Studie van nieuwe functies van Ran GTPase en NTF2 met...
65
Studie van nieuwe functies van Ran GTPase en NTF2 met behulp van nanobodies Kevin De Muynck Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Jan Gettemans Begeleidster: Dr. Katrien Van Impe Vakgroep Biochemie (UGent) – Medisch proteïne onderzoek (VIB) Academiejaar 2011-2012
Transcript of Studie van nieuwe functies van Ran GTPase en NTF2 met...
Studie van nieuwe functies
van Ran GTPase en NTF2
met behulp van nanobodies
Kevin De Muynck
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Jan Gettemans
Begeleidster: Dr. Katrien Van Impe
Vakgroep Biochemie (UGent) – Medisch proteïne onderzoek (VIB)
Academiejaar 2011-2012
Studie van nieuwe functies
van Ran GTPase en NTF2 met
behulp van nanobodies
Kevin De Muynck
Verhandeling ingediend tot het
verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Jan Gettemans
Begeleidster: Dr. Katrien Van Impe
Vakgroep Biochemie (UGent) – Medisch proteïne onderzoek (VIB)
Academiejaar 2011-2012
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor
consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk
gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht,
in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te
vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum:
Kevin De Muynck Prof. Dr. Jan Gettemans (handtekening student) (handtekening promotor)
Voorwoord
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Deze masterproef, het resultaat van een onderdompeling in het wetenschappelijk onderzoek
gedurende het academiejaar 2011-2012, is het finale product van een traject met vallen en
opstaan. Als er één aspect is van het uitvoeren van onderzoek die tijdens deze stageperiode
zéér duidelijk aan het licht kwam, dan is dit het feit dat wetenschap in de praktijk vaak ver
verwijderd is van de theorie. Gelukkig werd ik omringd door een aantal mensen met
specifieke kennis en vaardigheden waarop ik op tijd en stond kon terugvallen. Het is dan ook
mede dankzij hen dat het werk die u hieronder zal doornemen tot stand gekomen is.
Vooreerst zou ik graag Prof. Dr. Jan Gettemans willen bedanken om mij de kans en de
middelen te geven om mijn masterproef tot een goed einde te brengen binnen zijn
onderzoeksgroep. Ten tweede gaat een hartelijk woord van dank uit naar Dr. Katrien Van
Impe, mijn begeleidster, die mij van dichtbij bepaalde wetenschappelijke principes, theorieën
en praktische handelingen heeft aangeleerd, alsook het correct analyseren en interpreteren
van de verworven data.
Ook wil ik zeker en vast de andere leden van het onderzoeksteam bedanken. Voor de meest
uiteenlopende vragen kon ik steeds bij jullie terecht. Bedankt dus aan Dr. Ariane Deganck,
Ciska Boucherie, Evelien Martens, Isabelle Van Audenhove, Jonas Bethuyne, Olivier
Zwaenepoel, Sarah Declercq, Dr. Thomas Hubert, Wouter Van Overbeke en Adriaan
Verhelle, mijn collega thesisstudent. Verder dank ik ook Berlinda Vanloo voor haar bijdrage
aan deze masterproef d.m.v. haar knowhow omtrent isothermal titration calorimetry (ITC).
Zeer zeker wil ik nog mijn ‘bomma’, ‘bompa’ en moeder bedanken voor hun steun in alle
mogelijke vormen. Wat me zeker zal bijblijven is hoe steeds gevraagd werd: “En? Zijn de
buisjes en de beestjes gelukt vandaag?” Daarnaast bedank ik ook al mijn vrienden voor de
plezierige en vooral ontspannende momenten, want een immer gespannen boog zou na
verloop van tijd zijn pijlen niet langer met voldoende kracht kunnen afvuren.
Tot slot was het een leerrijk academiejaar die een substantieel deel aan ervaring heeft
meegegeven en zodoende ook een eerste realistische kijk gaf op het toekomstige
professionele aspect van het leven.
Afkortingen
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
(m)Abs = (monoclonal) antibodies
AZ = aminozuur
CRM1 = chromosomal region
maintenance
CDR = complementary determining
region
Fab = antigen binding fragment
Fc = constant fragment
FR = framework region
EGFR = epidermal growth factor receptor
EOC = epithelial ovarium carcinoma
GFP = green fluorescent protein
GBP = GFP binding protein
HRP = horse radish peroxidase
IMAC = immobilized metal affinity
chromatography
ITC = isothermal titration calorimetry
KT = kinetochoor
NE = nucleaire envelope
NES = nucleair export signaal
NLS = nucleair lokalisatie signaal
NTF2 = nuclear transport factor 2
Nb = nanobody
NPC = nuclear pore complex
NuPs = nucleoporins
MALDI = matrix assisted laser
desorption/ionisation
MT = microtubulus
RanBP = Ran binding protein
RanGAP = Ran GTPase activating protein
RanGEF = Ran guanine nucleotide
exchanging factor
RCC1 = regulator of chromosome
condensation 1
VH = variable part of the heavy chain
VHH = variable part of the heavy chain
of heavy-chain antibodies
VL = variable part of the light chain
SAFs = spindle assembly factors
SDS-PAGE = sodium(Na)-dodecyl-sulfate
polyacrylamide gel
electrophoresis
SCID = severe combined
immunodeficiency
PARP = poly-ADP ribose polymerase
PCD = programmed cell death
PSA = prostate specific antigen
XEE = Xenopus laevis egg extracts
Inhoudstafel
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Samenvatting 1
Inleiding 2
1. Het Ran systeem doorheen de celcyclus 2
1.1 Nucleocytoplasmatisch transport 2
1.2 Nuclear transport factor 2 4
1.3 Ran reguleert de mitose 5
1.4 Ran en NTF2 in relatie tot kanker en apoptose 6
2. Nanobodies 9
2.1 Structuur en functie 9
2.2 Voor- en nadelen 10
2.3 Toepassingen 11
Materiaal en methoden 13
1. DNA manipulaties 13
1.1 Beschikbare plasmiden 13
1.2 Kloneren NES target sequence in RanNb-pEGFP-N1 13
1.2.1 Annealing oligonucleotiden 13
1.2.2 Restrictiedigest plasmide 13
1.2.3 Fosforylering oligonucleotiden ; defosforylering geknipt plasmide 13
1.2.4 Ethanolprecipitatie 14
1.2.5 Ligatie 14
1.2.6 Transformatie E. coli TOP10 ; Uitplaten ; Plasmide-extractie 14
1.2.7 Controlerestrictiedigest 15
2. Celcultuur 15
2.1 Cellijnen en onderhoud 15
2.2 Cellen tellen en uitzaaien 15
2.3 Transfectie 16
3. Karakterisering nanobody-ligand interactie (recombinant) 16
3.1 Productie en opzuivering van recombinante proteïnen 16
3.1.1 NTF2-nanobody productie 16
3.1.2 SUMO-NTF2-WT en SUMO-NTF2-M118E productie 16
3.1.3 Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) 17
3.1.4 MonoQ chromatography 17
3.2 SDS-PAGE en Western Blotting 18
3.3 Isothermal titration calorimetry (ITC) 18
3.4 Immunoprecipitatie op recombinante eiwitten 19
3.5 Pull-down assay 19
4. Functionele assays 19
4.1 Immunoprecipitatie 19
4.2 Immuunkleuring en microscopie 20
4.3 Flowcytometrie 21
4.4 (Geproteolyseerd) caspase-3 en PARP detectie 21
Resultaten 22
A) NTF2-Nb8 heeft een potentieel hogere affiniteit voor NTF2-M118E
t.o.v. NTF2-WT 22
1. Productie en opzuivering van recombinante NTF2-Nbs en
SUMO-NTF2-WT/-M118E 22
2. Karakterisering van de interactie van NTF2-WT en NTF2-M118E
met NTF2-Nb8 24
2.1 Analyse met behulp van recombinante eiwitten 24
2.1.1 Immunoprecipitatie op recombinant NTF2-Nb8 24
2.1.2 Pull-down assay 25
2.1.3 Isothermal titration calorimetry (ITC) 26
2.2 Intracellulaire analyse 28
2.2.1 MOM recruitment assay 28
2.2.2 Intracellulaire lokalisatie van GFP-getaggeerd
NTF2-WT/-M118E en NTF2-Nb8 29
2.2.3 Optimaliseren van plasmide verhoudigen voor cotransfectie 31
2.2.4 Co-immunoprecipitatie van NTF2-Nb8 33
B) RanNb colokaliseert met endogeen Ran en het centrosoom 35
1. Kloneren van een NES sequentie in RanNb-pEGFP-N1 35
2. Intracellulaire lokalisatie van GFP-getaggeerd (NES) 36
3. MOM recruitment assay 37
4. Immunoprecipitatie van MOM-Ran-V5 38
C) NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb induceren apoptose
in HEK293T cellen 48u na transfectie 40
1. Kwantificatie van apoptose inductie in NTF2-Nb-GFP of
(NES)-RanNb-GFP getransfecteerde HEK293T cellen a.d.h.v. flowcytometrie 40
2. Detectie van caspase-3 en PARP verknipping in HEK293T cellen 42
Discussie 43
1. Evaluatie van de NTF2 – NTF2-Nb interactie 43
2. RanNb colokaliseert met endogeen Ran en het centrosoom 45
3. Inductie van apoptose door NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb 46
4. Algemene conclusie 48
Referenties 48
1
Samenvatting
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Het Ran proteïne is een klein GTPase dat centraal functioneert in een netwerk waarin
multipele cellulaire functies gereguleerd worden. Deze functies zijn meer bepaald
nucleocytoplasmatisch transport, regulatie van de mitose en opbouw en afbraak van de
nucleaire enveloppe. Een centraal mechanisme is de RanGTP/RanGDP turnover. Meer
specifiek, bij nucleocytoplasmatisch transport, functioneert het NTF2 dimeer als nucleaire
importreceptor voor RanGDP opdat deze terug kan omgezet worden in RanGTP. Kortom
zorgt NTF2 ervoor dat Ran niet depleteert uit de kern. Tot voor kort werd deze functie als
enige functie toegekend aan NTF2. Recente studies hebben echter nieuwe functies voor
NTF2 onthuld. Eerder al werd gedacht dat NTF2 naast zijn dimere vorm ook partieel
monomeer zou voorkomen in de cel, waarbij zijn aggregatiestatus zou kunnen correleren met
zijn functie. Een NTF2-M118E mutant die substantieel de dimerisatie vermindert, werd toen
reeds ontwikkeld.
In deze masterproef werd gebruik gemaakt van nanobodies als potentiële inhibitoren om
gekende functies van Ran en NTF2 te trachten inhiberen, en als onderzoeksinstrument om
mogelijkerwijs nieuwe functies te ontdekken.
Aan de hand van colokalisatiestudies werd NTF2-Nb8 aangetroffen ter hoogte van het
centrosoom. NTF2-wild type(WT) en NTF2-M118E colokaliseren bovendien ook met het
centrosoom. Co-immunoprecipitaties onthulden een potentieel hogere affiniteit van NTF2-
Nb8 voor NTF2-M118E in vergelijking met NTF2-WT. Dit resultaat werd enigszins gestaafd
door isothermal titration calorimetry experimenten via recombinant geproduceerd SUMO-
NTF2-WT, SUMO-NTF2-M118E.
Ook het RanNb en NES-getaggeerd RanNb lokaliseren zich ter hoogte van het centrosoom,
maar het NES-RanNb is niet in staat om endogeen Ran te delokaliseren uit de kern.
Verder is zowel het RanNb alsook het NES-RanNb en zelfs NTF2-Nb8 in staat om apoptose
te induceren in HEK293T cellen 48 u na transfectie. Ondanks het feit dat verder
experimenteel onderzoek dient uit te wijzen wat het exacte aangrijpingspunt van deze
nanobodies is, zou de apoptose inducerende capaciteit van NTF2-Nb8, RanNb en NES-
RanNb een mogelijke eerste stap kunnen zijn in de richting van de ontwikkeling van nieuwe
kankertherapeutica.
2
Inleiding
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Het Ran systeem doorheen de celcyclus
Ran, lid van de Ras eiwitfamilie, is een klein GTPase dat centraal functioneert in een netwerk
waarin multipele cellulaire functies gereguleerd worden. Ran en z’n bijhorende cellulaire
functies worden gesegregeerd in tijd en in ruimte. Zo lagde focus lag sinds de ontdekking van
RAN anno 1990 vooral op het onderzoeken van Ran in relatie tot nucleocytoplasmatisch
transport. Eind jaren ’90 werd echter voor het eerst aangetoond dat het aanpassen van de
RanGTP/RanGDP verhouding in Xenopus laevis egg extracts (XEE) leidt tot vorming van
abberante mitotische spoelfiguren, suggestief voor een rol van Ran in de mitose [1].
Recentere studies wezen bovendien op een verhoogde expressie van Ran in meerdere
kankertypes, waaruit de hedendaagse erkenning van Ran volgde als potentieel doelwit in
kankertherapie [2].
1.1 Nucleocytoplasmatisch transport
Eukaryote cellen worden typisch gekenmerkt door scheiding van nucleus en cytoplasma
tijdens interfase. De nucleaire enveloppe (NE), de dubbele membraan die het nucleoplasma
omsluit, bevat Nuclear Pore Complexes (NPCs) die nucleocytoplasmatisch transport toelaten.
NPCs zijn meer bepaald grote, porievormende proteïnecomplexen opgebouwd uit meerdere
types nucleoporines. Complete segregatie van kern en cytoplasma zou immers letaal zijn.
De import en export van eiwitten en nucleïnezuren doorheen deze NPCs wordt sterk
gereguleerd. Eiwitten die groter zijn dan de passieve diffusielimiet van ca. 50 kDa dienen
gebruik te maken van transportreceptoren. De meeste transportreceptoren behoren tot de β-
karyoferine familie, waarbij een onderscheid wordt gemaakt tussen importines en exportines.
Opdat eiwitten hierbij in het correcte compartiment terecht komen, maakt de eukaryote cel
gebruik van target sequences. Een Nuclear Localization Signal (NLS) brengt eiwitten
intranucleair, terwijl een Nuclear Export Signal (NES) eiwitten naar het cytoplasma draagt.
Een centrale en tevens cruciale rol in nucleocytoplasmatisch transport wordt ingenomen door
Ran. Ran bevindt zich in de kern vnl. in een GTP gebonden status, en in het cytoplasma is
Ran vnl. GDP gebonden waardoor een Ran gradiënt heerst over de nucleaire enveloppe heen.
Het in stand houden van deze gradiënt is gebaseerd op twee mechanismen. (i) De ruimtelijke
scheiding van RanGTPase Activating Protein (RanGAP) en Ran Guanine nucleotide
3
Fig. 2. Nucleaire proteïne import
cyclus. De transportreceptor hier is
importine-β (β) waarbij ook nood is
aan importine-α (α), een adaptor
eiwit dat het NLS van het te
importeren proteïne bindt. RanGTP
zorgt, na dissociëren van dit
drievoudig import complex, tevens
voor de retranslocatie van
importine-β naar het cytoplasma [4].
Fig. 1. 3D structuur van de NTF2 dimeer-
RanGDP interactie. Elk monomeer bindt één
RanGDP molecule. Ran is getoond in het
groen. GDP is getoond in het blauw. De
NTF2 monomere subeenheden zijn getoond
in rood en geel [3].
Exchange Factor (RanGEF of RCC1 (regulator of chromosome condensation 1)): het vnl.
cytoplasmatische RanGAP hydrolyseert RanGTP tot RanGDP, het vnl. nucleaire RanGEF
vervangt GDP door GTP. (ii) De re-importering van RanGDP wordt verzekerd door Nuclear
Transport Factor 2 (NTF2), opdat RanGTP niet zou depleteren uit de kern. NTF2 is een
homodimeer vormend eiwit en kan 2 RanGDP moleculen tegelijk transporteren (Fig. 1) [3].
RanGTP reguleert transport door het
dissociëren van importcomplexen en het
assembleren van exportcomplexen. Verschillende import- en exportreceptoren zijn
afhankelijk van dit Ran systeem, waarbij de klassieke nucleaire proteïne import, gebruik
makend van importine-α en -β (Fig. 2) reeds het best gekarakteriseerd is. Vele van de
mechanisch-moleculaire interacties van deze cyclus zijn reeds beschreven en worden
gedetailleerd besproken in de review van Stewart et al. [5]. Bij de export van NES-bevattende
eiwitten speelt het CRM1(chromosomal region maintenance) proteïne een voorname rol.
RanGTP stabiliseert nl. het NES-proteïne/CRM1 complex en activeert zo export [2].
Vervolgens vervult het cytoplasmatische Ran Binding Protein 1 (RanBP1) een functie door
de RanGAP activiteit te stimuleren. Op die manier wordt RanGTP sneller omgezet tot
RanGDP en worden bepaalde eiwitcomplexen, zoals NES-proteïne/CRM1/RanGTP of
importine-β/RanGTP, sneller gedissocieerd [2,3].
