1

Module: MOLGEN2: DNA-analyseInhoud van deze module:1. Wat is er nu bekend?2. Wat kan je analyseren3. Hoe kan je dat analyseren?4. Analysetechnieken (overzichtje)

a. DNA-isolatieb. DNA-amplicficatie: PCRc. Amplicon-detectie: gelectroforese

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

2

Bekend:1. De DNA-volgorde van slechts enkele

soorten (Mens, fruitvlieg, kip, koe, worm etc)

2. Van veel soorten is slechts een klein deel bekend

3. Van productiegewassen en dieren is inmiddels het gehele genoom wel bekend.(Financieel belang)

4. Het kennen van de DNA-volgorde wil niet zeggen dat je de genen kent!!!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

3

Tools:1. Genbanken zoals ncbi: http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore2. DNA-tools voor het maken van zogenaamde

primers(straks meer)

3. Blasts: het opzoeken of stukken DNA-volgorde ergens in het genoom voorkomen.Hiermee wordt verwantschapsanalyse tussen soorten gedaan

4. Merkers en microsatellieten: Hiermee worden vaderschaps-tests uitgevoerd. Voor een individue kenmerkende sequenties.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

4

FruitvliegNbci-database bevat genoom van veel organismen:• Fruitvlieg chromosoom 3L:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/113194865?report=graph&tracks=[key:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:false][key:gene_model_track,name:Genes,display_name:Genes,id:STD3,category:Genes,annots:Unnamed,Options:MergeAll,SNPs:false,CDSProductFeats:false,ShowLabelsForAllFeatures:false,HighlightMode:2]&appname=ncbientreznuccore&color=0&label=0&decor=0&spacing=0&v=8829531:8829583&c=00FF00&gflip=false&select=null

• Fruitvlieg vg: Chromosoom 2R:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/113194556?report=graph&tracks=[key:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:false][key:gene_model_track,name:Genes,display_name:Genes,id:STD3,category:Genes,annots:Unnamed,Options:MergeAll,SNPs:false,CDSProductFeats:false,ShowLabelsForAllFeatures:false,HighlightMode:2]&appname=ncbientreznuccore&color=0&label=0&decor=0&spacing=0&v=8767788:8781704&c=333333&gflip=false&select=gi|113194556-0085e3f9-00861144-0103-8ca27e44-ffea8d58

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

5

DNA-analyse.Hoe onderzoekt men of een gen er is?1. Je moet de sequentie van het gen kennen (uit eerder

onderzoek)2. Je moet een idee hebben wáár het zit.3. Je zoekt in de ncbi-database die plek op.

Bijvoorbeeld: Fruitvlieg: we weten dat kenmerk vestigalaanwezig is op chromosoom 2R.

4. We kiezen stukjes flankerende DNA-sequenties om de aanwezigheid van dit gen te vinden:

Nodig? De vermeerderings techniek> PCRPolymerase Chain Reaction.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

6

DNA-isolatieVoor dat je een organisme wil checken op de aanwezigheid van een gen, zal je:• Isolatie houdt in: DNA vrij maken uit een hoeveelheid

materiaal.• Als de onderzoeker nog meer analyses moet doen, moet het

DNA zuiver zijn, en vrij van blokkerende stoffen• Wij beperken ons tot het onderdompelen van een stukje

bladmateriaal in een bufferoplossing. Die maakt het celmembraan stuk en bevrijdt het DNA

• Bij lastige organismen (schimmels ed) moet je soms dik 30 stappen zetten om het DNA te bevrijden… Lastig,duur en tijdrovend.

• Gelukkig heeft de biochemische industrie overal ‘kits’ voor op de markt gebracht die veel werk verlichten.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

7

Analysetechnieken a. DNA-isolatieb. DNA-amplificatie: PCRc. Amplicon-detectie:

gelectroforese

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR MOLGEN2

8

PCRWat is PCR?• Staat voor Polymerase Chain Reaction• Ontwikkeld door de Amerikaan Karry Mullis

(1983). Nobelprijs gekregen.Wat doet PCR?• Gedeelte van het (deels) bekende genoom

vermeerderen (miljarden kopieen)• Toepassingen: snelle detectie van

ziekteverwekkers, genen, afwijkende DNAfragmenten etc.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

9

We zoeken het rode gen:..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG....TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC..We willen een techniek die alleen het rode gen doet verdubbelen en niet ál het DNA:..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG.. ------------AGTA CGCT-----------..TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC..

