Functionele studie van potentieel oncogene miRNA's in ...DBD DNA binding domein DDR DNA damage...
69
Functionele studie van potentieel oncogene miRNA's in erfelijke borstkanker. Liesbeth CLAEYS Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Ir. Kathleen Claes Vakgroep: Pediatrie en Genetica Academiejaar 2015-2016
Transcript of Functionele studie van potentieel oncogene miRNA's in ...DBD DNA binding domein DDR DNA damage...
Functionele studie van
potentieel oncogene miRNA's
in erfelijke borstkanker.
Liesbeth CLAEYS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Ir. Kathleen Claes
Vakgroep: Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2015-2016
Functionele studie van
potentieel oncogene miRNA's
in erfelijke borstkanker.
Liesbeth CLAEYS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Ir. Kathleen Claes
Vakgroep: Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2015-2016
I
Voorwoord
Deze thesis had ik niet tot een goed einde kunnen brengen zonder de hulp van vele mensen
die ik in dit voorwoord wil bedanken.
Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Kathleen Claes bedanken voor de
mogelijkheid om mijn thesis in haar labo uit te voeren, het delen van haar expertise en het
nalezen van mijn thesis.
Daarnaast wil ik ook Prof. Dr. Vral en Prof. Dr. Cornelissen bedanken voor het gebruik van
de laboratoria.
Mattias Van Heetvelde, mijn begeleider, verdient het grootste dankwoord. Bedankt voor alle
technieken die je me hebt aangeleerd, voor de vele tips tijdens het schrijven en het nalezen
van mijn thesis. Bedankt dat ik deel mocht uitmaken van 'team miRNA' en jouw doctoraat.
Een speciaal woordje van dank gaat uit naar Annelot Baert. Hoewel je officieel niet mijn
begeleidster was en zelf al heel wat studenten te begeleiden had, heb je me ontzettend veel
geleerd en kon ik steeds met mijn vragen bij je terecht. Ook wil ik je bedanken voor het
uitvoeren van de vele bestralingen en het nalezen van mijn thesis.
Daarnaast wil ik graag alle doctoraatstudenten en laboranten van 1MRB en 6B3 bedanken. Ik
kon steeds terecht bij jullie met praktische vragen en problemen.
Verder wil ik alle medestudenten van 1MRB en 6B3 bedanken voor de toffe momenten in het
labo en in het bijzonder Bram Verstraete die samen met mij aan dit project gewerkt heeft.
Lien en Laura, bedankt voor de avondjes samen thesissen. Samen afzien is altijd leuker dan
alleen.
Als laatste zou ik nog mijn vrienden, familie en ouders willen bedanken. Jullie hebben me niet
enkel dit jaar, maar gedurende mijn hele studies gesteund.
Bedankt,
Liesbeth
II
Inhoudsopgave
Inhoudsopgave .......................................................................................................................... II
Afkortingenlijst ......................................................................................................................... V
Samenvatting .............................................................................................................................. 1
Summary .................................................................................................................................... 2
1. Inleiding ............................................................................................................................. 3
1.1. Borstkanker ................................................................................................................ 3
1.2. Second hit hypothese van Knudson ........................................................................... 4
1.3. BRCA1 en BRCA2 .................................................................................................... 5
1.3.1. Gen ....................................................................................................................... 5
1.3.2. Eiwit ..................................................................................................................... 5
1.4. DNA dubbelstrengbreuken ......................................................................................... 6
1.4.1. Herstelmechanismen voor DSB ........................................................................... 6
1.4.1.1. Non-homologous end joining ....................................................................... 7
1.4.1.2. Homologe recombinatie ................................................................................ 8
1.4.2. Visualisatie van DSB en herstel ........................................................................... 9
1.4.2.1. γH2AX en 53BP1foci ................................................................................... 9
1.4.2.2. RAD51 foci ................................................................................................... 9
1.4.3. Micronucleï ........................................................................................................ 10
1.4.4. Parp-inhibitoren .................................................................................................. 10
1.5. microRNA's .............................................................................................................. 11
1.5.1. Biogenese van microRNA's ............................................................................... 11
1.5.2. Invloed van miRNA's op BRCA1 en BRCA2 ................................................... 12
1.5.2.1. Algemeen .................................................................................................... 12
1.5.2.2. miR146a, miR146b-5p, miR182 en miR1245 ............................................ 13
1.6. Doelstelling .............................................................................................................. 14
2. Materiaal en methoden ..................................................................................................... 14
2.1. Celculturen ............................................................................................................... 14
2.1.1. Onderhoud cellen ............................................................................................... 15
2.1.2. Lentivirale transductie van miRNA cellijnen ..................................................... 15
2.1.2.1. Optimalisatie transductie condities ............................................................. 16
2.1.2.2. Lentivirale transductie................................................................................. 17
2.2. Real-Time quantitative Reverse Transcriptase PCR ................................................ 17
III
2.2.1. RNA extractie ..................................................................................................... 17
2.2.2. miRNA extractie ................................................................................................ 18
2.2.3. DNase behandeling ............................................................................................ 18
2.2.4. Reverse transcriptase .......................................................................................... 18
2.2.5. Assays ................................................................................................................. 19
2.2.5.1. Kwaliteitscontrole assays ............................................................................ 19
2.2.5.2. BRCA assays .............................................................................................. 19
2.2.5.3. miRNA assays ............................................................................................. 19
2.2.6. qPCR .................................................................................................................. 20
2.3. Western blot ............................................................................................................. 20
2.3.1. Eiwitisolatie ........................................................................................................ 20
2.3.2. SDS-PAGE ......................................................................................................... 21
2.3.3. Blotten naar PVDF membraan ........................................................................... 22
2.3.4. Immunodetectie .................................................................................................. 22
2.4. ELISA BRCA1 ......................................................................................................... 23
2.5. Flowcytometrie ......................................................................................................... 24
2.6. Functionele testen ..................................................................................................... 24
2.6.1. Immuunkleuring ................................................................................................. 24
2.6.1.1. Optimalisatie RAD51 imuunkleuring ......................................................... 24
2.6.1.2. γH2AX/RAD51 foci assay .......................................................................... 25
2.6.1.3. Analyse ....................................................................................................... 26
2.6.2. Micronucleus test ............................................................................................... 26
3. Resultaten ......................................................................................................................... 27
3.1. Optimalisatie transductie condities .......................................................................... 27
3.2. Lentivirale transductie .............................................................................................. 28
3.2.1. FACS .................................................................................................................. 28
3.2.2. miRNA expressie in getransduceerde cellijnen.................................................. 29
3.3. BRCA expressie in getransduceerde cellijnen ......................................................... 30
3.3.1. RT-qPCR ............................................................................................................ 30
3.3.2. Western blot ....................................................................................................... 31
3.3.3. ELISA ................................................................................................................. 33
3.4. BRCA expressie na bestraling .................................................................................. 34
3.5. Flow cytometrie ........................................................................................................ 38
IV
3.6. Functionele testen ..................................................................................................... 38
3.6.1. Optimalisatie RAD51 foci assay ........................................................................ 38
3.6.2. γH2AX/RAD51 foci assay ................................................................................. 40
3.6.3. Micronucleus test ............................................................................................... 42
4. Discussie ........................................................................................................................... 43
5. Conclusie .......................................................................................................................... 48
Referentielijst ........................................................................................................................... 49
Bijlagen ....................................................................................................................................... i
Bijlage 1: Samenstelling MCF10A groei- en resuspensiemedium. ........................................ i
Bijlage 2: Vectormap lentivirale vectoren.............................................................................. ii
Bijlage 3: Primersequenties voor RT-qPCR assays .............................................................. iii
Bijlage 4: Samenstelling buffers Western Blot. .................................................................... iv
Bijlage 5: Foci classifier voor MCF10A cellen. .................................................................... v
Bijlage 6: MN classifier voor MCF10A cellen. .................................................................... vi
Bijlage 7: γH2AX en RAD51 foci resultaten mCherry cellijnen. ........................................ vii
V
Afkortingenlijst
53BP1 P53 binding protein 1
AGO Argonaute eiwitten
ATM Ataxia telangiectasia mutated
BARD1 BRCA1-associated RING domain protein 1
BER Base-excision repair
BRCA1 Breast cancer susceptibility gene 1
BRCA2 Breast cancer susceptibility gene 2
BRCT BRCA1 C terminus
BRIP1 BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1
BSA Bovine serum albumine
CDH1 Cadherin 1
CDK Cyclin-dependent kinase
cDNA Complementary DNA
CHEK1 Checkpoint kinase 1
CHEK2 Checkpoint kinase 2
Cq Quantification cycle
CtIP CtBP-interacting protein
Cyto B Cytochalasine B
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DBD DNA binding domein
DDR DNA damage respons
DNA Deoxyribonucleic acid
DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit
DMSO Dimethyl sulfoxide
DSB Dubbelstrengbreuken
dsDNA Dubbelstrengig DNA
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FCS Fetal calf serum
FSC Forward scatter
GAM Goat anti mouse
GAR Goat anti rabbit
gDNA Genomisch DNA
H2AX Histon 2AX
HR Homologe recombinatie
HRP Horseradisch peroxidase
hSSB1 Single-stranded DNA-binding protein
Ku70 70kDa subunit of Ku antigen
Ku80 80kDa subunit of Ku antigen
MDC1 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1
miR1245 miRNA 1245
miR146a-5p miRNA 146a-5p
VI
miR146b-5p miRNA 146b-5p
miR182-5p miRNA 182-5p
miRISC miRNA-associated multiprotein RNA-induced silencing complex
miRNA microRNA
MM Mastermix
MN Micronucleï
MRE11 Meiotic recombination 11
MRN MRE11-RAD50-NBS1 complex
mRNA Mesenger RNA
NBS1 Nijmegen breakage syndrome 1
NGS Normal goat serum
NHEJ Non-homologous end-joining
NLS Nucleair lokalisation sequence
OB Oligonucleotide bindingsplooien
ORF Open leesraam
P53 Tumor protein
PALB2 Partner and localizer of BRCA2
PARP Poly ADP-ribose polymerase
PBS Phosphate buffered saline
PFA Paraformaldehyde
PI Propidium iodide
Pre-miRNA Precursor microRNA
Pri-miRNA Primary microRNA transcript
PTEN Phosphatase and tensin homolog
PVDF polyvinylideenfluoride
QC Quality control
RAD50, 51, 52, 54 DNA repair protein RAD
RAN GTP GTP binding nuclear protein Ran
RECQL RecQ helicase-like
RIF1 Replication timing regulatory factor 1
RING Really interesting new gene
RNA Ribonucleic acid
RNF Ring finger protein
RPA Replication protein A
RT Reverse transcriptase
RT-qPCR Real time quantitative reverse transcriptase PCR
SARRP Small animal radiation research platform
SCD Serine cluster domein
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese
SMC Structural maintenance of chromosomes
SSB Enkelstrengige breuken
SSC Side scatter
ssDNA Enkelstrengig DNA
VII
STK11 Serine/threonine kinase 11
TD Tower domain
Tm Smelttemperatuur
TMB Tetramethylbenzidine
TOPBP1 Topoisomerase II binding protein 1
TP53 Tumor protein p53gene
UTR Untranslated region
WT Wild type
XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein 4
γH2AX Gefosforyleerd H2AX
1
Samenvatting
Probleemstelling: Borstkanker is wereldwijd de meest voorkomende vorm van kanker bij
vrouwen. Voor patiënten met een germinale mutatie in de borstkankergenen BRCA1 of
BRCA2 wordt aangenomen dat tumorigenese geïnitieerd wordt door verlies van het resterende
BRCA wild type allel. Deze second hit kan echter door de momenteel gekende mechanismen
niet in alle tumoren verklaard worden. miRNA's zijn mogelijks verantwoordelijk voor de
post-transcriptionele neerregulatie van BRCA1 en BRCA2. We lanceren de hypothese dat
potentieel oncogene miRNA's in borstkankerpatiënten met een germinale mutatie in BRCA1
of BRCA2, waarbij geen second hit vastgesteld kan worden, het functionele BRCA allel post-
transcriptioneel neerreguleren en op deze manier een second hit kunnen imiteren.
Doelstelling: miR146a-5p en miR182-5p zijn beschreven als miRNA's die de expressie van
BRCA1 en eventueel BRCA2 neerreguleren in verschillende kankercellijnen. Wij wensen deze
miRNA's te gebruiken als positieve controles voor optimalisatie van onze functionele assays
in de MCF10A cellijn (normale borstepitheelcellijn).
Materiaal en methoden: Deze miRNA's werden met behulp van lentivirale transductie
stabiel tot overexpressie gebracht in de MCF10A cellijn. Met behulp van RT-qPCR en
western blot werden de mRNA en eiwitexpressie in de verschillende cellijnen geëvalueerd.
Een γH2AX/RAD51 foci test en micronucleus test werden uitgevoerd om het effect van de
miRNA's op DNA herstel na te gaan.
Resultaten: De miRNA's, miR146a-5p en miR182-5p, komen stabiel tot overexpressie in de
MCF10A cellijn, maar op mRNA en eiwitniveau kon met de huidige condities geen duidelijke
neerregulatie van BRCA1 of BRCA2 aangetoond worden. Ook op functioneel vlak kon met
een γH2AX/RAD51 foci test nog geen effect aangetoond worden. Enkel bij de micronucleus
test was een licht effect waarneembaar in de miR146a-mCherry en miR182-mCherry cellijn.
Conclusie: Verdere optimalisaties zijn noodzakelijk om het effect van miR146a-5p en
miR182-5p op post-transcriptionele neerregulatie van BRCA1 en eventueel BRCA2 te kunnen
aantonen in de MCF10A cellijn. In een vervolg studie zullen deze miRNA's dan als positieve
controles gebruikt worden voor het valideren van kandidaat oncogene miRNA's voor
BRCA1/2.
2
Summary
Background: Breast cancer is the most common cancer in women. Loss of the remaining
functional wild type allele is considered to be necessary in patients with a germline mutation
in the breast cancer genes BRCA1 or BRCA2 to initiate tumorigenesis. The mechanisms to
induce this second hit are still unclear in some cases. We hypothesize that potentially
oncogenic miRNAs have the ability to perform posttranscriptional downregulation of the
functional BRCA allele in patients with a germline mutation in BRCA1/2 in tumors without
apparently a second hit and thereby mimicking a second hit.
Aim: miR146a-5p and miR182-5p are described as miRNAs that downregulate BRCA1 and
potentially BRCA2 expression in different cancer cell lines. We would like to use these
miRNAs as positive controls for the optimisation of our functional assays in the MCF10A cell
line (normal breast epithelial cell line).
Methods: We performed lentiviral transduction to stably overexpress these miRNAs in the
MCF10A cell line. With RT-qPCR and western blot, we evaluated the mRNA and protein
expression in the different cell lines. A γH2AX/RAD51 foci assay and micronucleus assay
were performed to evaluate the effect of the miRNAs on DNA repair.
Results: We were able to induce stable overexpression of miR146a-5p and miR182-5p in the
MCF10A cell line. With the current experiments, no clear downregulation on mRNA and
protein level could be detected. γH2AX/RAD51 foci assay did not show an effect either. Only
with the micronucleus assay a small effect in the miR146a-mCherry and miR182-mCherry
cell line could be detected.
Conclusion: Further optimisations are necessary to confirm the effect of miR146a-5p and
miR182-5p on BRCA1/2 in the MCF10A cell line, before these miRNAs could be used as
positive controls in further studies regarding oncogenic miRNAs targeting the BRCA genes.
3
1. Inleiding
1.1. Borstkanker
Borstkanker is wereldwijd de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen en de op één
na meest voorkomende oorzaak van mortaliteit ten gevolge van kanker [1, 2]. In 2013 werden
in België meer dan 10.000 vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker wat overeenkomt met
een incidentiecijfer van 189,2/100.000 vrouwen per jaar [3]. Slechts 5-7% van het totaal
aantal borstkankers volgen een Mendeliaans overervingspatroon en worden beschouwd als
erfelijk, 93-95% van de borstkankers ontstaan sporadisch (Figuur 1A) [2, 4]. Germinale
mutaties in de borstkankergenen BRCA1 en BRCA2 worden teruggevonden bij ongeveer 25%
van de patiënten met erfelijke borstkanker [2]. BRCA1 en BRCA2 mutatiedragers hebben
naast een verhoogd risico op borstkanker ook een verhoogd risico op ovariumkanker. Het
risico op het ontwikkelen van borst- en ovariumkanker voor de leeftijd van 70 jaar is
respectievelijk 44-78% en 18-54% in BRCA1 mutatiedragers en 31-56% en 2.4-19% in
BRCA2 mutatiedragers [5]. Naast BRCA1 en BRCA2 zijn er nog andere borstkanker
susceptibiliteitsgenen gekend die verantwoordelijk zijn voor erfelijke borstkankersyndromen
(Figuur 1B). Germinale mutaties in TP53 geven aanleiding tot het Li-Fraumeni syndroom,
wat bij een derde van de vrouwelijke mutatiedraagsters borstkanker veroorzaakt. Vrouwen
met het Cowden syndroom en het Peutz-Jeghers syndroom, die respectievelijk veroorzaakt
worden door germinale mutaties in PTEN en STK11, hebben een risico van 50% op
borstkanker. Bij ongeveer 30% van de families met erfelijke maagkanker, veroorzaakt door
een germinale mutatie in CDH1, wordt borstkanker vastgesteld. Mutaties in BRCA2 en
PALB2 kunnen naast borstkanker ook aanleiding geven tot Fanconi anemie. Recent onderzoek
heeft aangetoond dat mutaties in RECQL geassocieerd zijn met een verhoogd risico op
borstkanker. Daarnaast zijn er reeds pathogene mutaties geïdentificeerd in CHEK2, ATM,
NBS1, RAD50, RAD51B, RAD51C, RAD51D en vele andere genen [2, 4, 6].
