Studie van lange niet coderende RNA's in de ontwikkeling...

Studie van lange niet coderende RNA's in de

ontwikkeling van T-cel acute lymfoblastische

leukemie

Karen Verboom

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: prof. dr. Frank Speleman

Begeleider: Annelynn Wallaert

Vakgroep: Pediatrie en genetica (GE02)

Academiejaar 2014-2015

i

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze masterproef.”

Karen Verboom Prof. dr. F Speleman

ii

VOORWOORD

Met het schrijven van deze masterproef beëindig ik mijn studie Biomedische wetenschappen

en blik ik graag terug op de afgelopen 5 jaar. Ik koos voor deze opleiding vanuit mijn interes-

se in de medische wetenschap en de mens. Na het afronden van mijn bachelor besloot ik om

de master genetica te volgen. Gedurende deze twee masterjaren werd mijn interesse in weten-

schappelijk onderzoek steeds meer geprikkeld. Ik was dan ook blij dat ik na 4 jaar studeren de

theorie kon omzetten in de praktijk tijdens mijn masterstage. In deze masterproef onderzocht

ik de rol van lange niet coderende RNA's in T-cel acute lymfoblastische leukemie. Dit gaf mij

de kans mijn grootste interesses, kankeronderzoek en genetica, te combineren. Het jaar vloog

voorbij en voor ik deze masterproef afsluit, zou ik graag nog enkele mensen willen bedanken.

Eerst en vooral wil ik mijn promotor prof. dr. Frank Speleman bedanken om mij de kans gaf

mee te werken aan het project over lncRNA's en T-ALL. Verder wil ik ook Annelynn bedan-

ken voor de tijd die zij vrijmaakte om mij te begeleiden, mijn vragen te beantwoorden en deze

masterproef na te lezen, maar ook voor de aangename samenwerking. Aan alle medewerkne-

mers van het CMGG die steeds klaar stonden om hulp te bieden en die voor een goede sfeer

in het labo zorgden: hartelijk dank! Hierdoor was het steeds een plezier om in het labo te ko-

men werken.

Graag wil ik ook mijn medestudenten bedanken voor deze 5 fantastische jaren: voor het op-

lossen van mijn vragen, de motivatie op drukke momenten, maar vooral voor de ontspannende

uitstapjes na de lessen om stoom af te blazen.

Ik bedank ook mijn ouders en zus voor de steun en aanmoedigingen gedurende deze 5 jaar en

voor de talrijke verwennerijen, elke examenperiode opnieuw. Verder wil ik graag Jarne be-

danken voor de steun en het vertrouwen tijdens deze 5 jaar. Tenslotte wil ik mijn vriendinnen

bedanken voor al de leuke momenten, die mij de kans gaven om te ontspannen in drukke pe-

rioden.

Bedankt!

iii

INHOUDSTABEL

AUTEURSRECHT .................................................................................................................... i

VOORWOORD ........................................................................................................................ ii

INHOUDSTABEL ................................................................................................................... iii

OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE AFKORTINGEN .................................................. vi

SAMENVATTING ................................................................................................................... 1

SUMMARY ............................................................................................................................... 2

1 INLEIDING ........................................................................................................... 3

1.1 Hematopoëse en T-cel ontwikkeling ................................................................................... 3

1.1.1 Hematopoëse ....................................................................................................................... 3

1.1.2 Ontwikkeling van T-lymfocyten ......................................................................................... 3

1.2 T-cel acute lymfoblastische leukemie ................................................................................. 5

1.2.1 Kanker ................................................................................................................................. 5

1.2.2 Leukemie ............................................................................................................................. 7

1.2.3 T-cel acute lymfoblastische leukemie ................................................................................. 8

1.2.3.1 Incidentie .............................................................................................................................8

1.2.3.2 Genetische oorsprong van T-ALL .......................................................................................8

1.2.3.3 Behandeling .......................................................................................................................11

1.3 Lange niet coderende RNA's ............................................................................................. 11

1.3.1 Types niet coderend RNA ................................................................................................. 11

1.3.2 Functies van lncRNA's ...................................................................................................... 12

1.3.3 lncRNA's in het immuunsysteem ...................................................................................... 13

1.3.4 lncRNA's en kanker ........................................................................................................... 13

1.4 CRISPR/Cas9 .................................................................................................................... 14

1.5 Doel ................................................................................................................................... 16

2 MATERIALEN EN METHODEN .................................................................... 18

2.1 Cellijnen ............................................................................................................................ 18

2.2 Klonering van gRNA's in CRISPR plasmiden .................................................................. 18

2.2.1 Oligo design en annealing ................................................................................................. 18

2.2.2 Restrictie en ligatie ............................................................................................................ 19

2.2.3 Transformatie van E. coli .................................................................................................. 19

2.2.4 Plasmide isolatie ................................................................................................................ 20

2.2.5 Klonering van 2 gRNA's in een CRISPR plasmide ........................................................... 20

2.2.5.1 Isolatie van gRNA's door middel van een PCR reactie .....................................................20

2.2.5.2 Digestie en ligatie van gRNA PCR fragmenten en CRISPR plasmiden ............................20

iv

2.2.5.3 Transformatie van E. coli en DNA isolatie ........................................................................21

2.3 Elektroporatie in T-ALL cellijnen ..................................................................................... 21

2.3.1 Elektroporatie LNA's/ASO's ............................................................................................. 21

2.3.2 Elektroporatie plasmiden ................................................................................................... 21

2.3.3 Elektroporatie met een elektroporatiebuffer ...................................................................... 21

2.4 RT-qPCR ........................................................................................................................... 22

2.4.1 RNA isolatie ...................................................................................................................... 22

2.4.2 cDNA synthese .................................................................................................................. 22

2.4.3 RT-qPCR ........................................................................................................................... 22

2.5 Transfectie van HEK293TN cellen ................................................................................... 22

2.6 FACS analyse .................................................................................................................... 23

2.6.1 CD45 ................................................................................................................................. 23

2.6.2 GFP .................................................................................................................................... 23

2.6.3 Sorteren van GFP positieve cellen .................................................................................... 23

2.7 PCR ................................................................................................................................... 24

2.7.1 DNA isolatie ...................................................................................................................... 24

2.7.2 PCR ................................................................................................................................... 24

2.8 Western blot ...................................................................................................................... 24

2.8.1 Cellyse en eiwit denaturatie ............................................................................................... 24

2.8.2 SDS-PAGE en Western blotting ....................................................................................... 24

2.8.3 Immunoblotting ................................................................................................................. 25

3 RESULTATEN .................................................................................................... 26

3.1 Neerregulatie van LUNAR1 door LNA's en ASO's ........................................................... 26

3.1.1 Elektroporatie van LNA's tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen .......................................... 26

3.1.2 Elektroporatie van een LNA en een ASO tegen LUNAR1 in CUTLL1 en HBP-ALL cellen

28

3.1.3 Besluit ................................................................................................................................ 29

3.2 Optimalisatie van het CRISPR/Cas9 systeem ................................................................... 29

3.2.1 Optimalisatie van de elektroporatie met het pEGFP-C1 plasmide .................................... 29

3.2.1.1 Optimalisatie van de elektroporatie in verschillende cellijnen ..........................................29

3.2.1.2 Optimalisatie van de elektroporatie met verschillende condities .......................................31

3.2.2 Optimalisatie met CRISPR plasmiden .............................................................................. 33

3.2.2.1 pX458 plasmide .................................................................................................................33

3.2.2.2 Elektroporatie van pX330-CD45 in JURKAT cellen ........................................................34

3.2.2.3 Elektroporatie van pX321-CD45 in een Cas9 stabiele JURKAT cellijn ...........................35

3.2.3 Besluit ................................................................................................................................ 36

v

3.3 Knock out van LUNAR1 met het CRISPR/Cas9 systeem .................................................. 36

3.3.1 Knock out van LUNAR1 door het pX458 CRISPR plasmide met 2 gRNA's ..................... 36

3.3.2 Besluit ................................................................................................................................ 41

4 BESPREKING ..................................................................................................... 42

5 CONCLUSIE ....................................................................................................... 48

6 REFERENTIES ................................................................................................... 49

7 ADDENDUM .......................................................................................................... I

7.1 Materialen en methoden ....................................................................................................... I

7.2 Resultaten .......................................................................................................................... III

7.3 Protocols ........................................................................................................................ XXX

7.3.1 Klonering gRNA's in CRISPR plasmiden ..................................................................... XXX

7.3.2 Klonering 2 gRNA's in een CRISPR plasmide .......................................................... XXXV

7.3.3 Elektroporatie ASO's/ LNA's ................................................................................. XXXVIII

7.3.4 Elektroporatie plasmiden ...........................................................................................XXXIX

7.3.5 Elektroporatie plasmiden met een elektroporatiebuffer ................................................... XL

7.3.6 Cellen collecteren ............................................................................................................ XLI

7.3.7 RNA isolatie .................................................................................................................. XLII

7.3.8 cDNA synthese ............................................................................................................. XLIII

7.3.9 RT-qPCR ...................................................................................................................... XLIV

7.3.10 Transfectie van HEK293TN cellen ............................................................................... XLV

7.3.11 FACS: analyse van GFP positieve cellen ....................................................................XLVII

7.3.12 FACS: analyse van CD45 positieve cellen ................................................................ XLVIII

7.3.13 FACS: GFP positieve cellen sorteren ........................................................................... XLIX

7.3.14 DNA isolatie ........................................................................................................................ L

7.3.15 PCR .................................................................................................................................... LI

7.3.16 Western blot .................................................................................................................... LIII

vi

OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE AFKORTINGEN

Afkorting Uitleg

ABL1 Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1

AKT RAC α serine/threonine-protein kinase

ALL Acute lymfoblastische leukemie

ALT Alternative lengthening of telomeres

AML Acute myeloïde leukemie

ASO Antisense oligonucleotide

ATP Adenosinetrifosfaat

B-ALL B-cel acute lymfoblastische leukemie

BAX BCL2-associated X protein

BCL B-cell lymphoma

bHLH Basic helix-loop-helix

Bp Basenparen

BSA Bovine serum albumin

CD Cluster of differentiation

CDK Cyclin dependent kinase

CDKN2A/2B Cyclin dependent kinase inhibitor 2A/2B

CLL Chronische lymfoblastische leukemie

CMGG Centrum voor Medische Genetica Gent

CML Chonische myeloïde leukemie

CRISPR/Cas9 Clustered regulary interspaced short palindromic repe-

ats/CRISPR-associated 9

crRNA CRISPR RNA

DLL1 Delta-like protein 1

DN Dubbel negatief

DNA Desoxyribonucleïc acid

DNMT3A DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3A

DP Dubbel positief

E. coli Escherichia coli

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ETS6 Ets variant 6

FACS Fluorescence-actviated cell sorting

FBXW7 F-box/WD repeat-containing protein 7

FCS Feutaal kalfsserum

FLT3 Fms-related tyrosine kinase 3

FSC Forward scatter

GAS5 Growth arrest-specific 5

GFP Green fluorescent protein

GOF Gain of function

GRIN1 Glutamate receptor ionotropic N-methyl D-aspartate 1

gRNA Guide RNA

GSI γ-secretase inhibitor

vii

HDR Homology-directed repair

HER 2 Human epidermal growth factor receptor

HOTAIR HOX transcript antisense RNA

HOTAIRM HOXA transcript antisense RNA, myeloid-specific

HOX Homeobox

HPV Humaan papillomavirus

HRP Horse radish peroxidase

ICN1 Intracellulair domein van Notch1

IGF Insulin-like growth factor

IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor

IL2 Interleukine 2

Kb Kilobasen

LMO LIM-only domein

LNA Locked nucleic acid

lncRNA Long noncoding RNA

LOF Loss of function

LUNAR1 Leukemia-induced noncoding activator RNA1

LYL Lymphoblastic leukemia associated hematopoiesis regulator

MALAT1 Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1

MHC Major histocompatibility complex

miRNA microRNA

MLL Mixed-lineage leukemia

MLLT10 Mixed-lineage leukemia translocated 10

mRNA Messenger RNA

ncRNA Noncoding RNA

NFkB Nuclear factor kappa B

NHEJ Nonhomologous end-joining

NK Natural killer

NMDA N-methyl-D-aspartaat

NRON Noncoding repressor of NFAT

NUP214 Nucleoporin 214

PAM Protospacer-adjacent motif

PBS Phosphate buffered saline

PCGEM1 Prostate-specific transcript 1

PCR Polymerase chain reaction

PE Phyco-erytrine

PEI Polyehtyleenimine

PI3K Phosphatidylinositide 3-kinase

PICALM Phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate

piRNA PIWI-interacting RNA

PKB Proteine kinase B

pRB Retinoblastoma protein

viii

PTEN Phosphatase and tensin homolog

RAS Rat sarcoma viral oncogene homolog

RNA Ribonucleic acid

RNAi RNA-interferentie

RPM Rounds per minute

rRNA Ribosomaal RNA

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

shRNA Small hairpin RNA

SIL SCL interupting locys

siRNA Small interfering RNA

snoRNA Small nucleolar RNA

snRNA Small nuclear RNA

SRA Steroid receptor RNA activator

SSC Side scatter

TAL T-cell acute lymphocytic leukemia

TALEN Transcription activator-like effector nuclease

T-ALL T-cel acute lymfoblastische leukemie

T-ALL-R-LncR1 T-ALL related long non-coding RNA 1

TBS Tris buffered saline

TBST Tris buffered saline/Tween

TCR T-cel receptor

TERRA Telomeric repeat-containing RNA

TLX T-cell leukemia homeobox

TNFα Tumor necrosis factor α

TP53 Tumor protein 53

TracrRNA Trans-activating crRNA

tRNA Transfer RNA

VEGF Vascular endothelial growth factor

ZFN Zinc finger nuclease

αHIF Alpha-hypoxia inducible factor

SAMENVATTING

1

SAMENVATTING

T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) is een hematologische kanker die ontstaat door

een maligne transformatie van T-lymfocyten. Ondanks de vooruitgang in de therapieën blijft

de prognose voor chemotherapie resistente en hervallen patiënten slecht en zorgen de thera-

pieën voor ernstige bijwerkingen. Daarom is het essentieel om de moleculaire pathways ver-

der te onderzoeken en meer effectieve therapieën te ontwikkelen. Recent werd een nieuwe

klasse van niet coderende RNA's, lange niet coderende RNA's (lncRNA's), ontdekt. Voor en-

kele van deze lncRNA's is reeds aangetoond dat ze betrokken zijn in T-ALL. Zo werd in het

Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) recent het lncRNA netwerk downstream van

NOTCH1 beschreven in zowel de normale T-cel ontwikkeling als in T-ALL. Eén van deze

NOTCH1 gereguleerde lncRNA's is LUNAR1, dat in deze masterproef geselecteerd werd voor

neerregulatie door middel van LNA's, ASO's en het CRISPR/Cas9 systeem.

RT-qPCR toonde aan dat neerregulatie van LUNAR1 door middel van ASO's en LNA's ver-

waarloosbaar is. Daarom werd er geopteerd om LUNAR1 neer te reguleren met het CRIS-

PR/Cas9 systeem. Deze techniek werd recent geïntroduceerd in het CMGG en er werden

reeds succesvolle resultaten bekomen bij de zebravis. Om deze techniek te kunnen toepassen

werden eerst de optimale condities voor plasmide elektroporatie bepaald met een GFP-

plasmide. Opnames met de fluorescentiemicroscoop en FACS resultaten toonden aan dat de

hoogste elektroporatie-efficiëntie bereikt werd in JURKAT cellen en met 175 V, 30 µg plas-

mide en 8 pulsen of met 250 V, 10 µg plasmide en 8 pulsen. De werking van Cas9 kon wor-

den aangetoond door CRISPR plasmiden die het membraaneiwit CD45 targetten in JURKAT

cellen te elektroporeren. Met FACS werd een knock out van CD45 waargenomen met een

efficiëntie van 15,8 %. Door gebruik te maken van een Cas9 overexpresserende cellijn, kon

zelf een efficiëntie van 24,6 % bereikt worden. Aangezien het mogelijk was om CD45 uit te

schakelen met CRISPR/Cas9, werd in het laatste deel van deze masterproef geprobeerd om

LUNAR1 uit te schakelen met deze methode. Hiervoor werden 2 guide RNA's gekloneerd in

een CRISPR plasmide en werd dit plasmide geëlektroporeerd in CUTLL1, JURKAT en

HEK293TN cellen. Via RT-qPCR kon een beperkte daling in expressie van LUNAR1 waarge-

nomen worden op populatieniveau, wat op een knock out in enkele cellen kan wijzen. Herha-

lingen en verdere experimenten zijn nodig om deze resultaten te bevestigen.

Deze resultaten hebben bijgedragen tot de introductie en optimalisatie van het CRISPR/Cas9

systeem in het CMGG. Verdere experimenten en optimalisatie zijn noodzakelijk om grote

deleties van genen en lncRNA's te verkrijgen.

SUMMARY

2

SUMMARY

Background: Recently, the role of lncRNAs in normal development and disease has been

shown. There is already some evidence that these lncRNAs are also involved in T-ALL, but

further research is needed to investigate the function of these lncRNAs and to discover other

lncRNAs involved in T-ALL.

Methods: Two techniques were used for downregulation of the lncRNA LUNAR1. First,

LNAs and ASOs were electroporated in T-ALL cell lines and RT-qPCR was performed for

expression analyses. Secondly, the CRISPR/Cas9 technology was optimized and used to

knock out LUNAR1. FACS, PCR and RT-qPCR were used for expression analysis.

Results: Downregulation of LUNAR1 by LNAs and ASOs was limited. Optimization of the

CRISPR/Cas9 system by a GFP-plasmid showed the highest electroporation efficiency in

JURKAT cells with 175 V, 30 µg of plasmid and 8 pulses or with 250 V, 10 µg of plasmid

and 8 pulses. Electroporation of the pX330-CD45 CRISPR plasmid in JURKAT cells resulted

in a CD45 knock out with 15,8 % efficiency and even 25 % in a Cas9 overexpressing cell

line. The aim of the last part of this masterthesis was to knock out LUNAR1 in JURKAT,

CUTLL1 and HEK293TN cells. RT-qPCR showed a downregulation in expression on popula-

tion level, hinting towards the presence of knock out cells. However, repetitions of this exper-

iment are needed to confirm these results.

Conclusion: These results have contributed to the optimization and the introduction of

CRISPR/Cas9 in the CMGG. However, further research and optimization is necessary to

achieve a big deletion of a gene or lncRNA.

INLEIDING

3

1 INLEIDING

1.1 Hematopoëse en T-cel ontwikkeling

1.1.1 Hematopoëse

Bloed bestaat uit rode bloedcellen die zuurstof vervoeren, plaatjes die zorgen voor stolling in

beschadigde weefsels en witte bloedcellen die een rol spelen in de immuunafweer. Al deze

cellen ontwikkelen zich in het beenmerg uit de pluripotente hematopoïetische stamcellen die

zelf differentiëren in myeloïde en lymfoïde voorlopercellen. De myeloïde voorlopercellen

ontwikkelen verder in rode bloedcellen, megakaryocyten, monocyten, dendritische cellen en

granulocyten (eosinofielen, neutrofielen en basofielen). De lymfoïde voorlopercellen produce-

ren natural killer (NK) cellen, B- en T- lymfocyten (1) (Figuur 1). Hoewel de meeste bloed-

celtypes zich in het beenmerg ontwikkelen, migreren de voorlopercellen van de T-lymfocyten

via het bloed naar de thymus voor hun ontwikkeling (1,2). Na maturatie migreren deze cellen

naar perifere weefsels of circuleren ze in de bloedbaan of lymfevaten (1).

Figuur 1: de hematopoëse. Schematische voorstelling van de ontwikkeling van de verschillende celtypes in het

bloed uit de pluripotente hematopoïetsiche stamcel (3).

1.1.2 Ontwikkeling van T-lymfocyten

T-lymfocyten ontstaan uit lymfoïde voorlopercellen die vanuit het beenmerg naar de thymus

migreren. Daar krijgen ze een signaal om te prolifereren en brengen ze de eerste oppervlakte-

moleculen zoals CD34 tot expressie (dubbel negatief (DN) stadium) (1,2,4). Deze DN cellen

kunnen opgedeeld worden in vier opeenvolgende stadia waarbij er een verschillende expressie

is van de oppervlaktemerkers CD44 en CD25 (2). De grootste meerderheid van deze T-

lymfocyten ontwikkelt in de αβ lijn, terwijl slechts een klein deel in de γδ lijn ontwikkelt.

Vervolgens vindt er in de T-cel receptor β (TCRβ) keten een herschikking plaats waarbij T-

INLEIDING

4

lymfocyten die geen succesvolle herschikking ondergaan hebben een niet functionele pre-

TCR zullen vormen en zullen sterven (β selectie). De functionele β-ketens vormen samen met

de pre-α-keten de pre-TCR en deze wordt samen met CD3, CD4 en CD8 tot expressie ge-

bracht (dubbel positief (DP) stadium). Na de herschikking van de α-keten volgt een positieve

selectie waarbij T-lymfocyten die met hun TCR kunnen binden aan major histocompatibility

complex (MHC) moleculen overleven en verder uitrijpen. Hierna is er ook een negatieve se-

lectie waarbij T-lymfocyten die te sterk interageren met lichaamseigen stoffen sterven door

apoptose omdat deze zouden kunnen zorgen voor auto-immuniteit (1,2). Na deze selectiestap-

pen matureren de T-lymfocyten verder en brengen ze ofwel CD4 ofwel CD8 tot expressie

waardoor ze single positief worden. Deze verschillende stappen gebeuren op verschillende

plaatsen in de thymus aangezien interacties met de medulla en cortex van de thymus belang-

rijk zijn tijdens de T-cel ontwikkeling (Figuur 2).

Figuur 2: T-cel ontwikkeling in de thymus. Ontwikkeling van hematopoïetische voorlopercellen tot naïeve T-

cellen in verschillende delen van de thymus.

DN = dubbel negatief, DP = dubbel positief, TCR = T-cel receptor, SP = single positief (2).

De naïeve T-lymfocyten migreren naar de lymfoïde organen waar ze geactiveerd kunnen

worden door de presentatie van een peptide door het MHC van gastheercellen (1). Na activa-

tie differentieert de T-lymfocyt in één van de drie types T-cellen. De CD8 positieve cellen

ontwikkelen verder in cytotoxische T-cellen en doden geïnfecteerde cellen. De CD4 positieve

cellen differentiëren in T-helper cellen, die andere cellen van het immuunsysteem zoals B-

lymfocyten en macrofagen stimuleren. Ten slotte zijn er nog de regulatorische T-cellen, die de

activiteit van andere lymfocyten onderdrukken en de immuunrespons controleren (1).

INLEIDING

5

1.2 T-cel acute lymfoblastische leukemie

1.2.1 Kanker

Kanker is een kwaadaardige woekering van cellen die ongecontroleerd groeien, andere weef-

sels binnendringen (invasie) en uitzaaien naar andere plaatsen (metastase). Door de tumor-

massa's kunnen lichaamsfuncties uitvallen, maar het zijn meestal de metastasen die tot het

overlijden van de patiënt leiden. Bij kanker ontstaan er veranderingen in het genoom waar-

door een normale cel getransformeerd wordt naar een tumorcel. Deze veranderingen kunnen

zowel door interne (bv. probleem met de transcriptie machinerie) als externe (bv. straling)

factoren veroorzaakt worden. In tumoren worden er typisch mutaties gevonden in twee klas-

sen van genen: proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen (5). Proto-oncogenen bevorderen

celgroei in gezonde cellen door regulatie van celproliferatie, differentiatie en apoptose. Door

gain of function (GOF) mutaties in deze proto-oncogenen komen ze tot overexpressie waar-

door ze celgroei bevorderen. Ze worden vanaf dat moment oncogenen genoemd. Tumorsup-

pressoren gaan celgroei tegen wanneer er een fout ontstaat in de celcylus of als er DNA her-

steld moet worden. Door loss of function (LOF) mutaties in deze tumorsuppressoren worden

ze geïnactiveerd waardoor de celgroei opnieuw bevorderd wordt (3,5). Aangezien kanker een

meer-stapsproces is en er naast mutaties ook interacties tussen de tumorcel en zijn omgeving

nodig zijn, ontwikkelt kanker zich vaak maar op latere leeftijd (5). Ondanks de vooruitgang in

diagnose en behandeling blijft kanker een belangrijke oorzaak van sterfte (6).

Om kanker te ontwikkelen moet een cel 6 essentiële veranderingen ondergaan, zoals beschre-

ven door Hanahan en Weinberg (Figuur 3).

Figuur 3: de zes kenmerken van kanker. Schematische weergave van de 6 essentiële eigenschappen van kan-

ker (5).

INLEIDING

6

Zo moet een kankercel zichzelf voorzien in signalen voor groei. In tegenstelling tot normale

cellen, die groeisignalen nodig hebben om te prolifereren, is een kankercel onafhankelijk van

externe groeifactoren zoals IGF. De reden hiervoor is dat een kankercel zelf groeifactoren

(bv. TNFα in sarcoma's) kan generen (autocriene stimulatie) of het aantal receptoren (bv.

HER2/neu receptor bij borstkanker) die gevoelig zijn aan groeifactoren kan doen stijgen

waardoor de cel hyperresponsief wordt. Ook wijzigingen downstream in de groeisignalisatie

pathway (bv. RAS) kunnen zorgen dat kankercellen sterk prolifereren. Een tweede eigenschap

die de kankercel moet verwerven is de ongevoeligheid voor tumorsuppressoren die prolifera-

tie inhiberen. Een belangrijke rol is hierbij weggelegd voor het retinoblastoma eiwit (pRB).

pRB inhibeert proliferatie door sequestratie van E2F waardoor de genen die belangrijk zijn

voor de progressie naar de synthesefase niet worden afgeschreven en er dus geen proliferatie

is. In kankercellen komt er vaak een verstoring in de pRB pathway voor, waardoor proliferatie

bevorderd wordt. De derde essentiële eigenschap van een kankercel is apoptose vermijden en

op deze manier proliferatie verder bevorderen. Een kankercel vermijdt apoptose door het ver-

lies van pro-apoptotische regulatoren (bv. BAX), winst van anti-apoptotische regulatoren (bv.

BCL2) of een activatie van de PI3K/AKT/PKB pathway, die anti-apoptotische signalen door-

geeft. Naast deze eerste 3 eigenschappen, die leiden tot celgroei, moet een kankercel ook on-

gelimiteerd kunnen delen, wat de vierde essentiële eigenschap is. Een normale cel verliest bij

elke deling een stuk telomerisch DNA waardoor de cel na 60-70 delingen in scenescentie en

later ook in crisis gaat. Om dit tegen te gaan, brengen kankercellen het telomerase enzym tot

expressie of maken ze gebruik van het alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanis-

me. Door deze eigenschap zal de cel ongelimiteerd kunnen delen en groeien waardoor er een

tekort aan nutriënten en zuurstof zal ontstaan. Om dit tegen te gaan zal de kankercel de vijfde

eigenschap, namelijk aanhoudende angiogenese (groei van nieuwe bloedvaten) ontwikkelen.

Kankercellen zorgen hiervoor door een opregulatie van inducers van angiogenese zoals VEGF

en een neerregulatie van inhibitoren van angiogenese zoals trombospondine-1. Ten slotte is er

de eigenschap invasie en metastase, die voor een slechte prognose zorgt en in 90 % van de

gevallen tot het overlijden van de patiënt leidt. Kankercellen kunnen invaderen in naburige

weefsels en kunnen vervolgens via het bloed en lymfe naar verafgelegen plaatsen migreren-

waar ze nieuwe tumorhaarden kunnen vormen. Om te kunnen migreren naar andere plaatsen

is er een reductie in expressie van cel-cel adhesie moleculen en een verandering van een adhe-

sieve naar een minder adhesieve vorm nodig (epithelial-mesenchymal transition (EMT)).

Verder wordt er ook vaak een verandering in integrine expressie en een opregulatie van pro-

teasen waargenomen waardoor de kankercellen gemakkelijk kunnen migreren (5).

INLEIDING

7

Verder kankeronderzoek voegde later 4 eigenschappen toe (7). Genomische instabiliteit is

nodig om de eerste 6 eigenschappen te verwerven. Dit omdat een kankercel hiervoor meerde-

re mutaties nodig heeft en dit een inefficiënt proces is omdat er verschillende controlepunten

en herstelmechanismen zijn. Om dit te overwinnen worden er vaak mutaties waargenomen in

caretakers (bv. p53) die in normale cellen voor genomische stabiliteit zorgen. Door mutaties

in deze genen ontstaat er genomische instabiliteit en stapelen de mutaties zich sneller op

waardoor een kankercel de 6 eigenschappen gemakkelijker kan verwerven (5,7). Uit onder-

zoek bleek ook dat inflammatie in tumoren de tumorgroei kan bevorderen door het leveren

van bioactieve moleculen zoals groeifactoren, overlevingsfactoren en pro-angiogene factoren.

Kankercellen reprogrammeren ook hun energie metabolisme. Zo maken ze gebruik van glyco-

lyse, ook als er zuurstof aanwezig is. Aangezien er een lagere adenosinetrifosfaat (ATP) pro-

ductie is bij glycolyse in vergelijking met oxidatieve fosforylatie, is er een opregulatie van de

glucose transporters om voor de lagere ATP productie te compenseren. Ten slotte gaan kan-

kercellen ook immuundestructie tegen, onder andere door de secretie van immunosuppressie-

ve factoren (7).

