ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING VAN...

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING

ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

UNIVERSITEIT GENT


Vakgroep Bioanalyse

Laboratorium voor Bromatologie

Academiejaar 2009-2010

ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING VAN

ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN VIA LC-MS/MS

Maaike DE PAUW

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor Dr. C. Van Poucke

Commissarissen Prof. C. Van Peteghem Dr. K. Van Uytfanghe


ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VAN

ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN

DANKWOORD

Deze thesis kon slechts tot stand komen dankzij

de hulp en steun van verschillende mensen. Bijzondere dank gaat uit naar mijn promotor en begeleider,

Dr. C. Van Poucke, voor het interessante onderwerp, de goede begeleiding en het kritisch verbeteren van de tekst.

Daarnaast ook een gemeend woord van dank aan de commissarissen, Prof. C. Van Peteghem en Dr. K. Van Uytfanghe,

voor het kritisch evalueren van de thesis. Bijkomend wil ik Prof. C. Van Peteghem en Prof. S. De Saeger

Bedanken voor het ter beschikking stellen van het laboratorium. Verder wil ik ook mijn medestudenten bedanken en

alle medewerkers van het laboratorium. Tenslotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken

voor hun morele steun gedurende de voorbije maanden.

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING ........................................................................................................... 1

1.1. SITUERING ................................................................................................... 1

1.2. ANTIBIOTICA ................................................................................................ 1

1.2.1. Algemeen .......................................... ..................................................... 1

1.2.2. Werkingsmechanismen ............................... ......................................... 2

1.2.3. Resistentie ....................................... ...................................................... 4

1.3. DIERGENEESKUNDE .................................................................................. 6

1.3.1. Klassen antibiotica ............................... ................................................ 6

1.3.2. Coccidiostatica ................................... ................................................ 11

1.4. VOEDSELVEILIGHEID ............................................................................... 11

1.4.1. Prioriteren ....................................... ..................................................... 11

1.4.2. Wetgeving ......................................... ................................................... 12

1.4.3. Analysemethoden ................................... ............................................ 13

2. OBJECTIEVEN ....................................... ........................................................... 15

3. MATERIAAL EN METHODEN.............................. ............................................. 16

3.1. MATERIAAL ................................................................................................ 16

3.1.1. Antibiotica ....................................... .................................................... 16

3.1.2. Reagentia ......................................... .................................................... 17

3.1.3. Instrumenten ...................................... ................................................. 17

3.2. STANDAARD OPLOSSINGEN ................................................................... 17

3.2.1. Standaard stockoplossingen ........................ ..................................... 17

3.2.2. Tuneoplossingen ................................... ............................................. 18

3.2.3. Standaard mengsels ................................ ........................................... 18

3.3. UPLC-MS/MS .............................................................................................. 20

3.3.1. Principe .......................................... ...................................................... 20

3.3.2. Praktische uitvoering ............................. ............................................ 24

3.4. STAALVOORBEREIDING ........................................................................... 25

3.4.1. Extractie & clean-up experimenten ................. .................................. 25

3.4.2. Pre-validatie: inschatting gevoeligheid............ ................................. 28

3.4.3. Extra testen ...................................... ................................................... 30

3.4.4. Finale procedure voor extractie en clean-up ....... ............................. 30

3.5. VALIDATIE .................................................................................................. 30

3.5.1. Selectiviteit ..................................... ..................................................... 30

3.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding e n intra-lab

reproduceerbaarheid ............................... ...................................................... 31

4. RESULTATEN & DISCUSSIE ............................ ............................................... 33

4.1. TUNEN ........................................................................................................ 33

4.2. EXTRACTIE EN CLEAN-UP EXPERIMENTEN .......................................... 35

4.3. PRE-VALIDATIE.......................................................................................... 37

4.4. EXTRA TESTEN ......................................................................................... 38

4.5. VALIDATIE .................................................................................................. 39

4.5.1. Selectiviteit ..................................... ..................................................... 39

4.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding e n intra-lab

reproduceerbaarheid ............................... ...................................................... 40

4.5.3. Conclusie validatie ............................... .............................................. 47

4.6. VERDER ONDERZOEK .............................................................................. 48

5. CONCLUSIE ...................................................................................................... 49

6. LITERATUURSLIJST .................................. ...................................................... 51

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

4EACTC: 4epi-anhydro-chloortetracycline 4EAT: 4epi-anhydro-tetracycline 4ECTC: 4epi-chloortetracycline 4ET: 4epi-tetracycline ACN: Acetonitrille ACTC : Anhydro-chloortetracycline AHT: Anhydrotetracycline AMOX: Amoxicilline AMP: Amprolium API: Atmospheric pressure ionisation BAC: Bacitracine BEH: Bridged ethane hybrid COC: Coccidiostatica CTC: Chloortetracycline CV: Variatiecoëfficiënt CVr: Variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid CVR: Intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt DC: Doxycycline DHPS : Dihydropteroaat synthetase DIC: Diclazuril DIV: Diverse mengsel met macroliden, stretograminen, β-lactam antibiotica en polypeptiden DMC: Demeclocycline DMF: Dimethylformamide DMSO: Dimethylsulfoxide DNA: Desoxyribonucleïnezuur DNC: 4,4’-dinitrocarbanilide EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur ESI: Elektrospray ionisatie FA: Formic acid HLB: Hydrofiele-lipofiele balans HPLC: High performance liquid chromatography ICT: Isochloortetracycline LAS A : Lasalocid A LC: Liquid chromatography LOD: Detectielimiet LOQ: Kwantificatielimiet m/z: massa/lading MeOH: Methanol MON: Monensine MRL: Maximum residu limiet

MRM: Multiple reaction monitoring MRPL: Minimale vereiste prestatielimieten MS: Massaspectrometer N4AS: N4-acetyl-sulfamethazine NAR: Narasine NIC: Nicarbazine OTC: Oxytetracycline PBP: Penicilline bindende proteïnes PEN G: Penicilline G Q1: Quadrupool 1 Q2: Quadrupool 2 RNA: Ribonucleïnezuur SAL: Salinomycine SA : Sulfonamide SCP: Sulfachloropyridazine SDM: Sulfadimethoxine SDX: Sulfadoxine SDZ: Sulfadiazine SGD: Sulfaguanidine SIX: Sulfisoxazole SMP: Sulfamethoxypyridazine SMR: Sulfamerazine SMT: Sulfamethazine SMTX: Sulfamethoxazol SMZ: Sulfamethizol S/N: Signaal/ruis SPD: Sulfapyridine SPE: Solid phase extraction SPI: Spiramycine SQX: Sulfaquinoxaline STZ: Sulfathiazole TC: Tetracycline TRI: Trimethoprim TYL: Tylosine UPLC: Ultra performance liquid chromatography VGM: Virginiamycine

1

1. INLEIDING

1.1. SITUERING

Antibiotica worden intensief gebruikt bij dieren: therapeutisch of preventief om

infecties te bestrijden of als groeipromotor (Ungemach et al., 2006). Lage

hoeveelheden zorgen voor de selectie van antibioticaresistente stammen in het

milieu. Bovendien is er vaak onvolledige absorptie uit het gastro-intestinaal stelsel

waardoor antibiotica in de faeces en urine terechtkomen. Op deze manier komt

ongeveer 90% van bepaalde antibiotica onveranderd terecht in mest. In de landbouw

wordt mest universeel gebruikt op gewassen omwille van de voedingswaarde en als

manier om overtollige hoeveelheden kwijt te geraken. Alhoewel er richtlijnen zijn

omtrent bemesting in functie van de noden van de gewassen en de bodem, worden

deze toch niet altijd gevolgd. De aanwezige antibiotica in de mest zorgen voor

potentiële schade aan het milieu door resistentieontwikkeling en toxiciteit aan fauna

en flora (Kumar et al., 2005).

Veel gebruikte antibiotica zijn bijvoorbeeld tetracyclines, tylosine, sulfamethazine,

amprolium, monensine, virginiamycine, penicilline en nicarbazine. Ze blijven meestal

stabiel bij bewaren van de mest en komen zo op de gewassen terecht. Kumar et al.

(2005) toonde de opname van antibiotica, afkomstig van mest, door planten aan in

laboratoriumomstandigheden. Dit resultaat deed een aantal nieuw vragen rijzen

omtrent allergische reacties, toxische reacties, interacties en resistentieontwikkeling

na de consumptie van groenten, die antibiotica kunnen opnemen uit mest (Kumar et

al., 2005).

1.2. ANTIBIOTICA

1.2.1. Algemeen

Antibiotica worden geproduceerd door schimmels en bacteriën, als

verdedigingsmechanisme tegen andere bacteriën. Naast de natuurlijk geproduceerde

antibiotica zijn er ook een hele reeks synthetische en semisynthetische.

Antibacteriële middelen hebben ofwel een bactericide werking, zullen dus micro-

organismen doden, of zijn bacteriostatisch, waarbij de groei van micro-organismen

verhinderd wordt. (Blasco et al., 2007). Ze worden toegediend bij mensen en dieren

om een infectie te helpen bestrijden, door bacteriën te doden of hun groei te

verhinderen. Het organisme krijgt zo de kans afweermechanismen in gang te zetten

om bacteriën te elimineren en om

Antibiotica genezen de infectie zelf dus

versnellen.

1.2.2. Werkingsmechanismen

Antibiotica werken in op een specifieke target, een aangrijpingspunt dat enkel bij

de bacterie voorkomt en niet of onder een andere vorm bij de gastheer (mens of dier).

Zo zijn er 5 grote aangrijpingspunten (

eiwitsynthese, het celmembraan, de nucleïnezuursynthese en de foliumzuursynthese

(Tenover, 2006; Chander et al., 2007)

FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA.(http://microblog.me.uk/wp

1.2.2.1. Inhibitie van de celwandsynthese

Bacteriën bestaan uit een celwand, opgebouwd uit een complexe structuur van

verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die

en zorgt voor het behoud van de celwandstructuur

Peptidoglycaan bestaat uit lange repeterende ketens van aminosuikers met

afwisselend N-acetylglucosamine en N

β-(1,4)-glycosidische binding

verbonden met een stikstof van een korte aminozuurketen

1972).


bacteriën te elimineren en om uiteindelijk te herstellen van een infectie.

Antibiotica genezen de infectie zelf dus niet, maar helpen om het genezingsproces te

Werkingsmechanismen



er 5 grote aangrijpingspunten (figuur 1.1.): de celwandsynthese, de


over, 2006; Chander et al., 2007).

FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA.http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/Antibiotic_actions.jpg, 13

Inhibitie van de celwandsynthese


verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die

en zorgt voor het behoud van de celwandstructuur (Blumberg & Strominger, 1974)


acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur, verbonden via

glycosidische bindingen. Elke N-acetylmuraminezuur is via een

verbonden met een stikstof van een korte aminozuurketen (Schleifer & Kandler,

2


uiteindelijk te herstellen van een infectie.

niet, maar helpen om het genezingsproces te



1.1.): de celwandsynthese, de


FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA. content/uploads/Antibiotic_actions.jpg, 13-03-2010)


verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die de cel verstevigt

(Blumberg & Strominger, 1974).


, verbonden via

een carboxylgroep

(Schleifer & Kandler,

3

Cross-linking tussen de verschillende ketens van aminosuikers gebeurt door de

korte aminozuurketens met behulp van een transpeptidase, een penicilline bindende

proteïne (PBP) (Blumberg & Strominger, 1974).

Eukaryoten hebben geen celwand, dus geen peptidoglycaan, hierdoor is de

synthese van het peptidoglycaan een geschikt aangrijpingspunt voor antibiotica.

Wanneer de biosynthese van peptidoglycaan verhinderd wordt, door het crosslinken

van peptidebindingen te voorkomen, wordt de celwand minder stevig, de cel lyseert

en de bacterie zal afsterven (Haggett & Wilson, 2008).

1.2.2.2. Inhibitie van de eiwitsynthese

Eiwitsynthese is universeel voorkomend en bestaat steeds uit een transcriptie-

en een translatiefase, met een initiatie-, elongatie- en terminatiestap, eventueel

gevolgd door verdere modificaties. Toch is er ook hier een goede target voor

antibiotica aangezien de structuur van de ribosomen, nodig voor de translatie,

varieert bij de verschillende organismen. Eukaryoten (zoals mens en dier) hebben

80S ribosomen, terwijl prokaryote organismen (bijvoorbeeld bacteriën) 70S

ribosomen hebben. Door in te werken op de subeenheden van 70S ribosomen kan

de intitiatie, elongatie of terminatie specifiek verhinderd worden. Wanneer er geen of

een onvolledig eiwit aangemaakt wordt, mist de bacterie essentiële onderdelen om te

overleven of te groeien (Haggett & Wilson, 2008).

1.2.2.3. Inhibitie van de nucleotidesynthese

De nucleïnezuursynthese kan geremd worden door de replicatie of de transcriptie

van DNA (desoxyribonucleïnezuur) te verhinderen. DNA-replicatie is de verdubbeling

van het DNA-materiaal voor de celdeling. Dit DNA wordt gedeeld onder de

dochtercellen. Omdat de inhibitie van de DNA-replicatie een weinig specifieke reactie

is zijn antibiotica die de DNA-replicatie remmen zeer toxisch en worden ze zo weinig

mogelijk gebruikt. Transcriptie is het ‘overschrijven’ van DNA naar RNA

(ribonucleïnezuur) voor de aanmaak van messenger-RNA, ribosomaal-RNA of

transport-RNA. Deze moleculen spelen een rol bij de eiwitsynthese. Door een

inhibitie van de transcriptie wordt ook de eiwitsynthese geïnhibeerd (Haggett &

Wilson, 2008).

4

1.2.2.4. Inhibitie van de foliumzuursynthese

Remming van de foliumzuursynthese zorgt voor de inhibitie van de

nucleotidensynthese, aangezien foliumzuur een belangrijke bouwsteen is voor de

aanmaak van nucleotiden. Inhibitie van de foliumzuursynthese is specifiek omdat

zoogdieren in staat zijn foliumzuur op te nemen via de voeding, terwijl mirco-

organismen zoals bacteriën deze volledig zelf moeten aanmaken. Afhankelijk van het

type antibioticum kan een verschillende stap in de synthese aangepakt worden

(Haggett & Wilson, 2008).

1.2.2.5. Beschadiging van het celmembraan

Het celmembraan is opgebouwd uit een fosfolipidedubbellaag met daarin

negatief geladen fosfaatgroepen. Antibiotica met positief geladen aminogroepen

kunnen hieraan elektrostatisch binden. Hierdoor worden Ca+ en Mg2+ moleculen die

de fosfolipiden stabiliseren verplaatst. De permeabiliteit wordt verstoord, nutriënten

ontsnappen en de bacterie sterft af. Antibiotica die inwerken op het celmembraan

hebben als nadeel dat ze weinig specifiek zijn. Eukaryote cellen hebben namelijk een

celmembraan met gelijkaardige samenstelling. Als gevolg van mogelijke toxiciteit

worden deze antibiotica zoveel mogelijk vermeden (Haggett & Wilson, 2008).

1.2.3. Resistentie

Resistentie is de eigenschap van bepaalde bacteriën om ongevoelig te worden

voor bepaalde antibiotica. Als het aangrijpingspunt ontbreekt, spreken we van

natuurlijke resistentie. Anders is er sprake van verworven resistentie, zoals

geïllustreerd in figuur 1.2. Verworven resistentie kan chromosomaal ontstaan bij een

mutatie in een bepaalde stam, gevolgd door selectie waarbij niet-gemuteerde

bacteriën afsterven, terwijl gemuteerde overleven. Er is dan sprake van verticale

evolutie (McDermott et al., 2002; Bennett, 2008).

Resistentie kan ook extrachromosomaal verworven worden. Nieuw genetisch

materiaal wordt van een ander micro-organisme overgedragen. Dit is de horizontale

gentransfer. Plasmiden kunnen resistentie overdragen via conjugatie, transductie of

transformatie. Een andere mogelijkheid is de transpositie van transposons, korte

stukjes DNA die op een chromosoom of een plasmide kunnen verspringen.

Door deze genetische uitwisseling is het mogelijk dat een bacterie resistent wordt

tegen verschillende klassen van antibiotica

contact gekomen zijn. Een bacterie kan zo multiresistent worden

2002; Bennett, 2008).

FIGUUR 1.2.: VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN.

