Genotype/fenotype studie van patiënten met een (sub...
86
Academiejaar 2011 - 2012 Genotype/fenotype studie van patiënten met een (sub)microscopische chromosoomafwijking Sara David en Karel Maelegheer Promotor: Prof. Dr. Ir. Björn Menten Copromotoren: Dr. Barbara Delle Chiaie en Dr. Olivier Vanakker Scriptie voorgedragen in de 2 de master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE
Transcript of Genotype/fenotype studie van patiënten met een (sub...
Academiejaar 2011 - 2012
Genotype/fenotype studie van patiënten met een
(sub)microscopische chromosoomafwijking
Sara David en Karel Maelegheer
Promotor: Prof. Dr. Ir. Björn Menten
Copromotoren: Dr. Barbara Delle Chiaie en Dr. Olivier Vanakker
Scriptie voorgedragen in de 2de
master in het kader van de opleiding
MASTER IN DE GENEESKUNDE
Academiejaar 2011 - 2012
Genotype/fenotype studie van patiënten met een
(sub)microscopische chromosoomafwijking
Sara David en Karel Maelegheer
Promotor: Prof. Dr. Ir. Björn Menten
Copromotoren: Dr. Barbara Delle Chiaie en Dr. Olivier Vanakker
Scriptie voorgedragen in de 2de
master in het kader van de opleiding
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen
en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het
auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het
aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum:
Sara David Karel Maelegheer Prof. Dr. Ir. Menten
VOORWOORD Deze masterproef is het sluitstuk van onze academische opleiding Geneeskunde aan de Universiteit
Gent. Na twee literatuurstudies in de Bachelor Geneeskunde als oefening, hebben we gedurende twee
masterjaren aan dit onderzoeksproject gewerkt. We hebben dit graag gedaan, mede dankzij de
ondersteuning van enkele personen. Bij deze zouden we graag onze promotor en begeleiders bedanken. In
het bijzonder willen we Prof. Dr. Ir. Menten bedanken voor zijn deskundige en enthousiaste bijdrage, Dr.
Delle Chiaie die altijd klaarstond wanneer we vragen hadden en ons terug op de juiste weg zette, Dr.
Vanakker voor de kritische kijk op de zaak en Mevr. Van Vlierberghe voor het ontwerpen van alle ICT-
componenten van deze masterproef. Eveneens willen we de patiënten en medewerkers van de dienst
klinische genetica en het genetisch laboratorium van het UZ Gent bedanken. Ten slotte willen we ook de
mensen vermelden waarop we altijd konden rekenen: onze ouders, broers, zussen en partners.
Sara David en Karel Maelegheer
INHOUDSOPGAVE
1 Abstract ................................................................................................................................................ 1
2 Inleiding ................................................................................................................................................ 3
3 Literatuurstudie ................................................................................................................................... 4
3.1 Genetische analysetechnieken ........................................................................................ 4
3.1.1 Klassieke karyotypering ................................................................................................. 4 3.1.2 Fluorescence in-situ hybridization (FISH) ..................................................................... 5 3.1.3 Array-Comparative Genomic Hybridization (array-CGH) ............................................ 6
3.1.3.1 De techniek ............................................................................................................... 7 3.1.3.2 Voordelen en beperkingen ....................................................................................... 8 3.1.3.3 Copy number variations (CNV’s) ............................................................................ 9 3.1.3.4 Toepassingen ............................................................................................................ 9
3.2 Klinische genetica ........................................................................................................ 10
3.2.1 Anamnese ..................................................................................................................... 11 3.2.2 Klinisch onderzoek ....................................................................................................... 12 3.2.3 Aanvullend onderzoek .................................................................................................. 14 3.2.4 Genetische counseling .................................................................................................. 14
3.3 Databanken ................................................................................................................... 15
3.3.1 The human genome project .......................................................................................... 15 3.3.2 Genetic Laboratorium Information System (Glims)..................................................... 15 3.3.3 Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensemble
Resources (DECIPHER) .............................................................................................. 16 3.3.4 Database of Genomic Variants (DGV) ......................................................................... 16
4 Doelstelling ......................................................................................................................................... 17
5 Methodologie ...................................................................................................................................... 18
5.1 Deelnemers ................................................................................................................... 18
5.2 Procedure ...................................................................................................................... 19
5.3 Apparatuur en materialen ............................................................................................. 20
5.3.1 Array-CGH ................................................................................................................... 20 5.3.2 Checklists ..................................................................................................................... 21
5.3.2.1 De papieren checklist ............................................................................................. 21 5.3.2.2 De elektronische checklist ...................................................................................... 22
5.3.3 Databanken ................................................................................................................... 24 5.3.3.1 PubMed .................................................................................................................. 24 5.3.3.2 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) ..................................................... 24 5.3.3.3 Glims ...................................................................................................................... 24 5.3.3.4 DECIPHER ............................................................................................................ 25 5.3.3.5 Database of Genomic Variants (DGV) .................................................................. 25
6 Resultaten ........................................................................................................................................... 26
6.1 Fenotype/genotype studies ........................................................................................... 26
6.1.1 Mentale beperking ........................................................................................................ 26 6.1.1.1 Fenotypes ............................................................................................................... 26 6.1.1.2 Genotypes ............................................................................................................... 27
6.1.2 Congenitale hartafwijkingen......................................................................................... 30 6.1.2.1 Fenotypes ............................................................................................................... 30 6.1.2.2 Genotypes ............................................................................................................... 30
6.2 Genotype/fenotype studies ........................................................................................... 32
6.2.1 Chromosoomband 1q21.1 groep 1................................................................................ 33 6.2.2 Chromosoomband 1q21.1 groep 2................................................................................ 36 6.2.3 Chromosoomband 2p16.3 ............................................................................................. 39 6.2.4 Chromosoomband 15q15.3 ........................................................................................... 42 6.2.5 Chromosoomband 16p12.1 ........................................................................................... 45
7 Discussie .............................................................................................................................................. 48
7.1 Evaluatie van de methode ............................................................................................. 48
7.2 Interpretatie fenotype/genotype studies ........................................................................ 48
7.2.1 Mentale beperking ........................................................................................................ 49 7.2.2 Congenitale hartafwijking ............................................................................................ 50
7.3 Interpretatie genotype/fenotype studies ........................................................................ 50
7.3.1 1q21.1: Groep 1 ............................................................................................................ 50 7.3.2 1q21.1: Groep 2 ............................................................................................................ 53 7.3.3 2p16.3: Neurexine 1 CNV’s ......................................................................................... 56 7.3.4 15q15.3: Heterozygote deleties: normale varianten?.................................................... 57 7.3.5 16p12.1: Het 16p11.2p12.2 microdeletiesyndroom ..................................................... 59
7.4 Validering van de resultaten ......................................................................................... 62
7.5 Toekomstperspectieven ................................................................................................ 63
7.6 Besluit ........................................................................................................................... 64
8 Referenties .......................................................................................................................................... 66
Bijlagen .................................................................................................................................................. I
Bijlage I: Papieren checklist............................................................................................................. I
Bijlage II: Overzicht patiënten uit de resultaten ..............................................................................V
Bijlage III: Schriftelijke toestemming voor gebruik van Figuur 1 en Figuur 12 .......................... VI
LIJST VAN GEBRUIKTE AFKORTINGEN ADHD Attention Deficit and Hyperactivity Disorder
AMADID Agilent MicroArray Design Identifier
Array-CGH Micro-Array Comparative Genomic Hybridization
ASS Autismespectrumstoornis
ATP Adenosinetrifosfaat
BAC-array Bacterial Artificial Chromosome array
CATSPER Cation channel, sperm associated
CDR2 Cerebellar degeneration-related autoantigen 2
CH1L/ALC1 Chromodomain Helicase DNA-Binding Protein1-Like/Amplified in Liver Cancer 1
Chr Chromosoom
CKMT1A Creatine kinase, mitochondrial 1A
CKMT1B Creatine kinase, mitochondrial 1B
CMGG Centrum Medische Genetica Gent
CNV Copy Number Variation
Cons Consanguïniteit
COS Centrum voor Ontwikkelingsstoornissen
CX40 Connexin 40
CX50 Connexin 50
Cy3 Cyanine 3
Cy5 Cyanine 5
DECIPHER Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensemble
Resources
Del Deletie
DGV Database of Genomic Variants
Dn De novo
DNA Desoxyribonucleïnezuur
DSM IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition
Dupl Duplicatie
E. Coli Escherichia Coli
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
EEF2K Eukaryotic elongation factor 2 kinase
Fam Familiaal
FISH Fluorescence in-situ hybridization
G-banding Klassieke karyotypering met Giemsa-kleuring
GJA5 Gap junction alpha-5 protein
GJA8 Gap junction alpha-8 protein
Glims Genetic Laboratorium Information System
GPR89B G protein-coupled receptor 89B
GRIP1 Glutamate receptor-interacting protein 1
HFRE2A Hemocromatosis type 2A
Hg18 Human Genome assembly 18
HGNC HUGO Gene Nomenclature Committee
HISPPD2A Histidine acid phosphatidase domain-containing protein 2A
HMGA2 High-mobility group AT-hook 2
HYDIN2 Hydrocephalus inducing homolog 2
ITGA10 Integrin, alpha10
LCR Low Copy Repeat
LEMD3 LEM domain containing 3
LMDD London Medical Dysmorphology Database
Mat Maternaal
MR Mentale Retardatie
NAHR Non-Allelische Homologe Recombinatie
NCBI36.1 National Center for Biotechnology Information, build 36.1
MRB Medical Research Building
NBF11 Neuroblastoma breakpoint family, member 11
NRXN1 Neurexine 1
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
p Korte chromosoomarm
Pat Paternaal
PEX11B Peroxisome biogenesis factor 11B
PHA Phytohemaggluttinine
Pias 3 Protein inhibitor of activated STAT, 3
PRKAB2 Protein kinase, adenosine monophosphate-activated protein, beta 2 non-catalytic
subunit
q Lange chromosoomarm
RBM8A RNA-binding motif protein 8A
RBM8B RNA-binding motif protein 8B
S-fase Synthesefase van de celcyclus
SNP Single Nucleotide Polymorphism
TAR Trombocytopenia Absent Radius
TOPO II Type II Topoisomerases
UCSC University of California Santa Cruz
UGent Universiteit Gent
UQCRC2 Ubiquinol-cytochrome c reductase core protein II
UZ Gent Universitair Ziekenhuis Gent
WGO/WHO Wereldgezondheidsorganisatie/ World Health Organization
XRT Cross-Referenced Tables
1
1 ABSTRACT Achtergrond: De ontwikkeling van de medische genetica zit momenteel in een stroomversnelling.
Aan een razendsnel tempo komen er nieuwe technieken en inzichten bij. Eén van de laatst ontwikkelde en
tegenwoordig wereldwijd gebruikte chromosoomanalysetechnieken is array-vergelijkende
genoomhybridisatie (array-CGH). De implementatie van array-CGH bij patiënten met congenitale en/of
syndromale afwijkingen resulteert in de vaststelling van variaties in het genetisch materiaal (CNV’s). De
uitdaging van de klinische genetica op dit moment is het correct interpreteren van de betekenis van die
variaties. Internationale databanken (DECIPHER, OMIM, DGV) pogen gegevens van patiënten met
onverklaarde genetische afwijkingen te verzamelen en te vergelijken, zodoende de betekenis van
genetische afwijkingen te achterhalen.
Methode: Deze masterproef is een genotype/fenotype studie van een patiëntenpopulatie van 320
patiënten met een afwijkend array-CGH-resultaat bepaald door het Centrum Medische Genetica Gent
(CMGG). De klinische gegevens van deze patiënten werden retrospectief onderzocht aan de hand van een
gestandaardiseerde checklist. Er werd eveneens een papieren checklist opgesteld die kan gebruikt worden
als intakeformulier bij een klinische consultatie. Op basis hiervan kan in de toekomst prospectief
onderzoek uitgevoerd worden. De klinische en genetische informatie werd bestudeerd en getoetst aan
patiëntengegevens uit internationale databanken en wetenschappelijke publicaties. De resultaten werden
opgedeeld in twee fenotype/genotype studies m.b.t. mentale beperking en congenitale hartwijkingen en
vijf genotype/fenotype studies m.b.t. afwijkingen op chromosoombanden 1q21.1 groep 1, 1q21.1 groep 2,
2p16.3, 15q15.3 en 16p12.1.
Resultaten en discussie:
FENOTYPE/GENOTYPE STUDIE: Mentale beperking (MR) en congenitale hartafwijkingen zijn
frequente indicaties voor genetisch onderzoek. Zowel bij MR als bij hartafwijkingen is de klinische
betekenis onduidelijk bij meer dan de helft van de gerapporteerde CNV’s. Echter, in een minderheid kan
het CNV als causaal of normale variant worden beschouwd, wat relevante informatie oplevert voor de
counseling.
GENOTYPE/FENOTYPE STUDIE: Voor de 1q21.1 (groep 1) regio werden twee UZ Gent-
patiënten en acht patiënten uit DECIPHER weerhouden met een overlappende deletie in deze regio. De
patiënten bleken onderling een zeer variabel fenotype te hebben, gaande van taalachterstand tot
groeiretardatie. Dit resultaat is grotendeels vergelijkbaar met de bevindingen in de literatuur. Een
verschilpunt is dat microcefalie veel minder frequent voorkomt in de resultaten van deze masterproef.
2
Voor de 1q21.1 (groep 2) regio werden twee UZ Gent en vijf DECIPHER-patiënten geïncludeerd
met een overlappende deletie in deze regio. Deze deletie bevat de TAR-regio. Bij geen enkele patiënt zijn
de basiskenmerken van het TAR-syndroom (trombocytopenie en radius aplasie) teruggevonden. In de
literatuur wordt verondersteld dat voor deze fenotypische afwijkingen, die behoren tot het TAR-
syndroom, naast de deletie ook een extra modifier nodig is. De resultaten van deze masterproef kunnen dit
bevestigen.
Veertien beschreven CNV’s ter hoogte van 2p16.3 omvatten het neurexine1-gen. Dit uit zich in een
Pitt-Hopkinslike syndroom. Er is evidentie dat NRXN1 CNV’s predisponeren tot
MR/taalontwikkelingsachterstand, ASS en schizofrenie. Andere fenotypische kenmerken die zowel in de
literatuur als in deze studie naar voor komen als mogelijks gecorreleerd met NRXN1 CNV’s zijn:
wervelafwijkingen, hemangiomen, hartafwijkingen, hypotonie, epilepsie en faciale dysmorfie.
Voor de 15q15.3 regio werden vijf UZ Gent en twee DECIPHER-patiënten weerhouden. Een defect
in de genen CKMT1B, CATSPER en CKMT1A gaat mogelijks gepaard met MR en schisis (CKMT1B), MR
en colobomata (CATSPER) en hypotonie (CKMT1A). STRC is een ander gen dat bij de patiëntencluster
frequent gedeleteerd is. Volgens de literatuur komen heterozygote deleties van STRC voor in 1,6% van
een controlepopulatie, wat het dan weer waarschijnlijker maakt dat deze CNV’s normale varianten zijn.
Een deletie van chromosoomband 16p12.1 werd vastgesteld bij twee UZ Gent en zeven
DECIPHER-patiënten. Het ontstaan van een afwijkend fenotype wordt gegenereerd via een “three-hit”-
mechanisme: een S2-configuratie van deze regio is kwetsbaar voor het ontstaan van CNV’s. Deze CNV’s
predisponeren tot bepaalde neurocognitieve stoornissen. In combinatie met een omgevingsfactor of een
tweede genetische afwijking komen deze CNV’s klinisch tot expressie als MR, ASS en schizofrenie.
Besluit: Voor deze masterproef werd een gestandaardiseerde papieren en elektronische checklist
ontwikkeld waarin fenotypische en genotypische gegevens van patiënten met een (sub)microscopische
afwijking kunnen worden verwerkt. Op deze wijze werden de gegevens van 320 UZ Gent-patiënten
verwerkt. Vervolgens werden de verzamelde patiëntengegevens met behulp van wetenschappelijke
literatuur en internationale databanken geëvalueerd en geïnterpreteerd.
De resultaten bekomen uit deze masterproef leveren een bijdrage aan de interpretatie van
(sub)microscopische chromosoomafwijkingen. Tevens vormen de ontworpen checklists een handig
hulpmiddel voor toekomstige genotype/fenotype studies in het UZ Gent.
3
2 INLEIDING De ontwikkeling van de medische genetica zit momenteel in een stroomversnelling (1). Aan een
razendsnel tempo komen er nieuwe technieken en inzichten bij. Deze masterproef probeert een methode te
ontwikkelen om met bestaande technieken een beter inzicht te krijgen in de klinische relevantie en
causaliteit van genetische afwijkingen. Hiervoor wordt gepoogd twee soorten van patiënteninformatie te
correleren: het genotype en het fenotype.
Het genotype is de fundamentele genetische constitutie van een individu, het unieke DNA-patroon
dat hetzelfde is in alle cellen van een lichaam (2, 3). De laatste jaren zijn talrijke nieuwe genetische
analysetechnieken ontwikkeld die in staat zijn om steeds kleinere genetische afwijkingen te detecteren. De
discipline van het genetisch onderzoek wordt opgesplitst in de cytogenetica en de moleculaire genetica.
De cytogenetica onderzoekt het chromosomenpatroon van cellen (3). Een techniek die in deze masterproef
wordt gebruikt en beschreven is array-Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). De moleculaire
genetica is de wetenschap die zich bezighoudt met de biochemische processen die zich bij overerving
afspelen (3). Er kunnen drie vormen van erfelijkheid onderscheiden worden. De afwijking kan overgeërfd
zijn van de moeder (maternaal), van de vader (paternaal) of een nieuwe mutatie zijn die bij de
ontwikkeling van de geslachtscellen of bij de eerste celdelingen van het embryo ontstaan is (de novo).
Het fenotype is de tweede bron aan informatie. Fenotype betekent “de observatie van de
biochemische, fysiologische en morfologische karakteristieken van een individu, bepaald door zijn of haar
genotype en de omgeving waarin hij/zij zich bevindt” (2). Het opstellen van een uniform systeem om het
fenotype te benoemen is bijzonder moeilijk, maar er wordt toch getracht fenotypische begrippen te
standaardiseren (4). Een belangrijk onderdeel binnen het fenotype zijn de dysmorfe kenmerken.
Dysmorfologie betekent “het identificeren van een uiterlijk zichtbare anatomische variatie die wijst op een
syndroom met mentale retardatie en/of aangeboren misvormingen van organen” (3). Deze categorie van
fenotypische kenmerken is zeer moeilijk te standaardiseren vanwege de grote variatie en de vaak subtiele
verschillen. Experten in bepaalde vakgebieden kwamen samen om aan de hand van beeldmateriaal
eenduidige benamingen te geven aan morfologische afwijkingen (4, 5).
In de literatuurstudie wordt verder ingegaan op het verzamelen en vergelijken van genotypische en
fenotypische informatie. Vanuit die studie wordt de doelstelling van deze masterproef geformuleerd.
Vervolgens wordt een methode beschreven en geïllustreerd hoe deze informatie kan gestructureerd,
beheerd en bestudeerd worden, met als doel nieuwe inzichten te krijgen in de medische genetica. Het
terugvinden van steeds kleinere genetische afwijkingen heeft geleid tot veel nieuwe informatie waarbij het
de uitdaging vormt de betekenis ervan te interpreteren.
4
3 LITERATUURSTUDIE
3.1 GENETISCHE ANALYSETECHNIEKEN
De studie van de genetica begon in het midden van de 19de
eeuw door Mendel (6). Gregor Mendel
werkte vooral met erwten. Hieruit ontstonden enkele basiswetten van de genetica (7). In 1882 tekende
Flemming de eerste chromosomen. De term genetica zelf werd pas in 1888 bedacht door Waldeyer (7).
Gedurende de voorbije eeuw zijn heel wat technieken uitgewerkt om het menselijk genoom te visualiseren
en afwijkingen op te sporen.
3.1.1 KLASSIEKE KARYOTYPERING
Chromosomen kunnen gevisualiseerd worden onder de microscoop. Het bepalen van het aantal, de
grootte en de vorm van de chromosomen in een cel wordt karyotypering genoemd (3). Voor de klassieke
methode wordt gebruik gemaakt van perifere lymfocyten. Als alternatief kan ook gebruik gemaakt worden
van een huidbiopt, maligne cellen, prenatale weefsels… De tijdelijke bewaring van dit staal wordt
verkregen door toevoeging van een anticoagulans in een pH-neutraal milieu, bij 37° Celsius (2). De eerste
stap in de techniek is de phytohemagglutinine (PHA)-stimulatie. PHA is een eiwit afkomstig uit rode
bonen met mitogene activiteit. Het zorgt voor agglutinatie van de erytrocyten en proliferatie van de
lymfocyten. De cellen gaan in de celcyclus, maar gaan niet verder dan de S-fase. Na drie dagen wordt
colchicine toegevoegd. Dit tricyclisch alkaloïde blokkeert microtubuli en brengt de cellen in mitotisch
arrest, wat wil zeggen dat de celdeling stopt in de metafase. In deze fase zijn de chromosomen
gecondenseerd en liggen ze geordend in het evenaarsvlak van de cel, ideaal om ze te bekijken onder de
microscoop (2). In 1950 ontdekte Hsu de “hypotone shock”. Wanneer de cellen in een hypotone
zoutoplossing worden gewassen, zwellen ze op en kleven ze niet aan elkaar (7). Ten slotte wordt het
preparaat gefixeerd en worden de bruikbare kernen geselecteerd. Door het verbeteren van de techniek van
karyotypering hebben Tijo en Levan in 1955 als eerste aangetoond dat het menselijk genoom 46
chromosomen telt (6, 7). Naast het aantal kan ook de grootte van het chromosoom en de plaats van het
centromeer bepaald worden. Op basis van die kenmerken werden de chromosomen onderverdeeld in acht
groepen, dit is groep A tot en met G en de geslachtschromosomen (6). Door toevoeging van speciale
kleurstoffen, wordt er op de chromosomen een dwars bandingspatroon merkbaar. De meest gebruikte
kleuring is Giemsa waardoor dit type van karyotypering ook G-banding wordt genoemd. Omdat het
bandingspatroon voor ieder chromosomenpaar uniek is, is het nu mogelijk de chromosomen te
identificeren (2). De hedendaagse (“klassieke”) karyotypering stelt de chromosomen niet meer voor in de
acht groepen, maar wel per homoloog paar van nummer 1 t.e.m. nummer 22 en de geslachtschromosomen.
5
Door middel van de klassieke karyotypering kunnen heel wat numerieke chromosoomafwijkingen
worden gediagnosticeerd. Hierbij kan een bepaald chromosoom te veel of te weinig aanwezig zijn. De
bekendste voorbeelden zijn trisomie 13 (Patau syndroom), trisomie 18 (Edward syndroom) en trisomie 21
(Down syndroom), 45,X (Turner syndroom) en 47,XXY (Klinefelter syndroom). In het geval van
polyploïdie is een volledige extra haploïde set chromosomen in een veelvoud aanwezig. Bijvoorbeeld in
geval van triploïdie is één extra set aanwezig (69,XXX). Naast numerieke chromosoomafwijkingen
kunnen ook structurele chromosoomafwijkingen door middel van klassieke karyotypering vastgesteld
worden. Voorbeelden hiervan zijn deleties, duplicaties, inversies, inserties en translocaties. Deze
structurele afwijkingen kunnen enkel vastgesteld worden met de microscoop indien ze voldoende groot
zijn, dit is in de grootteorde van 8 à 10 Mb(6). Karyotypering wordt in de klinische genetica vaak
beschouwd als het onderzoek van eerste keuze, waarna stapsgewijs meer gesofisticeerde methoden kunnen
aangewend worden.
Een belangrijke beperking van klassieke karyotypering is dat kleine, submicroscopische
chromosomale defecten niet kunnen worden vastgesteld. Omwille van deze reden werd er gezocht naar
gevoeligere technieken om het menselijk genoom te bestuderen. Daarnaast is deze techniek zeer
arbeidsintensief en moet er meestal lang gewacht worden op het resultaat.
3.1.2 FLUORESCENCE IN-SITU HYBRIDIZATION (FISH)
De FISH-methode werd in de jaren ‘80 geïntroduceerd (8). FISH is een gericht onderzoek, het gaat
op zoek naar de aan- of afwezigheid van één bepaalde regio in het genoom. Het is dus noodzakelijk een
specifieke regio met eventueel een specifiek gen in gedachten te hebben op basis van klinische gegevens
en genetische kennis (8). Zo’n specifieke regio is meestal te klein om op karyotypering te zien, het is iets
op moleculair niveau. FISH slaat een brug tussen de cytogenetica en de moleculaire biologie en was zo de
eerste stap in het ontstaan van de “moleculaire cytogenetica” (9).
