SanPrep DNA SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒

用户操作手册 (第6.0版）w w w . s a n g o n . c o m

柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒柱式DNA 胶回收试剂盒柱式PCR

SanPrepSanPrepSanPrep 产物纯化试剂盒

Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.生工生物工程（上海）股份有限公司

热线电话: 4 0 0 - 8 2 1 - 0 2 6 8 公司地址: 上海市松江区香闵路 698号

公司网址: w w w .sangon.com

SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒试剂盒组成保存方法及注意事项产品介绍快速操作流程（质粒提取）标准抽提步骤常见问题解答

SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒试剂盒组成保存方法及注意事项产品介绍快速操作流程（胶回收）标准回收步骤常见问题解答

SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒试剂盒组成保存方法及注意事项产品介绍快速操作流程（ PCR产物纯化）标准纯化步骤常见问题解答

附录技术参数解释（质粒抽提试剂盒）技术参数解释（胶回收与 PCR产物纯化试剂盒）信息反馈

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21 热线电话：400-821-0268 公司网址：www.sangon.com公司地址：上海市松江区香闵路 698号企业邮箱：[email protected]

快速操作流程（质粒提取）

裂解

洗脱

离心

保存方法及注意事项

产品介绍

试剂盒于常温运输，有效期见包装。加入 RNase A 后，Buffer P1 请存放于 2-8 °C，有效期为半年。其他组分可于室温存放一年，长期存放请置于 2-8 °C。

Buffer P3 和 Buffer DW1 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

检查 Buffer P1 中是否已经加入 RNase A。

检查 Wash Solution 中是否已经加入无水乙醇。

检查 Buffer P2 和 P3 是否出现沉淀。

SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒是生工生物工程（上海）股份有限公司最新研制成功的一种质粒小量抽提试剂盒。本产品采用了一种新型的吸附材料，新吸附柱拥有良好的流速、超强的 DNA 结合能力和优秀的洗脱效率。改良的配方使试剂盒的菌液裂解能力、DNA 与吸附柱的结合能力大大加强，新型裂解染料V isualLyse 的加入让裂解过程变得可视、可控，实现质粒得率最大化。对于高拷贝质粒，从 6 mL 过夜菌液（OD600 = 2.0）中可以获得超过 35 μg 的质粒 DNA 。操作过程快速、方便，无需使用酚 / 氯仿抽提，无需乙醇沉淀，整个抽提过程可以在20 分钟内完成。由本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD260 / OD280 比值一般为1.8-1.9 之间，OD260 / OD230 比值大于 2.0，可直接用于转化、DNA 测序、PCR、基于 PCR 的突变、体外转录、酶切等后续实验。

1.

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5.

6.

7.

8.

4.

准备工作。

取 1.5-5 mL 过夜培养的菌液， 8,000 X g 离心 2 分钟收集菌体，弃尽培养基。

在沉淀中加入 250 μl Buffer P1，彻底悬浮菌体。

加入 250 μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管 5-10次混匀。室温静置 2-4 分钟。

加入350 μl Buffer P3，立即温和颠倒离心管 5-10次混匀。

12,000 X g 离心5-10 分钟。将上清液移入吸附柱，8,000 X g 离心 30 秒，倒掉收集管中液体。

（选做）加入 500 μl Buffer DW1，9,000 X g离心30秒，倒掉收集管中液体。

加入 500 μl Wash Solution，9,000 X g 离心 30秒，倒掉收集管中液体。

9. 重复步骤 8 一次

10. 空吸附柱于 9,000 X g 离心 1 分钟。

11. 将吸附柱放入一个干净的 1.5 mL 离心管中，在吸附膜中央加入 50-100 μl Elution Buffer，室温静置 1 分钟后，离心 1 分钟。保存管中 DNA 溶液。

洗涤

取上清

试剂盒组成组分 B518191,50次 B518191,100次

注： RNase A收到后，请及时存放于 2-8 °C，长期贮存请于 -20 °C放置。

*

*

菌体收集

SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒

50套14 mL14 mL20 mL 25 mL12 mL5 mL210 μl60 μl1份

100套28 mL28 mL40 mL50 mL24 mL10 mL420 μl120 μl1份

纯化套件（吸附柱+收集管）Buffer P1Buffer P2Buffer P3Buffer DW1Wash Solut ionElut ion BufferRNase AVisualLyse操作手册


标准抽提步骤

1.