Kankers kunnen opgedeeld worden in carcinoma's (kankers afgeleid van het epitheel), sar-

coma's (kankers afgeleid van mesenchymale celtypes) en leukemieën (kankers afgeleid van

hematopoëtische cellen) (3). In deze masterproef zal dieper in gegaan worden op de leuke-

mieën.

1.2.2 Leukemie

Leukemie is een bloed- en beenmergkanker die wereldwijd jaarlijks bij meer dan 250.000

mensen gediagnosticeerd wordt (8,9). De ziekte is verantwoordelijk voor 2,5 % van alle kan-

kers en komt voor in alle leeftijdscategorieën. Leukemie komt meer voor bij mannen dan bij

vrouwen. Risicofactoren om leukemie te ontwikkelen zijn ioniserende straling, sigarettenrook,

chemicaliën zoals herbiciden, genetische ziekten zoals het syndroom van Down en infecties.

Ook een kankerbehandeling met chemotherapie en radiotherapie kan aanleiding geven tot

secundaire leukemieën (6,8). Leukemieën kunnen enerzijds ingedeeld worden in een acute en

een chronische vorm. Bij de acute vorm ontwikkelt de ziekte snel en ontstaan er symptomen

zoals vermoeidheid en koorts en krijgen de patiënten vaak infecties. In de chronische vorm

zijn de kankercellen in het begin nog functioneel, waardoor de symptomen pas later optreden.

Anderzijds kunnen leukemieën ook ingedeeld worden in een lymfoblastische en een myeloïde

vorm waarbij respectievelijk de lymfoïde en myeloïde cellen aangetast worden (9). Op basis

van dit onderscheid kunnen leukemieën ingedeeld worden in vier grote groepen: acute lymfo-

INLEIDING

8

blastische leukemie (ALL), chronische lymfoblastische leukemie (CLL), acute myeloïde leu-

kemie (AML) en chronische myeloïde leukemie (CML) (8,9). CLL, AML en CML komen

vooral voor bij volwassenen terwijl ALL vooral bij kinderen wordt waargenomen (8). ALL

wordt verder opgesplitst in T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) en B-cel acute

lymfoblastische leukemie (B-ALL) waarbij er respectievelijk een maligne transformatie van

T- en B-lymfocyten is. In deze masterproef zal dieper in gegaan worden op T-ALL.

1.2.3 T-cel acute lymfoblastische leukemie

1.2.3.1 Incidentie

T-ALL is een hematologische kanker die ontstaat door een maligne transformatie van T-

lymfocyten. T-ALL is verantwoordelijk voor 15 % van de pediatrische en 20 % van de vol-

wassen ALL patiënten en komt 3 keer zoveel voor bij mannen dan bij vrouwen (10,11) . De

ziekte gaat gepaard met infiltratie van immature lymfoblasten in het beenmerg, een hoog aan-

tal witte bloedcellen, een vergroting van de mediastinale lymfeknopen en leukemische infil-

tratie in het centraal zenuwstelsel (4,12). Symptomen hierbij zijn koorts, blauwe plekken en

petechiën (12). De prognose is afhankelijk van verschillende factoren zoals het aantal lymfo-

cyten en de leeftijd waarop de diagnose gesteld wordt (11). Ook de genen betrokken in de

ziekte kunnen de prognose mee bepalen. Zo gaan DNMT3A mutaties samen met een laag

overlevingspercentage, terwijl CDKN2A/2B deleties gepaard met een betere prognose (13).

1.2.3.2 Genetische oorsprong van T-ALL

T-ALL is een genetisch heterogene ziekte die ontstaat door een meer-stapsproces waarbij ver-

schillende genetische afwijkingen zorgen voor een verstoring van vier belangrijke processen:

de celcyclus, proliferatie en overleving, differentiatie en zelfhernieuwingscapaciteit (4,13)

(Figuur 4).

De celcyclus

De celcyclus is een sterk gecontroleerd proces waarbij er verschillende controlepunten zijn

die zorgen voor genomische integriteit. Door defecten in de celcyclus kan er tumorvorming of

apoptose ontstaan. In normale cellen zorgen mitogenen voor de vorming van een complex

tussen cyclines en cyclin dependent kinases (CDK's). Dit leidt tot fosforylatie van het pRB en

inhibitie van de celproliferatie. Ondanks het belang van pRB1 en p53 worden er in T-ALL

maar zelden mutaties gevonden in deze genen (4). Het meest voorkomende genetisch defect is

echter een inactivatie van CDKN2A (Figuur 4). Deze inactivatie ontstaat meestal door een

deletie van de 9p21 locus, maar kan ook ontstaan door mutaties of promotor hypermethylatie

INLEIDING

9

(4). CDKN2A codeert voor p14 en p16 die respectievelijk zorgen voor inhibitie van pRB1

fosforylatie en p53 activatie. Door inactivatie van CDKN2A wordt proliferatie dus bevorderd

(4,11).

Proliferatie en overleving

De signalisatie vanuit de TCR is belangrijk voor de immuunrespons en voor T-cel proliferatie

en overleving. Als de TCR geactiveerd wordt door interactie met een antigen, worden er ver-

schillende kinasen gerekruteerd wat tot activatie van verschillende signaalmoleculen leidt.

Deze pathway wordt bij T-ALL vaak verstoord. Er worden ook fusies met het tyrosine kinase

ABL1 waargenomen zoals NUP214-ABL en ETV6-ABL. Dit leidt tot een constitutief geacti-

veerd ABL waardoor er een activatie van proliferatie en overleving is (4). Ook mutaties in

RAS, betrokken in het doorgeven van proliferatieve signalen, leiden tot een grotere celprolife-

ratie en transformatie (14). Inactivatie van PTEN, een tumorsuppressorgen, leidt ook tot onge-

controleerde proliferatie, omdat het evenwicht tussen PTEN en PI3K verstoord wordt in de

richting van PI3K, waardoor PIP2 gefosforyleerd wordt tot PIP3. Dit leidt tot activatie van

AKT waardoor verschillende transcriptiefactoren worden afgeschreven en de IL2 expressie

stijgt. Door deze stijging worden de T-lymfocyten gestimuleerd om te prolifereren. Ook ande-

re tyrosine kinasen zoals FLT3 die niet betrokken zijn in de TCR pathway kunnen geactiveerd

worden bij T-ALL (4).

Figuur 4: frequentie van de verschillende genetische defecten in T-ALL. Mutaties in T-ALL komen voor in

4 grote klassen. Deze worden weergegeven in de figuur met de frequenties van de verschillende mutaties. Fi-

guur overgenomen en aangepast van De Keersmaecker et al. (4).

INLEIDING

10

Differentiatie arrest

T-ALL wordt gekenmerkt door chromosomale translocaties waardoor oncogene transcriptie-

factoren vaak onder controle van regulatorische elementen van de TCR genen (TCRA@,

TCRB@ en TCRD@) geplaatst worden (4). Door deze translocatie ontstaat er een afwijkende

genexpressie van de transcriptiefactoren die vaak betrokken zijn in differentiatie controle

(11). Deze transcriptiefactoren bestaan uit de basic helix-loop-helix (bHLH) familie, de LIM-

only domein (LMO) genen en de homeobox (HOX) genen (15). HOX genen zijn betrokken in

anterieur-posterieure patroonvorming, differentiatie, hematopoëse, leukemogenese en in het

differentiatie arrest bij T-ALL. Zo wordt er bij T-ALL vaak een ectopische expressie van

TLX1 (HOX11) en TLX3 (HOX11L2) waargenomen. Hierbij wordt TLX3 meestal onder con-

trole van regulatorische elementen van TCRA@ en TCRB@ geplaatst en TLX1 naast de distale

regio van het BCL11B gen. Daarnaast worden er ook translocaties van HOXA@ naar de

TCRB@ locus gezien en bestaan er translocaties tussen de TCR en bHLH genen (LYL, TAL1

en TAL2) en tussen de TCR en LMO genen. Naast deze translocaties komen er ook fusiegenen

voor zoals PICALM-MLLT10, SIL-TAL1 en verschillende MLL fusies, die voor een differenti-

atie arrest zorgen (4). Ten slotte wordt er ook vaak een overexpressie van MYB waargenomen

ten gevolge van een translocatie of duplicatie (13,15).

Zelfhernieuwingscapaciteit

Ongelimiteerde zelfhernieuwingscapaciteit wordt in T-ALL in 50-60 % van de gevallen be-

komen door een activatie van NOTCH1 (11,13). NOTCH1 wordt na binding van zijn ligand,

delta-serrate-lag2, verknipt door onder andere γ-secretase waardoor het intracellulair domein

van NOTCH1 (ICN1) vrijkomt en naar de kern kan migreren. Daar vormt het samen met an-

dere eiwitten een transcriptie activator complex waardoor verschillende genen zoals c-myc,

cyclin D1 en p21 afgeschreven worden. In de meeste gevallen wordt een mutatie gevonden in

NOTCH1 zelf. Hierbij zijn er mutaties beschreven in het heterodimerisatiedomein en in het

PEST domein waardoor er meer ICN1 vrijkomt in de cel of waardoor de halfwaardetijd van

ICN1 verlengd wordt (16). Op deze manier is er een constitutieve NOTCH1 activatie waar-

door de transcriptie bevorderd wordt en de kankercel zelfhernieuwingscapaciteit verwerft

(4,16). Naast mutaties in NOTCH1 zelf, worden er ook inactiverende mutaties of deleties in

de tumorsuppressor FBXW7 waargenomen. Dit zorgt voor verminderde proteasomale degra-

datie van het geactiveerd NOTCH1 (16).

INLEIDING

11

1.2.3.3 Behandeling

De huidige therapie bestaat uit een combinatie van chemotherapeutica in drie fasen. De eerste

fase is de remissie-inductie fase die als doel heeft om meer dan 99 % van de initiële leuke-

miecellen te doden. Hierna volgt de consolidatie fase waarbij de overblijvende resistente leu-

kemische cellen verwijderd worden. In de laatste onderhoudsfase worden de laatste kanker-

cellen verwijderd om de kans op herval te verlagen (11,17). Met deze therapie kunnen 80 %

van de kinderen en 50 % van de volwassenen genezen worden, maar toch hervallen veel pati-

ënten en blijft de mortaliteit hoog (11). Het gebruik van chemotherapie zorgt bovendien voor

bijwerkingen zoals braken, diarree, een lagere eetlust, een verhoogde kans op infecties en

toxiciteit (9,12). Hierdoor is er nood aan meer effectieve en minder toxische therapieën tegen

T-ALL en is onderzoek naar nieuwe therapeutische targets belangrijk (15,18).

1.3 Lange niet coderende RNA's

1.3.1 Types niet coderend RNA

Uit genoom onderzoek is gebleken dat meer dan 70 % van het genoom dat wordt overge-

schreven in ribonucleic acid (RNA) niet codeert voor een eiwit. Deze RNA's worden niet-

coderende RNA's (noncoding RNA (ncRNA)) genoemd. ncRNA's zoals transfer RNA's (tR-

NA), ribosomale RNA's (rRNA's), small nuclear RNA's (snRNA's) en small nucleolar RNA's

(snoRNA's) spelen een belangrijke rol in de eiwitsynthese (19,20). De overige ncRNA's wor-

den volgens grootte ingedeeld in korte en lange niet coderende RNA's (long noncoding RNA

(lncRNA)). Korte ncRNA's zijn korter dan 200 nucleotiden en kunnen ingedeeld worden in

drie grote klassen: microRNA's (miRNA's), small interfering RNA's (siRNA's) en PIWI-

interacting RNA's (piRNA's). Deze ncRNA's zijn betrokken in de regulatie van de mRNA

niveaus en in de translatie efficiëntie van deze mRNA's (3,21).

lncRNA's zijn niet-eiwit coderende transcripten die meer dan 200 nucleotiden lang zijn

(22,23). Net zoals coderende genen hebben lncRNA's vaak een 5'cap en poly-A staart en wor-

den ze vaak gespliced (20). Het verschil met coderende genen is dat lncRNA's meestal in de

nucleus voorkomen en dat ze vaak heel weefselspecifiek tot expressie komen (22). Next gene-

ration sequencing en transcriptoom analyse zijn belangrijk in de detectie van lncRNA's, maar

ondanks deze vooruitgang is de functie van veel lncRNA's nog ongekend (19). lncRNA's

worden ingedeeld in 5 categorieën: sense (overlap met een of meerdere exonen op dezelfde

streng), antisense (overlap met een of meerdere exonen op de complementaire streng), bidi-

rectioneel (de expressie van het lncRNA en een coderend gen op de complementaire streng

worden in elkaars nabijheid geïnitieerd), intronisch (in een intron) en intergenisch (tussen

twee genen) (19,20) (Figuur 5).

INLEIDING

12

1.3.2 Functies van lncRNA's

Vroeger beschouwde men lncRNA's als 'transcriptional noise', maar recent is gebleken dat

lncRNA's een belangrijke functie kunnen uitoefenen bij zowel de normale ontwikkeling als

bij ziekten (22,23). Zo zijn er veel lncRNA's betrokken in de regulatie van transcriptie waarbij

ze bijvoorbeeld hun functie uitoefenen door het aanpassen van de chromatine structuur. Hier-

bij kan het lncRNA het histon modificerend complex binden en reguleren. lncRNA's kunnen

dus functioneren als een ruggengraat waarop andere eiwitten kunnen binden. De transcriptie

kan ook beïnvloed worden door een directe interactie met het transcriptie complex. Dit is mo-

gelijk door een interactie met polymerase II of transcriptiefactoren waardoor de transcriptie

verstoord wordt. Eenmaal de transcriptie voltooid is, volgen splicing en processing van het

transcript. Ook hier kunnen lncRNA's interfereren (Figuur 6).

Na deze processing is er posttranscriptionele regulatie mogelijk. lncRNA's kunnen dit proces

op verschillende manieren beïnvloeden (Figuur 6). Ze kunnen de mRNA stabiliteit positief of

negatief reguleren of miRNA's en eiwitten binden en sequestreren waardoor deze hun functie

niet kunnen uitoefenen (6,24). lncRNA's kunnen deze effecten zowel op naburige genen (cis

Figuur 5: schematische weergave van de 5 categorieën van lncRNA's. lncRNA's kunnen ingedeeld worden in

5 categorieën: sense, antisense, bidirectionele, intronische en intergenische lncRNA's.

Figuur 6: de rol van lncRNA's in mRNA processing en posttranscriptionele regulatie. lncRNA's kunnen de

splicing en processing van mRNA beïnvloeden (a,b). Ze kunnen posttranscriptioneel ook een functie uitoefenen

op verschillende manieren (c-f) (24).

INLEIDING

13

effect) als op verafgelegen genen (trans effect) uitoefenen (6). lncRNA's worden ook gebruikt

als signaalmoleculen. Ze kunnen via exosomen vervoerd worden tussen verschillende cellen,

waar ze onder andere de genexpressie reguleren (19,24). Ondanks de vele gekende werkings-

mechanismen van lncRNA's is de rol van veel lncRNA's nog ongekend en is verder onderzoek

nodig (23,25).

1.3.3 lncRNA's in het immuunsysteem

lncRNA's die in immuuncellen tot expressie komen zijn meestal celspecifiek en worden dy-

namisch gereguleerd tijdens de differentiatie en activatie van de immuuncellen (26,27). Zo is

HOTAIRM1 betrokken in de maturatie van granulocyten (20,27). HOTAIRM1 wordt opgere-

guleerd tijdens de differentiatie van de granulocyten en reguleert bepaalde HOXA genen, die

betrokken zijn in de hematopoëse. Lethe is een van de vele lncRNA's die een rol speelt in het

innate immuunsysteem (20). Lethe wordt overgeschreven na activatie van NFkB en attenueert

vervolgens de NFkB inflammatoire reacties (negatieve feedback cyclus) (20,27). Ook de lym-

focyten van het adaptief immuunsysteem brengen verschillende lncRNA's tot expressie. Zo

moduleert het lncRNA NRON de expressie van IL2 in geactiveerde T-cellen (20). Er wordt

vaak co-expressie waargenomen tussen deze lncRNA's en de eiwitcoderende genen die be-

trokken zijn in de immuunafweer. Dit kan erop wijzen dat lncRNA's een regulatorische rol

hebben in de T-cel ontwikkeling en differentiatie (26). Er zijn reeds verschillende andere ln-

cRNA's beschreven die tot expressie komen in immuuncellen, maar de functies van deze ln-

cRNA's zijn vaak nog ongekend (20,26,27).

1.3.4 lncRNA's en kanker

Er werden reeds verschillende verbanden aangetoond tussen lncRNA's en kanker. Zo is er

reeds voor elk van de 6 eigenschappen van kanker, beschreven door Hanahan en Weinberg,

een rol voor lncRNA's beschreven (19). Zo is het lncRNA SRA een co-activator van de steroid

receptor die verhoogd tot expressie komt in borsttumoren waardoor de kankercel kan prolife-

reren. Het vermijden van groeirepressoren wordt gemedieerd door GAS5 (19). GAS5 is een

tumorsuppressor lncRNA dat minder tot expressie komt in leukemische cellen en in borstkan-

ker. GAS5 bindt met het DNA bindend domein van de glucocorticoid receptor waardoor het in

competitie gaat met het glucocorticoid responsive element en het de inductie van verschillen-

de genen onderdrukt. Op deze manier veroorzaakt GAS5 een groei arrest en apoptose

(6,19,24). TERRA is een lncRNA dat belangrijk is voor het verkrijgen van immortaliteit door

het telomerase negatief te reguleren. In kankercellen wordt er een vermindering in de TERRA

expressie waargenomen zodat de cellen kunnen blijven delen (19,24). Twee lncRNA's die

INLEIDING

14

betrokken zijn in invasie en metastase zijn MALAT1 en HOTAIR. MALAT1 is een prognosti-

sche merker voor metastase en overleving in longkanker. In borst-, colon- en pancreaskanker

wordt er vaak overexpressie van HOTAIR gezien, wat gepaard gaat met metastase en een

slechte prognose (6,19). Het lncRNA αHIF is betrokken bij angiogenese en is een merker

voor een slechte prognose in borstkanker. Het komt tot overexpressie waardoor HIF1α, een

regulator van angiogenese, wordt afgebroken. Ten slotte moeten kankercellen celdood ver-

mijden. PCGEM1 is een lncRNA dat tot overexpressie komt in prostaatkanker en betrokken is

bij de inhibitie van apoptose (19).

lncRNA expressieprofielen kunnen gebruikt worden om kankersubtypes te identificeren en

kunnen gecorreleerd worden met drug resistentie, overleving en werkzaamheid van een thera-

pie. Daarom zal het in de toekomst belangrijk zijn om een genomisch profiel (coderend en

niet coderend) van de patiënt te bepalen en gepersonaliseerde geneeskunde toe te passen (6).

Er is nog maar weinig onderzoek gedaan naar het verband tussen lncRNA's en T-ALL (25).

Recent werden 2 T-ALL geassocieerde lncRNA's geïdentificeerd. Enerzijds het T-ALL related

long non-coding RNA 1 (T-ALL-R-LncR1) dat opgereguleerd is in T-ALL en zo apoptose te-

gengaat (25). En anderzijds het leukemia-induced noncoding activator RNA1 (LUNAR1) dat

gereguleerd wordt door NOTCH1 en de IGF signalering in T-ALL versterkt (22). In het Cen-

trum voor Medische Genetica Gent (CMGG) werd recent het lncRNA netwerk downstream

van NOTCH1 beschreven in zowel de normale T-cel ontwikkeling als in T-ALL. Dit werd

onder andere bepaald door RNA-sequenering van een GSI-behandelde T-ALL cellijn en een

co-cultuur van CD34+ normale T-cellen met het NOTCH1 ligand DLL1 (28).

1.4 CRISPR/Cas9

Het clustered regulary interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRIS-

PR/Cas9) systeem kan in cellijnen en diermodellen gebruikt worden om genen en lncRNA's

permanent uit te schakelen. In bacteriën en archaea speelt het CRISPR/Cas9 systeem een rol

bij de verworven immuunafweer tegen virussen en fagen door CRISPR RNA (crRNA) geme-

dieerde DNA herkenning en Cas eiwitten gemedieerde DNA verknipping. De CRISPR locus

bestaat uit geconserveerde repeats gescheiden door niet repetitieve sequenties (spacers).

Wanneer virussen of fagen de cel infecteren, wordt hun DNA door de Cas eiwitten verknipt in

kleine DNA fragmenten, die vervolgens in het gastheer DNA geïntegreerd worden ter hoogte

van de spacers. Vervolgens worden de spacers als template gebruikt om crRNA te produce-

ren waarna het crRNA de Cas eiwitten naar de doelwitsequentie leidt zodat de Cas eiwitten

het virus/faag DNA kunnen verknippen (29) (Figuur 7).

INLEIDING

15

Er bestaan verschillende Cas eiwit families die opgedeeld kunnen worden in drie types. Bij

genoom editing wordt vaak gebruik gemaakt van het type II, afkomstig van de Streptococcus

pyrogenes, waarbij Cas9 het endonuclease is (29,30). Hierbij vormt het sequentiespecifiek

crRNA een complex met het trans-activating crRNA (tracrRNA) waarna dit complex het niet-

specifiek endonuclease Cas9 begeleidt zodat het de doelwitsequentie kan verknippen (29,30).

Herkenning van de knipplaats gebeurt aan de hand van crRNA basenparing en een protospa-

cer-adjacent motif (PAM). PAM is een sequentie van 3 nucleotiden (NGG) die zich naast de

complementaire sequentie bevindt (30) (Figuur 8).

Figuur 8: het CRISPR/Cas9 systeem. Schematische weergave van de verknipping door CRISPR/Cas9. Het

crRNA en tracrRNA vormen een complex dat Cas9 begeleidt naar de doelwitsequentie waar Cas9 het DNA

verknipt en een dubbelstrengige breuk genereert. De PAM (NGG) sequentie is belangrijk bij de herkenning van

de doelwil sequentie (31).

Bij genetic engineering wordt gebruik gemaakt van een guide RNA (gRNA) dat het tracr-

RNA:crRNA complex nabootst en Cas9 rekruteert. Vervolgens genereert Cas9 een dubbel-

strengige breuk die hersteld kan worden door homology-directed repair (HDR) of nonhomo-

logous end-joining (NHEJ). Bij HDR kan een gen of een specifieke mutatie ingebracht wor-

Figuur 7: CRISPR/Cas9 bacterieel immuunsysteem. Bij een infectie door een faag wordt het vreemd DNA

verknipt en geïntegreerd in het gastheer genoom. Vervolgens is er transcriptie en wordt crRNA gevormd. Dit

crRNA begeleidt de Cas eiwitten naar de doelwitsequentie om daar het DNA van de faag te verknippen (29).

INLEIDING

16

den, terwijl bij NHEJ inserties of deleties (indels) gevormd worden. Deze indel mutaties kun-

nen in coderende regio's zorgen voor frame-shift mutaties of een prematuur stopcodon waar-

door de eiwitten geïnactiveerd worden (29,30). Het CRISPR/Cas9 systeem kan ook grote de-

leties veroorzaken door gebruik te maken van twee gRNA's voor 1 target locus, waarbij het

deel tussen de gRNA's gedeleteerd zal worden (30). Daarnaast kan het ook gebruikt worden

voor de regulatie van transcriptie van specifieke genen of voor het maken van een translocatie

(29,32).

Er zijn veel voordelen aan het CRISPR/Cas9 systeem in vergelijking met zinc finger nuclea-

ses (ZFN) en transcription activator-like effector nucleases (TALEN) die ook kunnen zorgen

voor een permanente uitschakeling van genen. ZFN's en TALEN's hebben in het algemeen

een lagere efficiëntie, zijn moeilijker te ontwikkelen en zijn duurder dan CRISPR/Cas9. Dit

omdat er bij ZFN's en TALEN's gebruik gemaakt wordt van eiwit geleide sequentie verknip-

ping terwijl CRISPR/Cas9 enkel RNA nodig heeft voor de sequentie specifieke verknipping.

CRISPR/Cas9 kan ook simultaan meerdere modificaties op verschillende plaatsen induceren

door gebruik te maken van verschillende gRNA's (29,30,33). Ondanks deze voordelen zijn er

ook enkele nadelen. Zo is dit systeem tolerant voor mismatches waardoor er off-target muta-

ties kunnen ontstaan en is het systeem afhankelijk van een PAM sequentie (29,33).

Het nut van het CRISPR/Cas9 systeem is reeds aangetoond in verschillende studies. Zo werd

het CRISPR/Cas9 systeem bijvoorbeeld gebruikt in humaan papillomavirus 16 (HPV16) posi-

tieve baarmoederhalskanker om het oncogen E7 uit te schakelen. E7 zorgt samen met E6 voor

een verstoring van de normale celcyclus en voor het behoud van een malign fenotype. Door

het gebruik van CRISPR/Cas9 konden dubbelstrengige breuken gegenereerd worden in E7 in

HPV16 positieve cellijnen waardoor er een knock out van het E7 eiwit bekomen werd en

apoptose en groei inhibitie bevorderd werden (31). Het CRISPR/Cas9 systeem blijkt ook te

werken in vivo. Zo heeft men het GRIN1 gen, dat voor een belangrijke subunit van de NMDA

receptor codeert, neergereguleerd in de piramidale neuronen van een muis. Door het ontbre-

ken van synaptische stroom, die gemedieerd wordt door de NMDA-type glutamaat recepto-

ren, kon besloten worden dat er een knock out van GRIN1 was (34).

1.5 Doel

In het CMGG wordt er onderzoek gedaan naar lncRNA's en T-ALL. Ondanks extensief on-

derzoek moeten er nog veel lncRNA's betrokken in T-ALL geïdentificeerd worden en moeten

de geïdentificeerde lncRNA's in detail onderzocht worden. Om de functie van deze lncRNA's

INLEIDING

17

te kunnen achterhalen zijn loss of function (LOF) studies nodig. Standaard knock down me-

thoden zoals siRNA's en small hairpin RNA's (shRNA's) werken vaak niet voor lncRNA's

aangezien deze vormen van RNA-interferentie (RNAi) hun functie in het cytoplasma uitoefe-

nen terwijl veel lncRNA's in de nucleus aanwezig zijn. Daarom zal in deze masterproef ener-

zijds getest worden of lncRNA's neergereguleerd kunnen worden door antisense oligonucleo-

tiden (ASO's) en locked nucleic acids (LNA's) die hun functie uitoefenen in de nucleus via

RNase H. Anderzijds zal nagegaan worden of lncRNA's kunnen uitgeschakeld worden met

het CRISPR/Cas9 systeem. Dit is een nieuwe techniek die reeds in vele labo's geïmplemen-

teerd wordt en die relatief eenvoudig is omdat er alleen gRNA's ontwikkeld moeten worden.

In het CMGG werd de CRISPR/Cas9 technologie reeds succesvol toegepast in zebravissen en

werd er reeds een t(11;17) translocatie gemaakt in NIH/3T3 cellen. Bij leukemische cellen

stelt zich echter het probleem dat deze niet of zeer slecht geëlektroporeerd kunnen worden

met plasmiden. Daarom zal deze techniek geoptimaliseerd worden.

In deze masterproef worden de volgende doelstellingen voorop gesteld:

1. Neerregulatie van LUNAR1 door LNA's en ASO's.

Er zal geprobeerd worden om het NOTCH1 gereguleerd lncRNA LUNAR1 neer te regule-

ren door middel van LNA's en ASO's. Deze oefenen hun functie uit in de kern, waar LU-

NAR1 zich bevindt.

2. Optimalisatie van de elektroporatie met een GFP-plasmide in verschillende cellijnen.

Verschillende elektroporatiecondities zullen getest worden in verschillende T-ALL cellij-

nen om na te gaan met welke conditie en in welke cellijn de hoogste elektroporatie-

efficiëntie bereikt kan worden. Hiervoor zal een GFP-plasmide gebruikt worden aangezien

dit eenvoudig gevisualiseerd kan worden met de fluorescentie microscoop en fluorescen-

ce-actviated cell sorting (FACS) door de green fluorescent protein (GFP) expressie.

3. Knock out van CD45 met CRISPR/Cas9 in JURKAT cellen.

De werking van Cas9 zal getest worden aan de hand van een knock out van CD45. CD45

is een membraaneiwit waarvan de expressie eenvoudig bekeken kan worden met FACS.

4. Knock out van CD45 met CRISPR/Cas9 in een Cas9 overexpresserende cellijn.

Door gebruik te maken van een Cas9 overexpresserende cellijn kan Cas9 uit het CRISPR

plasmide verwijderd worden. Hierdoor zal dit plasmide kleiner zijn en kunnen hogere ef-

ficiënties van elektroporatie verwacht worden.

5. Deletie van LUNAR1 met het CRISPR/Cas9 systeem.

In de literatuur is reeds aangetoond dat deleties geïntroduceerd kunnen worden door ge-

bruik te maken van 2 guide RNA's. Dit zal getest worden voor het lncRNA LUNAR1.