1.2.3.1. Mechanismen

Er zijn uiteenlopende mechanismen voor verworven resistentie. Als eerste is er

de enzymatische inactivatie of modificatie van het antibioticum, waardoor het niet

meer in staat is in te werken op een target

kan de antibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,

het antibioticum wordt dan continu naar buiten gepompt. Analoog resultaat wordt

bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines

antibioticum kan niet opgenome

opname, aanwezig zijn. Op deze manier kan de intracellulaire target niet bereikt

worden. Gewijzigd metabolisme zorg

het antibioticum heeft zo geen target

andere mogelijkheid is overproducti

overmaat aan targets waarbij het antibioticum overrompeld

uitmaakt. Vaak komen verschillende mechanisme

2002; Tenover, 2006).


illende klassen van antibiotica en antibiotica waar ze

contact gekomen zijn. Een bacterie kan zo multiresistent worden (McDermott et al.,

VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN. (McDermott et al., 2002)



te werken op een target en de bacterie ongehinderd blijft. Verder

ntibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,


bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines

antibioticum kan niet opgenomen worden omdat er te weinig porines, kanalen voor


ewijzigd metabolisme zorgt voor een verandering in het aangrijpingspunt,

et antibioticum heeft zo geen target meer om op in te werken, dus geen effect

overproductie van de target door een bypass.

overmaat aan targets waarbij het antibioticum overrompeld wordt en zijn effect weinig

uitmaakt. Vaak komen verschillende mechanismen tegelijk voor (McDermott et al.,

5


en antibiotica waar ze zelfs niet mee in

(McDermott et al.,

VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN.



en de bacterie ongehinderd blijft. Verder

ntibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,


bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines. Het

te weinig porines, kanalen voor


ndering in het aangrijpingspunt,

om op in te werken, dus geen effect. Een

e van de target door een bypass. Er ontstaat een

en zijn effect weinig

(McDermott et al.,

6

1.2.3.2. Gevolgen

Wanneer antibiotica aan een lage concentratie toegediend worden, is er een

selectieve druk waardoor er resistentie ontstaat door wijzigingen in het DNA.

Bepalende factoren hierbij zijn doel, dosis, duur, toedieningsweg en

resistentiemechanisme van de bacterie. Door het overdreven gebruik van antibiotica

is er een versnelde ontwikkeling van resistentie. Die verhoogde tolerantie maakt het

moeilijker om bepaalde ziekten te bestrijden, het duurt langer om een bacterie te

isoleren en om de antibioticasusceptibiliteit te bepalen. Aangezien antibioticagebruik

een belangrijke hoeksteen is in de moderne geneeskunde kan een ziekte fataal

worden wanneer de behandelingsmogelijkheden uitgeput raken en bovendien is de

ontwikkeling van alternatieven duur (McDermott et al., 2002; Chander et al., 2007).

1.3. DIERGENEESKUNDE

1.3.1. Klassen antibiotica

Strikt genomen zijn er 5 klassen van antibiotica: β-lactam antibiotica,

tetracyclines, macroliden, aminoglycosiden en amfenicolen. Daarnaast wordt de term

antibiotica ook vaak gebruikt voor antibacteriële, gesynthetiseerde geneesmiddelen

(bijvoorbeeld sulfonamiden) of substanties met een hoog moleculair gewicht

(bijvoorbeeld polypeptide antibiotica) (Blasco et al., 2007). Chemisch

gesynthetiseerde antibiotica worden ook chemotherapeutica genoemd. Voor de

bespreking van een aantal klassen beperken we ons tot de antibiotica die relevant

zijn voor het onderzoek.

1.3.1.1. β-lactam antibiotica

β-lactam antibiotica zijn een uitzonderlijke groep antibiotica met een breed

spectrum en weinig toxiciteit voor dieren. Ze hebben een kenmerkende β-lactam ring

(figuur 1.3.) met daarop zijketens die van belang zijn voor chemische modificaties,

zoals bijvoorbeeld resistentie tegen β-lactamase enzymen die de β-lactam afbreken

(Blumberg & Strominger, 1974). Ze zijn bactericide door een inhibitie van de

celwandsynthese (Tenover, 2006; Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt

veroorzaakt door een β-lactamase die de β-lactamring opent met verlies van

bactericide activiteit, of door een gewijzigd PBP met lagere affiniteit voor de β-lactam

antibiotica (Li et al., 2007).

7

β-lactam antibiotica worden natuurlijk geproduceerd in schimmels. Penicillines

worden geproduceerd door Penicillum spp. en hebben goede activiteit tegen gram-

positieve bacteriën, uitgezonderd bepaalde Staphylococcus spp. Ze werken minder

tegen gram-negatieve bacteriën (Haggett & Wilson, 2008).

FIGUUR 1.3.: STRUCTUUR VAN PENICILLINE G (LINKS) MET KENMERKENDE Β-LACTAMRING (RECHTS).

1.3.1.2. Tetracyclines

Tetracyclines, die kenmerkend opgebouwd zijn uit vier partieel geconjugeerde

ringen met een carboxyamide als functionele groep (figuur 1.4.), binden reversibel op

de 30S subeenheid van het ribosoom. Zo inhiberen ze de vorming van het

inititatiecomplex bij de eiwitsynthese. Ze zijn bacteriostatisch tenzij bij hoge dosissen

(Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt bekomen door een effluxpomp (Tenover,

2006). Tetracyclines zijn werkzaam tegen zowel gram-positieve als gram-negatieve

bacteriën, op enkele uitzonderingen na zoals Pseudomonas spp. en Proteus spp.

(Haggett & Wilson, 2008). Ze worden natuurlijk geproduceerd door Streptomyces spp.

(Zakeri & Wright, 2008). Wanneer tetracyclines blootgesteld worden aan extreme

condities van warmte, pH of vochtigheid, vormen ze degradatieproducten omwille

van epimerisatie aan C4. Extreem zure of basische condities veroorzaken

respectievelijk anhydro- of isotetracyclinevorming (figuur 1.4.), die ook epimerisatie

aan C4 kunnen ondergaan. Deze producten hebben lage antibacteriële activiteit en

sommige zijn toxisch (Monser & Darghouth, 2000; Spisso et al., 2009).

FIGUUR 1.4.: ALGEMENE STRUCTUUR VAN TETRACYCLINES (MIDDEN), ANHYDROTETRACYCLINE (LINKS) EN ISOTETRACYCLINES (RECHTS).

8

1.3.1.3. Sulfonamiden

Sulfonamiden zijn synthetische geneesmiddelen met een sulfonamide als

functionele groep, een sulfongroep met een zwavelatoom is hierbij gekoppeld op een

amidefunctie (figuur 1.5.). Het zijn competitieve inhibitoren van dihydropteroaat

synthetase (DHPS), een enzym dat tussenkomt bij de foliumzuurproductie. Dit

verklaart ook hun selectiviteit: DHPS komt enkel voor bij bacteriën, aangezien

zoogdieren in staat zijn foliumzuur op te nemen uit hun voeding. Sulfonamiden

verhinderen dus de werking van bacteriën via een inhibitie van de

foliumzuursynthese en zo ook de DNA-synthese (Skold, 2000).

Wanneer sulfonamiden alleen gebruikt worden hebben ze bacteriostatische

activiteit, in combinatie met diaminopyrimidines zoals trimethoprim (figuur 1.6.)

werken ze synergistisch met bactericide effect tot gevolg. Trimethoprim inhibeert

dihydrofolaatreductase, een ander enzym dat de foliumzuursynthese katalyseert

(Skold, 2000; Haggett & Wilson, 2008). Sulfonamiden worden synthetisch

aangemaakt, ze hebben een breedspectrum tegen gram-positieve en -negatieve

bacteriën. Pseudomonas spp., Mycoplasma spp. en Klebsiella spp. zijn echter

resistent (Haggett & Wilson, 2008).

FIGUUR 1.5.: STRUCTUUR VAN SULFAGUANIDINE, FIGUUR 1.6.: STRUCTUUR VAN DE MET KENMERKENDE SULFONAMIDEGROEP. DIAMINOPYRIMIDINE: TRIMETHOPRIM. 1.3.1.4. Macroliden

Macroliden hebben een macrocyclische lactonring (figuur 1.7.) met 14, 15 of 16

atomen die via glycosidische bindingen gebonden zijn op suikers (McGlinchey et al.,

2008). Ze binden reversibel op de 50S subeenheid van het ribosoom, bijgevolg is er

geen transpeptidatie, geen translocatie en onvolledige proteïnesynthese. Macroliden

zijn bactericide bij hoge dosissen (Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt

veroorzaakt door modificatie van de target door methylatie of mutatie, door een

effluxpomp of door wijziging van de macrolide (Jindal et al., 2006). Ze hebben betere

activiteit tegen gram-positieve en aërobe bacteriën, dan tegen gram-negatieven of

9

anaëroben (Haggett & Wilson, 2008). Biosynthese gebeurt door polyketide

synthetasen die te vinden zijn in bacteriën, schimmels en planten (Park et al., 2010).

Macroliden worden aangemaakt door Streptomyces spp. (Lee & Rho, 1999).

FIGUUR 1.7.: TYLOSINE, EEN MACROLIDE MET TYPISCHE MACROCYCLISCHE LACTONRING.

1.3.1.5. Polypeptiden

Polypeptiden, zoals bijvoorbeeld bacitracine (figuur 1.8.), zijn verbindingen die

bestaan uit verschillende peptidenketens (Wan et al., 2006). Ze verhinderen de

celwandsynthese. Bacteriën van het genus Bacillus produceren polypeptiden zoals

bacitracine (Jamil et al., 2007). Het spectrum voor bacitracine omvat gram-positieve

aërobe en anaërobe bacteriën (http://www.cbip-vet.be/, 25-03-2010).

FIGUUR 1.8.: STRUCTUUR VAN BACITRACINE A, EEN POLYPEPTIDE ANTIBIOTICUM.

1.3.1.6. Streptogramine

De streptograminen bestaan uit twee groepen: polyonverzadigde macrolactonen

en cyclische hexadepsipeptides. De twee groepen werken synergistisch om de

eiwitsynthese te verhinderen gedurende de translatie. Een effluxpomp of inactivatie

van de streptogramine veroorzaakt resistentie (Barriere et al., 1998).

10

Streptograminen (bijvoorbeeld quinupristin/dalfopristin) zijn belangrijke antibiotica

bij de bestrijding van vancomycine-resistente enterococcus, die ernstige infecties

veroorzaakt in ziekenhuizen. Het gebruik van de streptogramine virginiamycine

(figuur 1.9.) in de landbouw werd verboden omdat het de efficiëntie van

quinupristin/dalfopristin verlaagt. Virginiamycine zorgt voor de ontwikkeling van

streptogramine resistente enterococcus bij dieren die overgedragen kan worden op

E. faecium bij gehospitalisserde patiënten (Smith et al., 2003). Streptogramines

worden gesynthetiseerd in de Streptomyces spp. De voornaamste targets zijn

S. pneumonae, S. aureus en E. faecium (Barriere et al., 1998).

FIGUUR 1.9.:VIRGINIAMYCINE M1-STRUCTUUR

1.3.1.7. Gebruik

Antibiotica kunnen therapeutisch of metafylactisch gebruikt worden bij dieren en

uitzonderlijk profylactisch. Gewoonlijk worden antibiotica oraal toegediend (80%) via

voeder of drinkwater, waardoor dieren in groep behandeld kunnen worden.

Individuele toediening via injectie komt in minder dan 20% van de gevallen voor

(Ungemach et al., 2006). Bij gebruik als voederadditief in lage dosis wordt de groei

bevorderd, er zijn minder kosten en dieren worden sneller verkocht (Boxall & Long,

2005). Er zijn verschillende mogelijke verklaringen voor de groeibevorderende

werking van antibiotica: vermindering van subklinische infecties, vorming van

groeideprimerende microbiële metabolieten wordt gereduceerd, minder verbruik van

nutriënten door bacteriën en verhoogde opname van nutriënten door de dunne

darmwand (Kumar et al., 2005).

11

1.3.2. Coccidiostatica

1.3.2.1. Coccidiose

Coccidiose is een infectieuze ziekte veroorzaakt door protozoa van het geslacht

Eimeria of Isospora. Deze protozoa verblijven het grootste deel van hun leven in de

intestinale tractus van de gastheer, het dier. Ze zullen snel vermenigvuldigen,

oöcysten vormen die met de ontlasting in het milieu komen. Zo dragen ze bij tot een

vicieuze cirkel van besmetting, wanneer een ander dier in contact komt met de

besmette faeces. In de darm zullen de protozoa de darmcellen beschadigen, er

ontstaat diarree en groei wordt verhinderd, met bijhorende economische gevolgen

(Dubreil-Cheneau et al., 2009; Olejnik et al., 2009).

1.3.2.2. Gebruik

Er zijn twee belangrijke klassen van coccidiostatica: natuurlijk geproduceerde

ionofore polyether antibiotica (door Streptomyces spp.) en chemisch

gesynthetiseerde coccidiostatica. Coccidiostatica worden gebruikt als voederadditief,

om coccidiose te voorkomen of te genezen. Door de snelle verspreiding van de

protozoa kunnen de economische verliezen bij een uitbraak van coccidiose hoog

oplopen, daarom is voorkomen beter dan genezen. Vooral bij intensieve landbouw is

dit belangrijk, omdat daar de verliezen veel groter zullen zijn. Dit verklaart waarom

coccidiospreventie- en bestrijding heel belangrijk is bij pluimveebedrijven (Dubreil-

Cheneau et al., 2009; Olejnik et al., 2009).

1.4. VOEDSELVEILIGHEID

1.4.1. Prioriteren

Het is moeilijk om informatie te verzamelen over het gebruik van individuele

veterinaire geneesmiddelen in de landbouw, dit bemoeilijkt ook het opstellen van

experimentele studies. Men gaat beroep doen op gegevens omtrent verkoop en

gebruik van verschillende chemische klassen van geneesmiddelen. Op basis hiervan

werd bepaald dat antibiotica en coccidiostatica de meest verkochte klassen van

veterinaire geneesmiddelen zijn. In het Verenigd Koninkrijk werden prioriteiten

toegekend aan de verschillende geneesmiddelklassen, rekening houdend met

informatie over hoeveelheden, verspreiding in de omgeving en metabolisme om zo

12

de veterinaire geneesmiddelen te bepalen die een grote kans hebben om in het

milieu terecht te komen en toxiciteit te veroorzaken (Boxall et al., 2003). Op basis

hiervan hebben wij bepaalde veterinaire geneesmiddelen gekozen uit volgende

antibioticagroepen om verder te onderzoeken in groenten: tetracyclines,

sulfonamiden, coccidiostatica, β-lactam antibiotica, macroliden, polypeptide

antibiotica en streptograminen.

1.4.2. Wetgeving

Omtrent antibioticaresiduen in planten is er momenteel nog geen wetgeving, voor

dierlijke producten zijn er echter wel wettelijke bepalingen. In dierlijke producten,

afkomstig van dieren die behandeld werden met bepaalde geneesmiddelen, vindt

men vaak residuen van veterinaire geneesmiddelen terug. Residuen zijn

farmacologisch actieve bestanddelen, omzettingproducten of andere substanties die

op dierlijke producten kunnen worden overgedragen en potentieel schadelijk zijn voor

de mens. Volgens richtlijn 96/23/EG van de Europese Gemeenschap worden

residuen en substanties in 2 groepen ingedeeld. Groep A zijn stoffen met anabolisch

effect en niet-geautoriseerde substanties. In groep B zitten contaminanten en

veterinaire geneesmiddelen, waaronder ook antibacteriële middelen (Europese

Gemeenschap, 1996).

Maximum residu limieten (MRL’s) werden voor dierlijke producten (bijvoorbeeld

vlees, eieren, melk) vastgelegd in verordening 470/2009/EG. Dit zijn maximale

residugehalten, afkomstig van het gebruik van veterinaire geneesmiddelen, die in

voedingsproducten mogen voorkomen, uitgedrukt in ppb (µg/kg) (Europese

Gemeenschap, 2009). Sinds 1996 zijn er in alle lidstaten van de Europese Unie

richtlijnen (96/23/EG) voor het opsporen van residuen en stoffen in dierlijke weefsels,

producten, voeders en drinkwater (Europese Gemeenschap, 1996). Om ervoor te

zorgen dat de MRL niet overschreden wordt moet er volgens richtlijn 2001/82/EG ook

rekening gehouden worden met de wachttijd. Dit is de tijd die moet verstrijken tussen

de laatste toediening van het veterinair geneesmiddelen en het slachten van het dier

voor consumptie, of de periode waarin melk, eieren en honing niet mogen gebruikt

worden (Europese Gemeenschap, 2001).