Alvorens het patiëntenstaal te onderzoeken, moeten er enkelstrengige probes aangemaakt zijn. Er
zijn subtelomerische probes die een bepaald chromosoom herkennen en er zijn probes die de specifiek
gezochte regio zullen binden. Deze probes zijn gemerkt met fluorochromen (fluorescerende kleurstoffen)
(2). Bij multiplex FISH krijgt elk chromosoom een uniek kleurtje (10). Het dubbelstrengig patiënten-DNA
wordt door middel van opwarming en chemische stoffen gedenatureerd tot enkelstrengig DNA (2).
Wanneer de probes toegevoegd worden aan het hooggeconcentreerd patiëntenpreparaat zullen
complementaire sequenties hybridiseren via waterstofbruggen. Met fluorescentiemicroscopie wordt
gekeken of het gezochte gen aanwezig is op het gezochte chromosoom (2).
6
In vergelijking met klassieke karyotypering is FISH een zeer snel onderzoek met een hogere
resolutie. Daarenboven moeten de onderzochte cellen niet eerst gekweekt worden (2). Nadelen van de
FISH-methode zijn de kostprijs, de arbeidsintensieve procedure die moeilijk te automatiseren is en vooral
de beperkte beschikbaarheid van specifieke probes. Om deze redenen is het niet mogelijk FISH in te
zetten als screeningsmiddel bij niet-monogenische congenitale aandoeningen zoals mentale beperking.
3.1.3 ARRAY-COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (ARRAY-CGH)
Eén van de laatst ontwikkelde chromosoomanalysetechnieken is array-vergelijkende
genoomhybridisatie (array-CGH). Array-CGH laat toe om op een snelle manier kleine, submicroscopische
veranderingen in het volledige genoom te detecteren. Een tussenstap tussen FISH en array-CGH, was de
comparative genomic hybridization (CGH). Deze techniek is ontwikkeld door de groep van Ollie en Anna
Kallioniemi, Dan Pinkel, Joe Grayen en Peter Lichte (10). In tegenstelling tot bij FISH gaan DNA-
fragmenten uit een referentiegenoom in bindingscompetitie met DNA-fragmenten uit het genoom van de
patiënt. Deze twee stalen zijn met een verschillend fluorochroom gelabeld en proberen zoveel mogelijk te
hybridiseren met DNA-probes uit de te onderzoeken regio. Op basis van de intensiteit van de
fluorochromen kunnen deleties of duplicaties bij de patiënt opgespoord worden (11). Array-CGH is een
techniek die het gehele genoom van de testpersoon doorzoekt op duplicaties en deleties. Ook aneuploïdie
en subtelomerische of ongebalanceerde chromosomale herschikkingen kunnen opgespoord worden (12).
De meest recente technieken halen een resolutie van 5kb (9). Een alternatieve term voor array-CGH is
“moleculaire karyotypering” omdat het volledige genoom wordt onderzocht, zoals bij klassieke
karyotypering, maar dan wel op gedetailleerder, moleculair niveau (9).
Array-CGH bracht een ware revolutie teweeg in de genetica. Dit kan geïllustreerd worden aan de
hand van de vergelijking met een bibliotheek. Die bibliotheek stelt ons genoom voor en een boek staat
hierbij symbool voor een chromosoom. Vroeger konden alle boeken gezien worden en konden er slechts
veranderingen in de bibliotheek gezien worden als een boek of een groot deel van een boek ontbrak. Sinds
array-CGH kan nu zelfs het ontbreken van een bladzijde gezien worden. Tegenwoordig wordt
voornamelijk gezocht wat de betekenis is van een ontbrekende of toegevoegde pagina. Nog meer
gedetailleerde technieken sporen fouten in woorden op, namelijk mutaties op het niveau van baseparen.
Deze technieken zijn sequeneringstechnieken. Ze zijn echter zeer duur en arbeidsintensief waardoor ze, in
tegenstelling tot array-CGH, in de dagdagelijkse praktijk nog niet gebruikt worden voor volledige
genoomscreening.
7
3.1.3.1 De techniek
Figuur 1. Techniek Array-CGH1 (10).
Bij het begin van de array-CGH-procedure moet een bloedafname gebeuren bij de patiënt om
genetisch materiaal te bekomen. Dit gebeurt met steriele buisjes waarin Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
(EDTA) zit als anticoagulans. Er wordt ongeveer vijf ml bloed afgenomen. In het labo wordt DNA uit de
witte bloedcellen geïsoleerd. Dit wordt vervolgens gezuiverd en verdund tot een oplossing met vaste
concentratie DNA (2).
Het dubbelstrengig DNA ondergaat een proces waardoor het enkelstrengig wordt. Vervolgens wordt
het gemerkt met een fluorochroom (labeling in Figuur 1). Het sample van de patiënt wordt gemerkt met
Cyanine 3 (Cy3) (groen). Het controlegenoom, dat kan bestaan uit het genoom van één individu of een
pool van verschillende mensen, wordt gemerkt met Cy5 (rood) (9, 10). Meestal is deze controle van
hetzelfde geslacht maar sommige centra werken liever met “opposite-sex controls”. Vervolgens knippen
enzymen het DNA in fragmenten. De fragmenten van het patiënten- en controle-sample worden
gedenatureerd, gemengd en Cot1-DNA wordt toegevoegd om repetitieve sequenties te blokkeren (10) (mix
+ Cot-1 DNA in Figuur 1).
1 Deze figuur is gebruikt met toelating van de auteur, zie bijlage III.
8
Naast deze twee genomen is er ook een array-slide, een microscopisch draagglaasje waarop DNA-
probes gefixeerd werden (9). De probes zijn artificiële chromosomen op basis van bacteriën, plasmiden,
cosmiden, fosmiden of oligonucleotiden. Deze laatste soort heeft het voordeel dat ze de hoogste resolutie
bieden, dit door hun beperkte grootte (12). De probes op een dergelijke array-slide vormen zo’n 180 000
meetpunten, verspreid over het hele genoom (13).
Het mengsel van patiënten- en controle-DNA wordt vervolgens toegevoegd aan de array-slide. De
genfragmenten zoeken bindingsplaatsen op het draagglaasje om zich aan vast te zetten (10). De probes en
het preparaat zijn immers beiden enkelstrengig en kunnen nu hybridiseren met elkaar (hybridise in Figuur
1). De fragmenten die geen bindingsplaats gevonden hebben, worden van de array-slide weggewassen. De
computer kan tenslotte het resultaat interpreteren (analyze in Figuur 1). Per probe gaat de computer na
welke kleur elk punt op de slide uitstraalt. Indien het punt t.h.v. een bepaalde probe een rode kleur heeft
toont dit een deletie aan bij de testpersoon (copy loss in Figuur 1). Een groene kleur toont een duplicatie
aan (copy gain in Figuur 1). De meeste punten kleuren echter geel aan, wat wil zeggen dat het fragment
zowel bij de controle als bij de patiënt evenveel voorkomt (10). De afwijkende punten worden
gelokaliseerd in het genoom om zo te weten te komen welke chromosoomband en eventuele genen
afwijkend zijn.
3.1.3.2 Voordelen en beperkingen
Een groot voordeel van array-CGH is het feit dat er voor de analyse niet veel DNA en geen
celcultuur nodig is. Zoals reeds vermeld, heeft array-CGH een relatief hoge resolutie, afhankelijk van het
type array. Een BAC-array gaat tot 150 à 200 kb, een oligonucleotiden array tot 5 kb (9). Daarenboven is
de exacte locatie van de mutatie in het genoom gekend. In tegenstelling tot FISH, wordt het hele genoom
in één keer gescreend en zijn er mogelijkheden tot automatisatie van het proces.
Naast deze voordelen zijn er ook enkele beperkingen aan array-CGH. Ten eerste kunnen
polyploïdie, gebalanceerde translocaties en inversies niet gedetecteerd worden, tenzij de chromosomen elk
apart onderzocht worden door middel van flow sorting of chromosome microdissection (9). Ten tweede is
het niet gekend hoe gedetecteerde afwijkende DNA-fragmenten gepositioneerd zijn in het genoom (9).
Ten slotte is het nog steeds duur om het hele genoom tegen hoge resolutie te scannen en worden frequent
veranderingen met een onduidelijke betekenis teruggevonden (14).
9
3.1.3.3 Copy number variations (CNV’s)
Array-CGH spoort deleties, duplicaties, inserties en ongebalanceerde translocaties op. De meeste
van deze (sub)microscopische chromosoomafwijkingen zijn CNV’s (14). DNA kopij veranderingen is de
letterlijke vertaling van het Engelse copy number variations, verder in deze scriptie kortweg vermeld als
CNV’s. CNV’s zijn DNA-segmenten met een grootte van 1 kilobase tot enkele megabasen die in
verschillende aantallen voorkomen bij de vergelijking van twee genomen. Het gaat om deleties (één kopij)
of duplicaties (drie kopijen) van een bepaalde chromosomale regio in diploïde cellen die normaal gezien
in twee kopijen voorkomt. Een CNV kan geen, één of meerdere genen bevatten. Dit laatste geval heet een
“contiguous gene syndrome”. Het gewijzigd kopij-aantal van een gen kan zorgen voor een foute dosering
en/of veranderde sequentie van het eiwit dat geproduceerd wordt. Het resultaat van die CNV is zeer
variërend. Het kan een normale variant zijn, zorgen voor fenotypische diversiteit binnen de menselijke
soort, de kans op ziektes verhogen, soms mentale retardatie teweeg brengen of zorgen voor congenitale
afwijkingen (14, 15).
CNV’s komen heel frequent voor. Er zijn reeds 10 000 verschillende CNV’s beschreven en ze
zouden 13 à 15% van het humane genoom uitmaken (14, 15). Sommige van deze CNV’s komen
herhaaldelijk voor in de populatie. Deze recurrente CNV’s komen voor bij verscheidene niet-verwante
individuen, hebben exact dezelfde breekpunten, bestrijken hetzelfde interval en zijn van dezelfde grootte
(14). CNV’s kunnen de novo ontstaan of overgeërfd worden. Meestal ontstaat een de novo CNV tijdens de
meïose. Een mogelijk mechanisme is non-allelische homologe recombinatie (NAHR). Wanneer twee
homologe chromosomen niet correct aligneren bij de meïotische recombinatie kan er een ongelijke
crossing-over plaatsvinden. Dit resulteert dan bijvoorbeeld in één dochterchromosoom met een kopij
tekort en het ander met een kopij teveel. Low copy repeats (LCR’s) zijn een frequente uitlokkende factor
voor NAHR. LCR’s zijn weerkerende niet-coderende DNA-fragmenten van 1kb of groter. Een synoniem
voor LCR’s is segmentele duplicaties. Er kan NAHR optreden wanneer de LCR’s minder dan 10 Mb van
elkaar gelegen zijn en meer dan 90% (meestal zelfs meer dan 97% of 200 baseparen) identieke sequenties
bevatten (14). Ten gevolge van NAHR kan het gebied geflankeerd door twee LCR’s gedeleteerd,
gedupliceerd of geïnverteerd worden (14, 16). Dit mechanisme verklaart het voorkomen van recurrente
CNV’s met identieke breekpunten bij niet-verwante patiënten.
3.1.3.4 Toepassingen
De implementatie van array-CGH heeft de laatste jaren een enorme bijdrage geleverd aan
ontdekkingen op vlak van kankergenetica, congenitale aandoeningen en overerving. Daarenboven is het
begrip CNV’s ontstaan, zijn er bepaalde nieuwe genen en syndromen beschreven en is het Human
Genome Project vervolledigd. Array-CGH wordt in de huidige genetisch praktijk reeds met succes
10
toegepast voor detectie van chromosoomafwijkingen bij personen met mentale beperking en aangeboren
lichamelijke afwijkingen. Voor het vakgebied van de cytogenetica zijn er wellicht nog veel
ontwikkelingen in het vooruitzicht, maar zoals eerder aangehaald, ligt momenteel de uitdaging in het
verwerken en begrijpen van deze nieuwe informatie (1, 14).
Sinds de introductie van array-CGH werden reeds verschillende microdeletie- en microduplicatie
syndromen ontdekt. Een volledig overzicht van deze verschillende syndromen is terug te vinden op de
website van DECIPHER (zie verder). Zo werd het 12q14 microdeletiesyndroom beschreven door Menten
et al. (2007) dankzij array-CGH. Drie niet-verwante patiënten met overlappende deleties ter hoogte van
chromosoom 12 werden hierbij beschreven (17). De overlappende en kritische regio ligt ter hoogte van
12q14.3, wat o.a. de genen LEM domain containing 3 (LEMD3), glutamate receptor-interacting protein 1
(GRIP1) en high-mobility group AT-hook 2 (HMGA2) bevat. Het gelijkaardig fenotype van de patiënten
vertoont een milde mentale beperking, een gestoorde vroege ontwikkeling, een proportioneel kleine
gestalte en osteopoikilosis, een specifieke botafwijking te diagnosticeren a.d.h.v. radiografie. Het gen
LEMD3 was eerder al verantwoordelijk gesteld voor osteopoikilosis, HMGA2 wordt sinds 2009 gelinkt
met groei en GRIP-1 is een kandidaat gen voor mentale beperking (18-20).
3.2 KLINISCHE GENETICA
De klinische genetica is een relatief jonge discipline binnen de geneeskunde. In België is deze
discipline geen erkende specialisatie, maar er is wel een vorm van bescherming van het ambt door de
gecontroleerde benoeming van acht genetische centra in België, die op één na elk deel uitmaken van een
universitair ziekenhuis. De klinische genetica wordt uitgevoerd door gespecialiseerde artsen, bijvoorbeeld
kinderartsen. Het werk van een klinisch geneticus bestaat uit twee delen: de klinische diagnose van het
fenotype en de zogenaamde ‘genetische counseling’. De klinische diagnose van het fenotype is essentieel
voor het interpreteren van de genetische afwijkingen. Zoals in andere geneeskundige disciplines, zal de
klinisch geneticus steeds een uitgebreide persoonlijke en familiale anamnese afnemen. Daarna volgt een
klinisch onderzoek van de patiënt. Eventueel worden bijkomende onderzoeken aangevraagd en/of
verwanten op consultatie gevraagd en onderzocht. De ‘counseling’ omvat ondersteuning en
informatieverstrekking aan de patiënt en zijn of haar familie, ondermeer over het overervingsrisico van de
genetische aandoening. Er is een nauwe samenwerking met verscheidene genetische laboratoria, de
reproductieve geneeskunde en verloskunde binnen de gynaecologie, de dienst neonatologie, pediatrische
diensten, revalidatiecentra enzovoort.
11
3.2.1 ANAMNESE
De fenotypische diagnostiek begint bij de persoon die de patiënt doorverwijst naar de dienst
medische genetica (21). Vaak is dit een neonatoloog of pediater, soms een huisarts, de ouders van de
patiënt, een adoptiedienst… Redenen voor doorverwijzing naar genetica zijn: congenitale afwijkingen,
psychomotore ontwikkelingsachterstand, een gekende genetische aandoening in de familie, herhaald
miskraam, infertiliteit en/of afwijkende prenatale testen (2, 21).
Voor de persoonlijke anamnese is het handig een chronologische volgorde na te streven. Zo wordt
best begonnen met de prenatale periode. Er zijn enkele belangrijke persoonlijke vragen in verband met
deze periode. Zo kan bijvoorbeeld het al dan niet spontaan ontstaan van de zwangerschap relevant zijn. De
risico’s op het Beckwith-Wiedemann syndroom en Angelman syndroom zouden toenemen bij kinderen
verwekt na in vitro fertilisatie of intracytoplasmatische sperma-injectie (22). Indien de moeder miskramen
achter de rug heeft, zou dit kunnen wijzen op een erfelijke aandoening met risico op niet-levensvatbare
nakomelingen. De leeftijd van de ouders op het moment van de conceptie is eveneens van belang. Het is
algemeen geweten dat de kans op het syndroom van Down toeneemt met toenemende maternale leeftijd.
Verhoogde paternale leeftijd vergroot dan weer het risico op Marfansyndroom, achondroplasie en andere
aandoeningen (23). Na de conceptieperiode wordt er naar het verloop van de zwangerschap gevraagd.
Teratogenen en andere invloeden kunnen namelijk de embryologische ontwikkeling verstoren en tot
dysmorfologie en ontwikkelingsachterstand leiden. Zo moet er aandacht zijn voor het gebruik van alcohol,
drugs en geneesmiddelen, maternale infecties en andere ziekteperioden tijdens de zwangerschap.
Vervolgens wordt het verloop van de bevalling en perinatale periode nagegaan. Objectieve
maatstaven zijn cijfergegevens zoals geboortegewicht, lengte en hoofdomtrek. Daaropvolgend is het
belangrijk de ontwikkeling op te volgen. Zowel de ontwikkeling op vlak van groei, fijne en grove
motoriek, cognitieve mogelijkheden, taal als sociaal gedrag. Groeicurves, mijlpalen (bijvoorbeeld de
leeftijd waarop het kind zelfstandig begon te stappen), het boekje van Kind & Gezin, het Centrum voor
Ontwikkelingsstoornissen (COS) en ook het klinisch onderzoek kunnen helpen deze periode te
reconstrueren.
De medische voorgeschiedenis moet besproken worden, net zoals ook aandoeningen die
ondertussen reeds behandeld zijn. Majeure congenitale afwijkingen kunnen operatief gecorrigeerd zijn,
waardoor deze niet meer opgemerkt worden bij het klinisch onderzoek (23). Bij congenitale afwijkingen is
het zeer belangrijk na te gaan of de ouders ook dergelijke klachten gehad hebben. Dit wordt dan vermeld
in de stamboom. Als de patiënt al volwassen is, zal het moeilijker zijn de prenatale en neonatale anamnese
af te nemen. Eventueel kan beroep gedaan worden op originele dossiers of dossiers van de moeder, mits
een geschreven toestemming (21).
12
De familiale anamnese van elke patiënt (of de hele familie) gekend op een genetische dienst wordt
nauwkeurig nagevraagd. Meestal wordt er een stamboom over drie generaties opgemaakt. Algemene
gegevens zoals geslacht, geboortedatum, huwelijken en kinderen vormen de basis van de stamboom. In
verband met erfelijke aandoeningen is het belangrijk ook medische gegevens toe te voegen. In het
bijzonder moet er gevraagd worden naar aangeboren afwijkingen, mentale beperking,
fertiliteitsproblemen, miskramen… (21, 23, 24). Indien een bepaalde (genetische) aandoening gekend is in
de familie of ontdekt wordt, is de stamboom een zeer goed visueel hulpmiddel om het overervingspatroon
te zien en het risico in te schatten voor familieleden met een kinderwens (22). Consanguïniteit dient zeker
nagevraagd te worden, omdat dit het risico op (recessieve) aandoeningen verhoogt. De informatie voor de
stamboom wordt voornamelijk verkregen tijdens de anamnese van de patiënt of zijn of haar ouders.
Familieleden kunnen ook uitgenodigd worden op de consultatie of hun dossiers kunnen opgevraagd
worden, mits het familielid hiervoor zijn/haar toestemming heeft verleend.
3.2.2 KLINISCH ONDERZOEK
Dysmorfologie is een subdiscipline binnen de klinische genetica. De term dysmorfologie is afgeleid
van de Griekse woorden dys, morfy en logos, respectievelijk moeilijk/mis, vorm en woord/leerstelling
(24). Dokter David W. Smith bedacht de term in de jaren 1960. Dysmorfologie houdt de studie in van
menselijke congenitale malformaties, voornamelijk die malformaties die de morfologie, de anatomie van
het individu aangaan. Een dysmorf kenmerk wordt gedefinieerd als een uiterlijk zichtbare anatomische
variatie die wijst op een syndroom met mentale retardatie en/of aangeboren misvormingen van organen
(23). Er zijn enkele gespecialiseerde dysmorfologen, maar uiteindelijk zijn alle clinici die congenitale
malformaties bestuderen op dat moment dysmorfoloog. Dokter W. Reardon, een eminent dysmorfoloog,
benoemt het “dysmorfologische zesde zintuig”, een talent dat sommige clinici zouden hebben, waardoor
ze, instinctief, beter syndromen kunnen diagnosticeren dan hun collega’s (22).
Dysmorfe kenmerken kunnen opgedeeld worden in malformaties, deformaties en disrupties. Vaak is
er een overlap tussen deze categorieën. Malformaties zijn uitingen van een intrinsiek defect in een
genetisch programma. Omdat dat programma nodig is voor de ontwikkeling van verschillende onderdelen
van het lichaam, zijn er vaak malformaties op verschillende plaatsen (22). Malformaties worden op hun
beurt ingedeeld in majeure en mineure afwijkingen. Een voorbeeld van een majeure malformatie is een
ernstige hartafwijking en een gespleten huig is een voorbeeld van een mineure afwijking. Twee à drie
procent van de gehele populatie wordt met een majeure malformatie geboren (23). Deformaties zijn
vervormingen of abnormale posities van lichaamsdelen. Ze worden veroorzaakt door extrinsieke factoren,
bijvoorbeeld mechanische druk op de normaal gevormde structuren van de foetus. In tegenstelling tot
malformaties genezen deze misvormingen meestal spontaan of zijn ze eenvoudig te behandelen met
13
externe fixatiemiddelen. Ten derde zijn er de disrupties, verstoringen van het normaal geprogrammeerd
morfogenetisch proces. Oorzaken zijn extrinsiek: een virale infectie, vasculaire stoornis, amnionruptuur,
trauma of teratogene stof (23).
Het klinisch onderzoek begint met een algemene inspectie. Alvorens alle lichaamsdelen tot in het
detail te onderzoeken, is het belangrijk eerst de patiënt in zijn geheel te zien. De algemene indruk van de
bouw en gestalte van de patiënt wordt in de literatuur “Gestalt” genoemd. Voor het gelaat alleen is er ook
zo’n algemene indruk, de “facial gestalt”. Soms heeft de dysmorfoloog al genoeg met dit algemeen beeld
om enkele eerste hypothesen te bedenken. Het syndroom van Down bijvoorbeeld, is soms zeer herkenbaar
zonder alle kleine kenmerken te moeten opzoeken. Er zijn meer dan 3 000 syndromen beschreven. De
meeste hiervan zijn zeldzaam. Tevens is er een variabele expressie van genotypes, onvolledige
penetrantie, pleiotropie, mosaïcismen… Kortom, deze fenomenen zorgen er allemaal voor dat het
herkennen van fenotypes en het correleren aan een bepaald genotype soms ingewikkeld is. Er is niet steeds
één fenotype per genotype en vice versa (22). Tijdens het dysmorfologisch klinisch onderzoek worden
systematisch alle lichaamsdelen onderzocht op (mineure) afwijkingen. Mineure afwijkingen zijn fysieke
variaties die geen echte morbiditeit met zich meedragen. Doch, bij vermoeden van een genetische
aandoening kunnen deze afwijkingen toch klinisch belangrijk zijn, aangezien unieke combinaties van
afwijkingen de sleutel tot diagnose van een zeldzaam syndroom kunnen zijn. Systematisch worden alle
onderdelen van het hoofd, de huid, thorax, abdomen, bekken en ledematen geïnspecteerd, gepalpeerd en
eventueel geausculteerd. Belangrijk is om steeds links en rechts te vergelijken, net zoals in andere
klinische disciplines (23).
Soms zijn de dysmorfe kenmerken veranderend over de tijd omdat ze leeftijdsafhankelijk zijn (22-
24). Dit pleit, samen met de voordelen van “genetic counseling”, voor een jarenlange opvolging van de
patiënt. Een mogelijk nadeel van de dysmorfologie is het subjectieve karakter van de vaststellingen. De
fenotypische diagnostiek is namelijk afhankelijk van de onderzoeker. De oorzaak hiervan zou een
combinatie zijn van subjectiviteit en leeftijdsafhankelijkheid van (de duidelijkheid van) de kenmerken.
Hulpmiddelen om vertekening door subjectiviteit te beperken, zijn fotogrammetrie en antropometrie (23,
24). Bij fotogrammetrie worden objectieve metingen uitgevoerd op gestandaardiseerde foto’s van de
patiënt. Antropometrie voert allerlei objectieve metingen uit op het lichaam zelf. Eenvoudige voorbeelden
zijn het gewicht en de lengte. Ten slotte gebruiken artsen niet allemaal dezelfde terminologie. Dit hangt af
van hun taal, opleiding en eventuele bijscholingen. Voor een genotype/fenotype studie moeten
patiëntengegevens kunnen vergeleken worden. Dit impliceert dat synoniemen gelijkwaardig moeten
behandeld worden, rekening houdend met de eventuele veroudering van de termen of het lichte
14
nuanceverschil tussen de twee synoniemen (25). Dokter W. Reardon schrijft: “In no aspect is language
more important than in the description and classification of clinical signs”(22).
