Ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale...
81
Ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale retardatie Iris Laureyssens Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. dr. ir. Björn Menten Begeleider: Sarah Vergult Vakgroep Pediatrie en Genetica Academiejaar 2011-2012
Transcript of Ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale...
Ontrafeling van de rol van
MYT1L in mentale retardatie
Iris Laureyssens
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. dr. ir. Björn Menten
Begeleider: Sarah Vergult
Vakgroep Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2011-2012
Ontrafeling van de rol van
MYT1L in mentale retardatie
Iris Laureyssens
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. dr. ir. Björn Menten
Begeleider: Sarah Vergult
Vakgroep Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2011-2012
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder
de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Gent, 21 mei 2012
Iris Laureyssens Prof. dr. ir. Björn Menten
Voorwoord
Ik wens aan de hand van dit voorwoord een aantal mensen te bedanken die er mede voor
gezorgd hebben dat ik deze masterproef tot een goed einde heb kunnen brengen.
Allereerst zou ik graag mijn promotor Björn Menten, mijn begeleidster Sarah Vergult en Nina
De Rocker willen bedanken voor hun uitstekende begeleiding tijdens het tot stand komen van
deze thesis. Björn, bedankt voor de steun en de motivatie om toch verder te zoeken naar een
mutatie en om af en toe, ondanks je drukke agenda, wat tijd vrij te maken voor mij. Sarah,
bedankt om mij toch, ondanks het feit dat je zelf een doctoraat moest schrijven en zowel Silke
als mij onder je hoede had, steeds met raad en daad bij te staan, om er geen probleem van te
maken als ik nog maar eens je bureau binnenkwam of een mailtje stuurde om iets te vragen,
voor de motivatie toen de LightScanner plotseling verdwenen was en voor de snelle
verbeteringen. En Nina, bedankt om jouw resultaten te delen met mij, mij te laten meevolgen
en om mij al het nodige bij te brengen over de weefselkweek.
Verder zou ik graag de laboranten van MRB2 willen bedanken en dan vooral Elke, Lies en
Shalina. Bedankt Elke om mij alle tips en tricks te leren over het PCRen, het HRMen en de
manuele sequenering en Lies en Shalina, om mij altijd zo snel mogelijk en met een glimlach
te helpen als ik weer iemand nodig had om mee te volgen met de robot of als ik een
patiëntenstaal nodig had.
Natuurlijk zou ik ook graag mijn vriendinnen van de Biomedische en mijn
medethesisstudenten willen bedanken voor de toffe momenten in het studentenlokaaltje en
voor het aanhoren van mijn geklaag als ik alweer eens geen mutatie had gevonden.
Tenslotte mag mijn familie hier zeker niet ontbreken. Merci mama en papa voor de jarenlange
steun die jullie mij gegeven hebben tijdens het studeren en om steeds te blijven geloven in
mij. Bedankt ook zusje voor de vele examenperiodes dat we samen beleefd hebben en om die
periodes in de mate van het mogelijke net ietsje toffer te maken. En tot slot wil ik graag
Frederik bedanken voor de steun de laatste jaren, om mij steeds bij te staan met goede raad en
mij terug op te beuren met je onnozele grapjes toen ik het eventjes weer niet meer zag zitten.
Iris
Mei 2012
Afkortingen
°C graden Celsius
AAIDD American Association on Intellectual and Developmental Disabilities
arrayCGH array-comparative genomic hybridization
AZ aminozuur
bp basenparen
cDNA complement DNA
CMGG Centrum voor Medische Genetica van het UZ Gent
Cq quantification cycle
CZS centraal zenuwstelsel
ddNTPs dideoxyribonucleotidetrifosfaten
DMSO dimethylsulfoxide
DNA desoxyribonucleïnezuur
dNTPs deoxyribonucleotidetrifosfaten
dsDNA dubbelstrengig DNA
ESE Exonic Splicing Enhancer
g g-kracht (zwaartekracht)
HRM High-Resolution Melting
iN cellen geïnduceerde neuronale cellen
IQ Intelligentie quotiënt
miRNA micro-ribonucleïnezuur
mRNA messenger RNA
MYT1L myelin transcription factor-1 like
PCR Polymerase Chain Reaction
Polyphen-2 Polymorphism Phenotyping v2
qPCR quantitative (kwantitatieve) PCR
RNA ribonucleïnezuur
rpm revolutions per minute (omwentelingen per minuut)
SD Standard deviation (standaardafwijking)
ssDNA enkelstrengig DNA
SIFT Sorting Intolerant From Tolerant
siRNA small interfering RNA
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Tm Smelttemperatuur
UTR Untranslated Region
Inhoudsopgave
Samenvatting .............................................................................................................................. 1
1 Inleiding ............................................................................................................................. 2
1.1 Mentale Retardatie ..................................................................................................... 2
1.1.1 Definitie .................................................................................................................. 2
1.1.2 Classificatie ............................................................................................................ 3
1.1.3 Oorzaken ................................................................................................................ 4
1.1.3.1 Omgevingsfactoren ........................................................................................ 4
1.1.3.2 Genetische oorzaken....................................................................................... 5
1.1.3.2.1 Chromosomale afwijkingen ...................................................................... 5
1.1.3.2.1.1 Numerieke afwijkingen ..................................................................... 5
1.1.3.2.1.2 Structurele afwijkingen ...................................................................... 6
1.1.3.2.2 Monogenische afwijkingen ....................................................................... 6
1.1.3.3 Multifactoriële aandoeningen ......................................................................... 7
1.2 MYT1L ........................................................................................................................ 7
1.2.1 Eiwitfunctie .......................................................................................................... 10
1.2.2 MYT1 ................................................................................................................... 11
1.2.3 MYT1L en neurologische aandoeningen ............................................................. 12
1.3 Doelstelling van deze masterproef ........................................................................... 14
2 Materiaal en methoden ..................................................................................................... 15
2.1 Patiëntenmateriaal .................................................................................................... 15
2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................................... 15
2.2.1 Principe ................................................................................................................. 15
2.2.2 Protocol ................................................................................................................ 16
2.2.2.1 TECAN freedom EVO robot ........................................................................ 17
2.2.3 LabChip GX ......................................................................................................... 18
2.3 High-Resolution Melting curve analysis .................................................................. 18
2.3.1 Principe ................................................................................................................. 19
2.3.2 Protocol ................................................................................................................ 21
2.3.2.1 Analyse mbv LightScanner software ........................................................... 21
2.4 Manuele sequenering ................................................................................................ 22
2.4.1 Principe Sanger sequencing.................................................................................. 22
2.4.2 Protocol ................................................................................................................ 23
2.4.3 Analyse resultaten met Seqscape en Alamut ........................................................ 25
2.4.3.1 Sequentie-analyse met Seqscape .................................................................. 25
2.4.3.2 Mutatie-analyse met Alamut ........................................................................ 25
2.4.3.2.1 Mutatie in een intronisch regio ............................................................... 25
2.4.3.2.2 Mutatie in een coderende regio............................................................... 25
2.5 Functionele studie .................................................................................................... 26
2.5.1 Transfectie ............................................................................................................ 26
2.5.1.1 Protocol ........................................................................................................ 27
2.5.2 Cellen oogsten ...................................................................................................... 28
2.5.3 RNA isolatie ......................................................................................................... 28
2.5.4 Complement DNA(cDNA) synthese .................................................................... 29
2.5.5 Kwantitatieve PCR (qPCR) .................................................................................. 30
2.5.5.1 Principe ......................................................................................................... 30
2.5.5.2 Protocol ........................................................................................................ 31
3 Resultaten ......................................................................................................................... 33
3.1 Mutatiescanning van MYT1L ................................................................................... 33
3.1.1 Optimalisatie HRM met probes ............................................................................ 33
3.1.2 Exonische mutaties ............................................................................................... 36
3.1.2.1 Missense mutaties ........................................................................................ 36
3.1.2.2 Synonieme mutaties ..................................................................................... 38
3.1.3 Intronische mutaties ............................................................................................. 39
3.1.4 SNPs ..................................................................................................................... 39
3.2 Functionele studie .................................................................................................... 41
3.2.1 Cellijnen selecteren .............................................................................................. 41
3.2.2 Transfectie van NGP met siRNA ......................................................................... 41
3.2.3 Transfectie van SH-SY 5Y met siRNA ................................................................ 42
3.2.4 Transfectie van SMS-KAN met siRNA ............................................................... 43
3.2.5 Transfectie van SMS-KCNR met siRNA ............................................................. 43
4 Discussie ........................................................................................................................... 45
4.1 Mutatiescanning van MYT1L ................................................................................... 45
4.1.1 Exonische mutaties ............................................................................................... 45
4.1.1.1 Missense mutaties ........................................................................................ 45
4.1.1.1.1 c.1273G>A ............................................................................................. 47
4.1.1.2 Synonieme mutaties ..................................................................................... 48
4.1.2 Intronische mutaties ............................................................................................. 49
4.1.2.1 c.55+56G>A ................................................................................................. 49
4.1.3 Unclassified variants ............................................................................................ 50
4.2 Functionele studie .................................................................................................... 52
5 Algemene conclusie ......................................................................................................... 53
5.1 Besluit ....................................................................................................................... 53
5.2 Toekomstperspectieven ............................................................................................ 53
Referentielijst ........................................................................................................................... 54
1
Samenvatting
Mentale retardatie is de meest voorkomende ontwikkelingsstoornis. Bij meer dan de helft van
de patiënten is de oorzaak nog niet gekend, maar wordt er vermoed dat een genetische factor
aan de basis ligt. De ontrafeling van de genetische oorzaken van mentale retardatie is van
cruciaal belang voor de patiënt en blijft één van de grootste uitdagingen van de moleculaire
genetica.
Recent werd in het Centrum voor Medische Genetica bij dertien patiënten met mentale
retardatie een disruptie in het myelin transcription factor-1 like (MYT1L) gen gedetecteerd.
Bij negen patiënten werd een gemeenschappelijke gedeleteerde regio geïdentificeerd en bij de
anderen een duplicatie. De expressie van MYT1L blijft beperkt tot de neuronen, met de
hoogste expressie tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit zorgt ervoor dat MYT1L een sterk
kandidaatgen is voor mentale retardatie.
Het eerste doel van deze masterproef bestond erin om loss-of-function mutaties in het MYT1L
gen te identificeren in een grote patiëntenpopulatie met idiopathische mentale retardatie. Met
behulp van High-Resolution Melting als pre-screening techniek en Sanger sequenering
werden de mutaties in een populatie van 1152 patiënten geïdentificeerd. Er werden in totaal 7
missense, 11 synonieme en 3 intronische varianten gedetecteerd. Deze konden in de groep
unclassified variants worden geclassificeerd, aangezien geen enkele variant een duidelijke
klinische betekenis had.
Het tweede luik van deze masterproef hield het achterhalen van de functie van het MYT1L
proteïne in de humane neuronale ontwikkeling in. Daarbij werd gebruik gemaakt van vier
neuroblastoma cellijnen: NGP, SH-SY 5Y, SMS-KAN en SMS-KCNR. In deze cellen werd
geprobeerd om het MYT1L gen neer te reguleren via transfectie van een short interfering
RNA. Dit bleek niet de geschikte methode te zijn, aangezien onvoldoende knock-down kon
worden geïnduceerd voor verder functioneel onderzoek.
2
1 Inleiding
1.1 Mentale Retardatie
1.1.1 Definitie
Een definitie geven aan mentale retardatie is niet zo eenvoudig en blijft een uitdaging. Sinds
enkele jaren wordt er in het Engels zelfs niet meer gesproken van mental retardation, maar
van intellectual disability (=intellectuele onbekwaamheid of verstandelijke beperking). In
deze term kunnen we twee woorden onderscheiden: intelligentie en onbekwaamheid. Onder
intelligentie verstaat men het vermogen om zich aan te passen aan nieuwe situaties of
alledaagse problemen, de mogelijkheid om abstract te denken, kennis te kunnen opslaan, te
oordelen, begrijpen en redeneren. Intelligentie wordt zowel beïnvloed door genetische
factoren als omgevingsfactoren en wordt gemeten met behulp van IQ (intelligentie quotiënt)
testen [1]. De distributie van de IQ-score van een populatie wordt beschouwd als een normale
verdeling, waarbij het gemiddelde gelijkgesteld wordt aan 100 en de standaardafwijking (SD)
aan 15 eenheden. 68% van de bevolking wordt hierbij beschouwd als normaal, met een IQ-
score meer of minder dan 1 SD dan het gemiddelde. Als je score meer dan 2 SD lager is dan
het populatiegemiddelde (IQ< 70) wordt er gesproken van een verstandelijke beperking en dit
zou voorkomen bij 2,3% van de bevolking (Figuur 1).
Figuur 1: Verdeling van de IQ score over de populatie [2].
3
Door de American Association on Intellectual and Developmental Disabilities (AAIDD)
wordt een verstandelijke beperking gedefinieerd als volgt:
“Intellectual disability is characterized by significant limitations both in intellectual
functioning and adaptive behavior as expressed in conceptual, social, and practical skills,
which are apparent prior to the age of 18.” [3]
1.1.2 Classificatie
Er bestaan verscheidene methoden om een onderverdeling te maken in verschillende mentale
retardatie groepen. Er zijn twee methoden die een onderscheid maken op basis van de IQ-
score: ICD-10 en DSM-IV. De ICD-10 classificatie wordt het meest gebruikt en staat voor de
10de
versie van de International Classification of Diseases, opgesteld door de
Wereldgezondheidsorganisatie [4]. DSM-IV is de 4de
editie van de American Psychiatric
Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders en gebruikt ook nog de
IQ-score als criteria. Er wordt momenteel echter gewerkt aan een 5de
versie en deze zou geen
rekening meer houden met de IQ-score, maar eerder met de hulpbehoevendheid van de
persoon [5]. Naast een onderverdeling volgens IQ wordt mentale retardatie door de AAIDD
opgedeeld in verschillende niveaus op basis van de intensiteit van vereiste hulp van de
mentaal geretardeerde persoon [6] (Tabel 1).
Tabel 1: Classificaties volgens ICD-10, DSM-IV en AAIDD.
Intensiteit van vereiste hulp
ICD-10 DSM-IV AAIDD
50-69 55-69 Wisselend
35-49 40-54 Beperkt
20-34 25-39 Extensief
< 20 < 24 Indringend
70 70 70 tot 75Grenswaarde (IQ)
Graad
IQ-score
Mild
Matig
Ernstig
Diep
Van alle personen gediagnosticeerd met mentale retardatie heeft ongeveer 85% een milde
vorm en 15% valt in de categorie matig, ernstig of diep [7].
4
1.1.3 Oorzaken
Mentale retardatie kan veroorzaakt worden door omgevingsfactoren, genetische factoren of
een combinatie van beide (multifactorieel). Omgevingsfactoren zijn verantwoordelijk voor
ongeveer 16% van alle gevallen, genetische afwijkingen voor 28% en voor de overige 56%
van de gevallen kon tot heden nog geen onderliggende oorzaak geïdentificeerd worden [8]
(Figuur 2).
Figuur 2: Oorzaken van mentale retardatie, onderzocht op een populatie van 10997 individuen [8].
1.1.3.1 Omgevingsfactoren
Bij de omgevingsfactoren kan er een onderscheid gemaakt worden tussen prenatale (voor de
geboorte, tijdens de zwangerschap), perinatale (rond het tijdstip van de geboorte) en
postnatale oorzaken (na de geboorte).
De meest voorkomende prenatale vorm van mentale retardatie is te wijten aan alcohol- en
drugsgebruik van de moeder. Dit kan in het slechtste geval leiden tot het foetaal
alcoholsyndroom. Blootstelling van de foetus aan bepaalde chemicaliën (bv.
loodvergiftiging), bestraling en infecties zoals CMV of Toxoplasmose kunnen ook aanleiding
geven tot het ontwikkelen van een mentale beperking. Daarnaast kan malnutritie van de foetus
ook een risicofactor zijn [9].
Unknown
54%
Other environmental
insults 1%
Chromosome
10%
Single Gene
8%
Multifactorial
2%
Culturofamilial
6%
Syndromes
presumed to be genetic
1%
Other genetic
syndromes 1%
Injury
5%
Infection
5%
Chemical
2%
Prematurity
5%
Causes of mental retardation identified among cohort of 10,997
individuals
5
Perinataal kunnen complicaties tijdens de geboorte, zoals een tijdelijk zuurstoftekort of een
cerebrale bloeding, aanleiding geven tot onomkeerbare hersenschade. Bepaalde factoren zoals
prematuriteit en een laag geboortegewicht kunnen vaak op latere leeftijd ernstige problemen
zoals een mentale achterstand veroorzaken [9, 10].