Figuur 1. Verdeling van patiënten met borstkanker (a) en overzicht van de verschillende borstkanker
susceptibiliteitsgenen (b) [2].
4
1.2. Second hit hypothese van Knudson
De meeste loss-of-function mutaties die voorkomen in tumor suppressor genen zijn recessief.
Om tumorigenese te initiëren, moeten beide allelen van het tumor suppressor gen
geïnactiveerd zijn. Dit is gekend als de second hit hypothese, zoals beschreven door Alfred
Knudson in 1971. Bij de second hit hypothese kan een onderscheid gemaakt worden tussen
erfelijke en sporadische vormen van kanker. Bij erfelijke vormen van kanker is er reeds een
germinale mutatie aanwezig in alle lichaamscellen van een individu. Het verwerven van een
somatische mutatie in het resterend functionele allel van enkele cellen kan leiden tot
tumorvorming. In Figuur 2 wordt een overzicht weergegeven van enkele mechanismen die
verantwoordelijk kunnen zijn voor het verlies van het tweede functionele allel. Daarnaast kan
het resterend functionele allel geïnactiveerd zijn als gevolg van deleties, amplificaties,
translocaties of mitotische recombinase ter hoogte van de locus coderend voor het tumor
suppressor gen. Bij sporadische vormen van kanker is er nog geen germinale mutatie
aanwezig in het individu. Slechts enkele lichaamscellen zullen een somatische mutatie
verwerven op het ene allel. Wanneer in deze cellen een tweede somatische mutatie het
resterend functioneel allel uitschakelt, kunnen deze zich tot tumorcellen ontwikkelen. Dit
proces verloopt veel trager dan het verwerven van één somatische mutatie bij erfelijke vormen
van kanker. Erfelijke vormen van kanker komen hierdoor vaker voor op jonge leeftijd, terwijl
sporadische vormen van kanker meestal op latere leeftijd voorkomen [7–9].
Figuur 2. Overzicht van mogelijke genetische afwijkingen in een locus coderend voor een tumor
suppressor gen.
a: Gezonde cel. b: Cel na het verwerven van eerste somatische mutatie of een constitutionele cel met een
germinale mutatie. c1: Geen verandering ter hoogte van de heterozygote locus in de tumorcel, mogelijks
methylatie van de promotor regio van het wild type allel. c2: Somatisch polymorfisme van het wild type allel ter
hoogte van de heterozygote locus. c3: Nieuwe somatische mutatie op het wild type allel ter hoogte van de
heterozygote locus. c4: Copy number variatie van één of beide allelen.
c5: Somatisch of chromosomaal verlies van het mutant allel ter hoogte van de heterozygote regio.
c6: Somatisch of chromosomaal verlies van het wild type allel ter hoogte van de heterozygote regio.
5
1.3. BRCA1 en BRCA2
1.3.1. Gen
BRCA1 en BRCA2 zijn respectievelijk gelegen op chromosoom 17q21 en chromosoom
13q12.3. BRCA1 bestaat uit 24 exonen. Exon 11 bevat 2 nucleaire lokalisatie sequenties
(NLS) en codeert voor ongeveer 60% van het BRCA1 eiwit. BRCA2 bevat 27 exonen met 8
interne repeat sequenties, BRC motieven, in exon 11 [10, 11].
1.3.2. Eiwit
BRCA1 en BRCA2 hebben een belangrijke functie in de DNA damage respons (DDR)
signaalweg. Beide eiwitten zijn gekend voor hun functie in homologe recombinatie (HR), een
DNA herstelmechanisme dat het onbeschadigd zusterchromatide gebruikt om meestal
foutloos DNA dubbelstrengbreuken (DSB) te herstellen. BRCA1 heeft daarnaast ook een
functie in de activatie van checkpoints die de celcyclus vertragen en zo tijd maken voor DNA
herstel [12]. Figuur 3 geeft een overzicht van de functionele domeinen van BRCA1 en
BRCA2.
Figuur 3. Functionele domeinen van BRCA1 (a) en BRCA2 (b) [12].
BRCA1 bevat een N-terminaal RING domein dat bindt met het BRCA1-associated RING
domain protein 1 (BARD1). Het BRCA1-BARD1 complex is betrokken bij de activatie van
de G1/S, S-fase en G2/M checkpoints [12]. De 2 NLS domeinen zijn verantwoordelijk voor
het transport van BRCA1 vanuit het cytosol naar de nucleus [11]. De centrale regio van
BRCA1 bevat een checkpoint kinase 2 (CHEK2) fosforylatie plaats op S988. Deze
fosforylatie is samen met het coiled-coil domein belangrijk voor de interactie van BRCA1 met
6
de partner and localizer of BRCA2 (PALB2) en BRCA2. Daarnaast bevat BRCA1 een serine
cluster domein (SCD) met fosforylatieplaatsen voor Ataxia telangiectasia mutated (ATM) en
een BRCA1 C terminus (BRCT) domein dat bindt met ATM gefosforyleerd abraxas, CtBP-
interacting protein (CtIP) en BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 (BRIP1). Het
BRCA1-abraxas complex is verantwoordelijk voor de rekrutering van BRCA1 naar de
plaatsen van DNA schade. Het BRCA1-CtIP complex interageert met het MRN complex, dat
opgebouwd is uit Meiotic recombination 11 (MRE11), RAD50 en Nijmegen breakage
syndrome 1 (NBS1). Het is verantwoordelijk voor de detectie van DSB en de resectie van de
DNA 5'-uiteinden van de DSB. Het BRCA1-BRIP1-Topoisomerase II binding protein 1
(TOPBP1) macrocomplex is betrokken bij de activatie van het S-fase checkpoint na fork
collapse [11, 12].
PALB2 zorgt voor een fysieke link tussen BRCA1 en BRCA2. N-terminaal bindt PALB2 met
het coiled-coil domein van BRCA1 en de C-terminus van PALB2 bindt met de N-terminus
van BRCA2. BRCA2 is verantwoordelijk voor de rekrutering van RAD51 naar de plaats van
DNA DSB en bevat daarvoor een C-terminale cyclin-dependent kinase (CDK)
fosforylatieplaats en centraal 8 BRC repeats die binden met RAD51. Daarnaast bevat BRCA2
een DNA binding domein (DBD) dat opgebouwd is uit een α-helicaal domein, 3
oligonucleotide bindings plooien (OB) die enkelstrengig DNA (ssDNA) binden en een tower
domein (TD) dat uitsteekt van OB2 en dubbelstrengig DNA (dsDNA) bindt. De C-terminus
van BRCA2 bevat 2 NLS domeinen, die verantwoordelijk zijn voor de nucleaire translocatie
van BRCA2 [10, 12].
1.4. DNA dubbelstrengbreuken
1.4.1. Herstelmechanismen voor DSB
DNA DSB kunnen hersteld worden door middel van non-homologous end-joining (NHEJ) of
door HR (Figuur 4). De keuze tussen beide herstelmechanismen hangt af van de fase in de
celcyclus, cel type, chromatine complexiteit en de complexiteit van de geïnduceerde schade.
HR herstelt DSB tijdens de late S- en G2-fase van de celcyclus, wanneer een intact
zusterchromatide kan dienen als template voor herstel. In de vroege S- en G1-fase van de
celcyclus is dit niet mogelijk en worden DSB hersteld via NHEJ [12, 13].
Ongeacht het herstelmechanisme dat gebruikt wordt, NHEJ of HR, worden DSB
waargenomen door het MRN complex. MRE11 is noodzakelijk om andere herstel eiwitten
naar de plaats van DNA schade te rekruteren en heeft een endo- en exonuclease activiteit.
7
RAD50 bindt met MRE11 en ontwindt de dsDNA uiteinden waardoor andere eiwitten betere
toegang hebben tot de plaats van DNA schade. NBS1 interageert met gefosforyleerde eiwitten
en zorgt zo voor de rekrutering van verschillende hersteleiwitten en checkpoint controle
eiwitten [13]. ATM, een ander sensor eiwit voor DSB, wordt door het MRN complex naar de
plaats van DNA schade gerekruteerd en ondergaat autofosforylatie op Serine 1981 waardoor
het geactiveerd wordt. ATM kan dan op zijn beurt histon 2AX (H2AX) fosforyleren op Serine
139 wat resulteert in γH2AX foci op de plaatsen van DSB. Fosforylatie van ATM, ATR en
H2AX zorgen voor de amplificatie van het signaal van DNA schade. Dit zorgt voor verdere
rekrutering van DNA herstel eiwitten en checkpoint controle eiwitten waaronder Mediator of
DNA damage checkpoint protein 1 (MDC1), P53 binding protein 1(53BP1), BRCA1,
Checkpoint kinase 1 (CHEK1), CHEK2 en p53. Afhankelijk van de eiwitten die gerekruteerd
worden, ondergaat de cel checkpoint arrest, DNA herstel via NHEJ of HR, apoptose indien de
schade niet hersteld kan worden of senescentie [13].
Figuur 4. Herstelmechanismen voor DNA DSB: Non Homologous End-Joining (links) en Homologe
Recombinatie (rechts) [14].
1.4.1.1. Non-homologous end joining
NHEJ van 2 DNA uiteinden vereist geen onbeschadigde homologe template. Als gevolg
hiervan is NHEJ gevoelig aan fouten, waardoor kleine deleties geïntroduceerd kunnen worden
tijdens herstel van de DSB [14].
8
Een eerste stap in de NHEJ signaalweg is de rekrutering van 70kDa subunit of Ku antigen
(Ku70) en 80kDa subunit of Ku antigen (Ku80) naar de DSB, wat enkele seconden na het
ontstaan van de DSB reeds gebeurt. Binding van Ku70 en Ku80 met DSB resulteert in
conformationele veranderingen in hun C-terminale regio, wat binding met andere NHEJ
eiwitten mogelijk maakt. Twee DNA-dependent protein kinase, catalytic subunits (DNA-
PKcs) interageren met de C-terminale regio van elk Ku80 en houden de DNA uiteinden
samen. De DNA-PKcs rekruteren op hun beurt eiwitten met endo- en/of exonuclease activiteit
om de niet ligeerbare uiteinden van de DSB te verwijderen. Het X-ray repair cross-
complementing protein 4 (XRCC4)-DNA ligase IV complex staat in voor de ligatie van de
uiteinden en het uiteindelijke herstel van de DSB [13–15].
1.4.1.2. Homologe recombinatie
HR is een meer accuraat mechanisme voor herstel van DSB omdat het gebruik maakt van
homologe sequenties, zoals het onbeschadigd zusterchromatide, als template voor herstel. Als
de template perfect homoloog is, kan herstel van DSB via HR 100% accuraat zijn [15].
Het MRN complex bindt aan het DNA op de plaats van de DSB, waarna het ATM rekruteert
en activeert. De endonuclease activiteit van MRE11 zorgt voor de afbraak van 5'-3' en de
productie van 3' ssDNA uiteinden ter hoogte van de DSB. De endonuclease activiteit van
MRE11 wordt gereguleerd door binding met CtIP en is ATM- en BRCA1-afhankelijk. Single-
stranded DNA-binding protein (hSSB1) moleculen binden op de 3' uiteinden en worden
daarna vervangen door replication protein A (RPA) dat invasie van het homologe
zusterchromatide zal initiëren. Vervolgens wordt het RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54
complex gerekruteerd naar het ssDNA door het BRCA1/PALB2 complex. Dit
vergemakkelijkt de vervanging van RPA met RAD51, stabiliseert het filament en katalyseert
de invasie in het zusterchromatide en de daaropvolgende Holliday junction. Directe binding
van RAD52 aan de uiteinden van de DSB beschermt deze van de exonuclease activiteit. De 2
zusterchromatiden worden bij elkaar gehouden door Structural maintenance of chromosomes
(SMC) proteïnen, waardoor de 2 strengen gemakkelijk kunnen aligneren met homologe
regio's in het zusterchromatide. Het DNA polymerase δ katalyseert de DNA synthese vanaf
het 3' uiteinde. Eens de DNA replicatie compleet is, wordt de Holliday junction verbroken en
vindt ligatie plaats van de DNA uiteinden [13].
9
1.4.2. Visualisatie van DSB en herstel
DSB kunnen in vitro, na het bestralen van cellen om DNA schade te induceren, met specifieke
antilichamen gevisualiseerd worden.
1.4.2.1. γH2AX en 53BP1foci
H2AX is een variant van het H2A histon dat betrokken is bij de signalisatie van DSB. H2AX
wordt door ATM gefosforyleerd ter hoogte van Serine 139. De fosforylatie van H2AX kan
zich uitspreiden tot ~2000 γH2AX moleculen die samen een γH2AX focus vormen ter hoogte
van de DSB. Deze γH2AX foci kunnen met behulp van een specifiek antilichaam
gevisualiseerd worden en zijn een merker voor het aantal gevormde DSB in een celkern [16–
19].
Het p53-bindend proteïne 1 (53BP1) is een eiwit dat eveneens betrokken is bij de signalisatie
van DSB en rekrutering van andere hersteleiwitten naar de plaats van DNA schade. Wanneer
DSB gedetecteerd worden, accumuleert 53BP1 snel op het chromatine rondom het breukpunt.
Alhoewel de initiële rekrutering van 53BP1 onafhankelijk van γH2AX gebeurt, is de stabiele
associatie van 53BP1 met de DSB afhankelijk van de ring finger protein (RNF) 8 en 168-
gemedieerde ubiquitylatie cascade die geactiveerd wordt na fosforylatie van histon 2AX door
ATM en rekrutering van MDC1 [16, 19, 20]. Binding van 53BP1 is celcyclus afhankelijk.
Tijdens G1-fase kan 53BP1 binden met het chromatine. Het chromatine-53BP1-Replication
timing regulatory factor 1(RIF1) complex verhindert de binding van BRCA1 met het MRN
gebonden CtIP. Dit resulteert in gelimiteerde resectie van de DSB uiteinden, waardoor herstel
via HR tegengegaan wordt en herstel via NHEJ kan plaatsvinden. Tijdens S- en G2-fase is
CtIP gefosforyleerd wat de binding van BRCA1 vergemakkelijkt en binding van 53BP1-RIF1
met het chromatine verhindert. De resectie van de DSB uiteinden kan doorgaan wat de cellen
ertoe aanzet om de HR-pathway boven de NHEJ-pathway te verkiezen om DSB-herstel uit te
voeren [20]. Zoals voor de meeste componenten van de DSB-signalisatie pathway, kan de
rekrutering van 53BP1 tot subnucleaire foci ter hoogte van de DSB in vitro gevisualiseerd
worden met behulp van een specifiek antilichaam [20].
1.4.2.2. RAD51 foci
RAD51 foci ontstaan later in de HR signaalweg, wanneer herstel van DSB bezig is (zie
1.4.1.2.). RAD51 foci kunnen eveneens na immuunkleuring met een specifiek antilichaam
gevisualiseerd worden en zijn een merker voor herstel van DSB via HR [13, 19, 21].
10
1.4.3. Micronucleï
In cellen waar DNA herstelmechanismen niet meer efficiënt werken, zullen DSB niet of
foutief hersteld worden. Hierdoor kunnen acentrische fragmenten ontstaan. Deze zullen niet
opgenomen worden in de nieuwe dochterkernen wanneer de cel deelt, maar vormen kleine
aparte kernen, micronucleï (MN). Daarnaast kunnen ook volledige chromosomen, die als
gevolg van een defect ter hoogte van het kinetochoor of de spoeldraden tijdens de celdeling
niet verplaatst worden, aanleiding geven tot de vorming van MN (Figuur 5). Cytochalasine B
(Cyto B) blokkeert de polymerisatie van actinefilamenten, waardoor de cytokinese niet kan
doorgaan. Wanneer de cel na toevoeging van Cyto B deelt, zal kerndeling plaatsvinden, maar
de celdeling zelf kan niet doorgaan, waardoor een binucleaire cel ontstaat. MN kunnen aan de
hand van kernkleuring met o.a. 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gevisualiseerd worden
in binucleaire cellen [22–24].
Figuur 5. Vorming van micronucleï.
1.4.4. Parp-inhibitoren
Mutaties in BRCA1 en/of BRCA2 verstoren o.a. HR waardoor DNA schade en mutaties zich
opstapelen in de cel, maar waarbij de cel zijn vermogen om te delen bewaart [25]. Dit biedt
mogelijkheden voor therapieën tegen deze kankers. Olaparib is een poly ADP-ribose
polymerase (PARP) inhibitor die recent goedgekeurd is door de FDA als monotherapie voor
ovariumkanker patiënten met een germinale mutatie in BRCA1 of BRCA2 en in België sinds
december 2015 terugbetaald wordt door het RIZIV [26, 27]. Figuur 6 toont het
werkingsmechanisme van PARP-inhibitoren. PARP-inhibitoren werken in op het PARP eiwit,
dat zeer belangrijk is voor het herstel van enkelstrengige breuken (SSB) door middel van
base-excision repair (BER). Wanneer deze cellen in S-fase komen, zal de SSB na fork
collapse een DSB vormen, die hersteld dient te worden via HR. Als de PARP deficiënte
cellen ook BRCA1 of BRCA2 deficiënt zijn, kan er geen HR optreden. Het genoom wordt te
onstabiel en de tumorcel zal apoptose ondergaan [28].
