‘target analysis’ is,
dit is een kwantitatieve benadering van één of enkele metabolieten, die specifiek gerelateerd zijn aan een
bepaald metabolisch principe (Fiehn, 2002; Dunn et al., 2005).
Wanneer metabolieten geïdentificeerd en gekwantificeerd worden op basis van hun gelijkende chemische
eigenschappen of metabole principes, dan spreekt men van ‘metabolite profiling’ (Dunn et al., 2005). Meestal
maakt men hierbij gebruik van een aantal vooraf bepaalde metabolieten in een biologisch staal (Fiehn, 2002).
Een laatste categorie is de ‘metabolic fingerprinting’, hierbij worden de stalen geclassificeerd op basis van hun
origine of biologische relevantie (Fiehn, 2002), er treedt geen identificatie en kwalificatie op (Dunn et al., 2005).
1.2.2.2 Gebruikte technieken
1.2.2.2.1 Nucleaire magnetische resonantie
Eén van de eerste technieken gebruikt voor ‘metabolomics’ is de “Nucleaire Magnetische Resonantie” (NMR)
spectroscopie. Deze techniek kan voor veel stalen gebruikt worden, aangezien de meeste elementen minstens
één isotoop bezitten met een magnetisch spin nummer groter dan nul, dit is immers essentieel voor de werking
van NMR (Ellis et al., 2007). Kernen met een oneven aantal protonen of neutronen bezitten intrinsieke
magnetische eigenschappen (Nixon et al). De meest gevoelige NMR-techniek, welke nog steeds een vrij lage
gevoeligheid heeft, maakt gebruik van de 1H-kern, dit zijn enkelvoudige protonen en komen bij praktisch alle
chemische moleculen voor (Ellis et al., 2007).
Deze elektrisch geladen atomische kernen hebben kleine energieverschillen, die bepalen of ze parallel of
antiparallel bewegen bij aanleggen van een magnetisch veld (Sherry, 1984). Wanneer het staal in een
magnetisch veld met een radiofrequentie van het elektromagnetisch spectrum wordt geplaatst, dan zorgt de
straling voor een NMR transitie. Hierdoor zullen de kernen zich gaan alligneren en roteren zodat ze parallel
met dit magnetisch veld komen te liggen (Nixon et al., 1986, Ellis et al., 2007). Tijdens deze verandering van
spinstatus zullen de protonen een deel van de radiofrequentie energie absorberen.
25
Nuclei binnen dezelfde molecule, maar met een lichtjes verschillende omgeving vereisen een verschillende
energie voor de NMR transitie. Wanneer de magnetische puls verwijderd wordt, vallen te protonen terug naar
hun originele positie, waarbij ze een radiofrequentie signaal uitsturen. Op die manier worden karakteristieke
absorpties of resonanties geproduceerd en kan de moleculaire structuur bepaald worden (Sherry, 1984; Nixon
et al., 1986).
De betreffende straling beweegt snel door materiaal, waaronder zacht biologisch weefsel. Meestal brengt deze
straling een minimale opwarming van het staal teweeg, waardoor het kan gezien worden als een non-invasieve
analytische techniek (Dunn et al., 2005; Ellis et al., 2007). Bovendien is deze techniek heel gevoelig aan de
chemische omgeving waarin een component zich bevindt. Hierdoor wordt er in een mengsel met een grote
variëteit aan chemische componenten makkelijk een onderscheid gemaakt tussen de verschillende
componenten (Ellis et al., 2007).
1.2.2.2.2 Vloeistofchromatografie gekoppeld met massaspectrometrie
Een andere veelgebruikte techniek voor het uitvoeren van ‘metabolomics’ is de koppeling van
vloeistofchromatografie aan massaspectrometrie (LC-MS). Deze koppeling heeft meerdere voordelen, zoals
het grote aantal beschikbare instrumenten, gekoppeld aan ruime databases, net als het grote aantal
metabolieten die met deze techniek kunnen worden herkend. Dit zorgt ervoor dat men een vrij volledig beeld
krijgt van het effectieve metaboloom. Als laatste is deze techniek ook heel erg veelzijdig, zo kan een enkele
LC-MS combinatie gebruikt worden voor een groot aantal verschillende functies, met een minimum aan
modificaties (Gika et al., 2014).
1.2.2.2.2.1 “Ultra hoge prestatie vloeistofchromatografie”
“High Performance Liquid” Chromatografie (HPLC) is een methode die in staat is gecompliceerde mengsels
met componenten van verschillend moleculair gewicht te scheiden. Bovendien kan het ook moleculen met
verschillende polariteiten en zuur-base eigenschappen scheiden in verschillende matrices. Een groot nadeel
van deze techniek is dat er ofwel tijd ofwel resolutie moet opgeofferd worden. Biologische stalen zijn echter
vaak vrij complex en aanwezig in grote aantallen, waardoor deze scheiding met een hoge resolutie en
sensitiviteit, aan een hoge snelheid, moeten kunnen geanalyseerd worden. Daarom werden methodes
ontwikkeld die een snelle analyse konden uitvoeren, zonder dat dit gepaard gaat met een verlies aan efficiëntie
van de scheiding (Novakova & Vlckova, 2009).
Aan deze eisen wordt voldaan door de “Ultra High Performance Liquid” Chromatografie (UHPLC), waarbij
gebruik wordt gemaakt van sub-2-micron partikels in ultra hoge druksystemen. Daarom wordt ook wel eens
“Ultra High Pressure Liquid” Chromatografie als synoniem gebruikt. Het gebruik van kleine partikels is de beste
oplossing om de chromatografische prestaties te verbeteren (Novakova & Vlckova, 2009; Rainville et al.,
2014).
Het gebruik van deze techniek resulteert in een accurater metabolisch profiel, gecombineerd met een
toegenomen resolutie (meer discrete pieken per scheiding), betere sensitiviteit en verminderde
ionensuppressie. Deze voordelen maken het mogelijk om in eenzelfde analysetijd significant meer analyten in
een staal te detecteren (Rainville et al., 2014).
26
De laatste tijd is UHPLC een veel gebruikte analytische techniek, bruikbaar voor heel veel verschillende
doeleinden. De techniek kan toegepast worden voor farmaceutische analyses, proteomics, metabolomics en
analyses van voeding, omgeving en planten (Novakova & Vlckova, 2009).
1.2.2.2.2.2 Hoge resolutie massaspectrometrie
Een belangrijke techniek bij metabolomics is massaspectrometrie (MS), deze biedt een uitstekende
gevoeligheid en heeft bovendien de mogelijkheid verschillende honderden metabolieten te detecteren in één
enkele analyse (Ellis et al., 2007). Het is een complexe techniek die gebruikt wordt voor de identificatie en
kwantificatie van biologische en chemische entiteiten en is gebaseerd op het meten van massa.
Het moleculair gewicht van intacte metabolieten is gecorreleerd aan de elementaire samenstelling en wordt
experimenteel bepaald. De werking van een MS toestel volgt steeds een vast patroon. Het begint met de
introductie van een staal, gevolgd door de vorming van ionen in een ionenbron. Daarna gebeurt de scheiding
van de ionen op basis van hun massa/lading-verhouding (m/z), deze stap vindt plaats in een massa analysator.
Tenslotte worden de ionen gedetecteerd. Door de hoge sensitiviteit van deze techniek kunnen metabolieten
aan fysiologische concentraties gedetecteerd worden. Bovendien kunnen door de hoge selectiviteit
metabolieten in complexe biologische systemen specifiek gedetecteerd worden en kan er zowel een
confirmatie als identificatie van deze metabolieten gebeuren. Dit is allemaal mogelijk zonder een dure
voorbehandeling van de stalen, de voorbehandeling is echter wel complexer dan bij NMR. De selectiviteit kan
nog verhoogd worden door gebruik van een tandem MS, dit zijn twee massaspectrometers die met elkaar
gekoppeld zijn (Ellis et al., 2007; Römpp & Spengler, 2013; Hounoum et al., 2016).
Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) heeft een hogere accuraatheid dan de gewone
massaspectrometrie. Dit komt doordat de HRMS efficiënter kan centreren en zorgen voor deconvolutie van
piekprofielen (Hounoum et al., 2016).
HRMS maakt een accurate massa meting mogelijk met een hoog oplossend vermogen. De belangrijkste
HRMS technieken zijn “time-of-light” massa spectrometrie en “Orbitrap Fourier-transform”
massaspectrometrie. Beide technieken kunnen een component of een fragment vrij nauwkeurig bepalen zodat
de elementaire samenstelling onmiddellijk kan bepaald worden. Accurate massa en isotooppatronen werken
als filter voor confirmatie van de identiteit van een component of zelfs identificatie van een ongekende
component (Ojanpera et al., 2012; Junot et al., 2014). Het voordeel van een Orbitrap is dat het bij een lage
ratio reeds een hoge resolutie biedt. Het nadeel is echter dat het langer duurt voor de dataverzameling
compleet is (Hounoum et al., 2016). Deze techniek biedt een accurate massameting, met fouten van sub-ppm
grootte. Door discriminatie tussen isobare componenten verbetert HRMS de detectie van metabolieten, maar
ook de identificatie of structurele karakterisatie van de metabolieten is mogelijk (Junot et al., 2014).
1.2.3 Het gebruik van metabolomics voor de relatie dieet-gezondheid
Het gebruik van metabolomics is een techniek om de positieve en negatieve gevolgen van bepaalde voeding
of een bepaald dieet te evalueren. Ook kan deze techniek gebruikt worden om bepaalde voedingspatronen te
analyseren, bijvoorbeeld het Westers voedingspatroon, dat vrij veel vlees bevat (Kim et al., 2015).
27
Metabolomics kan helpen de interactie tussen nutriënten en het humaan metabolisme op te helderen.
Bovendien wordt het effect van het genoom en het darmmicrobioom op de algemene gezondheid van de mens
nagegaan (McNiven et al., 2011).
Verschillende studies zijn erin geslaagd biomerkers te identificeren die geassocieerd zijn met de opname van
bepaalde voedingselementen. Deze studies hebben ook aangetoond dat bepaalde voedingselementen of
patronen een significant effect hebben op bepaalde aspecten van de stofwisseling, zoals het aminozuur –en
lipidenmetabolisme, met invloed op de gezondheid van de mens.
Zo werd er aangetoond dat het dieet gepaard gaat met bepaalde ziektes, waarbij metabolomics kan gebruikt
worden om de metabolische verandering, geassocieerd met deze voedingsgerelateerde aandoening aan te
tonen. Metabolomics kan gebruikt worden om te controleren of een dieetinterventie het beoogde effect heeft
(Kim et al., 2015). Er kan ook nagegaan worden of een patiënt lijdt aan een deficiëntie.
Het metaboloom geeft een accurate weergave van de inwendige processen, waardoor heel snel
veranderingen kunnen opgemerkt worden. Op die manier kunnen overgangen van anabolisme naar
katabolisme of reacties op bepaalde stimuli snel gedetecteerd worden. Sommige elementen van het
metaboloom zullen echter meer gradueel veranderen, wat het begin van een ziekte kan reflecteren. Als laatste
zijn er ook bepaalde elementen in het profiel van de gastheer die gedurende het verloop van weken of soms
zelfs jaren constant blijven. Deze constante is te wijten aan de genetische samenstelling, levensstijl en
omgeving. De invloed van de omgeving kan zelfs aanleiding geven tot regionale metabolische fenotypes
(McNiven et al., 2011).
1.3 Rol van de gastro-intestinale microbiota
1.3.1 Verteringssimulaties
Onderzoek naar de in vivo digestie bij mensen bestaat uit een voedingsstudie en de verzameling van een
reeks stalen.
Fig. 14: Schematische voorstelling van de volledige digestietractus (Guerra et al., 2012).
28
Deze digestiestalen worden via nasogastrische of nasoduodenale aspiratie gepreleveerd uit de maag of dunne
darm. Het meer distale deel van de dunne darm is ontoegankelijk voor staalname, de eerstvolgende plaats
waar opnieuw stalen verzameld kunnen worden is het terminale ileum, in geval van ileostomie, of via de feces
(Wickham et al., 2009). Via in vivo interventiestudies, bij mensen of dieren, kunnen de meest accurate
gegevens verzameld worden, maar deze zijn tijdrovend en duur. Daarom werden in vitro procedures
ontwikkeld, een handig alternatief om voedingsmiddelen te screenen. Hierbij test men structurele en
chemische veranderingen van de voeding onder gesimuleerde gastrointestinale (GI) condities (Hur et al.,
2011).
1.3.1.1 Statische verteringssimulaties
Bij de statische of biochemische modellen blijven de finale digestieproducten gedurende het volledige
digestieproces aanwezig in hetzelfde recipiënt en worden geen andere fysische bewegingen zoals verkleinen,
mixen, daling van de maag pH en absorptieprocessen toegepast (Wickham et al., 2009; Guerra et al., 2012;
Minekus et al., 2014).
Deze statische modellen zijn niet in staat de dynamische veranderingen die optreden tijdens de digestie na te
bootsen (Nguyen et al., 2015). Ze worden voornamelijk gebruikt bij gelimiteerde digesties, om bijvoorbeeld
enkel de maagdigestie na te bootsen. Ze zijn minder bruikbaar voor volledige digestiestudies (Wickham et al.,
2009). Veel van deze modellen zijn vrij eenvoudig en bestaan uit de homogenisatie van voeding, verzuring
met HCl en toevoegen van de maagenzymen. Dit wordt gevolgd door een variabele incubatieperiode, wat
overeenkomt met het verblijf in de maag, vervolgens gebeurt er een neutralisatie met bicarbonaat en hydroxide
gecombineerd met de toevoeging van pancreasenzymen en galzouten. Gedurende het volledige proces wordt
er steeds gemengd en een temperatuur van 37 °C nagestreefd (Wickham et al., 2009).
Het grootste nadeel van deze statische modellen is dat de dynamische digestieprocessen zoals maaglediging,
peristaltische bewegingen, pH veranderingen in de maag, de secretie van enzymen en vocht tijdens de
digestie niet kunnen nabootsen. Wanneer de volledige digestietractus moet bestudeerd worden, maakt men
bijgevolg meestal gebruik van dynamische digestieprocessen (figuur 14) (Guerra et al., 2012).