4
Naast de indirecte regulatie van import-export kon anno 2008 een nieuwe functie worden
toegeschreven aan het Ran-NTF2 complex, nl. de nucleaire import van CapG, een actine
bindend eiwit dat een typische NLS sequentie ontbreekt. Resultaten van deze studie wezen op
een specifieke interactie tussen NTF2 en CapG die zowel in vitro als in vivo werd
aangetoond. Bovendien blijkt het zo dat de RanGDP-NTF2 binding een cruciale interactie is
alvorens nucleaire CapG import kan doorgaan [6]. Een jaar later werd wederom een nieuwe
interactiepartner ontdekt voor het Ran-NTF2 complex, nl. het SH2 domein van de Shc
familie, adaptor proteïnes van receptor tyrosine kinasen [7].
1.2 Nuclear transport factor 2
De voornaamste functie van NTF2 is zijn rol bij de nucleaire import van Ran-GDP. NTF2
bindt enerzijds aan RanGDP en anderzijds aan nucleoporines die FxFG repeats bevatten.
Elke monomere subeenheid van NTF2 gebruikt hiervoor twee verschillende en tevens
onafhankelijke bindingsplaatsen waarbij de dissociatieconstante Kd (NTF2-RanGDP) 100 nM, en
de Kd (NTF2-FxFG) 1 µM bedraagt. Vóór 2001 werd steeds gedacht dat NTF2 in vivo enkel als
dimeer voorkwam. In een studie in dat jaar zelf leverde de bepaling van de Kd (NTF2 dimeer) een
waarde op van 1.1 (± 0.05) µM. De NTF2 concentraties in het nucleoplasma en cytoplasma
bedragen bovendien respectievelijk 0,6 en 0,3 µM, wat suggereert dat NTF2 in een zekere
proportie monomeer voorkomt in vivo. Dit deed de vraag rijzen welke invloed de
aggregatiestatus van NTF2 heeft op zijn functie, maar omdat de Kd (NTF2 dimeer) van dezelfde
grootteorde is als de associatieconstante (Ka) (NTF2-RanGDP), alsook de Ka (NTF2-FxFG), wordt het
nagaan hiervan technisch bemoeilijkt. Om die reden werden er drie methionine (M) naar
glutaminezuur (E) mutanten gecreëerd op AZ posities 84, 102 en 118 om dimerisatie
substantieel te reduceren (Suppl. Fig. 1). Deze AZ posities bevinden zich nl. in de hydrofobe
dimeer interface. De M118E mutant is het meest effectief daar deze monomeer blijft tot aan
concentraties van 150 µM. Uit een pull-down assay bleek dat NTF2-M118E minder capabel
was om zowel RanGDP, alsook Nsp1-FF18 (18 FxFG repeats van het gist NSP1
nucleoporine eiwit) neer te halen in vergelijking met het wild-type NTF2 (NTF2-WT). Meer
nog, NTF2-M118E gekoppeld aan colloïdale goudpartikels vertoonde een sterk gedaalde
aanwezigheid t.h.v. de NPCs t.o.v. NTF2-WT na injectie in Xenopus oöcyten. Deze studie
impliceert dus dat de functie van NTF2 weldegelijk wordt beïnvloed door zijn monomeer-
dimeer balans [8].
5
Fig. 3. Het Ran netwerk
reguleert de mitose op
meerdere cellulaire locaties.
Een lokale kinetochoor (KT)
Ran cyclus speelt een rol in
het aantrekken van MTs naar
het KT en tevens de
aanhechting te stabiliseren.
De microtubule (MT) Ran
cyclus reguleert de dynamiek
van de MTs. De
centrosomale Ran cyclus
staat in voor de opbouw en
het behoud van de polariteit
van de mitotische
spoelfiguur. De voornaamste
eiwitten betrokken bij elke
cyclus worden weergegeven.
RCC1 = RanGEF [2].
1.3 Ran reguleert de mitose
Tijdens de mitose staat Ran in voor de vorming van de mitotische spoelfiguur. Het
basisprincipe van RanGTP-RanGDP turnover blijft immers functioneren na de afbraak van
de NE, maar niet langer in context van nucleocytoplasmatisch transport. Doordat RanGEF1
chromosomaal verankerd is, is er een cluster van RanGTP aanwezig in de directe nabijheid
van chromatine waardoor Spindle assembly factors (SAF), gecomplexeerd aan importine-β
via een NLS, zouden dissociëren t.h.v. deze cluster. Bijgevolg kunnen de vrijgestelde en dus
actieve SAFs hun functie uitoefenen en correct de mitotische spoelfiguur helpen opbouwen
(reguleren). Een belangrijk gegeven hierbij is dat RanGTP diffundeerbaar is. Zo zou
RanGTP, volgens het proteïne lokalisatie model, regionale signalen creëren door complexen
te vormen op specifieke plaatsen waar Ran effectoren voorkomen [1]. Op die manier is
bijvoorbeeld CRM1, naast zijn activiteit in nucleocytoplasmatisch transport, ook functioneel
tijdens de mitose. CRM1 associeert nl. met het kinetochoor (KT) t.h.v. het chromosomale
centromeer waardoor RanBP2 en RanGAP1 op dezelfde plaats worden aangetroffen.
Hierdoor ontstaat een zeer lokale Ran cyclus die verder downstream resulteert in het
aantrekken van microtubules (MT) naar het KT. RanBP2 (of Nup358) is een Ran bindend
proteïne met SUMO ligase activiteit. RanGAP1 wordt immers naar het KT gelokaliseerd in
een SUMO gemodificeerde vorm. Het RanBP2/RanGAP1 complex zorgt uiteindelijk voor de
stabilisatie van de MT aanhechting aan het KT (Fig. 3, Kinetochore Ran cycle) [1,2].
Gelijkaardige lokale Ran complexvorming wordt eveneens teruggevonden t.h.v. het
6
centrosoom waar uiteindelijk de MT nucleatie en elongatie wordt beïnvloed. Een evenwicht
in de Ran netwerk componenten en Ran gereguleerde proteïnes t.h.v. de centrosomen is
cruciaal voor het opbouwen en behouden van de polariteit van de mitotische spoelfiguur (Fig.
3, Centrosomal Ran cycle) [1,2]. Bovendien zou Ran reeds in interfase een rol spelen bij
centrosoomduplicatie [2]. Echter, het centrosoom is geen absoluut noodzakelijke cellulaire
component voor progressie doorheen mitose. Sommige zoogdiercellen zonder centrosoom
doorlopen de mitose, maar wel aanzienlijk trager. De helft van dergelijke cellen faalt immers
in het correct polariseren of positioneren van de mitotische spoelfiguur [9]. Finaal reguleren
Ran en enkele effectoren ook de dynamische activiteit van MTs die geprojecteerd worden
vanuit centrosomen tot deze contact maken met KTs (Fig. 3, MT Ran cycle). Op die manier
reguleert het Ran systeem meerdere cruciale processen doorheen de mitose. Indien er dus
fouten zouden optreden in de regulatie van de opbouw en het functioneren van de mitotische
spoelfiguur, leidt dit mogelijks tot achtereenvolgens foutieve chromosoomsegregatie, verlies
aan chromosomale stabiliteit, aneuploïdie en uiteindelijk tumorigenese [2]. In de telofase van
mitose wordt de mitotische spoelfiguur terug afgebroken en de NE gereconstrueerd rondom
het gedecondenseerd chromatine. Ook hierin zou Ran een regulerende functie vervullen, al is
er over dit mechanisme nog niet veel achterhaald. Ran’s rol hierin werd ontdekt wanneer
Ran-bedekte beads werden toegevoegd aan XEE en er vervolgens, in afwezigheid van
chromatine, een lipidelaag gevormd werd uit individuele vesikels waarin NPCs waren
geïncorporeerd. RanGDP gecoate beads vereisten RCC1 aanwezigheid en de inhibitie van
RanGAP1 reduceerde vesikelfusie, duidend op de nood aan zowel RanGTP generatie als Ran
turnover [1]. Omgekeerd zou Ran tevens de NE afbraak reguleren tijdens de vroege stappen
van de mitose [10].
Kort samengevat is Ran dus een centrale regulator in een netwerk waarin dit eiwit, samen met
zijn effectoren, meerdere processen doorheen de celcyclus reguleert in tijd en ruimte.
1.4 Ran en NTF2 in relatie tot kanker en apoptose
De enorme vooruitgang op vlak van genexpressieprofilering in de afgelopen jaren heeft
geleid tot de vaststelling dat abberrante expressie van één of meerdere Ran netwerk leden in
nagenoeg alle tumortypes voorkomt [2]. De hypothese dat Ran een potentieel doelwit is in
kankertherapie werd dus vooropgesteld. Zo werd bijvoorbeeld reeds aangetoond dat een Ran
siRNA strategie efficiënt inwerkt op Neuro2A neuroblastoma cellen. Meer concreet werden
‘transferine-afgeschermde oligoethyleenimine-HD (OEI-HD) siRNA polyplexen’ aangewend
7
tegen Ran. OEI-HD is nl. een propionamide gentransfer drager met dezelfde efficiëntie als
polyethyleenimine (PEI), maar wel minder cytotoxisch, beter biodegradabel en zodus beter
toepasbaar voor in vivo administratie. Systemische toediening van deze Ran siRNA
polyplexen resulteerde in gedaalde Ran expressie, apoptose van tumorcellen en finaal tot
reductie van tumorgroei in een Neuro2A tumor muismodel [11]. Ran expressie is eveneens
sterk verhoogd in epitheliale ovariumcarcinomen (EOC) van het sereuze type en deze
expressie correleert bovendien met de agressiviteit van de carcinomen. Een shRNA aanpak
tegen Ran resulteerde in vitro in een apoptose-gemedieerde daling van het aantal cellen
(TOV112D en TOV1946 cellijnen, twee ovariumcarcinoma cellijnen van het sereuze type).
Dat het hier apoptose betreft en niet necrose werd bevestigd a.d.h.v. (verknipt) caspase-3
detectie. Bij het in vivo experiment werd een SCID muis model aangewend waarin TOV112D
cellen subcutaan werden geïnjecteerd. De inductie van Ran shRNA correleerde hier met
inhibitie van tumorgroei. Immunohistochemie bevestigde dat het hier eveneens apoptose
betreft, daar er nucleaire aanwezigheid was van caspase-3. Hiermee werd aangetoond dat Ran
niet enkel wordt overgeëxpresseerd, maar dat deze tevens cruciaal is voor de overleving van
dergelijke EOC cellen [12]. RanNBP1 siRNA lokt eveneens een caspase-3 gemedieerde
apoptose uit. Net als Ran, wordt RanBP1 eveneens overgeëxpresseerd in vele kankertypes.
Naast z’n nucleocytoplasmatische transport functie reguleert dit eiwit tevens de MT
stabiliteit. Sterker nog, wanneer RanBP1 neerregulatie gecombineerd werd met een
taxolbehandeling, werden U2OS (humane osteosarcoma cellijn) en HeLa (cervix carcinoom
cellijn) cellen aanzienlijk sensitiever voor taxol-geïnduceerde apoptose die eveneens caspase-
3 afhankelijk verloopt. Er treedt dus een synergistisch effect op. Deze resultaten duiden dus
op een relatie tussen endogene RanBP1 niveaus en de efficiëntie van medicijnen die het MT-
apparaat verstoren [13].
Nog recenter werd ontdekt dat de inhibitie van PI3K/Akt/mTORC1 en Ras/MEK/ERK
signaalwegen ertoe leidt dat kankercellen (o.a. MDA-MB-231 borstcarcinoma cellen) minder
gevoelig worden aan Ran knockdown geïnduceerde apoptose. Deze beide signaalwegen zijn
het frequentst ontregeld bij kanker en resulteren finaal in een verhoogde groeirespons en een
langere overleving van de cel. Zo zou Ran knockdown geïnduceerde apoptose dus specifiek
kunnen zijn voor kankers waarin deze banen hyperactief zijn. Eerder al werd bovendien
beschreven dat o.i.v. Ran knockdown apoptose in mindere mate optreedt bij normale cellen
i.t.t.. kankercellen. Verder schrijven de auteurs hier de geïnduceerde apoptose toe aan een
ontregeling van nucleocytoplasmatisch transport met een ectopische lokalisatie van bepaalde
transcriptiefactoren tot gevolg. Een gevolg hiervan is dat de transcriptieverhouding van
8
overlevingseffectoren op apoptotische effectoren gewijzigd is en uiteindelijk tot apoptose
leidt [14].
Hoe nucleocytoplasmatisch transport in relatie staat tot apoptose is nog steeds een onderwerp
dat meer duidelijkheid vraagt. Zo blijkt dat langs de ene kant nucleocytoplasmatisch transport
essentieel is voor apoptoseprogressie. Bepaalde mitochondriale eiwitten, zoals bv. AIF en
WOX1 dienen eerst geïmporteerd te worden in de nucleus alvorens hun apoptotische functie
uitgevoerd kan worden. Omgekeerd dienen eiwitten in sommige gevallen extranucleair
gebracht te worden om apoptose te mediëren. Langs de andere kant dan, zou een algehele
inhibitie van nucleocytoplasmatisch transport een intrinsiek apoptotisch signaal kunnen zijn
[15]. Een studie anno 2008 op Trypanosomatidae ondersteunt deze hypothese. Apoptose in
deze organismen is in grote mate analoog aan die in hogere organismen, maar vanwege
enkele duidelijke verschillen, zoals het ontbreken van caspasen, spreken de auteurs liever
over apoptosis-like of geprogrammeerde celdood (PCD).
RNAi met het Ran homoloog als doelwit resulteert ook hier in PCD. Daar Ran essentieel is in
meerdere cellulaire functies, en NTF2 vnl. functioneert als RanGDP importreceptor, trachtten
de onderzoekers hier enkel nucleocytoplasmatisch transport te inhiberen via RNAi
gemedieerde NTF2 knockdown. Deze strategie leidt eveneens tot PCD, hetgeen een bewijs
levert voor de inhibitie van nucleocytoplasmatisch transport als intrinsiek apoptosesignaal
[16].
Finaal zou Ran knockdown ook apoptose kunnen induceren door een reductie van zijn functie
tijdens de mitose. Eerder al werd ontdekt dat een mitotische stop van abnormale duur tot
apoptose leidt [2]. Het is immers beschreven dat een defect in regulatie van MT polymerisatie
celcyclusprogressie kan verhinderen en apoptose uitlokken [12], analoog aan de studie van
Rensen et al. op RanBP1[13].
9
Fig. 4. De samenstelling van een klassiek antilichaam (links), een heavy-chain antilichaam (midden) en een VHH of Nb (rechts). De domeinstructuur wordt eveneens getoond. Fc: crystallizable fragment. CH: constant
domein van de heavy-chain. CL: constant domein van de light-chain. De twee gele bollen tussen de CH2
domeinen representeren disulfidebruggen [18].
2. Nanobodies
2.1 Structuur en functie
Conventionele antilichamen (Abs) hebben een typische structuur bestaande uit twee identieke
zware ketens en twee identieke lichte ketens. De eigenlijke interactie met het antigen gebeurt
via het antigen bindend fragment (Fab), meer specifiek door zowel het variable domein van
de zware keten (VH) als dat van de lichte keten (VL). Naast dergelijke Abs is in het serum
van Camelidae (dromedaris, kameel, lama en alpaca) tevens een aanzienlijke fractie Heavy-
chain antibodies (HcAbs) aanwezig die enkel opgebouwd zijn uit zware ketens. Het
Variabele deel van de Heavy chain van deze HcAbs (VHH) staat in voor antigenbinding.
Wanneer dit VHH, een domein op zich, apart wordt beschouwd, wordt tegenwoordig eerder
de term nanobody® (Nb) toegepast, een term toegekend door de firma Ablynx.
Zowel VH als VHH (Nb) bestaan uit vier framework regions (FR) gescheiden door drie
complementarity determining regions (CDR) waarvan deze laatste instaan voor de effectieve
antigenbinding door, conformationeel gezien, lussen te vormen. Desondanks de grote
structurele gelijkenissen zijn er toch enkele subtiele verschillen die een potentieel sterkere
VHH antigenbinding zouden kunnen verklaren. Alignering van de aminozuur (AZ)
sequenties van beide domeinen onthult dat CDR1 en CDR3 langer zijn in VHH. Wegens het
ontbreken van een VL, en zodus drie extra CDR’s, is het paratoop van een VHH niet enkel
kleiner dan dat van een klassiek Ab, maar eveneens minder gediversifieerd. De verlengde
CDR1 en -3 compenseren enigszins voor de grootte, terwijl het breder repertoire aan lus-
conformaties in zekere mate de diversiteit vergroot. Dit breder repertoire omvat tevens
conformaties die nooit eerder werden waargenomen in mens/muis VHs. Daarnaast is het
10
Fig. 5. De sequentiële opbouw van VH en VHH. FRs (grijze balken) worden afgewisseld met CDRs. De oranje
lijn representeert de inter-CDR disulfidebrug, frequent voorkomend bij de dromedaris [18].