3.2.3 AANVULLEND ONDERZOEK
Omdat genetische testen beperkt, duur en arbeidsintensief zijn, is het noodzakelijk de aanvraag van
dit onderzoek te staven met klinische bevindingen. Het genetisch labo zal sneller een mutatie vinden als de
clinicus informatie geeft over wat vermoed wordt. Indien de anamnese en het klinisch onderzoek geen
eenduidig beeld geven, zijn er aanvullende onderzoeken nodig om bepaalde hypothesen te verwerpen of te
staven. Naast uiterlijke dysmorfe kenmerken worden veel syndromen immers gekenmerkt door interne,
uiterlijk “onzichtbare” afwijkingen. Aanvullende onderzoeken vergen tijd en kosten. Ze worden dan ook
enkel aangevraagd indien er een duidelijke indicatie voor is. Zeer vaak worden metabole onderzoeken,
gehoortesten en oftalmologische testen aangevraagd (23). Beeldvormingstechnieken worden gebruikt om
interne afwijkingen op te sporen of om de dysmorfologische afwijkingen te objectiveren, bijvoorbeeld bij
schedelmisvormingen (23). Om de eventuele ontwikkelingsachterstand beter te evalueren, kan het
Centrum voor Ontwikkelingsstoornissen de patiënt scoren.
3.2.4 GENETISCHE COUNSELING
De genetische counseling is het specifieke communicatieproces bij genetische diagnoses. Deze
communicatie dient zowel voor als na de genetische testing plaats te vinden en zowel de patiënt als
zijn/haar familie te omvatten. Net zoals in andere disciplines is het de taak van de arts om de diagnose
mee te delen en een behandeling op te starten, al dan niet in een multidisciplinaire context. Hierbij zijn er
wel enkele elementen specifiek voor de medische genetica.
Wat betreft de diagnose is het niet altijd duidelijk of de gevonden genetische afwijking
verantwoordelijk is voor het klinisch probleem. Een eerste fenomeen dat de interpretatie van een
afwijkend genotype moeilijk maakt, is de epigenetica. Epigenetica verwijst naar alle elementen die de
functie van een gen kunnen veranderen zonder in te grijpen in het genotype (2).Op deze vorm van
functieverandering heeft een genotype/fenotype studie die enkel met array-CGH werkt geen enkel vat.
Penetrantie is ook een factor die kan meespelen. Penetrantie betekent het percentage personen met een
bepaalde genotypische afwijking dat werkelijk fenotypische afwijkingen vertoont (2). Indien deze zeer
laag is voor deze specifieke afwijkingen zorgt dit voor een zeer moeilijke genotype/fenotypestudie, want
hoe lager de overeenkomst tussen genotypische en fenotypische afwijkingen, hoe moeilijker om er
conclusies uit te trekken. Hiernaast speelt de variabele expressie van de genetische aandoening ook een
rol. Variabele expressie betekent het verschil in de ernst van fenotypische afwijkingen bij eenzelfde
genotypische afwijking. Wanneer een bepaalde fenotypische afwijking slechts in een zeer milde vorm
15
voorkomt kan het dus bijvoorbeeld zijn dat deze niet opgemerkt wordt. Een late onset aandoening is een
aandoening die pas op oudere leeftijd aan het licht komt. Schizofrenie is een voorbeeld dat in deze
masterproef aan bod komt. Een laatste belangrijk mechanisme is mosaïcisme. Dit treedt op wanneer niet
alle cellen in het lichaam een bepaalde genotypische afwijking dragen omdat de afwijking slechts later in
de (meestal embryonale) ontwikkeling opgetreden is en dus slechts enkele cellijnen treft. Dit kan zorgen
voor een sterk gevarieerd fenotype.
Wat betreft de aanpak zijn genetische afwijkingen tot nu toe (in afwachting van de implementatie
van gentherapie) niet causaal te behandelen. Toch is het stellen van een diagnose nuttig. Gerichte
begeleiding kan gezocht worden, er is een makkelijkere toegang tot financiële en praktische steun voor het
gezin en sommige risico’s op latere leeftijd kunnen vermeden worden. Niet alleen de risico’s voor de
patiënt zelf, maar ook erfelijkheidsadvies naar familieleden en eventuele nakomelingen toe dient in
overweging genomen te worden. Bij het bespreken van deze complexe zaken is het bijzonder belangrijk
om aandacht te hebben voor psychosociale aspecten, ethische principes en patiëntenrechten. Omdat het
wetenschappelijk onderzoek binnen de genetica veel sneller vooruit gaat dan de ethiek en wetgeving is
hierin een grote verantwoordelijkheid weggelegd voor de artsen (21, 24).
3.3 DATABANKEN
3.3.1 THE HUMAN GENOME PROJECT
The Human Genome Project is een realisatie van de U.S. Department of Energy and the National
Institutes of Health. Dit project nam 13 jaar in beslag en had als doel de volledige sequentie van ons DNA
te bepalen, alle genen in het menselijk DNA te detecteren en deze technologie over te brengen naar de
private sector. Eerst werd niet-menselijk DNA gebruikt (vb. E. Coli) om dan later de technologie bij het
complexere DNA van de mens toe te passen. Ook op domeinen zoals de biotechnologie en de landbouw
was het project actief. Sinds 2003 is het Human Genome Project afgewerkt (26). Op vlak van klinische
genetica brengt dit vooral perspectieven naar geïndividualiseerde diagnostiek en prognoses en nieuwe
geneesmiddelen. Na deze volledige bepaling van het genoom staan er nieuwe uitdagingen te wachten
waarvoor deze masterproef mogelijks een kleine bouwsteen kan zijn (26).
3.3.2 GENETIC LABORATORIUM INFORMATION SYSTEM (GLIMS)
Glims staat voor Genetisch Laboratorium Informatie Systeem. Glims is het programma dat in de
dagdagelijkse praktijk wordt gebruikt door het genetische labo van het UZ Gent om genotype en fenotype
gegevens van de patiënten bij te houden. In het kader van deze en toekomstige genotype/fenotype studies
werd de elektronische checklist van deze masterproef in Glims geïntegreerd. Klinische gegevens kunnen
16
gestandaardiseerd verwerkt worden in Glims en gebruikt worden voor bepaalde zoekacties. Zo kunnen
mensen met gelijkaardige afwijkingen gemakkelijk opgespoord worden. Dit is zowel handig voor de
individuele patiënt als voor wetenschappelijk onderzoek (27).
3.3.3 DATABASE OF CHROMOSOMAL IMBALANCE AND PHENOTYPE IN HUMANS USING
ENSEMBLE RESOURCES (DECIPHER)
DECIPHER is een database waarin de klinische en genetische gegevens van patiënten met
submicroscopische afwijkingen worden verzameld (28). Artsen en genetische onderzoekers uit meer dan
100 verschillende landen hebben een paswoord om patiëntengegevens in te voeren. De genotypes werden
bepaald via array-CGH en de patiënten gaven toestemming voor het invoeren van hun gegevens. Een deel
van de gegevens is vrij te raadplegen, andere gegevens zoals foto’s en bewerkingen zijn beveiligd. Op 22
februari 2011 bevatte DECIPHER 13000 patiënten uit 241 verschillende centra (29). De databank is
opgericht in 2004 met als doel genetici te helpen bij het interpreteren van array-CGH-resultaten. De
internationale samenwerking zorgt immers voor een groter patiëntenbestand, waarin ook meer zeldzame
afwijkingen voorkomen. Dit maakt het vergelijken van patiënten met eenzelfde genotype/fenotype
mogelijk. Niet alleen genotype/fenotype-informatie maar ook andere wetenschappelijke kennis over de
genetica wordt up-to-date opgenomen in DECIPHER. Er is een optimale samenwerking met de Ensemble
Genome Browser waardoor steeds de meest recente versie van het humaan genoom beschikbaar is.
DECIPHER is eveneens gelinkt aan andere genetische, bio-informatica en medische databases, waaronder
HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC), On-line Mendelian Inheritance in Man (OMIM),
PubMed, GeneReviews, Ensembl genes en Swiss-Prot (Firth Richards). Qua gebruiksvriendelijkheid biedt
DECIPHER ook een kanaal waarlangs moleculaire wetenschappers en genetici hun bevindingen kunnen
delen, de mogelijkheid tot het uitvoeren van query’s, een degelijk privacy protocol en handige functies,
zoals het opslaan in trio’s (kind met ouders) of het enkel weergeven van de de novo afwijkingen (30).
3.3.4 DATABASE OF GENOMIC VARIANTS (DGV)
De Database of Genomic Variants (DGV, databank van genomische varianten) is een verzameling
van structurele varianten in het menselijk genoom. Deze structurele varianten zijn voornamelijk CNV’s en
inversies die door array-CGH en ander genetisch onderzoek vastgesteld werden bij “normale”, gezonde
mensen. Aangezien deze gegevens vergaard worden uit peer-reviewed publicaties en afkomstig zijn van
gezonde patiënten kan er besloten worden dat de opgenomen varianten waarschijnlijk geen klinische
pathologie veroorzaken. Het is echter nooit helemaal zeker dat de betroffen patiënten volledig gezond zijn
en er is een mogelijke bias ten gevolge van de beperkte resolutie en gevoeligheid van de gebruikte
analysetechniek. Aan de hand van programma’s uit de bio-informatica (bijvoorbeeld Cross-Referenced
Tables (XRT)), worden de structurele chromosomale afwijkingen op een gebruiksvriendelijke manier
17
online weergegeven. Het is een handig hulpmiddel voor onderzoekers om array-CGH-resultaten van eigen
patiënten te interpreteren. Wanneer wetenschappers CNV’s van hun gezonde patiënten publiceren, kan de
Database of Genomic Variants deze CNV’s opnemen en hun databank up-to-date houden. In de toekomst
zal de database steeds meer gegevens bevatten en daarom ook interessanter en betrouwbaarder worden. De
database is openbaar te raadplegen op de website http://projects.tcag.ca/variation/?source=hg18. Er zijn
koppelingen met andere online databanken en verschillende weergave-opties, waaronder de genome
browser, die naast de CNV’s tevens de genen in de opgevraagde regio kan tonen. In de genome browser
van DECIPHER op zijn beurt, is er dan weer de mogelijkheid om de structurele varianten van de DGV
weer te geven (31).
4 DOELSTELLING Het doel van deze masterproef is een elektronische databank te ontwikkelen voor een betere
informatieverwerking van de genotypische en fenotypische gegevens in het Centrum Medische Genetica
Gent (CMGG), onderdeel van het Universitair Ziekenhuis Gent (UZ Gent). Deze databank heeft als doel
een brug te slaan tussen de klinisch geneticus en het genetisch laboratorium. Zo kan er enerzijds een
efficiënte methode ontwikkeld worden om patiëntengegevens te vergelijken, zowel binnen het centrum als
internationaal en anderzijds kan deze databank de mogelijkheid creëren genotype/fenotype studies uit te
voeren op grote patiëntenpopulaties om zo nieuwe associaties en oorzakelijke (sub)chromosomale
afwijkingen op te sporen. In deze masterproef wordt een retrospectief onderzoek uitgevoerd dat in de
toekomst als prototype kan gebruikt worden voor andere genotype/fenotype studies.
18
5 METHODOLOGIE
5.1 DEELNEMERS
De onderzoekspopulatie van deze studie bestaat uit 320 patiënten die klinisch en genetisch
onderzoek lieten uitvoeren in het UZ Gent. Dit is een selectie van mensen waarvan de array-CGH
doorging tussen 4 januari 2010 en 27 mei 2011 in het CMGG. Vervolgens werd ook geselecteerd naar
proband, aangezien dit de persoon is die onderzocht wordt vanwege zijn of haar eigen kliniek, in
tegenstelling tot eventuele (gezonde) familieleden die eveneens een genetisch onderzoek ondergingen.
Een volgend criterium is een afwijkend resultaat, wat aanwezig is bij ongeveer de helft van de proband
array-CGH’s. Ten slotte worden enkel de patiënten in de studie opgenomen die naar de dienst genetica
werden verwezen door artsen van het UZ Gent zelf. Deze patiënten worden klinisch opgevolgd op het UZ
Gent, waardoor het handiger is om klinische informatie, elektronisch en/of in papieren dossiers, te
raadplegen. Door deze selectie werd de patiëntenpopulatie herleid tot een aantal dat binnen de beperkte
tijdspanne van deze masterproef kwaliteitsvol te bestuderen valt. Aan de hand van bovenstaande in- en
exclusiecriteria werd de populatie verkleind van 3 195 naar 320 patiënten (Figuur 2). Van deze 320
patiënten werden eerst de patiënten met een de novo genetische afwijking verwerkt. Later werden ook de
maternaal en paternaal overgeërfde CNV’s erbij genomen. De patiënten die in de uiteindelijke
genotype/fenotype studies worden besproken, werden gecodeerd en opgelijst in Bijlage II. De
DECIPHER-patiënten en patiënten uit de literatuur zijn eveneens gecodeerd weergegeven. Deze studie
werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van het UZ Gent.
Figuur 2. Flow-chart onderzoekspopulatie.
Klinische opvolging van de patiënt
Resultaat
Patiënt zelf versus familie
Array-CGH tussen 04/01/2010 en
27/05/2011
3 195 array-CGH's
1 653 proband
843 afwijkend
320 in het UZ Gent
523 bij perifere artsen
753 normaal
57 mislukt
1 542 familieleden
19
5.2 PROCEDURE
Deze masterproef betreft een genotype/fenotype studie van patiënten met een submicroscopische
chromosoomafwijking. Hierbij werden zowel klinische (fenotype) als cytogenetische (genotype)
patiëntengegevens verzameld en vervolgens bestudeerd.
Het genotype van een patiënt wordt bepaald in het genetisch laboratorium. De specifieke techniek
die gebruikt werd is array-CGH. Het uitvoeren van dit onderzoek behoort niet tot de eigenlijke
masterproef. Doch, om de resultaten beter te kunnen interpreteren, werd achtergrondinformatie opgezocht
in de wetenschappelijke literatuur en werd het labo in het Medical Research Building (MRB) van het UZ
Gent bezocht.
Het verzamelen en verwerken van de fenotypische gegevens gebeurde retrospectief. De
patiëntendossiers van de onderzoekspopulatie werden opgezocht, inclusief de beschikbare brieven en
verslagen. Een groot deel van de dossiers was te vinden in het archief van de dienst pediatrie en genetica
van het UZ Gent. Van andere patiënten van het UZ Gent kon de nodige fenotypische informatie gevonden
worden in het elektronisch patiëntendossier (EPD). De twee studenten Geneeskunde die deze masterproef
schreven, volgden een cursus i.v.m. de werking van dit programma en kregen bijgevolg (gelimiteerde)
toegang tot de patiëntengegevens. Er werd gepoogd deze klinische gegevens te standaardiseren door
middel van checklists, zowel op papier als elektronisch. Deze checklists werden opgesteld op basis van
consultatiebezoeken, expertise van klinische genetici (de begeleiders van deze masterproef) en literatuur
i.v.m. dysmorfologie en bijhorende terminologie.
De klinische checklist werd verwerkt in Glims, de centrale database van de dienst medische
genetica van het UZ Gent waar de genetische informatie al in vervat zit. Vervolgens werd het mogelijk om
in dit programma zoekacties uit te voeren naar bepaalde klinische en/of genetische kenmerken. Dit door
het exporteren van de geselecteerde patiënten vanuit Glims naar een Excel-document. De gegevens
werden onderzocht op correlaties tussen verschillende patiënten en/of patiëntengroepen. Dit nazicht vormt
de basis van de uiteindelijke genotype/fenotype studie. In eerste instantie werd gezocht op fenotype.
Hierbij werden groepen gemaakt van personen a.d.h.v. specifieke kenmerken die frequent voorkomen in
de database (bijvoorbeeld mentale beperking, aandachts- en hyperactiviteitsstoornissen (ADHD),
autismespectrumstoornissen (ASS) en hartafwijkingen). Zo werd duidelijk welke afwijkingen vaak
voorkwamen hetgeen noodzakelijk was om het onderzoek iets beter te kunnen richten. Twee fenotypische
kenmerken werden van naderbij bekeken: mentale retardatie (MR) en congenitale hartafwijkingen. Er
werd gebruik gemaakt van de beslisboom voor klinische relevantie van CNV’s van Buysse et al. (32).
20
De volgende stap in het onderzoek was het groeperen van de patiënten op basis van genotype. Op
deze manier werden overlappende deleties en duplicaties opgespoord. Van patiënten waarbij de genetische
afwijkingen overlapten, werd het fenotype vergeleken. Op deze manier werd geprobeerd associaties tussen
de genetische afwijking en het fenotype te maken. Om meer patiënten te kunnen vergelijken, werden
eveneens DECIPHER-patiënten met eenzelfde afwijkende regio opgenomen, indien bij deze patiënten
klinische informatie beschikbaar was. Verder ondersteunen eveneens wetenschappelijke publicaties deze
genotype/fenotype studie. Bestaande literatuur over specifieke genen en genetische afwijkingen werd
opgezocht via PubMed, de DGV en de Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)-databank. Er werd
ook gebruikt gemaakt van de University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser voor de
grafische weergave van de genotypische afwijkingen.
Deze genotype/fenotype studie omvat een onderzoekspopulatie van 320 patiënten met een CNV.
Omwille van de beperkte tijdspanne werden enkel de meest “interessante casussen” geselecteerd.
Uiteindelijk werden bij de resultaten van deze masterproef vijf genotype/fenotype studies uitgewerkt.
Volgende voorkeurscriteria hebben geleid tot deze selectie: de novo CNV’s, deleties, aantal patiënten met
overlap binnen deze regio, in de literatuur nog geen eensluidendheid over de betekenis (zowel normale
variant als pathologisch).
5.3 APPARATUUR EN MATERIALEN
5.3.1 ARRAY-CGH
Array-CGH is het genetisch onderzoek dat bij de gehele onderzoekspopulatie van deze studie werd
uitgevoerd. De array-CGH werd uitgevoerd door ervaren laboranten in het CMGG, volgens de richtlijnen
van de fabrikant van de gebruikte materialen. De patiëntenstalen zijn afkomstig van perifere veneuze
bloedafnames op EDTA, waaruit DNA werd geïsoleerd m.b.v. QIAamp DNA Blood Mini Kit
(Qiagen, Belgium). De opeenvolgende reacties waren: hybridisatie, Cy3 of Cy5 labeling (BioPrime
Array CGH Genomic Labeling System, Invitrogen, Belgium), precipitatie, 24 uur hybridisatie bij 65°C en
wassen.
De twee gebruikte oligonucleotide arrays zijn Agilent 60k AMADID#021924 en Agilent 180k
AMADID#027676 (Agilent Technologies, Belgium). Deze arrays halen respectievelijk een resolutie van
13 kb en 41,4kb. Het is belangrijk te weten dat deze resoluties een theoretisch gegeven zijn en slechts
geldig zijn in bepaalde delen van het genoom. De reële resoluties t.h.v. andere loci is soms slechts 100 kb.
Het referentiegenoom van deze arrays is NCBI36.1, ook wel als hg18 genoteerd. Dit is het
referentiegenoom dat in maart 2006 werd gepubliceerd door het International Human Genome Sequencing
21
Consortium, dezelfde groep van het HGP. Ondertussen is in 2009 een recentere versie gepubliceerd. De
arrays werden gescand door een DNA micro-arrayscanner (Agilent). De hieruit volgende scanbeelden
werden verwerkt met Feature Extraction Software 10.1 en de eigen software van het CMGG,
arrayCGHbase genaamd. Vastgestelde CNV’s werden niet gerapporteerd bij het resultaat indien er een
consensus bestaat dat de CNV’s normale varianten zijn zonder klinische betekenis (9, 27).
5.3.2 CHECKLISTS
5.3.2.1 De papieren checklist
De papieren checklist (Bijlage I) kan beschouwd worden als een inhoudsopgave van het doorsnee
genetisch consult en vervangt het bestaande intake-formulier. Bij de consultatie van een nieuwe patiënt
met vermoeden van een genetische afwijking kan alle informatie stap voor stap worden genoteerd. De
opbouw van de checklist is analoog aan de opbouw van het consult.
De voorgeschiedenis wordt chronologisch opgelijst: prenataal, perinataal en neonataal. Bij de
neonatale medische voorgeschiedenis worden alle lichaamssystemen vernoemd, eventueel met
onderverdelingen. “Gastro-enterology” wordt bijvoorbeeld onderverdeeld in “malformations, nutrition en
stool”. Tevens wordt neurologie uitgebreid opgesplitst in motoriek, cognitie en andere. De bedoeling van
deze checklist is om zo geen zaken over het hoofd te zien en om de aandoeningen per vakgebied te
ordenen. Bij sommige onderdelen in de lijst worden enkele frequente aandoeningen/kenmerken
voorgesteld. Indien aanwezig, dient de arts dit aan te duiden. Daarnaast is er voldoende ruimte vrij gelaten
voor aanvullingen bij de frequente aandoening en/of voor het voluit schrijven van andere aandoeningen.
De familiale voorgeschiedenis is niet gedetailleerd uitgewerkt in de lijst. Het is de bedoeling dat op
de achterzijde van de checklist een stamboom wordt opgemaakt. Belangrijke familiale aandoeningen die
blijken uit deze stamboom, kunnen nogmaals worden genoteerd op de voorzijde, onder de titel “familial
history”. Het enige expliciet vermelde item is consanguïniteit, omdat dit altijd dient te worden nagevraagd.
Het tweede onderdeel van de papieren checklist omvat de klinische bevindingen. Zoals in het eerste
deel van de lijst is er een structuur waarbij per lichaamsdeel enkele belangrijke items worden bestudeerd.
Zo wordt het onderzoek van het oor bijvoorbeeld opgesplitst in vorm, positie en eventuele “pits” of “tags”.
Tevens zijn er voorstellen van frequente aandoeningen en is er vrije ruimte voor aanvullingen en andere
kenmerken. Bij de positie van het oor staat er bijvoorbeeld “normal/low-set/posteriorly
rotated/protruding/other”.
De papieren checklist sluit af met een open veld voor de differentiaal diagnose. Veeleer dan de
naam van een bepaalde genetische afwijking is dit een besluit waarin de voornaamste vaststellingen
samengevat worden. Hierbij kunnen eventuele hypothesen voor een bepaald syndroom vermeld worden.
22
Het genetisch onderzoek zal de hypothesen proberen bevestigen of ontkennen. Op de laatste pagina is er
tevens ruimte voor doorverwijzingen voor aanvullend onderzoek. Onder de titel “additional
investigations” kan genoteerd worden welke onderzoeken de klinisch geneticus nodig acht. Ten slotte
dient er nog aangeduid te worden of er al dan niet foto’s werden genomen van de patiënt en of er
toestemming werd gegeven om de patiëntendata te verwerken in de DECIPHER-database.
De structuur van deze lijst is gebaseerd op de London Medical Dysmorphology Database (LMDD).
Tevens werd een andere checklist als voorbeeld gebruikt, namelijk de Dysmorphology Examination
Checklist uit Oxford Desk Reference Clinical Genetics (33). Om te bepalen wat de vaakst voorkomende
kenmerken zijn, werd gezocht naar prevalentiecijfers, maar deze waren slechts in zeer beperkte mate
voorhanden in de wetenschappelijke literatuur. Scriver et al. verzamelden gegevens van 1 089 patiënten
op een afdeling pediatrie (34). Het artikel verscheen in 1973 getiteld “The frequency of genetic disease
and congenital malformation among patients in a pediatric hospital”. De incidenties van 14 congenitale
malformaties worden weergegeven, maar de gebruikte termen, zoals “hernia” en “anomalie van het oor”,
zijn weinig specifiek (34). Het meeste epidemiologisch onderzoek richt zich voornamelijk op diagnoses
van aandoeningen en niet op de klinische kenmerken ervan. Door afwezigheid van recente
epidemiologische literatuur is onze voornaamste bron de ervaring van de klinische genetici op de dienst
pediatrie en genetica van het UZ Gent. Een voorlopige lijst werd getest door deze clinici en aangepast aan
hun bemerkingen.
5.3.2.2 De elektronische checklist
De elektronische versie van de checklist is bedoeld voor de standaardisering van de klinische
kenmerken. Vervolgens worden deze gegevens geëxporteerd naar een database waarin correlaties
opgezocht kunnen worden. Dit vormt uiteindelijk de basis voor de genotype/fenotype studie.