Een statische benadering van de dikke darmfermentatie wordt gegeven door de ‘batch fermentatie’. Hierbij is
er groei van een bacteriële suspensie in een zorgvuldig geselecteerd medium, zonder verdere toediening van
nutriënten. Vaak wordt hier gebruik gemaakt van gesloten systemen die de suspensies van fecaal materiaal
bevatten en dit onder anaërobe condities houden. ‘Batch fermentaties’ worden voornamelijk gebruikt voor het
onderzoek naar metabole profielen van korte keten vetzuren, die ontstaan door actieve metabolisatie van
diëtaire componenten door de darmmicrobiota. Deze systemen zijn makkelijk in gebruik en goedkoop, zo
kunnen een grote hoeveelheid stalen snel getest worden (Payne et al., 2008).
1.3.1.2 Dynamische verteringssimulaties
Verschillende in vitro modellen worden gebruikt om de vertering na te bootsen, onder andere TIM-1, TIM-2 en
“Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem” (SHIME)
TIM-1 (TNA gastrointestinaal model 1) stelt het gastrointestinaal stelsel voor met 1 component die dienst doet
als maag, 3 componenten als dunne darm, meer bepaald duodenum, jejunum en ileum, en tot slot nog 1
component die de dikke darm voorstelt. Het hele systeem wordt gecontroleerd door een computer en houdt
rekening met de belangrijkste parameters tijdens de digestie, zoals humane temperatuur, pH-veranderingen
29
in de maag, de automatische secretie van maag –en pancreassap, transittijd (figuur 14), peristaltische
beweging en de absorptie van nutriënten ter hoogte van de darm (Guerra et al., 2012). Een nadeel van dit
systeem is dat het niet in staat is de microbiota te imiteren, om dit gebrek weg te werken werd TIM-2 ontwikkeld
uit TIM-1. Deze bevat nog andere belangrijke functies zoals de absorptie van water en metabolieten in de
dikke darm (Payne et al., 2012; Nguyen et al., 2015). TIM-2 bestaat uit vier glazen eenheden met een flexibele
binnenwand die peristaltische beweging mogelijk maakt. Aldus simuleert dit systeem het proximaal colon.
Er wordt een temperatuur van 37 °C en anaeroob milieu gehandhaafd, dit laatste gebeurt door te spoelen met
N2. Er wordt gebruik gemaakt van een spoelvloeistof die in de reactor gepompt wordt doorheen holle vezels.
Fecesstalen van 10 gezonde volwassenen worden gemengd en dienen als inoculum, dit wordt snel ingevroren
in vloeibare N2 en bewaard aan een temperatuur van -80 °C. Aan de start van het experiment wordt 30 mL
van dit fecaal inoculum samengevoegd met 80 mL van een dubbel verdund “standard ileal efflux” medium
(SIEM). Er wordt steeds volgens een vast patroon gewerkt, beginnend met een stabilisatieperiode, zodat de
microbiota zich kan aanpassen aan de in vitro cultuur, dit duurt 16 uur. Vervolgens wordt de microbiota 2 uur
gevast, waarna er een behandelingsperiode van 3 dagen plaatsvindt (figuur 15) (Van den Abbeele et al.,
2013).
Fig. 15: Schematische voorstelling van TIM-2 (Van den Abbeele et al., 2013).
30
Een tweede veel gebruikt systeem is SHIME en bestaat uit vijf dubbelwandige vaten die de maag, dunne
darmen en drie colonregio’s voorstellen. Dit is één van de enige modellen die het gehele gastrointestinaal
stelsel nabootst (Van den Abbeele et al., 2013; Van de Wiele et al., 2015). Ook hier wordt een temperatuur
van 37 °C gehandhaafd en wordt er een anaeroob milieu gecreëerd door de bovenstaande ruimte te spoelen
met N2. De colonregio’s worden geïnoculeerd met een fecaal staal van een gezonde vrijwilliger (Van den
Abbeele et al., 2013). De nadruk ligt hier op simulatie van de microbiële samenstelling van het colon, daarom
wordt wegens interindividuele variatie geen gebruik gemaakt van mengstalen. Het systeem kan worden
aangepast naargelang de doelgroep (volwassenen, kinderen, verschillende diersoorten) (Van de Wiele et al.,
2015). Drie keer per dag wordt er 140 mL nutritioneel medium toegediend aan de maag en 60 mL pancreassap
aan de dunne darm. Een voordeel van dit systeem is dat de microbiota gedurende een langere periode
geobserveerd kan worden, dit in tegenstelling tot TIM-2. Analoog met TIM-2 wordt ook hier gebruik gemaakt
van verschillende stadia, beginnend met een stabilisatieperiode (2 weken), waarin de microbiota kan wennen
aan de omgevingsomstandigheden. Vervolgens komt de basale periode (2 weken), waarbij het systeem getest
wordt onder normale omstandigheden en de basis parameters gemeten worden. Daarna wordt het effect van
een specifieke behandeling op de microbiota van het gastrointestinaal stelsel nagegaan tijdens de
behandelingsperiode (2-4 weken). Als laatste volgt de “wash-out” periode (2 weken) waarin wordt onderzocht
hoe lang de geïnduceerde veranderingen blijven bestaan na stopzetten van de behandeling (figuur 16) (Van
de Wiele et al., 2015).
Aangezien de activiteit van een voorbereid enzymmengsel afneemt, is het belangrijk dit bij de aanvang van
een nieuwe studie telkens opnieuw te bereiden. Belangrijk bij een in vitro digestie zijn de karakteristieken van
het gebruikte enzym, welke worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals concentratie, temperatuur,
pH, stabiliteit, eventuele activatoren en inhibitoren.
De temperatuur tijdens de digestie bedraagt steeds 37°C en de digestietijd is afhankelijk van het onderzochte
staal. De digestietijd bij in vivo vertering is afhankelijk van zowel de individuele karakteristieken zoals leeftijd,
geslacht, gezondheidstoestand, mentale gezondheid en tijdstip, als van de karakteristieken van de voeding,
Fig. 16: Schematische voorstelling van SHIME (Van den Abbeele et al., 2013).
31
zoals de totale hoeveelheid, samenstelling en partikelgrootte. Deze digestietijd kan heel erg variëren, het is
bijgevolg belangrijk dat de in vitro digestie hierop afgesteld worden (Hur et al., 2011).
1.3.2 Verband tussen microbiota en het risico op CRC
De microbiota die de mucus net boven het epitheel van het colon koloniseert wordt het mucosaal microbioom
genoemd. Dit is een belangrijke component van het microbieel ecosysteem aangezien ze door hun nabijheid
bij het colonepitheel een rol kunnen spelen in de darmgezondheid, en bij uitbreiding ook de gezondheid van
het individu (Van de Wiele et al., 2015).
Door zijn gunstige eigenschappen, zoals een trage darmtransit, nutriëntenbeschikbaarheid en een optimale
pH is het colon de anatomische locatie met het hoogste aantal micro-organismen (figuur 17) (Payne et al.,
2012).
De aanwezige microbiota van het colon bevat een complexe mengeling van bacteriën, deze vertonen zowel
inter –als intra-individuele verschillen, bovendien kunnen ze zelfs in het colon van anatomische positie en
lokalisatie in het lumen verschillen (Vanden Bussche et al., 2014).
De microbiota van de dikke darm wordt gezien als een belangrijk metabolisch orgaan, met impact op zowel
ziekte als gezondheid. Hierbij vormen de enterische bacteriën een natuurlijke barrière, met tal van protectieve,
structurele en metabolische effecten op het epitheel (figuur 18).
Fig. 17: De bacteriële densiteit neemt toe in het jejunum en ileum en is maximaal in het colon. De meest
voorkomende genera worden opgesomd (O'Hara & Shanahan, 2006).
Fig. 18: Commensale bacteriën oefenen een heel gamma van beschermende, structurele en metabole
effecten uit op de intestinale mucosa (O'Hara & Shanahan, 2006).
32
De intestinale epitheliale celdifferentiatie –en proliferatie wordt beïnvloed door de vorming van korte keten
vetzuren door bacteriën (O'Hara & Shanahan, 2006). De microflora van het colon is voornamelijk
samengesteld uit bacteriën, maar bevat ook fungi en protozoa. Sommige bacteriën zijn schadelijk voor de
gastheer, terwijl andere dan net weer voordelig zijn. Wanneer het evenwicht tussen beide groepen verstoord
is, kan dit de bioactivatie van carcinogenen beïnvloeden, en op die manier ook het risico op kanker (Kim et al.,
2013).
De samenstelling van dit microbioom kan worden beïnvloed door het dieet, zo zal er bij muizen gevoederd
met een hoofdzakelijk Westers dieet, ook hoog in vetpercentage, en supplementatie met haemijzer, een
verschuiving zijn naar hogere aantallen Bacteroides en lagere aantallen Firmicutes. Deze verschuiving zou
voornamelijk veroorzaakt worden door een selectieve gevoeligheid van gram+ bacteriën aan de haemijzer
geïnduceerde cytotoxiciteit van fecaal water. Hierdoor kan er een selectieve groei van gram- kiemen
plaatsvinden. De veranderde samenstelling van de microbiota oefent echter geen invloed uit op de
hyperproliferatie en hyperplasie (Ijssennagger et al., 2012). Ook Maier et al. (1974) observeerden bij omnivore
fecale stalen een toename van Bacteroides, Bifidobacterium, E. coli en Enterobactericeae. In een onderzoek
van Sobhani et al. (2011) werd een duidelijke stijging gezien van de bacteriën Bacteroïdes en Prevotella bij
patiënten met CRC tegenover de gezonde controlegroep. Enkele van deze colonbacteriën, meer bepaald de
Lactobacilli en de Bifidobacteria spp. zijn in staat NO te produceren uit nitriet (Vanden Bussche et al., 2014).
De microbiota spelen een belangrijke rol in het ontstaan van de hyperproliferatie en hyperplasie, aangezien
dit proces niet meer doorgaat na toediening van antibiotica. Een verklaring hiervoor is dat antibiotica zorgen
voor een versterking van de mucus barrière, door de eliminatie van een subgroep bacteriën die
verantwoordelijk zijn voor de productie van sulfiden en de degradatie van mucine (Ijssennagger et al., 2015).
Zowel supplementatie met haemijzer als een dieet met hoog vetgehalte resulteren in een toename van
reactieve zuurstof species, gepaard met hogere MDA concentraties in de feces, indicatoren voor oxidatieve
stress. Deze bevindingen zijn sterk positief geassocieerd met E. coli en Enterococcus species en negatief
geassocieerd met Lactobacillus. Bij controlediëten werden net de omgekeerde fenomenen gezien (Qiao et al.,
2013; Ijssennagger et al., 2015). Diëten hoog in vet geven een daling in Bifidobacteria, deze zijn betrokken in
de productie van butyraat, een belangrijke antitumorale molecule (Vanden Bussche et al., 2014).
Deze verschuivingen in microbiota, geassocieerd met oxidatieve stress, zijn belangrijk aangezien Ijssennagger
et al. (2012), bij haem gesupplementeerde muizen, een toegenomen capaciteit tot nitraatreductie vaststelden
in de colonmicrobiota. Dit leunt aan bij bevindingen van Engemann et al. (2013) en Vanden Bussche et al.
(2014), waarbij haemijzer de vorming van NOC afgeleide DNA-adducten bevordert. Aldus is het mogelijk dat
de microbiële samenstelling een determinerende factor is in de productie van toxische NOC’s, door zijn nitraat
reducerende eigenschappen (Ijssennagger et al., 2015).
Veranderingen in deze microbiële samenstelling kunnen leiden tot veranderingen in de immuunrespons en zo
evolueren tot de ontwikkeling van pathologische toestanden (Belkaid & Hand, 2014). Zo is bewezen dat de
manipulatie van de intestinale microbiota de ontwikkeling van colitis geassocieerde CRC bij muizen in de hand
werkt (Uronis et al., 2009), terwijl de depletie van luminaal ijzer aanpassingen in de microbiota genereert,
waardoor de ontwikkeling van chronische ileïtis bij muizen kan worden tegengegaan (Werner et al., 2010).
33
2. DOEL VAN DE STUDIE
2.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte
Eerder onderzoek, verricht door Rombouts et al. (2016), toonde aan dat er verschillende metabolieten worden
gevormd bij de colondigestie van rood vlees, die bij de digestie van kip in significant lagere concentratie tot
afwezig zijn. In dit onderzoek werd bij twee proefpersonen met behulp van een “untargeted metabolomics”
methode gezocht naar metabolieten die specifiek geassocieerd zijn met de colondigestie van rood vlees in
vergelijking met kip. Als resultaat van deze studie werden 10 metabolieten weerhouden die significant hoger
waren bij de vertering van rund versus gevogelte. Twee van deze 10 metabolieten zijn hoogstwaarschijnlijk
acylcarnitines (metaboliet 1 en 7), waaronder 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) (tabel 6). Deze laatste kan
door transformatie in de lever worden omgevormd naar trimethylamine-N-oxide (TMAO), wat geassocieerd is
met atherosclerose (Koeth et al., 2013). Volgens Bae et al. (2014) kan deze stof ook betrokken zijn bij de
carcinogenese van colonkanker.
Tabel 6: De metabolieten met hun specifieke m/z ratio en retentietijden (Rombouts et al., 2016).
Ionisatiemodus m/z ratio (Da) Retentietijd (min)
1: 3-dehydroxycarnitine + 146.11738 1,58
2: Niet gekend + 160.13284 1,64
3: Niet gekend - 180.07907 1,02
4: Niet gekend + 239.13870 7,05
5: Niet gekend + 241.15411 2,08
6: Isoleucyl-hydroxyproline + 245.14875 1,59
7: Methylmalonylcarnitine + 262.12789 1,73
8: Niet gekend + 264.13223 1,55
9: Niet gekend + 344.24240 0,71
10: Niet gekend + 373.24396 0,96
Het eerste deel van deze studie diende ter validatie van de reeds behaalde resultaten van bovenvermeld
onderzoek door na te gaan of er bij meerdere proefpersonen (n = 6) van verschillende leeftijd en geslacht
vergelijkbare resultaten bekomen worden. Om dit te bewerkstelligen werd gebruik gemaakt van ‘targeted
metabolomics’, waarbij specifiek werd gezocht naar deze tien rood vlees geassocieerde metabolieten. De
vertering van kippenvlees werd gezien als een controlegroep voor de vertering van rundvlees.