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5.

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9.

自备材料：小型高速离心机（最大离心力 ≥12,000 X g ）、1.5 mL 离心管、无水乙醇等。

试剂盒初次开启，将 RNase A 溶液全部加入 Buffer P1 中，混匀后在瓶身做好标记。储存于2-8 °C，有效期为 6 个月。

按瓶身标签说明在Wash Solut ion中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为 80% ），混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。

每次使用前请检查 Buffer P2 和 Buffer P3 是否出现沉淀，如有沉淀，请于 37 °C 溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

菌液状态对质粒得率非常关键，请用不超过容器容量 1/ 4 体积的培养基进行培养。

Elut ion Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，可以用 TE 或水（ pH > 7.0）代替。

将 Elu t ion Buffer 预热至 60 °C 可以进一步提高得率。

如果质粒 > 8 kb，加入 Elu t ion Buffer 后，在 37-60 °C 温浴 2 分钟可以显著提高得率。

使用小于 40 μl 的洗脱液可以得到浓度更高的 DNA，但得率显著降低。

Buffer P1 首次使用时请检查是否已加入 RNase A。

一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。

如果使用 V isualLyse，则在加入 250 μl P1 后再加入 1 μl V isualLyse，振荡混匀。

V i s u a l L y s e 需在临用前加入，直接加入到 Buffer P1 中出现浑浊为正常现象。

对于低拷贝质粒，如果使用更多的菌液，则同一个样品分多管收集，每管不超过 5 mL，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。

对于高拷贝质粒，从 5 mL 过夜菌液中通常可以获得超过 20 μg 质粒 DNA，不推荐使用更大的菌液量。

裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过 5 分钟。

如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开始。

如果使用了 V isualLyse，则溶液呈现均匀的蓝色表示混匀良好，如果出现白色团块，则提示菌体可能过量，宜选用更少的菌液重新开始。

如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法。

加入 Buffer P3 后，离心管中会立即出现大量白色絮状沉淀，如果使用了 V isualLyse，则溶液由蓝色重新变为无色，有蓝色残留提示混匀不彻底，继续混合至蓝色全部消失。如果起始菌液较多，混匀后室温静置 2 分钟以彻底去除 RNA 。

Wash Solut ion 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。

此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。

吸附柱的最大有效容积为 750 μl，如果裂解液较多，可以重复该步骤直到至所有裂解液流过吸附柱。

处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致 DNA 降解。

对于 End A+ 宿主菌，如 BL21，HB101，JM 系列等，此步不能省略。对于 End A- 宿主菌，如 DH5α，TOP10 等，此步可以省略，但进行该步骤可进一步降低蛋白残留量。

加入 350 μl Buffer P3，立即温和颠倒离心管 5-10 次充分混匀。

在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于 37 °C 摇床充分振荡培养 12-16 h。

在菌体沉淀中加入 250 μl Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。

加入 250 μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管 5-10 次混匀，室温静置 2-4 min 。

对于高拷贝质粒，取 1.5-5 mL 菌液，于室温，8,000 X g 离心 2 min 收集菌体，倒尽或吸干培养基。

重复步骤 8 一次。

10.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 X g 离心 1 min。

11.在吸附膜中央加入 50-100 μl Elut ion Buffer，室温静置 1-2 min，9,000 X g 离心 1 min。将所得到的质粒 DNA 溶液置于 -20 °C 保存或用于后续试验。

（可选步骤）在吸附柱中加入 500 μl 去蛋白液 Buffer DW1，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6. 于离心机最大转速（ ≥ 12,000 X g ）离心 5-10 min，将上清全部小心移入吸附柱，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

向吸附柱中加入 500 μl Wash Solut ion，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。


常见问题解答1. 未提出质粒或质粒得率较低

A.