13

Vereisten voor de analysemethoden van dierlijke producten en de interpretatie

van de resultaten werden vastgelegd door de Europese Gemeenschap in richtlijn

2002/657/EG. Hoewel deze niet rechtstreeks van toepassing zijn voor de methode

voor planten zullen een aantal criteria uit deze richtlijn gebruikt worden voor de

validatie van de methode voor planten. (Europese Gemeenschap, 2002).

1.4.3. Analysemethoden

Er zijn gevoelige en specifieke methodes nodig om voedingsmiddelen te

controleren op antibioticaresiduen. Vroeger werd de analyse in verschillende stappen

onderverdeeld: screening, post-screening en confirmatie. Screening gebeurde via

een microbiologische inhibitietest van microtiter plaatjes, gevolgd door kwantificatie

en confirmatie met klasse-specifieke LC-methoden. Om het proces te versnellen ging

men op zoek naar een methode waarbij in één stap meerdere klassen van residuen

kunnen worden bepaald. Tegenwoordig wordt de massaspectrometer met single of

triple quadrupool algemeen gebruikt voor de detectie van antibioticaresiduen in

voedsel door voedselveiligheidsagentschappen, aangezien identificatie en

kwantificatie mogelijk is bij zeer lage concentraties (Aguilera-Luiz et al., 2008;

Gaugain-Juhel et al., 2009; Granelli et al., 2009).

Er zijn vier belangrijke analytische risicopunten voor multi-residu, multi-klasse

analyses: we werken met een grote hoeveelheid componenten, van verschillende

antibioticaklassen, bij zeer lage concentraties (ppb) en in complexe matrices (Blasco

et al., 2007). De condities voor het experiment moeten zorgvuldig gekozen worden

aangezien we werken met antibiotica met zeer verschillende fysicochemische

eigenschappen. Hierbij zal er een compromis moeten gesloten worden, dit wil

zeggen dat de condities niet altijd optimaal zullen zijn voor alle componenten, maar

wel zo optimaal mogelijk moeten zijn (Gros et al., 2006).

Door Chico et al. (2008) werd een methode beschreven voor de multi-residu,

multi-klasse analyse van 39 antibiotica in spierweefsel van kippen met UPLC (Ultra

performance liquid chromatography) gekoppeld aan een triple quadrupool

massaspectrometer. Onder andere tetracyclines, sulfonamiden, diaminopyrimidine-

derivaten, macroliden en β-lactam antibiotica werden onderzocht. Extractie gebeurde

met MeOH/H2O 70/30 (v/v), zonder clean-up fase en scheiding gebeurde op een

reversed phase kolom met ACN/H2O als mobiele fase. De ingestelde gradiënt moest

14

ervoor zorgen dat de componenten binnen korte tijd achtereenvolgens elueren. MS-

parameters werden getuned door de infusie van standaard oplossingen in ACN

(Chico et al., 2008).

Bohm et al. (2009) maakte methode voor de analyse van 47 substanties van

verschillende antibioticaklassen (o.a. tetracyclines, sulfonamiden, macroliden en

diaminopyrimidinederivaten) in melk met HPLC (high performance liquid

chromatography) gekoppeld met MS (massaspectrometer). De stalen werden

onderworpen aan solid phase extraction (SPE) met Oasis HLB kolommen, die eerst

bevochtigd en geconditioneerd werden met respectievelijk MeOH en H2O. Na elutie

met MeOH werden de stalen drooggedampt bij 40°C ond er N2 (Bohm et al., 2009).

Granelli et al. (2009) valideerde een LC-MS/MS screening methode voor

verschillende antibioticaklassen in spierweefsel (o.a. tetracyclines, sulfonamides, β-

lactams en macroliden). Aan 3 g staal werd EDTA toegevoegd, vervolgens werd het

staal belast en geëxtraheerd met 70% MeOH. Centrifugeren gebeurde gedurende 5

min bij 3800 g en het extract werd verder verdund in H2O om te analyseren (Granelli

et al., 2009).

Een multiresidu LC-MS/MS methode voor de bepaling van coccidiostatica in

kippenlever werd beschreven door Olejnik et al. (2009). Extractie gebeurde met ACN,

gevolgd door clean-up met OASIS HLB SPE. De componenten werden gescheiden

op een fenylhexyl kolom met een gradiënt met MeOH, ACN en ammonium formaat.

Twee fragment ionen werden onderzocht voor validatie (Olejnik et al., 2009).

Ferraz Spisso et al. (2009) werkte een gevalideerde methode uit voor de

bepaling van verschillende tetracyclines in melk. Oxytetracycline, tetracycline en

chloortetracycline hebben dezelfde moleculaire massa als hun 4-epimeervorm,

daarom was een scheiding met gradiënt in de HPLC noodzakkelijk (Spisso et al.,

2009).

15

2. OBJECTIEVEN

In laboratoriumomstandigheden werd reeds aangetoond dat antibiotica via de

mest opgenomen worden door planten (Kumar et al., 2005). In het licht van de

voedselveiligheid is het noodzakelijk om na te gaan of het ook in reële

omstandigheden voorkomt en of dit een probleem vormt voor de volksgezondheid.

De aanwezigheid van antibioticaresiduen in groenten zorgt er immers voor dat de

mens door consumptie van groenten kan blootgesteld worden aan antibiotica. Op die

manier kunnen hypersensitieve mensen allergische reacties ontwikkelen, toxische

producten kunnen ontstaan door de interactie tussen bepaalde antibiotica en

resistentie tegen antibiotica neemt toe door de voortdurende blootstelling aan lage

concentraties van antibiotica.

Het doel van de thesis is het ontwikkelen van een methode om antibiotica in

groenten te analyseren. Aan de hand van deze methode kan later gecontroleerd

worden of antibioticaresiduen in reële omstandigheden voorkomen in groenten en in

welke concentraties. Verder kan dan in functie van de gedetecteerde concentraties

en het consumptiepatroon vastgesteld worden of er MRL waarden dienen te worden

bepaald.

Voor de analyse van voedsel gaan we op zoek naar een procedure die gebruik

gemaakt van UPLC/MS-MS in MRM-mode. Omwille van de matrix van groenten, die

mogelijk interfererend is, volgt er na extractie een clean-up stap. Er worden

verschillende antibiotica uit verschillende klassen gebruikt in de diergeneeskunde,

daarom is er het meest baat bij één methode die tegelijk verschillende residuen van

verschillende klassen antibiotica bepaalt. Bovendien willen we de antibiotica ook

kwantificeren, wat belangrijk is voor mogelijk toekomstige wetgeving voor maximale

residugehalten van antibiotica in groenten.

De methode moet gevalideerd worden om na te gaan of de gevonden resultaten

juist en precies zijn en of de methode algemeen toepasbaar is. De LOD en de LOQ

geven een indicatie van de gevoeligheid van de methode, de terugvinding geeft een

beeld van de juistheid, de intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de

herhaalbaarheid weerspiegelen de precisie. De selectiviteit toont tenslotte aan of de

methode algemeen toepasbaar is op verschillende matrices.

16

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1. MATERIAAL

3.1.1. Antibiotica

3.1.1.1. Sulfonamiden

Sulfaguanidine (SGD), sulfapyridine (SPD), sulfadiazine (SDZ), sulfathiazole

(STZ), sulfamerazine (SMR), sulfamethizol (SMZ), sulfamethazine (SMT),

Sulfamethoxypyridazine (SMP), sulfachloropyridazine (SCP), sulfisoxazole (SIX),

Sulfamethoxazol (SMTX), N4-acetyl-sulfamethazine (N4AS), sulfaquinoxaline (SQX),

sulfadimethoxine (SDM) worden aangekocht bij Sigma Alderich (Steinheim,

Duitsland). Verder wordt sulfadoxine (SDX) in 5:1 verhouding in combinatie met

trimethoprim (TRI), een diaminopyrimidinederivaat, bij Sigma Alderich (Steinheim,

Duitsland) aangekocht.

3.1.1.2. Tetracyclines

De tetracyclines: 4epi-tetracycline (4ET), demeclocycline (DMC), 4epi-

chloortetracycline (4ECTC), isochloortetracycline (ICT), anhydrotetracycline (AHT),

doxycycline (DC), 4epi-anhydro-tetracycline (4EAT), anhydro-chloortetracycline

(ACTC), 4epi-anhydro-chloortetracycline (4EACTC), oxytetracycline (OTC),

chloortetracycline (CTC) en tetracycline (TC) zijn afkomstig van Sigma Alderich

(Steinheim, Duitsland).

3.1.1.3. Coccidiostatica

Amprolium (AMP), monensine (MON), nicarbazine (NIC), lasalocid A (LAS A),

diclazuril (DIC), narasine (NAR) en salinomycine (SAL) worden allemaal gekocht bij

Sigma Alderich (Steinheim, Duitsland).

3.1.1.4. Diverse

Het diverse mengsel bestaat uit de β-lactam antibiotica amoxicilline (AMOX) en

penicilline G (PEN G), de macroliden spiramycine (SPI) en tylosine (TYL), de

polypeptide bacitracine (BAC) en tenslotte de streptogramine virginiamycine (VGM).

Eveneens worden ze aangekocht bij Sigma Alderich (Steinheim, Duitsland).

17

3.1.2. Reagentia

Methanol (MeOH) hipersolve chromanorm van VWR (Leuven, België) wordt

gebruikt, uitgezonderd voor de bereiding van mobiele fase: methanol LC-MS

Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Verder worden dimethylformamide (DMF) van

Acros (Geel, belgië), acetonitrille (ACN) HPLC R van Biosolve (Valkenswaard,

Nederland), formic acid (FA) van Fluka (Neu-Ulm, Zwitserland), azijnzuur van Merck

(Darmstadt, Duitsland), Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) van Fluka (Buchs,

Zwitserland) en dimethylsulfoxide (DMSO) van Vel (Leuven, België) gebruikt. Het

water (H2O) wordt gedeïoniseerd en gedestilleerd met een Milli Q apparaat voor

waterzuivering (Millipore, Billerica, VS).

3.1.3. Instrumenten

Analyses worden uitgevoerd op een Acquity UPLC van Waters (Milford,VS),

gekoppeld aan een Quattro premier XE massaspectrometer van Waters (Milford,VS).

Er wordt gebruik gemaakt van een BEH (Bridged Ethane Hybrid) C18-kolom (2,1 x

100; 1,7 µm) van Waters (Milford, VS). Het verwerken van de data gebeurt met

Masslynx-software van Waters (Milford, VS). Voor SPE worden C18 (GracePure,

500 mg, 6 mL, Discovery science, Deerfield, VS) en OASIS HLB (200 mg, 6 mL,

Waters, Milford, VS) kolommen aangekocht. Bij het ultracentrifugeren worden cupjes

gebruikt met 0,22 µm filter van Millipore (Billerica, VS).

3.2. STANDAARD OPLOSSINGEN

3.2.1. Standaard stockoplossingen

Standaard stockoplossingen worden gemaakt met concentraties en solventen

afhankelijk van hun oplosbaarheid (tabel 3.1.). Alle oplossingen worden bewaard in

het donker in de diepvriezer bij een temperatuur van -20°C, uitgezonderd NIC wordt

bewaard bij kampertemperatuur, omdat de standaard oplossing in DMSO gemaakt

wordt. De tetracyclines en VGM moeten zoveel mogelijk afgeschermd worden

omwille van hun degradatie onder invloed van licht.

18

TABEL 3.1.: STANDAARD STOCKOPLOSSINGEN

concentratie solvent antibioticum

5 mg/mL MeOH SDXa

3 mg/mL MeOH PEN G, AMP, MON, SAL, 4ET, DMC, 4ECTC, ICT, AHT, DC, 4EAT, ACTC, 4EACTC, OTC, TC

3 mg/mL DMF DIC 1,5 mg/mL MeOH CTC

1 mg/mL MeOH SGD, SPD, SDZ, STZ, SMR, SMZ, SMT, SMP, SCP, SFX, SDM, N4AS, SQX, SMTX, TRIa, SPI, BAC, TYL

1 mg/mL ACN/H2O (50/50 v/v) AMOX 0,5 mg/mL MeOH VGM, NAR 0,5 mg/mL DMSO NIC 100 ng/µL ACN LAS Ab

aTRI wordt aangekocht in 1:5 verhouding met SDX, we maken hiervan een stockoplossing met 1 mg/mL TRI en 5 mg/mL SDX in MeOH. bLAS A wordt aangekocht in een oplossing van 100 ng/µL in ACN.

3.2.2. Tuneoplossingen

Vertrekkende van de stockoplossingen uit 3.2.1. (tabel 3.1.) wordt een

verdunning gemaakt van 10 ng/µL in MeOH. Voor een stockoplossing van 3 mg/mL

brengen we 10 µL over in een proefbuis en lengen aan met 2990 µL MeOH. Deze

verdunning gebruiken we vervolgens voor de aanmaak van de tuneoplossing.

Hiervoor wordt 100 µL verdunning in een proefbuis met 900 µL ACN met 0,3% FA

gedaan, om de gevoeligheid in de positieve elektrospray ionisatie mode (ESI+) te

verhogen. Tuneoplossingen worden bewaard bij -20°C.

3.2.3. Standaard mengsels

3.2.3.1. Standaard mengsels voor clean-up en extractie experimenten

Voor de extractie en clean-up experimenten gebruiken we standaard mengsels

van 30 ng/µL. Er wordt een sulfonamidenmengsel (SA), een tetracyclinemengsel

(TC), een coccidiostaticamengsel (COC) en een diverse mengsel met daarin

streptograminen, β-lactam antibiotica, polypeptiden en macroliden (DIV) bereid op

basis van de standaard stockoplossingen uit 3.2.1. (tabel 3.1.). De mengsels worden

verder verdund in MeOH tot de gewenste concentratie (30 ng/µL) bekomen wordt.

De standaard mengsels worden bewaard bij -20°C.

Voor de analyse maken we eerst een zogenaamde “mix” van de standaard

mengsels. Hiervoor brengen we van elk mengsel 10 µL in een vial met insert en

lossen het na droogdampen bij 40 °C onder N 2 op in 100 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v),

19

om een goede scheiding te krijgen. Na extractie en clean-up worden stalen in vials

met insert voor LC-MS/MS gebracht. Op basis van de “mix” kan de aanwezigheid van

bepaalde antibiotica in het staal worden gecontroleerd, door een vergelijking van de

pieken en de retentietijden. Deze “mix” wordt dus gebruikt als referentie, om te

controleren of de apparatuur correct werkt en welke componenten in het staal

aanwezig zijn. De signaal-ruisverhouding voor elk ion moet groter zijn dan 3:1, de

retentietĳden moeten binnen een marge van 5 % identiek zĳn en de piekverhouding

van de 2 ionen moet binnen een marge van 10 % overeenkomen (Europese

Gemeenschap, 2002).

3.2.3.2. Standaard mengsels voor validatie

Uitgaande van de standaard stockoplossingen uit 3.2.3.1 (tabel 3.1.) worden

mengsels (A) bereid in MeOH (tabel 3.2.). Hierbij wordt elk antibioticum toegevoegd

op basis van de gevoeligheid die gevonden werd bij de pre-validatie. Deze mengsels

(tabel 3.2.) worden verder verdund: aan 10 µL mengsel A wordt 990 µL MeOH

toegevoegd, om heel lage concentraties te bekomen (mengsel B). De standaard

mengsels worden bewaard bij -20°C.

TABEL 3.2.: STANDAARD MENGSELS (A) VOOR VALIDATIE DEEL 2

Voor de analyse wordt een “mix” bereid op basis van de standaard mengsels (B)

uit tabel 3.2. Hiervoor brengen we van elk mengsel 10 µL in een vial en lossen het na

droogdampen bij 40 °C onder N 2 op in 100 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v). Deze “mix”

wordt opnieuw gebruikt als referentie voor de te analyseren stalen zoals beschreven

bij 3.2.3.1.

mengsel concentratie antibioticum

SA

2 ng/µL TRI

10 ng/µL SGD, SPD, SMR, N4AS, SIX, SDM

50 ng/µL SDZ, STZ, SMT, SMZ, SQX

100 ng/µL SMP, SCP, SMTX

TCA

20 ng/µL TC 50 ng/µL DMC

100 ng/µL 4ETC, ICTC, ATC, 4EATC

300 ng/µL 4ECTC, OTC, CTC,

DOX, 4EACTC, ACTC

COC 2 ng/µL NAR, NIC, AMP,

SAL, LAS A 100 ng/µL MON, DIC

DIV 10 ng/µL AMOX, TYL

100 ng/µL SPIR, VGM, PEN G 500 ng/µL BAC

20

3.3. UPLC-MS/MS

3.3.1. Principe

3.3.1.1. UPLC

Vloeistofchromatografie wordt gebruikt voor een scheiding van de te analyseren

componenten in een staal. Het staal wordt geϊnjecteerd in mobiele fase aan het begin

van een kolom gepakt met sferische partikels (stationaire fase) . De mobiele fase is

best niet reactief, niet ontvlambaar, heeft een lage viscositeit en een hoge

zuiverheidsgraad. De te scheiden componenten verdelen zich tussen de mobiele en

de stationaire fase, door interactie met de stationaire fase worden ze selectief

vertraagd en zullen ze één voor één de kolom verlaten. Bij gradiëntelutie begint men

met een zwakker eluens en wordt er geleidelijk overgeschakeld op een sterker

eluens.