MATERIALEN EN METHODEN

18

2 MATERIALEN EN METHODEN

2.1 Cellijnen

De T-ALL cellijnen JURKAT, ALL-SIL, HPB-ALL en DND41 werden aangekocht bij

DSMZ. De CUTLL1 cellijn was een geschenk van prof. dr. Hans HG Wendel. JURKAT,

HPB-ALL en DND41 cellen werden opgegroeid in RPMI-1640 medium (Gibco) aangevuld

met L-glutamine, 10 % feutaal kalfsserum (FCS) (10 ml/l) en de antibiotica penicilline

(100 U/ml) en streptomycine (100 µg/ml) (compleet RMPI-1640 medium). CUTLL1 en ALL-

SIL cellen werden opgegroeid in hetzelfde RPMI-1640 medium, maar met 20 % FCS. De

cellijnen werden om de 2 à 3 dagen gesplitst waarbij de cellen geteld werden met de Cellome-

ter Auto T4 (Nexcelom) en uitgezaaid werden aan 1 miljoen cellen/ml. Een uitzondering hier-

op waren de JURKAT en DND41 cellen die respectievelijk uitgezaaid werden aan 0,6 en 0,7

miljoen cellen/ml. Al de cellijnen werden geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2.

HEK293TN cellen werden om de 2 à 3 dagen gesplitst aan een 1/10 of 1/20 verdunning.

Hiervoor werden de cellen eerst gewassen met verseen (Versene 1:5000 (1x), Gibco), waarna

ze werden losgemaakt door toevoegen van trypsine met EDTA (0,05 % trypsine-EDTA, Gib-

co). Ten slotte werden ze verdund in compleet RMPI-1640 medium en werden de cellen geïn-

cubeerd bij 37 °C en 5 % CO2.

2.2 Klonering van gRNA's in CRISPR plasmiden

2.2.1 Oligo design en annealing

De oligo's werden ontwikkeld via de site http://crispr.mit.edu. Op deze site worden verschil-

lende mogelijke oligo's weergegeven voor de doelwitsequentie. De beste oligo's kunnen gese-

lecteerd worden aan de hand van een score die zo hoog mogelijk moet zijn en de off-target

effecten die zo laag mogelijk moeten zijn. Er werd een 5'CACC toegevoegd aan de forward

oligo's en een 5'AAAC aan de reverse oligo's. Bovendien werd er ook een guanine toege-

voegd aan de forward oligo's en een cytidine aan de reverse oligo's als de doelwitsequentie

niet met een guanine begon (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel I). Er werden dubbelstrengige

oligo's verkregen door middel van denaturatie en renaturatie. Hierbij werden 20 µM van de

forward en 20 µM van de reverse oligo's verdund in NEB 2.1 (10x) buffer en H2O. Denatura-

tie vond plaats bij 95 °C (5 minuten) op een thermoblock (TS-100C, Biosan). Renaturatie

gebeurde door het traag afkoelen van de oplossing door het uitschakelen van de thermoblock.

Ten slotte werd dit 500x verdund tot 0,04 µM en bewaard bij 4 °C.


19

2.2.2 Restrictie en ligatie

Voor de verknipping van de CRISPR plasmiden werd 5 µg van het plasmide samengevoegd

met 20 U Bbs1 en NEBuffer 2.1 (10x) in een totaal volume van 100 µl. Dit werd 1 uur geïn-

cubeerd bij 37 °C, waarna het gezuiverd werd met de QIAquick PCR Purification Kit (Qia-

gen) en de DNA concentratie gemeten werd met NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). Om de

dubbelstrengige oligo's in het plasmide te ligeren werd 50 ng van het plasmide samen ge-

voegd met 2 µl van de dubbelstrengige oligo's. Vervolgens werd de mighty mix (Takara,

Clontech) in een 1:1 ratio toegevoegd en werd dit geïncubeerd bij 16 °C overnacht.

2.2.3 Transformatie van E. coli

Per staal werden 50 µl DHα Escherichia coli (E. coli) bacteriën en 5 µl van de ligatiemix sa-

mengevoegd waarna de stalen 30 minuten op ijs geplaatst werden. Vervolgens werden de

plasmiden opgenomen door de E. coli bacteriën door een heat shock. Deze heat shock werd

bekomen door de stalen 30 seconden in een warm waterbad van 42 °C te plaatsen, waarna de

stalen onmiddellijk 5 minuten op ijs geplaatst werden. Hierna werd 650 µl warm SOC medi-

um toegevoegd en werden de stalen 1 uur schuddend geïncubeerd bij 37 °C aan 200 rounds

per minute (rpm). Ten slotte werd er 400 µl van de suspensie op een ampicilline bevattende

agarplaat gepipetteerd, verspreid met een steriele inoculatie loop en overnacht omgekeerd

geïncubeerd bij 37 °C.

Om na te gaan welke kolonies het plasmide hadden opgenomen werd een kolonie polymerase

chain reaction (PCR) uitgevoerd. Enkele kolonies werden aangetikt met een steriele inocula-

tie loop en opgelost in 20 µl H2O. Voor de PCR reactie werd gebruik gemaakt van de KAPA

Taq HotStart PCR Kit (KAPA Biosystems). Hiervoor werd 2 µl van de kolonie suspensie

samengevoegd met een 1x verdunning van de KAPA Taq hot start buffer (5x) ; 1,5 mM Mg-

Cl2; 0,2 mM dNTP mix; 0,3 µM forward primer en reverse oligo (zie 7.1 van 'Addendum',

Tabel II) en 1U KAPA Taq HotStart DNA Polymerase. Dit reactiemengsel werd aangelengd

tot 50 µl met H2O. Vervolgens werd de PCR reactie met de 1000™ Thermal Cycler (Bio-

Rad) uitgevoerd waarbij er eerst een hotstart was bij 95 °C voor 3 minuten. Vervolgens waren

er 35 cycli van denaturatie (95 °C voor 30 seconden), annealing (50 °C voor 30 seconden) en

elongatie (72 °C voor 1 minuut/kb). Na deze cycli was er een finale elongatie bij 72 °C voor 1

minuut. Via de labchip (Caliper, Life Sciences) werd bepaald welke kolonies het plasmide

hadden opgenomen.


20

2.2.4 Plasmide isolatie

De plasmiden werden geïsoleerd met de High Pure Plasmide Isolation Kit (Roche) en de con-

centratie werd gemeten met NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). De ingebouwde sequentie

werd geverifieerd aan de hand van capilaire Sanger sequenering met specifieke primers (zie

7.1 van 'Addendum', Tabel II). Hiervoor werd 0,5 µl primer en 2 µl plasmide per reactie ge-

bruikt.

2.2.5 Klonering van 2 gRNA's in een CRISPR plasmide

Voor dit protocol werd gestart met CRISPR plasmiden met 1 gRNA, bekomen zoals hierbo-

ven beschreven. De gebruikte oligo's zijn weergegeven in Tabel III van 'Addendum'.

2.2.5.1 Isolatie van gRNA's door middel van een PCR reactie

Om een gRNA uit een plasmide te isoleren werd een PCR reactie uitgevoerd met de Pfx kit

(Invitrogen, Life Technologies). Hiervoor werd 10 ng van het plasmide samengevoegd met

1U van het Pfx enzym; 0,3 µM forward en reverse primer (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel II);

0,3 M dNTP mix; 1 mM MgSO4 en een 1x verdunning van de Pfx amplification buffer (10x).

Vervolgens werd de PCR reactie uitgevoerd waarbij er eerst een hotstart was bij 94 °C voor 4

minuten, vervolgens 35 cycli van denaturatie (94 °C voor 15 seconden), annealing (55/60 °C

voor 30 seconden) en elongatie (68 °C voor 40 seconden). Via de labchip (Caliper, Life Sci-

ences) werd bepaald of de gRNA fragmenten door de PCR reactie uit het plasmide geïsoleerd

waren. De PCR fragmenten werden gezuiverd met de QIAquick PCR Purification Kit (Qia-

gen) en de DNA concentratie werd gemeten met NanoDrop 1000 (Thermo Scientific).

2.2.5.2 Digestie en ligatie van gRNA PCR fragmenten en CRISPR plasmiden

Voor de verknipping van de gRNA PCR fragmenten en de plasmiden met 1 gRNA werd 5 µg

van het PCR fragment of 2,5 µg van het plasmide samengevoegd met 20 U KpnI-HF, 20 U

XbaI en 5 µl van de CutSmart buffer (10x). Dit werd aangelengd met H2O tot 50 µl. Vervol-

gens werd dit 2 uur geïncubeerd bij 37 °C, waarna er een hitte-inactivatie van het XbaI enzym

was bij 65 °C voor 20 minuten. Vervolgens werd het restrictieproduct gezuiverd met de QI-

Aquick PCR Purification Kit (Qiagen) en werd de DNA concentratie gemeten met NanoDrop

1000 (Thermo Scientific). Voor de ligatie van de PCR fragmenten in de plasmiden werd

50 ng van het plasmide samengevoegd met de juiste hoeveelheid van het PCR fragment zodat

er 3 maal zoveel kopijen van het PCR fragment als van het plasmide waren. Vervolgens werd

de mighty mix (Takara, Clontech) in een 1:1 ratio toegevoegd en werd dit geïncubeerd bij

16 °C overnacht.


21

2.2.5.3 Transformatie van E. coli en DNA isolatie

DHα E. coli bacteriën werden getransformeerd met de CRISPR plasmiden met 2 gRNA's. Een

kolonie PCR werd uitgevoerd met een nieuwe forward primer die slechts 1 keer voor komt in

het plasmide en met de reverse oligo's van het gekloneerde gRNA (zie 7.1 van 'Addendum',

Tabel II). DNA werd geïsoleerd en ingebouwde sequentie werd geverifieerd zoals hiervoor

beschreven (zie 2.2.3 en 2.2.4 van 'Materialen en methoden').

2.3 Elektroporatie in T-ALL cellijnen

2.3.1 Elektroporatie LNA's/ASO's

8 miljoen cellen werden 10 minuten afgedraaid aan 1200 rpm en werden geresuspendeerd in

0,5 ml serumvrij RPMI-1640 medium per opstelling. De cellen werden geëlektroporeerd met

400 nM LNA (IDT) of ASO (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel IV, Tabel V) met de GenePulser

Xcell™ (Bio-Rad) aan 300 V en 1 mF. Hierna werd de oplossing overgebracht in RPMI-1640

medium met 15 % FCS en werd dit geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2.

2.3.2 Elektroporatie plasmiden

0,5 of 1 miljoen cellen per elektroporatie werden 10 minuten afgedraaid aan 1200 rpm en ge-

resuspendeerd in 0,1 ml serumvrij RPMI-1640 medium per opstelling. Per opstelling werden

100 µl cellen samengevoegd met 0, 10 of 30 µg van het plasmide. Dit werd geëlektroporeerd

in een totaal volume van 400 µl met de Gene Pulser II (Bio-Rad) aan 175 V of 250 V voor

2,5 ms met 4 of 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. Vervolgens werden de stalen overge-

bracht in RPMI-1640 medium met 20 % FCS en geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2. De

GFP/CD45 expressie werd bekeken na 2, 4 en/of 6 dagen met de EVOS fluorescentie micro-

scoop (AMG, Westburg) en/of met FACS met de S3™ Cell Sorter (Bio-Rad).

2.3.3 Elektroporatie met een elektroporatiebuffer

8 miljoen cellen werden 10 minuten afgedraaid aan 1200 rpm en geresuspendeerd in 2 ml

phosphate buffered saline (PBS) (Gibco, Life Technologies™). Hiervan werden 4 miljoen

cellen 10 minuten afgedraaid aan 1200 rpm en geresuspendeerd in 100 µl elektroporatiebuffer

(Gene Pulser® electroporation buffer, Bio-Rad) per opstelling. De gewenste hoeveelheid van

het plasmide werd toegevoegd en de stalen werden aangelengd tot 400 µl met de elektropora-

tiebuffer. Vervolgens werd dit geëlektroporeerd met de Gene Pulser II (Bio-Rad) aan 175 V

voor 2,5 ms met 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. De stalen werden overgebracht in

RPMI-1640 medium met 20 % FCS en geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2. De GFP expressie

werd bekeken na 2 dagen met de EVOS fluorescentie microscoop (AMG, Westburg) en/of

met FACS met de S3™ Cell Sorter (Bio-Rad).


22

2.4 RT-qPCR

2.4.1 RNA isolatie

De cellen werden gecollecteerd en gecentrifugeerd aan 1200 rmp bij 4 °C. Het medium werd

verwijderd en de pellet werd opgelost in 700 µl trizol (Qiazol Lysis Reagent, Qiagen). Hierna

werd het RNA geïsoleerd met de miRNeasy Mini Kit (Qiagen) gevolgd door een DNase be-

handeling (RNAse-free DNase Set (Qiagen)). De RNA concentratie werd gemeten met Na-

noDrop 1000 (Thermo Scientific) en het RNA werd bij -80 °C bewaard.

2.4.2 cDNA synthese

Voor de cDNA synthese werd gebruik gemaakt van de iScript cDNA Syntheses Kit (Bio-

Rad). Hiervoor werd per reactie 500 ng RNA samengevoegd met 4 µl iScript reaction mix en

1 µl iScript reverse transcriptase. Dit werd aangelengd tot 20 µl met nuclease vrij H2O (Sig-

ma). Hierna werden de stalen voor 5 minuten geïncubeerd bij 25 °C, 30 minuten bij 42 °C en

5 minuten bij 85 °C in de MyCycler™ (Bio-Rad). Ten slotte werd het cDNA 10x verdund tot

een concentratie van 2,5 ng/µl. Het cDNA werd bewaard bij -20°C.

2.4.3 RT-qPCR

De RT-qPCR mastermix (3µl) bevat 2,5 µl sSO Advanced SYBR Green Supermix (Bio-rad)

en 0,25 µl van de forward en reverse primer (IDT) (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel VI). Er

werd 3 µl van de mastermix en 2 µl (5 ng) cDNA toegevoegd per welletje van een 384-well

plaat. De RT-qPCR reactie werd uitgevoerd in de LightCycler 480 (Roche, model LC480). In

de eerste cyclus was er een enzym activatie op 95 °C gedurende 2 minuten. Vervolgens waren

er 44 PCR amplificatie cycli (95 °C voor 5 seconden, 60 °C voor 30 seconden en 72 °C voor

1 seconde). Hierna was er 1 smeltcyclus (95 °C voor 5 seconden, 60 °C voor 1 minuut en

95 °C (continu)). Ten slotte was er een koeling voor 3 minuten bij 37 °C. De genexpressie

werd gestandaardiseerd tegen 4 referentiegenen: HMBS, HPRT, SDHA en UBC (zie 7.1 van

'Addendum', Tabel VI). De resultaten werden geanalyseerd met het programma qBase+ (Bio-

gazelle).

2.5 Transfectie van HEK293TN cellen

De HEK293TN cellen werden losgemaakt door middel van trypsine zoals beschreven in 2.1

van 'Materialen en methoden'. Vervolgens werden de cellen 5 minuten afgedraaid bij

1200 rpm en werd de pellet opgelost in 10 ml compleet RPMI-1640 medium. 150 000 cellen

werden uitgezaaid in 2 ml medium in een 6-well plaat en geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2.

Na 24 u werd het medium verwijderd en werd 1,8 ml RPMI-1640 medium met 2 % FCS toe-

gevoegd. Per opstelling werd een oplossing gemaakt van 2 µg plasmide DNA aangelengd tot

100 µl met serumvrij RPMI-1640 medium. Er werd ook een 50 µg/ml polyethyleenimine


23

(PEI) oplossing gemaakt in serum vrij RPMI-1640 medium. Vervolgens werd 100 µl van de

PEI oplossing samengevoegd met 100 µl van de DNA oplossing en werd dit 10 minuten geïn-

cubeerd bij kamertemperatuur. Ten slotte werd 200 µl van deze oplossing druppelsgewijs

toegevoegd aan de cellen in de 6-well plaat en werd dit geïncubeerd bij 37 °C en 5 % CO2.

2.6 FACS analyse

2.6.1 CD45

Per staal werden 50 µl cellen, 49 FACS buffer (PBS met 2 % bovine serum albumin (BSA))

en 1 µl human CD45-phyco-erytrine (CD45-PE) (Miltenyi Biotec) samengevoegd. Dit werd

15 minuten geïncubeerd bij 4 °C in het donker. Vervolgens werd de suspensie gewassen met

2 ml FACS buffer en werd de pellet geresuspendeerd in 250 µl FACS buffer. De cellen wer-

den door een cell strainer in een FACS buisje gepipetteerd en de CD45 expressie werd geme-

ten met de S3™ Cell Sorter (Bio-Rad). De cellen werden in deze flowcytometer blootgesteld

aan een laserstraal en de forward en side scatter (FSC en SSC) werden gemeten. Op basis van

de FSC en SCC werd er in het eerste veld (R1) een gebied afgebakend waarin levende cellen

zaten, in het tweede veld (R2) zaten de single cellen en in het derde veld (R3) was er een se-

lectie van CD45 positieve cellen door de detectie van PE met de FL3 filter (615nm ± 25 nm).

2.6.2 GFP

Het aantal GFP positieve cellen werd gemeten met de S3™ Cell Sorter (Bio-Rad). De cellen

werden hierin bestraald door een laserstraal en de FSC en SSC werden gemeten. Vervolgens

werden de parameters FSC en SSC zo ingesteld dat in het eerste veld (R1) levende cellen za-

ten, in het tweede veld (R2) single cellen en in het derde veld (R3) was er een selectie van

GFP positieve cellen met de FL1 filter (525 nm ± 30 nm).

2.6.3 Sorteren van GFP positieve cellen

Om de GFP positieve cellen te sorteren werden de cellen 5 minuten gecentrifugeerd aan

1200 rpm en werd de pellet opgelost in 100 µl PBS (1x) per 1 miljoen cellen en door de cell

strainer van het FACS buisje gepipetteerd. De GFP positieve cellen werden gesorteerd op

basis van de FL1 filter (525 nm ± 30 nm) en werden opgevangen in een FACS buisje gevuld

met 750 µl RPMI-1640 medium met 20 % FCS. De gesorteerde cellen werden 5 minuten af-

gedraaid bij 1200 rpm en de pellet werd opgelost in compleet RPMI-1640 medium zodat ze

aan de gewenste concentratie zaten. Ten slotte werden de cellen geïncubeerd bij 37 °C en 5 %

CO2.


24

2.7 PCR

2.7.1 DNA isolatie

Cellen werden geïsoleerd voor DNA isolatie. Hiervoor werden de cellen gewassen met ge-

koelde PBS (1x). Vervolgens werd er 2 ml PBS (1x) toegevoegd en werden de cellen 5 minu-

ten afgedraaid aan 1200 rpm bij 4 °C. Het DNA werd uit de cellen geïsoleerd met de QiaAmp

DNA Mini kit (Qiagen). De DNA concentratie werd gemeten met NanoDrop 1000 (Thermo

Scientific) en het DNA werd bewaard bij -80 °C.

2.7.2 PCR

Voor de PCR reactie werd gebruik gemaakt van de KAPA Taq HotStart PCR Kit (KAPA Bi-

osystems). Hiervoor werd 100 ng DNA samengevoegd met een 1x verdunning van de KAPA

Taq hot start buffer (5x); 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP mix; 0,3 µM forward en reverse pri-

mer (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel VII) en 1U KAPA Taq HotStart DNA Polymerase. Dit

reactiemengsel werd aangelengd tot 50 µl met nuclease vrij H2O. Vervolgens werd de PCR

reactie met de 1000™ Thermal Cycler (Bio-Rad) uitgevoerd zoals beschreven in 2.2.3 van

'Materialen en methoden' met annealing bij Tm - 5 °C.

2.8 Western blot

2.8.1 Cellyse en eiwit denaturatie

De cellen werden gecollecteerd en gewassen in PBS (1x). De cellen werden gelyseerd door de

celpellet op te lossen in 100 µl RIPA buffer (250 mg natrium deoxycholaat (Sigma); 5 M Na-

Cl; 1 M Tris HCl (pH 7,5); 10 % sodium dodecyl sulfate (SDS) oplossing en 10 % NP-40)

waaraan een protease inhibitor (Roche) werd toegevoegd. Dit werd 1 uur geroteerd bij 4 °C en

10 minuten gecentrifugeerd aan 10.000 rpm bij 4 °C. Het lysaat werd overgebracht in gekoel-

de epjes. Om de eiwitten te denatureren werd 40x β-mercaptoethanol (Sigma) in een 1:7 ver-

houding toegevoegd aan 5x Laemli buffer (10 % SDS-oplossing; 100 % glycerol; 1 M TrisH-

Cl (pH6,8); 1 % bromofenol blauw oplossing). Ten slotte werd er 5 µl van deze mix toege-

voegd aan 20 µl lysaat en werd dit voor 10 minuten geïncubeerd bij 95 °C.

2.8.2 SDS-PAGE en Western blotting

Voor de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) werden de

gels (Bio-Rad, 10 % SDS) in de elektroforese tank geplaatst en werd de tank gevuld met run-

ning buffer (100 ml 10x Tris/Glycine/SDS buffer (Bio-Rad) en 900 ml gedestilleerd H2O).

Vervolgens werd er in het eerste laantje 5 µl prestained marker (Bio-Rad) en 2 µl gebiotiny-

leerde merker (Cell Signaling) geladen en werd er in de overige laantjes 20 µl staal geladen.

De eiwitten werden gescheiden aan 100 V en 0,25 A voor 1 à 2 uur (PowerPac™

Basic, Bio-


25

Rad). Hierna werden de gescheiden eiwitten overgebracht op een nitrocellulose membraan

(Bio-Rad). Hiervoor werd een blotting sandwich gemaakt die in de elektroforese tank ge-

plaatst werd. De tank werd gevuld met transfer buffer (100 ml 10x Tris/Glycine buffer (Bio-

Rad), 200 ml methanol en 700 ml gedestilleerd H2O) en de eiwitten werden overgebracht op

het membraan door elektrische stroom (100 V en 0,25 A voor 1 uur) (PowerPac™

Basic, Bio-

Rad).

2.8.3 Immunoblotting

De onbezette plaatsen op het membraan werden geblokkeerd door incubatie met 5 % melk in

TBST (0,1 % Tween in TBS (1x)) voor 1 uur. Vervolgens werd de blot overnacht geïncubeerd

bij 4 °C met een 5 % melk/TBST oplossing en met primair antilichaam. Hierna werd de blot

1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur met het secundair antilichaam, gekoppeld aan horse

radish peroxidase (HRP) (Cell Signaling). Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met

luminol/enancer buffer (1:1 verhouding, SuperSignal West Dura Extended Duration Substra-

te, Thermo Scientific) voor 30 seconden. De HRP enzymen gebonden aan het secundair anti-

lichaam op de blot kunnen dit substraat omzetten met de vorming van licht. Dit werd gedetec-

teerd met ChemiDoc-It 500 Imaging System van UVP.

RESULTATEN

26

3 RESULTATEN

3.1 Neerregulatie van LUNAR1 door LNA's en ASO's

In het eerste deel van deze masterproef werd getracht om het lncRNA LUNAR1 neer te regu-

leren door locked nucleic acids (LNA's) en antisense oligonucleotiden (ASO's). LUNAR1 is

een NOTCH1 gereguleerd lncRNA dat aanwezig is in de kern en betrokken is in het verster-

ken van de IGF1 signalering in T-ALL (22). lncRNA's zijn vaak moeilijk neer te reguleren

door siRNA's en shRNA's aangezien deze vormen van RNAi hun functie in het cytoplasma

uitoefenen, terwijl de meeste lncRNA's zich in de nucleus bevinden. LNA's en ASO's voeren

hun functie daarentegen wel in de kern uit via degradatie van het lncRNA door RNase H, dat

de DNA/RNA duplexen herkent. Een extra voordeel van LNA's ten opzichte van standaard

ASO's is dat ze een ribose ringstructuur hebben die gestabiliseerd wordt door een methyleen-

brug en dat de ribosen verbonden worden door een fosforothioaat binding (Figuur 9). Hier-

door zijn deze LNA moleculen stabieler en hebben ze een sterkere affiniteit met de lncRNA's

dan de reguliere ASO's (35).

3.1.1 Elektroporatie van LNA's tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen

Om na te gaan of LNA's (Exiqon) een lncRNA kunnen neerreguleren, werden 10 LNA's tegen

LUNAR1, ontwikkeld door Pieter-Jan Volders (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel IV), geëlektro-

poreerd in de CUTLL1 cellijn. Hiervoor werden 400 nM van de 10 LNA's tegen LUNAR1,

een LNA tegen MALAT1 (positieve controle) en een NTC-LNA (negatieve controle) geëlek-

troporeerd in de CUTLL1 cellijn met 1 miljoen cellen per opstelling (zie 2.3.1 van 'Materialen

en methoden'). Na 48u werden de cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd, cDNA gesyntheti-

seerd en RT-qPCR uitgevoerd (zie 2.4.2 en 2.4.3 van 'Materialen en methoden'). Als referen-

tiegenen werden HMBS, HPRT, SDHA en UBC gebruikt en de primers voor RT-qPCR zijn

weergegeven in Tabel VI van 'Addendum'. De genormaliseerde relatieve expressie werd bere-

A B

Figuur 9: schematische voorstelling van een LNA en een fosforothioaat binding. Figuur A geeft een sche-

matische voorstelling van een LNA weer waarbij de methyleenbrug aangeduid wordt door een pijl. Figuur B

toont een schematische voorstelling van een fosfortothioaat binding, eveneens aangeduid door een pijl (35).

RESULTATEN

27

kend met het programma qBase+ (Biogazelle) en is de verhouding tussen de genormaliseerde

expressie van de negatieve controle (NTC) en de genormaliseerde expressie van de doelwit-

genen. Bij de positieve controle MALAT1 werd er een duidelijke neerregulatie (68 %) waar-

genomen, wat de experimentele opstelling valideert. Er was geen of een beperkte neerre-

gulatie van LUNAR1 (0 % tot 37 %) en zijn target IGF1R (0 % tot 12 %) door de 10 gese-

lecteerde LNA's (Figuur 10) (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur I).

Figuur 10: elektroporatie van 10 LNA's tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen vertoont een beperkte efficiën-

tie. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 400 nM NTC-LNA, 400 nM LNA tegen MALAT1 en 400 nM

van 10 LNA's tegen LUNAR1. Na 48u werden de cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA

gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de relatieve expressies van MALAT1, LUNAR1 en IGF1R berekend met

qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve expressies werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie

met het NTC-LNA. De foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er is een duidelijke

neerregulatie van MALAT1 door het LNA tegen MALAT1 (A). Er wordt geen of een beperkte neerregulatie

waargenomen van LUNAR1 door de 10 LNA's (B). Er is geen of een beperkte neerregulatie van IGF1R door de

10 LNA's (C).

fd

1,00

1,15

0,88 0,95 0,911,10

1,351,22 1,20

0,95 0,98

0,00

0,50

1,00

1,50

NTC LNA1 LNA2 LNA15 LNA47 LNA51 LNA56 LNA59 LNA62 LNA70 LNA102

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)

1,00

0,32

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC LNA_MALAT1

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

MALAT1

1,000,78

0,7 0,63

0,94 0,99

1,61

1,06

1,55

1,16

2,09

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5


Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (3)

A

B

C

RESULTATEN

28

3.1.2 Elektroporatie van een LNA en een ASO tegen LUNAR1 in CUTLL1 en HBP-

ALL cellen

Het artikel waarin LUNAR1 voor het eerst beschreven werd, kon LUNAR1 neerreguleren met

een ASO. Hierbij waren de ribosen verbonden door een fosforothioaat binding en werd er

gebruik gemaakt van 2'-O-methyl RNA basen voor de eerste en laatste 3 nucleotiden om de

structuur stabieler te maken (22). Om dit te verifiëren werd 400 nM van dit ASO in CUTLL1

en HPB-ALL cellen geëlektroporeerd met 1 miljoen cellen per opstelling (zie 2.3.1 van 'Mate-

rialen en methoden'). Ter vergelijking werd een LNA tegen LUNAR1 meegenomen, waarvan

reeds in het labo was aangetoond dat het LUNAR1 kon neerreguleren (zie 7.1 van 'Adden-

dum', Tabel V). Na 48u werden de cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthe-

tiseerd. Vervolgens werd een RT-qPCR uitgevoerd waarvan de referentiegenen in 3.1.1 van

'Resultaten' beschreven werden (zie 2.4 van 'Materialen en methoden'). De gebruikte primers

worden weergegeven in Tabel VI van 'Addendum'. De genormaliseerde relatieve expressie

werd berekend met het programma qBase+ (Biogazelle) zoals beschreven in 3.1.1 van 'Resul-

taten'. Er werd een duidelijke neerregulatie van LUNAR1 waargenomen door het LNA (27-

58 %) met de verschillende primerparen, maar geen of een beperkte neerregulatie door het

ASO (0-15 %). Voor IGF1R werd er een beperkte neerregulatie gezien door zowel het LNA

(14-46 %) als het ASO (13 %) (Figuur 11) (zie 7.2. van 'Addendum', Figuur II). In de HPB-

ALL cellijn werden gelijkaardige resultaten bekomen (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur III).