In tegenstelling tot de papieren versie is de omvang van de elektronische checklist veel minder
beperkt. Tien bladzijden op papier invullen tijdens de consultatie zou tijdrovend zijn. De gevonden
aandoeningen opzoeken en aanduiden in een tiental tabbladen op computer is echter wel mogelijk. De
elektronische checklist omvat de gestandaardiseerde terminologie en hun synoniemen als
meerkeuzemogelijkheid in plaats van de open ruimte op de papieren checklist. Zo wordt het onderzoek
eerder kwantitatief dan kwalitatief. Als bron voor de structuur en de uitgebreide lijst van kenmerken en
afwijkingen werd de LMDD gebruikt. De structuur wijkt af van de papieren checklist doordat bij de
elektronische versie de anamnestische en klinische gegevens gecombineerd worden. Elk lichaamssysteem
komt slechts eenmaal aan bod, in tegenstelling tot bij de papieren checklist.
23
De terminologie van de LMDD i.v.m. dysmorfologie werd vergeleken en aangevuld met de Human
Phenotype Ontology en de reeks artikels “Elements of Morphology” verschenen in American Journal of
Medical Genetics Genetics (5, 25, 35-38). Deze laatste reeks artikels bespreken de dysmorfologische
terminologie. Elke term wordt gedefinieerd en geïllustreerd. Tevens worden synoniemen en analoge, maar
verouderde termen vernoemd. In de elektronische checklist zijn synoniemen gecombineerd als één
keuzemogelijkheid. Op deze manier zijn de zoekopdrachten naar alle patiënten met een bepaald kenmerk
niet afhankelijk van de gebruikte term of schrijfwijze.
Dysmorfologie omvat niet het gehele fenotype van de patiënt. Daarnaast zijn er nog gegevens uit de
medische voorgeschiedenis, neurologische bevindingen en resultaten van aanvullend onderzoek.
Disciplines zoals hematologie, endocrinologie, cardiologie en neurologie zijn dus ook vervat in de
checklist. Afwijkingen hieromtrent zijn ook te vinden in de LMDD, maar in beperkte mate of zonder veel
structuur. Bij verscheidene disciplines volstond het om wat structuur te brengen in de alfabetische lijst van
aandoeningen. Het onderdeel neurologie/psychiatrie werd geoptimaliseerd met behulp van een externe
bron, namelijk de Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition (DSM IV).
Aangezien de patiënten op de dienst klinische genetica voornamelijk kinderen zijn en het onderzoek over
congenitale aandoeningen gaat, werden aandoeningen die bijna uitsluitend bij volwassenen voorkomen
niet opgenomen in de checklist. Natuurlijk is er wel ruimte voorzien om deze diagnoses te noteren zodat
het risico om congenitale aandoeningen met late-onset te verwaarlozen, vermeden wordt.
Zoals vermeld in de literatuurstudie is de dysmorfologie enigszins subjectief. Daarom zijn er in de
checklists invulvelden voor de resultaten van objectieve metingen. Gewicht, lengte, hoofdomtrek,
armspan, onderste segment, handlengte ... In tegenstelling tot de papieren checklist moet op de
elektronische versie geen absolute waarde ingegeven worden, maar een relatieve waarde. Bij de “arm
span- en lower segment- lenght ratio’s” wordt de meting vergeleken met referentiewaarden. Op de
checklist is er dan een gestandaardiseerde keuze tussen “normal, increased of decreased”. Bij de meeste
andere grootheden kan vergeleken worden met de gekende percentielen. De absolute getallen zijn immers
afhankelijk van het geslacht en de leeftijd. Voor de vergelijking van patiënten in de database is het
interessanter met percentielen en relatieve waarden te werken. Als bron voor de waarden van die
percentielen werden de cijfers gehanteerd uit een studie van de Wereldgezondheidsorganisatie uit 2006,
meer bepaald WHO Child Growth Standards. (Length/height-for-age, weight-for-age, weight-for-length,
weight-for-height and body mass index-for-age) (39).
De oorspronkelijke vorm en inhoud van de checklist werd opgesteld in het programma Microsoft
Office Excel 2007. De gebruikte software voor de implementatie van deze klinische checklist is Glims.
24
5.3.3 DATABANKEN
5.3.3.1 PubMed
Literatuuronderzoek leverde de nodige achtergrondinformatie op voor het opstellen van de
checklists en voor het interpreteren van de resultaten. Kwaliteitsvolle relevante artikels werden opgezocht
via PubMed, het grootste digitaal archief van artikels binnen de gezondheidswetenschappen. Wanneer er
vanuit het statuut UGent-student relevante Engelstalige zoektermen ingevoerd worden, is het mogelijk een
grote hoeveelheid aan publicaties kosteloos te raadplegen. Naast deze openbare bronnen, werd ook
informatie gehaald uit bronnen van de UGent, met name doctoraatsstudies, masterproeven, cursussen en
boeken die aangeboden worden in het kader van de opleidingen Bachelor en Master in de Geneeskunde.
5.3.3.2 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)
OMIM is een databank die meer dan 12 000 menselijke genen bevat. Daarnaast zijn ook klinische
gegevens (fenotypes en ziektes) met een genetische oorzakelijke component opgenomen. Deze databank is
online vrij beschikbaar en wordt dagelijks bijgewerkt (40). Het is zowel mogelijk om in de databank te
zoeken op een (erfelijke) ziekte, zodoende de oorzakelijke genen te vinden, als te zoeken op een
(aangetast) gen, zodoende mogelijke ziektes en syndromen gelinkt aan dit gen te vinden. Voor de
genotype/fenotype studie in deze masterproef werd voornamelijk gebruik gemaakt van het zoeken volgens
aangetast gen. De fenotypische informatie werd vervolgens vergeleken met de patiëntengegevens.
5.3.3.3 Glims
In het kader van deze en toekomstige genotype/fenotype studies werd de elektronische checklist van
deze masterproef in Glims geïntegreerd. Het gebruik van de Glims software is praktisch in gebruik voor
de genotype/fenotype studie, maar het programma heeft ook zijn beperkingen. Ten eerste is het aantal
kenmerken per tabblad beperkt tot 53. Om dit te omzeilen werden er groepen van kenmerken in de
tabbladen geplaatst in plaats van de unieke aandoeningen. Bijvoorbeeld in het tabblad “periorbital region
and ears” staan niet alle mogelijke kenmerken onder elkaar, maar wel groepen van kenmerken zoals
“helix”, “helix crus”, “tragus”, “antitragus”, enzovoort. Meerdere tabbladen maken is in theorie wel
mogelijk, maar indien er twintig tabbladen zouden zijn, is het overzicht zoek en zijn de titels van de
tabbladen niet leesbaar. Dit wordt voor een deel opgevangen door de checklist over twee lijsten in het
programma te verdelen. Meer was echter niet mogelijk omdat het anders te arbeidsintensief zou zijn.
Bij het invoeren van gegevens in de elektronische checklist in Glims is het de bedoeling de
aandoeningen die aanwezig zijn bij de betreffende patiënt aan te klikken. Wanneer er op een aandoening
geklikt wordt, wordt een venster geopend met verschillende antwoordmogelijkheden. In het eenvoudigste
geval zijn deze keuzemogelijkheden “yes” of “no”. Wanneer er niet geklikt wordt op de aandoening,
25
interpreteert Glims dit automatisch als een “no”, wat wil zeggen dat het kenmerk afwezig is. Er is dus
geen nuancering tussen afwezig en niet onderzocht. Aangezien deze checklist bijzonder omvangrijk is en
in de tabbladen groepen van kenmerken staan, zijn de antwoordmogelijkheden meestal wat uitgebreider
dan “yes” of “no”. Wanneer bijvoorbeeld “ear tragus” aangeklikt wordt, kan nog een verdere keuze
gemaakt worden uit “absent”, “bifid”, “everted”, “underdeveloped” en “prominent”.
Het belangrijkste nadeel aan dit systeem is dat het onmogelijk is om meerdere opties uit één
meerkeuzelijst te kiezen. In realiteit is het bijvoorbeeld wel mogelijk zowel een “underdeveloped” als
“everted” tragus te hebben. Bij de groepering van kenmerken werd hierop gelet, zodat er meestal geen
combinaties optreden. “Lobe size” is hierin een mooi voorbeeld. Wanneer dit aangeklikt wordt, kan er
enkel gekozen worden tussen “small” en “large”, twee kenmerken die meestal niet samen voorkomen. Bij
elk item in de lijst is er ook een keuze-optie “others or combinations”, waar niet-vernoemde kenmerken
genoteerd kunnen worden, evenals combinaties die niet samen konden worden aangeklikt.
5.3.3.4 DECIPHER
De DECIPHER-database werd voornamelijk geconsulteerd via de genome browser van UCSC.
Bepaalde chromosoomregio’s werden opgevraagd met aandacht voor de correcte assembly, in dit geval
NCBI Build 36.1/hg18. In de genome browser wordt de gevraagde chromosoomband grafisch
weergegeven, met bijpassende informatie zoals OMIM-genen, ligging in het chromosoom en DECIPHER-
patiënten. Wanneer er in de grafische weergave een gen of patiënt aangeklikt wordt, wordt er naar meer
gedetailleerde informatie verwezen. Specifiek voor DECIPHER-patiënten kon de aangetaste regio en het
fenotype geconsulteerd worden via UCSC zelf. Andere patiëntengegevens zoals overerving van het CNV
en eventuele andere CNV’s moesten dan weer in DECIPHER zelf opgezocht worden. In de
genotype/fenotype studie van deze masterproef werden gegevens van patiënten uit de eigen
onderzoekspopulatie vergeleken met DECIPHER-patiënten. De opgenomen patiënten zijn enkel deze
waarvan klinische informatie online beschikbaar was, wat bij velen niet het geval was.
5.3.3.5 Database of Genomic Variants (DGV)
De DGV werd geconsulteerd voor het interpreteren van de array-resultaten van de onderzochte
patiënten. Deze databank werkt ook met een genome browser die de aangevraagde chromosomale regio
grafisch weergeeft. De DGV is slechts een verzameling van structurele varianten van gezonde mensen,
maar is geen absolute waarheid over het niet-pathologisch zijn van die varianten. Een criterium dat
gehanteerd werd in deze studie is gebaseerd op de flow-chart van Buysse et al. (32). Wanneer het
onderzochte CNV volledig wordt overlapt door minstens twee varianten uit de database, wordt dit CNV
als een normale variant beschouwd.
26
6 RESULTATEN
6.1 FENOTYPE/GENOTYPE STUDIES
Binnen de onderzoekspopulatie werd eerst gezocht volgens fenotype. Hierbij werden patiënten
gegroepeerd aan de hand van specifieke kenmerken die frequent voorkomen. Twee factoren die een hoge
frequentie binnen de onderzoekspopulatie kunnen verklaren zijn: een hoge prevalentie in de algemene
populatie en het feit dat het kenmerk op zich een reden tot genetische consultatie is. Twee grote groepen
van afwijkingen zijn morfologische afwijkingen en neuropsychiatrische problemen. Uit elk van deze
groepen werd op één kenmerk dieper ingegaan, respectievelijk hartafwijkingen en mentale beperking.
Binnen de morfologische afwijkingen is er ook veel dysmorfologie van het gelaat, maar de beschrijving
van deze is meer onderhevig aan subjectiviteit en minder klinisch relevant dan de hartafwijkingen.
6.1.1 MENTALE BEPERKING
6.1.1.1 Fenotypes
De term mentale retardatie (MR) zelf werd in totaal 69 keer aangevinkt in de checklist in Glims, dit
is 21,56% van de totale patiëntenpopulatie. Bij 48 van de 69 patiënten werd de ernst van MR niet
weergegeven. Volledigheidshalve werden ook patiënten geïncludeerd waarbij MR zelf niet werd
aangeduid, maar wel één van de volgende termen: neurocognitieve ontwikkelingsstoornis, vertraagde
taalontwikkeling of buitengewoon onderwijs/inclusie. Op deze manier werd de groep van patiënten met
een mentale beperking vergroot tot 128 (40% van de gehele onderzoekspopulatie). Motorische
ontwikkelingsstoornissen werden niet geïncludeerd, tenzij deze stoornissen overlapten met MR.
Binnen de neurocognitieve afwijkingen zijn ook autismespectrumstoornis (ASS), aandachts- en
hyperactiviteitsstoornissen (ADHD), epileptische convulsies en (fijne en grove) motorische
ontwikkelingsstoornissen frequent aanwezig. Deze afwijkingen overlappen vaak met mentale beperking
(Figuur 3). Onder de termen “speciaal schooltype” en “neurocognitieve ontwikkelingsstoornis (andere)”
bevinden zich ook veel patiënten met MR, maar ook niet allemaal. De patiënten met deze neurocognitieve
aandoeningen werden enkel opgenomen in de groep MR indien dit vermeld werd in hun dossier.
27
Figuur 3. Grafiek neuropsychiatrische aandoeningen, met of zonder overlap mentale retardatie (MR).
Noot. CNV: Copy Number Variant, MR: Mentale Retardatie.
6.1.1.2 Genotypes
Bij de mentaal beperkte fenotypes werden 179 verschillende genetische afwijkingen opgespoord
met array-CGH. Dit is meer dan het aantal patiënten, aangezien bij enkele patiënten meerdere CNV’s
werden vastgesteld. Naar voorbeeld van de beslisboom van Buysse et al. werden enkele criteria
gehanteerd om te bepalen of een CNV al dan niet klinisch relevant is (32). Figuur 4 stelt de 128 patiënten
omvattende populatie met MR voor met hun 179 CNV’s. 14 van deze CNV’s zijn gekend als een MR-
syndroom, dat zowel genetisch als klinisch overeenkomt met de patiënt. 14 andere CNV’s zijn gelegen in
een locus die gelinkt wordt met MR. Van de overige 151 CNV’s kunnen er acht beschouwd worden als
normale varianten. In de DGV werden immers minstens twee volledig overlappende CNV’s
teruggevonden. Bij de niet-frequent voorkomende CNV’s werd de overerving in rekening gebracht. Bij 45
CNV’s waren de ouders nog niet onderzocht en 93 CNV’s werden familiaal overgeërfd. Van deze 138
CNV’s kan geen besluit getrokken worden qua klinische significantie. Ten slotte moet causaliteit bij vijf
de novo ontstane CNV’s overwogen worden. Samen met de 14 CNV’s ter hoogte van een MR-locus, kon
2023
10
20 19
30 31
38
931 12
28
25
16
0
10
20
30
40
50
60
70
Met MR
Zonder MR
28
array-CGH 19 (10,6%) vermoedelijk causale afwijkingen vaststellen, naast 14 (7,8%) gediagnosticeerde
MR-syndromen.
Figuur 4. Overzicht fenotype/genotype studie: Mentale Retardatie (MR).
Noot. CNV: Copy Number Variant, MR: Mentale Retardatie.
De 14 gediagnosticeerde MR syndromen zijn: Riddle syndroom, Allan-Herndon-Dudley Syndroom,
X-gebonden Mentale Retardatie 91, Potocki-Shaffer syndroom, Phelan-McDermid syndroom, Prader-
Willi syndroom, Velocardiofaciaal syndroom (VCFS) (tweemaal), triple X syndroom (47, XXX), het
distale 22q11.2 deletiesyndroom, het 16p11.2 microdeletie syndroom, Kleefstra syndroom en 1q21.1
microdeletiesyndroom. In Tabel 1 worden de genotypes van de betrokken patiënten weergegeven. Deze
MR-syndromen komen zowel genetisch als klinisch overeen met de respectievelijke patiënten. In de twee
gevallen met een CNV t.h.v. Xq13 wordt het syndroom normaal veroorzaakt door een loss-of-function-
mutatie in een bepaald gen. Bij de patiënten hier worden de respectievelijke genen onderbroken door het
breekpunt van een duplicatie.
Klinische relevantie
Overerving
Frequent / infrequent voorkomend CNV in de database met normale
varianten
Gekend MR-syndroom of MR- locus
Aantal CNV's
Aantal patiënten met een mentale beperking
128 patiënten
179 CNV's
151 locus ongekend
8 frequente CNV's
8 waarschijnlijk
normale variant
143 infrequent
93 overgeërfd
45 ouders niet onderzocht
138 ongekende significantie
5 de novo
14 MR-locus
19 vermoedelijk causaal
14 MR- syndroom
14 causaal
29
Tabel 1. Overzicht genotype MR syndromen en MR-loci.
Noot. dn: de novo, kb: kilobaseparen, mat: maternaal, Mb: megabaseparen, MR: mentale retardatie, OMIM: Online Mendelian
Inheritance in Man, pat:paternaal.
De vermoedelijk causale CNV’s worden weergegeven in Tabel 2. 14 CNV’s omvatten een regio
en/of gen die in de literatuur gelinkt wordt aan mentale beperking. De hier genoteerde syndromen zijn
echter niet steeds gediagnosticeerd bij de betroffen patiënten zelf. De vijf de novo CNV’s met ongekende
betekenis werden eveneens in Tabel 2 opgenomen wegens hun vermoedelijk causaal karakter. Eén
daarvan omvat echter geen enkel OMIM-gen, wat causaliteit dan weer minder waarschijnlijk maakt.
Tabel 2. CNV's gelinkt aan MR.
Noot. dn: de novo, kb: kilobaseparen, mat: maternaal, Mb: megabaseparen, MR: mentale retardatie, OMIM: Online Mendelian
Inheritance in Man.
30
6.1.2 CONGENITALE HARTAFWIJKINGEN
6.1.2.1 Fenotypes
In totaal werd bij 32 van de 320 (10%) patiënten een hartafwijking vastgesteld. Conotruncale
afwijkingen waren het meest frequent in deze groep (9/32), waaronder tetralogie van Fallot, truncus
arteriosus en transpositie van de grote vaten. Bij vijf patiënten werd een ritmestoornis vastgesteld:
rechterbundeltakblok, Wolff-Parkinson-White syndroom, een supraventriculaire tachycardie en twee niet-
gespecificeerde ritmestoornissen. Er waren acht patiënten met een (klep)geruis bij auscultatie, de patiënten
met een conotruncale afwijking niet meegerekend. Het geruis was bij drie patiënten afkomstig van een
afwijking aan de mitralisklep, bij twee van de aortaklep, bij één van de tricuspidalisklep en bij de twee
overige werd dit niet gespecificeerd. Ten slotte werden nog andere afwijkingen zoals coarctatio aortae
(3/32), open ductus arteriosus (1/32), cardiomyopathieën (3/32) en atriale en/of ventriculaire
septumdefecten (7/32) genoteerd.
6.1.2.2 Genotypes
Bij enkele patiënten werden meerdere CNV’s teruggevonden met array-CGH waardoor het totaal
aantal CNV’s bij de 32 patiënten 39 is. Figuur 5 stelt de beslisboom voor om de klinische relevantie van
deze CNV’s te bepalen. De startpopulatie zijn de 32 patiënten met 39 CNV’s. Wanneer de CNV in een
regio ligt die bekend staat als microdeletie- of microduplicatiesyndroom betrokken bij hartafwijkingen of
in een gekende locus voor hartafwijkingen ligt, dan is de klinische relevantie al meteen zeer
waarschijnlijk. Dit is het geval bij zeven CNV’s. Van deze zeven CNV’s zijn er vier patiënten met een
22q11.21 microdeletie die zich uit in het velocardiofaciaal syndroom. De causaliteit van de 22q11.21
microdeletie was in deze gevallen duidelijk. De overige drie causale CNV’s kunnen verklaard worden
door overlap met het Frank ter-Haar syndroom, het Brachydachtylie-mentale retardatie syndroom en één
CNV bevat zowel de regio van het Beckwith-Wiedemann als het Jervell & Lange-Nielsen syndroom. De
genotypes van deze patiënten worden weergegeven in Tabel 3. Bij de overige CNV’s werd de DGV
geconsulteerd. Zeven CNV’s werden daarin minstens tweemaal teruggevonden, waardoor deze kunnen
beschouwd worden als normale varianten zonder klinische betekenis. Ten slotte werd de overerving van
de overige 25 CNV’s geëvalueerd. De vier de novo ontstane CNV’s die geen normale varianten zijn,
kunnen als vermoedelijk causaal worden benoemd. Bij de overige 21 CNV’s blijft de klinische relevantie
ongekend, omdat de ouders eveneens drager zijn of niet onderzocht werden. Er zijn dus 11 patiënten
waarvan het ontdekte CNV waarschijnlijk verantwoordelijk kan worden gesteld voor de aangeboren
hartafwijking: vier gekende syndromen, drie loci gelinkt aan hartafwijkingen en vier de novo infrequente
CNV’s.
31
Figuur 5. Overzicht fenotype/genotype studie: Congenitale hartafwijkingen.
Noot. CNV: Copy Number Variant.
Tabel 3. Overzicht vermoedelijk causale CNV’s van patiënten met een congenitale hartafwijking.
Noot. CNV‘s: copy number variations, kb: kilobaseparen, Mb: megabaseparen, OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man.
Klinische relevantie
Overerving
Frequent voorkomend CNV in de database met normale varianten
Gekend syndroom of locus, gelinkt aan hartafwijkingen
Aantal CNV's
Aantal patiënten met een congenitale hartafwijking
32 patiënten
39 CNV's
32 locus ongekend
7 frequente CNV's
7 waarschijnlijk normale variant
25 infrequent
15 overgeërfd van gezonde
ouder
6 ouders niet onderzocht
21 ongekende significantie
4 de novo
3 gekende locus
7 vermoedelijk causaal
4 gekend syndroom
4 causaal
32
6.2 GENOTYPE/FENOTYPE STUDIES
Na de fenotype/genotype studie, werd gezocht volgens genotype. Alle CNV’s van de
onderzoekspopulatie werden vergeleken op vlak van overeenkomstige aangetaste chromosoombanden.
Van een totaal van 387 CNV’s, waarbij het mogelijk is dat één patiënt geen, één of meerdere CNV’s heeft,
zijn er 163 (42,1% ) deleties en 224 (57,9%) duplicaties (Figuur 6). De CNV’s werden gegroepeerd in
clusters per aangetaste regio op hetzelfde chromosoom. Er kan opgemerkt worden dat er zelfs in deze
beperkte onderzoekspopulatie regio’s zijn die blijkbaar erg kwetsbaar zijn voor afwijkingen, met tot acht
patiënten met een CNV in dezelfde regio. De reeds beschreven Low Copy Repeats kunnen een verklaring
bieden voor recurrente CNV’s. De meerderheid van de CNV’s zijn echter solo-CNV’s (53,4%) of duo’s
(23,3 %) (Figuur 6). Er werd voor de genotype/fenotype studie geopteerd om de patiënten in clusters te
bespreken. Door de patiënten in clusters te plaatsen, konden interessante regio’s geselecteerd worden voor
deze masterproefstudie. Uiteindelijk werden vijf clusters weerhouden. De volgende inclusiecriteria
werden gehanteerd: aantal patiënten in de cluster, overlap tussen de CNV’s t.h.v. dezelfde
chromosoomband, een beschrijving van de CNV in de literatuur, fenotypische overeenkomsten binnen de
groep en zo weinig mogelijk bijkomende CNV’s.
Figuur 6. Overzicht genotype/fenotype studie.
Noot. CNV: Copy Number Variant.
Klinische opvolging van de patiënt
Deleties vs duplicaties
Aantal CNV's
Gehele patiëntenpopulatie 320
patiënten
387 CNV's
163 deleties
62 CNV's in 22 clusters
101 solo-CNV's
224 duplicaties
118 CNV's in 42 clusters
106 solo-CNV's
33
6.2.1 CHROMOSOOMBAND 1q21.1 GROEP 1
In de onderzoekspopulatie werd bij vier patiënten een deletie gevonden in chromosoomband
1q21.1. Deze vier patiënten werden opgedeeld in twee groepen (groep 1 en groep 2) van telkens twee
personen volgens de overlappende regio binnen chromosoomband 1q21.1. Er werden bij deze patiënten
geen bijkomende CNV’s vastgesteld met array-CGH.
De eerste groep bestaat uit patiënt 1, met een 2,55Mb deletie arr1q21.1q21.1(144525208-
147076428)x1 en patiënt 2, met een 1,55Mb deletie arr1q21.1q21.1(144745814-146294654)x1. Deze
deleties overlappen over 1,55Mb: 1q21.1q21.1(144745814-146294654). Bij patiënt 1 werd deze deletie
paternaal overgeërfd. Bij patiënt 2 is er nog geen informatie beschikbaar over het genetisch profiel van de
ouders.
In de DECIPHER-database vertonen 21 patiënten een overlappende deletie van deze regio. Bij 11
van deze patiënten wordt echter geen klinische informatie weergegeven. Deze 11 patiënten werden niet
geïncludeerd in de verdere resultatenverwerking. Vervolgens werden nog drie andere DECIPHER-
patiënten uitgesloten op basis van een te beperkte overlap en/of door teveel andere genetische afwijkingen
die mogelijks het fenotype zouden kunnen verklaren. De DECIPHER-database bevat tevens 27 patiënten
met een duplicatie in deze regio. Deze werden echter niet weerhouden voor de genotype/fenotype studie.