Leidt tot:..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG.. TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA CGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG..TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC..

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

10

En dat leidt tot:..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG.. TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA

CGCTTTCTCCTCGATCAGTCAT TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA

CGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG GCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA

CGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG..TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC..

Na 40 stappen heb je ca 2^40 van dit soort fragmenten.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

11

De Techniek.Deze methode verlangt een paar ingredienten:1. Er is maar heel weinig DNA nodig. 2. Aanwezige primers (stukjes DNA van

20 bp lang).3. Losse nucleotiden (een mengsel van

dNTP’s)4. DNA-polymerase (Hittebestendige

versie van het enzym dat nucleotiden aan het enkele DNA vasthecht)

5. Omgevingsfactoren (MgCl2) , Water ed.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

12

Hoe werkt het principe?• Bij hoge temperatuur smelten de DNA

strengen en raken uiteen (98 graden C)• Dan hechten zich korte apart vervaardigde

stukjes enkelstrengs DNA (zgn primers) (bij een bepaalde temp.

• Hierna koppelt DNApol er losse nucleotiden aan, en maakt de nieuwe strengen af.

• Deze drie stappen herhaal je 30-40x.• Tenslotte koelt het geheel weer af,en heb je

enorme hoeveelheid van gekopieerd fragment DNA.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

13

1a gewone dubbelstrengs DNA

1b DNA Smelt bij 98 graden

1c bij ca 50 graden hechten primers

1d bij 72 graden worden deze aangevuld met losse nucleotiden door enzym Taq-DNApolymerase(Taq -= Thermo aquatic)

2b Opnieuw smelt bij 98 graden

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

14

2c bij ca 50 graden hechten primers

2d Polymerase knoopt er opnieuw losse nucleotiden aan en verlengt de streng tot het einde. (Bij 72 graden)

3b Opnieuw smelt bij 98 graden voor ronde 3….Etc etc etc..

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

15

Wat valt op?• Elke ronde verdubbelt het

aantal korte fragmenten. Dus na 40 rondes heb je in principe 240 fragmenten.

• Het aantal grote strengen blijft gelijk

• Het aantal ‘halve’ strengen neemt elke stap lineair toe.

• Na 40 ronden is het aantal korte fragmenten dermate talrijk dat zij voor het blote oog kunnen worden aangetoond.

(Gel-electroforese).

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

16

Wat is de werkwijze in de praktijk?A) We moeten DNA zien te halen uit de cellen van

hetorganisme dat we onderzoeken. (plant)

B) Hiervan is maar heel weinig DNA nodigC) We voegen de ingredienten voor replicatie toe:

waterDNA-nucleotidenprimersTaq-DNA-polymerase (enzym)zouten ed.

D) Dit mengsel doorloopt een herhaald traject van temperaturen (98 graden, 50 graden, 72 graden).

E) Tenslotte is het mengsel verrijkt met korte fragmentjes.(Zó talrijk dat de rest nauwelijks meetelt..)

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

17

1. Epje 0.2 ml met verdunningsbuffer

2. Voeg 2 mm2 blad toe

3. Crush met pipetpunt4. Centrifugeer5. Neem supernatant

over in schoon epje6. Voeg toe:• Primers• dNTP’s, Mgcl2

mengsel• DNA polymerase• WaterEn dan….IN DE PCR!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

18

1. Verwarmd deksel2. Ruimte voor de

epjes (0.2 ml)96 stuks maximaal

3. Aparte instructie aanwezig.

4. Bedieningspaneel

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 PCR: Techne CYCLOGENE

1. Ruimte voor 96 epjes2. Verwarmd deksel voorkomt

verdamping.