VHH paratoop convex, waarbij de lange CDR3 lus voor 60-80% van de antigenbinding
instaat. Een VH paratoop daarentegen is vlak of concaaf. Verder nog bevat het VHH van een
dromedaris frequent cysteïne (Cys) residus in CDR1 en -3 waardoor een disulfide brug
gevormd kan worden (Fig. 3). In lama VHH’s worden deze Cys residus echter niet
teruggevonden [18]. Evolutionair gezien werden er bij VHH enkele typerende AZ substituties
doorgevoerd in de FR2 regio (V37F, G44E, L45R, W47G) daar waar bij VH deze regio sterk
geconserveerd blijft met hydrofobe residu’s, nodig voor de interactie met VL. De VHH FR2
regio wordt hierdoor hydrofieler en leidt zodus tot een verhoogde oplosbaarheid [17,18].
2.2 Voor- en nadelen
De fysicochemische eigenschappen van nanobodies staan in voor een aantal voordelen op
gebied van hun toepassing. Dankzij hun kleine grootte van ca. 15 kDa, het single domain
aspect en hun goede oplosbaarheid zijn nanobodies gemakkelijk te produceren in bepaalde
expressiesystemen, zoals bv. bacteriën, a.d.h.v. recombinant DNA (rDNA) technologie. Het
coderend DNA bedraagt immers slechts 350 baseparen (bp). Dit voorgaande en het strikt
monomeer gedrag na opvouwing maakt van nanobodies tevens ideale bouwblokken om
proteïnefusies te construeren.
Daarnaast laat hun globulaire vorm, kleine grootte en convex paratoop het toe om caviteiten,
groeven en begraven epitopen te bereiken daar waar grotere antigenbindende moleculen dit
niet kunnen. Zo worden er, desondanks de kleinere paratopische diversiteit, tóch meer
epitopen herkend door nanobodies in vergelijking met klassieke Abs. Nog een gevolg van
hun vorm en grootte is dat ze relatief goed penetreren doorheen dense weefsels, zoals bv.
tumoren [18]. Daarnaast worden nanobodies snel renaal geklaard omdat hun grootte zo’n vier
maal lager ligt dan de glomerulaire filtratie limiet van 60 kDa. Dit in combinatie met hun
hoge affiniteit maakt van nanobodies efficiënte en specifieke probes voor beeldvorming, bv.
inzake tumoren. Bovendien zijn reeds enkele specifieke nanobodies beschreven die succesvol
de bloed-hersen barrière kunnen doorkruisen wat de poort opent tot het diagnosticeren en
11
mogelijks zelfs behandelen van hersengerelateerde pathologieën. Therapeutisch gezien zou
de snelle renale klaring nadelig kunnen zijn wanneer langere behandelingsperiodes opgelegd
worden. Dit zou echter gemakkelijk opgelost kunnen worden door koppelen van nanobodies
aan grotere eiwitten om zo het halfleven te verhogen [19].
De stabiliteit van nanobodies is een andere voordelige eigenschap. Nanobodies blijken
namelijk in hoge mate resistent tegen proteasen, temperatuurschommelingen, pH
schommelingen en chemisch denaturerende producten. Overigens rapporteerde Ablynx reeds
een succesvolle passage van nanobodies doorheen de gastro-intestinale tractus, die nadien
nog steeds functioneel waren.
Eveneens gunstig is de mogelijkheid tot intracellulaire expressie (intrabodies). Het
cytoplasma is een reducerende omgeving waardoor disulfidebruggen, immer aanwezig bij
conventionele Abs, gedissocieerd worden. Wegens het vaak ontbreken van Cys residus in de
CDR1 en -3, vnl. bij lama’s, blijven deze nanobodies stabiel en functioneel binnenin de cel.
Tenslotte zijn nanobodies ook weinig immunogeen, en dit om de volgende redenen: (i) het
ontbreken van een Fc-fragment, (ii) de grote homologie met het humaan VH fragment, en
(iii) de gedaalde aggregatiegraad wegens verhoogde oplosbaarheid. Zodus draagt deze lage
immunogeniciteit bij aan de mogelijkheid om nanobodies in te zetten bij therapeutische en in
vivo diagnostische applicaties [18].
2.3 Toepassingen
Nanobody toepassingen zijn zeer breed gaande van research tool, over diagnosticum tot
therapeuticum. Hieronder volgen enkele concrete voorbeelden.
Anno 2008 creëerden Rothbauer en collega’s een onderzoeksinstrument met verschillende
toepassingen dat is gebaseerd op een GFP-bindend proteïne (GBP), nl. een anti-GFP Nb.
Meer concreet immobiliseerden ze dit GBP op sepharose beads en benoemden het als GFP-
nanotrap. Een eerste toepassing is de specifieke, kolomgebaseerde éénstapszuivering van
GFP fusieproteïnen. Een tweede is de mogelijkheid om informatie van subcellulaire
lokalisatie, al dan niet dynamisch, te correleren met biochemische karakterisering. Zo kunnen
GFP-getaggeerde proteïnen (of mutanten ervan) gevisualiseerd worden in levende cellen,
waarna de cellen na lyse onderworpen worden aan GFP-nanotrap immunoprecipitatie om
finaal bv. de interactiepartners te identificeren met MALDI massaspectrometrie, of de
enzymatische activiteit te bepalen. Daarnaast blijkt het GBP ook in vivo efficiënt. Door
koppeling van GBP aan lamineB1werd een GFP-nanotrap gecreëerd t.h.v. de nucleaire
12
membraan. Het GFP-PML fusieproteïne werd hierdoor van zijn normale distributie in het
nucleoplasma gedelokaliseerd naar de kernmembraan. De GFP-nanotrap opent zodus een
spectrum aan nieuwe functionele analyses [20].
Vanuit een diagnostisch oogpunt komen nanobodies in aanmerking om merkers van bepaalde
pathologieën te detecteren vanwege hun nanomolaire affiniteit en specifieke eigenschappen.
Zo zouden Nbs gericht tegen prostate specific antigen (PSA) een onderscheid kunnen maken
tussen verschillende isomeren van dit proteïne, teneinde de etiologie te achterhalen van de
disfunctie die de prostaat op dat moment ondervindt. Bepaalde PSA isomeren correleren
bijvoorbeeld beter met prostaatkanker in vergelijking met andere prostaatdisfuncties [17].
Inzake kankertherapie werd de epidermale groeifactor receptor (EGFR) als een belangrijk
doelwit gevalideerd in multipele kankertypes. Hiertoe werden anti-EGFR monoclonale
antilichamen (mAbs), zoals Cetuximab en Matuzumab, reeds positief geëvalueerd als
therapeutica. Recent werd deze strategie verder verfijnd door implementatie van een
bispecifiek nanobody construct dat zich antagonistisch opstelt t.o.v. de EGFR. De nanobodies
werden zo geselecteerd dat ze in competitie treden met bovenstaand vermelde mAbs. Er werd
dus voor gezorgd dat de nanobodies in zeker mate hetzelfde epitoop binden als deze mAbs.
Verder nog werd het construct trivalent gemaakt door een anti-albumine Nb eraan te linken
om zo het in vivo halfleven te verhogen. Het gehele construct, CONAN-1, inhibeerde zeer
efficiënt tumorgroei in A431 muis xenograften [21]. Aansluitend zouden radioactief
gemerkte anti-EGFR Nbs de respons op deze therapie in vivo kunnen opvolgen. In vivo muis
data omtrent de graad van intratumorale opname van dergelijke Nbs, alsook omtrent het
biodistributie patroon, onthulde hoog contrasterende beelden reeds 1u na injectie [19].
Als eiwit-eiwit interactie inhibitoren blijken nanobodies ook efficiënt te functioneren. Een
studie betreffende intracellulaire nanobodies gericht tegen L-plastine, een F-actine bundelend
eiwit, wees uit dat deze in staat waren tot blokkeren van actinebundeling, inhibitie van
filopodiavorming, en tot verhindering van celmigratie [22].
In deze masterproef werden nanobodies gericht tegen Ran en NTF2 aangewend in dezelfde
context als de studie op L-plastine. Er werd getracht om nieuwe functies van Ran en NTF2 te
onthullen, gebaseerd op de rationale dat nanobodies specifieker eiwitfuncties kunnen
inhiberen inzake multifunctionele proteïnes, daar waar RNAi gemedieerde neerregulatie het
volledig genproduct treft en de methode tevens andere nadelen inhoudt. Zo is RNAi eveneens
gelimiteerd door onvolledige RNA verknipping, bepaalde ontoegankelijke RNA sequenties,
aspecifiek getroffen doelwitsequenties en het minder toepasselijk zijn voor eiwitten met een
lang half-leven [22].
13
Materiaal en methoden
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1. DNA manipulaties
1.1 Beschikbare plasmiden
pEGFP-N1 vector (ClonTech): NTF2-WT ; NTF2-M118E ; NTF2-Nbs 1-8 ; RanNb
pcDNA3.1 vector (Invitrogen/Life Tech.): MOM-NTF2-WT ; MOM-NTF2-M118E ; MOM-VSV-Ran
pHEN6-V5 vector: NTF2-Nb8 ; SBP-NTF2-Nb2 ; SBP-NTF2-Nb4
pET-SUMO vector (Invitrogen/Life technologies): NTF2-WT ; NTF2-M118E
(NTF2 nanobodies werden verkregen in samenwerking met de VIB nanobody service facility)
(Vector maps: zie Addendum – vectoren)
1.2 Kloneren NES target sequence in RanNb-pEGFP-N1
Het insereren van cDNA coderend voor een Nucleair Export Signaal (NES) in het RanNb-
pEGFP-N1 plasmide bewerkstelligt het transport uit de kern van het GFP-getaggeerde
RanNb. Voor onderstaande reacties werd de T3 Thermocycler (Biometra) gebruikt.
1.2.1 Annealing oligonucleotiden
Single-stranded DNA (ssDNA) oligonucleotiden, coderend voor het NES, werden
aaneengehecht d.m.v. een tweetal thermoreacties om finaal double-stranded DNA (dsDNA)
te verkijgen die in het RanNb-pEGFP-N1 plamside gekloneerd kan worden. Er werd 1 µl
forward primer en 1 µl reverse primer gebruikt in aanwezigheid van 48 µl annealing buffer
(100 mM CH3COO-K
+, 30 mM HEPES-KOH, 2 mM Mg(CH3COO)2 (pH 7,04)). De reactie
verliep gedurende 4 min bij 95°C en vervolgens 10 min bij 70°C.
1.2.2 Restrictiedigest plasmide
RanNb-pEGFP-N1 werd gedigereerd met BsrGI. Hiertoe werd 1 µg van het plasmide
geïncubeerd met NEB2 buffer, BSA en BsrGI, en werd aangelengd met mQ tot 30 µl.
1.2.3 Fosforylering oligonucleotiden ; defosforylering geknipt plasmide
Van de annealed oligonucleotiden werd 5 µl geïncubeerd met 5 µl forward reaction buffer,
1,25 µl ATP (20 mM) en 1 µl T4 kinase (Invitrogen/Life
Technologies) voor de
fosforyleringsreactie. Vervolgens werd aangelengd met mQ tot een totaalvolume (TV) van 25
µl. De reactie verliep eerst 10 min bij 37°C en vervolgens 10 min bij 65°C. Om te
14
defosforyleren werden de geknipte plasmiden uit 1.2.2 samengevoegd met Antarctic
Phosphatase (5 units/μg DNA) en Antarctic Phosphatase buffer (New England Biolabs). De
reactie verliep eerst gedurende 15 minuten bij 37°C en nadien, om het fosfatase te
inactiveren, gedurende 5 minuten bij 65°C.
1.2.4 Ethanolprecipitatie
Om de gefosforyleerde annealed oligo’s alsook de gedefosforyleerde geknipte plasmiden op
te zuiveren, werd ethanolprecipitatie (EtOH precipitatie) uitgevoerd. Hiervoor werden beide
(oligo’s: 25 µl ; geknipte plasmiden: 40 µl) met mQ aangelengd tot 100 µl. Vervolgens werd
2 μl glycogeen, 50 μL ammoniumacetaat (7,5 M) en 300 μl EtOH (100%) toegevoegd,
waarna dit mengsel eerst gevortext werd, en aansluitend werd gecentrifugeerd (20 min, 4°C,
14000 rpm). Het supernatans werd afgenomen waarna de pellets gewassen werden met 500
µl EtOH (70%). Wederom werd gecentrifugeerd (2 min, 4°C, 14000 rpm). De pellets werden
daarna 15 min aan de lucht gedroogd en finaal opgelost in 10 µl mQ (+ goed gevortext).
1.2.5 Ligatie
De insert/vector verhouding dient 3/1 te bedragen voor optimale ligatie. Van de geknipte
plamsiden werd 2 µl samengebracht met 6 µl insert (de gefosforyleerde annealed
oligonucleotiden), 1 µl T4 ligase, 4 µl T4 ligase buffer (Invitrogen/Life Technologies) en dit
geheel werd aangelengd met mQ tot 20 µl. De reactie verliep eerst 25 min bij 25°C en daarna
16 u bij 16°C. Ook hier werd terug een EtOH precipitatie uitgevoerd, maar nu ter opzuivering
van het ligatieproduct (zie 1.2.4).
1.2.6 Transformatie E. coli TOP10 ; Uitplaten ; Plasmide-extractie
Het opgezuiverde ligatieproduct werden vervolgens d.m.v. elektroporatie getransformeerd in
Escherichia coli TOP10 cellen. Hiertoe werd achtereenvolgens 4 µl ligatieproduct bij de
TOP10 cellen toegevoegd, het geheel in een elektroporatiecuvet gepipetteerd,
geëlektroporeerd en daarna werd 250 µl Super Optimal broth with Catabolite repression
(SOC) medium toegevoegd. Dit gehele mengsel werd vervolgens overgebracht in een nieuwe
cryovial en er werd 1u geïncubeerd bij 37°C. Nadien werd 10 en 50 µl transformatiemengsel,
uitgeplaat op kanamycine-agarplaten en werden de platen overnacht geïncubeerd bij 37°C.
De dag nadien werden 10 kolonies uitgeprikt en overnacht opgegroeid bij 37°C in 5 ml LB-
medium + kanamycine. Nog een dag later werden de bacteriële culturen gecentrifugeerd en
werd plasmide uit de pellets geëxtraheerd met de QIAprep Spin miniprep kit, waarbij de
handleiding van de fabricant werd gevolgd. De concentratie aan gezuiverd plasmide werd
bepaald gebruik makend van een Nanodrop®
UV spectrofotometer.
15
1.2.7 Controlerestrictiedigest
Om na te gaan of de constructen het NES effectief bevatten, werd een controlerestrictiedigest
uitgevoerd met PstI. Er werd 1 µg construct geïncubeerd met NEB3 buffer, BSA en PstI en
aangelengd met mQ tot een TV van 20 µl. De reactie verliep 3u bij 37°C. Stalen werden
nadien gescheiden met gelektroforese ter analyse. Positieve stalen werden finaal opgestuurd
naar de VIB Nanobody Facility om te laten sequeneren ter bevestiging dat het NES in de
sense richting gekloneerd werd.
2. Celcultuur
2.1 Cellijnen en onderhoud
HEK293T (Human Embryonic Kidney) cellen werden onderhouden in een 10% CO2
incubator bij 37°C en opgegroeid in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) met
glutaMAX™ en met 10% foetal bovine serum (FBS). Wanneer de celcultuur confluent
was, werd deze uitgesplitst. Cellen werden hiertoe eerst gewassen met phosphate buffered
saline (PBS) zonder Ca2+
/Mg2+
en vervolgens getrypsiniseerd (Trypsine-EDTA). Trypsine
werd na enige seconden terug afgenomen en de falcon werd nadien ± 5 min geïncubeerd bij
37°C. Wanneer de cellen voldoende loskwamen, werden de cellen geresuspendeerd in
DMEM met glutaMAX™ en met 10% FBS. Vervolgens werden gepaste hoeveelheden
uitverdund al naargelang het gewenste recipiënt.
2.2 Cellen tellen en uitzaaien
De dag voor transfectie werden HEK293T cellen uitgezaaid. Vooreerst werden de cellen
geteld. Hiertoe werd 20 µl van een celsuspensie vijfmaal verdund in 80 µl PBS zonder
Ca2+
/Mg2+
. Vervolgens werd 10 µl in een Bürker telkamer gepipetteerd. Het aantal cellen per
ml werd vervolgens berekend door het aantal getelde cellen te vemenigvuldigen met 5
(verdunning) en 10000/9. Daarna konden de cellen uitverdund worden, al naargelang het
gewenste recipiënt. Voor immunostainingen: 600.000 cellen per 60 mm petridishes
(dekglaasjes werden vooreerst gecoat met rat tail collageen type I gedurende 1u bij 37°C om
vasthechting van de cellen te bevorderen). Voor immunoprecipitaties, flowcytometrie en
PARP/caspase-3 detectie: 750.000 cellen per 25 cm² falcon.
16
2.3 Transfectie
HEK293T cellen werden getransfecteerd via de calciumfosfaatmethode. Hiertoe werd CaCl2
(37°C) toegevoegd aan de vooreerst gemaakte plasmideverdunningen en vervolgens werden
deze al vortexend gedruppeld bij een HEPES-buffered saline (HEBS) oplossing. Na 15 min
werden de de gehele mengsels aan de cellen toegevoegd.