Meestal worden omgekeerde fase kolommen gebruikt, bestaande uit een

hydrofiele mobiele fase (bijvoorbeeld H2O, MeOH of ACN) en een hydrofobe

stationaire fase (bijvoorbeeld C2, C8 of C18). Hydrofobe substanties blijven langer

geadsorbeerd aan de stationaire fase en hebben langere retentietijd (Jakobsen,

2009).

De conventionele HPLC-techniek werd de laatste jaren sterk verbeterd om de

scheiding van componenten te versnellen en/of om de piekcapaciteit te verhogen.

Deze techniek wordt ultra performance liquid chromatography genoemd (UPLC).

Bij UPLC wordt er gewerkt met partikels onder 2 µm, veel kleiner dan bij HPLC.

Het belang hiervan wordt aangetoond met de Van Deemtertheorie (figuur 3.1.) Deze

theorie beschrijft de processen aan de basis van de piekverbreding, wat zeer

belangrijk is voor de scheidingsefficiëntie. Voor 2 van die processen, de Eddydiffusie

en de massatransfer, is de partikeldiameter van belang. Hoe kleiner de

partikeldiameter, hoe kleiner de Eddydiffusie en de massatransfer. Dit beïnvloedt het

Van Deemterplot (figuur 3.1.) die bepalend is voor de schotelhoogte en de snelheid

van de mobiele fase. Hoe kleiner de partikelgrootte, hoe beter de

scheidingsefficiëntie, hoe sneller de scheiding kan worden uitgevoerd.

21

FIGUUR 3.1.: INVLOED VAN PARTIKELGROOTTE OP VAN DEEMTERPLOT

Door de kleinere partikelgrootte wordt er bij UPLC een veel hogere druk (tot

15000 psi) opgebouwd dan bij HPLC. Er wordt gewerkt met hoge temperaturen (tot

200 °C) om de viscositeit van de mobiele fase te ve rminderen (Guillarme et al., 2010).

3.3.1.2. MS/MS

Wanneer de UPLC gekoppeld wordt met een MS-detector krijgt men gunstige

gevoeligheid en selectiviteit voor een snelle analyse van componenten in complexe

matrices en bij lage concentraties. Op die manier vormt de UPLC-MS/MS een snelle

multi-residu screening methode voor voedselmatrices (Guillarme et al., 2010). Door

de combinatie van LC en MS/MS krijgen we een scheiding en bovendien structurele

informatie, waardoor LC-MS/MS uiterst geschikt is voor de confirmatie van bepaalde

substanties (Bohm et al., 2009).

De massaspectrometer (figuur 3.2.) bestaat uit een bron met een capillair waarop

de kolom van de UPLC wordt aangesloten. In de bron heerst atmosferische druk.

Doorheen het capillair wordt het staal met behulp van verwarmd N2-gas gesproeid.

Door een voltage van ongeveer 3 - 4 kV aan te brengen aan het capillair worden

sterk geladen druppels gevormd. De druppel wordt verwarmd door het N2-gas,

hierdoor komen ionen dichter bij elkaar. Door een stijging van het elektrisch veld

bewegen ze naar de oppervlakte en evaporeren (figuur 3.3.) (Quattro-LC-operator-

training-course)

FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER

FIGUUR 3.3.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN (Quattr

Door de sterke elektrische lading ontstaat dus elektrospray ionisatie (ESI). Op die

manier kunnen positieve, geprotoneerde (

([M-H]-) ionen gevormd worden, afhankelijk van de eigensc

en de polariteit van de aangelegde spanning. We spreken van pseudomoleculaire

ionen, aangezien het exact gewicht niet

De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric

ionization = API) is een zachte ionisatietechniek, alle gevormde

worden ook gedetecteerd

operator-training-course).

De gevormde ionen worden naar de massaspectrometer geleid via 2 cones: de

sample en de extraction cone. Langs de sample cone

tegengestelde richting van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen

weggeduwd worden, terwijl alle ionen aangetrokken worden door een spanning op

de sample cone. De cones zullen het drukverval tussen de bron, waar atmosferische

druk heerst, en de quadrupolen,

training-course).

FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER(Waters, 2005).

.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN (Quattro-LC-operator-training-course).


manier kunnen positieve, geprotoneerde ([M+H]+), of negatieve, gedeprotoneerde

) ionen gevormd worden, afhankelijk van de eigenschappen van de molecule


ionen, aangezien het exact gewicht niet zichtbaar is door de protonatie/

De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric

zachte ionisatietechniek, alle gevormde

worden ook gedetecteerd en fragmenteren in de fragmentatiecel


sample en de extraction cone. Langs de sample cone stroomt N

van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen



en de quadrupolen, onder vacuum, opvangen (Quattro

22

FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER

.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN


), of negatieve, gedeprotoneerde

happen van de molecule


zichtbaar is door de protonatie/ deprotonatie.

De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric pressure

zachte ionisatietechniek, alle gevormde precursor ionen

en fragmenteren in de fragmentatiecel (Quattro-LC-


stroomt N2-gas in

van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen



(Quattro-LC-operator-

23

De massaspectrometer wordt zowel gebruikt voor kwantitatieve als kwalitatieve

doeleinden. Na ionisatie worden de componenten in MRM-mode (multiple reaction

monitoring, figuur 3.4.) gescheiden volgens massa/lading verhouding (m/z-waarde),

door de combinatie van twee quadrupolen (Q1 en Q2) en één fragmentatiecel

(Jakobsen, 2009).

FIGUUR 3.4.: MULTIPLE REACTION MONITORING, MET Q1 EN Q2 = QUADRUPOLEN. ZEER SELECTIEVE MODE OMDAT BEIDE QUADRUPOLEN GEBRUIKT WORDEN ALS MASSAFILTER.

IN DE COLLISION CELL VINDT DE FRAGMENTATIE PLAATS (Quattro-LC-operator-training-course).

De eerste quadrupool (Q1) bestaat uit 4 molybdene staven, met circulaire

doorsnede en op gelijke afstand van een centrale as. De staven hebben 2 aan 2

parallel een wisselspanning, waardoor bepaalde ionen een sinusfunctie beschrijven

doorheen de quadrupool en doorgelaten worden, terwijl anderen door de spanning

uit hun baan geraken en doorgang verhinderd wordt. Scheiding gebeurt in vacuüm,

er is een luchtvrije buis nodig om te voorkomen dat O2-moleculen de vlucht van de

ionen gaan hinderen. Vacuüm wordt bereikt door een direct drive rotary pomp en drie

turbomoleculaire pompen die via verschillende compartimenten geleidelijk de druk

opbouwen, dit wordt aangetoond op figuur 3.2.

Na de scheiding op de quadrupool volgt de fragmentatiestap in de

fragmentatiecel (collision cell), waarin via collision induced decombustion met een

inert gas, argon als botsingsgas, fragmenten gevormd worden. De fragmentatiecel

maakt gebruik van T-wave technologie voor hoge gevoeligheid en snelheid van de

analyse. Fragmentatie wordt gevolgd door een nieuwe scheiding volgens m/z met Q2,

die analoog aan Q1 is opgebouwd (Quattro-LC-operator-training-course).

Bij de MRM mode (figuur 3.4.) wordt Q1 ingesteld zodat enkel ionen met een

bepaald m/z-waarde doorgelaten worden en vervolgens gefragmenteerd worden in

de fragmentatiecel. Hierna worden met Q2 de geselecteerde fragment-ionen met een

bepaalde m/z-waarde doorgelaten. Voor kwantitatieve doeleinden wordt het meest

intense fragment-ion geselecteerd (Quattro-LC-operator-training-course).

24

Detectie gebeurt door de combinatie van een conversiedynode, fosfor en een

fotomultiplier detectie systeem. De gevormde ionen worden via de conversiedynode

omgezet naar elektronen die botsen met fosfor. Door die excitatie worden fotonen

uitgezonden die door een fotokathode opnieuw naar elektronen worden omgezet, de

fotomultiplier zorgt dan voor amplificatie in vacuüm, de elektrische signalen worden

geanalyseerd via software (Quattro-LC-operator-training-course).

3.3.2. Praktische uitvoering

3.3.2.1. Chromatografische condities bij de start

We werken bij een temperatuur van 40°C in de kolomo ven. Voor de scheiding

van de stalen wordt er gewerkt met een gradiënt. Mobiele fase A bestaat uit H2O met

0,1 % FA, mobiele fase B bestaat uit MeOH (LC-MS Biosolve) en 0,1 % FA. In Tabel

3.3. wordt de opbouw van de gradiënt weergegeven. Er wordt gestart met een

zwakker eluens (mobiele fase A), geleidelijk wordt overschakeld naar een sterker

eluens (mobiele fase B) om een mooie scheiding van de componenten te krijgen.

3.3.2.2. Aangepaste chromatografische condities

De temperatuur wordt aangepast naar 60°C in de kolo moven, bovendien wordt

een sterkere gradiënt ingesteld zoals weergegeven in tabel 3.4.

TABEL 3.3.: TIJDSTABEL GRADIENT 1 TABEL 3.4.: TIJDSTABEL GRADIENT 2 (flow rate 0,5 mL/min) (flow rate 0,5 mL/min)

3.3.2.3. MS-Tuning

De te analyseren componenten moeten eerst getuned worden om een aantal

parameters in te stellen zodat de verschillende componenten afzonderlijk doorheen

de quadrupolen passeren. We bepalen: de m/z-waarde van het precursor ion,

rekening houdend met eventueel waterverlies of adductvorming, het voltage nodig op

Tijd (min) %A %B Curve

0 100 0 -

0,5 100 0 -

6 76 24 lineair

8 36 64 lineair

9 18 82 lineair

11 18 82 -

13 100 0 lineair

Tijd (min) %A %B Curve

0 100 0 -

0,5 100 0 -

6 76 24 lineair

8 36 64 lineair

9 0 100 lineair

11 0 100 -

13 100 0 lineair

25

de cone om het signaal van het precursor ion te optimaliseren en de spanning op de

fragmentatiecel zodat moleculen botsen met argon en fragmenten vormen. Tenslotte

wordt ook de m/z-waarde bepaald van de fragment-ionen die gevormd worden, wat

belangrijk is voor de verdere identificatie en kwantificatie van de antibiotica.

De tuneoplossing wordt in de massaspectrometer geïnfuseerd met een snelheid

van 20 µL/min. Op basis van de brutoformule kan voor elk antibioticum het pseudo

moleculair gewicht berekend worden van het precursor ion. Eerst werken we alleen

met API-gas, er is dus enkel ionisatie en nog geen fragmentatie. Er wordt vervolgens

een MS-scan uitgevoerd met het masslynx-programma. De conespanning wordt

aangepast tot we de sterkste piekintensiteit vinden voor het precursor ion (tussen 20

en 55 V). Vervolgens voeren we een MS/MS-scan uit waarbij de gewenste spanning

voor de cone ingesteld wordt voor de te bepalen component. Het collison gas wordt

aangezet, de precursor ionen worden gefragmenteerd. Door de collision spanning op

te drijven (tussen 10 en 55 eV) gaan we op zoek naar de 2 meest intense fragment-

ionen.

3.4. STAALVOORBEREIDING

3.4.1. Extractie & clean-up experimenten

We voeren verschillende experimenten uit om de factoren te bepalen die een

significante invloed hebben op de extractie en clean-up. Deze testen gebeuren op

basis van het Plackett-Burman design voor de vergelijking van significante factoren

op 2 niveaus in N stalen, waarbij tot N – 1 factoren kunnen worden bepaald (N =

veelvoud van 4) (Srinubabu et al., 2008). Via lineaire regressie in SPSS worden

vervolgens de significante factoren op het 5% significantieniveau bepaald.

Voor extractie wordt gebruik gemaakt van een solvent (MeOH, H2O, aceton of

ACN) waarin het antibioticum oplost en met zo weinig mogelijk co-extractie van

interfererende stoffen uit de matrix van de groente geëxtraheerd wordt. Voor de

clean-up en aanconcentrering werken we met solid phase extraction (SPE). Er wordt

een extractie uitgevoerd tussen vaste en vloeibare fase, waarbij de te bepalen

component absorbeert aan een stationaire fase in een kolom. Interfererende stoffen

worden verwijderd door een wasstap. Vervolgens wordt het analyt met een geschikt

solvent (mobiele fase) geëlueerd.

26

Er zijn SPE kolommen met verschillende stationaire fasen: aluminium, amino of

sterke kationuitwisselaars voor geïoniseerde antibiotica. Voor neutrale antibiotica

worden polymere kolommen, zoals HLB (hydrofiele lipofiele balans) omgekeerde

fase of C18-kolommen gebruikt (Blasco et al., 2007; McGlinchey et al., 2008; Gorp,

2009). Alle geteste combinaties zijn voor elk experiment terug te vinden in de

bijhorende tabel.

3.4.1.1. Extractie en clean-up experiment 1

Bij deze test is wortel de matrix, deze worden eerst gemalen in een moulinette

om te homogeniseren en bewaard in de diepvriezer bij -20°C. Er wordt 8 keer 3 g

groente afgewogen in gosselin buizen van 50 mL.

Elk staal belasten we met 10 µL van elk mengsel uit 3.2.3.1. Dit komt overeen

met een concentratie van 100 ppb. We wachten 10 minuten om de antibiotica met de

matrix te laten reageren, zo worden natuurlijke omstandigheden nagebootst. Voor de

extractie wordt 200 µL 0,1M EDTA (32,2 g/L H2O) toegevoegd om complexvorming

van tetracyclines te verminderen. Tetracyclines hebben de neiging om chelaten te

vormen met divalente metaalionen in de matrix, waardoor ze minder goed

geëxtraheerd kunnen worden en hun terugvinding verlaagt (Chico et al., 2008).

Voor de extractie maken we 4 verschillende extractiesolventen aan: MeOH/H2O,

MeOH/Aceton, ACN/H2O en tenslotte ACN/Aceton, telkens in 50/50 (v/v) verhouding

(tabel 3.5., MeOH/ACN en H2O/Aceton). Aan elke buis wordt 7,5 of 15 mL van 1 van

de 4 extractiesolventen toegevoegd (tabel 3.5., mL extractie). Daarna vortexen we

elk staal gedurende 30 seconden voor mixen en homogeniseren, gevolgd door 15

minuten schudden en 10 minuten centrifugeren met een kracht van 3600 g, waardoor

een supernatans bekomen wordt. Van de bovenstaande fase wordt 3 of 6 mL (tabel

3.5., mL SPE) in een andere gosselin buis overgebracht en hieraan voegen we 27

mL H2O toe, om het extract polairder te maken voor de clean-up.

Bij de clean-up wordt gebruik gemaakt van C18 of OASIS HLB kolommen (tabel

3.5., SPE). We bevochtigen de kolommen met 4 mL MeOH, hierdoor zal de packing

in de kolom strekken en is er een groter contactoppervlakte voor de clean-up. De

uniforme packing is belangrijk om de efficiëntie van de clean-up procedure te

garanderen (McGlinchey et al., 2008). Daarna conditioneren we met 4 mL H2O om

27

de kolommen aan dezelfde omstandigheden bloot te stellen als het extract. Er moet

opgelet worden dat de kolommen nooit droog komen te staan, want hierdoor is er

een verlies van strekking in de packing. De clean-up wordt zo minder efficiënt.