Tenslotte kunnen we de postnatale oorzaken onderscheiden. Kinderziektes zoals kinkhoest,
waterpokken en mazelen kunnen aanleiding geven tot meningitis en encefalitis, die beiden de
hersenen ernstig kunnen beschadigen. Deze ziektes komen nog voornamelijk voor in
ontwikkelingslanden en minder bij ons, aangezien kinderen hiertegen kunnen gevaccineerd
worden. Ook lood, kwik en andere gifstoffen kunnen onherstelbare schade aan de hersenen en
het zenuwstelsel berokkenen. Daarnaast kan een trauma aan het hoofd ten gevolge van bv. een
ongeval aanleiding geven tot een verstandelijke beperking [10].
1.1.3.2 Genetische oorzaken
Zoals voorheen vermeld wordt bij 28% van de patiënten de mentale retardatie veroorzaakt
door genetische afwijkingen. Er wordt vermoed dat dit percentage eigenlijk veel hoger ligt en
dat bij zeker de helft van de idiopathische mentale retardaties een genetische factor aan de
basis ligt. Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen chromosomale en monogenische
afwijkingen. Chromosomale afwijkingen kunnen nog verder worden onderverdeeld in
numerieke en structurele afwijkingen.
1.1.3.2.1 Chromosomale afwijkingen
1.1.3.2.1.1 Numerieke afwijkingen
Bij een numerieke chromosomale afwijking is een abnormaal aantal chromosomen aanwezig
in de cel. Bij het ontbreken van een chromosoom uit een chromosomenpaar spreekt men van
monosomie en wanneer een extra kopij van een chromosoom aanwezig is spreekt men van
trisomie. In de meeste gevallen is aneuploïdie reeds vroeg in de embryonale ontwikkeling
lethaal. Enkel voor de autosomale trisomieën 13 (syndroom van Patau), 18 (syndroom van
Edwards) en 21 (syndroom van Down) zijn er levend geborenen gerapporteerd [9]. De eerste
twee zijn zeer zeldzaam en geven aanleiding tot ernstige mentale retardatie. Deze kinderen
sterven vaak binnen de eerste dagen na hun geboorte ten gevolge van ernstige malformaties
6
[11]. In tegenstelling tot kinderen met het syndroom van Patau en syndroom van Edwards
kunnen patiënten met het syndroom van Down dankzij de huidige medische zorgen wel 50 tot
60 jaar oud worden. Het is eveneens de meest frequente oorzaak van mentale retardatie met
een incidentie van 1 op 800 geborenen, waarbij het risico stijgt met de leeftijd van de moeder
bij conceptie. Naast een mentale beperking kunnen deze kinderen ook congenitale
hartafwijkingen hebben (in 50% van de gevallen), hebben ze een typisch dysmorf gelaat,
overtollige nekplooien, dwarsplooien in de handpalmen, afwijkingen van het
maag/darmstelsel en hebben ze een verhoogde kans op het krijgen van leukemie en een
vroegtijdige Alzheimer dementie [12].
1.1.3.2.1.2 Structurele afwijkingen
Bij een structurele afwijking is de structuur van één of meerdere chromosomen veranderd. Zo
kunnen er deleties, duplicaties, inserties, inversies en translocaties optreden in elk deel van elk
chromosoom. Translocaties kunnen optreden zonder dat er klinische gevolgen zijn, zolang dat
deze gebalanceerd zijn, dus zonder verlies of winst van genetisch materiaal en zonder een
interruptie van een belangrijk gen. Zo’n gebalanceerde translocatie kan echter ongebalanceerd
worden doorgegeven aan nakomelingen, met aandoeningen met mentale retardatie tot gevolg.
Deleties en duplicaties kunnen aanleiding geven tot diverse fenotypes, afhankelijk van hun
grootte en de plaats van voorkomen. Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen
interstitiële en subtelomerische (terminale) deleties. Een voorbeeld waarbij een interstitiële
deletie aan de oorzaak ligt van de aandoening is het velocardiofaciaal syndroom, met een
microdeletie ter hoogte van chromosoomband 22q11.2. Bij het Cri-du-chat syndroom treedt
dan weer een terminale deletie van de korte arm van chromosoom 5 op. Deze twee syndromen
worden gekarakteriseerd door mentale retardatie in combinatie met multipele andere
aangeboren afwijkingen [9, 13, 14].
1.1.3.2.2 Monogenische afwijkingen
Monogenische aandoeningen worden veroorzaakt door een mutatie in één enkel gen. Deze
mutaties kunnen de functie van dat gen verstoren en kunnen zo aanleiding geven tot mentale
retardatie. Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen de verschillende aandoeningen in
deze groep op basis van de manier van overerving: autosomaal dominant/recessief en X-
7
gebonden dominant/recessief [9]. De man-vrouw ratio van aangetaste personen is 3:1. Dit is
waarschijnlijk te wijten aan het feit dat een man maar één X-chromosoom heeft en dat men
vermoed dat er meer genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de hersenen gelegen
zijn op het X-chromosoom. De bekendste en meest voorkomende monogenische aandoening
die aanleiding geeft tot mentale retardatie is het fragiele X-syndroom, waarbij een mutatie
optreedt in het FMR1 gen, gelegen op het X-chromosoom. Het is, na het syndroom van
Down, de tweede belangrijkste oorzaak van mentale retardatie [13].
1.1.3.3 Multifactoriële aandoeningen
Genetische aandoeningen kunnen ook multifactorieel of complex zijn. Dit betekent dat ze het
gevolg zijn van het effect van meerdere genen in combinatie met omgevingsfactoren. Ze
vertonen eerder complexe overervingspatronen en niet de Mendeliaanse overervingspatronen
zoals monogenische aandoeningen. Dit, in combinatie met invloeden vanuit de omgeving,
zorgt ervoor dat het moeilijk is om de genen te identificeren die bij deze complexe
aandoeningen betrokken zijn [15]. Er is nu meer en meer evidentie dat een deel van de
idiopathische mentale retardatie kan verklaard worden als het gevolg van multifactoriële
factoren.
1.2 MYT1L
Zoals eerder vermeld kan met de huidige technieken bij ongeveer 56% van de patiënten met
mentale retardatie nog geen onderliggende oorzaak geïdentificeerd worden.
Het Centrum voor Medische Genetica (CMGG) heeft door de jaren heen veel vooruitgang
geboekt betreffende de ontdekking van nieuwe microdeletie syndromen en de karakterisering
van chromosomale afwijkingen in patiënten met mentale retardatie en congenitale
afwijkingen. Recent werd in het centrum met behulp van array-comparative genomic
hybridization (arrayCGH) één patiënt met mentale retardatie en een deletie ter hoogte van het
distale deel van de korte arm van chromosoom 2 (2p25.3) gedetecteerd. Met internationale
samenwerking zijn er nog acht andere patiënten gevonden met mentale retardatie en een
deletie in diezelfde regio en vier patiënten met een duplicatie. Vervolgens werd er gekeken
naar de kleinste regio van overlap bij al deze patiënten en dat interval bevat slechts één gen:
het myelin transcription factor-1 like gen (MYT1L). In de DECIPHER databank (databank dat
8
informatie opslaat verkregen na de uitvoering van een arrayCGH en hij linkt deze informatie
met het fenotype van de patiënt) werd dit ook nog eens nagegaan en daar werden nog twee
andere patiënten teruggevonden. De ene patiënt had een deletie en de andere patiënt een
duplicatie in het MYT1L gen. Deze beide patiënten hadden ook een mentale achterstand
(Figuur 3).
Figuur 3: Voorstelling patiënten met een MYT1L disruptie. Bovenaan wordt de lengte aangegeven en
daaronder de chromosomenband. De rode lijn geeft de deleties aan en de blauwe lijn de duplicaties die bij de 13
patiënten werden geïdentificeerd. De grijze verticale band wijst op het MYT1L gen. In DECIPHER werden nog 2
patiënten gevonden met een deletie of een duplicatie.
Het MYT1L gen is 542081 basenparen (bp) groot en telt 25 exonen. Exon 1 t.e.m. exon 5 en
het distale deel van exon 25 zijn untranslated regions (UTRs), terwijl de overige 19 exonen
en het proximale deel van exon 25 coderende regio’s zijn. MYT1L maakt deel uit van de
myelin transcription factor protein family, samen met nog twee andere leden: MYT1 en ST18.
Deze familie codeert voor neurale, zinkvinger-bevattende desoxyribonucleïnezuur (DNA)-
bindende proteïnen die hoog geconserveerd zijn [16]. Het MYT1L gen codeert voor een 1186
aminozuren lang proteïne dat een N-terminale zinkvinger, 2 tandem centrale zinkvingers en 3
C-terminale zinkvingers bevat [17].
Zinkvingers zijn domeinen die opvouwen wanneer ze gestabiliseerd worden door gebonden
zink ionen. Ze spelen een belangrijke rol in de celgroei, differentiatie en ontwikkeling.
Wanneer een aantal van deze zinkvingers aanwezig zijn, kan de transcriptiefactor een
specifieke DNA sequentie herkennen. Het is één van de meest voorkomende DNA
bindingsmotieven onder de eukaryotische transcriptiefactoren en ze worden geclassificeerd op
basis van hun aminozuursequentie, wat bestaat uit een combinatie van cysteïne en histidine
9
residuen. Er zijn reeds meer dan tien verschillende structurele klassen gekend en de meest
voorkomende is de Cys2His2 klasse. De drie leden van de myelin transcription factor protein
family behoren tot de ongewone Cys2HisCys klasse, welke een Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys
consensus sequentie hebben [17, 18] (Figuur 4).
Figuur 4: Schematische representatie van de geconserveerde functionele domeinen in de drie leden van de
human myelin transcription protein family [19].
Studies in ratten wijzen erop dat MYT1L tot expressie komt in de ontwikkelende hersenen
vanaf embryonale dag 15, met een piek in de expressie rond de partus. In volwassen hersenen
komt MYT1L ook tot expressie, maar er is toch een duidelijke daling te zien ten opzichte van
de embryonale hersenen. MYT1L expressie blijft in het centrale zenuwstelsel (CZS) beperkt
tot de neuronen [17] (Figuur 5).
Figuur 5: MYT1L expressie [20]. Onderaan zijn de verschillende weefsels weergegeven waarin de expressie
van MYT1L werd nagegaan. De groene balken stellen de mate van expressie voor.
10
1.2.1 Eiwitfunctie
Aangezien het MYT1L proteïne enkel in de neuronen van het centrale zenuwstelsel tot
expressie komt en het een transcriptiefactor is, is dit eiwit mogelijks betrokken bij de
neuronale differentiatie. Zijn exacte functie en in welke pathway deze betrokken is of met
welke andere proteïnen deze interageert is nog niet opgehelderd. Romm et al. [21] hebben
gezocht naar de interactiepartners van bepaalde leden van de myelin transcription factor
protein family, om te kunnen begrijpen hoe deze familie de neuronale differentiatie reguleert.
Uit dit onderzoek bleek dat in zowel een yeast als in een mammalian two-hybrid system,
MYT1 en MYT1L interageren met Sin3B, een proteïne dat zorgt voor de recrutering en
binding van histon deacetylasen (HDAC). Deze HDACs zorgen voor een verwijdering van de
acetylgroepen van de histonen, waarna een condensatie van de DNA structuur plaatsvindt en
transcriptie verhinderd wordt. Zo kan de MYT1 gen familie de silencing van bepaalde genen
bevorderen tijdens de neuronale differentiatie.
Een andere onderzoeksgroep [22] heeft onderzoek gedaan naar de interactiepartners van
Lingo-1, een transmembranair proteïne dat deel uitmaakt van het Nogo receptor complex en
een rol speelt in het verhinderen van axon regeneratie na schade aan het centrale zenuwstelsel.
Daaruit bleek dat het C-terminale domein van Lingo-1 in staat is om te interageren met
MYT1L. Het is nog niet duidelijk wat het belang is van deze interactie, maar men merkte op
dat MYT1L proteïne levels in het cytoplasma verhoogden wanneer Lingo-1 levels ook
verhoogden tijdens regeneratie condities in het ruggenmerg. Een mogelijke hypothese is dat
in deze condities Lingo-1 de MYT1L transcriptiefactor activiteit reguleert door deze in het
cytoplasma te houden. Men concludeerde dat Lingo-1 een rol kan spelen in de neurale cel
specificatie en proliferatie door regulatie van MYT1L.
Recent werd door Vierbuchen et al. [23] beschreven dat de directe conversie van muis
embryonale en postnatale fibroblasten naar functionele neuronen in vitro mogelijk is door het
gebruik van drie transcriptiefactoren: Ascl1, Brn2 en MYT1L. Deze geïnduceerde neuronale
cellen (iN cellen) vertonen expressie van verschillende neuron-specifieke proteïnen,
genereren actiepotentialen en vormen functionele synapsen. Gebruik van enkel
transcriptiefactor Ascl1 was voldoende om immature neuronale eigenschappen te induceren,
maar bijkomende expressie van Brn2 en MYT1L genereerde mature iN cellen. De auteurs van
dit artikel veronderstelden dat hoge expressie levels van sterke neurale cel bepalende
transcriptiefactoren bepaalde kenmerken van het neuronale transcriptionele programma
11
kunnen activeren. Dit wijst op een mogelijke centrale rol van MYT1L in de neuronale
ontwikkeling.
Daaropvolgend beschreven Pang et al. [24] de conversie van humane pluripotente stamcellen
en foetale en postnatale humane fibroblasten naar functionele neuronen aan de hand van
bepaalde transcriptiefactoren. Voor de inductie van functionele neuronen uit humane
pluripotente stamcellen zijn de drie boven vernoemde transcriptiefactoren voldoende. Voor de
conversie van foetale en postnatale humane fibroblasten is echter het gebruik van nog een
vierde transcriptiefactor NeuroD1 vereist. Deze geïnduceerde neuronale cellen waren
eveneens in staat om actiepotentialen te genereren en om synaptische contacten te ontvangen.
Zoals voorheen beschreven zijn neurogene transcriptiefactoren en evolutionair
geconserveerde signaalwegen bevorderlijk in de vorming van neuronen. Yoo et al. [25]
beschreven echter dat de expressie van micro-ribonucleïnezuur (miRNA) daarbij ook een rol
kunnen spelen. Er werd aangetoond dat de expressie van miRNA 9/9* en miRNA 124 in
humane fibroblasten hun conversie in neuronen induceerden. Dit proces werd gefaciliteerd
door NEUROD2. Verdere toevoeging van de neurogene transcriptiefactoren ASCL1 en
MYT1L verhoogde de snelheid van de conversie en de maturatie van de geconverteerde
neuronen.
Wanneer al deze data samen genomen wordt, kan er gesteld worden dat MYT1L belangrijk is
in de neuronale ontwikkeling en differentiatie, wat het een sterke kandidaat maakt voor
mentale retardatie.
1.2.2 MYT1
Het MYT1 gen behoort net als het MYT1L gen tot de myelin transcription factor protein
family, waarbij MYT1L sterk homoloog is aan MYT1. Het is gelegen op chromosoom 20 ter
hoogte van chromosoomband 20q13.33. Het MYT1 gen codeert voor een transcriptiefactor dat
bindt op de promoter regio van proteolipide proteïnen van het centrale zenuwstelsel. Het komt
tot expressie in neurale progenitor cellen en oligodendrocyt progenitor cellen in tegenstelling
tot MYT1L dat enkel tot expressie komt in de differentiërende neuronen [17]. Experimenten
tonen aan dat MYT1 een belangrijke rol speelt in de proliferatie en differentiatie van
oligodendrocyten door het reguleren van de expressie en transcriptie van myeline-specifieke
genen [26].
12
Er is evidentie dat de MYT1 functie kan gecompenseerd worden door de MYT1L activiteit
[27]. MYT1 wordt namelijk geëxpresseerd in de embryonale pancreas en speelt een rol bij de
endocriene differentiatie. Bij het maken van een pancreas-specifieke MYT1 knock-out muis,
bleek dat de expressie van de MYT1 paralogen MYT1Ll en MYT3 (ST18), die normaal gezien
niet in de pancreas geëxpresseerd worden, geïnduceerd werd. Zo stelde men de hypothese dat
de gevolgen van een MYT1 inactivatie in de ontwikkelde pancreas kon gemaskeerd worden
door de activatie van zijn paralogen.
Recent werd een geval gerapporteerd waarbij een de novo subtelomerische deletie van
chromosoom 20q aanleiding gaf tot de volledige deletie van het MYT1 en het PCMTD2 gen
[28]. Deze deletie werd gevonden bij een individu met ernstige mentale retardatie en milde
dysmorfe faciale kenmerken. De twee gedeleteerde genen komen tot expressie in het CZS,
maar gezien de bevindingen wordt er gesuggereerd dat de ontbrekende transcriptionele
controle van genen door MYT1 verantwoordelijk kan zijn voor de ernstige neurologische
stoornissen in de patiënt.