3. Karakterisering nanobody-ligand interactie (recombinant)
3.1 Productie en opzuivering van recombinante proteïnen
3.1.1 NTF2-nanobody productie
Op dag één werden E. coli WK6 cellen d.m.v. elektroporatie getransformeerd met 1 µl
plasmide (NTF2-Nb8-pHEN6 ; SBP-NTF2-Nb2-pHEN6 ; SBP-NTF2-Nb4-pHEN6). Na
toevoegen van 250 µl SOC medium werd 1 u geïncubeerd bij 37°C. Daarna werd 2 µl
transformatiemengsel aan 48 µl LB medium toegevoegd, dit geheel vervolgens uitgeplaat op
LB-agar-ampicilline(100 µg/ml)-1%glucose platen en finaal overnacht geïncubeerd bij 37°C.
Op dag twee werd de precultuur gestart. Eén of meerdere kolonies werden vanop plaat
uitgeprikt waarbij elke kolonie samengevoegd werd met 5 ml LB medium + ampicilline (100
µg/ml) + 1%-glucose. Wederom volgde incubatie bij 37°C overnacht.
De preculturen werden honderdmaal verdund en geïnduceerd tot expressie op dag drie.
Hiertoe werd 5 ml precultuur samengevoegd met 500 ml gebruiksklaar Terrific Broth (TB)
medium (TB medium + 2 mM KH2PO4 ; 2 mM K2HPO4.3H2O ; 2 mM MgCl2 ; 0,1%
glucose ; ampicilline). Incubatie bij 37°C was de volgende stap, dit tot een optische densiteit
(OD) tussen 0,6 en 0,9 bij 600 nm vastgesteld werd. Voor inductie van nanobody expressie
werd 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toegevoegd en vervolgens werd
overnacht geïncubeerd bij 28°C.
3.1.2 SUMO-NTF2-WT en SUMO-NTF2-M118E productie
Op dag één werden E. coli BL21 cellen d.m.v. heat-shock getransformeerd met 1 µl plasmide
(NTF2-pET-SUMO of NTF2-M118E-pET-SUMO). Na toevoegen van 250 µl SOC medium
werd 1 u geïncubeerd bij 37°C.
Op dag twee werd van elk transformatiemengsel 2 µl (verdund in 48 µl LB medium)
toegevoegd aan 5 ml LB medium + kanamycine (100 µg/ml) en overnacht geïncubeerd bij
17
37°C teneinde preculturen te vormen. De preculturen werden finaal honderdmaal verdund en
geïnduceerd op dag 3 , analoog zoals in 3.1.1, met dit verschil dat er geen TB medium met
ampicilline, maar LB medium met kanamycine gebruikt werd.
3.1.3 Immobilized metal affinity chromatography (IMAC)
Overnacht geïnduceerde culturen werden gecentrifugeerd (15 min, 6000 rpm, 4°C). De
pellets werden daarna roterend gelyseerd in lysis buffer (50 mM Tris (pH 8,25), 100 mM
KCl, 0,1 mM β-mercapto-ethanol; in aanwezigheid van een protease-inhibitor cocktail (IC)
(benzamidine, leupeptine, aprotinine), phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF), 1% NP-40 en
0,2 mg/ml lysozyme). Na soniceren (VibraCell™, Sonics & Materials Inc.) en centrifugeren
(30 min, 14.000 rpm, 4°C) werd het supernatans weerhouden. Vervolgens werd het
supernatans minimum 2 u roterend geïncubeerd met Ni2+
-sepharose beads (Probond™,
Invitrogen/Life Technologies). Centrifugatie volgde (5 min, 800 rpm, kamertemperatuur),
waarna de beads viermaal gewassen werden met wasbuffer (20 mM Tris (pH 8,25), 20 mM
imidazol, 500 mM KCl, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, 10% glycerol, IC en PMSF). Bij de
beads werd nu 1,5-2 ml elutiebuffer toegevoegd ( 20 mM Tris (pH 8,25), 500 mM imidazol,
100 mM KCl, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, 10% glycerol, IC en PMSF) en er werd overnacht
geroteerd bij 4°C. De dag nadien werd gecentrifugeerd en werd het supernatans
getransfereerd naar nieuwe 15 ml bluecaps. Een tweede elutie werd opgezet in wederom 1,5-
2 ml elutiebuffer gedurende minstens 2 u. Eiwitconcentraties werden bepaald a.d.h.v. Bio-rad
Protein Assay (Bio-Rad). Eluties werden finaal geanalyseerd via SDS-PAGE (zie 3.1.4),
gevolgd door coomassiekleuring. Eventueel volgde nog een Western blot met vervolgens
detectie (zie 3.1.4) met anti-V5 mAb (Invitrogen/Life Technologies).
3.1.4 MonoQ chromatografie
Om de SBP-getaggeerde NTF2-Nbs verder op te zuiveren, werden de proteïnestalen
gescheiden op basis van netto-ladingsverschillen. De gebruikte MonoQ kolom (Amersham
Pharmacia Biotech) is een sterke anion-uitwisselingskolom. De stalen werden vooreerst
overnacht gedialyseerd tegen een 20mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl, 1 mM EGTA en 0,5
mM DTT buffer. Om te bevestigen in welke fracties het geëlueerde eiwit aanwezig is, werden
bepaalde fracties gescheiden met SDS-PAGE gevolg door coomassiekleuring. Daarna volgde
nog een Western blot met vervolgens detectie met anti-V5 Ab (Invitrogen/Life
Technologies).
18
3.2 SDS-PAGE en Western Blotting
Om eiwitten te scheiden op basis van grootte werd natriumdodecylsulfaat polyacrylamide
gelektroforese (SDS-PAGE) uitgevoerd in 15% polyacrylamide gels in aanwezigheid van
running buffer (Tris (pH 8,3), SDS, glycine). Eiwitstalen werden vooreerst geïncubeerd met
protein sample buffer (65 mM Tris-HCL, 5% SDS, 20% glycerol, 5% β-mercapto-ethanol,
0,2% broomfenolblauw). Nadien werden proteïnes getransfereerd naar een
nitrocellulosemembraan (Hybond™-C-Extra, Amersham/GE Healthcare) in aanwezigheid
van blotbuffer (50 mM Tris, 50 mM boraat). Membranen werden vervolgens 1 u geblokkeerd
in 5% melkpoeder opgelost in Tris buffered saline (100 mM Tris pH 7,5 ; 1500 mM NaCl)
met 0,1% Tween 20 (TBS-T). Hierna werd driemaal gewassen met TBS-T. Daarop volgend
werden membranen geïncubeerd met een primair Ab, nl. anti-V5 (1/2000) (muis)
(Invitrogen/Life Technologies) in 5% melkpoeder in TBS-T. Vervolgens werd weer driemaal
wassen met TBS-T en aansluitend werd 30 min geïncubeerd met met ProtG-horse radish
peroxidase (HRP) (1/10000) (Millipore) in 5% melkpoeder in TBS-T. Finaal werden
membranen ± 1 min geïncubeerd met een 1:1 oplossing van peroxide solution en luminol
enhancer solution (Thermo Scientific) en werden chemiluminescente films (Hyperfilm™
ECL, Amersham/GE Healthcare) opgelegd in een cassette die de membranen bevat, waarna
deze films ontwikkeld werden met een SRX-101A medical film processor (Konica Minolta).
3.3 Isothermal titration calorimetry (ITC)
Om de affiniteit te bepalen van de binding tussen NTF2-Nb8 en SUMO-NTF2-WT enerzijds
of SUMO-NTF2-M118E anderzijds werd gebruik gemaakt van een Microcal VP-ITC
Microcalorimeter (Microcal Inc.). SUMO-NTF2-WT, SUMO-NTF2-M118E en NTF2-Nb8
werden vooreerst overnacht gedialyseerd tegen een 20 mM HEPES, 5 mM MgCl2 buffer (pH
8,25). Nadien werden de concentraties in µM berekend a.d.h.v. spectrofotometrie en de
theoretische absorptiecoëfficiënten werden bepaald d.m.v. ProtParam
www.expasy.ch/tools/protparam.html). Vervolgens werden alle eiwitten ontgast onder
vacuüm gedurende 10 min alvorens te titreren. In een typisch experiment werd ± 1,5 ml van
ofwel 14 µM SUMO-NTF2-WT ofwel 13 µM SUMO-NTF2-M118E getitreerd met 300 µl
van 100 µM NTF2-Nb8 bij 30°C. De injectienaald roteerde aan een snelheid van 300 rpm
gedurende titratie. Tussen injecties werd 4 min tijd gelaten opdat de reactie tot evenwicht
komen en terug de basislijn kon bereiken. Ruwe data werden geïntegreerd m.b.v. Microcal
Origin software.
19
3.4 Immunoprecipitatie op recombinante proteïnen
Recombinant SUMO-NTF2-WT (10 µg) of SUMO-NTF2-M118E (10 µg) werden
samengevoegd met ofwel NTF2-Nb8 (5 µg) ofwel GFP-Nb/CapG-Nb4 (5 µg) (beschikbare
controle eiwitten) in 1 ml buffer (PBS zonder Ca2+
/Mg2+
, 0,5% NP-40, IC en PMSF) en
vervolgens 1 u geroteerd bij 4°C. Daarna werd 12,5 µl settled anti-V5 agarose beads (Sigma-
Aldrich) toegevoegd per staal en wederom 1 u geroteerd bij 4°C. De beads werden nadien
vier maal gewassen met bovenstaande buffer en nadien werd 10 µl protein sample buffer
toegevoegd. Hierna werden de beads 5 min opgekookt en de stalen werden finaal
geanalyseerd met SDS-PAGE (zie 3.2) gevolgd door coomassiekleuring.
3.5 Pull-down assay
Recombinant SUMO-NTF2-WT (10 µg), SUMO-NTF2-M118E (10 µg), SBP-NTF2-Nb2 (5
µg) of SBP-NTF2-Nb4 (5 µg) werd verdund in 1 ml buffer (PBS zonder Ca2+
/Mg2+
, 0,5%
NP-40, IC en PMSF). Daarna werd 12,5 µl settled Strep-Tactin® sepharose beads (Nalgene)
toegevoegd per staal en 1 u geroteerd bij 4°C. De beads werden nadien vier maal gewassen
met buffer en nadien werd 10 µl protein sample buffer toegevoegd. Hierna werden de beads
5 min opgekookt en de stalen werden finaal geanalyseerd met SDS-PAGE (zie 3.2) gevolgd
door coomassiekleuring.
4. Functionele assays
4.1 Immunoprecipitatie
Na transfectie werden de cellen driemaal gewassen met PBS zonder Ca2+
/Mg2+
, gelyseerd
met lysis-/wasbuffer (PBS zonder Ca2+
/Mg2+
, 0,5% NP-40, 1 mM IC en 1 mM PMSF) (400
µl per 25 cm² falcon, 15 min op ijs) en vervolgens geoogst. Nadien werd gesoniceerd,
gecentrifugeerd (10 min, 14000 rpm, 4°C) en het supernatans behouden.
Proteïneconcentraties van de lysaten werd vervolgens bepaald a.d.h.v. Bio-Rad Protein
Assay. Er werd 1 mg ruw celextract geïncubeerd met ofwel eerst anti-GFP (Cell Signalling
Technology) (1 u, 4°C) en vervolgens met ProtG-sepharose beads (12,5 µl settled beads per
staal, 1 u, 4°C) (GE Healthcare), ofwel werd rechtstreeks met anti-V5 agarose beads
geïncubeerd (12,5 µl settled beads per staal, 1 u, 4°C) (Sigma-Aldrich). Stalen werden dan
gecentrifugeerd (2 min, 2000 rpm, 4°C), afgenomen en vier maal gewassen met lysis-
20
/wasbuffer. Vervolgens werd 10 µl protein sample buffer toegevoegd en aansluitend werden
de stalen 5 min opgekookt. Stalen werden nadien geanalyseerd via SDS-PAGE, Western Blot
en finale detectie met: primaire Abs: anti-GFP (1/2000) (konijn) (Cell Signalling
Technology) (in 5% bovine serum albumine (BSA) in TBS-T) (overnacht, 4°C) ; ofwel anti-
NTF2 (1/2000) (muis) (Santa Cruz) ; ofwel anti-Ran (1/2000) (muis) (BD Biotransduction
Laboratories) ; anti-V5 (1/2000) (muis) (Invitrogen/Life Technologies), allen in 5%
melkpoeder in TBS-T, en allen 1 u op kamertemperatuur. Secundaire Abs: geit anti-muis of
geit anti-konijn gekoppeld aan horse radish peroxidase (HRP) (allebei 1/2000) (GE
Healthcare)) ofwel met ProtG-HRP (1/10000) (Millipore) (allen in 5% melkpoeder in TBS-T)
(zie 3.2 voor exact protocol).
4.2 Immuunkleuring en microscopie
Na transfectie werden de cellen gewassen met (PBS) zonder Ca2+
/Mg2+
en vervolgens
gefixeerd met ofwel 3% paraformaldehyde (PFA) (25 min, kamertemperatuur), ofwel met
100% methanol (MeOH) (8 min, -20°C). Nadien werd nog driemaal gewassen met PBS met
Ca2+
/Mg2+
. Vervolgens werden PFA gefixeerde cellen gepermeabiliseerd in aanwezigheid
van 0,2% Triton X-100 in PBS met Ca2+
/Mg2+
(5 min, kamertemperatuur), om daarna, na
twee wasstappen, geïncubeerd te worden met glycine (0,75 g/100 ml, kamertemperatuur).
Hierna werden PFA en MeOH gefixeerde cellen geblokkeerd in 1% BSA in PBS met
Ca2+
/Mg2+
gedurende resp. 10 en 30 min bij kamertemperatuur. Primaire Abs (anti-NTF2
(1/500) (Santa Cruz), anti-Ran (1/500) (BD Biotransduction Laboratories), anti-V5 (1/500)
(Invitrogen/Life Technologies), anti-γ-tubuline (1/200) (Sigma-Aldrich)) werden vervolgens
toegevoegd (1 u, 37°C). Cellen werden nadien vier maal gewassen met 1% BSA in PBS met
Ca2+
/Mg2+
en daarna geïncubeerd met secundair Ab (Alexa 488 (groen)/594 (rood)
geconjugeerd geit anti-muis Ab) (30 min, kamertemperatuur). De dekglaasjess werden finaal
gemonteerd in Vectashield® mounting medium op draagglaasjes. Stalen werden geanalyseerd
met een ApoTome Zeiss Axiovert 200 epifluorescence microscoop (63x 1.4 NA olie
objectief) voorzien van een gekoelde CCD-camera (Axiocam). Beelden werden verwerkt met
Axiovision software.
21
4.3 Flowcytometrie
Na transfectie werden cellen gewassen, losgemaakt d.m.v. PBS zonder Ca2+
/Mg2+
met 5mM
EDTA (20 min, 37°C) en vervolgens gecentrifugeerd (10 min, 800 rpm, kamertemperatuur).
Cellen werden nadien geresuspendeerd in koude PBS zonder Ca2+
/Mg2+
en opnieuw
gecentrifugeerd (5 min, 3000 g, 4°C). Vervolgens werd 1 ml koude PBS zonder Ca2+
/Mg2+
en
200 µl 3% PFA toegevoegd, goed gevortext en werden de cellen 1 u geïncubeerd bij 4°C.
Hierna werd 2 ml PBS zonder Ca2+
/Mg2+
toegevoegd, gevortexed, gecentrifugeerd (5 min,
3000 g, 4°C), afgenomen en werd finaal 1 ml 70% ethanol (EtOH) al vortexend toegevoegd
waarna de stalen bewaard werden bij 4°C. Op de dag van de analyse werd eerst 2 ml PBS
zonder Ca2+
/Mg2+
toegevoegd, gevortext, gecentrifugeerd (5 min, 3000 g, 4°C) en daarna 500
µl PBS zonder Ca2+
/Mg2+
met propidiumiodide (40 µg/ml) en RNAse (100 µg/ml)
toegevoegd. Hierop volgend werd 30 min geïncubeerd bij 4°C. Stalen werden vervolgens
geanalyseerd m.b.v. een FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences) en CellquestPro
software. Van elk staal werd ± 25 000 cellen geteld. Finaal werd statistiek toegepast met
behulp van Sigmaplot 12 software. De data werden statistisch verwerkt a.d.h.v. de Student T-
Test.
4.4 (Geproteolyseerd) caspase-3 en PARP detectie
Na transfectie werden cellen gewassen en dan gelyseerd met lysis-/wasbuffer (PBS zonder
Ca2+/Mg2+, 0,5% NP-40, IC en PMSF) (400 µl per 25 cm² falcon, 15 min op ijs).
Vervolgens werden de cellen geoogst en gesoniceerd, waarna ze gecentrifugeerd werden (10
min, 14000 rpm, 4°C) en het supernatans behouden bleef. Aan de hand van Bio-Rad Protein
Assay werden de proteïneconcentraties bepaald. Aansluitend werd 50 µg celextract
geïncubeerd met protein sample buffer en werden de stalen gescheiden met SDS-PAGE (zie
3.1.4). Finaal werd Western Blot (zie 3.1.4) uitgevoerd gevolgd door detectie met anti-PARP
(1/2000) (muis) (BD Biotransduction Laboratories) en anti-caspase-3 (1/1000) (konijn) (Cell
Signalling Technology) ; allebei in 5% melkpoeder in TBS-T). Secundaire Abs: geit anti-
muis of geit anti-konijn gekoppeld aan HRP (allen 1/2000) allebei in 5% melkpoeder in TBS-
T (zie 3.2 voor exact protocol).