Het extract gaat vervolgens over de kolom en loopt traag door met een snelheid

van ongeveer 1 mL/min, zodat voldoende interactie mogelijk is tussen het extract en

de kolom. Hierna drogen we de kolommen door het vacuüm te verhogen gedurende

10 min. De componenten elueren uit de kolom in een glazen proefbuis met 1 of 2 mL

MeOH (tabel 3.5., mL elutie) en de kolom wordt opnieuw gedroogd door het vacuüm

te verhogen. Het bekomen extract wordt indampt in een warmwaterbad bij 40°C

onder N2.

Voor de analyse lossen we de stalen opnieuw op in 200 µL H2O/MeOH 90/10

(v/v). Na grondig vortexen gaan de stalen in vials met insert voor de LC-MS analyse.

Elk staal wordt geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities

uit 3.3.2.1.

TABEL 3.5.: BEPALEN SIGNIFICANTE FACTOREN 1


Voor extractie en clean-up experiment 2 werken we analoog als onder punt

3.4.1.1., met een aantal kleine aanpassingen. Er wordt uitsluitend met C18-

kolommen gewerkt. Na de clean up is er een wasstap met 5 mL H2O. De stalen

worden na heroplossen in MeOH/H2O 90/10 (v/v) geültracentrifugeerd in cupjes met

een filter, waardoor de extracten zuiverder zijn.

Er wordt opnieuw gewerkt met 8 keer 3 g wortel. We testen de verhouding MeOH

en H2O voor de extractie (MeOH/H2O), het volume van het extract nodig voor SPE

(mL voor SPE), het volume MeOH voor de elutie (mL elutie), de wasstap en tenslotte

staal mL extractie MeOH/ACN H 2O/Aceton mL voor SPE SPE mL elutie

1 15 ACN Aceton 6 C18 2

2 15 MeOH Aceton 3 OASIS 1

3 15 MeOH H2O 3 C18 2

4 7,5 MeOH H2O 6 C18 1

5 15 ACN H2O 6 OASIS 1

6 7,5 MeOH Aceton 6 OASIS 2

7 7,5 ACN H2O 3 OASIS 2

8 7,5 ACN Aceton 3 C18 1

28

wordt de ultracentrifugatie getest (tabel 3.6.). De stalen worden geanalyseerd zoals

beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.


Staal MeOH/H2O mL voor SPE mL wassen mL elutie ultracentrifugeren

1 70/30 6 0 4 nee

2 70/30 7,5 0 2 ja 3 70/30 7,5 5 2 nee

4 50/50 7,5 5 4 nee 5 70/30 6 5 4 ja

6 50/50 7,5 0 4 ja 7 50/50 6 5 2 ja

8 50/50 6 0 2 nee


De procedure van 3.4.1.2. wordt gevolgd voor 8 keer 3 g wortel. We testen

opnieuw de SPE-kolommen (SPE) en daarnaast ook de verhouding MeOH en H2O

voor de extractie (MeOH/H2O), het volume van het extract nodig voor SPE (mL voor

SPE), het volume MeOH voor de elutie (mL elutie), de wasstap (mL wassen) en

tenslotte wordt de ultracentrifugatie getest (tabel 3.7.). De stalen worden

geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.


Staal MeOH/H2O mL voor SPE mL wassen SPE mL elutie ultracentrifugeren

1 70/30 3 0 OASIS 2 ja

2 70/30 6 0 C18 4 nee

3 70/30 6 5 C18 2 ja

4 50/50 6 5 OASIS 2 nee

5 70/30 3 5 OASIS 4 nee

6 50/50 6 0 OASIS 4 ja

7 50/50 3 5 C18 4 ja

8 50/50 3 0 C18 2 nee

3.4.2. Pre-validatie: inschatting gevoeligheid

Voor de pre-validatie werken we met 12 keer 3 g groene paprika. Er worden 2

reeksen gemaakt, waarbij de buizen per twee belast worden met een verschillende

concentratie van de mengsels (tabel 3.8.). Hiervoor maken we eerst een verdunning

van 1/10 (v/v) van elk standaard mengsel van 30 ng/µL uit 3.2.3.1., zodat we

standaard mengsels van 3 ng/µL bekomen. Twee buizen worden niet belast, deze

gelden als blanco van elke reeks.

29

TABEL 3.8.: BELASTING VAN DE VERSCHILLENDE STALEN

a µL van elke mengsel waarmee het staal belast wordt b concentratie (in ng/µL) van de gebruikte mengsels

De stalen worden voorbereid met de geoptimaliseerde methode. Na 10 minuten

wachten voegen we 200 µL 0,1M EDTA (32,2 g/L H2O) toe. Als extractiemiddel wordt

MeOH/H2O 50/50 (v/v) gebruikt. We voegen aan elke buis 7,5 mL toe, daarna wordt

elke buis gevortext gedurende 30 sec, gevolgd door 15 min schudden en 10 min

centrifugeren met een kracht van 3600 g. Van de bovenstaande fase brengen we

6 mL in een andere gosselin buis en voegen hieraan 27 mL H2O toe.

Voor de clean-up wordt uitsluitend gebruik gemaakt van OASIS kolommen, die

bevochtigd worden met 4 mL MeOH en geconditioneerd met 4 mL H2O. Het extract

brengen we over de kolom, laten we traag doorlopen met een snelheid van ongeveer

1 mL/min en vervolgens wassen we met 5 mL H2O. Hierna worden de kolommen

gedroogd door het vacuüm te verhogen gedurende 10 minuten. We plaatsen glazen

proefbuizen in een rekje in het vacuüm elutiebakje. De componenten elueren met 1

mL MeOH (reeks B) of 2 mL MeOH (reeks A). De kolommen worden opnieuw

gedroogd door het vacuüm te verhogen.

De bekomen extracten van reeks A drogen we door in te dampen bij 40°C in een

warmwaterbad onder N2. Daarna worden de stalen heroplost in 200 µL H2O/MeOH

90/10 (v/v) en overgebracht in vials met insert voor de LC-MS analyse. Bij reeks B

wordt er niet drooggedampt, maar lengen we de extracten aan met 9 mL H2O.

Hiervan wordt 200 µL overgebracht in vials met insert voor LC-MS en geanalyseerd

zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.

Staal µL a ng/µL b ppb

1 0 0 0 2 1 3 1

3 10 3 10 4 50 3 50

5 10 30 100

6 15 30 150

30

3.4.3. Extra testen

3.4.3.1. Bacitracine

Met 8 keer 3 g wortel wordt de clean-up en extractie uitgevoerd zoals beschreven

onder 3.4.2. De extracten worden opgevangen in 4 glazen en 4 plastic proefbuizen.

We drogen 2 glazen en 2 plastic proefbuizen bij 40°C in een warmwaterbad onder N2.

De andere 2 glazen en 2 plastic proefbuizen worden bij 37°C in een verwarmblok

onder N2 gedroogd. Voor de analyse worden de extracten opgelost in 200 µL

H2O/MeOH 90/10 (v/v), daarna overgebracht in vials met insert voor LC-MS en

geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.

3.4.3.2. Diclazuril en coccidiostaticamengsel

We wegen 4 keer 3 g wortel en belasten 2 buizen met 10 µL van het oude COC-

mengsel en 2 buizen met 10 µL van het vers bereide COC-mengsel uit 3.2.3.1. Een

staal met verse en één met oude COC-mengsel wordt op C18 kolommen gebracht,

voor de overige 2 stalen wordt er met OASIS kolommen gewerkt. De procedure van

3.4.2. wordt gevolgd en de stalen worden geanalyseerd zoals beschreven onder punt

3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.

3.4.4. Finale procedure voor extractie en clean-up

De uiteindelijke procedure voor extractie en clean-up verloopt zoals beschreven

onder 3.4.2., vervolgens worden de extracten gedroogd in glazen proefbuizen in een

verwarmblok bij 37°C onder N 2. Voor de analyse worden de stalen heropgelost in

200 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v) en overgebracht in vials met insert voor LC-MS/MS.

3.5. VALIDATIE

3.5.1. Selectiviteit

Er worden 12 blanco matrices in tweevoud getest: wortel, aardappel, groene

paprika, tomaat, ajuin, erwten, witloof, prei, komkommer, venkel, champignons en sla.

Elke groente wordt gemalen in de moulinette tot een homogene massa en

vervolgens wordt telkens 3 g afgewogen in een gosselinbuis van 50 mL. Na de

extractie en clean-up procedure (3.4.4.) worden de stalen geanalyseerd zoals

beschreven onder punt 3.2.3.2. met de condities uit 3.3.2.2.

31

3.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvi nding en intra-lab

reproduceerbaarheid

Blanco materiaal wordt in triplicaat belast met 0.5, 1, 1.5 en 2 keer de MRPL

(minimaal vereiste prestatielimieten) die bepaald werden in 3.4.2. De MRPL is het

minimale gehalte van een analyt in een staal dat aangetoond en bevestigd moet

worden met de methode (Europese Gemeenschap, 2002). Dit komt overeen met 15,

30, 45 of 60 µL van de mengsels (B) uit 3.2.3.2. In tabel 3.9. worden de bekomen

concentraties in ppb weergegeven. Er wordt een reeks van 3 keer 4 stalen gemaakt

met groene paprika en met aardappel en 2 reeksen van 3 keer 4 stalen met wortel

als matrix. De stalen worden op 3 dagen geanalyseerd (dag 1: wortel, dag 2:

aardappel en dag 3: paprika). De clean-up en extractie procedure is beschreven

onder 3.4.4. Het staal wordt geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.2. met

de condities uit 3.3.2.2.

TABEL 3.9. DE PPB-WAARDEN DIE GEBRUIKT WORDEN VOOR VALIDATIE

3.5.2.1. Detectielimiet (LOD)

De detectielimiet is het laagst gemeten gehalte waaruit de aanwezigheid van het

analyt met redelijke statistische zekerheid kan worden afgeleid

(= aantoonbaarheidsgrens). We werken met 4 concentratieniveaus, waarbij elke

concentratie 3 keer bepaald wordt. Dit wordt nog 2 keer herhaald met andere

matrices, op die manier bekomen we 9 stalen per niveau. Aan de hand van de

gemiddelde piekoppervlakte per concentratieniveau wordt een kalibratiecurve

opgesteld. De LOD wordt met vergelijking 3.1 berekend op basis van die curve.

LOD = 3 seb/m (3.1) Waarin: LOD = detectielimiet

seb = standaarddeviatie op het snijpunt van de kalibratiecurve met de y-as

m = richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve

concentratie standaard mengsel (B) ng/µL

0,02 0,1 0,2 0,5 1 2 3 5

µL

15 0,1 0,5 1 2,5 5 10 15 25 → 0,5*MRPL

30 0,2 1 2 5 10 20 30 50 →1*MRPL

45 0,3 2 3 7,5 15 30 45 75 →1,5*MRPL

60 0,4 2,5 4 10 20 40 60 100 → 2*MRPL

32

3.5.2.2. Kwantificatielimiet (LOQ)

De kwantificatielimiet is het gehalte waarbij twee verschillende resultaten

duidelijk te onderscheiden zijn (= bepaalbaarheidsgrens). Deze wordt bepaald aan

de hand van formule 3.2.

LOD = LOQ * 2 (3.2) Waarin: LOD = detectielimiet uit 3.5.2.1. LOQ = kwantificatielimiet

3.5.2.3. Relatieve terugvinding

De relatieve terugvinding is de fractie van een analyt die gemiddeld bij een

analyse wordt teruggevonden, uitgedrukt in percentage ten opzichte van de

doelwaarde (formule 3.3). De gemiddelde gemeten concentratie wordt berekend bij 4

concentratieniveaus (9 stalen per niveau met 3 stalen per matrix). De gemeten

concentraties worden vergeleken met theoretisch toegevoegde concentraties.

gemeten concentratie % relatieve terugvinding = 100 * _________________________ (3.3)

toegevoegde concentratie

3.5.2.4. Intra-laboratoriumreproduceerbaarheid (R)

De intra-laboratoriumreproduceerbaarheid is de precisie die binnen 1 labo

verkregen wordt bij vastgelegde omstandigheden: er wordt 1 methode gebruikt voor

verschillende matrices, op verschillende dagen geanalyseerd, door dezelfde analist

en met dezelfde apparatuur. De gemiddelde gemeten concentratie wordt berekend

bij 4 concentratieniveaus (9 stalen per niveau met 3 stalen per matrix), aan de hand

van de standaarddeviatie wordt de variatiecoëfficiënt (CV) bepaald voor elke

concentratie.

3.5.2.5. Herhaalbaarheid (r)

De herhaalbaarheid is de precisie onder herhaalbaarheidsomstandigheden. Er

wordt gewerkt met dezelfde methode bij identiek analysemateriaal, in hetzelfde

laboratorium, door dezelfde analist en met dezelfde apparatuur. Hiervoor wordt de

gemiddelde gemeten concentratie berekend bij 4 concentratieniveaus met wortel als

matrix (6 stalen per niveau). Aan de hand van de standaarddeviatie wordt de CV

bepaald voor elke concentratie.

33

4. RESULTATEN & DISCUSSIE

4.1. TUNEN

Voor het tunen kan zowel met ESI+ of ESI- mode gewerkt worden. In het labo

was reeds ervaring voor een aantal componenten met positieve mode, bovendien

bleek uit literatuuronderzoek dat verschillende andere componenten in ESI+ mode

bepaald kunnen worden. Indien mogelijk worden daarom de componenten in ESI+

mode getuned (tabel 4.2.). NIC en DIC (tabel 4.1.) kunnen enkel in ESI- mode

getuned worden omdat in de positieve mode geen ionisatie van de componenten

waarneembaar is.

Voor bepaalde antibiotica wordt er gewerkt met een merker. BAC is een mengsel

van polypeptiden waarvan BAC A de belangrijkste component is, aangezien die

verantwoordelijk is voor de therapeutische activiteit (Wan et al., 2006). NIC bestaat

uit een equimolair mengsel van 4,4’-dinitrocarbanilide (DNC) en 2-hydroxy-4,6-

dimethylpyrimidine, omdat DNC meer persistent is wordt het gebruikt als

merkerresidu (Danaher et al., 2008). SPI is een mengsel van SPI I, SPI II en SPI III,

die alle drie afzonderlijk bepaald worden. SPI I is de belangrijkste component (Wang

& Leung, 2009). VGM is een streptogramine die opgebouwd is uit VGM M1 en VGM

S1, waarvan VGM M1 de merker is (Boison et al., 2009). Lasalocid is opgebouwd uit

5 homologen (A – E). LAS A bestaat voor meer dan 99% uit homoloog A en minder

dan 1% uit B, C, D en E (Focht, 2008).

CTC en 4ECTC hebben een zelfde precursor ion met gelijke

fragmentatiepatronen en hebben daarom dezelfde tuneparameters. Ook kunnen ze

met de huidige chromatografische methode niet gescheiden worden, ze zullen bij de

analyses dezelfde retentietijd hebben en worden daarom samen bepaald.