B.

C.

D.

E.

F.

G.

H.

I.

J.

K.

L.

M.

2. 质粒纯度不高

A.

B.

C.

D.

E.

3. 如何选择最合适的洗脱体积 A.

大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选单菌落进行液体培养。

乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加 Buffer P1，P2 和 P3 的用量。溶液使用不当：Buffer P2 和 P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37°C 温浴直至溶解，待冷却至室温后使用。吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基（如 SOC 或 SOB）或宿主菌生长率较高，则须减少菌液用量。质粒洗脱不完全：质粒洗脱时，可适当加温（ 37-60°C ）或延长溶解时间，对大质粒效果更为明显。

洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

洗脱液不合适：洗脱效率与洗脱液的 pH 值有关，如果使用水进行洗脱，请确保其 pH > 7.0，如果 pH 过低可能导致洗脱量低，可以用 1 M 氢氧化钠溶液调节水的 pH 值。

洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但质粒浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。如果是低拷贝质粒或质粒大于 8 kb 时，可以分两次洗脱，并且对于大的质粒延长放置时间，让 DNA 完全溶解后再洗脱，可以提高洗脱效率。溶液失效：Buffer P2 长期暴露在空气中容易失效，请每次使用完后，立即盖紧瓶塞，以免失效，造成碱裂解不充分。

质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可以使用更多的菌量但需要相应增加溶液使用量。

混有蛋白：不要使用过多菌体。经 Buffer P1，P2 和 P3 处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心，并延长离心时间，完全沉淀蛋白后再取上清到吸附柱中。混有 RNA：RNase A 处理不彻底，请减少菌体用量或加入 Buffer P3 后室温再延长放置时间 5-10 分钟。如果 Buffer P1 已保存 6 个月以上，请在Buffer P1 中再添加终浓度为 100 μg / mL 的 RNase A 。混有基因组 DNA：加入 Buffer P2 后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组 DNA 打断从而混杂在质粒中。如果加入 Buffer P2 后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞内 DNA 的降解，培养时间不要超过 16 小时。含大量核酸酶的宿主菌：BL21 和 HB101 等 End A+ 宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取和保存过程中可能导致质粒 DNA 降解，影响提取质粒 DNA 的完整性，对于这些宿主菌请在操作过程中使用去蛋白液 DW1。质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。

SanPrep 质粒试剂盒具有优秀的洗脱效率，通常情况下，使用 50 μl 洗脱液进行洗脱，回收率能达到 85%，使用小于 40 μl 进行洗脱时，质粒浓度提高，但总得率下降明显，而是用超过 100 μl 洗脱液进行洗脱，质粒得率增加不多，但浓度明显下降。如图所示，用户可以根据自己后续实验的需要进行选择。通常来说，如果预期质粒产量较低，则使用更少的洗脱液以保证得到的质粒浓度不至于过低，如果预期质粒产量较高，则可以使用更多的洗脱液进行洗脱。

菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

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ConcentrationPlasmid Yield

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Yie

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Volume of Elution Buffer(μl)


SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒

本试剂盒在室温干燥保存，有效期见包装。

切胶


产品介绍

1.

2.3.

快速操作流程（胶回收）

1.

检查 Wash Solution 中是否已经加入无水乙醇。

转移

洗脱

洗涤

检查 Buffer B2 是否出现沉淀。

将水浴锅调至 50 °C。

2.

3.

4.

6.

7.

8.

9.

称重

水浴

5.

Temp.