Figuur 11: elektroporatie van een ASO en een LNA tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen vertoont een be-

perkte efficiëntie voor het ASO en een goede efficiëntie voor het LNA. CUTLL1 cellen werden

geëlektroporeerd met 400 nM NTC-LNA, 400 nM ASO tegen LUNAR1 en 400 nM LNA tegen LUNAR1. Na

48u werden de cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de

relatieve expressies van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve expressies

werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met het NTC-LNA. De foutenbalken geven de

standaardfout op 2 technische replicas weer. Er is een duidelijke neerregulatie van LUNAR1 door het LNA en

een beperkte neerregulatie van LUNAR1 door het ASO (A). Er wordt een beperkte neerregulatie van IGF1R

waargenomen door zowel het LNA als het ASO (B).

fdsq

1,00 0,92

0,42

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (3)

1,000,87 0,84

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)A B

RESULTATEN

29

3.1.3 Besluit

Er werden reeds verschillende LNA's tegen LUNAR1 getest in het CMGG, maar er kon

slechts voor 1 LNA een sterke neerregulatie van LUNAR1 aangetoond worden. Om off-target

effecten te elimineren zijn meerdere LNA's nodig. Daarom werden in bovenstaande experi-

menten 10 andere LNA's en een ASO getest, maar de neerregulatie van LUNAR1 door deze

LNA's en het ASO was beperkt.

3.2 Optimalisatie van het CRISPR/Cas9 systeem

Aangezien er een slechte neerregulatie van LUNAR1 werd waargenomen door de LNA's en

het ASO werd geopteerd om LUNAR1 uit te schakelen met het CRISPR/Cas9 systeem. Dit

systeem maakt gebruik van specifieke CRISPR plasmiden die het Cas9 endonuclease en een

kloneringsplaats voor gRNA's bevatten. Het gRNA is complementair aan de regio van inte-

resse en begeleidt het Cas9 eiwit naar de doelwitsequentie, waar het dubbelstrengige breuken

genereert. Vervolgens vindt NHEJ plaats waardoor modificaties in het genoom ingebracht

worden. Deze CRISPR plasmiden moeten in de cellijn binnengebracht worden, maar tot nu

toe slaagde men er in het CMGG nog niet in om plasmiden in T-ALL cellijnen te elektropore-

ren. Daarom moest de elektroporatie van plasmiden in T-ALL cellijnen geoptimaliseerd wor-

den. Bovendien moest nagegaan worden of Cas9 zijn functie uitoefent.

3.2.1 Optimalisatie van de elektroporatie met het pEGFP-C1 plasmide

3.2.1.1 Optimalisatie van de elektroporatie in verschillende cellijnen

Om plasmiden te elektroporeren werd gebruik gemaakt van een elektroporatieprogramma met

pulsen verkregen van de onderzoeksgroep van prof. Jan Cools van de KULeuven (zie 2.3.2

van 'Materialen en methoden'). Dit programma bestaat uit 4 of 8 pulsen van 175 V met een

0,1 seconde interval. Om dit programma te testen werd 0, 10 of 30 µg van het pEGFP-C1

plasmide in JURKAT cellen geëlektroporeerd. Het pEGFP-C1 plasmide werd gekozen omdat

het een klein plasmide is waarbij de efficiëntie van de elektroporatie gemakkelijk bekeken kan

worden via GFP expressie met een fluorescentie microscoop en/of FACS. Na het toevoegen

van 30 µg plasmide en het toedienen van 8 pulsen werd de hoogste elektroporatie-efficiëntie

bereikt (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur IV). Er zal vanaf nu verwezen worden naar deze con-

dities als standaardcondities voor elektroporatie met plasmiden.

Met FACS werd nagegaan hoeveel dode cellen er waren en wat de efficiëntie van de elektro-

poratie was door het aantal GFP positieve cellen te tellen (zie 2.6.2 van 'Materialen en metho-

den'). Op basis van de FSC en SSC werden de levende cellen in het eerste veld (R1) geselec-

teerd. In het tweede veld (R2) werden op basis van de SSC de single cells geselecteerd en in

RESULTATEN

30

het derde veld (R3) de GFP positieve cellen op basis van filter 1 (FL1: 525 nm ± 30 nm). De

hoeveelheid celdood was gelijkaardig bij 4 en 8 pulsen (22-27 %) (zie 7.2 van 'Addendum,

Figuur V). Bij 30 µg en 8 pulsen werd de hoogste elektroporatie-efficiëntie bereikt. In deze

conditie waren er 28,45 % GFP positieve cellen (Figuur 12).

Figuur 12: elektroporatie van 0, 10 of 30 µg pEGFP-C1 in JURKAT cellen met 4 of 8 pulsen vertoont de

hoogste elektroporatie-efficiëntie bij 30 µg pEGFP-C1 en 8 pulsen. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd

met 0, 10 of 30 µg plasmide aan 175 V voor 2,5 ms en 4 of 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. Na 48u wer-

den de cellen met FACS bekeken. In de figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weer-

gegeven en werden de GFP positieve cellen gedetecteerd met de FL1 filter. A en B: geen elektroporatie, C: 0 µg

plasmide en 4 pulsen, D: 0 µg plasmide en 8 pulsen, E: 10 µg plasmide en 4 pulsen, F: 10 µg plasmide en 8

pulsen, G: 30 µg plasmide en 4 pulsen, H: 30 µg plasmide en 8 pulsen.

Vervolgens werd de elektroporatie-efficiëntie nagegaan in DND41, HPB-ALL, CUTLL1,

ALL-SIL en LOUCY cellen met het pEGFP-C1 plasmide. Aangezien in JURKAT cellen de

hoogste elektroporatie-efficiëntie bereikt werd met 30 µg plasmide en 8 pulsen en 8 pulsen

niet voor meer celdood zorgde dan 4 pulsen, werden deze standaardcondities ook gebruikt

voor deze cellijnen. In DND41en ALL-SIL cellen werd er geen GFP expressie waargenomen,

in HPB-ALL en CUTLL1 cellen was er een beperkte GFP expressie en in LOUCY cellen

werd er een matige GFP expressie waargenomen (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur VI-Figuur

VIII).

0,22 % 0,07 %

7,26 %

0,16 %

0,09 % 14,12 %

A B

D

G

C

E F

H

21,68 % 28,48 %

Geen elektroporatie Geen elektroporatie 0 µg pEGFP-C1, 4 pulsen

10 µg pEGFP-C1, 8 pulsen 10 µg pEGFP-C1, 4 pulsen 0 µg pEGFP-C1, 8 pulsen

30 µg pEGFP-C1, 4 pulsen 30 µg pEGFP-C1, 8 pulsen

RESULTATEN

31

In een volgend experiment werd nagegaan of een elektroporatiebuffer de elektroporatie-

efficiëntie kon verhogen. Hiervoor werd het pEGFP-C1 plasmide met de standaardcondities

en een specifieke elektroporatiebuffer (Gene Pulser® electroporation buffer, Bio-Rad) geëlek-

troporeerd in de LOUCY cellijn (zie 2.3.3 van 'Materialen en methoden'). De efficiëntie was

echter gelijkaardig aan de elektroporatie-efficiëntie in LOUCY cellen na elektroporatie zon-

der een elektroporatiebuffer (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur VIII, Figuur IX). Dit experiment

werd ook uitgevoerd in JURKAT cellen waarbij de cellen op hetzelfde moment met en zonder

een elektroporatiebuffer geëlektroporeerd werden met 10 µg of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V

om de variatie te verkleinen. Ook hier was de elektroporatie-efficiëntie gelijkaardig in beide

experimenten (33,2 % zonder vs 29,3 % met elektroporatiebuffer en 10 µg plasmide; 61,3 %

met vs 47,5 % zonder elektroporatiebuffer en 30 µg plasmide), waardoor de elektroporatie-

buffer in volgende experimenten niet meer gebruikt werd (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur X,

Figuur XI).

3.2.1.2 Optimalisatie van de elektroporatie met verschillende condities

Aangezien in de meeste cellijnen slechts lage elektroporatie-efficiënties bereikt werden, werd

de elektroporatie getest met nieuwe condities in JURKAT, ALL-SIL en CUTLL1 cellen. Zo

werd onderzocht of de efficiëntie verschillend was wanneer er 1 of 0,5 miljoen cellen geëlek-

troporeerd werden, of er een verschil was tussen het toedienen van pulsen van 175 V of 250 V

en of de hoeveelheid plasmide, 10 of 30 µg, een rol speelt. Deze verschillende condities wer-

den gecombineerd om na te gaan wat de ideale elektroporatieconditie is. Het pEGFP-C1

plasmide werd in deze cellijnen geëlektroporeerd met 8 pulsen van 2,5 milliseconden met een

0,1 seconde interval en de verschillende condities. Na 48u werd de GFP expressie bekeken

met de fluorescentie microscoop en met FACS. In JURKAT cellen leidde 250 V tot de hoog-

ste elektroporatie-efficiënties (15-67 % bij 175 V vs 61-79 % bij 250 V), doch ook tot veel

dode cellen (78 %) wanneer 30 µg plasmide werd toegevoegd. Wanneer echter slechts 10 µg

plasmide werd toegevoegd, werden er veel minder dode cellen (20 %) waargenomen en werd

er een hogere elektroporatie-efficiëntie bereikt (78 % bij 10 µg en 250 V vs 63 % bij 30 µg en

250 V). Bij 175 V werd slechts een klein verschil waargenomen tussen de hoeveelheid cel-

dood bij 10 µg (32 %) en 30 µg (38 %) pEGFP-C1, maar de elektroporatie-efficiëntie was

beduidend hoger wanneer 30 µg plasmide werd toegevoegd (15 % bij 10 µg vs 64 % bij

30 µg). Het aantal cellen dat geëlektroporeerd werd, bleek geen invloed te hebben. Rekening

houdend met het aantal dode cellen en de elektroporatie-efficiëntie waren de condities met

175 V en 30 µg plasmide (38 % dode cellen; 64 % GFP positieve cellen) en 250 V en 10 µg

RESULTATEN

32

plasmide (20 % dode cellen, 78 % GFP positieve cellen) het meest efficiënt (Figuur 13) (zie

7.2 van 'Addendum', Figuur XII, Figuur XIII). De exacte waarden worden weergegeven in

Tabel VIII van 'Addendum'.

Figuur 13: opnames van de GFP expressie in JURKAT cellen 48u na elektroporatie met verschillende

condities vertonen een hoge elektroporatie-efficiëntie. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 10 of

30 µg pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met een fluo-

rescentiemicroscoop bekeken op een 4x vergroting. A: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg plasmide, B: 175 V; 0,5

miljoen cellen en 30 µg plasmide, C: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg plasmide, D: 250 V; 1 miljoen cellen en

30 µg plasmide, E: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg plasmide, F: 250 V; 1 miljoen cellen en 10 µg plasmide,

G: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg plasmide.

In de CUTLL1 cellen werd eenzelfde tendens waargenomen in zowel het aantal dode cellen

als in de elektroporatie-efficiëntie per conditie. In deze cellijn werd over het algemeen meer

celdood waargenomen dan in JURKAT cellen (40-84 % in CUTLL1 cellen vs 20-80 % in

JURKAT cellen). Ook de elektroporatie-efficiënties waren beduidend lager als in JURKAT

cellen, variërend van 2,46 % tot 57,5 % over de verschillende condities (zie 7.2 van 'Adden-

dum', Figuur XIV, Figuur XV, Figuur XVI).

Ook ALL-SIL cellen vertoonden eenzelfde tendens in zowel de hoeveelheid celdood als in de

elektroporatie-efficiëntie per conditie. Hier werd echter een zeer lage elektroporatie-

efficiëntie waargenomen (2,59-5,94 %) (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XVII, Figuur XVIII).

A B

1000 µm 1000 µm

C

1000 µm

D E

1000 µm 1000 µm

F

1000 µm

G

1000 µm

RESULTATEN

33

Uit deze experimenten kan besloten worden dat de beste elektroporatie-efficiëntie bereikt

werd met 175 V en 30 µg plasmide en met 250 V en 10 µg plasmide.

Aangezien CRISPR plasmiden groter zijn dan het pEGFP-C1 plasmide (9 kb vs 4700 bp) en

in JURKAT cellen de hoogste elektroporatie-efficiëntie bereikt werd, werd nagegaan of er

ook een groter plasmide kon binnengebracht worden in JURKAT cellen. Hiervoor werd het

pLentiGFP plasmide (9,5 kb) geëlektroporeerd met de standaardcondities in JURKAT cellen.

Ook dit plasmide kon efficiënt binnengebracht worden (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XIX).

3.2.2 Optimalisatie met CRISPR plasmiden

Uit bovenstaande experimenten is gebleken dat in JURKAT cellen de hoogste elektroporatie-

efficiëntie bereikt kon worden. Bovendien was het ook mogelijk om een plasmide met een

gelijkaardige grootte als een CRISPR plasmide binnen te brengen. Daarom werd in de vol-

gende experimenten nagegaan of het mogelijk is om een CRISPR plasmide met een GFP

merker (pX458) binnen te brengen in JURKAT cellen en vervolgens ook om via het CRIS-

PR/Cas9 systeem een gen uit te schakelen in JURKAT en Cas9 stabiele JURKAT cellen.

3.2.2.1 pX458 plasmide

Om na te gaan of CRISPR plasmiden efficiënt kunnen binnen gebracht worden in een T-ALL

cellijn werd pX458 in JURKAT cellen geëlektroporeerd met de standaardcondities. pX458 is

een variant van het standaard CRISPR plasmide (pX330), dat naast Cas9 en een klonerings-

plaats voor een gRNA, ook GFP bevat (Figuur 14).

fdsq

pX458

9289 bp

pX330

8506 bp

A B

Figuur 14: schematische weergave van de CRISPR plasmiden pX330 en pX458. pX330 bestaat uit een

kloneringsplaats voor een gRNA met U6 promotor en terminator. Cas9 staat onder controle van een CBh pro-

motor en eindigt met een bGH polyA (A). pX458 is een variant van pX330 waar GFP aan toegevoegd is (B).

RESULTATEN

34

Op deze manier kan de elektroporatie-efficiëntie eenvoudig bekeken worden met een fluores-

centie microscoop en FACS. Er werd een matige elektroporatie-efficiëntie van 14,1 % waar-

genomen (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XX, Figuur XXI).

3.2.2.2 Elektroporatie van pX330-CD45 in JURKAT cellen

Om na te gaan of Cas9 zijn functie uitoefent, werden 5 verschillende gRNA's die CD45 tar-

getten in het pX330 CRISPR plasmide gekloneerd (zie 2.2 van 'Materialen en methoden').

CD45 is een membraaneiwit dat werd gekozen omdat de efficiëntie van de knock out hiervan

gemakkelijk bekeken kan worden met FACS. De gRNA's werden reeds gevalideerd in het

labo van prof. Jan Cools (KULeuven). Deze plasmiden werden in JURKAT cellen geëlektro-

poreerd met de standaardcondities. Na 4 en 6 dagen werden de cellen gecollecteerd en werd

een anti-CD45 antilichaam gekoppeld aan PE (Miltenyi Biotec) toegevoegd waardoor de

CD45 expressie gevisualiseerd kon worden via PE excitatie met de FL3 filter (615 nm ±

25 nm) van het FACS toestel (zie 2.6.1 van 'Materialen en methoden'). Zowel na 4 als 6 dagen

werd de grootste daling in CD45 expressie bekomen door het pX330-CD45-4 CRISPR plas-

mide (11,4 % na 4 dagen vs 14,4 % na 6 dagen) en het pX330-CD45-5 CRISPR plasmide

(11,5 % na 4 dagen vs 15,8 % na 6 dagen) (Figuur 15) (Zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XXII,

Figuur XXIII).

A B

Figuur 15: elektroporatie van pX330-CD45 in JURKAT cellen met 30 µg plasmide, 175 V en 8 pulsen

vertoont een matige efficiëntie van knock out na 6 dagen. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met

30 µg van de pX330-CD45 CRISPR plasmiden aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met 0,1 seconde interval. De

efficiëntie van knock out van CD45 door deze CRISPR plasmiden werd na 6 dagen bekeken met FACS. In de

figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de CD45 positieve

cellen gedetecteerd door PE excitatie (FL3). Figuur A is een negatieve controle waarbij er geen plasmide werd

toegevoegd en er een verwaarloosbare daling in expressie van CD45 is. Figuur B geeft de daling in expressie

van CD45 door het pX330-CD45-5 CRISPR plasmide weer.

RESULTATEN

35

3.2.2.3 Elektroporatie van pX321-CD45 in een Cas9 stabiele JURKAT cellijn

In een volgend experiment werd nagegaan of de efficiëntie van knock out van CD45 verhoogd

kon worden door gebruik te maken van een Cas9 stabiele cellijn. Dit omdat Cas9 dan reeds

aanwezig is in de cellijn en dus uit het plasmide geknipt kan worden waardoor het finale

plasmide kleiner is en er een hogere efficiëntie verwacht kan worden. Hiervoor werd een Cas9

overexpresserende JURKAT cellijn ontwikkeld door Kaat Durinck. Om na te gaan of de cel-

lijn Cas9 tot overexpressie bracht, werd een Western blot uitgevoerd. De Cas9 stabiele JUR-

KAT cellen werden gecollecteerd en gelyseerd met de RIPA buffer. Vervolgens werden de

eiwitten door hitte gedenatureerd en werden ze geladen op een 10 % SDS gel om ze te schei-

den (zie 2.8 van 'Materialen en methoden'). De eiwitten werden overgebracht op een nitrocel-

lulose membraan en het membraan werd geïncubeerd in een 1/1000 verdunning van het pri-

mair anti-Cas9 muis antilichaam (Diagenode). Hieruit bleek duidelijk dat Cas9 aanwezig was

in de Cas9 overexpresserende JURKAT cellijn (Figuur 16).

Aangezien Cas9 tot overexpressie kwam in de Cas9 stabiele cellijn, werd in een volgend ex-

periment getest of hogere efficiënties van knock out van CD45 bereikt konden worden in deze

cellijn. Hiervoor werd het pX321 CRISPR plasmide gebruikt. Dit bevat dezelfde elementen

als het standaard pX330 CRISPR plasmide, maar bevat geen Cas9 waardoor het plasmide

kleiner is (3206 bp) (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XXIV). Aangezien met de pX330-

CD45-4 en pX330-CD45-5 CRISPR plasmiden de hoogste efficiëntie van knock out bekomen

werd in JURKAT cellen (zie 3.2.2.2 van 'Resultaten'), werden CD45-4 en CD45-5 gRNA's in

het pX321 CRISPR plasmide gekloneerd (zie 2.2 van 'Materialen en methoden'). Vervolgens

werden de Cas9 overexpresserende JURKAT cellen geëlektroporeerd met deze plasmiden.

Hiervoor werd gebruik gemaakt van de elektroporatiecondities met de hoogste elektroporatie-

Figuur 16: Western blotting bevestigt de aanwezigheid van Cas9 in de Cas9 stabiele JURKAT cellijn. Cas9

overexpresserende JURKAT cellen werden gecollecteerd en gelyseerd. Immunodetectie van Cas9 gebeurde met

1/1000 verdund anti-Cas9 muis antilichaam (Diagenode) en 1/5000 verdund anti-muis-HRP als secundair antili-

chaam. Als ladingscontrole werd α-tubuline gedetecteerd met 1/2000 verdund anti-α-tubuline (muis, Sigma) en

als secundair antilichaam 1/5000 verdund anti-muis IgG-HRP (Sigma).

Cas9

160 kDa

α-tubuline

50kDa

Lad

der

JUR

KA

T c

elli

jn

Cas

9 s

tab

iele

JUR

KA

T c

elli

jn

RESULTATEN

36

efficiënties, namelijk met 175 V en 30 µg plasmide en met 250 V en 10 µg plasmide (zie

3.2.1.2 van 'Resultaten') (zie 2.3.2 van 'Materialen en methoden'). Na 4 dagen werden de cel-

len gecollecteerd en werd een anti-CD45 antilichaam gekoppeld aan PE (Miltenyi Biotec)

toegevoegd waardoor de CD45 expressie gevisualiseerd kon worden via PE excitatie met de

FL3 filter (615 nm ± 25 nm) van het FACS toestel (zie 2.6.1 van 'Materialen en methoden').

Na het toedienen van pulsen van 175 V met 30 µg plasmide werden geen cellen gedetecteerd

na selectie op FSC en SSC. Na het toedienen van pulsen van 250 V met 10 µg plasmide was

de efficiëntie van knock out 24,6 % voor pX321-CD45-4 en 16,6 % voor pX321-CD45-5 (zie

7.2 van 'Addendum', Figuur XXV).

3.2.3 Besluit

In bovenstaande experimenten werd het protocol voor elektroporatie van plasmiden in T-ALL

cellijnen geoptimaliseerd. De resultaten tonen aan dat het mogelijk is om plasmiden te elek-

troporeren in T-ALL cellijnen en dat de hoogste elektroporatie-efficiëntie in JURKAT cellen

bekomen werd. De hoogste efficiënties werden bereikt door 30 µg plasmide toe te voegen aan

de cellen en pulsen van 175 V toe te dienen of 10 µg plasmide toe te voegen en pulsen van

250 V toe te dienen. De werking van Cas9 kon worden aangetoond aangezien er een verlaag-

de expressie van CD45 waargenomen werd na elektroporatie van de pX330-CD45 CRISPR

plasmiden in JURKAT cellen. Door gebruik te maken van een Cas9 stabiele JURKAT cellijn

en het kleiner pX321 CRISPR plasmide kon een hogere efficiëntie van knock out bereikt wor-

den.

3.3 Knock out van LUNAR1 met het CRISPR/Cas9 systeem

Aangezien het mogelijk was om een gen uit te schakelen met het CRISPR/Cas9 systeem,

werd vervolgens nagegaan of het ook mogelijk is om een lncRNA uit te schakelen. Na een

literatuurstudie werd LUNAR1, een NOTCH1 gereguleerd lncRNA in T-ALL, geselecteerd

voor neerregulatie (22). De sequentie van LUNAR1 is weergegeven in Figuur XXVI van 'Ad-

dendum'.

3.3.1 Knock out van LUNAR1 door het pX458 CRISPR plasmide met 2 gRNA's

Bij het bekomen van een knock out van een eiwitcoderend gen, worden gRNA's ontworpen ter

hoogte van domeinen met een gekende functie en na de translatiestartplaats. Hierdoor zal er

een nonsense mutatie gevormd worden en wordt er vaak een prematuur stopcodon geïntrodu-

ceerd waardoor het eiwit zijn functie niet meer zal kunnen uitoefenen. Bij lncRNA's is het

echter vaak moeilijk te voorspellen wat het functionele domein zal zijn. Hierdoor is het moge-

lijk dat een deletie van enkele basenparen de functie van een lncRNA niet of slechts weinig

RESULTATEN

37

zal beïnvloeden. Uit literatuurstudie is gebleken dat het mogelijk is om een deletie van een

volledig gen te bekomen door gebruik te maken van een CRISPR plasmide met 2 gRNA's:

één aan de start en één aan het einde van het fucuntioneel domein van het gen. Een ncRNA

kan ook via deze methode uitgeschakeld worden door 2 gRNA's te ontwikkelen aan de gren-

zen van het ncRNA (30). Bovendien wordt ook beter het GFP bevattende pX458 CRISPR

plasmide gebruikt dan het standaard pX330 CRISPR plasmide omdat de cellen die het plas-

mide hebben opgenomen dan GFP positief zullen zijn en gesorteerd kunnen worden met

FACS. Om een deletie van LUNAR1 te bekomen werden 3 gRNA's aan het begin (gRNA

LUNAR1-S) en 3 gRNA's aan het einde (gRNA LUNAR1-E) van LUNAR1 ontwikkeld

(Figuur 17) (zie 7.1 van 'Addendum', Tabel III) en werden de verschillende mogelijke combi-

naties van LUNAR1-S en LUNAR1-E gRNA's in het pX458 CRISPR plasmide gekloneerd

(zie 2.2.5 van 'Materialen en methoden').

Hiervoor werd elk gRNA eerst apart gekloneerd in pX458. Om na te gaan of de gRNA's inge-

bouwd waren, werd een kolonie PCR uitgevoerd en werden de plasmiden gesequeneerd.

Hieruit bleek dat 5 van de 6 gRNA's in het plasmide opgenomen waren (S1, S3, E1, E2 en

E3) (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XXVII). Vervolgens werden de LUNAR1-E gRNA's

met de U6 promotor uit pX458 geïsoleerd door middel van een PCR reactie met primers met

restrictiesites voor XbaI en KpnI-HF. Ten slotte werden deze fragmenten gekloneerd in de

pX458 plasmiden met de LUNAR1-S gRNA's en werd via sequenering gekeken welke plas-

miden beide gRNA's bevatten (zie 2.2.5 van 'Materialen en methoden'). De plasmiden pX458-

S1-E1, pX458-S1-E2 en pX458-S1-E3 bevatten beide gRNA's en werden gebruikt in de ver-

dere experimenten (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XXVIII).

Om LUNAR1 uit te schakelen werd geopteerd om de pX458-S-E plasmiden te elektroporeren

in de CUTLL1 cellijn aangezien deze cellijn LUNAR1 tot expressie brengt. Ter controle wer-

den JURKAT en HEK293TN cellen meegenomen omdat deze een hogere elektroporatie of

Figuur 17: schematische voorstelling van LUNAR1 en de locatie van de gRNA's. In dit schema worden de

exonen en intronen van LUNAR1 weergegeven. De posities van de gRNA's zijn aangeduid met pijlen.

RESULTATEN

38

transfectie efficiëntie hebben. Deze cellijnen brengen LUNAR1 slechts laag (JURKAT) of

helemaal niet (HEK293TN) tot expressie, maar er kan op DNA niveau gekeken worden welke

modificaties plaatsgevonden hebben. Uit de experimenten met pEGFP-C1 en verschillende

elektroporatiecondities bleek dat met 175 V en 30 µg plasmide en met 250 V en 10 µg plas-

mide de hoogste elektroporatie-efficiënties bereikt werden (zie 3.2.1.2 van 'Resultaten').

Daarom werden 1 miljoen CUTLL1 en JURKAT cellen met 8 pulsen en deze condities geë-

lektroporeerd (zie 2.3.2 van 'Materialen en methoden'). Als controle werden de cellen ook

geëlektroporeerd met pX458 en pEGFP-C1 met dezelfde condities. Na 48u werden de GFP

positieve cellen gesorteerd met FACS (zie 2.6.3 van 'Materialen en methoden'). Zowel in

JURKAT als CUTLL1 cellen bleek dat de efficiënties hoger waren bij 250 V dan bij 175 V

(uitzondering pX458). In JURKAT cellen werden efficiënties tussen 9,70 % en 24,97 % be-

reikt en werden er 228.964 à 520.045 GFP positieve cellen gesorteerd (Tabel 1).

Tabel 1: weergave van de efficiëntie en het aantal gesorteerde GFP positieve cellen na elektroporatie van

CRISPR plasmiden met 2 gRNA's tegen LUNAR1 in JURKAT cellen.

Plasmide Pulsen (V) Efficiëntie (%) Aantal gesorteerde

GFP positieve cellen

pX458 175 15,19 335.982

pX458 250 14,15 321.975

pX458-S1-E1 175 22,40 379.626

pX458-S1-E1 250 24,97 520.045

pX458-S1-E2 175 11,11 247.069

pX458-S1-E2 250 15,90 362.964

pX458-S1-E3 175 9,70 228.964

pX458-S1-E3 250 18,17 433.167

Zoals verwacht uit voorgaande experimenten was de elektroporatie-efficiëntie in CUTLL1

cellen heel wat lager. Zo werden er efficiënties waargenomen variërend van 1,15 % tot

2,37 % bij 175 V en van 3,13 % tot 3,76 % bij 250 V. Het aantal GFP positieve gesorteerde

cellen varieerde respectievelijk tussen 23.832 en 31.209 cellen en tussen 37.253 en 62.263

cellen (zie 7.2 van 'Addendum, Tabel IX). Gezien de beperkte hoeveelheid gesorteerde

CUTLL1 cellen werden de CUTLL1 cellen van de experimenten met 175 V en 250 V samen-

gevoegd. De GFP positieve CUTLL1 en JURKAT cellen werden verder opgekweekt tot een

voldoende hoog celaantal bereikt werd voor DNA isolatie (1 miljoen cellen) en/of RNA isola-

tie (0,5 miljoen cellen).

HEK293TN cellen werden getransfecteerd met de PEI methode (zie 2.5 van 'Materialen en

methoden'). Hiervoor werd 100 µl van een DNA oplossing met 2 µg plasmide DNA samen-

RESULTATEN

39

gevoegd met 100 µl van een PEI oplossing en werd dit toegevoegd aan de cellen. Naast de

pX458-S-E plasmiden werden opnieuw 2 controles meegenomen, namelijk pX458 en pEGFP-

C1. Na 48u werden de cellen gecollecteerd voor DNA isolatie (zie 2.7.1 van 'Materialen en

methoden').

Om na te gaan of er een deletie was van LUNAR1 werd er een PCR uitgevoerd met 100 ng

DNA en verschillende primerparen in en buiten LUNAR1 in HEK293TN en JURKAT cellen

(Figuur 18) (zie 2.7.2 van 'Materialen en methoden'). Er werd verwacht dat enkel indien een

deletie had plaatsgevonden, een signaal gedetecteerd zou worden met de primers buiten het

lncRNA. Bij een wild type conditie liggen deze primers te ver van elkaar (> 16 kb) om een

PCR amplificatie te bekomen.