Aangezien er dus al een deletie van MYT1 gedetecteerd is in een individu met mentale
retardatie, MYT1L homoloog is aan MYT1 en dus een verlies van de MYT1 functie
gecompenseerd kan worden door de MYT1L activiteit, kan het MYT1L gen dus belangrijk
zijn bij het ontstaan van mentale retardatie.
1.2.3 MYT1L en neurologische aandoeningen
Er zijn reeds afwijkingen in het MYT1L gen beschreven. Zo werd een duplicatie gevonden ter
hoogte van chromosoom 2p25.3 in een patiënt met schizofrenie [29]. Deze duplicatie omvat
vier genen, maar het breekpunt van deze duplicatie verbreekt het terminale gedeelte van het
MYT1L gen. Zo kan deze de functie van MYT1L verstoren door verbreking van het gen of via
dosage effecten.
Er is ook al een Single Nucleotide Polymorphism (SNP), een variatie in het DNA tussen
individuen van slechts één nucleotide, beschreven in het MYT1L gen geassocieerd met een
ernstige depressie [16]. In deze studie werden 8 SNPs als merkers gebruikt om de rol van
MYT1L na te gaan in patiënten met een ernstige depressie in de Chinese Han populatie.
Daaruit bleek dat één bepaalde merker (rs3748989), gelokaliseerd in exon 9, sterk
geassocieerd was met de depressie. Alhoewel het een synonieme SNP is, kan een ander allel
13
de efficiëntie van transcriptie, de structurele stabiliteit van het transcript en de splicing
signalen beïnvloeden, wat resulteert in verschillen in expressie. Deze resultaten geven aan dat
MYT1L een potentieel risico gen kan zijn voor ernstige depressie, wat ook een neurologische
aandoening is.
Aangezien er reeds een duplicatie gevonden werd in het MYT1L gen bij een patiënt met
schizofrenie en er een SNP beschreven is in het MYT1L gen geassocieerd met depressie,
gingen Li et al. [30] na of er een associatie is tussen bepaalde SNPs in het MYT1L gen en
schizofrenie in de Chinese Han populatie. Daarbij heeft men ontdekt dat er een associatie is
tussen SNP rs17039584 en rs10190125 en patiënten met schizofrenie. Zo kon men besluiten
dat specifieke allelen van MYT1L een verhoogd risico op schizofrenie kunnen geven.
Tenslotte werd er recent gesuggereerd dat MYT1L een kandidaatgen kan zijn voor mentale
retardatie, wat onze veronderstelling ook staaft. Dit kwam doordat er deleties gedetecteerd
waren ter hoogte van chromosoomband 2p25.3 in acht patiënten met een mentale achterstand.
In de kleinste regio van overlap lag slechts één eiwit-coderend gen, namelijk het MYT1L gen.
Er wordt verondersteld dat MYT1L haploinsufficiëntie aan de basis ligt van de mentale
retardatie [19].
Wanneer we al deze data samennemen, dus het feit dat MYT1L bijna uitsluitend tot expressie
komt in het zich ontwikkelende brein en bijdraagt tot de proliferatie en differentiatie van
neuronen, er een homologie is met het MYT1 gen waarbij ook reeds een deletie werd terug
gevonden in een patiënt met mentale retardatie, er reeds variaties in het gen ontdekt zijn bij
andere neurologische aandoeningen en tenslotte dat er reeds deleties ontdekt zijn bij patiënten
met een mentale achterstand, kunnen we veronderstellen dat MYT1L een kandidaatgen kan
zijn voor mentale retardatie.
14
1.3 Doelstelling van deze masterproef
Mentale retardatie komt voor bij ongeveer 3% van de populatie. Er zijn reeds afwijkingen in
vele genen gekend die aan de oorzaak liggen van de intellectuele achterstand van de patiënten,
maar bij 56% van de patiënten kon tot heden nog geen onderliggende oorzaak vastgesteld
worden [8]. Het achterhalen van de precieze oorzaak van de mentale achterstand is van
cruciaal belang voor de medische begeleiding van de patiënt of om het herhalingsrisico bij
een verdere kinderwens in te schatten.
Recent werd in het CMGG een nieuw microdeletie syndroom geïdentificeerd op de korte arm
van chromosoom 2 in negen patiënten met mentale retardatie De kleinste regio van overlap
tussen deze patiënten bevat slechts één gen: het myelin transcription factor-1 like gen
(MYT1L). Dit gen komt bijna uitsluitend tot expressie in het zich ontwikkelende brein, wat het
een sterk kandidaatgen maakt voor mentale retardatie.
Het doel van deze masterproef is om te achterhalen of het MYT1L gen een rol speelt in de
ontwikkeling van mentale retardatie. Daarvoor zal deze masterproef onderverdeeld worden in
twee luiken.
Doelstelling 1: Identificatie van loss-of-function mutaties in het MYT1L gen in een grote
patiëntenpopulatie met mentale retardatie. Er zal hiervoor een mutatieonderzoek uitgevoerd
worden met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), High-Resolution Melting Curve
Analysis (HRM) en Sanger sequenering op 1152 patiënten met mentale retardatie. Bij deze
patiënten werden met behulp van verscheidene diagnostische testen tot nu toe nog geen
mutaties gevonden.
Doelstelling 2: Ontrafeling van de functie van MYT1L in de humane neuronale ontwikkeling.
Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van verschillende neuroblastoma cellijnen. In deze
cellen zal getracht worden het MYT1L gen neer te reguleren door middel van transfectie of
transductie van een short interfering ribonucleïnezuur (siRNA) en een short hairpin RNA
(shRNA), gevolgd door een functionele karakterisatie van de cellen.
15
2 Materiaal en methoden
2.1 Patiëntenmateriaal
Bij het mutatie-onderzoek werd gebruik gemaakt van genomisch DNA geëxtraheerd uit bloed
afkomstig van 1152 patiënten met milde of matige mentale retardatie en waarbij met
verscheidene diagnostische testen nog geen causaal defect teruggevonden werd. Van deze
patiënten zijn 960 van Belgische afkomst en 192 patiëntenstalen zijn verkregen via een
collaboratie en zijn afkomstig uit Brazilië.
2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.2.1 Principe
De Polymerase Chain Reaction of polymerase kettingreactie is een techniek die toelaat om
een specifieke DNA sequentie te selecteren en deze exponentieel te amplificeren. Er wordt
daarbij gebruik gemaakt van twee oligonucleotide primers, die complementair zijn aan het 3’-
uiteinde van het te amplificeren dubbelstrengig DNA (dsDNA) fragment. Verder worden
deoxyribonucleotidetrifosfaten (dNTPs) toegevoegd. Dit zijn vrije nucleotiden die
complementair aan de doelwitstreng met behulp van een thermostabiel DNA polymerase
worden aangebouwd aan de primers. Er zijn drie grote stappen in een conventionele PCR-
reactie, waarbij de temperatuur een cruciale rol speelt (Figuur 6) [31]:
1. Denaturatie: het template DNA wordt enkelstrengig gemaakt door blootstelling aan
een temperatuur tussen 92°C en 98°C. Bij deze temperatuur worden de
waterstofbruggen tussen de twee strengen verbroken.
2. Aanhechting van de primers aan het enkelstrengig DNA (ssDNA). Bij deze stap wordt
de temperatuur verlaagd tot 50 à 60°C, waardoor de primers zullen hybridiseren met
hun complementaire sequentie.
3. Elongatie: het DNA polymerase zal, vertrekkende van de uiteinden van de twee
gebonden primers, dNTPs aanbouwen bij een temperatuur van 72°C. Zo wordt een
nieuwe complementaire DNA streng gevormd.
16
Figuur 6: Principe van de PCR-reactie [31].
De nieuw gesynthetiseerde streng zal in de volgende cyclus vervolgens dienen als template
om bijkomende DNA strengen te genereren. Op deze manier treedt een kettingreactie in gang,
waarbij miljoenen identieke DNA fragmenten worden gecreëerd. Deze cyclus wordt meestal
25 à 30 keer herhaald.
2.2.2 Protocol
1. Alle reagentia worden gestockeerd bij -20°C, de LC Green kleurstof (Idaho
Technology Inc.) bij 4°C. De kleurstof wordt afgeschermd van het zonlicht door
middel van aluminium folie.
2. Ontdooi, vortex en centrifugeer kort alle reagentia (Bijlage 2), behalve het enzym, dat
enkel wordt gecentrifugeerd. Het enzym blijft bij -20°C tot het moment van
toevoegen.
3. Neem een epje van geschikt volume om de mastermix in te maken. Voeg de producten
van grootste naar kleinste volume toe. De mastermix wordt vervolgens geïnverteerd en
gecentrifugeerd.
17
4. Verdeel de mastermix uit in elk welletje van de 384- of 96-well plaat (Thermo-Fast
96, Non-Skirted (ThermoScientific) of 4titude (HRM)) door middel van de Distriman
(Gilson).
5. Voeg de patiëntenstalen handmatig toe (Multichannel, RAININ) of met de TECAN
freedom EVO robot (paragraaf 2.2.3.1).
6. Indien HRM-analyse: voeg 15μl minerale olie (Sigma-Aldrich) toe aan elk welletje.
Dit voorkomt verdamping van het reactievolume tijdens de analyse.
7. Sluit de plaat goed af met een Adhesive PCR film (ThermoScientific) en centrifugeer
gedurende 1,5 minuut aan 1500 omwentelingen per minuut (rpm).
8. Plaats de plaat in de PCR-Thermocycler (Bio-Rad) en start het gepaste programma
(Bijlage 5).
2.2.2.1 TECAN freedom EVO robot
De TECAN robot wordt gebruikt om de patiëntenstalen automatisch toe te voegen aan de
mastermix plaat. Er wordt gebruik gemaakt van twee protocols: van 4 x 96-well
patiëntenplaten naar 1 x 384-well mastermix plaat of van 4 x 96-well patiëntenplaten naar 4 x
96-well mastermix platen.
1. De tips (TECAN), patiëntenplaten en mastermixplaten worden geplaatst volgens
onderstaande opstelling (Figuur 7).
Groene tips
(50µl)
Groene tips
(50µl)
Groene tips
(50µl)
Groene tips
(50µl)
Patiënten-
plaat 1
(96-well)
Patiënten-
plaat 2
(96-well)
Patiënten-
plaat 3
(96-well)
Patiënten-
plaat 4
(96-well)
Mastermix-
plaat
(384-well)
Mastermix-
plaat 1
(96-well)
Mastermix-
plaat 2
(96-well)
Mastermix-
plaat 3
(96-well)
Mastermix-
plaat 4
(96-well)
of
18
Figuur 7: Opstelling TECAN freedom EVO robot. Van 4 x 96-well patiëntenplaten naar 1 x 384-well
mastermix plaat of van 4 x 96-well patiëntenplaten naar 4 x 96-well mastermix platen.
2. Zet de robot aan en open de “EvoWare Standard” software:
3. Kies “Edit Existing script” “user defined” (Pieter Mestdagh)/ “default dir”
2010_11_10_free_4Q_low_volume/ 20120224_96_96_low_vol_free_dispense
4. Klik “Run”. Vermeld vervolgens het aantal 384/96 well platen en het volume.
5. Als het protocol afgelopen is: software afsluiten en robot uitzetten.
2.2.3 LabChip GX
Het PCR-product van sommige exonen (exon 15, exon 25 3’ UTR) kan niet geanalyseerd
worden met HRM, aangezien er steeds afwijkende curves gegenereerd worden. Deze stalen
worden dus direct gesequeneerd. Om er zeker van te zijn dat de PCR-reactie hierbij goed is
doorgegaan, worden de stalen geladen in de LabChip GX (Caliper LifeSciences). Dit toestel
maakt gebruik van het elektroforese principe om de amplicons te scheiden volgens hun
grootte. Daarvoor moet 3μl van het PCR-product overgepipetteerd worden in een 384-well
plaat samen met 17μl H2O, waarna de plaat in het toestel wordt geplaatst. De bandjes kunnen
vervolgens bekeken worden met de LabChip GX software [32].
2.3 High-Resolution Melting curve analysis
High-Resolution Melting (HRM) is een methode om op een snelle manier genetische mutaties
of variaties in bepaalde sequenties op te sporen. Het is een goedkope en eenvoudige techniek
met een hoge sensitiviteit en specificiteit. In deze masterproef wordt de techniek gebruikt als
pre-sequeneringsscreening voor het selecteren van de patiënten met een mogelijke mutatie in
een bepaald exon of intron van het MYT1L gen. Patiënten zonder defecten in het gen kunnen
op deze manier uitgesloten worden en dienen bijgevolg niet gesequeneerd te worden. Zo
kunnen kosten bespaard worden, aangezien een sequenering een stuk duurder is dan een
HRM-analyse [33].
19
2.3.1 Principe
Een HRM smeltcurve analyse wordt voorafgegaan door een PCR-reactie waarbij een
fluorescente dye (LC Green) intercaleert tussen het dsDNA. Deze dye fluoresceert sterk
wanneer gebonden aan dsDNA en fluoresceert weinig in de afwezigheid van dsDNA [34]. Na
PCR-amplificatie worden de amplicons in de LightScanner (Idaho Technology Inc.)
blootgesteld aan stijgende temperaturen. In het begin is het DNA nog dubbelstrengig en is er
dus een hoge fluorescentie. Naarmate de temperatuur stijgt en de smelttemperatuur (Tm)
bereikt wordt, denatureert het DNA en worden enkelstrengen gevormd. Tijdens de uitsmelting
komt LC Green vrij en daalt bijgevolg de fluorescentie. Deze daling van fluorescentie in
functie van de temperatuur wordt weergegeven als de smeltcurve [33, 35] (Figuur 8).
Figuur 8: Smeltcurve HRM [36].
De vorm van de smeltcurve is afhankelijk van het GC-gehalte, de lengte, de sequentie en de
heterozygositeit. Als er een heterozygote mutatie aanwezig is in de sequentie, zullen er
heteroduplexen gevormd worden, met een verandering in vorm van de smeltcurve tot gevolg.
Een homozygote mutatie kan gedetecteerd worden door een verschuiving in de
smelttemperatuur. Door deze verschillende smeltcurves te vergelijken kunnen mutaties
gedetecteerd worden [37] (Figuur 9).
20
Figuur 9: Afwijkende smeltcurves HRM. Groene curve: wild-type/wild-type, blauwe curve: homozygoot
mutant, rode curve: heterozygoot mutant. De groene en de blauwe curve hebben dezelfde vorm, maar de Tm van
de blauwe ligt hoger dan deze van de groene curve. De rode smeltcurve heeft een andere vorm dan de wild-type
curve [36].
In sommige exonen van het MYT1L gen is een veel voorkomende SNP aanwezig. Aangezien
de patiënten met een SNP ook een afwijkend smeltprofiel zouden vertonen, wordt er gebruik
gemaakt van een ongelabelde probe voor de HRM-analyse, zodat deze patiënten ook kunnen
uitgesloten worden. Voor de meest voorkomende SNPs werd een specifieke probe ontwikkeld
van 30-35 bp, gericht tegen het meest onstabiele nucleotide. Deze probes hybridiseren aan de
DNA sequentie tijdens de PCR-reactie, met vorming van een probe-amplicon duplex. Tijdens
de HRM-analyse zal de uitsmelting veel sneller gebeuren en kan een heterozygote en
homozygote SNP onderscheiden worden (Figuur 10). Bij het gebruik van een probe wordt één
van de twee primers (forward of reverse, afhankelijk van de probe) in overmaat toegevoegd,
zodat voldoende probe-amplicon duplexen gevormd worden voor detectie [37].
Figuur 10: Afgeleide curves probe-amplicon duplexen. Grijze curve: homozygoot wild-type, blauwe curve:
homozygote SNP, rode curve: heterozygoot voor SNP.
21
2.3.2 Protocol
1. Als de PCR-reactie afgelopen is (paragraaf 2.2.2 en 2.2.3): centrifugeer de plaat
gedurende 10 minuten aan 3000 rpm.
2. Schakel de LightScanner aan en open de LightScanner software. Klik op “Run”.
3. Stel de begintemperatuur en eindtemperatuur in.
Zonder probe: begintemperatuur = 70°C; eindtemperatuur = 98°C
Met probe: begintemperatuur = 45°C; eindtemperatuur = 98°C
4. Klik op “Go to Hold Temp”.
5. Wanneer de hold temperature bereikt is: verwijder de seal en plaats de HRM-plaat in
het toestel.
6. Klik op “Start run” en geef de naam op waaronder de data moet worden opgeslagen.
7. Als de run beëindigd is: neem de plaat uit de LightScanner, sluit de software af en zet
het toestel uit.