22
Fig. 6. SDS-PAGE analyse van
de eluties na IMAC van NTF2-
Nb8 (links) en van SUMO-
NTF2-WT/M118E (rechts).
Cijferreeks links van de figuren
zijn de bijhorende groottes van
de eiwitmerker in kDa. M =
merker.
Resultaten
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A) NTF2-Nanobody8 heeft een potentieel hogere affiniteit voor
NTF2-M118E t.o.v. NTF2-WT
1. Productie en zuivering van recombinante NTF2-Nbs en SUMO-NTF2-
WT/-M118E
Teneinde gezuiverd recombinant nanobody en targeteiwit te bekomen om aan te wenden in
ITC alsook in pull-down assays, werden deze eiwitten geproduceerd in resp. WK6 en BL21
E. coli cellen. Voor de NTF2-Nb8 productie werden WK6 cellen getransformeerd met NTF2-
Nb8-pHEN6-V5 opgegroeid, waarbij 1 kolonie per liter TB medium (4 l totaal) gebruikt
werd. Expressie werd geïnduceerd door toevoegen van isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG). Eiwit werd finaal gezuiverd a.d.h.v. immobilized metal affinity
chromatography (IMAC), gebruik makend van Ni2+
sepharose beads die de His-tag bindt
waarvoor de pHEN6 vector eveneens codeert. Bij het pelleteren werden de culturen
afkomstig van kolonie 1 en 2 samengevoegd, alsook die van 3 en 4. Eerste eluties (E1)
leverden in beide gepoolde fracties nagenoeg dezelfde hoeveelheid NTF2-Nb8 op (15 kDa)
na analyse via SDS-PAGE gevolgd door coomassiekleuring. SDS-PAGE analyse van de
tweede eluties toonden aan dat de overgrote meerderheid NTF2-Nb8 geëlueerd werd bij E1.
Wanneer de verhouding van de contaminanten t.o.v. Nb8 geëvalueerd werd, waren de stalen
ca. 90% zuiver (Fig. 6, links).
Voor de productie van zowel SUMO-NTF2-wild type(WT) als van de SUMO-NTF2-M118E
werden BL21 cellen getransformeerd met NTF2-WT-pET-SUMO of NTF2-M118E-pET-
SUMO opgegroeid in 1 l LB medium. SDS-PAGE analyse van de eluties na IMAC zuivering
vertonen banden t.h.v. 26 kDa (Fig. 6, rechts). De SUMO-tag is immers 11 kDa groot (Tabel
1) en de grootte van NTF2 bedraagt ca. 15 kDa. Eerste eluties (E1) leverden nagenoeg
23
Fig. 7. Zuivering van SBP-NTF2-
Nbs 2 en 4. SDS-PAGE analyse van
de eluties na IMAC (a). Fracties na
MonoQ scheiding van Nb2 (b) en
Nb4 (c). Onderaan wordt steeds de
detectie getoond met anti-V5 mAb
na Western Blotting. M = merker.
dezelfde hoeveelheid recombinant eiwit op bij zowel het WT als de mutant. SDS-PAGE
analyse van de tweede eluties (E2) toonde aan dat het merendeel geëlueerd werd bij de eerste
eluties. SDS-PAGE analyse van zowel het WT als de mutant vertoonden eveneens de
aanwezigheid van potentiële contaminanten of afbraakproducten, maar wanneer deze in
verhouding tot de gewenste eiwitten worden beschouwd, zijn de stalen ca. 90% zuiver.
Om de recombinante nanobodies te kunnen evalueren in een pull-down assay a.d.h.v. Strep-
Tactin® beads, werden eveneens SBP (Streptavidin Binding Protein) (Tabel 1) getaggeerde
nanobodies gezuiverd met behulp van IMAC. NTF2-Nb2 en NTF2-Nb4 in de pHEN6-V5-
His vector waarin de SBP-tag carboxy(C)-terminaal gekloneerd werd, zijn hiertoe
beschikbaar. SDS-PAGE analyse van de eluties na IMAC zuivering van SBP-NTF2-Nb 2 en
4 (± 19 kDa) toonde de aanwezigheid van meerdere contaminanten en/of afbraakproducten
(Fig. 7a). Na Western Blotting en detectie met anti-V5 mAb bleek de bovenste band het
nanobody te zijn. Omdat gelfiltratie scheidt op basis van grootte, en de SBP-NTF2-Nbs en de
contaminant samenvielen in een zeer nauwe kDa range, werd vervolgens geopteerd voor een
scheiding op basis van lading m.b.v. MonoQ. Vervolgens werden bepaalde fracties
geanalyseerd met SDS-PAGE en coomassiekleuring, gevolgd door detectie met anti-V5 mAb
na Western Blotting. Voor SBP-NTF2-Nb2 werden fracties tussen 2 en 34 (met een interval
van 3 fracties) geanalyseerd (Fig. 7b), voor SBP-NTF2-Nb4 de fracties 2 tot en met 36 (met
een interval van 1 fractie) (Fig. 7c). De anti-V5 detectie na Western Blotting bevestigde dat
de fracties die banden vertoonden na SDS-PAGE effectief de nanobodies bevatten.
24
Fig. 8. SDS-PAGE
analyse van de
immunoprecipitatie met
anti-V5 agarose op
recombinant NTF2-Nb8-
V5 en SUMO-NTF2-
WT/M118E. 2 µg eiwit
werd geladen in de eerste
drie laantjes. IP zelf: 10
µg target ; 5 µg nanobody.
M = merker. Hc = heavy
chain anti-V5 mAb. Lc =
light chain anti-V5 mAb.
Nb = nanobody. M =
merker.
2. Karakterisering van de interactie van NTF2-WT en NTF2-M118E met
NTF2-Nb8
2.1 Analyse met behulp van recombinante eiwitten
2.1.1 Immunoprecipitatie van recombinant NTF2-Nb8
Om na te gaan of het NTF2-Nb8 mogelijks sterker bindt met NTF2-M118E (monomeer)
t.o.v. het WT (dimeer) werd een immunoprecipitatie (IP) uitgevoerd. De pHEN6 vector om
recombinant Nb te produceren codeert eveneens voor een V5-tag (Tabel 1). Deze tag laat toe
om de nanobodies te immunoprecipiteren m.b.v. anti-V5 agarose beads. Een eerste
experiment toonde aan dat zowel SUMO-NTF2-WT als SUMO-NTF2-M118E werden
geprecipiteerd, maar dit echter zowel bij NTF2-Nb8-V5 als bij het controlenanobody (GFP-
Nb-V5) (Fig. 8). SUMO-humaanCofiline, dat gebruikt werd als controle eiwit, wordt echter
niet geprecipiteerd, wat erop wijst dat de SUMO-tag niet aspecifiek interageert met anti-V5
agarose, i.t.t. SUMO-NTF2-WT en SUMO-NTF2-M118E.
In een tweede experiment werd het GFP-Nb-V5 vervangen door CapG-Nb4-V5 om toeval uit
te sluiten. Daarnaast werd in één conditie enkel anti-V5 agarose met SUMO-NTF2-WT
geïncubeerd om na te gaan of SUMO-NTF2-WT hieraan aspecifiek blijft kleven. Analyse via
SDS-PAGE gevolgd door coomassiekleuring toonde aan dat SUMO-NTF2-WT en SUMO-
NTF2-M118E eveneens co-immunoprecipiteren met CapG-Nb4-V5. Bovendien interageerde
het SUMO-NTF2-WT eveneens aspecifiek met anti-V5 agarose (Fig. 9) en dit zou de
aanwezigheid van SUMO getaggeerde NTF2 eiwitten ook bij de co-immunoprecipitaties van
de controlenanobodies kunnen verklaren.
25
Fig. 9. SDS-PAGE analyse van
de immunoprecipitatie met anti-
V5 agarose van recombinant
NTF2-Nb8-V5 en SUMO-
NTF2-WT/M118E. CapG-Nb4-
V5 werd als controlenanobody
gebruikt. 10 µg (1), 10 µg (2), 2
µg (3) werd geladen in eerste
drie laantjes. IP zelf: 10 µg
target ; 5 µg nanobody. M =
merker. Hc = heavy chain anti-
V5 mAb. Lc = light chain anti-
V5 Ab. Nb = nanobody.
Fig. 10. SDS-PAGE analyse
van de pull-down assay met
Strep-Tactin® sepharose van
recombinant SBP-NTF2-Nbs 2
en 4, alsook op SUMO-NTF2-
WT/M118E ter controle. 2 µg
eiwit geladen in eerste vier
laantjes. Pull-down zelf: 10 µg
target ; 5 µg nanobody. M =
merker. * = Strep-Tactin (± 15
kDa).
2.1.2 Pull-down assay
Vervolgens werd geopteerd om een pull-down assay uit te voeren met Strep-Tactin®
sepharose beads. Hiervoor werden SBP-NTF2-Nbs 2 en 4 aangewend. Ditmaal werd meteen
potentiële aspecifieke binding van de SUMO-NTF2 eiwitten op Strep-Tactin® sepharose
nagegaan. Ook hier zagen we dat SUMO-NTF2-WT en de mutant aspecifiek interageerden
met de Strep-Tactin® beads (Fig. 10).
Tabel 1. Karakteristieken van gebruikte tags. De grootte bij benadering in kDa werd berekend door
vermenigvuldiging van de gemiddelde aminozuur (AZ) grootte (0,11 kDa) maal het aantal AZen.
Tag
#
AZen
Sequentie Grootte
(kDa)
V5 14 GKPIPNPLLGLDST 1,54
SBP 38 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP 4,18
SUMO 101 Zie Uniprot Database (accessienummer: Q12306) 11,1
MOM 20 TAILATVAATGTAIGAYYYY 2,20
NES 18 NLVDLQKKLEELELDEQQ 1,98
His 6 HHHHHH 0,66
26
2.1.3 Isothermal titration calorimetry (ITC)
Om de hypothese dat NTF2-Nb8 een hogere affiniteit heeft voor NTF2-M118E verder te
onderzoeken en tevens specifieker de bindingskarakteristieken te bepalen, werd ITC
uitgevoerd. Hiertoe werd het recombinant SUMO-NTF2-WT en –M118E, alsook NTF2-Nb8
eerst overnacht gedialyseerd in 20 mM Tris (pH 8,25) met 5 mM MgCl2. Vlak voor de ITC-
bepaling werden de eiwitconcentraties bepaald a.d.h.v. spectrofotometrie. Een initiële meting
op SUMO-NTF2-WT leverde een absorbantie (A) op van 2,639. Omdat de wet van Lambert-
Beer (A = ε.b.c) stelt dat A ≤ 1 moet zijn om in het lineaire bereik te blijven, werden alle
stalen vervolgens tienmaal verdund. De weglengte (b) is constant en bedraagt 1 cm.
Theoretische absorptiecoëfficiënten (ε) werden bepaald gebruik makende van ProtParam en
finale concentraties zijn weergegeven in Tabel 2. In figuur 11 wordt in de bovenste luiken de
ruwe data weergegeven van de titratie van enerzijds 14 µM SUMO-NTF2-WT met 100 µM
Nb8 (links) en anderzijds 13 µM SUMO-NTF2-M118E met 100 µM Nb8 (rechts). De
onderste luiken stellen de geïntegreerde vrijgestelde warmte voor als functie van de molaire
verhouding van NTF2-Nb8 op SUMO-NTF2-WT of SUMO-NTF2-M118E. De volle lijn in
het rechterdeel van figuur 11 stelt de best fit voor. De KA (NTF2-Nb8/SUMO-NTF2-M118E) bedraagt
1,01E5 ± 7,44E4 M-1
, de stoïchiometrie 0,431 ± 0,308, de enthalpie -1435 ± 1275 kcal/mol
en de entropie 18,3 cal/(mol.K). Deze parameters en de hieruit berekende parameters worden
weergegeven in Tabel 3. De titratie van SUMO-NTF2-WT met NTF2-Nb8 leverde geen
significant warmtevrijstellingsprofiel op. Er zijn bijgevolg ook geen parameters beschikbaar
voor deze interactie. In het algemeen waren de warmtevrijstellingen in beide ITC
experimenten zeer laag. De fouten op de wel beschikbare parameters bij de meting van de
interactie van NTF2-Nb8 en SUMO-NTF2-M118E zijn relatief groot en de informatie hieruit
is minder betrouwbaar. Desondanks was het wel mogelijk om een best fit te genereren van de
data van de titratie van SUMO-NTF2-M118E met NTF2-Nb8 i.t.t. de data van SUMO-NTF2-
WT. Dit duidt mogelijks op een potentieel sterkere interactie tussen het NTF2-Nb8 en
SUMO-NTF2-M118E. Echter, een sluitende conclusie hieromtrent kan niet gevormd worden
a.d.h.v. deze uitgevoerde ITC-bepaling.
Tabel 2. Concentratiebepaling a.d.h.v. spectrofotometrie van de recombinante eiwitten die vervolgens
gebruikt werden voor ITC experimenten.
Eiwit A A’ ε (l.mol-1
.cm-1
) c (µM) Finale c (µM)
SUMO-NTF2-WT 0,304 0,005 22460 13,31 133,1
SUMO-NTF2-M118E 0,065 0,001 22460 2,85 28,5
NTF2-Nb8 0,275 0,009 21430 12,41 124,1
27
Fig. 11. Calorimetrische bepaling van bindingsparameters met behulp van ITC. Titratie van SUMO-
NTF2-WT met NTF2-Nb8 (links) en van SUMO-NTF2-M118E met NTF2-Nb8 (rechts).
Tabel 3. Thermodynamische parameters van ITC metingen van NTF2-Nb8 met SUMO-NTF2-M118E
Parameter SUMO-NTF2-WT +
NTF2-Nb8
SUMO-NTF2-M118E +
NTF2-Nb8
N 0,431 ± 0,308
K (M-1
) 1,10E5 ± 7,44E4
ΔH (kcal/mol) -1435 ±1275
ΔS (cal/(mol.K) 18,3
T.ΔS (kcal/mol) 5,6
ΔG (kcal/mol)* -1440,6
KD (M) 9,09E-6 ± 1,34E-5
Blanco kolom: geen significante binding ; * ΔG = ΔH – T.ΔS ; T in Kelvin (303K)
28
Fig. 17. MOM
recruitment assay.
HEK293T cellen
werden gefixeerd met
PFA na cotransfectie
van MOM-NTF2-WT-
V5 (kolom 1 en 2) of
MOM-NTF2-M118E-
V5 (kolom 3 en 4) en
NTF2-Nb8. NTF2-Nb8-
GFP (Nb8-GFP)
colokaliseert potentieel
met de MOM-
getaggeerde NTF2
eiwitten t.h.v. de
mitochondriën, i.t.t. de
controle, GFP. Het
colokalisatiepatroon van
Nb8-GFP en MOM-
NTF2-M118E-V5 is
echter wel sterker
overlappend. Detectie
van de MOM-
getaggeerde NTF2
eiwitten gebeurde met
anti-V5 mAb. Scale bar
10 µm (niet aanwezig in
kolom 4).
2.2 Intracellulaire analyse
2.2.1 MOM recruitment assay
De MOM-tag (Mitochondrial Outer Membrane tag, Tabel 1) heeft als doel om eiwitten
ectopisch te lokaliseren naar de mitochondriën. Met deze recruitment assay wordt nagegaan
of NTF2-Nb8-GFP naar de mitochondriën wordt gedelokaliseerd na cotransfectie met MOM-
NTF2-WT-V5 of MOM-NTF2-M118E-V5 en of deze delokalisatie sterker uitgesproken is bij
MOM-NTF2-M118E-V5. Figuur 17 toont aan dat het Nb8-GFP clusters van felgroene spots
vormt daar waar ook MOM-NTF2-WT-V5 zich lokaliseert (kolom 2). Potentieel zijn de spots
in deze conditie aggregaten van NTF2-Nb8-GFP. Het patroon van de lokalisatie van Nb8 is
meer analoog aan dat van MOM-NTF2-M118E-V5 in vergelijking met cotransfectie van het
WT (kolom 4). Een gelijkaardig patroon ontbreekt zeer duidelijk bij beide GFP controles
(kolom 1 en 3), waar het GFP proteïne weer homogeen de kern en het cytoplasma aankleurt.
Zodus is er een potentiële interactie waar te nemen tussen NTF2-Nb8 en MOM-NTF2-WT en
MOM-NTF2-M118E. De potentieel sterkere colokalisatie van NTF2-Nb8-GFP met de
mutant zet de hypothese dat NTF2-Nb8 een hogere affiniteit heeft voor deze mutant ook in
dit geval kracht bij.