11
Figuur 6. Werkingsmechanisme van een PARP-inhibitor [28].
1.5. microRNA's
microRNA's (miRNA's) zijn kleine (~22nt), niet-coderende, enkelstrengige RNA moleculen
die post-transcriptioneel de expressie van genen negatief kunnen reguleren. De meeste
miRNA's bevinden zich in de intronen van zowel eiwit coderende als niet-coderende
messenger RNA (mRNA) transcripten. Andere miRNA's bevinden zich in de exonen van niet-
coderende mRNA genen of in het 3' untranslated region (UTR) van mRNA genen. Ze kunnen
ook voorkomen in clusters met andere miRNA genen [29, 30].
1.5.1. Biogenese van microRNA's
De transcriptie van miRNA's gebeurt door het RNA polymerase II, waardoor grote RNA
precursoren, primary microRNA transcript (pri-miRNA's), ontstaan (Figuur 7). Een
pri-miRNA kan een enkel miRNA bevatten of een cluster van twee of meer miRNA's die
geproduceerd worden van éénzelfde primair transcript. Het pri-miRNA wordt in de nucleus
verder verwerkt door het RNase III enzym, DROSHA, en zijn cofactor, PASHA. DROSHA
bevat twee RNase III domeinen die elk één streng van het dubbelstrengig RNA knippen aan
de basis van de stam-lus. Zo ontstaat een haarspeld-vormig precursor miRNA (pre-miRNA)
(~70nt) met een 3' overhangend uiteinde van twee nucleotiden. Het pre-miRNA wordt
vervolgens door RAN GTP en exportine 5 naar het cytoplasma getransporteerd. DICER, een
ander RNase III enzym, bindt met zijn twee katalytische RNase III domeinen het pre-miRNA
en produceert door asymmetrisch knippen een miRNA:miRNA*duplex, dubbelstrengig RNA
van ~22nt met 2 nucleotiden overhang aan de 3' uiteinden. Eén streng van het mature miRNA
wordt gebonden door Argonaute eiwitten (AGO1-4) en wordt zo opgenomen in het miRNA-
associated multiprotein RNA-induced silencing complex (miRISC) om het complex te leiden
12
naar het complementair doelwit mRNA voor post-transcriptionele gene silencing [29, 30]. De
seed regio (nt 2-9) van het miRNA is cruciaal voor de herkenning van het doelwit mRNA
[31]. Afhankelijk van de complementariteit van het miRNA en het doelwit mRNA wordt de
expressie van het doelwit gen op een bepaalde manier negatief gereguleerd. De meeste
miRNA's binden met imperfecte complementariteit in het 3' UTR van het doelwit mRNA en
inhiberen zo translatie. miRNA's die met perfecte complementariteit binden met het doelwit
mRNA induceren mRNA-cleavage door de ribonucleasen in het miRISC, wat resulteert in
degradatie van het doewit mRNA. De complementaire sequenties van deze miRNA's worden
vooral teruggevonden in de coderende regio's van het open leesraam (ORF) van het mRNA
[29].
Figuur 7. Biogenese van miRNA's [29].
1.5.2. Invloed van miRNA's op BRCA1 en BRCA2
1.5.2.1. Algemeen
miRNA's reguleren negatief de expressie van genen. miRNA expressie wordt hierdoor vaak
gecorreleerd met verschillende kankers. Ze kunnen zowel als tumor suppressor of als oncogen
13
functioneren. Reductie of deletie van een miRNA dat functioneert als een tumor suppressor
kan leiden tot tumorvorming. Een verminderde productie van het matuur miRNA kan het
gevolg zijn van een defect in de miRNA biogenese pathway en kan leiden tot
ongecontroleerde expressie van het miRNA doelwit oncogen. Amplificatie of overexpressie
van een miRNA dat functioneert als een oncogen kan eveneens resulteren in tumorvorming.
Verhoogde expressie van het matuur miRNA kan het gevolg zijn van een constitutief actieve
promotor, verhoogde efficiëntie van miRNA productie of verhoogde stabiliteit van het
miRNA. Overexpressie van een miRNA kan aanleiding geven tot een daling in expressie van
het doelwit tumor suppressor gen, zoals bijvoorbeeld BRCA1 en BRCA2 [29, 30, 32].
miRNA's die inwerken op BRCA1 en/of BRCA2 verstoren op die manier HR [33].
1.5.2.2. miR146a, miR146b-5p, miR182 en miR1245
Er zijn reeds enkele oncogene miRNA's gekend die, wanneer ze tot overexpressie komen,
BRCA1 of BRCA2 expressie negatief reguleren en zo kunnen bijdragen tot de progressie van
borstkanker [31, 34, 35]. miRNA146a (miR146a) en miRNA146b-5p (miR146b-5p) hebben
dezelfde seed regio en hun volledige sequentie verschilt slechts in 2 nucleotiden. Bio-
informatica tools identificeerden voor deze miRNA's een bindingsplaats in de 3'UTR van
BRCA1. Garcia et al. bevestigden in vitro dat miR146a en miR146b-5p de expressie van
BRCA1 neerreguleren [31]. Overexpressie van miRNA182 (miR182), dat net als miR146a en
miR146b-5p een bindingsplaats heeft in de 3'UTR van BRCA1, kan ook BRCA1 expressie
post-transcriptioneel neerreguleren. Dit resulteert in een verhoogde celproliferatie en een
reductie in HR [35–37]. De onderzoeksgroep van Chowdhury heeft reeds een patent voor het
gebruik van miR182 in methoden om de BRCA1 expressie in patiënten te bepalen en aan te
passen. Alsook voor behandelingsmethoden van kankerpatiënten op basis van de miR182
expressie, zoals het bepalen of een patiënt behandeld kan worden met PARP-inhibitoren [38].
Song et al. toonden in hun studie aan dat c-myc het miRNA1245 (miR1245) opreguleert via
directe binding met de miR1245 promotor. miR1245 bindt op zijn beurt met de 3'UTR van
BRCA2 en inhibeert de translatie ervan, wat eveneens resulteert in een reductie van de
efficiëntie van HR [34].
Mogelijks zijn er naast deze miRNA's nog vele andere miRNA's die post-transcriptioneel de
expressie van BRCA1 en BRCA2 negatief reguleren. In een voorgaand luik van deze studie
werden op basis van literatuur gegevens, predictieprogramma's en miRNA expressie
profilering potentieel oncogene miRNA's geselecteerd. De miRNA expressie profilering werd
14
uitgevoerd bij borstkankerpatiënten met een germinale mutatie in BRCA1 of BRCA2, waarbij
geen second hit vastgesteld kon worden, en vergeleken met patiënten waarbij wel een second
hit aanwezig was.
1.6. Doelstelling
Bij patiënten met een germinale mutatie in de borstkankergenen BRCA1 of BRCA2 wordt
tumorigenese geïnitieerd door verlies van het resterende BRCA wild type allel. Deze second
hit kan door de momenteel gekende mechanismen niet in alle tumoren verklaard worden.
miRNA's zijn mogelijks verantwoordelijk voor de post-transcriptionele neerregulatie van
BRCA1 en BRCA2. We veronderstellen dat potentieel oncogene miRNA's in
borstkankerpatiënten met een germinale mutatie in BRCA1 of BRCA2, waarbij geen second
hit vastgesteld kon worden, het functionele BRCA allel post-transcriptioneel neerreguleren en
op deze manier een second hit kunnen imiteren (Figuur 8).
In deze studie gebruiken we miR146a-5p en miR182-5p als positieve controles om de
experimenten te optimaliseren die zullen toegepast worden ter validatie van de nieuw
geïdentificeerde miRNA's. Als eerste doel werden beide miRNA's tot overexpressie gebracht
in de MCF10A cellijn. Een vergelijking met controlecellijnen zal bepalen of deze miRNA's
een duidelijk effect hebben op de mRNA en eiwit expressie van BRCA1 of BRCA2 alsook op
DNA herstel. In een vervolgstudie kunnen deze miRNA's gebruikt worden als positieve
controles voor de geselecteerde potentieel oncogene miRNA's.
Figuur 8. Second hit hypothese miRNA's. a: Gezonde cel. b: Cel met een germinale mutatie. c: Cel waarin
tweede functioneel allel posttranscriptioneel neergereguleerd wordt door de overexpressie van een oncogeen
miRNA.
2. Materiaal en methoden
2.1. Celculturen
In deze studie werd gebruik gemaakt van de spontaan geïmortaliseerde humane
borstepitheliale MCF10A cellijn. In het labo waren naast de MCF10A wild type (WT) cellen
reeds verschillende MCF10A cellijnen aanwezig met een partiële knockdown voor BRCA1
(MCF10A BRCA1.3) of BRCA2 (MCF10A BRCA2.1), verkregen na transductie met
15
lentivirale vectoren met shRNA. Daarnaast beschikte het labo ook over een MCF10A GFP
cellijn, verkregen na transductie met een vector die enkel het Green Fluorescent Protein
(GFP) bevat, deze werd gebruikt als negatieve controle voor de knockdown cellijnen.
Specifiek voor dit project werden MCF10A cellijnen aangemaakt waarin miR146a-5p of
miR182-5p tot overexpressie komt. De lentivirale transductie van deze cellijnen wordt
besproken in 2.1.2.
2.1.1. Onderhoud cellen
De cellijnen werden bewaard in vloeibare stikstof in Fetal Calf Serum (FCS) met 10%
dimethyl sulfoxide (DMSO). Cellen werden ontdooid in steriel water (37°C). Na een aantal
wasstappen met koud resuspensiemedium, werden de cellen met 5mL groeimedium
overgebracht naar een T25 falcon met filterdop en in cultuur gehouden in een incubator bij
37°C en 5% CO2. De samenstelling van het MCF10A resuspensie- en groeimedium wordt
weergegeven in bijlage 1. MCF10A cellen zijn adherente cellen die in een monolayer groeien.
De cellen werden om de 2-3 dagen gesplitst. Hiervoor werd het groeimedium uit de T25
falcon afgenomen, waarna de T25 falcon gespoeld werd met Phosphate Buffered Saline
(PBS). De cellen werden los gemaakt door ze te trypsiniseren (Life technologies). Trypsine
kon nadien geneutraliseerd worden door een wasstap met resuspensiemedium (37°C). Een
celpellet werd bekomen door de celsuspensie 5 min te centrifugeren (1000rpm). De celpellet
werd geresuspendeerd in 1mL groeimedium (37°C), waarna de gepaste hoeveelheid cellen
overgebracht werd naar een nieuwe T25 falcon gevuld met 5mL groeimedium (37°C).
Afhankelijk van de confluentie van de celcultuur en het aantal te overbruggen dagen tot de
volgende splitsing, werd een splitsratio van 1:10 tot 1:20 gebruikt. Voor bepaalde
experimenten was het noodzakelijk om een exact aantal cellen uit te zaaien. Om cellen te
tellen, werd de celpellet geresuspendeerd in 1mL groeimedium. Vervolgens werd een 1:10
verdunning gemaakt van de celsuspensie met trypaanblauw. Dode cellen worden door
trypaanblauw aangekleurd omdat hun celmembraan niet meer intact is. Van de verdunning
werd 10µL gepipetteerd in een Bürker telkamer, waarna de getelde cellen vermenigvuldigd
werden met 105 om het aantal cellen/mL te verkrijgen.
2.1.2. Lentivirale transductie van miRNA cellijnen
Specifiek voor dit project werd de MCF10A WT cellijn getransduceerd met lentivirale
partikels met een vector coderend voor miRNA's 146a-5p (MIMAT0000449) of 182-5p
(MIMAT0000259), waarvan in de literatuur reeds beschreven werd dat ze BRCA1
16
posttranscriptioneel neerreguleren (zie 1.5.2.2). Daarnaast werd als negatieve controle ook
een transductie uitgevoerd met een lege vector (Biosettia) of vector die scrambled DNA
(Dharmacon) bevat. Tabel 1 geeft een overzicht van de bekomen cellijnen na transductie.
Tabel 1. Overzicht getransduceerde cellijnen.
Cellijn Lentivirale vector Firma
MCF10A miR146a-mCherry hsa-miR-146a-5p Biosettia
MCF10A miR182-mCherry hsa-miR-182-5p Biosettia
MCF10A miRCon-mCherry hsa-miR-control Biosettia
MCF10A miR146a-GFP hsa-miR-146a-5p Dharmacon
MCF10A miR182-GFP hsa-miR-182-5p Dharmacon
MCF10A miRCon-GFP hsa-miR-control Dharmacon
De vectormap van de verschillende lentivirale partikels wordt weergegeven in Bijlage 2.
Omdat alle vectoren een puromycine resistentie gen en een rood (Biosettia) of groen
fluorescente merker (Dharmacon) bevatten, kon selectie van de getransduceerde cellen
gebeuren door puromycine toe te voegen aan het groeimedium en door de cellen te selecteren
op basis van hun fluorescentie met behulp van fluorescence-activated cell sorting (FACS).
2.1.2.1. Optimalisatie transductie condities
Transductie met lentivirale partikels werd uitgevoerd in cellen die 40-80% confluent zijn. Om
de optimale concentratie cellen hiervoor te bepalen, werd een concentratierange van 100 tot
104 MCF10A WT cellen uitgezaaid in een 96 well plaat. Na 1 dag, de dag waarop normaal
transductie zou plaatsvinden, werden de cellen geëvalueerd onder de microscoop en werd de
graad van confluentie bepaald. Daarnaast werd de optimale polybreen concentratie, nodig
voor efficiënte opname van de viruspartikels in de cel, maar toxisch voor de cel, het gebruik
van transductiemedium met of zonder FCS en de optimale incubatietijd voor de transductie
bepaald. Hiervoor werden 5·103, 10
4 en 2·10
4 MCF10A WT cellen in 2 identieke 96 well
platen uitgezaaid. Op dag 2 werd het groeimedium verwijderd en werd transductiemedium
met of zonder FCS en een polybreen concentratie van 0 tot 14µg/mL toegevoegd. Na 6 en 24
uur werden respectievelijk de eerste en tweede plaat geëvalueerd onder de microscoop en
werd het transductiemedium opnieuw vervangen door groeimedium. Op dag 4 en 5 werden de
cellen eveneens bekeken onder de microscoop. Op basis van cytotoxiciteit werden de
optimale transductie condities bepaald. Als laatste werd de optimale puromycine concentratie
voor het selectiemedium bepaald door een kill curve experiment uit te voeren. Hiervoor
werden MCF10A WT cellen in duplo uitgezaaid in 6-well platen, waarna groeimedium met
17
puromycine in een concentratierange van 0 tot 10µg/mL werd toegevoegd. De cellen werden
gedurende 4 dagen om de 12 uur bekeken onder de microscoop, waarbij de viabiliteit
geëvalueerd werd. De optimale puromycine concentratie voor het selectiemedium is de
laagste concentratie puromycine waarbij zo snel mogelijk alle MCF10A WT cellen dood zijn.
2.1.2.2. Lentivirale transductie
Op dag 0 werden 104 MCF10A WT cellen per well uitgezaaid in een 96 well plaat. Voor
iedere conditie werd in drievoud gewerkt. Op dag 1 werd het groeimedium afgenomen en
werd transductiemedium met 8µg/mL polybreen en zonder FCS toegevoegd. Aan iedere well
werd 0, 1, 2 of 5µL van de lentivirale partikels toegevoegd, waarna gedurende 60 min
spinfection plaatsvond bij 1000g. De plaat werd overnacht geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2,
waarna op dag 2 het transductiemedium vervangen werd door groeimedium. Op dag 3 werd
het groeimedium vervangen door selectiemedium met 2µg/mL puromycine. Op dag 4 werden
per conditie de drie replicates samen overgebracht naar een 12 well plaat. Op dag 5 werden de
cellen vervolgens overgebracht naar T25 falcons. Gedurende de transductie werden de cellen
dagelijks geëvalueerd door van iedere conditie foto's te nemen met een lichtmicroscoop en
fluorescentiemicroscoop. Na een aantal passages in T25 falcons werden de getransduceerde
cellen op basis van fluorescentie gesorteerd met behulp van FACS, waarna de fractie (12.88-
38.02%) met de hoogste fluorescentie gebruikt werd om verder in cultuur te houden. De
fractie (5.48-22.66%) met de laagste fluorescentie werd telkens als reserve in cultuur
gehouden.
2.2. Real-Time quantitative Reverse Transcriptase PCR
Om de BRCA- en miRNA expressie in de verschillende cellijnen na te gaan en te vergelijken,
werd gebruik gemaakt van Real-Time quantitative Reverse Transcriptase PCR (RT-qPCR).
Hiermee kon het cDNA simultaan geamplificeerd en gekwantificeerd worden.
2.2.1. RNA extractie
RNA extractie van de cellijnen gebeurde met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen) [39].