2.3.2.1 Analyse mbv LightScanner software
Voor mutatieonderzoek: klik op “Scanning”; voor genotypering met ongelabelde probes: klik
op “Unlabeled probe”.
1. Aanmaken subsets: Klik op “New Subset”, benoem de subset en markeer de stalen die
in deze subset moeten voorkomen. Druk daarna op “Add marked to subset”.
2. Ga naar het tabblad “Negative filter” en duid de negatieven (mislukte PCR-reactie)
aan.
3. Ga naar het tabblad “Normalize” om de verkregen smeltcurves te normaliseren. Twee
paar balken worden net voor en net na de ombuigingen van de smeltcurve geplaatst.
Tussen deze balken moet een temperatuurverschil zitten van ongeveer 1°C.
4. Ga naar het tabblad “Grouping” om de smeltcurves te groeperen. Stel de sensitiviteit
als “High” in en klik op “Compute groups”.
22
2.4 Manuele sequenering
2.4.1 Principe Sanger sequencing
De meest gebruikte sequeneringsmethode is de Sanger sequencing methode of de dideoxy
terminatie methode. Met behulp van deze methode bepaalt men de exacte basenvolgorde van
een specifieke DNA sequentie. Het idee achter deze methode is om dochterstrengen te
synthetiseren, die complementair zijn met het template DNA fragment, die gelabeld zijn aan
één uiteinde en verschillen in lengte.
Het synthetiseren van deze dochterstrengen gebeurt door het uitvoeren van een aantal cycli
van drie opeenvolgend stappen:
1. Denaturatie van de template DNA sequentie.
2. Annealing van een universele primer aan de DNA sequentie.
3. Extensie en terminatie van de dochterstreng. Deze laatste stap gebeurt na toevoegen
van een DNA polymerase, vier dNTPs en vier fluorescent gemerkte
dideoxyribonucleotidetrifosfaten (ddNTPs). Deze ddNTPs verschillen van de dNTPs
doordat ze een hydroxylgroep missen aan het 3’-uiteinde, waardoor een volgende
nucleotide niet meer kan binden. Het DNA polymerase zal de primer verlengen door
het aanbouwen van dNTPs, complementair met het template DNA. Aangezien de
ddNTPs in ondermaat worden toegevoegd ten opzichte van de dNTPs, worden ze
slechts sporadisch ingebouwd. Als een ddNTP wordt ingebouwd, zal de synthese van
de dochterstreng worden stopgezet. Doordat er competitie is tussen de dNTPs en de
ddNTPs ontstaan er DNA fragmenten van verschillende lengte.
De DNA fragmenten worden vervolgens gescheiden op basis van hun grootte door capillaire
elektroforese. Op het einde van het capillair is een laser aanwezig die gebruikt wordt om de
laatste fluorescerende base te exciteren. Deze lasersignalen worden tenslotte omgezet in de
exacte nucleotidesequentie [38, 39].
In deze masterproef wordt het protocol voor manuele sequenering gebruikt. Daarbij wordt de
sequeneringsreactie manueel uitgevoerd en dienen de stalen enkel nog op de capillaire
sequencer gelopen worden.
23
2.4.2 Protocol
Opzuivering van het PCR-product
1. Bereid een Exo-AP mix voor het aantal stalen dat dient gesequeneerd te worden
(+10% extra). Plaats de producten op ijs en centrifugeer ze kort. Voor één staal:
0,05μl Exo (Exonuclease I, New England Biolabs)
0,20μl AP (Antarctic phosphatase, New England Biolabs)
0,75μl H2O
2. Om het PCR-product op te zuiveren wordt 1μl Exo-AP mix toegevoegd aan 5μl PCR-
product (in een nieuwe plaat: Thermo-Fast 96, Non-Skirted (ThermoScientific)).
3. Plaats de plaat in de PCR-Thermocycler (Bio-Rad) en voer de volgende clean up
reactie uit:
15 minuten op 37°C
20 minuten op 80°C
1 minuut op 4°C
4. Voeg 20μl H2O toe aan elk Exo-AP product.
Sequeneringsreactie
5. Bereid de sequeneringsreactie mix voor het aantal stalen dat dient gesequeneerd te
worden. Aangezien er telkens enkel forward gesequeneerd wordt, moet er slecht één
mix per staal gemaakt worden. Voor één staal:
2,0μl Sequencing buffer 5x (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit of custom made)
2,0μl 1μM primer: M13 F B (universele primer, IDT) of forward primer van
bij PCR-reactie (als de sequenering niet werkte met de universele primer)
0,5μl RR (Ready Reaction mix van BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI))
Optioneel: 0,5μl DMSO (Dimethylsulfoxide, VWR)
H2O tot een totaalvolume van 9μl (4,5μl voor een standaard reactie of 4μl bij het gebruik van DMSO)
24
6. Pipetteer 9μl van de sequeneringsreactie mix toe aan elk welletje van een nieuwe plaat
en voeg 1μl gezuiverd PCR-product toe.
7. Plaats de plaat in het PCR-toestel en voer de volgende sequeneringsreactie uit:
10 seconden op 92°C
5 seconden op 55°C 25 cycli
4 minuten op 60°C
Opzuivering van het sequeneringsproduct
8. Maak een 85% ethanoloplossing: 150μl nodig per staal (Ethanol absolute, VWR).
9. Resuspendeer de magnetische beads (CleanSeq magnetische beads, Agencourt).
10. Voeg 10μl beads toe aan elk sequeneringsproduct.
11. Voeg 45μl 85% ethanol toe en pipetteer 7 keer op en neer.
12. Plaats de plaat op de magnetische houder voor 3 minuten (Agencourt BioScience Inc).
13. Verwijder het supernatans.
14. Voeg 100μl 85% ethanol toe en plaats de plaat voor 1 minuut op de magnetische
houder.
15. Verwijder het supernatans.
16. Laat de plaat 10 minuten drogen op kamertemperatuur.
17. Voeg 40μl H20 toe, pipetteer 7 keer op en neer en wacht 3 minuten.
18. Plaats de plaat op de magnetische houder en wacht 1 minuut.
19. Transfereer 30μl opgezuiverd sequeneringsproduct (zonder beads) naar een nieuwe
plaat.
20. Geef de stalen in bij de GSU (sequeneringsfaciliteit) voor “just run”.
25
2.4.3 Analyse resultaten met Seqscape en Alamut
2.4.3.1 Sequentie-analyse met Seqscape
Na sequenering worden de resultaten bekeken met de Seqscape v2.5 software van Applied
Biosystems.
2.4.3.2 Mutatie-analyse met Alamut
Als bij analyse met Seqscape een mutatie gevonden wordt, zal in de Alamut software
(Interactive Biosystems) nagegaan worden of dit een mogelijks effect heeft. Een mutatie in
een intronische regio kan een invloed hebben op het splicing mechanisme. Een mutatie in een
coderende regio kan ofwel een missense, nonsense of synonieme mutatie zijn of ook een
invloed hebben op splicing. Deze effecten kunnen nagegaan met verschillende
predictieprogramma’s die ingebouwd zijn in Alamut.
2.4.3.2.1 Mutatie in een intronisch regio
Een mutatie in een intronische regio kan aanleiding geven tot het verlies of het creëren van
een splice site. Dit mogelijk effect kan nagegaan worden met verschillende splicing predictie
programma’s die ingebouwd zijn in Alamut: SpliceSiteFinder-like, MaxEntScan, NNSPLICE
en Human Splicing Finder. Deze programma’s zullen voorspellen wat de kans is dat die
bepaalde mutatie aanleiding geeft tot de verandering van een splice site [40].
2.4.3.2.2 Mutatie in een coderende regio
Afhankelijk van de mutatie in de coderende regio van het gen (missense, nonsense of
synoniem) kan deze een bepaald effect uitoefenen op het proteïne. Een nonsense mutatie geeft
aanleiding tot een verkort proteïne en een missense mutatie zorgt dat een nieuw aminozuur
ingebouwd wordt. Een synonieme mutatie (het nieuwe codon codeert voor hetzelfde
aminozuur) zal waarschijnlijk geen invloed hebben op het proteïne zelf. Het functionele effect
van een missense mutatie kan voorspeld worden met behulp van SIFT (Sorting Intolerant
From Tolerant), Polyphen-2 (Polymorphism Phenotyping v2) en de Grantham score, welke
alle drie ook ingebouwd zijn in Alamut. SIFT en Polyphen-2 baseren zich op het idee dat
evolutionair geconserveerde aminozuren een belangrijke invloed hebben op de functie van
een proteïne. SIFT bepaalt deze conservatie door sequenties te aligneren en een
conservatiescore te berekenen. Op basis van deze conservatiescore bepaalt SIFT of de
substitutie “tolerated” of “deleterious” is [41]. Polyphen-2 berekent ook deze
26
conservatiescore en gebruikt deze in combinatie met de fysicochemische en structurele
eigenschappen van de aminozuren. Zo komt men tot een substitutie die “benign”, “possibly
damaging” of “probably damaging” is [42]. De Grantham score is een maat voor de
fysicochemische afstand tussen twee aminozuren. Wanneer de Grantham score hoger is dan
60, wordt aangenomen dat de substitutie intolerant is.
Een missense en synonieme mutatie kan echter ook een invloed hebben op splicing via het
verlies of de creatie van een ESE (Exonic Splicing Enhancer). Dit kan dan weer voorspeld
worden met twee andere predictie programma’s (in Alamut): ESEFinder en RESCUE-ESE
[40].
2.5 Functionele studie
Er wordt naast het zoeken van mutaties bij patiënten met mentale retardatie ook onderzoek
gedaan naar de functie van het MYT1L eiwit in de neuronale ontwikkeling. Om dit te
achterhalen wordt geprobeerd om het MYT1L gen neer te reguleren in verschillende
neuroblastoma cellijnen. De eerste techniek die wordt aangewend is het creëren van een
knock-down door transfectie met een siRNA. Indien dit geen goede resultaten oplevert zal
overgegaan worden naar het gebruik van een shRNA.
De onderstaande proeven heb ik enkel meegevolgd en heb ik dus zelf niet uitgevoerd. Ik ben
wel nauw betrokken geweest bij het proces en de genomen beslissingen omtrent deze
functionele studie.
2.5.1 Transfectie
Het doel van een transfectie is om een siRNA gericht tegen het MYT1L gen binnen te brengen
in de cellen. Dit is mogelijk door gebruik te maken van lipiden, die complexen vormen met
het siRNA en ervoor zorgen dat de complexen fuseren met de celmembraan en het siRNA
binnenbrengen in de cel via endocytose. Het siRNA zal aanleiding geven tot een knock-down
van het MYT1L gen via activatie van het RISC complex. Het siRNA leidt het complex naar
een plaats in het gen waar het complex dient te knippen om zo een loss-of-function te
veroorzaken.
27
Er wordt een transfectie uitgevoerd met het siRNA gericht tegen het MYT1L gen, een blanco,
een positieve en een negatieve controle. Als positieve controle wordt een siRNA gekozen
gericht tegen een gen waarbij knock-down reeds gevalideerd is (verschilt per cellijn). Als
negatieve controle wordt een NTC (Non Targeting Control) siRNA gebruikt, dat ontworpen is
om geen enkel gen uit te schakelen. Vergelijking van de NTC getransfecteerde cellen en de
blanco (niet-getransfecteerd) duidt op veranderingen veroorzaakt door de transfectie zelf.
2.5.1.1 Protocol
1. Cellen worden uitgezaaid in een 6-well plaat (Nunc) aan 500.000 cellen in 2 ml per
well in RPMI (= medium, Invitrogen) enkel gesupplementeerd met 10% foetaal kalf
serum (Invitrogen).
2. Voor elke transfectie (MYT1L siRNA, positieve controle, NTC siRNA) worden twee
epjes voorbereid: één voor het siRNA mengsel (epje A) en één voor het lipidemengsel
(epje B). In epje A wordt het geschikt volume RPMI zonder supplementen
gepipetteerd en het geschikt volume van het siRNA. Voor epje B wordt hetzelfde
gedaan, maar er wordt DharmaFECT2 (Dharmacon) toegevoegd i.p.v. siRNA.
3. De mixen worden zachtjes gemengd door op en neer te pipetteren en worden
vervolgens 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd.
4. Voeg het geschikte volume van mengsel A toe aan mengsel B en pipetteer zachtjes op
en neer.
5. Laat 20 minuten incuberen op kamertemp zodat de RNA-lipide complexen zich
kunnen vormen.
6. Verwijder 200µl medium uit alle welletjes van de 6-well plaat, behalve de blanco.
7. Voeg 200µl van het transfectiemengsel toe aan de cellen en schud met de plaat in
rechte lijnen (boven-onder; links-rechts).
8. Laat de cellen vervolgens incuberen in de incubator gedurende voorafbepaalde
periodes (37°C, 5% CO2).
28
2.5.2 Cellen oogsten
Na een tijdspanne van 24, 48 of 72 uur worden de cellen geoogst
1. Neem de plaat uit de incubator en plaats deze op ijs.
2. Schraap m.b.v. een celschraper over de bodem van de welletjes zodat de adherente
cellen loskomen.
3. Pipetteer de inhoud van elk welletje in een epje en centrifugeer deze vervolgens voor
5 minuten bij 1600 rpm op 4°C.
4. Verwijder het supernatans.
5. Resuspendeer de pellet in 700 µl QIAzol (Qiagen) om het messenger RNA (mRNA)
te stabiliseren
6. Indien niet meteen overgegaan wordt tot RNA isolatie kunnen de cellen bewaard
worden bij -80°C.
2.5.3 RNA isolatie
De volgende stap is het uitvoeren van een RNA isolatie. Hierbij worden de cellen gelyseerd,
RNase geïnhibeerd en wordt het merendeel van het cellulair DNA en de proteïnen verwijderd
uit het lysaat zodat enkel RNA overblijft [43]. Het RNA wordt gezuiverd door middel van de
miRNeasy mini kit (Qiagen).
1. Diepgevroren stalen (-80°C) dienen eerst ontdooid te worden.
2. Voeg 140µl chloroform (Sigma-Aldrich) toe, mix goed door gepulseerd te vortexen en
laat de epjes gedurende 2 minuten staan op kamertemperatuur. Centrifugeer de epjes
daarna voor 15 minuten bij 12000 g-kracht (g) op 4°C. Er ontstaan 3 duidelijk te
onderscheiden fasen.
3. Transfereer de bovenste waterige laag (daarin zitten de RNA moleculen) naar een
nieuw epje en plaats op ijs.
4. Voeg 1,5 keer het volume 100% ethanol (Ethanol absolute, VWR) toe en mix door op
en neer te pipetteren.
29
5. Pipetteer 700µl van het staal in een RNeasy Mini spin kolom epje (miRNeasy mini kit,
Qiagen). Centrifugeer voor 15 seconden aan 12000g op kamertemp (het RNA bindt op
de membraan). Verwijder de doorgelopen vloeistof uit het opvangbuisje. Herhaal deze
stap voor de rest van het staal.
6. Voeg 350µl Buffer RWT (miRNeasy mini kit, Qiagen) toe en centrifugeer voor 15
seconden op 12000g om de kolom te wassen. Verwijder de vloeistof.
7. Pipetteer 80µl DNase I mix (10 µl DNase I + 70 µl RDD buffer) (RNase-Free DNase
Set, Qiagen) rechtstreeks op de kolom en laat gedurende 15 minuten op
kamertemperatuur incuberen. Herhaal vervolgens stap 6.
8. Voeg 500µl Buffer RPE (miRNeasy mini kit, Qiagen) toe om het afgebroken DNA te
verwijderen en centrifugeer voor 15 seconden op 12000g. Verwijder de vloeistof.
Herhaal deze stap, maar centrifugeer nu voor 2 minuten om de kolom te drogen.
9. Plaats de kolom in een nieuw opvangbuisje en centrifugeer voor 1 minuut op volle
snelheid. Gooi het opvangbuisje weg.
10. Plaats de kolom in een nieuw 1,5ml epje en pipetteer 30µl RNase-vrij water
(miRNeasy mini kit, Qiagen) rechtstreeks op de kolom. Centrifugeer voor 1 minuut op
12000g om het RNA te elueren. Verwijder vervolgens de kolom.
11. Plaats de stalen op ijs en meet de concentratie met de Nanodrop 1000
(ThermoScientific).
2.5.4 Complement DNA(cDNA) synthese
Voorafgaande aan een qPCR moet eerst het RNA omgezet worden naar cDNA. Dit gebeurt
met behulp van een reverse transcriptase, een enzym dat enkelstrengig RNA omzet in
complementair enkelstrengig DNA.