29
Fig. 12. Intracellulaire lokalisatie van GFP (kolom 1), NTF2-WT-GFP (kolom 2), NTF2-M118E-GFP
(kolom 3), NTF2-Nb8-GFP (kolom 4) in PFA gefixeerde HEK293T cellen. Witte pijlen duiden op een
potentiële aankleuring t.h.v. het centrosoom. Kernen werden aangekleurd met DAPI.
2.2.2 Intracellulaire lokalisatie van GFP getaggeerd NTF2-WT/-M118E en NTF2-Nb8
Om na te gaan wat de intracellulaire lokalisatie is van GFP-getaggeerd NTF2-WT of NTF2-
M118E, alsook NTF2-Nb8-GFP, werden immuunkleuringen uitgevoerd. PFA gefixeerde
HEK293T cellen vertonen een duidelijke groene aankleuring t.h.v. de kernmembraan
wanneer deze getransfecteerd werden met NTF2-WT-GFP. NTF2-M118E-GFP daarentegen
vertoont deze typische kernmembraankleuring zwak tot niet, maar wel een rijkere
aankleuring in het cytoplasma in vergelijking met NTF2-WT-GFP. HEK293T cellen
getransfecteerd met NTF2-M118E-GFP vertonen ook fellere groene spots terug te vinden die
potentieel colokaliseren met het centrosoom. Ook transfectie met NTF2-Nb8-GFP resulteert
in dergelijke groene spots. De lokalisatiepatronen van de hierboven vermelde eiwitten
verschillen allen t.o.v. de GFP controle die een homogene aankleuring vertoont in zowel de
nucleus als in het cytoplasma.
Om te bevestigen dat er colokalisatie is met het centrosoom dient een γ-tubuline kleuring
uitgevoerd te worden. Voor een duidelijke visualisatie van het centrosoom met behulp van γ-
tubuline moeten de cellen met methanol (MeOH) worden gefixeerd. HEK293T cellen werden
opnieuw getransfecteerd met GFP, NTF2-WT-GFP, NTF2-M118E-GFP of NTF2-Nb8-GFP.
Figuur 13a toont in de eerste kolom aan dat GFP niet colokaliseert met γ-tubuline t.h.v. het
centrosoom. Daarentegen colokaliseren zowel NTF2-WT-GFP, NTF2-M118E-GFP en
NTF2-Nb8-GFP met het centrosoom (Fig. 13a, kolom 2, 3 en 4 resp.). Door het contrast aan
te passen en de ruis te reduceren op zwart-wit afbeeldingen NTF2-Nb8-GFP, wordt het
30
Fig. 13. Intracellulaire colokalisatie van GFP (kolom 1), NTF2-WT-GFP (kolom 2), NTF2-M118E-GFP
(kolom 3), NTF2-Nb8-GFP (kolom 4) met γ-tubuline in MeOH gefixeerde HEK293T cellen. Scale bar
10 µm (ontbrekend bij kolom 2) (a). Hoog contrasterende zwart-wit afbeeldingen bevestigen de
colokalisatie van NTF2-NB8-GFP met het centrosoom (b). Kernen werden aangekleurd met DAPI.
zichtbaar dat NTF2-Nb8-GFP lokaliseert t.h.v. beide centriolen van het centrosoom. Dit is
een extra bevestiging dat het hier een centrosomale colokalisatie betreft en niet een aggregaat
(Fig. 13b).
a
b
31
2.2.3 Optimaliseren van plasmide verhoudingen voor cotransfectie
Preliminaire immunoprecipitaties (2.2.3) werden uitgevoerd op HEK293T cellen die
gecotransfecteerd werden met al dan niet MOM-getaggeerd NTF2-WT of NTF2-M118E en
GFP of NTF2-Nb8 (in totaal 12 µg plasmide, 6 µg elk). Analyse van deze
immunoprecipitaties na SDS-PAGE en Western Blotting toonde aan dat niet alle constructen
goed tot expressie kwamen. Vandaar werd beslist om de hoeveelheden plasmide bij
cotransfecties te optimaliseren. Er werd initieel geopteerd om twee condities uit te testen, nl.
3:3 (i) en 4:2 (ii) voor target:nanobody verhoudingen (Fig. 14).
(i) Bij de 3:3 verhoudingen werd een goede expressie waargenomen van NTF2-Nb8-GFP bij
cotransfectie met zowel MOM-NTF2-WT-V5 als met MOM-NTF2-M118E-V5 (resp.
laantjes 2 en 4). Wanneer we de MOM-NTF2-WT-V5 expressie nagaan met behulp van anti-
V5 mAb is er enkel (zwakke) expressie te zien in laantje 2. Tevens is de NTF2-Nb8-GFP
expressie ook ietwat sterker in vergelijking met laantje 4, waar het gecotransfecteerd MOM-
NTF2-M118E niet tot expressie kwam. De NTF2-Nb8-GFP expressie bij cotransfectie met
NTF2-WT-V5 of NTF2-M118E-V5 is echter zwak. Bovendien kwamen NTF2-WT-V5 en
NTF2-M118E-V5 niet tot expressie (laantjes 5-8). De GFP expressie in laantjes 5 en 7 is ook
zwakker in vergelijking met GFP expressie in laantjes 1 en 3 met cotransfectie van de MOM-
NTF2 eiwitten.
(ii) Bij de 4:2 verhoudingen is er goede expressie van zowel GFP als NTF2-Nb8-GFP bij
cotransfectie met de MOM-NTF2 eiwitten. Zowel MOM-NTF2-WT-V5 als MOM-NTF2-
M118E-V5 komen tot expressie, al is deze zeer zwak tot zwak in resp. laantjes 1 en 4.
Desalniettemin werd beslist om co-immunoprecipitatie experimenten uit te voeren met de 4:2
verhoudende condities (zie 2.2.3). De expressie van NTF2-Nb8-GFP bij cotransfectie van
niet MOM-getaggeerde NTF2 eiwitten is wederom, net zoals bij de 3:3 verhouding, zwak.
Evenzeer is er geen expressie waar te nemen van NTF2-WT-V5 of NTF2-M118E-V5
(laantjes 5-8). Opvallend is de sterke expressie van GFP in laantjes 7 en 8. Op de blots zelf is
duidelijk te zien dat in laantje 8 twee verschillende banden van elkaar kunnen onderscheiden
worden. Dit zou kunnen wijzen op afbraak van het NTF2-Nb8-GFP fusieproteïne, daar er in
laantje 8 een zeer zwakke expressie te zien is van dit fusieproteïne.
32
Fig. 14. Optimalisatie van hoeveelheden plasmide (µg) bij cotransfectie in HEK293T cellen.
Twee verhoudingen qua aantal µg target op aantal µg nanobody werden uitgetest, nl. 3:3 en
4:2. 50 µg ruw celextract werd geanalyseerd met SDS-PAGE en Western Blotting. Bovenste
luiken tonen NTF2-Nb8-GFP (Nb8) expressie, detectie met anti-GFP Ab. Middelste luiken
tonen GFP expressie, detectie met anti-GFP Ab. Onderste luiken tonen V5-getaggeerd NTF2
eiwit, detectie met anti-V5 mAb. ProteinG-HRP werd gebruikt om de uiteindelijke visualisatie
van de bandjes te bewerkstelligen. V5-getaggeerd NTF2-WT of NTF2-M118E werd niet
gedetecteerd. De cijfers boven de laantjes corresponderen met de condities in de legende
onderaan de figuur. M = merker.
De 4:2 verhouding voor cotransfectie van de MOM-getaggeerde NTF2 eiwitten en GFP of
NTF2-Nb8-GFP werd gebruikt voor de co-immunoprecipitatie experimenten. Er werd verder
gezocht naar een optimale verhouding voor cotransfectie van GFP of NTF2-Nb8-GFP met
NTF2-WT-V5 of NTF2-M118E-V5. Figuur 15 toont de expressie van deze eiwitten met de
vermelding van de nieuwe verhoudingen per laantje samen met de corresponderende
hoeveelheden aan plasmide die werden getransfecteerd. Ook bij deze nieuwe condities is er
slechte tot geen expressie detecteerbaar van NTF2-Nb8-GFP of GFP. Enkel het GFP signaal
na cotransfectie van 1 µg GFP-plasmide in cotransfectie met 5 µg MOM-NTF2-M118E is
duidelijk. Bovendien wordt geen enkel V5-getaggeerd NTF2 eiwit gedetecteerd (Fig. 15, luik
onderaan). Er werd dus nog geen optimale verhouding gevonden voor cotransfecties van
NTF2-WT-V5 of NTF2-M118E-V5 met GFP of NTF2-Nb8-GFP.
33
Fig. 15. Optimalisatie van hoeveelheden plasmide (µg) bij cotransfectie van HEK293T cellen
met GFP en NTF2-Nb8-GFP met enerzijds NTF2-WT-V5 of anderzijds NTF2-M118E-V5. 50
µg ruw celextract werd geanalyseerd met SDS-PAGE en Western Blotting. Bovenste luik toont
NTF2-Nb8-GFP (Nb8-GFP) of GFP expressie, detectie met anti-GFP gevolgd door anti-konijn-
HRP. Onderste luik toont de detectie met anti-V5 mAb in combinatie met ProteinG-HRP. M =
merker.
2.2.4 Co-immunoprecipitatie van NTF2-Nb8
HEK293T cellen werden gecotransfecteerd met V5-getaggeerde MOM-NTF2 constructen en
GFP of NTF2-Nb8-GFP in een 4:2 verhouding (target:nanobdy). In figuur 16 wordt het
resultaat van deze co-immunoprecipitaties weergegeven. Er werd aangetoond dat bij
immunoprecipitatie met anti-V5 agarose van MOM-getaggeerd NTF2-M118E-V5, het NTF2-
Nb8-GFP in een grotere hoeveelheid co-immunoprecipiteert in vergelijking met
immunoprecipitatie van het MOM-getaggeerd NTF2-WT (Fig. 16, zwarte pijlen, laantje 2 en
4). GFP co-immunoprecipiteert niet (Fig. 16, laan 1 en 3). De expressie van NTF2-Nb8-GFP
en GFP was in de ruwe celextracten bovendien vergelijkbaar bij cotransfectie van MOM-
34
Fig. 16. Co-Immunoprecipitatie van NTF2-Nb8-GFP (Nb8) met MOM-NTF2-WT-V5 en
MOM-NTF2-M118E-V5. De MOM-getaggeerde NTF2 eiwitten werden geïmmunoprecipiteerd
met anti-V5 agarose beads. Het linker luik toont expressie in het ruw celextract. Het bovenste
luik rechts toont dat NTF2-Nb8-GFP co-immunoprecipiteert (twee zwarte pijlen) met MOM-
NTF2-WT-V5 en met MOM-NTF2-M118E-V5. Bovenste luiken: detectie met anti-GFP gevolg
door anti-konijn-HRP. Onderste luik toont de aanwezigheid van de MOM-getaggeerde NTF2
eiwitten in het celextract (links) en in de immunoprecipitatie-complexen (rechts) (detectie met
anti-V5 mAb gevolgd door anti-muis-HRP). De heavy-chain (Hc) en light-chain (Lc),
afkomstig van de anti-V5 Abs gekoppeld op de agarose beads worden eveneens gedetecteerd
met het anti-muis-HRP. M = merker.
NTF2-WT-V5 en MOM-NTF2-M118E-V5 (Fig. 16, luik linksboven). Ook de expressie van
MOM-NTF2-WT-V5 of MOM-NTF2-M118E-V5 was in alle condities vergelijkbaar (Fig.
16, onderste luik links). Deze resultaten laten vermoeden dat NTF2-Nb8 inderdaad een
hogere affiniteit heeft voor NTF2-M118E in vergelijking dan voor NTF2-WT, analoog aan
de resultaten van het ITC experiment (2.1.3).
35
Fig. 19. DNA gelelektroforese van PstI-controlerestrictiedigest op NES-RanNb-pEGFP-N1 constructen.
Omkaderingen wijzen op een band van 1100 bp en zodus effectieve insertie van het NES. Zwarte kaders
wijzen op insertie van het NES in antisense richting, witte kaders in de sense richting. bp = baseparen.
B) RanNb colokaliseert met endogeen Ran en het centrosoom
1. Kloneren van een NES sequentie in RanNb-pEGFP-N1
Om het RanNb te depleteren uit de kern en zo eventueel de Ran gradiënt te verstoren door
endogeen Ran te delokaliseren naar het cytoplasma, werd een Nuclear Export Signal (NES)
in het RanNb-pEGFP-N1 construct geïnsereerd. Het cDNA van deze NES is afkomstig van
een humaan mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Tabel 1). De pEGFP-N1 vector
heeft een grootte van 4700 baseparen (bp) (Addendum – vectoren). De grootte van het
RanNb cDNA bedraagt ca. 400 bp. Controlerestrictiedigest met PstI levert, indien het NES
effectief geïnsereerd werd, twee banden op daar PstI twee knipplaatsen heeft in het construct,
meer bepaald één in het NES cDNA zelf en een ander in de pEGFP-N1 vector t.h.v. de
multiple cloning site (MCS). Een band van 4000 bp alsook één van 1100 bp zou moeten
gedetecteerd worden na scheiding op een 1%-agarose gel.
In het eerste controledigest uitgevoerd op kolonies 3, 5 en 9 bleek dit het geval voor kolonie 5
en 9. Kolonie 3 bleek echter geen band t.h.v. 1100 bp te genereren na restrictiedigest met PstI
en vertoonde één enkele band t.h.v. 5100 bp (Figuur 1, links). Kolonie 5 en 9 bleken, na
sequenering van de constructen door de VIB Genetic service facility, het NES echter in de
antisense richting te bevatten.
Voor een tweede controledigest werden de overige zeven van de oorspronkelijk tien
opgegroeide kolonies aangewend. Hier vertoonden kolonies 1, 2, 4 en 7 de twee gewenste
banden. Na sequencing bleken enkel kolonie 2 en 7 het NES in de sense richting te bevatten.
Het plasmide afkomstig van kolonie 7 werd vervolgens gebruikt voor verdere experimenten.
36
Fig. 20. Intracellulaire colokalisatie van
RanNb-GFP en NES-RanNb-GFP met γ-
tubuline t.h.v. van het centrosoom. Witte
pijlen duiden op een intensere aankleuring
t.h.v. centrosoom. De GFP controle
colokaliseert niet met γ-tubuline. Scale bar
10 µm.
2. Intracellulaire lokalisatie van GFP-getaggeerd (NES)-RanNb
Anno 2003 vonden Keryer et al. dat een deel van het endogene Ran colokaliseert met het
centrosoom [23]. Om een interactie tussen het RanNb en Ran aan te tonen, werden
immuunkleuringen uitgevoerd op MeOH gefixeerde HEK293T cellen die getransfecteerd
werden met GFP, RanNb-GFP of NES-RanNb-GFP. Hierbij werd nagegaan of het RanNb
zich eveneens t.h.v. het centrosoom lokaliseert. Uit kolom 2 van figuur 20 blijkt dit effectief
zo te zijn, waarbij colokalisatie kan waargenomen met -tubuline.. Bovendien colokaliseert
ook het NES-RanNb met het centrosoom (kolom 3). In kolom 1, die GFP getransfecteerde
HEK293T cellen representeert ter controle, vertoont GFP geen colokalisatie met het
centrosoom. Dit laat vermoeden dat de interactie tussen het RanNb en Ran specifiek is.
Om de lokalisatie van het RanNb verder te onderzoeken en daarnaast ook de werking van het
NES-RanNb te evalueren, werden eveneens HEK293T cellen getransfecteerd met GFP,
RanNb-GFp of NES-RanNb-GFP en geanalyseerd na PFA fixatie (Fig. 21). GFP
getransfecteerde cellen vertoonden een intense groene kleur t.h.v. de nucleus (Fig 21, kolom
1). RanNb-GFP vertoont in de meeste cellen eveneens een sterkere nucleaire kleuring (Fig.
21, kolom 2). Het NES-RanNb-GFP is vnl. aanwezig in het cytoplasma, wat erop wijst dat
het NES signaal correct functioneert en het RanNb extranucleair brengt (Fig. 21, kolom 3).
37
Fig. 21. Intracellulaire lokalisatie van GFP , RanNb-GFP en NES-RanNb-GFP
in PFA gefixeerde HEK293T cellen. Endogeen Ran werd rood aangekleurd met
anti-Ran mAb. Scale bar 10 µm.
Als vervolgens de lokalisatie van endogeen Ran bekeken wordt, dan wordt eveneens de kern
het meest intens aangekleurd (Fig. 21, rode kleuringen). In NES-RanNb-GFP
getransfecteerde cellen blijft het endogeen Ran echter ook nucleair aanwezig. Mogelijks
suggereert dit een zwakke interactie tussen het RanNb en Ran, waardoor NES-RanNb-GFP
niet in staat is om endogeen Ran extranucleair te delokaliseren.