Figuur 9 geeft de verschillende stappen van het RNA extractie protocol weer. In een eerste
stap werden de cellen gelyseerd. Aan de lysebuffer werd β-mercaptoethanol toegevoegd,
waardoor de aanwezige RNases geïnactiveerd werden en degradatie van het RNA voorkomen
werd. Ethanol werd toegevoegd om optimale binding van het RNA met de silica membraan in
de kolom te bekomen. Om het RNA op te zuiveren werden de stalen 3 maal gewassen met een
18
wasbuffer. Met RNase vrij water konden alle RNA moleculen groter dan 200 nucleotiden
geëlueerd worden. Het geëlueerde RNA werd onmiddellijk op ijs geplaatst. Na het meten van
de RNA concentratie met behulp van de Dropsense (Trinean) worden de RNA stalen bij
-80°C bewaard om degradatie te voorkomen.
Figuur 9. Procedure RNA extractie [39].
2.2.2. miRNA extractie
Voor de miRNA extractie van de cellijnen werd gebruik gemaakt van de miRNeasy Mini Kit
(Qiagen) [40]. De miRNA extractie verloopt zeer gelijkaardig aan de RNA extractie, hier
werden naast de RNA moleculen ook de veel kleinere miRNA moleculen geëxtraheerd. Na
het lyseren van de cellen werd chloroform toegevoegd. Hierdoor werden verschillende fasen
verkregen: een waterfase die het RNA bevat, een interfase met het DNA en eiwitten en een
organische fase met eiwitten en het celdebris. Aan de waterfase werd ethanol toegevoegd,
waarna het protocol verder verloopt zoals bij de RNA extractie.
2.2.3. DNase behandeling
Om het resterend genomisch DNA (gDNA) te verwijderen uit de RNA stalen werd een DNase
behandeling uitgevoerd. Dit gebeurde met behulp van de Heat & Run gDNA removal kit
(Arcticzymes). Op de miRNA stalen werd geen DNase behandeling uitgevoerd. In deze studie
werd enkel naar mature miRNA's gekeken. De assays die hiervoor gebruikt werden, geven
geen amplificatie op het gDNA.
2.2.4. Reverse transcriptase
Omdat RNA zeer onstabiel is, werd het met behulp van de iScriptTM
cDNA synthesis Kit
(BIO-RAD) omgezet naar het veel stabielere complementary DNA (cDNA). Voor de reverse
transcriptase (RT) van de miRNA stalen werd gebruik gemaakt van de miScript II RT Kit
(Qiagen). Naast de miScript HiSpec buffer die specifiek is voor mature miRNA's, bevat de kit
ook een HiFlex buffer die naast de RT van mature miRNA's ook instaat voor de RT van
precursor miRNA, niet coderend RNA en mRNA. Aangezien voor dit project specifiek
gekeken werd naar mature miRNA's, werd gebruik gemaakt van de miScript HiSpec buffer.
19
2.2.5. Assays
2.2.5.1. Kwaliteitscontrole assays
Om na te gaan of de DNase behandeling en de RT goed verlopen waren, werden 3
kwaliteitscontrole (QC) assays uitgevoerd op de RNA stalen, die mogelijks nog restjes gDNA
bevatten, en op de cDNA stalen. Een overzicht van de forward en reversed primers van deze
assays wordt weergegeven in Bijlage 3. De intronische assay werkt enkel op gDNA en werd
gebruikt om na te gaan of het resterende gDNA volledig verwijderd is uit de stalen. Deze
assay was dus een controle voor de DNase behandeling. Een exon omspannende assay werd
uitgevoerd ter controle van de RT stap. Deze assay werkt enkel op het cDNA, want de
primers kunnen niet correct annealen op het gDNA aangezien hier nog interonen aanwezig
zijn. Als laatste werd een SPUD assay uitgevoerd. Hierbij werd aan elk staal een artificiële
template toegevoegd die met specifieke primers geamplificeerd werd. Als deze template in
een staal minder geamplificeerd werd dan in de andere stalen kon men besluiten dat dit staal
meer PCR inhibitoren bevatte. Hiermee moest rekening gehouden worden tijdens de analyse
van de qPCR resultaten.
2.2.5.2. BRCA assays
Om de BRCA expressie in de verschillende stalen na te gaan, werden assays voor BRCA1 en
BRCA2 uitgevoerd. Een overzicht van de forward en reversed primers van deze assays wordt
weergegeven in Bijlage 3. Voor BRCA1 werd gebruik gemaakt van de BRCA1_ex5FL en de
BRCA1_ex19 assay. Voor BRCA2 werd de BRCA2_ex4 assay gebruikt. Daarnaast werden
assays voor de referentiegenen YWHAZ, ALU en B2M uitgevoerd, waarvan reeds aangetoond
was dat deze stabiel tot expressie kwamen in de verschillende cellijnen.
2.2.5.3. miRNA assays
Om de miRNA expressie in de verschillende cellijnen na te gaan, werd gebruik gemaakt van
miRNA assays (Qiagen). Er was een specifieke assay voor hsa-miR146a-5p
(MIMAT0000449) en hsa-miR182-5p (MIMAT0000259). Daarnaast waren er assays voor
hsa-miR15b-5p (MIMAT0000417), hsa-miR-361-5p (MIMAT0000703) en hsa-let-7d-5p
(MIMAT0000065). Deze werden als referentiegenen gebruikt. Als laatste werd ook een
controle assay meegenomen, miR-ctrl-1. Deze controle assay amplificeert een artificiële
template, toegevoegd via de miScript Reverse Transcriptase Mix, en is vergelijkbaar met de
SPUD assay.
20
2.2.6. qPCR
Voor de qPCR werden de RNA en cDNA stalen met RNase vrij water verdund naar 5ng/µL.
Het cDNA verkregen na miRNA extractie werd verdund tot 0.625ng/µL. Per assay werd een
mastermix (MM) gemaakt, dit om variaties tijdens het pipetteren te verminderen. De MM
bestaat uit SSO AdvancedTM
SYBR® Green Supermix (BIO-RAD) en assay specifieke forward
en reversed primers (5µM) (zie bijlage 3). Voor de miRNA assays werd daarnaast nog een
universele primer (5µM) aan de MM toegevoegd. Voor elk staal werd in drievoud gewerkt.
De MM en het verdunde cDNA werden uitverdeeld in een qPCR plaat (384 well plaat),
waarna de plaat geladen werd in de LightCycler LC480 (Roche). De gebruikte qPCR
programma's voor de verschillende assays worden weergegeven in Tabel 2 en Tabel 3. Na de
run werden de smeltcurve en de smelttemperatuur (Tm) waarden geanalyseerd via de software
module Tm calling. Iedere dsDNA molecule heeft een specifieke smelttemperatuur. De
smelttemperatuur kon dus gebruikt worden om te controleren of de assay specifiek is en
slechts 1 amplicon genereert. Via de software module Abs quant/2nd derivative max. werden
de quantification cycle (Cq) waarden bekomen. Er is een omgekeerd evenredig verband
tussen de Cq-waarden en de hoeveelheid RNA/cDNA. De Cq-waarden werden verder
geanalyseerd met qbase+ (Biogazelle).
Tabel 2. qPCR programma QC en BRCA assays
Tijd Temperatuur
Pre-incubatie 2 min 95°C
Amplificatie
(45 cycli) 5 sec 95°C
30 sec 60°C
1 sec 75°C
Smeltcurve 5 sec 95°C
1 sec 60°C
Cooling 30 sec 40°C
Tabel 3. qPCR programma miRNA assays
Tijd Temperatuur
Pre-incubatie 15 min 95°C
Amplificatie
(45 cycli) 15 sec 94°C
30 sec 55°C
30 sec 70°C
Smeltcurve 5 sec 95°C
1 sec 60°C
Cooling 30 sec 40°C
2.3. Western blot
Om de BRCA1 en BRCA2 eiwitexpressie in de verschillende celculturen na te gaan en te
vergelijken werd Western Blot uitgevoerd.
2.3.1. Eiwitisolatie
Van de verschillende celculturen werd een subconfluente T75 falcon getrypsiniseerd. De
cellen werden overgebracht naar koud resuspensiemedium en voor 5 min gecentrifugeerd bij
1000rpm en 4°C. De celpellet werd geresuspendeerd in koude PBS en overgebracht naar een
21
epje, waarna het op dezelfde manier gecentrifugeerd werd. Vervolgens werden de cellen
gewassen met 500µL wasbuffer en gecentrifugeerd voor 5 min bij 3000rpm en 4°C. De
celpellet werd geresuspendeerd in 100µL lysebuffer A en gedurende 15 min op ijs op een
schudplaat geplaatst. Daarna volgde een centrifugatiestap van 2 min bij 5500 rpm en 4°C. Het
supernatans, de cytoplasmatische eiwitfractie, werd afgenomen en bewaard in 200µL
lysebuffer B bij -80°C. De overgebleven celpellet werd geresuspendeerd in 100µL
lysebuffer B en gedurende 15 min op ijs op een schudplaat geplaatst. Vervolgens werd
gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 5500rpm en 4°C. Het supernatans, de nucleaire
eiwitfractie, werd afgenomen en bewaard bij -80°C. De samenstelling van de wasbuffer en de
verschillende lysebuffers wordt weergegeven in bijlage 4.
De eiwitconcentraties van de verschillende stalen werden bepaald met behulp van de PierceTM
BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, cat.23225). Naast de stalen werd een
standaardreeks met gekende concentraties van Bovine Serum Albumine (BSA) meegenomen
in de analyse. Er werd telkens in drievoud gewerkt. Van de eiwitstalen werd 2.5µL samen met
22.5µL lysebuffer in een 96 well plaat overgebracht. Voor de standaardreeks werd de
stockconcentratie (2mg/mL) BSA in lysebuffer verdund, waarna van elke verdunning 25µL
overgebracht werd naar de 96 well plaat. Een werkoplossing van Reagens A en Reagens B in
een 50:1 ratio werd aangemaakt. Vervolgens werd 200µL werkoplossing aan elke well
toegevoegd, waarna de plaat voor 30 min geïncubeerd werd bij 37°C. De plaat werd
geanalyseerd bij 562nm met de spectrofotometer (EL800). De eiwitconcentratie van de stalen
werd bepaald na vergelijking met de standaardcurve.
2.3.2. SDS-PAGE
Met behulp van sodium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE)
werden de eiwitten op basis van hun moleculair gewicht gescheiden. Voor de SDS-PAGE
werd gebruik gemaakt van Novex 3-8% Tris-Acetaat gels (ThermoScientific). De gels werden
gelopen in een XCell running tank, gevuld met Tris-Acetaat runningbuffer. De Tris-Acetaat
runningbuffer werd gemaakt door 40mL Tris-Acetaat SDS Running buffer samen te voegen
met 760mL dH2O. 500µL antioxidant werd toegevoegd aan 200mL running buffer die
gebruikt werd om de binnenste kamer van de tank te vullen. Per staal werd 7.5µL LDS sample
buffer (Invitrogen) en 3µL DTT (Sigma) gebruikt. Hier werd de nodige hoeveelheid eiwit en
dH2O aan toe gevoegd, zodanig dat een totale hoeveelheid van 50µg eiwit bekomen werd in
30µL. De stalen werden gedurende 5 min geïncubeerd bij 50°C, waarna ze op de gel geladen
22
werden. Naast de stalen werd ook gebruik gemaakt van een ladder, Himark Pre-Stained
Protein Standard (30-460kDa) (Invitrogen) of Precision Plus ProteinTM
All Blue Standards
(10-250kDa) (BIO-RAD), waarvan 5µL op de gel geladen werd. De gel werd ongeveer 6 uur
gelopen bij 25mA.
2.3.3. Blotten naar PVDF membraan
Na de SDS-PAGE werden de eiwitten uit de gel getransfereerd naar een
polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Millipore). De membraan werd 15 min
voorbehandeld in zuivere methanol (Chem-Lab) Vervolgens werd een stack gemaakt waarbij
in een cassette een opeenstapeling gemaakt werd van een spons, 2 maal filterpapier, gel,
PVDF membraan, 2 maal filterpapier en spons. De cassette werd in de blotting tank (BIO-
RAD) geplaatst met de gel aan de negatieve pool en de membraan aan de positieve pool. De
blotting tank werd gevuld met blotting buffer (4.55g Tris (Sigma Aldrich), 21.62g glycine
(VWR) 1350mL dH2O en 150mL methanol), waarna het blotten overnacht bij 30 volt en 4°C
plaatsvond.
2.3.4. Immunodetectie
Om aspecifieke binding van de antilichamen te voorkomen, werd de PVDF membraan
gedurende 1 uur geblokkeerd in blokking buffer. De samenstelling van de blokking buffer
wordt weergegeven in bijlage 4. Na het blokken werd de membraan indien nodig, als
verschillende antilichamen gebruikt werden die niet compatibel zijn, versneden. Vervolgens
werd het primair antilichaam toegevoegd. De antilichamen werden verdund in
verdunningsbuffer (zie bijlage 4). Een overzicht van de gebruikte antilichamen wordt
weergegeven in Tabel 4.
Tabel 4. Overzicht antilichamen Western Blot.
Antilichaam Firma Verdunning
α-actinine SantaCruz, sc-17829 1/100.000
α-BRCA1 Millipore, OP-107 1/200
α-BRCA2 Millipore, OP-95 1/500
RAM-hrp Perbio, 31450 1/1000
GAR-hrp Perbio, 31460 1/1000
Na 24 uur incubatie met het primair antilichaam bij 4°C, werd de membraan achtereenvolgens
voor 1 min, 10 min en 3 maal 5 min gewassen met de wasbuffer (zie bijlage 4). De secundaire
antilichamen, RAM-hrp voor BRCA2 en actinine en GAR-hrp voor BRCA1, werden
23
toegevoegd. Hiermee werd voor 1.5 uur geïncubeerd bij 4°C, waarna opnieuw de zelfde
wasstappen plaatsvonden. Detectie van de western blot gebeurde met behulp van de
SuperSignalTM
West Dura Extended Duration Substrate Kit (ThermoScientific, 34076). Deze
kit bevat een luminol substraat, dat interageert met het horseradisch peroxidase (HRP) dat
gebonden zit op het secundair antilichaam. De bekomen chemoluminiscentie kon vervolgens
gedetecteerd worden met de VisionWorks LS Analysis software en het Chemidoc-it imaging
system (UVP). Kwantificatie van de gedetecteerde bandjes gebeurde met Image J.
2.4. ELISA BRCA1
Met behulp van een ELISA kit specifiek voor BRCA1 (Antibodies-online Inc.
cat.ABIN416981) werd de BRCA1 eiwit expressie in de verschillende cellijnen
gekwantificeerd. De MCF10A celculturen werden gewassen in ijskoude PBS, waarna de
cellen geteld werden met behulp van de CellometerTM
auto T4 (Nexcelcom Bioscience). De
celculturen werden vervolgens gelyseerd door 2 maal 10sec te soniceren met een amplitude
van 40 en pulse van 2 sec. Figuur 10 geeft de procedure van ELISA weer. De ELISA werd
uitgevoerd zoals beschreven in de handleiding. Een standaardreeks, 0 tot 10ng/µL, en de
stalen werden aangebracht in de ELISA plaat gecoat met een antilichaam voor BRCA1. In een
tweede stap werd detectie reagens A, met een tweede antilichaam voor BRCA1 gebonden met
biotine, toegevoegd. Na enkele wasstappen werd detectie reagens B toegevoegd. Deze bevat
avidine gebonden met HRP. Opnieuw vonden enkele wasstappen plaats, waarna
tetramethylbenzidine (TMB) substraat toegevoegd werd. TMB interageert met HRP waardoor
de oplossing een blauwe kleur kreeg. Na toevoeging van de Stop Solution, wat een
zwavelzuur bevat, veranderde de blauwe kleur naar geel. De gele kleurintensiteit kon
gedetecteerd worden met behulp van spectrofotometrie bij een golflengte van 450nm. De
concentratie van BRCA1 in de stalen werd vervolgens bepaald door vergelijking met de
standaardcurve.
Figuur 10. Procedure ELISA.
24
2.5. Flowcytometrie
Een confluente en een subconfluente MCF10A cultuur werden getrypsiniseerd en
overgebracht naar een proefbuis met PBS. Na een centrifugatiestap van 5 min (1000rpm),
werd de celpellet geresuspendeerd in 0.5mL PBS. De cellen werden gefixeerd door al
vortexend 3mL 95% ethanol (-20°C) toe te voegen, waarna de proefbuizen voor 30 min bij -
20°C geplaatst werden. Vervolgens werd de celsuspensie voor 10 min gecentrifugeerd
(1000rpm), gewassen met 2mL PBS en nogmaals 5 min gecentrifugeerd. Het supernatans
werd verwijderd en 500µL hypotone staining buffer werd toegevoegd (Tabel 5).
De stalen werden uitgelezen met behulp van de BD FACSCanto II flowcytometer (BD
Biosciences). Op basis van de forward en side scatter (FSC en SSC) werden single cells
geselecteerd. De propidium iodide (PI) concentratie is een maat voor de hoeveelheid DNA
aanwezig in de cel. De hoeveelheid DNA is op zijn beurt een merker voor de fase van de
celcyclus waarin de cel zich bevindt. Een cel in G2/M fase zal dubbel zo veel DNA bevatten
dan een cel in G0/G1 fase van de celcyclus. Cellen met een DNA concentratie tussen deze van
G0/G1 en G2/M fase bevinden zich in S fase van de celcyclus.