2.2 Experiment vertering carnitine versus lysine
In voorgaand onderzoek werd met behulp van ‘untargeted metabolomics aangetoond dat er bij de vertering
van rood vlees hoogstwaarschijnlijk 2 acylcarnitines gevormd werden, namelijk 3-dehydroxycarnitine en
methylmalonylcarnitine. Deze werden significant minder gevormd bij de vertering van gevogelte.
In het tweede deel van deze studie werd nagegaan of deze acylcarnitines tijdens de vertering gevormd werden
vanuit de precursormolecule carnitine.
Voor zoogdiercellen is carnitine een essentiële component omdat het een sleutelrol speelt in de β-oxidatie.
Zijn primaire functie is namelijk het transporteren van lange keten vetzuren naar het cytosol van mitochondriën.
34
Carnitine komt vooral voor in vlees en melkproducten. Zo kan de hoogste concentratie carnitine gevonden
worden in het vlees van de kangaroo (6370 mg/kg DM), gevolgd door paardenvlees (4230 mg/kg DM),
rundvlees (1950 mg/kg DM) en varkensvlees (613 mg/kg DM). In het weefsel van gevogelte is er niet veel
carnitine aanwezig, namelijk een concentratie van 344 mg/kg DM. In vivo productie van carnitine kan gebeuren
uit de precursoren, lysine en methionine, dit zijn essentiële aminozuren (Seline & Johein, 2007). Gezien de
hoge concentratie carnitine in rood vlees is het waarschijnlijk dat er bij de vertering van rood vlees meer
acylcarnitines worden gevormd dan bij de digestie van gevogelte.
Lysine is een essentieel aminozuur en kan dus niet gesynthetiseerd worden in het lichaam, bijgevolg moet het
opgenomen worden met de voeding of voedingssupplementen. Vleesproducten zijn vaak rijk aan lysine, terwijl
granen vaak weinig lysine bevatten (Tomé & Bos, 2007; Rutherfurd & Moughan, 2007; Bertinato et al., 2016).
In dit experiment werd lysine gebruikt als controlegroep.
2.3 Metabolomics
Metabolomics kan ingedeeld worden in twee groepen naargelang men wel of geen voorkennis heeft van de
metabolieten die men wenst te bepalen, namelijk de ‘targeted metabolomics’ en de ‘untargeted metabolomics’.
Bij eerder onderzoek door Rombouts et al. (2016), alsook in dit onderzoek, werd gebruik gemaakt van
‘untargeted metabolomics’. Hierbij werd een globale benadering gebruikt waarbij zo veel mogelijk polaire tot
matig apolaire metabolieten gemeten worden binnen een bepaald bereik, die dan ondergebracht werden in
statistische modellen. Op die manier kunnen routinematig biologische stalen geanalyseerd worden, die
duizenden pieken genereren. Elk van deze pieken komt overeen met een gedetecteerd ion (afkomstig van
een metaboliet), met unieke massa-lading verhouding (m/z) en retentietijd. Op basis van deze eigenschappen
en de 12C/13C-isotoop kan de gevonden metaboliet geïdentificeerd worden.
Wanneer gebruik wordt gemaakt van een gedefinieerde set metabolieten spreekt met van ‘targeted
metabolomics’. Bij de keuze van de metabolieten wordt voornamelijk gefocust op één of meerdere pathways
van interesse (Patti et al., 2012). Deze methode werd gebruikt in het rood vlees-gevogelte onderzoek,
aangezien alleen op zoek werd gegaan naar de rood vlees geassocieerde metabolieten.
35
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1 In vitro digestie
3.1.1 Fecesstalen
In het eerste experiment (zie 1.1) werd de in vitro gastro-intestinale digestie van rundvlees en kip gesimuleerd.
Hiervoor werden verse fecesstalen verzameld bij 6 verschillende proefpersonen met een Westers dieet. Deze
mensen hadden bovendien geen antibioticagebruik gedurende de laatste 6 maanden. Proefpersoon 1 was
een man van 50 jaar, proefpersoon 2 een man van 25 jaar, proefpersoon 3 een vrouw van 52 jaar,
proefpersoon 4 een man van 53 jaar, proefpersoon 5 een man van 75 jaar en proefpersoon 6 een vrouw van
23 jaar. In totaal werden 6 digesties (kip in triplicaat en rund in triplicaat) per proefpersoon uitgevoerd. De
fecesstalen werden afgewogen en 60 g hiervan werd telkens verdund met 300 mL geautoclaveerd fecaal
inoculum buffer, bestaande uit K2HPO4 (4,4 g/ 500 mL), KH2PO4 (3,4 g/ 500 mL) en natriumthioglycolaat (0,5
g/ 500 mL). Nadien werd dit mengsel gedurende 10 minuten aan hoge intensiteit gehomogeniseerd met behulp
van een stomacher. Vervolgens werden de stalen gecentrifugeerd (500 g, 2 min), hiervan werd het
supernatans verzameld en 1 minuut gemengd (vortexen) met 20% glycerol, waarna de stalen werden
ingevroren bij -80°C.
Voor het uitvoeren van de digesties in het tweede experiment (zie 1.2) werd slechts het ingevroren fecaal
inoculum van proefpersoon 1 gebruikt, dit werd volgens dezelfde methode verkregen.
3.1.2 Vleesbereidingen
Voor de start van de incubatie werden er ook vleesbereidingen gemaakt. Voor het rundvlees werd gebruik
gemaakt van 3 kg diafragmaspier en bij kip 1 kg borstspier. Bij beide vleessoorten werd het vet verwijderd en
het vlees in kleine stukken van 1 à 2 cm3 gesneden. Vervolgens werd er 20% subcutaan varkensvet door
gemengd. De vleesbereidingen werden fijngemalen met behulp van een Omega T12, waarbij de eerste keer
een 10 mm plaat gebruikt werd, gevolgd door een 3,5 mm plaat. Daaropvolgend werd het vlees gelijkmatig
over 500 mL maatbekers verdeeld en, na het bereiken van een kerntemperatuur van 90 °C, 30 minuten verhit
in een warmwaterbad. Tenslotte werden de vleesbereidingen fijngemalen met een keukenrobot (Moulinex),
gealiquoteerd (70 g) en vacuüm verpakt.
3.1.3 Verteringssappen
De verteringssappen (speeksel, maagsap, duodenaalsap en galsap) bestaan uit een anorganische fractie
(tabel 7) en een organische fractie (tabel 8). De anorganische oplossingen kunnen ruim op voorhand
aangemaakt worden en dienen bewaard te worden in een koelkast. Een dag voor de incubatie werden de
organische oplossingen voorbereid en vermengd met de anorganische fractie. Deze finale verteringssappen
werden, met uitzondering van het duodenaalsap, geautoclaveerd. Pepsine (500 µL, aan een concentratie van
32 mg/100 mL) werd pas toegevoegd op de dag van de incubatie, dit simultaan met de toediening van
maagsap (figuur 19).
36
Tabel 7: Anorganische oplossing van de verschillende verteringssappen (op voorhand).
Speeksel Maagsap Duodenaalsap Galsap
20 mL KCl 31,4 mL NaCl 80 mL NaCl 60 mL NaCl
20 mL KSCN 6 mL NaH2PO4 80 mL NaHCO3 136,6 mL NaHCO3
20 mL NaH2PO4 18,4 mL KCl 20 mL KH2PO4 8,4 mL KCl
20 mL NaSO4 36 mL CaCl2.2H2O 12,6 mL KCl 1,3 mL HCl 37%
3,4 mL NaCl 20 mL NH4Cl 20 mL MgCl2
40 mL NaHCO3 13 mL HCl 37% 0,36 mL HCl 37%
Aanlengen met H2O tot 1000 mL
De dag voor de incubatie werd ook het fecaal inoculum gefinaliseerd, waarbij de eerder verwerkte fecale stalen
1/10de werden verdund met geautoclaveerd Brain Heart Infusion medium, bestaande uit Brain Heart Infusion
(37 g/L) en L-cysteïne (0,5 g/L). Deze fecale inocula werden nadien gedurende 1u gespoeld met N2 gas om
een anaeroob milieu te creëren, nodig voor de activiteit van de dikke darmflora. Uiteindelijk werden de fecale
inocula geïncubeerd gedurende 24u (37°C, 150 RPM) voor de verdere opkweek van de microbiota.
Tabel 8: Organische fractie van de verschillende verteringssappen (dag voor de incubatie).
Speeksel Maagsap Duodenaalsap Galsap
2 mL ureum (1,25 g in
50 mL H2O)
1,7 mL ureum (1,25 g in
50 mL H2O)
2 mL ureum (1,25 g in
50 mL H2O)
2,5 mL ureum (1,25 g in
50 mL H2O)
0,25 mL
lactoperoxidase (0,0016
g in 50 mL H2O)
0,3250 g glucose 0,0999 g CaCl2.2H2O 0,0555 g CaCl2.2H2O
0,0017 g NaNO2 0,0100 g glucuronzuur 0,5000 g BSA 0,4500 g BSA
0,0029 g urinezuur 0,1650 g glucosamine-
HCl
4,5000 g pancreatine 7,5000 g gal
0,0063 g mucine 0,0056 g FeSO4 0,7500 g lipase
0,0088 g ascorbinezuur
0,5000 g Bovine Serum
Albumin (BSA)
1,5000 g mucine
Aanlengen met H2O tot
125 mL
Aanlengen met H2O tot
250 mL
Aanlengen met H2O tot
250 mL
Aanlengen met H2O tot
125 mL
125 mL anorganische
oplossing toedienen
250 mL anorganische
oplossing toedienen
250 mL anorganische
oplossing toedienen
125 mL anorganische
oplossing toedienen
37
3.1.4 In vitro digestie
3.1.4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte
Bij het eerste experiment, betreffende de digestie van rood vlees en gevogelte, werd op de dag van de
incubatie 4,5 g vlees afgewogen. Vervolgens werd 6 mL speeksel, 12 mL maagsap, 10 µL H2O2 en 500 µL
pepsine (32 mg/100 mL) toegediend. Dit geheel werd gemixt (Ultraturax) en gedurende 2 uur geïncubeerd bij
37°C en stelt de passage door de maag voor. Hierna werd er 2 mL bicarbonaatoplossing (8,4 g/100 mL), 12
mL duodenaalsap en 6 mL galsap toegevoegd, gevolgd door opnieuw een 2 uur durende incubatie (37°C),
analoog met de passage doorheen de dunne darm. Tenslotte werd er 22 mL Simulator of the Human Intestinal
Microbial Ecosystem (SHIME) medium (tabel 9) en 22 mL fecaal inoculum toegevoegd waarna de eerste
staalnames (1 mL Eppendorf) gebeurden, representatief voor de dunne darmdigestie. De vaste fractie van het
SHIME-medium werd op voorhand aangemaakt en de dag voor de incubatie gemengd met 0,1 M fosfaatbuffer,
bestaande uit KH2PO4 (6,8 g/L) en K2HPO4 (8,8 g/L), waarna dit geheel geautoclaveerd en bewaard werd in
de koelkast. Na staalname werden de stalen gespoeld met N2 gedurende een half uur. Dit werd gevolgd door
een 48 uur durende incubatie (37°C, 150 RPM). Na deze incubatieperiode werden opnieuw stalen verzameld,
deze stellen de dikke darmdigestie voor (figuur 19). Drie replica’s per vleessoort werden geïnclineerd in de
studie. De stalen werden geanalyseerd met de UHPLC-Q-Orbitrap.
Figuur 19: Flowchart van de in vitro digestie.
38
Tabel 9: Vaste fractie SHIME medium.
Component g/L
Arabinogalactan 1
Gist extract 3
Glucose 0,4
L-cysteïne 0,5
Mucine 4
Pectine 2
Pepton 1
Xylaan 1
Aardappel zetmeel 4
3.1.4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine
Bij het tweede experiment, dit met carnitine, werden verschillende concentraties carnitine (aangekocht bij
Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA; C0158-1G; zuiverheid > 98%) en lysine toegevoegd aan 900 mg
varkensvet (20 % varkensvet voor 4,5 g vlees), dit varkensvet werd toegevoegd om te normaliseren voor
vetpercentage en komt overeen met het percentage dat ook in het eerste experiment gebruikt werd. Er werd
een verdunningsreeks gebruikt in de studie, met 3 verdunningen in triplicaat, van zowel carnitine als lysine.
Als referentie werd het vlees van de schouder van het rund gebruikt. Dit vlees bevat 1390 mg carnitine per kg
droog gewicht (Seline & Johein, 2007), dit correspondeert met 5 mg carnitine voor 3,6 g rood vlees. Als
alternatief voor gevogelte werd gebruik gemaakt van 0,5 mg carnitine voor 3,6 g vlees. Telkens werd dezelfde
concentratie lysine toegevoegd aan de controlegroepen van carnitine.
Een stockoplossing van carnitine en van lysine werden gemaakt, elk aan een concentratie van 5 mg aminozuur
per mL. Deze stockoplossingen werden gebruikt voor het aanmaken van de verdunningsreeksen, waarvan
telkens 1 mL werd toegediend aan de corresponderende potjes (tabel 10). Aan groep 1 en 2 werden
respectievelijk 100 % lysine-stockoplossing en 100 % carnitine-stockoplossing toegevoegd, dit komt neer op
5 mg aminozuur per potje. Voor groep 3 en 4 werd de stockoplossing verdund, waardoor er respectievelijk 0,5
mg lysine en carnitine aanwezig was per potje. Hiervoor moest de stockoplossing 10 x verdund worden. Aldus
werd 400 µL onverdunde stockoplossing samengevoegd met 3600 µL gedestilleerd water. Aan groep 5, die
kan gezien worden als de algemene controlegroep, werd uiteindelijk 100 % gedestilleerd water toegediend
(tabel 10).