De minimaal overlappende regio van patiënt 1, patiënt 2 en de acht weerhouden DECIPHER-patiënten is
1q21.1(145693383-146190000) (0.5Mb) (Figuur 7).
De OMIM-genen in deze minimaal overlappende regio zijn: gap junction protein, alpha-5 40kD
(GJA5,CX40), gap junction membrane channel protein alpha-8 connexin 50 (GJA8, CX50), G protein-
coupled receptor 89B (GPR89B) en neuroblastoma breakpoint family, member 11 (NBPF11).
Bij patiënt 1, patiënt 2 en bij de DECIPHER-patiënten werden de volgende klinische kenmerken
waargenomen: mentale beperking (9/10), vertraagde spraakontwikkeling (3/10), intra- (2/10) of extra-
uteriene groeiretardatie (4/10), aangezichtsafwijkingen (5/10), kort filtrum (2/10), nierafwijkingen (2/10)
en lidmaatafwijkingen (2/10) (Tabel 4).
Binnen de groep van de aangezichtsafwijkingen is er een grote verscheidenheid. Deze werd in drie
groepen ingedeeld: afwijkingen van neus, mond/lippen en mandibula/kin. De afwijkingen staan vermeld
in Tabel 4. De vinger- en teenafwijkingen zijn polydactylie, bifide hallux, brede duimen (D890) en
clinodactylie (D249135). Naast deze fenotypische overeenkomsten komen een aantal klinische
afwijkingen slechts bij één patiënt voor. Deze afwijkingen zijn nasale spraak bij patiënt 1, doofheid bij
D250214, cerebrale atrofie bij D251472, strabisme bij D1186 en cataract bij D250461.
34
Figuur 7. Overzicht overlappende deleties in chromosoomband 1q21.1 (groep 1).
35
Tabel 4. Overzicht fenotype 1q21.1 patiënten (groep 1).
Noot. ?: ongekend, -: afwezig, +: aanwezig, CNV's: Copy Number Variations, D: DECIPHER, del: deletie, dupl: duplicatie, fam: familiaal, j: jaar, MR: Mentale Retardatie, pat:
paternaal
36
6.2.2 CHROMOSOOMBAND 1q21.1 GROEP 2
Binnen de chromosoomband 1q21.1 bevindt zich naast groep 1, nog een tweede groep patiënten met
overlappende deleties. Deze deleties komen overeen met de TAR-regio op chromosoom 1.
Patiënt 3 heeft de deletie arr1q21.1q21.1(144126547-144454797)x1 (328 kb) en patiënt 4 de deletie
arr1q21.1q21.1(144126547-144475812)x1 (350 kb). Deze deleties overlappen over een 328 kb regio t.h.v.
1q21.1q21.1(144126547-144454797). Bij patiënt 3 is er nog geen informatie beschikbaar over het
genetisch profiel van de ouders. Patiënt 4 heeft de deletie paternaal overgeërfd.
Patiënt 3 en 4 worden vergeleken met vijf patiënten uit DECIPHER waarvan de klinische
informatie beschikbaar is. Eén van deze patiënten is ook in de 1q21.1 groep 1 geïncludeerd, namelijk
D250214. De minimaal overlappende regio van patiënt 3, patiënt 4 en de vijf DECIPHER-patiënten is 214
kb groot t.h.v. 1q21.1(144190575-144404740) (Figuur 8).
De OMIM-genen in deze minimaal overlappende regio zijn: RNA-binding motif protein 8A
(RBM8A, RBM8B), peroxisome biogenesis factor 11B (PEX11B), integrin, alpha10 ( ITGA10) en protein
inhibitor of activated stat 3 (PIAS3). Hemocrhomatosis type 2A (HFE2A) is gedeleteerd bij D2375,
D250214 en deels gedeleteerd bij patiënt 3 en patiënt 4.
Bij patiënt 3, patiënt 4 en bij de DECIPHER-patiënten werden volgende klinische kenmerken
waargenomen: mentale beperking (3/7), laag geboortegewicht (2/7), microcefalie (3/7),
aangezichtsafwijkingen (6/7) en lidmaatafwijkingen (4/7 ) (Tabel 5).
De waargenomen aangezichtsafwijkingen zijn zeer variabel en werden daarom onderverdeeld in
verschillende groepen, met name algemeen, oog/orbita-afwijkingen, mond/lipafwijkingen, oorafwijkingen
en neusafwijkingen. De verschillende klinische kenmerken werden opgenomen in Tabel 5.
37
Figuur 8. Overzicht overlappende CNV's 1q21.1 (groep 2).
38
Tabel 5.Overzicht fenotype 1q21.1 patiënten (groep 2).
Noot. ?: ongekend, -: afwezig, +: aanwezig, CNV's: Copy Number Variations, D: DECIPHER, del: deletie, dupl: duplicatie, fam: familiaal, j: jaar, MR: Mentale Retardatie, pat:
paternaal.
39
6.2.3 CHROMOSOOMBAND 2p16.3
Patiënt 5, patiënt 6 en patiënt 7 vertonen respectievelijke 2p16.3 deleties: patiënt 5 arr
2p16.3p16.3(50987317-51110512)x1 (~125 kb), patiënt 6 arr 2p16.3p16.3(50915065-50982361)x1 (~70
kb) en patiënt 7 arr 2p16.3p16.3(50996353-51212326)x1 (~230kb). Patiënt 5 heeft deze deletie paternaal
overgeërfd en patiënt 6 heeft een bijkomende maternale deletie t.h.v. 3p12.3. Patiënt 7 heeft zowel de
2p16.3 deletie als een 7q21.12 duplicatie maternaal overgeërfd en bij een maternale tante komt mentale
beperking voor. Over het genotype van de tante en over de intellectuele capaciteiten van de moeder zijn er
geen gegevens. Bij deze patiënt evenals bij patiënt 6 kunnen de andere CNV’s het fenotype niet verklaren.
In de DECIPHER-database werden acht patiënten met een 2p16.3 deletie en twee met een
duplicatie teruggevonden. In de literatuur beschrijft Zahir et al. een jongen met een de novo deletie van
2p16.3, namelijk arr 2p16.3p16.3(50799281-51120644) (41). Volgens OMIM bevindt zich in deze regio
het neurexine 1-gen (NRXN1) wat zich bij pathologie kan uiten in een Pitt-Hopkinslike syndroom en/of
verhoogde gevoeligheid voor schizofrenie (42). Alle beschreven CNV’s overlappen met dit gen (Figuur
9). De regio is in de DGV geen frequent voorkomende normale variant.
In Tabel 6 worden de fenotypes van de 14 patiënten weergegeven. Op neurocognitief vlak worden
weerhouden: (mentale) ontwikkelingsachterstand (10/14), motorische ontwikkelingsstoornis (5/10),
ASS/autistiforme kenmerken (6/14) en hypotonie en/of hyperlaxiteit (4/14). Schizofreniforme kenmerken
werden bij geen van de patiënten gerapporteerd, echter 12 van de 14 patiënten zijn nog minderjarig, en
hebben de gemiddelde leeftijd van onset van schizofrenie nog niet bereikt. Een afwijking van de gestalte
(3/14) is tweemaal een kleine gestalte (deleties) en eenmaal een grote gestalte (duplicatie). Morfologische
afwijkingen zijn er van de ledematen (5/14), dewelke allemaal verschillend zijn; afwijking van de
wervelzuil (2/14); een sacrale dimpel/sinus (2/14); afwijking van het hart (4/14), respectievelijk malpositie
van de aortaboog, palpitaties, patente ductus arteriosus en biventriculaire hypertrofie. Qua
schedelafwijkingen en faciale dysmorfologie werden beschreven: craniosynostosis (2/14), schisis (2/14),
micrognathie (2/14), oorafwijkingen (3/14) waarbij elke oorafwijking slechts eenmaal voorkomt en
afwijkingen van oogstand of orbita (3/14) (tweemaal epicantus en eenmaal hypertelorisme). Ten slotte
werd bij sommige patiënten een oftalmologische afwijking vastgesteld, waaronder meest frequent
strabisme (4/14).
40
Figuur 9. Overzicht overlappende CNV's 2p16.3.
41
Tabel 6. Overzicht fenotype 2p16.3
Noot. ?: ongekend, -: afwezig, +: aanwezig, ASS: autismespectrumstornis, CNV: Copy Number Variation, D: DECIPHER, del: deletie, dupl: duplicatie, fam: familiaal, j: jaar, m:
maand, mat: maternaal, MR: Mentale Retardatie, pat: paternaal .
42
6.2.4 CHROMOSOOMBAND 15q15.3
Vijf patiënten uit de onderzoekspopulatie vertonen een deletie t.h.v. chromosoomband 15q15.3. De
specifieke afwijkingen zijn: patiënt 8 arr 15q15.3q15.3(41676219-41738539)x1, patiënt 9 arr
15q15.3q15.3(41676219-41738539)x1, patiënt 10 arr 15q15.3q15.3(41638840-41738539)x1, patiënt 11
arr 15q15.3q15.3(41704264-41778405)x1 en patiënt 12 arr 15q15.3q15.3(41704264-41778405)x1. De
regio van minimale overlap tussen deze vijf omvat baseparen 41704264 tot en met 41738539. Zoals te
zien in Figuur 10, zijn sommige breekpunten dezelfde bij verschillende, niet-verwante patiënten, wat zou
kunnen verklaard worden door LCR’s. De afwijking van 15q15.3 werd bij patiënt 9, patiënt 10, patiënt 11
en patiënt 12 overgeërfd van één van de ouders. Bij patiënt 8 werden de ouders nog niet onderzocht. In de
familie van patiënt 11 is er consanguïniteit.
Bij vier van de vijf patiënten werden ook nog andere significante CNV’s vastgesteld. Een breekpunt
van de ~100 kb duplicatie arr 1p31.3p31.3(65424190-65843395)x3 van patiënt 8 ligt middenin het gen
voor een leptine-receptor (LEPR). Afwijkingen in dit gen worden verantwoordelijk gesteld voor morbide
obesitas met hypogonadisme. Deze kenmerken werden echter (nog) niet gediagnosticeerd bij patiënt 8.
Patiënt 9 heeft een maternaal overgeërfde 62-100 kb 2q13 duplicatie arr 2q13q13(110182348-
110615057)x3 mat. In deze duplicatie ligt het nephrocystin 1 (NPHP1). Deleties en/of mutaties in de twee
allelen van dit gen leiden o.a. tot het Joubert syndroom. Patiënt 9 heeft echter een duplicatie en dat slechts
op één allel. Patiënt 11 heeft de duplicatie arr 1p36.33p36.33(1935979-1995454)x3 pat dewelke gamma-
aminobutyric acid (GABA) A receptor omvat. Heterozygote mutaties geven een susceptibiliteit tot
epilepsie. De invloed van een duplicatie op de ontwikkeling van epilepsie is niet gekend.
In de DECIPHER-database werden acht patiënten teruggevonden met een deletie die dezelfde
overlappende regio op 15q15.3 omvat. Slechts van twee patiënten is er klinische informatie beschikbaar.
Zij hebben beiden geen andere CNV’s die de interpretatie van het genotype/fenotype kunnen beïnvloeden.
In de literatuur beschrijft Knijnenburg et al. een tienjarige jongen met een 80 kb homozygote deletie van
de betrokken regio in 15q15.3 (43). Bij hem werd ook een 1Mb deletie van 15q26.2 vastgesteld, de
gedeleteerde regio bevat echter geen functionele genen en het CNV is meermaals opgenomen in de DGV.
In de minimaal overlappende regio van de Glims- en DECIPHER-patiënten ligt slecht één OMIM-
gen: 607249. Figuur 10 illustreert de ligging van alle besproken CNV’s en OMIM-genen ter hoogte van
chromosoomband 15q15.3.
Tabel 7 toont de fenotypische kenmerken van de vijf Glims-patiënten, twee DECIPHER-patiënten
en de patiënt beschreven door Knijnenburg et al. (43). Neurocognitieve kenmerken zijn
MR/ontwikkelingsstoornis (6/8) en hypotonie (3/8). Huidaandoeningen (3/8) zijn cutis marmorata, eczema
43
neonatorum en hypertrichosis. Lidmaatafwijkingen (2/8) zijn brachydactylie en korte handen en voeten.
Twee patiënten werden geboren met schisis (2/8): een linker unilaterale incomplete gespleten lip en een
gespleten uvula. Bij de patiënt van Knijnenburg et al. werd een hoge verhemelteboog vastgesteld en bij
D1392 waren er voedingsproblemen in de kindertijd, wat kan wijzen op een gestoorde werking van het
verhemelte-apparaat (43). Andere faciale dysmorfologie is er t.h.v. de oren (3/8), respectievelijk
verschrompeld, posterieur geplaatst en laaggeplaatst. Afwijkende wenkbrauwen (3/8) zijn duidelijk
omschreven, prominent en synofrys. Ook dysmorfie van de neus komt driemaal voor (3/8): brede
neusbrug, deviatie neusseptum en hoge neusbrug en vooruitstekende columella. Ten slotte werden ook
congenitale colobomata vastgesteld (2/8). Bij drie patiënten werden gelijkaardige fenotypes in de familie
beschreven, meer specifiek gaat het over MR, schisis en congenitaal coloboma.
Figuur 10. Overzicht overlappende CNV's 15q15.3.
44
Tabel 7. Overzicht fenotype 15q15.3
Noot. ?: ongekend, -: afwezig, +: aanwezig, CNV's: Copy Number Variations, cons: consanguïniteit, d:dag, D: DECIPHER, del: deletie, dupl: duplicatie, fam: familiaal, j: jaar,
m: maand, mat: maternaal, MR: Mentale Retardatie, pat: paternaal.
45
6.2.5 CHROMOSOOMBAND 16p12.1
Patiënt 13 en patiënt 14 vertonen een overlappende deletie op chromosoom 16p12.1. De eerste
breekpunten zijn identiek bij beide patiënten; Patiënt 13 heeft een ~650kb deletie arr
16p12.1p12.1(21713820-22355674)x1 en patiënt 14 een ~600kb deletie arr 16p12.1p12.1(21713820-
22315373)x1. De regio van minimale overlap omvat baseparen 21713820 tot 22315373. Bij geen van
beide patiënten werden andere CNV’s gerapporteerd. De ouders van de patiënten werden nog niet
onderzocht. In de DECIPHER-database werden vijf overlappende deleties en twee overlappende
duplicaties van 16p12.1 opgenomen. Figuur 11 geeft alle CNV’s van de bestudeerde patiënten weer,
evenals de OMIM-genen in de betrokken regio. Alle DECIPHER-patiënten overlappen met de CNV’s van
beide patiënten van het UZ Gent. Er is geen minimaal overlappende regio van de negen beschouwde
CNV’s. Wanneer D251445 buiten beschouwing gelaten wordt, is de regio van minimale overlap arr
16p12.1p12.1(21856573-22116416). Het gen voor ubiquinol-cytochrome c reductase core protein II
(UQCRC2) ligt in deze regio. De DGV beschrijft enkele patiënten met inversies t.h.v. 16p12.1. D1579
heeft naast de 16p12.1 deletie ook een deletie van chromosoomband 22q11.2, wat kadert in het distaal
22q11.2 deletiesyndroom.
De fenotypische kenmerken van patiënt 13 en patiënt 14 en de zeven DECIPHER-patiënten worden
weergegeven in Tabel 8. Op neurocognitief gebied zijn er MR/ontwikkelingsvertraging (7/9),
hypotonie/spasticiteit (2/9) en ASS/autistiforme kenmerken (3/9). Op morfologisch gebied werden de
volgende afwijkingen gediagnosticeerd: schisis (3/9), wat bij patiënt 13 kadert in een Pierre-Robin-
sequentie; vingerafwijkingen (2/9), respectievelijk clinodactylie en brachydactylie; en oorafwijkingen
(4/9), meer specifiek gaat het over auriculaire tags, dysplasie van het oor, doofheid en prominente helix.
Andere, eenmalig voorkomende gelaatsafwijkingen zijn o.a. macrostomie (D2131), hypertelorisme
(patiënt 13), volle wangen (D249215) en tandafwijkingen (D248614). Eén patiënt heeft een kleine gestalte
(D2131), een andere heeft stagnatie van de groei (patiënt 14). Voedingsproblemen tijdens de kinderjaren
en diarree waren er bij patiënt 14. D1579 heeft naast bovenvermelde afwijkingen ook pigmentafwijkingen
van huid, haar en iris en bijkomend hyperthyroïdie, hypertensie en een niet-gespecificeerde hartafwijking.
De hartafwijkingen en MR van D1579 kunnen verklaard worden door de CNV ter hoogte van 22q11.2
(44).
46
Figuur 11. Overzicht overlappende CNV's 16p12.1
47
Tabel 8. Overzicht fenotype 16p12.1.
Noot. ?: ongekend, -: afwezig, +: aanwezig, CNV's: Copy Number Variations, D: DECIPHER, del: deletie, dupl: duplicatie, fam: familiaal, j: jaar, m: maand, mat: maternaal,
MR: Mentale Retardatie, pat: paternaal
48
7 DISCUSSIE Deze masterproef resulteert in vijf genotype/fenotype studies door gebruik te maken van twee
checklists, een papieren en een elektronische versie, die in de toekomst kunnen helpen om nieuwe
genotype/fenotype studies uit te voeren.
7.1 EVALUATIE VAN DE METHODE
Voordelen aan het gebruik van deze checklists zijn de standaardisatie, de elektronische database en
het feit dat deze laatste geïntegreerd is in de genetische database. Bepaalde processen in een
genotype/fenotype studie worden zodoende geautomatiseerd en verlopen dus overzichtelijker en sneller.
Manueel werk blijft echter noodzakelijk aangezien interpretatie van de gegevens per individuele patiënt
belangrijk blijft.
In deze masterproef werden de gegevens retrospectief verzameld vanuit bestaande dossiers.
Retrospectief onderzoek heeft als voordeel dat de dossiers zowel de klinische verslagen van de dienst
medische genetica bevatten als de klinische verslagen en resultaten van de andere behandelende
specialisten. Informatie uit de verslagen van de behandelende specialist zelf is doorgaans accurater dan die
verkregen via anamnese bij de klinisch geneticus (4). Eveneens bevat een dossier vaak gegevens van een
opvolging gedurende meerdere jaren wat een rijkdom aan informatie oplevert. Enkele nadelen bij
langdurige opvolging zijn o.a. het verloren gaan van relatief oude, niet-geïnformatiseerde informatie, het
voorkomen van tegenstrijdige informatie en het gebruik van verschillende termen voor eenzelfde
afwijking binnen de dysmorfologie. Door het opstellen van de papieren en elektronische checklist worden
deze nadelen naar de toekomst toe mogelijks omzeild. Wanneer in de toekomst prospectief gewerkt wordt
en de papieren checklist het intakeformulier vervangt, zal de patiënteninformatie op een meer
gestandaardiseerde en gestructureerde wijze kunnen verzameld worden. De elektronische versie zorgt er
dan weer voor dat de verzamelde gegevens op een eenvoudige, snelle en overzichtelijke manier kunnen
opgevraagd worden. Deze manier van werken heeft als doel genotype/fenotype studies naar de toekomst
toe minder arbeidsintensief te maken.
7.2 INTERPRETATIE FENOTYPE/GENOTYPE STUDIES
Voor de interpretatie van de array-CGH-resultaten bij 320 patiënten in het kader van de
fenotype/genotype studies werd gebruik gemaakt van een aangepaste versie van de flow-chart-methode uit
het werk van Buysse et al. (32). Twee groepen patiënten werden aan deze studie onderworpen, met name
128 patiënten met MR en 32 patiënten met een congenitale hartafwijking.
49
7.2.1 MENTALE BEPERKING
Oorzaken van MR zijn multifactorieel (9). Omgevingsfactoren die bijdragen tot MR zijn o.a. intra-
uteriene infecties en prematuriteit. In de patiëntenpopulatie van Stevenson et al. werd bij 20% van de 10
997 patiënten een genetische oorzaak van MR vastgesteld (45). Bij een deel van deze patiënten kadert de
MR in een ruimer chromosomaal syndroom, zoals het syndroom van Down. Een ander deel van de MR
heeft een monogenische oorsprong, voornamelijk te wijten aan afwijkingen op het X-chromosoom.
Aangezien het hierbij meestal om een X-gebonden recessieve overerving gaat, zou dit kunnen verklaren
waarom MR bij jongens 1,4 keer meer voorkomt dan bij meisjes. Een gelijkaardige verhouding werd ook
vastgesteld in de patiënten van deze studie waar bij 45 meisjes en 82 jongens MR werd vastgesteld. Dat is
1,8 keer zoveel jongens als meisjes.
In deze masterproefstudie werd MR bij 128 patiënten gediagnosticeerd. Bij deze 128 patiënten werden
179 CNV’s gedetecteerd. Door gebruik te maken van de aangepaste flow-chart werden in de MR groep
14/179 (7,8%) CNV’s verantwoordelijk geacht voor de MR en dit in het kader van een gekend MR-
syndroom. 21/179 (11,7%) CNV’s werden als vermoedelijk causaal beschouwd, omdat de betrokken regio
in de wetenschappelijke literatuur gelinkt wordt aan MR of omdat de CNV de novo ontstaan is. Hiernaast
werden 8/179 (4,5%) CNV’s meermaals teruggevonden in de DGV waardoor deze als normale variant
beschouwd konden worden. Bij de overige 136/179 (76%) CNV’s was de klinische relevantie van de
CNV minder duidelijk. Bij deze laatste groep CNV’s werd namelijk geen link met een MR-locus
teruggevonden in de literatuur. Bij een aantal CNV’s van deze groep bestond er tevens nog
onduidelijkheid met betrekking tot de overerving. De CNV’s waarvoor een besluit getrokken kan worden
qua klinische relevantie zijn de acht normale varianten, 21 vermoedelijk causale en 14 causale. Bij
patiënten waarbij geen causale CNV werd teruggevonden, kan nog steeds een andere genetische oorzaak,
zoals een puntmutatie, en/of omgevingsfactoren aan de basis liggen van de MR. Hiernaast is het aantal
causale CNV’s mogelijks onderschat doordat heden geen informatie beschikbaar is over de causaliteit van
de groep CNV’s met onduidelijke betekenis. Tenslotte kan gesteld worden dat onverklaarde mentale
beperking, zeker in combinatie met dysmorfologische kenmerken, een goede indicatie tot genetisch
onderzoek met array-CGH.
50
7.2.2 CONGENITALE HARTAFWIJKING
De groep van 32 patiënten met een hartafwijking werd op dezelfde manier beoordeeld op vlak van
klinische relevantie. Hier werden 39 CNV’s gedetecteerd. Vier (10.6%) CNV’s waren 22q11
microdeleties, overeenkomend met het velocardiofaciaal syndroom en dus causaal. Zeven (17,9%) andere
CNV’s waren vermoedelijk causaal. Deze CNV’s bevatten immers genen die gelinkt konden worden aan
hartafwijkingen of waren de novo ontstaan. Bij zeven andere CNV’s (17,9%) werd de genetische
afwijking beschouwd als een normale variant. Bij 21 (53,8%) CNV’s bestond er nog onduidelijkheid rond
de klinische relevantie van de CNV.
Hartafwijkingen zijn de meest frequent voorkomende congenitale structuurafwijkingen. Minstens
20% van deze hartafwijkingen zouden te wijten zijn aan Mendeliaanse monogenische mutaties of
chromosomale aneuploïdieën (bijvoorbeeld trisomie 21). De oorzaak van de andere 80% is meestal
minder duidelijk en waarschijnlijk een samenspel van polygenische en omgevingsfactoren, zoals prenatale
virale infecties, toxische stoffen, maternale diabetes mellitus… Verscheidene studies onderzochten de zin
of onzin van array-CGH bij congenitale hartafwijkingen. Bij 17 à 21 % van de patiënten wordt een CNV
ontdekt. Het CNV zou bij 17 tot 72% van hen causaal kunnen zijn voor de hartafwijking (46). De grote
spreiding van deze percentages kan vergeleken worden met de patiëntenpopulatie met een congenitale
hartafwijking van deze masterproef, waarin enkel patiënten met een afwijkend array-CGH-resultaat
voorkomen. Bij 28,5% van de patiënten werd (minimum het vermoeden van) causaliteit van een CNV
aangetoond. Naast 7,19% normale varianten, is er nog de grote groep van 53,8% waar onduidelijkheid
over bestaat. Dit zorgt ervoor dat ook in deze masterproef geen nauwkeurig percentage kan weerhouden
worden. Het uitvoeren van een array-CGH bij personen met een congenitale hartafwijking kan weldegelijk
nuttig zijn. Toch is er extra onderzoek nodig om een beter beeld te krijgen van het percentage van de
afwijkingen dat veroorzaakt wordt door een CNV. Zo kunnen meer nauwkeurige indicaties voor array-
CGH uitgewerkt worden.