1. Maak een mastermix van de volgende producten: per reactie 4 µl 5x iScript Reaction
Mix, 1µl iScript Reverse Transcriptase (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad).
Verdeel deze mastermix uit in de verschillende epjes.
30
2. Voeg het geschikte volume RNA (500 ng) toe en leng aan met nuclease-vrij water
(Sigma) tot een totaal reactievolume van 20µl.
3. Plaats de epjes in het MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad) PCR-toestel en start het
cDNA synthese protocol:
5 minuten op 25°C
30 minuten op 42°C
5 minuten op 85°C
Na de reactie komt men tot een concentratie van 25 ng/µl (500 ng cDNA in 20µl). Om een
werkconcentratie van 2.5 ng/µl te verkrijgen wordt het cDNA 1:10 verdund.
2.5.5 Kwantitatieve PCR (qPCR)
2.5.5.1 Principe
Bij een conventionele PCR kan enkel de hoeveelheid eindproduct bepaald worden door het
staal bijvoorbeeld te laden in de Labchip GX (paragraaf 2.2.3). Voor sommige toepassingen,
zoals genexpressie analyse of voor de analyse van copy number variations, kan het echter
handig zijn om de hoeveelheid startmateriaal en de hoeveelheid product na elke cycli te
kennen. Met de komst van de qPCR-methode is dit nu mogelijk. Deze techniek combineert de
DNA amplificatie (zoals bij een PCR) met de continue en directe detectie van het PCR-
product in één enkele reactie. De hoeveelheid product gedetecteerd op een gegeven punt van
de reactie is rechtstreeks gerelateerd aan de initiële hoeveelheid materiaal.
De qPCR-methode is gebaseerd op de toevoeging van een fluorescerende dye dat fluoresceert
wanneer het intercaleert met dubbelstrengig DNA. Naarmate de hoeveelheid PCR-product
stijgt (na elke cyclus), zal dus ook de fluorescentie toenemen. Dit wordt voorgesteld in een
curve waarbij de stijging van de fluorescentie uitgezet wordt ten opzicht van het aantal cycli
[44].
Voor de data-analyse wordt gebruik gemaakt van de 2nd derivative maximum method. Daarbij
wordt de Cq-waarde (Quantification cycle) bepaald aan de hand van het maximum van de
tweede afgeleide van de amplificatiecurve. De Cq-waarde wordt gedefinieerd als de cyclus
waarbij de fluorescentie het snelst stijgt en hangt af van de initiële hoeveelheid materiaal. Hoe
31
hoger namelijk de hoeveelheid startmateriaal, hoe sneller de Cq-waarde bereikt wordt (hoe
minder cycli nodig) (Figuur 11) [45].
Figuur 11: Amplificatiecurve van een qPCR-reactie [45]. Blauwe curve: 1ste
afgeleide van de
amplificatiecurve, rode curve: 2de
afgeleide van de amplificatiecurve.
qPCR wordt onder andere aangewend om de expressieniveaus van genen in een bepaalde
cellijn na te gaan. Aan de hand van qBasePLUS (Biogazelle), de gebruikte software voor de
analyse van qPCR-resultaten, wordt de expressie van MYT1L in onze cellijnen na transfectie
voorgesteld. Er wordt eveneens nagegaan wat de expressie is in de stalen van enkele
huishoudgenen (verschillen per cellijn) ter normalisatie. Vervolgens wordt de expressie van
het staal met het MYT1L siRNA vergeleken met het staal dat het NTC siRNA (beschouwd als
100%) bevat. Een lagere expressie van MYT1L in het MYT1L siRNA staal wijst op een
geslaagde knock-down.
2.5.5.2 Protocol
De qPCR-reactie wordt uitgevoerd met de Sso Advanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad).
De supermix bevat alle reagentia nodig voor de reactie: 2x reactiebuffer, polymerase, SYBR
Green kleurstof, dNTPs en MgCl2.
1. Maak een mastermix in een epje van geschikt volume. Per reactie wordt 2.5µl
supermix gebruikt, aangevuld met 0.25µl forward primer en 0.25µl reverse primer.
32
2. Voeg 3µl van het reactiemengsel toe aan de welletjes van een 384-well qPCR-plaat
(Roche).
3. Voeg 2µl cDNA (2.5 ng/µl) toe aan de welletjes en sluit de plaat af met een
Lightcycler 480 sealing foil (Roche).
4. Plaats de plaat in de LightCycler 480 (Roche) en start het standaard protocol van Sso
Advanced:
2 minuten op 95°C
5 seconden op 95°C
30 seconden op 60°C 35-40 cycli
1 seconde op 72°C
5 seconden op 95°C
1 minuut op 60°C
∞ op 95°C
33
3 Resultaten
3.1 Mutatiescanning van MYT1L
Het grootste deel van deze masterproef bestond uit het zoeken naar heterozygote mutaties in
het MYT1L gen in patiënten met idiopathische mentale retardatie. Er werd zowel gezocht naar
mutaties in de coderende exonen en de intron-exon boorden als naar mutaties in de 3’ UTR.
De 3’ UTR regio wordt ook onderzocht, aangezien er recent aangetoond werd dat mutaties in
de 3’ UTR van bepaalde genen nieuwe seeds kunnen creëren voor miRNAs of bestaande
seeds kunnen verbreken. Het onstaan van een nieuwe seed kan leiden tot een knock-down van
deze genen en het verdwijnen van een seed tot een overexpressie van deze genen [46]. Voor
elk exon werd eerst een PCR uitgevoerd op alle patiëntenstalen, gevolgd door een HRM-
analyse en tenslotte werden deze gesequeneerd.
Zoals voorheen vermeld werd de High-Resolution Melting techniek gebruikt als pre-
sequeneringsscreening om de amplicons zonder variant (wild-type) te onderscheiden van de
amplicons met een mogelijke sequentievariant. De amplicons die een afwijkend HRM-profiel
vertoonden werden vervolgens geselecteerd om nadien te sequeneren. Bij sommige exonen
werd gebruik gemaakt van een probe, om niet alleen de wild-type amplicons te onderscheiden
maar ook de amplicons met een veel voorkomende SNP. Exon 15 kon niet geoptimaliseerd
worden voor HRM en daarom werden alle stalen direct gesequeneerd. De 3’UTR werd ook
direct gesequeneerd.
3.1.1 Optimalisatie HRM met probes
In het MYT1L gen komen een aantal veel voorkomende SNPs voor. Een amplicon waarin een
SNP gelegen is, zal een afwijkend smeltprofiel vertonen bij HRM. Om deze er ook uit te
selecteren voor sequenering, werd er gebruik gemaakt van een ongelabelde probe gericht
tegen de meest onstabiele nucleotide (paragraaf 2.3.1). Er werden probes ontwikkeld van 30-
35 bp voor frequente SNPs in exon 7, 8, 9, 10, 18, 19, 20, 21 en 22 (Tabel 2).
34
Tabel 2: Probes ontwikkeld tegen veel voorkomende SNPs. De positie waar de SNP optreedt in de sequentie
van de probe is aangeduid in het rood. Als een probe gericht is tegen een SNP die gelegen is in een intron is de
sequentie van de probe voorgesteld met kleine letters, als de probe gericht is tegen een SNP gelegen in het exon
is de sequentie voorgesteld in hoofdletters. Sommige probes zijn gericht ten opzichte van twee SNPs.
SNP ExonSubstitutie
(X/Y)Sequentie probe
X Y
rs17338581 7 C/T 95% 5% cccattaacagtttggaaaattcacgc
rs2304008 7 T/G 66,80% 33,20% GTAATTTTCTGTGGAAGAGGGTCGCTTGTGA
rs2304009 7 G/A 80,50% 19,50% GTAATTTTCTGTGGAAGAGGGTCGCTTGTGA
rs2304007 8 C/A 20,80% 79,20% TAAAGTGACTTATTTGGGGACCCAGT
rs3748989 9a G/A 87,20% 12,80% AGTGATGGGACTGAGGACATGGATGAGA
rs3748988 9b T/C 60,20% 39,80% TCCCCTGGCTCATCATTGTCCTCGGA
rs13399855 10c A/G 44,50% 95,60% CATGTTCTGCTGCGGATTCCTCTCC
rs4853824 18 C/T 23,30% 76,70% ccagtgccttgatgtagacatggga
rs4553849 19 G/T 92,90% 7,10% gcaatagagttagtttgctttttggat
rs5828883 19 -/T (insT) - - gcaatagagttagtttgctttttggat
rs4381806 20 A/G 63,30% 36,70% gacatatacttgctttgcttgaatgcctcg
rs6728368 21 A/G 66,70% 33,30% TGAGCCGTCGCATCCTGGCGTGGGG
Frequentie
Vervolgens werden per exon verschillende PCR-protocols uitgetest. Eerst werd het Kapa
Touch-down 64-52 protocol getest. Als deze niet het gewenste resultaat opleverde, werd er
met een gradiënt-PCR gewerkt om na te gaan welke annealingstemperatuur het beste resultaat
gaf. Na de PCR-reactie werd een HRM uitgevoerd om te zien of de probe-amplicon duplexen
gevormd waren (Figuur 12). Indien dit het geval was, werd dit protocol gekozen voor de PCR
van de patiëntenstalen.
Figuur 12: Smeltcurves van HRM met ongelabelde probe (vb. MYT1L exon 9a).
Voor sommige exonen kon geen annealing van de probes verkregen worden. Bij deze werd
dan ook geen probe gebruikt voor HRM. Het betreft hier exon 10c en 18.
Probe-amplicon
duplex
Amplicon-duplex
35
Na HRM van de patiëntenstalen werden genormaliseerde smeltcurves van de probe–amplicon
duplexen verkregen. Daarbij kon een onderscheid gemaakt worden tussen stalen die
homozygoot zijn voor het meest onstabiele nucleotide, stalen die heterozygoot zijn en stalen
die homozygoot zijn voor het andere nucleotide (Figuur 13).
Figuur 13: Afgeleide genormaliseerde smeltcurves van MYT1L exon 9a. De probe is gericht tegen SNP
rs3748989 (G/A). Grijze curve: homozygoot voor G, blauwe curve: homozygoot voor A, rode curve:
heterozygoot voor G/A.
In exon 7 zitten meerdere SNPs en werden twee probes gebruikt. Probe 1 is gericht tegen SNP
rs17338581 en probe 2 combineert SNP rs2304009 en rs2304008. SNP rs2304009 is echter
het eerste nucleotide van de probe en werd niet gezien in de smeltcurve. De twee
gedetecteerde SNPs geven aanleiding tot meer complexe curves waarbij verschillende
combinaties van de SNPs optreden (Figuur 14).
Figuur 14: Genormaliseerde smeltcurves van MYT1L exon 7. Elke curve is een andere combinatie van SNP
rs17338581 en rs2304008. Vb. Rode curve: bult 1: heterozygoot voor T (rs17338581), bult 2: heterozygoot voor
C (rs17338581), bult 3: homozygoot voor T (rs2304008). Blauwe curve: bult 1: heterozygoot voor T
(rs17338581), bult 2: combinatie van heterozygoot voor C (rs17338581) en heterozygoot voor G (rs2304008),
bult 3: heterozygoot voor T (rs2304008).
36
3.1.2 Exonische mutaties
3.1.2.1 Missense mutaties
In zeven patiënten werd een missense mutatie teruggevonden in de coderende regio van het
MYT1L gen (Tabel 3).
Tabel 3: Gedetecteerde missense mutaties in het MYT1L gen. De nummering van de nucleotiden is gebaseerd
op NM_015025.2. Per substitutie werd, door gebruik te maken van verschillende predictieprogramma’s
(Grantham score, SIFT en Polyphen-2), voorspeld of deze een effect heeft op de functie van het MYT1L
proteïne. Een Grantham score <60 wordt beschouwd als tolerant. De voorspelling van SIFT is ofwel intolerant
(deleterious) of tolerant. Polyphen-2 geeft als uitkomst tolerant (benign), waarschijnlijk schadelijk (possibly
damaging) of hoogstwaarschijnlijk schadelijk (probably damaging).
Substitutie Exon AZ-verandering Grantham score SIFT Polyphen-2
c.653G> A 10b p.Arg218Gln 43 Tolerated Benign
c.1189G>T 10d p.Ala397Ser 99 Tolerated Benign
c.1273G>A 10d p.Asp425Asn 23 Deleterious Probably damaging
c.1444T>C 10d p.Ser482Pro 74 Tolerated Benign
c.1688G> A 12 p.Arg563Lys 26 Deleterious Benign
c.2339C>T 16 p.Pro780Leu 98 Tolerated Benign
c.2558G>A 17 p.Arg853Gln 43 Deleterious Benign
Deze amplicons vertoonden een afwijkend HRM-profiel (vb. c.1688G>A:
Figuur 15), waarna ze gesequeneerd werden (vb. c.1688G>A:
Figuur 16). Varianten c.653G>A, c.1189G>T, c.1273G>A, c.1444T>C, c.2339C>T en
c.2558G>A waren heterozygoot en variant c.1688G>A was homozygoot.
Figuur 15: HRM-profiel c.1688G>A HoZ (lichtgroene curve).
37
Figuur 16: Resultaat sequenering c.1688G>A (homozygote substitutie).
Na de sequenering werd er gekeken of deze missense mutaties een mogelijke invloed kunnen
hebben op de functie van het MYT1L proteïne met behulp van de Grantham score en de
predictieprogramma’s SIFT en Polyphen-2. De resultaten daarvan zijn weergegeven in Tabel
3. Polyphen-2 geeft twee voorspellingen, de ene is gebaseerd op de HumDiv trainingsset en
de andere op de HumVar trainingsset. De HumDiv trainingsset wordt het best gebruikt voor
de evaluatie van zeldzame allelen op loci die eventueel betrokken zijn in complexe fenotypes.
De HumVar trainingsset wordt aangewezen bij de diagnose van mutaties met drastische
effecten in Mendeliaanse aandoeningen. Hier werd gekozen om de HumVar trainingsset te
gebruiken, bestaande uit alle humane ziekte-veroorzakende mutaties uit UniProtKB en uit
vaak voorkomende humane niet-synonieme SNPs waarvan nog niet bekend is of ze betrokken
zijn in ziekte (deze worden als onschadelijk beschouwd).
Slechts één substitutie (c.653G>A) wordt door alle drie de methodes als tolerant beschouwd.
Drie substituties (c.1189G>T, c.1444T>C, c.2339C>T) worden door SIFT en Polyphen-2 als
tolerant beschouwd, maar hebben een Grantham score die hoger is dan 60 (intolerant) en twee
substituties (c.2558G>A, c.1688G>A) worden enkel door SIFT voorspeld als intolerant. Er is
geen enkele substitutie waarbij alle drie de methodes “schadelijk” aangeven. Voor één
nucleotideverandering, nl c.1273G>A, geven zowel SIFT (deleterious) als Polyphen-2
(probably damaging) aan dat deze een mogelijks effect heeft op de eiwitfunctie, hoewel de
Grantham score slechts 23 is. Deze substitutie wordt weergegeven in Figuur 17.
38
Figuur 17: Resultaat sequenering c.1273G>A HeZ
3.1.2.2 Synonieme mutaties
Er werden elf synonieme substituties gedetecteerd in de coderende regio van het MYT1L gen
bij twaalf verschillende patiënten (Tabel 4). Aangezien het synonieme substituties betreft,
wijzigt de eiwitsequentie niet.
Tabel 4: Gedetecteerde synonieme mutaties in het MYT1L gen. De nummering van de nucleotiden is
gebaseerd op NM_015025.2.
Substitutie Exon Aantal patiënten
c.273C>T 9a 2
c.405C>T 9b 1
c.411G>A 9b 1
c.423C>T 9b 1
c.1086G> T 10c 1
c.1089A>G 10c 1
c.1230C>T 10d 1
c.1854C>A 14 1
c.1947C>T 14 1
c.2514T>C 16 1
c.3399C>A 24 1
39
3.1.3 Intronische mutaties
Bij vier personen uit de patiëntenpopulatie kon een heterozygote substitutie in een intron van
het MYT1L gen aangetoond worden. Dit is voorgesteld in Tabel 5.
Tabel 5: Gedetecteerde intronische mutaties in het MYT1L gen. De nummering van de nucleotiden is
gebaseerd op NM_015025.2. Er werd gebruik gemaakt van verschillende predictieprogramma’s:
SpliceSiteFinder-like, MaxEntScan, NNSPLICE en Human Splicing Finder. Deze voorspellen of de substitutie
mogelijks aanleiding geeft tot het onstaan of verdwijnen van een 5’ donor splice site (D) of een 3’ acceptor
splice site (A). De kans dat er op die plaats een splice site aanwezig is, wordt weergegeven door een score. Bij
SpliceSiteFinder-like en Human Splicing Finder reiken die scores van 0-100, bij MaxEntScan van 0-16 en bij
NNSPLICE van 0-1. De eerste score is deze van het wild type en de tweede score is de score na substitutie. Als
de scores bij beide situaties gelijk zijn, heeft de substitutie geen effect.