Tabel 10: Verdunningsreeks carnitine-lysine.
Groep Verdunningsreeks Concentratie
Groep 1 5 mg lysine 1 mL van 100 % stockoplossing (5 mg/mL lysine)
Groep 2 5 mg carnitine 1 mL van 100 % stockoplossing (5 mg/mL carnitine)
Groep 3 0,5 mg lysine 1 mL van verdunde stockoplossing (400 uL onverdund lysine
+ 3600 uL gedestilleerd water)
Groep 4 0,5 mg carnitine 1 mL van verdunde stockoplossing (400 uL onverdund
carnitine + 3600 uL gedestilleerd water)
Groep 5 Geen aminozuren 1 mL gedestilleerd water
39
3.2 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS
3.2.1 Staalvoorbereiding
Voorafgaand aan de extractie werd aan de stalen 20 µL interne standaard (25ng/µL D-valine-d8, Sigma
Aldrich) toegevoegd, waarna ze gecentrifugeerd werden (13300 RPM, 5 min). Het supernatans werd
vervolgens gefilterd doorheen een Polyvinylideen Fluoride Membraan (PVDF filter (0,22 µL)) en in een nieuwe
eppendorf gebracht. Het filtraat werd vervolgens 1/5de verdund met ultrapuur (UP) water en overgebracht
naar een LC-MS vial.
Er werd ook gebruik gemaakt van kwaliteitscontrole door het supernatans van alle stalen te poolen en deze
1/5de te verdunnen met UP water (= QC stalen). Ook deze stalen werden overgebracht in een LC-MS vial en
meegenomen in de analyse. De methode die werd gebruikt op de UHPLC-Q-Orbitrap werd reeds ontwikkeld
door Vanden Bussche et al. (2015).
3.2.2 UHPLC-Q-Orbitrap
Deze methode maakt voor het UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) deel gebruik van een
Acquity HSS T3 C18 kolom (1,8 μm, 150 mm x 2,1 mm, Waters), aan een temperatuur van 45 °C, voor de
scheiding van de gastrointestinale metabolieten.
Er werd gebruik gemaakt van een binair solvent systeem met ultrapuur water (A) en acetonitrile (B), beide
geacidifieerd met 0,1 % mierenzuur, aan een constante snelheid van 0,4 mL/min. Voor elke analyse werd er
10 μL van elk staal geïnjecteerd. Zie tabel 11 voor de flowgradiënten van de solventen.
Tabel 11: Gradiënten van de solventen UHPLC.
Tijd (min) 0,1 % mierenzuur (%) 0,1 % ACN (%) μL/min
0 - 1,5 98 2 400
1,5 - 7,0 75 25 400
7,0 - 8,0 40 60 400
8,0 - 12,0 5 95 400
12,0 - 14,0 5 95 400
14,0 -14,1 98 2 400
4,0 min re-equilibratie
De HRMS analyse werd uitgevoerd met een Exactive benchtop Orbitrap massa spectrometer (Thermo Fisher
Scientific San José, CA, USA), uitgerust met een verwarmde elektrospray ionisatie bron (HESI), die kan
werken met een wisselende polariteit. Verder werden volgende instellingen gebruikt: voltage bron van 5 kV,
temperatuur van de bron bedroeg 350 °C, de scanrange bevond zich tussen 53,4-800 m/z, temperatuur van
de capillair was 250°C, voltage van de capillair: 90 kV (+/-), voltage tubelens 60 kV (+/-), ‘skimmer’ voltage 20
kV (+/-). Er was een ‘auxillary flow rate’ van 25 arbitraire eenheden, ‘sweep gas flow rate’ van 5 arbitraire
eenheden, ‘sheat gas flow rate’ van 50 arbitraire eenheden en ‘heather’ temperatuur van 350°C. Het ‘AGC
target’ was gebalanceerd (1 x 106 ionen) met een maximum injectietijd van 50 ms.
40
Er werd gewerkt in full scan modus, waardoor er geen fragmentatie optrad van moleculen. Deze methode
maakte gebruik van zeer hoge resolutie (100 000 full width half maximum) aan 1 Hz, waardoor telkens de
massa van de moleculen tot 10 ppm nauwkeurig kon worden bepaald. Het verschil tussen de theoretische
massa en de berekende massa werd daardoor begrensd tot maximaal 10 ppm (Vanden Bussche et al.,
2015).
3.3 Statistische analyse
3.3.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte
Zoals reeds eerder aangehaald werd er bij het experiment met rood vlees en gevogelte gewerkt met een
‘targeted’ methode, dit houdt in dat er specifiek gezocht werd naar de tien eerder bepaalde metabolieten. Deze
metabolieten kunnen herkend worden op basis van hun specifieke retentietijden en massa-lading ratio.
De resultaten werden manueel geprocessed met Xcalibur 2.1. Vervolgens werd voor elke metaboliet de
piekintensiteit bepaald, waarna voor elke proefpersoon per metaboliet in excel de gemiddelde waarde en
standaarddeviatie werden berekend van de drie herhalingen. Deze waarden werden uitgezet in een grafiek.
3.3.2 Experiment vertering carnitine versus lysine
Bij het lysine-carnitine experiment werd er zowel met ‘targeted’ als ‘untargeted metabolomics’ gewerkt. Bij de
‘untargeted metabolomics’ werd het volledige metabool patroon dat gegenereerd wordt door de digestie van
lysine vergeleken met dit van carnitine, de referentiegroep. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de statistische
programma’s SIEVETM en SIMCATM. De ‘targeted metabolomics’ gebeurde analoog aan het experiment van
de vertering van rood vlees versus gevogelte, waarbij er specifiek naar de 10 rood vlees geassocieerde
metabolieten werd gezocht, meer specifiek naar de acylcarnitines.
3.3.3 SAS Enterprise guide 7
De verdere statistische analyse van beide ‘untargeted metabolomic’ experimenten werd uitgevoerd met SAS
Enterprise guide 7. Er werd een ANOVA-tabel (Analysis of variance) gemaakt om na te gaan of de gemiddelde
waarden significant verschillend waren. Het doel van een Two-way ANOVA is om na te gaan of er significante
verschillen bestaan tussen de verschillende niveau’s van twee categorische variabelen (vlees en tijdstip
staalname), wat betreft de waarde van een bepaalde continue afhankelijke variabele (piekintensiteit). Door de
instelling “Differences of Least Squares Means” werden alle mogelijke combinaties tussen voor en na
colondigestie, en rund en kip met elkaar vergeleken. Er werd gebruik gemaakt van een Tukey’s test, hierbij
worden in één enkele stap multipele vergelijkingen berekend en worden een reeks
betrouwbaarheidsintervallen berekend voor alle paarsgewijze verschillen tussen de gemiddelden. Deze
intervallen zijn gebaseerd op Tukey’s “Honest Significant Difference”-methode. Bij de vergelijkingen werd
gebruik gemaakt van een “default” term, hierbij wordt een vooraf ingestelde waarde gegeven aan een variabele
als de gebruiker zelf geen waarde invoert (Seo et al., 1994).
Uiteindelijk werden de bekomen resultaten geïnterpreteerd, indien er een P-waarde bekomen werd die kleiner
is dan 0,05 betekent dit dat er een significant verschil was tussen de gemiddelden.
41
3.3.3.1 SIEVETM
Gebruikmakend van het statistisch programma SIEVETM 2.2 (ThermoFisher Scientific, San José, USA)
gebeurde er een eerste analyse van de stalen. Hierbij werden de lysine (5 mg) stalen vergeleken met de
carnitine (5 mg) stalen. Er werd een onderscheid gemaakt tussen de stalen met positieve ionisatie en die met
negatieve ionisatie, beide werden in een apart proces geanalyseerd, dit werd geregeld door de instelling ‘Filter
selection’.
De “intensity threshold” bedroeg 500.000, om achtergrondinformatie zoveel mogelijk te elimineren. De
identificatie van de statistisch weerhouden metabolieten gebeurde aan de hand van de “Human Metabolome
Database” (Wishart et al., 2013).
Als eerste werden de pieken gealligneerd, om de variabiliteit tussen de chromatogrammen te corrigeren,
waarna het programma kon gestart worden en de analyse begon. Voor de analyse werd carnitine gekozen als
ratio-groep, waartegenover lysine werd vergeleken. Vervolgens werd er gefilterd om enkel metabolieten die
significant tussen de carnitine- en lysinegroep verschilden te weerhouden. Deze filtering gebeurde als volgt:
‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine < 0,66 OR Ratio_lysine > 1,5)’, op deze manier trad er een sterke
reductie van het aantal componenten op.
De metabolieten werden geëxporteerd naar een excelfile, waarbij de metaboliet gekenmerkt werd door:
component ID, component moleculair gewicht, m/z-ratio, retentietijd, oppervlakten onder de piek, ratio,
standaardafwijking, p-waarde en de chemische formule.
Vervolgens werden deze component ID’s en hun corresponderend signaal (oppervlakte onder de piek) vanuit
excel overgebracht naar het statistisch programma SIMCATM 13.0.2 (Umetrics, Malmö, Zweden).
3.3.3.2 SIMCATM
Dit programma onderzocht welke metabolieten significant gerelateerd zijn met de digestie van carnitine, in
vergelijking met lysine aan de hand van verschillende statistische modellen (PCA-X, PLS-DA, OPLS-DA).
Allereerst werd een PCA-X (Principal Component Analysis) model opgesteld. In dit model werden de y-
variabelen (lysine en carnitine) uitgesloten. De clustering van de stalen werd nagegaan en er werd beoordeeld
of er uitbijters aanwezig waren aan de hand van een score-plot.
Hierna werd een PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) model opgesteld, dit model wordt
gebruikt om een permutatietest uit te voeren voor een eerste validatie van het statistisch model.
Tenslotte werd een OPLS-DA (orthogonal partial least squares) model opgesteld, waarin de systemische
variatie van de X-variabelen (metabolieten) opgesplitst wordt in twee elementen. Het ene element stelt de
variatie voor die lineair (voorspellend) gerelateerd is aan een Y-variabele en de andere de variatie die niet
gerelateerd (orthogonaal) is aan een Y-variabele. Deze onderverdeling van variatie vergemakkelijkt de
interpretatie van het model. Dit model werd finaal gebruikt om een selectie te maken van metabolieten die
specifiek geassocieerd zijn met carnitine. Bijkomende validatie werd uitgevoerd met behulp van CV-ANOVA.
Vervolgens werd een S-plot gemaakt, voor de selectie van de metabolieten specifiek voor de digestie van
carnitine, alsook werd een VIP-plot (Variable Importance in Projection) gemaakt. In het S-plot stelt elke cirkel
een metaboliet voor. De waarden op de X-as stellen de bijdrage van de metabolieten aan de variatie van de
observaties voor, terwijl de waarden op de Y-as de correlatie weergeven van een specifieke metaboliet met
een Y-variabele (carnitine of lysine). Hoe verder weg van 0 op de X-as en Y-as, hoe meer een metaboliet
geassocieerd kan worden met carnitine (positieve grenswaarde). Tenslotte werd aan de hand van het VIP plot
42
nagegaan in hoeverre de geselecteerde metabolieten belangrijk zijn (>1: zeer belangrijk, 1< middelmatig >0,8,
<0,8: weinig belangrijk). Alleen de metabolieten met een VIP-waarde boven 0,8 werden weerhouden.
Voor de identificatie van de finaal geselecteerde metabolieten, dewelke een sterke associatie vertoonden met
de digestie van carnitine, werd gebruik gemaakt van de online “Human Metabolome Database”. Hierbij was
de identificatie gebaseerd op de accurate massa (<10 ppm). Belangrijk om op te merken is dat men niet
volledig zeker kan zijn of de teruggevonden metaboliet in de “Human Metabolome Database” wel degelijk
overeenkomt met de metaboliet in het staal (vaak ook meerdere suggesties mogelijk per metaboliet). Om
volledig zeker te zijn zou men een analytische standaard van dit metaboliet moeten aankopen om de identiteit
te bevestigen. Indien een standaard niet beschikbaar is kunnen MS/MS spectra en/of nucleaire magnetische
resonantie (NMR) verdere verheldering geven van de structuur van een metaboliet.
43
4. RESULTATEN
4.1 Experiment vertering rood vlees versus gevogelte
In dit experiment werd bij zes proefpersonen nagegaan welke metabolieten significant verschillend waren
tussen de vertering van rood vlees en die van gevogelte. Hiervoor werd gebruik gemaakt van ‘targeted’
metabolomics, aldus werd er specifiek gezocht naar 10 metabolieten die significant meer voorkomen bij de
vertering van rood vlees ten opzichte van gevogelte (tabel 6). Van elke categorie (kip en rund voor
colondigestie, en kip en rund na colondigestie) werden de concentraties, bekomen na manuele processing
met X-calibur, ingevoerd in het statistisch programma SAS Enterprise guide 7. Op basis hiervan werd een
ANOVA tabel samengesteld, die de vergelijking van alle categorieën met elkaar mogelijk maakte. Er werd per
metaboliet gezocht naar significante verschillen tussen de categorieën, gekenmerkt door een P-waarde kleiner
dan 0,05.
Onderstaande tabel (tabel 12) geeft de algemene trends weer, waarbij voor elke paarsgewijze vergelijking
wordt vermeld welke categorieën significant verschillen. Deze algemene trends konden worden waargenomen
bij de meeste proefpersonen, er zijn echter wel uitzonderingen, wegens de interindividuele variatie tussen de
proefpersonen. Mogelijke verklaringen hiervoor worden beschreven in de discussie.
Tabel 12: Significante verschillen tussen de verschillende categorieën, vermeld met P-waarde, tussen
haakjes staat steeds de categorie met de hoogste concentratie. (R) rund, (K) Kip, (T0) voor colondigestie,
(T48) na colondigestie.