3. MOM recruitment assay
Een MOM-tag is reeds gekloneerd in het Ran-pcDNA3.1 plasmide teneinde dit eiwit naar de
mitochondriën te delokaliseren. Een VSV-tag (Tabel 1) is eveneens aanwezig in dit construct,
maar anti-VSV mAb werd niet gebruikt. Na transfectie in HEK293T cellen vertoont de GFP
controle (Fig. 22, kolom 1) een homogene aankleuring t.h.v. de kern en het cytoplasma,
waarbij de intensiteit van het signaal in sommige cellen iets sterker is in de kern (cel rechts
onder). Ook het RanNb (Fig. 22, kolom 2) vertoont in de overgrote meerderheid van de cellen
een sterkere nucleaire kleuring. De MOM-getaggeerde Ran eiwitten vertonen in de meeste
38
Fig. 22. MOM recruitment assay. HEK293T
cellen werden gecotransfecteerd met MOM-VSV-
Ran en GFP of RanNb-GFP. Na transfectie
werden de cellen gefixeerd met PFA. MOM-
VSV-Ran werd gevisualiseerd met anti-Ran Ab
(rood). Scale bar 10 µm.
Fig. 23. Optimalisatie van de hoeveelheid plasmide (µg) voor
cotransfectie van HEK293T cellen met MOM-Ran-V5 en GFP of
RanNb-GFP. 50 µg celextract werd geanalyseerd na SDS-PAGE en
Western Blotting. In het bovenste luik werd de detectie uitgevoerd
met anti-GFP Ab en in het onderste luik met anti-Ran Ab in
combinatie met ProteinG-HRP. Condities: Laan 1: 5 µg MOM-Ran-
V5 + 0,5 µg GFP. Laan 2: 2,5 µg MOM-Ran-V5 + 0,5 µg RanNb-
GFP. M = merker.
gevallen een typisch mitochondriaal lokalisatiepatroon. In kolom 2 (Fig. 22) zijn er tevens
niet getransfecteerde cellen te zien. De anti-Ran kleuring toont in deze niet getransfecteerde
cellen aan dat Ran vooral sterk nucleair aanwezig is. GFP colokaliseert dus niet met MOM-
VSV-Ran, maar het RanNb-GFP echter ook niet. Deze resultaten impliceren eveneens dat de
RanNb-GFP – Ran interactie potentieel (zeer) zwak is.
4. Immunoprecipitatie van MOM-Ran-V5
Ook voor cotransfectie van het MOM-Ran-V5 plasmide met GFP of RanNb-GFP werd de
verhouding van de hoeveelheden van de plasmiden geoptimaliseerd. De eerste condities
worden weergegeven in figuur 23. GFP en RanNb-GFP expresseren goed na transfectie van
39
Fig. 24. Optimalisatie van de hoeveelheid plasmide voor
cotransfectie van HEK293T cellen met MOM-Ran-V5 en GFP,
RanNb-GFP of NES-RanNb-GFP en immunoprecipitatie van MOM-
Ran-V5 met anti-V5 agarose beads (rechts). 50 µg ruw celextract
werd geanalyseerd na SDS-PAGE en Western Blotting (CE, links).
In het bovenste luik werd de detectie uitgevoerd met anti-GFP Ab in
combinatie met anti-konijn-HRP, en in het onderste luik met anti-Ran
Ab in combinatie met ProteinG-HRP. Condities: Laan 1: 5 µg MOM-
Ran-V5 + 0,5 µg GFP. Laan 2 en 3: 2,5 µg MOM-Ran-V5 + resp. 0,5
µg RanNb en NES-RanNb. CE = cel extract. IP =
immunoprecipitatieM = merker.
HEK293T cellen met slechts 0,5 µg plasmide. Mogelijke MOM-Ran expressie wordt
aangeduid door de twee witte pijlen (Fig. 23), doch kan dit een aspecifieke interactie zijn van
het anti-Ran Ab of ProteinG-HRP.
Vervolgens werden nog andere hoeveelheden uitgetest daar het MOM-Ran-V5 eiwit niet met
zekerheid gedetecteerd werd. In figuur 24 werd telkens 4,5 µg MOM-Ran-V5
gecotransfecteerd met 1,5 µg GFP, RanNb-GFP of NES-RanNb-GFP. Deze laatste drie
eiwitten kwamen goed tot expressie. Tevens werd MOM-Ran-V5 in alledrie de condities
gedetecteerd in het ruwe celextract. Een immunoprecipitatie van MOM-Ran-V5 met anti-V5
agarose beads werd eveneens uitgevoerd. MOM-Ran-V5 werd gedetecteerd na
immunoprecipitatie, maar zowel het RanNb-GFP als het NES-RanNb-GFP co-
immunoprecipiteerden niet mee. Mogelijks duiden deze resultaten wederom op een potentieel
zwakke affiniteit van het RanNb voor Ran.
40
Fig. 25. Inductie van apoptose 48 u na transfectie van HEK293T cellen met NTF2-Nbs 2, 7 en 8 alsook
met (NES)-RanNb. Alle Nbs zijn GFP-getaggeerd. Voor NTF2-Nb4 zijn geen data beschikbaar. Zwarte
balken stellen de genormaliseerde gemiddelden voor van twee onafhankelijke experimenten waarbij de
waarden van GFP aan 1 gelijk werden gesteld. Fijne T-vormige lijnen representeren de SE (Standard
Error). In de Y-as wordt de graad van apoptose-inductie weergegeven t.o.v. de GFP-controle.
C) NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb induceren apoptose in
HEK293T cellen 48u na transfectie
1. Kwantificatie van apoptose inductie in NTF2-Nb-GFP of (NES)-RanNb-
GFP getransfecteerde HEK293T cellen met behulp van flowcytometrie
Zoals aangekaart in de inleiding zorgt een knockdown van Ran expressie voor een verhoging
aan apoptotische cellen in een aantal kankercellijnen [2]. In dit experiment werd nagegaan of
ook apoptose uitgelokt wordt wanneer de Ran functie verstoord wordt op eiwitniveau via
RanNb. Ook werd het effect van NTF2-Nbs 2,7 en 8 nagegaan, uitgaande van het feit dat
NTF2 functioneert als carrier om RanGDP terug te transporteren naar de kern en zodus ook
potentieel de Ran gradiënt verstoord wordt. Meer bepaald werd in dit experiment a.d.h.v.
flow cytometrie van getransfecteerde cellen een celcyclus analyse uitgevoerd, na fixatie en
propidium iodide kleuring. Hierbij werd de hoeveelheid apoptotische cellen, die zich in de
sub-G1 piek bevinden, gekwantificeerd. Figuur 25 toont de inductie van apoptose 48 u na
transfectie van resp. NTF2-Nb2,7 en 8 en RanNb alsook NES-RanNb, dit t.o.v. een GFP
controle. Zo vertonen alle nanobodies behalve Nb7 een stijging van het aantal apoptotische
cellen. Deze is echter enkel significant voor Nb8, RanNb en NES-RanNb waarbij resp. 1,5 ;
4,2 en 5,0 keer meer apoptose werd geïnduceerd. Figuur 26 toont de data uit één enkel
experiment van de nanobodies die een significante inductie van apoptose teweegbrengen
t.o.v. GFP, waarbij ook hier reeds een stijging in absoluut celaantal te zien is in R9.
41
Fig. 26. Celcyclus analyse
a.d.h.v. flowcytometrie na
propidiumiodide (PI)
kleuring van PFA gefixeerde
HEK293T cellen getrans-
fecteerd met GFP,
(NES)Ran-Nb-GFP of
NTF2-Nb8-GFP. Sub-G1
(R9), G1 en G2/M (R3)
pieken worden weerge-
geven. X-as represen-teert
de DNA inhoud gemeten via
intensiteit van het PI signaal.
Y-as toont het aantal cellen.
De Y-as schaal bij NTF2-
Nb8 is kleiner in
vergelijking met de andere
condities.
Fig. 27. Expressie van NTF2-Nb8-GFP, GFP en RanNb-GFP
in 50 µg celextract. De hoeveelheden getransfecteerd plasmide
(in µg) staan vermeld per conditie. M = merker.
Tabel 3. Significantie van de verschillen in inductie van apoptose na transfectie met NTF2-Nb-GFP of
(NES-RanNb-GFP.
Nb2 Nb7 Nb8 RanNb NES-RanNb
GFP
Niet significant
(p = 0,609)
Niet significant
(p = 0,212)
Significant
(p < 0,001)
Significant
(p = 0,015)
Significant
(p = 0,032)
Wanneer de expressieniveaus van NTF2-Nb8-GFP en RanNb-GFP geëvalueerd worden in
een ruw celextract, dan valt op dat het RanNb-GFP in hogere mate tot expressie komt, zelfs
vertrekkende van viermaal minder getransfecteerd plasmide (0,5 µg) in vergelijking met
NTF2-Nb8-GFP (2 µg) (Fig. 27). Ook GFP expresseert goed na transfectie van slechts 0,5 µg
GFP-plasmide. Het verschil in inductie van apoptose zou bijgevolg door het verschil in
expressieniveau kunnen verklaard worden.
42
Fig. 28. Detectie van caspase-3 en PARP verknipping 24 u na transfectie van HEK293T cellen.
50 µg ruw celextract werd geanalyseerd na SDS-PAGE en Western Blotting. Enkel de
onverknipte eiwitten werden gedetecteerd: PARP (116 kDa) en caspase-3 (32 kDa).
Bij de NES-RanNb-GFP conditie is er beduidend minder PARP aanwezig. HEK293T par =
parentale HEK293T cellen. Merker is aanwezig in laan 5.
2. Detectie van caspase-3 en PARP verknipping in HEK293T cellen
Om na te gaan of de geïnduceerde apoptose eveneens caspase-3 afhankelijk verloopt, analoog
aan de studies van Barrès et al. en Yuen et al. [12, 14], werd 50 µg cellysaat per conditie
geanalyseerd via SDS-PAGE, gevolgd door Western Blotting en finaal detectie met anti-
caspase-3 mAb, en ook anti-poly-ADP ribose polymerase (PARP) mAb. De lysaten werden
bereid 24 u na transfectie. Caspase-3 (32 kDa als zymogen), een cysteïne protease en een
centrale effector in de apoptosecascade, wordt initieel verknipt door een initiator caspase in
een p17 (17 kDa) en een p12 (12 kDa) subeenheid (http://en.wikipedia.org/wiki/Caspase_3).
Deze subeenheden samen vormen een heterodimeer die de katalytische activiteit uitoefent en
onder meer PARP (116 kDa) verder downstream in de apoptosecascade verknipt tot
subeenheden van resp. 89 kDa en 27 kDa [24].
Figuur 28 toont aan dat zowel caspase-3 (32 kDa) als PARP (116 kDa) gedetecteerd worden
in elk van de condities. In dit experiment werd ook nagegaan of transfectie van GFP-
getaggeerd NTF2-WT of NTF2-M118E op zich reeds tot inductie van apoptose zouden
kunnen leiden. De verknipte producten van caspase-3 en PARP die mogelijks zouden duiden
op een activatie van apoptose werden echter bij geen enkele conditie gedetecteerd.
43
Discussie
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Ran werd recent erkend als potentieel therapeutisch doelwit bij meerdere types kanker [2].
Daarnaast toonden meerdere studies aan dat RNAi gemedieerde knockdown van Ran zorgt
voor een remming van tumorgroei via inductie van apoptose in bepaalde types kankercellen
[11, 12, 14]. Ook in Trypanosomatidae induceerde RNAi van zowel het Ran als het NTF2
homoloog eveneens apoptose [16]. In deze masterproef werd een beroep gedaan op
nanobodies gericht tegen Ran en NTF2, teneinde hun reeds gekende functies te beïnvloeden,
en potentieel nieuwe functies te achterhalen. Er werd vooreerst getracht de interactie tussen
de nanobodies en hun targets te karakteriseren, waarna de nanobodies onderworpen werden
aan een aantal functionele assays.
1. Evaluatie van de NTF2 – NTF2-Nb interactie
Om een interactie aan te tonen tussen NTF2-WT en/of NTF2-M118E met NTF2-Nbs werden
meerdere experimentele pistes uitgetest. Bij een intracellulaire aanpak werden
immuunkleuringen, MOM-recruitment assays en (co)-immunoprecipitaties uitgevoerd. Een
alternatieve aanpak, meer bepaald gebruik makend van recombinant geproduceerde
proteïnen, omvatte immunoprecipitaties, een pull-down assay en isothermal titration
calorimetry (ITC).
Evaluatie van de lokalisatie van GFP-getaggeerde NTF2-WT in paraformaldehyde (PFA)
gefixeerde HEK293T cellen vertoont een sterke aankleuring t.h.v. de nucleaire membraan.
NTF2-M118E-GFP vertoont dergelijke lokalisatie zeer zwak tot niet. Deze resultaten zijn in
overeenstemming met de bevindingen van Chaillan-Huntington et al. [8] waar colloïdale
goudpartikels gecoat met NTF2-WT eveneens het sterkst accumuleren t.h.v. de nucleaire
membraan op elektronenmicroscopische afbeelding. Lokalisatie van NTF2-M118E-GFP
daarentegen vertoont een sterkere cytoplasmatische aankleuring in PFA gefixeerde HEK293T
cellen, alsook de aanwezigheid van groene spots die potentieel colokaliseren met het
centrosoom. Ook NTF2-Nb8-GFP vertoont dergelijke groene spots alsook een sterke
cytoplasmatische aankleuring. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat het NTF2-Nb8
mogelijks sterker bindt met NTF2-M118E in vergelijking met NTF2-WT. Deze hypothese
werd dan ook verder doorheen deze masterproef onderzocht. Om na te gaan of de groene
44
spots colokaliseren met het centrosoom, werden getransfecteerde HEK293T cellen gefixeerd
met methanol (MeOH) en vervolgens gekleurd met anti-γ-tubuline mAb. De groene spots te
zien bij MeOH gefixeerde HEK293T cellen getransfecteerd met NTF2-WT-GFP of NTF2-
M118E-GFP alsook NTF2-Nb8-GFP bevinden zich effectief daar waar de γ-tubuline kleuring
het centrosoom visualiseert. Een centrosomale lokalisatie voor NTF2-WT of NTF2-M118E
werd voorheen nog niet aangetoond. Keryer et al. toonden in 2003 aan dat een deel van het
endogene Ran colokaliseert met het centrosoom via verankering aan het A kinase anchoring
protein (AKAP450) [23]. De mogelijkheid bestaat dat NTF2-WT eveneens centrosomaal
lokaliseert omdat Ran daar aanwezig is. Ook al waren beide NTF2 eiwitten GFP-getaggeerd,
wordt een aspecifieke centrosomale lokalisatie via de GFP-tag uitgesloten, daar GFP op zich
niet colokaliseerde met het centrosoom.
Voor co-immunoprecipitaties werd vooreerst een optimalisatie uitgevoerd van de te
transfecteren hoeveelheden plasmide. Ondanks het vinden van een goede conditie voor
coëxpressie van MOM-getaggeerde NTF2 eiwitten en GFP of NTF2-Nb8, blijft een optimale
conditie voor niet getaggeerde NTF2 eiwitten voorlopig uit. Een potentiële verklaring
hiervoor vinden we in een studie van Kvam en collega’s. Hun studie toonde nl. aan dat
taggen van intrabodies met negatief geladen peptiden de oplosbaarheid aanzienlijk verhoogt
[25]. Als we de MOM-tag sequentie analyseren in ProtParam, dan heeft deze een theoretische
pI van 5,18. Bij een intracellulaire pH van 7,4 is de MOM-tag negatief geladen en zou het
opvouwen van MOM-getaggeerde eiwitten bevorderd kunnen worden wegens een vergrootte
elektrostatische repulsie tussen de vertaalde NTF2 eiwitten. In de eigenlijke
immunoprecipitaties coprecipiteert NTF2-Nb8 coprecipiteert met MOM-NTF2-WT en op het
eerste zicht beter met MOM-NTF2-M118E. Bijgevolg levert dit een in vivo bewijs op voor de
eerder gestelde hypothese.
Verder werd tevens een analyse van de interactie gedaan a.d.h.v. recombinant geproduceerd
NTF2-WT of NTF2-M118E en NTF2-Nb8. Pull-down assays werden vervolgens uitgevoerd
met bovenvermelde recombinante eiwitten. Helaas konden uit deze experimenten geen
conclusies getrokkken worden. Zowel bij anti-V5 agarose beads als Strep-Tactin®
sepharose
beads coprecipiteerde SUMO-NTF2-WT aspecifiek. SUMO-hCofiline coprecipiteerde niet,
wat een potentiële aspecificiteit door de SUMO-tag uitsloot. Met de recombinante eiwitten
werd eveneens een ITC experiment uitgevoerd. Resultaten hiervan laten eveneens een
sterkere affiniteit vermoeden van NTF2-Nb8 voor NTF2-M118E in contrast met NTF2-WT,
af te leiden uit het feit dat enkel een best fit kon gegenereerd worden bij interactie met NTF2-
M118E. Helaas kan een sluitende conclusie niet gevormd worden uit dit experiment daar de
45
fouten op de parameters groot zijn. Hierbij kan opgemerkt worden dat de SUMO-tag
mogelijks een invloed zou kunnen uitoefenen. Eveneens kan de buffer waartegen
gedialyseerd werd niet de ideale samenstelling hebben om de in vivo situatie zo goed
mogelijk na te bootsen. Een studie op L-plastine vertoonde eveneens pas significante binding
in ITC experimenten na toevoeging van Ca2+
[22]. Het uittesten van andere buffercondities
zou dus mogelijkerwijs de interactie positief kunnen beïnvloeden.