Tabel 5. Samenstelling hypotone oplossing.
Product Firma Hoeveelheid
TRIS sodium citraat Sigma Aldrich 0.025g
Triton X-100 Sigma Aldrich 0.075mL
Ribonuclease A Sigma Aldrich 0.0005g
Propidium Iodide (1mg/mL) Sigma Aldrich 250µl
dH2O 25mL
2.6. Functionele testen
2.6.1. Immuunkleuring
Van de verschillende celculturen werden 200.000 cellen uitgezaaid in 6 well platen. De cellen
werden bestraald met X-stralen (220kV), geproduceerd door het Small animal radiation
research platform (SARRP) (Infinity lab, UGent), met een dosistempo van 2.77Gy/min
gedurende 217 sec wat resulteerde in een totale dosis van 10Gy. Per conditie werd ook een
0Gy controle onderzocht.
2.6.1.1. Optimalisatie RAD51 imuunkleuring
Voor de optimalisatie van de RAD51 immuunkleuring werd gebruik gemaakt van de
MCF10A GFP en de MCF10A BRCA2.1 cellijnen.
25
Om de optimale concentratie van het primair antilichaam RAD51 (Santa Cruz, sc-8349) te
bepalen, werden verschillende concentraties, gaande van 1:150 tot 1:6000, getest. Ook de
optimale incubatietijd van het primair antilichaam werd nagegaan. Hiervoor werden slides
30 min (37°C), 1 uur (kamertemperatuur) of overnacht (4°C) geïncubeerd met het primair
antilichaam. Het optimale tijdstip na bestraling om de celculturen te fixeren werd bepaald aan
de hand van een tijdsexperiment. Celculturen werden 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 uur na bestraling
getrypsiniseerd en gefixeerd in 3% paraformaldehyde (PFA) (VWR).
2.6.1.2. γH2AX/RAD51 foci assay
Van de verschillende celculturen werden cellen 5 uur en 24 uur na bestraling (10Gy)
gefixeerd. Hiervoor werden de celculturen getrypsiniseerd, gewassen met PBS, 5 min bij 1000
rpm gecentrifugeerd en geresuspendeerd in 250µL resuspensiemedium. Vervolgens werd
200µL celsuspensie op een polysine slide aangebracht met behulp van de Cytospin (Cellspin
I, Tharmac). Ter hoogte van de celpellet werd met een diamand pen een krasje aangebracht op
de slide. De slides werden gedurende 20 min gefixeerd in 3% PFA. De slides konden na deze
stap overnacht bij 4°C bewaard worden in 0.5% PFA of er kon onmiddellijk verder gewerkt
worden. De slides werden 2 maal 5 min gewassen in PBS, waarna antigen retrieval
plaatsvond door ze voor 20 min in citraatbuffer in een steamer te plaatsen. De citraatbuffer
werd gemaakt door 0.1g citroenzuur (Merck) op te lossen in 500 mL gedestileerd water,
waarna het op een pH van 6 tot 6.1 gebracht werd met behulp van NaOH en HCl. De
citraatbuffer werd voor gebruik reeds 20 min voorverwarmd in de steamer tot 92°C. Na de
antigen retrieval werden de slides in de citraatbuffer voor 15 min op kamertemperatuur
geplaatst om af te koelen. Met Dako Pen werd de pellet afgebakend, waarna ze 2 maal 5
minuten gewassen werden met PBS. De slides werden 30 min behandeld met blokkingsserum
(5mL PBS, 0.05g BSA (Roche), 250µL Normal Goat Serum (NGS) (Dako, X0907) en 100µL
Tween 20 10% (ICN Biomedicals)) om aspecifieke binding van de antilichamen te
verhinderen. De primaire antilichamen, RAD51 (Santa Cruz, sc-8349) en anti-γH2AX
(Biolegend, cat.613402), werden toegevoegd in respectievelijk 1:2000 en 1:8000 met een
verdunningsbuffer (9mL PBS en 1mL blokkingsserum). De slides werden overnacht bij 4°C
bewaard in een vochtige ruimte. Na 5 wasstappen van 2 min met PBS + Tween 20 0.3%
werden de fluorescente secundaire antilichamen voor 30 min toegevoegd in 1:1000
concentratie. Voor RAD51 en γH2AX zijn dit respectievelijk het groen fluorescente
geit anti-konijn (GAR-Alexa-488) (ThermoScientific) en het rood fluorescente geit anti-muis
26
(GAM-AF-555) (ThermoScientific) antilichaam. Vervolgens werd opnieuw 5 maal 2 min
gewassen met PBS + Tween 20 0.3%. Daarna werd 35µL fluoromount (Sigma Aldrich) met
DAPI (Sigma Aldrich) in een concentratie van 200ng/mL op de slides aangebracht. DAPI is
een blauw fluorescente kleurstof die intercalleert met het DNA. Dit werd opgelost in
fluoromount om fading van het fluorescent signaal te voorkomen. De slides werden afgedekt
met een dekglaasje en bewaard bij 4°C.
2.6.1.3. Analyse
Het aantal RAD51 en γH2AX foci werden geteld met behulp van het automatisch scanning
platform Metafer 4 (Metasystems), waarbij gebruik gemaakt werd van de software MetaCyte.
Indien mogelijk worden 500 cellen geteld per conditie. Hiervoor werd gebruik gemaakt van
de classifier specifiek voor MCF10A cellen (Bijlage 5). Celkernen werden geselecteerd onder
een DAPI filter, waarna RAD51 en γH2AX foci automatisch geanalyseerd werden onder
respectievelijk een FITC en TRITC filter. De resultaten werden verder geanalyseerd met
behulp van R.
2.6.2. Micronucleus test
Van de verschillende celculturen werden 2 T25 falcons met 1.5 x106 cellen uitgezaaid. Van
iedere celcultuur werd de volgende dag een 3Gy bestraling uitgevoerd op 1 T25 falcon. De
andere T25 falcon diende als 0Gy controle. De celculturen werden voor 65 sec bestraald aan
een dosistempo van 2.77Gy/min met het SARRP (Infinity lab, UGent). Direct na bestraling
werd aan alle celculturen 9µL Cyto B (Sigma) toegevoegd, waardoor binucleaire cellen
verkregen werden. 16 uur na bestraling werden de celculturen getrypsiniseerd en met PBS
overgebracht naar een proefbuis. Na een centrifugatiestap van 5 min (1000rpm) en het
verwijderen van het supernatans, werd druppelgewijs al vortexend 5mL 75µM KCl (4°C)
toegevoegd. Hierna volgde opnieuw een centrifugatiestap van 5 min, waarna het supernatans
afgenomen werd. Vervolgens werden de stalen voor de 1e maal gefixeerd door druppelgewijs
al vortexend 5mL methanol:ijsazijn:ringer (4°C) in een verhouding van 3:1:4 toe te voegen,
waarna de stalen overnacht bij 4°C bewaard werden. Na een centrifugatiestap van 5 min en
het verwijderen van het 1e fixatief, werden de stalen voor een 2e maal gefixeerd door
druppelgewijs al vortexend 5mL methanol:ijsazijn (4°C) in een verhouding van 3:1 toe te
voegen. De stalen werden overnacht bewaard bij 4°C. De stalen werden opnieuw
gecentrifugeerd zoals in de vorige stappen. Het 2e fixatief werd afgenomen tot ongeveer 1-
2cm boven de celpellet. Afhankelijk van de grootte van de celpellet moest deze hoeveelheid
27
eventueel aangepast worden tot de gewenste celconcentratie. Vervolgens werd 40µL
celsuspensie aangebracht op een draagglaasje. Per conditie werden 2 slides gemaakt. 2
druppels DAPI Vectashield® (vector laboratories) werden op het draagglaasje aangebracht
om de celkernen en MN te kleuren. DAPI is een blauwe fluorescente kleurstof die
intercalleert met het DNA. DAPI is opgelost in Vectashield® om fading van het fluorescent
signaal tegen te gaan. De slide werd afgedekt met een dekglaasje en bewaard bij 4°C. De
binucleaire cellen en MN werden geteld met behulp van het Metafer4 automatisch scanning
platform (Metasystems), waarbij gebruik gemaakt werd van de MSearch, MNScore software.
Per slide werden 1000 binucleaire cellen geanalyseerd op de aanwezigheid van MN. Hiervoor
wordt een classifier specifiek voor MCF10A cellen gebruikt (Bijlage 6). Omdat de metafer
niet 100% accuraat telt, werden de slides door 2 personen manueel nageteld. De resultaten
van de automatische en manuele tellingen werden nadien in Excel verder geanalyseerd, waar
het gemiddeld aantal MN per 1000 binucleaire cellen berekend werd.
3. Resultaten
3.1. Optimalisatie transductie condities
Uit de experimenten beschreven in 2.1.2.1. blijkt dat een celconcentratie van 5·103 tot 10
4
cellen geschikt is om een 40-80% confluente cultuur te bekomen. Voor de transductie werd
gebruik gemaakt van 104 cellen. Transductie medium zonder FCS met een polybreen
concentratie van 8µg/mL en een incubatietijd van 24 uur zijn optimaal om de transductie uit
te voeren.
Om de optimale puromycine concentratie voor het selectiemedium te bepalen werd een kill
curve experiment uitgevoerd. Zo werd de laagste puromycine concentratie bekomen waarbij
alle niet-getransduceerde cellen, die in tegenstelling tot de getransduceerde cellen geen
puromycine resistentie gen bevatten, dood gaan. Figuur 11 toont de resultaten van dit
experiment. Zelfs bij een zeer lage puromycine concentratie (0.5µg/mL) waren alle
MCF10A WT cellen na 84 uur dood. 2µg/mL was de laagste puromycine concentratie,
waarbij zo snel mogelijk alle MCF10A WT cellen dood waren. Het is dan ook deze
concentratie die gebruikt werd in het selectiemedium.
28
Figuur 11. Heat map kill curve experiment: Viabiliteit van MCF10A WT cellen na behandeling met
puromycine.
3.2. Lentivirale transductie
De lentivirale partikels voor miR146a-5p en miR182-5p werden aangekocht bij de firma's
Dharmacon en Biosettia. Aangezien de vectoren naast een puromycine resistentie gen ook een
rood (Biosettia) of groen (Dharmacon) fluorescente merker bevatten, konden de
getransduceerde cellen geselecteerd worden door puromycine toe te voegen aan het
groeimedium en door de cellen te selecteren op basis van hun fluorescentie met behulp van
FACS. Figuur 12 toont een beeld van de getransduceerde cellen onder een
fluorescentiemicroscoop. Door de aanwezigheid van de rood of groen fluorescente merker
(mCherry/GFP) in de lentivirale vectoren, waren de cellijnen rood of groen fluorescent.
Figuur 12. Cellijnen na transductie onder fluorescentiemicroscoop: mCherry (links) en GFP (rechts).
3.2.1. FACS
De getransduceerde cellen werden verder geselecteerd met behulp van FACS (Figuur 13). In
een eerste gate werden de cellen gescheiden van het celdebris. Vervolgens werden de single
cells geselecteerd op basis van de FSC height en de SSC width. Als laatste werden de cellen
gesorteerd op basis van de intensiteit van hun rood en groen fluorescent signaal. Hoe hoger
het fluorescent signaal, hoe beter de transductie gelukt was en hoe meer het vectorconstruct
tot expressie kwam. Van iedere getransduceerde cellijn werd de fractie cellen met het hoogst
fluorescent signaal gebruikt om verder in cultuur te houden. Als reserve werd ook de fractie
met het laagst fluorescent signaal in cultuur gehouden. Van de miR146a-GFP cellijn was de
hoge fractie verloren gegaan. Voor deze cellijn werd verder gewerkt met de lage fractie.
29
Figuur 13. Overzicht van de selectie van de getransduceerde cellen met behulp van FACS.
3.2.2. miRNA expressie in getransduceerde cellijnen
Om na te gaan of de getransduceerde cellijnen het gewenste miRNA tot overexpressie
brengen, werd RT-qPCR uitgevoerd. De referentiegenen let-7d-5p, miR-15b-5p en
miR-361-5p kwamen stabiel tot expressie in de verschillende cellijnen en werden gebruikt ter
normalisatie. In Figuur 14 wordt de relatieve expressie van miR146a-5p en miR182-5p in de
getransduceerde cellijnen ten opzichte van de MCF10A WT cellijn weergegeven.
Figuur 14. Relatieve expressie van miR146a-5p en miR182-5p in de getransduceerde cellijnen ten opzichte
van de MCF10A WT cellijn.
30
miR146a-5p kwam respectievelijk 9.63·104
± 5.92·103 en 3.18·10
4 ± 1.87·10
3 keer meer tot
expressie in de MCF10A miR146a-GFP en de MCF10A miR146a-mCherry cellijn dan in de
ancestrale MCF10A WT cellijn. miR182-5p kwam respectievelijk 23.17 ± 1.66 en 151.40 ±
7.72 keer meer tot expressie in de MCF10A miR182-GFP en de MCF10A miR182-mCherry
cellijn dan in de ancestrale MCF10A WT cellijn.
3.3. BRCA expressie in getransduceerde cellijnen
3.3.1. RT-qPCR
Om de BRCA expressie op mRNA niveau te vergelijken in de verschillende getransduceerde
cellijnen werd RT-qPCR uitgevoerd. De gebruikte referentiegenen, YWHAZ, ALU en B2M,
hadden een gemiddelde GeNorm expression stability value of the reference gene (M-waarde)
van 0.312 en een gemiddelde coefficient of variation of the normalized reference gene relative
quantities (CV) van 0.13. Aangezien deze waarden respectievelijk kleiner waren dan 0.5 en
0.2, kwamen de referentiegenen stabiel tot expressie in de verschillende cellijnen en konden
deze gebruikt worden om de RT-qPCR resultaten te normaliseren. Wegens een tekort aan
cDNA kon geen QC uitgevoerd worden op deze stalen, hiermee moet rekening gehouden
worden tijdens de interpretatie van de resultaten. Figuur 15 toont de RT-qPCR resultaten van
de BRCA assays op de MCF10A WT en de getransduceerde cellijnen.
Figuur 15. Relatieve expressie van BRCA1_ex5FL, BRCA1_ex19 en BRCA2_ex4 in de GFP
getransduceerde cellijnen (bovenaan) en de mCherry getransduceerde cellijnen (onderaan) ten opzichte
van de MCF10A WT cellijn.
Voor de GFP cellijnen was er enkel in de MCF10A miR182-GFP cellijn een zeer lichte
neerregulatie zichtbaar van BRCA1_ex19 ten opzichte van de MCF10A miRCon-GFP en de
31
MCF10A WT cellijn. In de mCherry cellijnen was zowel in de MCF10A miR146a-mCherry
als in de MCF10A miR182-mCherry cellijn een lichte neerregulatie van de BRCA1_ex19
expressie zichtbaar ten opzichte van de MCF10A WT cellijn. Wanneer de expressie in deze
cellijnen vergeleken werd met de miRCon-mCherry cellijn, was geen verschil meer
detecteerbaar. De BRCA1_ex5 expressie was in alle cellijnen stabiel. BRCA2_ex4 kwam in
de getransduceerde cellijnen meer tot expressie dan in de MCF10A WT cellijn.
3.3.2. Western blot
Om de BRCA expressie op eiwitniveau na te gaan in de verschillende cellijnen werd gebruik
gemaakt van western blot.
In Figuur 16 zijn de western blot resultaten voor BRCA1 weergegeven. De ladingscontrole,
actinine, was bij alle stalen duidelijk aanwezig en kon dus voor verdere analyse gebruikt
worden om te normaliseren. Enkel bij de MCF10A WT en de partiële BRCA1 knockdown
cellijn, MCF10A BRCA1.3, was een duidelijk bandje zichtbaar ter hoogte van 220kDa. Bij de
andere stalen was een zeer licht bandje te zien. Daarnaast waren er nog aspecifieke bandjes
zichtbaar boven 250kDa.
Figuur 16. Western blot voor BRCA1 in MCF10A cellijnen getransduceerd met miRNA's, de MCF10A
WT cellijn en een partiële BRCA1 knockdown cellijn (MCF10A BRCA1.3). α-actinine in een 1/100.000
concentratie werd gebruikt als ladingscontrole.
Figuur 17 geeft de relatieve BRCA1 eiwitexpressie ten opzichte van de MCF10A WT cellijn
weer, na normalisatie met behulp van actinine. Wanneer de MCF10A BRCA1.3 cellijn
vergeleken werd met de MCF10A WT cellijn, was een neerregulatie van ongeveer 30%
waarneembaar. Hieruit kon men besluiten dat het bandje ter hoogte van 220kDa wel degelijk
BRCA1 is. In de miRNA cellijnen werd een veel lagere expressie waargenomen van BRCA1
ten opzichte van de MCF10A WT cellijn, dit was echter ook zo voor de miRCon-GFP cellijn,
waarin een vector met scrambled miRNA werd getransduceerd, en voor de miRCon-mCherry
32
cellijn, waarin een lege vector getransduceerd werd. Wanneer de miR146a-mCherry
vergeleken werd met de miRCon-mCherry cellijn, was een relatieve expressie van 0.03 ten
opzichte van 0.12 waarneembaar, wat wijst op een sterke neerregulatie. Voor de miR182-
mCherry cellijn werd geen bandje gedetecteerd ter hoogte van 220kDa. De miR146a-GFP
cellijn vertoonde geen neerregulatie van BRCA1 ten opzichte van de miRCon-GFP cellijn.