Nr Kip vs. rund Voor vs. na Kip:
voor vs. na
Rund:
voor vs. na
Kip vs. rund:
voor
Kip vs. rund:
na
1 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (T48) 0,0241 (R) < 0,0001 (R)
2 < 0,0001 (R) 0,0037 (T0) 0,7931 0,0002 (T0) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)
3 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,2280 < 0,0001 (T48) 1,0000 < 0,0001 (R)
4 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,0448 (T48) < 0,0001 (T48) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)
5 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,8736 < 0,0001 (T48) 0,0003 (R) < 0,0001 (R)
6 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,9085 < 0,0001 (T48) < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)
7 < 0,0001 (R) < 0,0001 (T48) 0,8782 < 0,0001 (T48) 1,0000 < 0,0001 (R)
8 0,0214 0,0002 < 0,0001 0,4382 0,0005 0,7222
9 0,1027 0,0792 0,2137 0,2100 0,2442 0,2484
10 < 0,0001 (R) 0,7634 0,9630 0,6371 < 0,0001 (R) < 0,0001 (R)
Figuur 20 stelt de abundanties van 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) voor. Hierbij is er een stijging te zien
na de colondigestie van zowel rund als kip. Deze trend kan bij de meeste metabolieten worden waargenomen,
namelijk metaboliet 3, 4, 5, 6 en 7.
Tussen de vertering van rundvlees en gevogelte kunnen significante verschillen waargenomen worden bij
metabolieten 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 10. Het gaat hier over de combinatie van dunne darm digestie en
colondigestie. De abundantie van de metabolieten is telkens het hoogst bij de digestie van rundvlees.
Voor en na de colondigestie zijn er significante verschillen bij metabolieten 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7. Hierbij is de
abundantie steeds het hoogst na colondigestie, uitgezonderd metaboliet 2, waar de abundantie lijkt af te
nemen tijdens colondigestie.
44
Slechts bij twee metabolieten (metaboliet 1 of 3-dehydroxycarnitine, en metaboliet 4) neemt de abundantie
tijdens colondigestie van gevogelte significant toe.
Bij de colondigestie van rood vlees zijn er meerdere metabolieten die een significante verandering vertonen.
Zo is er bij metabolieten 1, 3, 4, 5, 6 en 7 een significant toegenomen abundantie na vertering ter hoogte van
het colon. Bij metabolieten 5 en 6 is er een afwijkend resultaat bij proefpersoon 3, waarbij de abundantie hoger
is ter hoogte van de dunne darm. Bij metaboliet 2 neemt de abundantie af tijdens de passage doorheen het
colon.
Reeds voor de passage doorheen het colon is er een significant verschil tussen rood vlees en gevogelte bij
metabolieten 1, 2, 4, 5, 6 en 10. Waarbij de metaboliet steeds in hoogste abundantie aanwezig is bij de
vertering van rundvlees.
Tot slot is er ook na de colondigestie een significant verschil tussen rood vlees en gevogelte bij de metabolieten
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 10. Ook hier ligt de abundantie van de metabolieten steeds het hoogst bij de digestie van
rood vlees.
Afwijkend van deze algemene trends zijn metabolieten 8 en 9. Deze metabolieten vertoonden veel variatie,
waardoor er geen significante verschillen aangetoond konden worden.
Fig. 20: De abundantie van 3-dehydroxycarnitine, voor (T0) en na (T48) colondigestie van rundvlees en
gevogelte. (A) significant verschil voor versus na colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie
van rund en kip, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Er is een significante stijging in abundantie,
na de colondigestie van zowel kip als rund. Ook zijn er significante verschillen tussen de digestie van
rund en kip, zowel voor (P-waarde < 0,05) als na (P-waarde < 0,001) de colondigestie, waarbij rund
steeds in hoogste abundantie voorkomt.
A**B**
A**B*
A**B* A**B**
45
4.2 Experiment vertering carnitine versus lysine
4.2.1 Inleiding
Voorgaand onderzoek wees aan dat er na colondigestie van rundvlees significant hogere hoeveelheden 3-
dehydroxycarnitine gevormd werden. Dit doet vermoeden dat het aanwezige L-carnitine in rundvlees tijdens
colondigestie een bacterieel katabolisme ondergaat, met de vorming van 3-dehydroxycarnitine.
Om dit te bevestigen werd een experiment opgestart waarbij zowel supplementatie met L-carnitine als
supplementatie met lysine geschiedde. Vervolgens werd per categorie gecontroleerd hoeveel 3-
dehydroxycarnitine gevormd werd.
4.2.2 Targeted metabolomics
Tijdens dit experiment werd de abundantie aan L-carnitine, 3-dehydroxycarnitine (metaboliet 1) en een
waarschijnlijk ongekend acylcarnitine (metaboliet 7) vergeleken en dit bij de verschillende categorieën
(supplementatie met carnitine en lysine, zowel 0,5 mg als 5 mg en zowel voor als na colondigestie). Hiervoor
werden de stalen manueel verwerkt met het programma X-calibur. De bekomen abundanties werden ook
ingevoerd in het statistisch programma SAS Enterprise guide 7, waar een ANOVA tabel werd samengesteld.
In deze ANOVA tabel werden alle categoriën met elkaar vergeleken, waarbij er gezocht werd naar significante
verschillen, gekenmerkt door een P-waarde kleiner dan 0,05. Eerst werden de abundanties van L-carnitine in
de stalen nagegaan, vervolgens de abundanties van 3-dehydroxycarnitine en als laatste deze van het
ongekende acylcarnitine (waarschijnlijk metaboliet 7 of methylmalonylcarnitine), deze werd echter in geen van
de stalen aangetroffen.
Na statistische verwerking van de stalen door SAS Enterprise guide 7 werden volgende significante verschillen
aangetroffen (figuur 21):
Fig. 21: De abundantie van L-carnitine, voor en na colondigestie van carnitine en lysine. (A) significant
verschil voor (T0) versus na (T48) colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie van carnitine
en lysine, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Er is een significante hogere abundantie voor
colondigestie, na supplementatie met L-carnitine. Na passage doorheen het colon lijkt alle L-carnitine te
zijn verdwenen, en is er geen significant verschil meer met supplementatie met lysine.
A**B**
A**B**
46
Voor colondigestie was er steeds een hogere abundantie carnitine aanwezig bij supplementatie met carnitine
(5 mg of 0,5 mg), dan bij supplementatie met lysine (5 mg of 0,5 mg) of zonder supplementatie met
aminozuren. De abundantie L-carnitine voor colondigestie is hoger na supplementatie met 5 mg dan na
supplementatie met 0,5 mg carnitine.
Bij supplementatie met carnitine was er bovendien steeds een significante daling van de abundantie L-
carnitine na colondigestie. Na colondigestie kon er geen significant verschil opgemerkt worden tussen
supplementatie met carnitine (5 mg of 0,5 mg) en supplementatie met lysine (5 mg of 0,5 mg) of zonder
supplementatie.
Na statistische verwerking met SAS Enterprise guide 7 kon worden opgemerkt dat er steeds een significante
stijging was van 3-dehydroxycarnitine na colondigestie, bij supplementatie met carnitine. Deze stijging kon niet
worden opgemerkt bij supplementatie met lysine. Ook was er een significant hogere concentratie 3-
dehydroxycarnitine aanwezig na colondigestie van 5 mg carnitine dan 0,5 mg carnitine (figuur 22).
Voor colondigestie kon er geen verschil worden opgemerkt tussen de verschillende categorieën.
4.2.3 Untargeted metabolomics
Met behulp van het statistisch programma SIEVE 2.2 werd geselecteerd naar metabolieten, die verschillend
zijn tussen de digestie van carnitine en lysine. Er werden afzonderlijke analyses uitgevoerd naar de stalen met
positieve ionisatie en deze met negatieve ionisatie, waarbij de intensity threshold telkens 500.000 bedroeg.
De “Human Metabolome Database” werd gebruikt voor de identificatie van de componenten (Wishart et al.,
2013). Om de variabiliteit tussen de chromatogrammen te corrigeren werden deze eerst gealligneerd. Na de
Fig. 22: De abundantie van 3-dehydroxycarnitine, voor (T0) en na (T48) colondigestie van carnitine en
lysine. (A) significant verschil voor versus na colondigestie, (B) significant verschil tussen de digestie van
carnitine en lysine, (*) P-waarde < 0,05, (**) P-waarde <0,0001. Na supplementatie met L-carnitine is er
een significant hogere abundantie van 3-dehydroxycarnitine na colondigestie. Na colondigestie is er ook
een significant verschil op te merken tussen supplementatie met carnitine versus lysine.
A**B**
B** A**
47
analyse werd er een eerste selectie gemaakt naar significante verschillen, op basis van de P-waarde en de
ratio: ‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine < 0,66 OR Ratio_lysine > 1,5) (tabel 15).
Vervolgens werden met
SIMCA 13.0.2 enkele
metabolieten geselecteerd
die specifiek geassocieerd
zijn met de vertering van
carnitine. Deze metabolieten
worden significant minder of
niet teruggevonden bij de
vertering van lysine. Als
eerste werd de clustering
van de stalen nagegaan aan
de hand van een PCA-X
model (figuur 23).
Tabel 15: aantal weerhouden metabolieten voor en na filtering (‘PValue_lysine < 0,05 AND (Ratio_lysine <
0,66 OR Ratio_lysine > 1,5)), met intensity threshold 500.000.
Ionisatiemodus Voor filtering Na filtering
5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie + 3706 6
5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie - 1304 4
5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie + 3039 20
5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie - 1139 8
5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie + 5194 6
5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie - 1162 5
Vervolgens werd een PLS-DA model opgesteld om een permutatietest uit te voeren als eerste validatie van
het statistisch model, deze test was steeds correct (snijpunt met Y-as van R2 en Q2 moet respectievelijk <0,5
en <0 zijn).
Tenslotte werd ook een OPLS-DA model opgesteld, hierbij werd geselecteerd naar volgende
validiteitsparameters: een R2X-waarde die de waarde 1 zo dicht mogelijk benaderde (in dit geval was de
kleinste R2X-waarde 0,86 en de kleinste R2Y-waarde 0,993) en een Q2-waarde groter dan 0,5 (in dit geval
was de kleinste Q2 waarde 0,969). Wanneer deze waarden gerespecteerd worden kan het model gevalideerd
worden.
Om deze validiteit na te gaan werd ook een CV-ANOVA bepaald, hier werd geselecteerd naar een P-waarde
kleiner dan 0,05, bij elk model werd dit gerespecteerd. Hierna werd een S-plot opgesteld om specifiek de
metabolieten die geassocieerd zijn met de digestie van carnitine te kunnen selecteren (figuur 24). Elke cirkel
in het S-plot stelt een metaboliet voor, waarbij de metabolieten in het onderste linkse kwadrant specifiek
Fig. 23: PCA-X model, met score-plot, hierbij is groep 1 de supplementatie
met lysine en groep 2 de supplementatie met carnitine. Dit model wordt
gebruikt om de aanwezigheid van uitbijters na te gaan. In dit geval zijn
beide categorieën mooi geclusterd.
48
geassocieerd zijn met
de vertering van
carnitine en deze in het
rechter boven kwadrant
met de digestie van
lysine, deze eerste zijn
de metabolieten van
interesse. Om de meest
specifieke metabolieten
te selecteren werd
gebruik gemaakt van
een cut off waarde,
waarbij enkel de
metabolieten met een
VIP-waarde hoger dan
0,8 weerhouden werden
(blauwe cirkels).
Er werd een vergelijking gemaakt tussen de groep met 5 mg carnitine en die van 5 mg lysine, zowel voor als
na colondigestie. Tenslotte werd ook het verschil tussen 5 mg carnitine en 0,5 mg carnitine onderzocht, waarbij
de eerste telkens fungeerde als ratiogroep.
Aan de hand van de theoretische massa, de retentietijd en de 13C/12C relatieve isotoop-ratio van de
weerhouden metabolieten werd in de online “Human Metabolome Database” (Wishart et al., 2013) gezocht
naar mogelijke identificaties.
4.2.3.1 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie
Bij de vergelijking van de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine voor colondigestie, met positieve
ionisatiemodus werden twee componenten weerhouden die specifiek geassocieerd werden met de vertering
van 5 mg carnitine. Deze componenten hadden een VIP-waarde groter dan 0,8.
Deze twee componenten hadden component ID’s 882 en 883, hierbij is component ID 882 een L-carnitine,
component ID 883 is vermoedelijk D-carnitine (tabel 16).
Tabel 16: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie,
positieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
882 1,89 162,11221 1,73 0,95 L-carnitine
883 0,96 162,11204 2,77 2,33 D-carnitine
Bij de stalen met negatieve ionisatiemodus werden opnieuw twee componenten weerhouden, namelijk
component ID 534 en 986, maar deze konden niet geïdentificeerd worden (tabel 17).
Fig. 24: S-plot (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie, positieve
ionisatiemodus) Rechts onderaan worden de waarden weergegeven die
significant geassocieerd zijn met de supplementatie van carnitine. De blauwe
bollen hebben een VIP-waarde groter dan 0,8.
49
Tabel 17: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie,
negatieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
534 1,21 198,07094 0,94 Niet geïdentificeerd
986 1,40 357,05921 0,94 Niet geïdentificeerd
4.2.3.2 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie
In de positieve ionisatiemodus werden vier component ID’s weerhouden, specifiek geassocieerd met de
digestie van carnitine, meer bepaald 529, 543, 680 en 833 (tabel 18, figuur 23 en 24).
Tabel 18: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie,
positieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
529 1,23 131,03383 0,61 1,56 4-5-dioxovaleraan-
zuur (DOVA)
543 0,87 132,06549 0,38 0,99 4-hydroxyproline
680 1,61 146,11741 1,16 1,01 3-dehydroxy-
carnitine
833 0,87 162,11227 1,73 0,95 L-carnitine
Component ID 529 kon mogelijks ook nog geïdentificeerd worden als:
- Itaconaat,
- Glutaconaat,
- 2,5-dioxo-pentanoaat,
- 5-Oxotetrahydrofuraan-2-carboxylaanzuur,
- Citraconaat,
- Trans-glutaconaat,
- (2Z)-4-Methoxy-4-oxo-2-butenoaat,
- Mesaconaat.