Een zeer belangrijke vraag die gesteld moet worden, is of NTF2 effectief ook als monomeer
voorkomt in vivo. Onze resultaten ondersteunen deze hypothese vermits NTF2-Nb8 en
NTF2-M118E sterk het cytoplasma en het centrosoom aankleuren. Twee recente studies
waarin gebruik wordt gemaakt van fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) suggereren
dat NTF2 enkel als dimeer voorkomt, zowel intracellulair [26] als in oplossing [27]. In deze
laatste studie werd aangetoond dat NTF2 dimeer blijft over een concentratie range van 30-
1400 nM in oplossing. Deze resultaten halen de hypothese dat NTF2 partieel als monomeer
voorkomt in de cel onderuit. Toekomstig onderzoek zal definitief uitlsuitsel moeten geven.
2. RanNb colokaliseert met endogeen Ran en het centrosoom
Lokalisatiestudies toonden aan dat het RanNb en het NES-RanNb colokaliseren met het
centrosoom in MeOH gefixeerde HEK293T cellen. Endogeen Ran, in zijn GTP-gebonden
status, is eveneens aanwezig ter hoogte van het centrosoom [23]. Dit suggereert dat het
RanNb sterker RanGTP bindt. In PFA gefixeerde HEK293T cellen vertoont het RanNb de
meest intense aankleuring in de nucleus, daar waar tevens endogeen RanGTP zich
voornamelijk lokaliseert. Een studie waarin Ran-GFP gevolgd werd doorheen de celcyclus
via live-cell imaging vertoonde eveneens een nucleaire aanwezigheid tijdens interfase [30].
Tijdens mitose werd Ran-GFP in deze studie echter diffuus aangetroffen in de cel. Het zou
interessant zijn om tevens het RanNb en Ran lokalisatie naderhand in mitotische cellen te
analyseren. Verder werd tijdens deze masterproef een NES gekloneerd in RanNb-pEGFP-N1
met als doel endogeen Ran extranucleair te delokaliseren en de Ran gradiënt over de
kernmembraan te verstoren. Verstoring van deze gradiënt is immers een mogelijke trigger
voor apoptose [16]. Lokalisatiestudies toonden aan dat endogeen Ran niet gedelokaliseerd
werd door het NES-RanNb. Ook in een MOM-recruitment assay was MOM-Ran-V5 niet in
staat om het RanNb te lokaliseren naar de mitochondriën. Deze resultaten kunnen er
mogelijks op wijzen dat de interactie wel specifiek is, maar niet sterk. Toch beweren Olichon
et al. dat RE3 VHH (RanNb) een hoge affiniteit heeft, althans in vitro [28]. Mogelijks zijn de
46
ELISA condities die werden gebruikt in deze studie niet representatief voor de intracellulaire
condities. Verder is een hoge affiniteit niet steeds evenredig met de capaciteit om te
delokaliseren. Zo heeft bv. CapG-Nb2 een affiniteit van 25 nM (bepaald via ITC), is het niet
in staat endogeen CapG te delokaliseren, maar heeft wel een functioneel effect op celmigratie
en de celcyclus [ongepubliceerde data].
Een analyse van de interactie via recombinant RanNb en recombinant Ran werd in deze
masterproef niet uitgevoerd. Immunoprecipitaties, pull-down assays en ITC experimenten
zouden concreter deze interactie kunnen karakteriseren en kunnen ingepland worden als
toekomstige experimenten. Mogelijks kan het ook interessant zijn om in een ITC experiment
met het RanNb, Ran mutanten te betrekken. RanQ69L is een mutant die de GTP-gebonden
status behoudt. RanT24N daarentegen heeft een lage affiniteit voor nucleotiden [29].
3. Inductie van apoptose door NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb
Om te evalueren of transfectie met bepaalde NTF2-Nbs, RanNb of NES-RanNb een effect
heeft op apoptose in HEK293T cellen werd via flowcytometrie het aantal apoptotische cellen
bepaald in de getransfecteerde populatie. Wanneer de gemiddelden genormaliseerd werden
t.o.v. de GFP controle lokken NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb resp. 1,5 ; 4,2 en 5,0 keer
meer apoptose uit 48 u na transfectie. De resultaten weergegeven in dit experiment zijn de
gemiddelden van twee onafhankelijke experimenten. Om echter meer betrouwbare data te
kunnen voorstellen, zou dit experiment nogmaals moeten herhaald worden. Op basis van de
beschikbare data kunnen wel reeds een paar trends besproken worden. NTF2-Nb8 induceert
anderhalf keer meer apoptose op een significante wijze. De twee waarden (i.e. het percentage
aan apoptotische cellen in de getransfecteerde populatie) van beide experimenten lagen dicht
bij elkaar. Het RanNb en het NES-RanNb induceren eveneens apoptose, maar dan meer
uitgesproken. De spreiding op de waarden was hier groter. Een mogelijke verklaring voor de
grotere mate van apoptose inductie door het RanNb t.o.v. NTF2-Nb8 kan gevonden worden
in het verschil in mate van expressie. De inductie van apoptose bij verstoring van Ran op
eiwitniveau stemt overeen met het feit dat RNAi van Ran eveneens apoptose induceert [11,
12, 14]. Verder is het opvallend dat NTF2-Nb7 een daling aan apoptose vertoont, doch niet
significant.
Niettegenstaande deze resultaten preliminair zijn en om extra bevestiging vragen, kan het
reeds interessant zijn om stil te staan bij potentiële mechanismen van apoptose inductie.
47
Wanneer we het NES-RanNb beschouwen, toonden lokalisatiexperimenten aan dat endogeen
Ran niet massaal gedelokaliseerd wordt uit de nucleus. Tevens blijken het RanNb en het
NES-RanNb nagenoeg even sterk in het uitlokken van apoptose. Op basis hiervan kan
gespeculeerd worden dat het mechanisme van apoptose inductie bij het NES-RanNb niet
geïnitieerd wordt vertrekkende van een verstoring in de Ran gradiënt wegens delokalisatie
van RanGTP. Mogelijkerwijs kunnen het RanNb en het NES-RanNb bv. de docking-site voor
NTF2 bezetten. Een andere optie is bv. het verstoren van de kinetochoor of microtubule Ran
cycli. Aangezien het NES-RanNb eveneens aangetroffen wordt t.h.v. het centrosoom, zou
ook een disfunctie van dit organel een potentieel mechanisme kunnen zijn. Er werd
bovendien reeds aangetoond dat CRM1, een exportreceptor tijdens nucleocytoplasmatisch
transport, ook lokaliseert t.h.v. het centrosoom tijdens mitose [2]. Een NES-RanNb/CRM1
complex zou zo ook naar het centrosoom gelokaliseerd kunnen worden en op die manier
centrosomale functies verstoren. Ook het NTF2-Nb8 zou apoptose kunnen induceren door
een centrosomale functie te verstoren aangezien dit nanobody eveneens ter hoogte van het
centrosoom lokaliseert. Daarnaast is er tevens de mogelijkheid dat NTF2-Nb8 zijn effect
uitoefent via ontregeling van nucleocytoplasmatisch transport.
Om verder te staven dat HEK293T cellen apoptose ondergingen, werden ruwe celextracten
geanalyseerd op aanwezigheid van geproteolyseerd caspase-3 en PARP. De geproteolyseerde
producten werden echter niet gedetecteerd. De celextracten werden gemaakt 24 u na
transfectie. Na flowcytometrie analyse was na 24 u reeds apoptose te zien, maar niet
significant. De (geproteolyseerde) caspase-3/PARP detectie is echter het resultaat van één
enkel experiment. Herhaling is hier zeker aangewezen, waarbij bovendien in de toekomst ook
het best twee of drie tijdstippen worden vooropgesteld om te analyseren (24, 48 en 72 u bv.).
Flowcytometrische analyse en (geproteolyseerde) caspase-3/PARP detectie in deze
masterproef werd uitgevoerd op HEK293T cellen. Toekomstig onderzoek zou er enorm veel
baat bij hebben om ook apoptose na te gaan in een aantal kankercellijnen. Zo blijken
bepaalde kankercellijnen (MDA-MB-231 (borst); A549 (long); DU145 (prostaat); EC109
(slokdarm) en HCT116/DLD-1 (colon)) gevoeliger te zijn aan siRNA tegen Ran in
vergelijking met geïmmortaliseerde HEK293T cellen [14].
48
4. Algemene conclusie
In deze masterproef werden nanobodies tegen Ran en NTF2 aangewend om nieuwe functies
van deze eiwitten te bestuderen. Karakterisering van de interactie van NTF2-Nb8 met NTF2-
WT en NTF2-M118E laat vermoeden dat dit nanobody een hogere affiniteit heeft voor
NTF2-M118E. Bovendien suggereren de flowcytometrische resultaten dat dit nanobody
potentieel heeft om apoptose te induceren, al is er nog geen duidelijkheid over het
onderliggend mechanisme. Bovendien hebben ook het RanNb en het NES-RanNb apoptose
inducerende capaciteiten die tevens meer uitgesproken zijn dan NTF2-Nb8. Ook hier kan nog
volop gespeculeerd worden over het onderliggende mechanisme. Verder is er onvoldoende
informatie beschikbaar omtrent de interactie van het RanNb met Ran.
We kunnen stellen dat er nood is aan een completere karakterisering van de interactie van de
nanobodies met hun targets. Maar ondanks het feit dat verder experimenteel onderzoek dient
uit te wijzen wat het exacte aangrijpingspunt van deze nanobodies is, zou de apoptose
inducerende capaciteit van NTF2-Nb8, RanNb en NES-RanNb dus een mogelijke eerste stap
kunnen zijn in de richting van de ontwikkeling van nieuwe kankertherapeutica.
Referenties
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Clarke PR & Zhang C (2008). Spatial and temporal coordination of mitosis by Ran GTPase. Nature
Reviews Molecular Cell Biology 9: 464-477.
2. Rensen WM, Mangiacasale R, Ciciarello M & Lavia P (2008). The GTPase Ran: regulation of cell life
and potential roles in cell transformation. Frontiers in Bioscience: 4097-4121.
3. Macara IG (2001). Transport into and out of the Nucleus. Microbiology and Molecular Biology
Reviews 65: 570–594.
4. Kau TR , Way JC & Silver PA (2004). Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention.
Nature Reviews Cancer 4: 106-117.
5. Stewart M (2007). Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle. Nature Reviews
Molecular Cell Biology 8: 195-207.
6. Van Impe K, Hubert T, De Corte V, Vanloo B, Boucherie C, Vandekerckhove J & Gettemans J (2008).
A new role for nuclear transport factor 2 and Ran: nuclear import of CapG. Traffic 9: 695-707.
7. George R, Chan HL, Ahmed Z, Suen KM, Stevens CN, Levitt JA, Suhling K, Timms J & Ladbury JE
(2009). A complex of Shc and RanGTPase localizes to the cell nucleus. Cellular and Molecular Life
Sciences 66: 711-720.
49
8. Chaillan-Huntington C, Butler JG, Huntington JA, Akin D, Feldherr C & Stewart M (2001). NTF2
monomer-dimer equilibrium. Journal of Molecular Biology 314: 465-477.
9. Sluder G (2005). Two-way traffic: centrosomes and the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell
Biology 6: 743-748.
10. Mühlhäusser P & Kutay U (2007). An in vitro nuclear disassembly system reveals a role for the
RanGTPase system and microtubule-dependent steps in nuclear envelope breakdown. The Journal of
Cell Biology 178: 595-610.
11. Tietze N, Pelisel J, Phillip A, Roedi W, Merdan T, Tarcha P, Ogris M & Wagner E (2008). Induction
of apoptosis in murine neuroblastoma by systemic delivery of transferring-shielded siRNA polyplexes
for downregulation of Ran. Oligonucleotides 18: 161-174.
12. Barrès V, Ouellet V, Lafontaine J, Tonin PN, Provencher DM & Mes-Masson AM (2010). An essential
role for Ran GTPase in epithelial ovarian cancer cell survival. Molecular Cancer 9: 272-283.
13. Rensen WM, Roscioli E, Tedeshi A, Mangiacasale R, Ciciarello M, Di Gioia SA & Lavia P (2009).
RanBP1 downregulation sensitizes cancer cells to taxol in a caspase-3-dependent manner. Oncogene
28: 1748-1758.
14. Yuen H, Chan K, Grills C, Murrat JT, Plat-Higgins A, Eldin OS, O’Byrne K, Janne P, Fennel DA,
Johnston PG, Rudland PS & El-Tanani M (2011). Ran is a potential therapeutic target for cancer cells
with molecular changes associated with activation of the PI3K/Akt/mTORC1 and Ras/MEK/ERK
pathways. Clinical Cancer Research 18: 380-391.
15. Ferrando-May E (2005). Nucleocytoplasmic transport in apoptosis. Cell death and Differentiation 12:
1263-1276.
16. Casanova M, Portalès P, Blaineau C, Crobru L, Bastien P & Pagès M (2008). Inhibition of active
nuclear transport is an intrinsic trigger of programmed cell death in trypanosomatids. Cell Death and
Differentiation 15: 1910–1920.
17. Revets H, De Baetselier P, Muyldermans S (2005). Nanobodies as novel agents for therapeutics. Expert
opinion Biol Therapy 5: 111-124.
18. Muyldermans S, Baral TN, Retarnozzo VC, De Baetselier P, De Genst E, Kinne J, Leonhardt H, Magez
S, Nguyen VK, Revets H, Rothbauer U, Stijlemans B, Tillib S, Wernery U, Wyns L, Hassanzadeh-
Ghassabeh G, Saerens D (2009). Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Veterinary
immunology and immunopathology 128:178-183.
19. Huang L, Muyldermans S & Saerens D (2010). Nanobodies®: proficient tools in diagnostics. Expert
Reviews of Molecular Diagnostics 10: 777-785.
20. Rothbauer U, Zolghadr K, Muyldermans S, Schepers A, Cardoso MC & Leonhardt H (2008). A
versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Molecular
and Cellular Proteomics 7.2: 282-289.
21. Roovers RC, Vosjan MJWD, Laeremans T, el Khoulati R, de Bruin RCG, Ferguson KM, Verkleij AJ,
van Dongen GAMS & van Bergen en Henegouwen PMP (2011). A biparatopic anti-EGFR nanobody
efficiently inhibits solid tumor growth. International Journal of Cancer 129: 2013-2024.
50
22. Delanote V, Vanloo B, Catillon M, Friederich E, Vandekerkchove J & Gettemans J (2010). An alpaca
single-domain antibody blocks filopodia formation by obstructing L-plastin-mediated F-actin bundling.
The FASEB Journal 24: 105-118.
23. Keryer G, Di Fiore B, Celati C, Lechtreck KF, Mogensen M, Delouvée A, Lavia P, Bornens M &
Tassin A (2003). Part of Ran is associated with AKAP450 at the centrosome: involvement in
microtubule-organizing activity. Molecular Biology of the Cell 14: 4260-4271.
24. Boulares AH, Yakovlev AG, Ivanova V, Stoica BA, Wang G, Iyer S & Smulson M (1999). Role of
Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage in apoptosis. The Journal of Biological Chemistry
274: 22932-22940.
25. Kvam E, Sierks MR, Shoemaker CB & Messer A (2010). Physico-chemical determinants of soluble
intrabody expression in mammalian cell cytoplasm. Protein Engineering, Design & Selection 23: 489-
498.
26. MacDonald PJ, Chen Yun, Wang X, Chen Yan & Mueller JD (2010). Brightness analysis by Z-scan
fluorescence fluctuation spectroscopy for the study of protein interactions within living cells.
Biophysical Journal 99: 979-988.
27. MacDonald PJ, Chen Y & Mueller JD (2012). Chromophore maturation and fluorescence fluctuation
spectroscopy of fluorescent proteins in a cell-free expression system. Analytical Biochemistry 421:
291-298.
28. Olichon A, Schweizer D, Muyldermans S & de Marco A (2007). Heating as a rapid purification
method for recovering correctly-folded thermotolerant VH and VHH domains. BMC Biotechnology 7.
29. Hutchins JRA, Moore WJ & Clarke PR (2009). Dynamic localisation of RanGTPase during the cell
cycle. BMC Cell Biology 10:66.
30. Vognsen T & Kristensen O (2012). Crystal structure from the rasputin NTF2-like domain from
Drosophila melanogaster. Biochemical and Biophysical Research Communications 420: 188-192.
Addendum
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Figuren
Suppl. Fig. 1. Oppervlaktevoorstelling van de NTF2 dimeer interface. Interface residuen kregen een
kleur volgens type (grijs: hydrofoob, rood: zuur, blauw: basisch, wit: polair). De cyaankleur
representeert één NTF2 monomeer. Methionines op AZ posities 84, 102 en 118 worden aangeduid
[30].
Vectoren
De PHEN6 vector is gelijkaardig aan de pHEN4 vector, met dit verschil dat de Haemaglutinine-tag
en gene III vervangen werden door een His6-tag (H-tag).