7.3 INTERPRETATIE GENOTYPE/FENOTYPE STUDIES
7.3.1 1q21.1: GROEP 1
Op basis van de klinische bevindingen bij onze patiënten, de patiënten in DECIPHER en uit de
literatuur blijkt dat deleties in deze 1q21.1 regio een zeer variabel fenotype hebben (47). Bij toepassing
van array-CGH in een controlepopulatie (4 737 controles) werd deze deletie in chromosoomband 1q21.1
slechts eenmaal teruggevonden (47). Bij een groep personen die klinische kenmerken vertoont die
gelijkaardig zijn met de patiënten in deze masterproef wordt deze deletie in 0.24% van de gevallen
teruggevonden (48).
51
Tussen patiënt 1 en patiënt 2 werden geen fenotypisch overlappende kenmerken teruggevonden.
Verschillende klinische kenmerken komen wel meermaals voor wanneer patiënten uit DECIPHER
meegenomen worden in de vergelijking. Er is echter geen duidelijk klinisch profiel van iemand met een
1q21.1 microdeletiesyndroom (49). In de studie van Mefford et al. kwam bij 76% van de patiënten met
een overlappende deletie in deze regio een ontwikkelingsachterstand of mentale retardatie voor (47). Dit
cijfer is enigszins vergelijkbaar met de 90% MR in de beperkte populatie van deze masterproef. Meer dan
80% had in de studie van Mefford et al. dysmorfe kenmerken (47). In deze masterproef kwamen vooral
faciaal dysmorfe kenmerken naar voor en dit bij 50% van de patiënten. De dysmorfe kenmerken waren
echter zeer gevarieerd. Het begrip dysmorf is niet strikt afgelijnd, wat deels een verklaring kan bieden
voor het feit dat er een groot verschil is tussen de studie en deze masterproef. In de studie van Mefford et
al. had 66% microcefalie (47). Dit werd echter slechts bij één patiënt van deze masterproef (D250214)
vermeld in het dossier. In de studie van Brunetti-Pierri et al. is er een statistisch significante associatie
gevonden tussen een deletie van deze locus en microcefalie (50). Deze studie postuleerde dat de
dosagegevoeligheid van het HYDIN2-gen verantwoordelijk is voor variaties in hoofdomtrek. HYDIN2 is
nog niet opgenomen in de OMIM-databank. Hierdoor is het gen niet weergegeven in Figuur 7. Dit gen
valt binnen de deletie van vier patiënten in deze masterproef: patiënt 1, patiënt 2, D250214 en D249135.
Bij D250214 is microcefalie vastgesteld en zou dit dus verklaard kunnen worden door de deletie van dit
gen. Bij de andere drie patiënten zou een herevaluatie van de hoofdomtrek interessant kunnen zijn. Het is
echter mogelijk dat deze fenotypische afwijking niet vermeld werd in de dossiers van deze patiënten. Bij
patiënt 2 werd wel een postnatale groeiretardatie vastgesteld waar microcefalie mogelijks in kan passen.
Een andere verklaring voor dit afwijkend resultaat zou kunnen liggen in het feit dat een groep met vier
patiënten zeer klein is, zeker in vergelijking met de groep van Brunetti-Pierri et al. (50). Anderzijds
versterkt het feit dat de overige zes patiënten die geen microcefalie hebben ook geen deletie van dit gen
vertoonden de hypothese dat dit gen een rol speelt in de hoofdomtrek. De associatie tussen microcefalie en
de deletie van HYDIN2 is in deze masterproef minder duidelijk, maar deze masterproef biedt toch enkele
argumenten om deze link te bevestigen.
In de literatuur wordt ook een link tussen deze regio en schizofrenie beschreven (51). Deze link kon
echter niet aangetoond worden in deze masterproef. Een verklaring hiervoor kan zijn dat de patiënten nog
niet de leeftijd hebben waarop schizofrenie meestal tot uiting komt. Het is echter wel belangrijk dat hier
rekening mee gehouden wordt in de opvolging van de patiënten.
In de studie van Brunetti-Pierri et al. worden ook patiënten beschreven die een deletie hebben die
groep 1 en groep 2 van 1q21.1 overlapt (50). In deze masterproef kwam deze grotere deletie ook eenmaal
voor, namelijk bij D250214.
52
Volgens Mefford et al. zou er naast bovenstaande afwijkingen ook nog een associatie zijn van deze
regio met congenitale anomalieën, zoals cataract en congenitale hartaandoeningen (52). Bij één van de
patiënten uit DECIPHER kwam cataract ook naar voor. In Mefford et al. hadden drie van de 21 patiënten
ook een vorm van congenitale cataract (47). Cataract zou geassocieerd zijn met de deletie van het GJA8
gen. Dit gen is geassocieerd aan het microcornea-cataractsyndroom. White et al. deden een experiment
met muizen waar dit specifieke gen verwijderd werd uit hun genoom. Dit zorgde voor een lagere
lensmassa, structurele lensafwijkingen en congenitaal cataract (53). In de literatuur komen verschillende
artikels voor over een mutatie in dit gen bij mensen en de invloed ervan op cataract (54-57). Devi et al.
vonden twee mutaties in dit gen bij 60 kinderen met congenitale cataract in India (56). Beide mutaties zijn
autosomaal dominant en zorgen vaak voor het microcornea-cataractsyndroom en een variabele graad van
myopie. De mutatie werd niet teruggevonden bij de 400 controlepatiënten van deze studie, wat de kans op
causaliteit verhoogt. Zowel in een dierenexperiment als in onderzoek bij patiënten met deze deletie is
aangetoond dat het gaat om een loss-of-function mutatie (58, 59). Een deletie van dit gen zou dus dezelfde
fenotypische kenmerken kunnen geven. He et al. onderzochten mutaties in dit gen bij een Chinese familie
(59). Alle dragers van de heterozygote mutatie in dit gen hadden cataract, op één familielid na. Dit zou
kunnen wijzen op onvolledige penetrantie (59). Het feit dat het gen bij alle patiënten van deze groep in
hun deletie lag en dat slechts bij één patiënt cataract gerapporteerd werd, doet vermoeden dat een deletie
van dit gen niet volstaat om cataract te veroorzaken.
De 1q21.1 regio wordt ook geassocieerd aan atriale fibrillatie door mutaties in het GJA5 gen (60,
61). GJA5 is net zoals GJA8 een gap junction eiwit. Gap junctions bevorderen de adhesie van cellen en
zorgen voor directe intercellulaire communicatie (62). De relatie van atriale fibrillatie met een deletie van
dit gen is nog niet beschreven in de literatuur. In de studie van Christiansen et al. werden in een groep van
505 patiënten met een congenitale structurele hartafwijking drie personen met een deletie t.h.v. deze locus
gevonden (63). Een deletie van GJA5 werd hier als mogelijke verklaring naar voor geschoven. Bij geen
enkele van de door ons bestudeerde patiënten werd echter een hartritmestoornis of een hartafwijking
beschreven.
In de studie van Harvard et al. wordt de functie van de genen gelegen in 1q21.1 (groep 1) regio
bestudeerd (64). Bij een deletie van deze genen kon een duidelijk verminderde concentratie van de
proteïnen gerelateerd aan de genen uit de regio gezien worden. De twee genen met de grootste associatie,
chromodomain helicase DNA-binding protein1-like/amplified in liver cancer 1 (CH1L/ALC1) en protein
kinase, adenosine monophosphate-activated protein, beta 2 non-catalytic subunit (PRKAB2), werden in
detail besproken. Alle patiënten van groep 1 behalve D890, D1186 en D250461 hadden een deletie van
deze twee genen. CH1L/ALC1 (OMIM: 613039) speelt een rol in chromatin remodeling en is nodig voor
53
DNA-herstel, replicatie en transcriptie (65). Er zijn reeds meer dan 18 genen beschreven die een rol in
chromatin remodeling spelen en ook in verband gebracht zijn met MR (66). Het is echter kort door de
bocht om dit gen verantwoordelijk te stellen voor de MR bij de patiënten uit deze groep. De drie patiënten
waarbij dit gen wel nog aanwezig is hebben ook MR en bij patiënt 2, waarbij het gen afwezig is, is geen
MR gerapporteerd. Dit laat toe te besluiten dat dit gen hoogstens een invloed heeft op MR.
Het andere gen besproken in de studie van Harvard et al. is PRKAB2 (OMIM: 602741) (64). Dit gen
valt in de deletie van patiënt 1, patiënt 2, D250214, D249135 en D251472. Dit gen codeert voor de beta2
unit van adenosine monophosphate-activated protein kinase, een proteïne die energieniveaus in cellen,
voornamelijk in de hersenen, regelt (67). Dit zou deels een verklaring kunnen bieden voor de
leermoeilijkheden en MR bij patiënten met een deletie van dit gen (64). Deze hypothese wordt nog
versterkt door het feit dat dit proteïne een rol zou spelen in een pathway verantwoordelijk voor leren en
geheugen (64). Aangezien bij patiënt 2 geen MR werd gerapporteerd en de andere patiënten uit deze
groep, waarbij dit gen niet tot de deletie behoort, ook MR hebben, kan net als bij het bovenstaande gen
enkel besloten worden dat dit gen mogelijks een rol speelt in de MR bij deze patiënten, maar dat de
evidentie hiervan momenteel zwak is.
Voor alle andere fenotypische afwijkingen kon geen informatie in de literatuur en link met de
gedeleteerde genen teruggevonden worden. Toch kwamen er echter nog enkele fenotypische afwijkingen
voor met een (ernstige) impact op het leven van de patiënten zoals cystische nierziekte, doofheid en
aangezichts- en lidmaatafwijkingen.
Als besluit bij deze patiëntengroep kan gesteld worden dat de patiënten onderling een zeer variabel
fenotype hebben. Dit bevestigt de resultaten van Mefford et al. (47). Volgende klinische kenmerken
werden frequent waargenomen: mentale retardatie, groeiretardatie en aangezichtsafwijkingen. Bij een
minderheid van de patiënten werden vertraagde spraakontwikkeling, nierafwijkingen en/of
lidmaatafwijkingen waargenomen. Extra onderzoek naar de oorzakelijke genen en mechanismen die dit
variabel fenotype veroorzaken is zeker nodig om dit microdeletiesyndroom beter te begrijpen. Het vinden
van oorzakelijke genen voor de specifieke fenotypische afwijkingen zou mogelijks kunnen bijdragen tot
een gemakkelijkere klinische diagnose van dit syndroom.
7.3.2 1q21.1: GROEP 2
De minimaal overlappende deletie bij de 1q21.1 (groep 2) is 214165 bp (een ruime 200 kb) groot.
Deze deletie overlapt met de in de literatuur beschreven deletie die verantwoordelijk is voor het
thrombocytopenia-absent radius (TAR) syndroom. De studie van Greenhalgh et al. beschreef 34 patiënten
met het TAR-syndroom (68). Alle patiënten hadden de basisafwijkingen van het TAR-syndroom,
54
trombocytopenie en bilaterale radiale aplasia. 47% vertoonden koemelkeiwitallergie, 23% hadden
nierafwijkingen en 15% hadden cardiale afwijkingen (68). In deze masterproef had slechts één patiënt
koemelkeiwitallergie (patiënt 3) en kwam er bij één patiënt (D250214) een nierafwijking voor. De andere
fenotypische afwijkingen werden niet bij de bestudeerde patiënten teruggevonden, behoudens bij D2375
waarbij niet nader gespecificeerde afwijkingen van bovenste en onderste ledematen werden waargenomen.
Een mogelijke verklaring hiervoor is dat een 200 kb deletie in deze locus niet voldoende is om een TAR-
syndroom te veroorzaken (69). Een additionele modifier zou nodig zijn voor het al of niet tot uiting komen
van de klinische kenmerken van het TAR-syndroom (69, 70). Welke deze modifier precies is, is nog niet
gekend. Waarschijnlijk is het een vaak voorkomend polymorfisme omdat er een grote groep is van dragers
van deze deletie zonder dat de symptomen van het TAR-syndroom tot uiting komen (69). Dit zou een
verklaring kunnen bieden voor het ontbreken van de typische kenmerken van het TAR-syndroom bij de
patiënten uit deze masterproef.
Deze 1q21.1 (groep 2) deletie is hoogstwaarschijnlijk causaal aangezien ze niet beschreven wordt in
de databank voor normale varianten en aangezien er geen vergelijkbare deleties gevonden worden in
controlepopulaties (69). De rol van een eventuele modifier kan ook een verklaring bieden voor de
overerving van de deletie van niet-aangetaste ouders.
Geen enkel gen kon verantwoordelijk gesteld worden voor de basissymptomen van het TAR-
syndroom. PIAS3 werd initieel naar voorgeschoven als kandidaatgen. Dit gen speelt een rol in een
signalisatiepathway die de groei van bloedcellen stimuleert. Aangezien de uitschakeling van dit gen niet
zorgt voor de verwachte biochemische veranderingen in deze pathway kan een deletie van dit gen niet
verantwoordelijk zijn voor de fenotypische afwijkingen van dit syndroom (69). Over de andere genen in
de TAR-regio is er nog geen informatie beschikbaar of ze eventueel een rol kunnen spelen in andere
fenotypische afwijkingen.
De 1q21.1 (groep 2) regio omvat ook het HFRE2A-gen (OMIM: 602390). Homozygote mutaties of
samengesteld heterozygote mutaties in dit gen geven aanleiding tot juveniele hemochromatose.
Verschillende mutaties van dit gen zijn beschreven, maar deleties van dit gen in combinatie met
fenotypische afwijkingen komen niet voor in de literatuur. HFRE2A is gedeleteerd in patiënt 3, patiënt 4,
D2375 en D250214, doch geen van deze patiënten vertonen symptomen van deze autosomaal recessieve
aandoening.
Een ander gen gelegen in de minimaal overlappende regio is PEX11B (OMIM: 603867). Dit gen is
betrokken bij peroxisoomproliferatie. Li et al. concludeerde uit zijn onderzoek dat het klinisch beeld van
Pex11b-deficiëntie bij muizen lijkt op de majeure neurologische en ontwikkelingsproblemen die te zien
55
zijn bij het Zellweger syndroom, een peroxisomale aandoening, maar dat de cellulaire en biochemische
kenmerken van deze ziekte afwezig zijn (71). Het Zellweger syndroom is een autosomaal recessief
syndroom met een brede variëteit aan klinische symptomen zoals hypotonie, epilepsie,
ontwikkelingsachterstand, een typische dysmorfologie van het aangezicht en nierafwijkingen (72).
Sommige afwijkingen komen ook voor bij de patiënten uit 1q21.1 (groep 2) zoals nierdysplasie,
hypertelorisme, epilepsie, maar deze afwijkingen kwamen slechts eenmaal voor in deze groep. Dit maakt
de kans op een oorzakelijk verband zeer klein. Vooral omdat het gen in de minimaal overlappende regio
ligt en dus bij alle patiënten in de deletie gelegen is. De mentale beperking bij drie van de zeven patiënten
kan met de beperkte gegevens die beschikbaar zijn ook niet verklaard worden. Het Zellweger syndroom is
een autosomaal recessief syndroom. In de literatuur zijn er geen argumenten te vinden dat een dergelijk
syndroom zou bestaan dat veroorzaakt wordt door een heterozygote deletie van PEX11B. Op basis van de
resultaten in dit onderzoek lijkt de deletie van dit gen geen rol te spelen in de fenotypische afwijkingen.
Dit kan echter niet met volledige zekerheid besloten worden.
Over andere genen, met name RBM8 en ITGA10, in de minimaal overlappende regio kon geen
relevante informatie worden teruggevonden met betrekking tot het fenotype.
Als conclusie voor deze groep patiënten wordt het frequent voorkomen van aangezichts- en
lidmaatafwijkingen weerhouden. Tevens worden bij enkele van deze patiënten weerhouden: mentale
retardatie (3/7), een laag geboortegewicht (2/7) en microcefalie (3/7). De resultaten van deze masterproef
bevestigen de hypothese dat een heterozygote deletie van de TAR-regio niet voldoende is om de
fenotypische afwijkingen van het TAR-syndroom te veroorzaken. Een mogelijke verklaring zou kunnen
zijn dat er een extra modifier nodig is om de basissymptomen van het TAR-syndroom tot expressie te
brengen. Verder onderzoek naar deze modifier zou de genotype/fenotype correlatie binnen deze
patiëntengroep misschien kunnen verduidelijken. Bij de onderzochte patiënten komen enkele fenotypische
afwijkingen frequent voor (vb. MR). Voor verder onderzoek is het belangrijk om uit te zoeken of deze
heterozygote deletie op zichzelf een rol speelt bij deze afwijkingen, atypisch bij het TAR-syndroom of dit
resultaat eerder een gevolg is van een bias. Een mogelijke bias zou kunnen zijn dat veel array-CGH
aangevraagd worden na het klinisch vaststellen van MR.
56
7.3.3 2p16.3: NEUREXINE 1 CNV’S
Veertien patiënten met een variabel CNV t.h.v. chromosoomband 2p16.3 werden beschreven (drie
patiënten uit het UZ Gent, tien vanuit DECIPHER en één uit de literatuur). Hun fenotype kenmerkt zich
door MR/ontwikkelingsachterstand en ASS/autistiforme kenmerken. De 14 bestudeerde CNV’s omvatten
allemaal (een deel van) NRXN1.
Het NRXN1-gen is met zijn grootte van 1,1 Mb waarin 24 exonen gelegen zijn één van de grootste
genen van het humane genoom (73, 74). Na transcriptie is er veel (alternatieve) splicing wat leidt tot
verscheidene genproducten (41, 74). NRXN1 codeert voor de eiwitten neurexine α en neurexine β. Deze
eiwitten functioneren als cel-adhesiemolecules ter hoogte van de presynaptische membraan. Expressie van
dit genproduct is aanwezig in het zenuwstelsel, voornamelijk t.h.v. glutaminerge neurotransmissie, de
witte stof en de frontale hersenkwab (73). Beide neurexines zijn van belang bij de ontwikkeling van het
zenuwstelsel (41, 42). Het CNV van de patiënt beschreven door Zahir et al. omvat enkel de 5’ regio die
NRXNα codeert, waarbij NRXNβ intact blijft (41). Dit is eveneens het geval bij patiënt 5, patiënt 6,
patiënt 7, D951, D251242 en D250904. De overige CNV’s betreffen zowel NRXN α als β.
Zowel SNP’s, puntmutaties als CNV’s van NRXN1 werden reeds onderzocht in wetenschappelijke
studies. Voineskos et al. toonden een correlatie aan tussen NRXN1-SNP’s en de sensorimotore functie bij
normale individuen (73). Zweier et al. zagen homozygote en compound heterozygote afwijkingen van
NRXN1 bij patiënten met ernstige MR en een fenotype dat lijkt op het Pitt-Hopkins syndroom (42). De
meest onderzochte genotype/fenotype-correlatie is die tussen heterozygote afwijkingen en MR, ASS en
schizofrenie. Er is consensus over deze correlatie aangezien deze fenotypische kenmerken significant
frequenter voorkomen bij patiënten met NRXN1-afwijkingen dan bij een controlepopulatie (41, 42, 73-75).
Zweier et al. benoemen dit fenotypisch beeld als een Pitt-Hopkinslike syndroom, aangezien deze
afwijkingen een mildere expressie geven dan het echte Pitt-Hopkins syndroom. Ook in de
onderzoekspopulatie van deze studie is de correlatie tussen heterozygote CNV’s en MR en ASS te stellen.
Immers, MR is aanwezig bij 10/14 en ASS bij 6/14. Deze aantallen zijn waarschijnlijk niet onderschat
aangezien deze diagnoses niet in één consultatie te stellen zijn, zeker niet op jonge leeftijd. Schizofrene
kenmerken werden bij geen enkele van de patiënten vastgesteld, echter omwille van de jonge leeftijd van
de meeste patiënten, kan het ontstaan van schizofrenie op latere leeftijd niet uitgesloten worden. Het
onderliggend mechanisme waardoor NRXN1-afwijkingen predisponeren tot deze neuropsychiatrische
stoornissen is gelegen in het zenuwstelsel. NRXN1-defecten uiten zich in een verminderde myelinisatie
van de witte stof en een verminderd thalamusvolume, waardoor vervolgens de thalamocorticale circuits
verstoord worden (73). Ching et al. benoemen dit als het neurologisch disconnectie syndroom, dat
bijdraagt tot de etiopathogenese van ASS (74).
57
Naast MR, ASS en schizofrenie, zijn er nog andere fenotypische kenmerken die frequent aanwezig
zijn bij patiënten met CNV’s t.h.v. NRXN1. In de literatuur worden nicotine- en alcoholafhankelijkheid,
wervelafwijkingen, faciale dysmorfologie, epilepsie, hypotonie, hartafwijkingen en hemangiomen
beschreven (41, 42, 73-75). Op middelenafhankelijkheid na, zijn deze kenmerken ook aanwezig in de
patiëntencluster van deze masterproef. Significantie van deze mogelijke correlaties en mechanismen die ze
kunnen verklaren zijn echter nog niet uitvoerig bestudeerd. Er is expressie van NRXN1 in hartspierweefsel
en in het ontwikkelende ruggenmerg bij dierproeven, wat de correlaties met hart- en wervelafwijkingen
ondersteunt (41, 74). De specifieke hart- en wervelafwijkingen zijn echter niet steeds van dezelfde aard.
Bij het hart gaat het bijvoorbeeld zowel over septumafwijkingen als malpositie van de aortaboog en
palpitaties. Sommige kenmerken die in de besproken patiëntencluster meermaals voorkomen, worden niet
vernoemd in de literatuur. Het gaat over afwijkende gestalte, sacrale dimpel/sinus, craniosynostose,
schisis, epicantus en strabisme. Wat betreft schisis, werden twee patiënten met een 2p16.3 deletie als enige
CNV geboren met een gespleten lip en/of verhemelte. Een derde patiënt had voedingsproblemen tijdens de
kindertijd wat een indirect signaal kan zijn van een verhemelteafwijking. Wat betreft de gestalte hebben
twee deletiepatiënten een kleine gestalte en een duplicatiepatiënt een grote gestalte, echter de andere
patiënten met eveneens een CNV t.h.v. NRXN1 hebben een normale gestalte.
Bovenstaande hypotheses in overweging nemend, is er enkel evidentie voor een causale correlatie
tussen NRXN1 CNV’s en ASS, MR/ontwikkelingsachterstand en schizofrenie. Bij de genetische
counseling van de patiënt en zijn/haar ouders is het belangrijk te anticiperen op de predispositie voor deze
neuropsychiatrische stoornissen. De overige hypotheses naar genotype/fenotype-correlaties dienen verder
onderzocht te worden, aangezien ze ernstig kunnen zijn (vb. hartafwijkingen) of kunnen helpen bij de
klinische herkenning (vb. sacrale dimpel/sinus).
7.3.4 15q15.3: HETEROZYGOTE DELETIES: NORMALE VARIANTEN?
Vijf patiënten uit de onderzoekspopulatie van deze masterproef hebben een deletie tussen baseparen
41638840 en 41778405 van chromosoomband 15q15.3. De regio van minimale overlap van deze en ook
twee DECIPHER-patiënten met 15q15.3 deleties loopt van baseparen 41704264 t.e.m. 41738539. Ook een
patiënt uit de literatuur werd opgenomen in de genotype/fenotype studie. Andere CNV’s bij deze patiënten
kunnen het fenotype niet verklaren (76). Sommige patiënten erfden de 15q15.3 deletie en sommigen
erfden eveneens fenotypische kenmerken. Zes van de acht patiënten hebben een mentale beperking en drie
zijn hypotoon. Bij meerdere patiënten zijn er huidaandoeningen, schisis en colobomata vastgesteld.
Volgens OMIM zijn er verscheidene genen gelegen op de bestudeerde chromosoomband. Ze werden reeds
weergegeven in Figuur 10 en zullen hieronder verder worden besproken.
58
Histidine acid phosphatase domain-containing protein 2A (HISPPD2A) wordt gedeleteerd of
onderbroken door de CNV’s van patiënt 10, D1392 en Knijnenburg (43). Deze patiënten vertonen een
gestoorde mentale ontwikkeling, waarvan twee patiënten ook taalstoornissen. Patiënten bij wie
HISPPD2A wel nog aanwezig is, vertonen echter ook deze fenotypische kenmerken.