Substitutie Intron Aantal
patiënten
SpliceSiteFinder
likeMaxEntScan NNSPLICE
Human Splicing
Finder
c.55+56G>A 6 2 A (0→85,3) A (0→8,2) A (0→0,8) A (0→90,9)
c.2278-29G>T 15 1 Geen effect Geen effect Geen effect A (70,6→0)
c.2852+58T>C 20 1 Geen effect Geen effect Geen effect Geen effect
Met behulp van verschillende splicing predictieprogramma’s (paragraaf 2.4.3.2.1) werd
voorspeld of deze varianten mogelijks leiden tot het verdwijnen of ontstaan van een splice
site. Er wordt voorspeld dat de substitutie in intron 6 (c.55+56G>A) aanleiding geeft tot het
ontstaan van een mogelijke 3’ acceptor splice site. De andere twee substituties blijken geen
drastische invloed te hebben op het splicing mechanisme.
3.1.4 SNPs
Niet voor alle exonen werden probes gebruikt, omdat er slechts een probe werd aangemaakt
als de SNP in meer dan 3% van de gevallen voorkwam en niet alle probes konden worden
geoptimaliseerd voor HRM. Toch kon in de meeste gevallen de aanwezigheid van de SNP
reeds bij HRM gedetecteerd worden (Figuur 18).
40
Figuur 18: HRM profiel exon 20, plaat 5 groep 2: SNP rs438180 A>G. De grijze curves zijn de patiënten die
homozygoot zijn voor A, de blauwe curves zijn de patiënten die heterozygoot zijn voor A/G en de rode curves
zijn de patiënten die homozygoot zijn voor G.
In de exonen en intronen waarbij geen probe werd gebruikt, werden ook in meerdere
patiëntenstalen SNPs teruggevonden. Deze zijn samengevat in Tabel 6.
Tabel 6: Gedetecteerde SNPs in het MYT1L gen. De nummering van de nucleotiden is gebaseerd op
NM_015025.2.
Variant Positie Nr in dbSNP
c.56-48T>G intron 6-7 rs2304008
c.89+52C>T intron 7-8 rs17338581
c.152+13delT intron 8-9 rs3214602
c.291G>A exon 9 rs3748989
c.345T>C exon 9 rs3748988
c.924C>T exon 10 rs2241686
c.1053G>A exon 10 rs13399855
c.1104C>A exon 10 rs1529667
c.1477+25G>A intron 10-11 rs139126460
c.1703+43T>C intron 12-13 rs12988500
c.1811+15T>G intron 13-14 rs180992065
c.2394G>A exon 16 rs75247762
c.2478C>T exon 16 rs71442304
c.2514+54C>G intron 16-17 rs189111564
c.2526G>A exon 17 rs191820268
c.2706-92G>T intron 18-19 rs4553849
c.2852+74A>G intron 20-21 rs4381806
c.2865C>T exon 21 rs59128763
c.3166+56G>A intron 22-23 rs76779761
c.3249T>C exon 23 rs2288179
c.3270+38C>T intron 23-24 rs2288178
c.*395C>T 3' UTR rs6744433
41
3.2 Functionele studie
Bij het onderzoek naar de functie van het MYT1L eiwit in de neuronale ontwikkeling wordt
geprobeerd om het MYT1L gen neer te reguleren in bepaalde neuroblastoma cellijnen. Eerst
werd geprobeerd om een knock-down te creëren door transfectie met een siRNA. Daarbij
mikken we op een knock-down van 80-90%. Hoe lager namelijk de knock-down, hoe minder
cellen het siRNA omvatten en hoe moeilijk de knock-down te zien is op qPCR.
3.2.1 Cellijnen selecteren
Er zijn verschillende neuroblastoma cellijnen voorhanden in het CMGG. Om te selecteren
welke het best gebruikt worden voor transfectie, werd gekeken in welke cellijnen MYT1L het
hoogst tot expressie komt. Hoe hoger MYT1L namelijk tot expressie komt, hoe duidelijker de
knock-down zal zijn. Er werd een qPCR uitgevoerd in 31 verschillende neuroblastoma
cellijnen. Daaruit kon men concluderen dat MYT1L het hoogst tot expressie komt in de
cellijnen SMS-KCNR, SMS-KAN, SH-SY 5Y, LAN-5 en NGP. SMS-KCNR en SMS-KAN
zijn semi-adherente cellijnen en zijn moeilijker om op te kweken en te transfecteren dan SH-
SY 5Y en NGP, wat adherente cellijnen zijn. Daarom werd besloten om eerst de adherente
cellijnen te proberen transfecteren en nadien, bij geen goede resultaten, de semi-adherente
cellijnen te transfecteren.
3.2.2 Transfectie van NGP met siRNA
De transfectie van de NGP cellijn gebeurde met de “On-Target plus siRNA smartpool”
(Dharmacon). Bij deze techniek wordt het siRNA binnengebracht in de cel met behulp van
lipiden (DharmaFECT2). Er werd ook een NTC gebruikt en de cellen werden geoogst na een
tijdspanne van 24 en 48 uur. Vervolgens werd een qPCR uitgevoerd ter confirmatie van de
knock-down (Figuur 19).
42
Figuur 19: Knock-down MYT1L in de NGP cellijn na 24 en 48 uur. Per tijdspunt wordt de expressie van
MYT1L voorgesteld, uitgedrukt in percentage.
Er was onvoldoende knock-down van de MYT1L expressie na zowel 24 als 48 uur.
3.2.3 Transfectie van SH-SY 5Y met siRNA
Voor de transfectie van de SH-SY 5Y cellijn werd gebruik gemaakt van de Accell kit
(Dharmacon), welke werkt zonder transportsysteem. De cellen werden uitgezaaid en
getransfecteerd in tweevoud, met een siRNA gericht tegen het MYT1L gen, een blanco, een
positieve controle en een NTC. Deze werden geoogst na 24, 48 en 72 uur. Op deze
tijdspunten werd met de microscoop gekeken naar het fenotype van de cellen (Bijlage 6) en
daarna werd een qPCR uitgevoerd (Figuur 20).
Figuur 20: Gemiddelde expressie van MYT1L van de twee transfecties in SH-SY 5Y na 24, 48 en 72 uur.
100,00% 105,07%
74,83%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
NTC 24h 48h
Knock-down MYT1L in NGP
100,00%
44,69%
36,28%
70,65%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
NTC 24h 48h 72h
Gemiddelde knock-down MYT1L in SH-
SY 5Y
43
Na 48 uur was een duidelijk fenotype zichtbaar: de MYT1L siRNA getransfecteerde cellen
waren aanwezig in een kleinere populatie en vertoonden minimale tekenen van synaptogenese
in vergelijking met de positieve controle, de NTC en de blanco. Deze hadden allemaal een
gelijkaardig fenotype. Na 24 en 48 uur was er een duidelijke knock-down te zien bij analyse
van de qPCR-resultaten.
3.2.4 Transfectie van SMS-KAN met siRNA
De transfectie van de SMS-KAN cellijn werd uitgevoerd met de “On-Target plus siRNA
smartpool”. Er werd een NTC gebruikt en de cellen werden geoogst na 24, 48 en 72 uur.
Tenslotte werd een qPCR uitgevoerd (Figuur 21). Er kon niet genoeg knock-down worden
vastgesteld na de drie tijdspunten.
Figuur 21: Knock-down van MYT1L in de SMS-KAN cellijn na 24, 48 en 72 uur.
3.2.5 Transfectie van SMS-KCNR met siRNA
Net als bij de de transfectie van SMS-KAN werd er gebruik gemaakt van de “On-Target plus
siRNA smartpool”, een NTC en werden de cellen geoogst na 24, 48 en 72 uur. Nadien werd
een qPCR uitgevoerd (Figuur 22). Er kon geen of onvoldoende knock-down worden
gedetecteerd na 24, 48 en 72 uur.
100,00% 71,41%
121,83% 103,46%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
NTC 24h 48h 72h
Knock-down MYT1L in SMS-KAN
44
Figuur 22: Knock-down van MYT1L in de SMS-KCNR cellijn na 24, 48 en 72 uur.
100,00%
216,97%
88,68%
122,76%
0%
50%
100%
150%
200%
250%
NTC 24h 48h 72h
Knock-down MYT1L in SMS-
KCNR
45
4 Discussie
4.1 Mutatiescanning van MYT1L
4.1.1 Exonische mutaties
4.1.1.1 Missense mutaties
In tegenstelling tot nonsense mutaties, die aanleiding geven tot een getrunceerd eiwit en
waarbij de interpretatie van de causaliteit eenvoudiger is, is de interpretatie bij missense
mutaties iets moeilijker. Het bepalen van de causaliteit is gebaseerd op de voorspelling van
verschillende predictieprogramma’s: SIFT, Polyhpen-2 en de Grantham score (paragraaf
2.4.3.2.2). Indien SIFT en Polyphen-2 met voldoende hoge sensitiviteit en specificiteit
voorspellen dat de substitutie geen effect heeft op de functie van het MYT1L proteïne (ze
voorspellen de substitutie respectievelijk als tolerant en benign) en als de substitutie geen
aanleiding geeft tot drastische aminozuurwijzigingen (Grantham score <60), dan is de
missense mutatie waarschijnlijk niet het causale defect in die patiënt (c.653G>A).
In sommige gevallen kunnen de predictieprogramma’s tegenstrijdige voorspellingen doen (zie
Tabel 3: c.1688G>A, c.2558G>A). Dit kan te wijten zijn aan het gebruik van verschillende
parameters waarop de voorspelling gebaseerd is. SIFT zal enkel orthologe en/of paraloge
sequenties aligneren, een conservatiescore berekenen en op basis daarvan een voorspelling
doen. Polyphen-2 daarentegen baseert zich zowel op de alignering van sequenties als op de
verandering in structuur. Daarbij wordt een score bepaald, samen met de sensitiviteit en de
specificiteit van de voorspelling. De sensitiviteit wordt gedefinieerd als de probabiliteit dat
een pathogene mutatie correct zal worden geclassificeerd en de specificiteit wordt
gedefinieerd als de probabiliteit dat een niet-pathogene mutatie correct zal worden
geclassificeerd [42]. Een vaak voorkomend probleem bij SIFT is dat de alignering
onvoldoende niet-verwante sequenties bevat en dat er dus te weinig diversiteit tussen de
sequenties is om een betrouwbare voorspelling te doen [41], wat bij deze twee substituties het
geval is. Bij substitutie c.1688G>A zijn er slechts 11 sequenties waarop SIFT zijn
voorspelling baseert en bij substitutie c.2558G>A zijn het er 12. Door het gebrek aan
diversiteit tussen de sequenties geeft SIFT een waarschuwing dat er een lage confidentie ligt
in beide voorspellingen. Polyphen-2 voorspelt de substituties als benign en dit met een vrij
46
hoge sensitiviteit (90% voor c.1688G>A en 86% voor c.2558G>A) en een vrij hoge
specificiteit (89% voor c.1688G>A en 77% voor c.2558G>A). Dit stemt overeen met de
voorspelling van de Grantham score die lager is dan 60 (respectievelijk 26 en 43) waarbij de
substituties worden beschouwd als tolerant. Aangezien SIFT als voorspelling tolerated geeft,
hoewel met lage confidentie, Polyphen-2 vrij hoge sensitiviteits- en specificiteitsscores
genereert en de Grantham score laag is, zijn de substituties waarschijnlijk niet
verantwoordelijk voor de mentale retardatie.
Sommige varianten (c.1189G>T, c.1444T>C en c.2339C>T) worden door SIFT en Polyphen-
2 voorspeld als tolerant, maar door de Grantham score als intolerant (score >60). Dit kan
doordat de Grantham score enkel een maat is voor de fysicochemische afstand tussen twee
aminozuren, gebaseerd op de compositie, de polariteit en het volume van de aminozuren [48].
Bij alle drie de varianten geeft SIFT aan dat er voldoende niet-verwante sequenties zijn om
een correcte voorspelling te doen. De sensitiviteit van de voorspelling gemaakt door
Polyphen-2 is hoog voor deze varianten (respectievelijk 99%, 98% en 84%), maar de
specificiteit is laag bij varianten c.1189G>T en c.1444T>C (18% en 26%) en hoog voor
variant c.2339C>T (70%). Aangezien het niet duidelijk is welke voorspelling als correct kan
aanschouwd worden, kan er niet besloten worden of deze substituties al dan niet pathogeen
zijn.
Het is aangetoond met de bovenstaande voorbeelden dat het aangewezen is om met
verschillende criteria rekening te houden en niet volledig te steunen op de voorspellingen van
SIFT en Polyphen-2. Het percentage aan vals negatieven, de hoeveelheid aan niet-neutrale
substituties die voorspeld worden als tolerant, is namelijk vrij hoog: 31% voor beide. Dit heeft
als gevolg dat de sensitiviteit en de specificiteit van de programma’s ook vrij laag liggen.
Flanagan et al hebben dit onderzocht voor een set van 141 missense varianten. Daaruit bleek
dat SIFT en Polyphen accurater waren in het voorspellen van loss-of function mutaties in
tegenstelling tot gain-of-function mutaties. In deze studie was de sensitiviteit (= percentage
echte positieven) van SIFT en Polyphen respectievelijk 69% en 68%. De specificiteit (=
percentage echte negatieven) was iets hoger, namelijk 75% en 100% [47]. Deze programma’s
zijn dus niet volledig correct voorspellend en moeten met de nodige voorzichtigheid worden
gebruikt.
47
4.1.1.1.1 c.1273G>A
In exon 10 werd een heterozygote mutatie gedetecteerd waarbij op eiwitpositie 425
asparagine ingebouwd wordt in plaats van asparaginezuur. De chemische structuren van deze
aminozuren zijn voorgesteld in (Figuur 23).
Figuur 23: Chemische structuur van asparaginezuur en asparagine. Aangepast van [49].
Asparaginezuur bevat een negatief geladen zure zijketen en asparagine een ongeladen
hydrofiele zijketen. Beide aminozuren zijn gelijkaardig in structuur en dit vertaalt zich in een
Grantham score van 23. Deze waarde is beduidend lager dan 60, waardoor de substitutie als
tolerant wordt beschouwd [48].
SIFT voorspelt dat de substitutie een invloed heeft op de functie van het eiwit (deleterious),
met een score van 0,00. Als deze score kleiner is dan 0,05 wordt er voorspeld dat de
substitutie intolerant is. Deze score wordt waarschijnlijk bekomen doordat een asparaginezuur
voorkomt op die positie in elke bestudeerde sequentie en er dus een hoge conservatie van dat
aminozuur op die positie is. De mediaan van de conservatie van de sequenties bedraagt 4,32,
wat de hoogst mogelijke score is. Als deze waarde groter is dan 3,25 betekent dit dat er te
weinig diversiteit tussen de gealigneerde sequenties is. Daardoor heeft deze voorspelling een
lage confidentie meegekregen door SIFT. Er werden 13 sequenties opgenomen in deze
alignering, wat ook niet erg veel is [41].
Polyphen-2 voorspelt dat deze substitutie hoogstwaarschijnlijk pathogeen is (score: 0,998),
met een sensitiviteit van 18% en een specificiteit van 98%. Dit wordt eveneens bekomen
doordat een asparaginezuur voorkomt op die plaats in elke sequentie die Polyphen-2
aanwendt. Over de 3D-structuur is geen informatie beschikbaar.
De voorspellingen van SIFT/Polyphen-2 en de Grantham score blijken tegenstrijdig te zijn.
Ondanks het feit dat de meerderheid van de predictieprogramma’s voorspellen dat de
Asparaginezuur Asparagine
48
substitutie waarschijnlijk pathogeen is, kan dit niet aangenomen worden. Dit omwille van
verschillende redenen: (1) de fysicochemische eigenschappen van asparaginezuur en
asparagine zijn sterk gelijkend, (2) de regio waarin de substitutie gelegen is maakt geen deel
uit van een belangrijk functioneel domein van MYT1L, zodat geen domeinen aangetast zijn,
(3) de voorspelling van SIFT heeft een lage confidentie door het onvoldoende aantal niet-
verwante sequenties en (4) de sensitiviteit van Polyphen-2 is in dit geval te laag om een
correcte uitspraak te doen.
Segregatie onderzoek van beide ouders zou kunnen aantonen dat de mutatie al dan niet de
novo is ontstaan en zou verder uitsluitsel kunnen geven.