Via de labchip (Caliper, Life Sciences) werden goede primerparen geselecteerd en werd ge-

keken of er een deletie van LUNAR1 was. In HEK293TN cellen werden er duidelijke bandjes

gezien met de primerparen 2, 3 en 4. Deze primerparen zullen enkel een succesvolle PCR

reactie verkrijgen indien de deletie niet heeft plaatsgevonden. Ook bij de CRISPR behandelde

stalen werd hier een signaal gedetecteerd. Bij primerpaar 1 en primerpaar 5 werd geen duide-

lijk bandenpatroon waargenomen. Ook bij primerpaar 6 werd geen signaal gedetecteerd (zie

7.2 van 'Addendum', Figuur XXIX). Aangezien primerpaar 2, 3 en 6 het meest informatief

waren, werd de PCR in JURKAT cellen uitgevoerd met deze primerparen en met een extra

primerpaar buiten LUNAR1. Hier werd eenzelfde tendens als in de HEK293TN cellen waar-

genomen. Bij primerpaar 7 werden veel aspecifieke bandjes waargenomen, maar in enkele

condities werd ook een licht bandje bij 1000 bp gezien, wat op een deletie kan wijzen (zie 7.2

van 'Addendum', Figuur XXX).

Figuur 18: schematische voorstelling van LUNAR1 met de posities van de gRNA's en de primers voor

PCR. De posities van de gRNA's zijn aangeduid met verticale pijlen. De verschillende primerparen worden

weergegeven door de gekleurde horizontale pijlen.

RESULTATEN

40

Om de eventuele daling in expressie van LUNAR1 te kwantificeren werd een RT-qPCR uitge-

voerd in JURKAT en CUTLL1 cellen (zie 2.4 van 'Materialen en methoden'). Bij 175 V en

30 µg plasmide werd in JURKAT cellen een verlaagde expressie van LUNAR1 waargenomen

door pX458-S1-E1 (20-41 %) en door pX458-S1-E3 (22-28 %) met de verschillende primer-

paren. Er werd ook een daling in expressie van IGF1R van 20 % waargenomen door pX458-

S1-E1 (Figuur 19) (zie 7.2 van 'Addendum', Figuur XXXI).

Na elektroporatie met 250 V en 10 µg plasmide werd een beperkte daling in expressie van

LUNAR1 waargenomen door pX458-S1-E1 (20-29 %) en pX458-S1-E2 (21-27 %) met de

verschillende primerparen. Er werd geen daling in expressie van IGF1R waargenomen (zie

7.2 van 'Addendum', Figuur XXXII).

In CUTLL1 cellen werd een grote daling in expressie van LUNAR1 waargenomen bij het

LUNAR (2) primerpaar en een kleine of afwezige daling in expressie van LUNAR1 bij de

LUNAR1 (3) en (4) primerparen. Ondanks de beperkte daling van LUNAR1 werd er wel een

sterke daling in expressie van IGF1R waargenomen (Figuur 20) (zie 7.2 van 'Addendum',

Figuur XXXIII). Sequenering zal moeten uitgevoerd worden om te verklaren waarom er een

groot verschil wordt waargenomen tussen de expressie van LUNAR1 met de verschillende

primerparen en om te verklaren wat de sterke daling in expressie van IGF1R veroorzaakt

heeft.

1,00

0,67

1,20

0,72

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (3)1,00

0,801,04 0,98

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)

Figuur 19: elektroporatie van pX458-S-E plasmiden in JURKAT cellen vertoont een verlaagde expressie

van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en pX458-S1-E3 en een daling in expressie van IGF1R door pX458-S1-E1.

JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 30 µg pX458S-E met 8 pulsen van 175 V. GFP positieve cellen

werden gesorteerd met FACS. De cellen werden gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na

RT-qPCR werden de relatieve expressies van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+ (Biogazelle). Deze

relatieve expressies werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met pX458. De

foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er werd een verlaagde expressie van

LUNAR1 waargenomen door pX458-S1-E1 en pX458-S1-E3 (A). Er werd ook een daling in expressie van IGF1R

waargenomen door pX458-S1-E1 (B).

A B

RESULTATEN

41

3.3.2 Besluit

In bovenstaande experimenten werd geprobeerd om LUNAR1 uit te schakelen met het CRIS-

PR/Cas9 systeem. Hiervoor werd een CRISPR plasmide met 2 gRNA's tegen LUNAR1 binnen

gebracht in CUTLL1, JURKAT en HEK293TN cellen. Via PCR kon niet onmiddellijk een

knock out van LUNAR1 aangetoond worden voor JURKAT en HEK293TN cellen. RT-qPCR

toonde een beperkte daling in expressie van LUNAR1 aan in JURKAT cellen en een grotere

daling in expressie van LUNAR1 in CUTLL1 cellen. Dit wijst er mogelijks op dat de deletie

aanwezig is in een beperkt aantal cellen. Mogelijks kon dit niet opgepikt worden door de ont-

worpen primers voor PCR. Sequenering is nodig om deze resultaten te verklaren. Om finaal

tot een knock out cellijn te komen moet single cell sorting uitgevoerd worden en moeten deze

single cells verder uitgroeien tot klonale celculturen. De deletie kan hier opnieuw nagegaan

worden met PCR en bevestigd worden aan de hand van Sanger sequenering.

fds

fds

1,00

0,56

0,99 1,02

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Rel

ati

eve

exp

ress

ieLUNAR1 (2)

1,00

0,37

0,830,90

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)

1,000,84

1,12 1,16

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (3)A C B

Figuur 20: elektroporatie van pX458-S-E plasmiden in CUTLL1 cellen vertoont een matige daling in

expressie van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en een sterke daling in expressie van IGF1R door pX458-S1-

E1. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 30 µg pX458S-E en 175 V of met 10 µg pX458S-E en 250 V.

GFP positieve cellen werden gesorteerd met FACS en cellen geëlektroporeerd met 175 V of 250 V werden

samengevoegd. De cellen werden gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na RT-qPCR wer-

den de relatieve expressies van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve

expressies werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met pX458. De foutenbalken geven

de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er werd een daling in expressie van LUNAR1 waargenomen

door pX458-S1-E1 (A, B). Er werd een sterke daling in expressie van IGF1R waargenomen door pX458-S1-E1

(B).

BESPREKING

42

4 BESPREKING

Recent werd een nieuwe klasse van niet coderende RNA's, lange niet coderende RNA's (ln-

cRNA's), geïdentificeerd. lncRNA's zijn langer dan 200 bp en coderen niet voor eiwitten

(22,23). Hoewel er al meer dan 111.000 lncRNA's geïdentificeerd zijn, zijn slechts enkele van

deze lncRNA's in detail onderzocht (36). lncRNA's blijken betrokken te zijn bij zowel de

normale ontwikkeling als bij ziekten zoals kanker (23). Zo heeft men in het Centrum voor

Medische Genetica Gent (CMGG) recent aangetoond dat bepaalde lncRNA's gereguleerd

worden door NOTCH1 in zowel de normale T-cel ontwikkeling als in T-ALL. Door middel

van guilt by association analyse konden reeds mogelijke functies gekoppeld worden aan enke-

le van deze NOTCH1 gereguleerde lncRNA's (28). Verder onderzoek is nodig om nieuwe

lncRNA's te identificeren die betrokken zijn in T-ALL en om hun rol in de normale T-cel

ontwikkeling en T-ALL te achterhalen. Om hier meer inzicht in te krijgen zijn knock down en

overexpressie studies nodig. Daarom werden in deze masterproef 2 technieken getest voor

neerregulatie van een lncRNA.

In het eerste deel van deze masterproef werd getracht om het lncRNA, LUNAR1, neer te regu-

leren door middel van LNA's en een ASO. LUNAR1 is een lncRNA dat aanwezig is in de kern

en dat direct gereguleerd wordt door NOTCH1. LUNAR1 is betrokken in het versterken van de

IGF1 signalering door transcriptionele regulatie van IGF1R (22). In eerste instantie werd er

geopteerd voor neerregulatie van LUNAR1 door middel van LNA's gezien de vele voordelen

van LNA's ten opzichte van siRNA's en ASO's. Zo zijn siRNA's werkzaam in het cytoplasma,

terwijl de meeste lncRNA's aanwezig zijn in de nucleus. LNA's en ASO's voeren daarentegen

wel hun functie in de nucleus uit. Hierbij bindt het LNA of ASO aan het lncRNA waarna dit

DNA-RNA complex het RNase H activeert en dit RNase H het lncRNA in de nucleus degra-

deert (35,37). Een extra voordeel van LNA's ten opzichte van ASO's is dat de ribose ring-

structuur gestabiliseerd is door een methyleenbrug en dat de ribosen verbonden worden door

een fosforothioaat binding. Hierdoor zijn deze LNA moleculen stabieler en hebben ze een

sterkere affiniteit met het lncRNA dan de reguliere ASO's (37). In het labo werden reeds en-

kele LNA's, ontwikkeld door Exiqon, getest waarvan slechts 1 voor een aanzienlijke neerre-

gulatie zorgde. Aangezien meerdere werkzame LNA's nodig zijn om de off-target effecten te

beperken werden in deze masterproef 10 extra LNA's getest waarvan de sequentie bepaald

werd door een in house ontwikkeld algoritme door Pieter-Jan Volders. Ondanks de vele voor-

delen van LNA's bleek na elektroporatie van de LNA's in CUTLL1 cellen dat er geen of een

geringe neerregulatie was van LUNAR1 en zijn target IGF1R. Bij de positieve controle, MA-

BESPREKING

43

LAT1, werd daarentegen wel een sterke neerregulatie waargenomen wat aantoont dat het ge-

brek aan neerregulatie niet te wijten is aan een probleem in de experimentele opstelling, zoals

de cellen of de elektroporatie-opstelling.

Trimarchi et al. slaagden erin om LUNAR1 neer te reguleren met een ASO (22). Om dit te

bevestigen werd dit ASO geëlektroporeerd in CUTLL1 en HPB-ALL cellen. Als controle

werden een LNA tegen MALAT1 en een LNA tegen LUNAR1, waarvan reeds in het labo was

aangetoond dat het LUNAR1 kon neerreguleren, meegenomen. Zoals verwacht was er een

sterke neerregulatie van MALAT1 en werd er ook een neerregulatie waargenomen van LU-

NAR1 door het LNA. Er werd echter geen of een geringe neerregulatie van LUNAR1 waarge-

nomen door het ASO, waardoor de resultaten uit het artikel niet bevestigd konden worden.

Neerregulatie door LNA's en ASO's is wellicht niet voor elk lncRNA mogelijk aangezien

sommige lncRNA's maar een beperkt aantal target plaatsen hebben, door bijvoorbeeld secun-

daire structuren, en die plaatsen moeilijk te bepalen zijn.

Gezien de beperkte neerregulatie van LUNAR1 door LNA's en ASO's werd geopteerd om

LUNAR1 neer te reguleren door middel van CRISPR/Cas9. Dit systeem heeft als voordeel dat

het relatief eenvoudig te ontwikkelen is, dat het genen permanent kan uitschakelen en dat het

efficiënt en specifiek is (34). Dit systeem maakt gebruik van een Cas9 endonuclease en een

gRNA, dat complementair is met de regio van interesse en dat het Cas9 eiwit naar de doelwit-

sequentie brengt. Na dubbelstrengige verknipping door Cas9 vindt NHEJ plaats, waardoor er

fouten in het genoom ingebracht worden. Voor de start van deze masterproef, werd in het

CMGG al succesvol gebruik gemaakt van de CRISPR/Cas9 technologie bij zebravissen en

werd er reeds een t(11;17) translocatie gemaakt in een fibroblast cellijn, zoals beschreven in

Maddalo et al. (32). In het labo wordt voor het bekomen van een knock out cellijn met CRIS-

PR/Cas9 een plasmide gebruikt dat het Cas9 gen en een kloneringsplaats voor het gewenste

gRNA bevat. Aangezien deze techniek nog niet werd toegepast in een T-ALL context, moest

deze eerst geoptimaliseerd worden. De grote uitdaging hierbij was om het grote CRISPR-

plasmide in een T-ALL cellijn te brengen, aangezien T-ALL cellijnen zeer moeilijk te trans-

fecteren zijn.

Het elektroporeren van een plasmide in verschillende T-ALL cellijnen werd daarom eerst

getest met een kleiner plasmide met een GFP merker, namelijk pEGFP-C1. Het protocol werd

verkregen van de groep van prof. Jan Cools (KULeuven). Er werd gebruik gemaakt van 10 en

30 µg plasmide wat aanzienlijk hogere concentraties zijn dan dat er gebruikt worden bij de

BESPREKING

44

transfectie van adherente cellijnen. Door middel van elektroporatie van het pEGFP-C1 plas-

mide in verschillende cellijnen en met verschillende condities kon worden aangetoond dat met

175 V, 30 µg plasmide en 8 pulsen van 2,5 ms en met 250 V, 10 µg plasmide en 8 pulsen van

2,5 ms de hoogste elektroporatie-efficiëntie bereikt werd. In JURKAT cellen was de elektro-

poratie-efficiëntie ook aanzienlijk hoger dan in andere T-ALL cellijnen (CUTLL1, ALL-SIL,

HPB-ALL, LOUCY en DND41). Er bleek ook dat een elektroporatiebuffer deze efficiëntie

niet kon verhogen. Bij 175 V werden relatief weinig dode cellen waargenomen wat aantoont

dat de cellen niet sensitief zijn aan de vele pulsen. Bij pulsen van 250 V en 30 µg plasmide

steeg de celdood aanzienlijk. Wanneer er echter slechts 10 µg plasmide werd toegevoegd en

pulsen van 250 V werden toegediend, werd de hoeveelheid celdood sterk gereduceerd. Hieruit

kan besloten worden dat zowel het toedienen van een hoog voltage als het binnenbrengen van

een grote hoeveelheid plasmide toxisch is voor de cellen. Uit deze experimenten bleek ook dat

het aantal cellen per opstelling; 0,5 of 1 miljoen, geen invloed had op de elektroporatie-

efficiëntie. In JURKAT, CUTLL1 en ALL-SIL werd eenzelfde tendens waargenomen, maar

in CUTLL1 en ALL-SIL cellen werden er duidelijk meer dode cellen waargenomen en was de

elektroporatie-efficiëntie heel wat lager dan in de JURKAT cellen. Dit is een tendens die ook

waarneembaar is voor andere experimentele opstelling (vb. transductie), waarbij de JURKAT

cellijn telkens efficiënter te manipuleren is dan de andere T-ALL cellijnen.

Hoewel in het experiment met verschillende elektroporatiecondities 61 % GFP positieve cel-

len waargenomen werden in JURKAT cellen na elektroporatie aan 175 V met 30 µg pEGFP-

C1 en 8 pulsen (zie figuur XVI), werden in een voorgaand experiment in JURKAT cellen met

dezelfde condities slechts 28 % GFP positieve cellen waargenomen. Dit toont aan dat deze

experimenten zeer gevoelig zijn aan technische variatie en dat meer herhalingen met zo wei-

nig mogelijk variatie nodig zijn om een juiste inschatting van de elektroporatie-efficiëntie te

kunnen maken.

In een volgende stap werd aangetoond dat ook het grotere pLentiGFP (9,5 kb) plasmide en het

pX458 CRISPR (CRISPR plasmide dat gRNA's, Cas9 en GFP bevat) plasmide efficiënt kon-

den worden opgenomen door JURKAT cellen. Vervolgens werd ook de werking van Cas9

nagegaan. Hiervoor werd gRNA dat CD45 target in het pX330 CRISPR gekloneerd. Dit

plasmide is een standaard CRISPR plasmide dat Cas9 en een gRNA kloneringsplaats bevat.

Het membraaneiwit CD45 werd gekozen omdat het tot expressie komt in lymfocyten en de

efficiëntie van knock out eenvoudig gevisualiseerd kan worden met FACS. Na elektroporatie

van de pX330-CD45 plasmiden in JURKAT cellen kon er met FACS een knock out van CD45

BESPREKING

45

waargenomen worden met een efficiëntie van 15,8 %. Dit wijst erop dat Cas9 zijn functie

uitgeoefend heeft en dubbelstrengige breuken gegenereerd heeft. Om de efficiëntie van knock

out te verhogen werd een Cas9 overexpresserende JURKAT cellijn ontwikkeld. In deze Cas9

stabiele cellijn was Cas9 reeds aanwezig waardoor dit uit het CRISPR plasmide geknipt kon

worden. Hierdoor was het CRISPR plasmide pX321 (CRISPR plasmide zonder Cas9) heel

wat kleiner dan het standaard CRISPR plasmide (pX330) en werden er hogere efficiënties van

knock out van CD45 bekomen (tot 24,6 %) wanneer 10 µg plasmide werd toegevoegd en pul-

sen van 250 V werden toegediend. Wanneer er echter 30 µg plasmide werd toegevoegd en

pulsen van 175 V werden toegediend, konden geen cellen gedetecteerd worden via FSC en

SSC selectie. Dit kan mogelijks verklaard worden door het feit dat er bij 30 µg van dit kleine

plasmide een veel hogere hoeveelheid van het plasmide aanwezig is, wat voor meer toxiciteit

kan zorgen. In een volgende stap zal er een fluorescente merker in het pX321 plasmide geli-

geerd worden zodat cellen die het plasmide bevatten gesorteerd kunnen worden. Deze cellen

kunnen dan verder opgekweekt worden en de effecten in deze populatie kunnen onderzocht

worden.

Aangezien het mogelijk was om een gen uit te schakelen met CRISPR/Cas9, werd in het laat-

ste deel van deze masterproef geprobeerd om het lncRNA, LUNAR1, uit te schakelen. Een

knock down maken van een eiwitcoderend gen is relatief eenvoudig omdat een kleine deletie

of insertie het open reading frame reeds kan onderbreken zodat er geen functioneel genpro-

duct geproduceerd wordt. Bij lncRNA’s is het echter moeilijk om te bepalen wat het functio-

nele deel is en is het mogelijk dat een kleine deletie of insertie niet tot een knock out zal lei-

den. Ook miRNA's kunnen gemakkelijker uitgeschakeld worden aangezien deze veel kleiner

zijn dan lncRNA's en hun belangrijke functionele regio wel gekend is (38). Om toch een

knock out van een lncRNA te bekomen is uit literatuurstudie gebleken dat 2 gRNA's, één aan

de start en één aan het eind van het lncRNA, ontwikkeld moeten worden. Zheng et al. hebben

reeds aangetoond dat door gebruik te maken van 2 gRNA's deleties tot 10 kb gegenereerd

kunnen worden in HEK293T cellen. Voor deze deleties werden efficiënties van 11 % tot 68 %

bereikt afhankelijk van de gebruikte gRNA's en de doelwitsequentie (30).

Om een deletie van LUNAR1 te bekomen werden er 3 gRNA's aan de start en 3 gRNA's aan

het einde van het lncRNA ontwikkeld en werden de verschillende combinaties van 2 gRNA's

gekloneerd in het pX458 plasmide. Vervolgens werden deze pX458 plasmiden met 2 gRNA's

geëlektroporeerd of getransfecteerd in CUTLL1, JURKAT en HEK293TN cellen. Er werd

geopteerd om 2 gRNA's in 1 plasmide te kloneren en dit plasmide te elektroporeren in plaats

BESPREKING

46

van de 2 gRNA's apart in een plasmide te kloneren en beide plasmiden te elektroporeren. Dit

omdat de 2 gRNA's dan steeds aanwezig zijn in de cellen die het plasmide hebben opgenomen

en omdat het eenvoudiger is voor de cellen om slechts 1 plasmide op te nemen (38). Om een

aanrijking te krijgen van JURKAT en CUTLL1 cellen die het plasmide hadden opgenomen,

werden de GFP-positieve cellen via FACS uit de populatie gesorteerd. Aan de hand van een

PCR met verscheidene primerparen binnen en buiten LUNAR1 werd nagegaan of de deletie

geslaagd was in HEK293TN en JURKAT cellen. Deze resultaten konden de deletie niet on-

middellijk aantonen. Dit kan verklaard worden door de afwezigheid van de deletie, een lage

frequentie van de deletie of door het design van de primerparen. Voor de JURKAT en

CUTLL1 cellen werd een RT-qPCR uitgevoerd om het effect van de deletie op expressieni-

veau na te gaan. Er werd een beperkte daling in expressie van LUNAR1 waargenomen. Deze

beperkte daling in expressie kan erop wijzen dat er toch enkele cellen in de populatie een mo-

no- of bi-allelische knock out van LUNAR1 ondergaan zullen hebben. In CUTLL1 cellen werd

een verlaagde expressie waargenomen bij 1 primerpaar voor LUNAR1, maar geen of een

zwakke daling in expressie bij de andere primerparen voor LUNAR1. Het is opmerkelijk dat er

wel een sterk verlaagde expressie van IGF1R werd waargenomen. Mogelijks wijst dit erop dat

de knock out gelukt is in een deel van de cellen, maar sequenering zal deze resultaten moeten

verklaren. In CUTLL1 cellen werden betere resultaten bekomen dan in JURKAT cellen wat

verklaard kan worden door het feit dat CUTLL1 cellen LUNAR1 hoger tot expressie brengen

en dat CUTLL1 cellen sterker afhankelijk zijn van de NOTCH1 signalisatie. Om definitieve

conclusies te kunnen trekken, moet sequenering uitgevoerd worden. De reden waarom er

slechts een beperkte daling in expressie werd waargenomen in plaats van een volledige knock

out, kan op 3 manieren verklaard worden. Ten eerste werd er op populatieniveau gekeken

waarbij er wellicht meer cellen waren die de deletie niet bevatten dan cellen die de deletie wel

bevatten, waardoor het signaal van de wild type cellen overheerste en de neerregulatie slechts

beperkt detecteerbaar was. Een andere verklaring is dat cellen polyploïd zijn waardoor er een

deletie op elk allel moet zijn om een volledige knock out te verkrijgen. Ten slotte is het ook

mogelijk dat slechts 1 van de 2 gRNA's in het plasmide een DSB genereert. Deze zal dan her-

steld worden door NHEJ waardoor er in deze cellen geen deletie van LUNAR1 zal zijn.

Om meer zekerheid te krijgen over de modificaties die plaats gevonden hebben, moet er in

verdere experimenten op single cell niveau gekeken worden. Hiervoor kan single cell sorting

met FACS uitgevoerd worden en moeten de single cells uitgroeien tot klonale celculturen

waarbij alle cellen eenzelfde modificatie hebben. Op deze cellen kan opnieuw een PCR uitge-

BESPREKING

47

voerd worden met dezelfde primerparen om na te gaan welke cellen een deletie hebben. Ver-

volgens kunnen de modificaties geverifieerd worden aan de hand van Sanger sequenering.

Hiervoor moeten de mutante PCR fragmenten in een plasmide gekloneerd (TA klonering)

worden waarna de plasmiden gesequeneerd kunnen worden. Ten slotte kunnen de effecten op

RNA niveau bekeken worden met RT-qPCR.

Indien na deze experimenten geen neerregulatie van LUNAR1 kan aangetoond worden kan dit

te wijten zijn aan de grootte van het lncRNA. Door de grote intronen in LUNAR1 zou de vol-

ledige deletie 16,3 kb moeten zijn. Daarom zal in de toekomst eerst getest moeten worden of

kleinere deleties kunnen geïnduceerd worden met deze condities. Ook het effect van een dele-

tie van een exon van LUNAR1 moet onderzocht worden. Anderzijds kan nagegaan worden of

er met andere technieken een hogere elektroporatie-efficiëntie bereikt kan worden. Zo werd er

op het einde van deze masterproef een demonstratie gegeven van een nucleofectie (4D nucle-

ofector™, Lonza). Hierbij werd gebruik gemaakt van een speciale buffer waardoor er kort-

stondig poriën ontstaan in de kernmembraan en de gRNA's, die hun functie in de kern uitoe-

fenen, naar de kern kunnen migreren. Hieruit bleek dat door middel van nucleofectie hogere

efficiënties bereikt konden worden in de ALL-SIL cellijn met een klein GFP plasmide. Met

het grotere pX458 CRISPR plasmide was er echter geen GFP expressie zichtbaar. Indien dit

toestel aangekocht wordt, zal er een optimalisatie per cellijn nodig zijn.

Indien er een klonale knock out cellijn ontwikkeld kan worden, moeten de effecten van de

knock out van LUNAR1 en de functie van LUNAR1 verder onderzocht worden. Er is reeds

geweten dat neerregulatie van LUNAR1 zorgt voor neerregulatie van IGF1R en voor groeire-

tardatie in vitro en in vivo, maar het effect op andere genen en andere functies zijn nog niet

gekend (22). Hiervoor kunnen genexpressie arrays (Agilent) gebruikt worden om na te gaan

welke eiwitcoderende genen op- of neergereguleerd worden na knock out van LUNAR1. Vali-

datie van de geïdentificeerde gedereguleerde genen kan vervolgens uitgevoerd worden door

middel van RT-qPCR en Western blot.

Beperkingen van dit onderzoek waren dat de vele experimenten tijdens de optimalisatie

slechts 1 maal uitgevoerd konden worden, waardoor de conclusies niet met zekerheid getrok-

ken kunnen worden. Hierbij moest telkens de keuze tussen het bekomen van technische en

biologische herhalingen of het testen van veel verscheidene opstellingen afgewogen worden.

Er werd ook vastgesteld dat de elektroporatie-efficiëntie zeer gevoelig is aan variatie. Daarom

is het belangrijk om de experimenten zo correct mogelijk en met zo weinig mogelijk variatie

BESPREKING

48

uit te voeren. In deze masterproef was het niet altijd mogelijk om bij de elektroporatie expe-

rimenten de efficiëntie te bepalen met FACS waardoor de resultaten bekeken met de fluores-

centiemicroscoop niet bevestigd konden worden door absolute cijfers.

Beide T-ALL onderzoeksgroepen in het CMGG (groep prof. dr. Speleman en groep dr. Van

Vlierberghe) zijn van plan deze CRISPR technologie te gebruiken, zowel voor het maken van

knock out cellijnen van eiwitcoderende genen als voor lncRNA's. De optimalisaties uitge-

voerd in deze masterproef zijn dus van groot belang voor het verdere T-ALL onderzoek. In de

toekomst is het belangrijk om nieuwe lncRNA's die betrokken zijn in T-ALL te identificeren

en hun functie te achterhalen. Hiervoor kunnen naast de loss of function (LOF) studies ook

gain of function (GOF) studies gebruikt worden. Het probleem bij het tot overexpressie bren-

gen van lncRNA's is dat de exacte sequentie van lncRNA's vaak ongekend is. Recent is echter

aangetoond dat ook voor de GOF studies gebruik gemaakt kan worden van het CRISPR/Cas9

systeem. Zo kan Cas9, mits enkele modificaties, gebruikt worden als transcriptionele activator

voor zowel genen als lncRNA's. Hierbij is er een inactivatie van de katalytische endonuclease

domeinen van Cas9 en fusie met transcriptie activator domeinen nodig (39).

5 CONCLUSIE

Deze masterproef is gestart met het testen van de antisense technologie voor het bekomen van

een knock down van LUNAR1, een belangrijk lncRNA in T-ALL (doelstelling 1). Door de

minimale efficiëntie werd er beslist om over te schakelen op een nieuwe technologie van

knock out, namelijk CRISPR/Cas9. Hiervoor werden verscheidene optimalisatiestappen door-

lopen, waarbij voor de eerste keer T-ALL cellijnen geëlektroporeerd konden worden met

plasmiden in het CMGG (doelstelling 2). Vervolgens werd ook een knock out van CD45 be-

komen (doelstelling 3). Er werd ook aangetoond dat de efficiëntie van knock out verhoogd

kon worden door gebruik te maken van een Cas9 stabiele cellijn en een kleiner CRISPR

plasmide (doelstelling 4). Tot slot werd het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt om een volledige

deletie van een lncRNA, LUNAR1, te verkrijgen (doelstelling 5). Aangezien het bekomen van

een volledige knock out cellijn een lang proces is, startende van kloneringen tot het uitgroeien

van klonale cellijnen, is dit laatste proces nog niet gefinaliseerd. De bekomen resultaten tonen

reeds aan dat het CRISPR/Cas9 systeem efficiënt gebruikt kan worden voor het uitschakelen

van genen, mits het testen van verscheidene gRNA's. Verdere optimalisatie is nodig om grote

deleties van genen en lncRNA's te bekomen.

REFERENTIES

49

6 REFERENTIES

1. Murphy K. Janeway’s immunobiology. 8th edition. Garland Science.

2. Germain RN. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2002

May;2(5):309–22.

3. Weinberg R. The biology of cancer. 2nd edition. Garland Science.

4. De Keersmaecker K, Marynen P, Cools J. Genetic insights in the pathogenesis of T-cell acute lymphoblas-

tic leukemia. Haematologica. 2005 Aug;90(8):1116–27.

5. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000 Jan 7;100(1):57–70.

6. Malek E, Jagannathan S, Driscoll JJ. Correlation of long non-coding RNA expression with metastasis,

drug resistance and clinical outcome in cancer. Oncotarget. 2014 Sep 20;5(18):8027–38.

7. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4;144(5):646–74.

8. Rodriguez-Abreu D, Bordoni A, Zucca E. Epidemiology of hematological malignancies. Ann Oncol. 2007

Feb;18:I3–8.

9. National cancer institure. What you need to know about leukemia. 2013.

10. Van Vlierberghe P, Palomero T, Khiabanian H, Van der Meulen J, Castillo M, Van Roy N, et al. PHF6

mutations in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet. 2010 Apr;42(4):338–U95.

11. Pui C-H, Robison LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 2008 Mar 22;371(9617):1030–

43.

12. Ibagy A, Silva DB, Seiben J, Winneshoffer APFF, Costa TEJB, Dacoregio JS, et al. Acute lymphoblastic

leukemia in infants: 20 years of experience. J Pediatr (Rio J). 2013 Feb;89(1):64–9.