Creatine kinase, mitochondrial 1B (CKMT1B) is een tweede gen dat gedeleteerd is in de
chromosoomband 15q15.3 van verscheidene patiënten, met name van patiënt 8, patiënt 9, patiënt 10,
D1392 en Knijnenburg (43). Er is geen enkel gemeenschappelijk fenotypisch kenmerk bij deze vijf
patiënten. Twee kenmerken komen bij drie van deze vijf patiënten voor: MR/ontwikkelingsstoornis en
schisis/verhemelteafwijking. MR/ontwikkelingsstoornis kan niet worden uitgesloten bij patiënt 8 en
patiënt 9, aangezien zij beiden pasgeborenen waren op het moment van het klinisch en genetisch
onderzoek. Schisis is aanwezig bij patiënt 9 en patiënt 10, het betreft een linker unilaterale incomplete
gespleten lip en een gespleten uvula. Bij D1392 werd geen schisis gediagnosticeerd, maar wel
voedingsproblemen in de kindertijd wat een indirect teken zou kunnen zijn van een congenitaal
verhemelteprobleem. Knijnenburg stelde een hoge verhemelteboog vast bij zijn patiënt (43). De functie
van creatinine kinases, zoals het CKMT1B-enzym, is het katalyseren van de overdracht van een
fosfaatgroep van ATP naar creatinine in het energiemetabolisme van de cel. Er werd expressie van
CKMT1B gevonden in de dunne darm en de placenta, maar niet in skeletspieren, ventrikels en lever. Ter
hoogte van de huid stijgt de hoeveelheid CKMT1B bij wondheling. Literatuur over de relatie tussen
CKMT1B en de ontwikkeling van het verhemelte werd niet teruggevonden (77).
Een volgende gen in de chromosoomband 15q15.3 is stereociline (STRC). Volgens de literatuur
leidt een homozygote deletie van de 15q15.3 regio waar dit gen in valt tot neurosensoriële doofheid en
mannelijke infertiliteit (77). Dit is het geval bij de patiënt van Knijnenburg (43). Aangezien de UZ Gent-
patiënten allen heterozygoot zijn voor de deletie en bij hen geen doofheid of infertiliteit werd vastgesteld,
is de heterozygote deletie van het STRC-gen voor hen hoogstwaarschijnlijk weinig klinisch relevant. Dit
gegeven is echter wel van belang voor reproductieve counseling. De homozygote patiënten beschreven
door Zhang et al. vertonen geen syndromale kenmerken naast de doofheid en infertiliteit (77). De patiënt
van Knijnenburg en de in deze masterproef beschreven patiënten met een deletie van het STRC-gen
vertonen wel syndromale kenmerken zoals MR, maar er is geen duidelijk patroon van fenotypische
kenmerken bij deze patiënten waar te nemen (43).
Een vierde gen binnen de bestudeerde regio op chromosoomband 15q15.3 is het cation channel,
sperm-associated (CATSPER) gen (OMIM: 607249). Zhang et al. stellen de hypothese dat ook dit gen
betrokken is bij recessieve infertiliteit en doofheid (77). Een homozygoot defect van STRC zou
59
verantwoordelijk zijn voor de doofheid en CATSPER voor de mannelijke infertiliteit. Het CATSPER-gen
is bij alle besproken patiënten gedeleteerd. Het fenotypisch kenmerk dat bij zowel de heterozygote als
homozygote patiënten aanwezig is, is MR/ontwikkelingsstoornis, al dan niet gepaard met taalstoornissen.
Bij patiënt 8 en patiënt 9 is geen MR gediagnosticeerd, maar het kan ook niet worden uitgesloten omwille
van hun jonge leeftijd. Synofrys van de wenkbrauwen en oor- en neusdysmorfologie zijn ook kenmerken
die bij sommige patiënten voorkomen. Het kenmerk coloboma is aanwezig bij patiënt 8 en patiënt 12. Het
enige gen dat in beide deleties zit, is het CATSPER-gen. De vader van patiënt 12 had ook een coloboma,
evenals de 15q15.3 deletie.
Creatine kinase, mitochondrial 1A (CKMT1A) is het laatste gen dat bij verscheidene UZ Gent-
patiënten (gedeeltelijk) gedeleteerd is. De deleties van de twee DECIPHER-patiënten omvatten ook
CKMT1A. Drie van deze vier patiënten hebben een (niet-myopathische) hypotonie. CKMT1A is
vergelijkbaar met het eerder besproken CKMT1B, maar over de functie en pathologie van het gen is de
kennis beperkt (77).
In de DGV kunnen tien klinisch gezonde mensen worden teruggevonden met een CNV (meestal
deletie) van de minimaal overlappende regio hier besproken. Knijnenburg et al. probeerden ook de
prevalentie van heterozygote STRC-deleties in een normale populatie te bepalen (43). De prevalentie in
hun studiepopulatie bedraagt 1,6%. Deze twee gegevens doen vermoeden dat heterozygote CNV’s van de
besproken regio meestal normale varianten zijn. In verder onderzoek en patiëntencontact kan dit CNV
echter ook niet genegeerd worden, aangezien de besproken patiënten toch wel een afwijkend fenotype
tonen en aangezien er een overervingsrisico bestaat dat kan resulteren in een kind met doofheid en
infertiliteit.
7.3.5 16p12.1: HET 16p11.2p12.2 MICRODELETIESYNDROOM
Een CNV ter hoogte van de chromosoomband 16p12.1 werd teruggevonden bij twee UZ Gent-
patiënten (twee deleties) en zeven DECIPHER-patiënten (vijf deleties en twee duplicaties). Fenotypisch
komen de volgende kenmerken meermaals voor in de onderzochte populatie: MR/ ontwikkelingsstoornis,
hypotonie/spasticiteit, ASS, schisis, oorafwijking, lidmaatafwijking en korte gestalte. De drie genen in de
betroffen regio zijn ubiquinol-cytochrome c reductase core protein II (UQCRC2), elongation factor 2
kinase (EEF2K) en cerebellar degeneration-related antigen-2 (CDR2).
Antonacci et al. ontdekten dat polymorfismen van de regio 16p12.1 wereldwijd zeer frequent zijn
(16). Door evolutionaire ontwikkeling zijn er twee structurele configuraties (S) binnen de algemene
populatie: 17.6% van de wereldbevolking heeft een S1-configuratie van 16p12.1 en 82.4% een S2-
configuratie, wat in de Europese populatie 82,4% is (16). De S2-configuratie bevat additionele kopijen
60
over een regio van 333 kb. Omwille van deze segmentele duplicaties/low copy repeats (LCR’s), treedt
soms non-allelische homologe recombinatie (NAHR) op, wat kan leiden tot een microdeletie. Dit
mechanisme werd reeds beschreven in de literatuurstudie in het kader van recurrente CNV’s. De
microdeleties hebben meestal breekpunten in een specifiek gedupliceerde regio van 68 kb (16, 78), zie
Figuur 12. Er zijn LCR’s tussen baseparen 21.7 en 21.9Mb en tussen 22.4 en 22.5Mb (16, 78). Bij zes van
de negen patiënten uit deze studie zijn de breekpunten inderdaad gelegen in deze regio’s, waardoor het
CNV de loci van CDR2, EEF2K en UQCRC2 overspant. De S1-configuratie is minder complex waardoor
een homozygoot S1-individu als het ware “immuun” is voor CNV’s. De correlatie tussen een S2-
configuratie en microdeleties t.h.v. 16p12.1 is significant (16). Het bestaan van LCR’s verklaart de
patiënten met inversies in deze regio, teruggevonden in de DGV.
Figuur 122. Genomische structuur van chromosoomband 16p12.1 met genen, recurrente microdeletie en LCR’s. (79)
Noot. LCR: Low Copy Repeat; rode blokken: 68kb LCR’s; grijze blokken: andere LCR’s; groene lijnen: directe oriëntatie,
blauwe lijnen: inversie; CNP: Copy-Number Polymorphism.
CNV’s van 16p12.1 predisponeren tot mentale beperking en neuropsychiatrische afwijkingen zoals
schizofrenie (16, 78). Vergeleken met een controlepopulatie is de associatie tussen een 16p12.1
microdeletie en ontwikkelingsstoornissen (MR, leermoeilijkheden en schizofrenie) statistisch significant
(78). De associatie met ASS wordt ook verondersteld, maar toont geen significantie. Het mechanisme
waardoor de microdeletie geassocieerd is aan deze aandoeningen, zou een “two-hit”-mechanisme zijn. De
microdeletie is een predisponerende factor maar er is nog een tweede factor nodig om de aandoening
volledig tot uiting te laten komen. Die tweede factor kan zowel een ander CNV zijn als een
omgevingsfactor tijdens de ontwikkeling van het individu (78). De noodzaak van zo’n bijkomende factor
zou variabele expressie van 16p12.1 CNV’s kunnen verklaren. De meerderheid van de patiënten van deze
2 Deze figuur is gebruikt met toelating van de auteur, zie Bijlage III.
61
studie hebben het 16p12.1 CNV immers overgeërfd van een (schijnbaar) gezonde ouder, voor zover de
klinische informatie over de ouders beschikbaar was.
Samenvattend zou kunnen gesproken worden van een “three-hit”-mechanisme, waarbij de eerste hit
de S2-configuratie is, die predisponeert tot de tweede hit, het 16p12.1 CNV, wat in combinatie met de
derde hit (een ander CNV of een omgevingsfactor) als neuropsychiatrische stoornissen tot expressie komt.
Naast het CNV in 16p12.1 bestaat er een recurrent 16p11.2p12.2 microdeletiesyndroom (80).
Cytogenetisch kenmerkt dit syndroom zich door een pericentrische deletie van chromosoom 16. Dit is bij
geen van de patiënten uit de cluster van negen het geval. Het bijhorend fenotype omvat veel kenmerken
waaronder ontwikkelingsachterstand, hypotonie, problemen bij de voeding, recurrente oorontstekingen en
faciale dysmorfologie (inclusief de oren en schisis) (80). Binnen de 16p11.2p12.2 regio is nog geen
verdere duidelijkheid over cruciale genen, verantwoordelijk voor bepaalde van de fenotypische
kenmerken. Een kleinere recurrente ~500 kb microdeletie t.h.v. 16p11.2 is geassocieerd met ASS, maar
niet met faciale dysmorfologie (80). Aangezien de patiënten uit deze masterproef voornamelijk afwijken
t.h.v. chromosoomband 16p12.1, kunnen deze resultaten misschien eveneens hiertoe bijdragen. De
fenotypes die zowel voorkomen in het 16p11.2p12.2 microdeletiesyndroom als bij de beschreven 16p12.1
deleties zijn: MR, ASS, hypotonie, voedingsproblemen, schisis en oorafwijkingen. Recurrente
oorontstekingen zijn afwezig bij patiënten met 16p12.1 CNV’s.
Binnen de 16p12.1 regio zelf, omvatten de CNV’s van acht patiënten het UQCRC2, wat niet het
geval is bij D251445. Fenotypisch is het kenmerk MR/ontwikkelingsstoornis aanwezig bij zeven
patiënten, maar niet bij D251445 en patiënt 14. Autistiforme kenmerken werden vastgesteld bij drie
patiënten met een gedeleteerd UQCRC2. Door de jonge leeftijd van D251445 en de meeste overige
patiënten, in combinatie met de onvolledigheid van de klinische informatie bij sommige DECIPHER-
patiënten kan ASS ook bij hen niet met zekerheid uitgesloten worden. Schisis en een oorafwijking zijn
aanwezig bij D251445. UQCRC2 is van belang bij de mitochondriale functie en dit in ongeveer alle
weefsels van het lichaam, waaronder ook de hersenen (maar niet de cortex). Hieruit zou een hypothese
voor verder onderzoek kunnen volgen: predisponeren CNV’s van UQCRC2 tot MR/ontwikkelingsstoornis
en ASS?
Van de tien patiënten in deze cluster, zijn er acht waarbij de OMIM-genen EEF2K en CDR2 in de
gedeleteerde of gedupliceerde regio gelegen zijn. Dit is niet het geval bij D251445 en D248406. Wanneer
men deze twee groepen vergelijkt qua fenotype zijn brachy-/clinodactylie en kleine gestalte twee
kenmerken die wel aanwezig zijn als de twee genen in de afwijkende regio liggen. Deze correlaties zijn
62
echter niet erg sterk aangezien de kenmerken elk slechts tweemaal voorkomen in de groep van acht en dit
eenmaal bij een deletie en eenmaal bij een duplicatie.
Patiënt 14 heeft een deletie t.h.v. 16p12.1 en heeft een groeistagnatie, D2131 heeft een duplicatie
t.h.v. 16p12.1 en heeft een kleine gestalte. In de patiëntenpopulatie van Giririjan et al. komt
groeiachterstand voor bij 9/22 (78). Xi Li et al. stellen een correlatie vast tussen CNV’s t.h.v. arr
16p12.1(21808808-21990388) en de lengte van een individu (15). De CNV’s van patiënt 14 en D2131
omvatten deze regio. De correlatie is net significant (p=0,049), maar na multipele testcorrecties is er geen
significantie meer en er zijn in de regio ook geen genen waarvan de biologische functie gelinkt is aan
groei of gestalte (15).
Schisis en oorafwijkingen komen voor bij patiënt 13, D251445, D248614 en D1579. Er is geen
regio van minimale overlap van de CNV’s van deze vier patiënten.
Als besluit kan gesteld worden dat CNV’s t.h.v. 16p12.1 recurrent voorkomen omwille van NAHR
ter hoogte van LCR’s in de S2-configuratie bij 82,4% van de populatie. De betroffen regio omvat de
genen UQCRC2, EEF2K en CDR2. Klinische kenmerken die mogelijks volgen uit deze CNV’s zijn MR
(UQCRC2), ASS (UQCRC2), hypotonie, voedingsproblemen, schisis en oorafwijkingen. Deze CNV’s
predisponeren tot schizofrenie en andere neuropsychiatrische stoornissen. De expressie van deze
stoornissen wordt beïnvloed door een tweede factor zoals andere genetische afwijkingen en
omgevingsfactoren. Voor de toekomst van deze patiënten, zal het dus vooral van belang zijn de
neurocognitieve ontwikkeling positief te stimuleren.
7.4 VALIDERING VAN DE RESULTATEN
Tegenwoordig wordt de meeste wetenschappelijke literatuur gevalideerd aan de hand van statistiek.
In deze masterproef was het echter moeilijk om statistische testen te doen en tot statistische significantie te
komen. De redenen hiervoor zijn het beperkt aantal patiënten, de zeldzaamheid waarmee afwijkingen
voorkomen, pleiotropie (allelische variëteit van genen gelinkt aan eenzelfde fenotype, bijvoorbeeld MR)
en variabele expressie van genotypes bepaald door epigenetica, mosaïcismen, onvolledige penetrantie, late
onset… (2). Genotype/fenotype studies zoals deze kunnen dus zelden een causaliteit besluiten, zowel in de
literatuur voor onderzoekers en klinische genetici, als in de communicatie naar patiënten en hun familie
toe. Buysse et al. creëerden een beslisboom om genotypes te valideren op vlak van klinische relevantie
(32). Deze flow-chart werd toegepast in de fenotype/genotype studie. Gebruikte criteria zijn: gekend
syndroom, gekende normale variant, de novo versus familiaal overgeërfd en het aantal genen in de
aangetaste regio. Mefford et al. stelden op hun beurt ook criteria op m.b.t. causaliteit (47). Het afwijkende
genotype dient de novo ontstaan te zijn, afwezig te zijn in een controlepopulatie en er moeten klinische
63
overeenkomsten zijn binnen de aangetaste populatie. Deze criteria hebben echter hun beperkingen.
Wanneer een aandoening overgeërfd werd en de aangetaste ouders eveneens een gelijkaardig (eventueel
milder) fenotype hebben, mag causaliteit niet uitgesloten worden. OMIM hanteert ook criteria om te
bepalen welke fenotypes opgenomen worden in de online databank (81). Ook andere instellingen hebben
zo’n criteria opgesteld. Het vastleggen van universele criteria voor causaliteit zou handig zijn. Naast
universele criteria, is het vergroten van de onderzoekspopulatie een manier waarop genotype/fenotype
correlaties gemakkelijker gevonden kunnen worden. In deze studie en in de DECIPHER-database
bijvoorbeeld werken genetische onderzoekers samen om steeds meer patiënten te kunnen vergelijken. Op
die manier vergroot voor de individuele patiënt de kans op een correcte diagnose en counseling.
7.5 TOEKOMSTPERSPECTIEVEN
Eén van de uitdagingen voor huidige en toekomstige onderzoekers binnen de genetica is het
ontwikkelen van een zogenaamde “Human Morbid Map” (10). Dit zou gezien kunnen worden als een
vervolg van het “Human Genome Project”. Waar toen alle genen in het genoom een plaats kregen, zouden
nu alle pathologische CNV’s een plaats moeten krijgen. Genotype/fenotype studies als deze masterproef
kunnen hieraan een kleine bijdrage leveren. Zoals hierboven reeds vermeld werd, is het noodzakelijk om
internationaal alle beschikbare informatie uit te wisselen om ook erg zeldzame afwijkingen te kunnen
includeren. DECIPHER is een initiatief dat deze weg reeds ingeslagen is. Ondertussen zijn er 241 centra
betrokken bij DECIPHER en werden meer dan 13 000 patiënten ingebracht (82). Dankzij DECIPHER
werden al verschillende microdeletiesyndromen ontdekt en beschreven waaronder 17q21.3, 14q11.2 en
19q13.11 (28). Op deze manier zullen in de toekomst nog nieuwe syndromen en associaties gevonden
kunnen worden. DECIPHER en analogen leveren niet alleen een bijdrage aan nieuwe syndromen, maar
ook een betere beschrijving van gekende syndromen en een bijdrage aan onderzoek i.v.m. genfunctie en
ziekten.
Genetisch onderzoek is veel ruimer dan alleen genotype/fenotype studies. Wetenschappelijke
gebieden zoals cytogenetica en bio-informatica zijn onmisbaar en ook in volle ontwikkeling. Met de
huidige kennis blijkt het genoom immers nog steeds een heel complex en onvolledig ontrafeld fenomeen
te zijn. Een andere grote uitdaging binnen de genetica is de epigenetica. Nieuwe inzichten en kennis over
deze mechanismen zouden verklaringen kunnen opleveren voor o.a. variabele fenotypische expressie.
Online databases zoals DECIPHER, Pubmed en UCSC houden onderzoekers up-to-date door het
verzamelen van (resultaten van) kwaliteitsvolle publicaties. DECIPHER bijvoorbeeld, is gelinkt aan
andere genetische, bio-informatica en medische databases, waaronder HUGO Gene Nomenclature
Committee (HGNC), OMIM, PubMed, GeneReviews, Ensembl genes en Swiss-Prot (28). Op vlak van
techniek kunnen er in de toekomst micro-arrays ontwikkeld worden met een nog hogere resolutie, maar
64
dan zal ook het aantal irrelevante afwijkingen/CNV’s toenemen (32). Dit benadrukt dat de mens en zijn
interpretatiemethodes mee moeten evolueren met de steeds betere technieken om de resultaten te
bekomen. Misschien kan de werkwijze sneller en/of goedkoper gemaakt worden. Dit zou het aantal
indicaties waarvoor de techniek aangewend zou kunnen worden mogelijks doen stijgen.
Hierbij moet wel rekening gehouden worden met het feit dat het verbeteren en meer toegankelijk
maken van deze techniek de kans op vraag naar commercialisatie van deze techniek vergroot. Genetica is
een discipline die al altijd ethische vragen heeft opgeroepen. Bij elke evolutie in de genetica komen
vragen naar boven zoals: “Gaat men niet te ver?”, “Waarvoor mogen we dit gebruiken?” en “Enkel
diagnose of ook therapeutisch?” Deze vragen zijn terechte bekommernissen. De “bedreiging” van deze
evoluties hangt niet alleen af van de wetenschap, maar ook van de maatschappij. Het doel van de
wetenschap en de genetica in het bijzonder is om de mensen te helpen, niet om een superras te creëren en
eveneens niet om mensen te discrimineren. Mensen helpen kan op een zeer uitgebreide manier
geïnterpreteerd worden. De evolutie in de genetica moet zeker niet gestopt worden vanwege deze
bedreigingen, maar er moet bij elke stap die genomen wordt op zijn minst gereflecteerd worden over
welke impact nieuwe technieken kunnen hebben en hoe men zich kan wapenen tegen misbruik ervan. Een
uitgebreide ethische discussie is dus zeker op zijn plaats, maar valt buiten het bestek van deze
masterproef.
7.6 BESLUIT
Deze masterproef ontwikkelde een gestandaardiseerde papieren en elektronische checklist waarin
fenotypische en genotypische gegevens van 320 patiënten werden verwerkt. Ondersteund door
wetenschappelijke literatuur en internationale databanken werden deze gegevens geïnterpreteerd. Deze
checklists en methode kunnen in de toekomst aangevuld worden met nieuwe gegevens van het UZ Gent
en opnieuw gebruikt worden om array-CGH-resultaten te interpreteren en wetenschappelijk onderzoek te
verrichten. Idealiter kan deze masterproef bijdragen in het verdere onderzoek naar nieuwe syndromen,
genotype/fenotype associaties en causale genen voor fenotypische afwijkingen.
De fenotype/genotype studie over mentale beperking en congenitale hartafwijkingen besluit dat
genetisch onderzoek bij deze aandoeningen geïndiceerd en nuttig kan zijn, maar bij vele patiënten geen
uitsluitsel geeft m.b.t. de klinische betekenis van vastgestelde afwijkingen.
Vijf chromosomale regio’s werden onderzocht in de genotype/fenotype studie. Alle regio’s zijn
interessante onderwerpen voor verder onderzoek. T.h.v. chromosoomband 1q21.1 werden twee clusters
beschreven. Over de eerste groep zijn reeds enkele studies verschenen, maar verder onderzoek is zeker
nodig om meer fenotypische afwijkingen te verklaren. Bij de tweede groep is verder onderzoek nodig naar
65
het mechanisme van het TAR-syndroom en naar atypische fenotypische kenmerken, zoals die voorkomen
in de patiëntencluster van deze studie. De cluster CNV’s ter hoogte van 2p16.3 omvat het NRXN1-gen. Dit
uit zich in een Pitt-Hopkinslike syndroom, wat predisponeert tot MR/taalontwikkelingsachterstand, ASS
en schizofrenie. Heterozygote CNV’s ter hoogte van 15q15.3 komen voor in 1,6% van een normale
populatie, maar zijn in deze onderzoekspopulatie gelinkt aan een variabel fenotype, waaronder mentale
beperking, hypotonie, huidaandoeningen, faciale dysmorfologie en colobomata. Ten slotte werd een
cluster van patiënten met een CNV van chromosoomband 16p12.1 bestudeerd. Klinische kenmerken die
mogelijks gecorreleerd zijn aan deze CNV’s zijn MR (UQCRC2), ASS (UQCRC2), hypotonie,
voedingsproblemen, schisis en oorafwijkingen. Via een “second hit”, predisponeren deze CNV’s eveneens
tot schizofrenie en andere neuropsychiatrische stoornissen.
De medische genetica omvat een groot potentieel, aangezien er nog steeds complexe vraagstukken
onopgelost zijn. Om dit potentieel uit te bouwen, is verder onderzoek naar betere technieken en
interpretatiemethodes cruciaal. Internationale samenwerking kan hierbij een efficiënt hulpmiddel zijn.
Ook het verder uitwerken van gentherapie als een veilige en doeltreffende behandelmethode creëert
mogelijkheden voor de toekomst. Wanneer de genetica een belangrijker onderdeel van het medisch
landschap wordt, kan dit een bijdrage leveren aan de algemene gezondheid van de mens. Toch blijft het
essentieel om voor elke nieuwe ontwikkeling de voor- en nadelen ervan te evalueren en hierbij zeker het
ethisch aspect niet uit het oog te verliezen.
66
8 REFERENTIES 1. De Paepe A. Medische genetica in de klinische praktijk. Tijdschrift voor Geneeskunde.
2010;66(21):1.
2. Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. Thompson & Thompson genetics in medicine, 7th
edition Elsevier Saunders, Philadelphia, 2007.
3. Pinkhof H. Geneeskundig woordenboek, 11de
druk. Boh Stafleu van Loghum, Houten, 1992.
Nussbaum RL. Thompson & Thompson genetics in medicine. 2004.
4. Allanson JE, Biesecker LG, Carey JC, Hennekam RC. Elements of morphology: introduction. Am
J Med Genet A. 2009;149A(1):2-5. Epub 2009/01/08.
5. Hunter A, Frias JL, Gillessen-Kaesbach G, Hughes H, Jones KL, Wilson L. Elements of
Morphology: Standard Terminology for the Ear. Am J Med Genet A. 2009;149A(1):40-60.
6. Niermeijer M. Geschiedenis van de klinische genetica. Bijblijven. 2011;27(9):7.
7. de Nijs BS-S, C.T.R.M. Klinische genetica (1): enkele historische highlights patient care.
2000;27(3):6.
8. Langer-Safer PR, Levine M, Ward DC. Immunological method for mapping genes on Drosophila
polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79(14):4381-5. Epub 1982/07/01.