TABEL 4.1.: TUNEGEGEVENS VOOR ANTIBIOTICA MET ESI- MODE

Antibioticum

(merker) Precursor

(Da) Fragmenten

(Da) Cone

(V) Coll. (eV)

DIC 406,6 335,7 45 20

NIC (DNC) 301,2 107,3 30 40 137,0 30 10

34

TABEL 4.2.: TUNEGEGEVENS VOOR ANTIBIOTICA MET ESI+ MODE

Antibioticum (merker)

Precursor (Da)

Fragmenten (Da)

Cone (V)

Coll. (eV)

Antibioticum (merker)

Precursor (Da)

Fragmenten (Da)

Cone (V)

Col . (eV)

4EATC 427,1 153,5 22 28

SDX 311,2 92,1 28 30

409,7 22 18 155,9 28 15

4ETC 445,2 153,5 22 25

SDZ 251,2 91,9 20 25

409,5 22 18 156,1 20 15

ACTC 461,1 153,5 22 25

SGD 215,2 92 20 25

443,6 22 18 155,9 20 15

AMOX 366,2 114 26 16

SIX 268,2 112,9 22 15

349,2 26 8 156,1 22 12

AMP 243,2 94,0 15 15

SMP 281,2 91,1 25 30

150,1 15 12 156 25 15

ATC 427,1 153,5 22 28

SMR 265,2 107,8 25 18

409,7 22 18 155,8 25 15

BAC (BAC A) 475,4

85,7 30 20 SMT 279,2

91,9 25 30

670 30 15 124,2 25 20

CTC/ 4ECTC 479,2

444 38 22 SMTC 254,2

92,2 22 25

462 38 16 156 22 15

DC 445,1 153,5 22 30

SMZ 271,2 91,9 20 30

427,7 22 22 156,1 20 15

DMC 465,2 153,5 25 25

SPD 250,2 92 25 25

447,7 25 18 156 25 15

ICT 479,1 196,5 22 38

SPI I 422,5 540,6 25 12

461,5 22 20 699,7 25 12

LAS A 613,2 377,2 55 34

SPI II 443,5 741,7 27 11

577,5 55 34 744,6 27 11

MON 693,2 462,2 40 55

SPI III 450,5 596,6 30 16

676,4 40 45 755,7 30 12

N4AS 321,2 134 30 25

SQX 301,2 92,2 30 25

198,1 30 20 156,1 30 15

NAR 787,2 431,2 44 52

STZ 256,2 91,9 22 22

531,2 44 50 156 22 15

OTC 461,2 426,2 32 20

TC 445,2 154 35 24

444 32 18 410 35 16

PEN G 357,2 181,8 35 20

TRI 291,2 123,1 35 28

197,7 35 15 230,2 35 25

SAL 773,2 431,2 55 52

TYL 916,7 174,2 42 40

531,2 55 48 772,5 42 25

SCP 285,2 91,8 25 30 VGM

(VGM M1) 526,6 337,6 28 20

155,8 25 15 355,6 28 18

SDM 311,2 108,1 30 28

156,1 30 18

35

4.2. EXTRACTIE EN CLEAN-UP EXPERIMENTEN

Om tot een optimale extractie en clean-up procedure te komen voor zoveel

mogelijk componenten werden verschillende experimenten gedaan om de factoren te

bepalen die een significante invloed hebben op de resultaten. Uit literatuuronderzoek

(1.4.3) werden een aantal factoren bepaald die getest werden: het volume van het

extractiesolvent, de samenstelling van het extractiesolvent met MeOH of ACN en

H2O of Aceton, het type van SPE-kolom, het volume van het extract dat op de SPE-

kolom gebracht wordt, het volume MeOH voor elutie van de kolom, de wasstap en

ultracentrifugatie.

Voor de opbouw van de experimenten werd gebruik gemaakt van het Plackett-

Burman design. De bekomen resultaten uit de experimenten werden verwerkt in

SPSS via lineaire regressie van de piekoppervlaktes van elke component.

Significante factoren werden voor elk antibioticum getest in het 95%

betrouwbaarheidsinterval.

Uit de resultaten van het eerste extractie en clean-up experiment blijkt dat er een

significant verschil is voor het volume van extractiesolvent dat gebruikt wordt. Voor

een aantal componenten is 7,5 mL solvent optimaal voor de extractie. Aangezien

voor geen enkele component 15 mL tot betere resultaten leidt, wordt verder gewerkt

met 7,5 mL extractiesolvent. Ook voor het extractiesolvent vinden we een significant

verschil, voor geen enkele component is ACN een betere keuze. Omdat MeOH voor

een aantal componenten betere resultaten geeft wordt hiermee verder gewerkt.

Aangezien er met aceton als extractiesolvent geen betere resultaten bekomen

worden dan met H2O wordt er gekozen om met H2O verder te werken. Voor het

volume voor clean-up met SPE is er een sigificant verschil: 6 mL is optimaal voor de

meerderheid van de componenten, geen enkel antibioticum heeft betere resultaten

met 3 mL. Ook het volume dat voor elutie gebruikt wordt is significant verschillend,

daarom wordt verder gewerkt met 2 mL MeOH. Voor de SPE-kolommen zijn de

resultaten voor C18 en OASIS optimaal voor een gelijk aantal componenten. Er

wordt echter gekozen om verder te werken met C18, omwille van de kostprijs. Alle

tetracyclines geven problemen en ook BAC, SPI II en SPI III zijn nauwelijks

detecteerbaar.

36

Bij het tweede extractie en clean-up experiment werd de samenstelling van de

extractiesolventen verder geoptimaliseerd. MeOH/H2O 50/50 (v/v) geeft voor de

meerderheid van de componenten betere resultaten, MeOH/H2O 70/30 (v/v) is enkel

voor BAC en MON optimaal, daarom wordt gekozen voor MEOH/H2O 50/50 (v/v).

Het volume van het extract dat op de kolommen gebracht wordt is weinig significant

verschillend wanneer met 6 of 7,5 mL wordt gewerkt, daarom wordt bij het volgende

experiment geopteerd voor 6 mL extract. We vergeleken 4 en 2 mL MeOH voor de

elutie. De bekomen resultaten tonen een significant verschil aan dat erop wijst dat 2

ml de optimale keuze is. Voor de wastap en de ultracentrifugatie zijn de bekomen

resultaten niet significant verschillend. De tetracyclines geven bij dit experiment geen

goede resultaten, net zoals bij experiment 1, daarom worden de resultaten van

experiment 1 en 2 voor de tetracyclines vergeleken. Daaruit blijkt dat voor

tetracyclines de clean-up beter is wanneer gewerkt wordt met OASIS kolommen.

Om te testen of er inderdaad betere resultaten bekomen worden voor de

tetracyclines met OASIS kolommen werd bij het derde experiment opnieuw gewerkt

met OASIS en C18 kolommen. Hierdoor moesten ook een aantal van de voorgaande

testen hernomen worden.

MeOH/H2O 50/50 (v/v) blijkt nog steeds de beste resultaten te geven, behalve

voor TYL, BAC en DIC. Voor SPE is 6 mL volume van het extract dat op de kolom

gebracht wordt voor de meeste componenten optimaal, behalve voor BAC en SIX,

waar beter gewerkt wordt met 3 mL. 4ETC, SPI I en SPI III worden best gewassen

met 5 mL H2O, enkel voor DIC is de wasstap nadelig. De wasstap wordt daarom

behouden. Uit de test blijkt dat OASIS kolommen duidelijk voor de meerderheid van

de componenten de beste resultaten geven, inclusief de tetracyclines, daarom wordt

verder gewerkt met OASIS kolommen, ondanks de kostprijs. Enkel DIC heeft meer

voordeel bij C18-kolommen. Het volume MeOH voor elutie is niet significant

verschillend wanneer gewerkt wordt met 2 of 4 mL MeOH, we gebruiken daarom 2

mL voor de finale methode omwille van de resultaten uit experiment 2. De

ultracentrifugatiestap is nadelig voor STZ, SIX, 4ETC, SPI I, SPIII, TYL, MON en DIC.

Bovendien heeft geen enkele component voordeel door de ultracentrifugatie, daarom

wordt deze stap weggelaten.

37

Er is weinig DIC te zien in de meeste stalen, dit kan te wijten zijn aan de keuze

van de kolom. Het is mogelijk dat DIC niet aan OASIS-kolommen gaat binden,

bijgevolg zal DIC bij de clean-up onmiddellijk elueren en wegwassen bij de wasstap.

Er bevindt zich dan geen DIC in het te analyseren staal. Ook kan er invloed zijn van

het drogen of het droog bewaren.

Voor de finale methode wordt gebruik gemaakt van 7,5 mL MeOH/H2O 50/50 (v/v)

als extractiesolvent. Voor de clean-up met SPE wordt 6 mL extract overgebracht op

een OASIS HLB-kolom, gewassen met 5 mL H2O en vervolgens geëlueerd met 2 mL

MeOH.

4.3. PRE-VALIDATIE

De pre-validatie bestaat uit 2 experimenten die tegelijk uitgevoerd werden. De

gevoeligheid van de componenten werd ingeschat door de stalen met verschillende

concentraties te belasten, zowel lagere als hogere dan de concentratie (100 ppb) die

bij de extractie en clean-up testen gebruikt werd. Het tweede deel van de pre-

validatie was een experiment waarbij getest wordt of de gevoeligheid verschillend is

wanneer een staal heropgelost of aangelengd wordt om te testen of dit invloed heeft

op de stabiliteit van DIC. Er was immers weinig DIC te zien in de stalen van de

voorgaande experimenten, dit kan te wijten zijn aan verlies van DIC door drogen of

droog bewaren. Reeks A werd geëlueerd met 2 mL MeOH, gedroogd onder N2 bij

40°C en vervolgens opnieuw opgelost in 200 µL H 2O/MeOH 90/10 v(v). De extracten

van reeks B werden geëlueerd met 1 mL MeOH, aangelengd met 9 mL H2O en

hiervan werd 200 µL in vials met insert voor LC-MS/MS analyse gebracht.

De gevoeligheid ligt tussen 1 en 100 ppb voor reeks A en tussen 50 en meer dan

150 ppb voor reeks B. Zoals verwacht is reeks B veel minder gevoelig dan reeks A,

er zit ongeveer een factor van 50 verschil op de resultaten. Er is echter 1

uitzondering: voor BAC zijn de 2 methodes ongeveer even gevoelig. Dit kan er op

wijzen dat BAC op één of andere manier verloren gaat door het drogen bij 40°C.

Verder vinden we geen pieken voor DIC voor beide reeksen. Dit wijst er op dat zowel

drogen als droog bewaren geen invloed hebben op de resultaten voor DIC, zoals

voorgesteld bij 4.2., experiment 2. Mogelijk zijn er slechte resultaten voor DIC omdat

dit antibioticum enkel bindt op C18-kolommen bij SPE, door gebruik van OASIS

kolommen gaat DIC verloren bij de clean-up.

38

4.4. EXTRA TESTEN

Een aantal extra testen werden een uitgevoerd met BAC en DIC om een aantal

hypothesen uit 4.2. en 4.3. te testen. Tijdens de pre-validatie werd vastgesteld dat

BAC zowel bij drogen en heroplossen, als bij aanlengen dezelfde gevoeligheid

vertoont (50 ppb). Voor alle andere componenten werd er echter een verschil in

gevoeligheid gevonden met factor 50, waaruit besloten kan worden dat de methode

waarbij het extract aangelengd wordt minder gevoelig is. Dit kan erop wijzen dat BAC

instabiel is bij droogdampen onder 40°C en afgebrok en wordt of door het drogen blijft

kleven aan de proefbuis. De gevoeligheid van de methode vermindert hierdoor.

Voor de test met BAC werd de temperatuur voor droogdampen en het materiaal

van de proefbuizen getest. Het materiaal zou immers significante invloed kunnen

hebben op de gevoeligheid van een methode wanneer de component blijft kleven

aan de wand. Hoewel de pieken hoger zijn bij drogen in verwarmblok bij 37°C in

plastic proefbuizen blijkt er geen significant verschil op het 0,5% significantieniveau

met SPSS. Voor de finale methode wordt er gekozen voor glazen proefbuizen en

wordt er toch gedroogd bij 37°C, omwille van de res ultaten uit de bovenstaande

resultaten.

Bij het extractie en clean-up experiment 3 (4.2.) werd vastgesteld dat van DIC

slechts sporen aanwezig zijn in de stalen. Dit is te wijten aan de kolomkeuze, het

drogen of het droog bewaren. Uit de pre-validatie (4.3.) bleek dat drogen en droog

bewaren weinig invloed heeft, aangezien DIC in beide reeksen niet zichtbaar was.

Daarom werden in deze test de OASIS en C18-kolommen vergeleken. Bovendien

werd ook de stabiliteit van coccidiostatica getest omdat bij de laatste reeksen geen

reproduceerbare resultaten gevonden werden. Een oud mengsel werd vergeleken

met een vers bereid mengsel.

Bij DIC vinden we piekoppervlaktes van 3800 na C18 clean-up, voor OASIS zijn

deze 10 keer lager (± 300). Voor de clean-up bindt DIC beter aan C18-kolommen.

We werken echter verder met OASIS voor de finale methode omdat dit optimaler is

voor de tetracyclines en dus voor de meerderheid van de componenten.

39

Er is geen verschil in de resultaten tussen het oude en het nieuwe COC-mengsel.

Om te testen of er problemen zijn met de kolom wordt een nieuwe kolom gebruikt. De

druk is even hoog als bij de vorige kolom, bovendien zijn er ook hier slechte pieken

voor NAR en SAL, daarom wordt een sterkere gradiënt (3.3.2.2.) ingesteld. De

gradiënt wordt opgedreven naar 100% MeOH omdat anders geen reproduceerbare

elutie bekomen wordt. Door het gebruik van 100% MeOH krijgen we goede pieken

voor de coccidiostatica. Eveneens wordt de temperatuur in de kolomoven verhoogd

naar 60°C om de druk in de kolom te verlagen.

4.5. VALIDATIE

4.5.1. Selectiviteit

Verschillende blanco matrices werden geanalyseerd om na te gaan of er

interferentie is bij bepaalde matrices. Bij bepaalde stalen vinden we voor bepaalde

componenten pieken die mogelijk kunnen wijzen op de aanwezigheid van

componenten. Om een piek te kunnen identificeren als een component moet aan 4

criteria voldaan zijn (Europese Gemeenschap, 2002). Er moeten 2 ionen simultaan

voorkomen, de retentietijd moet overeenkomen met de retentietijd voor de

component uit de zogenaamde “mix” (3.2.3.2.) binnen een marge van 5%, de S/N-

verhouding voor elk ion moet groter zijn dan 3:1 en de piekverhouding van de 2

ionen moet overeenkomen met de piekverhouding in de “mix” binnen een marge van

10%. Bij het gebruik van de MRM-mode en bovenstaande identificatiecriteria is de

kans op vals positieve resultaten als gevolg van interfererende pieken klein.

In een komkommerstaal vinden we sporen van TYL (figuur 4.1.). Er zijn

simultaan 2 ionen aanwezig, de retentietijd, de S/N-verhouding en de piekverhouding

liggen binnen de criteria. Daarom kunnen we vermoeden dat de component TYL

gedetecteerd werd bij komkommer als matrix, dit moet verder bevestigd worden. Bij

champignons tenslotte zijn er sterke pieken te vinden voor TRI. Er zijn simultaan 2

ionen aanwezig, de retentietijd is goed en ook de S/N-verhouding en de

piekverhouding liggen binnen de criteria. Dit staal moet verder worden onderzocht

omdat we vermoeden dat TRI aanwezig is in de stalen.

FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS

In alle stalen zijn pieken bij

contaminatie van de gebruikte solventen voor extractie en clean

worden onderzocht, maar er w

onderzocht worden waarom in alle stalen spor

het werkelijk om SAL gaat.

4.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid,

reproduceerbaarheid

De resultaten van de pre

de gevoeligheid van de methode. Aa

worden. Dit wordt gebruikt bij het maken van

de validatie.

Er worden bij de validatie

A en DIC. Voor DIC werd bij de extra testen a

gebruik van OASIS kolommen. Voor de overige componenten is dit onduidelijk, het is

mogelijk dat de factoren voor clean

antibiotica of het is te wijten aan een instabiliteit

Omdat in bepaalde stalen geen pieken voor de componenten bepaald konden

worden, vinden we onvolled

de paprikastalen bij SPI I en voor de aarda

FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS 8,22 MIN.

zijn pieken bij SAL terug te vinden, dit wijst op mogelijke

contaminatie van de gebruikte solventen voor extractie en clean-up. Alle solventen

rden onderzocht, maar er wordt geen contaminatie gevonden.

onderzocht worden waarom in alle stalen sporen van SAL terug te vinden zijn en of

LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding en intra

reproduceerbaarheid

De resultaten van de pre-validatie (4.3.) worden gebruikt voor het inschatten van

de gevoeligheid van de methode. Aan de hand hiervan kan de MRPL bepaald

worden. Dit wordt gebruikt bij het maken van standaard mengsels voor belasting bij

bij de validatie geen pieken gevonden voor AMOX, NIC, PEN G, LAS

Voor DIC werd bij de extra testen aangetoond dat dit te wijten is aan het


factoren voor clean-up en extractie niet optimaal zijn voor deze

antibiotica of het is te wijten aan een instabiliteit van de standaarden.


nvolledige gegevens voor de wortelstalen bij ATC en AMP, voor

de paprikastalen bij SPI I en voor de aardappelstalen bij NAR, SAL en MON.

40

FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS

SAL terug te vinden, dit wijst op mogelijke

up. Alle solventen

geen contaminatie gevonden. Er moet verder

AL terug te vinden zijn en of

terugvinding en intra -lab

validatie (4.3.) worden gebruikt voor het inschatten van

n de hand hiervan kan de MRPL bepaald

s voor belasting bij

gevonden voor AMOX, NIC, PEN G, LAS

angetoond dat dit te wijten is aan het


up en extractie niet optimaal zijn voor deze

van de standaarden.


voor de wortelstalen bij ATC en AMP, voor

ppelstalen bij NAR, SAL en MON.

Op dag 1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag

2 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met aardappel en de laatste reeks die

gemaakt werd op dag 3 was 6 stalen op 4 concentratieniveaus met groene paprika.