B518131,50次 B518131,100次纯化套件（吸附柱+收集管） 50套 100套

试剂盒组成

组分

Buffer B2 50 mL 100 mLWash Solut ion 12 mL 24 mLElu t ion Buffe r 5 mL 10 mL操作手册 1份 1份

Buffer B2 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

适用范围广，回收效率高。

操作简单快速，整个回收过程仅需 15 分钟左右。洗脱效率高，洗脱体积最小可低至 15 µl。

本试剂盒适用于从 TAE 和 TBE 琼脂糖凝胶中回收 100 bp - 10 kb 的 DNA 片段，回收效率可达 80%。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除其他杂质，得到高质量的 DNA 回收产物。本试剂盒采用的膜结合液中不含有干扰酶活性的碘化钠，所得到的 DNA 可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点：

准备工作。

从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重。

加入胶块重量 3-6 倍的 Buffer B2 ，50 °C水浴5-10分钟溶胶。

(选做)对于 < 500 bp 的片段，加入1 / 3 Buffer B2体积的异丙醇。

将溶胶液移入吸附柱中，8,000 X g 离心 30 秒。倒掉收集管中液体。

加入500 μl Wash Solution，9,000 X g 离心30 秒，倒掉收集管中液体。


空吸附柱于 9,000 X g 离心 1 分钟。

将吸附柱放入一个干净的 1.5 mL 离心管中，在吸附膜中央加入 15-40 μl Elution Buffer，室温静置1 分钟后，离心 1 分钟。保存管中 DNA 溶液。


常见问题解答1.

DNA 回收效率较低或者未回收到目的片段

回收 DNA 进行后续酶切反应效率低

胶块溶解不完全：可适当延长水浴的时间，并增加颠倒混匀的频率辅助溶解。

胶块体积太大：溶胶困难。可先将胶块切碎，溶胶后分多次上柱离心，回收 DNA 片段。

漂洗液中未加入正确量的无水乙醇

Agarose 抑制 DNA 与吸附材料的结合：应尽量切除不含目的 DNA 片段的 Agarose 胶。

A.

B.

C.

D. E.

F.

G.

H.

I .

2.

A.

B.

C.

3. 琼脂糖凝胶胶块不溶A.

B.

C.

4. 洗脱液的选择A.

标准回收步骤

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.9.

10.

自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力 ≥12,000 X g ）、1.5 mL 离心管、无水乙醇、异丙醇等。

按瓶身标签说明在 Wash Solution 中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为 80%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。

Buffer B2 在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于 37 °C 溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

提前将水浴锅调至 50 °C 备用。

尽可能多地去掉不含目标 DNA 的琼脂糖。

凝胶浓度 ≤ 1%，每 100 mg 凝胶加入 300 µl Buffer B2；凝胶浓度＞ 1%，≤ 1.5%，每 100 mg 凝胶加入 400 µl Buffer B2；凝胶浓度＞ 1.5%，≤ 2%，每 100 mg 凝胶加入 500 µl Buffer B2；凝胶浓度＞ 2% ，每 100 mg 凝胶加入 600 µl Buffer B2。

Elut ion Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，可以用 TE 或水（ pH > 7.0 ）代替。将 Elut ion Buffer 预热至 60 °C 可以进一步提高得率。请勿使用小于 15 μl 的洗脱液进行洗脱。

胶块完全溶化即可，过长时间的处理可能导致 DNA 损伤。

如果溶胶液总体积大于 750 µl，则每次使用 750 µl，多次上柱。

Wash Solut ion 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。


每管琼脂糖凝胶块不要超过 400 mg，否则导致溶胶不完全。切胶过程尽可能快，减少 DNA 在紫外线中的暴露时间以降低对 DNA 的损伤。

向吸附柱中加入 300 μl Buffer B2，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的 DNA 片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶块切下，放入 1.5 mL 离心管中，称重。

根据胶块的重量和浓度，按每 100 mg 琼脂糖（如胶块不足 100 mg 则用水补充至 100 mg）加 300-600 µl 的比例加入 Buffer B2。

（可选步骤）当目的片段 < 500 bp 时，加入所使用的 Buffer B2 体积 1/3 的异丙醇，混匀。当目的片段 ≥ 500 bp 时，此步骤可以省略，直接进行步骤 5。将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

将离心管置于 50°C 水浴 5-10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。

在吸附膜中央加入 15-40 μl Elut ion Buffer，室温静置 1-2 min，9,000 X g 离心 1 min。将所得到的 DNA 溶液置于 -20 °C 保存或用于后续试验。