9. Buysse K. Molecular karytopying: a powerful tool for the study of genomic defects in patients
with mental retardation. Ghent: University of Ghent; 2009.
10. Menten B. High resolution DNA copy number analysis of constitutional chromosomal aberrations
in human genomic disorders. Ghent: University of Ghent; 2007.
11. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, et al. Comparative
genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science. 1992;258(5083):818-
21. Epub 1992/10/30.
12. Shinawi M, Cheung SW. The array CGH and its clinical applications. Drug discovery today.
2008;13(17-18):760-70. Epub 2008/07/12.
13. Betere Diagnostiek voor MCA/MR patiënten. Leids universitair medisch centrum Utrecht; 2010.
14. van Binsbergen E. Origins and breakpoint analyses of copy number variations: up close and
personal. Cytogenetic and genome research. 2011;135(3-4):271-6. Epub 2011/08/19.
15. Li X, Tan LJ, Liu XG, Lei SF, Yang TL, Chen XD, et al. A genome wide association study
between copy number variation (CNV) and human height in Chinese population. J Genet Genomics.
2010;37(12):779-85.
16. Antonacci F, Kidd JM, Marques-Bonet T, Teague B, Ventura M, Girirajan S, et al. A large and
complex structural polymorphism at 16p12.1 underlies microdeletion disease risk. Nat Genet.
2010;42(9):745-U29.
17. Menten B, Buysse K, Zahir F, Hellemans J, Hamilton SJ, Costa T, et al. Osteopoikilosis, short
stature and mental retardation as key features of a new microdeletion syndrome on 12q14. J Med Genet.
2007;44(4):264-8. Epub 2007/01/16.
18. Buysse K, Reardon W, Mehta L, Costa T, Fagerstrom C, Kingsbury DJ, et al. The 12q14
microdeletion syndrome: additional patients and further evidence that HMGA2 is an important genetic
determinant for human height. Eur J Med Genet. 2009;52(2-3):101-7. Epub 2009/03/21.
19. Mari F, Hermanns P, Giovannucci-Uzielli ML, Galluzzi F, Scott D, Lee B, et al. Refinement of the
12q14 microdeletion syndrome: primordial dwarfism and developmental delay with or without
osteopoikilosis. Eur J Hum Genet. 2009;17(9):1141-7. Epub 2009/03/12.
20. Lynch SA, Foulds N, Thuresson AC, Collins AL, Anneren G, Hedberg BO, et al. The 12q14
microdeletion syndrome: six new cases confirming the role of HMGA2 in growth. Eur J Hum Genet.
2011;19(5):534-9. Epub 2011/01/27.
21. Kingston HM. Abc of Clinical Genetics - Clinical Genetic Services. Brit Med J.
1989;298(6669):306-8.
22. Reardon W, Donnai D. Dysmorphology demystified. Arch Dis Child-Fetal. 2007;92(3):F225-F9.
67
23. Puri RD, Verma IC. Dysmorphology diagnosis. Indian journal of pediatrics. 2004;71(6):535-9.
Epub 2004/07/01.
24. Hunter AGW. Medical genetics: 2. The diagnostic approach to the child with dysmorphic signs.
Can Med Assoc J. 2002;167(4):367-72.
25. Allanson JE, Cunniff C, Hoyme HE, McGaughran J, Muenke M, Neri G. Elements of
morphology: standard terminology for the head and face. Am J Med Genet A. 2009;149A(1):6-28. Epub
2009/01/07.
26. Health USDoEatNIo. Human Genome Project information. [Internet] 2011 [updated 25/06/2011;
cited 2012 25/03/2012]; Available from:
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml.
27. Gent CvMG. Centrum Medische Genetica. [Internet] 2012; Available from: medgen.ugent.be.
28. Firth HV, Richards SM, Bevan AP, Clayton S, Corpas M, Rajan D, et al. DECIPHER: Database of
Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources. American journal of
human genetics. 2009;84(4):524-33. Epub 2009/04/07.
29. Corpas M, Richards S, Bevan AP, Van Vooren S, Pettett RM, Firth HV, et al. DECIPHER:
Shedding Light on Chromosomal Imbalance and Phenotype Interpretation. Chromosome Res. 2009;17:13-
4.
30. Firth H, Pettet RM, Bevan AP, Carter NP, Cox AV. DECIPHER - A new clinical and research tool
for the genomic array era. J Med Genet. 2004;41:S15-S.
31. Zhang J, Feuk L, Duggan GE, Khaja R, Scherer SW. Development of bioinformatics resources for
display and analysis of copy number and other structural variants in the human genome. Cytogenetic and
genome research. 2006;115(3-4):205-14.
32. Buysse K, Delle Chiaie B, Van Coster R, Loeys B, De Paepe A, Mortier G, et al. Challenges for
CNV interpretation in clinical molecular karyotyping: Lessons learned from a 1001 sample experience.
Eur J Med Genet. 2009;52(6):398-403.
33. Firth HH, J. . Dysmorphology examination checklist Oxford Desk Reference Clinical Genetics.
Oxford New York Oxford University Press; 2005. p. 670.
34. Scriver CR, Neal JL, Saginur R, Clow A. The frequency of genetic disease and congenital
malformation among patients in a pediatric hospital. Can Med Assoc J. 1973;108(9):1111-5. Epub
1973/05/05.
35. Biesecker LG, Aase JM, Clericuzio C, Gurrieri F, Temple IK, Toriello H. Elements of
morphology: standard terminology for the hands and feet. American journal of medical genetics Part A.
2009;149A(1):93-127. Epub 2009/01/07.
36. Carey JC, Cohen MM, Jr., Curry CJ, Devriendt K, Holmes LB, Verloes A. Elements of
morphology: standard terminology for the lips, mouth, and oral region. Am J Med Genet A.
2009;149A(1):77-92. Epub 2009/01/07.
37. Hall BD, Graham JM, Jr., Cassidy SB, Opitz JM. Elements of morphology: standard terminology
for the periorbital region. Am J Med Genet A. 2009;149A(1):29-39. Epub 2009/01/07.
38. Hennekam RC, Cormier-Daire V, Hall JG, Mehes K, Patton M, Stevenson RE. Elements of
morphology: standard terminology for the nose and philtrum. Am J Med Genet A. 2009;149A(1):61-76.
Epub 2009/01/20.
39. de Onis M, Martorell R, Garza C, Lartey A, Reference WMG. WHO Child Growth Standards
based on length/height, weight and age. Acta Paediatr. 2006;95:76-85.
40. Medicine M-NIoG. Online Mendelian Inheritance in Man. [Internet] 1995 [updated 18/04/2012;
cited 2012 19/04/2012]; Available from: http://omim.org/about.
41. Zahir FR, Baross A, Delaney AD, Eydoux P, Fernandes ND, Pugh T, et al. A patient with
vertebral, cognitive and behavioural abnormalities and a de novo deletion of NRXN1 alpha. J Med Genet.
2008;45(4):239-43.
42. Zweier C, de Jong EK, Zweier M, Orrico A, Ousager LB, Collins AL, et al. CNTNAP2 and
NRXN1 Are Mutated in Autosomal-Recessive Pitt-Hopkins-like Mental Retardation and Determine the
Level of a Common Synaptic Protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 2009;85(5):655-66.
68
43. Knijnenburg J, Oberstein SAJL, Frei K, Lucas T, Gijsbers ACJ, Ruivenkamp CAL, et al. A
homozygous deletion of a normal variation locus in a patient with hearing loss from non-consanguineous
parents. J Med Genet. 2009;46(6):412-7.
44. Ben-Shachar S, Ou Z, Shaw CA, Belmont JW, Patel MS, Hummel M, et al. 22q11.2 distal
deletion: A recurrent genomic disorder distinct from DiGeorge syndrome and velocardiofacial syndrome.
Am J Hum Genet. 2008;82(1):214-21.
45. Stevenson RE, Procopio-Allen AM, Schroer RJ, Collins JS. Genetic syndromes among individuals
with mental retardation. Am J Med Genet A. 2003;123A(1):29-32.
46. Southard AE, Edelmann LJ, Gelb BD. Role of copy number variants in structural birth defects.
Pediatrics. 2012;129(4):755-63. Epub 2012/03/21.
47. Mefford HC, Sharp AJ, Baker C, Itsara A, Jiang Z, Buysse K, et al. Recurrent rearrangements of
chromosome 1q21.1 and variable pediatric phenotypes. The New England journal of medicine.
2008;359(16):1685-99. Epub 2008/09/12.
48. Girirajan S, Eichler EE. Phenotypic variability and genetic susceptibility to genomic disorders.
Hum Mol Genet. 2010;19(R2):R176-87. Epub 2010/09/03.
49. Mefford HC, Batshaw ML, Hoffman EP. Genomics, intellectual disability, and autism. The New
England journal of medicine. 2012;366(8):733-43. Epub 2012/02/24.
50. Brunetti-Pierri N, Berg JS, Scaglia F, Belmont J, Bacino CA, Sahoo T, et al. Recurrent reciprocal
1q21.1 deletions and duplications associated with microcephaly or macrocephaly and developmental and
behavioral abnormalities. Nat Genet. 2008;40(12):1466-71. Epub 2008/11/26.
51. Stone JL, O'Donovan MC, Gurling H, Kirov GK, Blackwood DHR, Corvin A, et al. Rare
chromosomal deletions and duplications increase risk of schizophrenia. Nature. 2008;455(7210):237-41.
52. Mefford HCB, M.L. Hoffman, E.P. Genomics, intellectual disability, and autism. The New
England journal of medicine. 2012(366):11.
53. White TW, Goodenough DA, Paul DL. Targeted ablation of connexin50 in mice results in
microphthalmia and zonular pulverulent cataracts. J Cell Biol. 1998;143(3):815-25. Epub 1998/11/13.
54. Berry V, Mackay D, Khaliq S, Francis PJ, Hameed A, Anwar K, et al. Connexin 50 mutation in a
family with congenital "zonular nuclear" pulverulent cataract of Pakistani origin. Hum Genet. 1999;105(1-
2):168-70. Epub 1999/09/10.
55. Polyakov AV, Shagina IA, Khlebnikova OV, Evgrafov OV. Mutation in the connexin 50 gene
(GJA8) in a Russian family with zonular pulverulent cataract. Clin Genet. 2001;60(6):476-8. Epub
2002/02/16.
56. Devi RR, Vijayalakshmi P. Novel mutations in GJA8 associated with autosomal dominant
congenital cataract and microcornea. Molecular vision. 2006;12:190-5. Epub 2006/04/11.
57. Willoughby CE, Arab S, Gandhi R, Zeinali S, Luk D, Billingsley G, et al. A novel GJA8 mutation
in an Iranian family with progressive autosomal dominant congenital nuclear cataract. J Med Genet.
2003;40(11):e124. Epub 2003/11/25.
58. Chang B, Wang X, Hawes NL, Ojakian R, Davisson MT, Lo WK, et al. A Gja8 (Cx50) point
mutation causes an alteration of alpha 3 connexin (Cx46) in semi-dominant cataracts of Lop10 mice. Hum
Mol Genet. 2002;11(5):507-13. Epub 2002/03/05.
59. He W, Li X, Chen J, Xu L, Zhang F, Dai Q, et al. Genetic linkage analyses and Cx50 mutation
detection in a large multiplex Chinese family with hereditary nuclear cataract. Ophthalmic genetics.
2011;32(1):48-53. Epub 2010/12/23.
60. Yang YQ, Liu X, Zhang XL, Wang XH, Tan HW, Shi HF, et al. Novel connexin40 missense
mutations in patients with familial atrial fibrillation. Europace. 2010;12(10):1421-7.
61. Wirka RC, Gore S, Van Wagoner DR, Arking DE, Lubitz SA, Lunetta KL, et al. A common
connexin-40 gene promoter variant affects connexin-40 expression in human atria and is associated with
atrial fibrillation. Circulation Arrhythmia and electrophysiology. 2011;4(1):87-93. Epub 2010/11/16.
62. Lampe PD, Lau AF. Regulation of gap junctions by phosphorylation of connexins. Archives of
biochemistry and biophysics. 2000;384(2):205-15. Epub 2001/05/23.
69
63. Christiansen J, Dyck JD, Elyas BG, Lilley M, Bamforth JS, Hicks M, et al. Chromosome 1q21.1
contiguous gene deletion is associated with congenital heart disease. Circ Res. 2004;94(11):1429-35.
64. Harvard C, Strong E, Mercier E, Colnaghi R, Alcantara D, Chow E, et al. Understanding the
impact of 1q21.1 copy number variant. Orphanet J Rare Dis. 2011;6.
65. Deng WB. PARylation: Strengthening the Connection between Cancer and Pluripotency. Cell
Stem Cell. 2009;5(4):349-50.
66. Kramer JM, van Bokhoven H. Genetic and epigenetic defects in mental retardation. Int J Biochem
Cell B. 2009;41(1):96-107.
67. Ronnett GV, Ramamurthy S, Kleman AM, Landree LE, Aja S. AMPK in the brain: its roles in
energy balance and neuroprotection. Journal of neurochemistry. 2009;109 Suppl 1:17-23. Epub
2009/05/07.
68. Greenhalgh KL, Howell RT, Bottani A, Ancliff PJ, Brunner HG, Verschuuren-Bemelmans CC, et
al. Thrombocytopenia-absent radius syndrome: a clinical genetic study. J Med Genet. 2002;39(12):876-81.
69. Klopocki E, Schulze H, Strauss G, Ott CE, Hall J, Trotier F, et al. Complex inheritance pattern
involving a microdeletion in thrombocytopenia-absent radius (TAR) syndrome. Cell Oncol.
2007;29(2):113-.
70. Klopocki E, Schulze H, Strauss G, Ott CE, Hall J, Trotier F, et al. Complex inheritance pattern
resembling autosomal recessive inheritance involving a microdeletion in thrombocytopenia-absent radius
syndrome. Am J Hum Genet. 2007;80(2):232-40. Epub 2007/01/20.
71. Li X, Baumgart E, Morrell JC, Jimenez-Sanchez G, Valle D, Gould SJ. PEX11 beta deficiency is
lethal and impairs neuronal migration but does not abrogate peroxisome function. Molecular and cellular
biology. 2002;22(12):4358-65. Epub 2002/05/25.
72. Steinberg SJ, Raymond GV, Braverman NE, Moser AB. Peroxisome Biogenesis Disorders,
Zellweger Syndrome Spectrum. In: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, Stephens K, Adam MP, editors.
GeneReviews. Seattle (WA)1993.
73. Voineskos AN, Lett TAP, Lerch JP, Tiwari AK, Ameis SH, Rajji TK, et al. Neurexin-1 and
Frontal Lobe White Matter: An Overlapping Intermediate Phenotype for Schizophrenia and Autism
Spectrum Disorders. Plos One. 2011;6(6).
74. Ching MSL, Shen YP, Tan WH, Jeste SS, Morrow EM, Chen XL, et al. Deletions of NRXN1
(Neurexin-1) Predispose to a Wide Spectrum of Developmental Disorders. Am J Med Genet B.
2010;153B(4):937-47.
75. Yan J, Noltner K, Feng JN, Li WY, Schroer R, Skinner C, et al. Neurexin 1 alpha structural
variants associated with autism. Neurosci Lett. 2008;438(3):368-70.
76. Chance PF, Cavalier L, Satran D, Pellegrino JE, Koenig M, Dobyns WB. Clinical nosologic and
genetic aspects of Joubert and related syndromes. J Child Neurol. 1999;14(10):660-6.
77. Zhang Y, Malekpour M, Al-Madani N, Kahrizi K, Zanganeh M, Mohseni M, et al. Sensorineural
deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. J Med Genet. 2007;44(4):233-40.
78. Girirajan S, Rosenfeld JA, Cooper GM, Antonacci F, Siswara P, Itsara A, et al. A recurrent
16p12.1 microdeletion supports a two-hit model for severe developmental delay. Nat Genet.
2010;42(3):203-9. Epub 2010/02/16.
79. . !!! INVALID CITATION !!!
80. Hempel M, Rivera Brugues N, Wagenstaller J, Lederer G, Weitensteiner A, Seidel H, et al.
Microdeletion syndrome 16p11.2-p12.2: clinical and molecular characterization. Am J Med Genet A.
2009;149A(10):2106-12. Epub 2009/08/14.
81. Amberger J, Bocchini C, Hamosh A. A New Face and New Challenges for Online Mendelian
Inheritance in Man (OMIM (R)). Human mutation. 2011;32(5):564-7.
82. Institute TS. Decipher v5.1. [Internet] 2012 [cited 2012 28/03/2012]; Available from:
http://decipher.sanger.ac.uk/.
I
BIJLAGEN
BIJLAGE I: PAPIEREN CHECKLIST
Checklist clinical features
Doctor's name Date:
General Data: First name Surname:
Date of birth: Age:
Obstetric history mother:
Prenatal history: spontaneous pregnancy/stimulation/IVF/ICSI echography: infection/drugs: other:
Personal history:
Perinatal history: Delivery: spontaneous/induced/vacuum extraction/sectio caesarea
Term:
Apgar-scores: 1’ 5’ 10’
Weight: (P ), Length : (P ), OFC: (P ) Neonatal history: Gastro-enterology: Malformations:
Nutrition: normal/ feeding problems/reflux/allergy/other:
Stool: normal/constipation/diarrhea
Investigations:
Staturoponderal development: Growth:
Bone age:
Skeletal radiographies:
Cardiology: normal/ASD / VSD / Fallot’s tetralogy / hypertrophy/other:
Surgery: Investigations:
Respiratory: normal/recurrent infections / asthma / laryngo-tracheomalacia/malformations/other:
Investigations:
Ophthalmology: Visus: normal/hypermetropia / myopia /strabism/other:
ERG:
II
ENT: Hearing: normal/conductive-sensorineural-combined deafness Other: Surgery: Urinary system: Malformations:
Enuresis:
Neurology: Motor development (milestones):
Cognitive development:
Language development:
School type:
Stimulation: kinesitherapy/ergotherapy/logopedia
Behaviour: ASS / ADHD / agressivity / eating disorder / stereotypic movements /other:
Sleeping disorder:
Epilepsy: EEG:
Brain MRI/CT
Skin/Muscle biopsy:
Metabolic investigations:
Immunology: Immune deficiency/other:
Endocrinology: normal/diabetes mellitus/thyroid problems/other:
Hematology: normal/clotting disorder/anemia/leucopenia/other:
Family history (see family tree)
Consanguinity:
Clinical examination
Weight: (P ) Length: (P ) OFC: (P )
Span: Lower segment: Hand length:
Built (dis)proportionate/obesity /slender / muscular
Skin Texture: dry/soft/wrinkling/elastic/cutis laxa
Pigmentation:
Hemangioma:
Hair and nails:
Other:
III
Head & neck
Cranium: normal/microcephaly/macrocephaly/brachycephaly/other:
Fontanel:
Face
Forehead: normal/small/high/bossing/hirsutism/temporal narrowing/other:
Eyes: Position: normal/hypo -hypertelorism/deep-set/prominent
OC: IC: IP:
Eye movements: normal/absent/nystagmus/strabism/other:
Eyelids: normal/up-downslanting/ptosis/epicanthal folds/everted/other:
Eyebrows: normal/arched/straight/sparse/brushy/synophrys Eyelashes: normal/sparse/long/curly/absent
Nose: normal/short/long/bulbous/other:
flat/high nasal bridge
Nostrils: normal/anteverted/small
Philtrum: normal/long/short/smooth/other:
Mouth : General: normal/microstomia/macrostomia
Lips: normal/thin/full/everted/uni-bilateral cleft/other:
Palate: normal/ogival/cleft soft-hard palate
Uvula: normal/bifid/broad
Chin: normal/micro-prognathia/other:
Ears: Shape: normal/microtia/other:
Position: normal/low-set/posteriorly rotated/protruding
Pits or tags:
Neck: normal/short/webbed
Thorax General morphology: normal/pectus carinatum-excavatum /other:
Nipples: normal/inverted/widely spaced/other:
Back: normal/scoliosis/hyperlordosis/kyphosis/other:
Heart: normal/murmur
Respiratory: normal/wheezing/stridor
IV
Abdomen & Pelvis General: normal/umbilical or inguinal hernia/striae/other:
Hepato-splenomegaly
Genitalia: normal/virilisation/ undescended testes/ hypospadias/other:
Limbs General: joint hyperlaxity/stiffness
Beighton score:
Upper limbs : Hands: campto-clino-arachno-syn-oligo-
polydactyly
Lower limbs: Feet: syn-oligo-polydactyly
Palmar and plantal creases:
Neurology
Muscle tone: normal/hypotonia / hypertonia
Reflexes: normal/increased/diminished
Gait:
Behaviour: normal/autistic-like/hyperkinetic/passive/ agressive / stereotypic movements /other:
Differential diagnosis:
Additional investigations:
Photographs: yes/no
Informed consent: photographs: yes/no DECIPHER: yes/no
V
BIJLAGE II: OVERZICHT PATIËNTEN UIT DE RESULTATEN
Naam patiënt Chromosoomband Breekpunt 1 Breekpunt 2 Soort CNV
Patiënt 1 1q21.1 144525208 147076428 Pat del
Patiënt 2 1q21.1 144745814 146294654 ? del
Patiënt 3 1q21.1 144126547 144454797 ? del
Patiënt 4 1q21.1 144126547 144475812 Pat del
Patiënt 5 2p16.3 50987317 51110512 Pat del
Patiënt 6 2p16.3 50915065 50982361 ? del
Patiënt 7 2p16.3 50996353 51212326 Mat del
Patiënt 8 15q15.3 41676219 41738539 ? del
Patiënt 9 15q15.3 41676219 41738539 Mat del
Patiënt 10 15q15.3 41638840 41738539 Mat del
Patiënt 11 15q15.3 41704264 41778405 Pat del
Patiënt 12 15q15.3 41704264 41778405 Pat del
Patiënt 13 16p12.1 21713820 22355674 ? del
Patiënt 14 16p12.1 21713820 22315373 ? del Noot. CNV: Copy Number Variant, pat: paternaal, mat: maternaal, del: deletie, ?: overerving onbekend.
VI
BIJLAGE III: SCHRIFTELIJKE TOESTEMMING VOOR GEBRUIK VAN
FIGUUR 1 EN FIGUUR 12
FIGUUR 1:
Prof. Dr. Ir. Björn Menten, promotor van deze masterproef, geeft de toestemming tot gebruik van de
figuur i.v.m. array-CGH. Het betreft Figuur 1.3 – Principle of array CGH: test and control DNA is
differentially labeled with fluorochromes. The DNA is denaturated and mixed with Ct-1 DNA to block
repetitive sequences. The mixture is subsequently put on a glass slide with immobilized DNA reporters
and hybridized. Fluorescence intensities are measured with a laser scanner and dedicated software.
Bron: Menten B. High resolution DNA copy number analysis of constitutional chromosomal aberrations
in human genomic disorders. Ghent: University of Ghent; 2007.
Datum: Handtekening:
FIGUUR 12:
> Subject: RE: Copyright figure about 16p12.1
> Date: Mon, 23 Apr 2012 10:54:11 -0400
> From: [email protected]
> To: [email protected]; [email protected]
> CC: [email protected]
>
> Dear Karel and Sara,
>
> Yes, you have the journal's permission to use Figure 2 from the below mentioned article for the
purposes of this essay provided that you cite the original publication as the source of the figure.
>
> With best regards,
> Kyle
>
>
> Kyle Vogan, Ph.D.
> Senior Editor, Nature Genetics
>
>
> -----Original Message-----
> From: Evan Eichler [mailto:[email protected]]
> Sent: Sunday, April 22, 2012 3:00 PM
> To: Sara David
> Cc: [email protected]; Vogan, Kyle
> Subject: Re: Copyright figure about 16p12.1
VII
>
> Of you have my permission but I share copyright
> with the journal. You will also need to get
> Nature Genetics permission, which should not be
> problem. I have cc'd Kyle Vogan who can forward
> your request on the appropriate person there.
>
> Kind regards
> Evan Eichler
>
> At 09:33 AM 4/22/2012, Sara David wrote:
> >Dear Dr. Eichler,
> >
> >We are two Belgian medical students, writing an essay in the programme
> >of the second year of Master in Medicine, University of Ghent. In the
> >essay, we discuss genotype/fenotype correlations of 16p12.1
> >microdeletions. Reading the publication in Nature Genetics from 2010
> >March was most interesting: A recurrent 16p12.1 microdeletion suggests
> >a two-hit model for severe developmental delay.
> >
> >Our question to You is a permission to use Figure 2, subject to the
> >copyright laws and, of course, extensively specifying the source.
> >
> >yours sincerely,
> >
> >Karel Maelegheer
> >Sara David
> >Medical Students, second year of Master in Medicine, University of Ghent
> >Promotor of the essay: Prof. dr. ir. Björn Menten
> >