4.1.1.2 Synonieme mutaties
Bij synonieme substituties verandert de eiwitsequentie niet. Daarom wordt er doorgaans
aangenomen dat deze veranderingen geen effect zullen hebben op het eiwit en wordt er verder
geen aandacht meer aan besteed.
De laatste jaren echter is er meer onderzoek naar deze substituties gebeurd en daaruit blijkt
dat synonieme mutaties veranderingen in de expressie, de structuur en de functie van een
proteïne kunnen veroorzaken [50]. Er zijn reeds verschillende aandoeningen beschreven
waarbij synonieme mutaties causaal bleken te zijn voor de ziekte. In X-gebonden mentale
retardatie werd een synonieme c.605C>A mutatie (p.R192R) in het HSD17B10 gen ontdekt
wat de causale mutatie bleek te zijn [51].
Er zijn verschillende hypotheses over hoe een synonieme substitutie aanleiding kan geven tot
een aandoening. Zo kan een synonieme substitutie optreden in een ESE sequentie, waardoor
het splicing mechanisme verstoord wordt. Een andere hypothese is dat een synonieme mutatie
de bindingsplaats van een miRNA verandert. Het kan ook een invloed hebben op de
hoeveelheid proteïne wat bepaald wordt door transcriptie en translatie. Zo kan een synonieme
verandering resulteren in een minder stabiele secundaire mRNA structuur, waardoor een
verhoogde degradatie optreedt van dat mRNA en met lagere proteïne levels tot gevolg.
Wanneer echter een meer stabiele structuur nabij het startcodon ontstaat (lokaal), zal dit de
initiatie van translatie verhinderen en leiden tot een gereduceerde proteïne expressie.
Synonieme mutaties kunnen ook de snelheid van translatie beïnvloeden en een verkeerde
49
opvouwing van het eiwit veroorzaken (verandering in de 3D-structuur), wat dan weer
aanleiding geeft tot een aggregatie van het proteïne [50].
Door het feit dat er reeds synonieme substituties gevonden zijn die aanleiding geven tot ziekte
(o.a. in mentale retardatie) en aangezien deze in vele mechanismen een rol kunnen spelen, kan
er niet zomaar besloten worden dat een synonieme mutatie geen effect heeft op het eiwit en
dus niet causaal is.
Bij de gedetecteerde synonieme substituties in het MYT1L gen werd nagegaan of deze
aanleiding kunnen geven tot veranderingen in een ESE site. Daarvoor werden de
predictieprogramma’s ESEFinder en RESCUE-ESE uit Alamut gebruikt. Substitutie
c.1089A>G heeft geen invloed op een ESE, substituties c.273C>T, c.411G>A, c.423C>T,
c.1086G> T, c.1230C>T, c.1854C>A, c.1947C>T en c.2514T>C veroorzaken het verlies van
een ESE en substituties c.405C>T en c.3399C>A creëren een nieuwe ESE. Aangezien nog
niets geweten is over de betrouwbaarheid van deze programma’s en verder onderzoek
betreffende de invloed van het verdwijnen of creëren van een ESE zeker nog nodig is, kan er
nog geen uitsluitsel gegeven worden over de causaliteit van deze synonieme substituties in het
MYT1L gen.
4.1.2 Intronische mutaties
Varianten c.2278-29G>T en c.2852+58T>C blijken door de meerderheid van de
predictieprogramma’s geen aanleiding te geven tot een aberrante splicing van het betreffende
intron. Vervolgens kan besloten worden dat deze substituties waarschijnlijk niet
verantwoordelijk zijn voor de aanwezigheid van de ziekte.
4.1.2.1 c.55+56G>A
In silico onderzoek van de c.55+56G>A variant gaf aan dat deze mutatie mogelijks aanleiding
geeft tot het ontstaan van een 3’ acceptor splice site (substitutie van GG naar AG). Bij de
normale splicing van een intron herkent het spliceosoom complex intronen met GT aan de
5’splice site en AG aan de 3’ splice site. De predictieprogramma’s berekenen de kans dat er
op een bepaalde plaats in het intron een donor (5’) of acceptor (3’) kan gelegen zijn [40].
Intron 6 is 168 basenparen lang. In Alamut kan gezien worden dat de scores van een andere
mogelijke 3’ acceptor splice site, meer afwaarts gelegen ter hoogte van de exon-intron boord
50
op positie c.56-1 en -2, iets hoger zijn dan de scores van de bovenstaande mogelijke 3’
acceptor splice site (Figuur 24). Dit wil dus zeggen dat de kans dat de 3’ splice site ter hoogte
van de exon-intron boord als acceptor gekozen wordt door het spliceosoom hoger is dan de
kans dat de 3’ splice site die 111 basen ervoor gelegen is wordt gekozen.
Figuur 24: Voorstelling intron 6 met scores van splicing predictieprogramma’s van nieuwe 3’ acceptor
splice site (c.55+56 en +57, groene pijl) en oorspronkelijke 3’ acceptor splice site (c.56-1 en -2, oranje pijl).
De probabiliteit dat de nucleotiden op een bepaalde plaats zullen dienen als 3’ acceptor splice site zijn
weergegeven als een score.
Van één van de twee patiënten met deze mutatie was er intern DNA aanwezig van de ouders,
waardoor kon geconfirmeerd worden of deze mutatie al dan niet de novo ontstaan is. Na
sequenering bleek dat de vader ook drager was van de intronische mutatie. Deze argumenten
in rekening gehouden kan er dus geconcludeerd worden dat deze intronische mutatie
hoogstwaarschijnlijk niet pathogeen is.
4.1.3 Unclassified variants
Voor de meeste varianten is het dus niet direct duidelijk of het een pathogene mutatie dan wel
een polymorfisme betreft, waardoor ze in de groep unclassified variants kunnen worden
geclassificeerd.
Het feit dat er geen varianten gedetecteerd zijn met een duidelijke klinische betekenis kan op
verschillende manieren worden verklaard. Met behulp van arrayCGH en internationale
samenwerking werden 9 patiënten geïdentificeerd met een deletie die het MYT1L gen omvatte
(paragraaf 1.2). Deze patiënten hadden enkel een milde tot matige mentale beperking, zonder
51
tekenen van andere congenitale afwijkingen. Bij de mutatiescanning van het MYT1L gen werd
een zo groot mogelijke patiëntenpopulatie geselecteerd om de kans op het vinden van een
mutatie te vergroten. Bij deze populatie zaten ook patiënten met syndromale vormen van
mentale retardatie. Dit kan een reden zijn waarom geen duidelijke pathogene mutaties
gedetecteerd zijn, aangezien varianten in het MYT1L gen misschien alleen voorkomen bij
patiënten met uitsluitend een mentale beperking.
Daarnaast is de kans op het vinden van een mutatie in een nieuw kandidaatgen voor mentale
retardatie zeer klein. Er zijn reeds honderden genen geïdentificeerd in patiënten met X-
gebonden, autosomaal-recessieve of syndromale vormen van mentale retardatie. Deze
behoren tot de 28% van de reeds gekende genetische oorzaak van een mentale beperking.
Voor 56% van de patiënten kon tot heden nog geen onderliggende oorzaak geïdentificeerd
worden, maar wordt ook een genetische afwijking vermoed [9]. Zo kan er aangenomen
worden dat er nog honderden ongekende genen betrokken zijn bij mentale retardatie en dat
een afwijking in elk gen slechts voorkomt bij een zeer laag percentage patiënten. Bovendien
is het moeilijk om een mutatie te detecteren in een sporadische geval van mentale retardatie.
Hoyer et al. [52] stelden dit ook vast. Zij vonden een microdeletie in een patiënt met een
ernstige mentale beperking via arrayCGH. In de gedeleteerde regio was het ARID1B gen
gelegen. Vervolgens voerden ze een mutatie analyse uit in 887 patiënten met een tot nu toe
onverklaarbare oorzaak van mentale retardatie. In deze populatie vonden ze acht bijkomende
nonsense en frameshift mutaties, wat slecht 0,9% van de onderzochte patiënten is. Hetzelfde
kon vastgesteld worden bij een andere onderzoeksgroep [53] die een mutatiescanning heeft
uitgevoerd in het MEF2C gen bij 428 patiënten met het Rett-syndroom. In slechts één patiënt
werd een deletie teruggevonden dat een deel van het MEF2C gen deleteert. Tot nu toe zijn er
nog maar 25 MEF2C-positieve patiënten gedetecteerd.
Hieruit kan besloten worden dat er slechts zeldzaam mutaties gevonden worden in genen
waarvan men vermoedt dat ze betrokken zijn in mentale retardatie en is het dus niet
verwonderlijk dat wij geen varianten konden detecteren met een duidelijke klinische
betekenis. Het is dus belangrijk om nog meer patiënten te onderzoeken waarbij de
patiëntenpopulatie goed geselecteerd wordt (i.e. patiënten met enkel mild tot matige mentale
retardatie).
52
4.2 Functionele studie
Uit de resultaten van het onderzoek bleek dat er zowel bij de NGP, SMS-KAN als SMS-
KCNR cellijn onvoldoende knock-down was van MYT1L expressie voor verder functioneel
onderzoek. Bij de SH-SY 5Y cellijn was er een duidelijke knock-down te zien, maar dit was
nog steeds minder dan de 80-90% waarop gemikt werd. Daarom werd er ook besloten om hier
niet mee verder te werken.
Neuroblastoma cellijnen en zelf meer algemeen, neuronale cellijnen zijn moeilijk te
transfecteren [54]. Vaak wordt eerst geprobeerd om een knock-down te induceren via
transfectie van een siRNA, omdat een siRNA vrij makkelijk en snel te maken is, omdat het
eenvoudig kan geïntroduceerd worden in de cel, omdat er minder kans is op niet-specifieke
effecten en omwille van de kostprijs. Daarentegen zijn er ook een aantal nadelen: (1) het heeft
een lage efficiëntie, voornamelijk in moeilijk transfecteerbare cellijnen, (2) een siRNA heeft
slechts een transiënt effect en (3) als de cellen delen dan deelt het siRNA niet mee en blijft het
maar in één van de twee cellen aanwezig, waardoor er een verdunningseffect optreedt en de
concentratie zal dalen [55]. Deze nadelen van een siRNA en het feit dat neuroblastoma
cellijnen moeilijk te transfecteren zijn kunnen verklaren hoe het komt dat een siRNA in dit
onderzoek geen aanleiding geeft tot voldoende knock-down van MYT1L.
De volgende stap is meestal virale transductie van een shRNA. Deze techniek heeft als
grootste voordeel dat het shRNA integreert in het gastheergenoom, waardoor ze veel stabieler
zijn dan siRNA. Daarnaast is met een shRNA 100% neerregulatie mogelijk en is er een
efficiënte virale aflevering voor moeilijk te transfecteren cellijnen. Een shRNA heeft
natuurlijk ook een aantal belangrijke nadelen: de preparatie van de virale partikels neemt meer
tijd in beslag en er kunnen virus-gemedieerde toxische effecten optreden [55]. Bovendien
moet er voor bepaalde virale packaging systemen (second en third generation systemen) in
een veiliger laboratorium gewerkt worden. Voor transfectie kan een L2 laboratorium gebruikt
worden, vanaf third generation systemen (4 vectoren) is minstens een L2+ laboratorium
nodig en voor second generation systemen (3 vectoren) is een L3 laboratorium vereist.
Aangezien de siRNA resultaten in dit onderzoek niet voldoende zijn voor verder functioneel
onderzoek, zal er overgeschakeld worden op lentivirale transductie van shRNA constructen.
53
5 Algemene conclusie
5.1 Besluit
De combinatie van High-Resolution Melting als pre-screening methode en Sanger
sequenering zijn geschikte methoden voor de mutatiescanning van het MYT1L gen. Het
gebruik van ongelabelde probes voor HRM, gericht tegen de meest voorkomende SNPs,
leidde tot een verhoging van de efficiëntie. Bovenstaande technieken zijn toegepast in een
populatie van 1152 patiënten met idiopathische mentale retardatie. In een aantal patiënten
werd een missense, synonieme of intronische substitutie gedetecteerd in verschillende exonen
van het gen. Het is echter nog niet volledig duidelijk wat het belang is van deze substituties en
of deze verantwoordelijk zijn voor de mentale retardatie in de patiënten.
Om de functie van het MYT1L proteïne in de ontwikkeling van de hersenen te achterhalen,
werd geprobeerd om dit gen neer te reguleren in verschillende neuroblastoma cellijnen.
Transfectie van een siRNA blijkt hiervoor niet de geschikte methode te zijn, aangezien er niet
voldoende knock-down wordt geïnduceerd voor verder functioneel onderzoek.
5.2 Toekomstperspectieven
Detectie van mutaties in het MYT1L gen bij meer patiënten met milde of matige mentale
retardatie zou op dezelfde manier makkelijk kunnen uitgevoerd worden, aangezien de
methoden reeds geoptimaliseerd zijn voor alle exonen. Samen met een goede geselecteerde
patiëntenpopulatie zou dit belangrijk kunnen zijn om uiteindelijk personen te identificeren
met een duidelijke pathogene mutatie in het MYT1L gen.
Bij de functionele studie zal getracht worden in een volgende stap voldoende knock-down van
de MYT1L expressie te induceren via lentivirale transductie van een shRNA. Indien dit wordt
bereikt, zal met behulp van expressie arrays nagegaan worden welke genen minder of meer tot
expressie komen, om een aanwijzing te krijgen welke genen betrokken zijn in dezelfde
pathway. Er zal eveneens een functionele karakterisatie van de neuronen worden uitgevoerd.
Daarbij zal het effect van de knock-down op de groei, viabiliteit, migratie, differentiatie, enz.
van de cellen worden nagekeken.
54
Referentielijst
1. IQ test labs (2011). http://www.intelligencetest.com/report/information.htm#definition.
2. Verdeling IQ score (2011). http://pharosnl.nl/menu/hoogbegaafd-nieuws/hoogbegaafdheid-artikelen/iq/.
3. AAIDD (2010). Definition of Intellectual Disability.
http://www.aamr.org/intellectualdisabilitybook/content_7473.cfm?navID=366.
4. World Health Organisation (2011). International Classification of Diseases.
http://www.who.int/classifications/icd/en/.
5. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (2011).
6. AAIDD (2011). Support Intensity Scale. http://www.siswebsite.org/.
7. Matson JL (2007) Handbook of Assessment in Person With Intellectual Disability, Volume 34. 462
8. Stevenson RE, Procopio-Allen AM, Schroer RJ, Collins JS (2003) Genetic syndromes among
individuals with mental retardation. American journal of medical genetics Part A 123A(1):29-32
9. Winnepenninckx B, Rooms L, Kooy RF (2003) MENTAL RETARDATION : A REVIEW OF THE
GENETIC CAUSES. 49(96):29-44
10. The Arc (2011). Causes and Prevention of Mental Retardation.
www.thearc.org/Document.Doc?&id=147.
11. Matthews a L (1999) Chromosomal abnormalities: trisomy 18, trisomy 13, deletions, and
microdeletions. The Journal of perinatal & neonatal nursing 13(2):59-75; quiz 103-4
12. Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM®. Johns Hopkins University, Baltimore, MD. MIM
Number: 190685: 7/7/2011: . World Wide Web URL: http://omim.org/.
13. Raymond FL, Tarpey P (2006) The genetics of mental retardation. Human molecular genetics 15 Spec
No(2):R110-6
14. Shaffer L, Lupski J (2000) Molecular mechanisms for constitutional chromosomal rearrangements in
humans. Annual Review of Genetics 297-329
15. Rao DC, Gu CC (2008) Genetic dissection of complex traits. 731
16. Wang T, Zeng Z, Li T, et al (2010) Common SNPs in myelin transcription factor 1-like (MYT1L):
association with major depressive disorder in the Chinese Han population. PloS one 5(10):e13662
17. Kim JG, Armstrong RC, v Agoston D, Robinsky A, Wiese C, Nagle J, Hudson LD (1997) Myelin
transcription factor 1 (Myt1) of the oligodendrocyte lineage, along with a closely related CCHC zinc
finger, is expressed in developing neurons in the mammalian central nervous system. Journal of
neuroscience research 50(2):272-90
18. Jiang Y, Yu VC, Buchholz F, O’Connell S, Rhodes SJ, Candeloro C, Xia YR, Lusis a J, Rosenfeld MG
(1996) A novel family of Cys-Cys, His-Cys zinc finger transcription factors expressed in developing
nervous system and pituitary gland. The Journal of biological chemistry 271(18):10723-30
55
19. Stevens SJC, van Ravenswaaij-Arts CM a, Janssen JWH, et al (2011) MYT1L is a candidate gene for
intellectual disability in patients with 2p25.3 (2pter) deletions. American journal of medical genetics Part
A 155(11):2739-45
20. BioGPS (2011). http://biogps.org/.
21. Romm E, Nielsen J a, Kim JG, Hudson LD (2005) Myt1 family recruits histone deacetylase to regulate
neural transcription. Journal of neurochemistry 93(6):1444-53
22. Llorens F, Gil V, Iraola S, Carim-Todd L, Martí E, Estivill X, Soriano E, del Rio JA, Sumoy L (2008)
Developmental analysis of Lingo-1/Lern1 protein expression in the mouse brain: interaction of its
intracellular domain with Myt1l. Developmental neurobiology 68(4):521-41
23. Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Südhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of
fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463(7284):1035-41
24. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, et al (2011) Induction of human neuronal cells by defined transcription
factors. Nature 1-6
25. Yoo AS, Sun AX, Li L, Shcheglovitov A, Portmann T, Li Y, Lee-Messer C, Dolmetsch RE, Tsien RW,
Crabtree GR (2011) MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature 3-7
26. Nielsen J a, Berndt JA, Hudson LD, Armstrong RC (2004) Myelin transcription factor 1 (Myt1)
modulates the proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells. Molecular and cellular
neurosciences 25(1):111-23
27. Wang S, Zhang J, Zhao A, Hipkens S, Magnuson M a, Gu G (2007) Loss of Myt1 function partially
compromises endocrine islet cell differentiation and pancreatic physiological function in the mouse.