重复步骤 7 一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 X g 离心 1 min。

向吸附柱中加入 500 μl Wash Solution，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

提高 Buffer B2 的相对浓度，增加 DNA 与吸附膜的作用时间（静置时间），在一定程度上可以提高回收率。

如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少，可以将洗脱液再次加入至吸附柱中进行洗脱，以提高回收效率。

洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。

洗脱液不合适：洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其 pH 值 > 7.0，pH 值过低可能导致低洗脱效率。

洗脱时间过短：洗脱时放置 1分钟可达到较好的洗脱效果。洗脱时将洗脱液预热至60°C 后使用，有利于提高洗脱效率。

洗脱产物中含有残留的乙醇：可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 2-5 分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。

盐份的残留：请确保使用 Wash Solut ion 洗涤两次，每次 500 µl 沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。

含目的片段的胶块在空气中放置时间过长，使胶块失水、干燥。建议切胶后立即进行胶回收，或将胶块保存在 4 °C 或 -20 °C 备用。

洗脱液可以根据后续实验的需要来确定：一般情况下，若需要进行测序反应，请用双蒸水洗脱。如果需要长期保存 DNA，请用 TE 洗脱。

配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。应重新配制缓冲液。

琼脂糖质量差：请选用高质量的琼脂糖。

琼脂糖质量差：请选用高质量的琼脂糖。


1.

检查 Wash Solution中是否已加入无水乙醇。

检查 Buffer B3

Buffer B3

中是否已加入异丙醇。

检查是否出现沉淀。

2.

3.

4.

6.

7.

5.

准备工作。

8,000 X g 离心 30 秒。倒掉收集管中液体。

加入 500 μl Wash Solution，9,000 X g 离心 30 秒，倒掉收集管中液体。

在 PCR 反应液中加入 5 倍体积的 Buffer B3 ，充分混匀。


空柱于 9,000 X g 离心 1 分钟。

将吸附柱放入一个干净的 1.5 mL 离心管中，在吸附膜中央加入 15-40 μl Elution Buffer，室温静置 1分钟后，离心 1 分钟。保存管中 DNA 溶液。

SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒

洗脱

洗涤

快速操作流程（ PCR 产物纯化）

混匀

离心

加液

B518141,50次 B518141,100次

试剂盒组成

组分

纯化套件（吸附柱+收集管）

操作手册 E l u t io n B u f f e r Wash Solut ionBuffer B3

本试剂盒在室温干燥保存，有效期见包装。


产品介绍

1.

2.

3.

Buffer B3 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

适用范围广，回收效率高。

操作简单快速，整个回收过程仅需 5 分钟左右。

洗脱效率高，洗脱体积最小可低至 15 µl。

本试剂盒适用于从 PCR 反应液或各种酶促反应液中纯化回收 DNA 片段。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP 等，得到高质量的 DNA 纯化产物，可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点：

50套24 mL12 mL5 mL 1份

100套48 mL24 mL10 mL 1份


标准回收步骤

1.

2.

3.

4.

5.

6.

自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力 ≥12,000 X g ）、1.5 mL 离心管、无水乙醇、异丙醇等。

按瓶身标签说明在 Wash Solut ion 中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为 80%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。

按瓶身标签说明在 Buffer B3 中加入相应量的异丙醇（异丙醇终浓度为 20%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。

Buffer B3 在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于 37 ℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。

如果体系总体积大于 750 µl，则每次使用 750 µl，多次上柱。将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱，可以进一步提高 DNA 回收率。

Elut ion Buf fer 为 2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，可以用 TE 或水（ pH > 7.0 ）代替。

将 Elut ion Buf fer 预热至 60 °C 可以进一步提高得率。

如果片段 > 4 kb，在 37-60 °C 温浴 2 分钟可以显著提高得率。

请勿使用小于 15 μl 的洗脱液进行洗脱。

Wash So lu t ion 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。


若反应液体积过小，可用 TE 或水补足至 100 µl，然后再加入 500 µl Buffer B3。

在吸附膜中央加入 15-40 μl Elut ion Buf fer，室温静置 1-2 min，9,000 X g 离心1 min。将所得到的 DNA 溶液置于 -20 °C 保存或用于后续试验。