De tweede component ID 543 kon mogelijks ook nog geïdentificeerd worden als:
- 5-aminolevulinezuur
- Acetylalaninehydroxide,
- Ethylformylglycine,
- l-Glutamic-gamma-semialdehyde,
- 2-Oxo-5-aminopentanoaat,
- cis-4-Hydroxyproline,
- (3S)-3-Hydroxy-L-proline,
- (3S)-3-Hydroxy-D-proline.
50
De derde component ID 680 is waarschijnlijk ‘4-trimethylammoniobutanoic acid’ of ‘gamma-butyrobetaine’ of
3-dehydroxycarnitine, deze heeft namelijk dezelfde retentietijd als de molecule die in het eerste experiment
geïdentificeerd werd als 3-dehydroxycarnitine. De laatste component ID is 833 en komt overeen met L-
carnitine.
In de negatieve
ionisatiemodus werden
drie component ID’s
weerhouden, geen van
deze kon worden
geïdentificeerd (tabel
19). Bij deze
metabolieten valt op
dat er in het PCA-X
model een uitbijter in
de lysinegroep lijkt te
zijn. Ditzelfde
fenomeen werd ook
gezien bij de negatieve
ionisatie voor
colondigestie (figuur 25).
Tabel 19: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie,
negatieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
438 1,15 278,05664 1,00 Niet geïdentificeerd
589 1,92 216,05591 1,00 Niet geïdentificeerd
899 1,17 332,07543 1,01 Niet geïdentificeerd
3.2.3.3 De vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie
Bij de stalen met positieve ionisatie werden twee component ID’s, geassocieerd met de digestie van 5 mg
carnitine, weerhouden, meer bepaald 710, met retentietijd 1,01 welke gelinkt wordt aan gamma-butyrobetaine
(zie eerder) en 858, met retentietijd 0,95 welke gelinkt wordt aan L-carnitine (tabel 20).
Fig. 25: Score-plot, groep 1 is de supplementatie met lysine, groep 2 de
supplementatie met carnitine. In de groep van lysine lijkt er een uitbijter te zijn.
51
Tabel 20: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na
colondigestie, positieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M+H+]+ Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
710 1,41 146,11742 1,16 1,01 Gamma-
butyrobetaine
858 1,26 162,11227 1,73 0,95 L-carnitine
Uit de stalen met negatieve ionisatie werden drie component ID’s weerhouden, maar deze konden niet
geïdentificeerd worden (tabel 21).
Tabel 21: component ID’s en bijhorende metaboliet (5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na
colondigestie, negatieve ionisatie).
Component
ID
VIP-waarde [M-H-]- Verschil ppm
(Da)
Retentietijd
(min)
Metaboliet volgens
HMDB
450 1,18 278,05664 1,00 Niet geïdentificeerd
605 1,21 216,05591 1,00 Niet geïdentificeerd
916 1,07 332,07544 1,01 Niet geïdentificeerd
52
5. DISCUSSIE
5.1 De vertering van rood vlees versus gevogelte
Van de twee acylcarnitines die in onderzoek van Rombouts et al. (2016) geïdentificeerd werden kon de eerste,
namelijk 3-dehydroxycarnitine, ook steeds worden teruggevonden bij de digestie van rundvlees. Ook lijkt de
concentratie van deze metaboliet steeds toe te nemen na colondigestie. Dit kan worden verklaard door het feit
dat 3-dehydroxycarnitine een intermediaire metaboliet is in het bacteriële katabolisme van L-carnitine (Koeth
et al., 2013). Het tweede acylcarnitine, mogelijks methylmalonylcarnitine (metaboliet 7) wordt vooral gevormd
na de colondigestie van rundvlees, aldus kan er vermoed worden dat deze metaboliet door bacteriële
omzetting in het colon wordt gevormd.
Een mogelijke verklaring voor de individuele verschillen in gevormde metabolieten komt van Dethlefsen et al.
(2006). Zij stellen dat de microbiota voornamelijk bestaat uit Firmicutes en Bacteroides, maar dat binnenin
deze twee predominante phyla er nog verschillende stammen bestaan en dat dit leidt tot het ontstaan van een
darmflora die even uniek is als een vingerafdruk. Zij stellen dat er verschillende factoren zijn die een invloed
hebben op de samenstelling van de microbiota, waaronder voeding, gastheer genotype en interacties tussen
de microbiota (Oostindjer et al., 2014).
De darmmicrobiota kan gewijzigd worden door aanpassingen aan de levensstijl, waarbij vooral het dieet een
cruciale rol speelt. Eetgewoontes bepalen namelijk welke voedingsstoffen er beschikbaar komen voor de
darmflora. Het genoom en het epigenoom van een bacterie bepalen zijn metabole activiteit en zo ook welke
voedingsstoffen deze het best kan verwerken. Zo zijn saccharolytische bacteriën in staat carbohydraten te
metaboliseren. In deze groep zitten volgende bacteriën: Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus,
Eubacterium, Propionibacterium, Escherichia, Enterococcus, Peptostreptococcus, Fusobacteria, en anderen.
De proteolytische bacteriën halen hun energie dan weer uit de fermentatie van proteïnen. Hieronder vallen:
Streptococcus, Staphylococcus, Proteus, Escherichia, en sommige soorten van Clostridium, Fusobacteria,
Bacillus, Propionibacterium, en anderen.
Er zijn drie enterotypes beschreven, met predominantie van Bacteroides, Prevotella of Ruminococcus. Het
enterotype Bacteroides komt meest voor bij mensen met een Westers dieet, namelijk een voedingspatroon
rijk in vet en proteïnen. Het Prevotella enterotype komt veel voor bij mensen met een dieet rijk aan vezels
(Kashtanova et al., 2015). Deze genera impliceren dat de enterotypes op verschillende manieren hun energie
generen uit voedingsstoffen die het colon bereiken. Deze fylogenetische verschillen leiden tot functionele
verschillen tussen de enterotypes (Arumugam et al., 2011).
5.2 De vertering van carnitine versus lysine
5.2.1 Targeted metabolomics
5.2.1.1 L-carnitine
Bij de targeted metabolomics aanpak van dit experiment (tabel 13) kan worden opgemerkt dat L- carnitine
steeds in de hoogste concentratie aanwezig is voor colondigestie. Na colondigestie is er steeds significant
minder L-carnitine aanwezig. De hoogste waarden kunnen worden gezien voor de colondigestie van 5 mg L-
carnitine en iets minder hoge waarden voor de colondigestie van 0,5 mg L-carnitine. Deze resultaten
suggereren een afbraak van L-carnitine gedurende de colondigestie. Bovendien is er na colondigestie geen
53
verschil meer op te merken tussen de verschillende categorieën, dit wijst op een significant hogere afbraak
van L-carnitine tijdens de colondigestie.
Ook in de groepen zonder supplementatie met L-carnitine, zowel de groep met supplementatie van lysine als
de controlegroep, is er steeds L-carnitine aanwezig en ook hier treedt er een daling van de concentratie op na
colondigestie. De aanwezigheid van L-carnitine in deze groepen kan worden verklaard worden door de
aanwezigheid in vetweefsel, wat aan elke recipiënt werd toegevoegd. Dit toont aan dat er voor het bereiken
van het colon geen verschil is tussen de metabolisatie van carnitine versus die van lysine. De afbraak van
carnitine in het colon werd reeds aangetoond door Steiber et al. (2004) en Koeth et al. (2013).
L-carnitine kan zowel endogeen gevormd worden als uit de voeding opgenomen worden. Onder normale
omstandigheden wordt de totale hoeveelheid L-carnitine uit de voeding opgenomen ter hoogte van de dunne
darm. L-carnitine is in vrij hoge concentraties aanwezig in vrijwel elke vleessoort, verwerkt vlees is hiermee
vergeleken veel armer aan carnitine (Demarquoy et al., 2004).
L-carnitine is een antioxidant en kan aldus het lichaam beschermen tegen vrije radicalen en reactieve
zuurstofmoleculen. Deze schadelijke moleculen worden tijdens normale fysiologische processen continu
gevormd en kunnen bij overmaat gelinkt worden aan een risico op CRC (Gulcin, 2006; Jegasothy et al., 2014).
Carnitine is essentieel in de mitochondriale β-oxidatie, waar het instaat voor het transport van geactiveerde
vetzuren doorheen de mitochondriale membraan (Demarquoy et al., 2004). Door bacterieel katabolisme kan
er in het colon echter wel een omzetting gebeuren naar 3-dehydroxycarnitine. Deze molecule werd in de
literatuur reeds geassocieerd met verscheidene aandoeningen, zoals atherosclerose (Koeth et al., 2013).
5.1.2.2 3-Dehydroxycarnitine
De abundantie aan 3-dehydroxycarnitine neemt telkens significant toe na colondigestie (tabel 14). Dit
suggereert een vorming tijdens de passage doorheen het colon. De toename is vooral duidelijk na
supplementatie van carnitine (zowel bij toediening van 5 mg, als in mindere mate na toediening van 0,5 mg)
en in veel mindere mate na supplementatie van lysine. Dit doet vermoeden dat er tijdens de colondigestie een
omzetting is van L-carnitine naar 3-dehydroxycarnitine.
3-Dehydroxycarnitine is een intermediaire molecule in de intestinale bacteriële degradatie van L-carnitine naar
trimethylamine (Steiber et al., 2004). Deze afbraak is aanwezig bij alle proefpersonen en afhankelijk van de
aanwezige microbiota in het colon. Sommige enterotypes kunnen deze L-carnitine beter afbreken dan andere
enterotypes (Koeth et al., 2013).
5.1.2.3 Ongekend acylcarnitine
Het waarschijnlijk ongekende acylcarnitine werd in geen enkele van de stalen aangetroffen. Er wordt vermoed
dat deze molecule een acylcarnitine is, aangezien er in eerder onderzoek van Rombouts et al. (2016) een
fragment 85.280 werd teruggevonden, typisch voor de acylcarnitinegroep, waarbij fragmentatie gekenmerkt
wordt door een gemeenschappelijk ion bij acylcarnitines met een m/z [85]+ (Costa et al., 1997). De urinaire
concentratie aan acylcarnitines is gelinkt met de consumptie van rood vlees. Zo is de concentratie in de urine
veel hoger bij mensen die een dieet rijk aan rood vlees nuttigen (O'Sullivan et al., 2011).
54
5.2.2 Untargeted metabolomics
5.2.2.1 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie
Bij de untargeted metabolomics van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine werden er voor de colondigestie bij
positieve ionisatiemodus 2 component ID’s gevonden, geassocieerd met de vertering van carnitine, namelijk
882 en 883 (tabel 16). In de Human Metabolome Database wordt Component ID 882 aangeduid als L-carnitine.
Deze bevinding sluit aan bij de resultaten van de targeted metabolomics, aangezien ook hier een hogere
concentratie L-carnitine kon gevonden worden voor de colondigestie, bij de groep met de hoogste
supplementatie. Aangezien de moleculaire massa van component ID 883 exact gelijk is aan deze van
component 882, is deze vermoedelijk een isomeer van L-carnitine, namelijk D-carnitine. De aangekochte
standaard L-carnitine (Sigma-Aldrich; St. Louis, Missouri, USA; C0158-1G) had een zuiverheid van > 98%,
het is dus mogelijk dat er ook een kleine hoeveelheid D-carnitine aanwezig was in dit mengsel. Om dit na te
gaan werd ook de standaard geanalyseerd, waaruit bleek dat hier een kleinere hoeveelheid molecule
aanwezig was met dezelfde massa, maar verschillende retentietijd. Deze retentietijd kwam overeen met de
geobserveerde waarde bij het experiment van de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor
colondigestie.
Bij negatieve ionisatiemodus werden opnieuw 2 component ID’s weerhouden, deze zijn geassocieerd met
carnitine maar konden beide niet worden geïdentificeerd door de Human Metabolome Database (tabel 17).
5.2.2.2 De vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na colondigestie
Vervolgens werd gekeken naar de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, na de colondigestie.
Onder de positieve ionisatiemodus werden hier 4 metabolieten gevonden, geassocieerd met carnitine, met
volgende component ID’s: 529, 543, 680 en 833 (tabel 18).
De metaboliet met component ID 529 komt op basis van de literatuur vermoedelijk overeen met 4-5-
dioxovaleraanzuur (DOVA), dit is het finale oxidatieproduct van 5-aminolevulinezuur, een precursor van
porfyrine in de biosynthese van haem (Kikuchi et al., 1958; Wishart et al., 2013). De aanwezigheid van deze
component ID kan op een degradatie van het aanwezige haem wijzen tijdens colondigestie. Aangezien deze
intermediairen van de haemsynthese significant minder voorkomen bij de controlegroep (supplementatie
lysine), kan er vermoed worden dat er een interactie plaatsvindt tussen carnitine en de haemmolecule.
Component 543 is vermoedelijk 4-hydroxyproline is. 4-hydroxyproline is een belangrijke component van
collageen, en bevindt zich voornamelijk in spierweefsel (Ogle et al., 1962; Lepetit, 2008). Een studie van Ross
et al. (2015) toonde aan dat 4-hydroxyproline een mogelijke biomerker is voor de digestie van rundvlees.
Hierbij was er een gelijke concentratie van vrij 4-hydroxyproline aanwezig in zowel haring als rood vlees, maar
na digestie bleek de hoeveelheid 4-hydroxyproline veel hoger te liggen in het plasma na de vertering van
rundvlees. Dit doet vermoeden dat er meer factoren een rol spelen dan alleen de hoeveelheid collageen in de
spieren. Een mogelijkheid bestaat dat L-carnitine een rol speelt in de vorming van 4-hydroxyproline. Zo
toonden Akkus et al. (2009) aan dat de toediening van carnitine aan wonden zorgt voor een toegenomen
aanwezigheid van hydroxyproline.