Mechanisms of development 124(11-12):898-910
28. Kroepfl T, Petek E, Schwarzbraun T, Kroisel PM, Plecko B (2008) Mental retardation in a girl with a
subtelomeric deletion on chromosome 20q and complete deletion of the myelin transcription factor 1
gene (MYT1). Clinical genetics 73(5):492-5
29. Vrijenhoek T, Buizer-Voskamp JE, Van Der Stelt I, Strengman E, others (2008) Recurrent CNVs disrupt
three candidate genes in schizophrenia patients. The American Journal of Human Genetics 83(4):504–
510
30. Li W, Wang X, Zhao J, et al (2011) Association study of myelin transcription factor 1-like
polymorphisms with schizophrenia in Han Chinese population. Genes, brain, and behavior 1-7
31. Anderson P (2011) PCR: Uses, Steps, Purpose. http://schoolworkhelper.net.
32. Labchip GX (Calliper Lifesciences 2012 ). http://www.caliperls.com/products/labchip-systems/labchip-
gx.htm.
33. Vossen RH a M, Aten E, Roos A, den Dunnen JT (2009) High-resolution melting analysis (HRMA):
more than just sequence variant screening. Human mutation 30(6):860-6
34. Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Pryor RJ (2003) High-resolution genotyping by
amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical chemistry 49(6 Pt 1):853-60
35. Introduction to High Resolution Melt Analysis (KAPA Biosystems).
36. A Guide to High Resolution Melting ( HRM ) Analysis (Applied Biosystems).
56
37. Claes K (2011) Cursus Universiteit Gent: Genetische Diagnostiek, Mutatie detectie en -strategieën. Slide
79-81; 99-107
38. Lodish H, Berk A, Kaiser C, Krieger M, Scott M, Bretscher A, Ploegh H, Matsudaira P (2008)
Molecular Cell Biology: 6th edition. 1150
39. DNA sequencing - The Sanger method (Animatie, 2012). http://www.wellcome.ac.uk/Education-
resources/Teaching-and-education/Animations/DNA/WTDV026689.htm.
40. Alamut Documentation (2012). http://www.interactive-biosoftware.com/alamut/doc/2.0/.
41. SIFT Help (2012). http://sift.jcvi.org/www/SIFT_help.html.
42. Polyphen-2 Wiki (2012). http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/dokuwiki/start.
43. (2007) miRNeasy Mini Handbook (Qiagen).
44. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH (2005) Basic principles of real-
time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics 5(2):209-19
45. Biogazelle qPCR analysis (2012). http://www.biogazelle.com/course/4_qPCR_analysis.pdf.
46. Felekkis K, Touvana E, Stefanou C, Deltas C (2010) microRNAs: a newly described class of encoded
molecules that play a role in health and disease. Hippokratia 14(4):236-40
47. Flanagan SE, Patch A-M, Ellard S (2010) Using SIFT and PolyPhen to predict loss-of-function and gain-
of-function mutations. Genetic testing and molecular biomarkers 14(4):533-7
48. Grantham R (1974) Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science
185(4154):862-864
49. Amino acids (2012). http://www.geneinfinity.org/images/aminoacids.jpg.
50. Sauna ZE, Kimchi-Sarfaty C (2011) Understanding the contribution of synonymous mutations to human
disease. Nature reviews Genetics 12(10):683-91
51. Yang S-Y, He X-Y, Olpin SE, Sutton VR, McMenamin J, Philipp M, Denman RB, Malik M (2009)
Mental retardation linked to mutations in the HSD17B10 gene interfering with neurosteroid and
isoleucine metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 106(35):14820-4
52. Hoyer J, Ekici AB, Endele S, et al (2012) Haploinsufficiency of ARID1B, a Member of the SWI/SNF-A
Chromatin-Remodeling Complex, Is a Frequent Cause of Intellectual Disability. American journal of
human genetics 90(3):565-572
53. Lambert L, Bienvenu T, Allou L, et al (2012) MEF2C mutations are a rare cause of Rett or severe Rett-
like encephalopathies. Clinical genetics 5-7
54. Karra D, Dahm R (2010) Transfection techniques for neuronal cells. The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience 30(18):6171-7
55. Campeau E, Gobeil S (2011) RNA interference in mammals: behind the screen. Briefings in functional
genomics 10(4):215-26
i
Bijlagen
Bijlage 1: MYT1L primers
Exon Forward (F) primer
6 CACGACGTTGTAAAACGACagcacattgatggctgctaa
7 CACGACGTTGTAAAACGACactttcatgccacccttttg
8 CACGACGTTGTAAAACGACgaagctttccgtctcacctg
9a CACGACGTTGTAAAACGACctctctctcccctgccttct
9b CACGACGTTGTAAAACGACCAAGATAAACAGCCCCAGGA
10a CACGACGTTGTAAAACGACagacggtttgacttgcagtt
10b CACGACGTTGTAAAACGACGAACTGGTGGCCAAGTCATT
10c CACGACGTTGTAAAACGACACAGCATGTCGCAGCAAG
10d CACGACGTTGTAAAACGACACTCGGACATGCTGAACCTC
11 CACGACGTTGTAAAACGACtcacatttgtctttgattggtaaa
12 CACGACGTTGTAAAACGACggcctttgttaaatgactgcat
13 CACGACGTTGTAAAACGACtgctgtgaaggtgtttgagg
14 CACGACGTTGTAAAACGACtttaatgtgaagctcgtcgtgt
15 CACGACGTTGTAAAACGACgcctgagtcatccctgtcc
16 CACGACGTTGTAAAACGACatctgggaggaaggactcgt
17 CACGACGTTGTAAAACGACtcagtctgtgtgccatgtga
18 CACGACGTTGTAAAACGACcgaaccgattcagaattaattacac
19 CACGACGTTGTAAAACGACgctccactcagcctctttca
20 CACGACGTTGTAAAACGACggggtgctttctgaaatgtg
21 CACGACGTTGTAAAACGACacggtggccagacaataaag
22 CACGACGTTGTAAAACGACgccttgcttaccaccacttc
23 CACGACGTTGTAAAACGACggaacaaagaaagctcccaaa
24 CACGACGTTGTAAAACGACtcctaggtcctcctggtgtt
25 CACGACGTTGTAAAACGACaccaggggcactatgctatg
3' UTR CACGACGTTGTAAAACGACCGTGACTACTTTGACGGAAATG
ii
Exon Reverse (R) primer
6 CAGGAAACAGCTATGACCcaaaagggtggcatgaaagt
7 CAGGAAACAGCTATGACCtgcagtgtgcccattagaag
8 CAGGAAACAGCTATGACCtgctcacacagttcatcatcag
9a CAGGAAACAGCTATGACCTCGTCCTCCTCGTCCTCA
9b CAGGAAACAGCTATGACCtgaacagtggacccaaatca
10a CAGGAAACAGCTATGACCGGGAGTCCACTGTTTCTCTAACA
10b CAGGAAACAGCTATGACCACACACCTCCTCATCGCTCT
10c CAGGAAACAGCTATGACCTGTCCGAGTTCACAGAGGTG
10d CAGGAAACAGCTATGACCtcatgttttcatgaggcaactt
11 CAGGAAACAGCTATGACCagagtcatgggtgtttgcac
12 CAGGAAACAGCTATGACCcccccaggaaggagaagg
13 CAGGAAACAGCTATGACCgtgtggggcagactatggat
14 CAGGAAACAGCTATGACCaccaccaccgctcaactaat
15 CAGGAAACAGCTATGACCcatacagctgccccgaaag
16 CAGGAAACAGCTATGACCtgcaaatggcttttctttca
17 CAGGAAACAGCTATGACCtcagccaaagaatgggaaga
18 CAGGAAACAGCTATGACCggctgaaattccgaggattc
19 CAGGAAACAGCTATGACCcctgccatttcagtgagaaa
20 CAGGAAACAGCTATGACCcccgctgtctctttttcttg
21 CAGGAAACAGCTATGACCaacacaggtgacgggagaag
22 CAGGAAACAGCTATGACCgacacacagctggcatgg
23 CAGGAAACAGCTATGACCcagctctcctaaaagctgatttc
24 CAGGAAACAGCTATGACCtttaggctgtgcgctgtg
25 CAGGAAACAGCTATGACCAAGCATAACACTGTTTCAAATTCA
3' UTR CAGGAAACAGCTATGACCccaagtttccatggcttgat
iii
Bijlage 2: PCR producten
Kit 1: KAPATaq HotStart
KAPATaq HotStart PCR-kit (KapaBiosystems): Taq DNA polymerase, KAPA buffer
5x, MgCl2 25mM
Nuclease-vrij water (Sigma)
dNTPs 1mM (Invitrogen)
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Primers 5μM (Bijlage 1)
DNA-staal, 25ng/μl
Kit 2: KAPA HiFi HotStart
KAPA HiFi HotStart (KapaBiosystems): HiFi Hotstart DNA polymerase, KAPA HiFi
GC buffer 5x, dNTPs 10mM
Nuclease-vrij water (Sigma)
Primers 5μM (Bijlage 1)
DNA staal, 25ng/μl
Bijkomende benodigdheden wanneer na de PCR-reactie een HRM analyse uitgevoerd wordt:
LCGreen Plus Melting Dye (Idaho Technology Inc.)
Probe 5μM
iv
Bijlage 3: Samenstelling PCR-reactiemengsels
KAPATaq HotStart zonder probe
Benodigdheden Standaard
PCR (μl)
Standaard PCR
met 5% DMSO
(μl)
PCR voor
HRM (μl)
PCR voor HRM
met 3% DMSO
(μl)
KAPA buffer 5x 2 5 2 2
MgCl2 (25mM) 0,6 1,5 0,6 0,6
dNTPs (1mM) 2 5 2 2
Forward primer (5μM) 0,98 2,45 0,98 0,98
Reverse primer (5μM) 0,98 2,45 0,98 0,98
Taq DNA polymerase 0,13 0,325 0,13 0,13
LC Green 0 1 0,8 0,8
DMSO 0 1,25 0 0,3
H2O 1,31 1,025 0,51 0,21
DNA (25ng/μl) 2 5 2 2
Totaal 10 25 10 10
v
KAPATaq HotStart met probe
Benodigdheden
PCR voor
HRM: 2 probes
tov sense
streng (μl)
PCR voor
HRM: probe
tov sense
streng (μl)
PCR voor
HRM : probe
tov antisense
streng (μl)
PCR voor
HRM : probe
tov antisense +
3%DMSO (μl)
KAPA buffer 5x 2 2 2 2
MgCl2 (25mM) 0,6 0,6 0,8 0,8
dNTPs (1mM) 2 2 2 2
Forward primer (5μM) 0,08 0,08 0,4 0,4
Reverse primer (5μM) 0,4 0,4 0,08 0,08
Taq DNA polymerase 0,13 0,13 0,13 0,13
LC Green 1 1 1 1
Probe 1 (5μM) 0,32 0,32 0,32 0,32
Probe 2 (5μM) 0,32 0 0 0
DMSO 0 0 0 0,3
H2O 1,15 1,47 1,27 0,97
DNA (25ng/μl) 2 2 2 2
Totaal 10 10 10 10
vi
KAPA HiFi HotStart
Benodigdheden Standaard PCR (µl) PCR voor HRM: probe
tov antisense streng (µl)
KAPA HiFi GC buffer 5x 5 5
dNTPs (10mM) 0,75 0,75
Forward primer (5μM) 1,5 1
Reverse primer (5μM) 1,5 0,2
HiFi Hotstart DNA
polymerase 0,5 0,5
LC Green 0 0,8
Probe (5µM) 0 0,8
H2O 11,75 11,95
DNA (25ng/μl) 4 4
Totaal 25 25
vii
Bijlage 4: PCR-protocols
TD 64-52-10
4 min op 94°C
20 sec op 94°C
15 sec op 64°C 12 cycli
1 min op 72°C
40 sec op 94°C
40 sec op 52°C 20 cycli
30 sec op 72°C
10 min op 72°C
10 min op 15°C
5 min op 95°C
10 min op 20°C
TD 64-52-30
4 min op 94°C
20 sec op 94°C
15 sec op 64°C 12 cycli
1 min op 72°C
40 sec op 94°C
40 sec op 52°C 30 cycli
30 sec op 72°C
10 min op 72°C
10 min op 15°C
5 min op 95°C
10 min op 20°C
viii
TD 66-54
2 min op 96°C
20 sec op 96°C
15 sec op 66°C 12 cycli
1 min op 72°C
40 sec op 96°C
40 sec op 54°C 25 cycli
30 sec op 72°C
10 min op 72°C
10 min op 15°C
5 min op 95°C
10 min op 20°C
TD 60-50-60
30 sec op 95°C
30 sec op 95°C
30 sec op 60°C 55 cycli
30 sec op 72°C
30 min op 98°C
5 min op 20°C
G5565U59
30 sec op 95°C
30 sec op 95°C
30 sec op 59°C 55 cycli
30 sec op 72°C
30 min op 98°C
ix
5 min op 20°C
G5565U65
30 sec op 95°C
30 sec op 95°C
30 sec op 65°C 55 cycli
30 sec op 72°C
30 min op 98°C
5 min op 20°C
T6777U67
30 sec op 95°C
30 sec op 95°C
30 sec op 67°C 55 cycli
30 sec op 72°C
30 min op 98°C
5 min op 20°C
Kapa Hifi 70-55 (K7055H69)
3 min op 95°C
30 sec op 95°C
30 sec op 69,2°C 55 cycli
1 min op 72°C
1 min op 72°C
x
STS56
5 min op 92°C
1 min op 92°C
1 min op 56°C 35 cycli
1 min op 72°C
10 min op 72°C
10 min op 15°C
STS58
5 min op 92°C
1 min op 92°C
1 min op 58°C 35 cycli
1 min op 72°C
10 min op 72°C
10 min op 15°C
xi
Bijlage 5: Samenstelling reactiemengsel en PCR-protocol
Exon Samenstelling reactiemengsel (Bijlage 3)PCR protocol
(Bijlage 4)
6 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 66-54
7 KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: 2 probes tov sense streng T605060
8 KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov sense streng G5565U59
9a KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov sense streng TD 64-52-30
9b KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov antisense streng + 3% DMSO G5565U65
10a KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
10b KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
10c KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
10d KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
11 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 66-54
12 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
13 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 66-54
14 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
15 KapaTaq Hotstart zonder probe: Standaard PCR met 5% DMSO STS58
16 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
17 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
18 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM met 3% DMSO STS56
19 KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov sense streng T6777U67
20 KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov antisense streng G5565U65
21 Kapa Hifi Hotstart: PCR voor HRM: probe tov antisense K7055H69
22 KapaTaq Hotstart met probe: PCR voor HRM: probe tov antisense streng + 3% DMSO G5565U65
23 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
24 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
25 KapaTaq Hotstart zonder probe: PCR voor HRM TD 64-52-10
3'UTR Kapa Hifi Hotstart: Standaard PCR K7055H69
xii
Bijlage 6: Resultaat transfectie van SH-SY 5Y met siRNA
Foto’s van cellen na 48 uur:
MYT1L siRNA
Non targeting control siRNA (negatieve controle)
xiii
PPIB siRNA (positieve control)
Blanco
xiv
Foto’s van cellen na 72 uur:
MYT1L siRNA
Non targeting control siRNA (negatieve controle)
xv
PPIB siRNA (positieve controle)
Blanco