将 PCR 反应液或酶促反应液移至一干净的 1.5 mL 离心管中，加入 5 倍体积的Buffer B3，充分混匀。

将混合液全部移入吸附柱，8,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。


将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 X g 离心 1 min。

向吸附柱中加入 500 μl Wash Solut ion，9,000 X g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

常见问题解答1. PCR产物回收效率较低或者未回收到目的片段

回收的 PCR产物进行后续酶切或者连接效率低

Wash So lu t ion 中未加入正确量的无水乙醇。A.

B.

C.

D.

E.

F.

G.

2.

A.

B.

C.

3. 回收的片段为什么电泳上样会漂起来？

A.

D.

洗脱液不合适：洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其 pH 值 > 7.0，pH 值过低可能导致低洗脱效率。

洗脱时将洗脱液预热至 60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也有影响。洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。

提高 Buffer B3 的相对浓度，增加 DNA 与吸附膜的作用时间（静置时间），在一定程度上可以提高回收率。

如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少，可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱，以提高回收效率。

洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。

若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干2-5 分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。

盐份的残留。请确保使用 Wash Solut ion 冲洗两次，每次 500 µl 沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。

选择合适的 PCR 产物和 T 载体的分子数比例，有助于提高连接效率 .

E. 请确保 PCR 最后 72℃ 5-10 分钟的延伸时间，这样才有足够的 PCR 产物在末段带有 A 附加碱基，保证较高的连接效率。

回收后的 PCR 产物在反复冻溶的情况下，会加速末端 A 和整个 PCR 产物的断裂，从而造成与T载体连接或直接酶切效率的下降。建议回收后立即进行酶切或连接实验。

主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 2-5分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。


附录

技术参数解释（质粒抽提试剂盒）1. 试剂盒工作原理

2. 细菌培养、菌液用量及质粒拷贝数

3. 吸附柱参数

关于 VisualLyse 的使用

去蛋白液 Buffer DW1 的使用

4.

5.

SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒是采用改良碱裂解法和硅胶膜核酸纯化技术相结合的质粒抽提方法。含有目标质粒的细菌在强碱的作用下裂解并释放质粒，而蛋白和基因组 DNA 则由于变性而被去除。裂解液中的质粒 DNA 在一定的盐溶液和 pH 条件下特异的结合到吸附柱中的硅胶膜介质上，通过洗涤步骤去除大部分的RNA、蛋白、和盐分等小分子杂质。改变缓冲液条件后，结合在膜上的质粒 DNA通过洗脱液洗脱下来。

在试剂盒操作过程中，溶液比例非常重要，如果用户根据实际情况需要调整溶液的用量，请保持 Buffer P1:P2 :P3 = 5:5:7 的比例加入。Buffer P2 在碱法抽提方法中起非常关键的作用，其中所含的 NaOH 很容易因为被空气中的 CO2 中和而失效，因此每次使用后一定要密封保存。

SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒是生工生物工程（上海）股份有限公司自主研发的第 3 代质粒抽提试剂盒，本试剂盒中采用了新型的 DNA 吸附材料，具有容量大、盐分残留少、洗脱效率高的特点。理论上每个吸附柱的吸附容量大于 40 μg。

为了方便用户使用，本试剂盒中提供的吸附柱已经组装至收集管中，该吸附柱的有效容积为 750 μl，按照说明书中的溶液用量，一次裂解液可以一次过柱。如果样品量超过 750 μl，则需要分多次上柱：先加入 750 μl，离心后，倒掉收集管中的液体，再加入 600 μl（此时由于收集管底部溶液残留，吸附柱的有效容积约为 600 μl ），离心，倒掉收集管中的液体，重复操作直至所有样品全部通过吸附柱。