De derde component ID 680 is vermoedelijk ‘4-trimethylammoniobutanoic acid’ of ‘gamma-butyrobetaine’ of
3-dehydroxycarnitine. Deze molecule is een bouwsteen van carnitine. Deze observatie komt overeen met de
resultaten van de ‘targeted metabolomics’, waar ook een toename gezien werd in concentratie 3-
dehydroxycarnitine. Deze toename was het hoogst bij hoge supplementatie carnitine, wat opnieuw doet
55
vermoeden dat er ter hoogte van het colon een degradatie is van L-carnitine naar zijn bouwstenen, waaronder
3-dehydroxycarnitine. De laatste component ID is 833 en kon nog niet geïdentificeerd worden.
Bij de negatieve ionisatiemodus kon geen enkele component ID geïdentificeerd worden (tabel 19). Hier werd
bij de score-plot (net als bij de vertering van 5 mg carnitine versus 5 mg lysine, voor colondigestie, maar ook
bij negatieve ionisatie) een mooie clustering gezien van de carnitine-groep. Bij de lysine-groep lijkt er echter
een uitbijter aanwezig te zijn, deze mag toch worden opgenomen in de statistische verwerking aangezien het
model kon gevalideerd worden (figuur 25).
5.2.2.3 De vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie
Bij de vertering van 5 mg carnitine versus 0,5 mg carnitine, na colondigestie, werden er bij de positieve ionisatie
twee component ID’s weerhouden, deze konden geassocieerd worden met 5 mg carnitine. Deze component
ID’s zijn 710 en 858.
Component ID 710 komt overeen met gamma-butyrobetaine, of meer bepaald 3-dehydroxycarnitine. Deze
molecule werd ook geassocieerd met supplementatie met carnitine, na colondigestie. Het is dan ook logisch
dat deze significant meer aanwezig is bij hogere supplementatie met carnitine. De tweede component ID is
858 en kon nog niet geïdentificeerd worden. Bij de negatieve ionisatiemodus kon er geen enkele component
geïdentificeerd worden.
Zoals reeds eerder aangehaald is het onmogelijk met zekerheid te bepalen welke metabolieten teruggevonden
zijn, louter op basis van het gebruik van de Human Metabolome Database.
5.2.2.4 Verder onderzoek
Om met zekerheid te kunnen beslissen welke metabolieten werden teruggevonden, kan er bij reeds
gekarakteriseerde moleculen gebruik gemaakt worden van een standaard, die kan aangekocht worden. Hierbij
is het belangrijk dat er minimum twee onafhankelijke en orthogonale data, die eigen zijn aan deze authentieke
component worden mee geanalyseerd, onder identieke experimentele omstandigheden als de stalen. Het
gebruik van waarden, vermeld voor deze authentieke stalen, uit de literatuur wordt als onvoldoende
beschouwd om een betrouwbare identificatie toe te laten.
Dankzij de accurate massameting van HRMS, kunnen de authentieke spectra gebruikt worden, waarmee
spectrale matching kan worden gedaan, hiervoor moeten deze spectra wel beschikbaar zijn in databases
(Sumner et al., 2007; Brown et al., 2009; Roux et al., 2012).
5.2.3 Het effect van carnitine op het risico op CRC
Uit de literatuur is gebleken dat er effectief een afbraak is van carnitine tijdens de colondigestie. L-carnitine
heeft een trimethylamine (TMA) structuur en wordt tijdens colondigestie dan ook omgezet naar trimethylamine-
derivaat, vermoedelijk 3-dehydroxycarnitine (4-trimethylammoniobutanoic acid) (Steiber et al., 2004). TMA
wordt opgenomen in het bloed en naar de lever getransporteerd, hier bevinden zich de hepatische flavine
monooxygenasen, die TMA zullen omvormen naar trimethylamine-N-oxide (TMAO). Dit is een proatherogene
molecule en bovendien geassocieerd met cardiovasculair risico. De afbraak van L-carnitine door de darmflora
werd aangetoond door Koeth et al. (2013), waarbij de darmmicrobiota een essentiële rol bleek te spelen. Bij
dit onderzoek werd aan proefpersonen gedurende één week breed spectrum antibiotica toegediend, om de
intestinale microbiota te onderdrukken. Na supplementatie met L-carnitine bleek er een complete
56
onderdrukking te zijn van de vorming van TMAO. Zonder toediening van antibiotica bleek de omvorming van
L-carnitine naar TMA en TMAO ongestoord door te gaan. Dit toont aan dat de productie van TMAO vanuit L-
carnitine afhankelijk is van de intestinale microbiota.
De verschillende bacteriële taxa beïnvloeden plasma TMAO concentraties, zo is het Prevotella enterotype
geassocieerd met een hogere TMAO concentratie dan Bacteroides enterotypes. Dit impliceert dat bestaande
eetgewoontes zowel de intestinale microbiële samenstelling als de mogelijkheid tot productie van TMA en
TMAO vanuit L-carnitine moduleren. Zo kan bovendien een langdurige supplementatie met L-carnitine een
verschuiving aan bacteriële taxa veroorzaken, met soorten die beter geschikt zijn voor de TMA-productie uit
L-carnitine (Koeth et al., 2013). Veranderingen in de metabolisatie van deze trimethylamine-structuren kunnen
voorkomen in het begin van de ziekteontwikkeling, dit kan geassocieerd zijn met een hoger risico op CRC. Er
is een positieve associatie tussen plasma TMAO en CRC aangetoond, dit is consistent met een betrokkenheid
van het darmmicrobioom in de pathogenese van CRC (Bae et al., 2014). Een studie van Vanden Bussche et
al. (2014) toonde aan dat er veel interindividuele variatie bestaat in de vorming van DNA-adducten. Dit leidt
tot een grote variatie in de gevoeligheid van een persoon tot het ontwikkelen van CRC, na het eten van haem-
rijke voeding, zoals rood vlees.
57
7. BIBLIOGRAFIE
-Ajouz H., et al. (2014). "Secondary bile acids: an underrecognized cause of colon cancer." World Journal of
Surgical Oncology 12(164).
-Akkus A., et al. (2009). "Effect of carnitine on cutaneous wound healing in immunosuppressed rats." J Surg
Res 155(2): 301-305.
-Al-Sohaily S., et al. (2012). "Molecular pathways in colorectal cancer." J Gastroenterol Hepatol 27(9): 1423-
1431.
-Alaejos M. S. and A. M. Afonso (2011). "Factors That Affect the Content of Heterocyclic Aromatic Amines in
Foods." Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 10(2): 52-108.
-Alexander D. D., et al. (2009). "Meta-analysis of animal fat or animal protein intake and colorectal cancer."
Am J Clin Nutr 89(5): 1402-1409.
-Arumugam M., et al. (2011). "Enterotypes of the human gut microbiome." Nature 473(7346): 174-180.
-Aune D., et al. (2013). "Red and processed meat intake and risk of colorectal adenomas: a systematic review
and meta-analysis of epidemiological studies." Cancer Causes Control 24(4): 611-627.
-Bae S., et al. (2014). "Plasma choline metabolites and colorectal cancer risk in the Women's Health Initiative
Observational Study." Cancer Res 74(24): 7442-7452.
-Baena R. and P. Salinas (2015). "Diet and colorectal cancer." Maturitas 80(3): 258-264.
-Baradat M., et al. (2011). "4-Hydroxy-2(E)-nonenal metabolism differs in Apc(+/+) cells and in Apc(Min/+)
cells: it may explain colon cancer promotion by heme iron." Chem Res Toxicol 24(11): 1984-1993.
-Barrasa J. I., et al. (2013). "Bile acids in the colon, from healthy to cytotoxic molecules." Toxicol In Vitro 27(2):
964-977.
-Bartsch H. and J. Nair (2004). "Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in inflammation
driven carcinogenesis." Cancer Detect Prev 28(6): 385-391.
-Bastide N. M., et al. (2015). "A central role for heme iron in colon carcinogenesis associated with red meat
intake." Cancer Res 75(5): 870-879.
-Bastide N. M., et al. (2011). "Heme iron from meat and risk of colorectal cancer: a meta-analysis and a review
of the mechanisms involved." Cancer Prevention Research: 1-16.
-Belkaid Y. and T. W. Hand (2014). "Role of the microbiota in immunity and inflammation." Cell 157(1): 121-
141.
-Bertinato J., et al. (2016). "l-Lysine supplementation does not affect the bioavailability of copper or iron in
rats." J Trace Elem Med Biol.
-Boland C. R. and A. Goel (2010). "Microsatellite instability in colorectal cancer." Gastroenterology 138(6):
2073-2087 e2073.
-Botteri E., et al. (2008). "Smoking and Colorectal Cancer: a meta-analysis." American Medical Association
300(23): 2765-2778.
-Boyle P., et al. (2008). "Diet, nutrition and cancer: public, media and scientific confusion." Ann Oncol 19(10):
1665-1667.
-Brown M., et al. (2009). "Mass spectrometry tools and metabolite-specific databases for molecular
identification in metabolomics." Analyst 134(7): 1322-1332.
-Butler L. M. (2003). "Heterocyclic Amines, Meat Intake, and Association with Colon Cancer in a Population-
based Study." American Journal of Epidemiology 157(5): 434-445.
58
-Byres E., et al. (2008). "Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial
toxin." Nature 456(7222): 648-652.
-Cabrera-Mendoza F., et al. (2014). "Clinical relevance of the K-ras oncogene in colorectal cancer: Experience
in a Mexican population." Revista de Gastroenterología de México (English Edition) 79(3): 166-170.
-Chao A., et al. (2005). "Meat consumption and risk of colorectal cancer." American Medical Association
293(2): 172-183.
-Cirillo T., et al. (2010). "Assessment of the dietary habits and polycyclic aromatic hydrocarbon exposure in
primary school children." Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 27(7): 1025-1039.
-Corpet D. E. (2011). "Red meat and colon cancer: should we become vegetarians, or can we make meat
safer?" Meat Sci 89(3): 310-316.
-Corpet D. E., et al. (1995). "Colonic Protein Fermentation and Promotion of Colon Carcinogenesis by
Thermolyzed Casein." Nutrition and Cancer 23(3): 271-281.
-Costa C., et al. (1997). "Quantitative analysis of plasma acylcarnitines using gas chromatography chemical
ionization mass fragmentography." Journal of Lipid Research 38: 173-182.
-Cross A. J. and R. Sinha (2004). "Meat-related mutagens/carcinogens in the etiology of colorectal cancer."
Environ Mol Mutagen 44(1): 44-55.
-Daniel C. R., et al. (2011). "Prospective investigation of poultry and fish intake in relation to cancer risk."
Cancer Prev Res (Phila) 4(11): 1903-1911.
-De Kok T. M. and J. van Maanen (2000). "Evaluation of fecal mutagenicity and colorectal cancer risk."
Mutation Research 463: 53-101.
-Degirolamo C., et al. (2011). "Bile acids and colon cancer: Solving the puzzle with nuclear receptors." Trends
Mol Med 17(10): 564-572.
-Demarquoy J., et al. (2004). "Radioisotopic determination of l-carnitine content in foods commonly eaten in
Western countries." Food Chemistry 86(1): 137-142.
-Demeyer D., et al. (2015). "Mechanisms Linking Colorectal Cancer to the Consumption of (Processed) Red
Meat: A Review." Crit Rev Food Sci Nutr: 0.
-Dethlefsen L., et al. (2006). "Assembly of the human intestinal microbiota." Trends Ecol Evol 21(9): 517-523.
-Dunn W. B., et al. (2005). "Measuring the metabolome: current analytical technologies." Analyst 130(5): 606-
625.
-Ellis D. I., et al. (2007). "Metabolic fingerprinting as a diagnostic tool." Pharmacogenomics 8(9): 1243-1268.
-Engemann A., et al. (2013). "Intestinal formation of N-nitroso compounds in the pig cecum model." J Agric
Food Chem 61(4): 998-1005.
-Fearon E. and B. Vogelstein (1990). "A Genetic Model for Colorectal Tumorigenesis." Cell 61: 759-767.
-Ferrari P., et al. (2007). "Lifetime and baseline alcohol intake and risk of colon and rectal cancers in the
European prospective investigation into cancer and nutrition (EPIC)." Int J Cancer 121(9): 2065-2072.
-Fiehn O. (2002). "Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes." Plant Molecular Biology 48:
155-171.
-Gika H. G., et al. (2014). "LC-MS-based holistic metabolic profiling. Problems, limitations, advantages, and
future perspectives." J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 966: 1-6.
-Giovannucci E. and B. Goldin (1997). "The role of fat, fatty acids, and total energy intake in the etiology of
human colon cancer." Am J Clin Nutr 66: 1564S-1571S.
59
-Grivennikov S. I. (2013). "Inflammation and colorectal cancer: colitis-associated neoplasia." Semin
Immunopathol 35(2): 229-244.
-Guerra A., et al. (2012). "Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion."
Trends Biotechnol 30(11): 591-600.
-Gulcin I. (2006). "Antioxidant and antiradical activities of L-carnitine." Life Sci 78(8): 803-811.
-Gunter M. J., et al. (2005). "Meat intake, cooking-related mutagens and risk of colorectal adenoma in a
sigmoidoscopy-based case-control study." Carcinogenesis 26(3): 637-642.
-Hedlund M., et al. (2008). "Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated
inflammation in carcinoma progression." Proc Natl Acad Sci U S A 105(48): 18936-18941.
-Helmus D. S., et al. (2013). "Red meat-derived heterocyclic amines increase risk of colon cancer: a
population-based case-control study." Nutr Cancer 65(8): 1141-1150.
-Hogg N. (2007). "Red meat and colon cancer: heme proteins and nitrite in the gut. A commentary on "diet-
induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract"." Free Radic Biol Med 43(7): 1037-1039.
-Hounoum B. M., et al. (2016). "Liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry-based cell
metabolomics: Experimental design, recommendations, and applications." TrAC Trends in Analytical
Chemistry 75: 118-128.
-Hughes R., et al. (2000). "Protein degradation in the large intestine: relevance to colorectal cancer." Curr.
Issues Intest. Microbiol. 1(2): 51-58.
-Hur S. J., et al. (2011). "In vitro human digestion models for food applications." Food Chemistry 125(1): 1-12.
-IARC (2015). "IARC Monographs evaluate consumption of red meat and processed meat."