13. Van Vlierberghe P, Ambesi-Impiombato A, De Keersmaecker K, Hadler M, Paietta E, Tallman MS, et al.

Prognostic relevance of integrated genetic profiling in adult T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood.

2013 Jul 4;122(1):74–82.

14. Lubbert M, Mirro J, Miller C, Kahan J, Isaac G, Kitchingman G, et al. N-Ras Gene Point Mutations in

Childhood Acute Lymphocytic-Leukemia Correlate with a Poor Prognosis. Blood. 1990 Mar

1;75(5):1163–9.

15. Van Vlierberghe P, Ferrando A. The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest.

2012 Oct 1;122(10):3398–406.

16. Tzoneva G, Ferrando AA. Recent advances on NOTCH signaling in T-ALL. Curr Top Microbiol Immu-

nol. 2012;360:163–82.

17. Pui CH, Evans WE. Drug therapy - Treatment of acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 2006 Jan

12;354(2):166–78.

18. Peirs S, Matthijssens F, Goossens S, Van de Walle I, Ruggero K, de Bock CE, et al. ABT-199 mediated

inhibition of BCL-2 as a novel therapeutic strategy in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2014

Oct 9;124(25):3738-47.

19. Gutschner T, Diederichs S. The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view. RNA Biol.

2012 Jun;9(6):703–19.

20. Atianand MK, Fitzgerald KA. Long non-coding RNAs and control of gene expression in the immune

system. Trends Mol Med. 2014 Nov;20(11):623–31.

21. Jane B. Reece, Lisa A. Urry, Michael L. Cain, Steven A. Wasserman, Peter V. Minorsky, Robert B

Jackson. Campbell biology. 9th edition. Pearson.

22. Trimarchi T, Bilal E, Ntziachristos P, Fabbri G, Dalla-Favera R, Tsirigos A, et al. Genome-wide mapping

and characterization of Notch-regulated long noncoding RNAs in acute leukemia. Cell. 2014 Jul

31;158(3):593–606.

REFERENTIES

50

23. Fang K, Han B-W, Chen Z-H, Lin K-Y, Zeng C-W, Li X-J, et al. A distinct set of long non-coding RNAs

in childhood MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia: biology and epigenetic target. Hum Mol Ge-

net. 2014 Jun 15;23(12):3278–88.

24. Geisler S, Coller J. RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular con-

texts. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Nov;14(11):699–712.

25. Zhang L, Xu H-G, Lu C. A novel long non-coding RNA T-ALL-R-LncR1 knockdown and Par-4 coopera-

te to induce cellular apoptosis in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells. Leuk Lymphoma. 2014

Jun;55(6):1373–82.

26. Hu G, Tang Q, Sharma S, Yu F, Escobar TM, Muljo SA, et al. Expression and regulation of intergenic

long noncoding RNAs during T cell development and differentiation. Nat Immunol. 2013

Nov;14(11):1190–U118.

27. Fitzgerald KA, Caffrey DR. Long noncoding RNAs in innate and adaptive immunity. Curr Opin Immunol.

2014 Feb;26:140–6.

28. Durinck K, Wallaert A, Van de Walle I, Van Loocke W, Volders P-J, Vanhauwaert S, et al. The Notch

driven long non-coding RNA repertoire in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2014

Dec;99(12):1808–16.

29. Zhang F, Wen Y, Guo X. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Hum

Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40–6.

30. Zheng Q, Cai X, Tan MH, Schaffert S, Arnold CP, Gong X, et al. Precise gene deletion and replacement

using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques. 2014;57(3):115–24.

31. Hu Z, Yu L, Zhu D, Ding W, Wang X, Zhang C, et al. Disruption of HPV16-E7 by CRISPR/Cas system

induces apoptosis and growth inhibition in HPV16 positive human cervical cancer cells. BioMed Res Int.

2014;2014:612823.

32. Maddalo D, Manchado E, Concepcion CP, Bonetti C, Vidigal JA, Han Y-C, et al. In vivo engineering of

oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 2014 Dec

18;516(7531):423–7.

33. Gagnon JA, Valen E, Thyme SB, Huang P, Ahkmetova L, Pauli A, et al. Efficient mutagenesis by Cas9

protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One.

2014;9(5):e98186.

34. Straub C, Granger AJ, Saulnier JL, Sabatini BL. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic

neurons. PloS One. 2014;9(8):e105584.

35. Lennox KA, Behlke MA. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Ther.

2011 Dec;18(12):1111–20.

36. Volders PJ, Verheggen K, Menschaert G, Vandepoele K, Martens L, Vandesompele J, et al. An update on

LNCipedia: a database for annotated human lncRNA sequences. Nucleic Acids Res. 2015 Apr

30;43(8):4363–4.

37. Veedu RN, Wengel J. Locked nucleic acids: promising nucleic acid analogs for therapeutic applications.

Chem Biodivers. 2010 Mar;7(3):536–42.

38. Ho T-T, Zhou N, Huang J, Koirala P, Xu M, Fung R, et al. Targeting non-coding RNAs with the CRIS-

PR/Cas9 system in human cell lines. Nucleic Acids Res. 2015 Feb 18;43(3):e17.

39. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, et al. Genome-scale trans-

criptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583–8.

ADDENDUM

I

7 ADDENDUM

7.1 Materialen en methoden

Forward Reverse

CD45-1 5’-CACCGCACTGTTGTCTTATCAGACG-3’ 5’ -AAACCGTCTGATAAGACAACAGTGC- 3’

CD45-2 5’-CACCGCCAAAGAGTCCGGGGATACT-3’ 5’ -AAACAGTATCCCCGGACTCTTTGGC - 3’

CD45-3 5'-CACCGTATACTCATGTTCGGGTTCA-3’ 5’ -AAACTGAACCCGAACATGAGTATAC- 3’

CD45-4 5’-CACCGTTGAGTTTTGCATTGGCGG-3’ 5’ -AAACCCGCCAATGCAAAACTCAAC - 3’

CD45-5 5’-CACCGTCTGCGAGTCTGCGTGCGT-3’ 5’ -AAAC ACGCACGCAGACTCGCAGAC- 3’

Tabel II: primers voor (kolonie) PCR en sequenering

Forward Reverse

Kolonie PCR

1 gRNA 5' -GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3' Reverse oligo van de opstelling

Sequenering 1 gRNA

5' -GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3' 5'-AAAAAAGCACCGACTC-3'

PCR

2 gRNA's 5'- AAAGTTTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGAT-3' 5'-AAAGTTGGTACCAAAAAAGCACCGACTCGGTG-3'

Kolonie PCR

2 gRNA's 5'- GCTGGCCTTTTGCTCACATG-3' Reverse oligo van de opstelling

Sequenering 2 gRNA's

5'- GCTGGCCTTTTGCTCACATG-3' 5'- GGAAAGTCCCTATTGGCGTTAC-3'

Tabel III: oligo's voor de klonering van 2 LUNAR1 gRNA's in pX458

Forward Reverse

gRNA LUNAR1

start 1 (S1) 5’-CACCGTTCTCCTGGGGTGGCGAATC-3’ 5’-AAACGATTCGCCACCCCAGGAGAAC-3’

gRNA LUNAR1

start 2 (S2) 5’-CACCGCCTGGGGTGGCGAATCAGGT-3’ 5’-AAACACCTGATTCGCCACCCCAGGC-3’

gRNA LUNAR1

start 3 (S3) 5’-CACCGTCCTGGGGTGGCGAATCAGG-3’ 5’-AAACCCTGATTCGCCACCCCAGGAC-3’

gRNA LUNAR1

einde 1 (E1) 5’-CACCGCAGTATTAGAGTATGTGCGG-3’ 5’-AAACCCGCACATACTCTAATACTGC-3’

gRNA LUNAR1

einde 2 (E2) 5’-CACCGTTTACATCTTGGGCCGGGCG-3' 5’-AAACCGCCCGGCCCAAGATGTAAAC-3'

gRNA LUNAR1

einde 3 (E3) 5’-CACCGTGGTGAACTTTTTCCGTAAA-3' 5’-AAACTTTACGGAAAAAGTTCACCAC-3'

Tabel IV: LNA's voor de elektroporatie in CUTLL1 cellen

LNA Sequentie

LNA_NTC 5'-+A*+A*+C*A*C*G*T*C*T*A*T*A*+C*+G*+C-3'

LNA_MALAT1 5'-+A*+A*+C*A*C*G*T*C*T*A*T*A*+C*+G*+C-3'

LNA_LUNAR1_1 5'-+A*+C*+G*G*G*C*G*C*C*T*G*T*A*+G*+A*+A-3'

LNA_LUNAR1_2 5'-+C*+C*+G*A*G*C*G*G*C*C*G*T*A*+A*+A*+G-3'

Tabel I: oligo's voor de klonering van CD45 gRNA in pX330

ADDENDUM

II

LNA_LUNAR1_15 5'-+T*+C*+T*G*C*A*G*C*A*T*C*G*G*+G*+G*+A-3'

LNA_LUNAR1_47 5'-+C*+G*+G*G*G*C*G*G*A*G*G*T*T*+T*+C*+A-3'

LNA_LUNAR1_51 5'-+G*+A*+A*G*C*A*G*C*G*T*G*C*A*+C*+G*+T-3'

LNA_LUNAR1_56 5'-+G*+C*+C*A*G*C*G*G*C*T*G*G*C*+A*+T*+C-3'

LNA_LUNAR1_59 5'-+G*+G*+T*C*A*C*A*C*C*C*G*T*G*+G*+G*+T-3'

LNA_LUNAR1_62 5'-+G*+G*+G*G*T*G*G*C*A*G*G*T*T*+G*+T*+T-3'

LNA_LUNAR1_70 5'-+G*+T*+C*C*A*G*C*T*G*T*G*C*A*+C*+A*+A-3'

LNA_LUNAR1_102 5'-+C*+C*+T*G*G*C*G*G*T*C*G*G*T*+T*+C*+T-3'

Tabel V: ASO/LNA's voor de elektroporatie in CUTLL1 en HPB-ALL cellen

LNA/ASO Sequentie

LNA_NTC '5-+A*+A*+C**A*C*G*T*C*T*A*T*A*+C*+G*+C-3'

ASO_LUNAR1 '5-mG*mG*mU*mC*mU*mU*C*T*C*C*T*C*C*A*A*A*C*T*G*mC*mU*mA*mA*mG*mC-3'

LNA_LUNAR1_3 '5-+T*+A*+C*A*A*G*G*C*A*G*G*T*T*+A*+A*+G-3'

Tabel VI: primers voor qPCR

Forward Reverse

Referentiegenen

HMBS 5'-GGCAATGCGGCTGCAA-3' 5'-GGGTACCCACGCGAATCAC-3'

HPRT 5'-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3' 5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3'

SDHA 5'-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3' 5'-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3'

UBC 5'-ATTTGGGTCGCGGTTCTTG-3' 5'-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3'

Genen

LUNAR1 (2) 5'-GCTGTGACTTAGAGTTGCTT-3' 5'-CAATTGGCTAATCGCTACCT-3'

LUNAR1 (3) 5'-TACCACCCTCATCCTTTACC-3' 5'-GGTTCTTATGCACACAGTCT-3'

LUNAR1 (4) 5'-TCTGACCTCCTCCCTTCTGT-3' 5'-CTGGCCCCTCTCTGCTTTAT-3'

LUNAR1 (6) 5'-GGAGGCTGAGGCCGCCTGTT-3' 5'-AGGCTGCAGGGGAACAGGTCTT-3'

MALAT1 (1) 5'-AGTTCGTGGTGAAGATAGGA-3' 5'-TAGCTTCCTTCACCAAATCG-3'

MALAT1 (2) 5'-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3' 5'-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3'

IGF1R (1) 5'-AAAAACCTTCGCCTCATCC-3' 5'-TGGTTGTCGAGGACGTAGAA-3'

IGF1R (2) 5'-TACGGTGATTGCTAGTTGTG-3' 5'-TTAAAGGGAACACGCTATGG-3'

Tabel VII: primers voor PCR om neerregulatie van LUNAR1 na te gaan

Forward Reverse

Primerpaar 1 5'-GATGAGGTGGCCTCTGAAAG-3' 5'-CCATCAGGGGAACTCACTGT-3'

Primerpaar 2 5'-ATTGCCTCCTTCCCCTAAGA-3' 5'-TGTTGCCCCAGATCTCTTTC-3'

Primerpaar 3 5'- GCGTTAACGGTGTCTTCTCC-3' 5'- TGTTTACGGGATCCTGTTGC-3'

Primerpaar 4 5'- CAACACTGGCTGTGTCTCAAA-3' 5'- TGTTTACGGGATCCTGTTGC-3'

Primerpaar 5 5'- CAACACTGGCTGTGTCTCAAA-3' 5'- AACCCACGTAGCCCTCTCTT-3'

Primerpaar 6 5'- AGCAAAAGCGGCCTGTAATA-3' 5'- AACCCACGTAGCCCTCTCTT-3'

Primerpaar 7 5'-CTGTATTCCACCTCCCCTTG-3' 5'- AAAGCCAGAGAACCCAACTG-3'

ADDENDUM

III

7.2 Resultaten

Figuur I: elektroporatie van 10 LNA's tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen vertoont een beperkte

efficiëntie. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 400 nM NTC-LNA, 400 nM LNA tegen MALAT1 en

400 nM van 10 LNA's tegen LUNAR1. Na 48u werden de cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA

gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de relatieve expressies van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+

(Biogazelle). Deze relatieve expressies werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met het

NTC-LNA. De foutenbalken geven de standaarfout op 2 technische replicas weer. Er wordt geen of een beperkte

neerregulatie waargenomen van LUNAR1 door de 10 LNA's (A, B). Er wordt geen of een beperkte neerregulatie

van IGF1R gezien door de 10 LNA's (C).

fd

1,00 1,09

0,80,66

1,61

1,28

1,52

1,251,39

1,12

0,69

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (2)

1,00 0,92 0,91 1,01 1,05 0,96

1,401,26

1,76 1,63

0,9

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR (4)

1,001,14

0,98 1,010,93 0,91

1,52

1,24

1,431,62

1,02

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (2)

A

B

C

ADDENDUM

IV

cd

1,00

1,23

0,73

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ieLUNAR1 (4)

1,00

0,85

0,49

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (6)

1,000,86 0,87

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (2)

A B

C

Figuur II: elektroporatie van een ASO en een LNA tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen geeft een beperkte

efficiëntie voor het ASO en een goede efficiëntie voor het LNA. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met

400 nM NTC-LNA, 400 nM ASO tegen LUNAR1 en 400 nM LNA tegen LUNAR1. Na 48u werden de cellen

gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de relatieve expressies van

LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve expressies werden berekend ten opzichte

van de expressie na elektroporatie met het NTC-LNA. De foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische

replicas weer. Er is een duidelijke neerregulatie van LUNAR1 door het LNA en een beperkte neerregulatie van

LUNAR1 door het ASO (A, B). Er wordt een beperkte neerregulatie van IGF1R waargenomen door zowel het

LNA als het ASO (C).

ADDENDUM

V

fds

1,00 1,03

0,52

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ieLUNAR1 (3)

1,00

1,16

0,59

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (4)

1,001,03

0,45

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (6)

1,001,02

1,07

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)

1,000,91

0,99

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

NTC ASO LNA

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (2)

A B

C D

E

Figuur III: elektroporatie van een ASO en een LNA tegen LUNAR1 in HPB-ALL cellen vertoont een be-

perkte efficiëntie voor het ASO en goede efficiëntie voor het LNA. HPB-ALL cellen werden geëlektroporeerd

met 400 nM NTC-LNA, 400 nM ASO tegen LUNAR1 en 400 nM LNA tegen LUNAR1. Na 48u werden de

cellen gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de relatieve expressies

van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve expressies werden berekend ten

opzichte van de expressie na elektroporatie met het NTC-LNA. De foutenbalken geven de standaardfout op 2

technische replicas weer. Er is een duidelijke neerregulatie van LUNAR1 door het LNA en geen neeregulatie

door het ASO (A, B, C). Er wordt geen of een beperkte neerregulatie van IGF1R waargenomen door zowel het

ASO als het LNA (D,E).

ADDENDUM

VI

D

Figuur IV: opnames van de GFP expressie in JURKAT cellen 48u na elektroporatie met 10 of 30 µg

pEGFP-C1 en 4 of 8 pulsen vertonen de hoogste elektroporatie-efficiëntie bij 30 µg en 8 pulsen. JURKAT

cellen werden geëlektroporeerd met 0, 10 of 30 µg plasmide aan 175 V voor 2,5 ms en 4 of 8 pulsen met een

0,1 seconde interval. Na 48u werden de cellen met een fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x vergroting.

Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 vertoonde geen GFP expressie. Figuur A en B tonen respectievelijk de

GFP expressie na toevoegen van 10 µg plasmide en 4 (C) of 8 (D) pulsen. Figuur C en D tonen respectievelijk

de GFP expressie na toevoegen van 30 µg plasmide en 4 (D) of 8 (F) pulsen van 175 V.

B

C

A

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

VII

Figuur V: FACS resultaten na elektroporatie met 0, 10 of 30 µg pEGFP-C1 en 4 of 8 pulsen in JURKAT

cellen geven even veel dode cellen weer bij 4 als 8 pulsen. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 0,

10 of 30 µg plasmide aan 175 V voor 2,5 ms en 4 of 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. Na 48u werden de

cellen met FACS bekeken. Het R1 veld met de levende cellen wordt weergegeven. A: geen elektroporatie, B:

0 µg plasmide en 4 pulsen, C: 10 µg plasmide en 4 pulsen, D: 30 µg plasmide en 4 pulsen, E: geen elektropo-

ratie, F: 0 µg plasmide en 8 pulsen, G: 10 µg plasmide en 8 pulsen, H: 30 µg plasmide en 8 pulsen.

1000 µm

74 % 75 % 75 %

75 % 73 %

%

76 % 78 %

1000 µm 1000 µm

A B

D

G

C

E F

H

76 %

%

ADDENDUM

VIII

Figuur VI: opnames van HPB-ALL cellen en de GFP expressie in HPB-ALL cellen 48u na elektroporatie

met 30 µg pEGFP-C1 en 8 pulsen vertonen een beperkte elektroporatie-efficiëntie. HPB-ALL cellen wer-

den geëlektroporeerd met 0 of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde inter-

val. Als controle werd 1 staal niet geëlektroporeerd. Na 48u werden de cellen met een licht- en fluorescentiemi-

croscoop bekeken op een 4x vergroting. Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle vertoon-

den geen GFP expressie. De figuren tonen HPB-ALL cellen en de GFP expressie in HPB-ALL cellen na het

toevoegen van 30 µg pEGFP-C1 en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

Figuur VII: opnames van CUTLL1 cellen en de GFP expressie in CUTLL1 cellen 48u na elektroporatie

met 30 µg pEGFP-C1 en 8 pulsen vertonen een beperkte elektroporatie-efficiëntie. CUTLL1 cellen werden

geëlektroporeerd met 0 of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval.

Als controle werd 1 staal niet geëlektroporeerd. Na 48u werden de cellen met een licht- en fluorescentiemicro-

scoop bekeken op een 4x vergroting. Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle vertoonden

geen GFP expressie. De figuren tonen CUTLL1 cellen en de GFP expressie in CUTLL1 cellen na het toevoegen

van 30 µg pEGFP-C1 en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

fd

fd

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

IX

Figuur VIII: opnames van LOUCY cellen en de GFP expressie in LOUCY cellen 48u na elektroporatie

met 30 µg pEGFP-C1 en 8 pulsen vertonen een matige elektroporatie-efficiëntie. LOUCY cellen werden

geëlektroporeerd met 10 of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval.

Na 48u werden de cellen met een licht- en fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x vergroting. Elektropora-

tie met 0 µg pEGFP-C1 vertoonde geen GFP expressie. De figuren tonen LOUCY cellen en de GFP expressie in

LOUCY cellen na toevoegen van 30 µg pEGFP-C1 en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

Figuur IX: opnames van LOUCY cellen en de GFP expressie in LOUCY cellen 48u na elektroporatie met

30 µg pEGFP-C1, 8 pulsen en een elektroporatiebuffer vertonen een beperkte elektroporatie-efficiëntie.

LOUCY cellen werden geëlektroporeerd met 0 of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een

0,1 seconde interval en een specifieke elektroporatiebuffer (Bio-Rad). Als controle werd 1 staal niet geëlektro-

poreerd. Na 48u werden de cellen met een licht- en fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x vergroting.

Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle vertoonden geen GFP expressie. De figuren tonen

LOUCY cellen en de GFP expressie in LOUCY cellen na het toevoegen van 30 µg pEGFP-C1 en een specifieke

elektroporatiebuffer (Bio-Rad) en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

fd

fd

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

X

Figuur X: opnames van de GFP expressie in JURKAT cellen 48u na elektroporatie met 10 of 30 µg

pEGFP-C1, met of zonder een elektroporatiebuffer, en 8 pulsen vertonen een gelijkaardige elektropora-

tie-efficiëntie tussen experimenten met of zonder buffer. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 0, 10

of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval met of zonder een speci-

fieke elektroporatiebuffer (Bio-Rad). Na 48u werden de cellen met fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x

vergroting. Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 vertoonde geen GFP expressie. Figuur A en C geven de opna-

mes van de GFP expressie in JURKAT cellen weer na toevoegen van respectievelijk 10 en 30 µg pEGFP-C1 en

8 pulsen van 175 V. Figuur B en D geven dezelfde condities weer, maar na elektroporatie met een elektropora-

tiebuffer.

fd

A B

C D

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

XI

Figuur XI: FACS resultaten na elektroporatie met 0, 10 of 30 µg pEGFP-C1, met of zonder een elektro-

poratiebuffer en 8 pulsen vertonen een gelijkaardige elektroporatie-efficiëntie tussen experimenten met

of zonder buffer. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 0, 10 of 30 µg pEGFP-C1 aan 175 V voor

2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval met of zonder een specifieke elektroporatiebuffer (Bio-Rad).

Na 48u werden de cellen met FACS bekeken. In de figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en

single cells weergegeven en werden de GFP positieve cellen gedetecteerd met de FL1 filter. Figuur A, B en C

geven de FACS plots met de GFP positieve cellen weer na toevoegen van respectievelijk 0, 10 en 30 µg

pEGFP-C1. Figuur D, E en F geven dezelfde condities weer, maar na elektroporatie met een elektroporatiebuf-

fer.

A B C

D E F

ADDENDUM

XII

Figuur XII: elektroporatie van JURKAT cellen met verschillende condities leidt tot een verschillend aan-

tal dode cellen afhankelijk van de conditie. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 10 of 30 µg

pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken.

De figuren geven het R1 veld weer met de levende cellen. A: geen elektroporatie en 0,5 miljoen cellen, B: geen

elektroporatie en 1 miljoen cellen, C: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, D: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, E

250 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, F: 250 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, G: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, H:

175 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, I: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg, J: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg,

K: 250 V; 1 miljoen cellen en 10 µg, L: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, M: 250 V; 1 miljoen cellen en

30 µg.

A B C

D E F

G

A

H I

J K L

M

A

A B C

D E F

G

A

H I

J K L

M

A

ADDENDUM

XIII

Figuur XIII: elektroporatie van JURKAT cellen met verschillende condities vertoont de hoogste elektropora-

tie-efficiëntie bij 175 V en 30 µg plasmide en bij 250 V en 10 µg plasmide. JURKAT cellen werden geëlektropo-

reerd met 10 of 30 µg pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met

FACS bekeken. In de figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de

GFP positieve cellen gedetecteerd met de FL1 filter. A: geen elektroporatie en 0,5 miljoen cellen, B: geen elektropo-

ratie en 1 miljoen cellen, C: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, D: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, E: 250 V; 0,5

miljoen cellen en 0 µg, F: 250 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, G: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, H: 175 V; 0,5

miljoen cellen en 30 µg, I: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg, J: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, K: 250 V; 1 mil-

joen cellen en 10 µg, L: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, M: 250 V; 1 miljoen cellen en 30 µg.

A B C

D

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

D

E F

G

A

H I

J K L

M

A

ADDENDUM

XIV

Pulsen (V) Hoeveelheid plasmide (µg) Celdood (%) Efficiëntie (%)

175 10 31,5 15,4

175 30 37,6 60,6-67

250 10 21,4-19 77,8-79

250 30 75,9-79,8 61,4-65,8

Tabel VIII: de hoeveelheid celdood en de elektroporatie-efficiënties na elektroporatie van JURKAT cellen

met verschillende condities worden weergegeven.

Figuur XIV: opnames van de GFP expressie in CUTLL1 cellen 48u na elektroporatie met verschillende

condities vertonen een matige elektroporatie-efficiëntie. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 0, 10

of 30 µg pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Als controle werd 1 staal niet geë-

lektroporeerd. Na 48u werden de cellen met een fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x vergroting. Elek-

troporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle vertoonden geen GFP expressie. A: 175 V; 0,5 mil-

joen cellen en 30 µg plasmide, B: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg plasmide, C: 250 V; 0,5 miljoen cellen en

10 µg plasmide, D: 250 V; 1 miljoen cellen en 10 µg plasmide, E: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg plasmi-

de, F: 250 V; 1 miljoen cellen en 30 µg plasmide.

1000 µm 1000 µm

A B

C D

E F

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

XV

A B C

D E F

G H I

M N

J k L

A

A A

Figuur XV: elektroporatie van CUTLL1 cellen met verschillende condities leidt tot een verschillend aantal

dode cellen afhankelijk van de conditie. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 10 of 30 µg pEGFP-C1; 0,5

of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken. De figuren geven het

R1 veld weer met de levende cellen. A: geen elektroporatie en 0,5 miljoen cellen, B: geen elektroporatie en 1 miljoen

cellen, C: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, D: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, E: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg,

F: 250 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, G: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, H: 175 V; 1 miljoen cellen en 10 µg

I: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, J: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg, K: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg,

L: 250 V; 1 miljoen cellen en 10 µg, M: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, N: 250 V; 1 miljoen cellen en 30 µg.

ADDENDUM

XVI

Figuur XVI: elektroporatie van CUTLL1 cellen met verschillende condities vertoont de hoogste elektroporatie-

efficiëntie bij 175 V en 30 µg en bij 250 V en 10 µg. CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 10 of 30 µg

pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken. In de

figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de GFP positieve cellen

gedetecteerd met de FL1 filter. A: geen elektroporatie en 0,5 miljoen cellen, B: geen elektroporatie en 1 miljoen cel-

len, C: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, D: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, E: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 0 µg, F:

250 V; 1 miljoen cellen en 0 µg, G: 175 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, H: 175 V; 1 miljoen cellen en 10 µg I: 175 V;

0,5 miljoen cellen en 30 µg, J: 175 V; 1 miljoen cellen en 30 µg, K: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 10 µg, L: 250 V; 1

miljoen cellen en 10 µg, M: 250 V; 0,5 miljoen cellen en 30 µg, N: 250 V; 1 miljoen cellen en 30 µg.

A B C

D E F

G H I

M N

J K L

ADDENDUM

XVII

Figuur XVIII: elektroporatie van ALL-SIL cellen met verschillende condities leidt tot een verschillend

aantal dode cellen afhankelijk van de conditie. ALL-SIL cellen werden geëlektroporeerd met 10 of 30 µg

pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen, 175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken.

De figuren geven het R1 veld weer met de levende cellen. A: geen elektroporatie en 1 miljoen cellen, B: 175 V; 1

miljoen cellen en 0 µg plasmide, C: 250 V; 1 miljoen cellen en 0 µg plasmide, D: 250 V; 1 miljoen cellen en

10 µg plasmide, E: 250 V; 1 miljoen cellen en 30 µg plasmide.

Figuur XVII: elektroporatie van ALL-SIL cellen met verschillende condities vertoont een lage elektropo-

ratie-efficiëntie. ALL-SIL cellen werden geëlektroporeerd met 10 of 30 µg pEGFP-C1; 0,5 of 1 miljoen cellen,

175 V of 250 V en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken. In de figuren worden de FACS plots

van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de GFP positieve cellen gedetecteerd met de FL1

filter. A: geen elektroporatie en 1 miljoen cellen, B: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg plasmide, C: 250 V; 1

miljoen cellen en 0 µg plasmide, D: 250 V; 1 miljoen cellen en 10 µg plasmide, E: 250 V; 1 miljoen cellen en

30 µg plasmide.

A B C

D E

A B C

D E

ADDENDUM

XVIII

A B

1000 µm

Figuur XIX: opname van de GFP expressie in JURKAT cellen 48u na elektroporatie met 30 µg pLen-

tiGFP en 8 pulsen vertoont een hoge elektroporatie-efficiëntie. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd

met 0 of 30 µg pLentiGFP aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. Als controle werd 1

staal niet geëlektroporeerd. Na 48u werden de cellen met een fluorescentiemicroscoop bekeken op een 4x ver-

groting. Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle vertoonden geen GFP expressie. De figuur

toont de GFP expressie na het toevoegen van 30 µg pLentiGFP en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

1000 µm 1000 µm

1000 µm

Figuur XX: opnames van JURKAT cellen en de GFP expressie in JURKAT cellen 48u na elektroporatie

met 30 µg pX458 en 8 pulsen vertonen een matige elektroporatie-efficiëntie. JURKAT cellen werden geë-

lektroporeerd met 0 of 30 µg pX458 aan 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met een 0,1 seconde interval. Als

controle werd 1 staal niet geëlektroporeerd. Elektroporatie met 0 µg pEGFP-C1 en de negatieve controle ver-

toonden geen GFP expressie. Na 48u werden de cellen met een licht- en fluorescentiemicroscoop bekeken op

een 4x vergroting. De figuur toont JURKAT cellen en de matige GFP expressie in JURKAT cellen na het

toevoegen van 30 µg pX458 en het toedienen van 8 pulsen van 175 V.