Voor de miR182-GFP cellijn was een neerregulatie van 50% detecteerbaar ten opzichte van
de miRCon-GFP cellijn.
Figuur 17. Relatieve BRCA1 eiwitexpressie ten opzichte van de MCF10A WT cellijn na normalisatie met
behulp van actinine.
In Figuur 18 worden de western blot resultaten voor BRCA2 weergegeven.
Figuur 18. Western blot voor BRCA2 in MCF10A cellijnen getransduceerd met miRNA's en de MCF10A
WT cellijn. α-actinine in een 1/100.000 concentratie werd gebruikt als ladingscontrole.
De ladingscontrole, actinine, was bij alle stalen duidelijk zichtbaar en kon gebruikt worden
om de BRCA2 expresie in de verschillende stalen te normaliseren. Voor BRCA2 was steeds
een bandje ter hoogte van 460kDa en een bandje ter hoogte van 230kDa aanwezig. Na
33
kwantificatie met ImageJ en normalisatie met behulp van actinine, werd de relatieve BRCA2
expressie in de verschillende cellijnen ten opzichte van de MCF10A WT cellijn berekend
(Figuur 19). BRCA2 230kDa kwam in de meeste cellijnen stabiel tot expressie. Enkel in de
miR146a-mCherry cellijn was een neerregulatie van ongeveer 50% zichtbaar. Er werd meer
variatie waargenomen in de BRCA2 460kDa expressie. Voor BRCA2 460kDa was enkel in
de miR146a-mCherry en de miR182-mCherry cellijn een neerregulatie zichtbaar. In de
miRCon cellijnen alsook in de miR146a-GFP en miR182-GFP cellijnen werd meer BRCA2
460kDa gedetecteerd dan in de MCF10A WT cellijn.
Figuur 19. Relatieve BRCA2 eiwitexpressie ten opzichte van de MCF10A WT cellijn na normalisatie met
behulp van actinine.
3.3.3. ELISA
Naast western blot werd ook ELISA uitgevoerd om de BRCA1 expressie op eiwitniveau in de
verschillende cellijnen te kwantificeren. Na het analyseren van de standaardreeks werd een
standaardcurve bekomen met vergelijking y = 1,96x - 3,44 en R² = 0,95. Figuur 20 geeft een
overzicht van de relatieve BRCA1 concentratie in de verschillende cellijnen ten opzichte van
de MCF10A WT cellijn. In de MCF10A BRCA1.3 cellijn was de BRCA1 concentratie
gedaald met 71% ten opzichte van de MCF10AWT cellijn. Voor de miR146a-mCherry en de
miR182-mCherry cellijn werd een neerregulatie van ongeveer 40% waargenomen ten
opzichte van de MCF10A WT cellijn. In de miRCon-mCherry cellijn werd geen BRCA1
expressie waargenomen. In de miR146a-GFP en miR182-GFP cellijnen werd geen
neerregulatie van de BRCA1 expressie gedetecteerd. De miRCon-GFP cellijn daarentegen
vertoonde 70% minder BRCA1 expressie dan de MCF10A WT cellijn.
34
Figuur 20. Relatieve BRCA1 concentratie ten opzichte van de MCF10A WT cellijn.
3.4. BRCA expressie na bestraling
Aangezien met de voorgaande testen geen duidelijk effect van de miRNA's waarneembaar
was op de BRCA1/2 expressie en men na bestraling via activatie van de DDR pathway een
opregulatie van de BRCA1/2 expressie verwacht, werd besloten de testen te herhalen na
bestraling. Om het tijdstip na bestraling (10Gy) met maximale BRCA expressie te bepalen
werd RT-qPCR uitgevoerd. In een eerste experiment werden MCF10A WT stalen van 1, 3, 6
en 24 uur na bestraling geanalyseerd. In een tweede experiment werden MCF10A WT stalen
van 30 min, 1 en 3uur na bestraling geanalyseerd. De QC assays leverden de gewenste
resultaten op (Figuur 21).
Figuur 21. Resultaten QC assays: SPUD assay (bovenaan), intronische assay (midden) en exon
omspannende assay (onderaan).
De artificiële template van de SPUD assay kwam in de stalen iets minder tot expressie dan in
de negatieve controle, maar de expressie tussen de stalen zelf was wel gelijk. Hieruit kon men
35
besluiten dat alle stalen evenveel PCR inhibitoren bevatten. De intronische assay gaf bij geen
enkel staal amplificatie wat er op wijst dat de DNase behandeling gelukt is. De exon
omspannende assay gaf bij alle stalen ongeveer evenveel amplificatie, waaruit men kon
besluiten dat de RT in alle stalen gelukt is. De referentiegenen ALU, B2M en YWHAZ
kwamen in beide RT-qPCR analyses stabiel tot expressie en werden gebruikt om de
RT-qPCR resultaten te normaliseren. Figuur 22 geeft de resultaten van de twee RT-qPCR
analyses weer.
Figuur 22. Relatieve expressie van BRCA1_ex5, BRCA1_ex19 en BRCA2_ex4 in MCF10A WT cellen 1, 3,
6 en 24 uur na bestraling (bovenaan) en 30 min, 1 en 3 uur na bestraling (onderaan).
In de eerste RT-qPCR was er een lichte opregulatie in BRCA expressie te zien 1 uur na
bestraling ten opzichte van de 0Gy controle. 3, 6 en 24 uur na bestraling was geen opregulatie
in BRCA expressie meer waarneembaar. De BRCA expressie was hier zelfs lager dan in de
0Gy controle. In de tweede RT-qPCR was 30 min na bestraling een lichte opregulatie van de
BRCA expressie te zien. 1 uur na bestraling was enkel nog een lichte opregulatie van
BRCA2_ex4 zichtbaar. 3 uur na bestraling was geen opregulatie van BRCA expressie meer
waar te nemen.
Om de BRCA eiwitexpressie na bestraling na te gaan, werd een western blot voor BRCA1 en
BRCA2 uitgevoerd op MCF10A WT stalen geïsoleerd 30 min, 1 en 3 uur na een 10Gy
bestraling.
Op de western blot voor BRCA1 (Figuur 23) was in de cytoplasmatische fractie een sterker
bandje voor BRCA1 zichtbaar 30 min en 1 uur na bestraling in vergelijking met het niet
36
bestraald staal. 3 uur na bestraling was geen bandje voor BRCA1 meer zichtbaar. Bij de
nucleaire eiwitfracties is zo goed als geen signaal zichtbaar, dit mogelijks door een fout
tijdens de eiwitisolatie waar bij een foutieve snelheid gecentrifugeerd werd. De
ladingscontrole, actinine, kwam in alle stalen stabiel tot expressie en werd gebruikt om de
BRCA1 eiwitexpressie in de verschillende stalen te normaliseren tijdens de kwantificatie.
Figuur 23. Western blot BRCA1: Cytoplasmatische fractie (links) en nucleaire fractie (rechts) van
MCF10A WT cellen niet bestraald, 30 min, 1 en 3 uur na bestraling. α-actinine in een 1/250.000
concentratie werd gebruikt als ladingscontrole.
Figuur 24 geeft de relatieve BRCA1 eiwitexpressie weer ten opzichte van de
cytoplasmatische fractie van het niet bestraalde MCF10A WT staal, na normalisatie met
behulp van actinine. In de cytoplasmatische eiwitfracties was een verdubbeling van de
BRCA1 eiwitexpressie waar te nemen 30 min en 1 uur na bestraling. 3 uur na bestraling was
praktisch geen BRCA1 expressie meer aanwezig in de MCF10A WT cellen. In de nucleaire
fracties waren slechts minimale hoeveelheden BRCA1 detecteerbaar.
Figuur 24. Relatieve BRCA1 eiwitexpressie ten opzichte van niet bestraalde MCF10A WT cellen na
normalisatie met actinine.
Op de western blot voor BRCA2 (Figuur 25) waren minder duidelijke verschillen
waarneembaar tussen de verschillende stalen. In de cytoplasmatische fracties werden enkel
37
bandjes voor BRCA2 ter hoogte van 230kDa gedetecteerd. In de nucleaire fractie werden ook
lichte bandjes ter hoogte van 460kDa gedetecteerd.
Figuur 25. Western blot BRCA2: Cytoplasmatische fractie (links) en nucleaire fractie (rechts) van
MCF10A WT cellen niet bestraald, 30 min, 1 en 3 uur na bestraling. α-actinine in een 1/250.000
concentratie werd gebruikt als ladingscontrole.
Figuur 26 geeft de relatieve BRCA2 eiwitexpressie weer ten opzichte van de
cytoplasmatische fractie van het niet bestraalde MCF10A WT staal, na normalisatie met
behulp van actinine. In de cytoplasmatische eiwitstalen was bijna geen opregulatie van
BRCA2 230kDa expressie zichtbaar na bestraling. In de nucleaire eiwitstalen was voor
BRCA2 230kDa ten opzichte van de nucleaire fractie van het niet bestraalde MCF10A WT
staal een opregulatie zichtbaar 1 en 3 uur na bestraling. Voor BRCA2 460kDa was 30 min en
1 uur na bestraling een opregulatie detecteerbaar ten opzichte van het niet bestraalde
MCF10A WT staal. 3 uur na bestraling was 64% minder BRCA2 460kDa aanwezig dan in het
niet bestraald staal.
Figuur 26. Relatieve BRCA2 eiwitexpressie ten opzichte van niet bestraalde MCF10A WT cellen na
normalisatie met actinine.
38
3.5. Flow cytometrie
Homologe recombinatie kan enkel plaatsvinden in S en G2/M fase van de celcyclus. Om op
functioneel vlak een maximaal effect waar te nemen, werd met flow cytometrie nagegaan
hoeveel procent van de cellen zich in deze fase van de celcyclus bevonden bij een confluente
en een subconfluente MCF10A cultuur.
In Figuur 27 worden de flow cytometrie resultaten van een confluente MCF10A cultuur
weergegeven. 92.8% van de gedetecteerde cellen waren single cells. Hiervan bevonden 86.3%
van de cellen zich in G0/G1 fase van de celcyclus, 4.2% van de cellen bevond zich in S fase
en 2.1% van de cellen bevond zich in G2/M fase.
Figuur 27. Resultaten flow cytometrie: confluente MCF10A cultuur.
Figuur 28 geeft de flow cytometrie resultaten van een subconfluente MCF10A cultuur weer.
92.9% van de gedecteerde cellen waren single cells. Hiervan bevonden 44.6% zich in G0/G1
fase van de celcyclus, 28.6% van de cellen bevond zich in S fase en 18.5% van de cellen
bevond zich in G2/M fase.
Figuur 28. Resultaten flow cytometrie: subconfluente MCF10A cultuur.
Uit de flow cytometrie resultaten werd besloten om voor de functionele testen steeds met
subconfluente celculturen te werken om een maximaal effect te kunnen waarnemen.
3.6. Functionele testen
3.6.1. Optimalisatie RAD51 foci assay
Na het uittesten van verschillende concentraties en incubatieperioden van het primair
antilichaam, bleek een overnacht incubatie bij 4°C met een 1:2000 concentratie optimaal te
zijn.
39
Figuur 29 geeft een overzicht weer van de resultaten van de RAD51 immuunkleuring waarbij
de MCF10A GFP cellen, dit is een controle cellijn voor de partiële knockdown cellijen voor
BRCA1/2, op verschillende tijdstippen na bestraling gefixeerd werden. 2 uur na bestraling
waren nog bijna geen RAD51 foci zichtbaar. Hoe langer gewacht werd na bestraling om te
fixeren, hoe meer foci detecteerbaar waren.
0Gy 10Gy_2h 10Gy_3h 10Gy_4h
10Gy_5h 10Gy_6h 10Gy_7h 10Gy_8h
Figuur 29. Overzicht RAD51 immuunkleuring van MCF10A GFP cellen met fixatie op verschillende
tijdstippen na bestraling.
Figuur 30 geeft een overzicht van de manuele tellingen van het aantal foci in 100 MCF10A
GFP cellen van de 0Gy conditie en de 10Gy condities die 4, 5 en 6 uur na bestraling gefixeerd
werden. Vanaf 5 uur na bestraling waren voldoende foci aanwezig in de cellen om analyse uit
te voeren. Omdat op een later tijdstip fixeren geen meerwaarde bood en dit praktisch ook
minder haalbaar was, werd gekozen om de fixatie van de cellen 5uur na bestraling uit te
voeren.
Figuur 30. Manuele telling van het aantal foci in 100 MCF10A GFP cellen per conditie.
11
30
18 12
35
47
65
0
10
20
30
40
50
60
70
0Gy 10Gy - 4h 10Gy - 5h 10Gy - 6h
0
1 tot 10
10+
20+
40
3.6.2. γH2AX/RAD51 foci assay
Figuur 31 geeft een overzicht van een γH2AX/RAD51 immuunkleuring op een niet bestraald
(0Gy) en een bestraalde (10Gy) MCF10A miRCon-mCherry celcultuur.
Figuur 31. Overzicht γH2AX/RAD51 immuunkleuring: 0Gy en 10Gy conditie. RAD51 foci (groen),
γH2AX foci (rood).
In Figuur 32 wordt het aantal γH2AX foci en RAD51 foci in functie van het aantal cellen van
de miRCon-mCherry 0Gy conditie vergeleken met de miRCon-mCherry 10Gy 5 uur conditie.
Er waren duidelijk meer γH2AX en RAD51 foci aanwezig in de bestraalde celcultuur dan in
de niet bestraalde celcultuur. Voor de miRCon-GFP 0Gy en miRCon-GFP 10Gy 5 uur
condities werd gelijkaardige data verkregen.
Figuur 32. Barplot van het aantal γH2AX foci (links) en RAD51 foci (rechts) in functie van het aantal
cellen van miRCon-mCherry 0Gy (blauw) ten opzichte van miRCon-mCherry 10Gy 5 uur (rood). Overlap
van de 2 condities (paars).
Figuur 33 toont het aantal γH2AX foci en RAD51 foci in functie van het aantal cellen van de
miRCon-mCherry 10Gy 5 uur conditie vergeleken met de miRCon-mCherry 10Gy 24 uur
conditie. Er waren duidelijk meer γH2AX en RAD51 foci waarneembaar 5 uur na bestraling
dan 24 uur na bestraling. Deze trend was in alle cellijnen terug te vinden.
41
Figuur 33. Barplot van het aantal γH2AX foci (links) en RAD51 foci (rechts) in functie van het aantal
cellen van de miRCon-mCherry 10Gy 5 uur conditie (rood) ten opzichte van miRCon-mCherry 10Gy 24
uur conditie (blauw). Overlap van de 2 condities (paars).
Figuur 34. Barplot van het aantal γH2AX foci (links) en RAD51 foci (rechts) in functie van het aantal
cellen van miRCon-GFP 10Gy 5h (blauw) ten opzichte van miR146a-GFP 10Gy 5h (bovenaan) (rood) en
miR182 GFP 10Gy 5h (onderaan) (rood). Overlap van de 2 condities (paars).
42
Figuur 34 toont het aantal γH2AX foci en RAD51 foci in functie van het aantal cellen van de
miRCon-GFP 10Gy 5 uur conditie vergeleken met de miR146a-GFP 10Gy 5 uur en de
miR182-GFP 10Gy 5 uur conditie. Er waren geen duidelijke verschillen in aantal γH2AX en
RAD51 foci zichtbaar tussen de verschillende cellijnen. Een vergelijking van de
miRCon-mCherry 10Gy 5 uur conditie met de miR146a-mCherry 10Gy 5 uur en de miR182-
mCherry 10Gy 5 uur conditie leverde voor het aantal RAD51 foci gelijkaardige resultaten op
(Bijlage 7). In de miRCon-mCherry cellijn waren echter wel meer γH2AX foci detecteerbaar
dan in de miR146a-mCherry en miR182-mCherry cellijnen 5 uur na bestraling.
3.6.3. Micronucleus test
Figuur 35 toont een overzicht van de manuele tellingen van het aantal micronuclei per 1000
binucleaire cellen.
Figuur 35. Overzicht van manuele tellingen van het aantal micronuclei per 1000 binucleaire cellen.
Er waren in alle celculturen meer micronuclei waarneembaar in de bestraalde conditie (3Gy)
dan in de niet bestraalde conditie (0Gy). Er waren beduidend meer micronuclei aanwezig in
11
165
21
261
16
297
0
100
200
300
400
500
0Gy 3Gy
MCF10A_GFP
MCF10A_BRCA1.3
MCF10A_BRCA2.1
11
365
16
386
12
475
0
100
200
300
400
500
0Gy 3Gy
MCF10A_miRCon-mCherry
MCF10A_miR146a-mCherry
MCF10A_miR182-mCherry
12
333
15
208
15
164
0
100
200
300
400
500
0Gy 3Gy
MCF10A_miRCon-GFP
MCF10A_miR146a-GFP
MCF10A_miR182-GFP
43
de partiële knockdown cellijnen voor BRCA1/2, MCF10A BRCA1.3 en MCF10A BRCA2.1,
dan in de controle cellijn, MCF10A GFP. In de MCF10A miR146a-mCherry en de MCF10A
miR182-mCherry cellijn was een lichte verhoging van het aantal micronuclei waarneembaar
ten opzichte van de MCF10A miRCon-mCherry cellijn. Bij de MCF10A miR146a-GFP en
MCF10A miR182-GFP cellijnen waren minder micronuclei waarneembaar ten opzichte van
de MCF10A miRCon-GFP cellijn.