-Ijssennagger N., et al. (2015). "Gut Microbiota Facilitates Dietary Heme-induced epithelial Hyperproliferation
by Opening the Mucus Barrier in Colon." PNAS 112(32): 10038-10043.
-Ijssennagger N., et al. (2012). "Dietary heme alters microbiota and mucosa of mouse colon without functional
changes in host-microbe cross-talk." PLoS One 7(12): e49868.
-Jagerstad M. and K. Skog (2005). "Genotoxicity of heat-processed foods." Mutat Res 574(1-2): 156-172.
-Jakszyn P., et al. (2004). "Development of a Food Database of Nitrosamines, Heterocyclic Amines, and
Polycyclic Aromatic Hydrocarbons." J Nutr 134: 2011-2014.
-Jegasothy H., et al. (2014). "In vitro heme and non-heme iron capture from hemoglobin, myoglobin and ferritin
by bovine lactoferrin and implications for suppression of reactive oxygen species in vivo." Biometals 27(6):
1371-1382.
-Johnson C. M., et al. (2013). "Meta-analyses of colorectal cancer risk factors." Cancer Causes Control 24(6):
1207-1222.
-Junot C., et al. (2014). "High resolution mass spectrometry based techniques at the crossroads of metabolic
pathways." Mass Spectrom Rev 33(6): 471-500.
-Kamangar F., et al. (2006). "Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents:
defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world." J Clin Oncol 24(14):
2137-2150.
-Kashtanova D. A., et al. (2015). "Association between the gut microbiota and diet: Fetal life, early childhood,
and further life." Nutrition.
-Kassie F., et al. (2004). "Effect of intestinal microfloras from vegetarians and meat eaters on the genotoxicity
of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline, a carcinogenic heterocyclic amine." J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 802(1): 211-215.
60
-Kikuchi G., et al. (1958). "The enzymatic synthesis of gamma-aminolevulinic acid." J Biol Chem 233: 1214-
1219.
-Kim E., et al. (2013). "Review of the association between meat consumption and risk of colorectal cancer."
Nutr Res 33(12): 983-994.
-Kim S., et al. (2015). "Food metabolomics: from farm to human." Curr Opin Biotechnol 37: 16-23.
-Kinzler K. and B. Vogelstein (1996). "Lessons from hereditary colorectal cancer." Cell 87: 159-170.
-Koeth R. A., et al. (2013). "Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes
atherosclerosis." Nat Med 19(5): 576-585.
-Kuhnle G. G. and S. Bingham (2007). "Dietary meat, endogenous nitrosation and colorectal cancer."
Biochemical society transactions 35(5): 1355-1357.
-Kuhnle G. G., et al. (2007). "Diet-induced endogenous formation of nitroso compounds in the GI tract." Free
Radic Biol Med 43(7): 1040-1047.
-Larsson S. C., et al. (2005). "Whole grain consumption and risk of colorectal cancer: a population-based
cohort of 60,000 women." Br J Cancer 92(9): 1803-1807.
-Le Marchand L., et al. (2002). "Red Meat Intake, CYP2E1 Genetic Polymorphisms, and Colorectal Cancer
Risk." Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 11: 1019-1024.
-Lee W.-C. and K. H. Lee (2004). "Applications of affinity chromatography in proteomics." Analytical
Biochemistry 324(1): 1-10.
-Lepetit J. (2008). "Collagen contribution to meat toughness: Theoretical aspects." Meat Sci 80(4): 960-967.
-Lewin M. H., et al. (2006). "Red meat enhances the colonic formation of the DNA adduct O6-carboxymethyl
guanine: implications for colorectal cancer risk." Cancer Res 66(3): 1859-1865.
-Lipkin M. (1974). "Phase 1 and phase 2 proliferative lesions of colonoc epithelial cells in diseases leading to
colonic cancer." Cancer(34): 878-888.
-Lombardi-Boccia G., et al. (2002). "Total Heme and Non-heme Iron in Raw and Cooked Meats." Food
Chemistry and Toxicology 67(5): 1-4.
-Maier B., et al. (1974). "Effects of a high-beef diet on bowel flora: a preliminary report." Am J Clin Nutr 27:
1470-1474.
-Markowitz S., et al. (1995). "Inactivation of the Type II TGF-β Receptor in Colon Cancer Cells with
Microsatellite Instability." Science 268(5215): 1336-1338.
-Marnett L. (2000). "Oxyradicals and DNA damage." Carcinogenesis 21(3): 361-370.
-Massey R., et al. (1988). "An investigation of the endogenous formation of apparent total N-nitroso
compounds in conventional microflora and germ-free rats." Fd Chem. Toxic. 26(7): 595-600.
-McNiven E. M., et al. (2011). "Analytical metabolomics: nutritional opportunities for personalized health." J
Nutr Biochem 22(11): 995-1002.
-Minekus M., et al. (2014). "A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international
consensus." Food Funct 5(6): 1113-1124.
-Nguyen T. T. P., et al. (2015). "A comprehensive review on in vitro digestion of infant formula." Food Research
International 76: 373-386.
-Nixon C., et al. (1986). "Nuclear magnetic resonance." Anaesthesia 41: 131-137.
-Novakova L. and H. Vlckova (2009). "A review of current trends and advances in modern bio-analytical
methods: chromatography and sample preparation." Anal Chim Acta 656(1-2): 8-35.
-O'Hara A. M. and F. Shanahan (2006). "The gut flora as a forgotten organ." EMBO Rep 7(7): 688-693.
61
-O'Sullivan A., et al. (2011). "Dietary intake patterns are reflected in metabolomic profiles: potential role in
dietary assessment studies." Am J Clin Nutr 93(2): 314-321.
-Ogle J., et al. (1962). "3-Hydroxyproline, a new amino acid of collagen." The Journal of Biological Chemistry
237(12): 3667-3673.
-Ojanpera I., et al. (2012). "Current use of high-resolution mass spectrometry in drug screening relevant to
clinical and forensic toxicology and doping control." Anal Bioanal Chem 403(5): 1203-1220.
-Oostindjer M., et al. (2014). "The role of red and processed meat in colorectal cancer development: a
perspective." Meat Sci 97(4): 583-596.
-Pan A., et al. (2012). "Red meat consumption and mortality: results from 2 prospective cohort studies." Arch
Intern Med 172(7): 555-563.
-Paskett E. D., et al. (2007). "Association between cigarette smoking and colorectal cancer in the Women's
Health Initiative." J Natl Cancer Inst 99(22): 1729-1735.
-Patel P. and P. De (2016). "Trends in colorectal cancer incidence and related lifestyle risk factors in 15-49-
year-olds in Canada, 1969-2010." Cancer Epidemiol 42: 90-100.
-Payne A. N., et al. (2012). "Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling." Trends
Biotechnol 30(1): 17-25.
-Payne C., et al. (2008). "Hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon
carcinogenesis." Clinical and Experimental Gastroenterology 19(47): 19-47.
-Pignatelli B., et al. (1993). "Mutagens, N-nitroso compounds and their precursors in gastric juice from patients
with and without prrecancerous lesions of the stomach." European Journal of Cancer 29A(14): 2031-2039.
-Qiao Y., et al. (2013). "Alterations of the gut microbiota in high-fat diet mice is strongly linked to oxidative
stress." Appl Microbiol Biotechnol 97(4): 1689-1697.
-Rainville P. D., et al. (2014). "Advances in liquid chromatography coupled to mass spectrometry for metabolic
phenotyping." TrAC Trends in Analytical Chemistry 61: 181-191.
-Rombouts C., et al. (2016). High-resolution mass spectrometry based metabolomics reveals acylcarnitines
as key metabolites discriminating red from white meat colonic digestion. 61st International Congress of Meat
Science and Technology. Clermont-Ferrand, France.
-Römpp A. and B. Spengler (2013). "Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space."
Histochem Cell Biol 139(6): 759-783.
-Ross A. B., et al. (2015). "Herring and Beef Meals Lead to Differences in Plasma 2-Aminoadipic Acid, beta-
Alanine, 4-Hydroxyproline, Cetoleic Acid, and Docosahexaenoic Acid Concentrations in Overweight Men." J
Nutr 145(11): 2456-2463.
-Roux A., et al. (2012). "Annotation of the human adult urinary metabolome and metabolite identification using
ultra high performance liquid chromatography coupled to a linear quadrupole ion trap-Orbitrap mass
spectrometer." Anal Chem 84(15): 6429-6437.
-Rutherfurd S. M. and P. J. Moughan (2007). "Development of a novel bioassay for determining the available
lysine contents of foods and feedstuffs." Nutr Res Rev 20(1): 3-16.
-Saffhill R., et al. (1985). "Mechanisms of carcinogenesis induced by alkylating agents." Biochimica et
Biophysica Acta 823: 111-145.
-Scalbert A., et al. (2014). "The food metabolome: a window over dietary exposure." Am J Clin Nutr 99(6):
1286-1308.
62
-Schwab C., et al. (2000). "Search for Compounds That Inhibit the Genotoxic and Carcinogenic Effects of
Heterocyclic Aromatic Amines." Critical Reviews in Toxicology 30(1): 1-69.
-Seline K. and H. Johein (2007). "The determination of l-carnitine in several food samples." Food Chemistry
105(2): 793-804.
-Seo T., et al. (1994). "A generalized Tukey conjecture for multiple comparisons among mean vectors." Journal
of the American Statistical Association 89(426): 676-679.
-Sesink A., et al. (1999). "Red Meat and Colon Cancer: The Cytotoxic and Hyperproliferative Effects of Dietary
Heme." Cancer Research 59: 5704-5709.
-Sesink A., et al. (2001). "Red meat and colon cancer: dietary haem-induced colonic cytotoxicity and epithelial
hyperproliferation are inhibited by calcium." Carcinogenesis 22(10): 1653-1659.
-Sherry (1984). Gadolinium chelates as NMR contrast agents, The Board of Regents, The University of Texas
System. 4639365.
-Smolinska A., et al. (2012). "NMR and pattern recognition methods in metabolomics: from data acquisition to
biomarker discovery: a review." Anal Chim Acta 750: 82-97.
-Sobhani I., et al. (2011). "Microbial dysbiosis in colorectal cancer (CRC) patients." PLoS One 6(1): e16393.
-Spiegelhalder B., et al. (1976). "Influence of dietary nitrate on nitrite content of human saliva: possible
relevance to in vivo formation of N-nitroso compounds." Fd. Cosmet Toxicol 14: 545-548.
-Stavric B. (1994). "Biological significance of trace levels of mutagenic heterocyclic aromatic amines in human
diet: a critical review." Food Chemistry Toxicology 32(10): 977-994.
-Steiber A., et al. (2004). "Carnitine: a nutritional, biosynthetic, and functional perspective." Mol Aspects Med
25(5-6): 455-473.
-Sumner L. W., et al. (2007). "Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis
Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI)." Metabolomics 3(3): 211-221.
-Tomé D. and C. Bos (2007). "Lysine requirement through the human life cycle." The journal of nutrition 137:
1642S-1645S.
-Tricker A. (1997). "N-nitroso compounds and man: sources of exposure, endogenous formation and
occurrence in body fluids." European Journal of Cancer Preventio 6: 226-268.
-Tricker A. and R. Preussmann (1991). "Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurence, formation,
mechanismsand carcinogenic potential." Mutation Research 259: 277-289.
-Uronis J. M., et al. (2009). "Modulation of the intestinal microbiota alters colitis-associated colorectal cancer
susceptibility." PLoS One 4(6): e6026.
-Van de Wiele T., et al. (2015). "The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME®)." 305-
317.
-Van den Abbeele P., et al. (2013). "Different human gut models reveal the distinct fermentation patterns of
Arabinoxylan versus inulin." J Agric Food Chem 61(41): 9819-9827.
-van den Brandt P. A. and R. A. Goldbohm (2006). "Nutrition in the prevention of gastrointestinal cancer." Best
Pract Res Clin Gastroenterol 20(3): 589-603.
-Vanden Bussche J., et al. (2014). "O(6)-carboxymethylguanine DNA adduct formation and lipid peroxidation
upon in vitro gastrointestinal digestion of haem-rich meat." Mol Nutr Food Res 58(9): 1883-1896.
-Vanden Bussche J., et al. (2015). "Validated High Resolution Mass Spectrometry-Based Approach for
Metabolomic Fingerprinting of the Human Gut Phenotype." Anal Chem 87(21): 10927-10934.
63
-Vanhaecke L., et al. (2008). "The microbial PhIP metabolite 7-hydroxy-5-methyl-3-phenyl-6,7,8,9-
tetrahydropyrido[3',2':4,5]imidazo[1,2-a]pyri midin-5-ium chloride (PhIP-M1) induces DNA damage, apoptosis
and cell cycle arrest towards Caco-2 cells." Toxicol Lett 178(1): 61-69.
-Vogelstein B. and K. Kinzler (1993). "The mutlistep nature of cancer." Reviews 9(4): 138-141.
-Vogelstein B. and K. W. Kinzler (2004). "Cancer genes and the pathways they control." Nat Med 10(8): 789-
799.
-WCRF (2011). "Continuous Update Project Report. Food, Nutrition, Physical Activity, and the Prevention of
Colorectal Cancer."
-WCRF (2012). "World Cancer Research Fund International."
-Weckwerth W. and K. Morgenthal (2005). "Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation."
Drug Discovery Today 10(22): 1551-1558.
-Wei E. K., et al. (2009). "Cumulative risk of colon cancer up to age 70 years by risk factor status using data
from the Nurses' Health Study." Am J Epidemiol 170(7): 863-872.
-Werner T., et al. (2010). "Depletion of luminal iron alters the gut microbiota and prevents Crohn's disease-like
ileitis." Gut 60: 325-333.
-Wickham M., et al. (2009). "In vitro digestion methods for assessing the effect of food structure on allergen
breakdown." Mol Nutr Food Res 53(8): 952-958.
-Windey K., et al. (2012). "Relevance of protein fermentation to gut health." Mol Nutr Food Res 56(1): 184-
196.
-Wishart D. S., et al. (2013). "HMDB 3.0 - The Human Metabolome Database in 2013."
Top Related