Omdat er een probleem wa

geplande dag uitgevoerd worden en werden uitgesteld. Dit had als gevolg dat stalen

de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij

andere stalen onmiddellijk of na slechts

Het effect hiervan is vooral te vinden bij de anhydrovormen

ACTC. In figuur 4.2. vergelijken we de c

van ATC met wortel en paprika als matrix. Voor de paprikastalen worden duidelijke

pieken gevonden die overeenkomen met de retentietijd van ATC, op de

chromatogrammen van de wortelstalen is geen duidelijke piek te zien voor ATC.

Mogelijk is er een gebrek

droog bewaren van de stalen

vooraleer ze heropgelost w

componenten wordt enkel rekening gehouden me

aardappel en van paprika.

FIGUUR 4.2.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) EN PAPRIKA (RECHTS)

CONCENTRATIE VAN 20 PPB.

1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag



Omdat er een probleem was met de Quattro Premier konden de analyses niet op de


de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij

andere stalen onmiddellijk of na slechts een paar dagen verder geanalyseerd werden.

Het effect hiervan is vooral te vinden bij de anhydrovormen:

ACTC. In figuur 4.2. vergelijken we de chromatogrammen voor de fragment




brek aan stabiliteit bij de anhydrovormen omwille van het

droog bewaren van de stalen voor de reeksen van wortel gedurende een week

vooraleer ze heropgelost werden in H2O/MeOH 90/10 (v/v) voor analyse.

componenten wordt enkel rekening gehouden met de resultaten uit de reeks van

.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) (RECHTS) ALS MATRIX. BEIDE STALEN WERDEN BELAST MET EEN

CONCENTRATIE VAN 20 PPB. DE RETENTIETIJD VOOR ATC IS 8,01 MIN.

41

1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag



s met de Quattro Premier konden de analyses niet op de


de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij -20°C. Terwijl de

een paar dagen verder geanalyseerd werden.

4EATC, ATC en

hromatogrammen voor de fragment-ionen




vormen omwille van het

gedurende een week

O/MeOH 90/10 (v/v) voor analyse. Voor deze

t de resultaten uit de reeks van

.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) EIDE STALEN WERDEN BELAST MET EEN

DE RETENTIETIJD VOOR ATC IS 8,01 MIN.

4.5.2.1. LOD & LOQ

De gevonden LOD en LOQ waarden zijn

hoger dan verwacht op basis

wijten aan de methode die gebruikt wordt voor het

komt overeen met drie keer de standaard

gedeeld door de richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve.

een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke com

vertekend beeld, omdat er

SPI III vinden we via de ijklijn een LOD van

zichtbaar zijn bij 50 ppb (figuur 4.3.)

ppb, terwijl er reeds duidelijke pieken zijn bij 1,5 ppb. Verder vinden we ook bij SPI I,

SPI II, BAC A, VGM M1 en SAL afwijkende resultaten.

Omwille van de vertekening

targetlynx wordt op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de

verhouding groter is dan 3, omdat hierbij het signaal zeker te onderscheiden is van

de ruis ten gevolge van de matrix.

SPI III een LOD van 50 ppb. Om m

antibioticaresiduen aanwezig zijn in een staal moet het antibiotica in een concentratie

aanwezig zijn die gelijk is aan de LOD. Om te kwantificeren moet de concentratie

minimaal gelijk zijn aan de LOQ.

FIGUUR 4.3.: CHROMATOGRAMDE MATRIX IS GROENE PAPRIKA

De gevonden LOD en LOQ waarden zijn voor een aantal componenten veel

hoger dan verwacht op basis van de toegevoegde concentraties antibiotica. Dit is te

die gebruikt wordt voor het bepalen van de waarden.

komt overeen met drie keer de standaarddeviatie van het snijpunt op de y

gedeeld door de richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve. Door het opstellen van

een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke com

vertekend beeld, omdat er te veel spreiding zit op de resultaten. Bijvoorbeeld bij

vinden we via de ijklijn een LOD van 211,5 ppb, terwijl reeds duidel

zichtbaar zijn bij 50 ppb (figuur 4.3.). Ook bij N4AS vinden we een LOD van 29,05


SPI II, BAC A, VGM M1 en SAL afwijkende resultaten.

Omwille van de vertekening wordt de LOD op een andere manier bepaald:

op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de


de ruis ten gevolge van de matrix. Op die manier bekomen we voor bijvoorbeeld

SPI III een LOD van 50 ppb. Om met deze methode aan te tonen dat



minimaal gelijk zijn aan de LOQ.

CHROMATOGRAMMEN VOOR SPI III, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 50 PPB,

DE MATRIX IS GROENE PAPRIKA, DE RETENTIETIJD VOOR SPI III IS 7,79 MIN.

42

voor een aantal componenten veel

van de toegevoegde concentraties antibiotica. Dit is te

bepalen van de waarden. De LOD

eviatie van het snijpunt op de y-as

het opstellen van

een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke component is er een

veel spreiding zit op de resultaten. Bijvoorbeeld bij

ppb, terwijl reeds duidelijke pieken

en LOD van 29,05


de LOD op een andere manier bepaald: via

op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de S/N-


Op die manier bekomen we voor bijvoorbeeld

et deze methode aan te tonen dat



VOOR SPI III, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 50 PPB, , DE RETENTIETIJD VOOR SPI III IS 7,79 MIN.

43

4.5.2.2. Relatieve terugvinding

Afhankelijk van de toegevoegde concentraties antibioticum moet de relatieve

terugvinding (in %) zich in een bepaald interval bevinden dat slechts beperkt mag

afwijken van de doelwaarde van 100%. De criteria die worden gehandhaafd voor de

relatieve terugvinding kunnen teruggevonden worden in richtlijn 2002/657/EG

(Europese Gemeenschap, 2002) en staan samengevat in tabel 4.3.

TABEL 4.3.: CRITERIA VOOR RELATIEVE TERUGVINDING

Voor de meeste componenten is er een goede relatieve terugvinding. De

gevalideerde waarden variëren van 75,24% voor AMP (2*MRPL) tot 119,21% voor

TRI (1*MRPL).

Bij de sulfonamiden zijn de resultaten voor SMTX licht afwijkend van de

bovengrens van 110%. De relatieve terugvinding bedraagt 111,34%, 114,02%, 86,10%

en 111,50% voor massafracties van respectievelijk 5, 10, 15 en 20 ppb. Enkel voor

1,5 keer de MRLP (15 ppb) voldoet de relatieve terugvinding aan de vooropgestelde

criteria. De overige sulfonamiden hebben goede relatieve terugvinding, variërend

tussen 86,57% voor SQX (massafractie 5 ppb) en 116,77% voor SDM (massafractie

1 ppb).

Bij de tetracyclines is er slechte relatieve terugvinding voor 4EATC, met

onmogelijke waarden boven 7000%. Zoals reeds opgemerkt bij 4.6. is dit te wijten

aan problemen met de stabiliteit van anhydrovormen bij het droog bewaren van de

wortelstalen gedurende een week. Daarom worden de resultaten opnieuw berekend

met weglating van de resultaten met wortel als matrix. Dan blijkt er een goede

relatieve terugvinding op 0.5, 1, 1.5 en 2 keer de MRPL (98,01%, 107,41%, 103,29%

en 108,00%). De waarden voor de relatieve terugvinding variëren bij de andere

tetracyclines tussen 91,21% voor OTC (massafractie 15 ppb) en 109,77% voor DC

(massafractie 15 ppb).

Massafractie Interval

≤ 1 µg/kg -50% - + 20 %

> 1 µg/kg tot 10 µg/kg -30% - + 10 %

≥ 10 µg/kg -20% - + 10%

Voor de coccidiostatica vinden we geen

overige componenten (SAL, MON, NAR en AMP) zijn er

boven 150%. Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,

91,99%, 154,71% en 117,70% voor massafracties van respectievelijk 0.1, 0.2, 0.3 en

0.4 ppb.

Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G

te nemen. TYL heeft een goede relatieve terugvinding voor alle

BAC A, SPI I en SPI II hebben ook goede relatieve terugvinding. SPI III heeft een

licht afwijkende relatieve terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,

113,01% en 116,70%). Er is heel

20,01%, 20,72% en 23,48%), toch zijn er duidelijk pieken en

stellen dat VGM M1 detecteerbaar is indien aanwezig bij

10 ppb (figuur 4.4.)

FIGUUR 4.4.: CHROMATOGRAM VAN VGMMATRIX IS PAPRIKA

4.5.2.3. Intra-laboratoriumreproduceerbaarheid (R)

Om te evalueren of er een goede

gebruik gemaakt van de criteria uit richtlijn 2002/657/EG

2002). Via de vergelijking van Horwitz

intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt (CVR) berekend.

Voor de coccidiostatica vinden we geen pieken voor LAS A, DIC en NIC. Voor de

onenten (SAL, MON, NAR en AMP) zijn er sterke uitschieters van

Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,


Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G

. TYL heeft een goede relatieve terugvinding voor alle belaste


terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,

113,01% en 116,70%). Er is heel lage relatieve terugvinding voor VGM

,72% en 23,48%), toch zijn er duidelijk pieken en daarom kunnen we

stellen dat VGM M1 detecteerbaar is indien aanwezig bij concentraties

.: CHROMATOGRAM VAN VGM M1, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 10 PPB, DE IS PAPRIKA, RETENTIETIJD VOOR VGM M1 IS 8,64 MIN.

laboratoriumreproduceerbaarheid (R)

Om te evalueren of er een goede intra-laboratoriumreproduceerbaarheid

gebruik gemaakt van de criteria uit richtlijn 2002/657/EG (Europese Gemeenschap

. Via de vergelijking van Horwitz (4.1) wordt de maximale waarde voor de

intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt (CVR) berekend.

44

LAS A, DIC en NIC. Voor de

sterke uitschieters van

Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,


Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G waar

belaste concentraties.


terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,

terugvinding voor VGM M1 (25,61%,

daarom kunnen we

concentraties van ongeveer

1, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 10 PPB, DE , RETENTIETIJD VOOR VGM M1 IS 8,64 MIN.

laboratoriumreproduceerbaarheid is wordt

Europese Gemeenschap,

(4.1) wordt de maximale waarde voor de

45

CV = 2(1 – 0,5 log C) (4.1) Waarbij: CV = variatiecoëfficiënt (%) C = massafractie als macht van 10

Voor massafracties onder 100 µg/kg (CV = 23%) zijn er onaanvaardbaar hoge

waarden wanneer met vergelijking 4.1 gewerkt wordt. Daarom moet de CVR zo klein

mogelijk zijn. We nemen als criteria dat de CVR best onder 23% ligt, met maximale

uitschieters tot 30%. Op figuur 4.5. zijn de chromatogrammen te vinden voor STZ in

de 3 matrices met belaste concentratie van 10 ppb, wat overeen komt met 2*MRPL.

STZ is een voorbeeld van een component met goed reproduceerbare resultaten.

Voor de sulfonamiden waarvoor tijdens de validatie aanvaardbare resultaten voor

de reproduceerbaarheid werden bekomen variëren de waarden tussen 9,56% voor

SMP (1*MRLP) en 29,06% voor SMTX (0,5*MRPL). Voor TRI, N4AS en SQX zijn de

resultaten op geen enkel niveau reproduceerbaar, de waarden variëren tussen 31,40%

voor TRI (2*MRPL) en 79,85% voor SQX (1*MRPL).

Ook bij de tetracyclines is de reproduceerbaarheid goed, de waarden liggen

tussen 11,99% voor TC (1*MRPL) en 29,28% voor 4ETC (2*MRPL). Slechte

reproduceerbaarheid is er voor de resultaten van ATC en 4EATC, wat mogelijk te

wijten is aan de lange, droge bewaring van de wortelstalen. De waarden variëren

tussen 32,91 voor ATC (1,5*MRPL) en 243,85% voor 4EATC (2*MRPL). Daarom

worden de resultaten voor de wortelstalen weggelaten. De reproduceerbaarheid is

dan goed voor ATC bij 0,5*MRPL (26,92%). Voor 4EATC vinden we 31,66%, 47,12%,

28,12% en 49,51%. Enkel voor 1,5 keer de MRPL is de reproduceerbaarheid goed,

maar de waarden liggen wel in een meer realistische range.

Voor NIC, LAS A en DIC zijn geen pieken, vanzelfsprekend kan de

reproduceerbaarheid voor deze componenten niet bepaald worden. Voor de overige

coccidiostatica valt alleen de reproduceerbaarheid voor AMP bij 1*MRPL (26,41%)

binnen de vastgelegde criteria. In alle andere gevallen is voldoet de

reproduceerbaarheid niet en varieert tussen 36,71% voor AMP (2*MRPL) en 77,66%

voor NAR (0,5*MRPL).

Voor TYL zijn de waarden reproduceerbaar voor alle

(13,25 %, 11,33%, 18,55% en

27,73%) en BAC A (24,74%)

87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III

criteria. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan

dus niet bepaald worden.

FIGUUR 4.5.: CHROMATOGRAM VOOR STZ IN AARDAPPEL (10 PPB

4.5.2.4. Herhaalbaarheid (r)

De maximale CV voor analyses onder herhaalbaarheidsomstandigheden is de

helft van de waarde berekend voor reproduceerbaar

(Europese Gemeenschap

(variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid) kleiner moet zijn dan 15%.

De herhaalbaarheid is voor de

de sulfonamiden zijn enkel de resultaten op 2*MRPL herhaal

SPD en SMP (13,08%, 14,91%, 13,72%, 13,75% en 10,59%). De overige CVr’s

variëren tussen 16,41% voor SPD en 79,68% voor N4AS

De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en

OTC (10,93%) en voor DC

wortel als matrix, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is

bij de anhydrovormen door lange tijd droog bewaren van de wortelstalen.

Voor TYL zijn de waarden reproduceerbaar voor alle belaste

%, 11,33%, 18,55% en 14,28%). Ook voor VGM M1 (21,57%, 28,14% en

%) zijn er reproduceerbare resultaten. Met waarden tussen

87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III

. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan

.: CHROMATOGRAM VOOR STZ IN AARDAPPEL (LINKS) EN PAPRIKA (PPB, RETENTIETIJD VOOR STZ IS 3,48 MIN.

Herhaalbaarheid (r)


helft van de waarde berekend voor reproduceerbaarheid met vergelijking 4.1.

p, 2002). We nemen als criteria dat de CVr


De herhaalbaarheid is voor de resultaten van de meeste componenten slecht. Bij

de sulfonamiden zijn enkel de resultaten op 2*MRPL herhaalbaar bij SGD, SDZ, STZ,


variëren tussen 16,41% voor SPD en 79,68% voor N4AS

De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en

%) en voor DC (13,50%). De herhaalbaarheid werd getest op stalen met

, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is


46

belaste concentraties

%). Ook voor VGM M1 (21,57%, 28,14% en

zijn er reproduceerbare resultaten. Met waarden tussen

87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III afwijkend van de

. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan

) EN PAPRIKA (RECHTS) BIJ


heid met vergelijking 4.1.

. We nemen als criteria dat de CVr


meeste componenten slecht. Bij

baar bij SGD, SDZ, STZ,


De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en 14,16%), voor

herhaalbaarheid werd getest op stalen met

, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is


47

Ondanks de slechte relatieve terugvinding zijn er resultaten herhaalbaar voor

AHTC (4,80% op 1,5*MRPL) en 4EATC (13,55% op 1*MRPL). Voor ACTC zijn er

geen pieken gevonden, de herhaalbaarheid kan niet bepaald worden voor deze

component. De CVr’s van de resultaten die niet herhaalbaar zijn schommelen tussen

18,04% voor TC (2*MRPL) en 46,93% voor DMC (0,5*MRPL).

Voor geen enkele component uit de groep coccidiostatica zijn de resultaten

herhaalbaar. Alle CVr’s hebben een waarde boven 15% met variatie tussen 17,38%

voor MON (1*MRPL) en 151,29% voor AMP (0,5*MRPL). Slechte herhaalbaarheid uit

deze groep zou ook te wijten kunnen zijn aan de lange bewaring van de wortelstalen.

Geen pieken werden gevonden voor NIC, LAS A en DIC, bijgevolg kan de

herhaalbaarheid van de methode voor deze componenten niet bepaald worden.