可视化裂解染料 VisualLyse 是生工质粒抽提试剂盒中新添加的组分，通过颜色的变化方便地显示裂解和中和过程。随试剂盒带的 VisualLyse 以 250 倍的浓缩液形式提供，每管样品在加入 250 μl Buffer P1 后加入 1 μl VisualLyse 试剂，一起混匀即可，如果一次操作多个样品，也可以把该试剂按照 1:250 的比例添加至 Buffer P1中。请在临用前添加，否则会导致颜色不均匀。添加有 VisualLyse 的细菌悬浮液在加入 Buffer P2 后，溶液变为均匀的蓝色，表示裂解完全。加入 Buffer P3 后，溶液重新变为无色，无蓝色残留表示中和完全。VisualLyse 本身在纯化过程中会被完全去除，不影响质粒的得率和质量。

通过 VisualLyse 的使用，用户可以更方便地把握裂解过程，及时发现由于菌体过量、裂解不完全或中和不充分带来的问题，但是，VisualLyse 不会对裂解能力有任何帮助，不能因为使用了 VisualLyse 而简单增加菌液用量。

在碱法质粒抽提过程中，细菌中的基因组 DNA 和大部分蛋白以沉淀的形式经过离心去除，经过吸附柱后，质粒 DNA 被吸附，蛋白和其他杂质进一步减少。通常情况下，即使不使用去蛋白液，所得到的质粒中的蛋白含量已经在很低的水平。但对于BL21，HB101，JM 系列等 End A+ 的宿主菌而言，由于这类菌核酸酶含量高，微量蛋白的残留即可能导致质粒 DNA 的降解，因此，对这类宿主菌，我们强烈建议使用 Buffer DW1 进一步去除蛋白。对于 DH5 α，TOP10 等 End A- 的宿主菌，Buffer DW1 可以省略，但使用该溶液也能进一步降低质粒 DNA 中的蛋白残留。

细菌的生长状态和质粒拷贝数对质粒抽提的得率和质量有重要影响，通常大肠杆菌在 37°C 充分充气的条件下培养 12-16小时达到平台期，此时每 mL 菌液中约含有 3-4 × 109 个细菌。处于平台期的细菌中质粒 DNA 与 RNA 的比例达到最高，过度培养的细菌可能导致 DNA 的降解。

培养基的成分对细菌的生长状态和质粒产量也有一定的影响，对于 SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒，我们推荐用 LB 培养基进行细菌培养，丰富培养基的使用反而会降低质粒产量和增加盐分等杂质残留的风险。

质粒拷贝数与质粒自身的复制子起始位点有关，带有 ColE1 和 pMB1 等复制起始位点的质粒（如 pUC 系列、pBluescript 系列等）为高拷贝质粒，每个细菌中的拷贝数可以达到 300-500 个，而带有 p15A 和 pSC101 等复制起始位点的质粒（如pBR322 系列、pSC101 系列等）为中到低拷贝质粒，每个细菌中的拷贝数在 20 以下。用户需要根据实际情况和需求选择菌液的用量。

菌液用量与质粒得率密切相关，较多的菌液含有较多的质粒，但过多的菌液会导致裂解不充分，会严重影响质粒的得率和纯度。如果菌液量较多，溶液使用量也需要相应增加。对于低拷贝质粒，我们推荐同一个样品分多管进行裂解，所得到的裂解液分多次通过同一根吸附柱的方法来提高质粒产量，而不是简单的增加菌液量。


7. 洗脱体积的选择

6. 离心速度与时间

8. 进一步提高得率或纯度的技巧

9. 关于内毒素

技术参数解释（胶回收与PCR 产物纯化试剂盒）

1. 试剂盒工作原理

2. 片段大小与回收效率

3. 试剂与吸附柱的通用性

4. 洗脱体积的选择

信息反馈欢迎您帮助我们改进产品。Website: www.sangon.comEmail: [email protected]: 400-821-0268

试剂盒中提到的离心时间，均指达到设定速度后需要维持的时间。按照操作步骤中的离心时间，通常时间长一些不会产生大的问题，但离心时间不足则可能导致抽提失败。更具体的说，对于过柱的步骤而言，离心时间通常维持 15-30 秒让所有溶液通过吸附膜即足够，但对于蛋白沉淀和空柱离心步骤而言，离心时间不足可能导致杂质去除不尽。