4. Discussie
Bij patiënten met een germinale mutatie in de borstkankergenen BRCA1 of BRCA2 wordt
tumorigenese geïnitieerd door verlies van het resterende BRCA WT allel. Zo'n second hit
wordt echter momenteel niet in alle tumoren geobserveerd. We hypothetiseren dat miRNA's
mogelijks verantwoordelijk kunnen zijn voor de post-transcriptionele neerregulatie van
BRCA1 en BRCA2.
Garcia et al. toonden reeds aan dat miR146a-5p BRCA1 post-transcriptioneel negatief
reguleert [31]. Daarnaast bestaat er mogelijks een feedback lus tussen BRCA1 en
miR146a-5p. BRCA1 zou namelijk binden met de promotorregio van miR146a-5p waardoor
de expressie van het miRNA opgereguleerd wordt. Overexpressie van miR146a-5p zorgt op
zijn beurt voor post-transcriptionele neerregulatie van BRCA1 [36, 41]. Het effect van
miR-182-5p op BRCA1 werd reeds meerdere keren beschreven in de literatuur [35, 37, 38].
Om het effect van miR146a-5p en miR182-5p op BRCA1 en eventueel op BRCA2 te
bevestigen en deze miRNA's in een vervolgstudie eventueel als positieve controles te kunnen
gebruiken, werden deze miRNA's stabiel tot overexpressie gebracht in de MCF10A WT
cellijn. Met behulp van RT-qPCR en western blot werd de mRNA en eiwitexpressie tussen de
verschillende cellijnen vergeleken. γH2AX/RAD51 foci kleuring en micronucleus test werden
uitgevoerd om het effect van de miRNA's op DNA herstel na te gaan.
Op mRNA niveau was geen duidelijke neerregulatie van BRCA1/2 zichtbaar (Figuur 15). Men
kan er vanuit gaan dat de gebruikte BRCA assays accuraat werken. De BRCA1_ex5FL assay
was op voorhand reeds gevalideerd en werkt accuraat. Van exon 19 is geweten dat het zeer
weinig aan alternatieve splicing onderhevig is en op deze manier een accurate kwantificatie
van de WT BRCA1 expressie verkregen kan worden. Er moet echter rekening gehouden
worden dat bij dit experiment geen QC uitgevoerd werd. Bijgevolg is het mogelijk dat de
DNase behandeling of RT stap niet overal optimaal verlopen is. Een mogelijke verklaring
44
voor de afwezige neerregulatie van BRCA1/2 op mRNA niveau is dat de miR146a-5p en
miR182-5p binden in de 3'UTR van BRCA1, dit zorgt voor translatie inhibitie en niet voor
mRNA degradatie. mRNA degradatie vindt enkel plaats bij miRNA's die met perfecte
complementariteit hun doelwit mRNA binden [29]. RNA interferentie effecten worden dan
ook best bestudeerd op eiwit niveau met behulp van western blot in plaats van op mRNA
niveau met behulp van RT-qPCR [42].
Op eiwit niveau werd met een western blot voor BRCA1 een neerregulatie van 30%
gedetecteerd in de MCF10A BRCA1.3 cellijn ten opzichte van de MCF10A WT cellijn
(Figuur 17). In de cellijnen waarin miR146a-5p of miR182-5p tot overexpressie komen werd
eveneens een sterke neerregulatie van BRCA1 ten op zichte van de MCF10A WT cellijn
waargenomen. Deze neerregulatie werd echter ook in de miRCon cellijnen teruggevonden,
waarin bij de mCherry cellijn een lege vector en bij de GFP cellijn enkel een scrambled
miRNA getransduceerd werd. Slechts minimale tot geen verschillen werden waargenomen
tussen de miR146a-5p en miR182-5p cellijnen ten opzichte van de miRCon cellijnen (Figuur
17). In deze western blot werd een α-actinine concentratie van 1/100.000 gebruikt, wat
resulteerde in een zeer sterke band ter hoogte van 100kDa (Figuur 16). Dit zorgde mogelijks
voor een minder betrouwbare kwantificatie.
Op een western blot voor BRCA2 werd steeds een bandje ter hoogte van 230kDa en 460kDa
gedetecteerd (Figuur 18). BRCA2 heeft echter een moleculair gewicht van 384kDa. Volgens
de fabrikant van het gebruikte antilichaam (OP95, Millipore) co-migreert BRCA2 op SDS-
PAGE met de katalytische subeenheid van DNA-PK waardoor met western blot een signaal
ter hoogte van 460kDa gedetecteerd wordt. Daarnaast zijn een aantal cellijnen beschreven met
een c.5946-5946delT; p.Ser1982Argfs mutatie in BRCA2 waardoor een getrunceerd BRCA2
eiwit van 230kDa tot expressie komt [43]. Deze mutatie werd na sequeneren echter niet
teruggevonden in de MCF10A cellijnen gebruikt in dit project. Mogelijks is een andere
mutatie verantwoordelijk voor deze BRCA2 variant in de MCF10A cellijnen. Sequentie
analyse van de volledige coderende sequentie van het BRCA2 gen wordt gepland om een
BRCA2 mutatie uit te sluiten. Er werd enkel een neerregulatie waargenomen in de miR146a-
mCherry cellijn voor BRCA2 230kDa en in de miR146a-mCherry en miR182-mCherry
cellijn voor BRCA2 460kDa. Opmerkelijk was wel dat in de GFP cellijnen en de miRCon-
mCherry cellijn 2 tot 3 keer meer BRCA2 460kDa gedetecteerd werd dan in de MCF10A WT
cellijn, hiervoor werd nog geen verklaring gevonden.
45
De resultaten van de ELISA voor BRCA1 waren niet conclusief. Er werd een duidelijke
knockdown gedetecteerd in de MCF10A BRCA1.3 cellijn ten opzichte van de MCF10A WT
cellijn wat ook verwacht werd aangezien de MCF10A BRCA1.3 cellijn een partiële
knockdown cellijn voor BRCA1 is. In de mCherry cellijnen werd ook een downregulatie
gedetecteerd ten opzichte van de MCF10A WT cellijn, maar in de miRCon cellijnen werd nog
een veel sterkere knockdown gedetecteerd. Aangezien deze test slechts eenmalig uitgevoerd
is, mogen hier geen sluitende conclusies uit getrokken worden. Herhaling van deze test is
noodzakelijk om mogelijke fouten tijdens de uitvoering van de test uit te sluiten.
Er werd een tijdsexperiment uitgevoerd in MCF10A WT cellen om na te gaan op welk tijdstip
na bestraling BRCA1/2 maximaal tot expressie komt. Na het induceren van schade met behulp
van IR wordt de DDR signaalweg geactiveerd. Als gevolg verwacht men dan ook een
opregulatie van de BRCA1/2 expressie. We hopen een groter effect te kunnen waarnemen van
de miRNA's op de BRCA1/2 expressie wanneer de testen uitgevoerd worden na bestraling. Op
mRNA niveau werd 30 min tot 1 uur na een 10Gy bestraling een lichte opregulatie van de
BRCA1/2 expressie waargenomen (Figuur 22). Vanaf 3 uur na bestraling werd minder
BRCA1/2 expressie waargenomen dan in het niet bestraald staal. Op eiwitniveau werd een
veel duidelijker effect bekomen. Op de western blot voor BRCA1 zien we 30 min en 1 uur na
bestraling een verdubbeling van de BRCA1 eiwitexpressie in de cytoplasmatische
eiwitfracties. Drie uur na bestraling is bijna geen BRCA1 signaal detecteerbaar (Figuur 24). In
de literatuur werd een experiment teruggevonden dat gelijkaardige resultaten opleverde. Hier
werd met een dosis van 20Gy bestraald. De degradatie van BRCA1 na bestraling gebeurt
mogelijks via ubiquitinatie en activatie van de apoptose pathway. Wanneer een lagere dosis
(5Gy) gebruikt werd, was geen verandering in de BRCA expressie waarneembaar [44]. Op
western blot voor BRCA2 werden minder duidelijke verschillen waargenomen (Figuur 25 en
26). Opvallend is dat de bandjes ter hoogte van 460kDa enkel in de nucleaire fracties
voorkomen. Zoals eerder vermeld is dit BRCA2 die co-migreert met de katalytische
subeenheid van DNA-PK en deze zijn voornamelijk in de nucleus gelokaliseerd [45]. Voor
BRCA2 460kDa werd in de nucleaire fracties wel een opregulatie waargenomen 30 min en 1
uur na bestraling, gevolgd door een downregulatie 3 uur na bestraling, wat dus overeenkomt
met de bevindingen bij de western blot voor BRCA1.
Wegens tijdsgebrek konden deze experimenten binnen het tijdsbestek van deze masterproef
niet meer herhaald worden op de cellijnen waarin de miRNA's tot overexpressie gebracht
46
werden. We hopen echter dat wanneer we de BRCA expressie 30 min tot 1 uur na bestraling
in de verschillende cellijnen gaan vergelijken er een duidelijker effect waarneembaar is tussen
de cellijnen met overexpressie van miR146a-5p of miR182-5p en de controlecellijnen.
Indien na bestraling nog steeds geen duidelijk effect van de miRNA's zichtbaar is, moet
eventueel overwogen worden om de transductie van de miRNA's in andere
borstkankercellijnen uit te voeren. Garcia et al. rapporteerden downregulatie van BRCA1 door
miR146a-5p. Zij maakten in hun studie echter gebruik van de MDA-MB-468, MDA-MB-436
en de MDA-MB-157 cellijn om het effect van miR146a-5p op BRCA1 na te gaan. Uit hun
onderzoek bleek ook dat MDA-MB-468 van nature lage expressie van miR146a-5p en
gemiddelde expressie van BRCA1 had. De cellijnen MDA-MB-436 en MDA-MB-157
daarentegen vertonen van nature hoge expressie van miR146a-5p en een lage expressie van
BRCA1 [31]. De MCF10A cellijn die in deze masterproef gebruikt werd, heeft een lage
miR146a-5p expressie en een lage BRCA1 expressie. Daarnaast kan ook geopteerd worden
om de miRNA's transiënt via transfectie tot overexpressie te brengen in de cellijnen in plaats
van transductie uit te voeren. De miRCon cellijnen vertoonden vaak afwijkende resultaten.
Mogelijks veroorzaakt het scrambled miRNA of de transductie op zich, aangezien in de
miRCon-mCherry cellijn een lege vector ingebracht werd, reeds een effect, waardoor het
effect van de miRNA's niet meer waarneembaar is. Eventueel moet verder gezocht worden
naar een ander miRNA dat gebruikt zou kunnen worden als positieve controle. Voor miR9
werd ook reeds beschreven dat het BRCA1 post-transcriptioneel neer reguleert [46].
Voor de functionele testen werd steeds gewerkt met subconfluente celculturen. Met
flowcytometrie werd aangetoond dat 47.1% van de cellen zich dan in S of G2/M fase van de
celcyclus bevinden (Figuur 28) en dus de mogelijkheid hebben om HR uit te voeren. Van
deze fractie cellen zullen nog steeds een deel cellen NHEJ verkiezen voor het herstel van
DSB. Mogelijks blijven te weinig cellen over die HR uitvoeren om een duidelijk effect van de
miRNA's waar te nemen. Een mogelijke oplossing is om de celculturen te synchroniseren
alvorens ze te bestralen, zodat op het moment van bestraling een grotere fractie cellen zich in
S of G2/M fase van de celcyclus bevinden en dus een grotere fractie cellen bekomen wordt
die HR uitvoert bij het herstel van DSB. Synchronisatie van de celcultuur kan gebeuren door
een dubbele thymidine behandeling voor arrest in S fase of een thymidine-nocodazole
behandeling voor arrest in G2/M fase te verkrijgen [35, 44].
47
Om het aantal DSB en het aantal DSB die hersteld worden via HR te visualiseren in de
verschillende cellijnen, werd een γH2AX/RAD51 immuunkleuring uitgevoerd nadat de
celculturen met een 10Gy dosis bestraald werden om DNA schade te induceren. Zoals
verwacht werden duidelijk meer γH2AX en RAD51 foci waargenomen in de bestraalde
celculturen dan in de niet-bestraalde celculturen (Figuur 32). Ook werden meer γH2AX en
RAD51 foci waargenomen 5 uur na bestraling dan 24 uur na bestraling (Figuur 33). 24 uur na
bestraling zijn namelijk reeds een groot deel van de DSB hersteld. Wanneer een vergelijking
gemaakt werd van de miR146a-5p en miR182-5p cellijnen met de miRCon cellijnen (Figuur
34 en Bijlage 7), werden geen duidelijke verschillen in RAD51 foci-aantal waargenomen.
Men verwacht echter minder RAD51 foci te zien bij de miR146a-5p en miR182-5p cellijnen,
aangezien overexpressie van deze miRNA's voor een neerregulatie van BRCA1 zorgt
waardoor HR niet meer efficiënt kan doorgaan.
Een mogelijke verklaring voor het niet waarnemen van het effect is, zoals hierboven reeds
beschreven, dat mogelijks te weinig cellen zich in S en G2/M fase van de celcyclus bevinden
op het moment van bestraling. Uit de tijdsexperimenten waarbij de BRCA expressie na 10Gy
bestraling bepaald werd, was vanaf 3 uur na bestraling bijna geen BRCA expressie meer
zichtbaar op eiwitniveau. Aangezien de γH2AX/RAD51 foci test 5 uur na bestraling
uitgevoerd werd, kan de afwezigheid van BRCA1 vanaf 3 uur na bestraling mogelijks een
effect hebben op de vorming van RAD51 foci. Daarnaast is een 10Gy dosis mogelijks te
hoog, waardoor te veel DNA schade veroorzaakt wordt en de cel overgaat tot apoptose. Op de
bestraalde celculturen werden vaak celkernen waargenomen die volledig omringd werden
door γH2AX, waarneembaar als een rode ring rondom de celkernen (Figuur 31). Deze
nucleaire γH2AX ringen zijn een kenmerk van apoptose [47]. Aan de hand van een
dosisrespons experiment zou nagegaan kunnen worden bij welke dosis nog voldoende DSB
geïnduceerd worden om de analyse uit te voeren, maar waarbij apoptose beperkt blijft. Men
zou er ook voor kunnen kiezen om bij een lagere dosis te werken, maar deze te combineren
met PARP-inhibitoren om het aantal DSB te vergroten. PARP-inhibitoren zullen ervoor
zorgen dat SSB niet meer hersteld kunnen worden via BER, waardoor deze na fork collapse
omgezet zullen worden naar DSB [28]. Verder kan geopteerd worden om 2 aparte kleuringen
uit te voeren in plaats van een combinatiekleuring van γH2AX en RAD51. De γH2AX en
RAD51 epitopen bevinden zich beide ter hoogte van de DSB [13]. Hierdoor kan mogelijks
competitie van de antilichamen optreden om te binden ter hoogte van deze colokaliserende
epitopen, wat een accurate telling bemoeilijkt. Daarnaast kan de kleuring voor γH2AX
48
uitgebreid worden met een kleuring voor 53BP1. 53BP1 is een eiwit dat eveneens betrokken
is bij de signalisatie van DSB, maar specifiek is voor NHEJ [20]. Cellijnen waarin BRCA1/2
neergereguleerd is, zullen veel minder gebruik maken van HR voor het herstel van DSB en
overschakelen naar NHEJ. In deze cellijnen verwachten we dus meer 53BP1 foci te detecteren
dan in de cellijnen waarin BRCA1/2 wel nog functioneel zijn. De RAD51 kleuring kan
uitgebreid worden met een kleuring voor cycline B1. Cycline B1 is een eiwit die specifiek
voorkomt in G2/M fase [48]. Wanneer men vervolgens enkel de cellen die cycline B1 positief
zijn, en dus HR kunnen uitvoeren, verder gaat analyseren op basis van het aantal aanwezige
RAD51 foci, kan een meer accurate telling plaatsvinden.
Bij de micronucleus test was een duidelijk effect zichtbaar van de partiële knockdown
cellijnen voor BRCA1 en BRCA2, MCF10A BRCA1.3 en MCF10A BRCA2.1 cellijn, ten
opzichte van de MCF10A GFP cellijn (Figuur 35). Waarbij 50 tot 80% meer MN aanwezig
waren in de MCF10A BRCA1.3 en MCF10A BRCA2.1 cellijn ten opzichte van de MCF10A
GFP cellijn. In de mCherry cellijnen was een licht effect waarneembaar in de cellijnen die
miR146a-5p of miR182-5p tot overexpressie brengen ten opzichte van de miRCon cellijn. In
de GFP cellijnen was het omgekeerde effect waarneembaar. Deze test is slechts een maal
uitgevoerd geweest. Herhaling van de micronucleus test is dan ook noodzakelijk om een
sluitende conclusie te trekken en eventuele staalverwisseling in de GFP cellijnen uit te sluiten.