In de diverse groep zijn enkel de resultaten voor de macrolide TYL herhaalbaar

(13,87%, 14,16%, 7,75% en 13,89%). Voor de spiramycines schommelen de CVr’s

tussen 33,51% en 122,16%. BAC A heeft waarden tussen 25,83% en 36,06%. Voor

VGM M1 tenslotte zitten de CVr’s tussen 29,10% en 52,43%.

4.5.3. Conclusie validatie

Door de spreiding op de resultaten, die werd vast gesteld tijdens de validatie,

werden slechte waarden bekomen voor de reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid.

Bijgevolg kan er besloten worden dat de methode niet optimaal is om te gebruiken

als een kwantitatieve methode. De variatie van de resultaten voor

anhydrotetracyclines is te wijten aan de instabiliteit van de componenten in de

wortelstalen. Voor screening is de methode wel goed, bovendien kan een eerste

schatting gemaakt worden van de concentratie aanwezig in het staal. Dit wordt

bewezen door de goede relatieve terugvinding van de meeste componenten. Bij de

selectiviteitstesten werd reeds aangetoond dat antibiotica in reële omstandigheden

kunnen voorkomen in groenten.

48

4.6. VERDER ONDERZOEK

Bij de selectiviteit werden een aantal blanco matrices getest op mogelijke

interferentie, contaminatie of reële aanwezigheid van bepaalde componenten. Hierbij

werd TYL gedetecteerd in komkommer en TRI in champignons. Deze stalen moeten

verder onderzocht worden om de aanwezigheid te bevestigen. Verder moet de

concentratie bepaald worden om te kijken of het om significante of verwaarloosbare

hoeveelheden gaat. Om te onderzoeken of de aanwezigheid van antibioticaresiduen

in reële omstandigheden een significant probleem is moet een groter aantal stalen

geanalyseerd worden. De aanwezigheid van SAL in alle matrices bij de testen voor

de selectiviteit kon niet opgehelderd worden. Hier moet verder onderzoek naar

gedaan worden.

Er moeten ook verdere testen gebeuren voor de detectie van AMOX, NIC, PEN

G, LAS A en DIC. Bij DIC werd aangetoond dat het gebruik van OASIS-kolommen

nadelig is. DIC bindt beter met C18-kolommen voor clean-up. Voor de overige

componenten kan getest worden of een bepaalde factor van de clean-up en extractie

ook niet optimaal is. Ook de stabiliteit van de componenten kan getest worden door

de procedure voor extractie en clean-up te vergelijken met oude en vers bereide

standaard mengsels.

De resultaten voor anhydrotetracyclines zijn afwijkend omwille van mogelijke

instabiliteit bij lang en droog bewaren van de extracten bij -20°C. De stalen met

wortel als matrix werden immers een week op voorhand bereid en gedroogd,

vooraleer ze geanalyseerd werden op de LC-MS/MS. De 2 reeksen wortel werden

niet hernomen omdat de slechte resultaten bij de reeks van aardappel en van

paprika er reeds op wijzen dat de methode niet voldoet aan de validatiecriteria voor

een kwantitatieve methode. Om te testen of de bewaring invloed heeft op de

stabiliteit van bepaalde componenten moet de validatie hernomen worden. Hierbij

moeten de gemaakte stalen na drogen heropgelost worden in H2O/MeOH 90/10 (v/v)

om onmiddellijk te analyseren.

49

5. CONCLUSIE

Er werd gezocht naar een methode om groenten te analyseren op antibiotica.

Deze methode moet toelaten om in de toekomst vast te stellen of er een reëel

probleem is met antibioticaresiduen in groenten als gevolg van het gebruik van

antibiotica in de veeteelt.

Uit de testen voor de extractie en clean-up kan besloten worden dat de extractie

voor de meerderheid van de componenten optimaal is wanneer gewerkt wordt met

7,5 mL MeOH/H2O 50/50 (v/v) als extractiesolvent. Voor de clean-up met SPE wordt

6 mL extract overgebracht op een OASIS HLB-kolom, gewassen met 5 mL H2O, en

vervolgens geëlueerd met 2 mL MeOH.

Bij de selectiviteit werden een aantal blanco matrices getest op mogelijke

interferentie, contaminatie of reële aanwezigheid van bepaalde componenten. Door

aanwezigheid van 2 ionen, S/N-verhouding, retentietijd en piekverhouding van de

ionen te controleren kunnen componenten gedetecteerd worden. Op die manier werd

TYL gedetecteerd in komkommer en TRI in champignons. Deze stalen dienen verder

te worden onderzocht om hun aanwezigheid te bevestigen en aanwezige

concentraties te bepalen.

Er werd gewerkt met een ijklijn die de lineaire trend bepaald voor de berekening

van de LOD en de LOQ. Hierdoor wijken de resultaten sterk af van de resultaten

verwacht aan de hand van de chromatogrammen, waarbij de LOD gelijk staat aan

een S/N van minstens 3. De relatieve terugvinding is voor de meeste componenten

goed, de methode geeft een goede indicatie van de aanwezige concentratie

antibioticaresiduen. Er zit wel te veel spreiding op de resulaten, die zorgt voor een

slechte intralaboratoriumreproduceerbaarheid en vooral heel slechte herhaalbaarheid.

Enkel voor TYL kan de methode gevalideerd worden voor alle criteria bij alle belaste

concentraties.

De multi-klasse, multi-residu methode is niet geschikt voor de kwantitatieve

bepaling van antibiotica in groenten. Door de verschillende fysico-chemische

eigenschappen van de diverse componenten moest er een compromis gesloten

worden bij de extractie en clean-up waardoor deze stap niet optimaal is voor alle

componenten.

50

Er is geen kwantificering mogelijk van de verschillende antibiotica, daarom kan

de methode niet gebruikt worden voor het bepalen van maximale residugehalten. De

methode is echter wel geschikt voor de screening van antibiotica in groenten,

uitgezonderd AMOX, NIC, PEN G, LAS A en DIC. Deze componenten kunnen niet

gedetecteerd worden. Bij DIC is dit te wijten aan het gebruik van OASIS HLB

kolommen. DIC bindt beter aan C18-kolommen voor clean-up, maar de methode is

optimaal voor de meerderheid van de componenten wanneer met OASIS kolommen

gewerkt wordt.

De resultaten van de selectiviteit bevestigen dat de methode als

screeningsmethode kan gebruikt worden. De resultaten tonen aan dat

antibioticaresiduen mogelijk in reële omstandigheden in groenten worden

opgenomen. Hoewel het op basis van deze resultaten lijkt dat het om een

verwaarloosbaar probleem zou gaan dienen er aanzienlijk meer stalen te worden

geanalyseerd om een gegronde uitspraak te doen met betrekking tot de prevalentie

van antibiotica in groenten.

51

6. LITERATUURSLIJST

Aguilera-Luiz, M. M.; Vidal, J. L.; Romero-Gonzalez, R.; Frenich, A. G. (2008). Multi-residue determination of veterinary drugs in milk by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1205, 10-16.

Barriere, J. C.; Berthaud, N.; Beyer, D.; Dutka-Malen, S.; Paris, J. M.; Desnottes, J. F. (1998). Recent developments in streptogramin research. Current Pharmaceutical Design, 4, 155-180.

Bennett, P. M. (2008). Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol, 153 Suppl 1, S347-357.

Blasco, C.; Torres, C. M.; Pico, Y. (2007). Progress in a antibacterials analysis of residual in food. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 26, 895-913.

Blumberg, P. M.; Strominger, J. L. (1974). Interaction of penicillin with the bacterial cell: penicillin-binding proteins and penicillin-sensitive enzymes. Bacteriol Rev, 38, 291-335.

Bohm, D. A.; Stachel, C. S.; Gowik, P. (2009). Multi-method for the determination of antibiotics of different substance groups in milk and validation in accordance with Commission Decision 2002/657/EC. Journal of Chromatography A, 1216, 8217-8223.

Boison, J.; Lee, S.; Gedir, R. (2009). Analytical Determination of Virginiamycin Drug Residues in Edible Porcine Tissues by LC-MS with Confirmation by LC-MS/MS. Journal of Aoac International, 92, 329-339.

Boxall, A.; Long, C. (2005). Veterinary medicines and the environment. Environ Toxicol Chem, 24, 759-760.

Boxall, A. B.; Kolpin, D. W.; Halling-Sorensen, B.; Tolls, J. (2003). Are veterinary medicines causing environmental risks? Environ Sci Technol, 37, 286A-294A.

Chander, Y.; Gupta, S. C.; Goyal, S. M.; Kumar, K. (2007). Perspective - Antibiotics: Has the magic gone? Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, 739-742.

Chico, J.; Rubies, A.; Centrich, F.; Companyo, R.; Prat, M. D.; Granados, M. (2008). High-throughput multiclass method for antibiotic residue analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1213, 189-199.

Danaher, M.; Campbell, K.; O'Keeffe, M.; Capurro, E.; Kennedy, G.; Elliott, C. T. (2008). Survey of the anticoccidial feed additive nicarbazin (as dinitrocarbanilide residues) in poultry and eggs. Food Additives and Contaminants, 25, 32-40.

Dubreil-Cheneau, E.; Bessiral, M.; Roudaut, B.; Verdon, E.; Sanders, P. (2009). Validation of a multi-residue liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory method for 10 anticoccidials in eggs according to Commission Decision 2002/657/EC. J Chromatogr A, 1216, 8149-8157.

Europese Gemeenschap (1996). Richtlijn 96/23/EG van de Raad van 29 april 1996 inzake controlemaatregelen ten aanzien van bepaalde stoffen en residuen daarvan in levende dieren en in produkten daarvan en tot intrekking van de Richtlijnen 85/358/EEG en 86/469/EEG en de Beschikkingen 89/187/EEG en 91/664/EEG. Publicatieblad, L 125, 10 - 32.

Europese Gemeenschap (2001). Richtlijn 2001/82/EG: tot vaststelling van een communautair wetboek betreffende geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik. Publicatieblad, L 311, 1–66.

52

Europese Gemeenschap (2002). Beschikking 2002/657/EG van de Commissie van 12 augustus 2002 ter uitvoering van Richtlĳn 96/23/EG van de Raad wat de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten betreft. Publicatieblad, L 221, 8–36.

Europese Gemeenschap (2009). Verordening 470/2009/EG tot vaststelling van communautaire procedures voor het vaststellen van grenswaarden voor residuen van farmacologisch werkzame stoffen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong, tot intrekking van Verordening (EEG) nr. 2377/90 van de Raad en tot wijziging van Richtlijn 2001/82/EG van het Europees Parlement en de Raad en van Verordening (EG) nr. 726/2004 van het Europees Parlement en de Raad. Publicatieblad van de Europese Unie, L 152,11-22.

Focht, C. (2008). Determination of lasalocid sodium in animal feeds and premixes by reversed-phase liquid chromatography: Collaborative study. Journal of Aoac International, 91, 479-488.

Gaugain-Juhel, M.; Delepine, B.; Gautier, S.; Fourmond, M. P.; Gaudin, V.; Hurtaud-Pessel, D.; Verdon, E.; Sanders, P. (2009). Validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry screening method to monitor 58 antibiotics in milk: a qualitative approach. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 26, 1459-1471.

Gorp, N. V. (2009). Ontwikkeling van een procedure voor de evaluatie van de bindingscapaciteit van mycotoxineadsorberende kleimaterialen, master thesis at Katholieke hogeschool Kempen, Belgium.

Granelli, K.; Elgerud, C.; Lundstrom, A.; Ohlsson, A.; Sjobery, P. (2009). Rapid multi-residue analysis of antibiotics in muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 637, 87-91.

Gros, M.; Petrovic, M.; Barcelo, D. (2006). Development of a multi-residue analytical methodology based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for screening and trace level determination of pharmaceuticals in surface and wastewaters. Talanta, 70, 678-690.

Guillarme, D.; Schappler, J.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L. (2010). Coupling ultra-high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 29, 15-27.

Haggett, E. F.; Wilson, W. D. (2008). Overview of the use of antimicrobials for the treatment of bacterial infections in horses. Equine Veterinary Education, 20, 433-448.

http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/Antibiotic_actions.jpg. (13-03-2010). http://www.cbip-vet.be/. (25-03-2010). Jakobsen, I. H. (2009). Analysis of selected benzodiazepines in the environment by

HF-LPME and LC-MS/MS. Master thesis at University of Tromsø, Noorwegen. .

Jamil, B.; Hasan, F.; Hameed, A.; Ahmed, S. (2007). Isolation of bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production. Pak J Pharm Sci, 20, 26-31.

Jindal, A.; Kocherginskaya, S.; Mehboob, A.; Robert, M.; Mackie, R. I.; Raskin, L.; Zilles, J. L. (2006). Antimicrobial use and resistance in swine waste treatment systems. Applied and Environmental Microbiology, 72, 7813-7820.

Kumar, K.; Gupta, S. C.; Baidoo, S. K.; Chander, Y.; Rosen, C. J. (2005). Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure. J Environ Qual, 34, 2082-2085.

53

Lee, S. H.; Rho, Y. T. (1999). Improvement of tylosin fermentation by mutation and medium optimization. Lett Appl Microbiol, 28, 142-144.

Li, X. Z.; Mehrotra, M.; Ghimire, S.; Adewoye, L. (2007). beta-Lactam resistance and beta-lactamases in bacteria of animal origin. Vet Microbiol, 121, 197-214.

McDermott, P. F.; Zhao, S.; Wagner, D. D.; Simjee, S.; Walker, R. D.; White, D. G. (2002). The food safety perspective of antibiotic resistance. Animal Biotechnology, 13, 71-84.

McGlinchey, T. A.; Rafter, P. A.; Regan, F.; McMahon, G. P. (2008). A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matrices. Anal Chim Acta, 624, 1-15.

Monser, L.; Darghouth, F. (2000). Rapid liquid chromatographic method for simultaneous determination of tetracyclines antibiotics and 6-Epi-doxycycline in pharmaceutical products using porous graphitic carbon column. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 23, 353-362.

Olejnik, M.; Szprengier-Juszkiewicz, T.; Jedziniak, P. (2009). Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 8141-8148.

Park, S. R.; Han, A. R.; Ban, Y. H.; Yoo, Y. J.; Kim, E. J.; Yoon, Y. J. (2010). Genetic engineering of macrolide biosynthesis: past advances, current state, and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol, 85, 1227-1239.

Quattro-LC-operator-training-course. Schleifer, K. H.; Kandler, O. (1972). Peptidoglycan types of bacterial cell walls and

their taxonomic implications. Bacteriol Rev, 36, 407-477. Skold, O. (2000). Sulfonamide resistance: mechanisms and trends. Drug Resist

Updat, 3, 155-160. Smith, D. L.; Johnson, J. A.; Harris, A. D.; Furuno, J. P.; Perencevich, E. N.; Morris, J.

G. (2003). Assessing risks for a pre-emergent pathogen: virginiamycin use and the emergence of streptogramin resistance in Enterococcus faecium. Lancet Infectious Diseases, 3, 241-249.

Spisso, B. F.; de Araujo, M. A., Jr.; Monteiro, M. A.; Lima, A. M.; Pereira, M. U.; Luiz, R. A.; da Nobrega, A. W. (2009). A liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory assay for the simultaneous determination of several tetracyclines in milk considering keto-enol tautomerism and epimerization phenomena. Anal Chim Acta, 656, 72-84.

Srinubabu, G.; Ratnam, B. V. V.; Rao, A. A.; Rao, M. N. (2008). Development and validation of LC-MS/MS method for the quantification of Oxcarbazepine in human plasma using an experimental design. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 56, 28-33.

Tenover, F. C. (2006). Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. American Journal of Infection Control, 34, S3-10; discussion S64-73.

Ungemach, F. R.; Mueller-Bahrdt, D.; Abraham, G. (2006). Guidelines for prudent use of antimicrobials and their implications on antibiotic usage in veterinary medicine. International Journal of Medical Microbiology, 296, 33-38.

Wan, E. C.; Ho, C.; Sin, D. W.; Wong, Y. C. (2006). Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 385, 181-188.

54

Wan, E. C. H.; Ho, C.; Sin, D. W. M.; Wong, Y. C. (2006). Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 385, 181-188.

Wang, J.; Leung, D. (2009). Determination of spiramycin and neospiramycin antibiotic residues in raw milk using LC/ESI-MS/MS and solid-phase extraction. Journal of Separation Science, 32, 681-688.

Waters (2005). Quattro premier XE. infobrochure. Zakeri, B.; Wright, G. D. (2008). Chemical biology of tetracycline antibiotics. Biochem

Cell Biol, 86, 124-136.

ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING VAN...

Documents

Transcript of ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING VAN...