1000 µm

1000 µm 1000 µm

ADDENDUM

XIX

Figuur XXI: elektroporatie van pX458 in JURKAT cellen met de standaardcondities vertoont een matige

elektroporatie-efficiëntie. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 0 of 30 µg pX458, 1 miljoen cellen,

175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen. Na 48u werden de cellen met FACS bekeken. In de figuren worden de FACS

plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de GFP positieve cellen gedetecteerd met de

FL1 filter. A: geen elektroporatie, B: 175 V; 1 miljoen cellen en 0 µg plasmide, C: 175 V; 1 miljoen cellen en

30 µg plasmide.

A B C

Figuur XXII: elektroporatie van pX330-CD45 in JURKAT cellen met 30 µg plasmide, 175 V en 8 pulsen

vertoont een matige efficiëntie van knock out van CD45 na 4 dagen. JURKAT cellen werden geëlektropo-

reerd met 30 µg van de pX330-CD45 CRISPR plasmiden met 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met 0,1 seconde

interval. De efficiëntie van knock out van CD45 door deze CRISPR plasmiden werd na 4 dagen bekeken met

FACS. In de figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de

CD45 positieve cellen gedetecteerd door PE excitatie (FL3). A: geen plasmide, B: negatieve controle (pX330

zonder CD45 gRNA), C: pX330-CD45-1, D: pX330-CD45-3, E: pX330-CD45-4, F: pX330-CD45-5.

A B C

D E F

ADDENDUM

XX

A B

C D

Figuur XXIII: elektroporatie van pX330-CD45 in JURKAT cellen met 30 µg plasmide, 175 V en 8 pulsen

vertoont een matige efficiëntie van knock out van CD45 na 6 dagen. JURKAT cellen werden geëlektropo-

reerd met 30 µg van de pX330-CD45 CRISPR plasmiden met 175 V voor 2,5 ms en 8 pulsen met 0,1 seconde

interval. De efficiëntie van knock out van CD45 door deze CRISPR plasmiden werd na 6 dagen bekeken met

FACS. In de figuren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de

CD45 positieve cellen gedetecteerd door PE excitatie (FL3). A: negatieve controle (pX330 zonder CD45

gRNA), B: pX330-CD45-1, C: pX330-CD45-3, D: pX330-CD45-4.

ADDENDUM

XXI

Figuur XXIV: schematische weergave van het pX321 CRISPR plasmide. pX321 is een variant van het

pX330 CIRSPR plasmide dat uit dezelfde elementen bestaat, maar waar Cas9 uitgeknipt is.

pX321

3206 bp

fsd

24,6 %

pX321-CD45-4

16,6 %

pX321-CD45-5, 250 V

0,4 %

Parentaal

24,6 %

pX321-CD45-4, 250 V

0,2 %

pX321, 250 V

Figuur XXV: elektroporatie van pX321-CD45 in een Cas9 stabiele JURKAT cellijn met 10 µg plasmide

en 250 V vertoont een matige efficiëntie van knock out van CD45 na 4 dagen. Cas9 stabiele JURKAT cellen

werden geëlektroporeerd met 30 µg plasmide en 175 V of met 10 µg plasmide en 250 V. De efficiëntie van

knock out van CD45 door de pX321-CD45 CRISPR plasmiden werd na 4 dagen bekeken met FACS. In de figu-

ren worden de FACS plots van 10.000 levende en single cells weergegeven en werden de CD45 positieve cellen

gedetecteerd door PE excitatie (FL3). A: parentale cellen B: negatieve controle (pX321 zonder CD45 gRNA),

C: pX321-CD45-4, D: pX321-CD45-5.

pX321

3206 bp

A B

C D

ADDENDUM

XXII

5'-CTCTGGGGAGCCAGGGGTTGGTAGCTGGGAAGACTGTTGGGTGGTGACCCTGGGGGAGGGGAA

GGGGCCGGGGAGCGGGGAACGGGGGCAGCCCCTGGGGAGGAATGGGAGAGGGAGGAGGACGCCA

GGGGCACAGGGACAGCCTCCGGGGCGGGGCGCGGCGCCAGCCTAGCCCGAGGATGGAGGCTGAG

GCCGCCTGTTGAGTCACAG[...]TTTCCCTGTGATGCTCATTTTAACCAGATGGCACTTGCTTAGCAGT

TTGGAGGAGAAGACCTGTTCCCCTGCAG[...]CCTTCCATGATTAGACCTCAACTCATGAGAACTCTT

GCCTTGCTCACAAGTGGGAGTAAATGCTCATAGCTCTAGAAATCTCCCAGGAACCAGACATCACGG

AAACTAGAAAGGCTAAGGGAGTCCAATCTTCCTCTAAATTGGCCAACAGTAGAGTGGTGGAAAGA

GAACAAGCTGCAAACCAGACAGACCCAAGCTTGAATCTCACCTCTGCCAAGCTACCAG[...]AGCTC

AACAAACTACAGACCACGGGCCAAATCTGACCCACCGCTGCTTTTGTAAATAAAACTTTATTGGAA

AAAAGCCACATTTGTGTATGTGTTGTCTGTGGCTGCTTTTGTGCTACCGAGACAGAGGTGAGTAGTC

GCAACAGAGACCATATGGATCCACAAGACCTAA-3'

Figuur XXVI: sequentie van LUNAR1. De exonen van LUNAR1 worden weergegeven in het groen. Er wor-

den 100 bp voor en na LUNAR1 weergegeven.

ADDENDUM

XXIII

Figuur XXVII: 5 van de 6 gRNA's tegen LUNAR1 werden opgenomen in het pX458 CRISPR plasmide.

De pX458 plasmiden met gRNA's tegen LUNAR1 werden gesequeneerd. De ingebouwde gRNA's worden aan-

geduid in het geel. pX458-S1, -S3, -E1, -E2 en -E3 bevatten het gRNA.

pX458-S1 5'-TCAGCTGTTAGAGAGatATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTA

GAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTA

ACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTCTCCTGGGGTGGCG

AATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAG

TCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAA

TTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCA

ACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTAtTTA

CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACgCCCCCCTATTGACGTCAATGACG

GGTAAATGGGCCCNNCCNGGGCATTTNNNGCCC-3'

pX458-S2 5'-AGCTGTTAGAGAGatAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAG

AAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAAC

TTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTG

TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGT

GCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTG

CAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC

CCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATANGGACTTTCCATTGACGTCNNTGGGGTGNNNTATTTACNG

NAAACTGCCCANNNGGNNAGTACNTCANGNGTATCATATGCCAANT-3'

pX458-S3 5'-TCAGCTGTTAGAGAGatAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGT

AGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGT

AACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCCTGGGGTGGCGAA

TCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGA

GTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCA

ATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCC

AACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTT

ACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACG

GNNNATGGCCCGCCNGGCATTGNGNCCAGTACATGACCTTATGGNNNTTTNNTACTTGGNA-3'

pX458-E1 5'-GCTGTTAGAGAGatAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGA

AAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACT

TGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCAGTATTAGAGTATGTGCG

GGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG

GTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTC

TGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAAC

CATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG-3'

pX458-E2 5'-GCTGTTAGAGAGatAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGA

AAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACT

TGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTTACATCTTGGGCCGGGC

GGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG

GTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTC

TGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAAC

CATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACT

TGCCAGCGCCTTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAA

GCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTT

GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCT

TTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACTCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGG

ATTTTGCCGATTTCNGTCTATTG-3'

p458-E3 5'-CAGCTGTTAGAGAGatAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAG

AAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAAC

TTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGGTGAACTTTTTCCGTA

AAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTC

GGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATT

CTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAA

CCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGNGTNNNNGNNNNNNNCGCNGCGTGACCGCTA

CACTTGNCAGCGCCTTANCGCCNGCTNCNTNNGCTTTCNTCCNNNNNNTTNNNN-3'

ADDENDUM

XXIV

pX458-S1-E1

5'-CATGTGAGGGCcTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTT

GACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTAT

GTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAA

ACACCGTTCTCCTGGGGTGGCGAATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA

AGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGC

CAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA

GAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT

AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTAT

ATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCAGTATTAGAGTATGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC

TAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC

TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCATTGACGT-3'

pX458-S1-E2

5'-ATCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGT

ACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGC

TTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTCTCCTGGGGTGGCGA

ATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT

TTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCT

AGAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGAC

TGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTT

TTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACA

CCGTTTACATCTTGGGCCGGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGT

GGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC-3'

pX458-S1-E3

5'-TCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTA

CAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTT

ACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTCTCCTGGGGTGGCGAAT

CGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAG

AGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTG

TAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTT

AAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACAC

CGTGGTGAACTTTTTCCGTAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG

GCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC -3'

pX458-S3-E2

5'-ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTGAGGGCCTATTTCC

CATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATAT

TAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCAT

ATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCCTGGGGTGGCG

AATCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG

CTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATG

GCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAG

TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTNA-3'

pX458-S3-E3

5'-

TGAGATACNTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGNCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCA

GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCT

CTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGT

TCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCT

GTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTC

TTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGG

CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCCTGGGGTGGCGAATCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT

AAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATG

GCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGG

GTGGAGTATTTACGGTANACTGCCCA-3'

Figuur XXVIII: 3 van de 5 combinaties van gRNA's tegen LUNAR1 werden correct ingebouwd in het

pX458 CRISPR plasmide. De pX458 plasmiden met 2 gRNA's tegen LUNAR1 werden gesequeneerd. pX458-

S1-E1, pX458-S1-E2 en pX458-S1-E3 bevatten beide gRNA's.

S1= geel, S3= groen, E1= rood, E2= blauw, E3= roze.

ADDENDUM

XXV

Tabel IX: weergave van de efficiëntie en het aantal gesorteerde GFP positieve cellen na elektroporatie van

CRISPR plasmiden met 2 gRNA's tegen LUNAR1 in CUTLL1 cellen.

Plasmide Pulsen (V) Efficiëntie (%) Aantal gesorteerde

GFP positieve cellen

pX458 175 2,37 29.375

pX458 250 3,13 62.263

pX458-S1-E1 175 1,49 23.832

pX458-S1-E1 250 3,27 54.676

pX458-S1-E2 175 1,44 32.209

pX458-S1-E2 250 3,38 55.572

pX458-S1-E3 175 1,15 25.508

pX458-S1-E3 250 3,76 37.253

D

F

ADDENDUM

XXVI

Figuur XXIX: resultaten labchip na PCR met 6 primerparen op HEK293TN cellen getrans-

fecteerd met pX458-S-E plasmiden. HEK293TN cellen werden getransfecteerd zonder plasmide

(NTC), met pEGFP-C1, pX458 of pX458-S1-E1/2/3 met de PEI methode. Vervolgens werd een

PCR uitgevoerd met 6 primerparen en werden de resultaten bekeken met labchip. Laan 1: NTC,

laan 2: pEGFP-C1, laan 3: pX458, laan 4: pX458-S1-E1, laan 5: pX458-S1-E2, laan 6: pX458-S1-

E3. A: primerpaar 1 (245 bp), B: primerpaar 2 (282), C: primerpaar 3 (454 bp), D: primerpaar 4

(876 bp), E: primerpaar 5 (923 bp), F: primerpaar 6 (524 bp).

A

E

C D

B

F

ADDENDUM

XXVII

A

C D

B

fd

Figuur XXX: resultaten labchip na PCR met 4 primerparen op JURKAT cellen geëlektroporeerd met

pX458-S-E. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met pX458 en met pX458-S1-E1/2/3 aan 175 V met

30 µg plasmide of aan 250 V met 10 µg plasmide. Vervolgens werd een PCR uitgevoerd met 4 primerparen en

werden de resultaten bekeken met labchip. Laan 1: pX458, 175 V, 30 µg plasmide, laan 2: pX458, 250 V,

10 µg plasmide, laan 3: pX458-S1-E1, 175 V, 30 µg plasmide, laan 4: pX458-S1-E1, 250 V, 10 µg plasmide,

laan 5 pX458-S1-E2 plasmide, 175 V, 30 µg plasmide, laan 6: pX458-S1-E2, 250 V, 10 µg plasmide, laan 7:

pX458-S1-E3, 175 V, 30 µg plasmide, laan 8: pX458-S1-E3, 250 V, 10 µg plasmide, laan 9: NTC. A: primer-

paar 2 (282), B: primerpaar 3 (454 bp), C: primerpaar 6 (524 bp), D: primerpaar 7 (1000 bp).

A

C D

B

ADDENDUM

XXVIII

Figuur XXXI: elektroporatie van pX458-S-E CRISPR plasmiden in JURKAT cellen geeft een daling in

expressie van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en pX458-S1-E3. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met

30 µg pX458S-E aan 175 V voor 2,5 ms met 8 pulsen. Cellen werden gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA

gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werd de relatieve expressie van LUNAR1 berekend met qBase+ (Biogazelle).

Deze relatieve expressie werd berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met pX458. De

foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er werd een daling in expressie

waargenomen van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en pX458-S1-E3 (A, B).

Figuur XXXII: elektroporatie van pX458-S-E CRISPR plasmiden in JURKAT cellen geeft een daling in

expressie van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en pX458-S1-E2. JURKAT cellen werden geëlektroporeerd met 10

µg pX458-S-E aan 250 V voor 2,5 ms met 8 pulsen. Cellen werden gecollecteerd, RNA geïsoleerd en cDNA

gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werden de relatieve expressies van LUNAR1 en IGF1R berekend met qBase+

(Biogazelle). Deze relatieve expressies werden berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie met

pX458. De foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er werd een beperkte daling in

expressie waargenomen van LUNAR1 door pX458-S1-E1 en pX458S1-E2 (B). Er werd geen neerregulatie daling

in expressie van IGF1R waargenomen (D).

A B

1,000,80

1,04

0,73

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2R

elati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (2)1,00

0,801,04 0,98

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R (1)

1,00 0,71 0,73

0,96

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (2)

1,000,80 0,79

1,10

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (3)

1,001,22

1,40

2,00

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (4)

1,00 1,06 1,031,22

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

IGF1R

A B

C D

ADDENDUM

XXIX

Figuur XXXIII: elektroporatie van pX458-S-E plasmiden in CUTLL1 cellen vertoont geen daling in ex-

pressie van LUNAR1 bij primerpaar LUNAR1 (4). CUTLL1 cellen werden geëlektroporeerd met 30 µg

pX458S-E en 175 V of met 10 µg pX458S-E en 250 V. GFP positieve cellen werden gesorteerd met FACS en

cellen geëlektroporeerd met 175 V of 250 V werden samengevoegd. De cellen werden gecollecteerd, RNA

geïsoleerd en cDNA gesynthetiseerd. Na RT-qPCR werd de relatieve expressie van LUNAR1 berekend met

qBase+ (Biogazelle). Deze relatieve expressie werd berekend ten opzichte van de expressie na elektroporatie

met pX458. De foutenbalken geven de standaardfout op 2 technische replicas weer. Er werd geen daling in

expressie van LUNAR1 waargenomen.

1,00 0,99

1,09 1,19

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Rel

ati

eve

exp

ress

ie

LUNAR1 (4)

ADDENDUM

XXX

7.3 Protocols

7.3.1 Klonering gRNA's in CRISPR plasmiden

1. Design oligo's

Criteria voor de selectie van oligo's:

Gebruik targets met een score >50 (hogere score = minder off-target effecten. Deze score voorspelt niet

of de target plaats goed zal werken).

Ontwikkel 3-5 oligo's per gen/ lncRNA. Gebruik verschillende exonen, zeker het exon na de translatie

start plaats, maar niet het eerste exon.

Voor de klonering in het plasmide wordt 5’-CACC toegevoegd aan de forward sequentie en 5'-AAAC aan de

reverse sequentie. Als de target plaats (forward) niet met een G start, moet een G worden toegevoegd aan de

forward sequentie en een C een de reverse sequentie.

2. Oligo annealing

Benodigdheden:

- Oligo's (100 µM)

- Buffer (ex. NEB 2 10x)

- Nuclease vrij water

Vooraf:

- Zet de hot block op 95 °C

Protocol:

1. Los de oligo's op aan 100 µM in nuclease vrij water.

2. Anneal de forward en reverse oligo's in een 1,5 ml epje:

Finale concentratie

Forward (100 µM) 20 µM

Reverse (100 µM) 20 µM

Buffer (ex. NEB 2 10x) 1X

H20 Tot 50 µL

3. Plaats de epjes op een hot block van 95 °C voor 5 minuten.

4. Zet de hot block uit zodat de temperatuur kan afkoelen tot kamertemperatuur (45 min).

5. Verdun de stalen 500 x tot 0,04 µM: 1 µl oligo's + 499 µl H2O.

6. Bewaar de stalen op 4 °C.

3. Digestie van CRISPR plasmiden

Benodigdheden:

- BbsI

- 10x NEBuffer (2.1)

- Plasmiden


- qiaQuick PCR purification kit (Qiagen)

ADDENDUM

XXXI

Protocol:

1. Verknip 5 µg van het plasmide met BbsI in 100 µl voor minstens 1 uur.

Hoeveelheid

Plasmide 5 µg

10x NEBuffer (2.1) 1x

Bbs1 20 U

Water Tot 100 µl

2. Incubeer bij 37 °C voor 1 uur.

3. Voer een PCR zuivering uit met de qiaQuick PCR purificatie kit:

a) Voeg 5 volumes van de Buffer PB bij 1 volume van de PCR reactie en mix dit. Als de kleur van het

mengsel oranje of paars is, moet 10 µl 3 M sodium acetaat (pH 5,0) toegevoegd worden zodat de

kleur geel wordt.

b) Plaats de QIAquick kolom in een 2 ml collectie-epje.

c) Breng het staal op de QIAquick kolom en centrifugeer voor 1 min aan 13000 rpm. Giet de doorge-

lopen vloeistof uit.

d) Voeg 750 µl Buffer PE op de QIAquick kolom en centrifugeer voor 1 min aan 13000 rpm. Giet de

doorgelopen vloeistof uit.

e) Centrifugeer dit opnieuw voor 1 min om de overige buffer te verwijderen.

f) Plaats de QIAquick kolom in een nieuw epje.

g) Pipetteer 50 µl water op het membraan van de QIAquick kolom om het DNA te elueren.

h) Incubeer 1 min bij kamertemperatuur en centrifugeer voor 1 min aan 13000 rmp.

i) Meet de DNA concentraties met de NanoDrop.

4. Ligatie van dsDNA Oligo's in CRISPR plasmiden

Benodigdheden:

- Plasmiden

- ds DNA oligo's (0,004 µM)

- Mighty mix (Takara, Clontech)

Protocol:

1. Voeg 50 µg plasmide DNA samen met 2 µl van de dsDNA oligo's (0,04 µM).

2. Voeg water toe tot 10 µl.

3. Voeg de Takara mighty mix toe in een 1:1 ratio (10 µl).

4. Pipetteer op en neer om dit te mixen en draai kort af.

5. Incubeer bij 16 °C voor 16 uur (overnacht)

Voeg een zelf ligatie test toe: 50 ng plasmide DNA + mighty mix in een 1:1 ratio

5. Transformatie van DH5α

Benodigdheden:

- E. Coli's

- SOC medium

- Plasmiden

- Ijs

- Platen

ADDENDUM

XXXII

Vooraf:

- Ontdooi E. Coli's 30 min op ijs (niet op en neer pipetteren).

- Plaats het warm water bad op 42 °C.

- Plaats het SOC medium en de platen in de incubator (37 °C).

- Plaats de epjes op ijs.

Protocol:

1. Voeg per staal het volgende samen:

a) 50 µl bacteriën

b) Plasmide DNA (5-10 µl)

- Plasmide met insert

- zelf ligatie test

2. Tik tegen de epjes en plaats ze 30 min op ijs (om de vector in de buurt van de cellen te brengen).

3. Vries de overblijvende bacteriën terug in.

4. Plaats de epjes 30 sec in het warm water bad (heat shock).

5. Plaats de epjes direct terug op ijs voor 5 min.

6. Voeg 650 µl SOC medium toe.

7. Plaats 1 uur op een shaker bij 200 rpm en 37 °C.

8. Pipetteer 400 µl op een plaat en verspreid dit met een inoculatie loop.

9. Incubeer overnacht bij 37 °C (platen omgedraaid).

5. Kolonie PCR

Benodigdheden:

- Producten afkomstig van de KAPA Taq HotStart PCR Kit (KAPA Biosystems):

5x buffer

25µM MgCl2

10mM dNTP mix

Taq (5U/µl)

- 5µM Forward primer

- 5µM Reverse oligo's

- Nuclease vrij water (Sigma)

- Ijs

Vooraf:

- Vul PCR strips met 20 µl H2O.

- Plaats het Taq polymerase op ijs.

Protocol:

1. Pik 6 kolonies per ligatie en 1 zelf ligatie kolonie. Pik hiervoor een deel van de kolonie met een

incoluatie loop (en markeer de kolonie) en breng het in 20 µl water. Pipetteer op en neer. Er wordt ook

1 NTC meegenomen per ligatie (PCR zonder DNA).

ADDENDUM

XXXIII

finaal

Kolonie oplossing (in post-PCR) 2 µl

5X KAPA Taq hot start buffer 1X

25 mM MgCl2 1.5 mM

10 mM dNTP Mix 0.2 mM each

5 µM Forward Primer 0.3 µM

100 µM Reverse Oligo 0.3 µM

5U/µl KAPA Taq HotStart DNA Polymerase 1 U

Water Tot 50 µl

2. Deel de mastermix uit per 48 µl in PCR strips en voeg 2 µl van de kolonie PCR toe (of 2 µl H2O voor

de NTC).

3. Plaats de PCR strips in het PCR toestel:

Hotstart 95°C 3 min

35 cycli

Denaturation 95°C 30 sec

Annealing Afhankelijk van

Tm primers

30 sec

Elongation 72°C 1 min/kb

Final elongation 72°C 1 min

Stop 4°C forever

De stalen kunnen bij 4 °C bewaard worden.

Controle van de reactie kan uitgevoerd worden via LabChip (17 µl water, 3 µl staal).

6. Kolonies pikken

Benodigdheden:

- LB+ ampicilline

Protocol:

1. Vul 15 ml falcons met 5 ml LB+ ampicilline.

2. Pik kolonies met een incolulatie loop en breng deze in het medium.

3. Plaats op een shaker bij 37 °C overnacht.

ADDENDUM

XXXIV

7. Glycerolstock

Benodigheden:

- Glycerol

Protocol:

1. Plaats de glycerol 20 min in een warm water bad.

2. Breng 100 µl van de glycerol samen met 900 µl van het construct in een cryovail.

3. Mix door de vail enkele malen om te keren.

4. Bewaar bij -80 °C.

8. DNA isolatie

Benodigdheden:

- High Pure Plasmide Isolation Kit (Roche).

- Ijs

Protocol:

1. Plaats de Binding Buffer op ijs.

2. Centrifugeer de stalen 10 min aan 4750 rpm.

3. Verwijder het supernatans.

4. Los de pellet op in 250 µl Suspension Buffer met RNase en breng dit over in een epje.

5. Voeg 250 µl Lysis Buffer toe en mix voorzichtig door het epje 3-6 maal te inverteren.

6. Incubeer voor 5 min bij kamertemperatuur.

7. Voeg 350 µl gekoelde Binding Buffer toe en mix door het epje 3-6 maal te inverteren.

8. Incubeer op ijs voor 5 min.

9. Centrifugeer voor 10 min aan 13,000 rmp in een microcentrifuge.

10. Breng het supernatans over op de kolom.

11. Centrifugeer voor 1 min aan 16,000 rmp.

12. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

13. Voeg 700 µl Wash Buffer II toe.

14. Centrifugeer voor 1 min aan 16,000 rmp.

15. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

16. Centrifugeer dit opnieuw voor 1 min aan 16,000 rmp.

17. Plaats de kolom in een nieuw collectie-epje en breng 100 µl water op het membraan.

18. Plaats dit 1 min op kamertemperatuur en centrifugeer 1 min aan 16,000 rpm.

19. Meet de DNA concentraties met de NanoDrop.

ADDENDUM

XXXV

7.3.2 Klonering 2 gRNA's in een CRISPR plasmide

Beide gRNA's worden in een afzonderlijk CRISPR plasmide gekloneerd zoals beschreven in 7.3.1 van 'Adden-

dum'.

1. PCR reactie

Benodigdheden:

- Pfx kit (Invitrogen, Life Technologies):

Pfx enzym

MgSO4 (50 mM)

10x amplification buffer

10 mM dNTP mix

- Plasmide

- Primers (5 µM)


- Ijs

Vooraf:

- Plaats het Pfx enzym op ijs.

Protocol:

1. Maak een PCR mastermix per primerpaar. Vortex deze mix en draai af.

finaal

Vector 10 ng

Pfx enzym 1U

F (5 µM stock) 0.3 µM

R (5 µM stock) 0.3 µM

dNTP (10 mM stock) 0.3 M

MgSO4 (50 mM stock) 1 mM

10x Pfx amplification buffer 1 x

water Tot 50 µl

2. Verdeel deze mixen uit: 50 µl per reactie.

3. Vortex en draai af.

4. Plaats de stalen in het toestel en stel volgend protocol in:

ADDENDUM

XXXVI


35 cycli

Denaturatie 94°C 15 sec

Annealing Afhankelijk van Tm

primers

1 min/ kb

elongatie 68°C 40 sec

Stop 4°C forever

5. Voer een PCR zuivering uit (qiaQuick PCR purificatie kit).


2. Digestie van PCR fragment 2 en CRISPR plasmide 1

Benodigdheden:

- KpnI-HF (20U/µl)

- XbaI (20U/µl)

- 10x CutSmart buffer

- Plasmiden

- PCR fragmenten

- qiaQuick PCR purification kit


Protocol:

1. Maak een mastermix:

PCR fragment 2 Plasmide 1

PCR fragment 2/

plasmide 1

5 µg 2,5 µg

10x CutSmart buffer 1x 1x

KpnI-HF 20 U 20 U

XbaI 20 U 20 U

Water Tot 50 µl Tot 50 µl

2. Incubeer voor 2 uur bij 37 °C.

3. Hitte inactivatie van XbaI bij 65 °C voor 20 minuten.

4. Voer een PCR zuivering uit (qiaQuick PCR purificatie kit).

3. Ligatie van PCR fragment 2 in CRISPR plasmide 1

Om het PCR fragment in het CRISPR plasmide te ligeren moeten het plasmide en het PCR fragment in een 3:1

verhouding in aantal kopijen worden samengevoegd. Hiervoor moet de grootte het plasmide en het PCR frag-

ment gekend zijn om de hoeveelheid nodig van elk te kunnen berekenen.

ADDENDUM

XXXVII

Benodigdheden:

- Plasmiden

- ds DNA oligo's (0,004 µM)

- Mighty mix (Takara, Clontech)

Protocol:

1. Voeg 50 ng acceptor samen met ... ng insert om een 3:1 verhouding te bekomen in aantal kopijen.

2. Voeg water toe tot 7,5 µl.

3. Voeg de Takara mighty mix toe in een 1:1 ratio.

4. Pipetteer op en neer om dit te mixen en draai kort af.

5. Incubeer bij 16 °C voor 16 uur (overnacht).

Voeg een zelf ligatie test toe: 50 ng acceptor + mighty mix in een 1:1 ratio

5. Kolonie PCR

Zie 7.3.1 van 'Addendum'. In deze kolonie PCR wordt een nieuwe primer ontwikkeld aangezien de forward

primer die normaal gebruikt wordt voor kolonie PCR 2x voorkomt in het plasmide aangezien er 2 gRNA's met

U6 promotor inzitten. Daarom wordt een forward primer ontwikkeld die slechts 1x voorkomt in het plasmide.

De volgdende stappen zijn dezelfde stappen als in 7.3.1 te beginnen bij transformatie van DHα.

ADDENDUM

XXXVIII

7.3.3 Elektroporatie ASO's/ LNA's

Benodigdheden:

- Warm FCS

- Warm RPMI medium

- 6 well platen

- LNA's/ ASO's

Vooraf:

- RPMI medium (zonder AB en FCS) en FCS warm zetten.

Opstelling: 6 well plaat

Protocol:

1. Breng 4,5 ml 15% FCS medium in de welletjes van de 6 well plaat. (vul de overige welletjes met 5 ml

medium (complete of rest van 15%)) en plaats de plaat in de incubator.

2. Pipetteer de cellen op en neer. Tel het aantal cellen (2x) en bereken hoeveel ml nodig is voor x elektro-

poraties aan 8.106 cellen per elektroporatie. We nemen de hoeveelheid nodig voor x+1 elektroporaties.