Indien na verder onderzoek een duidelijk effect van miR146a-5p en miR182-5p op BRCA1
waargenomen wordt, kunnen rescue experimenten uitgevoerd worden om na te gaan of het
effect specifiek afkomstig is van de miRNA's die tot overexpressie gebracht zijn en dit effect
via rescue experimenten ongedaan gemaakt kan worden. Hiervoor kan een construct
complementair aan de miRNA's toegevoegd worden aan de cellijnen, namelijk anti-miR146a-
5p of anti-miR182-5p, waardoor de overexpressie van de miRNA's te niet gedaan wordt [31].
Een andere mogelijkheid is om een BRCA1 construct zonder de 3'UTR in de cellen te
brengen. Aangezien dit BRCA1 geen 3'UTR heeft, zullen miR146a-5p en miR182-5p het
mRNA niet kunnen binden en geen translatie inhibitie van BRCA1 kunnen veroorzaken [31].
5. Conclusie
Met de data uit deze masterproef kan nog geen duidelijk effect van miR146a-5p en miR182-
5p op BRCA1 aangetoond worden. De miRNA's komen stabiel tot overexpressie in de
49
MCF10A cellijn, maar op mRNA en eiwitniveau werd met de huidige testen geen duidelijke
neerregulatie van expressie van BRCA1 aangetoond, zoals beschreven in de literatuur. Ook op
functioneel vlak kon met een γH2AX/RAD51 foci assay nog geen effect aangetoond worden.
Enkel bij de micronucleus test was een licht effect waarneembaar in de mCherry cellijnen.
Verder optimalisaties van de testen zijn noodzakelijk om te kunnen aantonen dat deze
miRNA's BRCA1 en eventueel BRCA2 post-transcriptioneel neerreguleren. De
geoptimaliseerde condities kunnen dan gebruikt worden voor een functionele validatie van
kandidaat oncogene miRNA's geprioritiseerd op basis van differentiële miRNA expressie in
borsttumoren van patiënten met een germinale mutatie in BRCA1 waarbij geen second hit
vastgesteld kon worden en tumoren waarin wel een second hit vastgesteld werd.
Referentielijst
1 Fanale D, Amodeo V, Corsini LR, Rizzo S, Bazan V, Russo A. (2012) Breast cancer genome-wide
association studies: there is strength in numbers. Oncogene, 31(17), 2121–2128.
2 Melchor L, Benítez J. (2013) The complex genetic landscape of familial breast cancer. Hum. Genet.,
132(8), 845–863.
3 Stichting Kankerregister. (2015) Incidence fact sheet female breast cancer, incidentiejaar 2013.
4 Economopoulou P, Dimitriadis G, Psyrri A. (2015) Beyond BRCA: New hereditary breast cancer
susceptibility genes. Cancer Treat. Rev., 41(1), 1–8.
5 Antoniou A, Pharoah PDP, Narod S, Risch HA, Eyfjord JE, Hopper JL, et al. (2003) Average risks of
breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series
unselected for family history: a combined analysis of 22 studies. Am. J. Hum. Genet., 72(5), 1117–1130.
6 Cybulski C, Carrot-zhang J, Kluźniak W, Rivera B, Kashyap A, Wokołorczyk D, et al. (2015) Germline
RECQL mutations are associated with breast cancer susceptibility. Nat. Genet., 47(6), 643–646.
7 Chial H. (2008) Tumor suppressor (TS) genes and the two-hit hypothesis. Nat. Educ., 1(1), 117.
8 Knudson a G. (2001) Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat. Rev. Cancer, 1(2), 157–162.
9 Foulkes WD. (2008) Inherited susceptibility to common cancers. N. Engl. J. Med., 359(20), 2143–2153.
10 Lee H. (2014) Cycling with BRCA2 from DNA repair to mitosis. Exp. Cell Res., 329(1), 78–84.
11 Paul A, Paul S. (2014) The breast cancer susceptibility genes (BRCA) in breast and ovarian cancers.
Front. Biosci., 19, 605–618.
12 Roy R, Chun J, Powell SN. (2012) BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of
genome protection. Nat. Rev. Cancer, 12(1), 68–78.
13 Kavanagh JN, Redmond KM, Schettino G, Prise KM. (2013) DNA double strand break repair: a
radiation perspective. Antioxid. Redox Signal., 18(18), 2458–2472.
14 Khanna KK, Jackson SP. (2001) DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection.
Nat. Genet., 27(3), 247–254.
15 Shrivastav M, De Haro LP, Nickoloff JA. (2008) Regulation of DNA double-strand break repair
pathway choice. Cell Res., 18(1), 134–147.
16 Kinner A, Wu W, Staudt C, Iliakis G. (2008) γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-
strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res., 36(17), 5678–5694.
17 Kuo LJ, Yang L-X. (2008) γ-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo., 22(3),
305–310.
18 Mariotti LG, Pirovano G, Savage KI, Ghita M, Ottolenghi A, Prise KM, et al. (2013) Use of the γ-H2AX
assay to investigate DNA repair dynamics following multiple radiation exposures. PLoS One, 8(11), 1–
12.
19 Willers H, Gheorghiu L, Liu Q, Efstathiou JA, Wirth LJ, Krause M, et al. (2015) DNA damage response
assessments in human tumor samples provide functional biomarkers of radiosensitivity. Semin. Radiat.
Oncol., 25(4), 237–250.
50
20 Panier S, Boulton SJ. (2014) Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat. Rev. Mol. Cell
Biol., 15(1), 7–18.
21 Tarsounas M, Davies D, West SC. (2003) BRCA2-dependent and independent formation of RAD51
nuclear foci. Oncogene, 22(8), 1115–1123.
22 Vral A. (2015) Cursus radiobiologie. 1–46.
23 Fenech M, Natarajan AT, Surralles J, Crott JW, Parry J, Norppa H, et al. (2011) Molecular mechanisms
of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells.
Mutagenesis, 26(1), 125–132.
24 Kirsch-Volders M, Plas G, Elhajouji A, Lukamowicz M, Gonzalez L, Vande Loock K, et al. (2011) The
in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput
methodologies and toxicological relevance. Arch. Toxicol., 85(8), 873–899.
25 Jackson SP, Bartek J. (2009) The DNA-damage response in human biology and disease. Nature, 461,
1071–1078.
26 Food and drug administration. (2014) FDA aproved drugs: Olaparib (online). http://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm427598.htm
27 RIZIV. (2015) liste-specialites-20151201.
28 Weil MK, Chen AP. (2011) PARP inhibitor treatment in ovarian and breast cancer. Curr. Probl. Cancer,
35(1), 7–50.
29 Esquela-Kerscher A, Slack FJ. (2006) Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer,
6(4), 259–269.
30 Lin S, Gregory RI. (2015) MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nat. Rev. Cancer, 15(6), 321–333.
31 Garcia AI, Buisson M, Bertrand P, Rimokh R, Rouleau E, Lopez BS, et al. (2011) Down-regulation of
BRCA1 expression by miR-146a and miR-146b-5p in triple negative sporadic breast cancers. EMBO
Mol. Med., 3(5), 279–290.
32 Adams BD, Kasinski AL, Slack FJ. (2014) Aberrant regulation and function of microRNAs in cancer.
Curr. Biol., 24(16), 762–776. Elsevier Ltd.
33 Choi YE, Pan Y, Park E, Konstantinopoulos P, De S, D’Andrea A, et al. (2014) MicroRNAs down-
regulate homologous recombination in the G1 phase of cycling cells to maintain genomic stability. Elife,
3, 1–21.
34 Song L, Dai T, Xie Y, Wang C, Lin C, Wu Z, et al. (2012) Up-regulation of miR-1245 by c-myc targets
BRCA2 and impairs DNA repair. J. Mol. Cell Biol., 4, 108–117.
35 Moskwa P, Buffa FM, Pan Y, Panchakshari R, Gottipati P, Muschel RJ, et al. (2011) miR-182-mediated
downregulation of BRCA1 impacts DNA repair and sensitivity to PARP inhibitors. Mol. Cell, 41(2),
210–220.
36 Chang S, Sharan SK. (2012) BRCA1 and microRNAs: emerging networks and potential therapeutic
targets. Mol. Cells, 34(5), 425–432.
37 Liu Z, Liu J, Segura MF, Shao C, Lee P, Gong Y, et al. (2012) MiR-182 overexpression in
tumourigenesis of high-grade serous ovarian carcinoma. J. Pathol., 228, 204–215.
38 Chowdhury D. (2011) miR-182 in the diagnosis and treatment of cancer. US 2011/0178163 A1.
39 Qiagen. (2012) RNeasy Mini Handbook.
40 Qiagen. (2014) miRNeasy Mini Handbook.
41 Kumaraswamy E, Wendt KL, Augustine L a, Stecklein SR, Sibala EC, Li D, et al. (2014) BRCA1
regulation of epidermal growth factor receptor (EGFR) expression in human breast cancer cells involves
microRNA-146a and is critical for its tumor suppressor function. Oncogene, 1–14.
42 Holmes K, Williams CM, Chapman E a, Cross MJ. (2010) Detection of siRNA induced mRNA silencing
by RT-qPCR: considerations for experimental design. BMC Res. Notes, 3(53).
43 Yuan Y, Shen Z. (2001) Interaction with BRCA2 suggests a role for Filamin-1 (hsFLNa) in DNA
damage response. J. Biol. Chem., 276(51), 48318–48324.
44 Liu W, Zong W, Wu G, Fujita T, Li W, Wu J, et al. (2010) Turnover of BRCA1 involves in radiation-
induced apoptosis. PLoS One, 5(12), e14484.
45 Mi J, Dziegielewski J, Bolesta E, Brautigan DL, Larner JM. (2009) Activation of DNA-PK by ionizing
radiation is mediated by protein phosphatase 6. PLoS One, 4(2), e4395.
46 Sun C, Li N, Yang Z, Zhou B, He Y, Weng D, et al. (2013) MiR-9 regulation of BRCA1 and ovarian
cancer sensitivity to cisplatin and PARP inhibition. J. Natl. Cancer Inst., 105(22), 1750–1758.
47 Solier S, Pommier Y. (2014) The nuclear γH2AX apoptotic ring: implications for cancers and
autoimmune diseases. Cell. Mol. Life Sci., 71(12), 2289–2297.
48 Barnes E a, Kong M, Ollendorff V, Donoghue DJ. (2001) Patched1 interacts with cyclin B1 to regulate
cell cycle progression. EMBO J., 20(9), 2214–2223.
i
Bijlagen
Bijlage 1: Samenstelling MCF10A groei- en resuspensiemedium.
Tabel 1: Samenstelling groeimedium MCF10A cellen
Producten Firma Hoeveelheden
DMEM/Glutamax Gibco 250 ml
F12/Glutamax Gibco 250 ml
FCS Invitrogen 25 ml
EGF Peprotech 100 µl
Hydrocortisone Sigma Aldrich 250 µl
Insulin Sigma Aldrich 500 µl
Pen/Strep Invitrogen 2.5 ml
Aan het groeimedium van de getransduceerde cellijnen wordt puromycine (2µg/mL) (Sigma
Aldrich) toegevoegd.
Tabel 2: Samenstelling resuspensiemedium MCF10A cellen.
Producten Firma Hoeveelheden
DMEM/Glutamax Gibco 200 ml
F12/Glutamax Gibco 200 ml
FCS Invitrogen 100 ml
Pen/Strep Invitrogen 2.5 ml
ii
Bijlage 2: Vectormap lentivirale vectoren
Figuur 1. Vectormap van de lentivirale partikels van Biosettia.
De vector bevat een EF1α promotor en een rPuro gen, dat codeert voor het rood fluorescente puromycin-N-
acetyl-transferase.
Figuur 2. Vectormap van de lentivirale partikels van Dharmacon.
De vector bevat een EF1α promotor, een GFP gen, dat codeert voor het Green Fluorescent Protein, en een
puromycineresistentiegen (PuroR).
iii
Bijlage 3: Primersequenties voor RT-qPCR assays
Tabel 3: primersequenties QC assays, BRCA assays en referentiegenen.
Assay Forward primer Reversed primer
INTRON
(ABCA4_intron30) 5’-CCAAGCCTACCTACATGGTGT-3’ 5’-AGGGATCCCAAAAGAAGGAC-3’
EXONSPAN
(MKNK2_ex1-3) 5’-CCAGCCGAACTTCAGGGTTT-3’ 5’- CGTCCGGGATGTCAATGGG-3’
SPUD* 5’- AACTTGGCTTTAATGGACCTCCA-3’ 5’-ACATTCATCCTTACATGGCACCA-3’
BRCA1_ex5FL 5’-CATGCTGAAACTTCTCAACCAGAA-3’ 5’-CTTACTATATTGGTTTTCCTCGGATGT-3’
BRCA1_ex19 5'-ACAGGTGTCCACCCAATTG-3' 5'-TGCATGGAAGCCATTGTCCT-3'
BRCA2_ex4 5'-GAAGGAATGTTCCCAATAGTAGAC-3' 5'-GAACAACAGGACTTTCACTAAGA-3'
YWHAZ 5'-ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA-3' 5'-CCGCCAGGACAAACCAGTAT-3'
ALU 5'-CATGGTGAAACCCCGTCTCTA-3' 5'-GCCTCAGCCTCCCGAGTAG-3'
B2M 5'-TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3' 5'-TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT-3'
*artificiële template: 5'AACTTGGCTTTAATGGACCTCCAATTTTGAGTGTGCACAAGCTATGGAACACCACG
TAAGACATAAAACGGCCACATATGGTGCCATGTAAGGATGAATGT-3’
iv
Bijlage 4: Samenstelling buffers Western Blot.
Buffers eiwitisolatie:
Stockoplossingen:
o Stockoplossing 1M Hepes: 0,2383g Hepes (Serva) in 1mL dH2O
o Stockoplossing 1M MgCl2: 0,2033g MgCl2 (Merck) in 1mL dH2O
Buffer A:
o 100µL 1M Hepes
o 100µL 1M KCl (Merck)
o 9.80mL dH2O
Buffer B:
o 200µL 1M Hepes
o 5mL 1M KCl
o 15µL 1M MgCl2
o 2,785 mL dH2O
o 2mL glycerol (Sigma Aldrich)
Werkingsbuffers:
o Wasbuffer: 1mL buffer A + 0,5µL DTT (Sigma Aldrich) + 10µL protease
inhibitor
o Lysebuffer A: 1mL buffer A + 0,5µL DTT + 10µL protease inhibitor + 10µL
NP-40
o Lysebuffer B: 1mL buffer B + 0,5µL DTT + 10µL protease inhibitor
Blocking buffer:
10x TBS-buffer:
o 121g Tris oplossen in dH2O -> aanzuren tot pH 7.54
o 87g NaCl toevoegen, verder aanlengen met dH2O tot 1L
1x TBST-buffer:
o 100mL 10x TBS-buffer
o 1mL Tween 20
o aanlengen met dH2O tot 1L
Blocking buffer:
o 1.5g BSA (Roche)
o 2.5g melkpoeder (Nestlé)
o 50 mL 1x TBST-buffer
Verdunningsbuffer antilichamen:
0.5g melkpoeder
0.5g BSA
50mL 1x TBST-buffer
Wasbuffer:
1x TBST-buffer
v
Bijlage 5: Foci classifier voor MCF10A cellen.
Tabel 4: parameters MCF10A foci classifier.
Classifier Setup
Field overlap (X/Y) 2/19 µm
Min. Cell Distance 0 µm
Object Treshold 50%
Min. Object Area 20µm2
Max. Object Area 300µm2
Max. Relative concavity depth 0.1
Max. Aspect Ratio 3
vi
Bijlage 6: MN classifier voor MCF10A cellen.
Tabel 5: parameters MCF10A MN classifier.
Classifier Setup
Field overlap (X/Y) 50/50 µm
Min. Metaphase Distance 50 µm
Microscope Magnification 10
Default Classif. Sensitivity 5
Object Treshold 50%
Min...Max Area 20...300µm2
Max. Relative concavity depth 0.1
Max. Aspect Ratio 3
MN Score Setup: Nuclei Parameters
Object Threshold 15%
Min. Area 80 µm2
Max. Area 1000 µm2
Max. Aspect Ratio 2
Max. Rel. Concavity Depth 0.2
Max. Distance 30µm
Max. Area Asymmetry 80%
Region of Interest Radius 35 µm
Max. Object area in ROI 35 µm2
MN Score Setup: MN Parameters
Object Treshold 7%
Min. Area 1 µm2
Max. Area 40 µm2
Max. Aspect Ratio 1.7
Max. RCD 0.7
Max. Distance 35 µm
Autoseparate: Use automatic binucleate cell separation
Concavity Regression Radius 10/10 µm
Concavity Min. Contour Angle 45°
Min. Concavity Distance 40%
vii
Bijlage 7: γH2AX en RAD51 foci resultaten mCherry cellijnen.
Figuur 3. Barplot van het aantal γH2AX foci (links) en RAD51 foci (rechts) in functie van het aantal cellen
van miRCon-mCherry 10Gy 5h ten opzichte van miR146a-mCherry 10Gy 5h (bovenaan) en miR182-
mCherry 10Gy 5h (onderaan). Overlap van de 2 condities (paars).