19

Zorg dat je alles bij de hand hebt.1. Centrifuge2. Pipetten3. Puntjes4. Rekje voor epjes5. Chemicalien6. Handschoenen7. Stift8. Afvalvat9. Tissues10. Vortex/shaker

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

Dit type practicum EIST dat je je volledig voorbereid.

20

Electroforese• DNAfragmenten zijn negatief geladen en

zullen in een electrisch veld van MIN naar PLUS bewegen.

• De grootte van de fragmenten bepalen de migratiesnelheid. Grote langzaam, kleine snel!

• Methode: Men maakt een gel van agarose (soort zeewierextract)

• Hierin worden kuiltjes/welletjes aangebracht.• De hele gel gaat in een buffer, waarmee ook

de gel gemaakt is.• Na 1-2 uur ‘runnen’ zullen de diverse DNA

fragmenten zich scheiden op basis van hun grootte.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE

21Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE

Het ‘home-made’ electroforese-bakje.• De gel ligt verhoogd• Links en rechts

aansluitingen• Ernaast ligt het

kammetje dat wordt gebruikt om tijdens het stollen van de gel de kuiltjes (welletjes) te maken.

• In één welletje past ca 30 uL.

• Hiernaast de bak aangesloten op 100 volt.

• Deze gel is bijna halverwege: de kleuren verraden hoevér je bent.

22Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE

• Deze gel is bijna halverwege: de kleuren verraden hoevér je bent.

• Agar is niet geschikt. Te grof en de zaak wordt diffuus.

23Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE: het resultaat

Let op: de ruler 50bp, de helderheid van bandjes.

Welletjes

Ruler

bandje

24

Werkwijze in detail.

Het hele proces laat zich verdelen in drie etappes.1. DNA-isolatie uit moedermateriaal.

Voor dit practicum zijn dat bladeren van de aardappel

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

2. DNA-PCR techniek voor amplicons3. Gel-electroforese

25

Werkwijze in detail. DNA-ISOLATIE

• Het zuiver in handen krijgen van DNA is een lastige klus die veelal ingewikkelde chemicalien en handelingen vergt.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

• Er zijn ‘kits’ op de markt die dat proces a.h.w. met een kookboekrecept kunnen maken. Die werken prima maar zijn erg duur (vanaf 300-400 euro voor 50 reacties..)• Wij gebruiken de Phire-Plant PCR kit waarmee eenvoudige plantaardige samples kunnen worden behandeld. Nadeel: er komen veel vervuilingen mee en verdere analyse van het DNA kan dus niet.

26

Werkwijze in detail. DNA-ISOLATIE- 21. In een klein epje van 0.2 ml wordt 10 uL buffer

gedaan.2. Men snijdt op een objectglaasje met schone

scalpel een stukje blad/stengel af ter grootte van 1 x 2 mm.

3. Dit wordt erbij gegooid.4. Met een plastic pipetpunt wordt het materiaal

‘gecrusht.’. Het ziet nu groen van de chlorophyll.

5. 1 minuut centrifuge 10000-15000 rpm6. Overpipetteren van het schone supernatant in

een schone ep van 0,2 ml.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

Wat gebeurt er?Het DNA dat aan randen zit van het stukje blad is vrij gekomen en wordt door de centrifuge niet naar beneden gedrukt. De bladresten wel. De buffer lyseert enigszins ook de cellen, zodat er meer DNA kan vrijkomen.

27

Werkwijze in detail. PCR 11. Van het supernatant wordt maar 0,5 uL monster

genomen. (dat is érg weinig… maar genoeg!)2. Hierbij worden in volgorde toegevoegd:3. 0,4 uL primer A4. 0.4 uL primer B5. 10 ul PCR buffer (bevattende de dNTP’s, MgCl2

etc)6. 0.4 uL Taq-Polymerase.7. Aanvullen tot 20 uL vloeistof met water dat geen

dNase bevat (aquadest dat even gekookt heeft).Men heeft de concentraties zó gekozen dat de hoeveelheden passenbij de reacties. Elk epje bevat zo steeds 20 uL reactiemengsel.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

28

Werkwijze in detail. PCR 2Vervolgens:1. Instellen PCR apparaat op programma 202. Dit impliceert: • 1e ronde 10 min 98 graden• 2e ronde 10 sec 98 graden, 10 sec 52

graden, 30 sec 72 graden. • Stap twee nog 39 x herhalen.• 3e ronde: 5 minuten op 72 graden.