3. Breng deze hoeveelheid over in één of meerdere 50 ml falcons.

4. Centrifugeer de celsuspensie voor 10 minuten aan 1200 rpm.

5. Neem het medium af met een pasteurpipet.

6. Los de pellet op in 4.5 ml medium zonder FCS. En verdeel per 500 µl in epjes. Maak volgende opstel-

lingen

a. Geen LNA/ASO: 500 µl cellen

b. NTC LNA (400nM): 500 µl + 10 µl NTC LNA (werkoplossing aan 20 µM)

c. LNA/ASO (400 nM): 500 µl + 10 µl LNA (werkoplossing aan 20 µM)

d. MALAT1 (400nM): 500 + 20 µl LNA (werkoplossing aan 10 µM)

7. Verdeel alles (=500 µl) uit per opstelling in cuvetten, waarbij er eerst op en neer gepipetteerd wordt in

het epje.

8. Elektroporeer de 8 opstellingen aan 300 V, 1mF.

9. Breng alles over in de 6-well plaat per opstelling met een 200 µl pipet. (Probeer geen schuim over te pi-

petteren).

10. Plaats de platen in de incubator (37°C, 5% CO2).

ADDENDUM

XXXIX

7.3.4 Elektroporatie plasmiden

Benodigdheden:

- Warm FCS

- Warm RPMI medium

- 24 well platen

- Plasmiden

Vooraf:



Protocol:

1. Maak RPMI + 20 % FCS en breng 1.1 ml over in de welletjes van de 24 well plaat.

Vul de overige welletjes met 1.5 ml (RPMI of compleet RPMI).

2. Tel de concentratie cellen via de cellometer en bereken hoeveel ml cellen nodig is voor x+1 opstellin-

gen (1 miljoen per opstelling= x+1*1 miljoen cellen, 0,5 miljoen per opstelling= x+1*0,5 miljoen cel-

len).

3. Breng de gewenste hoeveelheid over in een 50 ml falcon.

4. Centrifugeer de celsuspensie voor 10 min aan 1200 RPM.

5. Zuig het medium af en resuspendeer de pellet in serum vrij RPMI (100 µl per opstelling) = x+1 *100

µl.

6. Verdeel per 100µl in epjes.

7. Voeg volgende hoeveelheid plasmide toe:

a. No EP: 0 µl +300µl RMPI

b. 0 µg/opstelling: 0 µl + 300 µl RPMI

c. 10 µg/opstelling: ... µl + ... µl RPMI

d. 30 µg/opstelling: ... µl +... µl RPMI

8. Breng per 400 µl over in elektroporatie cuvetjes .

9. Elektroporeer met het CRISPR programma (175 V of 250 V, 4 of 8 pulsen).

10. Breng over in de 24-well plaat.

11. Check GFP expressie na 2 dagen.

ADDENDUM

XL

7.3.5 Elektroporatie plasmiden met een elektroporatiebuffer

Benodigdheden:

- Warm FCS

- Warm RPMI medium

- 24 well platen

- Plasmiden

- Elektroporatie buffer

- PBS (1x)

Vooraf:



Protocol:

Dag 1:

1. Maak RPMI + 20 % FCS en breng 1,1 ml over in de welletjes van de 24 well plaat.

Vul de overige welletjes met 1,5 ml (RPMI of compleet RPMI).

2. Tel de concentratie cellen via de cellometer en breng ongeveer (2* (x+1* 1 miljoen)) cellen over in een

50 ml falcon.


4. Zuig het medium af en resuspendeer de pellet in 2 ml PBS (voorzichtig pipeteren).

5. Tel de cellen en breng miljoen cellen over in een falcon.


7. Zuig het medium af en resuspendeer de pellet in elektroporatie buffer: x+1* 0,1 ml

8. Verdeel de celsuspensies uit per 100 µl en voeg volgende hoeveelheid van plasmide toe:

a. No EP: 0 µl+ 300 µl elektroporatie buffer

b. 0 µg: 0 µl + 300 µl elektroporatie buffer

c. 30 µg: ... µl + ... µl elektroporatie buffer

9. Breng per 400 µl over in elektroporatie cuvetjes.

10. Elektroporeer met CRISPR protocol (175 V, 8 pulsen).

11. Breng over in de 24-well plaat.

Dag 2:

1. Inhoud van de welletjes overbrengen in 1.5 ml epje.

2. 5 min afdraaien aan 1200 rmp.

3. Medium afnemen en pellet oplossen in 1.5 ml compleet medium.

4. Inhoud epje terug overbrengen in welletjes.

ADDENDUM

XLI

7.3.6 Cellen collecteren

Benodigdheden:

- Ijs

- Trizol

- Vloeibare stikstof

Vooraf:

- Centrifuge laten afkoelen tot 4°C

Protocol:

1. Collecteer de inhoud van de welletjes in epjes.

2. Centrifugeer 5 min aan 1200 rpm bij 4°C.

3. Zuig het medium af en zet de epjes in een ijsbak.

4. Voeg 700 µl trizol toe (onder de trekkast!).

5. Flash-freeze door het onder te dompelen in de vloeibare stikstof.

6. Bewaar de epjes bij -80°C.

ADDENDUM

XLII

7.3.7 RNA isolatie

Benodigdheden:

- miRNeasy mini kit (Qiagen #217004)

- RNAse-Free DNase set (Qiagen #79254)

Vooraf:

- Buffers RWT en RPE worden geleverd als concentraten. Voor het eerste gebruik moet de nodige

hoeveelheid ethanol (100 %) toegevoegd worden (volume aangegeven op fles).

- Koel de centrifuge tot 4 °C.

- Pipetteer de gewenste hoeveelheid absolute ethanol en chloroform in een falcon. Gebruik voor

chloroform een glazen pipet en een polypropyleen falcon.

- Los het gelyofiliseerde DNase I op in 550 µl RNase vrij water (meegeleverd). Injecteer het water

met een RNase vrije naald en spuit. Mix voorzichtig door het enkele malen om te draaien. (Niet

vortexen of op en neer pipetteren!)

Protocol:

Na oogsten van de cellen en het oplossen van de pellet in 700 µl QIAzol kunnen de cellen gehomogeniseerd

worden met een naald en spuit.

1. Plaats de epjes met het homogenaat bij kamertemperatuur (15-25 °C) voor 5 min.

2. Voeg 140 µl chloroform toe. Mix door pulsed vortexing.

3. Plaats de epjes op kamertemperatuur voor 2 min.

4. Centrifugeer voor 15 min op 12, 000 rpm bij 4 °C. (Na centrifugatie: warm centrifuge op tot kamertem-

peratuur).

5. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuw collectie epje en plaats dit op ijs.

6. Voeg 1,5 volumes van 100 % ethanol toe en mix door meerdere malen op en neer te pipetteren. (Niet

centrifugeren!)

7. Pipetteer 700 µl van het staal in een RNeasy Mini spin kolom in een 2 ml collectie epje. Sluit het deksel

en centrifugeer bij 16,000 rpm voor 15 s. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

8. Herhaal stap 7 met de overschot van het staal. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

9. Voeg 350 µl Buffer RWT toe aan de RNeasy Mini spin kolom. Sluit het deksel en centrifugeer 15 s aan

16,000 rpm om de kolom te spoelen. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

10. Pipetteer 80 µl DNase I (10 µl DNase I stock oplossing + 70 µl buffer RDD) direct op het membraan

van de RNeasy Mini spin kolom en plaats dit 15 min bij kamertemperatuur.

11. Voeg 350 µl Buffer RWT toe op de RNeasy Mini spin kolom. Sluit het deksel en centrifugeer voor 15 s

bij 16,000 rpm om de kolom te spoelen. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

12. Pipetteer 500 µl Buffer RPE in de RNeasy Mini spin kolom. Sluit het deksel en centrifugeer voor 15 s

bij 16,000 rpm om de kolom te spoelen. Giet de doorgelopen vloeistof uit.

13. Voeg nogmaals 500 µl Buffer RPE toe. Sluit het deksel en centrifugeer voor 2 min bij 16,000 rpm om

het membraan van de RNeasy Mini spin kolom te drogen.

14. Plaats de RNeasy Mini spin kolom in een nieuw 2 ml collectie epje. Centrifugeer op volle snelheid

(16,000 rpm) voor 1 min. Verwijder de collectie tube met de doorgelopen vloeistof.

15. Plaats de RNeasy Mini spin kolom in een nieuw 1,5 ml collectie epje. Pipetteer 30 µl RNase vrij water

direct op het membraan van de kolom. Sluit het deksel en centrifugeer voor 1 min bij 16,000 rpm om

het RNA te elueren.

16. Verwijder de RNeasy Mini spin kolom en sluit het collectie epje.

17. Plaats de stalen op ijs.

18. Meet de concentratie met Nanodrop en bewaar de stalen bij -80 °C.

ADDENDUM

XLIII

7.3.8 cDNA synthese

Benodigdheden:


- iScript cDNA synthese kit (Bio-Rad)

Protocol:

1. Voeg 500 ng van het RNA toe aan een RNase vrij 0,2 ml epje.

2. Voeg 4 µl iScript reactie mix toe.

3. Voeg 1 µl iScript reverse transcriptase toe.

4. Voeg nuclease vrij water toe tot een totaalvolume van 20 µl.

5. Plaats de stalen in het toestel en kies het iScript programma:

a) 5 minuten bij 25 °C

b) 30 minuten bij 42 °C

c) 5 minuten bij 85 °C

6. Verdun het cDNA (500 ng/20µl) met nuclease vrij water afhankelijk van de gewenste eindconcentratie.

(Voor qPCR is 2,5 ng/µl nodig: 10 keer verdunnen).

ADDENDUM

XLIV

7.3.9 RT-qPCR

Benodigdheden:

- sSO Advanced 2x mastermix (Bio-Rad)

- Forward Primer (5 µM)

- Reverse Primer (5 µM)

Vooraf:

- Mastermix afschermen van het licht.

Protocol:

1. Maak een mix per primerpaar. Vortex en draai af.

Mastermix 1 reactie

sSO Advanced 2x mastermix 2,5 µl

Forward Primer (5 µM) 0,25 µl

Reverse Primer (5 µM) 0,25 µl

2. Verdeel de primermix over de plaat (3 µl).

3. Verdeel de stalen (2 µl) over de plaat.

4. Sluit de plaat af met bijhorende plastiekfolie, vortex en draai af (1 min).

5. Dek de plaat af met aluminium. (Bewaren bij 4 °C of bij -20 °C afhankelijk van de duur).

6. Plaats de plaat in het qPCR-toestel en volg volgende protocol:

Enzym activatie 1 cyclus 95 °C 2 min

Amplificatie 44 cycli

95 °C

60 °C

72 °C

5 sec

30 sec

1 sec

Smelt cyclus 1 cyclus 95 °C

60 °C

95 °C

5 sec

1 min

Continu

Koeling 1 cyclus 37 °C 3 min

ADDENDUM

XLV

7.3.10 Transfectie van HEK293TN cellen

Dag 1: uitzaaien van HEK293TN cellen

Benodigdheden:

- Trypsine

- Verseen

- RMPI medium

- 6 well plaat

Protocol:

1. Trypsiniseer cellen (5ml verseen/5ml trypsine/5ml medium) en breng de cellen over in epjes.

2. Centrifugeer de stalen 5 min bij 1200 rpm op kamertemperatuur.

3. Resuspendeer in 10 ml vers medium.

4. Tel de cellen (aantal/ml).

5. Maak een nieuwe celsuspensie waarin het aantal cellen zit dat nodig is in het totaalvolume: we willen 6

wells in 6-well formaat met 150.000 cellen in 2 ml medium per well; maak een suspensie voor x opstel-

lingen, dus totaal x*2 ml met x*150.000 cellen in een nieuw epje, en zaai hiervan 2 ml uit per well.

6. Incubeer de plaat in de incubator en wacht minimum 24u voor verdere assays.

Dag 2 : transfectie van de cellen met de PEI methode

Benodigdheden:

- Warm FCS

- RMPI medium

- Plasmiden

- PEI

Vooraf:

- FCS warm zetten

Protocol:

1. Verwijder het medium en voeg 1.8 ml 2% FCS medium toe per well.

2. Maak de DNA oplossing in een epje: bereken voor elk plasmide DNA afzonderlijk hoeveel volume

overeenstemt met 1-2 µg en leng aan met serumvrij medium tot totaalvolume van 100 µl:

3. Maak de PEI oplossing: 95 µl serumvrij medium en 5 µl PEI per opstelling; maak een mastermix voor

het aantal opstellingen. Pipetteer goed op en neer en laat 5 min incuberen bij kamertemperatuur.

4. Voeg 100 µl van de PEI oplossing toe aan 100 µl DNA oplossing, en vortex de epjes eventjes (of alter-

natief heel goed op en neer pipetteren).

5. Laat het mengsel 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur om de DNA-PEI complexen te laten

vormen.

6. Voeg het totaal (200 µl) druppelgewijs toe aan de cellen.

Dag 3: medium verversen

Benodigdheden:

- RPMI medium

Protocol:

1. Neem per welletje het medium af (met pipet, langs de rand) en voeg 2 ml complete medium toe (voor-

zichtig langs de rand).

ADDENDUM

XLVI

Dag 4: oogsten van de cellen voor DNA isolatie

Benodigdheden:

- Ijs

- PBS (1x)

- Schraper

- Vloeibare stikstof

Vooraf:

- Koel de centrifuge naar 4 °C.

Protocol:

1. Plaats de 6 well plaat op ijs.

2. Verwijder het medium.

3. Was met 2 ml 1x PBS (voorzichtig, langs de rand).

4. Verwijder het PBS en voeg opnieuw 2ml 1X PBS toe.

5. Schraap de cellen los en breng ze over in een epje.

6. Draai de cellen 5 min af bij 1200 rpm en 4 °C.

7. flash-freeze de cellen in vloeibare stikstof.

8. Bewaar de cellen bij -80 °C.

ADDENDUM

XLVII

7.3.11 FACS: analyse van GFP positieve cellen

Benodigdheden:

- FACS buisjes met filter

- Ijs

Vooraf:

- FACS toestel aanleggen:

Login

Klik op Start-up (rechtsboven) (+- 20 min).

Voer een Quality Control uit met calibration beads (koele kamer, vortexen) (+- 10 min). Steek deze

in het toestel (naar beneden en achter duwen). Duw op slotje en haal ze er terug uit na de QC.

Protocol:

1. Pipetteer de cellen op en neer (moet niet steriel) en breng 500 µl op het membraan van een FACS

buisje met een filter.

2. Plaats de stalen op ijs.

3. Plaats de negatieve controle in het toestel en vink de cycle modus aan. Zorg dat de levende cellen

in het R1 veld zitten door FSC en SSC aan te passen.

4. Selecteer de juiste filter voor het R3 veld ( FL1)

5. Schakel de cycle modus uit en vink limit (10 000) aan.

6. Meet per staal het aantal GFP positieve cellen.

ADDENDUM

XLVIII

7.3.12 FACS: analyse van CD45 positieve cellen

Benodigdheden:


- Ijs

Vooraf:

- Grote centrifuge afkoelen naar 4 °C

- FACS toestel aanleggen:

Login

Klik op Start-up (rechtsboven) (+- 20 min).

Voer een Quality Control uit met calibration beads (koele kamer, vortexen) (+- 10 min). Steek deze

in het toestel (naar beneden en achter duwen). Duw op slotje en haal ze er terug uit na de QC.

Protocol:

1. Breng 50 µl cellen in een 15 ml falcon.

2. Maak een antibody mix: per staal 49 µl FACS buffer (PBS met 2 % BSA) + 1 µl human CD45-PE

(donkere flow).

3. Voeg 50 µl antibody mix toe aan de cellen. Incubeer de tubes in het donker (aluminiumfolie) bij 4 °C

voor 15 min.

4. Voeg 2 ml FACS buffer toe om te wassen. Centrifugeer 5 min bij 1350 rpm bij 4°C.

5. Verwijder supernatans, resuspendeer pellet in 250 µl FACS buffer.

6. Pipetteer de cellen door een cell strainer in een FACS buisje (blauw dopje).

7. Plaats de negatieve controle in het toestel en vink de cycle modus aan. Zorg dat de levende cellen in het

R1 veld zitten door FSC en SSC aan te passen.

8. Selecteer de juiste filter voor het R3 veld ( FL3).


10. Meet per staal het aantal CD45 positieve cellen.

ADDENDUM

XLIX

7.3.13 FACS: GFP positieve cellen sorteren

Benodigdheden:


- FACS buisjes zonder filter

- PBS (1x)

- Warm FCS

- Ijs

- Well plaat

Protocol:

1. Draai de cellen 5 min af.

2. Los de pellet op in 100 µl PBS per 1 miljoen cellen.

3. Pipetteer de cellen door de filter in een FACS tube en plaats de stalen op ijs.

4. Vul FACS tubes (wit dopje) met 750 µl 20% medium om de gesorteerde cellen in op te vangen.

5. Plaats de negatieve controle in het toestel en vink de cycle modus aan. Zorg dat de levende cellen in het

R1 veld zitten door FSC en SSC aan te passen.

6. Selecteer de juiste filter voor het R3 veld ( FL1 voor GFP).


8. Klik (rechtermuis knop) op de regio waar de GFP positieve cellen inkomen (R3) en selecteer 'left sort'.

9. Klik op 'sort logic': 5ml tube: vul 750 µl in, zet de posities waar FACS buisjes inzitten om cellen in op

te vangen op 'purity', de andere posities op 'none'. Vink 'prevent overflow' aan.

10. Plaats de opvang buisjes op de gewenste posities.

11. Klik op knop om te sorteren (naast startknop).

12. Zorg dat de efficiëntie steeds hoge als 80 %.

13. Plaats de gesorteerde cellen op ijs.

14. Draai de cellen 5 min af bij 1200 rpm.

15. Los de cellen op in medium zodat ze aan de gewenste concentratie zitten.

16. Breng de cellen over in een geschikte well plaat (afhankelijk van het volume).

ADDENDUM

L

7.3.14 DNA isolatie

QiaAmp DNA Mini kit (Qiagen #51304)

Benodigdheden:

- QiaAmp DNA Mini kit:

Buffer AL

Buffer AW1

Buffer AW2

Buffer AE

Proteinase K

- Ethanol (100 %)

- PBS

Vooraf:

- Plaats de hot block op 56 °C.

- Buffers AW1, buffer AW1 en proteinase K worden geleverd als concentraten. Voor het eerste gebruik

moet de nodige hoeveelheid ethanol (100 %) toegevoegd worden (volume aangegeven op fles).

Protocol:

1. Los de cel pellet op in 200 µl PBS.

2. Voeg 20 µl proteinase K toe.

3. Voeg 200 µl buffer AL toe aan het staal en mix door pulsed vortexing voor 15 sec.

Het staal en de buffer AL moeten goed gemixt worden om efficiënte lyse te bekomen. Voeg proteinase

K nooit direct bij de buffer AL.

4. Incubeer bij 56 °C voor 10 minuten.

De DNA opbrengst is maximaal na lyse voor 10 min bij 56 °C. Langere incubatie heeft geen effect op

de opbrengst en op de kwaliteit van het DNA.

5. Centrifugeer kort.

6. Voeg 100 µl ethanol (100 %) toe en mix door pulsed vortexing voor 15 sec. Draai de stalen kort af.

7. Breng het mengsel van stap 6 op de QIAamp Mini spin kolom (in een 2 ml collectie epje) en centrifu-

geer voor 1 min bij 8000 rmp. Plaats vervolgens de kolom in een nieuw 2 ml collectie epje en gooi de

andere kolom weg.

Centrifugeren op hogere snelheid zal de opbrengst of kwaliteit van het DNA niet aantasten. Als het ly-

saat niet volledig door de kolom is gelopen na centrifugatie, moet dit opnieuw worden afgedraaid aan

een hogere snelheid tot de kolom leeg is.

8. Voeg 500 µl buffer AW1 toe en centrifugeer voor 1 min aan 8000 rpm. Plaats de kolom in een nieuw 2

ml collectie epje en gooi het ander collectie epje weg.

9. Voeg 500 µl buffer AW2 toe en centrifugeer voor 3 min aan maximale snelheid.

10. Plaats de kolom in een nieuw 2 ml collectie epje en gooi het oude collectie epje weg. Centrifugeer aan

maximale snelheid voor 1 min.

Deze stap helpt om buffer AW2 carry over te elemineren.

11. Plaats de kolom in een 1,5 ml epje en voeg 100 µl buffer AE toe. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur

en centrifugeer 1 min bij 8000 rpm.

12. Meet de concentratie met NanoDrop. Initialiseer met water en stel de blanco in met AE buffer.

ADDENDUM

LI

7.3.15 PCR

Benodigdheden:

- Producten afkomstig van de KAPA Taq HotStart PCR Kit (KAPA Biosystems):

5x buffer

25µM MgCl2

10mM dNTP mix

Taq (5U/µl)

- 5µM Forward primer

- 5µM Reverse primer

- Nuclease vrij water (Sigma)

- Ijs

Vooraf:

- Plaats het Taq polymerase op ijs.

Protocol:

1. Maak een mastermix:

finaal

DNA 100 ng of

200 ng

5X KAPA Taq hot start buffer 1X

25 mM MgCl2 1.5 mM

10 mM dNTP Mix 0.2 mM each

5 µM Forward Primer 0.3 µM

5 µM Reverse Primer 0.3 µM

5U/µl KAPA Taq HotStart DNA Polymerase 1 U

Water Tot 50 µl

2. Deel de mastermix uit per 50 µl in PCR strips.

3. Plaats de PCR strips in het PCR toestel:

ADDENDUM

LII


35 cycli

Denaturation 95°C 30 sec

Annealing Afhankelijk van

Tm primers

30 sec

elongation 72°C 1 min 30 sec

of

1 min 45 sec

Final elongation 72°C 1 min

Stop 4°C forever

De stalen kunnen bij 4 °C bewaard worden.


ADDENDUM

LIII

7.3.16 Western blot

1. Cellyse

Benodigdheden:

- RIPA-buffer (voor 50 ml):

40,5 ml gedestilleerd water

250 mg natrium deoxycholaat (DOC; Sigma)

1,5 ml 5M NaCl oplossing

2,5 ml 1M TrisHCl (pH 7,5) oplossing

0,5 ml 10% SDS oplossing

5 ml 10% NP-40 (=Igepal) oplossing

- Protease inhibitor (Roche complete inhibitor cocktail):

7x stock oplossing: 1 Roche tablet oplossen in 1,5 ml gedestilleerd water

Of

los 1 Roche tablet op in 10 ml RIPA-buffer voor onmiddellijk gebruik.

- Ijs

Vooraf:

- Plaats centrifuge op 4 °C.

Protocol:

1. Verdun de protease inhibitor 7x stock oplossing 1:6 in RIPA-buffer.

2. Koel de buffer in ijs vooraleer deze toe te voegen aan de cellen. Alle verdere stappen

moeten worden uitgevoerd op ijs of op een temperatuur van 4 °C.

3. Voeg de RIPA-lyse buffer (waar er protease inhibitor aan toegevoegd werd) toe aan de cellen:

a) Ontdooi de celpellets op ijs.

b) Voeg 100 µl RIPA-lyse buffer toe aan de pellet voor HEK-293Tn cellen geoogst van een 6-

well plaat. Voor T-ALL cellen in een 12-well plaat wordt 300 µl RIPA-lyse buffer toe ge-

voegd.

c) Pipetteer op en neer om de pellet op te lossen en de cellen te lyseren.

d) Om een complete lyse te bekomen worden de epjes voor 1 uur bij 4 °C geroteerd.

4. Centrifugeer de lysaten voor 10 min aan 8 000 g (10 000 RPM) bij 4 °C om het celdebris te pelleteren.

5. Breng het geklaard lysaat over in nieuwe epjes (afgekoeld!) en verwijder de epjes met het debris.

2. Denaturatie

Benodigdheden:

- 5x Laemli denaturatie buffer

25 ml 10 % SDS oplossing

20 ml 100 % glycerol

7,75 ml 1 M TrisHCL pH 6,8 oplossing

1,25 ml 1 % Bromofenol Blauw oplossing

- 40x β-mercaptoethanol (in trekkast werken!)

Vooraf:

- Plaats de hotblock op 95 °C.

Protocol:

1. Maak een mix (5x buffer) waarbij 40x β-mercaptoethanol 8 keer verdund wordt in 5x Laemli buffer.

Vortex kort. (Volume afhankelijk van het aantal stalen: 5 µl per staal

nodig).

2. Breng van de cellysaten 20 µl over in nieuwe epjes en voeg daarbij 5 µl van de mix

toe.

3. Denatureer de stalen bij 95 °C voor 10 min. Draai nadien kort af.

ADDENDUM

LIV

3. SDS-PAGE

Benodigdheden:

- Running buffer (1 L):

100 ml 10x Tris/glycine/SDS buffer (Biorad)

900 ml gedestilleerd water

- Precast gel (Biorad; 10 % SDS)

Protocol:

1. Open de folie van de precast gel en verwijder de strip aan de onderkant van de gel.

2. Plaats de gel in de houder (de welletjes zijn gericht naar de binnenkant van het systeem). Plaats aan de

andere kant een andere gel of een plastiek buffer.

3. Verwijder de kam van de gel.

4. Vul de tank met running buffer (giet tussen de twee gels) en zorg dat er geen lucht is tussen de laantjes

van de gel (eventueel op en neer pipetteren in de laantjes).

5. Laad de stalen op de gel:

a. 5 µl ‘prestained marker’ (Biorad, blauwe kleur) en 2 µl gebiotinyleerde eiwit merker (Cell Signa-

ling).

b. Stalen: 20 µl in een gel met 10 lanen, 15 µl in een gel met 15 lanen.

6. Schakel de stroombron aan: 100 V, 0,25 A, 1-2 uur (tot het blauwe front de onderkant van de gel be-

reikt).

4. Blotten

Benodigdheden:

- Transfer buffer (voor 1 L):

100 ml 10x Tris/Glycine buffer (Biorad)

200 ml methanol (in trekkast!)


- Biorad Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches 0,2 µm

Protocol:

1. Maak de blotting sandwich.

a) Open de cassette met de zwarte kant op de tafel.

b) Plaats een spons (geweekt in transfer buffer) op de zwarte kant.

c) Plaats er daarna een geweekt filter papier (Whatman) op.

d) Haal de gel uit het systeem en uit de twee glasplaten, maak die vochtig in transfer buffer en plaats

de gel bovenop het Whatman papier.

e) Plaats het nitrocellulose membraan (geweekt in transfer buffer) bovenop de gel.

f) Verwijder luchtbellen tussen de gel en het membraan: rol over het membraan met een plastiek pi-

pet.

g) Plaats er een filter Whatman papier (geweekt in transfer buffer) op.

h) Plaats er nog een geweekte spons op en sluit de cassette.

2. Plaats de cassette in de houder, waarbij de zwarte kant gericht is naar de zwarte kant

van de houder.

3. Vul de tank met transfer buffer en plaats een ijshouder in de tank.

5. Immunoblotting

Benodigdheden:

- 10x TBS buffer (voor 1 L):

24,3 g Tris (finale concentratie: 200 mM)

87,75 g NaCl (finale concentratie: 1,5 M)

- 1x TBST buffer (voor 1 L):

100 ml 10x TBS


ADDENDUM

LV

- 1 ml Tween-20 (0,1 % finaal)

- 5 % melkoplossing:

5 g melkpoeder

Aanlengen tot 100 ml in 1x TBST

- Luminol/enhancer buffer (ThermoScientific)

Vooraf:

- Los de Tris en NaCl op in gedestilleerd water tot een volume van ongeveer 950 ml.

- Pas de pH aan door het druppelsgewijs toevoegen van geconcentreerd HCl onder constant roeren en

controleren van de pH totdat een pH van 7,4 bereikt wordt.

Protocol:

1. Blokkeer het nitrocellulose membraan met 10 ml 5 % melkoplossing door het al

schuddend te incuberen bij kamertemperatuur voor 1 uur.

2. Incubeer met het primair antilichaam in 6 ml 5 % melkoplossing (verdunning afhankelijk van gebruikte

antilichaam) overnacht bij 4 °C.

3. Was drie maal met TBST (3 x 5 min).

4. Incubeer voor 1 uur met het secundaire antilichaam gekoppeld met HRP (anti -muis of

anti-konijn) in 6 ml 5 % melkoplossing. Voeg ook 1/10 000 anti-biotine HRP (Cell

Signalling) toe aan de melkoplossing.

5. Was drie maal met TBST.

6. Incubeer de blot met luminol/enhancer buffer (1 ml van luminol met 1 ml enhancer

buffer, ratio 1:1) voor 30 sec tot maximum 5 min. (Maak deze buffer net voor het

toevoegen aan het membraan!)

7. Detectie: plaats het membraan in een plastiek folie, plaats dit in het detectietoestel

(UCP chemiDoc-it®500 Imaging System) en open het programma (VisionWorks LS).

Kies de detectietijd en analyseer het signaal.

8. Indien je een tweede eiwit wil detecteren:

a. Voeg 6 ml Stripping buffer (ThermoScientific) toe aan het membraan.

b. Laat 45 min al schuddend incuberen.

c. Was drie maal met TBST.

d. Begin opnieuw bij stap 1.

Studie van lange niet coderende RNA's in de

ontwikkeling van T-cel acute lymfoblastische

leukemie

Karen Verboom

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: prof. dr. Frank Speleman

Begeleider: Annelynn Wallaert

Vakgroep: Pediatrie en genetica (GE02)

Academiejaar 2014-2015

Studie van lange niet coderende RNA's in de ontwikkeling...

Documents

Transcript of Studie van lange niet coderende RNA's in de ontwikkeling...