操作步骤中提到的离心速度需要认真对待，过高的离心速度可能导致吸附柱损坏，过低的速度可能导致抽提失败。转速 ( rpm) 与相对离心力 ( RCF, X g ) 的关系可按照如下公式换算：

柱式胶回收试剂盒与 PCR 产物纯化试剂盒原理类似，都是使用硅胶膜作为介质，在一定的盐溶液和 pH 条件下，溶液中的 DNA 片段特异性结合到吸附柱中。通过洗涤进一步去除体系中的蛋白、小分子、盐分等其他杂质，通过洗脱液将 DNA 从吸附柱中释放，得到纯净的 DNA。胶回收试剂盒与 PCR 产物纯化试剂盒不同之处在于其溶胶液中包含溶化琼脂糖的成分。

SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒中的吸附柱可以互换使用，但与 SanPrep 柱式质粒 DNA 试剂盒中的吸附柱不能互换。

与质粒抽提试剂盒不同，对于胶回收和 PCR 产物纯化的后续应用而言，浓度通常比得率更为重要，因此，如果需要得到更高浓度的回收产物，尽量用更小的体积洗脱。SanPrep 胶回收和 PCR 产物纯化试剂盒使用的新型吸附柱材料可以使洗脱体积低至 15 μl。

对于柱式胶回收和 PCR 产物纯化试剂盒而言，过大或过小的片段都不利于回收。胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒均可以很好地回收 100 bp ‒ 10 kb 的片段，对大于 10 kb 的片段回收效率略低，如果使用，请增加洗脱液体积和洗脱温度。对于小于 50 bp 的片段，胶回收试剂盒可以有部分回收，PCR 产物纯化试剂盒则不能回收，因此，PCR 纯化试剂盒可以有效去除 PCR 反应体系中的引物、dNTP 等影响后续反应的成分。用户如果需要回收 50-100 bp 的片段，我们推荐使用 SanPrep 胶回收试剂盒，并且在操作过程中适当降低离心转速和增加异丙醇用量。

对于柱离心式抽提方法得到的质粒而言，其浓度和总得率是一对矛盾。使用较多的洗脱液进行洗脱，可以获得更多的 DNA，但质粒浓度降低；使用较少的洗脱液进行洗脱，可以获得高浓度的质粒，但总得率显著下降。对于 SanPrep 质粒 DNA 小量抽提试剂盒而言，使用 50 μl 洗脱液进行洗脱，回收率可以达到 85% 以上。因此，对于大多数用户而言，我们推荐使用 50 μl 洗脱液进行洗脱。用户可以根据自身需要进行调整，但大于 100 μl 或少于 40 μl 洗脱液可能会分别导致质粒浓度或得率显著下降，不推荐使用。

SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒在开发过程中经过了大量的实验验证，严格按照标准步骤操作，所得到的质粒质量是可以有保证的，用于细菌转化，酶切，PCR 等实验都可以取得良好的效果，用于测序，一次反应可以解读超过 900 个核苷酸。如果用户仍然希望进一步提高纯度，可以增加一次 Wash Solut ion 的洗涤。

该试剂盒不包含去内毒素试剂，用户如果需要提取去内毒素质粒，可以单独购买生工去内毒素试剂（产品编号：B641718 ）对质粒进行进一步处理。

A. 在步骤 6 中将样品上柱后的流出液再次上柱；B. 在步骤 11 中 37-60 °C 温浴并适当延长温浴时间；C. 将洗脱得到的溶液再次加入吸附柱中进行洗脱。

如果希望进一步提高得率，可以考虑如下的一些操作：

rpm = 1000 × ( RCF/ 1.12r) 其中 r 为离心机转子半径 ( mm)1/ 2

19 热线电话：400-821-0268 公司网址：www.sangon.com公司地址：上海市松江区香闵路 698号企业邮箱：[email protected] 18

Note

SanPrep DNA SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒

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