Laden epjes. PCRapparaat aan, heated lid ook aan, goeie programma selecteren en GO!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

29

Werkwijze in detail. PCR 3Vervolgens:1. Instellen PCR apparaat op programma 202. Dit impliceert: • 1e ronde 10 min 98 graden• 2e ronde 10 sec 98 graden, 10 sec 52

graden, 30 sec 72 graden. • Stap twee nog 39 x herhalen.• 3e ronde: 5 minuten op 72 graden.

Laden epjes. PCRapparaat aan, heated lid ook aan, goeie programma selecteren en GO!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

30

Werkwijze in detail. Maken van de gel.

1. Neem 25 ml 10 xTBE-buffer.2. Voeg 225 ml aquadest toe. (10 verdund).3. Neem hiervan 80 ml.4. Voeg 1,6 gram agarosepoeder.5. Verhit in d magnetron voor 45 sec en

zwenk6. Verhit verder totdat het bijna kookt en

de agarose is gesmolten en helder is.7. Laat afkoelen tot ca 60 graden8. Pipetteer 6 uL EthidiumBromide (giftig en

carcinogeen!) erbij.9. Giet dit in het bakje nadat je de

scheidingswandjes geplaatst hebt.10.Plaats het 9 holes kammetje bij de min-

pool.11.Cool down…. Min 30-60 min.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

31

Werkwijze in detail. Laden van de GEL1. Voeg aan elk PCR-epje 6 ul loading dye

Dit maakt het inladen zichtbaar.2. Haal, als de gel goed gestold is, het

kammetje eruit.3. Vul de gelchamber met TBEbuffer in

dezelfde concentratie als waarmee de gel is gemaakt.

4. Vul elke welletje met 20 ul mengsel vanuit de epjes met monster én loadingdye.

5. Sluit de chamber met de deksel6. Sluit de voeding aan op 50 Volt en zet

de zaak aan voor 10 min.7. Na 10 min over op 100 Volt.8. Na afloop eerst de spanning eraf.9. Chamber leeggieten in opvangbak.

Kijk uit dat de gel er niet uitvalt.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

32

Werkwijze in detail. Bekijken van de gel met UV.

Het EtBr hecht zich aan DNA en is fluoriserend als het met UV wordt beschenen.

Kijk NOOIT in de UV lamp

Als het goed is, is de DNA ladder 50 bp te zien als een reeks bandjes.1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200,150, 100, 50 basepairs.1. Maak een digitale foto 2. Zet de lamp snel uit.3. Verpak de Gel in plastig, label en mik het

in de vriezer. Daardoor verlopen de bandjes niet en kan je later de zaak nog na eens bekijken.

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

33

Werkwijze in detail. Bekijken van de gel met UV.SOMS gaat het gewoon MIS…..

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

34

Werkwijze in detail. Bekijken van de gel met UV.SOMS gaat het gewoon GOED!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

35

Hierna volgt de module:DNALAB1 SolanumOfDNALAB2 DROSOfDNALAB3 CSI

In alle gevallen: Lees en bestudeer je handleiding!!En werk aandachtig. Deze spullen zijn kostbaar!!

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1

36

Verder nog:Sequencing:

http://www.youtube.com/watch?v=8n2LvJ-m0n0MIT: college over DNA-technieken:

http://www.youtube.com/watch?v=uDXH6Uu0ghc

http://www.youtube.com/watch?v=P-Ry4rRdDbk&list=PLF83B8D8C87426E44 http://www.youtube.com/watch?v=QTb6YsxMbBY

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1